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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-31
(54)【発明の名称】ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231024BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231024BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20231024BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231024BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231024BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231024BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231024BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231024BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231024BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20231024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C07K14/725
C07K19/00
C07K16/28
C12N15/13
A61K35/17
A61P35/00
A61K45/00
A61K48/00
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023520016
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-05-26
(86)【国際出願番号】 CN2021121678
(87)【国際公開番号】W WO2022068870
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】202011062635.6
(32)【優先日】2020-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512256605
【氏名又は名称】インスティテュート オブ ズーオロジー、チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ
(71)【出願人】
【識別番号】523115405
【氏名又は名称】ベイジン インスティテュート フォー ステム セル アンド リジェネレイティブ メディシン
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ハオイー
(72)【発明者】
【氏名】シュー，ベイレイ
(72)【発明者】
【氏名】リー，ナー
(72)【発明者】
【氏名】タン，ナー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC41
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、そのＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにその調製方法および使用を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＥＧＦＲを特異的に標的とする細胞外抗原結合ドメインを含み、前記細胞外抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ｉ）前記ＶＨは、配列番号１に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１０に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１３に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１９に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号２１に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号２２に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２４に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号２８に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３０に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号３１に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号３３に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号３７に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３９に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４２に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号４６に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号５１に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む、
ＣＡＲ。
【請求項2】
ｉ）前記ＶＨが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み；ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）前記ＶＨが、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）前記ＶＨが、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨが、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項3】
前記細胞外抗原結合ドメインが一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１または２に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項4】
前記ｓｃＦｖが、配列番号９、１８、２７、３６、４５および５４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項5】
Ｎ末端にＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含み、例えば、前記ＣＤ８αシグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項6】
ＣＤ８α膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインをさらに含み、例えば、前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが配列番号５７のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項7】
前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含み、例えば、前記ヒンジ領域がＣＤ８αヒンジ領域であり、例えば、前記ＣＤ８αヒンジ領域が配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項8】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメインをさらに含み、例えば、前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項9】
４－１ＢＢ共刺激ドメインなどの１以上の共刺激ドメインをさらに含み、例えば、前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号５８のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項10】
配列番号６０～６５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲを標的とするＣＡＲ。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む治療用Ｔ細胞。
【請求項12】
治療用Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体がノックダウンまたはノックアウトされている、請求項１１に記載の治療用Ｔ細胞。
【請求項13】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を、約０．２：１～約０．００６２５：１、例えば、約０．２：１、約０．１：１、約０．０５：１、約０．０２５：１、約０．０１２５：１、および約０．００６２５：１のエフェクター－ターゲット比で特異的に溶解することができる、請求項１１または１２に記載の治療用Ｔ細胞。
【請求項14】
ＥＧＦＲ関連癌を治療するための薬物の調製における、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞の使用。
【請求項15】
対象におけるＥＧＦＲ関連癌を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞、および薬学上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項16】
ＥＧＦＲ関連癌を治療するための方法であって、治療上有効な量の請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞または請求項１５に記載の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項17】
放射線療法および／または化学療法および／または別の腫瘍標的薬物および／または免疫療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＥＧＦＲ関連癌が、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌（非小細胞肺癌ＮＳＣＬＣを含む）、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膀胱癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌ＳＣＣＨＮを含む）、骨肉腫、前立腺癌、神経芽細胞腫、腎腫、神経膠腫、神経膠芽腫および皮膚癌（上皮癌を含む）から選択される、請求項１４に記載の使用、請求項１５に記載の医薬組成物または請求項１６～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項20】
配列番号６６～７１から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
調節配列と作動可能に連結された、請求項１９または２０に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築物。
【請求項22】
請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞を調製するための方法であって、以下の工程：ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程；および
ｂ）請求項１９または２０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２１に記載の発現構築物を前記Ｔ細胞に導入し、それによって、前記Ｔ細胞に請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現させる工程
を含む、
方法。
【請求項23】
ｘ）前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体をノックダウンまたはノックアウトする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ｙ）前記Ｔ細胞を増幅する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
請求項１１～１３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、そのＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにその調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ－１またはＥｒｂ－Ｂ１としても知られ、本明細書では「ＥＧＦＲ」と呼ばれる）は、ｃ－ｅｒｂＢ癌原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す。ＥＧＦＲは、限定されるものではないが、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂および転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含む、チロシンキナーゼによって媒介されるシグナル伝達経路によって、様々な細胞プロセスを調節する。
【0003】
ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の増加および過剰発現が、正常細胞の悪性転化および悪性腫瘍の転移を促進する可能性があることは研究から示されており、ＥＧＦＲのシグナル伝達ネットワークは、腫瘍の形成および発生過程において重要な役割を果たしている。ＥＧＦＲの過剰発現は、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌および乳癌などを含む多くのヒト悪性腫瘍の研究においてすでに報告されている。加えて、ＥＧＦＲの過剰発現が患者の予後不良と関連していることは臨床研究の結果から示されている。ＥＧＦＲは、すでに抗腫瘍療法の特定の標的となっている。
【0004】
ＥＧＦＲを標的とするいくつかの薬物が、ヒト悪性腫瘍の臨床治療に承認されている。これらの薬物は、主に２つのカテゴリーに分類される：最初のカテゴリーは、ＥＧＦＲの細胞外機能領域をブロックするモノクローナル抗体薬、セツキシマブ、パニツムマブおよびニモツズマブなどであり；もう１つのカテゴリーは、ＥＧＦＲの細胞内領域を標的とする小分子チロシンキナーゼ阻害剤、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびアファチニブなどである。これらの薬物の安全性および臨床的有効性はすでに証明されているが、多くの場合、それらの抗腫瘍効果は期待したほど有効ではなく、モノクローナル抗体標的薬の血中濃度の経時的低下、低い標的応答率、およびＥＧＦＲの突然変異などの問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従って、この分野では、ＥＧＦＲ関連悪性腫瘍を治療するための新しい薬物および療法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の概要
一態様において、本発明は、ＥＧＦＲを特異的に標的とする細胞外抗原結合ドメインを含む、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、このＣＡＲでは、前記細胞外抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、
ｉ）前記ＶＨは、配列番号１に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１０に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１３に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１９に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号２１に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号２２に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２４に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号２８に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３０に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号３１に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号３３に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号３７に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３９に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４２に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号４６に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号５１に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
一態様において、本発明は、ＥＧＦＲを特異的に標的とする細胞外抗原結合ドメインを含む、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、このＣＡＲでは、前記細胞外抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、
ｉ）前記ＶＨは、配列番号１に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１０に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１３に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１９に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号２１に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号２２に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２４に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号２８に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３０に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号３１に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号３３に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号３７に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３９に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４２に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号４６に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号５１に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、
ｉ）前記ＶＨが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）前記ＶＨが、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）前記ＶＨが、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨが、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。
ｉ）前記ＶＨが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）前記ＶＨが、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）前記ＶＨが、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨが、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原結合ドメインが一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、前記ｓｃＦｖが、配列番号９、１８、２７、３６、４５および５４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端にＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含み、例えば、前記ＣＤ８αシグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインをさらに含み、例えば、前記ＣＤ８α膜貫通ドメインが配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含み、例えば、前記ヒンジ領域がＣＤ８αヒンジ領域であり、例えば、前記ＣＤ８αヒンジ領域が配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメインをさらに含み、例えば、前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインなどの１以上の共刺激ドメインをさらに含み、例えば、前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号６０～６５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0016】
一態様において、本発明は、本発明のＣＡＲを含む治療用Ｔ細胞を提供する。
【0017】
いくつかの実施形態では、前記治療用Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされている。
【0018】
いくつかの実施形態では、前記治療用Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を、約０．２：１～約０．００６２５：１、例えば、約０．２：１、約０．１：１、約０．０５：１、約０．０２５：１、約０．０１２５：１、および約０．００６２５：１のエフェクター－ターゲット比で特異的に溶解することができる。
【0019】
一態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連癌を治療するための薬物の調製における本発明の治療用Ｔ細胞の使用を提供する。
【0020】
一態様において、本発明は、対象におけるＥＧＦＲ関連癌を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の本発明の治療用Ｔ細胞、および薬学上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0021】
一態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連癌を治療するための方法であって、治療上有効な量の本発明の治療用Ｔ細胞または本発明の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記方法は、放射線療法および／または化学療法および／または別の腫瘍標的薬物および／または免疫療法を前記対象に投与することをさらに含む。
【0023】
本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記ＥＧＦＲ関連癌が、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌（非小細胞肺癌 ＮＳＣＬＣを含む）、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膀胱癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌 ＳＣＣＨＮを含む）、骨肉腫、前立腺癌、神経芽細胞腫、腎腫、神経膠腫、神経膠芽腫および皮膚癌（上皮癌を含む）から選択される。
【0024】
一態様において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６６～７１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0025】
一態様において、本発明は、調節配列と作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する
【0026】
一態様において、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞を調製するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：
ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程；および
ｂ）本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現構築物を前記Ｔ細胞に導入し、それによって、前記Ｔ細胞に本発明のＣＡＲを発現させる工程
を含む。
ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程；および
ｂ）本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現構築物を前記Ｔ細胞に導入し、それによって、前記Ｔ細胞に本発明のＣＡＲを発現させる工程
を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記方法は、
ｘ）前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）をノックダウンまたはノックアウトする工程
をさらに含む。
ｘ）前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）をノックダウンまたはノックアウトする工程
をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図3】図３は、６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＬ－５８２６細胞と長期間共培養し、ＣＲＬ－５８２６細胞のルシフェラーゼ含量を測定して、殺腫瘍値（Ｎ＝４、ＳＥＭ）を定量することを示す。
【図4】図４は、６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能の比較を示す：６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏストレステスト実験。殺滅サンプルウェルからＣＡＲ－Ｔ細胞を１日おきに採取し、新しい腫瘍標的細胞をＥ：Ｔ＝２：１の比率で添加し、殺滅率を検出した（標的細胞：ＣＲＬ－５８２６、Ｅ：Ｔ＝２：１、５０％ＣＡＲ－Ｔ陽性率、Ｎ＝４、ＳＥＭ）。
【図5】図５は、６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能の比較を示す：Ａ）ＮＰＧマウスの実験プロセス。腫瘍細胞接種量：２×１０６／マウス、ＣＡＲ－Ｔ細胞注射用量：１×１０７／マウス、５０％ＣＡＲ陽性、ｉ．ｖ．：尾静脈注射、各群５匹のＮＰＧマウス。Ｂ）マウスの腫瘍体積の変化（Ｎ＝５、ＳＥＭ）。
【図6】図６は、ヒト化ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞とマウス由来ｍ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能の比較を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＲＬ－５８２６細胞と長期間共培養し、ＣＲＬ－５８２６細胞のルシフェラーゼ含量を検出して、殺腫瘍値（Ｎ＝４、ＳＥＭ）を定量する。
【図7】図７は、ＴＧＦ－β受容体ＩＩがノックアウトされたｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞を示す。Ａ）ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞のノックアウト効率は、ＴＩＤＥ法によって検出した。Ｂ）ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔおよびｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率は、フローサイトメトリーによって検出した。
【図8-1】図８は、ＴＧＦ－β受容体ＩＩがノックアウトされたｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅機能の検出を示す。Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＲＬ－５８２６細胞の長期殺滅の検出。ＴＧＦ－β終濃度：５ｎｇ／μｌ、（Ｎ＝４、ＳＥＭ）。Ｂ．ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔおよびｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の４回目および５回目の殺滅の検出。追加のＴＧＦ－βの終濃度：５ｎｇ／μｌ。（Ｎ＝４、ＳＥＭ）。Ｃ）ストレステスト実験におけるｈｕ８０６およびｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞増殖統計。
【図9】図９は、マウスのｉｎ ｖｉｖｏ実験を示す。Ａ）種々の用量のＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＰＧマウスの尾静脈に注射した結果、腫瘍サイズが変化し、腫瘍の再接種後に腫瘍サイズが変化した。各群５匹のマウスにＣＡＲ－Ｔを注射し、陽性率は５０％であった。Ｂ）各実験群およびＰＢＳ群のマウスの末梢血におけるヒトＣＤ３含量は、フローサイトメトリーによって検出した。
【図10-1】図１０は、マウスにおける様々なサブタイプのｈｕＣＤ３の分析実験を示す。Ａ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（１×１０７細胞／マウス、５０％ＣＡＲ陽性）をＮＰＧマウスの尾静脈に注射した後、腫瘍サイズが変化した。ＣＡＲ－ＴＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ増幅能の強い＃４ドナー末梢血を用いて調製した。各群をマウス５匹とした。Ｂ）各実験群およびＰＢＳ群のマウスの末梢血におけるヒトＣＤ３含量は、フローサイトメトリーによって検出した。Ｃ）マウスの末梢血におけるＴ細胞サブタイプの割合は、フローサイトメトリーによって検出した。Ｄ）マウスの末梢血におけるｈｕＣＤ３に対するｈｕＣＤ４およびｈｕＣＤ８の割合は、フローサイトメトリーによって検出した。２１、２８、３６および４２日目に分析のために２群のマウスから末梢血を採取した。
【図11-1】図１１は、担腫瘍ＮＰＧマウスにおけるＨｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ治療用量実験を示す。Ａ）種々の用量のＣＡＲ－Ｔ細胞（それぞれ：２×１０６ＣＡＲ＋細胞／マウス、１×１０６ＣＡＲ＋細胞／マウス、０．５×１０６ＣＡＲ＋細胞／マウスおよび０．２５×１０６ＣＡＲ＋細胞／マウス）をＮＰＧマウスの尾静脈に注射し、腫瘍サイズが変化した。腫瘍が完全に消失した後、再接種すると腫瘍サイズが変化した。各群をマウス５匹とした。Ｂ）各実験群および対照群のマウスの末梢血におけるヒトＣＤ３含量は、フローサイトメトリーによって検出した。
【発明を実施するための形態】
【0029】
発明の詳細な説明
別段の指示または定義がない限り、使用される総ての用語は当技術分野で通常の意味を有し、その意味は当業者によって理解され得る。Sambrook et al.、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」; Lewin、「Genes VIII」；およびRoitt et al.、「Immunology」（第８版）などの標準的なマニュアル、ならびに本明細書に引用されている一般的な既存の技術を参照でき；加えて、別段の指定がない限り、具体的に詳述されていない総ての方法、工程、技術および操作は、当業者によって理解され得る既知の方法で実行される可能性があり、実行されてきた。また、標準的なマニュアル、上記の一般的な既存の技術、およびそこに引用されているその他の参考文献も参照できる。
別段の指示または定義がない限り、使用される総ての用語は当技術分野で通常の意味を有し、その意味は当業者によって理解され得る。Sambrook et al.、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」; Lewin、「Genes VIII」；およびRoitt et al.、「Immunology」（第８版）などの標準的なマニュアル、ならびに本明細書に引用されている一般的な既存の技術を参照でき；加えて、別段の指定がない限り、具体的に詳述されていない総ての方法、工程、技術および操作は、当業者によって理解され得る既知の方法で実行される可能性があり、実行されてきた。また、標準的なマニュアル、上記の一般的な既存の技術、およびそこに引用されているその他の参考文献も参照できる。
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「および／または」は、この用語によって結び付けられた項目の総ての組合せを含み、各組合せはすでに本明細書で別々に列挙されていると考えるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、「Ａ」、「ＡおよびＢ」、および「Ｂ」を包含する。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「ＡおよびＢ」、「ＡおよびＣ」、「ＢおよびＣ」、および「ＡおよびＢおよびＣ」を包含する。
【0031】
用語「含む(comprises/comprising)」がタンパク質または核酸の配列を説明するために本明細書で使用される場合、そのタンパク質または核酸は、その配列から構成されてもよく、またはそのタンパク質の一方または両方の末端に追加のアミノ酸またはヌクレオチドを有してもよいが、本発明に記載の活性を依然として有する。加えて、当業者は、ペプチドのＮ末端の開始コドンによってコードされるメチオニンが、いくつかの実際の状況（特定の発現系で発現される場合など）で保持される可能性があることを承知しているが、それはペプチドの機能に実質的に影響を及ぼさない。従って、本願の明細書及び特許請求の範囲において特定のアミノ酸配列を説明する場合、開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンを含まなくてもよいが、メチオニンを含む配列も包含する。それに対応して、それによってコードされるヌクレオチド配列も開始コドンを含むことができ、逆の場合も同じである。
【0032】
第１の態様において、本発明は、ＥＧＦＲを特異的に標的とする細胞外抗原結合ドメインを含む、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、このＣＡＲでは、前記細胞外抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、
ｉ）前記ＶＨは、配列番号１に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１０に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１３に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１９に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号２１に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号２２に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２４に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号２８に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３０に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号３１に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号３３に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号３７に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３９に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４２に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号４６に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号５１に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
ｉ）前記ＶＨは、配列番号１に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１０に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号１３に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１６に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１９に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号２１に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号２２に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２４に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号２８に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３０に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号３１に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号３３に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号３７に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号３９に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４０に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号４２に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号４６に示されるＶＨ－ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＶＨ－ＣＤＲ２、および配列番号４８に示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、配列番号４９に示されるＶＬ－ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＶＬ－ＣＤＲ２、および配列番号５１に示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原結合ドメインがＶＨおよびＶＬを含み、ここで、
ｉ）前記ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。
ｉ）前記ＶＨは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）前記ＶＨは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）前記ＶＨは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）前記ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）前記ＶＨは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み；または
ｖｉ）前記ＶＨは、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原結合ドメインが一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、前記ＶＨおよびＶＬがリンカーによって連結されている。いくつかの実施形態では、前記リンカーがフレキシブルペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、前記リンカーが、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、前記ｓｃＦｖが、配列番号９、１８、２７、３６、４５および５４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｎ末端にＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ８αシグナルペプチドが配列番号５５のアミノ酸配列を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＤ８α膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ８α膜貫通領域が配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域をさらに含み、例えば、前記ヒンジ領域がＣＤ８αヒンジ領域である。いくつかの実施形態では、前記ＣＤ８αヒンジ領域が配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
【0040】
いくつかの実施様式ではでは、前記ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化に使用され得るシグナル伝達ドメインなどと、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄから選択されるシグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、例えば、前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0041】
いくつかの実施様式では、前記ＣＡＲは、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢＬから選択される共刺激ドメインなどの１以上の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【0042】
いくつかの実施様式では、前記ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＥＧＦＲを標的とするＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、場合によりＮ末端にＣＤ８αシグナルペプチドを含む。
【0043】
いくつかの特定の実施形態では、前記ＣＡＲは、配列番号６０～６５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0044】
別の態様において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６６～７１から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0045】
別の態様において、本発明は、調節配列と作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する。
【0046】
本発明の「発現構築物」は、線状核酸断片、環状プラスミド、ウイルスベクター、または翻訳可能なＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、前記発現構築物は、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【0047】
用語「調節配列」および「調節エレメント」は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を与える、コード配列の上流（５’非コード配列）、中間または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指すために交換可能に使用し得る。発現調節エレメントとは、関与するヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳を制御し得るヌクレオチド配列を指す。調節配列には、限定されるものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサーおよびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」とは、調節エレメント（限定されるものではないが、プロモーター配列、および転写終結配列など）と核酸配列（コード配列またはオープンリーディングフレームなど）との間の連結を指し、ヌクレオチド配列の転写は、転写調節エレメントによって制御および調節されるようになっている。調節エレメント領域を核酸分子に作動可能に連結するための技術は、当技術分野で知られている。
【0049】
別の態様において、本発明は、本発明のＣＡＲを含む治療用Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞膜表面で発現される。
【0050】
いくつかの実施形態では、前記治療用Ｔ細胞のＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされている。
【0051】
本明細書で使用される場合、「治療用Ｔ細胞のＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされている」とは、対照のＴ細胞と比較して、本発明の治療用Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）の発現がダウンレギュレートされるかもしくは発現されない、またはＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）の活性が低下しているかもしくは不活性化されている（拮抗されているなど）ことを意味する。本明細書で使用されるノックダウンまたはノックアウトは、ゲノムレベル、転写レベル、翻訳レベル、または翻訳後レベルであり得る。
【0052】
本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記治療用Ｔ細胞は、対象の自己細胞に由来する。本明細書で使用される場合、「自己」とは、対象の治療に使用される細胞、細胞株、または細胞集団が対象に由来することを指す。いくつかの実施形態では、前記治療用Ｔ細胞は、同種異系細胞に由来し、例えば、治療を受ける対象とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合するドナー対象に由来する。ドナー対象からの細胞は、標準的なスキームを使用して非同種異系反応性細胞に変換され、１以上の対象に適用し得る細胞を生成する必要に応じて複製することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は健康な対象に由来する。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、癌に罹患している対象に由来する。
【0054】
本発明の文脈において記載されるＴ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、および／またはヘルパーＴリンパ球に由来し得る。いくつかの実施形態では、本発明の文脈において記載されるＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球に由来し得る。
【0055】
本発明の文脈におけるＴ細胞は、末梢血単球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む様々な限定されない方法によって、多くの限定されない起源から得ることができる。本発明の文脈におけるＴ細胞は、異なる表現型の特徴を示す細胞の混合集団の一部であってもよい。
【0056】
本発明の治療用Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を特異的に溶解し得る。例えば、本発明の治療用Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞と共培養することにより、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を、約０．２：１～約０．００６２５：１、例えば、約０．２：１、約０．１：１、約０．０５：１、約０．０２５：１、約０．０１２５：１、および約０．００６２５：１のエフェクター－ターゲット比（治療用Ｔ細胞：ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞）で効果的かつ特異的に溶解し得る。例えば、１、２、３、４、５、６、または７日間の共培養後、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、さらに、少なくとも約９０％以上が溶解される。
【0057】
本願の文脈において使用される場合、「対象」とは、本発明の細胞、医薬組成物、または方法によって治療することができる疾患（例えば、ＥＧＦＲ関連癌などの癌）に罹患しているまたは罹患しやすい生物を指す。限定されない例には、ヒト、ウシ、ラット、マウス、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、および他の非哺乳類が含まれる。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【0058】
別の態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の治療用Ｔ細胞、および薬学上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、対象におけるＥＧＦＲ関連癌を治療するために使用される。
【0059】
本明細書で使用される「薬学上許容される担体」には、ありとあらゆる生理学上適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが包含される。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮への投与（例えば、注射または注入による）に適している。
【0060】
別の態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連癌を治療するための薬物の調製における本発明の治療用Ｔ細胞の使用を提供する。
【0061】
本発明の別の態様において、治療上有効な量の本発明の治療用Ｔ細胞または本発明の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む、ＥＧＦＲ関連癌を治療するための方法がさらに提供される。
【0062】
いくつかの実施様式では、前記方法は、放射線療法および／または化学療法および／または別の腫瘍標的薬物（他の抗原を標的とするモノクローナル抗体または小分子化合物など）および／または免疫療法（免疫チェックポイント阻害剤など）を前記対象に投与することをさらに含む。
【0063】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」または「有効な量」とは、対象への投与後に治療効果を生み出すのに少なくとも十分な物質、化合物、材料または細胞の量を指す。従って、疾患または疾患の症状を予防、治癒、改善、遮断または部分的に遮断するのに必要な量である。本明細書で使用される場合、治療は疾患（癌など）の再発を防止することも包含する。
【0064】
例えば、本発明の細胞または医薬組成物の「有効な量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患の頻度と無症候期間の増加、または疾患の痛みによって引き起こされる損傷もしくは障害の予防につながる。例えば、腫瘍の治療では、未治療の対象と比較して、本発明の細胞または医薬組成物の「有効な量」は、好ましくは、腫瘍細胞増殖または腫瘍増殖を、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％阻害する。腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいは、腫瘍細胞増殖を阻害する能力を調べることによって評価することができ、この阻害は、当業者に周知の実験によってｉｎ ｖｉｔｒｏで決定することができる。
【0065】
実際の応用においては、本発明の医薬組成物中の細胞の用量レベルを変更して、患者への毒性がなく、特定の対象に対して所望の治療反応を効果的に達成し得る有効成分組成物の量および投与様式を得ることができる。用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与のタイミング、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態および病歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に応じて選択することができる。
【0066】
本明細書で使用される場合、治療上有効な量の治療用Ｔ細胞とは、使用後に腫瘍細胞の量を減少させ得る治療用Ｔ細胞の量、例えば、腫瘍細胞の量を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および少なくとも約９０％減少させ得るか、または癌の完全寛解を達成し得る量を指す。本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記有効な量の治療用Ｔ細胞が、約１０４～約１０９個の細胞、例えば、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、または約１０９個の細胞である。いくつかの実施形態において、前記治療用Ｔ細胞の投与量が、対象の体重に従って決定され、例えば、約１０４細胞／ｋｇ体重～約１０９細胞／ｋｇ体重、例えば、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、または約１０９細胞／ｋｇ体重である。
【0067】
本発明者の研究結果から、本発明の、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされている治療用Ｔ細胞が、対照Ｔ細胞（ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされていない）と比較して、より少ない用量でより良い治療効果を達成し得ることが示されている。例えば、本発明のＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）を有する治療用Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞より低いエフェクト－ターゲット比でおよび／またはより長い期間、より優れた殺腫瘍効果を達成し得る。これは、調製時間およびコストを削減するのに特に有益であり、高用量投与によって引き起こされる副作用も軽減され得る。
【0068】
例えば、本発明の、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩＩなど）を有する治療用Ｔ細胞の投与用量は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）がノックダウンまたはノックアウトされていない対照Ｔ細胞の投与用量よりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約８０倍、約１００倍、約１５０倍、約１６０倍、約２００倍以上低い。
【0069】
本発明による細胞または組成物の投与は、注射、注入、植え込みまたは移植を含む任意の好都合な形式で実行し得る。本明細書に記載される細胞または組成物の投与は、静脈内、リンパ管、皮内、腫瘍内、髄内、筋肉内、または腹腔内に投与し得る。ある実行スキームでは、本発明の細胞または組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
【0070】
本発明の各態様のいくつかの実施形態では、前記ＥＧＦＲ関連癌が、限定されるものではないが、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌（非小細胞肺癌 ＮＳＣＬＣを含む）、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膀胱癌、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌 ＳＣＣＨＮを含む）、骨肉腫、前立腺癌、神経芽細胞腫、腎腫、神経膠腫、神経膠芽腫および皮膚癌（上皮癌を含む）を含む、腫瘍細胞がＥＧＦＲを発現する癌である。
【0071】
別の態様において、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞を調製するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：
ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程；および
ｂ）本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現構築物を前記Ｔ細胞に導入し、それによって、前記Ｔ細胞に本発明のＣＡＲを発現させる工程
を含む。
ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程；および
ｂ）本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現構築物を前記Ｔ細胞に導入し、それによって、前記Ｔ細胞に本発明のＣＡＲを発現させる工程
を含む。
【0072】
単離されたＴ細胞を提供する工程は、Ｔ細胞を分離するための当技術分野で公知の方法によって実行し得る。例えば、市販のキットを使用して、対象の末梢血からＴ細胞を単離し得る。適切なキットには、限定されるものではないが、EasySep human T cell Enrichment kit(Stemcell Technologies)が挙げられる。上記のように、単離されたＴ細胞は、必ずしも均質である必要はなく、異なる細胞の混合集団であってよく、好ましくは、Ｔ細胞が集団中に富んでいる。
【0073】
いくつかの実施形態では、前記方法は、
ｘ）前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）の発現をノックダウンまたはノックアウトする工程
をさらに含む。
ｘ）前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩなど）の発現をノックダウンまたはノックアウトする工程
をさらに含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、前記工程ｘ）が前記工程ｂ）の前に実行される。いくつかの実施形態では、前記工程ｘ）が前記工程ｂ）の後に実行される。
【0075】
細胞におけるタンパク質発現をノックダウンまたはノックアウトするための複数の方法が当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）の発現が、アンチセンスＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡを導入することによってノックダウンまたはノックアウトされる。他の実行様式において、前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）の発現が、遺伝子編集方法によって、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ(transcription activator like effector nuclease)またはＣＲＩＳＰＲシステムを導入することによってノックダウンまたはノックアウトされている。本発明の方法の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムが前記Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）の発現をノックダウンまたはノックアウトするために使用される。いくつかの実施様式では、ＣＲＩＳＰＲシステムによって使用されるヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）は、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３もしくはＣ２ｃ２タンパク質、またはこれらのヌクレアーゼの機能的バリアントから選択し得る。
【0076】
前記ポリヌクレオチド、発現構築物および／またはタンパク質は、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－グルカンまたは他の物質を使用したトランスフェクション；パーティクルボンバードメント；リポソームトランスフェクション；および感染（例えば、この発現構築物はウイルスである）を包含する任意の適当な方法によって前記細胞に導入し得る。
【0077】
本発明のＴ細胞は、任意の修飾工程の前または後に活性化し、増幅し得る。このＴ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増幅し得る。
【0078】
従って、いくつかの実施形態において、前記方法は、
ｙ）前記Ｔ細胞を増幅する工程
をさらに含む。
ｙ）前記Ｔ細胞を増幅する工程
をさらに含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、前記工程ｙ）が前記工程ｂ）の前および／または後に実行される。いくつかの実施形態では、前記工程ｙ）が前記工程ｘ）の前および／または後に実行される。
【0080】
通常、本発明のＴ細胞は、例えば、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体の表面の共刺激分子を刺激する試薬とＴ細胞とを接触させて、Ｔ細胞活性化シグナルを生成することによって、増幅し得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、または、例えばフィトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂レクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成し得る。いくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、例えば、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）とカルシウムイオノフォアとを接触させることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し得る。例えば、Ｔ細胞増殖を刺激するのに適切な条件下では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。Ｔ細胞培養に適用可能な条件には、増殖および活力に必要な因子を含み得る好適な培地（最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ ５、（Ｌｏｎｚａ）など）が含まれ、ここで、必要な因子には、血清（ウシ胎児またはヒト血清など）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ、または細胞増殖のための当業者に公知の添加剤が含まれる。細胞増殖のために使用される他の添加剤には、限定されるものではないが、界面活性剤、ヒト血漿タンパク質粉末、および還元剤（例えば、Ｎ－アセチルシステインおよび２－メルカプト酢酸）が包含される。培地には、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類、無血清もしくは適度に添加された血清（もしくは血漿）もしくは一連の確定されたホルモン、ならびに／またはＴ細胞成長および増幅を促進するのに十分な一定量のサイトカインが包含され得る。Ｔ細胞は、増殖を支援するために必要な条件下、例えば、適当な温度（例えば、３７℃）および環境（例えば、空気＋５％ＣＯ２）下で維持し得る。
【0081】
別の態様において、本発明は、本発明の治療用Ｔ細胞を調製するためのキットをさらに提供する。本発明のキットは、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現構築物、および／またはＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）の発現をノックダウンもしくはノックアウトするためのツール、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ(transcription activator like effector nuclease)またはＣＲＩＳＰＲシステムまたはそれをコードする核酸またはベクターを包含する。このキットは、前記Ｔ細胞を分離、培養、および／または増幅するための試薬、前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質を前記細胞に導入するための調製物などをさらに含み得る。
【実施例】
【0082】
以下に本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は記載する実施例の範囲に限定されるものではない。
【0083】
実験材料および方法
１．ＣＤ３＋Ｔ細胞の分離、刺激、および増幅
健康なドナーからの新鮮な臍帯血を、インフォームドコンセントを得て、北京臍帯血バンクから取得した。単核細胞は、ヒトリンパ球分離液(天津市ハオヤン生物製品科技有限責任公司)を使用することによって分離した。Ｔ細胞を、EasySep human T cell Enrichment kit(Stemcell Technologies)を使用することによって分離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(Thermo Fisher Scientific)を使用説明書に従って加え、分離されたＴ細胞を１：１の比率で活性化した。Ｔ細胞用の培地は、５％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清(GIBCO)および４００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２(Sino-biological Inc.)を添加したＸ－ＶＩＶＯ１５培地(Lonza)であった。
１．ＣＤ３＋Ｔ細胞の分離、刺激、および増幅
健康なドナーからの新鮮な臍帯血を、インフォームドコンセントを得て、北京臍帯血バンクから取得した。単核細胞は、ヒトリンパ球分離液(天津市ハオヤン生物製品科技有限責任公司)を使用することによって分離した。Ｔ細胞を、EasySep human T cell Enrichment kit(Stemcell Technologies)を使用することによって分離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(Thermo Fisher Scientific)を使用説明書に従って加え、分離されたＴ細胞を１：１の比率で活性化した。Ｔ細胞用の培地は、５％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清(GIBCO)および４００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２(Sino-biological Inc.)を添加したＸ－ＶＩＶＯ１５培地(Lonza)であった。
【0084】
２．抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
７種の抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖ遺伝子断片をそれぞれ合成し(華大青蘭生物科技有限公司)、ＳｃＦｖフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩおよびＭｌｕ Ｉの２つの酵素消化部位によってｐＲＲＬＳＩＮレンチウイルスベクターにそれぞれクローニングした。３プラスミド系ベクタープラスミド、ｐＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２を、Ｌｉｐｏ３０００(Thermo Fisher Scientific)を使用することによって、２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、それぞれ、４８時間および７２時間の時点でレンチウイルス培養上清を採取し、濃縮カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルター、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００Ｋ）で濃縮した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気ビーズで２４時間刺激した後、レンチウイルス感染を実施した。感染時には、ＣＤ３＋Ｔ細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整した。ＭＯＩ＝１の比率に従って、共トランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ(Ｓｉｇｍａ)を同時に加え、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅの終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。４８時間の感染後、フローサイトメーターによってＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した。
７種の抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖ遺伝子断片をそれぞれ合成し(華大青蘭生物科技有限公司)、ＳｃＦｖフラグメントを、Ｂａｍ ＨＩおよびＭｌｕ Ｉの２つの酵素消化部位によってｐＲＲＬＳＩＮレンチウイルスベクターにそれぞれクローニングした。３プラスミド系ベクタープラスミド、ｐＭＤ２．ＧおよびｐｓＰＡＸ２を、Ｌｉｐｏ３０００(Thermo Fisher Scientific)を使用することによって、２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、それぞれ、４８時間および７２時間の時点でレンチウイルス培養上清を採取し、濃縮カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルター、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００Ｋ）で濃縮した。ヒト初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気ビーズで２４時間刺激した後、レンチウイルス感染を実施した。感染時には、ＣＤ３＋Ｔ細胞密度を２×１０６／ｍｌに調整した。ＭＯＩ＝１の比率に従って、共トランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ(Ｓｉｇｍａ)を同時に加え、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅの終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。４８時間の感染後、フローサイトメーターによってＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した。
【0085】
３．フローサイトメトリー検出
約１～１０×１０５個の細胞を集め、抗体会社の推奨用量に従って染色した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ(Beckman Coulter Inc.)をオンマシン検出に使用した。以下の抗体を使用した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）フローサイトメトリー抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７(１０９－６０６－００３、Jackson)、マウス抗ヒトＣＤ３フローサイトメトリーモノクローナル抗体 Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１(３００４３４、BioLegend)、マウス抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体ＰＥ(３５２９０３、BioLegend)、８０６組換えモノクローナル抗体(Genscriptによる合成品)、マウス抗ヒトＣＤ４フローサイトメトリーモノクローナル抗体ＰＥ(３００５０８、BioLegend)、マウス抗ヒトＣＤ８αフローサイトメトリーモノクローナル抗体ＡＰＣ(３０１０１４、BioLegend)、マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＯフローサイトメトリーモノクローナル抗体ＰＥ(３０４２０５、BioLegend)、およびマウス抗ヒトＣＣＲ７フローサイトメトリーモノクローナル抗体ＡＰＣ(３５３２１３、BioLegend)。
約１～１０×１０５個の細胞を集め、抗体会社の推奨用量に従って染色した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ(Beckman Coulter Inc.)をオンマシン検出に使用した。以下の抗体を使用した：ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）フローサイトメトリー抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７(１０９－６０６－００３、Jackson)、マウス抗ヒトＣＤ３フローサイトメトリーモノクローナル抗体 Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１(３００４３４、BioLegend)、マウス抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体ＰＥ(３５２９０３、BioLegend)、８０６組換えモノクローナル抗体(Genscriptによる合成品)、マウス抗ヒトＣＤ４フローサイトメトリーモノクローナル抗体ＰＥ(３００５０８、BioLegend)、マウス抗ヒトＣＤ８αフローサイトメトリーモノクローナル抗体ＡＰＣ(３０１０１４、BioLegend)、マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＯフローサイトメトリーモノクローナル抗体ＰＥ(３０４２０５、BioLegend)、およびマウス抗ヒトＣＣＲ７フローサイトメトリーモノクローナル抗体ＡＰＣ(３５３２１３、BioLegend)。
【0086】
４．ＣＡＲ－Ｔ細胞のエレクトロポレーションおよび編集効率の検出
Ｔ細胞活性化の３日後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを磁石で除去した。エレクトロポレーションの前に、ＲＮＰ複合体を調製し、６μｇのＣａｓ９タンパク質(Shenzhen Feipeng Biotechnology Co., Ltd.)およびｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し調製した６μｇのｓｇＲＮＡ（標的配列：ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡ）を室温で２０分間インキュベートした。２０μｌのＰ３初代細胞４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸキットエレクトロポレーション溶液(Ｖ４ＸＰ－３０２４、Lonza)を使用することによって、１×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を再懸濁し、インキュベートしたＲＮＰを加えた。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｎ(Lonza)エレクトロポレーターを、ＥＯ－１１５エレクトロポレーション条件下でのエレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーション後、細胞混合物を抽出し、予熱したＴ細胞培地に移した。４８時間後、エレクトロポレーション効率を検出した。サンガー配列決定（配列決定プライマー：ＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｆ：５’－ｃａｃａｔｃｔｇｇｃｃｃｇｃａｃａｔｃｔ－３’；およびＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｒ：５’－ｇｇａａａｃｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｔｃｃｇｃ－３’）は、サーベイヤーアッセイのＰＣＲ産物（プライマー：ＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｆ：５’－ｃａｃａｔｃｔｇｇｃｃｃｇｃａｃａｔｃｔ－３’；およびＴＧＦｂＲ２－ＧＴ－Ｒ：５’－ｇｇｇｔｇｇｃｔｃａｇａａａｇａｇｃｔｇ－３’）に対して実施した。ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌにより、配列決定結果を分析した。
Ｔ細胞活性化の３日後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを磁石で除去した。エレクトロポレーションの前に、ＲＮＰ複合体を調製し、６μｇのＣａｓ９タンパク質(Shenzhen Feipeng Biotechnology Co., Ltd.)およびｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し調製した６μｇのｓｇＲＮＡ（標的配列：ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡ）を室温で２０分間インキュベートした。２０μｌのＰ３初代細胞４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸキットエレクトロポレーション溶液(Ｖ４ＸＰ－３０２４、Lonza)を使用することによって、１×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を再懸濁し、インキュベートしたＲＮＰを加えた。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｎ(Lonza)エレクトロポレーターを、ＥＯ－１１５エレクトロポレーション条件下でのエレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーション後、細胞混合物を抽出し、予熱したＴ細胞培地に移した。４８時間後、エレクトロポレーション効率を検出した。サンガー配列決定（配列決定プライマー：ＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｆ：５’－ｃａｃａｔｃｔｇｇｃｃｃｇｃａｃａｔｃｔ－３’；およびＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｒ：５’－ｇｇａａａｃｔｔｔｃｃｔｃｇｔｔｔｃｃｇｃ－３’）は、サーベイヤーアッセイのＰＣＲ産物（プライマー：ＴＧＦｂＲ２－ＴＩＤＥ－Ｆ：５’－ｃａｃａｔｃｔｇｇｃｃｃｇｃａｃａｔｃｔ－３’；およびＴＧＦｂＲ２－ＧＴ－Ｒ：５’－ｇｇｇｔｇｇｃｔｃａｇａａａｇａｇｃｔｇ－３’）に対して実施した。ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｔｉｄｅ．ｎｋｉ．ｎｌにより、配列決定結果を分析した。
【0087】
５．ＣＡＲ－Ｔ細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅実験（ルシフェラーゼ検出法）
ＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉ細胞の構築：野生型ＣＲＬ－５８２６細胞にルシフェラーゼおよびピューロマイシン耐性スクリーニング遺伝子を発現するレンチウイルスを感染させ、その後、ピューロマイシンで２週間スクリーニングして、ルシフェラーゼを安定に発現するＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉ細胞を得た。殺滅実験：１６４０完全培地を使用することによって標的細胞ＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉを、細胞密度が１×１０６／ｍｌとなるように再懸濁した。標的細胞懸濁液を９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌ接種した。異なる数のエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター－ターゲット比に従ってそれぞれ加え、各エフェクター－ターゲット比について４反復で行った。各ウェルの最終容量は２００μｌであった。それらをインキュベーターに入れ、異なる時点で取り出し、殺滅効率を検出した。検出時には、１０μｌのＳｔｅａｄｙ－ｇｌｏ フルオレセイン基質(Promega)を各ウェルに加え、５分間反応させた。蛍光値は、マイクロプレートリーダーＰｅｒｉｎＥｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ Ｘ３を使用することによって検出した。標的細胞に対するエフェクター細胞の殺滅効率は各ウェルの蛍光値に基づいて計算した：特異的溶解（％）＝（１－ＲＵＬ エフェクター細胞＋標的細胞／ＲＵＬ 標的細胞）×１００（ＲＵＬ：相対光単位）。
ＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉ細胞の構築：野生型ＣＲＬ－５８２６細胞にルシフェラーゼおよびピューロマイシン耐性スクリーニング遺伝子を発現するレンチウイルスを感染させ、その後、ピューロマイシンで２週間スクリーニングして、ルシフェラーゼを安定に発現するＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉ細胞を得た。殺滅実験：１６４０完全培地を使用することによって標的細胞ＣＲＬ－５８２６－Ｌｕｃｉを、細胞密度が１×１０６／ｍｌとなるように再懸濁した。標的細胞懸濁液を９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌ接種した。異なる数のエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター－ターゲット比に従ってそれぞれ加え、各エフェクター－ターゲット比について４反復で行った。各ウェルの最終容量は２００μｌであった。それらをインキュベーターに入れ、異なる時点で取り出し、殺滅効率を検出した。検出時には、１０μｌのＳｔｅａｄｙ－ｇｌｏ フルオレセイン基質(Promega)を各ウェルに加え、５分間反応させた。蛍光値は、マイクロプレートリーダーＰｅｒｉｎＥｌｍｅｒ ＶＩＣＴＯＲ Ｘ３を使用することによって検出した。標的細胞に対するエフェクター細胞の殺滅効率は各ウェルの蛍光値に基づいて計算した：特異的溶解（％）＝（１－ＲＵＬ エフェクター細胞＋標的細胞／ＲＵＬ 標的細胞）×１００（ＲＵＬ：相対光単位）。
【0088】
６．ＣＡＲ－Ｔ細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅実験（ＲＴＣＡ検出法）
エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅機能を、リアルタイム非標識細胞機能分析装置を使用することによって検出した。線維芽細胞、ＣＲＬ－５８２６細胞、およびＫ５６２細胞をそれぞれＥ－Ｐｌａｔｅ１６（ＡＣＥＡ）に播種し、２５００個の細胞を各ウェルに加え、２反復で行った。２４時間後、エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター－ターゲット比（０．２：１、０．０５：１、０．０１２５：１、および０：１）に従ってそれぞれ加えた。細胞指数（ＣＩ）値を４日間継続的に観察した。エフェクター細胞の標的細胞に対する殺滅効率は各ウェルのＣＩ値に基づいて計算した：特異的溶解（％）＝（１－ＣＩ エフェクター細胞＋標的細胞／ＣＩ 標的細胞）×１００。
エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅機能を、リアルタイム非標識細胞機能分析装置を使用することによって検出した。線維芽細胞、ＣＲＬ－５８２６細胞、およびＫ５６２細胞をそれぞれＥ－Ｐｌａｔｅ１６（ＡＣＥＡ）に播種し、２５００個の細胞を各ウェルに加え、２反復で行った。２４時間後、エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター－ターゲット比（０．２：１、０．０５：１、０．０１２５：１、および０：１）に従ってそれぞれ加えた。細胞指数（ＣＩ）値を４日間継続的に観察した。エフェクター細胞の標的細胞に対する殺滅効率は各ウェルのＣＩ値に基づいて計算した：特異的溶解（％）＝（１－ＣＩ エフェクター細胞＋標的細胞／ＣＩ 標的細胞）×１００。
【0089】
７．マルチラウンド抗原刺激（ストレステスト）実験
２×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ－５８２６腫瘍細胞と共培養し、エフェクター－ターゲット比は１：１である。２日後、総ての腫瘍細胞を溶解し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した後、新しい腫瘍細胞を追加した。同様に、新しい腫瘍細胞を１日おきに追加し、異なる群間でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効率に有意な差が現れるまで、エフェクター－ターゲット比を１：１に維持した。添加群のＴＧＦ－β１濃度は５ｎｇ／ｍｌに維持した。
２×１０５個のＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ－５８２６腫瘍細胞と共培養し、エフェクター－ターゲット比は１：１である。２日後、総ての腫瘍細胞を溶解し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を計数した後、新しい腫瘍細胞を追加した。同様に、新しい腫瘍細胞を１日おきに追加し、異なる群間でＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効率に有意な差が現れるまで、エフェクター－ターゲット比を１：１に維持した。添加群のＴＧＦ－β１濃度は５ｎｇ／ｍｌに維持した。
【0090】
８．担腫瘍マウスモデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞機能の検出
実験マウスは６週齢のＮＰＧ雌マウス（Ｗｅｉｔｏｎｇｄａ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）であった。ＣＲＬ－５８２６細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、細胞密度は２×１０７／ｍｌであった。それぞれ１００μｌの細胞懸濁液を採取し、１００μｌのマトリゲルを加え、マウスに皮下注射を行った。各マウスに約２×１０６個のＣＲＬ－５８２６細胞を注射し、腫瘍体積は４週間後に約３００ｍｍ３であった。腫瘍のサイズに応じて、担腫瘍マウスを無作為に群化し、実験群当たり５匹のマウスを割り当てた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なる注射用量で尾静脈に１回注射した（ＣＡＲ＋は約５０％である）。腫瘍体積、末梢血中のヒトＣＤ３含量、およびＴ細胞サブタイプの割合を毎週測定した。腫瘍塊の再接種：ＰＢＳ群のマウスを安楽死させ、腫瘍塊を摘出し、２００～３００ｍｍ３の腫瘍塊に分割し、腫瘍が完全に除去されたマウスの反対側の皮下にそれぞれ接種した。４匹の新たなＮＰＧマウスを選び、再接種対照として分割した腫瘍塊を皮下に接種した。
実験マウスは６週齢のＮＰＧ雌マウス（Ｗｅｉｔｏｎｇｄａ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）であった。ＣＲＬ－５８２６細胞をＤＰＢＳで再懸濁し、細胞密度は２×１０７／ｍｌであった。それぞれ１００μｌの細胞懸濁液を採取し、１００μｌのマトリゲルを加え、マウスに皮下注射を行った。各マウスに約２×１０６個のＣＲＬ－５８２６細胞を注射し、腫瘍体積は４週間後に約３００ｍｍ３であった。腫瘍のサイズに応じて、担腫瘍マウスを無作為に群化し、実験群当たり５匹のマウスを割り当てた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なる注射用量で尾静脈に１回注射した（ＣＡＲ＋は約５０％である）。腫瘍体積、末梢血中のヒトＣＤ３含量、およびＴ細胞サブタイプの割合を毎週測定した。腫瘍塊の再接種：ＰＢＳ群のマウスを安楽死させ、腫瘍塊を摘出し、２００～３００ｍｍ３の腫瘍塊に分割し、腫瘍が完全に除去されたマウスの反対側の皮下にそれぞれ接種した。４匹の新たなＮＰＧマウスを選び、再接種対照として分割した腫瘍塊を皮下に接種した。
【0091】
実施例１：抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖ配列の合成およびベクター構築
６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖ配列と１つのマウス由来抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖを既存の特許および国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から見出した（ｈｕ８０６（ＵＳ００９４９３５６８Ｂ２）、Ｅ２（ＵＳ２０１５００３０５９９Ａ１）、Ｐａｎ（ＵＳ２０１５０１５２１８４Ａ１）、Ｎｅｃ（ＷＯ２００５／０９０４０７Ａ１）、Ｎｉｍｏ（ＵＳ６５０６８８３Ｂ２）、３０１（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＪＱ３０６３３０．１）、およびｍ８０６（ＷＯ０２０９２７７１Ａ２））。遺伝子合成後、これらの７種のＳｃＦｖをそれぞれＣＡＲフレームワーク遺伝子とともにレンチウイルスベクターｐＲＲＬＳＩＮプラスミドに挿入した（図１）。
６種のヒト化抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖ配列と１つのマウス由来抗ＥＧＦＲ ＳｃＦｖを既存の特許および国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から見出した（ｈｕ８０６（ＵＳ００９４９３５６８Ｂ２）、Ｅ２（ＵＳ２０１５００３０５９９Ａ１）、Ｐａｎ（ＵＳ２０１５０１５２１８４Ａ１）、Ｎｅｃ（ＷＯ２００５／０９０４０７Ａ１）、Ｎｉｍｏ（ＵＳ６５０６８８３Ｂ２）、３０１（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＪＱ３０６３３０．１）、およびｍ８０６（ＷＯ０２０９２７７１Ａ２））。遺伝子合成後、これらの７種のＳｃＦｖをそれぞれＣＡＲフレームワーク遺伝子とともにレンチウイルスベクターｐＲＲＬＳＩＮプラスミドに挿入した（図１）。
【0092】
実施例２：抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
実施例１に記載した異なるＳｃＦｖを含む７種のＣＡＲ構造をそれぞれレンチウイルスによりヒト初代Ｔ細胞に導入した。ヒト初代Ｔ細胞を同じウイルス力価で感染させた後、感染後５日目にＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した（図２）。結果から、同じレンチウイルス力価の条件下でも、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率には依然として比較的大きな差異とクラスターがあることが分かる。
実施例１に記載した異なるＳｃＦｖを含む７種のＣＡＲ構造をそれぞれレンチウイルスによりヒト初代Ｔ細胞に導入した。ヒト初代Ｔ細胞を同じウイルス力価で感染させた後、感染後５日目にＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率を検出した（図２）。結果から、同じレンチウイルス力価の条件下でも、異なるＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率には依然として比較的大きな差異とクラスターがあることが分かる。
【0093】
実施例３：抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの殺滅機能の比較
異なるｓｃＦｖ源からの抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅機能を比較するために、ＣＲＬ－５８２６細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ低エフェクター－ターゲット比長期殺滅実験および腫瘍抗原連続刺激殺滅ストレステスト実験に供した（図３および図４）。結果から、ｈｕ８０６およびＮｉｍｏ ＣＡＲ－Ｔは、他の４種のｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔと比較して、より強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍機能を有することが分かる。加えて、ストレステストの結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔの腫瘍除去効果がＮｉｍｏ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍除去効果よりも優れていることが示されている。次に、ＮＰＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏ担腫瘍および治療実験（図５Ａ）を実施した。ＣＲＬ－５８２６細胞により皮下に腫瘍を形成し、５週間後に６種類の抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ同用量で尾静脈に注射した。その後、腫瘍体積の変化を毎週観察した（図５Ｂ）。結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞が最適なｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍除去効果を有することが示されている。
異なるｓｃＦｖ源からの抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅機能を比較するために、ＣＲＬ－５８２６細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ低エフェクター－ターゲット比長期殺滅実験および腫瘍抗原連続刺激殺滅ストレステスト実験に供した（図３および図４）。結果から、ｈｕ８０６およびＮｉｍｏ ＣＡＲ－Ｔは、他の４種のｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔと比較して、より強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍機能を有することが分かる。加えて、ストレステストの結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔの腫瘍除去効果がＮｉｍｏ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍除去効果よりも優れていることが示されている。次に、ＮＰＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏ担腫瘍および治療実験（図５Ａ）を実施した。ＣＲＬ－５８２６細胞により皮下に腫瘍を形成し、５週間後に６種類の抗ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ同用量で尾静脈に注射した。その後、腫瘍体積の変化を毎週観察した（図５Ｂ）。結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞が最適なｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍除去効果を有することが示されている。
【0094】
実施例４：ヒト化ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞とマウス由来ｍ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅機能の比較
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６ ＳｃＦｖは、もともとマウスＩｇＧ２ｂ（ｍ８０６）に由来し、ＦＲ領域の配列がヒト化されて、ヒト化８０６（ｈｕ８０６）になった。この出願では、ヒト化およびマウス８０６ ＳｃＦｖに由来するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能を比較した。実験結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞はより強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍機能を有することが示されている（図６）。
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６ ＳｃＦｖは、もともとマウスＩｇＧ２ｂ（ｍ８０６）に由来し、ＦＲ領域の配列がヒト化されて、ヒト化８０６（ｈｕ８０６）になった。この出願では、ヒト化およびマウス８０６ ＳｃＦｖに由来するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能を比較した。実験結果から、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞はより強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍機能を有することが示されている（図６）。
【0095】
マウスＩｇＧ２ｂ（ｍ８０６）ＣＡＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８１および８２に示し、マウスＩｇＧ２ｂ（ｍ８０６）ＣＡＲの各部分は下記表１に対応する。
【0096】
【表1】
【0097】
実施例５：ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＴＧＦ－β受容体ＩＩがノックアウトされた後、抗腫瘍能力は増強され得る
ＴＧＦ－β受容体がノックアウトされたｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞とノックアウトされていないものの抗腫瘍機能を比較した。ヒト初代Ｔ細胞にレンチウイルスを感染させ、４８時間後に、ＴＧＦｂＲ２を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。２日後、ノックアウト細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＡＲ－Ｔ細胞のノックアウト効率（図７Ａ）および陽性率（図７Ｂ）をＴＩＤＥ法により検出した。７日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後、ＴＧＦ－βの存在下でのｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍条件を観察する。
ＴＧＦ－β受容体がノックアウトされたｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞とノックアウトされていないものの抗腫瘍機能を比較した。ヒト初代Ｔ細胞にレンチウイルスを感染させ、４８時間後に、ＴＧＦｂＲ２を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰをエレクトロポレーションした。２日後、ノックアウト細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＡＲ－Ｔ細胞のノックアウト効率（図７Ａ）および陽性率（図７Ｂ）をＴＩＤＥ法により検出した。７日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後、ＴＧＦ－βの存在下でのｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺腫瘍条件を観察する。
【0098】
結果から、ＴＧＦ－βはｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍機能を阻害することが示され、ＴＧＦ－β受容体ＩＩがノックアウトされると、ＣＡＲ－Ｔ細胞機能に対するＴＧＦ－βの阻害効果（図８Ａ）が逆転する可能性がある。また、ストレステストの実験結果から、複数ラウンドの腫瘍抗原連続刺激の後、ｈｕ８０６－ＴＫＯはｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してより多くの抗腫瘍利点を有することも示される（図８Ｂ）。加えて、ＴＧＦ－β受容体ＩＩがノックアウトされたｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くの増殖上の利点を有する（図８Ｃ）。
【0099】
実施例６：ＮＰＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏ実験は、ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔがより優れた治療効果を有することを示す
Ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞と８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞を異なる用量で注射し、担腫瘍ＮＰＧマウスにおける腫瘍体積の変化を観察した（図９Ａ）。動物のｉｎ ｖｉｖｏ実験結果から、注射用量が高いほど、腫瘍除去速度が速いことが示されている。加えて、同じ用量条件下では、ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果は、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果よりも有意に優れていた（図９Ａ）。腫瘍が完全に除去されたｈｕ８０６－ＴＫＯ群のマウスに対して腫瘍再接種を実施した。３～４週間後、実験群のマウスは再び腫瘍を除去する能力を示した。マウスの末梢血中のヒトＣＤ３の割合を分析することにより、ｈｕ８０６－ＴＫＯ群のｈＣＤ３の割合がｈｕ８０６群よりも有意に高く（図８Ｂ）、腫瘍除去効果と正の相関があることが分かる。
Ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞と８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞を異なる用量で注射し、担腫瘍ＮＰＧマウスにおける腫瘍体積の変化を観察した（図９Ａ）。動物のｉｎ ｖｉｖｏ実験結果から、注射用量が高いほど、腫瘍除去速度が速いことが示されている。加えて、同じ用量条件下では、ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果は、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果よりも有意に優れていた（図９Ａ）。腫瘍が完全に除去されたｈｕ８０６－ＴＫＯ群のマウスに対して腫瘍再接種を実施した。３～４週間後、実験群のマウスは再び腫瘍を除去する能力を示した。マウスの末梢血中のヒトＣＤ３の割合を分析することにより、ｈｕ８０６－ＴＫＯ群のｈＣＤ３の割合がｈｕ８０６群よりも有意に高く（図８Ｂ）、腫瘍除去効果と正の相関があることが分かる。
【0100】
実施例７：ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した担腫瘍ＮＰＧマウスの末梢血中のＴ細胞サブタイプの割合
動物に注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅とサブタイプの割合の変化を観察するために、良好なｉｎ ｖｉｖｏ増幅効果を有する＃４ドナーのＣＤ３ Ｔ細胞を使用することによってｈｕ８０６細胞およびｈｕ８０６－ＴＫＯ細胞を調製した。２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞およびＰＢＳ対照を尾静脈に注射し、注射用量は５ｅ６ ＣＡＲ＋／マウスであった。Ｔ細胞のサブタイプを観察するために毎週採血した。結果から、ノックアウト群がより良好な腫瘍除去効果を有していたことが再び示される（図１０Ａ）。マウスの末梢血中のｈＣＤ３の割合は最初に増加した後、減少した。治療の後期でも、ｈｕ８０６－ＴＫＯ群は、ｈｕ８０６群と比較して、より高い割合のｈＣＤ３を依然として維持した（図１０Ｂ）。マウス末梢血中のヒトＣＤ３サブタイプをさらに分析すると、ＴＫＯ群は記憶状態Ｔ細胞の割合が高く、特に中央記憶（central memory）Ｔ細胞の割合が高く、これがより有利であることが示された（図１０Ｃ）。公開文書によると、中央記憶Ｔ細胞の割合は予後および有効性と正の相関関係がある。ＣＤ４およびＣＤ８染色の結果から、治療の初期では、ＴＫＯ群でＣＤ８ Ｔ細胞の割合が高かったことが分かる。時間の経過とともに、ＣＤ４ Ｔ細胞が主要な細胞サブグループとなった（図１０Ｄ）。
動物に注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅とサブタイプの割合の変化を観察するために、良好なｉｎ ｖｉｖｏ増幅効果を有する＃４ドナーのＣＤ３ Ｔ細胞を使用することによってｈｕ８０６細胞およびｈｕ８０６－ＴＫＯ細胞を調製した。２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞およびＰＢＳ対照を尾静脈に注射し、注射用量は５ｅ６ ＣＡＲ＋／マウスであった。Ｔ細胞のサブタイプを観察するために毎週採血した。結果から、ノックアウト群がより良好な腫瘍除去効果を有していたことが再び示される（図１０Ａ）。マウスの末梢血中のｈＣＤ３の割合は最初に増加した後、減少した。治療の後期でも、ｈｕ８０６－ＴＫＯ群は、ｈｕ８０６群と比較して、より高い割合のｈＣＤ３を依然として維持した（図１０Ｂ）。マウス末梢血中のヒトＣＤ３サブタイプをさらに分析すると、ＴＫＯ群は記憶状態Ｔ細胞の割合が高く、特に中央記憶（central memory）Ｔ細胞の割合が高く、これがより有利であることが示された（図１０Ｃ）。公開文書によると、中央記憶Ｔ細胞の割合は予後および有効性と正の相関関係がある。ＣＤ４およびＣＤ８染色の結果から、治療の初期では、ＴＫＯ群でＣＤ８ Ｔ細胞の割合が高かったことが分かる。時間の経過とともに、ＣＤ４ Ｔ細胞が主要な細胞サブグループとなった（図１０Ｄ）。
【0101】
実施例８：ｈｕ８０６－ＴＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療用量の探索
臨床実験に注射治療用量の基準を提供するために、担腫瘍ＮＰＧマウスに対して用量群化実験を実施した。マウスとヒトの間の等価用量変換に基づいて、異なる注入用量を処方した（表２）。動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ群化療法の結果から、ｈｕ８０６－ＴＫＯの４つの用量群総てがＣＤＸモデル腫瘍を効果的に除去することができ、用量は腫瘍除去速度に関連していたことが分かる（図１１Ａ）。腫瘍除去後、２つの治療用量群の腫瘍再接種実験を実施し、両方の群で再接種腫瘍の体積の効果的な減少が観察された（図１１Ａ）。マウス末梢血中のｈＣＤ３含量は注入用量に関連し、治療時間とともにｈＣＤ３含量は最初に増加した後、減少した（図１１Ｂ）。
臨床実験に注射治療用量の基準を提供するために、担腫瘍ＮＰＧマウスに対して用量群化実験を実施した。マウスとヒトの間の等価用量変換に基づいて、異なる注入用量を処方した（表２）。動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ群化療法の結果から、ｈｕ８０６－ＴＫＯの４つの用量群総てがＣＤＸモデル腫瘍を効果的に除去することができ、用量は腫瘍除去速度に関連していたことが分かる（図１１Ａ）。腫瘍除去後、２つの治療用量群の腫瘍再接種実験を実施し、両方の群で再接種腫瘍の体積の効果的な減少が観察された（図１１Ａ）。マウス末梢血中のｈＣＤ３含量は注入用量に関連し、治療時間とともにｈＣＤ３含量は最初に増加した後、減少した（図１１Ｂ）。
【0102】
【表2】
【0103】
実施例９：ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ安全性
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の主なリスクはオフターゲット効果にある。抗ＥＧＦＲ ｈｕ８０６ ＳｃＦｖのオフターゲット効果を検出し、ｉｎ ｖｉｖｏでの安全性を明らかにするために、ｈｕ８０６組換え抗体を使用して肺扁平上皮癌細胞とヒト初代線維芽細胞を染色した。フローサイトメトリーの結果から、ＣＲＬ－５８２６と線維芽細胞の両方がＥＧＦＲを発現したのに対し、線維芽細胞は少量のｈｕ８０６抗原のみを発現したことが分かる。血液由来の白血病細胞Ｋ５６２はＥＧＦＲを発現しなかった（図１２Ａ）。それに応じて、これらの３種類の細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅検出では、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＥＧＦＲ陽性８０６抗原陽性ＣＲＬ－５８２６細胞に対して強い殺滅機能を有する一方、ＥＧＦＲ陽性８０６抗原陰性線維芽細胞およびＥＧＦＲ陰性Ｋ５６２細胞をほとんど殺滅しないことが示された（図１２Ｂ）。これは、ｈｕ８０６細胞を薬剤として体内に注射した場合、オフターゲット副作用のリスクが低いことを示唆している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の主なリスクはオフターゲット効果にある。抗ＥＧＦＲ ｈｕ８０６ ＳｃＦｖのオフターゲット効果を検出し、ｉｎ ｖｉｖｏでの安全性を明らかにするために、ｈｕ８０６組換え抗体を使用して肺扁平上皮癌細胞とヒト初代線維芽細胞を染色した。フローサイトメトリーの結果から、ＣＲＬ－５８２６と線維芽細胞の両方がＥＧＦＲを発現したのに対し、線維芽細胞は少量のｈｕ８０６抗原のみを発現したことが分かる。血液由来の白血病細胞Ｋ５６２はＥＧＦＲを発現しなかった（図１２Ａ）。それに応じて、これらの３種類の細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅検出では、ｈｕ８０６ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＥＧＦＲ陽性８０６抗原陽性ＣＲＬ－５８２６細胞に対して強い殺滅機能を有する一方、ＥＧＦＲ陽性８０６抗原陰性線維芽細胞およびＥＧＦＲ陰性Ｋ５６２細胞をほとんど殺滅しないことが示された（図１２Ｂ）。これは、ｈｕ８０６細胞を薬剤として体内に注射した場合、オフターゲット副作用のリスクが低いことを示唆している。
【0104】
配列表：
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【配列表】
【国際調査報告】