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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-31
(54)【発明の名称】キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20231024BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20231024BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231024BHJP
A01H 6/82 20180101ALN20231024BHJP
A01H 6/28 20180101ALN20231024BHJP
A01H 6/54 20180101ALN20231024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
A01H5/00 A
C12N15/09 100
A01H6/82
A01H6/28
A01H6/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521305
(86)(22)【出願日】2021-10-07
(85)【翻訳文提出日】2023-06-05
(86)【国際出願番号】 US2021053985
(87)【国際公開番号】W WO2022076695
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】63/088,790
(32)【優先日】2020-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522105908
【氏名又は名称】カリックス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＬＹＸＴ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】バトラー， ナサニエル
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030CA15
2B030CB02
(57)【要約】
本開示の実施形態は、宿主植物の挿し木に発現コンストラクトを保有するリゾビウム・リゾゲネスを感染させることによってキメラ植物を生成するステップ、及び発現コンストラクトによるゲノム編集に起因する遺伝子編集についてキメラ植物からの新しい成長をスクリーニングするステップを含む方法を対象としている。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集試薬の送達の方法であって、宿主植物の挿し木に発現コンストラクトを保有するリゾビウム・リゾゲネスを感染させることによってキメラ植物を生成するステップ；及び
発現コンストラクトに起因する遺伝子編集についてキメラ植物からの新しい成長をスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項2】
キメラ植物が、野生型／トランスジェニックキメラ植物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
発現コンストラクトが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
発現コンストラクトが、ｍＲＮＡコーディング配列及びプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
プロモーターが３５Ｓである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
プロモーターがノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
キメラ植物の作成からの検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ若しくはタンパク質、又はゲノム編集からのゲノム編集を用いて、キメラ植物からの新しい成長をスクリーニングするステップ；及び検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ若しくはタンパク質又はゲノム編集からの組織又は種子を増殖させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ゲノム編集試薬を発現するキメラ植物を生成する方法であって、宿主植物から野生型のシュート又は実生の挿し木を調製するステップ；
野生型のシュート又は実生の挿し木にリゾビウム・リゾゲネス溶液を接種するステップ；及び
Ｒ．リゾゲネス溶液に感染した野生型のシュート又は播種をトランスジェニック毛状根の成長のための培地へ移すステップを含む、方法。
【請求項9】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ｍＲＮＡの発現について個々のキメラ植物をスクリーニング及び選択するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
エンドポイント逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）又はウエスタンブロットを使用してシュート組織におけるトランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の蓄積を検出するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
請求項８に記載の方法によって生成された、非天然植物。
【請求項12】
請求項８に記載の方法によって生成された非天然種子、生殖組織、又は栄養組織。
【請求項13】
ゲノム編集技術によって生成された非天然植物であって、前記ゲノム編集技術が：宿主植物の挿し木を調製するステップ；
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）コーディング配列；及び
プロモーター；
を含む、リゾビウム・リゾゲネス溶液で宿主植物の挿し木を感染させることによってキメラ植物を生成するステップ；
標的遺伝子のゲノム編集について、又はＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の検出によって、ゲノム編集に起因するキメラ植物からの成長をスクリーニングするステップ；並びに
編集された事象を単離するために、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を蓄積させたキメラ植物から成長又は種子を増殖させるステップを含む、非天然植物。
【請求項14】
ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡが、カンナビス・サティバ・テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＣｓＴＨＣ）遺伝子を標的とする、請求項１３に記載の非天然植物。
【請求項15】
ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡが、ソラヌム・ツベロスム・フィトエン・デサチュラーゼ（ＳｔＰＤＳ）遺伝子を標的とする、請求項１３に記載の非天然植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達に関する。
【背景技術】
【0002】
[0001]変異開始にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用せずに実行されるゲノム編集の方法は、「ＤＮＡフリーの」ゲノム編集技術と呼ばれる。植物におけるＤＮＡフリーのゲノム編集には、典型的には、ゲノム編集試薬から植物細胞へのトランスジェニックリボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はタンパク質の直接送達、並びに植物全体及び編集された系統としての形質転換細胞の再生が必要である。このアプローチでは、トランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質を植物組織に直接送達し、形質転換された材料を植物全体として再生するために、特殊な植物形質転換及び組織培養プロトコルを必要とする。場合によっては、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はスモールＲＮＡなどのゲノム編集試薬を送達するためにＲＮＡウイルスが使用されている。しかしながら、厳密なウイルスサイズ制限が、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のような転写活性化因子又はクリスパー関連タンパク質９（Ｃａｓ９）などのより大きな試薬がウイルス粒子に直接取り込まれることを妨げている。さらに、プロトプラスト、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）又はジェミニウイルスレプリコン（ＧＶＲ）を組み込んだ試薬送達の「トランジェント（一過性）」法もまた実証されているが、それには費用のかかる組織培養プロトコルの開発及び宿主植物へのＤＮＡのリスクのある組み込みが必要である。
【発明の概要】
【0003】
[0002]本概要は、以下の「詳細な説明」でさらに記載される概念の選択を簡略化された形式で紹介するために提供される。
【0004】
[0003]一態様において、本開示は、ゲノム編集試薬の送達の方法を提供する。本方法は、発現コンストラクトを保有するリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ｒ．リゾゲネス）で宿主植物の挿し木を感染させることによってキメラ植物を生成するステップ、及び発現コンストラクトによるゲノム編集に起因する遺伝子編集についてキメラ植物からの新しい成長をスクリーニングするステップを含む。リゾビウム・リゾゲネスは、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．リゾゲネス）とも呼ばれ、本明細書ではこれらの用語は交換可能に使用される場合がある。
【0005】
[0004]いくつかの例において、キメラ植物は、野生型／トランスジェニックキメラ植物を含む。いくつかの例において、発現コンストラクトは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ｍＲＮＡを含む。いくつかの例において、発現コンストラクトは、ｍＲＮＡコーディング配列及びプロモーターを含む。いくつかの例において、プロモーターは３５Ｓである。いくつかの例において、プロモーターはノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）である。
【0006】
[0005]いくつかの例において、本方法は、発現コンストラクトからの検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ又はタンパク質を有するキメラ植物からの新しい成長、及び／又はゲノム編集に起因する遺伝子編集についてスクリーニングするステップ、並びに検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ若しくはタンパク質又はゲノム編集を有する組織又は組織からの種子を増殖させるステップを含む。
【0007】
[0006]別の例示的な実施形態において、ゲノム編集試薬を発現するキメラ植物を生成する方法は、宿主植物から野生型のシュート又は実生の挿し木を調製するステップ、野生型のシュート又は実生の挿し木にリゾビウム・リゾゲネス溶液を接種するステップ、及び野生型のシュート又は実生の挿し木にリゾビウム・リゾゲネス溶液を接種するステップ、並びにＲ．リゾゲネス溶液に感染した野生型のシュート又は播種をトランスジェニック毛状根の成長のための培地へ移すステップを含む。
【0008】
[0007]いくつかの例において、本方法は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現について個々のキメラ植物をスクリーニング及び選択するステップを含む。いくつかの例において、本方法は、エンドポイント逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）又はウエスタンブロットを使用してシュート組織におけるトランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質の蓄積を検出するステップを含む。様々な例は、本方法によって生成された非天然植物、及び本方法によって生成された非天然種子、生殖組織、又は栄養組織を対象としている。
【0009】
[0008]別の態様において、本開示は、ゲノム編集技術によって生成された、非天然植物を提供する。このような実施形態において、本ゲノム編集技術は、宿主植物の挿し木を調製するステップ、並びに宿主植物の挿し木に、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡコーディング配列、及びプロモーターを含むＲ．リゾゲネス溶液を感染させることによってキメラ植物を生成するステップを含む。本ゲノム編集技術はさらに、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質によるゲノム編集に起因するキメラ植物からの成長をスクリーニングするステップ、並びに編集された事象の単離のためにＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の蓄積を用いてキメラ植物からの成長又は種子を増殖させることを含む。
【0010】
[0009]いくつかの例において、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡは、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）・テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＣｓＴＨＣ）遺伝子を標的とする。いくつかの例において、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡは、ソラヌム・ツベロスム・フィトエン・デサチュラーゼ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ；ＳｔＰＤＳ）遺伝子を標的とする。
【0011】
[0010]本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本開示と一致する、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達のための例示的な方法を例示する図である。
【図2】本開示と一致する、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達のための例示的な方法を例示する図である。
【図3A】本開示と一致する、ゲノム編集試薬を送達するための発現コンストラクトの例を例示する図である。
【図3B】本開示と一致する、ゲノム編集試薬を送達するための発現コンストラクトの例を例示する図である。
【図4A】本開示と一致する、ジャガイモにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示する図である。
【図4B】本開示と一致する、ジャガイモにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示する図である。
【図5A】本開示と一致する、アサにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示する図である。
【図5B】本開示と一致する、アサにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示する図である。
【図6】本開示と一致する、トランスジェニック毛状根を有するキメラアサ植物を例示する図である。
【図7】本開示と一致する、トランスジェニック毛状根を有するキメラジャガイモ植物を例示する図である。
【図8A】本開示と一致する、キメラジャガイモ植物組織から得られたゲル電気泳動の結果を例示する図である。
【図8B】本開示と一致する、キメラジャガイモ植物組織から得られたゲル電気泳動の結果を例示する図である。
【図9】本開示と一致する、アサトランスジェニック毛状根の発生を例示する図である。
【図10】本開示と一致する、キメラジャガイモ植物のシュート先端から得られたデータを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
［詳細な説明］
[0021]様々なゲノム編集方法により、植物におけるＤＮＡフリーの編集が可能となる。これらの方法には、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の直接送達、プロトプラスト、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、リゾビウム・リゾゲネス、又はパーティクル・ボンバードメント法による「一時的な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）」ＤＮＡ送達、並びにＲＮＡ試薬（すなわち、ｓｇＲＮＡ及びスモールＲＮＡ）又はＤＮＡ（すなわち、ジェミニウイルスレプリコン）のウイルス送達が含まれる。これらの方法は全て、標的植物遺伝子型へのある程度の試薬送達及び編集された組織の再生が必要となる。さらに、これらの送達方法はしばしば非効率的であり、効率をさらに低下させる可能性のあるＲＮＡ、タンパク質、及びウイルス粒子の調製を必要とする。
[0021]様々なゲノム編集方法により、植物におけるＤＮＡフリーの編集が可能となる。これらの方法には、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の直接送達、プロトプラスト、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、リゾビウム・リゾゲネス、又はパーティクル・ボンバードメント法による「一時的な（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）」ＤＮＡ送達、並びにＲＮＡ試薬（すなわち、ｓｇＲＮＡ及びスモールＲＮＡ）又はＤＮＡ（すなわち、ジェミニウイルスレプリコン）のウイルス送達が含まれる。これらの方法は全て、標的植物遺伝子型へのある程度の試薬送達及び編集された組織の再生が必要となる。さらに、これらの送達方法はしばしば非効率的であり、効率をさらに低下させる可能性のあるＲＮＡ、タンパク質、及びウイルス粒子の調製を必要とする。
【0014】
[0022]植物の形質転換及び組織培養技術は、ゲノム編集成果に重大な制限をもたらし、特殊なプロトコルを開発及び実装するために、多大な時間、労力、及び材料を必要とする。本明細書において議論するＤＮＡフリーの編集技術は、トランスジェニックＤＮＡの取り込みを排除することによって時間を節約することができる。本開示と一致する、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達は、植物組織へのＤＮＡフリーのゲノム編集試薬の直接送達を可能にし、編集可能な植物遺伝子型の数を拡大することができる。さらに、Ｒ．リゾゲネスを介したトランスジェニック毛状根を有するキメラ植物の生成は、植物材料を直接的に形質転換及び再生することなく、ゲノム編集試薬からＲＮＡ及び／又はタンパク質を送達する機会を提供し、不応性及び非不応性の植物遺伝子型におけるゲノム編集を可能にすると考えられる。
【0015】
[0023]植物の維管束系は、水及びミネラル（木部を介して）並びに糖（師部を介して）を植物の成長部分（すなわち、シンク（ｓｉｎｋ））に輸送することを可能にする。ＲＮＡ及びタンパク質などの高分子もまた、長距離のシグナル伝達のために維管束系（主に師部）を介して輸送され、複数の植物機能を制御する。長距離のシグナル伝達は、葉及び根の師部のコンパニオン細胞（すなわち、ソース（ｓｏｕｒｃｅ））での高分子の合成、並びにプラスモデスムを介した植物の遠く離れた成長部分（すなわち、シンク）への輸送のために高分子をふるい要素にロードすることによって機能する。本明細書で開示するように、Ｒ．リゾゲネス感染に起因するトランスジェニック毛状根の師部コンパニオン細胞におけるゲノム編集試薬の発現は、トランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質の長距離輸送、並びに個々の編集イベントの増殖及び単離のためのシンク組織におけるＤＮＡフリーの編集を促進し得る。
【0016】
[0024]本開示によるキメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達により、多くの利益が達成される。第１に、標的遺伝子型のバックグラウンドで編集イベントを開発するための標的遺伝子型の直接的な形質転換及び再生は必要ではなく、これにより、遺伝子型に特異的な形質転換及び再生プロトコルの開発と実装のコストが削減される。第２に、ＲＮＡ及びタンパク質のようなＤＮＡフリーの試薬の調製を必要としないため、そのような専用プロトコルの生産コスト及び技術開発がさらに削減される。第３に、ゲノム編集試薬を発現するトランスジェニック根を持つキメラ系統が開発されると、ゲノム編集試薬の送達に組織培養は必要なくなり、非組織培養環境で生産を行うことができる。本開示の利点は、上に列挙したものに限定されることはなく、追加の利点を実現することができる。
【0017】
[0025]図１は、本開示と一致する、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達のための例示的な方法１００を例示している。Ｒ．リゾゲネスは、植物細胞の形質転換に用いられるリゾビウム属の一種で、高い病原性を持ち、毛状根の形態のトランスジェニック材料を迅速に発生させることができる。植物茎組織のＲ．リゾゲネス感染に起因する毛状根は、いわゆる根誘導（ｒｏｏｔ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ；Ｒｉ）プラスミドからのトランスファーＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）を保有し、植物宿主との維管束の接続を形成する。これらの維管束の接続により、毛状根は野生型の根と同様に機能し、野生型の根を凌駕するほど積極的に成長する可能性がある。ＲｉプラスミドからのＴ－ＤＮＡに加えて、ゲノム編集試薬を保有するバイナリーベクターからのものなどの追加のＴ－ＤＮＡを植物茎組織に共送達し、トランスジェニック毛状根としての毛状根で発現させることができる。ＴＡＬＥＮは、植物組織に共送達される可能性のあるゲノム編集試薬を保有するバイナリーベクターの一例であり、本明細書においてさらに議論される。
【0018】
[0026]野生型植物宿主において形成されるトランスジェニック毛状根は、トランスジェニック毛状根組織においてＲＮＡ及び／又はタンパク質の形態でゲノム編集試薬を発現できるトランスジェニック／野生型キメラ植物を作成する。トランスジーン発現がトランスジェニック毛状根の師部組織（すなわち、コンパニオン細胞）に向けられる場合、トランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質は師部ふるい要素にロードされ、成長している野生型組織まで長距離輸送される可能性がある。成長している組織におけるトランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質の蓄積は、トランスジェニックＤＮＡの非存在下での編集をもたらす可能性があり、個々のイベントは栄養増殖及び／又は種子の生産によって単離される可能性がある。
【0019】
[0027]ステップ１０１での方法１００は、宿主植物の挿し木を、発現コンストラクトを保有するＲ．リゾゲネスに感染させることによってキメラ植物を生成することを含む。ＴＡＬＥＮ又は他のゲノム編集試薬を発現するキメラ植物は、Ｒ．リゾゲネスに感受性のある遺伝子型又は種で最初に生成される場合がある。Ｒ．リゾゲネス感染に使用される方法は、宿主植物の種によって異なる場合があるが、典型的には、新鮮な野生型のシュート（茎で切り込み）又は実生（胚軸で切り込み）の挿し木を調製すること、及び切り込み端にＲ．リゾゲネス溶液を接種することが含まれる。したがって、キメラ植物は、野生型／トランスジェニックキメラ植物であり得る。非選択培地でおよそ２日間キメラ植物を共培養すると、野生型組織へのＲｉプラスミド及びバイナリーベクターＴ－ＤＮＡの両方の送達が促進される可能性がある。
【0020】
[0028]本明細書で使用される場合、発現コンストラクトは、ゲノム編集試薬（ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡなど）及びプロモーターを保有する１つ又は複数のバイナリーベクターを含む核酸配列を指すか、又はそれを含む。「プロモーター」という用語は、遺伝子をオン又はオフに変えるＤＮＡの配列を指すか、又はそれを含む。いくつかの例において、プロモーターは、インビボで活性である構成的プロモーター、オン及び／又はオフにされ得る誘導性プロモーター、又は師部組織において活性を有する師部特異的プロモーターであってもよい。いくつかの例において、表現コンストラクトは、１つ又は複数のジップコード要素（ｚｉｐ－ｃｏｄｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含んでもよい。本明細書で使用する場合、ジップコード要素は、ｍＲＮＡ配列が師部を通して輸送することを可能にするシス作動性シグナル（例えば、師部移動性ＲＮＡ）、若しくは「ジップコード」を指す、又はそれを含む。ジップコード要素は、師部移動性ＲＮＡからの非翻訳領域（ＵＴＲ）、又は師部移動性ＲＮＡからの全長配列を含んでもよい。ジップコード要素の非限定的な例としては、とりわけ、シロイヌナズナのＧＡＩなどのジベレリン酸非感受性（ＧＡＩ）ｍＲＮＡ、及びノットド１様ホメオボックス（ＫＮＯＸ）ｍＲＮＡ、トマトＫＮＯＴＴＥＤ１（ＬｅＴ６）、ジャガイモＢＥＬ５、シロイヌナズナｔＲＮＡｍｅｔ（Ａｔ５ｇ５７８８５）、シロイヌナズナｔＲＮＡｇｌｙ（Ａｔ５ｇ５７８８５）、シロイヌナズナＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＩＳ（ＡＴＣ）、ジャガイモＫＮＯＴＴＥＤ１（ＳｔＰＯＴＨ１）、カボチャＮＡＣＰ（ＮＡＭ、ＡＴＡＦ１／３及びＣＵＣ２）、並びにカボチャＧＡＩＰなどが挙げられる。本開示に従った様々な実施形態は、以下の参考文献で議論されるように、ジップコード要素及び遺伝子配列を含む、実質的に同じ特徴及び属性の少なくともいくつかを含むことができ、それらの各々は、ジップコード要素に関連するそれらの一般的教示及び特定の遺伝子の配列（複数可）に関連する特定の教示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる：Ｈｕａｎｇ、ＮＣ．；Ｙｕ、ＴＳ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧＡ－ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ＲＮＡ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ｔｈｅ ｍｏｔｉｆｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ＲＮＡ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２００９年、５９、９２１～９２９ページ；Ｋｉｍ、Ｍ．；Ｃａｎｉｏ、Ｗ．；Ｋｅｓｓｌｅｒ、Ｓ．；Ｓｉｎｈａ、Ｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｌｏｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１年、２９３、２８７～２８９ページ；Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ａ．Ｋ．；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、Ｍ．；Ｙｕ、Ｙ．；Ｓｕｈ、Ｓ．Ｇ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．Ａ．；Ｈａｎｎａｐｅｌ、Ｄ．Ｊ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ａ ｍｏｂｉｌｅ ＲＮＡ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２００６年、１８、３４４３～３４５７ページ；Ｌｉ、Ｃ．；Ｇｕ、Ｍ．；Ｓｈｉ、Ｎ．；Ｚｈａｎｇ、Ｈ．；Ｙａｎｇ、Ｘ．；Ｏｓｍａｎ、Ｔ．；Ｌｉｕ、Ｙ．；Ｗａｎｇ、Ｈ．；Ｖａｔｉｓｈ、Ｍ．；Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｓ．ら、Ｍｏｂｉｌｅ ＦＴ ｍＲＮＡ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｆｌｏｒｉｇｅｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｆｌｏｒａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１１年、１、７３ページ；Ｚｈａｎｇ、Ｗ．；Ｔｈｉｅｍｅ Ｃ．Ｊ．；Ｋｏｌｌｗｉｇ Ｇ．；Ａｐｅｌｔ、Ｆ．；Ｙａｎｇ、Ｌｅｉ．；Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎ．；Ａｎｄｒｅｓｅｎ、Ｎ．；Ｗａｌｔｈｅｒ、Ｄ．；Ｋｒａｇｌｅｒ、Ｆ．ｔＲＮＡ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２０１６年、２８、１２３７～１２４９ページ；Ｈｕａｎｇ、Ｎ．Ｃ．；Ｊａｎｅ、Ｗ．Ｎ．；Ｃｈｅｎ、Ｊ．；Ｙｕ、Ｔ．Ｓ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＥＮＴＲＯＲＡＤＩＡＬＩＳ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ａｃｔｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｆｌｏｒａｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２０１２年、７２、１７５～１８４ページ；Ｍａｈａｊａｎ、Ａ．；Ｂｈｏｇｌｅ、Ｓ．；Ｋａｎｇ、Ｉ．Ｈ．；Ｈａｎｎａｐｅｌ、Ｄ．Ｊ．；Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ａ．Ｋ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｏｆ ａ Ｋｎｏｔｔｅｄ１－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｉｓ ｐｈｌｏｅｍ ｍｏｂｉｌｅ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１２年、７９、５９５～６０８ページ；Ｒｕｉｚ－Ｍｅｄｒａｎｏ、Ｒ．；Ｘｏｃｏｎｏｓｔｌｅ－Ｃａｚａｒｅｓ、Ｂ．；Ｌｕｃａｓ、Ｗ．Ｊ．Ｐｈｌｏｅｍ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＣｍＮＡＣＰ ｍＲＮＡ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｕｐｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９９年、１２６、４４０５～４４１９ページ；Ｈａｙｗｏｏｄ、Ｖ．；Ｙｕ、Ｔ．Ｓ．；Ｈｕａｎｇ、Ｎ．Ｃ．；Ｌｕｃａｓ、Ｗ．Ｊ．Ｐｈｌｏｅｍ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ＧＩＢＢＥＲＥＬＬＩＣ ＡＣＩＤ－ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｅａｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．２００５年、４２、４９～６８ページ。
【0021】
[0029]また、本明細書で使用される師部特異的プロモーターは、師部特異的遺伝子発現を標的とするプロモーターを指すか、又はそれを含む。これらのプロモーター要素は、師部細胞において、又は師部が限定された生物から特異的に発現される遺伝子と関連している場合がある。師部特異的プロモーターの非限定的な例には、スクロース輸送タンパク質１（ＳＵＴ１）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）、スクロース輸送タンパク質２（ＳＵＣ２）、シロイヌナズナＳＵＣ２、トマトＳＵＴ１、ジャガイモＰＴＢ１、及びアグロバクテリウムｒｏｌＣが含まれる。また、本明細書で使用されるように、構成的プロモーターは師部特異的遺伝子発現を標的とするプロモーターを指すか、又は含む。これらのプロモーター要素は、植物細胞タイプに渡って発現する遺伝子と関連している可能性があり、非植物源に由来する場合もある。構成的プロモーターの非限定的な例には、とりわけ、３５Ｓプロモーター、２ｘ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）プロモーター、ＶａＵｂｉ３が含まれる。また、本明細書で使用される場合、誘導性プロモーターは師部特異的遺伝子発現を標的とするプロモーターを指すか、又はそれを含む。これらのプロモーター要素は、外因性因子（例えば、β－エストラジオール）への曝露によって誘導される遺伝子発現に関連している可能性があり、非植物源に由来している場合もある。誘導性プロモーターの非限定的な例には、とりわけ、Ｐ１６ΔＳ：ｓＸＶＥプロモーター、及びＳＵＰＥＲＲ：ｓＸＶＥプロモーターが含まれる。本開示に従った様々な実施形態は、以下の文献で議論されるような、プロモーター及び遺伝子配列を含む、少なくともいくつかの実質的に同じ特徴及び属性を含むことができ、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が、植物遺伝学に関連するそれらの一般的な教示及び特定のプロモーターの配列（複数可）に関連する特定の教示について、参照により本明細書に組み込まれる：Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ａ．Ｃ．；Ｇａｎｅｓａｎ、Ｓ．；Ｉｓｍａｉｌ、Ｉ．Ｏ．；Ａｙｒｅ、Ｂ．Ｇ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡｔＳＵＣ２ Ｓｕｃｒｏｓｅ／Ｈ＋ Ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ ｂｙ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｐｈｌｏｅｍ Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｔ Ｎｏｔ ｉｎ Ｌｏｎｇ－Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００８年、１４８、２００～２１１ページ；Ｋｕｈｎ、Ｃ．；Ｈａｊｉｒｅｚａｅｉ、Ｍ．Ｒ．；Ｆｅｒｎｉｅ、Ａ．Ｒ．、Ｒｏｅｓｓｎｅｒ－Ｔｕｎａｌｉ、Ｕ．；Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋｉ．；Ｈｉｒｎｅｒ、Ｂ．；Ｆｒｏｍｍｅｒ、Ｗ．Ｂ．Ｔｈｅ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＳｔＳＵＴ１ Ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｔｏ Ｓｉｅｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｏｔａｔｏ Ｔｕｂｅｒ Ｐｈｌｏｅｍ ａｎｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｔｕｂｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３年、１３１、１０２～１１３ページ；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｎ．Ｍ．；Ｈａｎｎａｐｅｌ、Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｕｅｓ．Ｐｌａｎｔａ ２０１２年、２３６、１７４７～１７５５ページ；Ｓｃｈｍｉｉｌｌｉｎｇ、Ｔ．；Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ．；Ｓｐｅｎａ、Ａ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌＡ、Ｂ，ａｎｄ Ｃ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ａｒｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９８９年、１、６６５～６７０ページ；Ｓｃｈｌｕｃｋｉｎｇａ、Ｋ．；Ｅｄｅｌ、Ｋ．Ｈ．；Ｄｒｅｒｕｐ、Ｍ．Ｍ．；Ｋｏｓｔｅｒ、Ｐ．；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｃ．；Ｓｔｅｉｎｈｏｒｓｔ、Ｌ．、Ｗａａｄｔ、Ｒ．；Ｂａｔｉｓｔｉｃ、Ｏ．；Ｋｕｄｌａ、Ｊ．Ａ Ｎｅｗβ－Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｔ ｔｈａｔ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｅａｓｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ＣＢＬ３－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｔｏ Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＩＰＫ５．Ｍｏｌｅ．Ｐｌａｎｔ ２０１３年、６、１８１４～１８２９ページ。
【0022】
[0030]発現コンストラクトは、宿主植物の師部におけるゲノム編集試薬の長距離輸送を容易にするように選択及び配置された、種々の核酸セグメントを含んでもよい。例えば、発現コンストラクトは、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡを含んでもよい。いくつかの例では、発現コンストラクトは、ｍＲＮＡコーディング配列及びプロモーターを含んでもよい。いくつかの例において、発現コンストラクトは、輸送されたｍＲＮＡ及び／又は輸送されたタンパク質の検出を可能にし得るプロモーター及びマーカーを含む。発現コンストラクトの例が図３に例示されており、本明細書においてさらに議論される。
【0023】
[0031]したがって、キメラ植物を生成するために使用される発現コンストラクトは、ｍＲＮＡコーディング配列のような多くの成分、及び他の限定されない成分の中でプロモーターを含むことができる。個々のキメラ植物は、トランスジェニック毛状根において、エンドポイント逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、又は蛍光タンパク質レポーター発現（すなわち、ＧＵＳ、ＲＦＰ又はＹＦＰ）を用いて、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の高い発現についてスクリーニングされてもよいし、選択されてもよい。例えば、いくつかの例では、発現コンストラクトに含まれる師部移動性ＲＮＡはＧＡＩである。いくつかの例では、師部移動性ＲＮＡはＫＮＯＸであってもよい。同様に、いくつかの例では、プロモーターはＳＵＴ１である。いくつかの例では、プロモーターはＳＵＣ２であってもよい。プロモーターは、列挙された特定の例に限定されない。本明細書において議論するように、異なるプロモーターを使用してもよい。図３に関してさらに議論されるように、プロモーターは、ｍＲＮＡコーディング配列から上流であってもよい。例は、それほど限定されることはなく、追加の及び／又は異なる発現コンストラクトが企図される。
【0024】
[0032]１０３において、方法１００は、発現コンストラクトによるゲノム編集に起因する遺伝子編集について、キメラ植物からの新しい成長をスクリーニングするステップを含む。いくつかの例において、キメラ植物を作成するステップには、植物選択剤（すなわち、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ））を使用して発現コンストラクトに起因するトランスジェニック毛状根を選択することを含む。いくつかの例において、検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を含むシンク組織を編集のためにスクリーニングし、編集を安定させるためのさらなる増殖のために使用することができる。いくつかの例において、キメラ植物を種子生産のために使用し、種に依存して、種子を編集された子孫についてスクリーニングすることができる。
【0025】
[0033]いくつかの例において、方法１００は、検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を有するキメラ植物からの新しい成長をスクリーニングすること、並びに検出可能なトランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む組織を増殖させることを含むことができる。
【0026】
[0034]図２は、本開示と一致する、キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達のための例示的な方法２００を例示している。図２において、方法２００は、２０５で、宿主植物から切除された野生型シュート又は実生を調製することを含む。滅菌したはさみ又はメスの刃、ピンセット、及び実体鏡を使用して、野生型のシュートを茎で切り込み、実生を胚軸で切り込むことができる。
【0027】
[0035]２０７において、方法２００は、野生型のシュート又は実生の挿し木にＲ．リゾゲネス溶液を接種するステップを含む。本開示に従って、目的のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのコーディング配列をプロモーターの下流に配置することにより、長距離輸送の標的とすることができる。そのようなｍＲＮＡの例には、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡが含まれる。このようなコンストラクトが利用可能になると、バイナリーベクターを保有するＲ．リゾゲネス株が調製され、野生型のシュートの挿し木に感染させるために使用される。使用することができるＲ．リゾゲネス株の非限定的な例には、Ａ４、ＡＴＣＣ １５８３４、ＡＴＣＣ ４３０５６、ＡＴＣＣ ４３０５７、ＡＴＣＣ １３３３３、又はＫ５９９が含まれる。植物選択剤（すなわち、スペクチノマイシン）を使用したトランスジェニック毛状根の選択は、高く発現しているトランスジェニック毛状根の形成を可能にし（ＲｉプラスミドＴ－ＤＮＡ又は野生型根のみを保有する非トランスジェニック毛状根に対して）、根組織におけるゲノム編集試薬の発現が増加する可能性がある。
【0028】
[0036]図２に例示するように、トランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のトランスロケーションは、野生型／トランスジェニックキメラ植物を通して、トランスジェニック毛状根から野生型茎へと促進される。トランスジェニック毛状根が確立され、キメラ植物が作成されると、トランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が、トランスジェニック毛状根から成長している野生型組織に移動し、トランスジェニックＤＮＡの非存在下で野生型組織における編集が可能になる。図２に示されるように、キメラ植物で新しい成長が発生すると、トランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が新しい成長において機能する。
【0029】
[0037]２０９において、方法２００は、Ｒ．リゾゲネス溶液を用いて感染させた挿し木を、トランスジェニック毛状根の成長のための培地に移すことを含む。キメラ植物における編集の程度は、シンク組織におけるトランスジェニックｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の存在量に関連している場合があり、ｍＲＮＡ及びタンパク質検出の様々な方法を使用して追跡することができる。例えば、キメラ植物は、新しいシュート組織（すなわち、新しい分裂組織、葉、枝及び／又は花序）におけるトランスジェニックＲＮＡ及び／又はタンパク質の蓄積について、アッセイされてもよい。ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を、それぞれエンドポイント逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）又はウエスタンブロットを使用して検出するために、新しいシュート成長をサンプリングしてもよい。ＴＡＬＥＮ標的遺伝子のイルミナ（登録商標）アンプリコン配列決定法を使用して、編集の検出のために、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が陽性のシュート成長をスクリーニングしてもよい。編集に陽性のシュート成長は、種に依存して、個々の植物の編集を安定させるために、栄養的に、又は種子を介して増殖されてもよい。
【0030】
[0038]本開示の様々な例は、図１に関して記載された方法１００及び／又は図２に関して記載された方法２００によって生成された非天然植物に関する。同様に、本開示は、図１に関して記載された方法１００及び／又は図２に関して記載された方法２００によって生成された自然発生ではない種子、生殖組織、又は栄養組織に関する。本開示の様々な例は、図１に関して記載された方法１００及び／又は図２に関して記載された方法２００によって生成された野生型／トランスジェニック植物に関する。例えば、方法１００及び２００と一致して、非天然植物は、ＤＮＡフリーのゲノム編集技術によって生成されてもよい。ＤＮＡフリーのゲノム編集技術は、宿主植物の挿し木を調製すること、宿主植物の挿し木に、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡコーディング配列、及びプロモーターを含むＲ．リゾゲネス溶液を感染させてキメラ植物を生成すること、ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質によるゲノム編集に起因するキメラ植物からの成長をスクリーニングすること、並びに、キメラ植物からの成長を増殖又は種子を設定するための培地に移植することを含んでもよい。
【0031】
[0039]図３Ａ及び３Ｂは、本開示と一致する、ゲノム編集試薬のＤＮＡフリーの送達のための発現コンストラクト３００の例を例示している。図３Ａは、ｍＲＮＡコーディング配列３１５及びｍＲＮＡコーディング配列３１５の上流のプロモーター３１１を含む発現コンストラクト３００を例示している。使用されるｍＲＮＡコーディング配列の非限定的な例には、カンナビス・サティバ・フィトエン・デサチュラーゼ（ＣｓＰＤＳ）遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡコーディング配列、カンナビス・サティバ・テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＣｓＴＨＣ）遺伝子、及びソラヌム・ツベロスム・フィトエン・デサチュラーゼ（ＳｔＰＤＳ）遺伝子が含まれ得る。いくつかの例においては、発現コンストラクト３００には、師部移動性ＲＮＡからの第２のジップコード要素（例示せず）が含まれてもよい。例えば、ｍＲＮＡコーディング配列の上流、ｍＲＮＡコーディング配列の下流、又はｍＲＮＡコーディング配列の上流及び下流の両方に、１つ又は複数のジップコード要素を組み込むことができる。理解され得るように、上流には、参照配列と比較して、プロモーター３１１の５’末端に近接及び／又はより近い位置を含めることができる。逆に、下流には、参照配列と比較して、ターミネーター配列３２５の３’末端に近接及び／又はより近い位置を含めることができる。
【0032】
[0040]図２に関して論じたように、ジップコード要素は、異なる師部移動性ＲＮＡ由来及び／又は同じ師部移動性ＲＮＡ由来であってもよい。さらに、各々のジップコード要素は、師部移動性ＲＮＡ又は全長配列からのＵＴＲであってもよい。非限定的な例として、師部移動性ＲＮＡは、ＧＡＩ及び／又はＫＮＯＸである。非限定的な例として、師部特異的プロモーターはＳＵＴ１及び／又はＳＵＣ２である。
【0033】
[0041]図３Ｂは、トランスジェニック組織におけるｍＲＮＡ配列及び／又はタンパク質の検出を可能にし得る、単一のｍＲＮＡ配列及び検出可能なマーカー３１７を含む発現コンストラクト３００の例を例示している。検出可能なマーカーの非限定的な例には、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）又はＲＦＰ若しくはＹＦＰのような蛍光タンパク質レポーターが含まれる。
【0034】
[0042]様々な実施形態は、２０２０年１０月７日に出願され、「キメラ植物を介したゲノム編集試薬の送達」と題された基礎となる仮出願である、米国仮出願第６３／０８８，７９０号に従って実装され、その利益は請求され、参照により全体が本明細書に組み込まれる。仮出願で議論された実施形態は、特に断りのない限り、全体的な技術的開示、又は請求された発明のいずれかの部分を限定することをいかなる意味においても意図していない。
【0035】
[0043]本明細書で引用される刊行物及びそれらが引用される主題は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【0036】
[0044]当業者は、本明細書（特許請求の範囲を含む）で使用される様々な用語が、別段の指示がない限り、当技術分野における明白な意味を意味することを認識するであろう。本明細書で使用される用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）；含む」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ）；含む」、「ｈａｖｉｎｇ；有する」、「ｈａｓ；有する」、「ｃａｎ；できる」、「ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）；含む」、及びそれらの変形は、追加の行為又は構造の可能性を排除しないオープンエンドな移行句、用語、又は単語であることを意図している。単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別の指示をしない限り、複数の参照を含む。本開示は、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素を「含む」、「からなる」、及び「本質的にからなる」他の実施形態もまた企図する。
【0037】
[0045]上記の議論及び例示に基づいて、当業者は、本明細書に例示及び記載された例示的な実施形態及び用途に厳密に従うことなく、様々な実施形態に対して様々な修正及び変更を行うことができることを容易に認識するであろう。例えば、図に例示されるような方法は、本明細書の実施形態の１つ又は複数の態様を保持して、様々な順序で実行されるステップを含んでもよく、又はより少ないか、又はより多くのステップを含んでもよい。そのような修正は、特許請求の範囲に記載された態様を含む、本開示の様々な態様の真の趣旨及び範囲から逸脱するものではない。
【0038】
[0046]開示される方法及び組成物のために使用することができるか、それらと組み合わせて使用することができるか、それらの準備のために使用することができるか、又はそれらの生成物である材料、組成物、及び成分が開示される。これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されている場合、これらの化合物のあらゆる単一の組み合わせ及び順列への特定の言及が明示的に開示されていないことがあったとしても、様々な個々の組み合わせ及び集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されていることが理解される。この概念は、記載された方法のステップを含むがそれに限定されない本開示の全ての態様に適用される。したがって、任意の前述の実施形態の特定の要素を組み合わせたり、他の実施形態の要素に置き換えたりすることができる。例えば、実行可能な様々な追加のステップがある場合、これらの追加ステップの各々は、開示された方法の任意の特定の方法ステップ又は方法ステップの組み合わせで実行可能であり、そのような組み合わせ又は組み合わせのサブセットの各々は、特に企図され、開示されているものとみなされるべきであるものと理解される。さらに、本明細書に記載された実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されたもの、又は当該技術分野で知られているものなどの任意の適切な材料を使用して実装することができることが理解される。
【実施例】
【0039】
実験的／より詳細な実施形態
[0047]実験的実施形態に関連して以下にさらに例示するように、ゲノム編集試薬はキメラ植物を介して送達することができる。上記の記載と一致して、Ｒ．リゾゲネス株及び植物源材料を以下のように調製した。実験の５～７日前に、所望のＲ．リゾゲネス株を、抗生物質を含む寒天培地でプレーティングした培地にストリークした。実験の当日まで、プレートをおよそ２８℃でインキュベートした。実験の６日前に、５０～１００個のアサ種子をおよそ１０ｍＬの濃硫酸で表面滅菌し、滅菌水で２回洗浄した。種子を３０％Ｈ２Ｏ２に２０分間浸し、滅菌水で２回洗浄した。種子を一晩（例えば、およそ１６～２４時間）、穏やかに攪拌しながら（電動インバーターに置かれた円錐管又はロータリーシェーカー上の密閉ペトリ皿のいずれかで）滅菌水に浸した。翌日、水を除去し、浸した種子を３０％過酸化水素でおよそ５分間もう一度洗浄した後、滅菌水で３回すすいだ。ピンセット及び実体顕微鏡を使用して、種皮及び胚乳を除去した後、胚をＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）培地プレートにプレーティングして、１プレートあたり最大５つの胚を播種した。プレートをパラフィルムで密封し、暗所に３日間置いた。プレートをさらに２日間、１６／８時間の明／暗インキュベーター（７５ルーメン、およそ２３℃）に移した。
[0047]実験的実施形態に関連して以下にさらに例示するように、ゲノム編集試薬はキメラ植物を介して送達することができる。上記の記載と一致して、Ｒ．リゾゲネス株及び植物源材料を以下のように調製した。実験の５～７日前に、所望のＲ．リゾゲネス株を、抗生物質を含む寒天培地でプレーティングした培地にストリークした。実験の当日まで、プレートをおよそ２８℃でインキュベートした。実験の６日前に、５０～１００個のアサ種子をおよそ１０ｍＬの濃硫酸で表面滅菌し、滅菌水で２回洗浄した。種子を３０％Ｈ２Ｏ２に２０分間浸し、滅菌水で２回洗浄した。種子を一晩（例えば、およそ１６～２４時間）、穏やかに攪拌しながら（電動インバーターに置かれた円錐管又はロータリーシェーカー上の密閉ペトリ皿のいずれかで）滅菌水に浸した。翌日、水を除去し、浸した種子を３０％過酸化水素でおよそ５分間もう一度洗浄した後、滅菌水で３回すすいだ。ピンセット及び実体顕微鏡を使用して、種皮及び胚乳を除去した後、胚をＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）培地プレートにプレーティングして、１プレートあたり最大５つの胚を播種した。プレートをパラフィルムで密封し、暗所に３日間置いた。プレートをさらに２日間、１６／８時間の明／暗インキュベーター（７５ルーメン、およそ２３℃）に移した。
【0040】
[0048]毛状根を生成するためのアサ胚軸組織の感染は、以下のように行った。感染の５時間前に、白金耳量のプレートからの細菌を、およそ１００μＭのアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）を含むおよそ１ｍＬの滅菌水に懸濁した。細菌懸濁液は、室温で暗所の実験室の引き出しに保管した。アサの実生をインキュベーターから取り出し、以下のステップを行った。実生全体に感染させるために、メスの先を使用して、幼根の上部からおよそ５～１０ｍｍ上の各実生の胚軸に小さな傷をつけた。創傷直後に、およそ２０μＬの細菌懸濁液を傷に接種した。最低１０分後、実生をアサ毛状根共培養培地に移した。プレートあたりの実生の数は、接種した実生が５つに制限された。プレートをパラフィルムで密閉し、一晩、暗所（およそ２２℃～およそ２３℃）に配置した。プレートを暗室から取り出し、さらに１日、１６／８時間の明／暗インキュベーター（７５ルーメン、およそ２３℃）に移し、合計２日間の共培養を行った。
【0041】
[0049]全体の実生の場合、各実生を、およそ５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）を含む個々のアサ毛状根培地プレートに移し、胚軸の以前に創傷した部分が培地に触れていることを確実するように注意を払った。フィトトレイズ（Ｐｈｙｔｏｔｒａｙｓ）（商標）を閉じて、２週間、明室に配置した。組織培養又は発根した穂木からの土壌で増殖した新しいシュート成長をサンプリングして、個々のゲノム編集系統を単離した。
【0042】
[0050]Ｒ．リゾゲネス及び感染溶液は、以下のように調製した。実験の５～７日前に、抗生物質を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地寒天プレートに所望のＲ．リゾゲネス株をストリークした。実験の当日まで、およそ２８℃でプレートを逆さにしてインキュベートした。実験の前日、１５ｍＬ滅菌培養チューブ内に入れた抗生物質を含むおよそ５ｍＬのＬＢ培地に単一コロニーを接種し、およそ２８℃で、およそ１６時間、およそ２５０ｒｐｍで振とう培養した。実験の当日、５０ｍＬの滅菌済み培養管に入れた抗生物質を含むおよそ５０ｍＬのＬＢ培地に培養液の内容物を注ぎ、およそ２８℃、およそ２５０ｒｐｍでＯ．Ｄ．６００が０．５～０．６になるまで振とう培養した。およそ６０００ｒｐｍでおよそ１０分間の遠心分離によって細胞を収集し、最小グロース（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ；ＭＧ）培地に再懸濁した。およそ１ｍＬのＲ．リゾゲネス感染溶液を１．５ｍＬチューブに分注し、感染のおよそ１時間前におよそ１００μＭのアセトシリンゴンを添加した。
【0043】
[0051]トランスジェニック毛状根キメラ植物の生産のためのダイズ穂木の調製及び感染は、以下のように行った。実験の２～３週間前に、２５０ｍＬビーカーにおよそ１００ｍＬの漂白剤を入れた９Ｌデシケーターチャンバーに種子を入れて、ダイズ種子を滅菌した。およそ３．５ｍＬの濃ＨＣＬをゆっくりと添加し、デシケーターチャンバーをおよそ１６時間密閉して塩素ガス滅菌を行った。種子を使用する前に、塩素ガスを消散させた。種子を沈めて、種子のへそを下向きにすることによって、滅菌した種子をＭＳ培地を有するフィタトレイズ（Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ）（商標）に移した。１６／８時間の明／暗（７５ルーメン、およそ２８℃）下にフィタトレイズ（商標）を配置した。実生がＶＣ段階（栄養子葉）に達したら、滅菌メス及び無菌技術を用いて、全ての実生から子葉を除去した。実生の穂木は、胚軸断面を横切った子葉節の背軸方向のシュートを切除することによって調製し、切り込み端をＲ．リゾゲネス感染溶液に入れた。実生の穂木をおよそ２３℃でおよそ１５分間インキュベートした。感染した切り込み端を無菌濾紙にブロットし、切り込み端を培地表面のおよそ１．５ｃｍ下に沈めることにより、ＭＳ培地を含むフィタトレイズ（商標）に入れた。フィタトレイズ（商標）を閉じ、およそ２８℃で１６／８時間の明／暗（７５ルーメン、およそ２８℃）に２日間、配置した。およそ５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及びおよそ１５０ｍｇ／Ｌのチメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）及び植物選択剤と共にＭＳ培地を含むフィタトレイズ（商標）に、切り込み端を培地表面のおよそ１．５ｃｍ下に沈めることにより、感染した穂木を移した。フィタトレイズ（商標）を閉じ、およそ２８℃の暗所に２日間、配置した。新しいシュート成長をサンプリングし、組織培養又は土壌で発根した穂木から増殖させて、個々のゲノム編集系統を単離した。
【0044】
[0052]トランスジェニック毛状根キメラ植物の生産のためのジャガイモ穂木の調製及び感染は、以下のように行った。実験のおよそ３～４週間前に、組織培養ジャガイモ小植物体を、ＭＭＳ（修飾したＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ）培地を含むマジェンタ（商標）ボックス内で、小植物体シュート先端及び無菌技術を使用して増殖させた。組織培養ジャガイモ小植物体を１６／８時間の明／暗（７５ルーメン、およそ２３℃）に配置した。小植物体が５節段階に達すると、完全に出現した葉の根元から４番目の節までを取り除き、完全に出現した葉の単一の節及び頂端分裂組織を残した。ジャガイモ小植物体からの穂木の挿し木は、茎の断面を横切ることによって第４節の背軸方向のシュートを切除し、切り込み端をＲ．リゾゲネス感染溶液に入れることによって調製した。穂木の挿し木をおよそ２３℃で、およそ１５分間インキュベートした。感染した切り込み端を無菌濾紙にブロットし、切り込み端を培地表面のおよそ１．５ｃｍ下に沈めることにより、ＭＳ培地を含むフィタトレイズ（商標）に配置した。フィタトレイズ（商標）を閉じ、２日間、およそ２８℃で、１６／８時間の明／暗（７５ルーメン、およそ２８℃）に配置した。およそ５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及びおよそ１５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び植物選択剤と共にＭＳ培地を含むフィタトレイズ（商標）に、切り込み端を培地表面のおよそ１．５ｃｍ下に沈めることによって、感染した穂木を移した。フィタトレイズ（商標）を閉じ、およそ２８℃の暗所に２日間、配置した。新しいシュート成長をサンプリングし、組織培養又は土壌で発根した穂木から増殖させて、個々のゲノム編集系統を単離した。
【0045】
[0053]ＭＳ培地（フィタトレイズ（商標）又はプレート）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して、培地の１Ｌ溶液を作成した。
１６００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
１０ｇのスクロース；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｍ５１９）；
溶液を１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量に合わせた；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した；
３．５８ｇのＧｅｌｚａｎ（商標）（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｇ３２５１）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、フィタトレイ（Ｐｈｙｔａｔｒａｙ）（商標）又は１００×２５ｍｍプレートあたり１００ｍＬを注いだ。
１６００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
１０ｇのスクロース；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｍ５１９）；
溶液を１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量に合わせた；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した；
３．５８ｇのＧｅｌｚａｎ（商標）（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｇ３２５１）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、フィタトレイ（Ｐｈｙｔａｔｒａｙ）（商標）又は１００×２５ｍｍプレートあたり１００ｍＬを注いだ。
【0046】
[0054]ＭＭＳ培地（マジェンタボックス（商標））を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して、培地の１Ｌ溶液を作成した。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２５ｇのスクロース；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｍ５１９）；
溶液を１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量に合わせた；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した；
７．５ｇの寒天（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ａ２９６）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブした；
０．８ｍｌのセフォタキシム（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）（２５０ｍｇ／ｍｌ）；
０．１ｍｌの６－ＢＡＰ（１ｍｇ／ｍｌ）；
培地を５５℃に冷却し、マジェンタボックス（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｖ８５０５）あたり１００ｍＬ注いだ。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２５ｇのスクロース；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｍ５１９）；
溶液を１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量に合わせた；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した；
７．５ｇの寒天（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ａ２９６）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブした；
０．８ｍｌのセフォタキシム（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）（２５０ｍｇ／ｍｌ）；
０．１ｍｌの６－ＢＡＰ（１ｍｇ／ｍｌ）；
培地を５５℃に冷却し、マジェンタボックス（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｖ８５０５）あたり１００ｍＬ注いだ。
【0047】
[0055]（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地（培養管）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して、培地の１Ｌ溶液を作成した。
６００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２５ｇのＬＢ（シグマ：Ｌ３５２２）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
培地は、液体サイクルで２５分間オートクレーブした。
６００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２５ｇのＬＢ（シグマ：Ｌ３５２２）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
培地は、液体サイクルで２５分間オートクレーブした。
【0048】
[0056]ＬＢ寒天培地（プレート）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して、培地の１Ｌ溶液を作成した。６００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２５ｇのＬＢ（シグマ：Ｌ３５２２）；
１５ｇの寒天（シグマ：Ａ５３０６）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
２５ｇのＬＢ（シグマ：Ｌ３５２２）；
１５ｇの寒天（シグマ：Ａ５３０６）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
【0049】
[0057]ＭＧ（最小グロース）塩（２０Ｘ）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用した。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２０ｇのＮＨ４Ｃｌ；
６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；
３ｇのＫＣｌ；
０．２ｇのＣａＣｌ２；
５０ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
２０ｇのＮＨ４Ｃｌ；
６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；
３ｇのＫＣｌ；
０．２ｇのＣａＣｌ２；
５０ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
【0050】
[0058]ＭＧ（最小グロース）緩衝液（２０Ｘ）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して１Ｌの培地を形成した。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
６０ｇのＫ２ＨＰＯ４；
２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４；
溶液は、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
６０ｇのＫ２ＨＰＯ４；
２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４；
溶液は、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した。
【0051】
[0059]液体寒天培地を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して１Ｌの培地を形成した。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
５ｇのグルコース；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
５０ｍｌの２０ｘ ＭＧ塩；
５０ｍｌの２０Ｘ ＭＧ緩衝液；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブした。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
５ｇのグルコース；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
５０ｍｌの２０ｘ ＭＧ塩；
５０ｍｌの２０Ｘ ＭＧ緩衝液；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブした。
【0052】
[0060]プレート寒天培地を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して１Ｌの培地を形成した。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
５ｇのグルコース；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
５０ｍｌの２０ｘ ＭＧ塩；
５０ｍｌの２０Ｘ ＭＧ緩衝液；
１５ｇの寒天（シグマ：Ａ５３０６）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
７００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
５ｇのグルコース；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
５０ｍｌの２０ｘ ＭＧ塩；
５０ｍｌの２０Ｘ ＭＧ緩衝液；
１５ｇの寒天（シグマ：Ａ５３０６）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
【0053】
[0061]アサの毛状根培地（フィタトレイズ（商標））を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用した。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
３０ｇのスクロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｓ９３７８）；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（フィトテック：Ｍ５１９）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した；
６ｇのアガロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ａ６０１３）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、フィタトレイ（商標）あたり１００ｍＬを注いだ。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
３０ｇのスクロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｓ９３７８）；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（フィトテック：Ｍ５１９）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した；
６ｇのアガロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ａ６０１３）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、フィタトレイ（商標）あたり１００ｍＬを注いだ。
【0054】
[0062]アサの毛状根共培養培地（プレート）を作成するために、以下のプロトコル及び容量を使用して１Ｌの培地を作成した。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
３０ｇのスクロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｓ９３７８）；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｍ５１９）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した；
６ｇのアガロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ａ６０１３）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×２５ｍｍプレートあたり５０ｍＬを注いだ。
８００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ；
３０ｇのスクロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｓ９３７８）；
４．４３ｇのＭＳ基礎塩＋ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ｍ５１９）；
溶液は、１０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏで容量を調整した；
ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した；
６ｇのアガロース（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ：Ａ６０１３）；
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブし、５５℃に冷却し、１００×２５ｍｍプレートあたり５０ｍＬを注いだ。
【0055】
[0063]図４Ａ及び４Ｂは、本開示と一致する、ジャガイモにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示している。特には、図４Ａは、図３Ａに関して議論したように、ＴＡＬＥＮを発現するジャガイモにおけるトランスジェニック毛状根の蛍光画像を例示している。トランスジェニック組織は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）として例示されている。図４Ｂは、ＴＡＬＥＮを発現するジャガイモのトランスジェニック毛状根の蛍光画像及び白色光画像を例示している。トランスジェニック組織は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）として例示されている。
【0056】
[0064]図５Ａ及び５Ｂは、本開示と一致する、アサにおけるトランスジェニック毛状根の成長を例示している。特には、図５Ａは、図３Ａに関して議論したように、ＴＡＬＥＮを発現するアサのトランスジェニック毛状根の蛍光画像を例示している。トランスジェニック組織は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）として例示されている。図５Ｂは、ＴＡＬＥＮを発現するアサのトランスジェニック根の蛍光画像及び白色光画像を例示している。トランスジェニック組織は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）として例示している。
【0057】
[0065]図６は、本開示と一致する、トランスジェニック毛状根を有するキメラアサ植物を例示している。特には、図６は、アサにおける毛状根を、ＴＡＬＥＮを使用せずに成長させ、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の動きを示すために、ＧＵＳマーカーを使用した対照実験の結果を例示している。図６に例示されるように、ＴＡＬＥＮを使用しない場合、マーカーのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質は毛状根の組織に統合され、植物の下部が青色に染色された。赤い矢印で識別される染色のいくつかのスポットは、アサ植物の葉へのマーカーｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の最小限の動きを示している。
【0058】
[0066]図７は、本開示と一致する、トランスジェニック毛状根を有するキメラジャガイモ植物を例示している。特には、図７は、ジャガイモの毛状根を、ＴＡＬＥＮを使用せずに成長させ、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の動きを示すために、ＧＵＳマーカーを使用した対照実験の結果を例示している。図７に例示するように、ＴＡＬＥＮを用いない場合は、マーカーｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が毛状根の組織に統合され、その結果、植物の下部に青色の染色が生じた。赤い矢印で識別される染色のいくつかのスポットは、アサ植物の葉へのマーカーｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の最小限の動きを示している。
【0059】
[0067]図８Ａ及び８Ｂは、本開示と一致する、キメラジャガイモ植物組織から得られたゲル電気泳動の結果を例示している。特には、図８Ａは、ＴＡＬＥＮを保有するＲ．リゾゲネスにさらされた植物から得られたゲル電気泳動の結果を例示しており、図８Ｂは、８Ａで使用されたが対照１８Ｓ遺伝子を検出したサンプルから得られたゲル電気泳動の結果を例示している。
【0060】
[0068]図８Ａに例示するように、列は、キメラ植物のシュート先端の３つのサンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「シュート先端」の下の列１、２、及び３）、トランスジェニック毛状根の３つのサンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「根」の下の列１、２、及び３）、プラスミドの２つのサンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「プラスミド」の下の列１及び２）、ＴＡＬＥＮを保有するＲ．リゾゲネスを含まない野生型植物の４つのシュート先端サンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「野生型」の下の列１、２、３、及び４）、水の対照を使用したもののように分割された。図８Ａに例示するように、全てのシュート先端、全ての根、及びプラスミドには、ＴＡＬＥＮ配列に対応する、４２０塩基対での結果が含まれる。対照的に、野生型の植物と水の結果には４２０塩基対のシグナルが含まれていないが、これは、ＴＡＬＥＮ配列が野生型の組織又は水に存在していないことを示している。これらの結果は、本明細書で議論した例に従って、ＴＡＬＥＮを保有するＲ．リゾゲネスに宿主植物を感染させることによって、キメラ植物を生成できることを確証している。
【0061】
[0069]図８Ｂは、別の対照実験からのゲル電気泳動の結果を例示している。列は、キメラ植物のシュート先端の３つのサンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「シュート先端」の下の列１、２、及び３）、トランスジェニック毛状根の３つのサンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「根」の下の列１、２、及び３）、野生型植物の４つのシュート先端サンプルをサンプリングしたもの（すなわち、「野生型」の下の列１、２、３、及び４）のように分割された。図８Ｂで使用される植物組織サンプルは、８Ａで使用されたものと同じであり、サンプリングされた全ての植物組織は、植物全体に渡って見られる１８Ｓ遺伝子を保有している。１８Ｓ遺伝子は、ＲＴ－ＰＣＲにおいて使用されるＲＮＡサンプルの陽性対照として機能した。その結果、各サンプルは４９３塩基対で結果を示し、同等のＲＮＡ品質を持っていた。図８Ａ及び８Ｂに例示される結果の組み合わせは、ＴＡＬＥＮを含む発現コンストラクトを保有するＲ．リゾゲネスにより、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が、本明細書で議論されるようなキメラ植物のトランスジェニック毛状根からシュート先端に移動することが可能になることを実証する。
【0062】
【0063】
[0071]図１０は、本開示と一致する、キメラジャガイモ植物のシュート先端から得られたデータを例示している。特には、図１０は、キメラ植物のシュート先端におけるゲノム編集の倍増を例示している。最初の列（左から）は、ＣｓＰＬ００７＿Ｎｏｓ．ＴＨＣキメラアサが、野生型アサに対して、シュート先端でのＴＨＣ遺伝子のゲノム編集で、８．２７倍の増加を実証したことを例示しており、及び２番目の列は、ＣｓＰＬ００７＿Ｕｂｉ３．ＴＨＣキメラアサが、野生型アサに対して、シュート先端でのＴＨＣ遺伝子のゲノム編集で、３．０５倍の増加を実証したことを例示している。３番目の列は、ＣｓＰＬ００７＿３５Ｓ．ＰＤＳキメラアサが、野生型アサに対して、シュート先端でのＰＤＳ遺伝子のゲノム編集で、５．５０倍の増加を実証したことを例示しており、４番目の列は、ＣｓＰＬ００７＿Ｎｏｓ．ＰＤＳキメラアサが、野生型アサに対して、シュート先端でのＰＤＳ遺伝子のゲノム編集で、７．６７倍の増加を実証したことを例示しており、及び５番目の列は、ＣｓＰＬ００７＿Ｕｂｉ３．ＰＤＳキメラアサが、野生型アサに対して、シュート先端でのＰＤＳ遺伝子のゲノム編集で、２．１４倍の増加を実証したことを例示している。６番目の列は、ＳｔＲＲ＿Ｎｏｓ．ＰＤＳのキメラジャガイモが、野生型ジャガイモに対して、シュート先端でのＰＤＳ遺伝子のゲノム編集で、１．８２倍の増加を実証したことを例示している。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】