特表 2023-545668 拡散構造を有する３Ｄ細胞培養基体を含有する培養容器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-31

(54)【発明の名称】拡散構造を有する３Ｄ細胞培養基体を含有する培養容器

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20231024BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20231024BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023519861

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2023-05-26

(86)【国際出願番号】 US2021052546

(87)【国際公開番号】W WO2022072421

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】63/085,701

(32)【優先日】2020-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】397068274

【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100175042

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 秀明

(72)【発明者】

【氏名】リー，フォン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン，グレゴリー ロジャー

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC02

4B029GB09

4B029GB10

4B029HA10

4B065AA90X

4B065BC41

4B065BC46

4B065CA43

4B065CA44

(57)【要約】

細胞培養装置は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレートを含む。複数の足場が、マルチウェル細胞培養プレートのウェル内に配置され、各足場は細胞接着表面を有する。いくつかの実施の形態において、足場は繊維足場から作られる。いくつかの実施の形態において、足場は、人工血管足場から作られる。いくつかの実施の形態において、細胞培養装置は、マルチウェル細胞培養プレート内に配置された複数のヒドロゲル足場を含み、その複数のヒドロゲル足場は、異なる長さのヒドロゲル繊維から作られ、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部がマルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養装置において、
各ウェルが上部、半球形状を有する底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート、および
前記マルチウェル細胞培養プレートの前記複数のウェル内に配置された複数の足場であって、少なくとも１つの足場が、該足場の一方の端部が各ウェルの底部分に固定されるように各ウェル内に配置される、複数の足場、
を含み、
各足場が細胞接着表面を備える、細胞培養装置。

【請求項2】

前記底部が複数のマイクロキャビティを含み、該複数のマイクロキャビティの底部分に足場が固定される、請求項１記載の装置。

【請求項3】

前記足場が、約１００μｍから約１０００μｍの範囲の平均長さおよび約１０μｍから約１００μｍの範囲の平均幅を有する、請求項１または２記載の装置。

【請求項4】

前記複数の足場の内の１つの足場が１つの繊維足場を含み、該繊維足場が、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリガラクツロン酸、および／またはその組合せから形成される、請求項１から３いずれか１項記載の装置。

【請求項5】

前記繊維足場が、複数の繊維から作られる、請求項４記載の装置。

【請求項6】

前記複数の繊維の各繊維が各ウェルの底部分に固定され、個々の繊維の固定された端部が、各ウェルにおいて約１００μｍから約２００μｍだけ互いから距離が置かれている、請求項５記載の装置。

【請求項7】

前記人工血管足場が、互いから約１００μｍから約２００μｍで、前記ウェルの底部に固定される複数の個々の中空繊維から作られる、請求項６記載の装置。

【請求項8】

前記中空繊維が非イオン性高分子から形成され、該非イオン性高分子が、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはポリガラクツロン酸を含む、請求項７記載の装置。

【請求項9】

前記人工血管足場が、ヒドロゲルから作られる、請求項７記載の装置。

【請求項10】

三次元（３Ｄ）細胞培養物を培養する方法において、
請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養装置内に細胞を播種する工程であって、該細胞が、該細胞培養装置内に配置された足場の細胞接着表面に接着する、工程と、
前記細胞培養装置に細胞培養培地を加えて、栄養素と酸素を供給することによって、前記細胞を３Ｄ細胞培養物に培養する工程であって、該細胞は、該細胞培養培地の添加または交換中に前記足場に接着したままである、工程と、
前記細胞培養装置の足場に接着した３Ｄ細胞培養物を撮像する工程と、
前記足場を必要に応じて消化する工程と、
を含む方法。

【請求項11】

相互接続された細胞培養装置において、
各ウェルが上部、半球形状を有する底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート、および
前記マルチウェル細胞培養プレート内に配置された、異なる長さのヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場であって、該ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、前記マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、複数のヒドロゲル足場、
を含む細胞培養装置。

【請求項12】

各ヒドロゲル繊維が、細胞接着性表面を含み、約１００μｍから約１００ｍｍの範囲の長さおよび約１０μｍの平均幅を有する、請求項１１記載の装置。

【請求項13】

前記ヒドロゲル繊維が、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド結合配列、架橋高分子、および／またはその組合せから形成される、請求項１１または１２記載の装置。

【請求項14】

前記底部が複数のマイクロキャビティを含み、前記ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部が、異なるマイクロキャビティ内に配置されて、相互接続されたマイクロキャビティを作り出す、請求項１１から１３いずれか１項記載の装置。

【請求項15】

相互接続された細胞培養装置を形成する方法であって、
各ウェルが上部、各々が半球形状を有する複数のマイクロキャビティを含む底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレートを含む細胞培養装置に細胞を播種する工程、
前記細胞培養装置に、複数のヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場を供給する工程であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、前記マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、工程、および
細胞培養培地を提供して、細胞成長および三次元（３Ｄ）細胞培養物の形成のための栄養素と酸素を供給する工程、
を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の説明】

【0001】

本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、２０２０年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０８５７０１号の米国法典第３５編第１１９条の下での優先権の恩恵を主張するものである。

【技術分野】

【0002】

本明細書は、広く、細胞培養装置に関し、より詳しくは、スフェロイドの細胞培養のための拡散構造を有する装置に関する。

【背景技術】

【0003】

スフェロイドなどの、三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたその対応物よりも生体内のような機能を示すことができる。２Ｄ細胞培養システムにおいて、細胞は、それらが培養される基体に接着することができる。しかしながら、細胞が、スフェロイド内など、３Ｄで成長させられる場合、その細胞は、基体に接着せずに、互いに相互作用する傾向にある。よって、３Ｄで培養された細胞は、細胞コミュニケーションおよび細胞外基質の発生の観点から、生体内組織に非常によく似ている。

【0004】

３Ｄ細胞集合体またはスフェロイドは、正常細胞、がん細胞、および細胞株から産生することができる。しかしながら、現在入手できる培養装置では機能的血管構造が欠如しているために、スフェロイドの成長は制限され、このため、スフェロイド内の内部細胞が悪影響を受けてしまう。内部細胞塊は、スフェロイド上の外部細胞と比べて、栄養素と酸素の供給が不均一である。同様に、スフェロイドからの拡散抵抗が増加するために、細胞代謝の老廃物が、スフェロイド内の内部細胞により蓄積する。これらの問題は、壊死性コアの形成の原因となり、このことが、スフェロイドのサイズが直径約５００μｍに到達した場合の、腫瘍スフェロイド培養に報告されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、これらの制限のない培養装置が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

ここに述べられたような本開示の実施の形態は、スフェロイド成長を可能にする細胞培養装置を提供する。スフェロイド成長の制限を減少させるかまたはなくし、より組織状の３Ｄ培養を確立するために、ここに述べられた装置は、培養装置のウェル内の３Ｄ細胞培養物中に拡散構造を導入する。この拡散構造は足場(scaffolds)を備える。実施の形態において、その足場は繊維から作られる。繊維の非限定例としては、プラスチックまたは高分子繊維およびヒドロゲル繊維が挙げられる。繊維は、多孔質、ガス透過性、またはその組合せであり、受動拡散作用様式により３Ｄ培養物の内部細胞塊から出入りする栄養素供給と老廃物交換を可能にすることができる。

【0007】

いくつかの実施の形態において、本開示の培養基体は、ここに記載されたような足場を持たない培養容器と比べて、その培養基体が、ウェルの断面容積中で改善された細胞分布、改善された細胞の生存能力、細胞の底に向かう重力の作用による細胞からの改善された老廃物の除去、減少した壊死性コア、または他の属性を含む、改善されたおよび／または調整可能な性質を提供できるように作られる。

【0008】

ある態様において、細胞培養装置は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート；および各足場が細胞接着表面を備える、マルチウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された複数の足場を含む。

【0009】

いくつかの実施の形態において、底部は、半球形状を構成する。

【0010】

いくつかの実施の形態において、足場は各ウェル内に配置されている。いくつかの実施の形態において、足場の少なくとも一方の端部は、各ウェルの底部分に固定されている。

【0011】

いくつかの実施の形態において、底部は、複数のマイクロキャビティを含む。いくつかの実施の形態において、足場は、複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティ内に配置されている。いくつかの実施の形態において、足場は、各マイクロキャビティの底部分に固定されている。

【0012】

いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約３０００μｍの長さを有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約１０００μｍの長さを有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約５００μｍの長さを有する。実施の形態において、足場は、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍの長さを有する。実施の形態において、足場は、３０００μｍ以下、２０００μｍ以下、１０００μｍ以下、５００μｍ以下の長さを有する。

【0013】

いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約１００μｍの幅を有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約５０μｍの幅を有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約２０μｍの幅を有する。実施の形態において、足場は、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍの幅を有する。実施の形態において、足場は、１００μｍ以下、５０μｍ以下、２０μｍ以下の幅を有する。
いくつかの実施の形態において、足場は、繊維足場から作られる。いくつかの実施の形態において、繊維足場は、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはポリガラクツロン酸（ＰＧＡまたはペクチン）から形成される。ＰＧＡが使用される実施の形態において、接着した３Ｄ細胞培養物は、足場から放出または収穫されることがある。例えば、足場を消化するために、ペクチナーゼなどの酵素および／またはキレート剤が使用されることがある。いくつかの実施の形態において、足場を穏やかに消化して、３Ｄ細胞培養物を放出できる他のヒドロゲルが使用されることがある。

【0014】

いくつかの実施の形態において、繊維足場は、複数のプラスチック繊維または高分子繊維から作られる。いくつかの実施の形態において、複数のプラスチック繊維の各繊維は、各ウェルの底部分に固定されている。いくつかの実施の形態において、個々の繊維は、各ウェル内で約１００μｍから約２００μｍだけ互いから距離が置かれている。

【0015】

いくつかの実施の形態において、足場は、人工血管足場から作られる。

【0016】

いくつかの実施の形態において、人工血管足場は、中空繊維から作られる。いくつかの実施の形態において、人工血管足場は、複数の中空繊維から作られる。いくつかの実施の形態において、個々の中空繊維は、互いから約１００μｍから約２００μｍだけ離れて固定されている。いくつかの実施の形態において、中空繊維は、非イオン性高分子から形成される。いくつかの実施の形態において、非イオン性高分子は、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、またはポリプロピレンから作られる。

【0017】

いくつかの実施の形態において、中空繊維は、ヒドロゲルコーティングをさらに含む。いくつかの実施の形態において、人工血管足場は、ヒドロゲルから作られる。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲルは、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ組織、架橋高分子、またはその組合せから作られる。接着性ヒドロゲルの非限定例としては、ＥＣＭタンパク質および脱細胞化組織ＥＣＭ足場が挙げられ、ＥＣＭの例としては、多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、並びにコラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンなどのタンパク質が挙げられる。非接着性ヒドロゲルの非限定例としては、数ある中でも、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリアクリルアミドなどの架橋高分子が挙げられる。

【0018】

ある態様において、三次元（３Ｄ）細胞培養物を培養する方法が提供される。この方法は、ここに示されたような、１つ以上の実施の形態による細胞培養装置内に細胞を播種する工程であって、細胞が、細胞培養装置内に配置された足場の細胞接着表面に接着する、工程、および細胞培養装置に細胞培養培地を加えて、栄養素と酸素を供給することによって、細胞を３Ｄ細胞培養物に培養する工程であって、細胞は、細胞培養培地の添加または交換中に足場に接着したままである、工程を含む。いくつかの実施の形態において、この方法は、細胞培養装置の足場に接着した３Ｄ細胞培養物を撮像する工程をさらに含む。

【0019】

ある態様において、相互接続された細胞培養装置は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート；およびそのマルチウェル細胞培養プレート内に配置された、異なる長さのヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、複数のヒドロゲル足場を含む。

【0020】

いくつかの実施の形態において、底部は、半球形状を構成する。

【0021】

いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、約１００μｍから約１００ｍｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、約１０μｍの幅を有する。

【0022】

いくつかの実施の形態において、各ヒドロゲル繊維は、細胞接着性表面を含む。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、非接着性ヒドロゲルから形成され、接着性基(attachment group)で官能化された表面を含む。接着性基の非限定例としては、ＥＣＭタンパク質およびアルギニン・グリシン・アスパラギン酸（ＲＧＤ）などの接着性ペプチド配列が挙げられる。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、ＥＣＭタンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド配列、および架橋高分子から形成される。接着性ヒドロゲルの非限定例としては、ＥＣＭタンパク質および脱細胞化組織ＥＣＭ足場が挙げられる。ＥＣＭの例としては、多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、並びにコラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンなどのタンパク質が挙げられる。非接着性ヒドロゲルの非限定例としては、数ある中でも、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、およびポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）などの架橋高分子が挙げられる。

【0023】

いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル足場は、ウェル内で固定されていない、または浮遊性である。

【0024】

いくつかの実施の形態において、底部は、複数のマイクロキャビティを含む。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、異なるマイクロキャビティ内に配置されて、相互接続されたマイクロキャビティを作り出す。

【0025】

ある態様において、相互接続された細胞培養装置を形成する方法が提供される。この方法は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレートを含む細胞培養装置に細胞を播種する工程；細胞培養装置に、複数のヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場を供給する工程であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、工程；および細胞培養培地を提供して、細胞成長および三次元（３Ｄ）細胞培養物の形成のための栄養素と酸素を供給する工程を含む。

【0026】

いくつかの実施の形態において、底部は、半球形状を構成する。いくつかの実施の形態において、底部は、複数のマイクロキャビティを含む。

【0027】

ここに記載された実施の形態の追加の特徴と利点は、以下の詳細な説明に述べられており、一部は、その説明から当業者に容易に明白となるか、または以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付図面を含む、ここに記載された実施の形態を実施することによって、認識されるであろう。

【0028】

先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、様々な実施の形態を記載しており、請求項の主題の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供する意図があることを理解すべきである。添付図面は、その様々な実施の形態のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、ここに記載された様々な実施の形態を図示しており、説明とともに、請求項の主題の原理および作動を説明する働きをする。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】スフェロイドのコア中の細胞死を示す蛍光像

【図2】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、繊維から作られた足場の存在下で培養された細胞の画像

【図3】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、繊維から作られた足場の存在下で培養された細胞の画像

【図4A】本開示の１つ以上の実施の形態による、マルチウェルマイクロプレートの実施の形態であって、マルチウェルマイクロプレートを示す説明図

【図4B】本開示の１つ以上の実施の形態による、マルチウェルマイクロプレートの実施の形態であって、マルチウェルマイクロプレートの１つのウェルを示す説明図

【図4C】本開示の１つ以上の実施の形態による、マルチウェルマイクロプレートの実施の形態であって、図４Ｂの囲みＣ内に示された区域の拡大図

【図5A】本開示の１つ以上の実施の形態による、数々のマイクロキャビティの実施の形態を示す説明図

【図5B】本開示の１つ以上の実施の形態による、数々のマイクロキャビティの実施の形態を示す説明図

【図6A】本開示の１つ以上の実施の形態による、３Ｄ細胞培養マイクロプレートの実施の形態の説明図

【図6B】本開示の１つ以上の実施の形態による、３Ｄ細胞培養マイクロプレートの実施の形態の説明図

【図7】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、テザリング繊維を有するウェルの断面側面図

【図8】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、人工血管足場を有するウェルの断面側面図

【図9】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、血管足場の差し込み図を含む、図８のウェルの上面図

【図10】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、ヒドロゲル足場の側面斜視図

【図11】ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、ヒドロゲル足場を有する相互接続されたウェルの上面図

【発明を実施するための形態】

【0030】

スフェロイドの細胞培養のための従来の装置と容器には、スフェロイドの成長の制限に関連する欠点がある。従来の装置には、機能性血管構造がなく、これにより、スフェロイド内の内部細胞が悪影響を受け、スフェロイドの成長が制限される。スフェロイド上の外部細胞と比べて、内部細胞塊は、栄養素と酸素の供給が不均一である。細胞代謝の老廃物が、スフェロイドからの拡散抵抗が増加するために、スフェロイド内の内部細胞により蓄積する。これらの問題は、壊死性コアの形成の原因となり、このことが、スフェロイドのサイズが直径約５００μｍに到達した場合の、腫瘍スフェロイド培養に報告されている。

【0031】

スフェロイドの生存能力を、肝がん細胞株を使用して評価した。６ウェルのマイクロプレート用に設計されたマイクロキャビティ挿入物のプロトタイプ（各々が７３３のマイクロウェルを有する）内に、バルクスフェロイド培養のために、１２０Ｋ細胞／ｍＬでＨｅｐＧ２細胞を播種した。図１は、９日目のＨｅｐＧ２スフェロイドの明視野像を示している。カルセインＡＭで染色された９日目のＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光像が示されており、緑色がカルセインＡＭおよび生細胞を示す－緑色は、黒色の画像背景に対して薄い灰色として示されている。ＥｔｈＤ－１で染色された９日目のＨｅｐＧ２スフェロイドの蛍光像が示されており、赤色がＥｔｈＤおよび死細胞を示す－赤色は、黒色の画像背景に対して中間の灰色として示されている。死細胞（赤色のＥｔｈＤ染色／中間の灰色により示される）および生細胞（緑色のカルセインＡＭ染色／薄い灰色により示されている）の融合蛍光像も、９日目のＨｅｐＧ２スフェロイドについて示されており、これは、黒色の画像背景に対して薄い灰色の外輪の内部に中間の灰色の輪がある、著しい細胞死を示している。このように、図１に示された９日目のＨｅｐＧ２スフェロイドのスフェロイド生存能力評価は、スフェロイドのコア内に細胞死をはっきりと示している。

【0032】

３Ｄスフェロイドとして細胞を成長させるための市販されている従来の基体は、一般に、細胞に非接着性である表面コーティングを有する微細構造のピット状形状を有する。細胞は、これらのピットの底に沈み、互いに接着し、次いで、細胞集合体（すなわち、スフェロイド）として成長する。しかしながら、マイクロピットが浅すぎると、スフェロイドは、培地の交換中にピットから容易に外れ、失われ得る。反対に、マイクロピットが深すぎると、マイクロピットを含む容器に細胞培養培地を最初に加える最中に、マイクロピットの容積内に空気を捕捉しないようにするのが難しくなり得る。

【0033】

本開示は、細胞培養中にプラスチック繊維、ヒドロゲルポスト、またはその組合せを３Ｄ細胞培養物に導入する細胞培養装置を記載する。その繊維またはポストは、スフェロイドのコアに栄養素を供給できるように、並びに３Ｄ細胞培養物の内部細胞塊から老廃物を交換できるように、多孔質またはガス透過性であることがある。老廃物交換は、プラスチック繊維またはヒドロゲルポストの特徴のために、受動拡散作用様式により行われる。

【0034】

ここに記載された実施の形態による装置は、ウェル内またはマイクロキャビティ内に３Ｄ細胞塊を固定化する特徴のために、細胞培養操作中のスフェロイドの損失を防ぐ。実施の形態において、ここに記載された装置は、３Ｄ細胞培養物内の栄養素、代謝老廃物、および酸素の均一な分布を可能にする人工血管足場の使用により、組織状３Ｄ培養物を支援する。さらに、ここに記載された装置の実施の形態は、３Ｄ細胞培養物内の壊死性コアの形成を防ぎ、３Ｄ形態で生成される人工組織のサイズを増加させるのに役立つ。

【0035】

図２および図３は、本開示の実施の形態による培養装置のウェル内で培養された細胞の画像を示す。肝臓スフェロイド培養を計画するために、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の２つの異なるドナーロットを使用した。これらの画像は、Ｃｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルスフェロイドプレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）内の超低接着（ＵＬＡ）表面コーティングで被覆されたウェル内の肝細胞を示している。図２の画像は、ＰＨＨのドナーロット３３６について２８日目に撮影され、図３の画像は、ＰＨＨのドナーロット４０４について１３日目に撮影された。図２に示されるように、培養装置は、ウェル内に実質的に真っ直ぐな形状のプラスチック繊維を含み、細胞は、プラスチック繊維の長さに沿って細長い３Ｄ配置のプラスチック繊維に付着している。図３に示されるように、培養装置は、ウェル内の湾曲形状のプラスチック繊維を含み、細胞は、繊維の第１の端部から反対の端部までに広がる３Ｄ配置のプラスチック繊維に付着している。図２および図３のプラスチック繊維は、ウェル内に配置され、培地内に浮遊している。しかしながら、いくつかの実施の形態において、プラスチック繊維は、ウェル内に固定されていることがある。

【0036】

ここに記載された態様において、細胞培養装置内に複数の足場が配置されることがある。この細胞培養装置は、各ウェルが、上部開口、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を含む、複数のウェルを備えることがあり、各ウェルは、内部表面が細胞非接着性表面を構成するように作られている。ある実施の形態において、この培養装置の複数のウェルにおける各ウェルは、複数の足場を含むことがある。ある実施の形態において、この培養装置の複数のウェルにおける各ウェルは、少なくとも１つの足場を含むことがある。ある実施の形態において、この培養装置の複数のウェルにおけるウェルの少なくともいくつかは、足場を含む。

【0037】

ある実施の形態において、プラスチック繊維または人工血管足場などのここに記載された足場は、ウェルまたはマイクロキャビティ内に固定されることがある。足場は、足場をウェルまたはマイクロキャビティ内にしっかりと位置付けるどの適切な手段によって固定されてもよい。非限定例において、足場は、接着剤により固定される、もしくはウェルまたはマイクロキャビティに成形または外側被覆(overmolded)されることがある。

【0038】

いくつかの実施の形態において、足場は、マルチウェルプレート内の各ウェルまたはマイクロキャビティ内の実質的に同じ位置に固定され、これにより、３Ｄ細胞培養物の効率的な撮像が容易になる。例えば、足場は、各ウェルまたはマイクロキャビティの中央の底部分に固定されることがある。ある実施の形態において、繊維足場の複数の繊維における各繊維は、各ウェルの底部、または底部の一部に固定される。各繊維の端部が底部に固定されることがある。個々の繊維の固定された端部は、隣接して固定された繊維から距離が置かれることがある。例えば、個々の繊維の固定端部は、各ウェルにおいて互いから約１００μｍから約２００μｍだけ距離が置かれることがある。いくつかの実施の形態において、プラスチック繊維の少なくとも一方の端部は、ウェルまたはマイクロキャビティ内に固定されることがあり、そのプラスチック繊維は、ウェルまたはマイクロキャビティ内で垂直または実質的に垂直の向きを有することがある。いくつかの実施の形態において、プラスチック繊維の互いに反対の端部が、ウェルまたはマイクロキャビティ内に固定され、そのプラスチック繊維は、ウェルまたはマイクロキャビティにおいて水平または実質的に水平の向きを有することがある。

【0039】

ある態様において、マルチウェルプレートのウェル内に３Ｄ細胞培養物拡散構造を含む細胞培養装置が提供される。実施の形態において、拡散構造は、足場を含む。その足場は、テザリングプラスチック繊維の非限定例など、繊維から作られることがある。実施の形態において、ウェルプレートの各ウェル内に足場が配置されることがある。実施の形態において、ウェルプレートの選択されたウェル内に足場が配置されることがある。そのウェルプレートは、マルチウェルプレートにおけるように、複数のウェルを含むことがある。実施の形態において、各ウェルの内部表面は、超低接着（ＵＬＡ）コーティングで被覆された、または処理された表面の非限定例など、細胞非接着性表面である。足場は、細胞接着性表面を含み、３Ｄ細胞培養物に固定点を提供し、これにより、細胞培養過程中により完全な培地交換ができる。３Ｄ細胞培養物を固定することによって、培地の交換または化合物の添加の最中など、細胞培養操作またはアッセイ過程中に、３Ｄ細胞培養物の移動または損失が防がれる。

【0040】

ここで図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃを参照すると、マイクロキャビティプレートである細胞培養装置の実施の形態が示されている。９６ウェルのマイクロキャビティプレートは、９６ウェルの各々に多数の３Ｄ細胞培養物を提供するために、各ウェルの底面に数々のマイクロキャビティを有し、各マイクロキャビティは、培養細胞を３Ｄ立体構造で成長させるような構造になっている。図４Ａは、数々のウェル１１０を有するマルチウェルプレート１０を示す。図４Ｂは、図４Ａのマルチウェルプレート１０の１つのウェル１０１を示す。１つのウェル１０１は、上部開口１１８、液体不透過性底面１０６、および側壁１１３を有する。図４Ｃは、図４Ｂの囲みＣ内に示されたウェル１０１の底面１０６の区域の拡大図であり、図４Ｂに示された１つのウェルの底面に数々のマイクロキャビティ１１２を示している。数々のマイクロキャビティ１１２における各マイクロキャビティ１１５は、側壁１２１および液体不透過性底面１１６を有する。図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに示されたマイクロキャビティスフェロイドプレートは、個々のウェル１０１の底部に数々のマイクロキャビティ１１２を提供し、マルチウェルプレートの個々のウェルのマイクロキャビティの各々の中で個々の３Ｄ細胞培養物を成長させるために使用することができる。このタイプの容器を使用することによって、利用者は、マルチウェルプレートの各ウェル内で多数の３Ｄ細胞培養物を成長させ、それによって、長期の生存能力および機能性を維持し、ここに提供されるようなアッセイに使用するための同じ培養および実験条件下で処理できる多数の３Ｄ細胞培養物を提供することができる。さらに、このタイプの容器は、培養または試験中にどのような３Ｄ細胞培養物の融合も防ぐために、個々の３Ｄ細胞培養物間に物理的バリアを提供する。

【0041】

ここで図５Ａを参照すると、数々のマイクロキャビティ１１２の典型的な実例が示されている。図５Ａは、各々が、上部開口１１８、底面１１９、深さｄ、および側壁１２１により画成される幅ｗを有する、マイクロキャビティ１１５を示している。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、数々のマイクロキャビティは、液体不透過性の凹形弓状底面１１６を有する。実施の形態において、マイクロキャビティの底面は、円形または円錐形、角度のある、平らな底の、または３Ｄ細胞培養物を形成するのに適したどの形状であっても差し支えない。いくつかの実施の形態において、円形底部が好ましい。円形底部１１９は、垂直側壁が円形底部１１９に移行するときに、移行区域１１４を有し得る。この区域は、滑らかなまたは角度のある移行区域であり得る。実施の形態において、「マイクロキャビティ」は、例えば、上部開口１１８と最下点１１６、上部開口の中心、および最下点と上部開口の中心との間の中心軸１０５を画成するマイクロウェル１１５であり得る。実施の形態において、ウェルは、その軸の周りに回転対称である（すなわち、側壁は円筒形である）。いくつかの実施の形態において、上部開口は、２５０μｍから１ｍｍ、またはそれらの測定値内の任意の範囲の上部開口を横切る距離（幅ｗ）を規定する。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、２００μｍと９００μｍの間、または４００μｍと６００μｍの間である。数々のマイクロキャビティは、異なる形状、例えば、放物線、双曲線、逆Ｖ字、および同様の断面形状、またはその組合せを有することがある。実施の形態において、マイクロキャビティは、マイクロキャビティが実験台やテーブルなどの表面と直接接触しないようにその下に保護層１３０を有することがある。いくつかの実施の形態において、ウェルの底部１１９と保護層との間に空隙１１０が設けられることがある。実施の形態において、空隙１１０は、外部環境と連通していても、閉じられていてもよい。いくつかの個々のマイクロキャビティ１１５の底部に、３Ｄ細胞培養物２５が示されている。

【0042】

ここで図５Ｂを参照すると、数々のマイクロキャビティ１１２のさらなる典型的な実例が示されている。図５Ｂは、数々のマイクロキャビティ１１２が正弦波形または放物形を有することがあるのを示している。この形状により、丸まった上縁またはマイクロキャビティの縁が作り出され、これにより、実施の形態において、マイクロキャビティの上部での尖った角または９０度の角度での空気の捕捉が減少する。図５Ｂに示されるように、複数の態様において、マイクロキャビティ１１５は、上部直径Ｄ_上部を有する上部開口、マイクロキャビティの最下点１１６からマイクロキャビティの上部までの高さＨ、マイクロキャビティの上部とマイクロキャビティの最下点１１６との間の中間の高さでの直径Ｄ_ｈ、および側壁１１３を有する。そのような実施の形態において、ウェルの底部は丸まっており（例えば、半球形に丸い）、側壁は、ウェルの底部から上部へと直径が増加し、ウェル間の境界は丸くなっている。それゆえ、ウェルの上部は、直角で終わっていない。いくつかの実施の形態において、ウェルは、底部と上部との間の中間地点での直径Ｄ（Ｄ_ｈとも称される）、ウェルの上部での直径Ｄ_上部、およびウェルの底部から上部までの高さＨを有する。これらの実施の形態において、Ｄ_上部は、Ｄより大きい。

【0043】

ここで図６Ａおよび６Ｂを参照すると、細胞を３Ｄ立体構造で成長させるような構造になっているウェルを含む細胞培養装置、例えば、３Ｄ細胞培養プレートの実施の形態が示されている。図６Ａは、３Ｄ細胞培養プレート１１、この場合には、９６ウェルプレートの実施の形態を示し、丸底１１９は、９６ウェルの各々に１つの３Ｄ細胞培養物を収容するように作られている。通常、これらのプレートは、ウェル１０１の上部開口１１８を上向きにして使用されるが、図６Ａでは、ウェル１０１の底部の構造を示すために、そのプレートは逆さまに示されている。図６Ｂは、フレーム１３０と、各々が、上部開口１１８、側壁１２１、および液体不透過性の凹形弓状底面１１９を有する、多数のウェル１０１とを有する３Ｄ細胞培養マイクロプレートの実施の形態の図である。３Ｄ細胞培養物２５が、個々のウェル１０１の底部に示されている。実施の形態において、フレーム１３０は、実験台やテーブルなどの表面の上にウェルの底部を保持することがある。いくつかの実施の形態において、ウェルの底部１１９とプレートの真下の表面との間に、空隙が設けられることがある。実施の形態において、その空隙は、外部環境と連通していても、閉じられていてもよい。

【0044】

実施の形態において、ウェルの少なくとも１つの凹形弓状底面は、例えば、同じウェル内に複数の隣接した凹形弓状底面を有し得る。または、図４Ａ～Ｃに示されるように、マルチウェルプレートは、平らな底面を持つウェルを有することがあり、その平らな底面は、同じウェル内に数々の隣接した凹形弓状底面またはマイクロキャビティを有する。実施の形態において、細胞培養装置は、例えば、１つのウェル、もしくは各ウェルの底部または基部にある複数の窪みまたはピットなど、多数の「３Ｄ細胞培養ウェル」を有するマルチウェルプレート形態、例えば、マイクロキャビティ３Ｄ細胞培養プレートであり得る。いくつかの実施の形態において、その複数の３Ｄ細胞培養ウェルは、例えば、単一の３Ｄ細胞培養物または３Ｄ細胞培養ウェル当たり１つの３Ｄ細胞培養物を収容するように作られている。

【0045】

実施の形態において、少なくとも１つの凹形弓状底面または「カップ」を有するマイクロキャビティの底面は、例えば、半球形状、丸まった底部を有する円錐表面、および同様の表面形状、またはその組合せであり得る。マイクロキャビティの底部は、窪み、ピット、および同様の凹形円錐台状起伏表面(relief surface)、またはその組合せのような、３Ｄ細胞培養に適した丸い面または曲面で最終的に終端する、終わる、または底に達する。実施の形態において、チャンバ内の各マイクロキャビティの少なくとも１つの凹面は、半球形状面、側壁から底面まで約３０から約６０度のテーパーを有する円錐面、またはその組合せを含む。いくつかの実施の形態において、少なくとも１つの凹形弓状底面は、例えば、選択されたウェル形状、各ウェル内の凹形弓状面の数、プレート内のウェルの数、および同様の検討事項に応じて、例えば、中間値と中間範囲を含む、約２５０から約５，０００マイクロメートル（すなわち、０．０１０から０．２００インチ）の直径を有する、半球体の水平部分または薄片などの半球体の一部であり得る。他の凹形弓状面は、例えば、放物線、双曲線、逆Ｖ字、および同様の断面形状、またはその組合せを有し得る。

【0046】

実施の形態において、ウェルを備えた細胞培養装置、例えば、３Ｄ細胞培養プレートまたはマイクロキャビティ３Ｄ細胞培養プレートは、細胞非接着性表面をさらに備えることができる。細胞培養プレートの各ウェルは、細胞非接着性表面を備えるように作られた内部表面を含むことがある。例えば、細胞非接着性表面は、少なくとも１つの凹面および／または１つ以上の側壁上など、ウェルの一部の上に、低接着性、超低接着性、または非接着性コーティングを含むことがある。細胞非接着性材料の例としては、ペルフルオロポリマー、オレフィン、または同様の高分子、またはその混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、またはポリエチレンオキシドなどのポリエーテルまたはポリビニルアルコールなどのポリオール、または同様の材料、またはその混合物が挙げられる。

【0047】

実施の形態において、側壁表面（すなわち、周囲）は、例えば、垂直円筒またはシャフト、ウェル上部からウェル底部まで直径が減少する垂直円錐の一部、円錐移行部を有する垂直な正方形シャフトまたは垂直楕円シャフト、すなわち、円錐に移行し、少なくとも１つの凹形弓状面、すなわち、丸い表面または曲面を有する底部で終わる、ウェルの上部で正方形または楕円のシャフト、またはその組合せであり得る。他の説明に役立つ形状例としては、穴あき円筒、穴あき円錐型円筒、最初に円筒で次に円錐、および他の同様の形状、またはその組合せが挙げられる。

【0048】

例えば、細胞非接着性表面または低接着基体、細胞培養物品チャンバの本体部および基部のウェルの曲率、および重力の１つ以上が、腫瘍細胞の３Ｄ細胞培養物への自己組織化を誘発し得る。腫瘍細胞は、単層で成長した細胞と比べて、より生体内のような応答を示す分化細胞機能を維持する。実施の形態において、３Ｄ細胞培養物は、例えば、３Ｄ細胞培養物中の細胞の種類に応じて、非限定例として、中間値と中間範囲を含む、約１００から約５００マイクロメートル、約１５０から約４００マイクロメートル、約１５０から約３００マイクロメートル、および約２００から約２５０マイクロメートルの直径を持つスフェロイド状形状を有することがある。

【0049】

実施の形態において、ウェルおよび／またはチャンバ内の各マイクロキャビティを含む細胞培養装置は、不透明側壁および／または少なくとも１つの凹面を有するガス透過性かつ液体不透過性底部をさらに備え得る。不透明側壁は、蛍光イメージングが利用される場合、ウェル間またはマイクロウェル間のクロストークを防ぐ。いくつかの実施の形態において、少なくとも１つの凹面を有する底部の少なくとも一部は透明である。そのような特徴を有する細胞培養装置（例えば、マイクロキャビティスフェロイドプレート、マイクロキャビティ挿入物、マイクロキャビティ挿入プレートなど）は、あるマルチウェルプレート（その中で３Ｄ細胞培養物を形成し、可視化できる）からアッセイを行うための別のプレートに３Ｄ細胞培養物を移送する必要をなくし、したがって時間を節約し、３Ｄ細胞培養物を不必要に乱すのを防ぐことを含む、本開示の方法のいくつかの利点を提供することができる。さらに、ガス透過性底部（例えば、特定の規定の厚さでガス透過性を有する高分子から作られたウェルの底部）により、３Ｄ細胞培養物は増加した酸素供給を受けることができる。例示のガス透過性底部は、所定の厚さでペルフルオロポリマーまたはポリ４－メチルペンタンなどの高分子から形成することができる。

【0050】

ガス透過性ポリマーの代表的な厚さと範囲は、例えば、中間値と中間範囲を含む、約０．００１インチから約０．０２５インチ、０．００１５インチから約０．０３インチ（ここで、１インチ＝２５，４００マイクロメートル、０．００００３９インチ＝１マイクロメートル）であり得る。それに加え、またはそれに代えて、ポリジメチルシロキサンポリマーなどのガス透過率の高い他の材料は、例えば、約１インチまでのある厚さで、十分なガス拡散を与えることができる。

【0051】

図７は、拡散構造または足場を含む細胞培養装置におけるウェルまたはマイクロキャビティ３００の断面側面図を示す。図７に示されるように、足場は、ある実施の形態によるテザリング足場またはテザリングプラスチック繊維である。このテザリング足場またはテザリングプラスチック繊維は、細胞接着を可能にする接着性表面を有し、３Ｄ細胞培養物を機械的に支持し、固定化する。側壁３７０が、ウェルまたはマイクロキャビティの上部３８０と、ウェルまたはマイクロキャビティの底部３６０との間に配置されている。ウェルまたはマイクロキャビティの底部３６０は、半球形状を有することがある。ウェルまたはマイクロキャビティの内部表面または内面３４０は、ＵＬＡ表面３３０など、細胞非接着性表面を有することがある。テザリングプラスチック繊維３５０が、ウェルまたはマイクロキャビティ内に配置されることがあり、これは、３Ｄ細胞培養物３１０の固定地点である。いくつかの実施の形態において、複数のテザリングプラスチック繊維が、ウェルまたはマイクロキャビティ内に配置されることがある。

【0052】

いくつかの実施の形態において、繊維などの足場が、マイクロキャビティの底部に接着され、これにより、マイクロキャビティをより浅くし、それでも、培地交換中に３Ｄ細胞培養物を維持することができる。これは、３Ｄ細胞培養物は、足場を形成するこれらの繊維またはポストの周りに成長し、いくつかの実施の形態において、それに接着するために起こる。このようにして、容器に培地を最初に導入する最中に、空気の捕捉が取るに足らなくなる。

【0053】

テザリング足場は、どの適切な手段によって、ウェルまたはマイクロキャビティに固定されてもよい。非限定例として、足場は、プラスチック繊維から作られることがあり、これは、プラスチック繊維をウェルまたはマイクロキャビティに成形することによって、固定することができる。培地３２０は、３Ｄ細胞培養物３１０およびプラスチック繊維３５０を覆う量でウェルまたはマイクロキャビティ３００内に配置される。ウェルまたはマイクロキャビティ３００は、内面３４０上にＵＬＡ表面３３０を有し、このＵＬＡ表面は、細胞がウェルまたはマイクロキャビティの内面に接着するのを防ぐ。

【0054】

ここに記載されたような足場は、一本の繊維または複数の繊維から作られることがある。足場は、３Ｄ細胞培養物を形成するために細胞をテザリングすることができるどの適切な材料から形成されてもよい。ある実施の形態において、細胞培養装置の各ウェルは、異なる材料から形成された繊維足場を有することがある。ある実施の形態において、細胞培養装置の各ウェルは、同じ材料から形成された繊維足場を有することがある。例えば、繊維は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリガラクツロン酸（ＧＰＡまたはペクチン）、および／またはその組合せから形成されたプラスチック繊維または高分子繊維であることがある。

【0055】

ＰＧＡが使用される実施の形態において、接着した３Ｄ細胞培養物は、足場から放出または収穫されることがある。例えば、ペクチナーゼなどの酵素および／またはキレート剤を使用して、足場を消化することができる。ここに記載されたような足場を使用する方法は、細胞培養後、または細胞培養中の規定の時間で、酵素および／またはキレート剤を添加することによって、足場が消化される、消化工程を必要に応じて含むことがある。いくつかの実施の形態において、足場を穏やかに消化して、３Ｄ細胞培養物を放出することができる他のヒドロゲルが使用されることがある。

【0056】

いくつかの実施の形態において、繊維は、ウェル内で浮遊性であることがある。いくつかの実施の形態において、繊維は、ウェルの一部に固定されることがある。例えば、繊維は、ウェルの底部に一端で固定されることがある。いくつかの実施の形態において、繊維は、実質的に真っ直ぐな形状などに、成形または形成されている、弧状または湾曲形状の形態に成形されている、もしくは円の形状に成形されている。

【0057】

足場は、足場をウェルまたはマイクロキャビティ内に配置できるどのサイズのものであってもよく、細胞培養のために十分な空間を提供することができる。細胞培養装置内に配置された足場は、寸法が様々であってよい。いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約３０００μｍの平均長さを有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約１０００μｍの平均長さを有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１００μｍから約５００μｍの平均長さを有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約１００μｍの平均幅を有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約５０μｍの平均幅を有する。いくつかの実施の形態において、足場は、約１０μｍから約２０μｍの平均幅を有する。

【0058】

ここに記載された実施の形態による細胞培養装置に、細胞培養のためのどの適切なマルチウェルプレートを使用してもよい。いくつかの実施の形態において、細胞培養装置は、６ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。ウェルプレートは複数のウェルを備え、ウェルプレート内に配列されたウェルの量は、ウェルプレートのサイズと用途に応じて様々である。いくつかの実施の形態において、細胞培養装置は、マイクロキャビティ挿入物をさらに含む。例えば、ウェルプレートは、九十六（９６）ウェルの超低接着表面の無菌スフェロイドマイクロプレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手できる；カタログ番号４５１５、４５２０）であることがある。例えば、ここに記載された実施の形態による足場は、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルまたは３８４ウェルスフェロイドプレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手できる）およびＥｌｐｌａｓｉａマイクロキャビティウェルプレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手できる）など、どの適切なマルチウェルプレートを構成してもよい。ウェルプレートは、ガラス、プラスチック、または同様の材料から製造されることがある。ウェルプレートは蓋を必要に応じて有することがあり、その蓋は、異物が複数のウェルに入るのを防ぐために、ウェルプレートの上部を覆って配置されるように作られている。蓋は、ウェルプレート上にきつく嵌めることができる、もしくはテープ、輪ゴムなどの代替手段によって、ウェルプレートに固定することができる。

【0059】

ウェルプレートは、各ウェル内に配置された細胞培養物を含む。細胞培養物は、ウェルプレートの複数のウェルの各々の中に配置され、成長させられる。培地も、ウェルプレートの複数のウェルの各々の中に配置され、ここで、培地は、細胞培養物を被包し、ウェル内のエア・ポケットを除去するために使用される。細胞培養物は、ある期間（すなわち、６日間まで）に亘り成長させられた後、ウェルプレート内で３Ｄ細胞培養物を形成したであろう。ある場合には、細胞培養物は、ウェルプレートをインキュベータ（図示せず）内に配置することによって、成長させられることがある。いくつかの実施の形態において、細胞培養物をウェル内に配置する前に、ウェルプレートを殺菌することがある。

【0060】

本開示の実施の形態による方法は、細胞培養装置で細胞を培養する工程を含むことがある。各ウェルまたはマイクロキャビティ内に足場を含む細胞培養装置において、細胞を３Ｄ細胞培養物に培養する工程は、細胞をウェル内に配置された足場に播種する工程を含むことがある。細胞を足場に播種する工程は、足場またはウェルを、細胞を含有する溶液と接触させる工程を含むことがある。細胞を足場に播種する最中に、細胞は、足場の表面に接着する。細胞を足場に播種する工程は、足場を細胞培養培地と接触させる工程をさらに含むことがある。一般に、足場を細胞培養培地と接触させる工程は、培養すべき細胞を、培養すべき細胞が中にある培地を含む環境にある足場上に配置する工程を含む。足場を細胞培養培地と接触させる工程は、細胞培養培地を足場上にピペットで供給する工程、または足場を細胞培養培地内に浸す工程、または細胞培養培地を連続様式で足場に通過させる工程を含むことがある。

【0061】

ある態様において、ここに記載された実施の形態による細胞培養装置は、より組織状の３Ｄ培養物を支持するための人工血管足場を含む。人工血管足場は、分岐した、互いに触れた、および／または互いに接触した複数の繊維から作られることがある。この細胞培養装置は、人工血管足場が３Ｄ細胞構造の内部細胞塊に酸素と栄養素の拡散を可能にしつつ、代謝老廃物をより容易に外側に（すなわち、ウェルの内側側壁に向かって）拡散させられるので、３Ｄ組織状培養物を可能にする。細胞培養装置は、複数のウェルおよび／または複数のマイクロキャビティを有するマルチウェル細胞培養プレートを備える。

【0062】

図８は、ここに示されたか、または記載された１つ以上の実施の形態による人工血管足場を含むウェルまたはマイクロキャビティの断面側面図を示す。図９は、ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、血管足場の差し込み図を含む、図８のウェルまたはマイクロキャビティの上面図を示す。ウェルまたはマイクロキャビティ４００は、上部４８０、底部４６０、上部４８０と底部４６０との間に配置された側壁４７０を含む。ウェルまたはマイクロキャビティ４００は、細胞に非接着性である表面４３０を有する内面または内側表面４４０を備えている。いくつかの実施の形態において、細胞非接着性表面４３０は、超低接着（ＵＬＡ）表面である。細胞は、細胞培養装置のウェル／マイクロキャビティ中に播種され、細胞培養培地４２０がウェル／マイクロキャビティ内に配置される。

【0063】

細胞接着性表面を有する人工血管足場４５５が、ウェル／マイクロキャビティ内に配置され、ウェル／マイクロキャビティの底部４６０に固定されることがある。この人工血管足場は、接着剤などによって、どの適切な手段により固定されてもよい、もしくは成形または外側被覆によって形成されてもよい。いくつかの実施の形態において、人工血管足場は、細胞接着性表面を有する複数の繊維４５０から作られる。いくつかの実施の形態において、人工血管足場４５５の繊維４５０は、ポストまたは支柱のような形状をしており、ウェル／マイクロキャビティ４００の底部４６０に一端で固定されている。いくつかの実施の形態において、人工血管足場は複数の繊維から作られ、繊維は、互いから約１００μｍから約２００μｍの距離で配置されている。

【0064】

人工血管足場４５５は、栄養素と酸素を運搬する培地の受動拡散を可能にするどの適切な材料から形成されてもよい。例えば、人工血管足場は、ヒドロゲル材料または中空繊維から作られることがある。中空繊維またはヒドロゲル材料は、細胞培養培地４２０から３Ｄ細胞培養物４１０の内部に栄養素と酸素を運搬する培地の受動拡散を可能にする。人工血管足場は、非イオン性高分子から製造されることがある。非イオン性高分子の非限定例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡまたはペクチン）、および／またはその組合せが挙げられる。ＰＧＡが使用される実施の形態において、接着した３Ｄ細胞培養物は、足場から解放または収穫されることがある。例えば、足場を消化するために、ペクチナーゼなどの酵素および／またはキレート剤が使用されることがある。ヒドロゲル材料は、表面被覆、成形、または足場へのヒドロゲル材料の印刷などによって、人工足場に施すことができる。ヒドロゲルは、当該技術分野で公知のどの材料からなっても差し支えなく、細胞に接着性または非接着性のいずれかであるように製造できる。例えば、いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、ＥＣＭタンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド配列、架橋高分子、またはその組合せから形成される。接着性ヒドロゲルの非限定例としては、ＥＣＭタンパク質および脱細胞化組織ＥＣＭ足場が挙げられる。ＥＣＭの例としては、多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、並びにコラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンなどのタンパク質が挙げられる。非接着性ヒドロゲルの非限定例としては、数ある中でも、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、およびポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）などの架橋高分子が挙げられる。いくつかの実施の形態において、足場を穏やかに消化して、３Ｄ細胞培養物を放出できる他のヒドロゲルが使用されることがある。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲルは、非接着性ヒドロゲルから形成され、接着性基で官能化された表面を有する。接着性基の非限定例としては、ＥＣＭタンパク質およびアルギニン・グリシン・アスパラギン酸（ＲＧＤ）などの接着性ペプチド配列が挙げられる。

【0065】

ウェル／マイクロキャビティ内に播種された細胞は、人工血管足場に接着するか、または人工血管足場の周りに形成することがある。細胞培養中、細胞は、成長し続けて、足場内の繊維間と人工血管足場の周りに３Ｄ細胞塊を形成する。３Ｄ細胞塊が細胞培養中に成長するときに、人工血管足場の中空繊維またはヒドロゲル材料は、細胞培養培地４２０から３Ｄ細胞培養物４１０の内部に栄養素と酸素を運搬する培地の受動拡散を可能にする。人工血管足場の拡散性のために、栄養素と酸素は、３Ｄ細胞培養物の体積全体に亘り栄養素と酸素がより均一に供給される。それに加え、人工血管足場により提供される拡散により、代謝老廃物の濃度を３Ｄ細胞培養物の体積全体に亘りより均一に激減させることができる。それゆえ、人工血管足場の拡散性のために、壊死性コアが形成される前に、体積がより大きい３Ｄ細胞培養物を産生することができる。さらに、人工血管足場は、ウェル／マイクロキャビティ内の３Ｄ細胞塊を機械的に支持し、固定化する。３Ｄ細胞塊を固定化することによって、３Ｄ細胞培養物のイメージングが簡単になる。ウェルまたはマイクロキャビティの多くの異なる部分に焦点を合わせ、３Ｄ細胞培養物の存在または位置を探す代わりに、利用者は、３Ｄ細胞塊内に埋め込まれている人工血管支持体上に撮像装置の焦点を合わせることができる。さらに、人工血管支持体は、全てのウェルまたはマイクロキャビティにおいて均一な位置に固定されることがある。非限定例として、いくつかの実施の形態において、人工血管支持体は、各ウェルまたはマイクロキャビティ内の中央に集められ、ウェルまたはマイクロキャビティの中央の底部分に固定される。

【0066】

ある態様において、細胞培養装置は、図１０に示されたようなヒドロゲル足場を含む。図１０は、ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による、ヒドロゲル足場６００の側面斜視図を示す。ヒドロゲル足場６００は、長さが異なるヒドロゲル繊維６５５、６５３、６５７から作られている。例えば、ヒドロゲル繊維６５３は、ヒドロゲル繊維６５７より長い長さを有する。足場のヒドロゲル繊維は、細胞接着性表面を有し、３Ｄ細胞培養物６１０が、ヒドロゲル足場に接着した細胞から形成される。

【0067】

ヒドロゲルにより、３Ｄ細胞培養物に出入りする化合物の受動拡散が可能になり、よって、気体、栄養素、および代謝老廃物の拡散交換が大幅に改善されるために、壊死性コアの形成をなくすのに役立つ。いくつかの実施の形態において、繊維はヒドロゲル材料から形成される。いくつかの実施の形態において、繊維またはポストは、ポリスチレンのような高分子などの固体材料から形成され、これは、次に、３Ｄ細胞培養物のコアに対する拡散交換を可能にするのに十分な厚さでヒドロゲルにより被覆される。ある実施の形態において、ヒドロゲル繊維またはポストは、細胞の播種前、または細胞の播種中に、マイクロキャビティ内に堆積された遊離ヒドロゲル繊維の形態にある。このヒドロゲルは、当該技術分野で公知のどの材料から作られても差し支えなく、細胞に接着性または非接着性のいずれかであるように製造することができる。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド結合配列、または架橋高分子から形成される。接着性ヒドロゲルの非限定例としては、ＥＣＭタンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、およびＥＣＭペプチド配列が挙げられる。ＥＣＭの例としては、多糖グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、並びにコラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンなどのタンパク質が挙げられる。いくつかの実施の形態において、ヒドロゲル繊維は、非接着性ヒドロゲルから形成され、接着性基で官能化された表面を有する。接着性基の非限定例としては、ＥＣＭタンパク質およびアルギニン・グリシン・アスパラギン酸（ＲＧＤ）などの接着性ペプチド配列が挙げられる。非接着性ヒドロゲルの非限定例としては、数ある中でも、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、およびポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）などの架橋高分子が挙げられる。

【0068】

実施の形態において、ヒドロゲル足場により、図１１に示されるように、装置のウェル／マイクロキャビティ内の３Ｄ細胞培養物間にヒドロゲル通路を含む、相互接続された細胞培養装置を形成することができる。相互接続された細胞培養装置を形成するために、３Ｄ細胞培養のための培養装置を最初に組み立てる最中に、予め作られたヒドロゲル足場繊維を細胞と混合することができる。その結果、異なるサイズのヒドロゲル足場が、３Ｄ細胞培養構造内に存在することになる。例えば、細胞懸濁液およびヒドロゲル足場を含む混合物を調製し、３Ｄ細胞培養物のバルク培養のためにマルチウェル細胞培養プレートに施すことができる。３Ｄ細胞培養物のバルク培養のためのマルチウェル細胞培養プレートの非限定例としては、Ｅｌｐｌａｓｉａ２４ウェルマイクロキャビティプレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手できる）が挙げられる。足場の拡散性のために、栄養素と酸素は、３Ｄ細胞培養物の体積全体に亘りより均一に供給され、反対に、代謝老廃物の濃度は、３Ｄ細胞培養物の体積全体に亘りより均一に激減もする。これにより、３Ｄ細胞培養物内に壊死性コアが形成される前に、体積がより大きい３Ｄ細胞培養物を産生することができる。

【0069】

図１１は、ここに示されたか記載された１つ以上の実施の形態による相互接続された細胞培養装置７００における相互接続されたウェルまたはマイクロキャビティ７０２～７０５の上面図を示す。本開示の実施の形態は、マルチウェル細胞培養プレート７０１を含む。この細胞培養プレートは、複数のウェルおよび／または複数のマイクロキャビティ７０２、７０３、７０４、７０５を備えることがあり、そのウェルまたはマイクロキャビティの内部表面は、細胞接着を防ぐ非接着性表面をさらに含むことがある。ヒドロゲル足場６００を作り出すために、細胞培養プレート７０１のウェルまたはマイクロキャビティ７０２～７０５内に、ヒドロゲル繊維６５５と共に、細胞７１０を播種する。

【0070】

ウェルおよび／またはマイクロキャビティ７０２～７０５の非接着性表面と、ヒドロゲル繊維６５５の細胞接着性表面との組合せのために、細胞７１０は、ヒドロゲル足場６００におけるヒドロゲル繊維６５５の表面に接着する。ウェルまたはマイクロキャビティ７０２～７０５内に配置された細胞培養培地７２０から栄養素が供給されて、細胞７１０は、ヒドロゲル足場６００内のヒドロゲル繊維６５５の間とその周りに成長し続けて、３Ｄ細胞培養物７２５を形成する。さらに、ヒドロゲル繊維のサイズと長さは異なるので、ある足場の繊維は、隣接するマイクロキャビティ／ウェル内の３Ｄ細胞培養物中に埋め込まれることもある。例えば、相互接続された細胞培養装置は、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部が異なるウェルまたはマイクロキャビティ内に位置付けられているときに作り出される拡散経路またはヒドロゲル通路７５０から形成される。一例として、ヒドロゲル繊維６５５ａの一端がウェル／マイクロキャビティ７０２内に位置しており、一方で、ヒドロゲル繊維６５５ａの反対の端部は隣接するウェル／マイクロキャビティ７０３内に位置しており、ウェルまたはマイクロキャビティ７０２と７０３の間にヒドロゲル通路７５０を作り出す。ヒドロゲル繊維およびヒドロゲル通路は、３Ｄ細胞培養物のコアへとそこからの受動拡散を可能にし、栄養素を、３Ｄ細胞培養物内、並びに全培養物に亘り、供給できる拡散経路の機能を果たす。さらに、ヒドロゲル繊維は、相互接続されたウェルまたはマイクロキャビティとの物理的接続を提供し、その物理的接続は、培地交換または薬物試験などの操作中に３Ｄ細胞培養物が失われるのを防ぐ。

【0071】

以下に限られないが、固定化細胞、初代培養細胞、がん細胞、幹細胞（例えば、胚または人工多能性）などを含む、どの種類の細胞を細胞培養装置の実施の形態において培養してもよい。ここに記載された実施の形態において、三次元細胞培養物が考えられているが、細胞は、本開示の実施の形態による細胞培養装置に導入されるときに、分散（例えば、新たに播種された）、コンフルエント、二次元、三次元、スフェロイドなどを含むどの培養形態にあってもよい。細胞は、哺乳類細胞、鳥の細胞、魚の細胞などであってよい。細胞は、以下に限られないが、腎臓、線維芽細胞、乳腺、皮膚、脳、卵巣、肺、骨、神経、筋肉、心臓、結腸直腸、膵臓、免疫（例えば、Ｂ細胞）、血液などを含むどの組織の種類のものであってもよい。いくつかの実施の形態において、細胞培養物は、生細胞培養物である。いくつかの実施の形態において、細胞培養物は、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）から作られた肝臓スフェロイドである。しかしながら、他の種類の細胞培養物が考えられ、可能であることを理解すべきである。

【0072】

細胞の成長を支援することのできるどの細胞培養培地を使用してもよい。細胞培養培地は、例えば、以下に限られないが、糖類、塩類、アミノ酸、血清（例えば、ウシ胎仔血清）、抗体、成長因子、分化因子、染料、または他の所望の因子であってよい。例示の細胞培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２栄養混合物、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ－ＸＦ培地などが挙げられる。さらに、細胞培養培地は、どの所定のスケジュールにしたがって、取り出し、交換してもよい。例えば、細胞培養培地の少なくともいくらかは、１時間毎、または１２時間毎、または２４時間毎、または２日毎、または３日毎、または４日毎、または５日毎などで、取り出し、交換してもよい。

【0073】

ここに用いられているように、いくつかの実施の形態において、細胞培養物品は、１から約２，０００のウェルを含み、各ウェルは、どの他のウェルからも物理的に隔てられている。実施の形態において、ウェルは、マルチウェルプレートのウェルである。例えば、細胞培養装置は、細胞培養表面または底面上に数々のマイクロキャビティを有する、１つのウェルまたはチャンバを備えたフラスコであることがある。細胞培養装置は、１、６、１２、２４、９６、３８４または１５３６ウェルを有するマルチウェルプレートであることがある。いくつかの実施の形態において、各ウェルは、約２５から約１，０００のマイクロキャビティを含む。

【0074】

ここに用いられているように、いくつかの実施の形態において、ウェルは、マルチウェルプレートの形態で設けられた個々の細胞培養環境である。実施の形態において、ウェルは、４ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、５３８ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、または任意の他のマルチウェルプレート形態のウェルであって差し支えない。いくつかの実施の形態において、マルチウェルプレートのウェルは、その１つのウェル内で１つの３Ｄ細胞塊として成長するように関心のある細胞を制限するように構造化することができる。例えば、９６ウェルプレートのウェル（従来の９６ウェルプレートのウェル）は、深さが約１０．６７ｍｍであり、上部開口が約６．８６ｍｍであり、ウェル底部の直径が約６．３５ｍｍである。実施の形態において、３Ｄ細胞培養プレートは、１つの３Ｄ細胞物用の数々の培養チャンバまたはウェルを有するマルチウェルプレートを意味する。すなわち、実施の形態において、マルチウェルプレートは多数のチャンバまたはウェルを有することがあり、各チャンバまたはウェルは、１つの３Ｄ細胞培養物または３Ｄ細胞塊を収容するように作られている。

【0075】

ここに用いられているように、マイクロウェルまたはマイクロキャビティは、３Ｄ立体構造で成長するように関心のある細胞を制限するように構造化されており、寸法または処理、もしくは寸法と処理の組合せを有し、これにより、培養中の細胞が、細胞の二次元シートとしてではなく、３Ｄ立体構造で成長するのが支援される。処理の例としては、低結合性溶液による処理、表面を疎水性でなくす処理、殺菌処理が挙げられる。

【0076】

ここに用いられているように、いくつかの実施の形態において、ウェルは、マイクロキャビティの配列または複数のマイクロキャビティを有することがある。実施の形態において、マイクロキャビティまたはマイクロウェルは、例えば、上部開口と最下点、上部開口の中心、および最下点と上部開口の中心との間の中心軸を画成するマイクロウェルであり得る。実施の形態において、マイクロキャビティまたはマイクロウェルは、その軸の周りに回転対称である（すなわち、側壁は円筒形である）。いくつかの実施の形態において、上部開口は、２５０μｍから１ｍｍ、またはそれらの測定値内の任意の範囲の上部開口を横切る距離を規定する。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、２００μｍと９００μｍの間である。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、４００μｍと６００μｍの間である。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、少なくとも２００μｍである。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、少なくとも２５００μｍである。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、少なくとも４００μｍである。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、１ｍｍ以下である。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、９００μｍ以下である。いくつかの実施の形態において、上部開口から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、６００μｍ以下である。数々のマイクロキャビティは、異なる形状、例えば、放物線、双曲線、逆Ｖ字、および同様の断面形状、またはその組合せを有することがある。

【0077】

ここに用いられているように、実施の形態において、ウェルまたはマイクロキャビティの丸底は、例えば、半球体、もしくはウェルまたはマイクロキャビティの底部を構成する半球体の水平部分または薄片などの半球体の一部であり得る。

【0078】

ここに用いられているように、実施の形態において、マイクロキャビティプレートは、各ウェルが数々のマイクロキャビティを有する、数々のウェルを持つマルチウェルプレートを意味する。ここに用いられているように、挿入物は、プレートまたはマイクロキャビティプレートのウェルに嵌まる細胞培養ウェルを意味する。その挿入物は、細胞を培養するためのキャビティを画成する側壁と底面を有する。ここに用いられているように、挿入プレートは、マルチウェルプレートの数々のウェルに嵌まるように構造化された数々の挿入物を含有する挿入プレートを意味する。ここに用いられているように、マイクロキャビティ挿入プレートは、その数々の挿入物における各挿入物が、数々のマイクロキャビティを有する底面を備えた挿入プレートを意味する。

【0079】

ここに用いられているように、実施の形態において、「３Ｄ細胞培養物」という用語は、例えば、細胞の平らな二次元（２Ｄ）シートではない、培養中の細胞の群であり得る。いくつかの実施の形態において、３Ｄ細胞培養物は、細胞の平らな二次元シートではない、３Ｄスフェロイド状の形状、もしくは培養中の細胞の集合体またはボールに似た形状に似ていることがある。実施の形態において、３Ｄ細胞培養物は、１つの細胞型または多数の細胞型からなる。３Ｄ細胞培養物が３Ｄスフェロイド状の形状に似ている実施の形態において、３Ｄ細胞培養物は、例えば、３Ｄ細胞培養物の細胞型に応じて、中間値と中間範囲を含む、例えば、約１００から約５００マイクロメートル、より好ましくは約１５０から約４００マイクロメートル、さらにより好ましくは約１５０から約３００マイクロメートル、そして最もより好ましくは約２００から約２５０マイクロメートルの直径を有することがある。

【0080】

ある態様において、細胞培養装置は、各ウェルが、上部開口、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート；および各足場が細胞接着表面を備える、マルチウェル細胞培養プレートの複数のウェル内に配置された複数の足場を含む。その底部は、半球形状を構成することがある。少なくとも１つの足場が、各ウェル内に配置されることがある。複数の足場が、各ウェル内に配置されることがある。複数のウェルの少なくともいくつかのウェルが、中に配置された１つの足場を有することがある。

【0081】

足場の少なくとも一部が、各ウェルの底部、または底部の一部に固定されることがある。足場の少なくとも一方の端部が、各ウェルの底部分に固定されることがある。

【0082】

底部は、複数のマイクロキャビティを含むことがある。足場が、複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティ内に配置されることがある。その足場は、各マイクロキャビティの底部分に固定されることがある。

【0083】

足場は、約１００μｍから約１０００μｍの範囲の平均長さを有することがある。足場は、約１０μｍから約１００μｍの範囲の平均幅を有することがある。

【0084】

複数の足場の内の１つの足場が、１つの繊維足場を含むことがある。その繊維足場は、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリガラクツロン酸、および／またはその組合せから形成されることがある。繊維足場は、複数の繊維から作られることがある。複数の繊維の各繊維は、各ウェルの底部分に固定されることがある。個々の繊維の固定された端部は、各ウェルにおいて約１００μｍから約２００μｍだけ互いから距離が置かれていることがある。

【0085】

ある態様において、複数の足場の内の１つの足場が、人工血管足場を含むことがある。この人工血管足場は、ヒドロゲルから作られることがある。人工血管足場は、中空繊維から作られることがある。人工血管足場は、複数の中空繊維から作られることがある。個々の中空繊維は、互いから約１００μｍから約２００μｍで、ウェルの底部に固定されることがある。中空繊維は、非イオン性高分子から形成されることがある。非イオン性高分子は、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリガラクツロン酸、および／またはその組合せを含むことがある。中空繊維は、ヒドロゲルコーティングをさらに含むことがある。

【0086】

ある態様において、三次元（３Ｄ）細胞培養物を培養する方法が提供される。この方法は、ここに示された態様のいずれかによる細胞培養装置内に細胞を播種する工程であって、細胞が、細胞培養装置内に配置された足場の細胞接着表面に接着する、工程と、細胞培養装置に細胞培養培地を加えて、栄養素と酸素を供給することによって、細胞を３Ｄ細胞培養物に培養する工程であって、細胞は、細胞培養培地の添加または交換中に足場に接着したままである、工程と、足場を必要に応じて消化する工程とを含む。この方法は、細胞培養装置の足場に接着した３Ｄ細胞培養物を撮像する工程をさらに含むことがある。

【0087】

ある態様において、相互接続された細胞培養装置が提供される。相互接続された細胞培養装置は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート；およびそのマルチウェル細胞培養プレート内に配置された、異なる長さのヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、複数のヒドロゲル足場を含む。底部は、半球形状を構成することがある。ヒドロゲル繊維は、約１００μｍから約１００ｍｍの範囲の長さを有することがある。ヒドロゲル繊維は、約１０μｍの平均幅を有することがある。各ヒドロゲル繊維は、細胞接着性表面を含むことがある。ヒドロゲル繊維は、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド結合配列、架橋高分子、および／またはその組合せから形成されることがある。ヒドロゲル足場は、ウェル内で固定されていない、または浮遊性であることがある。底部は、複数のマイクロキャビティを含むことがある。ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、異なるマイクロキャビティ内に配置されて、相互接続されたマイクロキャビティを作り出すことがある。

【0088】

ある態様において、相互接続された細胞培養装置を形成する方法が提供される。この方法は、各ウェルが上部、底部、および上部と底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレートを含む細胞培養装置に細胞を播種する工程；細胞培養装置に、複数のヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場を供給する工程であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、工程；および細胞培養培地を提供して、細胞成長および三次元（３Ｄ）細胞培養物の形成のための栄養素と酸素を供給する工程を含む。底部は、半球形状を構成することがある。底部は、複数のマイクロキャビティを含むことがある。

【0089】

請求項の主題の精神および範囲から逸脱せずに、ここに記載された実施の形態に、様々な改変および変更を行えることが当業者に明白であろう。それゆえ、本明細書は、ここに記載された様々な実施の形態の改変および変更を、そのような改変および変更が不随の特許請求の範囲およびその等価物の範囲に入るという前提で、包含することが意図されている。

【0090】

様々な開示された実施の形態は、その特定の実施の形態に関連して記載された特定の特徴、要素、または工程を含むことがあるのが認識されよう。特定の特徴、要素、または工程が、ある特定の実施の形態に関連して記載されているにもかかわらず、様々な説明されていない組合せまたは配列で代わりの実施の形態と交換されてもよいまたは組み合わされてもよいことも認識されよう。

【0091】

ここに用いられているように、名詞は、「少なくとも１つ」の対象を指し、特に明記のない限り、「ただ１つ」に限定されるべきではないことも理解されよう。それゆえ、例えば、「開口」に対する言及は、文脈上明白に他の意味に解釈すべき場合を除いて、そのような「開口」を２つ以上有する例を含む。

【0092】

ここに用いられた全ての科学用語と技術用語は、特に明記のない限り、当該技術分野で一般に使用されている意味を持つ。ここに提供された定義は、ここに頻繁に使用されている特定の用語の理解を容易にするためであり、本開示の範囲を限定する意図はない。

【0093】

ここに用いられているように、「有する」、「含む」、「構成する」などは、制約のない意味で使用され、一般に、「含むが、限定されない」ことを意味する。

【0094】

範囲が、「約」ある特定値から、および／または「約」別の特定値まで、とここに表現されることがある。そのような範囲が表現された場合、例は、そのある特定値から、および／または他方の特定値までを含む。同様に、値が、「約」という先行詞を使用して、近似として表現される場合、その特定値が別の態様を形成することが理解されよう。範囲の各々の端点が、他方の端点との関連で、および他方の端点とは関係なくの両方で有意であることがさらに理解されよう。

【0095】

ここに表現される全ての数値は、特に明記のない限り、そのように記載されていようとなかろうと、「約」を含むものとして解釈されるべきである。しかしながら、列挙された各数値が、「約」その値と表現されているかいないかにかかわらず、同様に正確に考えられることがさらに理解されよう。それゆえ、「１０ｍｍ未満の寸法」および「約１０ｍｍ未満の寸法」の両方は、「約１０ｍｍ未満の寸法」並びに「１０ｍｍ未満の寸法」の実施の形態を含む。

【0096】

特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程が特定の順序で行われることを必要とすると解釈されることは、決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程がしたがうべき順序を実際に列挙していない場合、または工程が、特定の順序に限定されるべきことが、特許請求の範囲または説明に他に具体的に述べられていない場合、どの特定の順序も暗示されることは、決して意図されていない。

【0097】

特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程が、「含む」という移行句を使用して開示されることがあるが、「からなる」または「から実質的になる」という移行句を使用して記載されることのあるものを含む、代わりの実施の形態が暗示されることを理解すべきである。それゆえ、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む方法に対して暗示される代わりの実施の形態は、方法がＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施の形態、および方法がＡ＋Ｂ＋Ｃから実質的になる実施の形態を含む。

【0098】

本開示の多数の実施の形態を詳細な説明を記載してきたが、本開示は、開示された実施の形態に限定されず、以下の請求項により述べられ、定義されたような本開示から逸脱せずに、様々な再配置、改変および置換が可能であることを理解すべきである。

【0099】

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

【0100】

実施形態１
細胞培養装置において、
各ウェルが上部、底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート、および
各足場が細胞接着表面を備える、前記マルチウェル細胞培養プレートの前記複数のウェル内に配置された複数の足場、
を含む細胞培養装置。

【0101】

実施形態２
前記底部が半球形状を構成する、実施形態１に記載の装置。

【0102】

実施形態３
少なくとも１つの足場が各ウェル内に配置される、実施形態１または２に記載の装置。

【0103】

実施形態４
前記足場の少なくとも一方の端部が、各ウェルの底部分に固定される、実施形態３に記載の装置。

【0104】

実施形態５
前記底部が複数のマイクロキャビティを含む、実施形態１から４のいずれかに記載の装置。

【0105】

実施形態６
前記複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティ内に足場が配置される、実施形態５に記載の装置。

【0106】

実施形態７
前記足場が、各マイクロキャビティの底部分に固定される、実施形態６に記載の装置。

【0107】

実施形態８
前記足場が、約１００μｍから約１０００μｍの範囲の平均長さを有する、実施形態１から７のいずれかに記載の装置。

【0108】

実施形態９
前記足場が、約１０μｍから約１００μｍの範囲の平均幅を有する、実施形態１から８のいずれかに記載の装置。

【0109】

実施形態１０
前記複数の足場の内の１つの足場が、１つの繊維足場を含む、実施形態１から９のいずれかに記載の装置。

【0110】

実施形態１１
前記繊維足場が、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリガラクツロン酸、および／またはその組合せから形成される、実施形態１０に記載の装置。

【0111】

実施形態１２
前記繊維足場が、複数の繊維から作られる、実施形態１０または１１に記載の装置。

【0112】

実施形態１３
前記複数の繊維の各繊維が、各ウェルの底部分に固定される、実施形態１２に記載の装置。

【0113】

実施形態１４
個々の繊維の固定された端部が、各ウェルにおいて約１００μｍから約２００μｍだけ互いから距離が置かれている、実施形態１３に記載の装置。

【0114】

実施形態１５
前記複数の足場の内の１つの足場が、人工血管足場を含む、実施形態１に記載の装置。

【0115】

実施形態１６
前記人工血管足場が、中空繊維から作られる、実施形態１５に記載の装置。

【0116】

実施形態１７
前記人工血管足場が、複数の中空繊維から作られる、実施形態１５に記載の装置。

【0117】

実施形態１８
個々の中空繊維が、互いから約１００μｍから約２００μｍで、ウェルの底部に固定される、実施形態１７に記載の装置。

【0118】

実施形態１９
前記中空繊維が、非イオン性高分子から形成される、実施形態１６に記載の装置。

【0119】

実施形態２０
前記非イオン性高分子が、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはポリガラクツロン酸を含む、実施形態１９に記載の装置。

【0120】

実施形態２１
前記中空繊維が、ヒドロゲルコーティングをさらに含む、実施形態１６に記載の装置。

【0121】

実施形態２２
前記人工血管足場が、ヒドロゲルから作られる、実施形態１５に記載の装置。

【0122】

実施形態２３
三次元（３Ｄ）細胞培養物を培養する方法において、
実施形態１から２２のいずれかに記載された細胞培養装置内に細胞を播種する工程であって、該細胞が、該細胞培養装置内に配置された足場の細胞接着表面に接着する、工程と、
前記細胞培養装置に細胞培養培地を加えて、栄養素と酸素を供給することによって、前記細胞を３Ｄ細胞培養物に培養する工程であって、該細胞は、該細胞培養培地の添加または交換中に前記足場に接着したままである、工程と、
前記足場を必要に応じて消化する工程と、
を含む方法。

【0123】

実施形態２４
前記細胞培養装置の足場に接着した３Ｄ細胞培養物を撮像する工程をさらに含む、実施形態２３に記載の方法。

【0124】

実施形態２５
相互接続された細胞培養装置において、
各ウェルが上部、底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、細胞非接着性表面を構成する内部表面を持つように作られた、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレート、および
前記マルチウェル細胞培養プレート内に配置された、異なる長さのヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場であって、該ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、前記マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、複数のヒドロゲル足場、
を含む細胞培養装置。

【0125】

実施形態２６
前記底部が半球形状を構成する、実施形態２５に記載の装置。

【0126】

実施形態２７
前記ヒドロゲル繊維が、約１００μｍから約１００ｍｍの範囲の長さを有する、実施形態２５または２６に記載の装置。

【0127】

実施形態２８
前記ヒドロゲル繊維が、約１０μｍの平均幅を有する、実施形態２５から２７のいずれかに記載の装置。

【0128】

実施形態２９
各ヒドロゲル繊維が、細胞接着性表面を含む、実施形態２５から２８のいずれかに記載の装置。

【0129】

実施形態３０
前記ヒドロゲル繊維が、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、脱細胞化組織ＥＣＭ足場、ＥＣＭペプチド結合配列、架橋高分子、および／またはその組合せから形成される、実施形態２５から２９のいずれかに記載の装置。

【0130】

実施形態３１
前記ヒドロゲル足場が、前記ウェル内で固定されていない、または浮遊性である、実施形態２５から３０のいずれかに記載の装置。

【0131】

実施形態３２
前記底部が、複数のマイクロキャビティを含む、実施形態２５から３１のいずれかに記載の装置。

【0132】

実施形態３３
前記ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部が、異なるマイクロキャビティ内に配置されて、相互接続されたマイクロキャビティを作り出す、実施形態３２に記載の装置。

【0133】

実施形態３４
相互接続された細胞培養装置を形成する方法であって、
各ウェルが上部、底部、および該上部と該底部との間に配置された側壁を備え、超低接着表面を構成する内部表面を有する、複数のウェルを備えたマルチウェル細胞培養プレートを含む細胞培養装置に細胞を播種する工程、
前記細胞培養装置に、複数のヒドロゲル繊維から作られた複数のヒドロゲル足場を供給する工程であって、ヒドロゲル繊維の互いに反対の端部は、前記マルチウェル細胞培養プレート内の異なるウェル内に配置されて、相互接続されたウェルを作り出す、工程、および
細胞培養培地を提供して、細胞成長および三次元（３Ｄ）細胞培養物の形成のための栄養素と酸素を供給する工程、
を含む方法。

【0134】

実施形態３５
前記底部が半球形状を構成する、実施形態３４に記載の方法。

【0135】

実施形態３６
前記底部が、複数のマイクロキャビティを含む、実施形態３４または３５に記載の方法。

【符号の説明】

【0136】

１０ マルチウェルプレート
２５、３１０、６１０、７２５ ３Ｄ細胞培養物
１０１ １つのウェル
１０５ 中心軸
１０６ 液体不透過性底面
１１０ ウェル
１１２、１１５、３００、４００、７０２、７０３、７０４、７０５ マイクロキャビティ
１１３、１２１、３７０、４７０ 側壁
１１４ 移行区域
１１６ 液体不透過性底面、凹形弓状底面、最下点
１１８ 上部開口
１１９ 底面、円形底部、丸底
１３０ 保護層
３２０、４２０、７２０ 培地
３３０、４３０ ＵＬＡ表面
３４０、４４０ 内部表面、内面
３５０ テザリングプラスチック繊維
３６０、４６０ 底部
３８０、４８０ 上部
４５０ 繊維
４５５ 人工血管足場
６００ ヒドロゲル足場
６５３、６５５、６５７ ヒドロゲル繊維
７００ 細胞培養装置
７１０ 細胞

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】