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特表2023-545850ＣＤ１４プロモーターを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-31
(54)【発明の名称】ＣＤ１４プロモーターを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20231024BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20231024BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231024BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231024BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231024BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20231024BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20231024BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20231024BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20231024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231024BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231024BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20231024BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/12
C12N7/01
C12N1/21
A61K35/15
A61K39/00 H
A61K39/02
A61K39/12
A61P35/00
A61P37/04
A61K38/19
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523665
(86)(22)【出願日】2021-10-14
(85)【翻訳文提出日】2023-06-02
(86)【国際出願番号】 US2021054975
(87)【国際公開番号】W WO2022081839
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】63/092,239
(32)【優先日】2020-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523138356
【氏名又は名称】アヴォサイト， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チャン， アイチュアン
(72)【発明者】
【氏名】リウ， チュアンシン
(72)【発明者】
【氏名】リウ， ヨン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084DA01
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C085AA03
4C085BA07
4C085BA51
4C085BB01
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB44
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、ＣＤ１４＋細胞において外因性核酸配列を特異的に発現するｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶビリオンを提供する。ｒＡＡＶベクターまたはビリオンは、例えば、がん抗原、ウイルス抗原、および／または細菌抗原をコードする外因性核酸配列を単球および樹状細胞において特異的に発現させるのに有用である。ｒＡＡＶを形質導入したＣＤ１４＋細胞は、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する抗原提示細胞として使用することができる。本開示はさらに、ｒＡＡＶビリオンを産生する方法および免疫療法の方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むポリヌクレオチドであって、前記ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４発現細胞において特異的に前記外因性核酸の発現を誘導する、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記ＣＤ１４プロモーターがヒトＣＤ１４プロモーター配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＣＤ１４プロモーターが配列番号１を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記ＣＤ１４プロモーターが、配列番号１の３７８～３８６位、４０４～４１０位および５３３～５３８位に少なくともヌクレオチドを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＣＤ１４発現細胞が、単球、マクロファージまたは樹状細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ｒＡＡＶベクターが、５’→３’方向に、第１のＩＴＲ、前記外因性核酸配列に作動可能に連結された前記ＣＤ１４プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、および第２のＩＴＲを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ＩＴＲ配列がＡＡＶ－２ ＩＴＲである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記第１のＩＴＲ配列および前記第２のＩＴＲ配列がＡＡＶ－２ ＩＴＲである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記ｒＡＡＶベクターがプラスミドである、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記プラスミドが、ヒトＣＤ１４転写プロモーター、ＡＡＶ２型逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、マルチクローニングサイト配列（ＭＣＳ）、ＳＶ４０後期ポリＡ配列、抗生物質耐性遺伝子、および前記プラスミドが宿主細胞において複製することを可能にする遺伝子エレメントを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記ｒＡＡＶベクターがエンハンサー領域をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
前記外因性核酸配列が、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、制限酵素標的配列、および／またはポリペプチドをコードする配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記外因性核酸配列が、ポリペプチドをコードする配列を含み、前記ポリペプチドが、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、サイトカイン、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記外因性核酸配列が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物をコードする配列を含み、前記腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物が、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ／ＣＴ２．１）、分化抗原群２０（ＣＤ２０）、ＣＤ２６９、Ｇ２５０（炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ ＩＸ）、ＨＭ１．２４、ＣＤ１５４、前立腺がん関連抗原、乳がん関連腫瘍関連抗原、がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリーのメンバー、ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーのメンバー、ＭＡＲＴ １、ＳＡＧＥ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９、Ｋ１９、ｃｙｆｒａ２１－１）、サバイビン、ムチン－１（ＭＵＣ－１、ＣＡ １５－３）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）抗原、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
（ａ）前記前立腺がん関連抗原が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）もしくは前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせであり、（ｂ）前記乳がん関連腫瘍関連抗原が、乳房上皮抗原４６（ＢＡ４６、ラクトアドヘリン）またはその任意の抗原断片であり、
（ｃ）前記がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリーのメンバーが、ニューヨーク食道扁平上皮癌－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）（ＣＴ６．１）、ＡＤＡＭ２（ＣＴ１５）、ＳＰＡ１７（ＣＴ２２）、またはＳＰＡＮＸ－Ａ １（ＣＴ１１．１）、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組合せであり、または
（ｄ）前記ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーのメンバーが、ＭＡＧＥ－Ａ１／ＣＴ１．１、ＭＡＧＥ－Ａ２／ＣＴ１．２、ＭＡＧＥ－Ａ３／ＣＴ１．３、ＭＡＧＥ－Ａ４／ＣＴ１．４、ＭＡＧＥ－Ｂ１／ＣＴ３．１、ＭＡＧＥ－Ｃ１／ＣＴ７．１、ＭＡＧＥ－Ｃ２／ＣＴ １０、ＭＡＧＥ－Ｃ３／ＣＴ７．２もしくはＭＡＧＥ－Ｅ１、または任意の抗原断片および／もしくはその組合せである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物が、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ、ＢＡ４６、ＣＥＡ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＣＫ１９、サバイビン、ＭＵＣ－１、ＳＣＣ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＡＤＡＭ２、ＳＰＡ１７もしくはＳＰＡＮＸ－Ａ１、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせである、請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
前記外因性核酸配列がウイルス抗原をコードする配列を含み、前記ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
前記ＨＰＶ抗原がＥ６抗原またはＥ７抗原である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記Ｅ６抗原またはＥ７抗原が、ＨＰＶ血清型１６、１８、３０、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、６１、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
前記外因性核酸配列が、サイトカインをコードする配列を含み、前記サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＴＧＦ－β、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２５、ＩＬ－２７、およびアンフィレグリン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
請求項１から２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項22】
前記ビリオンが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む、請求項２１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項23】
前記ビリオンがＡＡＶ２のカプシドタンパク質を含む、請求項２１または２２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項24】
前記ビリオンが、以下：前記ＣＤ１４プロモーター以外のプロモーターおよびＡＡＶ構造遺伝子のうちの１つまたは複数を含まない、請求項２１～２３のいずれかに記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項25】
ＡＡＶ構造遺伝子がＡＡＶ２のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含む、請求項２４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項26】
ｒＡＡＶビリオンを産生する方法であって、請求項１～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをパッケージング細胞に導入するステップを含み、前記パッケージング細胞がヘルパー遺伝子をコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含む、方法。
【請求項27】
前記ヘルパー遺伝子が、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記パッケージング細胞が前記ヘルパー遺伝子を安定的に発現する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ヘルパー遺伝子が、単一のプラスミド上にコードされる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記ヘルパー遺伝子が２つ以上のプラスミドに含まれる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子が第１のヘルパープラスミド上にコードされ、前記ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子が第２のヘルパープラスミド上にコードされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記ヘルパー遺伝子が、請求項１～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで前記パッケージング細胞に共トランスフェクトされる、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記ｒＡＡＶベクターが、前記ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドで共トランスフェクトされ、前記パッケージング細胞がアデノウイルスに感染される、請求項２６に記載の方法。
【請求項34】
前記パッケージング細胞が、ＨＥＫ ２９３、ＨｅＬａ、またはＨＴ１０８０細胞である、請求項２６～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
請求項１～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞の集団。
【請求項36】
前記細胞がＣＤ１４を発現する、請求項３５に記載の単離された細胞の集団。
【請求項37】
前記細胞が、ポリペプチドをコードする前記外因性核酸配列を発現する、請求項３５または３６に記載の単離された細胞の集団。
【請求項38】
前記細胞が、単球、樹状細胞またはマクロファージである、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の単離された細胞の集団。
【請求項39】
前記細胞がパッケージング細胞である、請求項３５に記載の単離された細胞の集団。
【請求項40】
前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項３５または３９に記載の単離された細胞の集団。
【請求項41】
請求項３５～３８のいずれか１項に記載の単離された細胞を含む医薬組成物であって、前記細胞が、前記外因性核酸配列によってコードされる前記ポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を生成するためにＴ細胞を活性化するのに有効である、医薬組成物。
【請求項42】
前記ポリペプチドが、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、または細菌抗原である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項43】
前記ポリペプチドが、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物であり、前記腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物が、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ／ＣＴ２．１）、分化抗原群２０（ＣＤ２０）、ＣＤ２６９、Ｇ２５０（炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ ＩＸ）、ＨＭ１．２４、ＣＤ１５４、前立腺がん関連抗原、乳がん関連腫瘍関連抗原、がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリーのメンバー、ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーのメンバー、ＭＡＲＴ １、ＳＡＧＥ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９、Ｋ１９、ｃｙｆｒａ２１－１）、サバイビン、ムチン－１（ＭＵＣ－１、ＣＡ １５－３）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）抗原、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
（ａ）前記前立腺がん関連抗原が、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）もしくは前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせであり、（ｂ）前記乳がん関連腫瘍関連抗原が、乳房上皮抗原４６（ＢＡ４６、ラクトアドヘリン）またはその任意の抗原断片であり、
（ｃ）前記がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリーの前記メンバーが、ニューヨーク食道扁平上皮癌－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）（ＣＴ６．１）、ＡＤＡＭ２（ＣＴ１５）、ＳＰＡ１７（ＣＴ２２）、またはＳＰＡＮＸ－Ａ １（ＣＴ１１．１）、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組合せであり、または
（ｄ）前記ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーの前記メンバーが、ＭＡＧＥ－Ａ１／ＣＴ１．１、ＭＡＧＥ－Ａ２／ＣＴ１．２、ＭＡＧＥ－Ａ３／ＣＴ１．３、ＭＡＧＥ－Ａ４／ＣＴ１．４、ＭＡＧＥ－Ｂ１／ＣＴ３．１、ＭＡＧＥ－Ｃ１／ＣＴ７．１、ＭＡＧＥ－Ｃ２／ＣＴ １０、ＭＡＧＥ－Ｃ３／ＣＴ７．２もしくはＭＡＧＥ－Ｅ１、または任意の抗原断片および／もしくはその組合せである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項45】
前記腫瘍抗原、腫瘍関連抗原または癌遺伝子産物が、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ、ＢＡ４６、ＣＥＡ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＣＫ１９、サバイビン、ＭＵＣ－１、ＳＣＣ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＡＤＡＭ２、ＳＰＡ１７もしくはＳＰＡＮＸ－Ａ１、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせである、請求項４３または４４に記載の医薬組成物。
【請求項46】
前記ポリペプチドがウイルス抗原であり、前記ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項47】
前記ＨＰＶ抗原がＥ６抗原またはＥ７抗原である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項48】
前記Ｅ６抗原またはＥ７抗原が、ＨＰＶ血清型１６、１８、３０、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、６１、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項49】
前記細胞が、単球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項４１～４８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項50】
免疫療法の方法であって、請求項３５～３８に記載の単離された細胞の集団または請求項４１～４９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを投与すること必要とする対象に投与し、それによって免疫応答を刺激するステップを含む、方法。
【請求項51】
前記対象がヒトである、請求項５０に記載の免疫療法の方法。
【請求項52】
前記単離された細胞の前記集団が前記対象由来であった、請求項５０または５１に記載の免疫療法の方法。
【請求項53】
請求項１～２０のいずれか１項に記載の外因性核酸配列によってコードされる前記ポリペプチドを発現する細胞を標的とする抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、前記Ｔ細胞が請求項３５～３８のいずれか１項に記載の細胞によって活性化されている、医薬組成物。
【請求項54】
免疫療法の方法であって、請求項５３のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを投与することを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項55】
前記対象がヒトである、請求項５４に記載の免疫療法の方法。
【請求項56】
前記抗原特異的Ｔ細胞が前記対象由来であった、請求項５４または５５に記載の免疫療法の方法。
【請求項57】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む医薬組成物であって、前記ＰＢＭＣが、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の細胞によって活性化されている抗原特異的Ｔ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項58】
免疫療法の方法であって、請求項５７に記載の医薬組成物を、それを投与することを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項59】
前記対象がヒトである、請求項５８に記載の免疫療法の方法。
【請求項60】
前記ＰＢＭＣが前記対象由来であった、請求項５８または５９に記載の免疫療法の方法。
【請求項61】
免疫療法の方法であってａ．対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に請求項２１～２５のいずれかに記載されるｒＡＡＶビリオンを感染させて感染ＰＢＭＣを生成するステップと、
ｂ．分化サイトカインを添加して前記感染ＰＢＭＣの単球を樹状細胞（ＤＣ）に分化させるステップと、
ｃ．活性化サイトカインを添加して前記感染ＰＢＭＣの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化して活性化ＣＴＬを生成するステップと、
ｄ．必要に応じて、前記感染ＰＢＭＣから活性化ＣＴＬを単離するステップと、
ｅ．有効量の、活性化ＣＴＬまたは単離された活性化ＣＴＬを含む前記感染ＰＭＢＣを前記対象に投与するステップと
を含む、方法。
【請求項62】
改変された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法であって、ｉ）ＣＤ１４＋細胞を提供するステップと、ｉｉ）前記ＣＤ１４＋細胞を、ポリペプチドをコードする配列を発現するのに十分な、請求項２１～２５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと接触させるステップと、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドを発現するのに十分な時間、ステップｉｉ）の前記ＣＤ１４＋細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項63】
前記ＣＤ１４＋細胞が、単球または樹状細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記単球が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団にある、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記単球が、単離された単球である、請求項６３に記載の方法。
【請求項66】
前記単球を樹状細胞にさらに分化させる、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記単球を外因性サイトカインと接触させることによって、前記単球を樹状細胞に分化させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
外因性サイトカインをコードするポリヌクレオチドを前記単球に導入することによって、前記単球を樹状細胞に分化させ、それによって前記単球に外因性サイトカインを発現させる、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記外因性サイトカインをコードする前記ポリヌクレオチドがプラスミドまたはｒＡＡＶビリオンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記ｒＡＡＶビリオンが、請求項２１～２５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンである、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記外因性サイトカインを前記細胞培養物に添加する、請求項６７に記載の方法。
【請求項72】
前記外因性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６７～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
前記外因性サイトカインが、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αである、請求項６３～７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項74】
抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法であって、ｉ）ナイーブＴ細胞を提供するステップと、
ｉｉ）前記ナイーブＴ細胞を請求項６２～７３のいずれか１項に記載の方法によって産生された改変ＡＰＣと接触させるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の前記Ｔ細胞を活性化サイトカインと接触させるステップと
を含む、方法。
【請求項75】
前記活性化サイトカインがＩＬ－２、ＩＬ－７、またはその両方である、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項７４または７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙媒体の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は１００２３９＿４０１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは７．６ＫＢで、２０２１年９月１５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙媒体の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は１００２３９＿４０１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは７．６ＫＢで、２０２１年９月１５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【0002】
背景
技術分野
本発明は、分子生物学、免疫学、免疫療法、および遺伝子治療の分野に関する。具体的には、本発明は、ＣＤ１４プロモーター領域を有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよびその実用的な用途に関する。
技術分野
本発明は、分子生物学、免疫学、免疫療法、および遺伝子治療の分野に関する。具体的には、本発明は、ＣＤ１４プロモーター領域を有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターおよびその実用的な用途に関する。
【背景技術】
【0003】
関連技術の説明
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２型ゲノムは、約４．７キロベース長である一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）で構築されている。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（１４５塩基）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子とを含む。ＡＡＶゲノムの左側にはｐ５、ｐ１９、およびｐ４０プロモーターがあり、そこから異なる長さの２つの重複ｍＲＮＡを産生することができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２型ゲノムは、約４．７キロベース長である一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）で構築されている。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（１４５塩基）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子とを含む。ＡＡＶゲノムの左側にはｐ５、ｐ１９、およびｐ４０プロモーターがあり、そこから異なる長さの２つの重複ｍＲＮＡを産生することができる。
【0004】
ＡＡＶは非病原性ウイルスであるため、遺伝子治療および免疫療法のウイルスベクターとして利用されている。ＡＡＶおよび組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、体細胞、神経細胞、および血球などの様々なヒト細胞に広く感染する（形質導入する）能力を有する。ｒＡＡＶは、ポリペプチドに翻訳され得る外因性ＲＮＡを発現し得る。ｒＡＡＶのこの感染性の性質は、多くの疾患の遺伝子治療において利点を有する。しかしながら、ｒＡＡＶベクターは通常、ＡＡＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなどの構成的プロモーターを含み、すべてまたは多くの組織での遺伝子の発現を促進することができる。構成的プロモーターを有するｒＡＡＶは、非標的細胞に感染しかつ外因性遺伝子の産物を非標的細胞において発現させることによって、望ましくないオフターゲット効果を発生させる可能性がある。したがって、臨床処置において、構成的プロモーターを有するｒＡＡＶは、毒性作用の潜在的な危険性を含む、処置の目的とは無関係の有害反応または副作用をもたらし得る。したがって、処置の安全性、精度、および有効性が改善されたｒＡＡＶベクターが当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
簡潔な概要
本開示は、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むポリヌクレオチドであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４発現細胞において特異的に外因性核酸の発現を誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ヒトＣＤ１４プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１の３７８～３８６位、４０４～４１０位および５３３～５３８位に少なくともヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４発現細胞は、単球、マクロファージ、または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、５’→３’方向に、第１のＩＴＲ、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、および第２のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、制限酵素標的配列、および／またはポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、サイトカイン、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部をコードする。
本開示は、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むポリヌクレオチドであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４発現細胞において特異的に外因性核酸の発現を誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ヒトＣＤ１４プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１の３７８～３８６位、４０４～４１０位および５３３～５３８位に少なくともヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４発現細胞は、単球、マクロファージ、または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、５’→３’方向に、第１のＩＴＲ、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、および第２のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、制限酵素標的配列、および／またはポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、サイトカイン、またはそれらの任意の組み合わせの全部または一部をコードする。
【0006】
いくつかの実施形態では、本開示は、２つのＩＴＲ配列を含むポリヌクレオチドと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むｒＡＡＶビリオンであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４発現細胞において特異的に外因性核酸の発現を誘導する、ｒＡＡＶビリオンを提供する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターをパッケージング細胞に導入するステップを含む、ｒＡＡＶビリオンを産生する方法であって、パッケージング細胞がヘルパー遺伝子をコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを産生する方法は、ヘルパー遺伝子を本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターと共にパッケージング細胞に共トランスフェクトするステップを含む。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａまたはＨＴ１０８０細胞である。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む単離細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ１４を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、単球、樹状細胞、またはマクロファージである。
【0009】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される単離されたｒＡＡＶ形質導入ＣＤ１４＋細胞を含む医薬組成物であって、細胞が外因性核酸配列によってコードされるポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を生成するためにＴ細胞を活性化するのに有効である、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、または細菌抗原である。いくつかの実施形態では、細胞は、単球、樹状細胞、またはマクロファージである。
【0010】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される外因性核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を標的とする抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物であって、Ｔ細胞が本明細書に開示されるｒＡＡＶ形質導入ＣＤ１４＋細胞のいずれか１つの細胞によって活性化されている、医薬組成物を提供する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む医薬組成物であって、ＰＢＭＣが本明細書に開示されるｒＡＡＶ形質導入ＣＤ１４＋細胞によって活性化された抗原特異的Ｔ細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【0012】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法の方法であって、本明細書に開示される単離された細胞の集団または本明細書に開示される医薬組成物を、それを投与することを必要とする対象に投与し、それによって免疫応答を刺激するステップを含む、免疫療法の方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法の方法であって、ａ．対象のＰＢＭＣを本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンで感染させて、感染ＰＢＭＣを生成するステップと、ｂ．分化サイトカインを添加して感染ＰＢＭＣの単球を樹状細胞（ＤＣ）に分化させるステップと、ｃ．活性化サイトカインを添加して感染ＰＢＭＣの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化して活性化ＣＴＬを生成するステップと、ｄ．必要に応じて、感染ＰＢＭＣから活性化ＣＴＬを単離するステップと、ｅ．有効量の、活性化ＣＴＬまたは単離された活性化ＣＴＬを含む感染ＰＭＢＣを対象に投与するステップとを含む、免疫療法の方法を提供する。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法であって、ｉ）ＣＤ１４＋細胞を提供するステップと、ｉｉ）ＣＤ１４＋細胞を、ポリペプチドをコードする配列を発現するのに十分な、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンと接触させるステップと、ｉｉｉ）ポリペプチドを発現するのに十分な時間、ステップｉｉ）のＣＤ１４＋細胞を培養するステップとを含む、改変された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４＋細胞は単球または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、単球はＰＢＭＣの集団にある。いくつかの実施形態では、単球は単離された単球である。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞にさらに分化させる。いくつかの実施形態では、単球を外因性サイトカインと接触させることによって、単球は樹状細胞に分化させる。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせである。
【0015】
いくつかの実施形態では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法であって、ｉ）ナイーブＴ細胞を提供するステップと、ｉｉ）ナイーブＴ細胞を本明細書に開示される産生された改変ＡＰＣと接触させるステップと、ｉｉｉ）ステップｉｉ）のＴ細胞を活性化サイトカインと接触させるステップとを含む、抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはその両方である。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【0016】
本開示のいくつかの実施形態は、例として示されており、添付の図面によって限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【発明を実施するための形態】
【0035】
詳細な説明
単球または樹状細胞（ＤＣ）などのＣＤ１４＋細胞における作動可能に連結されたポリヌクレオチドの標的化および／または特異的発現を促進することができる分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の抗原１４（ＣＤ１４）プロモーターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書で提供される。外因性遺伝子および／またはコード配列をｒＡＡＶベクターに挿入することができる。ＣＤ１４＋細胞に感染し、ＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結された外因性遺伝子および／またはコード配列を導入し、それによってＣＤ１４＋細胞における外因性遺伝子および／またはコード配列の標的化および／または特異的発現を促進することができるｒＡＡＶビリオン（例えば、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ）も提供される。外因性遺伝子および／またはコード配列の例としては、野生型、切断型または変異体腫瘍抗原遺伝子、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、サイトカインおよび目的の他のポリペプチドをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、単球およびＤＣを形質導入して、悪性腫瘍、ウイルスまたは細菌感染性疾患、および他の疾患を処置または予防するために使用することができる免疫応答を誘導するのに有用である。組織または細胞特異的ＣＤ１４プロモーターを使用して、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、組成物、方法は、非標的細胞での発現に起因し得る合併症を低減しながら、ＣＤ１４＋細胞における目的のポリヌクレオチド配列の標的化および／または特異的発現の利点を提供する。
単球または樹状細胞（ＤＣ）などのＣＤ１４＋細胞における作動可能に連結されたポリヌクレオチドの標的化および／または特異的発現を促進することができる分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の抗原１４（ＣＤ１４）プロモーターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書で提供される。外因性遺伝子および／またはコード配列をｒＡＡＶベクターに挿入することができる。ＣＤ１４＋細胞に感染し、ＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結された外因性遺伝子および／またはコード配列を導入し、それによってＣＤ１４＋細胞における外因性遺伝子および／またはコード配列の標的化および／または特異的発現を促進することができるｒＡＡＶビリオン（例えば、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ）も提供される。外因性遺伝子および／またはコード配列の例としては、野生型、切断型または変異体腫瘍抗原遺伝子、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、サイトカインおよび目的の他のポリペプチドをコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、単球およびＤＣを形質導入して、悪性腫瘍、ウイルスまたは細菌感染性疾患、および他の疾患を処置または予防するために使用することができる免疫応答を誘導するのに有用である。組織または細胞特異的ＣＤ１４プロモーターを使用して、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、組成物、方法は、非標的細胞での発現に起因し得る合併症を低減しながら、ＣＤ１４＋細胞における目的のポリヌクレオチド配列の標的化および／または特異的発現の利点を提供する。
【0036】
定義
本明細書において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、他に指示がない限り、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、他に指示がない限り、示された範囲または値の±２０％を意味する。
本明細書において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比の範囲、または整数範囲は、他に指示がない限り、列挙された範囲内の任意の値または部分範囲を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、他に指示がない限り、示された範囲または値の±２０％を意味する。
【0037】
また、「または」という用語は、文脈上別段の指示がない限り、「および／または」（すなわち、選択肢のいずれか１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味する）を含むその意味で一般的に使用されることに留意されたい。
【0038】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0039】
「備える（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびそれらの変形は同義的に使用され、非限定的であると解釈されるべきである。
【0040】
本明細書で使用される「それらの組み合わせ（ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」という用語は、その用語の前に列挙された項目のすべての可能な組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのいずれか１つを指すことが意図されている。同様に、本明細書で使用される「それらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」という用語は、その用語の前に列挙された項目のすべての可能な組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、およびそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、およびＡＢＣのすべてを指すことが意図されている。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、直鎖もしくは環状のコンホメーションで、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（ｌｏｃｉ）（遺伝子座（ｌｏｃｕｓ））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定すると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分において修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語はまた、１つまたはそれを超えるアミノ酸が対応する天然由来のアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【0043】
一般に、本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチドを指す。ベクターとしては、一本鎖、二本鎖または部分二本鎖であるポリヌクレオチド分子；１つまたはそれを超える自由末端を含むポリヌクレオチド分子、自由末端を含まないポリヌクレオチド分子（例えば、円形）；ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含むポリヌクレオチド分子；および当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルスにパッケージングするためにベクター中に存在する（例えば、アデノ随伴ウイルス）。ウイルスベクターとしては、宿主細胞への形質導入のためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドも含まれる。
【0044】
「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は交換可能であり、外因性ＤＮＡ配列が真核細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクションなどを含むいくつかの方法のいずれか１つによって達成することができる。形質導入は、一般に、ウイルスベクター、例えばＡＡＶ、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスベクターによって達成される真核細胞への外因性ＤＮＡ配列の導入を指す。
【0045】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。したがって、遺伝子は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および／または変異体を発現するか、または発現するように適合されたｃＤＮＡ配列、ゲノム配列、およびより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得るが、必ずしもこれらに限定されない。
【0046】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「発現産物」と呼ばれ得る。
【0047】
本明細書で使用される場合、「特異的発現」、「標的化発現」および「特異的に発現する」は互換的に使用され、特定の標的組織または標的細胞型におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を指すが、非標的組織または非標的細胞型では発現が欠如しているかまたは検出不能な発現を指す。特異的発現は、通常、「組織特異的プロモーター」または「細胞特異的プロモーター」によって駆動される。「組織特異的プロモーター」は、１つまたは少数の標的組織でその制御下にある遺伝子を発現するが、他の組織では発現しない。「細胞特異的プロモーター」は、１つまたは少数の特定の細胞型においてその制御下にある遺伝子を発現するが、他の細胞型では発現しない。組織特異的プロモーターおよび細胞特異的プロモーターの両方は、本明細書で使用される場合、「特異的プロモーター」と呼ばれ得る。特異的プロモーターは、転写の活性化因子および／または抑制因子として作用することができる１つまたはそれを超える特定の転写因子と相互作用する特定のＤＮＡ配列を含む。特異的プロモーターは、特定の細胞型および／または組織においてのみポリヌクレオチドの発現を駆動する。例えば、特異的プロモーターは、Ｔ細胞または上皮細胞ではなく、単球および／またはＤＣにおいてポリヌクレオチドの特異的発現を駆動することができる。特異的プロモーターの例は、ＣＤ１４プロモーターである。
【0048】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、ベクターが宿主細胞に導入された場合に、例えば宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、目的のヌクレオチド配列がプロモーターなどの調節エレメント（複数可）に連結されていることを意味することを意図する。
【0049】
「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図される。そのような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆに記載されている。調節エレメントには、組織特異的発現を指示するものが含まれる。
【0050】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶ粒子」という用語は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターをカプシド形成する少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含むカプシドを含む感染性ウイルス粒子を指す。好ましくは、ベクターは、ｒＡＡＶビリオンが標的細胞に感染（形質導入）した後に発現される外因性および／または異種核酸配列を含む。
【0051】
本明細書で使用される場合、「外因性」とは、細胞またはウイルスに通常は存在しないが、１つまたはそれを超える遺伝的、生化学的または他の方法によって細胞またはウイルスに導入されることができる核酸配列またはポリペプチドを指す。例えば、外因性核酸配列は、細胞に導入された感染性ウイルスベクター、プラスミド、またはエピソームの一部であり得る。外因性核酸配列の更なる例は、ウイルスポリヌクレオチド配列に導入された哺乳動物ポリヌクレオチドである。外因性核酸配列またはポリペプチドの別の例は、同等の細胞において検出可能なレベルで通常発現されない細胞に導入された核酸配列またはポリペプチドであるか、あるいは野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体形態および／または切断型形態である。
【0052】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、１つまたはそれを超えるＭＨＣ受容体、抗体、または他の抗原結合部分によって結合されることができる１つまたはそれを超えるエピトープを含む分子を指す。例えば、抗原が提示されると、抗原は宿主の免疫系を刺激して細胞抗原特異的免疫応答を引き起こすことができる。抗原はまた、それ自体で、または別の分子と組み合わせて存在する場合、細胞性免疫応答を誘発する能力を有することができる。例えば、腫瘍細胞抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識され得る。抗原は、タンパク質の野生型、変異体、または切断型のバージョンであり得る。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。病原性生物のゲノムのヌクレオチド配列もしくは部分ヌクレオチド配列、または免疫応答を誘発するタンパク質の遺伝子もしくは遺伝子の断片を含む発現ＤＮＡは、抗原の合成をもたらすことが当技術分野で認識されている。さらに、本開示は、遺伝子またはｃＤＮＡの核酸配列全体の使用に限定されない。したがって、２つ以上の遺伝子またはｃＤＮＡの部分核酸配列の使用が本明細書で企図され、これらの核酸配列は、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置される。
【0053】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、少なくとも１つの抗原または抗原断片をその細胞表面上（もしくは細胞表面）に表示、取得、または提示することができる様々な細胞のいずれかである。そのような細胞は、本明細書に開示され、当技術分野で公知の方法を使用して同定することができる。当業者によって理解され、本明細書で使用されるように、特定の実施形態では、例えばクラスＩＩ主要組織適合性分子または複合体（ＭＨＣＩＩ）と共に抗原を免疫細胞に表示または提示する細胞は、抗原提示細胞である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ１４陽性」または「ＣＤ１４＋」細胞は、ＣＤ１４遺伝子を天然に発現する細胞を指す。ＣＤ１４＋細胞の例としては、単球、ＤＣおよびマクロファージが挙げられる。当技術分野で公知の遺伝子発現を検出するための任意の方法、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色、蛍光顕微鏡法、ウエスタンブロット、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲを使用してＣＤ１４発現を検出することができる。フローサイトメトリーによって検出される場合、マーカーについて「陽性」の細胞集団とは、アイソタイプコントロールによる染色について見出されるレベルを超える細胞集団の均一なモノクローナル抗体染色を指す。いくつかの実施形態では、参照集団と比較したＭＦＩの少なくとも２倍の増加は、細胞がマーカーの発現に関して陽性であることを示す。例えば、マーカーについて陽性である細胞集団は、アイソタイプコントロールと比較して、２倍～４倍、４倍～１０倍、１０倍～１００倍、および１００倍～１，０００倍、１，０００倍～１０，０００倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれよりも高いＭＦＩを示すことができる。
【0055】
「単球」は、マーカーＣＤ１４を発現し、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる免疫細胞である。ＣＤ１４に加えて、単球は、ＣＤ１１ｂ、ＣＣＲ２、およびＣＤ１６の少なくとも１つを発現する。
【0056】
「樹状細胞」または「ＤＣ」は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、または宿主もしくは対象に存在する、または単球もしくは造血幹細胞に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆体は、末梢血および骨髄ならびに様々なリンパ器官、例えば脾臓、リンパ節から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞体から離れて複数の方向に延びる薄いシート（ラメリポディア）を有する特徴的な形態を有する。ＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩ拘束性システム（Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏら、ＰＮＡＳ ９６（２６）：１５０５０－５５，１９９９）の両方のための強力なプロフェッショナル抗原提示細胞である。典型的には、樹状細胞は、高レベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７－１およびＢ７－２）分子を発現する。樹状細胞は、Ｔ細胞の抗原特異的分化を誘導することができ、インビトロおよびインビボで細胞傷害性Ｔリンパ球応答を開始することができる。
【0057】
本明細書で使用される場合、「分化サイトカイン」という用語は、単球の樹状細胞への分化を促進することができるサイトカインを指す。サイトカインを分化させる例としては、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αが挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
本明細書で使用される場合、「活性化サイトカイン」という用語は、細胞傷害性Ｔリンパ球などの抗原特異的Ｔリンパ球の活性化を促進することができるサイトカインを指す。サイトカインを活性化する例としては、ＩＬ－２およびＩＬ－７が挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
「がん」および「腫瘍」という用語は、本明細書では互換的に使用され、制御されない成長、分化の欠如、局所組織浸潤、および／または転移をもたらす細胞の過剰増殖を指す。
【0060】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」、「処置された」または「処置すること」という用語は、そのような用語が適用される疾患、障害、または状態の進行を逆転すること、緩和すること、阻害すること、該疾患、障害、または状態の可能性を防ぐことまたは減少させることを含み得る。例えば、がんに関して使用される場合、この用語は、一般に、疾患および／または症状の進行を逆転、緩和、阻害することを指す。感染性疾患に関して使用される場合、例えば、この用語は、感染と戦うための、例えば、感染を減少させるかもしくは排除するための、または感染が悪化するのを防ぐための、対象が感染した後の処置、ならびに病原体による感染に対する対象の耐性を増加させるか、または換言すれば、感染に起因する病気の徴候を示す可能性を減少させる予防的処置を指すことができる。
【0061】
「有効量」または「治療有効量」とは、対象（例えば、ヒト）に投与された場合、疾患の処置を補助するのに十分な、本明細書に記載の組成物の量を指す。「治療有効量」を構成する組成物の量は、細胞および／またはｒＡＡＶ調製物、症状およびその重症度、投与様式、ならびに処置される対象の体重および年齢に応じて変わるが、当業者は、自身の知識および本開示を考慮して日常的に決定することができる。
【0062】
本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する」という用語は、抗原特異的細胞媒介性免疫応答を活性化および／または促進する能力を指す。例えば、本開示の組成物は、免疫応答を増強および／または活性化することができる。免疫応答は、エクスビボおよび／またはインビボで誘導することができる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」とは、本明細書に開示される処置、治療、細胞組成物、および／またはｒＡＡＶ組成物を受けることを必要としている１つまたはそれを超える個体のことを指す。本開示に従って処置され得る対象は、一般にヒトである。しかしながら、更なる対象としては、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、またはモルモットが含まれる。対象は男性または女性であり得、乳児、若年、青年、成人、および老人の対象を含む任意の適切な年齢であり得る。
【0064】
本明細書で使用される場合、「薬学的または薬理学的に許容され得る」という用語は、動物またはヒトに投与した場合に、有害な、アレルギーまたは他の不都合な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の培地または剤が本発明のベクターまたは細胞と適合しない限り、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助有効成分も組成物に組み込むことができる。
【0065】
本明細書で使用される場合、「試料」は、細胞の集団が単離され、富化され、または枯渇され得る細胞源（例えば、生体組織）を指す。いくつかの実施形態では、試料は、一般に、前もって処理されていないか、または最小限に処理されている。例えば、試料は、非動員血液（ｎｏｎ－ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｌｏｏｄ）、非動員アフェレーシス産物、動員末梢血、動員アフェレーシス産物、骨髄、臍帯血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、試料は、密度勾配、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、赤血球低張溶解、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）緩衝液での処理、ｐＨ平衡等張緩衝液への洗浄、またはそれらの任意の組み合わせによって調製もしくは最小限に処理される。いくつかの実施形態では、試料は、単一の組織採取によって提供される。いくつかの実施形態では、試料は、１つまたはそれを超える組織採取によって提供される。
【0066】
組換えＡＡＶベクター
本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、内部ＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子ならびに他の内因性ＤＮＡ部分を欠失させ、ＩＴＲ間に外因性核酸配列を挿入することによってＡＡＶゲノムの内部非反復部分を欠失させることによって目的の遺伝子を送達するように操作されている。外因性遺伝子は、ＣＤ１４発現（ＣＤ１４＋）標的細胞における特異的発現を駆動することができるＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結されている。したがって、本開示は、２つのＩＴＲ配列をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むポリヌクレオチドであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４＋細胞において外因性核酸の特異的発現を誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。ＣＤ１４プロモーターは、ＣＤ１４陽性細胞において外因性核酸配列の発現を特異的に駆動する任意の哺乳動物ＣＤ１４プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ヒトＣＤ１４プロモーター配列である。ヒトＣＤ１４プロモーターは、配列番号１を含むか、または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する一方、ＣＤ１４＋細胞における特異的発現を駆動することができる。配列番号１の位置を参照すると、ＣＤ１４プロモーターは、ＴＡＴＡボックス（４８１～４８６位）、Ｃ／ＥＢＰ部位（３７８～３８６位）、Ｓｐ１結合部位（４０４～４１０位および５３３～５３８位）、Ｍｙｂ部位（４２～４７位および４５７～４６３位）、ＡＰ－１部位（１１３～１２１位、１２７～１３３位、および２８８～２９３位）、ＡＰ－２部位（２７６～２８３位および３５６～３６４位）ならびにＣＤＰ（ＣＣＡＴＴ置換タンパク質）部位（１６４～１６８位）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ＣＤ１４の組織特異的発現を調節するＣ／ＥＢＰ部位およびＳｐ１部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１の３７８～３８６位、４０４～４１０位および５３３～５３８位に少なくともヌクレオチドを含む。ＣＤ１４発現細胞の例としては、単球、樹状細胞、およびマクロファージが挙げられる。
本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、内部ＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子ならびに他の内因性ＤＮＡ部分を欠失させ、ＩＴＲ間に外因性核酸配列を挿入することによってＡＡＶゲノムの内部非反復部分を欠失させることによって目的の遺伝子を送達するように操作されている。外因性遺伝子は、ＣＤ１４発現（ＣＤ１４＋）標的細胞における特異的発現を駆動することができるＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結されている。したがって、本開示は、２つのＩＴＲ配列をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターとを含むポリヌクレオチドであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４＋細胞において外因性核酸の特異的発現を誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。ＣＤ１４プロモーターは、ＣＤ１４陽性細胞において外因性核酸配列の発現を特異的に駆動する任意の哺乳動物ＣＤ１４プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ヒトＣＤ１４プロモーター配列である。ヒトＣＤ１４プロモーターは、配列番号１を含むか、または配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する一方、ＣＤ１４＋細胞における特異的発現を駆動することができる。配列番号１の位置を参照すると、ＣＤ１４プロモーターは、ＴＡＴＡボックス（４８１～４８６位）、Ｃ／ＥＢＰ部位（３７８～３８６位）、Ｓｐ１結合部位（４０４～４１０位および５３３～５３８位）、Ｍｙｂ部位（４２～４７位および４５７～４６３位）、ＡＰ－１部位（１１３～１２１位、１２７～１３３位、および２８８～２９３位）、ＡＰ－２部位（２７６～２８３位および３５６～３６４位）ならびにＣＤＰ（ＣＣＡＴＴ置換タンパク質）部位（１６４～１６８位）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、ＣＤ１４の組織特異的発現を調節するＣ／ＥＢＰ部位およびＳｐ１部位を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４プロモーターは、配列番号１の３７８～３８６位、４０４～４１０位および５３３～５３８位に少なくともヌクレオチドを含む。ＣＤ１４発現細胞の例としては、単球、樹状細胞、およびマクロファージが挙げられる。
【0067】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、５’→３’方向に、第１のＩＴＲ、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーター、ポリアデニル化シグナル配列、および第２のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ－２ ＩＴＲ配列であるか、またはＡＡＶ－２ ＩＴＲ配列に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ－２ ＩＴＲであるか、またはＡＡＶ－２ ＩＴＲに由来する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、任意の他のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０に由来する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＩＴＲ配列は、第１および第２のＩＴＲに挟まれた配列の効率的な分裂増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のために左右対称であることが望ましいと考えられる。ポリアデニル化シグナル配列の例としては、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターはエンハンサー配列をさらに含む。エンハンサーは当技術分野で周知であり、プロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサー配列は、ＣＤ１４プロモーターによって駆動される発現の特異性に有意に影響を与えない。エンハンサーの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよびＨＡＣＮＳ１（ＣＥＮＴＧ２）エンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、「ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ」（すなわち、ＡＡＶ ＩＴＲ配列およびＣＤ１４プロモーターを含有するプラスミド）とも呼ばれるプラスミドベクターである。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、ヒトＣＤ１４転写プロモーター、ＡＡＶ２型逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、マルチクローニングサイト配列（ＭＣＳ）、ＳＶ４０後期ポリＡ配列、抗生物質耐性遺伝子、例えばβ－ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、Ａｍｐｒ）、およびプラスミドが大腸菌で複製することを可能にする遺伝子エレメント（ＤＨ５αなど）を含む。例示的なプラスミドベクターを図１に示す。いくつかの実施形態では、プラスミドは配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶビリオンにカプシド形成される。
【0069】
特定の実施形態では、外因性核酸配列がマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。ＭＣＳ配列は当技術分野で周知であり、ポリリンカーと呼ばれることもある。ＭＣＳ配列は、通常、制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素としても知られる）によって標的化され得る制限部位として知られるいくつかのユニークな配列を含むＤＮＡの短いセグメントである。ＭＣＳは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超えるユニークな制限部位を含み得る。当技術分野で公知の任意の制限部位を使用することができる。制限部位の例としては、ＡｂｓＩ、ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｃｌＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｓｔＢＩ、Ｂｓｔ９８Ｉ、ＢｍｇＢＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＦｓｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｒｅＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ、ＳｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎＦＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｍａＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｈｇａｌ、Ａｌｕｌ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＰｍｅＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｒｆＩ、ＸｈｏＩ、およびＸｂａＩ．が挙げられる。更なる制限部位および制限酵素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲＥＢＡＳＥデータベースに列挙されている。
【0070】
いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードする配列を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードする配列がＭＣＳに挿入される。ＲＮＡの例としては、ｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムが挙げられる。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は抗原ポリペプチドをコードする。抗原ポリペプチドの例としては、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、抗原ポリペプチドは、全長タンパク質、タンパク質の抗原断片、切断型タンパク質、および／またはタンパク質の変異体形態であり得る。
【0071】
樹状細胞を含む細胞は、本質的に任意の細胞翻訳産物（例えば、タンパク質）からペプチドのレパートリーを天然に産生し、ペプチド／ＭＨＣ複合体を介して細胞の表面にペプチドを提示する。内因性および／または外因性タンパク質のタンパク質分解は、ＭＨＣ分子に結合してペプチド／ＭＨＣ複合体を形成し得るより小さなペプチドを産生する。次いで、ペプチド／ＭＨＣ複合体は細胞表面に輸送される。循環する細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞指向性免疫応答を引き起こす腫瘍抗原またはウイルスタンパク質などのペプチドの存在についてペプチド／ＭＨＣ複合体をプローブする。細胞の表面上でのペプチドの産生および提示のための細胞プロセスは、例えば、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」９ｔｈ Ｅｄ．（２０１６）に要約されている。
【0072】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または癌遺伝子産物は、当技術分野で公知の任意のそのような抗原ポリペプチドまたはその断片であり得る。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または癌遺伝子産物の例としては、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ／ＣＴ２．１）、分化抗原群２０（ＣＤ２０）、ＣＤ２６９、Ｇ２５０（炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ ＩＸ）、ＨＭ１．２４、ＣＤ１５４、前立腺がん関連抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）および前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原）、乳がん関連腫瘍関連抗原（例えば乳房上皮抗原４６（ＢＡ４６、ラクトアドヘリン））、がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリー（例えば、ニューヨーク食道扁平上皮癌－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）（ＣＴ６．１）、ＡＤＡＭ２（ＣＴ１５）、ＳＰＡ１７（ＳＰ１７、ＣＴ２２）、ＳＰＡＮＸ、例えば、Ｓｐａｎｘ－Ａ１（ＣＴ１１．１））、ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリー（例えばＭＡＧＥ－Ａ１／ＣＴ１．１、ＭＡＧＥ－Ａ２／ＣＴ１．２、ＭＡＧＥ－Ａ３／ＣＴ１．３、ＭＡＧＥ－Ａ４／ＣＴ１．４、ＭＡＧＥ－Ｂ１／ＣＴ３．１、ＭＡＧＥ－Ｃ１／ＣＴ７．１、ＭＡＧＥ－Ｃ２／ＣＴ１０、ＭＡＧＥ－Ｃ３／ＣＴ７．２、ＭＡＧＥ－Ｅ１）、ＭＡＲＴ１、ＳＡＧＥ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９、Ｋ１９、ｃｙｆｒａ２１－１）、サバイビン、ムチン－１（ＭＵＣ－１、ＣＡ１５－３）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）抗原、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、当技術分野で公知の任意のウイルス抗原であり得る。ウイルス抗原の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルス、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ６ポリペプチド、Ｅ７ポリペプチド、またはそれらの任意の抗原断片である。特定の実施形態では、外因性核酸配列は、Ｅ６ポリペプチドおよびＥ７ポリペプチド、またはそれらの抗原断片をコードする配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ６またはＥ７抗原は、ＨＰＶ血清型１６、１８、３０、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、６１、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇおよび／またはＨＢｘＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４および／またはＮＳ５抗原である。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原、ｐｏｌ抗原および／またはｅｎｖ抗原である。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原は、ｐｐ６５抗原、ｐｐ１５０抗原、および／またはｇＢ抗原である。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ抗原は、ＬＭＰ－１抗原、ＬＭＰ－２Ａ抗原、ＬＭＰ－２Ｂ抗原、ＥＡＲ抗原、ＥＡＤ抗原、ＶＣＡ抗原、ＭＡ抗原、ＥＢＮＡ１抗原、ＥＢＮＡ２抗原、ＥＢＮＡ３抗原、ＥＢＮＡ３ Ｂ抗原、および／またはＥＢＮＡ３Ｃ抗原である。
【0074】
いくつかの実施形態では、細菌抗原は、当技術分野で公知の任意の細菌抗原であり得る。細菌抗原を誘導し得る細菌の例としては、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリディウム属、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ）、プラスモディウム属、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、結核菌抗原は、ＭＰＴ４４抗原、ＭＰＴ４５抗原、ＭＰＴ５９抗原、ＭＰＴ６４抗原、Ａｇ８５Ｂ抗原、Ｒｖ３１１７抗原、および／またはＥＳＡＴ－６抗原である。
【0075】
表１は、出願の時点で入手可能な代表的な抗原およびＵｎｉＰｒｏｔＵＫアクセッション番号のリストを提供する。バージョン番号は、データベースに提供された配列のバージョンを指す。既知および予測されるアイソフォームについてのＵｎｉＰｒｏｔＵＫアクセッション番号も提供される。
【0076】
【表1-1】
【表1-2】
【0077】
いくつかの実施形態では、外因性核酸配列はサイトカインをコードする。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。サイトカインの例としては、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＴＧＦ－β、当技術分野で公知の他のＴｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８およびＩＬ－２７、当技術分野で公知の他のＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２５、およびアンフィレグリン、ならびに／またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含む。ＩＲＥＳ配列を使用して、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳ配列は、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードする外因性核酸配列に作動可能に連結することができる。複数の外因性核酸配列を一緒に転写することができ、各々がＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロン性メッセージを作り出す。ＩＲＥＳ配列のおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。少なくとも２つのＲＮＡおよび／またはポリペプチド（各々が参照により組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照されたい）をコードする単一のメッセージを転写するために単一のプロモーターを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる。
【0079】
本開示によれば、ｒＡＡＶプラスミドベクターは、式「ｐＡＡＶ－［プロモーター］／［ペイロード］」に従って命名される。したがって、「ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性遺伝子」とは、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターを含むｒＡＡＶプラスミドベクターを指し、ＣＤ１４プロモーターおよび外因性核酸配列は、配列の５’および３’領域に位置するＩＴＲ配列に挟まれている。更なる例としては、ｒＡＡＶプラスミドベクターを指すｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原およびｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインが挙げられ、ＣＤ１４プロモーターは、それぞれ抗原またはサイトカインをコードする核酸配列に機能的に連結されている。さらに、特定のポリペプチドをコードする外因性配列を含むｒＡＡＶプラスミドベクターは、外因性配列の名称を含む。例えば、ＰＳＡをコードする外因性核酸に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターを含むｒＡＡＶプラスミドベクターは、「ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ」と呼ばれる。ｒＡＡＶプラスミドベクターの例としては、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＡＦＰ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＢＡ４６、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ２．１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２０、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２６９、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／Ｇ２５０、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ７、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６－Ｅ７、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ７、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６－Ｅ７、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＥＲ２、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＭ１．２４、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＬＭＰ－１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ２、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ４、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｂ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｃ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｅ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＲＴ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＵＣ－１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ６．１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＡＰ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＣＡ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＡＧＥ１、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＣＣ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡＮＸ、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡ１７、およびｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サバイビンが挙げられる。
【0080】
ｒＡＡＶビリオン
特定の実施形態では、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターを含むｒＡＡＶビリオンであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４＋細胞において特異的に外因性核酸の発現を誘導する、ｒＡＡＶビリオンが本明細書に開示される。ｒＡＡＶビリオンは、本明細書で提供される実施形態および実施例に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、本明細書に開示される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかなどの抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲ配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源に対して異種であるキメラｒＡＡＶビリオンが使用される。例としては、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシド（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）とを有するキメラウイルスが挙げられる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＣＤ１４プロモーター以外のプロモーターを含まない。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ構造遺伝子、すなわちＲｅｐおよび／またはＣａｐ遺伝子を含まない。本開示によれば、ｒＡＡＶビリオンは、式「ｒＡＡＶ－［プロモーター］／［ペイロード］」に従って命名される。ｒＡＡＶビリオンの例としては、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＡＦＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＢＡ４６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ２．１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２０、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２６９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／Ｇ２５０、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＥＲ２、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＭ１．２４、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＬＭＰ－１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ２、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ４、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｂ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｃ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｅ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＲＴ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＵＣ－１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ６．１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＡＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＣＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＡＧＥ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＣＣ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡＮＸ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡ１７、およびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サバイビンが挙げられる。
特定の実施形態では、外因性核酸配列に作動可能に連結されたＣＤ１４プロモーターを含むｒＡＡＶビリオンであって、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４＋細胞において特異的に外因性核酸の発現を誘導する、ｒＡＡＶビリオンが本明細書に開示される。ｒＡＡＶビリオンは、本明細書で提供される実施形態および実施例に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、本明細書に開示される腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原、細菌抗原、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかなどの抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはそれらの任意の組み合わせのカプシドタンパク質を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲ配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源に対して異種であるキメラｒＡＡＶビリオンが使用される。例としては、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシド（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）とを有するキメラウイルスが挙げられる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＣＤ１４プロモーター以外のプロモーターを含まない。特定の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ構造遺伝子、すなわちＲｅｐおよび／またはＣａｐ遺伝子を含まない。本開示によれば、ｒＡＡＶビリオンは、式「ｒＡＡＶ－［プロモーター］／［ペイロード］」に従って命名される。ｒＡＡＶビリオンの例としては、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＡＦＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＢＡ４６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ２．１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２０、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＤ２６９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／Ｇ２５０、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６－Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８－Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＥＲ２、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＭ１．２４、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＬＭＰ－１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ２、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ４、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｂ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｃ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｅ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＲＴ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＵＣ－１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＴ６．１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＡＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＣＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＡＧＥ１、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＣＣ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡＮＸ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＳＰＡ１７、およびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サバイビンが挙げられる。
【0081】
一態様では、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性プラスミドをパッケージング細胞に導入するステップを含むｒＡＡＶビリオンを産生する方法であって、パッケージング細胞がヘルパー遺伝子をコードする１つまたはそれを超える核酸配列を含む、方法が本明細書に開示される。感染性ｒＡＡＶビリオンを産生するために、適切なパッケージング細胞株を、本明細書の実施形態および実施例に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含むプラスミドでトランスフェクトすることができる。パッケージング細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちＲｅｐおよびＣａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む。パッケージング細胞株はまた、ヘルパーウイルス遺伝子、例えば感染性ビリオンの産生に必要なアデノウイルス遺伝子をコードするプラスミドを含有する。例えば、ヘルパープラスミドは、アデノウイルス、例えばアデノウイルス５型のＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子を含み得る。ヘルパーウイルス遺伝子は、ｒＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために有意な量でパッケージングされない。特定の実施形態では、ヘルパー遺伝子は、単一のプラスミド上に含まれる。他の実施形態では、ヘルパー遺伝子は、２つ以上のプラスミド（例えば、２つのプラスミド）上に含まれる。いくつかの実施形態では、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性プラスミドを、ヘルパー遺伝子を含む１つまたはそれを超えるプラスミドでパッケージング細胞に共トランスフェクトする。あるいは、パッケージング細胞株にヘルパーとしてアデノウイルスを感染させてもよい。いくつかの実施形態では、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性プラスミドを、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドでパッケージング細胞に共トランスフェクトし、細胞をアデノウイルスに感染させる。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減することができる。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は哺乳動物細胞である。ｒＡＡＶビリオンを産生するために使用することができるパッケージング細胞の例としては、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。パッケージング細胞株はまた、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子を含む１つまたはそれを超えるベクターで安定にトランスフェクトまたは形質導入することができる。細胞へのポリヌクレオチドの送達のための更なる方法は、当技術分野で公知である。本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、標的細胞がＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスヘルパー遺伝子を欠くので、複製して標的細胞（例えば、単球およびＤＣ）中に子孫感染ビリオンを形成することができない。
【0082】
改変抗原提示細胞の産生方法および抗原特異的Ｔ細胞の産生方法
外因性核酸配列をＣＤ１４＋標的細胞において特異的に発現させるために本明細書で提供されるｒＡＡＶベクターを使用する方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣを産生する方法であって、ｉ）ＣＤ１４＋細胞を提供するステップと、ｉｉ）ＣＤ１４＋細胞を、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を発現するのに十分な量で、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれかと接触させるステップと、ｉｉｉ）ポリペプチドを発現するのに十分な時間、ステップｉｉ）のＣＤ１４＋細胞を培養するステップとを含む、改変ＡＰＣを特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する産生する方法が提供される。ＣＤ１４＋細胞は、単球または樹状細胞であり得る。ｒＡＡＶベクターは、本明細書の実施形態のいずれかに開示されるｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶプラスミドであり得る。ｒＡＡＶビリオンがＣＤ１４＋細胞を形質導入するのに十分な時間、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶビリオンと共培養することによって、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶビリオンと接触させることができる。あるいは、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶプラスミドでトランスフェクトすることができる。
外因性核酸配列をＣＤ１４＋標的細胞において特異的に発現させるために本明細書で提供されるｒＡＡＶベクターを使用する方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣを産生する方法であって、ｉ）ＣＤ１４＋細胞を提供するステップと、ｉｉ）ＣＤ１４＋細胞を、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を発現するのに十分な量で、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれかと接触させるステップと、ｉｉｉ）ポリペプチドを発現するのに十分な時間、ステップｉｉ）のＣＤ１４＋細胞を培養するステップとを含む、改変ＡＰＣを特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する特異的に発現する産生する方法が提供される。ＣＤ１４＋細胞は、単球または樹状細胞であり得る。ｒＡＡＶベクターは、本明細書の実施形態のいずれかに開示されるｒＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶプラスミドであり得る。ｒＡＡＶビリオンがＣＤ１４＋細胞を形質導入するのに十分な時間、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶビリオンと共培養することによって、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶビリオンと接触させることができる。あるいは、ＣＤ１４＋細胞をｒＡＡＶプラスミドでトランスフェクトすることができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、単球は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団にある。いくつかの実施形態では、単球は単離された単球である。いくつかの実施形態では、単離された単球は試料から単離される。いくつかの実施形態では、単離された単球はＰＢＭＣの集団から単離される。単球は、当技術分野で公知の任意の方法を使用してＰＢＭＣの集団から単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によって血液試料から得ることができる。次いで、タグ、標識またはビーズに連結された抗ＣＤ１４抗体（および／または他の適切な単球マーカー）を使用して単球を選別することができる。次いで、単球を、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気ビーズ分離を使用して選別または単離する。あるいは、単球は、ＰＢＭＣ試料から非単球を選別および除去するために抗ＣＤ３抗体を使用してＰＢＭＣから分離することができる。単球は、当技術分野で公知の接着培養分離技術を使用してＣＤ３＋リンパ球から分離することもできる。
【0084】
いくつかの実施形態では、上記のステップｉｉ）は、単球を樹状細胞に分化させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間、単球をサイトカインと接触させることによって、単球を樹状細胞に分化させる。いくつかの実施態様では、サイトカインを細胞培養物に添加する。いくつかの実施形態では、単球を、外因性サイトカインをコードするポリヌクレオチドを単球に導入することによって樹状細胞に分化させ、それによって単球に外因性サイトカインを発現させる。外因性サイトカインをコードする核酸は、プラスミドまたはｒＡＡＶビリオンであり得る。いくつかの実施形態では、外因性サイトカインをコードする核酸は、ＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結される。培地に添加されるか、または核酸配列にコードされるサイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間は、当業者が容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間は、１～８日、２～７日、または３～６日である。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日または８日である。また、当該技術において公知の単球を樹状細胞に分化させる方法のいずれを用いてもよい。
【0085】
抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法は、ｉ）ナイーブＴ細胞を提供するステップと、ｉｉ）ナイーブＴ細胞を本明細書の実施形態および実施例に記載される任意の改変ＡＰＣと接触させるステップと、ｉｉｉ）ステップｉｉ）のＴ細胞を活性化サイトカインと接触させるステップとを含む。好ましくは、改変ＡＰＣは、抗原ポリペプチドをコードする外因性核酸を特異的に発現させる改変樹状細胞である。活性化サイトカインは、培養培地中のＴ細胞に添加することができる。活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはその両方であり得る。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物である。いくつかの実施形態では、改変樹状細胞は、ＩＬ－１２をコードし、ＩＬ－１２ポリペプチドを発現する核酸配列に機能的に連結されたＣＤ１４プロモーターを含むｒＡＡＶベクターをさらに含み、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を増強する。
【0086】
いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を産生する方法は、ｉ）ＣＤ１４＋単球およびＣＤ３＋Ｔ細胞を含むＰＢＭＣの集団を提供するステップと、ｉｉ）ＰＢＭＣの集団を、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を発現するのに十分な量で、本明細書の実施形態および実施例に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれかと接触させるステップと、ｉｉｉ）単球をサイトカインと接触させ、単球を樹状細胞に分化するのに十分な時間培養することによって、ＰＢＭＣ中の単球を樹状細胞に分化させるステップと、ｉｖ）分化樹状細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化サイトカインと接触させ、分化樹状細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗原特異的Ｔ細胞を産生するのに十分な時間培養するステップとを含む。いくつかの実施形態では、単球をサイトカインと接触させることによって、単球を樹状細胞に分化させる。サイトカインは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間は、１～８日、２～７日、または３～６日である。いくつかの実施形態では、単球を樹状細胞に分化させるのに十分な時間は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日または８日である。活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはその両方であり得る。いくつかの実施形態では、分化樹状細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を培養することによって抗原特異的Ｔ細胞を産生するのに十分な時間は、１～１２日間、２～１０日間、または３～６日間である。いくつかの実施形態では、分化樹状細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞を培養することによって抗原特異的Ｔ細胞を産生するのに十分な時間は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間または１２日間である。抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物であり得る。
【0087】
医薬組成物および処置方法
医薬組成物および疾患の処置方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣの集団であって、改変ＡＰＣが本明細書の実施形態および実施例に開示される改変ＡＰＣのいずれかであり、Ｔ細胞を活性化して、ＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結された外因性核酸配列によってコードされるポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を生成するのに有効である、改変ＡＰＣの集団と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物が提供される。改変ＡＰＣは、単球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単球から分化した樹状細胞である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単離された単球である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単離された樹状細胞である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣはＰＢＭＣの混合物中にある。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣはＣＤ３＋Ｔ細胞との混合物中にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、改変ＡＰＣと抗原特異的Ｔ細胞との混合物を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物である。
医薬組成物および疾患の処置方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣの集団であって、改変ＡＰＣが本明細書の実施形態および実施例に開示される改変ＡＰＣのいずれかであり、Ｔ細胞を活性化して、ＣＤ１４プロモーターに作動可能に連結された外因性核酸配列によってコードされるポリペプチドに対する抗原特異的免疫応答を生成するのに有効である、改変ＡＰＣの集団と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物が提供される。改変ＡＰＣは、単球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単球から分化した樹状細胞である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単離された単球である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣは単離された樹状細胞である。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣはＰＢＭＣの混合物中にある。いくつかの実施形態では、改変ＡＰＣはＣＤ３＋Ｔ細胞との混合物中にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、改変ＡＰＣと抗原特異的Ｔ細胞との混合物を含む。いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの混合物である。
【0088】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の改変ＡＰＣは、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、癌遺伝子産物、ウイルス抗原または細菌抗原を特異的に発現する。
【0089】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または癌遺伝子産物は、当技術分野で公知の任意のそのような抗原ポリペプチドまたはその断片であり得る。腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、または癌遺伝子産物の例としては、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂメラノーマ抗原（ＢＡＧＥ／ＣＴ２．１）、分化抗原群２０（ＣＤ２０）、ＣＤ２６９、Ｇ２５０（炭酸脱水酵素ＩＸ／ＣＡ ＩＸ）、ＨＭ１．２４、ＣＤ１５４、前立腺がん関連抗原（例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）および前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原）、乳がん関連腫瘍関連抗原（例えば乳房上皮抗原４６（ＢＡ４６、ラクトアドヘリン））、がん精巣抗原（ＣＴ）ファミリー（例えば、ニューヨーク食道扁平上皮癌－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）（ＣＴ６．１）、ＡＤＡＭ２（ＣＴ１５）、ＳＰＡ１７（ＳＰ１７、ＣＴ２２）、ＳＰＡＮＸ、例えば、Ｓｐａｎｘ－Ａ１（ＣＴ１１．１））、ヒトメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）ファミリー（例えばＭＡＧＥ－Ａ１／ＣＴ１．１、ＭＡＧＥ－Ａ２／ＣＴ１．２、ＭＡＧＥ－Ａ３／ＣＴ１．３、ＭＡＧＥ－Ａ４／ＣＴ１．４、ＭＡＧＥ－Ｂ１／ＣＴ３．１、ＭＡＧＥ－Ｃ１／ＣＴ７．１、ＭＡＧＥ－Ｃ２／ＣＴ１０、ＭＡＧＥ－Ｃ３／ＣＴ７．２、ＭＡＧＥ－Ｅ１）、ＭＡＲＴ１、ＳＡＧＥ １、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、サイトケラチン１９（ＣＫ１９、Ｋ１９、ｃｙｆｒａ２１－１）、サバイビン、ムチン－１（ＭＵＣ－１、ＣＡ１５－３）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）抗原、または任意の抗原断片および／もしくはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、当技術分野で公知の任意のウイルス抗原であり得る。ウイルス抗原の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルス、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ抗原は、Ｅ６ポリペプチド、Ｅ７ポリペプチド、またはそれらの任意の抗原断片である。特定の実施形態では、外因性核酸配列は、Ｅ６ポリペプチドおよびＥ７ポリペプチド、またはそれらの抗原断片をコードする配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ６またはＥ７抗原は、ＨＰＶ血清型１６、１８、３０、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、６１、または任意の抗原断片および／またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇおよび／またはＨＢｘＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ抗原は、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４および／またはＮＳ５抗原である。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原、ｐｏｌ抗原および／またはｅｎｖ抗原である。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ抗原は、ｐｐ６５抗原、ｐｐ１５０抗原、および／またはｇＢ抗原である。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ抗原は、ＬＭＰ－１抗原、ＬＭＰ－２ Ａ抗原、ＬＭＰ－２Ｂ抗原、ＥＡＲ抗原、ＥＡＤ抗原、ＶＣＡ抗原、ＭＡ抗原、ＥＢＮＡ１抗原、ＥＢＮＡ２抗原、ＥＢＮＡ３抗原、ＥＢＮＡ３Ｂ抗原、および／またはＥＢＮＡ３Ｃ抗原である。
【0091】
いくつかの実施形態では、細菌抗原は、当技術分野で公知の任意の細菌抗原であり得る。細菌抗原を誘導し得る細菌の例としては、結核菌、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリディウム属、ジフテリア菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、プラスモディウム属、コレラ菌、大腸菌、赤痢菌、腸チフス菌、および淋菌が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、結核菌抗原は、ＭＰＴ４４抗原、ＭＰＴ４５抗原、ＭＰＴ５９抗原、ＭＰＴ６４抗原、Ａｇ８５Ｂ抗原、Ｒｖ３１１７抗原、および／またはＥＳＡＴ－６抗原である。
【0092】
いくつかの実施形態では、外因性核酸配列はサイトカインをコードする。サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。サイトカインの例としては、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＴＧＦ－β、当技術分野で公知の他のＴｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８およびＩＬ－２７、当技術分野で公知の他のＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－２５、およびアンフィレグリン、ならびに／またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0093】
本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオン、改変ＡＰＣおよび活性化Ｔ細胞は、疾患および障害を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫療法の方法であって、有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンのいずれかを、それを投与することを必要とする対象に投与し、それによって免疫応答を刺激するステップを含む、免疫療法の方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、免疫療法の方法であって、有効量の本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターのいずれかおよび／または本明細書に開示される医薬組成物のいずれかを含む細胞（例えば、単離された細胞）のいずれかを、それを投与することを必要とする対象に投与し、それによって免疫応答を刺激するステップを含む、免疫療法の方法が提供される。いくつかの実施形態では、免疫療法の方法であって、有効量の本明細書に記載の改変ＡＰＣのいずれかによって活性化された抗原特異的Ｔ細胞の集団および本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかによってコードされた抗原を発現する標的細胞を投与するステップを含む、免疫療法の方法が提供される。いくつかの実施形態では、免疫療法の方法であって、有効量の集団ＰＢＭＣを投与するステップであって、ＰＢＭＣが、本明細書に記載の改変ＡＰＣのいずれかによって活性化された抗原特異的Ｔ細胞および本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかによってコードされた抗原を発現する標的細胞とを含む、免疫療法の方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、単離された細胞の集団は、処置される対象または処置中の対象から得られた試料に由来した。
【0094】
いくつかの実施形態では、末梢静脈血は、処置される患者（例えば、がん患者）から採取され、末梢血単核細胞を単離するために使用され得る。単離された末梢血単核球をインビトロ（例えば、細胞培養プレートまたはペトリ皿において）で培養し、次いで、末梢血単核球中の単球を末梢血リンパ球から分離することができる。次いで、単球を本明細書に提供されるｒＡＡＶビリオンに感染させ、続いてサイトカインの存在下でＤＣに分化させることができる。成熟（例えば、６日間培養）後、ＤＣを採取し、上記のように調製した末梢血リンパ球の培養物に添加して混合培養物を生成することができる。混合培養物を十分な時間（例えば、６～１２日間）培養した後、混合培養物中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を採取し、患者に投与してもよい（例えば、静脈内投与を介して）。
【0095】
いくつかの関連する実施形態では、末梢静脈血は、処置される患者（例えば、がん患者）から採取され、末梢血単核細胞を単離するために使用され得る。単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、本明細書に提供されるｒＡＡＶビリオンに感染させることができ、感染したＰＢＭＣの単球は続いてサイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－α）の存在下でＤＣに分化し得る。さらに、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２およびＩＬ ７）を培養ＰＢＭＣに添加してＣＴＬを活性化することができる。次いで、ＰＢＭＣから採取された活性化ＣＴＬまたは活性化ＣＴＬを含む、得られたＰＢＭＣを患者に投与することができる（例えば、静脈内投与を介して）。
【0096】
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法の方法であって、
ａ．対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に本明細書で提供されるｒＡＡＶビリオンを感染させて感染ＰＢＭＣを生成するステップと、
ｂ．分化サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－α）を添加して感染ＰＢＭＣの単球を樹状細胞（ＤＣ）に分化させるステップと、
ｃ．活性化サイトカイン（例えば、ＩＬ－２およびＩＬ７）を添加して感染ＰＢＭＣの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化して活性化ＣＴＬを生成するステップと、
ｄ．必要に応じて、感染ＰＢＭＣから活性化ＣＴＬを単離するステップと、
ｅ．有効量の、活性化ＣＴＬまたは単離された活性化ＣＴＬを含む感染ＰＭＢＣを対象に投与するステップと
を含む、免疫療法の方法を提供する。
ａ．対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に本明細書で提供されるｒＡＡＶビリオンを感染させて感染ＰＢＭＣを生成するステップと、
ｂ．分化サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－α）を添加して感染ＰＢＭＣの単球を樹状細胞（ＤＣ）に分化させるステップと、
ｃ．活性化サイトカイン（例えば、ＩＬ－２およびＩＬ７）を添加して感染ＰＢＭＣの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化して活性化ＣＴＬを生成するステップと、
ｄ．必要に応じて、感染ＰＢＭＣから活性化ＣＴＬを単離するステップと、
ｅ．有効量の、活性化ＣＴＬまたは単離された活性化ＣＴＬを含む感染ＰＭＢＣを対象に投与するステップと
を含む、免疫療法の方法を提供する。
【0097】
いくつかの実施形態では、免疫療法を必要とする対象は、がん、腫瘍、ウイルス感染または細菌感染と診断されている。
【0098】
いくつかの実施形態では、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液体腫瘍、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、および／または膀胱がんである。いくつかの実施形態では、がんは、ＡＦＰ陽性肝がん；ＢＡ４６陽性乳がん；ＣＴ２．１陽性悪性黒色腫肺がん、胃がん、または他のＣＴ２．１陽性悪性がん；ＣＥＡ陽性肺がん、結腸がん、乳がん、または他のＣＥＡ陽性がん；ＣＤ２０陽性悪性胸腺腫、リンパ腫、骨髄腫および他のＣＤ２０陽性肉腫；ＣＤ２６９陽性肝臓がん、ＣＫ１９陽性肺がん、結腸がん、乳がんおよび他のＣＫ１９陽性がん；Ｇ２５０陽性悪性消化管腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＧ２５０陽性がん；ＨＰＶ－１６ Ｅ６陽性子宮頸がんおよび他のＨＰＶ－１６ Ｅ６陽性悪性腫瘍；ＨＰＶ－１６ Ｅ７陽性子宮頸がんおよび他のＨＰＶ－１６ Ｅ７陽性悪性腫瘍；ＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７陽性子宮頸がんならびに他のＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７陽性悪性腫瘍；ＨＰＶ－１８ Ｅ６陽性子宮頸がんおよび他のＨＰＶ－１８ Ｅ６陽性悪性腫瘍；ＨＰＶ－１８ Ｅ７陽性子宮頸がんおよび他のＨＰＶ－１８ Ｅ７陽性悪性腫瘍；ＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７陽性子宮頸がんならびに他のＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７陽性悪性腫瘍；ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がん、肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性悪性腫瘍；ＨＭ１．２４陽性多発性骨髄腫、骨髄腫、およびリンパ腫；ＬＭＰ－１陽性鼻咽頭癌およびリンパ腫；ＭＡＧＥ－Ａ１陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ａ１陽性悪性腫瘍；ＭＡＧＥ－Ａ２陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ａ２陽性悪性腫瘍；ＭＡＧＥ－Ａ４陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ａ４陽性悪性腫瘍；ＭＡＧＥ－Ｂ１陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ｂ１陽性悪性腫瘍；ＭＡＧＥ－Ｃ１陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ｃ１陽性悪性腫瘍；ＭＡＧＥ－Ｃ１陽性肺がん、胃腸腫瘍、腎臓がん、黒色腫および他のＭＡＧＥ－Ｃ１陽性悪性腫瘍；ＭＡＲＴ１陽性黒色腫および他のＭＡＲＴ１陽性悪性腫瘍；ＭＵＣ－１陽性悪性腫瘍；ＮＹ－ＥＳＯ－１陽性悪性腫瘍；ＰＳＡ陽性前立腺がん；ＰＡＰ陽性前立腺がん；ＰＳＭＡ陽性前立腺がん、肺がん、乳がん、腎臓がんおよび他のＰＳＭＡ陽性悪性腫瘍；ＰＳＣＡ陽性前立腺がん；ＳＡＧＥ１陽性肉腫、黒色腫および他のＳＡＧＥ １悪性腫瘍；ＳＣＣ陽性扁平上皮癌；ＳＰＡＮＸ－Ａ１陽性腺癌、肉腫および黒色腫；ＳＰＡ１７陽性腺癌、肉腫および黒色腫；ならびにサバイビン陽性悪性腫瘍である。
【0099】
いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、麻疹ウイルスまたはロタウイルスによる感染である。
【0100】
いくつかの実施形態では、細菌感染は、結核菌、ヘリコバクター、カンピロバクター、クロストリディウム属、ジフテリア菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、プラスモディウム属、コレラ菌、大腸菌、赤痢菌、腸チフス菌、および淋菌による感染である。
【実施例】
【0101】
実施例１
例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐの産生
本開示前の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの多くに共通する特徴は、プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＡＡＶ ｐ５プロモーターなどの構成的プロモーターであることであった。以前のｒＡＡＶベクターによって導入された外因性遺伝子は、様々なヒト細胞で発現され得る。しかしながら、本開示に記載される例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐベクターは、これらのプロモーターを有しない。むしろ、本開示のｒＡＡＶベクターは、組織特異的または細胞特異的なＣＤ１４プロモーターを有する。本明細書で提供されるｒＡＡＶベクターによって運ばれる外因性遺伝子は、単球およびＤＣなどのＣＤ１４＋細胞で特異的に発現されるが、ＣＤ１４陰性（ＣＤ１４－）細胞では有意および／または検出可能な発現はない。
例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐの産生
本開示前の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの多くに共通する特徴は、プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＡＡＶ ｐ５プロモーターなどの構成的プロモーターであることであった。以前のｒＡＡＶベクターによって導入された外因性遺伝子は、様々なヒト細胞で発現され得る。しかしながら、本開示に記載される例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐベクターは、これらのプロモーターを有しない。むしろ、本開示のｒＡＡＶベクターは、組織特異的または細胞特異的なＣＤ１４プロモーターを有する。本明細書で提供されるｒＡＡＶベクターによって運ばれる外因性遺伝子は、単球およびＤＣなどのＣＤ１４＋細胞で特異的に発現されるが、ＣＤ１４陰性（ＣＤ１４－）細胞では有意および／または検出可能な発現はない。
【0102】
図１は、例示的なＡＡＶ／ヒトＣＤ１４プロモーターベクター（例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ）の概略図を提供する。このｒＡＡＶベクターは、ヒトＣＤ１４転写プロモーター（６１４ｂｐ）、ＡＡＶ２型逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（各々１４５塩基）、マルチクローニングサイト配列（ＭＣＳ）、ＳＶ４０後期ポリＡ配列（２５６ｂｐ）、β－ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、Ａｍｐｒ）、およびプラスミドが大腸菌で複製することを可能にする遺伝子エレメント（ＤＨ ５αなど）から構成される。
【0103】
例示的なｒＡＡＶベクターを以下のように調製した：完全なＡＡＶ－２ゲノムを含むｐＣＡＡＶ－２プラスミドを調製し、出発点として使用した。ＡＡＶ－２ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１９０１．１）を参照として使用して、ｐＣＡＡＶ－２プラスミドを２つの制限エンドヌクレアーゼ（ＢｍｇＢ ＩおよびＳｎａＢ Ｉ）で消化して、ｎｔ １６５からｎｔ ４４９３までのＡＡＶ－２のすべてのプロモーターおよび構造遺伝子（ＲｅｐおよびＣａｐ）を欠失させて、ウイルスＩＴＲ配列のみが保持されるようにした（ｎｔ １－１６４およびｎｔ ４４９４－４６７５）。
【0104】
ヒトＣＤ１４ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ１９９２３０．１）を、ＣＤ１４プロモーターを標的とするＰＣＲプライマーを構築するための参照として使用した。プライマー配列を以下に提供する：
上流プライマー：５’－ａｔｇａｃｇｔｇｇｔｇｃｃａａｃａｇａｔｇａｇｇｔｔｃ－３’（配列番号４；ｎｔ ２９８６－３００４；ＢｍｇＢ Ｉリンカー）；
下流プライマー：５’－ａｔｔａｃｇｔａｇｃａｇａｔｃｔａｇｔｃｔｃｔａｇａｇｇｔｃｇａｔａａｇｔｃｔｔｃｃｇａａｃ－３’（配列番号３；ｎｔ ３５９９－３５８０；ＭＣＳ（ＳｎａＢ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｘｂａ Ｉ）リンカー）。
上流プライマー：５’－ａｔｇａｃｇｔｇｇｔｇｃｃａａｃａｇａｔｇａｇｇｔｔｃ－３’（配列番号４；ｎｔ ２９８６－３００４；ＢｍｇＢ Ｉリンカー）；
下流プライマー：５’－ａｔｔａｃｇｔａｇｃａｇａｔｃｔａｇｔｃｔｃｔａｇａｇｇｔｃｇａｔａａｇｔｃｔｔｃｃｇａａｃ－３’（配列番号３；ｎｔ ３５９９－３５８０；ＭＣＳ（ＳｎａＢ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｘｂａ Ｉ）リンカー）。
【0105】
全ＤＮＡをヒト単球から単離し、ＣＤ１４プロモーターＤＮＡをハイフィデリティＰＣＲで増幅した（図２）。精製したＣＤ１４プロモーターＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｍｇＢ ＩおよびＳｎａＢ Ｉで消化し、次いで制限エンドヌクレアーゼ消化ｐＣＡＡＶ－２プラスミドに連結した。次に、ＳＶ４０後期ポリＡ ＤＮＡ配列をプラスミドに挿入し（図３）、例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐベクターを産生した。
【0106】
例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドへのＣＤ１４プロモーターの挿入を、制限酵素消化分析によって確認した。具体的には、例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐをＢｍｇＢＩおよびＳｎａＢＩで消化し、ゲル電気泳動を行った。図４は、ＣＤ１４プロモーターＤＮＡの適切なサイズのバンドを示す。さらに、例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐを配列決定して、ヒトＣＤ１４プロモーターが正しく配置されており、変異が導入されていないことを確認した（ベクター中のＣＤ１４プロモーター配列とＧｅｎＢａｎｋ中のＤＮＡ配列との間のアラインメント：図５の（ＨＱ１９９２３０．１）を参照されたい）。本明細書で提供される例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドは、外因性遺伝子をＭＣＳ（例えば、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性遺伝子）に挿入するように適宜改変され得る。
【0107】
実施例２：
感染性ビリオンの産生
アデノ随伴ウイルスは複製不全ウイルスであり、感染性ビリオンを組み立てるには自然界のヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）が必要である。図６は、野生型ヘルパーウイルスを含まず、複製コンピテントＡＡＶ－２を混入させずに、感染性ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性遺伝子）ビリオンを調製する概略図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドを構築し、これはＡＡＶビリオンの組み立てに必要なアデノウイルス５型のＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子ならびにＡＡＶ２型のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含む。ｐＡＡＶ－ＣＤ１４／外因性遺伝子プラスミドをｐＨｅｌｐｅｒプラスミドでＨＥＫ ２９３細胞に共トランスフェクトした。感染性ｒＡＡＶビリオンは、トランスフェクト細胞の培養の７２～９６時間後に生成された。ｒＡＡＶビリオンの力価を、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出した。ヒトＣＤ１４プロモーターを標的とするジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブを使用してｒＡＡＶビリオンを検出し、ローディング標準と比較した。図７は、高力価の感染性ｒＡＡＶビリオンを示す。したがって、本データは、例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐおよびｐＨｅｌｐｅｒプラスミド系が細胞培養においてｒＡＡＶビリオンを効果的に産生したことを実証している。
感染性ビリオンの産生
アデノ随伴ウイルスは複製不全ウイルスであり、感染性ビリオンを組み立てるには自然界のヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）が必要である。図６は、野生型ヘルパーウイルスを含まず、複製コンピテントＡＡＶ－２を混入させずに、感染性ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／外因性遺伝子）ビリオンを調製する概略図を示す。ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドを構築し、これはＡＡＶビリオンの組み立てに必要なアデノウイルス５型のＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４遺伝子ならびにＡＡＶ２型のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含む。ｐＡＡＶ－ＣＤ１４／外因性遺伝子プラスミドをｐＨｅｌｐｅｒプラスミドでＨＥＫ ２９３細胞に共トランスフェクトした。感染性ｒＡＡＶビリオンは、トランスフェクト細胞の培養の７２～９６時間後に生成された。ｒＡＡＶビリオンの力価を、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出した。ヒトＣＤ１４プロモーターを標的とするジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブを使用してｒＡＡＶビリオンを検出し、ローディング標準と比較した。図７は、高力価の感染性ｒＡＡＶビリオンを示す。したがって、本データは、例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐおよびｐＨｅｌｐｅｒプラスミド系が細胞培養においてｒＡＡＶビリオンを効果的に産生したことを実証している。
【0108】
実施例３
単球の単離および樹状細胞への分化
末梢静脈血を対象から採取した。Ｆｉｃｏｌｌを用いて末梢静脈血からＰＢＭＣを分離した。いくつかの実験では、接着細胞（単球）を非接着細胞（リンパ球）から分離するための培養方法を使用して単球をＰＢＭＣから分離した。簡潔には、ＰＢＭＣを細胞培養培地（ＡＩＭ－Ｖ培地ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、組織培養フラスコに添加した。次いで、ＰＢＭＣを、単球がフラスコの底に接着するまで、３７℃、５％ＣＯ２で２～４時間培養した。非接着細胞（リンパ球）を除去し、更なる実験のために保存した。接着細胞（単球）を培養で維持した。代替として、いくつかの実験では、滅菌抗ＣＤ１４抗体標識磁気ビーズを使用して単球をＰＢＭＣから分離した。このプロセスにより、ＰＢＭＣ由来の単球を含有する画分およびリンパ球を含有する画分が得られた。
単球の単離および樹状細胞への分化
末梢静脈血を対象から採取した。Ｆｉｃｏｌｌを用いて末梢静脈血からＰＢＭＣを分離した。いくつかの実験では、接着細胞（単球）を非接着細胞（リンパ球）から分離するための培養方法を使用して単球をＰＢＭＣから分離した。簡潔には、ＰＢＭＣを細胞培養培地（ＡＩＭ－Ｖ培地ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、組織培養フラスコに添加した。次いで、ＰＢＭＣを、単球がフラスコの底に接着するまで、３７℃、５％ＣＯ２で２～４時間培養した。非接着細胞（リンパ球）を除去し、更なる実験のために保存した。接着細胞（単球）を培養で維持した。代替として、いくつかの実験では、滅菌抗ＣＤ１４抗体標識磁気ビーズを使用して単球をＰＢＭＣから分離した。このプロセスにより、ＰＢＭＣ由来の単球を含有する画分およびリンパ球を含有する画分が得られた。
【0109】
次に、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αを含むサイトカインを連続的に添加すして単球のＤＣへの分化を誘導することによって、単球をＤＣに分化させた。０日目に、ＧＭ－ＣＳＦ（８００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）を培地に添加した。培地を２日ごとに新鮮な培地およびサイトカインで置き換えた。５日目に、ＴＮＦ－α（１００ＩＵ／ｍＬ）を培地に添加した。分化培養は、細胞培養の６日目に成熟ＤＣをもたらした。
【0110】
実施例４
ＣＤ１４プロモーターはＣＤ１４発現細胞における外因性遺伝子発現を特異的に駆動する
次に、外因性遺伝子の発現に対するＣＤ１４プロモーターの特異性を試験した。最初に、実施例１に記載されるように例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにｅＧＦＰをクローニングして、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰを生成した。次に、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰおよびｐＨｅｌｐｅｒを上記のようにＨＥＫ ２９３細胞に共トランスフェクトすることによって感染性ビリオンを生成し、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰビリオンを採取した。
ＣＤ１４プロモーターはＣＤ１４発現細胞における外因性遺伝子発現を特異的に駆動する
次に、外因性遺伝子の発現に対するＣＤ１４プロモーターの特異性を試験した。最初に、実施例１に記載されるように例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにｅＧＦＰをクローニングして、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰを生成した。次に、ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰおよびｐＨｅｌｐｅｒを上記のようにＨＥＫ ２９３細胞に共トランスフェクトすることによって感染性ビリオンを生成し、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰビリオンを採取した。
【0111】
次に、ＣＤ１４＋単球およびＤＣにＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰウイルスを形質導入した。ＣＤ１４－末梢血リンパ球およびＨＥＫ ２９３細胞に、対照としてｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰウイルスを形質導入した。ｅＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡法によって評価した。細胞がｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｅＧＦＰウイルスに感染してから７２時間後、ｅＧＦＰはＣＤ１４＋単球および樹状細胞で特異的に発現し、ＣＤ１４－リンパ球およびＨＥＫ ２９３細胞では発現しなかった（図８）。したがって、データは、ＣＤ１４プロモーターがＣＤ１４＋細胞における外因性遺伝子産物の発現を特異的に駆動することを実証している。
【0112】
実施例５
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入された単球および樹状細胞における抗原の発現
がん抗原の発現を試験するために、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＣＫ１９、ＭＡＧＥ－Ａ３、サバイビンまたはＭｕｃ－１をそれぞれコードするＤＮＡ配列を、上記の方法を使用して実施例１に記載の例示的ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにクローニングすることによって生成した。これらのビリオンは、それぞれｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＡＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サバイビン、およびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／Ｍｕｃ－１と呼ばれる。
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入された単球および樹状細胞における抗原の発現
がん抗原の発現を試験するために、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＣＫ１９、ＭＡＧＥ－Ａ３、サバイビンまたはＭｕｃ－１をそれぞれコードするＤＮＡ配列を、上記の方法を使用して実施例１に記載の例示的ｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにクローニングすることによって生成した。これらのビリオンは、それぞれｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＡＰ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サバイビン、およびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／Ｍｕｃ－１と呼ばれる。
【0113】
単球およびＤＣにおける抗原ペイロードのＣＤ１４プロモーター（ＣＤ１４ｐ）媒介発現を評価するために、単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入し、培養中にＤＣに分化させた。まず、ヒト対象の末梢静脈血からＰＢＭＣを得た。実施例３に記載したようにＰＢＭＣから単球を分離し、細胞培養培地中で培養した。単球を分離した後、異なるｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ウイルスを直ちに添加して５０のＭＯＩで単球培養物を分離し、実施例３に記載されているようにサイトカインを培養培地に添加して単球のＤＣへの分化を誘導した。
【0114】
異なるｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入された単球およびＤＣにおける抗原の発現を、フローサイトメトリーを使用して形質導入後細胞培養の３日目に評価した。フローサイトメトリーの結果は、細胞の抗原の発現率が７９．６％～９１．７％の範囲であったことを示している（図９）。データは、抗原発現の率が高く、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンの形質導入効率も高いことを示す。
【0115】
実施例６
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインビリオンによって形質導入された樹状細胞におけるサイトカインの発現
サイトカインの発現を試験するために、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインビリオンを、ＧＭ－ＣＳＦまたはＩＬ－４をそれぞれコードするＤＮＡ配列を、上記の方法を使用して例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにクローニングすることによって生成した。これらのビリオンは、それぞれｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＧＭ－ＣＳＦおよびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＩＬ－４と呼ばれる。ＣＤ１４プロモーターではなく構成的ｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーター、すなわちｒＡＡＶ－ｐ５／ＧＭ－ＣＳＦおよびｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＩＬ－４を含む対照ベクターも産生した。
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインビリオンによって形質導入された樹状細胞におけるサイトカインの発現
サイトカインの発現を試験するために、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインビリオンを、ＧＭ－ＣＳＦまたはＩＬ－４をそれぞれコードするＤＮＡ配列を、上記の方法を使用して例示的なｐＡＡＶ－ＣＤ１４ｐプラスミドにクローニングすることによって生成した。これらのビリオンは、それぞれｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＧＭ－ＣＳＦおよびｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＩＬ－４と呼ばれる。ＣＤ１４プロモーターではなく構成的ｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーター、すなわちｒＡＡＶ－ｐ５／ＧＭ－ＣＳＦおよびｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＩＬ－４を含む対照ベクターも産生した。
【0116】
単球をＰＢＭＣから分離し、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインビリオンを形質導入し、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αを用いたＤＣ分化培養で培養した。形質導入の５日後、ルーチンのフローサイトメトリーを使用して、ＤＣにおけるサイトカイン遺伝子の発現を検出した（図１０）。ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカインウイルスを形質導入したＤＣにおけるサイトカイン発現のレベルは、形質導入されていない対照のものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。フローサイトメトリーの結果はまた、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカイン遺伝子ウイルスのトランスフェクション効率が高かったことを実証している。驚くべきことに、構成的ｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターを有するｒＡＡＶビリオンの形質導入効率は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／サイトカイン遺伝子ウイルスよりも有意に低かった（ｐ＝０．０２～０．０４）。
【0117】
実施例７
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原を形質導入した細胞上での樹状細胞マーカーの発現
抗原特異的ＣＴＬのＤＣ活性化に重要なマーカーの発現をフローサイトメトリーによって評価した。ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６は、ＤＣのマーカーである。ＣＤ１ａは、分化の初期に発現されるＤＣマーカーである。ＣＤ１ａ＋ＤＣは、刺激時に有意な量のＩＬ－１２ ｐ７０を産生し、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成する。ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子は、Ｔ細胞のＤＣ刺激のための重要な共刺激分子として働く。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現増加は、堅牢なＣＴＬ応答の生成に寄与する。ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌは、共刺激分子の対であり、それらの相互作用は、成功した適応免疫応答、特にＣＤ８＋ＣＴＬの発達にとって重要である。ＣＤ８０は、ＤＣ機能およびＣＴＬ活性化における重要な成分である。ＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ－ペプチド複合体がＴヘルパー細胞上の受容体と相互作用すると、ＣＤ８０はＣＤ２８を介してＤＣとＣＤ８＋Ｔリンパ球との間の相互作用を可能にする。ＣＤ２８を介した相互作用は、Ｔリンパ球のＣＴＬへの分化をシグナル伝達するのに役立つ。ＣＤ８６は、Ｔリンパ球の活性化および生存に重要な共刺激シグナルを提供する。
ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原を形質導入した細胞上での樹状細胞マーカーの発現
抗原特異的ＣＴＬのＤＣ活性化に重要なマーカーの発現をフローサイトメトリーによって評価した。ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６は、ＤＣのマーカーである。ＣＤ１ａは、分化の初期に発現されるＤＣマーカーである。ＣＤ１ａ＋ＤＣは、刺激時に有意な量のＩＬ－１２ ｐ７０を産生し、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成する。ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６分子は、Ｔ細胞のＤＣ刺激のための重要な共刺激分子として働く。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現増加は、堅牢なＣＴＬ応答の生成に寄与する。ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌは、共刺激分子の対であり、それらの相互作用は、成功した適応免疫応答、特にＣＤ８＋ＣＴＬの発達にとって重要である。ＣＤ８０は、ＤＣ機能およびＣＴＬ活性化における重要な成分である。ＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ－ペプチド複合体がＴヘルパー細胞上の受容体と相互作用すると、ＣＤ８０はＣＤ２８を介してＤＣとＣＤ８＋Ｔリンパ球との間の相互作用を可能にする。ＣＤ２８を介した相互作用は、Ｔリンパ球のＣＴＬへの分化をシグナル伝達するのに役立つ。ＣＤ８６は、Ｔリンパ球の活性化および生存に重要な共刺激シグナルを提供する。
【0118】
図１１は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入されたＤＣのＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６レベルが非常に高かったことを示す。ｒＡＡＶを形質導入したＤＣのＣＤマーカーの高い発現レベルは、ＤＣが免疫応答、特に抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激するように機能し得ることを示している。
【0119】
実施例８
ｒＡＡＶを形質導入したＤＣにおけるＩＬ－１２およびＩＬ－１０の発現
ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の発現を、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入したＤＣにおいて測定した。ＩＬ－１２およびＩＬ－１０は、ＤＣ媒介性免疫応答において対照的な役割を果たすと考えられる。ＤＣにおけるＩＬ－１２の高発現は、Ｔｈ１応答を増強し、ＣＴＬ増殖を増加させると考えられる。対照的に、ＩＬ－１０の発現はＴｈ２応答を増強すると考えられる。ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７またはｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＣＡビリオンを形質導入したＤＣを、ＡＡＶタイプｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターを有するビリオン、すなわちｒＡＡＶ－ｐ５／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＰＳＣＡを形質導入したＤＣと比較した。ｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターは、ＣＤ１４陰性細胞を含む様々なヒト細胞において外因性遺伝子を発現することができる。単球をＰＢＭＣから分離し、ｒＡＡＶビリオンで形質導入し、上記のようにＤＣに分化させた。図１２に示すように、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオン形質導入ＤＣによって発現されたＩＬ－１２のレベルは、対照のレベルよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
ｒＡＡＶを形質導入したＤＣにおけるＩＬ－１２およびＩＬ－１０の発現
ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の発現を、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入したＤＣにおいて測定した。ＩＬ－１２およびＩＬ－１０は、ＤＣ媒介性免疫応答において対照的な役割を果たすと考えられる。ＤＣにおけるＩＬ－１２の高発現は、Ｔｈ１応答を増強し、ＣＴＬ増殖を増加させると考えられる。対照的に、ＩＬ－１０の発現はＴｈ２応答を増強すると考えられる。ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７またはｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＣＡビリオンを形質導入したＤＣを、ＡＡＶタイプｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターを有するビリオン、すなわちｒＡＡＶ－ｐ５／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＰＳＣＡを形質導入したＤＣと比較した。ｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターは、ＣＤ１４陰性細胞を含む様々なヒト細胞において外因性遺伝子を発現することができる。単球をＰＢＭＣから分離し、ｒＡＡＶビリオンで形質導入し、上記のようにＤＣに分化させた。図１２に示すように、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオン形質導入ＤＣによって発現されたＩＬ－１２のレベルは、対照のレベルよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【0120】
データは、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原遺伝子ウイルスによって単球およびＤＣをトランスフェクトした後、ＩＬ－１２の発現レベルが上方制御され、ＩＬ－１０の発現レベルが下方制御されたことを示している。ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入したＤＣは、ＡＡＶタイプｐ５プロモーターまたはＣＭＶプロモーターを有するｒＡＡＶによってトランスフェクトされたＤＣよりも、抗原特異的ＣＴＬの殺傷能力を増強するのにより効率的であった。
【0121】
実施例９
ＤＣへの単球の分化効率
ヒトＣＤ１４＋単球を、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αの存在下で培養して、細胞をＤＣに分化させた。細胞培養６日目に多数のＤＣが検出された。分化効率を評価するために、培養中の残存する単球の数をフローサイトメトリーによって検出した。結果は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入された残存する単球の数が、ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ビリオンまたはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオンによって形質導入された残存する単球の数よりも有意に低いことを示した（ｐ＜０．０５）（図１３）。これらの結果は、予想外にも、ヒトＣＤ１４＋単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入することによって、より多くのＤＣを得ることができることを示している。
ＤＣへの単球の分化効率
ヒトＣＤ１４＋単球を、上記のようにＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αの存在下で培養して、細胞をＤＣに分化させた。細胞培養６日目に多数のＤＣが検出された。分化効率を評価するために、培養中の残存する単球の数をフローサイトメトリーによって検出した。結果は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンによって形質導入された残存する単球の数が、ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ビリオンまたはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオンによって形質導入された残存する単球の数よりも有意に低いことを示した（ｐ＜０．０５）（図１３）。これらの結果は、予想外にも、ヒトＣＤ１４＋単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンを形質導入することによって、より多くのＤＣを得ることができることを示している。
【0122】
実施例１０
リンパ球におけるＩＦＮ－γ発現のＤＣ誘導
Ｔｈ１応答を活性化するｒＡＡＶ形質導入ＤＣの能力を、ＤＣ細胞をリンパ球と共培養し、ＩＦＮ－γ発現を測定することによって評価した。ＩＦＮ－γは重要なＴｈ１サイトカインである。Ｔリンパ球によるＩＦＮ－γの発現は、抗原特異的ＣＴＬが抗原陽性標的細胞を死滅させる能力と正の相関がある。
リンパ球におけるＩＦＮ－γ発現のＤＣ誘導
Ｔｈ１応答を活性化するｒＡＡＶ形質導入ＤＣの能力を、ＤＣ細胞をリンパ球と共培養し、ＩＦＮ－γ発現を測定することによって評価した。ＩＦＮ－γは重要なＴｈ１サイトカインである。Ｔリンパ球によるＩＦＮ－γの発現は、抗原特異的ＣＴＬが抗原陽性標的細胞を死滅させる能力と正の相関がある。
【0123】
単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンまたはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオンを形質導入し、上記のように分化培養で６日間培養した。単球に、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ｃ２、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＨＰＶ１８ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＣＥＡ、またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＭＡＧＥ－Ｃ２を形質導入した。細胞培養の６日目に、ＤＣを採取し、単球と同じドナーから採取したリンパ球と混合した。ＤＣおよびリンパ球をＩＬ－７（８０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）の存在下で共培養した。培地およびサイトカインを２日ごとに交換した。細胞培養１４日目にリンパ球を採取し、フローサイトメトリーによりＩＦＮ－γの発現レベルを測定した。
【0124】
結果は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原遺伝子ウイルスをトランスフェクトしたＤＣによって活性化されたＴリンパ球によって発現されるＩＦＮ－γレベルが、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原遺伝子ウイルスをトランスフェクトしたＤＣによって活性化されたＴリンパ球によって発現されるＩＦＮ－γレベルよりも有意に高かったことを示している（図１４；ｐ＜０．０５）。これは、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ＤＣの数と比較してｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣの数が多く、その結果、ＣＴＬの生成が増加したためである可能性がある。換言すれば、ＣＤ１４プロモーターを有するｒＡＡＶは、驚くべきことに、リンパ球がＩＦＮ－γを発現するように誘導するのにより効率的である。
【0125】
実施例１１
ＣＤ６９およびＣＤ８のリンパ球発現
ＣＤ６９およびＣＤ８の発現レベルを、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４／抗原ビリオン形質導入ＤＣと共培養したＴリンパ球において評価した。ＣＤ６９は、ＣＴＬ（ＣＤ８＋Ｔリンパ球）の早期活性化のマーカーである。単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオン、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオン、またはｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ビリオンを形質導入し、上記の分化培養で６日間培養した。より具体的には、単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＢＡ４６、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ｐ５／ＣＬ１９またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＢＡ４６を形質導入した。細胞培養６日目にＤＣを採取し、単球と同じドナーから採取したリンパ球と混合した。ＤＣおよびリンパ球を、上記のようにＩＬ－７およびＩＬ－２の存在下で共培養した。ＤＣおよびＴリンパ球共培養の１４日目に、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞集団中のＣＤ６９＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を検出した。
ＣＤ６９およびＣＤ８のリンパ球発現
ＣＤ６９およびＣＤ８の発現レベルを、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４／抗原ビリオン形質導入ＤＣと共培養したＴリンパ球において評価した。ＣＤ６９は、ＣＴＬ（ＣＤ８＋Ｔリンパ球）の早期活性化のマーカーである。単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオン、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオン、またはｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ビリオンを形質導入し、上記の分化培養で６日間培養した。より具体的には、単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＢＡ４６、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ｐ５／ＣＬ１９またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＢＡ４６を形質導入した。細胞培養６日目にＤＣを採取し、単球と同じドナーから採取したリンパ球と混合した。ＤＣおよびリンパ球を、上記のようにＩＬ－７およびＩＬ－２の存在下で共培養した。ＤＣおよびＴリンパ球共培養の１４日目に、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞集団中のＣＤ６９＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を検出した。
【0126】
結果は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原遺伝子ウイルスをトランスフェクトしたＤＣによって活性化されたＣＤ６９＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数が、ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原遺伝子ウイルスまたはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原遺伝子ウイルスをトランスフェクトしたＤＣによって活性化されたＣＤ６９＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球の数よりもはるかに多いことを示した（図１５）。データは、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンが、標的細胞に対する強固な殺傷活性を有するＴリンパ球の生成において、ｐ５またはＣＭＶ駆動ビリオンよりも効率的であることを示している。
【0127】
実施例１２
標的細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球殺傷
単球をｒＡＡＶビリオンによって形質導入し、上記のようにＤＣに分化させた。ＤＣを上記のようにドナーリンパ球と共培養した。単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡまたはｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ３を形質導入した。ＤＣおよびＴリンパ球の共培養の１４日目に、細胞を採取した。ＣＴＬを、それぞれのウイルス抗原または腫瘍抗原を発現する腫瘍組織から単離された細胞、すなわちＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７抗原陽性子宮頸がん細胞、ＰＳＭＡ陽性前立腺がん細胞、およびＭＡＧＥ－Ａ３陽性非小細胞肺腺癌細胞と共培養した。ルーチンのクロム（５１Ｃｒ）放出アッセイを使用して、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣによってプライミングされたＣＴＬの殺傷活性を分析した。
標的細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球殺傷
単球をｒＡＡＶビリオンによって形質導入し、上記のようにＤＣに分化させた。ＤＣを上記のようにドナーリンパ球と共培養した。単球にｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１６ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＭＡまたはｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＭＡＧＥ－Ａ３を形質導入した。ＤＣおよびＴリンパ球の共培養の１４日目に、細胞を採取した。ＣＴＬを、それぞれのウイルス抗原または腫瘍抗原を発現する腫瘍組織から単離された細胞、すなわちＨＰＶ－１６ Ｅ６およびＥ７抗原陽性子宮頸がん細胞、ＰＳＭＡ陽性前立腺がん細胞、およびＭＡＧＥ－Ａ３陽性非小細胞肺腺癌細胞と共培養した。ルーチンのクロム（５１Ｃｒ）放出アッセイを使用して、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣによってプライミングされたＣＴＬの殺傷活性を分析した。
【0128】
図１６は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣによってプライミングされたＣＴＬの腫瘍抗原陽性およびウイルス抗原陽性標的細胞の一回の殺傷の割合が約５０．２％～６７．２％であったことを示す。対照実験では、ＣＴＬとの共培養の６時間前に抗ヒトＭＨＣクラスＩ抗体を細胞培養物に添加し、腫瘍抗原陽性およびウイルス抗原陽性標的細胞の一回の殺傷の割合は約１２．３～１６．６であった。したがって、抗ＭＨＣ－Ｉ抗体は、抗原陽性細胞の殺傷を劇的に減少させた（図１６）。さらに、一連の抗原陰性対照細胞は殺傷されなかった（図１６）。結果は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣ細胞が、ＭＨＣ－Ｉ拘束性様式で標的細胞の抗原特異的ＣＴＬ殺傷を活性化することができたことを実証している。
【0129】
次に、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＨＰＶ１８ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＥＡ、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＰＳＡ、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＨＰＶ１８ Ｅ６－Ｅ７、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＣＥＡ、またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／ＰＳＡを形質導入したＤＣによって活性化されたＣＴＬ殺傷を比較した。改変ＤＣを生成し、上記のようにドナーリンパ球と共培養した。ＣＴＬを、それぞれのウイルス抗原または腫瘍抗原を発現する腫瘍組織から単離された細胞、すなわちＨＰＶ－１８ Ｅ６およびＥ７抗原陽性子宮頸癌細胞、ＰＳＡ陽性前立腺癌細胞、およびＣＥＡ陽性非小細胞肺腺癌細胞と共培養した。ＣＴＬと抗原発現標的細胞との共培養および５１Ｃｒ放出アッセイによって殺傷活性を評価した。ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣによって誘発させたＣＴＬによって殺傷された標的細胞の割合は、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原形質導入ＤＣによって誘発させたＣＴＬによって殺傷された標的細胞の割合よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図１７）。結果は、驚くべきことに、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原形質導入ＤＣによって活性化されたＣＴＬよりも、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＤＣによって活性化されたＣＴＬの方が、より強固な抗原特異的殺傷活性を示している。
【0130】
実施例１３
標的細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球殺傷
ＰＢＭＣの混合培養におけるｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原特異性を評価するために実験を行った。ヒトＰＢＭＣは、主にリンパ球と少数の単球とから構成される。ＣＤ３は、Ｔリンパ球のマーカーである。この研究では、ヒトＰＢＭＣをｒＡＡＶに直接感染させた。ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ウイルス、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ウイルス、またはｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ウイルスであった。より具体的には、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｍｕｃ－１、ｒＡＡＶ－ｐ５／ＣＫ１９またはｒＡＡＶ－ｐ５／ｍｕｃ－１。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αをＰＢＭＣ培養物に添加して、単球のＤＣへの分化を促進した。培養６日目に、ＩＬ－２およびＩＬ７を上記のように添加した。細胞培養培地およびサイトカインを２日ごとに交換した。１４日目に、ＰＢＭＣを採取し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球の数をフローサイトメトリーによって分析した。
標的細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球殺傷
ＰＢＭＣの混合培養におけるｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原特異性を評価するために実験を行った。ヒトＰＢＭＣは、主にリンパ球と少数の単球とから構成される。ＣＤ３は、Ｔリンパ球のマーカーである。この研究では、ヒトＰＢＭＣをｒＡＡＶに直接感染させた。ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ウイルス、ｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ウイルス、またはｒＡＡＶ－ｐ５／抗原ウイルスであった。より具体的には、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ＣＫ１９、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／ｍｕｃ－１、ｒＡＡＶ－ｐ５／ＣＫ１９またはｒＡＡＶ－ｐ５／ｍｕｃ－１。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４およびＴＮＦ－αをＰＢＭＣ培養物に添加して、単球のＤＣへの分化を促進した。培養６日目に、ＩＬ－２およびＩＬ７を上記のように添加した。細胞培養培地およびサイトカインを２日ごとに交換した。１４日目に、ＰＢＭＣを採取し、ＣＤ３＋Ｔリンパ球の数をフローサイトメトリーによって分析した。
【0131】
結果（図１８）は、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原形質導入ＰＢＭＣ中のＣＤ３＋Ｔリンパ球の数が、０日目の形質導入前のＣＤ３＋細胞の数と比較して１４日目までに増加したことを実証している。対照的に、ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原およびｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原を形質導入したＰＢＭＣ中のＣＤ３＋細胞の数は有意に減少した。ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原を形質導入したＰＢＭＣ中のＣＤ３＋細胞数の減少は、活性化ＣＴＬによる標的に対してだけでなくそれ以外の組織に対する殺傷の結果であると考えられる。ｐ５プロモーターおよびＣＭＶプロモーターは構成的プロモーターであるので、ｒＡＡＶ－ｐ５／抗原またはｒＡＡＶ－ＣＭＶｐ／抗原ビリオンによって形質導入されたＣＤ３＋細胞も抗原を発現し、抗原特異的ＣＴＬによって標的とされる。対照的に、ＣＤ１４プロモーターは、ＤＣにおける抗原の発現を特異的に駆動する。したがって、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンはＣＤ３＋Ｔリンパ球に感染し得るが、ＣＤ３＋細胞は抗原を発現せず、培養中に抗原特異的ＣＴＬによって殺傷されない。
【0132】
したがって、この研究は、細胞免疫療法におけるｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原ビリオンの適用がより安全であることを示唆するだけでなく、ＣＴＬを調製するための新規かつ迅速な方法も提供する。この研究の結果によれば、ＰＢＭＣから単球を最初に分離することなく、ｒＡＡＶ－ＣＤ１４ｐ／抗原遺伝子ウイルスにＰＢＭＣを直接感染させてＣＴＬを調製することができる。対照的に、ＤＣによって活性化されたＣＴＬを調製する以前の方法は、ＰＢＭＣから単球を分離する最初のステップが必要であった。
【0133】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、更なる実施形態を提供することができる。本明細書で言及され、かつ／または２０２０年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０９２，２３９号を含む出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、さらに別の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を使用するように変更することができる。
【0134】
これらおよび他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共にすべての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】