特表 2023-545658 増強された薬物動態を示す、操作された細胞外小胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-31

(54)【発明の名称】増強された薬物動態を示す、操作された細胞外小胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20231024BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231024BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20231024BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20231024BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231024BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231024BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20231024BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20231024BHJP

【ＦＩ】

C12N15/88 Z

C12N15/63 Z

C12N15/11 Z

C07K19/00

A61K48/00

A61K9/00

A61K47/42

A61K35/76

A61P3/00

A61P21/00

A61P25/00

A61P13/12

A61P1/16

A61P9/00

A61P35/00

A61P31/00

A61P37/02

A61P29/00

C12N5/10

A61K38/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519528

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2023-03-28

(86)【国際出願番号】 EP2021076845

(87)【国際公開番号】W WO2022069577

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】2015399.5

(32)【優先日】2020-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】518259431

【氏名又は名称】エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ダヌ・グプタ

(72)【発明者】

【氏名】サミル・エル・アンダロッシ

(72)【発明者】

【氏名】オスカー・ヴィクランダー

(72)【発明者】

【氏名】ジョエル・ノルディン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA60

4C076AA29

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC27

4C076CC31

4C076EE41

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

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4C084ZA01

4C084ZA02

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4C084ZA94

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4C087AA01

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4C087ZB26

4C087ZB31

4C087ZC21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、種々の重篤な疾患の治療に対する治療モダリティとしての操作された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。より具体的には、本発明は、その半減期を延長し、その生体内分布を変化させ、遺伝的疾患だけではなく、本質的に全ての療法分野にわたってより広範囲な用途に適した様々な種類の薬物を運ぶことができる新規治療モダリティをもたらす、操作されたＥＶを製造するための新規アプローチに関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリヌクレオチドカーゴを含む送達ベクターであって、前記ポリヌクレオチドカーゴが、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む融合タンパク質をコードし、細胞外小胞（ＥＶ）を産生する細胞によって前記融合タンパク質へと翻訳されるように整列され、前記翻訳が、前記融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、送達ベクター。

【請求項2】

前記送達ベクターが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、ポリマー又は薬学的に許容される担体からなる群から選択されるウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項１に記載の送達ベクター。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチドカーゴが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、環状ｍＲＮＡ、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（登録商標）ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（登録商標））、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ウイルスゲノム、又は上述のいずれかの修飾態様である、請求項１又は２に記載の送達ベクター。

【請求項4】

前記融合タンパク質が、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項5】

前記少なくとも１つのＥＶが、患者由来ＥＶである、先行請求項のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項6】

前記患者由来ＥＶが、肝臓細胞由来ＥＶ、脳細胞由来ＥＶ、又は筋肉細胞由来ＥＶである、請求項５に記載の送達ベクター。

【請求項7】

前記融合タンパク質が、少なくとも１つの標的化ドメイン、少なくとも１つのエンドソーム脱出ドメイン、少なくとも１つの切断可能ドメイン、少なくとも１つの自己切断ドメイン、血漿タンパク質に結合可能な少なくとも１つのドメイン、及び／又は少なくとも１つのリンカーを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項8】

前記送達ベクターが、ＬＮＰであり、前記ポリヌクレオチドカーゴが、ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡである、先行請求項のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチドカーゴが、ｍＲＮＡであり、前記融合タンパク質が、前記ＰＯＩに連結したＥＶポリペプチドを含み、前記ＰＯＩが、酵素である、先行請求項のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項10】

前記融合タンパク質が、自己切断ドメイン及び／又は血漿タンパク質に結合可能なドメインを更に含む、請求項９に記載の送達ベクター。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクターを含む、薬学的組成物。

【請求項12】

医薬に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクター。

【請求項13】

遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクター、又は請求項１１に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

疾患、障害又は状態を治療する方法に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクター、又は請求項１１に記載の薬学的組成物であって、前記方法が、前記送達ベクター又は薬学的組成物を患者に投与することを含み、前記患者の標的細胞が、前記ポリヌクレオチドカーゴを前記融合タンパク質へと翻訳し、前記標的細胞が、前記融合タンパク質を含むＥＶを産生する、送達ベクター又は薬学的組成物。

【請求項15】

前記標的細胞が、肝臓細胞、脾臓細胞、肺細胞、筋肉細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、胃腸細胞、中枢神経系細胞、骨髄細胞、腫瘍細胞、免疫系細胞、又はＥＶを分泌可能な任意の他の組織の細胞である、請求項１４に記載の使用のための送達ベクター又は薬学的組成物。

【請求項16】

前記中枢神経系細胞が、脳細胞である、請求項１５に記載の使用のための送達ベクター又は薬学的組成物。

【請求項17】

患者においてＥＶを産生する方法であって、前記方法が、請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクター、又は請求項１１に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含み、前記患者における標的細胞が、前記ＥＶを産生し、前記ＥＶが、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む、方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つのＰＯＩを、タンパク質系の薬物カーゴ及び／又はＲＮＡ系の薬物カーゴと相互作用させ、これらを前記ＥＶに輸送することを更に含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

請求項１７又は１８に記載の方法によって得ることができる、ＥＶ。

【請求項20】

医薬に使用するための、請求項１９に記載のＥＶ。

【請求項21】

遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１９に記載のＥＶ。

【請求項22】

疾患、障害又は状態を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、請求項１～１０のいずれか一項に記載の送達ベクター、又は請求項１１に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記対象における標的細胞が、前記ポリヌクレオチドカーゴを前記融合タンパク質へと翻訳し、少なくとも１つのＥＶを産生し、前記少なくとも１つのＥＶが、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む、方法。

【請求項23】

前記疾患、障害又は状態が、欠陥遺伝子から生じる遺伝的疾患、障害又は状態であり、前記ＰＯＩが、前記欠陥遺伝子に対応するタンパク質である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ＰＯＩが、細胞内若しくはリソソーム酵素、又は膜タンパク質である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記融合タンパク質が、自己切断ポリペプチドを介してＥＶポリペプチドに連結した前記ＰＯＩを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

前記遺伝的疾患、障害又は状態が、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、リソソーム蓄積障害、神経筋疾患、又は神経変性疾患である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＥＶが、ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質を含む、遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項28】

前記ＰＯＩが、前記患者の変異した遺伝子、欠失した遺伝子、下方調節された遺伝子、又はその他の欠陥遺伝子によってコードされるタンパク質に対応する、請求項２７に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項29】

前記ＰＯＩが、酵素、トランスポーター、シャペロン、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及び／又はタンパク質結合タンパク質である、請求項２７又は２８に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項30】

前記融合タンパク質及び／又は前記ＰＯＩが、前記患者に対して異種である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項31】

前記ＥＶが、前記患者において２時間を超える、６時間を超える、又は２４時間を超える血漿半減期を有する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項32】

前記血漿半減期が、前記融合タンパク質及び／又は前記ＰＯＩの存在について血漿をアッセイすることによって測定可能である、請求項３１に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項33】

前記ＥＶが、前記患者の細胞において前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを翻訳することによって得ることができる、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項34】

前記ＥＶが、肝臓細胞由来ＥＶである、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項35】

医薬に使用するための、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【請求項36】

遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に使用するための、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、種々の重篤な疾患の治療に対する治療モダリティとしての操作された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。より具体的には、本発明は、ＥＶの薬物動態及び生体内分布を調整するためのＥＶのインビボ産生に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞（例えばエキソソーム）は、ほとんどの細胞型によって産生され、細胞間のタンパク質及びペプチド、核酸、脂質、及び様々な他の生体分子のための身体の天然輸送システムとして機能するナノメートルサイズの小胞である。ＥＶは、いくつかの潜在的な治療用途を有し、操作されたＥＶは、タンパク質生物学的製剤、核酸治療薬、遺伝子編集剤、及び低分子薬物のための送達ビヒクルとして既に調査されている。しかしながら、ＥＶは、標的組織に迅速に取り込まれるため、エキソソーム療法薬の臨床応用は、比較的頻繁な投薬を必要とする可能性が高い。ＥＶ（すなわち、操作されているか、又は操作されていないかにかかわらず、所与のＥＶの集団）は、通常、哺乳動物において数分間の範囲の血漿半減期を有し、この短い半減期は、全身静脈内投与の際には特に明らかである。

【0003】

ＥＶ製造は、エキソソーム療法薬の分野の先駆けとなる初期の学術刊行物から大きな発展を遂げてきた（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１）。しかしながら、ＥＶの製造、並びに及び上流及び下流の処理（精製を含む）のスケールアップは、特に、精製中にＥＶ表面に付与される変化を低減し、大きな患者集団における商業的使用の準備ができるようにするために、依然として更なる開発を必要とする。

【0004】

これらの欠点にもかかわらず、ＥＶは、生物学的障壁を越えて薬物カーゴ分子を送達するための新規薬物モダリティとして依然として顕著な可能性を有しており、ＥＶ療法薬のモジュール性は、他のモダリティ及び送達系と比べて、ＥＶの比類なき利点である。本発明は、ＥＶの送達特性及びその固有のモジュール性を維持しつつ、短い血漿半減期の課題、及び大規模なＥＶ製造に関連する困難に対処するものであり、それによって、ＥＶ系の療法薬への新しいアプローチを可能にする。

【発明の概要】

【0005】

したがって、ＥＶの半減期、生体内分布及び製造に伴う上に特定した問題を克服することが、本発明の目的である。

【0006】

第１の態様では、本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドカーゴを含む送達ベクターを含む組成物であって、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、上述の融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、組成物に関する。インビボでの細胞によるポリヌクレオチドカーゴの翻訳は、問題の融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの産生をもたらし、融合タンパク質を運ぶ操作された自己ＥＶの形態における遺伝的に操作された送達モダリティのインサイチュ産生をもたらす。重要なことに、融合タンパク質は、それ自体が薬物（例えば、限定されないが、酵素、トランスポーター、転写因子、シャペロン等）のいずれかであるか、又は薬物（例えば、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等）に結合し、その後の送達のために、操作されたＥＶにそれを輸送する能力を有する、目的のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）を含む。

【0007】

第２の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物（すなわち、ポリヌクレオチドが発現されると、融合タンパク質の翻訳及び融合タンパク質を含む操作された（すなわち、修飾された）ＥＶの生成を引き起こす、融合タンパク質をコードする送達ベクター及びポリヌクレオチドを含む組成物）を含む、薬学的組成物に関する。

【0008】

第３の態様では、本発明は、医薬に使用するための本発明による組成物に関する。より具体的には、本明細書の組成物は、本質的に任意の疾患、障害、状態、又は病気、好ましくは、遺伝的疾患、遺伝性疾患（遺伝的疾患及び非遺伝的遺伝性疾患の両方を含む）、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、及び炎症性疾患からなる群から選択されるものの治療に使用するためのものであり得る。更なる態様では、本発明は、本発明の組成物を製造する方法に関する。

【0009】

更に別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞においてＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質を含む少なくとも１つの遺伝的に操作されたＥＶを産生する方法に関する。この方法は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）と、本明細書に記載の組成物とを接触させることを含み、哺乳動物細胞が、ポリヌクレオチドカーゴを対応する融合タンパク質へと翻訳し、融合タンパク質、それによってＰＯＩを含む哺乳動物細胞由来ＥＶの産生をもたらすことができる。上述のように、哺乳動物細胞は、哺乳動物の身体の任意の細胞、例えば、肝細胞又は肝臓マクロファージ（例えば、クッパー細胞）等の肝臓細胞であり得る。肝臓以外の器官における様々な他の細胞及び細胞型はまた、本発明の本質的に自己であるが遺伝的に操作されたＥＶの「インサイチュバイオリアクター」としても機能し得る。

【0010】

更なる態様では、本発明は、融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生する方法であって、融合タンパク質が、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含み、本方法が、患者の細胞に、本発明による組成物を投与するステップを含み、それによって、患者の細胞が、患者由来ＥＶを産生する、方法に関する。したがって、患者由来ＥＶは、インビボで産生され、遺伝的に修飾された患者由来ＥＶである。これらの患者由来ＥＶは、順にＰＯＩ（これも患者に対して異種であり得る）を含む翻訳された融合タンパク質への設計されたポリヌクレオチドの発現から生じるという事実の結果として、患者に対して異種である。しかしながら、重要なことに、融合タンパク質及び／又はＰＯＩ（及び／又はＰＯＩによって結合される任意の他の薬物）が、患者に対して異種であるにもかかわらず、ＥＶは、同時に、これらが患者のために患者によって産生されるという意味で、自己である。このことは、「正常な」細胞機構が、操作されたＥＶの発現／産生に利用される場合の高収率、広範囲にわたる生体内分布をもたらすと推測される、自己ＥＶプロファイルに起因する免疫沈黙、循環中の長い半減期、及び効率的な障壁の通過及び薬物送達を含め、多くの利点を有する。遺伝的に操作されたＥＶのインビボ産生は、エクスビボで産生されたＥＶの患者への投与によるカーゴの送達と比較して、以下の理由で有益である。ａ）ＥＶは、精製プロセスによって損傷を受けないため、その天然タンパク質の完全なコロナを保持し、したがって、レシピエント細胞によるＥＶの取り込みに有益であるため、生物学的に非常に活性である可能性が高く、ｂ）ＥＶのインビトロ精製プロセスは、大きすぎるＥＶ又は小さすぎるＥＶの特定の集団を必然的に除外するため。ＥＶが、このインサイチュ法によってインビボで産生される場合、ＥＶの完全なスペクトルが、患者細胞において生成し、放出され、特定の融合タンパク質が特定のサイズのＥＶに優先的に組み込まれることが知られているため、広範囲にわたるカーゴを確実にロードすることができる。したがって、このインサイチュ送達方法は、各産物の精製プロセスを変更する必要なく、非常に広範囲にわたるカーゴの送達のための汎用性の高いプラットフォーム技術を可能にする。したがって、更なる態様では、本発明は、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶ（及びデフォルトでは、このようなＥＶの集団でもある）であって、患者由来ＥＶが上述の方法によって製造されるものに関する。本発明は更に、本明細書に記載の多くの疾患において、医薬に使用するためのこのような遺伝的に操作された患者由来ＥＶに関する。

【0011】

別の態様では、本発明は、疾患、障害又は状態を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、上述の方法が、本発明の組成物を対象に投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、方法に関する。任意の疾患、障害、又は状態が、治療に好適な標的として企図される。

【0012】

更なる態様では、本発明は、欠陥遺伝子から生じる遺伝的疾患、障害又は状態を治療する方法に関する。遺伝子欠陥は、変異、欠失、先端切断、重複、染色体損傷、欠失又は重複を含む多くの形態をとっていてもよく、遺伝子欠陥は、単一遺伝子性又は多遺伝子性であり得る。単一遺伝子性欠陥は、本発明の患者由来の遺伝的に操作されたＰＯＩを保有するＥＶによる治療に特に適している。遺伝子欠陥から生じる疾患を治療するための方法は、対象に、本発明による組成物を投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への発現／翻訳は、ＰＯＩを含む少なくとも１つの細胞外小胞（ＥＶ）の産生をもたらし、ＰＯＩは、対象の欠陥遺伝子に対応するタンパク質である。

【0013】

別の態様では、本発明は、患者の標的細胞、標的器官若しくは器官系、標的区画、又は標的組織にＰＯＩを送達する方法に関する。ＰＯＩを送達する方法は、患者の細胞（多くの場合、プロデューサー細胞と呼ばれる）に、本発明による組成物を投与するステップを含み、それによって、患者のプロデューサー細胞は、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生し、患者由来ＥＶは、ＰＯＩを標的細胞に送達する。非常に驚くべきことに、本願発明者らは、本発明による遺伝的に操作された患者由来ＥＶが、エクスビボ産生された遺伝的に操作されたＥＶと比較して（エクスビボ産生された患者由来の遺伝的に操作されたＥＶと比較した場合であっても）、循環中でかなり長い半減期を有することを発見した。この驚くべき技術的効果は、ＥＶが患者の体内でインビボで（インサイチュとも呼ばれる）産生されることと組み合わせて、ＥＶが患者特異的（自己）であるという事実に応じたものである可能性が高く、例えば血管を介して全身循環に入るとすぐに、患者に特異的なコロナが、遺伝的に操作されたＥＶと会合すると推測される。宿主におけるタンパク質コロナ（すなわち、自己コロナ）の形成は、いずれかの理論に拘束されることを望むものではないが、操作された自己ＥＶ（異種カーゴ分子を含む）が免疫不全性になり、患者において顕著に長い血漿半減期をもたらすと推測される。一例として、遺伝的に操作された対象由来ＥＶの集団の半減期は、通常は２４時間よりも長く、これは、対応するインビトロ製造されたＥＶの半減期の少なくとも１０倍であり、より好ましくは１００倍の長さである。しかしながら、本願発明者らは、インビボでの血漿半減期が７２時間を超え、更に長く延長されることを観察した。ここで再び、精製されたＥＶに対するＥＶのインビボ産生の利点が適用され、エクスビボで産生されたＥＶと比較して、インサイチュ産生されたＥＶによって観察される、より大きな治療効果が説明される。簡単に言うと、これらの利点は、ａ）ＥＶが、精製プロセスによって損傷を受けないため、その天然タンパク質の完全なコロナを保持し、したがって、生物学的に非常に活性である可能性が高く、ｂ）プラットフォーム技術の汎用性に起因して、ある範囲の異なるカーゴ（ＰＯＩ）の効果的な送達が可能であることを意味する、任意のＥＶサブ集団の消失が存在しないことを含む。

【0014】

本明細書で簡潔に要約され、以下により詳細に記載されるような本発明は、例えばＰＯＩの形態の薬物を含む融合タンパク質を保有する遺伝的に操作された対象由来（すなわち、自己）ＥＶのインサイチュでの産生をもたらす細胞工学の顕著な偉業に基づいている。本発明は、操作されたＥＶ療法薬への完全に新規のアプローチを表し、より少ない投薬頻度、より低い商品コスト、ＰＫ／ＰＤプロファイル及び生体内分布の増強を可能にし、また、操作されたＥＶ療法薬開発の観点での段階的な変化である、自己の操作されたＥＶのスケール変更可能な製造及び適用を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】インサイチュで操作されたＥＶの産生概念を説明する概略図であり、それによって、インビボで一過性に操作された患者細胞は、操作されたＥＶを産生し、すなわち、患者自身がエキソソームを産生し、薬物を手の届きにくい器官に送達する能力を利用することで、所望の薬物（目的のタンパク質（ＰＯＩ）の形態で）及び任意選択的に操作されたＥＶの薬理学的活性を増強するための追加の部分を含有するように設計された他の患者特異的な自己ＥＶの長期的に持続する操作された融合タンパク質を保有するＥＶの産生をもたらす。

【図2】インサイチュで産生される治療的な遺伝的に操作されたＥＶが、大腸炎のマウスモデルにおいて長期的な治療効果を提供することができることを示すインビボデータ。

【図3】肝臓中でインサイチュで産生されるＥＶが、広範囲にわたる器官において、及び血漿中で長期間にわたって検出可能であることを示すインビボ生体内分布データ。

【図4】ＰＯＩを含む融合タンパク質を保有する自己の対象特異的ＥＶが、エクスビボで産生されたＥＶと比較して、有意に改善した半減期を有することを示す、（ｉ）マウス細胞から分泌され、ＰＯＩとしてヒトＣＤ６３及び酵素ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを含む融合タンパク質を保有するように一過性の遺伝的に操作されたマウスのインサイチュで産生されたＥＶ、並びに（ｉｉ）全く同じ融合タンパク質を保有するインビトロで製造されたＥＶの投与の時間経過に伴うマウス血漿における酵素活性のレベルの比較。

【図5】ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質へのアルブミン結合ドメインの付加が、インサイチュで産生されたインサイチュ産生された遺伝的に操作されたＥＶの半減期を更に延長することを示す、インビボ生体内分布及び半減期データ。

【図6】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によるｍＲＮＡの送達を介するインサイチュエキソソーム産生後のｎａｎｏｌｕｃ融合タンパク質（ヒトＣＤ６３－ｌｕｃ、ヒトＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ、又はｌｕｃ単独）を発現するＥＶのインビボ生体内分布。

【図7】ＬＮＰによるｍＲＮＡ送達後に産生されるインサイチュで操作されたＥＶの半減期に対するアルブミン結合ポリペプチドの効果。

【図8】精製されたＥＶに対する、インサイチュの血漿動態の比較。

【図9】様々な異なるＥＶポリペプチドを含む融合タンパク質が、カーゴも送達することができるという証拠。

【図10】大腸炎の治療のための療法スーパーレプレッサーｉｋＢａタンパク質のインサイチュＥＶ送達。

【図11】インサイチュで産生されたＥＶが、大腸炎モデルにおいて炎症性サイトカインレベルを低減するという証拠。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、ＥＶベースの薬物開発の主な欠点に対処する、ＥＶ療法薬の開発に対する新規かつ独創的なアプローチに関する。インビトロ細胞培養物においてエクスビボで操作されたＥＶ療法薬を製造する代わりに、本発明の背後にいる本願発明者らは、インビボ設定でインサイチュで遺伝的に操作された患者由来ＥＶによって、これらの遺伝的に操作されたＥＶが、薬物動態及び生体内分布の両方に関連して、エクスビボで製造されたＥＶとは異なる挙動をするという、注目に値する発明を行った。初代細胞又は細胞株からインビトロで製造されたＥＶを投与するときにみられる急速な血漿クリアランスは、本願発明者らが示されるように、所与の薬物カーゴを保有する遺伝的に操作されたＥＶが、インビボで器官系に存在する標的細胞をＥＶ産生のためのバイオリアクターに変えることによってインサイチュで作製されるときに、完全に無効化される。このことは、少なくともＥＶポリペプチド及び目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を標的細胞に送達する本発明の方法によって達成される。ポリヌクレオチド構築物を送達すると、標的細胞機構は、ポリヌクレオチド構築物を融合タンパク質へと翻訳し（必要な場合には、すなわち、ポリヌクレオチド構築物がｍＲＮＡではない場合には、転写し）、上述の融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの細胞からの産生、及び最終的には分泌をもたらす。タンパク質に含まれるＰＯＩは、それ自体が薬物（例えば、酵素補充療法のための治療用酵素）であってもよく、又は薬物、すなわち、薬理学的に活性な薬剤、例えば、別のタンパク質若しくは核酸等に結合し得る。これにより、（ポリヌクレオチド及び送達ベクターに応じて、一過性かつ安定的に）ＰＯＩを保有する遺伝的に操作されたＥＶの産生がもたらされ、これらは患者によって標的細胞から循環に分泌され、これらのＥＶは、エクスビボ産生された遺伝的に操作されたＥＶよりもかなり長い循環半減期及び異なる生体内分布プロファイルを有する。

【0017】

便宜上及び明確にするために、本明細書で使用される特定の用語をまとめて、以下に説明する。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

【0018】

本発明の特徴、態様、実施形態、又は代替物がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群メンバーの任意の個々のメンバー又は下位群に関しても説明されることを認識するであろう。当業者は、本発明がそれによって、マーカッシュ群メンバーの個々のメンバー又は下位群の任意の組み合わせに関しても記載されることを更に認識するであろう。加えて、本発明の態様及び／又は実施形態のうちの１つに関連して説明される実施形態及び特徴はまた、本発明の全ての他の態様及び／又は実施形態において準用されることに留意されたい。例えば、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と組み合わせて本明細書に記載される融合タンパク質は、本明細書の他の全ての態様、教示、及び実施形態、例えば、遺伝的に操作されたＥＶに関する態様及び／若しくは実施形態、並びに／又は医薬におけるそれらの用途とともに開示され、これに関連し、適用可能であり、かつ適合性があると理解されるべきである。更に、特定の態様と組み合わせて記載される特定の実施形態、例えば、組成物及び薬学的組成物に関する態様に関連して記載される異なるウイルス性送達ベクター及び非ウイルス性送達ベクターは、全ての他の態様及び／又は実施形態、例えば、治療方法及び／又はかかる組成物の医学的用途に関するものとともに開示され、これに関連し、適用可能であり、かつ適合性があると理解されるべきである。更に、本明細書で言及される全てのＥＶポリペプチド及び目的のタンパク質（ＰＯＩ）を、任意の順序、配列で、又は任意のドメイン、領域、若しくはその伸長部を使用して、融合タンパク質の作製のための従来の戦略を使用して、融合タンパク質に自由に組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書に記載のＥＶポリペプチドを、１つ以上のＰＯＩとの任意の組み合わせで自由に組み合わせてもよく、任意選択的に、他のポリペプチドドメイン、領域、配列、ペプチド、及び本明細書の基、例えば、リンカー配列、自己切断ドメイン、エンドソーム脱出ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、標的化部分、及び／又は血漿タンパク質に対する結合を媒介するドメイン等と組み合わせてもよい。更に、任意及び全ての特徴（例えば、マーカッシュ群の任意及び全てのメンバー）は、任意及び全ての他の特徴（例えば、任意の他のマーカッシュ群の任意及び全てのメンバー）と自由に組み合わせることができ、例えば、任意のＥＶポリペプチドを、任意のＰＯＩと組み合わせてもよく、次いで、任意の他のポリペプチドドメイン、核酸薬物カーゴ等の他の薬物カーゴ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ等のＲＮＡ分子）、又は本明細書の任意の他の態様及び／又は実施形態との組み合わせで、組み合わせ、使用するか、又は適用してもよい。更に、本明細書の教示が単数形のＥＶ及び／又は別個のナノ粒子様小胞としてのＥＶを指す場合、全てのそのような教示は、複数のＥＶ及びＥＶ集団に同様に関連し、適用可能であることが理解されるべきである。一般的な注釈として、本発明によるＥＶポリペプチド、ＰＯＩ、追加のポリペプチドドメイン及び部分（例えば、限定されないが、標的化ドメイン、切断可能ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、自己切断ドメイン、エンドソーム脱出ドメイン、血漿タンパク質結合ドメイン、リンカー等）、並びに全ての他の態様、実施形態、及び代替物を、本発明の範囲及び要旨から逸脱することなく、ありとあらゆる可能な組み合わせで自由に組み合わせてもよい。更に、本発明の任意のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又は任意のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列（それぞれアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列）は、任意の所与の分子がそれに関連する所望の技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び配列から大幅に逸脱し得る。それらの生物学的特性が維持される限り、本出願によるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド配列は、可能な限り高い配列同一性又は類似性が好ましいが（例えば、６０％、７０％、８０％、又は例えば９０％以上）、天然配列と比較して最大５０％（例えば、ＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを使用して計算される）逸脱してもよい。相同性を決定するために、当該技術分野の標準的な方法を使用してもよい。例えば、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズム及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を計算するか、又は配列をアラインメントして、同一性又は類似性を決定することができる。いくつかのポリペプチドの組み合わせ（すなわち、融合）は、それぞれのポリペプチドの特定のセグメントが置き換えられてもよく、先端切断されてもよく、及び／若しくは修飾されてもよいこと、かつ／又は配列が、他のアミノ酸伸長部の挿入によって中断されてもよいことを暗示し、これは、重要な特性（例えば、ＥＶポリペプチドの文脈において、融合タンパク質をＥＶに輸送する能力、又は酵素であるＰＯＩの文脈において、その酵素活性）が保存されているか、又は少なくとも実質的に維持されている限り、天然配列からの逸脱がかなりのものであってもよいことを意味する。したがって、それらのポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ若しくはＲＮＡであるか、又はその２つの組み合わせであるかどうか、また、それらが転写及び翻訳を必要とするか、若しくは対応する融合タンパク質への単なる翻訳を必要とするかにかかわらず、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に同様の論法が当然適用される。遺伝子、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関連して本明細書で言及される任意の受入番号又は配列番号は、単なる例として、単なる情報のためとみなされ、全ての遺伝子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、当業者がそれらを理解するように、通常の意味を付与されるものとする。したがって、上述のように、当業者はまた、本発明が、本明細書において言及されている特定の配列番号及び／又は受入番号のみを包含するだけではなく、それらのバリアント及び誘導体をも包含するということを理解するであろう。本明細書において言及される全ての受入番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号であり、本明細書で述べられている全ての遺伝子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、当業者によって理解されるように、それらの従来の意味に従って解釈されるべきである。

【0019】

「ＥＶ」又は「細胞外小胞」又は「エキソソーム」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の形態で細胞から得ることができる任意の種類の小胞、例えば、微小胞（例えば、細胞の形質膜から産生された任意の小胞）、エキソソーム（例えば、エンドソーム、リソソーム、及び／若しくはエンドリソソーム経路に由来する任意の小胞、並びに／又は細胞の形質膜若しくは任意の他の膜に由来する任意の小胞）、ＡＲＭＭ（アレスチンドメイン含有タンパク質１（ＡＲＲＤＣ１）媒介性小胞、微小胞の形態である）等に関すると理解され得る。エキソソーム、微小胞、及びＡＲＲＤＣ１媒介性小胞（ＡＲＭＭ）は、特に好ましいＥＶを表すが、他のＥＶもまた、様々な状況で有利であり得る。本発明のＥＶ、エキソソーム等は、遺伝的に修飾され得る。「遺伝的に操作された」、又は単に「修飾された」若しくは「操作された」という用語も使用され得る。「遺伝的に修飾された」及び「遺伝的に操作された」ＥＶという用語は、ＥＶが、遺伝的に修飾／操作された細胞に由来することを示す。細胞及びそこから得られる遺伝的に操作されたＥＶの遺伝子操作は、典型的には、ＥＶポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの翻訳（及び必要な場合には、その前の転写）の結果であり、細胞に導入されると、上述の融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの産生（遺伝的に操作／修飾された細胞による）をもたらす。

【0020】

ＥＶのサイズは、大幅に変化し得るが、ＥＶは、典型的には、ナノサイズの流体力学半径、すなわち、１０００ｎｍ未満の半径を有する。エキソソームは、多くの場合、３０～３００ｎｍ、典型的には４０～２５０ｎｍの範囲のサイズを有し、これは、療法用の目的にとって非常に好適なサイズ範囲である。明らかに、ＥＶは、肝臓等の器官がＥＶ産生のための高度に生産的な器官であるにもかかわらず、インビボで任意の細胞型に由来してもよい。

【0021】

ＥＶの医学的及び科学的な使用及び用途を説明する場合、当業者には、本発明は通常、複数のＥＶ、すなわち、数千、数百万、数十億、又は更には数兆のＥＶを含み得るＥＶの集団に関することが明らかであろう。ＥＶは、単位体積当たり（例えば、１ｍｌ当たり、又は１Ｌ当たり）、１０^５、１０^８、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１８、１０^２５、１０^３０個のＥＶ（多くの場合、「粒子」と呼ばれる）等の濃度、又はより大きい、より小さい、若しくはその中間の任意の他の数等の濃度で存在し得る。同じように、例えば、特定のＰＯＩとともに特定の融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶに関連し得る「集団」という用語は、かかる集団を一緒に構築する複数のエンティティを包含することが理解されるべきである。言い換えれば、個々のＥＶは、複数で存在する場合、ＥＶ集団を構成する。したがって、当然、本発明は、当業者に明らかであるように、個々のＥＶ及びＥＶを含む集団の両方に関する。

【0022】

本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチドカーゴ」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにＲＮＡヌクレオチド及び／又はＤＮＡヌクレオチドの任意の修飾形態の形態であり得る、少なくとも１０個のヌクレオチドモノマーを含むバイオポリマーに関すると理解されたい。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、種々の二次及び三次構造を有する、直鎖又は環状であってもよい。天然に存在するか、又は天然に存在しないかにかかわらず、任意のポリヌクレオチドは、本発明の趣旨において、ポリヌクレオチドであると理解されるべきである。ポリヌクレオチドの好ましい実施形態としては、直鎖ｍＲＮＡ、環状ｍＲＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ウイルスゲノム（一本鎖若しくは二本鎖、ＲＮＡで構成されるか、若しくはＤＮＡで構成される）、又は上述のいずれかの修飾態様、並びに任意の他の好適なポリヌクレオチドカーゴが挙げられる。より具体的には、本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ」は、天然に存在し得るか、又は天然に存在し得ないメッセンジャーリボ核酸を指す。例えば、ｍＲＮＡは、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、又はリンカー等の修飾された及び／又は天然に存在しない構成要素を含み得る。ｍＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。本発明のｍＲＮＡは、通常、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し、本発明の文脈において、ポリペプチドは、典型的には、融合タンパク質であり、上述の融合タンパク質は、ひいては、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内のｍＲＮＡのインビボでの翻訳は、ポリペプチド、すなわち、本発明の態様及び実施形態による、ＰＯＩを含む融合タンパク質を産生し得る。有利な一実施形態では、１つより多いＰＯＩ（例えば、２つ、３つ、若しくは４つ、又はそれより多いＰＯＩ）、又は１つのＰＯＩ及び第２のタンパク質若しくはＲＮＡ分子をコードするために、１つより多いポリヌクレオチドが、組成物に含まれ、ここで、第２のタンパク質又はＲＮＡ分子は、薬物である（すなわち、実際の薬理学的／治療活性を有する）。一例として、２つのｍＲＮＡ、又は２つのｐＤＮＡプラスミド、又は１つのｐＤＮＡプラスミド及び１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド等が、本明細書の組成物に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＯＩの補助によって操作されたＥＶへと輸送されるＰＯＩ及びｍＲＮＡを含む融合タンパク質を含む、遺伝的に操作されたインサイチュで産生された患者特異的ＥＶの産生を駆動するために、ＰＯＩを含む融合タンパク質のためのｍＲＮＡコードと、ＰＯＩが相互作用するように設計されているｍＲＮＡ分子のためのｐＤＮＡポリヌクレオチドコードとを有することが有利な場合がある。上のことからわかるだろうが、本発明によるポリヌクレオチドの多数の態様、代替物、及びバリアントが本明細書に提供され、本発明の固有の能力によって、インサイチュで操作されたＥＶ産生技術を介して多数の薬物カーゴを可能にすることができる。自己増幅ＲＮＡをポリヌクレオチドカーゴとして使用する利点は、自己増幅ＲＮＡが組織に送達されると、ＲＮＡの複数のコピーが作製され、ＲＮＡテンプレートの増幅特性の補助によって、ＰＯＩの更に多くのコピーが作製されることである。重要なことに、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、感染性ではなく、細胞を溶解せず、確実にタンパク質発現を持続させる。したがって、増幅により、非常に高いＲＮＡコピー数が得られ、それによって、はるかに低い用量で効果的なタンパク質産生を達成する。

【0023】

「翻訳」及び「発現」という用語は、本明細書において互換的に使用され、対応するポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドをもたらす様々なステップに関連し、それらを含むと理解されるべきであり、限定されないが、（ｉ）複製（例えば、通常はレプリソームと呼ばれる因子群の一部を形成する、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを用いた、自身のＤＮＡ産生コピー）、（ｉｉ）転写（例えばＲＮＡポリメラーゼ及び他の因子を用いた、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ（例えばプレｍＲＮＡ）の産生）、（ｉｉｉ）ＲＮＡからｍＲＮＡへのプロセシング（スプライシングを介する（例えばプレｍＲＮＡ）、５’キャップ及びポリＡテールの付加、及び他の形態のＲＮＡプロセシング）、（ｉｖ）並びにリボソーム機構を用いた、ｍＲＮＡから対応するタンパク質への翻訳を含む。したがって、本発明に使用される「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡをタンパク質に変換する実際の翻訳プロセスを含む、ポリヌクレオチド中の情報を対応するタンパク質に変換する際の全てのステップを包含する。

【0024】

「投与」及び「投与する」という用語は、対象、例えば患者に組成物を提供する異なる手段に関すると理解されるべきである。投与は、様々な異なる投与経路を介して、また、様々な異なる投薬及び／又は治療計画を介して、組成物を対象に提供することを含み得る。本発明の組成物の単回用量は、特定の文脈において、十分なものであってもよいが、ほとんどの疾患及び状態において、複数回用量が想定される。複数の用量はまた、複数の異なる経路、例えば、静脈内及び髄腔内の組み合わせ、又は皮下及び筋肉内の組み合わせを介して投与され得る。本発明で企図される投与経路としては、限定されないが、例えば、耳介（耳）、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質性、腹腔内（ｉｎｔｒａ－ａｂｄｏｍｉｎａｌ）、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、大脳内、脳室内、嚢内、大槽内、結腸内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、鼻腔内、脊髄内、滑膜内、精巣内、髄腔内、胸腔内、尿細管内、腫瘍内、鼓膜内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオン浸透法、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、密封包帯技術、眼、経口、口腔咽頭、その他のもの、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、経直腸、呼吸器（吸入）、眼球後方、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、及び／又は膣の投与、及び／又は上述の投与経路の任意の組み合わせ等の経路を介した投与が挙げられ、典型的には、治療される疾患、患者集団の特徴、及び／又は患者由来の遺伝的に操作されたＥＶ自体の所望の特徴に依存する。静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、髄腔内（ＩＴ）、脳室内（ＩＣＶ）、大槽内（ＩＣＭ）、腹腔内（ＩＰ）、及び筋肉内（ＩＭ）は、本発明による好ましい投与経路の１つである。

【0025】

第１の態様では、本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドカーゴを含む送達ベクターを含む組成物であって、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、上述の融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、組成物に関する。上述のように、インビボでの細胞によるポリヌクレオチドカーゴの翻訳は、問題の融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの産生をもたらし、これが、インビボで細胞中で起こる場合に、ＥＶ生物発生プロセスの一部としてＥＶに組み込まれると推測される。ポリヌクレオチドカーゴを、様々なウイルス性又は非ウイルス性送達ベクターを使用して標的細胞に送達することができ、ベクターの選択は、所望の標的細胞型及び器官、ポリヌクレオチドのサイズ、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はその両方で構成されるかどうか、投薬頻度（非ウイルスベクターの代わりにウイルスベクターを使用することによって有意に低下させることができる）、時間経過に伴う再投与の必要性、並びに発現レベル、毒性、免疫原性、及び多くの他の因子に関連する考慮事項を含む多数のパラメータに依存する。代替の実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴ、例えば、修飾ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡを、その単語の従来の意味で送達ベクターを使用することなく、遺伝的に操作されたＥＶを保有する融合タンパク質のインサイチュ産生のために標的細胞に送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、ポリヌクレオチドのＩＣＶ、ＩＴ、又はＩＣＭ投与を介する、例えば、筋肉組織（ＩＭ）へ、心臓へ、固形腫瘍若しくは任意の他のがん性組織へ、又は脳を含む中枢神経系への直接的な、薬学的に許容される担体のみにおけるポリヌクレオチドの直接投与に関する。例えば、ＬＮＰ又はポリマー系ベクターが存在しない場合であっても、ポリヌクレオチドカーゴが製剤化される薬学的組成物は、本発明の全ての意図及び目的のために送達ベクターとして機能する。特定の組織への局所投与に加えて、ポリヌクレオチドの全身投与もまた、本明細書で企図される。１つの特に適切なアプローチは、流体力学的投与であってもよく、ポリヌクレオチドを肝臓細胞に送達するために静脈内で行い、又は腸管投与を介して行い、ポリヌクレオチドを内皮細胞及び胃腸系の他の細胞に送達することを可能にしてもよい。上述のように、ポリヌクレオチドから薬学的組成物への直接的な（例えば、生理食塩水溶液、又は任意の他の生理学的に好適な溶液中で直接的な）製剤化は、ＰＯＩを含む融合タンパク質を保有する操作されたＥＶへと翻訳されるポリヌクレオチドの重要な特性が維持される限り、非ウイルス性送達ベクター及び問題のポリヌクレオチドを含む組成物の使用と同等であると考えられる。

【0026】

好ましい実施形態では、組成物は、非ウイルスベクターを含む。本発明に好適な非ウイルスベクターとしては、脂質系送達ベクター、例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、リポプレックス、リピドイド、脂質エマルション、カチオン性脂質、双性イオン性脂質、又は任意の他の種類の脂質系送達ベクターが挙げられる。更に、ポリマー系送達ベクターも、本発明の適用に適している。これらのポリマー系ベクターとしては、例えば、ポリプレックス及びポリアミンが挙げられる。他の形態の送達ベクターとしては、ペプチド系ベクター、例えば、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）送達ベクター（カーゴとのポリプレックスを形成し得るＣＰＰを含む）、又はインビボでのポリヌクレオチドカーゴの送達に適した任意の他の非ウイルス性送達ベクターが挙げられる。

【0027】

ナノ粒子組成物の形態の脂質含有送達ベクターは、細胞及び／又は細胞内区画への輸送ビヒクルとして、様々な異なる種類のポリヌクレオチド、特に、その修飾態様を含むＤＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のために非常に有効であることが証明されている。これらの脂質ベースの送達ベクターは、一般に、１つ以上の「カチオン性」及び／又はアミノ（イオン化可能）脂質、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造化脂質（例えば、ステロール）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ脂質）を含有する脂質を含む。カチオン性及び／又はイオン化可能脂質としては、例えば、それらをカチオン性にするために容易にプロトン化されるアミン含有脂質が挙げられる。脂質又は脂質様材料（リピドイド）を用いることにより、様々な送達ベクター、例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、脂質エマルション、脂質インプラント等を調製することができる。例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、古典的なカチオン性脂質として、ＤＮＡ及びｍＲＮＡ及びＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥを送達するために広く使用されており、コレステロールは、ｍＲＮＡを樹状細胞、マクロファージ、及び肺内皮細胞等に送達するために使用されてきた。リピドイド、ＬＮＰ、及び他の種類の脂質ベースの送達ベクターを形成するために使用することができる他の脂質ベースの化合物としては、ＤｌｉｎＤＭＡ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、脂質テールにエステル及びアルキンを含む骨格修飾を有するＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、ｃＫＫ－Ｅ１２、５Ａ２－ＳＣ８、７Ｃ１、及び１，３，５－トリアジナン－２，４，６－トリオン（ＴＮＴ）誘導体、ＭＣ３、ＸＴＣ２等が挙げられる。例えば、これらの脂質又はリピドイドに基づいて、ヘルパー脂質、ＰＥＧ－脂質及びコレステロールに対する主要脂質のモル比を調節し、ヘルパー脂質又はＰＥＧ－脂質を変化させ、別の構成要素（例えば、プロタミン）を添加することによって、効果的で非常に効果的なｍＲＮＡ送達及び融合タンパク質発現を達成することができる。

【0028】

リポソームは、本発明の文脈において、ポリヌクレオチドとともに組成物の一部を形成するのに好適な、一種の非ウイルス性の脂質ベース送達ベクターである。リポソームに組み込まれたポリヌクレオチドは、リポソームの内部空間中に、リポソームの二重層膜内、又はリポソーム膜の外側表面と会合して、完全又は部分的に位置していてもよい。リポソームは、標的細胞への核酸の導入を容易にすることができるが、コポリマーとしてのポリカチオン（例えば、ポリＬ－リジン及びプロタミン）の添加は、いくつかの種類のカチオン性リポソームの送達効率を容易にすることができ、いくつかの場合では、顕著に増強することができる。本発明の好ましい実施形態では、脂質ベースの送達ベクターは、脂質ナノ粒子として製剤化される。本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という語句は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含む送達ベクターを指す。好適な脂質の例には、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシド）が含まれる。また、単独で、又は他の移送ビヒクルと組み合わせた状態で、移送ビヒクルとしてのポリマーの使用も企図される。好適なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、デンドリマー、及びポリエチレンイミンが含まれ得る。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の正電荷を保有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。企図される脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を使用する、様々な比率の多成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。他の適切な脂質としては、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、又は「ＤＯＴＭＡ」が使用される。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化することができ、又は中性脂質、ジオレオイルホスファチジル－エタノールアミン若しくは「ＤＯＰＥ」、又は他のカチオン性脂質若しくは非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム若しくは脂質ナノ粒子にすることができる。他の好適なカチオン性脂質としては、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド又は「ＤＯＧＳ」、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム又は「ＤＯＳＰＡ」、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン又は「ＤＯＤＡＰ」、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン又は「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。他の企図されるカチオン性脂質としては、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は「ＤＳＤＭＡ」、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は「ＤＯＤＭＡ」、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン又は「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド又は「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド又は「ＤＤＡＢ」、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド又は「ＤＭＲＩＥ」、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン又は「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－ｌ－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’、ｌ－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン又は「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン又は「ＤＭＯＢＡ」、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン又は「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ν，Ν－ジメチルプロピルアミン又は「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン又は「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン又は「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン又は「ＤＬｉｎ－ＤＭＡ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン又は「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」、及び２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ））、又はこれらの混合物も挙げられる。本発明によって、コレステロールベースのカチオン性脂質の使用も企図される。このようなコレステロール系カチオン性脂質は、単独で、又は他のカチオン性脂質若しくは非カチオン性脂質と組み合わせて使用され得る。好適なコレステロール系カチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジンが挙げられる。他の好適なカチオン性脂質としては、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、及びグアニジニウム系脂質が挙げられる。例えば、特定の実施形態は、１つ以上のイミダゾール系カチオン性脂質、例えば、イミダゾールコレステロールエステル又は「ＩＣＥ」脂質を含む組成物に関する。

【0029】

同様に、特定の実施形態は、ＨＧＴ４００３カチオン性脂質２－（（２，３－ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イルオキシ）プロピル）ジスルファニル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミンを含む脂質ナノ粒子に関する。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、１つ以上の切断可能脂質、例えば、切断可能ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）官能基を含む１つ以上のカチオン性脂質又は化合物（例えば、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＨＧＴ４００４、及びＨＧＴ４００５）を含む脂質ナノ粒子に関する。単独で、又は好ましくは、送達ベクターを含む他の脂質（例えば、脂質ナノ粒子）と一緒に組み合わせた、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－ｌ－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及び誘導体化セラルミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）等の誘導体化脂質の使用も、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質としては、限定されないが、Ｃ６～Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合した、長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が挙げられる。かかる構成要素の添加により、複雑な凝集が防止される可能性があり、また、循環寿命を増加させ、標的細胞への脂質－ポリヌクレオチド組成物の送達を増加させる手段を提供する可能性があり、又はそれらをインビボで製剤から迅速に交換するために選択し得る。特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４又はＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化脂質は、脂質系送達ベクターに存在する総脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、又は約２％のモル比を含み得る。代替の実施形態では、非ウイルス性の脂質系送達ベクターはまた、非カチオン性脂質を使用してもよい。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性脂質、双性イオン性脂質、又はアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という語句は、選択されたｐＨ、例えば、生理的ｐＨで正味の負電荷を保有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質としては、限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチル ＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物が挙げられる。このような非カチオン性脂質を、単独で使用してもよいが、好ましくは、他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用される場合、非カチオン性脂質は、送達ベクター中に存在する総脂質の５％～約９０％、又は好ましくは約１０％～約７０％のモル比を含まれ得る。好ましくは、脂質ナノ粒子は、複数の脂質及び／又はポリマー構成要素を組み合わせることによって調製される。例えば、送達ベクターは、ＣＩ ２－２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを４０：３０：２５：５のモル比で、又はＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを１８：５６：２０：６のモル比で、又はＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを４０：２０：３５：５のモル比で、又はＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを４０：２０：３５：５のモル比で使用して調製され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／又はＰＥＧ修飾脂質の選択、並びにそのような脂質の互いに対する相対的モル比は、選択される脂質の特徴、意図される標的細胞の性質、送達されるポリヌクレオチド（典型的には修飾ｍＲＮＡ）の特徴に基づいている。追加の考慮事項としては、例えば、アルキル鎖の飽和、並びに選択された脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、及び毒性が挙げられる。したがって、モル比は、それに応じて調節され得る。例えば、複数の実施形態では、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の割合は、１０％より大きく、２０％より大きく、３０％より大きく、４０％より大きく、５０％より大きく、６０％より大きく、又は７０％より大きくてもよい。脂質ナノ粒子中の非カチオン性脂質の割合は、５％より大きく、１０％より大きく、２０％より大きく、３０％より大きく、又は４０％より大きくてもよい。脂質ナノ粒子中のコレステロールの割合は、１０％より大きく、２０％より大きく、３０％より大きく、又は４０％より大きくてもよい。脂質ナノ粒子中のＰＥＧ修飾脂質の割合は、１％より大きく、２％より大きく、５％より大きく、１０％より大きく、又は２０％より大きくてもよい。特定の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、以下のカチオン性脂質のうちの少なくとも１つを含む。Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＨＧＴ５０００、又はＨＧＴ５００１。複数の実施形態では、送達ベクターは、コレステロール及び／又はＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、送達ベクターは、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み、いくつかの実施形態では、送達ベクターは、以下の脂質製剤のうちの１つを含む。Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ。

【0030】

好ましい実施形態では、本発明の脂質ベースの送達ベクターは、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群から選択されるＰＥＧ脂質を使用し、一方で、構造化脂質は、コレステロールフェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、ウルソール酸、又はアルファ－トコフェロールを含み得る。脂質構成要素は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の（ポリ）不飽和脂質を含み得る。一般に、かかる脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含み得る。

【0031】

上述のように、ポリマーベースの非ウイルス性送達ベクターもまた、ポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの送達ベクターとして本発明で企図される。ポリマーは、生分解性及び／又は生体適合性であってもよく、限定されないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択されてもよい。例えば、ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コーカプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ酢酸ビニル）、ポリハロゲン化ビニル、例えば、ポリ塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、及びそのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリオキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、及びトリメチレンカーボネートを含み得る。

【0032】

本発明の別の実施形態では、組成物の送達ベクターは、ウイルス性送達ベクター、すなわち、ポリヌクレオチドカーゴを運ぶように修飾されたウイルスである。好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ワクシニアウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、ロタウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はポリヌクレオチドカーゴに好適な任意の他のウイルス性送達ベクターが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のウイルス性送達ベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスである。ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９を含む多くの天然血清型で存在し、これらは全て、本発明のポリヌクレオチドのための好適なウイルス担体である。また、様々な組換え及び修飾ＡＡＶ血清型が存在し、これらの全てのバリアントも、本発明の文脈における適用に適する。ＡＡＶ血清型の選択は、主に、ポリヌクレオチドカーゴで形質導入することを望む標的細胞に関連する考慮事項によって行われる。例えば、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９は、肝臓に形質導入する際に非常に効率的であり、これは、ポリヌクレオチドカーゴの転写及び翻訳の結果として、融合タンパク質を含む操作されたＥＶの産生をもたらすため、本発明の好ましい実施形態である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９は、問題の融合タンパク質を含む操作されたＥＶの産生のために筋肉細胞を標的化することができるため、これも好適なウイルスベクターである。中枢神経系細胞の標的化は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を使用して最もよく達成され、これにより、中枢神経系における療法用途のために、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む操作されたＥＶの産生がもたらされ得る。レンチウイルスは、本発明のポリヌクレオチドのための別の適切なウイルス性送達ベクターであり、ＡＡＶよりも大きな導入遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）を運ぶことができるという利点を有する。

【0033】

好ましい実施形態では、本発明の送達ベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ＶＬＰは、天然ウイルスの組織及び構成を模倣する、２０～８００ｎｍの範囲のサイズを有する自己組織化したポリペプチド構造であるが、ウイルスゲノムを欠いているため、より安全かつより安価な薬物送達小胞を産生する可能性を有する。ＶＬＰは、自然に組織化する少なくとも１つの構成要素から形成される、自己組織化した粒子であり、その構成要素は、ポリペプチド又は非ペプチド化合物であり得る。ＶＬＰは、１つ以上のペプチドで構成されていてもよく、１つ以上のペプチドは、同じポリペプチドであってもよく、又は異なるポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、ウイルス構造化ポリペプチドであってもよく、したがって、ＶＬＰは、ウイルス粒子に類似していてもよい。ウイルス構造化ポリペプチドは、天然に存在するウイルスポリペプチド又はその修飾ポリペプチドであり得る。ウイルスポリペプチドは、カプシド及びエンベロープタンパク質を含む、天然に存在するウイルス構造化ポリペプチドであってもよい。例えば、エンベロープタンパク質は、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、及びＥ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含んでいてもよく、並びに／又はカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、又はＶＰ４のうちの少なくとも１つであり得る。ＶＬＰを構成するウイルスタンパク質は、限定されないが、Ｃ型肝炎、アルファウイルス、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノ随伴ウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ニパ）、及びバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含む多種多様なウイルスファミリーに由来し得る。ＶＬＰは、細菌、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母及び植物細胞を含む複数の細胞培養系において産生され得る。

【0034】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを、有利には、例えば、ＡＡＶ等のウイルス及び脂質ナノ粒子又はその類似のもの、又は任意の種類の非ウイルス性送達ベクターと組み合わせたウイルス構成要素を含む、ハイブリッドベクターに組み合わせてもよい。一般に、ウイルス性送達技術及び非ウイルス性送達技術は両方とも、標的細胞に対するポリヌクレオチドの送達について、よく知られており、十分に理解されており、したがって、当業者は、ＧＭＰ製造を実施するために商業的エンティティからの契約製造サービスを活用する方法を含め、これらのベクターの製造プロセスに十分に精通している。

【0035】

所望の送達ベクターに応じて、本発明の組成物のポリヌクレオチドカーゴは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含んでいてもよく、これらは両方とも、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。例えば、組成物が、ＡＡＶウイルスの形態のウイルス性送達ベクターを利用する場合、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムのフォーマットである一本鎖ＤＮＡであることが必要であり、一方で、ウイルス性送達ベクターが、レンチウイルス等のレトロウイルスである場合、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明の組成物が、ウイルス性送達ベクターを利用している場合、操作されたＥＶのインビボでの所与の標的細胞からの産生は、ＥＶ産生細胞の本質的に安定な形質導入の結果として、長期間にわたって持続される。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、導入遺伝子の発現は、特に、非分裂組織において、数十年間続く場合がある。しかしながら、（治療用ＰＯＩを送達するための）融合タンパク質から、組成物がポリヌクレオチドを送達する細胞によって産生される操作されたＥＶへの短期間の一過性の発現及び翻訳が望ましい場合、ＬＮＰ、リポソーム、ポリマー系ベクター又はＣＰＰ等の非ウイルスベクターが好ましい場合がある。一本鎖の直鎖又は環状ｍＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）は、ＬＮＰ若しくはリポソーム系送達ベクターと組み合わせって、又はＣＰＰベクターとともに、特に有利な実施形態である。ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、より一般的に、安定性を増加させ、免疫原性を低下させ、ＰＫ／ＰＤ特性を改善するように修飾される。したがって、本発明のポリヌクレオチドカーゴは、限定されないが、直鎖ｍＲＮＡ、環状ｍＲＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ウイルスゲノム、又は上述のいずれかの修飾態様、並びに任意の他の好適なポリヌクレオチドカーゴからなる群から選択され得る。

【0036】

特定の実施形態では、送達ベクターは、ＬＮＰであり、カーゴ核酸は、ｍＲＮＡであるか、送達ベクターは、ＬＮＰであり、カーゴ核酸は、プラスミドであるか、送達ベクターは、ＶＬＰであり、カーゴ核酸は、ｍＲＮＡであるか、又は送達ベクターは、ＬＮＰであり、カーゴ核酸は、プラスミドである。

【0037】

本発明の好ましい実施形態では、組成物のポリヌクレオチドカーゴによってコードされる融合タンパク質は、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つの目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む。ＥＶポリペプチドは、本質的に、所与のＥＶ産生細胞によって産生されるＥＶへと融合タンパク質を輸送することができるアミノ酸の任意のタンパク質、領域、ドメイン、モチーフ、又は配列若しくは伸長部である。ＥＶポリペプチドという用語の一般性を限定することなく、本発明による融合タンパク質に含まれる好ましいＥＶポリペプチドは、膜貫通ＥＶポリペプチドであり得る。具体的な好ましいＥＶポリペプチドは、以下の非限定的な例からなる群から選択され得る。ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＡＡＴ、ＡＴ１Ｂ３、ＡＴ２Ｂ４、ＡＬＩＸ、アネキシン、ＢＡＳＩ、ＢＡＳＰ１、ＢＳＧ、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２、Ｌａｍｐ２ａ、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＮ１、ＴＳＮ３、ＴＳＮ４、ＴＳＮ５ ＴＳＮ６、ＴＳＮ７、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＮ３１、ＴＳＮ１０、ＴＳＮ１１、ＴＳＮ１２、ＴＳＮ１３、ＴＳＮ１４、ＴＳＮ１５、ＴＳＮ１６、ＴＳＮ１７、ＴＳＮ１８、ＴＳＮ１９、ＴＳＮ２、ＴＳＮ４、ＴＳＮ９、ＴＳＮ３２、ＴＳＮ３３、ＴＮＦＲ、ＴｆＲ１、シンデカン－１、シンデカン－２、シンデカン－３、シンデカン－４、、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２２４、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ４、インターロイキン受容体、ＣＤ２、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ５３、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＦＰＲＰ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＧＰ１３０、ＧＰＩアンカータンパク質、ＧＴＲ１、ＨＬＡＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、ＩＴＡ３、ラクトアドヘリン、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＩＭＰ２、ＭＹＯＦ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＭＡＲＣＫＳＬ１等のミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質ファミリーのメンバー、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１４（ＭＭＰ１４）、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、、ＰＲＰＨ２、ＲＯＭ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＳＥＡ４、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＦＲ１、ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、及び任意の他のＥＶポリペプチド、並びにそれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、バリアント、変異体、又は領域。その機能を変化させるために、ＥＶポリペプチドの野生型配列に、変異、先端切断、リンカー又は付加物を導入してもよく、例えば、本発明による好ましい変異体は、２３５位のチロシンをアラニンで置き換えたテトラスパニンＣＤ６３の変異である（ＣＤ６３／Ｙ２３５Ａと示される）。ＥＶタンパク質の使用は、ＥＶへの融合タンパク質のローディングを駆動する効果を有し、その結果、ＰＯＩがＥＶに位置し、その後、ＥＶ産生細胞によって分泌されるだけではなく、融合タンパク質を含むＥＶの産生も、送達されたポリヌクレオチドカーゴを発現し、翻訳するためにＥＶ産生細胞に対して及ぼされる圧力によって増加する。特に有利なＥＶポリペプチドとしては、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＬＡＭＰ２Ｂ、ＬＩＭＰ２、ＩＣＡＭ、インテグリン、ＡＲＲＤＣ１、シンデカン、シンテニン、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＴｆＲ、及びＡｌｉｘ、並びにそれらの誘導体、ドメイン、バリアント、変異体、又は領域が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝的に操作されたＥＶへの融合タンパク質のローディングを増強するために、ＥＶポリペプチドを、種々のサイトカイン受容体からの膜貫通ドメイン（例えば、ＴＮＦＲ及びｇｐ１３０）と組み合わせてもよい。

【0038】

本発明による融合タンパク質に含まれるＰＯＩは、通常、酵素、受容体、腫瘍抑制因子又は転写因子等の核酸相互作用タンパク質、又は所与の疾患の文脈における薬理学的効果を媒介することができる任意の他の適切なタンパク質等の薬理学的に活性な薬剤である。ＰＯＩは、酵素、トランスポータータンパク質、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、転写因子タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、核タンパク質、受容体タンパク質、タンパク質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、シャペロンタンパク質、翻訳調節タンパク質、転写規則タンパク質、毒素タンパク質、結合タンパク質、分子担体タンパク質、免疫系タンパク質、代謝タンパク質、シグナル伝達タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及びタンパク質結合タンパク質、又は任意の他の種類のタンパク質等の非限定的な例からなる群から選択され得る。好ましい実施形態では、ＰＯＩは、酵素、トランスポーター、シャペロン、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、腫瘍抑制剤等の核酸結合タンパク質、転写因子、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、メガヌクレアーゼ等）、リコンビナーゼ、及びタンパク質結合タンパク質からなる群から選択される療法用タンパク質である。

【0039】

本発明の融合タンパク質は、有利な実施形態では、操作されたＥＶに、インビボでの薬理学的挙動、薬物動態的挙動、又は生体内分布挙動を増強するための追加の特性を付与することを意図した様々なドメインを更に含み得る。例えば、融合タンパク質は、例えば、標的化ペプチド、一本鎖抗体誘導体（例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、アルファボディ、アフィボディ、センチリン、重鎖のみの抗体、ヒューマボディ、又はナノボディ）、又は任意の他の形態の標的化エンティティの形態で標的化ドメインを含有するように設計することができる。融合タンパク質に融合した標的化部分を有する融合タンパク質の非限定的な例は、血液脳関門上のトランスフェリン受容体を標的化するＶＨＨと、ＥＶポリペプチドＬａｍｐ２Ｂ及び所与のＰＯＩ、好ましくは、中枢神経系において薬理学的活性を有するものとの間の融合である。更に、標的化部分を使用して、ＥＶを細胞、細胞内位置、組織、器官、又は他の身体区画に標的化し得る。標的化され得る器官及び細胞型としては、脳、神経細胞、血液脳関門、筋肉組織、眼、肺、肝臓、腎臓、心臓、胃、腸、膵臓、赤血球細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞を含む白血球細胞、リンパ節、骨髄、脾臓、並びにがん細胞が挙げられる。標的化は、例えば、標的化ペプチドの使用等の様々な手段によって達成することができる。かかる標的化ペプチドは、数アミノ酸長～数百アミノ酸長のいずれかの範囲、例えば、３～２００個のアミノ酸、３～１００個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、５～２５個のアミノ酸の間隔、例えば７個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、２０個のアミノ酸等であってもよい。本発明の標的化ペプチドはまた、受容体、受容体リガンド等の全長タンパク質を含み得る。例示的な標的化部分としては、ＲＶＧ、ＮＧＦ、メラノトランスフェリン及びｓｃＦｖ ＦＣ５等の脳標的化部分が挙げられる。ペプチド及び筋肉標的化には、筋肉特異的ペプチド（ＭＳＰ）等の部分が含まれる。

【0040】

別の有利な実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質からのＰＯＩの放出を可能にするために、少なくとも１つの切断可能ドメインを更に含む。切断可能ドメインの非限定的な例としては、アミノ酸配列中にプロテアーゼ切断部位を有するドメイン、又は自己切断性であるシス切断ドメインが挙げられる。本発明による好適な放出ドメインは、インテイン等のシス切断配列、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ、ＥｏｓＦＰ、ｔｄＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓ２、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＧＦＰ様Ｄｅｎｄｒａタンパク質であるＤｅｎｄｒａ及びＤｅｎｄｒａ２、ＣＲＹ２－ＣＩＢＮ等の光誘導性の単量体又は二量体の放出ドメインであり得る。代替的に、核局在化シグナル（ＮＬＳ）－核局在化シグナル結合タンパク質（ＮＬＳＢＰ）（ＮＬＳ－ＮＬＳＢＰ）放出系を用いてもよい。プロテアーゼ切断部位もまた、融合ポリペプチドの所望の機能性に応じて、プロテアーゼトリガー性放出等のために融合タンパク質に組み込まれ得る。核酸カーゴ（例えば、ｍＲＮＡ）に結合し、これをＥＶに輸送するＰＯＩの場合には、特定の核酸切断ドメインが含まれてもよい。核酸切断ドメインの非限定的な例としては、エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、操作されたＰＵＦヌクレアーゼ、部位特異的ＲＮＡヌクレアーゼ等が挙げられる。自己切断ドメインの好ましい実施形態としては、インテイン等のシス切断ドメインが挙げられる。自己切断ドメインは、標的細胞区画、例えば、細胞質、ミトコンドリア、核、及び／又はエンドリソソーム系において可溶性である必要がある酵素と組み合わせたときに、特に有利である。かかる融合タンパク質の非限定的な例としては、ＥＶポリペプチドＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ｌａｍｐ、ＰＴＧＦＲＮ、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、自己切断インテイン、及びＰＯＩ、例えば、リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）酵素、尿素サイクル酵素、又は先天性代謝異常において破壊若しくは変異される任意の酵素（かかる酵素の非限定的な例としては、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素、カルバモイルリン酸合成酵素、オルニチントランスカルバモイラーゼ、カルバミルリン酸合成酵素、アルギノコハク酸シンターゼ、アルギノコハク酸合成酵素、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｌｙａｓｅ）（アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ）としても知られている）、アルギナーゼ、ミトコンドリアオルニチントランスポーター、オルニチントランスロカーゼ、シトリン、フェニルアラニンデヒドロキシラーゼ、シスタチオニンベータシンターゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、イミグルセラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、イデュルスルファーゼ、アリールスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、セラミダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニド－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファＮ－アセチルノイラミニダーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン１、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バッテニン、リンクリン（ｌｉｎｃｌｉｎ）、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンＫ、シアリン、及びヘキソアミニダーゼ）、並びに／又は任意の他の細胞内酵素若しくはタンパク質が挙げられる。

【0041】

更に、操作されたＥＶの循環時間及び具体的には血漿半減期を更に延長するために、融合タンパク質は、好適な血漿及び／又は血液タンパク質に結合するポリペプチドドメインを更に含み得る。これの例示的な実施形態は、細胞によって産生され、細胞外環境に分泌される操作されたＥＶが、血清アルブミン（ヒト態様であるヒト血清アルブミン）に結合するために、アルブミン結合ポリペプチドの融合タンパク質に含めることである。アルブミン結合ポリペプチド又はアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）という用語は、本明細書において互換的に使用され、アルブミンに結合することができる任意のタンパク質、ペプチド、抗体若しくはナノボディ、又はその断片若しくはドメインに関すると理解することができる。ＡＢＤは、任意の種に由来し得る。好ましくは、ＡＢＰは、ヒト血清アルブミンに対して特異的な結合親和性を有する。一般に知られているＡＢＤは、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ由来のＰＡＢタンパク質、並びにＣ群及びＧ群の連鎖球菌由来のプロテインＧに由来するアルブミン又はＡＢＤに対して上昇される抗体又はナノボディであり、これらの両方は、高い親和性でアルブミンに結合する。ＡＢＤは、例えばグラム陽性細菌によって発現されることが多い様々な表面タンパク質にみられる小さな３個の螺旋のタンパク質ドメインである。天然にみられるアルブミン結合ドメインは、異なるアルブミンに対するより広範な特異性、安定性の増加、免疫原性の低下、又は結合親和性の改善を達成するために、特異的変異誘発によって操作されてもよい。本発明の融合タンパク質に含まれるＡＢＤはまた、抗体、ｓｃＦｖ）、ナノボディ、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、ＶＨＨ若しくはＶＮＡＲ等の一本鎖ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、又はアルブミンに結合することができるこれらの断片であり得る。ｓｄＡｂ及び抗体断片は、融合タンパク質に他の追加のドメインを導入することが可能なその小さなサイズ、並びに単純な構築物設計及び発現／翻訳に起因して、特に好ましい。アルブミン結合を媒介するために、本発明によるＡＢＤは、ポリヌクレオチド内に操作され、したがって、得られる融合タンパク質は、ＥＶの表面上に存在するため、主に循環系にみられるアルブミンに結合することができる。ＡＢＤは、任意の数の方法でＥＶの表面上に提示されてもよい。ただし、ＡＢＤは、アルブミンと結合することができるようにＥＶの外側表面上に露出している。

【0042】

重要なことに、本発明の組成物は、インビボでのＥＶ産生細胞へのポリヌクレオチド構築物のウイルス性及び非ウイルス性送達を可能にし、ＰＯＩがその中に組み込まれたＥＶの産生をもたらし、したがって、最終的に様々な標的組織へのＰＯＩのＥＶ媒介性送達をもたらす。インサイチュ又は内因性の薬物送達に対するこのアプローチは、ＥＶ療法薬に対する完全に新しいアプローチを表し、操作されたＥＶに、薬理学的に活性な薬剤（ＰＯＩの形態で、又はＰＯＩがＥＶに結合し、ＥＶに輸送する薬剤の形態で）、及び対象自体のＥＶの特徴の両方を付与し、患者からのＥＶの採取を必要とすることなく、本質的に自己のＥＶ療法を可能にする。ＰＯＩを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を利用する能力は、得られた患者由来ＥＶが本質的に良好に忍容性であるだけではなく、それらはまた、優れたＰＫ／ＰＤ特性を示し、製造するためのコストが著しく低く、修飾ｍＲＮＡが、組成物中で非ウイルスベクターとともにポリヌクレオチドカーゴとして使用される場合に、例えばｍＲＮＡ療法薬に匹敵する商品コストを有することを意味する。本発明の好ましい実施形態では、組成物に含まれるポリヌクレオチドから産生される融合タンパク質を含むＥＶは、患者細胞特異的ＥＶであり、好ましくは、肝臓細胞、筋肉細胞及び／又は中枢神経系若しくは脳の細胞等の細胞型に由来する。したがって、好ましい代替物としては、限定されないが、遺伝的に操作された患者由来ＥＶが挙げられ、好ましくは、患者の肝臓細胞由来の遺伝的に操作されたＥＶ（すなわち、遺伝的に操作された患者肝臓細胞由来ＥＶ）、患者のＣＮＳ若しくは脳細胞由来のもの（すなわち、遺伝的に操作された患者ＣＮＳ又は脳細胞由来ＥＶ）、又は患者の筋肉細胞由来のもの（すなわち、遺伝的に操作された患者筋肉細胞由来ＥＶ）が挙げられる。

【0043】

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、脂質ナノ粒子である送達ベクターと、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡのいずれかであるポリヌクレオチドカーゴと、を含む。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、エピソームによって標的細胞に送達され、対応する融合タンパク質の長期発現をもたらし、融合タンパク質を含む操作されたＥＶの産生をもたらす能力のために、有利である。ポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡで構成されるｐＤＮＡである場合、ポリヌクレオチドは、分子生物学のセントラルドグマの従来のステップ、すなわち、ＤＮＡからＲＮＡへの転写、その後、種々のプロセシングステップ及びＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）から得られた融合タンパク質への翻訳を介して、対応する融合タンパク質へと変換される必要がある。明確にするために、本発明の文脈で使用される翻訳及び発現という用語（本明細書で互換的に使用される）は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写（レンチウイルス等のレトロウイルスによって実行されるような）、ＲＮＡからｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡから融合タンパク質への翻訳、及び任意の他の中間ステップ又はプロセスを含め、ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその２つの組み合わせを含み得る）をアミノ酸配列に変換するのに必要な全てのステップを含むと理解すべきである。ｐＤＮＡに加えて、融合タンパク質を翻訳し、それによって、融合タンパク質を含む操作されたＥＶを作製する持続的な能力を有する他の形態のポリヌクレオチドが存在する。そのような他の形態の長期的なポリヌクレオチドには、自己増幅ＲＮＡ、ウイルスゲノム、環状ｍＲＮＡ、エピソーム、カプシドを含まないＡＡＶゲノム、及び他の形態のポリヌクレオチド等の自己複製ポリヌクレオチドが含まれる。

【0044】

上述のように、本発明の好ましい実施形態は、ポリヌクレオチドとしての脂質ナノ粒子送達ベクター及びｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、天然に存在するか、又は天然に存在しないｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾された核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドを含み得る。ｍＲＮＡの核酸塩基は、プリン若しくはピリミジン等の有機塩基、又はその誘導体である。核酸塩基は、標準的塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、及びシトシン）、又は限定されないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／又はチオ置換を含む１つ以上の置換又は修飾、１つ以上の縮合環又は開環、酸化、及び／又は還元を含む非標準的塩基若しくは修飾された塩基であり得る。したがって、核酸塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、７－メチルグアニン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、チミン、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、ヒポキサンチン、及びキサンチンからなる非限定的な群から選択され得る。ｍＲＮＡのヌクレオシドは、糖分子（例えば、ペントース、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、又はそれらのデオキシ誘導体等の５炭素糖又は６炭素糖）を核酸塩基と組み合わせて含む化合物である。ヌクレオシドは、標準的ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５－メチルウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、及びチミジン）若しくはそれらの類似体であってもよく、又は限定されないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／又はチオ置換を含む１つ以上の置換又は修飾、１つ以上の縮合環又は開環、酸化、及び／又は核酸塩基及び／若しくは糖構成要素の還元を含んでいてもよい。ｍＲＮＡのヌクレオチドは、ヌクレオシド及びホスフェート基又は代替基（例えば、ボラノホスフェート、チオホスフェート、セレノホスフェート、ホスホネート、アルキル基、アミデート、及びグリセロール）を含有する化合物である。ヌクレオチドは、標準的ヌクレオチド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５－メチルウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、及びチミジンモノホスフェート）若しくはそれらの類似体であってもよく、又は限定されないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／又はチオ置換を含む１つ以上の置換又は修飾、１つ以上の縮合環又は開環、酸化、及び／又は核酸塩基、糖、及び／若しくはホスフェート若しくは代替構成要素の還元を含んでいてもよい。ヌクレオチドは、１種以上のホスフェート基又は代替基を含み得る。例えば、ヌクレオチドは、ヌクレオシド及びトリホスフェート基を含み得る。「ヌクレオシドトリホスフェート」（例えば、グアノシントリホスフェート、アデノシントリホスフェート、シチジントリホスフェート、及びウリジントリホスフェート）は、標準的ヌクレオシドトリホスフェート、又はその類似体若しくは誘導体を指していてもよく、本明細書に記載の１つ以上の置換又は修飾を含み得る。例えば、「グアノシントリホスフェート」は、標準的グアノシントリホスフェート、７－メチルグアノシントリホスフェート、又は本明細書に包含される任意の他の定義を含むと理解されるべきである。ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、及び／又はコード配列若しくは翻訳配列を含んでいてもよく、これらが翻訳され、本発明の融合タンパク質を作製する。ｍＲＮＡは、数十、数百、又は数千の塩基対を含む任意の数の塩基対を含み得る。任意の数（例えば、全て、いくつか、又はなし）の核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドは、標準的種、置換されたもの、修飾されたもの、又はそれ以外の天然に存在しないものの類似体であり得る。特定の実施形態では、特定の核酸塩基の種類の全てが修飾され得る。例えば、ｍＲＮＡ中の全てのシトシンは、５－メチルシトシンであり得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。キャップ構造又はキャップ種は、その５’末端でｍＲＮＡをキャップするリンカーによって連結される２つのヌクレオシド部分を含み、天然に存在するキャップ、天然に存在しないキャップ若しくはキャップ類似体、又は逆転防止キャップ類似体（ＡＲＣＡ）から選択され得る化合物である。キャップ種は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド及び／又はリンカー部分を含み得る。例えば、天然のｍＲＮＡキャップは、その５’位にあるトリホスフェート結合（例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、一般的にｍ７ＧｐｐｐＧと書かれる）によって連結する、グアニンヌクレオチド及び７位でメチル化されたグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを含み得る。キャップ種はまた、逆転防止キャップ類似体であってもよい。考えられるキャップ種の非限定的な例としては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｉｒｉ２７’０３’ＧｐｐｐＧ、ｉｒｉ２７’０３’ＧｐｐｐｐＧ、ｉｒｉ２７’０２’ＧｐｐｐｐＧ、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ、ｍ７３’ｄＧｐｐｐＧ、ｉｒｉ２７’０３’ＧｐｐｐＧ、ｉｒｉ２７’０３’ＧｐｐｐｐＧ、及びｍ２７ ０２’ＧｐｐｐｐＧが挙げられる。ｍＲＮＡは、代わりに、又は追加的に、鎖終結ヌクレオシドを含み得る。例えば、鎖終結ヌクレオシドは、それらの糖基の２’位及び／又は３’位で脱酸素化されたヌクレオシドを含み得る。このような種としては、３’－デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’－デオキシウリジン、３’－デオキシシトシン、３’－デオキシグアノシン、３’－デオキシチミン、及び２’，３’－ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’－ジデオキシアデノシン、２’，３’－ジデオキシウリジン、２’，３’－ジデオキシシトシン、２’，３’－ジデオキシグアノシン、及び２’，３’－ジデオキシチミンが挙げられ得る。ｍＲＮＡは、代わりに、又は追加的に、ヒストンステムループ等のステムループを含み得る。ステムループは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上のヌクレオチド塩基対を含み得る。例えば、ステムループは、４、５、６、７、８、９個のヌクレオチド塩基対を含み得る。ステムループは、ｍＲＮＡの任意の領域に位置していてもよい。例えば、ステムループは、非翻訳領域（５’非翻訳領域若しくは３’非翻訳領域）、コード領域、又はポリＡ配列若しくは尾部の中に、その前に、又はその後に位置してもよい。ｍＲＮＡは、代わりに、又は追加的に、ポリＡ配列及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、アデニンヌクレオチド、又はその類似体若しくは誘導体を完全に、又はほとんど含み得る。ポリＡ配列は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に隣接して位置する尾部であってもよい。本発明の修飾されたｍＲＮＡは、コード領域（融合タンパク質をコードし、コドン最適化され得る）に加えて、ステムループ、鎖終結ヌクレオシド、ｍｉＲＮＡ結合部位、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、３’及び／又は５’非翻訳領域（３’ＵＴＲ及び／若しくは５’ＵＴＲ）及び／又は５’キャップ構造のうちの１つ以上を含み得る。上述のように、様々なヌクレオチド修飾が、好ましくは、ｍＲＮＡに組み込まれ、翻訳の増加、免疫原性の低下、及び安定性の増加のために、ｍＲＮＡを修飾する。好適な修飾されたヌクレオチドとしては、限定されないが、Ｎ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）が挙げられる。これらのｍＲＮＡ修飾のうち、ｍ５Ｃ及びψは、ｍＲＮＡの免疫原性を低下させるとともにインビボでの翻訳効率を増加させるため、最も好ましい。本発明の好ましい実施形態では、本明細書の組成物は、ポリヌクレオチドカーゴとして修飾ｍＲＮＡを含むＬＮＰ又はリポソーム等の非ウイルス性送達ベクターを含み、ｍＲＮＡが、少なくとも５０％のｍ５Ｃ及び５０％のψ若しくはｍ１ψ、好ましくは少なくとも７５％のｍ５Ｃ及び７５％のψ若しくはｍ１ψ、更により好ましくは９０％のｍ５Ｃ及び９０％のψ若しくはｍ１ψ、又は更により好ましくはｍ５Ｃ及びψ若しくはｍ１ψを使用した１００％の修飾を有するように修飾される。かかる修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、（ｉ）ＥＶポリペプチド、例えば、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＰＴＧＦＲＮ、又はＬａｍｐ２、（ｉｉ）自己切断ポリペプチドドメイン、例えば、シス切断ドメイン、例えば、インテイン、及び（ｉｉｉ）先天性代謝異常から選択される疾患において欠損している酵素の形態であるＰＯＩ、例えば、ＰＡＨ、ＡＳＬ、ＡＳＳ、ＧＡＡ、ＧＬＡ等を含む融合タンパク質をコードする。別の好ましい実施形態では、構成要素（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を、（ｉｖ）操作されたＥＶの外表面に発現する標的化エンティティと更に組み合わせ、それによって、好ましい標的細胞及び／又は組織への送達を誘導することができ、（ｖ）血清アルブミンに結合するポリペプチドドメインと更に組み合わせ、ＰＯＩを含む操作されたＥＶの既に長い半減期を更に延長することができる。

【0045】

第２の態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物（すなわち、ポリヌクレオチドが発現されると、融合タンパク質の翻訳及び融合タンパク質を含むＥＶの生成を引き起こす、融合タンパク質をコードする送達ベクター及びポリヌクレオチドを含む組成物）を含む、薬学的組成物に関する。本発明の組成物は、既に薬学的目的に好適であるが、更なるステップでは、薬学的に許容される製剤に製剤化され得る。例えば、本発明の組成物は、限定されないが、生理食塩水、分散媒体、希釈剤、分散助剤、懸濁剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、保存剤、及び他の種を含む水性溶媒等の１つ以上の溶媒を含む、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は補助成分を用いて製剤化され得る。ワックス、バター、着色剤、及びコーティング剤等の賦形剤も含まれ得る。例示的な賦形剤としては、分解又は活性の喪失を低減することを意図した賦形剤、例えば、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ポリオール、例えば、グリセロール、ソルビトール及びエリスリトール、アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、グリシン、ヒスチジン及びメチオニン、ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン及びヒドロキシプロピルセルロース、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０及びプルロニックＦ６８、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びアルファ－トコフェロール（ビタミンＥ）、緩衝剤、例えば、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、金属イオン／キレート剤、例えば、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋及びＥＤＴＡ、シクロデキストリン系、例えば、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン、並びにその他、例えば、ポリアニオン及び塩、安定化剤又は増量剤、例えば、ラクトース、トレハロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、グリセロール、アルブミン、ゼラチン、マンニトール及びデキストラン、又は保存剤、例えば、ベンジルアルコール、ｍ－クレゾール、フェノール、２－フェノキシエタノールが挙げられる。組成物及び薬学的組成物という用語は、本明細書において互換的に使用され、上述の組成物のうちの１つが企図されるとき、上述の組成物のうちの他方も企図される。

【0046】

本発明の薬学的組成物は、静脈内製剤、非経口製剤、又は任意の種類の修飾放出製剤として製剤化され得ることが想定され、経口製剤（錠剤、カプセル、又は液体）も可能である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、液体形態である。投薬計画は、送達されるカーゴ、治療される疾患、及び当業者によって容易に決定されるであろう任意の追加の投与される療法に依存する。本発明の組成物は、複数回、すなわち、１回を超えるが、通常２回を超えて投与されるか、又は潜在的には慢性の長期治療のために、すなわち、慢性治療計画の一部として投与される（すなわち、数十～数百～数千回投与される）ことが想定される。投薬量は、ベクター及び／又はカーゴに依存し得るが、当業者によって容易に決定されるであろう。例示的な例としては、ＬＮＰの場合、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１～５ｍｇ／ｋｇ）の範囲、ＡＡＶの場合、１×１０^９～１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ（例えば、１×１０^１１～１×１０^１３）の範囲、及びｓａＲＮＡの場合、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１～５ｍｇ／ｋｇ）の範囲が挙げられる。

【0047】

第３の態様では、本発明は、医薬に使用するための本発明による組成物に関する。好適な製剤、投与経路、投薬量、計画等は、本明細書に開示される薬学的組成物について記載されている通りである。より具体的には、本明細書の組成物は、本質的に任意の疾患、障害、状態、又は病気、好ましくは、遺伝的疾患、遺伝性疾患（遺伝的疾患及び非遺伝的遺伝性疾患の両方を含む）、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、中枢神経系疾患、感染性疾患、及び炎症性疾患からなる群から選択されるものの治療及び／又は予防に使用するためのものであり得る。遺伝子欠陥から生じる多数の疾患、すなわち、所与のタンパク質の置き換え（遺伝子欠陥の結果として欠損しているか、又は欠陥がある）が、欠陥遺伝子によってコードされるべきであるタンパク質に対応するＰＯＩを含む融合タンパク質を送達することによって達成することができる、このような疾患は、本発明の組成物及び得られる操作されたＥＶによる治療に特に適している。そのような操作されたＥＶに基づく補充療法は、本質的にＥＶ媒介性タンパク質補充療法であるとみなすことができ、ＰＯＩを、遺伝子欠陥を有する対象（すなわち、ＰＫＵ、ＡＳＡ、ＭＭＡ、ＯＴＣ、ＮＰＣ、ポンペ病、ファブリー病、ゴーシェ病等の例えば先天性代謝異常を患う患者）の細胞によって分泌される操作されたＥＶ中に存在するＰＯＩの補助によって、細胞外環境だけではなく、細胞内（リソソームを含む）及び／又は膜環境へと送達することができるという固有の利点を有する。治療は、疾患、障害、状態、又は病気の緩和、及び／又は症状の改善を含み得る。予防は、疾患、障害、状態、又は病気の部分的又は完全な予防を含み得る。任意の成人又は小児のヒト患者集団は、治療又は予防のために考慮され得る。

【0048】

更なる実施形態では、本発明は、疾患の治療方法に使用するための本明細書の組成物であって、本方法が、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳の結果として、融合タンパク質を含むＥＶを産生し、分泌することができる標的細胞に組成物を投与することを含む、組成物に関する。上に示すように、ポリヌクレオチドから融合タンパク質への翻訳（組成物の送達のために標的細胞によって分泌される操作されたＥＶにロードされる）は、ｍＲＮＡからタンパク質への実際の翻訳の前の様々なステップ、例えば、逆転写、転写、スプライシング、及び他の形態のＲＮＡプロセシング、並びに自己複製ポリヌクレオチドカーゴの場合には、複製も含み得る。重要なことに、本発明の組成物を患者の標的細胞に投与することで、ポリヌクレオチドカーゴの翻訳の結果として、融合タンパク質を含む患者由来の操作されたＥＶを産生する患者の標的細胞をもたらし、このことはＰＯＩを有する融合タンパク質が、ＥＶ中に存在し、次いで、患者の体内で局所的に、及び／又は全身的のいずれかで分泌されることを意味している。ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの産生は、ＰＯＩ（ＰＯＩ自体又はＰＯＩが相互作用する任意の他の薬剤のいずれか）によって媒介される薬理学的活性が、本発明の組成物の標的である細胞に限定されるだけでなく、ＥＶの天然の送達能力が、問題のＰＯＩの送達のために利用されることを意味する。重要なことに、ポリヌクレオチドの発現から産生される融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶは、エクスビボ（すなわち、インビトロ）で産生されるＥＶと比較して、かなり延長された循環半減期を有する。このことは、患者由来ＥＶの相同性の性質の結果であると推測されるが、患者の体内でインサイチュで産生され、分泌されたときに、遺伝的に操作された患者由来ＥＶを覆い、及び／又はそれと会合すると予測される宿主因子の別個のコロナにも関連している可能性が高い。エクスビボで製造された遺伝的に操作されたＥＶは、この重要な属性を欠いており、したがって、インビボで異なる有利ではない生体内分布／薬物動態プロファイルを示す。

【0049】

重要なことに、商品コスト（ＣＯＧ）の観点から、本発明による治療方法は、インビトロでの遺伝的に操作されたＥＶの製造をスケールアップする必要はなく、適切な送達ベクターにおいて適切なポリヌクレオチドカーゴ分子の規制対応（すなわち、ＧＭＰ）製造のみ、例えば、脂質ナノ粒子にロードされた修飾ｍＲＮＡの製造を必要とする。このことは、ＣＯＧが、従来のＥＶ製造の場合と比べて、低く保たれる可能性があることを意味しており、また、組成物の繰り返し投与が、薬理学的及び薬学的に有利であるだけではなく、技術的及び商業的に実現可能であることも意味する。所望のＰＫ／ＰＤアウトカムに応じて、繰り返し投与は、同じ標的器官中の同じ標的細胞に対するものであってもよく、又は他の標的器官中の他の標的細胞に焦点を当てるものであってもよい。

【0050】

ＰＯＩの薬理学的（すなわち、治療）活性が、ＥＶ送達によって媒介されるため、有意なＥＶ産生を、好ましくは長期間にわたって刺激することが重要である。特定の標的器官は、高いＥＶ産生をもたらすため、好ましい。有利な実施形態では、本発明の組成物は、肝臓、脾臓、肺、筋肉組織、中枢神経系の組織、骨髄、及び／又は好ましくは長時間にわたってＥＶを高速で分泌することができる任意の他の組織等の標的器官に対して、疾患の治療方法の一部として送達される。肝臓、特に、肝臓の肝細胞及び／又はマクロファージ（例えば、クッパー細胞）が、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶの全身循環への分泌のための「インサイチュバイオリアクター」として機能し、それによって、例えば、遺伝的疾患（例えば、尿素サイクル障害、リソソーム蓄積障害、又は他の先天性代謝異常）のための操作されたＥＶ媒介性タンパク質補充療法の形態での全身薬理活性を媒介することができるため、肝臓は、本発明の組成物にとって好ましい標的器官である。

【0051】

別の態様では、本発明は、本発明の組成物を製造する方法に関する。この製造する方法は、典型的には、（ｉ）適切なポリヌクレオチドカーゴを提供するステップと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドカーゴを、選択される送達ベクターに組み込むステップと、を含む。上述のように、特定の組成物、特に、ＬＮＰ又はリポソーム等の脂質ベースの送達ベクターに組み込まれる修飾ｍＲＮＡが好ましい。ｍＲＮＡ含有組成物を製造するための方法は、（ｉ）好適なヌクレオチド修飾を有するインビトロ転写（ＩＶＴ）されたｍＲＮＡポリヌクレオチドカーゴ、及び高い翻訳を補助するためのポリヌクレオチドの適切な構成要素（例えば、ＵＴＲ、５’キャップ、ポリ（Ａ）テール等の上に詳細に記載するもの）を提供するステップと、（ｉｉ）ＬＮＰ、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、又は脂質エマルション等の好適な脂質ベースの送達ベクター中でＩＶＴ ｍＲＮＡポリヌクレオチドカーゴを製剤化するステップと、を含み得る。当業者は、例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチドの長さ、修飾パターン、二次構造、及び標的細胞型等の因子に応じて使用する最適なＬＮＰ製剤をよく知っている。

【0052】

なお別の態様では、本発明は、哺乳動物細胞においてＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶを産生する方法であって、本方法が、哺乳動物細胞を本明細書に記載の組成物と接触させた状態にすることを含み、哺乳動物細胞が、ポリヌクレオチドカーゴを対応する融合タンパク質へと翻訳することができ、融合タンパク質を含む哺乳動物細胞由来ＥＶの産生をもたらす、方法に関する。上述のように、哺乳動物細胞は、哺乳動物の身体の任意の細胞、例えば、肝細胞又は肝臓マクロファージ（例えば、クッパー細胞）等の肝臓細胞であり得る。肝臓以外の器官における様々な他の細胞及び細胞型はまた、本発明の遺伝的に操作されたＥＶを産生する方法にとって重要である、「インサイチュバイオリアクター」として機能し得る。他の細胞型としては、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、星状細胞、グリア細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、及び本質的に哺乳動物（例えば、ヒト）の身体の任意の細胞が挙げられる。

【0053】

更なる態様では、本発明は、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生する方法であって、本方法が、患者の細胞に、本発明による組成物を投与するステップを含み、それによって、患者の細胞が、患者由来ＥＶを産生する（すなわち、エクスビボ産生以外のＥＶのインビボ産生）、方法に関する。好適な製剤、投与経路、投薬量、計画等は、本明細書に開示される薬学的組成物について記載されている通りである。したがって、患者由来ＥＶは、遺伝的に修飾された患者由来ＥＶである。これらの患者由来ＥＶは、順にＰＯＩ（これも患者に対して異種であり得る）を含む翻訳された融合タンパク質への設計されたポリヌクレオチドの発現から生じるという事実の結果として、患者に対して異種である。上述のように、患者細胞は、任意の細胞、好ましくは、肝細胞又は肝臓マクロファージ（例えば、クッパー細胞）等の肝臓細胞であり得る。肝臓以外の器官における様々な他の細胞及び細胞型はまた、本発明の患者に由来する遺伝的に操作されたＥＶを産生する方法にとって重要である、「インサイチュバイオリアクター」として機能し得る。他の細胞型としては、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、星状細胞、グリア細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞、上皮細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、及び本質的に患者の身体の任意の細胞が挙げられる。したがって、更なる実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶであって、患者由来ＥＶが上述の方法によって製造されるものに関する。本発明は更に、医薬に使用するための、より具体的には、遺伝的疾患、遺伝性疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、及び炎症性疾患、並びにこれらの患者由来ＥＶが薬理学的効果を発揮し得る任意の他の疾患からなる非限定的な群から選択される疾患の治療及び／又は予防に使用するためのこのような遺伝的に操作された患者由来ＥＶに関する。

【0054】

別の態様では、本発明は、患者の標的細胞、標的器官若しくは器官系、標的区画、又は標的組織にＰＯＩを送達する方法に関する。ＰＯＩを送達する方法は、患者の細胞（多くの場合、プロデューサー細胞と呼ばれる）に、本発明による組成物を投与するステップを含み、それによって、患者のプロデューサー細胞は、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生し、患者由来ＥＶは、ＰＯＩを標的細胞に送達する。好適な製剤、投与経路、投薬量、計画等は、本明細書に開示される薬学的組成物について記載されている通りである。プロデューサー細胞による遺伝的に操作された患者由来ＥＶのインビボ産生は、ＰＯＩを含む患者特異的な（すなわち、自己の）操作されたＥＶをもたらし、次いで、患者由来の遺伝的に操作されたＥＶの標的である細胞に送達される。所与の標的細胞に対する患者由来ＥＶの標的化は、所与の細胞型への固有の標的化の結果であってもよく、かつ／又は遺伝的に操作されたＥＶに対する標的化部分の導入の結果であってもよく、これは、通常、ＰＯＩも含む融合タンパク質に標的化ポリペプチドを含ませることによって行われる。活性な操作された標的化の一例は、肝臓細胞に対するポリヌクレオチドを含む本発明の組成物の送達の結果として肝臓細胞において翻訳される、融合タンパク質への脳を標的とするポリペプチドの導入、その後の薬理学的効果を発揮するための融合タンパク質及びＰＯＩを含む遺伝的に操作されたＥＶの産生であり得る。ＰＯＩが送達される標的細胞は、プロデューサー細胞型と同じ細胞型、又は異なる細胞型であってよい。本発明の標的細胞としては、限定されないが、肝臓の細胞、脳細胞を含む中枢神経系細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、筋肉細胞、腎臓細胞、膵臓の細胞、心臓の細胞、肺細胞、骨髄由来細胞、又は任意の他の細胞型が挙げられる。同様に、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む遺伝的に操作された患者由来ＥＶを産生するためのプロデューサー細胞は、本質的に哺乳動物の体内の任意の細胞であってもよく、例えば、肝臓の細胞、脳細胞を含む中枢神経系細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、筋肉細胞、腎臓細胞、心臓の細胞、膵臓の細胞、肺細胞、骨髄由来細胞、又は任意の他の細胞型であってもよい。上述のように、本発明の好ましい実施形態は、（ｉ）ｍＲＮＡ、環状ｍＲＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ドギーボーンＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）、ＤＮＡプラスミド、直鎖ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ウイルスゲノム、又は上述のいずれかの修飾態様から選択されるポリヌクレオチドカーゴと、（ｉｉ）脂質系ベクターである非ウイルス性送達ベクターと、を含む組成物であって、これらの非ウイルス性送達組成物が、プロデューサー細胞からのＥＶの分泌を介する、標的細胞にＰＯＩを送達するための方法の文脈でも好ましい、組成物に関する。上述のように、本発明のいくつかの実施形態では、非ウイルス性送達ベクターは、例えば、脂質系ベクター、ポリマー系ベクター、ペプチド系ベクター、又はベクターの任意の他の活性形態から選択される必要はないが、上述の非ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドカーゴを標的細胞に送達することにより、ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質を保有する操作された自己患者由来ＥＶへのポリヌクレオチド構築物の発現がもたらされる限り、任意の薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩水溶液又は類似物から選択することができる。

【0055】

いくつかの好ましい実施形態では、１つより多いポリヌクレオチド、例えば、１つより多いｍＲＮＡ（すなわち、異なるタンパク質をコードする２つ以上のｍＲＮＡ）、又は１つのｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ及び１つのｐＤＮＡポリヌクレオチドが、本発明による組成物に含まれる。単に生理学的及び薬学的に許容される担体に基づく送達ベクターを含む、非ウイルス性送達ベクターは、このような組み合わせポリヌクレオチド療法のための好ましい送達ベクターである。薬物カーゴ（例えば、酵素又は膜貫通タンパク質等）をその後にコードするｍＲＮＡに対して結合するＰＯＩを含む融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶをインビボで産生する能力は、比較的低い商品コストで、自己の長く続く安全なアプローチを介して、目的の組織に対する上述のｍＲＮＡ薬物カーゴのＥＶ媒介性送達に対する高度に洗練されたアプローチである。

【0056】

別の態様では、本発明は、疾患、障害又は状態を治療及び／又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、上述の方法が、本発明の組成物を対象に投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、方法に関する。任意の疾患、障害、又は状態が、治療及び／又は予防に好適な標的として企図される。治療は、疾患、障害若しくは状態の緩和、及び／又は症状の改善を含み得る。予防は、疾患、障害若しくは状態の部分的又は完全な予防を含み得る。任意の成人又は小児のヒト患者集団は、上に定義した任意の投与経路又は投薬計画を介して、本発明の方法による治療又は予防のために考慮され得る。好適な製剤、投与経路、投薬量、計画等は、本明細書に開示される薬学的組成物について記載されている通りである。

【0057】

更なる態様では、本発明は、欠陥遺伝子から生じる遺伝的疾患、障害又は状態を治療する方法に関する。遺伝子欠陥は、変異、欠失、先端切断、重複、染色体損傷、欠失又は重複を含む多くの形態をとっていてもよく、遺伝子欠陥は、単一遺伝子性又は多遺伝子性であり得る。単一遺伝子性欠陥は、本発明の患者由来の遺伝的に操作されたＰＯＩを保有するＥＶによる治療に特に適している。遺伝子欠陥から生じる疾患を治療するための方法は、対象に、本発明による組成物を投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への発現／翻訳は、ＰＯＩを含む少なくとも１つの細胞外小胞（ＥＶ）の産生をもたらし、ＰＯＩは、対象の欠陥遺伝子に対応するタンパク質である。好適な製剤、投与経路、投薬量、計画等は、本明細書に開示される薬学的組成物について記載されている通りである。非限定的な例として、本発明の組成物は、自己切断インテインを介して酵素ＰＡＨの形態でＰＯＩに融合するＥＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）という疾患に罹患する患者にこの組成物を投与すると、ＰＡＨ含有融合タンパク質の翻訳、及びＰＡＨ酵素がロードされる遺伝的に操作された患者由来ＥＶの産生がもたらされるだろう。患者由来ＥＶは、例えば、患者の肝細胞等の肝臓細胞によって産生することができ、肝臓由来ＰＡＨ含有ＥＶが分泌され、次いで、活性なＰＡＨ酵素を他の肝臓細胞及び身体の他の細胞にも送達する。インテインは、ＥＶポリペプチドとＰＯＩ（例えば、ＰＡＨ酵素等のようなもの）との間に挿入されると、ＰＯＩの放出を引き起こし、酵素がＥＶ及び／又は標的細胞に遊離の可溶性形態で存在することを確実にする、自己切断ポリペプチドである。

【0058】

したがって、本発明の複数の実施形態では、ＰＯＩは、細胞内酵素若しくはリソソーム酵素、又は任意の他の形態のタンパク質、例えば、膜結合タンパク質若しくは膜貫通タンパク質であり得る。上述のように、ＰＯＩは、自己切断ポリペプチド、例えば、インテイン又は他のシス切断ポリペプチドを介してＥＶポリペプチドに有利に連結される。本発明の方法は、様々な遺伝的疾患の治療に非常に適しており、単一遺伝子性疾患は、本発明の方法に基づく治療に特に適している。遺伝的疾患、障害又は状態は、特に、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、リソソーム蓄積障害、神経筋疾患、又は神経変性疾患から選択され得るが、本質的に、単一遺伝性又は多遺伝性のいずれの遺伝的疾患であってもよい。重要なことに、本発明は、ＥＶ産生細胞の独創的な操作を介して、天然の薬物送達ビヒクルとして全身的に生体利用可能な患者由来ＥＶを分泌する、ＰＯＩを含む操作された（すなわち、修飾された）患者由来ＥＶ産物の作製による、これらの疾患の治療に対する新しいアプローチを可能にする。

【0059】

別の態様では、本発明は、遺伝的に操作された患者由来ＥＶであって、上述のＥＶが、ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質を含む、遺伝的に操作された患者由来ＥＶに関する。上述のように、患者由来のインビボ産生された遺伝的に操作されたＥＶは、エクスビボで製造された遺伝的に操作されたＥＶと比較して、異なる生体内分布プロファイルを有するだけではなく、これらのＰＯＩを含む患者由来の遺伝的に操作されたＥＶが、本質的に患者の体内で製造されるため、製造のＣＯＧは有意に低く、ＰＯＩを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物の送達の補助によって、患者の体内で局所的及び／又は全身的に分泌される融合タンパク質及びＰＯＩを含む操作されたＥＶをもたらす。本発明の好ましい実施形態では、遺伝的に操作された患者由来ＥＶは、患者の変異、欠失、下方調節、又は他の方法で欠損した遺伝子によってコードされるタンパク質に対応するＰＯＩを含む。このことは、操作された患者由来ＥＶが、標的組織に欠損／血管タンパク質を送達する操作されたＥＶに基づく自己タンパク質補充療法を本質的に形成することを意味する。一般に、ＰＯＩは、本質的に、例えば、酵素、トランスポーター、シャペロン、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及びタンパク質結合タンパク質、並びに所与の疾患の文脈で薬理学的効果を媒介することができる任意の他のタンパク質からなる非限定的な群から選択される、任意の目的のタンパク質であってもよい。本発明の融合タンパク質は、典型的には、患者に対して異種であり、すなわち、それらは、患者のゲノムによって天然ではコードされない。これは、ＰＯＩを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドカーゴを作製するために適用される遺伝子操作戦略の結果である。一例として、テトラスパニンＥＶポリペプチド（テトラスパニンは、この融合タンパク質が、任意の哺乳動物系に天然で存在しないため、本発明の目的にとって好ましい種類のＥＶポリペプチドである）と、所与の酵素（例えば、酵素ＰＡＨ又は尿素サイクル酵素）との間の融合タンパク質は、全てのヒトを含む全ての哺乳動物に対して本質的に異種である。更に、ＰＯＩは、それ自体が患者にとって異種である場合があり、これは、ＰＯＩが遺伝子疾患の文脈でタンパク質補充療法として機能することを意図している疾患において、当てはまる場合がある。変異又は欠失又は同様のものから生じる遺伝的疾患を患う患者は、身体の細胞内に野生型タンパク質を全く有していない可能性があり、このことは、これらの場合に、患者に対して異種である融合タンパク質に加えて、ＰＯＩも、患者にとって異種であることを意味している。

【0060】

非常に驚くべきことに、本願発明者らは、本発明による遺伝的に操作された患者由来ＥＶが、エクスビボ産生された遺伝的に操作されたＥＶと比較して（エクスビボ産生された患者由来の遺伝的に操作されたＥＶと比較した場合であっても）、循環中でかなり長い半減期を有することを発見した。この驚くべき技術的効果は、ＥＶが患者の体内でインビボで（インサイチュとも呼ばれる）産生されることと組み合わせて、ＥＶが患者特異的（自己）であるという事実に応じたものである可能性が高く、例えば血管を介して全身循環に入るとすぐに、患者に特異的なコロナが、遺伝的に操作されたＥＶと会合すると推測される。非常に驚くべきことに、遺伝的に操作された対象由来ＥＶの集団の対象における血漿半減期は、通常は１２時間よりも長く、これは、対応するインビトロ製造されたＥＶの半減期の少なくとも１０倍であり、好ましくは５０倍の長さ、好ましくは１００倍の長さ、好ましくは２００倍の長さ、更により好ましくは３００倍の長さ、更になお好ましくは５００倍の長さである。したがって、本発明の実施形態では、遺伝的に操作された患者由来ＥＶは、２時間より長く、好ましくは６時間より長く、更により好ましくは２４時間より長く、更により好ましくは４８時間より長い血漿半減期を有する。患者由来インサイチュＥＶの血漿半減期は、少なくとも約１２、１８、２４、４８、３６、７２、１００、１５０、２００、２５０、３００、又はそれより長い時間、例えば、約５～１０時間、約１０～１５時間、約５～２０時間、約２４～４８時間、約２４～７２時間、約１２～７２時間、約１２～１００時間、約１２～２００時間、又は約１２～３００時間であり得る。遺伝的に操作された患者由来ＥＶの血漿半減期は、融合タンパク質の存在について、及び／又はＰＯＩの存在について（例えば、採血によって）血漿をアッセイすることによって容易に測定することができる。ｅＧＦＰ及びルシフェラーゼ等のレポータータンパク質をＰＯＩとして使用して、遺伝的に操作された患者由来ＥＶの循環時間及び半減期をアッセイし、決定することを容易にすることができる。

【0061】

上述のように、これらのインサイチュで産生された患者由来ＥＶは、患者の細胞において、ＰＯＩ及びＥＶポリペプチドを両方とも含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させる／翻訳することによって、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含むように遺伝的に操作され、ＰＯＩを含むＥＶの細胞による産生がもたらされる。ＥＶポリペプチドは、本発明の組成物が送達されるＥＶ産生細胞において形成されるＥＶへとＰＯＩを「ロードする」、すなわち、輸送するために使用され得る任意のポリペプチドから本質的に選択され得る。ＥＶポリペプチドの非限定的な例としては、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＡＡＴ、ＡＴ１Ｂ３、ＡＴ２Ｂ４、ＡＬＩＸ、アネキシン、ＢＡＳＩ、ＢＡＳＰ１、ＢＳＧ、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２、Ｌａｍｐ２ａ、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＮ１、ＴＳＮ３、ＴＳＮ４、ＴＳＮ５ ＴＳＮ６、ＴＳＮ７、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＮ３１、ＴＳＮ１０、ＴＳＮ１１、ＴＳＮ１２、ＴＳＮ１３、ＴＳＮ１４、ＴＳＮ１５、ＴＳＮ１６、ＴＳＮ１７、ＴＳＮ１８、ＴＳＮ１９、ＴＳＮ２、ＴＳＮ４、ＴＳＮ９、ＴＳＮ３２、ＴＳＮ３３、ＴＮＦＲ、ＴｆＲ１、シンデカン－１、シンデカン－２、シンデカン－３、シンデカン－４、、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２２４、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ＣＬＩＣ１、ＣＬＩＣ４、インターロイキン受容体、ＣＤ２、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ５３、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＦＰＲＰ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＧＰ１３０、ＧＰＩアンカータンパク質、ＧＴＲ１、ＨＬＡＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、ＩＴＡ３、ラクトアドヘリン、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＩＭＰ２、ＭＹＯＦ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＭＡＲＣＫＳＬ１等のミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質ファミリーのメンバー、マトリックスメタロプロテイナーゼ－１４（ＭＭＰ１４）、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＲＰＨ２、ＲＯＭ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＳＥＡ４、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＦＲ１、ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、及び任意の他のＥＶポリペプチド、並びにそれらの任意の組み合わせ、誘導体、ドメイン、バリアント、変異体、又は領域が挙げられる。

【0062】

本発明は、ＥＶポリペプチドに関連するような有意なモジュール性及び任意選択性を可能にするだけではなく、多くの種類のタンパク質を、本発明の文脈においてＰＯＩとして使用することができる。好適なＰＯＩの非限定的な例としては、酵素、トランスポーター、シャペロン、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及びタンパク質結合タンパク質、並びに薬理学的効果自体を媒介することができるか、又は薬理学的効果を媒介する別の薬剤に結合することができる本質的に任意の他のタンパク質が挙げられる。例えば、ＰＯＩは、所与のＲＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）に結合し、ＲＮＡカーゴを遺伝的に操作された患者由来ＥＶを輸送するＲＮＡ結合タンパク質であり得る。ＰＯＩを使用することによって、インサイチュで産生された遺伝的に操作されたＥＶに追加の薬理学的に活性なカーゴ生体分子を組み込む能力は、多数の応用を可能にする。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドを介してＰＯＩを含む融合タンパク質のＥＶローディングを可能にし、第２のポリヌクレオチドを介して、ＰＯＩによって結合する別のタンパク質のＥＶローディングを可能にし、したがって、インビボでＥＶ産生細胞によって産生されるＥＶにロードされるために、１つより多いポリヌクレオチドカーゴを本明細書の組成物に組み込むことができ、第３及び更なるポリヌクレオチドを介して、追加のカーゴ分子がＥＶにロードされてもよい。有利な一実施形態では、本発明の組成物に含まれるポリヌクレオチドカーゴは、ＰＯＩ（その後はＲＮＡ結合タンパク質である）を含む融合タンパク質と、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ分子との両方をコードする。ＰＯＩがＲＮＡ結合タンパク質であることは、このＲＮＡ結合タンパク質が、所与のＲＮＡ分子上の特定の配列、例えば、ｍＲＮＡのＵＴＲに結合するように設計され得ることを意味する。このモジュール式操作アプローチは、インサイチュで産生された患者由来の操作されたＥＶが、そのＰＯＩを利用して、所与のｍＲＮＡカーゴに結合し、身体内の標的組織へのｍＲＮＡのＥＶ媒介性輸送を可能にすることを意味している。上の実施例と同様に、ＰＯＩ及びＲＮＡ薬物分子（すなわち、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）は、ＰＯＩの形態でのタンパク質、及び例えばｍＲＮＡの形態でのＲＮＡ分子の両方をコードすることができる単一ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡプラスミド、又はポリヌクレオチドの任意の他の形態によってコードされ得る。更に、バイシストロン及び他の形態のマルチシストロンポリヌクレオチドを利用して、１つより多いＰＯＩをコードしてもよく、例えば、その後に問題の薬物を形成する別のタンパク質に結合するＰＯＩをコードしてもよい。

【0063】

ＥＶポリペプチド及びＰＯＩに加えて、上述のように、追加のポリペプチドドメインは、有利には、例えば、（ｉ）細胞型特異的標的化を媒介するための標的化ポリペプチド、（ｉｉ）血清アルブミンに結合することによって、更になお延長された血漿半減期を可能にするための血清アルブミン結合ドメイン、（ｉｉｉ）融合タンパク質からＰＯＩを放出するような、シス切断ポリペプチド（例えば、インテイン）等の放出ポリペプチド、（ｉｖ）核酸由来分子の種々の形態の結合のための核酸結合ドメイン等に対して、融合タンパク質に含まれ得る。上述のように、本質的に任意の細胞型は、本明細書に記載の組成物のポリヌクレオチドの翻訳の結果として、遺伝的に操作された患者由来ＥＶを産生することができるが、特定の細胞は、ＥＶ収率の観点から特に生産的である。肝臓は、かなりの量のＥＶを分泌する代謝的に活性な器官であり、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む操作された患者由来ＥＶの産生のための効率的な「インサイチュ」（互換的に「インビボ」と呼ばれる）バイオリアクターとして使用することができる。本発明のための特定の有用性を有する肝臓細胞としては、肝細胞及び肝臓マクロファージが挙げられる。

【0064】

本発明による遺伝的に操作された患者由来ＥＶは、医薬に使用するための重要な有用性を有する。より詳細には、遺伝的に操作された患者由来ＥＶは、遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、及び炎症性疾患、並びに好適なＰＯＩが薬理学的効果を発揮し得る任意の他の疾患からなる非限定的な群から選択される疾患の治療に使用するためのものであり得る。本発明の患者由来ＥＶが有利に適用され得る疾患の非限定的な例としては、以下の例が挙げられる。クローン病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン－１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギラン・バレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、腎不全、心不全、又は任意の急性若しくは慢性器官不全及び関連する基礎病因、移植片対宿主病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー及び他の筋ジストロフィー、炭水化物代謝障害を含む先天性代謝異常、例えば、Ｇ６ＰＤ欠損症ガラクトース血症、遺伝性フルクトース不耐症、フルクトース１，６－ジホスファターゼ欠損症及び糖原病、有機酸代謝異常症（有機酸尿症）、例えばアルカプトン尿症、２－ヒドロキシグルタル酸尿症、メチルマロン酸若しくはプロピオン酸血症、多発性カルボキシラーゼ欠損症、アミノ酸代謝異常症、例えばフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型、アミノ酸症、例えば遺伝性チロシン血症、非ケトーシス型高グリシン血症、及びホモシスチン尿症、遺伝性チロシン血症、ファンコーニ症候群、原発性乳酸アシドーシス、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びチシトクロムオキシダーゼ欠損症、脂肪酸酸化障害及びミトコンドリア代謝障害、例えば短鎖、中鎖、及び長鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症（ベータ酸化欠損症としても知られる）、ライ症候群、中鎖アシル－コエンザイムＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤＤ）、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＲＦＦ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、急性間欠性ポルフィリン症等のポルフィリン代謝障害、レッシュ・ナイハン症候群等のプリン又はピリミジン代謝障害、先天性リポイド過形成症等のステロイド代謝障害、先天性副腎過形成症、カーンズ・セイヤー症候群等のミトコンドリア機能障害、ツェルベルガー症候群及び新生児性副腎白質ジストロフィー等のペルオキシゾーム機能障害、先天性副腎過形成症又はスミス・レムリ・オピッツ、メンケス症候群、新生児ヘモクロマトーシス症、尿素サイクル異常症、例えばＮ－アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、シトルリン血症（アルギニノコハク酸合成酵素欠損症）、アルギニノコハク酸尿症（アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症）、アルギニン血症（アルギナーゼ欠損症）、高オルニチン血症、高アンモニア血症、ホモシトルリン尿症（ＨＨＨ）症候群（ミトコンドリアオルニチントランスポーター欠損症）、シトルリン血症ＩＩ（シトリン欠損症、アスパラギン酸・グルタミン酸トランスポーター）、リジン尿性タンパク質不耐症（ｙ＋Ｌアミノ酸トランスポーター１の変異、オロト酸尿症（酵素ウリジン一リン酸合成酵素の欠損症、ＵＭＰＳ）、全てのリソソーム蓄積症、例えば、アルファ－マンノース症、ベータ－マンノース症、アスパチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシド蓄積症、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシドーシスＩＩＩ型、ＧＭ２－サンドホフ病、ＧＭ２－テイ－サックス病、ＧＭ２－ガングリオシドーシス、ＡＢバリアント、ムコリピドーシスＩＩ型、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ Ｉ－ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ－シェイ症候群、ＭＰＳ Ｉ－ヒューラー－シェイ症候群、ＭＰＳ ＩＩ－ハンター症候群、ＭＰＳ ＩＩＩＡ－サンフィリポ症候群Ａ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｂ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｃ型、ＭＰＳ ＩＩＩＢ－サンフィリポ症候群Ｄ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＡ型、ＭＰＳ ＩＶ－モルキオＢ型、ＭＰＳ ＩＸ－ヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ ＶＩ－マロトー－ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩ－スライ症候群、ムコリピドーシスＩ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、ムコ多糖症、マルチプルスルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、神経セロイドリポフスチン症Ｔ９、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１０、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ポンペ病、濃化異骨症、サラ病、シンドラー病及びウォルマン病等、嚢胞性線維症、原発性線毛機能不全症、肺胞タンパク症、ＡＲＣ症候群、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＧＢＡ関連パーキンソン病、ハンチントン病及び他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含む神経変性疾患、プリオン病、前頭側頭型認知症を含む認知症、ＡＬＳ、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、がん悪液質、食欲不振、２型糖尿病、肢帯型２Ａ、肢帯型２Ｄ、脊髄性筋萎縮症呼吸窮迫症Ｉ型（ＳＭＡＲＤ１）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、並びに各種がん。事実上全ての種類のがん、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん腫、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、小脳若しくは大脳、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳がん、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、消化管）、原発不明がん腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、又は卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（脳幹の神経膠腫、大脳星状細胞腫、視経路及び視床下部神経膠腫）、胃カルチノイド、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞がん腫（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、咽頭がん（Ｌａｒｙｎｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ）、白血病（（急性リンパ芽球性（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ球性（慢性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、ヘアリー細胞白血病））、口唇口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん（原発性）、肺がん（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン、髄芽腫、メルケル細胞がん、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、口腔がん（ｍｏｕｔｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん腫、神経芽細胞腫、口腔がん（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表面上皮－間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、膵島細胞がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん（腎臓がん）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫、黒色腫）、小腸がん、扁平上皮がん、頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、精巣がん、咽頭がん（Ｔｈｒｏａｔ ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、並びに／又はウィルムス腫瘍が、本発明について関連性のある疾患標的である。

【0065】

本発明の別の態様では、上述のように、患者由来の遺伝的に操作されたＥＶは、対象（例えば、患者）に組成物を投与することを含む方法によって製造されてもよく、ポリヌクレオチドカーゴ（組成物に含まれる）の対応する融合タンパク質への発現／翻訳は、後でＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来の遺伝的に操作されたＥＶの集団の産生をもたらす。重要なことに、ウイルス性又は非ウイルス性のナノ粒子送達方法を使用してポリヌクレオチド送達のための組成物を設計し、製造する能力は、ＣＯＧを低下させつつ、操作されるＥＶのモジュール性及び汎用性を利用して、操作されたＥＶの循環半減期を延長させ、先天的又は適応的免疫原性又はインビトロで製造されたＥＶ療法薬に関連する任意の他の安全性懸念のリスクを最小化するか、又は完全に除外することを可能にする。

【0066】

当業者は、本明細書に記載されるように、本発明に従って特定の実施形態と同等の日常的な実験を超えない実験を使用して認識するか、又は確認することができるであろう。本発明の範囲は、上述の説明によって限定されることを意図するものではなく、以下の実施例及び実験によって限定されることを意図するものではない。本発明及びその種々の態様、実施形態、代替案、選択肢、及び変形例は、ここで、本明細書に含まれる非限定的な実施例を用いて更に例示及び説明され、これらの実施例は、本発明の範囲及び要旨から逸脱することなく、日常的な実験を超えない実験を使用して、大きく修正され得る。

【0067】

実施例１：インサイチュで産生された遺伝的に操作された療法的ＥＶは、大腸炎のマウスモデルにおいて、長期的な薬理学的／治療効果を提供する
ＥＶポリペプチド（この実験では、種々のテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）が陽性の結果で試験され、データはＣＤ６３について示される）とともに融合タンパク質に含まれるＰＯＩとしてＴＮＦＲデコイを含むように操作されたＥＶの治療効果を試験するために、これらのＥＶがインビボ（インサイチュ）で産生される場合に、大腸炎のマウスモデルを使用した。ＴＮＢＳ誘発性大腸炎は、ＩＢＤ患者にみられるサイトカイン急増、下痢、体重減少、及び胃腸の炎症をシミュレートする、よく理解されたＢａｌｂ／Ｃマウスモデルである。産生されたＥＶは、大腸炎モデルにおいて炎症を弱めるシグナル伝達不能なＴＮＦ受容体を発現するように設計され、遺伝的に操作された。

【0068】

図２は、ＴＮＦＲデコイを送達する２つの異なる方法の比較を示す。第１に、マウスの肝臓細胞（肝臓マクロファージ及び肝細胞の両方の組み合わせであると推測される）を形質転換するためのプラスミド含有薬物送達組成物の非ウイルス性投与により、第２に、ＴＮＦＲデコイを含むように操作されたＥＶの静脈内投与による。上述のように、プラスミドＤＮＡポリヌクレオチドカーゴから発現される融合タンパク質は、テトラスパニンの形態のＥＶポリペプチドを、ＰＯＩとしてのＴＮＦ受容体と融合させることに基づいていた。

【0069】

治療群は、次の通りであった。
ａ）ポリヌクレオチドカーゴとしてのプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達であって、ｐＤＮＡが、ＥＶポリペプチドに融合したシグナル伝達不能なＴＮＦ受容体（ＰＯＩとしてのＴＮＦデコイ）を含むもの（データはＣＤ６３について示される）。
ｂ）同じＴＮＦＲデコイ融合タンパク質を含むインビトロ産生されたＥＶのＩＶ注射。
ｃ）ポリヌクレオチドカーゴとしてのプラスミドＤＮＡの非ウイルス性送達であって、ｐＤＮＡ構築物が、ＰＯＩをコードしないが、単にＥＶポリペプチドをコードするもの（データはＣＤ６３について示される）（陰性対照として）。
ｄ）融合タンパク質中の目的のＴＮＦＲタンパク質を欠く、インビトロ産生されたＥＶのＩＶ注射（陰性対照として）。

【0070】

図２は、ｐＤＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の非ウイルス性投与によるＴＮＦＲの送達が、ＰＯＩを含む融合タンパク質を保有する自己の遺伝的に操作されたＥＶの産生をもたらし、ＰＯＩが、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎に対する長期的な保護を特異的に付与し、エクスビボで製造され、ＩＶ投与を介して全身的に投与された操作されたＥＶを上回ることを示す。操作されたＥＶの治療は、繰り返し投薬を必要とし、依然としてインサイチュで産生された自己の操作されたＥＶと同じ薬理学的効果を達成しないが、一方で、ポリヌクレオチドカーゴとしてＴＮＦＲ－ＣＤ６３プラスミドを含む組成物の単回の非ウイルス性投与は、初期治療及びチャレンジ治療から９日後であっても、治療的に有効であり、第２の大腸炎の誘導と同時に送達されたエクスビボで製造されたＥＶと比較して、改善された治療効果を提供することに留意することは重要である。

【0071】

実施例２：肝臓においてインサイチュで産生された操作されたＥＶが、広範囲にわたる器官及び血漿において検出可能であることを示す生体内分布実験。
肝臓細胞由来の操作されたＥＶ産生の概念実証として、ＮＭＲＩマウスに、流体力学的注入（ＨＩ）によって、ヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ ｐＤＮＡ又はＮａｎｏＬｕｃのみのｐＤＮＡを注射した。ＨＩ投与は、プラスミドＤＮＡポリヌクレオチドを、肝臓に、具体的には肝細胞に送達し、肝臓細胞において、融合タンパク質ＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ又はＮａｎｏＬｕｃのみを産生する。次いで、ＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ ｐＤＮＡポリヌクレオチドで形質転換されたマウスは、ＥＶポリペプチド（融合タンパク質を自己生成したＥＶに輸送する）の補助によって、ヒトＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ融合タンパク質を含む自己の操作されたＥＶを産生する。ＮａｎｏＬｕｃのみのプラスミドポリヌクレオチドカーゴで形質転換されたマウスの肝臓は、ＮａｎｏＬｕｃのみを発現し、それらの肝臓細胞によって産生されたＥＶ内に能動的にロードされる。

【0072】

４８時間後に器官／血漿を採取し、これを分析して、異なる器官に存在するＮａｎｏＬｕｃの相対発光単位（ＲＬＵ）を決定した。図３は、組織中のＲＬＵ／肝臓中のＲＬＵを示し、インサイチュで操作されたＥＶの産生を支える脳、筋肉及び血漿等の組織への肝臓からの明確な分布シフトを示しており、融合タンパク質を含むＥＶが、肝臓細胞によって産生され、放出され、次いで他の器官によって取り込まれることを示している。

【0073】

血漿中のヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ ＥＶの存在は、インサイチュでの産生及び放出を確認するものであり、生成されたＥＶが、血漿中で少なくとも４８時間持続したことを示しており、このことは、それらの半減期が、エクスビボで製造されたＥＶの血漿半減期よりも有意に長いことを意味している。ヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド（シュードウリジン（ψ）及び５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）修飾を有する）のＬＮＰ（具体的にはＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）媒介性送達により、同様のデータが得られ、同様の生体内分布プロファイルが観察され、インビトロで製造された操作されたＥＶと比較して、肝臓細胞由来の操作されたＥＶの半減期が延長された。

【0074】

実施例３：（ｉ）ヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃを含むマウスでインサイチュ産生されたＥＶ、及び（ｉｉ）対応するインビトロ製造されたＥＶの時間経過に伴うマウス血漿における酵素活性のレベルの比較
インサイチュの自己産生された操作されたＥＶに対する、ＩＶ注射による操作されたＥＶの半減期を調べるために、ＮＭＲＩマウスに、ＥＶ融合タンパク質をコードするベクター及びポリヌクレオチドカーゴを含む組成物をＩＶ注射したか、又はＥＶ融合タンパク質をコードするベクター及びポリヌクレオチドカーゴを含む組成物の非ウイルス性送達法（この場合には、ｍＲＮＡ及びｐＤＮＡのＨＩのＬＮＰ媒介性送達）を介してインサイチュで産生させた。血漿を、フローサイトメトリー分析のために様々な時点で採取し、循環中の操作されたＥＶの量を決定した。血漿中の操作されたＥＶの存在を、ＡＰＣで標識された抗ヒト汎テトラスパニン抗体を使用してフローサイトメトリーによってアッセイした。

【0075】

第１の実験では、１０＾１１個の標識されていないＨＥＫ２９３ ＥＶをマウスにＩＶ注射し、次いで１０～６０分目に安楽死させ、血漿を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。図４は、ＩＶ注射された標識されていないヒトＥＶを、１０分後にマウス血漿において検出することができ、そのレベルが、バックグラウンドよりも十分に高いことを示す。しかしながら、６０分目の時点までに、ＥＶは、細胞に急速に取り込まれ、既に血漿中のより低レベルの検出に近づいている。

【0076】

第２の実験では、ヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃポリヌクレオチドの非ウイルス性投与を、ＮａｎｏＬｕｃのみの場合と比較した。図４はまた、インサイチュで産生された自己の遺伝的に操作されたヒトＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ ＥＶが、４８時間後でさえ、血漿中に豊富に存在したことを示している。この２つの実験を比較すると、インサイチュで産生されたＥＶに対し、エクスビボで製造されたＥＶのＩＶ注射におけるＡＰＣ＋事象／ｕＬは、４８時間後のインビボで操作されたマウスにおけるＥＶのレベルが、エクスビボで製造されたＥＶの注射から１０分後よりも高かったことを示すことがわかるだろう。この効果は、様々な送達方法を用いて４回繰り返して観察された。

【0077】

実施例４：アルブミン結合ポリペプチドが、インサイチュ産生された操作されたＥＶの半減期に対して及ぼす効果
アルブミン（通常、融合タンパク質の形態で）の存在は、注射された生物学的製剤薬物の循環時間を増加させることができることが知られている。本願発明者らの一人はまた、ＥＶアルブミン結合ポリペプチド（多くの場合、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）と呼ばれる）の表面上の操作によって、アルブミンをＥＶの外表面に接続させることによってその半減期を増加させることができるアプローチを以前に発明し、特許を取得した。ＡＢＤ操作されたＥＶの半減期の延長及び生体内分布の変化は、ＥＶが、ＥＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＯＩ、及びその後に自己の産生された遺伝的に操作されたＥＶの外側に配置されたＡＢＤドメインを含む組成物の非ウイルス性又はウイルス性の送達の後に、インサイチュで産生されたときにもみられると予測された。この戦略を試験するために、ヒトＣＤ６３－ＡＢＤ－ＮａｎｏＬｕｃ、ＣＤ６３－ＮａｎｏＬｕｃ、又はＮａｎｏＬｕｃプラスミドのみをコードするｐＤＮＡを含む組成物の送達の非ウイルス性方法（ＨＩ及びＬＮＰ媒介性送達）をマウスで試験した。組成物の投与の７２時間後に、ＮａｎｏＬｕｃレベルをアッセイし、分析した。

【0078】

図５は、ＣＤ６３－ＡＢＤ融合タンパク質を含む自己の遺伝的に操作されたＥＶのインサイチュでの産生が、両方のＣＤ６３構築物による組織分布の改善をもたらしたが、構築物中にＡＢＤドメインが存在すると、脾臓における取り込みが少なくなり、より重要なことに、血漿においてかなり高いＥＶレベルが生じることを示しており、このことは、構築物中にＡＢＤが存在すると、インサイチュで産生された操作されたＥＶの血漿半減期を増加させることを意味している。７２時間目に検出されたＡＢＤ ＥＶのほぼ１００％が、依然として循環中にあった。このことは、ＡＢＤが、血漿濃度を大きく増加させ、それによって、インサイチュで産生されたＥＶの循環時間を有意に増加させることによって、ＥＶの両方の生体内分布を変化させるのに有益であることを示す。この発見は、肝外疾患、例えば、操作されたＥＶが所与の薬物カーゴ（例えば、ＰＯＩ、又はＰＯＩが結合することができ、薬理学的効果を発揮することができる任意の他の薬剤）を組織関門（例えば、血液脳関門）を通って送達することが必要な疾患及び状態の治療に特に有用である。しかしながら、循環時間の増加は、任意の器官に対する標的化送達にとって重要であり、インサイチュでの操作されたＥＶの産生と組み合わせてＡＢＤを組み込むことによって肝臓クリアランスを低下させる能力は、変革的なアプローチを表す。

【0079】

実施例５：追加の送達方法による種々のポリヌクレオチド酸カーゴの送達
流体力学的注射及びＬＮＰによるｍＲＮＡ／ｐＤＮＡ送達によって送達されるプラスミドが、インビボで肝臓細胞を形質転換して、強力かつ長く続く治療効果を有する治療用の操作されたＥＶを産生することができたという発見に続き、カーゴとのポリプレックスを形成するためのウイルスベクター送達（例えば、ＡＡＶ若しくはレンチウイルス）、又は他の脂質系送達ベクター（例えば、他のＬＮＰ、リピドイド、又はリポソーム））、又はタンパク質／ペプチド系送達ビヒクル（例えば、ＣＰＰ）等の他の送達機構を用いて、プラスミド又は任意の他の種類のポリヌクレオチドカーゴ（ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、裸のＡＡＶゲノム等を含む）を送達することもできると仮定された。また、広範囲にわたる異なるポリヌクレオチドカーゴの送達が、肝臓だけではなく、他の器官にも可能であると考えられ、その結果、他のＥＶ産生細胞型の中で、インサイチュでの産生が、脳又は中枢神経系、筋肉細胞、又は免疫系細胞等の器官から可能である。

【0080】

ａ）ＬＮＰによるｍＲＮＡ送達
上述のように、ＬＮＰ媒介性ｍＲＮＡ送達は、ｍＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質を含む遺伝的に操作されたＥＶを効率的に産生することが示されている。ｍＲＮＡの送達を徹底的に最適化するために、修飾ｍＲＮＡの多数の態様を合成し（例えば、ｍＲＮＡ供給業者ＴｒｉＬｉｎｋによって）、脂質ナノ粒子へと製剤化し得る。以下の修飾ｍＲＮＡ構築物を、例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、シュードウリジン（ψ）、及び／又はＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を使用した様々な程度の修飾により合成してもよい。
●ＮａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ
●ヒトＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ ｍＲＮＡ
●ヒトＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ－ＡＢＤ ｍＲＮＡ
●マウスＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ ｍＲＮＡ
●マウスＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ－ＡＢＤ ｍＲＮＡ

【0081】

次いで、これらのｍＲＮＡ構築物を、脂質ベースの非ウイルス性送達ベクター（例えば、ＤｌｉｎＤＭＡ、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、ｃＫＫＥ１２、５Ａ２－ＳＣ８、又は７Ｃ１）へと製剤化し、マウス及び非ヒト霊長類において試験することができる。修飾ｍＲＮＡと非ウイルス性の脂質ベースの送達ベクターとを組み合わせた、最適化された組成物は、ＥＶポリペプチド及びＰＯＩ融合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドカーゴの送達及び翻訳の増強をもたらすことができ、得られる自己の操作されたＥＶの分泌は、時間経過に伴って更に高く、より持続する（すなわち、例えば、実施例２～４にみられる、更により好ましいＰＫ／ＰＤプロファイル）という仮説が成り立つ。

【0082】

ｂ）ＣＰＰによるＣＮＳへのｍＲＮＡ送達
細胞透過ペプチドによってＣＮＳに送達されるｍＲＮＡの局所送達の有効性を試験するために、修飾ｍＲＮＡを合成し（例えば、ｍＲＮＡ供給業者ＴｒｉＬｉｎｋによって）、ＣＰＰ送達ビヒクル（Ｐｅｐｆｅｃｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＴＰ１０、トランスポータン、ペンテトラチン、Ｔａｔ、又は他のＣＰＰを含む）と一緒に製剤化し得る。以下の修飾ｍＲＮＡ構築物を、例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、シュードウリジン（ψ）、及び／又はＮ１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）を使用した様々な程度の修飾により合成してもよい。
●ＮａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ
●ヒトＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ ｍＲＮＡ
●ヒトＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ－ＡＢＤ ｍＲＮＡ

【0083】

脳を含む中枢神経系等の特定の器官へのＣＰＰによるｍＲＮＡの送達が、実施例２～４において持続的なＥＶ産生のためにプラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡを肝臓に送達することが示されている非ウイルス性送達方法と同じ方法で、インサイチュで長く続く操作されたＥＶの産生がもたらされるという仮説が成り立つ。ｍＲＮＡ（又は本発明による任意の他のポリヌクレオチドカーゴ）の局所送達の利点は、アクセスすることが困難な器官（例えば、脳）への単回送達が、脳の場合には血液脳関門による保護を介する等、その他の方法では循環する薬物によるアクセスから保護され得るか、又は除外され得る部位／器官で、ｍＲＮＡ又は他のポリヌクレオチドからインサイチュで治療用の操作されたＥＶを産生することを可能にすることである。このことは、目的の器官（例えば、脳）への単回注射が、ＢＢＢによる保護に起因して通常可能であるよりもはるかに高いレベルの融合タンパク質を保有する産生された操作されたＥＶが標的細胞によって取り込まれることを可能にするだけではなく、目的の器官によって、薬物（すなわち、ＰＯＩ、又はＰＯＩが相互作用する任意の他の薬物）を保有するインサイチュで産生されたＥＶの持続的な送達を確実にすることを意味する。

【0084】

ｃ）ＥＶをコードするポリヌクレオチドの送達のためのウイルス性送達ベクター
ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質をコードする一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを、ウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスに組み込んでもよい。次いで、このウイルス性「ＥＶ遺伝子療法」アプローチ（例えば、有利には、レンチウイルス又は上で言及した肝臓向性ＡＡＶ血清型を使用する肝臓指向性遺伝子療法に焦点を当てて適用されてもよく、又はＣＮＳ向性ＡＡＶ血清型を利用することによってＣＮＳに焦点を当ててもよい）を使用して動物モデルを治療して、実施例２～４の非ウイルス性投与の代わりに、ポリヌクレオチドカーゴを送達して、肝臓、ＣＮＳ、又は更に筋肉細胞（又は適切なウイルスベクターによって標的化され得る任意の器官中の任意の他の細胞型）を形質転換し、様々な種類のペイロードを保有し、改善された半減期を示す、自己の操作されたＥＶ療法薬を産生することができることを示し得る。

【0085】

実施例６：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によるｍＲＮＡの送達後のインサイチュ産生されたエキソソームのインビボ生体内分布。
上の実施例に詳細に示されるように、流体力学的注射によるプラスミドＤＮＡの送達の成功に続いて、本願発明者らは、必要とされる融合タンパク質をコードする代替核酸カーゴを送達し、代替ビヒクルによってこのような核酸を追加的に送達するときに、この効果を達成することができるかを確認したいと考えた。

【0086】

脂質ナノ粒子によるｍＲＮＡの送達は、ＨＩによって送達されるプラスミドＤＮＡと同等に効果的であり得るという仮説が成り立った。この理論を試験するために、本願発明者らは、ヒトＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ、ヒトＣＤ６３－ｌｕｃ、マウスＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ、マウスＣＤ６３－ｌｕｃ、又はｌｕｃのみをコードするｍＲＮＡが、脂質混合物（リン脂質、イオン化可能脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質）及びｍＲＮＡを、ナノ流体デバイスを介して通過させることによって、ＬＮＰに封入する実験を設計した。その理論の実現可能性を証明するために、マウスを、ｍＲＮＡを封入したＬＮＰの静脈内投与によって治療した（１ｍｇ／ｋｇ、１群当たり５匹のマウス）。次いで、送達されたｍＲＮＡから翻訳されたｎａｎｏｌｕｃルシフェラーゼの生体内分布を、エクスビボルシフェラーゼアッセイによって７２時間後に分析した。簡潔に述べると、採取した組織を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩを使用して、ＰＢＳ中の１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に溶解させた。次いで、組織溶解物を、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１：１０に希釈し、１０μｌの組織溶解物を、提供された緩衝液（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ）で１：５０に希釈した３０μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ基質とともに、白色９６ウェルプレートに加えた。

【0087】

図６のデータは、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡ（ヒトＣＤ６３－ｌｕｃ、ヒトＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ又はｌｕｃのみをコードする）の送達後のインサイチュで産生されたＥＶの生体内分布を示す。この図は、ｍＲＮＡの送達（及び以前の実験によるプラスミド送達）によって、インサイチュでのエキソソームの産生が可能であることを示し、更に、ｍＲＮＡであるか、又はプラスミドであるかにかかわらず、インサイチュでの構築物の送達が、ＬＮＰへの封入によって、広範囲にわたる異なる器官型に対して可能であることを示す。

【0088】

器官及び血漿中のＮａｎｏＬｕｃの存在は、融合タンパク質を含むＥＶのインサイチュでの産生及び放出を確認するものであった。このことはまた、生成されたＥＶが、血漿中で少なくとも７２時間持続したことを示し、このことは、その半減期が、エクスビボで製造されたＥＶの血漿半減期よりも有意に長いことを意味している。更に、このことは、ＣＤ６３－ＡＢＤ融合タンパク質を含む自己の遺伝的に操作されたＥＶのインサイチュでの産生が、両方のＣＤ６３構築物による組織分布の改善をもたらし、構築物中にＡＢＤドメインが存在すると、血漿においてかなり高いＥＶレベルが生じることを示しており、このことは、構築物中にＡＢＤが存在すると、インサイチュで産生された操作されたＥＶの血漿半減期を増加させることを意味している。このことは、ＡＢＤが、血漿濃度を大きく増加させ、それによって、インサイチュで産生されたＥＶの循環時間を有意に増加させることによって、ＥＶの両方の生体内分布を変化させるのに有益であることを示す。ここでも再び、この発見は、肝外疾患、例えば、操作されたＥＶが所与の薬物カーゴ（例えば、ＰＯＩ、又はＰＯＩが結合することができ、薬理学的効果を発揮することができる任意の他の薬剤）を組織関門（例えば、血液脳関門）を通って送達することが必要な疾患及び状態の治療に特に有用である。

【0089】

実施例７：ＬＮＰによるｍＲＮＡ送達後に産生されるインサイチュで操作されたＥＶの半減期に対するアルブミン結合ポリペプチドの効果
インサイチュで構築物をコードするｍＲＮＡの送達が、７２時間以上の長い血漿半減期を有するインサイチュで産生されたＥＶをもたらしたことを示す図６のデータに続いて、本願発明者らは、より詳細な動態を試験するための時間経過実験を使用して、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）をインサイチュで構築物に組み込むことによって、図５（実施例４）でみられるものと同様の結果を達成することができるかどうかを調べたいと考えた。

【0090】

ＡＢＤドメインが、インサイチュでＥＶの血漿半減期をここでも再び増加させるかどうかを試験するために、ヒトＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ、ヒトＣＤ６３－ｌｕｃ、マウスＣＤ６３－ＡＢＤ－ｌｕｃ、マウスＣＤ６３－ｌｕｃ、又はｎａｎｏｌｕｃのみをコードするｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（１ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ投与によってマウスを処置した（１群当たりＮ＝５）。ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡは、脂質混合物（リン脂質、イオン化可能脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質）及びｍＲＮＡを、ナノ流体デバイスを介して通過させることによって調製した。次いで、翻訳された構築物のルシフェラーゼレベルを、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に血漿において分析した。簡潔に述べると、採取した組織を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩを使用して、ＰＢＳ中の１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に溶解させた。次いで、組織溶解物を、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１：１０に希釈し、１０μｌの組織溶解物を、提供された緩衝液（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ）で１：５０に希釈した３０μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ基質とともに、白色９６ウェルプレートに加えた。

【0091】

発現動態の結果を図７に示す。図７は、ＣＤ６３－ＡＢＤ融合タンパク質を含む自己の遺伝的に操作されたＥＶのインサイチュでの産生が、血漿におけるこれらのＥＶの保持の改善をもたらし、以前の所見を裏付けるものであることを示す。このことは、図５及び６に示すデータと同様に、構築物中のＡＢＤの存在が、インサイチュで産生された操作されたＥＶの血漿内半減期を増加させたことを示す。この発見は、肝外疾患、例えば、操作されたＥＶが所与の薬物カーゴ（例えば、ＰＯＩ、又はＰＯＩが結合することができ、薬理学的効果を発揮することができる任意の他の薬剤）を組織関門（例えば、血液脳関門）を通って送達することが必要な疾患及び状態の治療に特に有用である。しかしながら、循環時間の増加は、任意の器官に対する標的化送達にとって重要であり、インサイチュでの操作されたＥＶの産生と組み合わせてＡＢＤを組み込むことによって肝臓クリアランスを低下させる能力は、変革的なアプローチを表す。

【0092】

実施例８：精製されたＥＶに対する、インサイチュの血漿薬物動態の比較
ｍＲＮＡの送達後に産生されるＥＶのインサイチュでの血漿薬物動態を更に調べるために、精製されたＥＶに対し、インサイチュの薬物動態を比較する実験を行った。簡潔に述べると、マウスに、ヒトＣＤ６３－ｌｕｃ（２ｍｇ／ｋｇ）をコードするｍＲＮＡを封入したＬＮＰ、又は１×１０^１１のヒトＣＤ６３－ｌｕｃ操作されたＨＥＫ２９３Ｔ ＥＶを封入したＬＮＰのいずれかを注射した。動物を異なる時点で採血し、血漿をルシフェラーゼアッセイによって分析して、ＥＶレベルを決定した。

【0093】

図８は、ＥＶが、ａ）インサイチュで構築物をコードするｍＲＮＡの送達後のインサイチュ（インビボ）産生によって産生されたか、又はｂ）精製されたＥＶがエクスビボで産生され（細胞培養物から産生され）、次いで、ＩＶ注射によって投与されたときに、ＣＤ６３－Ｎａｎｏｌｕｃ構築物を発現するＥＶの血漿薬物動態の比較を示す。

【0094】

インサイチュで産生されたＥＶに対して、エクスビボで製造されたＥＶの結果を比較することによって、インビボで操作されたマウスにおけるＥＶのレベルが、エクスビボで製造されたＥＶが送達された場合よりも一貫して高いことがわかるだろう。この効果は、２４時間の時間経過に伴って、より顕著になる。

【0095】

実施例９：代替ＥＶポリペプチドを含む融合タンパク質の試験
次いで、本願発明者らは、様々な代替ＥＶタンパク質を試験して、どのＥＶタンパク質が、インサイチュの文脈で使用するのに最良の足場であるかを調査した。以下の構築物を試験した。
ＴｆＲ ＶＨＨ ＩＬ６ＳＴ ＡＢＤ ＦＤＮ ＴＦＲ Ｎｌｕｃ
ＴｆＲ ＶＨＨ ＩＬ６ＳＴ ＡＢＤ ＦＤＮ ＮＳＴ ＴＦＲ Ｎｌｕｃ
ＴｆＲ ＶＨＨ ＩＬ６ＳＴ ＡＢＤ ＬＺ ＴＦＲ Ｎｌｕｃ
ＴｆＲ ＶＨＨ ＡＢＤ ＰＴＧＦＲＮ Ｎｌｕｃ
（ＴｆＲ ＶＨＨ＝トランスフェリン受容体を標的化するＶＨＨ、ＩＬ６ＳＴ＝インターロイキン６シグナル伝達物質、ＦＤＮ＝フォールドオンドメイン、ＮＳＴ＝Ｎ末端シンテニン、ＴＦＲ＝トランスフェリン受容体、ＡＢＤ＝アルブミン結合ドメイン、ＬＺ＝ロイシンジッパー、ＰＴＧＦＲＮ＝プロスタグランジンＦ２受容体阻害剤、Ｎｌｕｃ＝ｎａｎｏｌｕｃルシフェラーゼ）

【0096】

およそ２ｍｌ（体重の８％）の生理食塩水中の上述の構築物をコードする５０μｇのｐＤＮＡを、マウスに静脈内投与した（Ｎ＝５）。次いで、インサイチュで産生されたＥＶに組み込まれたｎａｎｏｌｕｃルシフェラーゼの生体内分布を、７２時間目に血漿及び組織溶解物において分析した。図９のデータは、上述の構築物をコードするｐＤＮＡの送達後のインサイチュで産生されたＥＶの生体内分布を示す。簡潔に述べると、採取した組織を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩを使用して、ＰＢＳ中の１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００に溶解させた。次いで、組織溶解物を、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１：１０に希釈し、１０μｌの組織溶解物を、提供された緩衝液（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ）で１：５０に希釈した３０μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ基質とともに、白色９６ウェルプレートに加えた。

【0097】

器官及び血漿中のＮａｎｏＬｕｃの存在は、異なる融合タンパク質を含むＥＶのインサイチュでの産生及び放出を確認するものである。このことはまた、生成されたＥＶが、血漿中で少なくとも７２時間持続したことを示す。重要なことに、この図は、インサイチュでのエキソソームの産生が、いくつかの異なるＥＶタンパク質を使用して、様々な異なる構築物によって達成されることを示しており、この現象が、広範囲にわたる異なるＥＶタンパク質によって共有されることを示している。

【0098】

実施例１０：大腸炎の治療のための治療用タンパク質のインサイチュＥＶ送達。
実施例１に示されるＥＶのインサイチュによる治療用送達の成功に続き、本願発明者らは、代替のインサイチュで産生されたＥＶが治療用タンパク質を送達して疾患を治療する能力を試験したいと考えた。

【0099】

大腸炎のＴＮＢＳ誘導性マウスモデル（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ｕｎｉｔ １５．１９）を使用した。このモデルは、ＩＢＤ患者にみられるサイトカイン急増、下痢、体重減少、及び胃腸の炎症をシミュレートする、よく理解されたＢａｌｂ／Ｃマウスモデルである。

【0100】

ＶＳＶＧ－インテイン－スーパーレプレッサーｉｋＢａ（ＶＳＶＧ＝水疱性口内炎ウイルスＧ、ｉｋＢａ＝Ｂ細胞阻害剤アルファにおけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子）は、ＮＦｋＢを調整し、炎症を緩和することが知られている。スーパーレプレッサーｉｋＢａ（治療用ＰＯＩ）に融合したＥＶタンパク質としてＣＤ６３又はＶＳＶＧを含む構築物を、自己切断インテインを用いて生成し、ＰＯＩが可溶性形態で放出可能であるようにした。

【0101】

およそ２ｍｌ（体重の８％）の生理食塩水中の構築物（ＣＤ６３－インテイン－スーパーレプレッサー及びＶＳＶＧ－インテイン－スーパーレプレッサー）をコードする５０μｇのｐＤＮＡを、マウスにＩＶ注射した（Ｎ＝９）。２４時間後、動物は、ＴＮＢＳ大腸炎を誘導された。その次の５日間、動物の体重を毎日測定し、スコア付けした。結果を図１０に提供し、ｐＤＮＡポリヌクレオチドを含む組成物の非ウイルス性投与によるスーパーレプレッサーの送達が、スーパーレプレッサーを含む融合タンパク質を保有する自己の遺伝的に操作されたＥＶの産生をもたらし、スーパーレプレッサーが、対照治療に対して、ＴＮＢＳ誘導性大腸炎に対する長期間の保護を付与する治療効果を有していたことを示す。

【0102】

実施例１１：インサイチュで産生されたＥＶは、大腸炎モデルにおいて炎症性サイトカインレベルを低減する
実施例１０に記載した実験の後に、本願発明者らは、次いで、実施例１０と同じ構築物（ＣＤ６３－インテイン－スーパーレプレッサー及びＶＳＶＧ－インテイン－スーパーレプレッサー）で治療した同じ大腸炎モデルを使用して、マウスにおける炎症誘発性サイトカインのレベルを試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に（Ｎ＝９）、マウス当たり３０μｌのＴＮＢＳ＋４２．１μｌの９５％エタノール＋２７．９μｌのＨ_２Ｏの直腸内投与によって、ＴＮＢＳ大腸炎を誘導した。１３種類の異なる炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－２３、ＩＬ－１アルファ、ＩＮＦ－Ｇ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦ－Ｂ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２７、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＩＬ－１ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＭＣＰ－１及びＩＬ－１２ｐ７０）の血漿レベルを、５日目のｐ．ｄ．ｉ．で測定した。図１１から、ほぼ全ての炎症誘発性サイトカインのレベルが、インサイチュ産生された、操作されたＥＶによる治療によって低下し、ここでも再び、これらの患者が産生したＥＶが、疾患モデルにおいて有益な治療効果を発揮することができることを示すことがわかるだろう。

【0103】

実施形態
１．融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドカーゴを含む送達ベクターを含む組成物であって、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を含む上述の融合タンパク質を含む少なくとも１つの細胞外小胞（ＥＶ）の産生をもたらす、組成物。
２．送達ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、ポリマー又は薬学的に許容される担体である、実施形態１に記載の組成物。
３．ポリヌクレオチドカーゴが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、環状ｍＲＮＡ、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（登録商標）ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（登録商標））、直鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直鎖ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、ウイルスゲノム、又は上述のいずれかの修飾態様、又は任意の他のポリヌクレオチドカーゴである、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の組成物。
４．融合タンパク質が、少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の組成物。
５．融合タンパク質を含むＥＶが、患者由来ＥＶ、好ましくは肝臓細胞由来ＥＶ、脳細胞由来ＥＶ、又は筋肉細胞由来ＥＶである、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の組成物。
６．融合タンパク質が、少なくとも１つの標的化ドメイン、少なくとも１つのエンドソーム脱出ドメイン、少なくとも１つの切断可能ドメイン、少なくとも１つの自己切断ドメイン、血漿タンパク質に結合可能な少なくとも１つのドメイン、及び／又は少なくとも１つのリンカーを更に含む、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の組成物。
７．送達ベクターが、脂質ナノ粒子であり、ポリヌクレオチドカーゴが、ｍＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡである、先行実施形態のうちのいずれか１つに記載の組成物。
８．ｍＲＮＡが、酵素であるＰＯＩに連結されたＥＶポリペプチドを含む融合タンパク質をコードし、任意選択的に、融合タンパク質が、自己切断ドメイン及び／又は血漿タンパク質に結合するドメインを更に含む、実施形態３～７のうちのいずれか１つに記載の組成物。
９．薬学的に許容される製剤に製剤化された、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物を含む、薬学的組成物。
１０．医薬に使用するための、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物。
１１．遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物。
１２．治療の方法に使用するための、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物であって、本方法が、組成物を患者の標的細胞に投与するステップを含み、それによって、患者の標的細胞が、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳の結果として、融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生する、組成物又は薬学的組成物。
１３．実施形態１２に記載の治療の方法に使用するための、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物であって、標的細胞が、肝臓、脾臓、肺、筋肉組織、腎臓、膵臓、胃腸系の細胞、脳、骨髄、腫瘍組織、免疫系細胞を含む中枢神経系の組織の細胞、及び／又はＥＶを分泌可能な任意の他の組織の細胞である、組成物又は薬学的組成物。
１４．少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶを産生する方法であって、本方法が、患者の細胞に、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物を投与するステップを含み、それによって、患者の細胞が、上述の患者由来ＥＶを産生する、方法。
１５．少なくとも１つのＥＶポリペプチド及び少なくとも１つのＰＯＩを含む融合タンパク質を含む患者由来ＥＶであって、上述の患者由来ＥＶが、実施形態１４の方法によって製造される、患者由来ＥＶ。
１６．ＰＯＩを、タンパク質系の薬物カーゴ及び／又はＲＮＡ系の薬物カーゴと相互作用させ、これらをＥＶに輸送する、実施形態１４～１５のうちのいずれか１つに記載の患者由来ＥＶ。
１７．医薬に使用するための、実施形態１４～１６のうちのいずれか１つに記載の患者由来ＥＶ。
１８．遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、実施形態１４～１７のうちのいずれか１つに記載の患者由来ＥＶ。
１９．疾患、障害又は状態を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、上述の方法が、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、ＰＯＩを含む融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらす、方法。
２０．欠陥遺伝子から生じる遺伝的疾患、障害又は状態を治療する方法であって、上述の方法が、実施形態１～８のうちのいずれか１つに記載の組成物、又は実施形態９に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ポリヌクレオチドカーゴの対応する融合タンパク質への翻訳が、融合タンパク質を含む少なくとも１つのＥＶの産生をもたらし、融合タンパク質のＰＯＩが、対象の欠陥遺伝子に対応するタンパク質である、方法。
２１．ＰＯＩが、細胞内若しくはリソソーム酵素、又は膜タンパク質である、実施形態２０に記載の方法。
２２．ＰＯＩが、自己切断ポリペプチドを介してＥＶポリペプチドに連結する、実施形態２０～２１のうちのいずれか１つに記載の方法。
２３．遺伝的疾患、障害又は状態が、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、リソソーム蓄積障害、神経筋疾患、又は神経変性疾患である、実施形態２０～２１のうちのいずれか１つに記載の方法。
２４．上述のＥＶが、ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質を含む、遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
２５．ＰＯＩが、患者の変異した遺伝子、欠失した遺伝子、下方調節された遺伝子、又はその他の欠陥遺伝子によってコードされるタンパク質に対応する、実施形態２４に記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
２６．ＰＯＩが、酵素、トランスポーター、シャペロン、膜貫通タンパク質、構造化タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、及びタンパク質結合タンパク質からなる群から選択される、実施形態２４～２５のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
２７．融合タンパク質及び／又はＰＯＩが、患者に対して異種である、実施形態２４～２６のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
２８．遺伝的に操作された患者由来ＥＶの集団の患者における血漿半減期が、２時間を超える、好ましくは６時間を超える、更により好ましくは２４時間を超える、実施形態２４～２７のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
２９．血漿半減期が、融合タンパク質の存在及び／又はＰＯＩの存在について血漿をアッセイすることによって測定される、実施形態２４～２８のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
３０．患者由来ＥＶが、患者の細胞において、ＥＶポリペプチド及びＰＯＩを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを翻訳することによって、融合タンパク質を含むように遺伝的に操作される、実施形態２４～２９のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
３１．患者由来ＥＶが、患者肝臓細胞由来ＥＶである、実施形態２４～３０のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
３２．医薬に使用するための、実施形態２４～３１のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。
３３．遺伝的疾患、リソソーム蓄積障害、先天性代謝異常、尿素サイクル障害、神経筋疾患、神経変性疾患、中枢神経系疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、心血管疾患、がん、感染性疾患、自己免疫疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、実施形態２４～３２のうちのいずれか１つに記載の遺伝的に操作された患者由来ＥＶ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】