特表 2023-545862 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-10-31

(54)【発明の名称】重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/215 20060101AFI20231024BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 11/16 20060101ALI20231024BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231024BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231024BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20231024BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20231024BHJP

   C12N 15/50 20060101ALN20231024BHJP

【ＦＩ】

A61K39/215

A61P31/14 ZNA

A61P11/16

A61K48/00

A61P37/04

A61K9/127

C12N15/85 Z

C12N15/50

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527955

(86)(22)【出願日】2021-07-19

(85)【翻訳文提出日】2023-01-17

(86)【国際出願番号】 KR2021009290

(87)【国際公開番号】W WO2022015124

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】10-2020-0088992

(32)【優先日】2020-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＳＰＡＮ

３．Ｃａｒｂｏｐｏｌ

(71)【出願人】

【識別番号】523020372

【氏名又は名称】ジェネワン、ライフ、サイエンス、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＯＮＥ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ， ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】523020383

【氏名又は名称】コリア、ディジーズ、コントロール、アンド、プリベンション、エージェンシー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＤＩＳＥＡＳＥ ＣＯＮＴＲＯＬ ＡＮＤ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ ＡＧＥＮＣＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】パク、ヨンクン

(72)【発明者】

【氏名】チョ、ビョンムン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ムンソプ

(72)【発明者】

【氏名】リー、ヒョジン

(72)【発明者】

【氏名】ユ、ソンイョン

(72)【発明者】

【氏名】チョ、ヨンラン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ボヨン

(72)【発明者】

【氏名】ギル、アルム

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ボヒョン

(72)【発明者】

【氏名】オ、イェウン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ギホ

(72)【発明者】

【氏名】ジョエル、マズロー

(72)【発明者】

【氏名】クレア、ロバーツ、クリスティーン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミヨン

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジュンア

(72)【発明者】

【氏名】リム、ヒジ

(72)【発明者】

【氏名】ファン、ユンホ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA95

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC07

4C076CC15

4C076CC35

4C084AA13

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA24

4C084MA59

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA59

4C084ZB09

4C084ZB33

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC08

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

(57)【要約】

本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物に関するものである。本発明による重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原としてスパイクと、ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドとを含む。前記ワクチン組成物は、１種類の抗原を含むものに比べて、多数の共発現される抗原による顕著な抗体免疫応答およびＴ細胞免疫応答誘導効果があるところ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染予防の分野において多様に活用されてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および
（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；
を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物。

【請求項2】

（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および
（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；
を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２免疫原性組成物。

【請求項3】

前記スパイク、ＯＲＦ３ａ、またはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンが最適化されたものである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記スパイクタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１または３の塩基配列で表されるものである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されるものである、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列で表されるものである、請求項３に記載の組成物。

【請求項7】

前記（ａ）スパイクタンパク質をコードする遺伝子；および
（ｂ）ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；は、バイシストロニック発現ベクターに含まれるものである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、２回投与用である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物は、（ａ）スパイクタンパク質；および（ｂ）ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドタンパク質；に対する免疫原性が同時に誘導されるものである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物は、抗体応答とＴ細胞免疫応答を同時に誘導するものである、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項11】

（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする遺伝子、および
（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；を含む、バイシストロニック発現カセット。

【請求項12】

前記スパイク、ＯＲＦ３ａ、またはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンが最適化されたものである、請求項１１に記載のバイシストロニック発現カセット。

【請求項13】

前記スパイクタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１または３の塩基配列で表されるものである、請求項１２に記載のバイシストロニック発現カセット。

【請求項14】

前記ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されるものである、請求項１２に記載のバイシストロニック発現カセット。

【請求項15】

前記ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列で表されるものである、請求項１２に記載のバイシストロニック発現カセット。

【請求項16】

前記バイシストロニック発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、コザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＩｇＥリーダー配列（ＩｇＥ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、フーリン認識部位（ｆｕｒｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ＧＳＧ－Ｔ２Ａ切断部位、ＢＧＨポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ ｐｏｌｙ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、カナマイシン耐性遺伝子およびｐＵＣ複製起点からなる群から選択される１以上の構成要素をさらに含むものである、請求項１１に記載のバイシストロニック発現カセット。

【請求項17】

前記バイシストロニック発現カセットは、以下の切断地図で表されるものである、請求項１６に記載のバイシストロニック発現カセット。

【化1】

【請求項18】

請求項１１に記載のバイシストロニック発現カセットを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物。

【請求項19】

請求項１１に記載のバイシストロニック発現カセットを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２免疫原性組成物。

【請求項20】

前記組成物は、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、静脈内（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ） および鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）からなる群から選択される１以上の経路で投与されるものである、請求項１８または１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記組成物は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃法（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）およびジェット噴射（Ｊｅｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）からなる群から選択される１以上の方法で投与されるものである、請求項１８または１９に記載の組成物。

【請求項22】

前記組成物は、電気穿孔法によって筋肉内投与されるものである、請求項１８または１９に記載の組成物。

【請求項23】

前記組成物は、リポソーム媒介送達法（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって投与されるものである、請求項１８または１９に記載の組成物。

【請求項24】

請求項１１に記載のバイシストロニック発現カセットを個体に処理する工程；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染予防方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルス感染症－１９（ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ－１９、ＣＯＶＩＤ－１９）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）による呼吸器感染症である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月２３日に中国の武漢で新たに発見された一本鎖ＲＮＡの新型ベータコロナウイルスであって、２０２０年１月に国際ウイルス分類委員会によって「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」と命名された。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染経路は、未だ明らかに解明されていないが、一部の研究によれば、コウモリからヒトに感染することが報告されている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは、非分節型であり、大きさは約３０ｋｂであり、１０個のタンパク質をコードしている。１０個のタンパク質は、１個の複製ポリタンパク質（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ １ａｂ）、４個の構造タンパク質（スパイク、エンベロープ、メンブレン、ヌクレオカプシド）、５個の非構造タンパク質（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ ３ａ、６、７ａ、８ ａｎｄ １０）からなる。

【0003】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトからヒトへ感染する可能性があり、非常に高い死亡率を占めしているので、国内外で大きな問題となっている。２０２０年３月１６日、１６７，５１１人の患者が発生しており、そのうち１３，９０８人の患者が死亡していることがＷＨＯに報告されており、現在もその死亡者が急増している趨勢である。
韓国では、２０１９年１月に中国から入国した３６歳の女性において最初のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が確認され、２０２０年３月１７日までにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の感染者が発生しており、８，３２０人のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染者が確認され、２８６，７１６人の隔離者が発生した。

【0004】

２０１９年に中国で最初に発見されて以来、中国地域で集中的に発症しており、２０２０年度には韓国、日本、イタリアなどの１６０カ国以上で感染者が発生している。また、高い伝播性を示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、感染すると呼吸器だけでなく、肺炎や急性腎不全などの合併症を起こし、高い致死率および感染性から大きな問題を引き起こしている。
現在、国内外で新規感染者が持続的に発生しており、伝播率の高いウイルスであることを鑑みたとき、これを予防するためのワクチンの開発が緊急な実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

そこで、本発明者らは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチンを開発するために努力した結果、スパイクとＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドを発現するＤＮＡワクチンを開発することによって本発明を完成するに至った。

【0006】

したがって、本発明の目的は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物を提供するものである。

【0007】

本発明の別の目的は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２免疫原性組成物を提供することである。

【0008】

本発明の別の目的は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；を含む、バイシストロニック発現カセットを提供することである。

【0009】

本発明の別の目的は、前記バイシストロニック発現カセットを含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物を提供することである。

【0010】

本発明の別の目的は、前記バイシストロニック発現カセットを含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するための免疫原性組成物を提供することである。

【0011】

本発明の別の目的は、前記バイシストロニック発現カセットを個体に処理する工程；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染予防方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物を提供する

【0013】

また、本発明は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染免疫原性組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；を含む、バイシストロニック発現カセットを提供する。

【0015】

また、本発明は、前記バイシストロニック発現カセットを含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物を提供する。

【0016】

また、本発明は、前記バイシストロニック発現カセットを含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するための免疫原性組成物を提供する。

【0017】

また、本発明は、前記バイシストロニック発現カセットを個体に処理する工程；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染予防方法を提供する。

【発明の効果】

【0018】

本発明による重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗原として、スパイクと、ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドを含む。前記ワクチン組成物は、１種類の抗原を含むものに比べて、複数の共発現抗原による顕著な抗体免疫応答およびＴ細胞免疫応答の誘導効果を有するところ、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防する分野において多様に活用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1a】本発明によるスパイク抗原およびＯＲＦ３ａをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＧＯ－１００２の切断地図を示す図である。

【図1b】前記プラスミドｐＧＯ－１００２によって発現されたペプチドの翻訳後修飾（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）メカニズムを示す図である。

【図2a】ウェスタンブロッティングによりプラスミドｐＧＯ－１００２がトランスフェクションされた細胞におけるスパイク抗原およびＯＰＦ３ａタンパク質の産生を確認した結果を示す図である。

【図2b】免疫蛍光染色によりプラスミドｐＧＯ－１００２がトランスフェクションされた細胞におけるスパイク抗原およびＯＰＦ３ａタンパク質の産生を確認した結果を示す図である。

【図3】本発明によるプラスミドｐＧＯ－１００２の生体内における毒性を評価した結果を示す図である。

【図4】抗体免疫応答によるスパイク抗原特異的結合抗体価を測定した結果を示す図である。

【図5】抗体免疫応答によるＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価を測定した結果を示す図である。

【図6】ＥＬＩＳｐｏｔ分析によりスパイクＯＬＰで刺激された脾細胞のＴ細胞免疫応答を評価した結果を示す図である。

【図7】ＥＬＩＳｐｏｔ分析によりＯＲＦ３ａ ＯＬＰで刺激された脾細胞のＴ細胞免疫応答を評価した結果を示す図である。

【図8】ＥＬＩＳｐｏｔ分析によりスパイクＯＬＰおよびＯＲＦ３ａ ＯＬＰで刺激された脾細胞のＴ細胞免疫応答を評価した結果を示す図である。

【図9】プラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により中和抗体価を評価した結果を示す図である。

【図10】プラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により中和抗体価を評価した結果を示す図である。

【図11】ＡＣＥ受容体競合評価によりＡＣＥタンパク質との競合的結合能を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0021】

本発明の態様によれば、本発明は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質またはそれをコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドまたはそれをコードする遺伝子；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染免疫原性組成物を提供する。

【0022】

本発明の実施形態において、前記スパイク、ＯＲＦ３ａ、またはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンが最適化されたものが好ましい。

【0023】

本発明において、スパイクは、宿主細胞へのコロナウイルスの侵入を仲介する多機能タンパク質を意味し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクは、１２７３個のアミノ酸からなる（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９０．１）。また、スパイクは、既存のワクチンの抗原として用いられているが、ラクダおよびサルなどの大型動物では、臨床症状が改善されたにもかかわらず、ウイルス除去効果（すなわち、殺菌効果）が低レベルであることが確認された。同じコロナウイルスであるＭＥＲＳ－ＣｏＶの事例から、スパイクのみを抗原として用いた動物実験の場合、マウスのような小型動物に比べて、大型動物において免疫応答誘導効果に限界があることが確認された。これにより、大型動物において有効な応答を誘導するためには、スパイク以外の抗原を追加してこれを補う必要性が台頭している。

【0024】

本発明の好ましい実施形態では、前記スパイクタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンに最適化されたものであり、配列番号１または３の塩基配列で表されることが好ましい。

【0025】

本発明において、ＯＲＦ３ａ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ３ａ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で最も大きい補助タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、２７５個のアミノ酸からなる（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９１．１）。前記ＯＲＦ３ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）中、インターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与するタンパク質である。

【0026】

本発明において、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、アミノ酸配列であって、翻訳されるＤＮＡ塩基配列を意味する。

【0027】

本発明の好ましい実施形態では、前記ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンに最適化されたものであって、配列番号２の塩基配列で表されることが好ましい。

【0028】

本発明において、ヌクレオカプシドは、ウイルスの遺伝情報であるＲＮＡやＤＮＡを内部に含むタンパク質構造体を意味する。前記ヌクレオカプシドは、４１９個のアミノ酸配列からなる（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９７．２）。

【0029】

本発明の好ましい実施形態では、前記ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンに最適化されたものであって、配列番号４の塩基配列で表されることが好ましい。

【0030】

本発明の実施形態では、前記（ａ）スパイクタンパク質をコードする遺伝子；および（ｂ）ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；は、バイシストロン性発現ベクターに含まれることが好ましいが、これに限定されない。

【0031】

本発明において、ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）は、抗原に対する後天性免疫を付与する医薬品であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特異的で、能動的な免疫性を誘導する目的で投与される。

【0032】

本発明の組成物は、抗原であるスパイク、ＯＲＦ３ａ、およびヌクレオカプシドに加えて、組成物を構成するのに適した１つ以上のアジュバントまたは賦形剤または担体を含むことができる。

【0033】

本発明の組成物に含まれ得るアジュバントは、注射された動物の免疫応答を増強させる物質を意味するものであって、多くの異なるアジュバントが当業者に知られている。前記アジュバントには、完全フロイントおよび不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、鉱物油および無鉱物油およびカーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）、油中水型乳剤のアジュバントなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0034】

本発明の組成物に含まれ得る賦形剤の例としては、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどがある。

【0035】

本発明の組成物に含まれ得る担体は、薬学的に許容される担体であってもよく、前記薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどがある。

【0036】

本発明の組成物は、防腐剤およびその他の添加剤、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスのようなものをさらに含むことができる。前記防腐剤としては、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、アムホテリシンＢなどが含まれる。本発明の組成物は、１つ以上の適切な乳化剤、例えば、スパン型（Ｓｐａｎ）またはツイン型（Ｔｗｅｅｎ）を含むことができる。また、本発明の組成物は、保護剤を含むことができ、当業界に公知された保護剤を制限なく使用することができ、これは、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ；ＬＰＧＧ）またはトレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ；ＴＰＧＧ）を含むことができるが、これらに制限されるものではない。

【0037】

本発明の実施形態では、前記組成物は、２回投与用であることが好ましく、２週間間隔で２回投与用であることがより好ましい。

【0038】

本発明の実施形態では、前記組成物は、（ａ）スパイクタンパク質；および（ｂ）ＯＲＦ３ａまたはヌクレオカプシドタンパク質；に対する免疫原性を同時に誘導することが好ましい。

【0039】

本発明の実施形態では、前記組成物は、抗体応答およびＴ細胞免疫応答を同時に誘導することが好ましい。

【0040】

本発明の別の態様によれば、本発明は、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子；またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；を含む、バイシストロニック発現カセットを提供する。

【0041】

本発明の別の態様によれば、本発明は、バイシストロニック発現カセットを含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するためのワクチン組成物および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染を予防するための免疫原性組成物を提供する。

【0042】

本発明の実施形態では、前記スパイクタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンに最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されていることが好ましく、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２固有のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をＩｇＥリーダー配列に置き換えられたものが好ましい。

【0043】

本発明の好ましい実施形態では、前記スパイクタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１または３の塩基配列で表されるものであってもよい。

【0044】

本発明の実施形態では、前記ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンが最適化されていることが好ましく、より好ましくはＩｇＥリーダー配列が追加されていることが好ましい。

【0045】

本発明の好ましい実施形態では、前記ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表されるものであってもよい。

【0046】

本発明の実施形態では、前記ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトコドンが最適化されていることが好ましく、より好ましくはＩｇＥリーダー配列が追加されていることが好ましい。

【0047】

本発明の好ましい実施形態では、前記ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列で表されるものであってもよい。

【0048】

本発明において、バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）とは、真核細胞内でｍＲＮＡの内部でもリボソームがポリペプチドを合成できるようになって、一つのｍＲＮＡから複数のタンパク質が合成可能になったシステムを意味し、本発明では、（ｉ）スパイクタンパク質およびＯＲＦ３ａタンパク質；または（ｉｉ）スパイクタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質；が共発現されるように発現カセットを設計した。

【0049】

本発明の好ましい実施形態では、前記（ｉ）スパイクタンパク質およびＯＲＦ３ａタンパク質が共発現されるように設計された発現カセットは、配列番号１の塩基配列で表されるスパイクタンパク質をコードする遺伝子；および配列番号２の塩基配列で表されるＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子；を含むことができる。

【0050】

本発明の好ましい実施形態では、（ｉｉ）スパイクタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質が共発現されるように設計された発現カセットは、配列番号３の塩基配列で表されるスパイクタンパク質をコードする遺伝子；および配列番号４のヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子；を含むことができる。

【0051】

本発明において、発現カセットは、プロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるので、プロモーター下流に作動可能に組み込んだ目的タンパク質を産生するために発現させることができる単位カセットを意味する。このような発現カセットの内部または外部には、前記目的タンパク質の効率的な生産を助けることができる多様な因子が含まれてもよい。前記目的タンパク質発現カセットは、具体的には、プロモーター配列の下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に組み込まれたものであってもよい。前記の作動可能に組み込むとは、本発明のプロモーター活性を有する核酸配列が目的タンパク質をコードする遺伝子の転写を開始および媒介するように、前記遺伝子配列とプロモーター配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な組み込みは、当業界の公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができ、部位－特異的ＤＮＡ切断および連結酵素は、当業界の切断および連結酵素などを用いて作製することができるが、これらに限定されるものではない。

【0052】

本発明の実施形態では、前記バイシストロニック発現カセットは、追加の構成要素、すなわちＣＭＶプロモーター、コザック配列（Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＩｇＥリーダー配列（ＩｇＥ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、フーリン認識部位（ｆｕｒｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ＧＳＧ－Ｔ２Ａ切断部位、ＢＧＨポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ ｐｏｌｙ ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、カナマイシン耐性遺伝子およびｐＵＣ複製起点からなる群から選択される１以上の構成をさらに含むことが好ましい。前記ＣＭＶプロモーター、コザック配列およびＩｇＥリーダー配列は、動物細胞内の高レベルの遺伝子発現および分泌を誘導するためのものであり；フーリン認識部位およびＧＳＧ－Ｔ２Ａ切断部位は、タンパク質切断のためのものであり；ＢＧＨポリアデニル化シグナルは、効率的な転写終結と転写物の安定化のためのものであり；カナマイシン耐性遺伝子は、大腸菌選択マーカーであり；ｐＵＣ複製起点は、大腸菌内の高いコピー数を維持するためのもの；である。

【0053】

本発明の実施形態では、前記バイシストロニック発現カセットは、ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）であることが好ましく、より好ましくは以下の切断地図で示されるものであってもよい。

【化1】

【0054】

本発明において、ベクターとは、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用することができるベクターは、当業界でしばしば使用されるプラスミド（例えば、ｐＧＬＳ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λＣｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＡＡＶ、ＭＶＡなど）を操作して作製することができる。

【0055】

前記組換えベクターは、典型的にはクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。前記発現用ベクターは、当業界において植物、動物または微生物において外来タンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法により構築することができる。

【0056】

前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築することができる。例えば、真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、ＣＭＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点等を含むが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）を使用することができ、転写終結配列として一般的にポリアデニル化配列を有する。

【0057】

本発明の実施形態では、前記組成物は１～３週間間隔で１～３回投与することが好ましく、２週間間隔で２回接種することがより好ましい。

【0058】

本発明の実施形態では、前記組成物は、哺乳動物への投与時、活性成分の迅速な放出、または持続放出もしくは遅延放出が可能なように当業界で公知の方法を使用して剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射用溶液、滅菌粉末形態を含む。

【0059】

本発明の実施形態では、前記組成物は、筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、静脈注射（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）および鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）からなる群から選択される１以上の経路で投与することができる。

【0060】

本発明の実施形態では、前記組成物は、投与時の送達効率を高めるために物理的な刺激を加える方法によって投与することができ、その例としては、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃法（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）およびジェット噴射（Ｊｅｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などがある。

【0061】

本発明において、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、細胞に電場を加えて、原形質膜の透過性を増加させることによって化学物質、薬物またはＤＮＡを細胞内に導入されるようにする技術である。特に、電気穿孔法は、新しいＤＮＡを導入し、細菌、動物細胞、または植物細胞を形質転換するのに活用される。

【0062】

本発明において、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）は、直径１～５μｍの適当な金、タングステン、またはプラスチックの粒子に組換えプラスミドを付着し、適正速度で加速して細胞壁や細胞膜を通過できるようにした機構を意味する。前記遺伝子銃を用いた送達方法は、生きている細胞内へ生物学的物質を導入することに使用される。

【0063】

本発明において、ジェット噴射は、注射針を刺入れせず、噴射式注射器を用いて液体薬剤を高圧で微細に噴射させて、皮下に注入する方法を意味する。

【0064】

本発明の好ましい実施形態では、前記組成物は、電気穿孔法によって筋肉内投与されることが好ましい。

【0065】

本発明の実施形態では、前記組成物は、送達効率を高めるために生化学的方法によって投与されてもよく、好ましくは、リポソーム媒介送達法（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって組成物を投与することができる。

【0066】

本発明において、リポソーム媒介送達法は、目的物質を含有するリポソームを用いて目的物質を細胞内に送達する方法を意味する。

【0067】

本発明による組成物は、一般的に使用される薬学的に許容される担体と共に適切な形態に剤形化することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、適切な油、生理食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などの酸化防止剤がある。適切な保存剤としては、塩化ベンズアルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベンおよびクロロブタノールがある。また、本発明に係る組成物は、その投与方法や剤形に応じて必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤等を適宜含むことができる。

【0068】

前記組成物の患者への投与量は、患者の腎臓、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因によって異なる。

【0069】

さらに、本発明の組成物は、治療的に有効な量で投与される。

【0070】

本発明において、治療的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素および他の医学分野で周知の要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、６０ｋｇの成人に基づいて０．０１ｍｇ／６０ｋｇ～１ｇ／６０ｋｇで投与することができる。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別、および状態に応じて適切に調整することができる。

【0071】

本発明による、抗原タンパク質であるスパイクおよびＯＲＦ３ａをコードする遺伝子を含むバイシストロニック発現カセット；またはスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニック発現カセット；を含む組成物は、抗原抗体免疫応答およびＴ細胞免疫応答を効果的に誘導し、中和抗体がおよびｈＡＣＥ２タンパク質との競争的結合能力が高いことを確認した。したがって、本発明による組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症の予防分野において多様に活用されてもよい。

【0072】

本発明の別の態様では、本発明は、前記バイシストロニック発現カセットを個体に処理する工程；を含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２感染予防方法を提供する。

【0073】

本発明の実施形態では、前記バイシストロニック発現カセットは、それを含むベクターの形態で個体に処理することが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0074】

本発明において、前記個体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２に感染するリスクのある個体または感染したと予想される個体であってもよい。

【実施例】

【0075】

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0076】

実施例１．候補抗原選定およびバイシストロニックベクターの設計
Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７）から候補スパイク抗原（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９０．１）、ＯＲＦ３ａ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９１．１）およびヌクレオカプシド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＹＰ＿００９７２４３９７．２）を選定した。

【0077】

前記抗原の内、ＯＲＦ３ａは、２７５個のアミノ酸からなる最大の補助タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンドサイトーシス （ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関与する。

【0078】

前記の候補抗原の内、（ｉ）スパイクおよびＯＲＦ３ａ；または（ｉｉ）スパイクおよびヌクレオカプシド；をコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクター（すなわち、ＤＮＡワクチン形態の混合ワクチン）を調製した。前記バイシストロニックベクターの製造に用いたスパイク、ＯＲＦ３ａ、またはヌクレオカプシドをコードする遺伝子は、当該Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．のアミノ酸配列をヒトコドンが最適化された塩基配列である。スパイクの場合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２固有のシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をＩｇＥリーダー配列に置き換え、ＯＲＦ３ａおよびヌクレオカプシドの場合、ＩｇＥリーダー配列を追加したものである。前記バイシストロニックベクターの製造に用いたスパイクタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１または３の塩基配列で表され、ＯＲＦ３ａタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列で表され、ヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列で表される。

【0079】

（ｉ）スパイクタンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）およびＯＲＦ３ａをコードする遺伝子（配列番号２）を含むバイシストロニックベクター（ｐＧＬＳ－ＢＣ－ｎＣｏＶ－Ｓ－Ｏｒｆ３ａ＿ｈＣＯ）を設計し、これをプラスミドｐＧＯ－１００２と命名した。前記プラスミドｐＧＯ－１００２の切断地図を図１ａに示した。前記図１ａのプラスミドｐＧＯ－１００２を用いて、細胞内で発現されたペプチドは、シグナルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどの様々な切断部位を含んでいる。前記プラスミドｐＧＯ－１００２によって発現されたペプチドは、図１ｂに示すように翻訳後修飾（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって切断され、それにより細胞外分泌時にスパイクおよびＯＲＦ３ａタンパク質のみが分泌される。

【0080】

（ｉｉ）スパイクタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３）およびヌクレオカプシドをコードする遺伝子（配列番号４）を含むバイシストロニックベクター（ｐＧＬＳ－ＢＣ－ｎＣｏＶ－Ｓ－Ｎ＿ｈＣＯ）を設計し、これをプラスミドｐＧＯ－１００３と命名した。前記プラスミドｐＧＯ－１００３は、細胞内で発現されたペプチドは、シグナルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどの様々な切断部位を含んでいる。前記プラスミドｐＧＯ－１００３によって発現されたペプチドは、翻訳後修飾（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって切断され、それにより細胞外分泌時にスパイクおよびヌクレオカプシドタンパク質のみが分泌される。

【0081】

また、後述する実験では、プラスミドｐＧＬＳ１０１を陰性対照群として使用し、陽性対照群としては、スパイクとＯＲＦ３ａがそれぞれ一つずつ挿入されたプラスミドｐＧＬＳ－スパイク（ｐＧＯ－１００１）およびｐＧＬＳ－ＯＲＦ３ａを用いた。前記プラスミドｐＧＬＳ１０１は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＶＡＸ１プラスミド（カタログ番号Ｖ２６０２０）に由来するものである。

【0082】

実施例２．ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原産生の確認
前記実施例１で調製したプラスミドｐＧＯ－１００２がトランスフェクトした細胞において抗原であるスパイクおよびＯＲＦ３ａタンパク質を産生するかどうかを確認した。具体的には、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にプラスミドｐＧＯ－１００２（ｐＧＬＳ－ＢＣ－ｎＣｏＶ－Ｓ－ＯＲＦ３ａ＿ｈＣＯ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を溶解した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより、スパイクおよびＯＲＦ３ａタンパク質の産生が確認された。前記ウェスタンブロッティングに用いた抗体は、以下の通りである。

【0083】

＜一次抗体＞
－抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗体（カタログ番号３５２５，ＰｒｏＳｃｉ）、１：５，０００
－抗ＯＲＦ３ａ ｓｅｒｕｍ（Ｌａｂ－ｍａｄｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｂ）、１：１００
－抗β－アクチン（ａｂ８２２６、Ａｂｃａｍ）、１：１，０００

【0084】

＜二次抗体＞
－抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（カタログ番号Ｇ－２１２３４、Ｔｈｅｒｍｏ）、１：１０，０００
－抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（６２－６５２０、Ｔｈｅｒｍｏ）、１：５，０００

【0085】

ウェスタンブロッティングの結果を図２ａに示した。

【0086】

図２ａに示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２をトランスフェクトした細胞は、細胞内でスパイクおよびＯＲＦ３ａがそれぞれ正常に発現されることが確認された。

【0087】

免疫蛍光染色により、スパイクおよびＯＲＦ３ａタンパク質発現の有無が確認された。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株にプラスミドｐＧＯ－１００２をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクトした細胞を免疫蛍光標識した。細胞核のＤＮＡをＤＡＰＩで染色標識し、対照群として活用した（青色パネル）。染色結果を図２ｂに示した。

【0088】

図２ｂに示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２をトランスフェクトした細胞は、細胞内でスパイク（ＴＲＩＴＣ）およびＯＲＦ３ａ（ＦＩＴＣ）がそれぞれ正常に発現されることが確認された。

【0089】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターｐＧＯ－１００３を用いて前記と同様の方法で実験した。

【0090】

その結果、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターでトランスフェクションされた細胞は、細胞内でスパイクおよびヌクレオカプシドがそれぞれ正常に発現されることが確認された。

【0091】

実施例３．抗原の毒性評価
前記実施例１にて調製したプラスミドｐＧＯ－１００２の毒性を評価した。前記細胞評価は、プラスミドｐＧＯ－１００２で免疫化したマウスにおける抗原発現によって誘導された体重変化を測定することによって毒性を評価した。前記免疫化したマウスは、電気穿孔法を用いてプラスミドｐＧＯ－１００２を筋肉内接種し、２週間間隔で２回接種した。本実施例で使用したマウスは、プラスミドｐＧＯ－１００２を一次接種し、１５日後に二次接種したものである。陰性対照群は、プラスミドｐＧＬＳ－１０１を接種し、陽性対照群は、プラスミドｐＧＬＳ－ＯＲＦ３ａを接種した。抗原の毒性を評価した結果を図３に示した。

【0092】

図３に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した実験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、陰性および陽性対照群と同様の体重増加率を示した。前記の結果は、スパイク抗原およびＯＲＦ３ａが体内で毒性が低いことを意味する。

【0093】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターｐＧＯ－１００３を用いて前記と同様の方法で実験した。

【0094】

その結果、実験群は、陰性および陽性対照群と同様の体重増加率を示した。これは、スパイク抗原およびヌクレオカプシドが体内で毒性が低いことを意味する。

【0095】

実施例４．抗体免疫応答による免疫原性の評価
抗体免疫応答による免疫原性評価は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）試験法により行った。

【0096】

実験方法
ＥＬＩＳＡプレートを組換え抗原が含まれた１×リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）１μｇ／ｍｌでコーティングした後、４℃で一晩インキュベートした。コーティングされたプレートにブロッキングバッファー（ｓｅｒａｃａｒｅ、カタログ番号５１４０－００１１）を添加した後、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションした後、プレートを５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＰＢＳで洗浄し、マウス血清を連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、３７℃で２時間インキュベートした。前記マウス血清は、マウスに電気穿孔接種法により前記実施例１で調製されたプラスミドｐＧＯ－１００２を、筋肉内接種（２週間間隔で２回）した後に、電気穿孔法により送達したマウスから得たものである。インキュベーション後、プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、スパイクまたはＯＲＦ３ａと結合する一次抗体を添加してインキュベートした後、１×ＰＢＳで洗浄した。プレートにＨＲＰ（ｆｏｒｓｅ ｅａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１４３０）（１：２，５００）を処理した後、室温で１時間インキュベートした。その後、１×ＰＢＳでプレートを洗浄し、プレートはＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ、カタログ番号５１２０－００３２）を用いて、現像（ｄｅｖｅｏｐｉｎｇ）し、ＡＢＴＳ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ、カタログ番号５１５０－００１７）を処理して反応を中断させた。プレートを４０５ｎｍで３０分以内に読み取った。前記プレートの読み取りには、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｐａｒｋ、ＶＴ）を使用した。カットオフ値は、次のように計算した。
－カットオフ：各群の０日目；（ｅａｃｈ ｖａｌｕｅ－ｂｌａｎｋ）Ａｖｇ＋（２．５×ＳＤ）

【0097】

正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、プラスミドｐＧＬＳ－スパイクおよびｐＧＬＳ－ＯＲＦ３ａを接種したマウス血清で行った。

【0098】

対照群は、プラスミドｐＧＬＳ－１０１（陰性対照群）、ｐＧＬＳ－スパイク（陽性対照群）を接種したマウスから採取した血清を用いた。

【0099】

スパイク抗原特異的結合抗体力価の測定
スパイク抗原特異的結合抗体価を測定するために、プラスミドを接種する前（Ｄ０）、２週間（Ｗｋ２）および４週間（Ｗｋ４）後にマウスの血清を採取した。前記採取した血清およびマウスのスパイクに結合する一次抗体を用いたＥＬＩＳＡにより、スパイク抗原特異的結合抗体価を測定した。スパイク抗原特異的結合抗体価を測定した結果を図４に示す。

【0100】

図４に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、スパイク抗原特異的結合抗体価が陽性対照群（ｐＧＬＳ－スパイク）と同様のレベルであることが確認された。

【0101】

ＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価の測定
ＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価を測定するために、プラスミドを接種する前（Ｄ０）、２週間（Ｗｋ２）および４週間（Ｗｋ４）後にマウスの血清を採取した。この採取した血清およびマウスのＯＲＦ３ａに結合する一次抗体を用いたＥＬＩＳＡによってＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価を測定した。ＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価を測定した結果を図５に示した。

【0102】

図５に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、ＯＲＦ３ａ抗原特異的結合抗体価が陰性対照群（ｐＧＬＳ－１０１）より著しく高いことが確認された。

【0103】

前記の結果は、プラスミドｐＧＯ－１００２によって発現されたスパイクおよびＯＲＦ３ａタンパク質がそれぞれ十分な免疫応答を誘導することを意味する。

【0104】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを用いて前記と同様の方法で実験した。

【0105】

その結果、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターによって発現されたタンパク質（すなわち、スパイクおよびヌクレオカプシド）はそれぞれ十分な免疫応答を誘導することを意味する。

【0106】

実施例５．Ｔ細胞免疫応答による免疫原性の評価
ウイルスを体内から除去するためには、強力な抗体応答と同時にＴ細胞免疫応答が必要である。本発明のスパイクおよびＯＲＦ３ａが抗体形成による免疫だけでなく、Ｔ細胞免疫応答を誘導するかどうかを確認するための実験を行った。Ｔ細胞免疫応答による免疫原性評価は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｐｏｔ ａｓｓａｙ）により行った。

【0107】

実験方法
電気穿孔接種法によりプラスミドｐＧＯ－１００２をマウスに筋肉内接種し、接種は２週間間隔で２回行った。前記マウスを犠牲にし、脾臓を採取した。Ｒ１０培地中のマウス由来の脾臓から単一脾臓細胞を個別に収集し、単細胞懸濁液(ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を調製した。前記Ｒ１０培地は、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を意味する。前記細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得て、細胞ペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１０４９２０１）５ｍｌに再懸濁した後、８分間インキュベートした。培養後の反応を停止させるために、細胞が含まれたチューブにＲ１０培地を加えた後、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。前記細胞ペレットをＲ１０培地に再懸濁し、細胞懸濁液を調製した。

【0108】

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、マウスＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳプレート（ＭＡＢＴＥＣＨ、カタログ番号３３２１２Ｈ）を用いて行った。ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）のために、捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）でコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレートにＲ１０培地を加えた後、室温で１時間インキュベートした。マウス脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）２００，０００個を、前記ブロックされたＥＬＩＳｐｏｔプレートの各ウェルにプレーティングした。プレーティングされた細胞は、オーバーラッピングペプチド（ＯＬＰ；ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｌｏｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）プールを用いて、１４時間脾臓細胞を刺激した。Ｒ１０培地で１ウェル当たり１μｇ／ｍｌの各ペプチドで細胞を刺激した。細胞刺激後に発現されたスポットは、メーカーのマニュアルに従って現像した。Ｒ１０培地および１％ＤＭＳＯ混合物とＣｏｎＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎｅ Ａ）をそれぞれ陰性および陽性対照群として用いた。スポットをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ＣＴＬリーダーでスキャンおよび定量した。細胞１，０００，０００個当たりのＳＦＵ（ｓｐｏｔ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）は、Ｒ１０培地および１％のＤＭＳＯ混合物を処理したウェルの値を除して計算した。カットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ）は、以下のように計算した：カットオフ＝ＭＥＡＮ ｏｆ Ｓｐｏｔ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ＯＬＰｓ＋（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｔ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ＯＬＰｓ×３）。カットオフ値のための試料は、ワクチンを接種しなかった脾臓細胞を使用した。

【0109】

前記ＯＬＰプールは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクまたはＯＲＦ３ａタンパク質に由来するＯＬＰプール；またはこれらの組み合わせ；である。

【0110】

対照群は、プラスミドｐＧＬＳ－１０１（陰性対照群）、ｐＧＬＳ－スパイク（陽性対照群）を接種したマウスから採取した脾細胞を使用した。

【0111】

スパイクＯＬＰに対するＴ細胞免疫応答の評価
ＥＬＩＳｐｏｔ分析により、スパイクＯＬＰで刺激した脾臓細胞のＴ細胞免疫応答を評価した。前記Ｔ細胞免疫応答の評価には、スパイクＶ１６－Ｖ３５０に該当する６５個のＯＬＰプールであるＳ１＿ＯＬＰ１；スパイクＹ３５１－Ｑ６７５に該当する６５個のＯＬＰプールであるＳ１＿ＯＬＰ２；スパイクＩ６６６－Ｓ９７５に該当する６０個のＯＬＰプールであるＳ２＿ＯＬＰ１；スパイクＬ９６６－Ｔ１２７３に該当する６０個のＯＬＰプールであるＳ２＿ＯＬＰ２；ＯＲＦ３ａ Ｍ１－Ｌ２７５に該当する５３個のＯＬＰプールであるＯＲＦ３＿ＯＬＰ１を使用した。前記ＯＬＰプールは、１０個のアミノ酸が重複する１５ｍｅｒ長のペプチドからなる。スパイクＯＬＰに対するＴ細胞免疫応答を評価した結果を図６に示す。

【0112】

図６に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、陽性対照群（ｐＧＬＳ－スパイク）よりスパイクＯＬＰに対するＴ細胞免疫応答を効果的に誘導することが確認された。

【0113】

ＯＲＦ３ａＯＬＰに対するＴ細胞免疫応答の評価
ＥＬＩＳｐｏｔ分析により、ＯＲＦ３ａ ＯＬＰで刺激された脾細胞のＴ細胞免疫応答を評価し、その結果を図７に示す。

【0114】

図７に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、ＯＲＦ３ａ ＯＬＰに対するＴ細胞免疫応答を効果的に誘導した。

【0115】

スパイクＯＬＰおよびＯＲＦ３ａＯＬＰの複合Ｔ細胞免疫応答の評価
ＥＬＩＳｐｏｔ分析により、スパイクＯＬＰおよびＯＲＦ３ａＯＬＰで刺激された脾細胞のＴ細胞免疫応答を評価した。実験群は、マウスにプラスミドｐＧＯ－１００２を筋肉内注射および電気穿孔法により投与した。対照群は、プラスミドｐＧＬＳ１０１を筋肉内注射および電気穿孔法により投与した群である。スパイクＯＬＰおよびＯＲＦ３ａＯＬＰに対する複合Ｔ細胞免疫応答を評価した結果を図８に示す。

【0116】

図８に示すように、プラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、発現されたそれぞれのタンパク質スパイクおよびＯＲＦ３ａによってＴ細胞免疫応答が効果的に誘導されたことが確認された。

【0117】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを用いて前記と同様の方法で実験した。

【0118】

その結果、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを接種した試験群は、陽性対照群に比べて顕著なＴ細胞免疫応答効果があることが確認された。

【0119】

実施例６．プラーク減少中和試験による中和抗体の評価
Ｌｉｖｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害する中和抗体を用いたＰＲＮＴ_５０試験により中和抗体価を評価した。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ／２０２０分離中和アッセイは、疾患管理本部で行った。中和ウイルス力価は、５６℃で３０分間熱不活性化（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）した血清試料中で測定した。試験群血清は、マウスに筋肉内接種後、電気穿孔法により前記実施例１で調製したプラスミドｐＧＯ－１００２を接種（２週間間隔で２回）したマウスから得たものであり、対照群血清は、プラスミドｐＧＬＳ－１０１またはｐＧＬＳ－スパイクを接種したマウスから得たものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＢｅｔａＣｏＶ／Ｋｏｒｅａ／ＫＣＤＣ０３／２０２０）（６０ ｐｆｕ ｍｌ^－１）を１０％のＦＢＳ、１００ ＩＵ ｍｌ^－１ペニシリンおよび１００μｇｍｌ^－１ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）と５０：５０：で混合し、９６ｗｅｌｌ Ｕ ｂｏｔｔｏｍｅｄ ｐｌａｔｅで１：４～１：２０４０まで連続血清希釈した。前記プレートを３７℃のｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ｂｏｘで１時間インキュベートした後、ウイルスをＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）（１０％のＦＢＳ、１００ ＩＵ ｍｌ^－１ペニシリン、１００μｇｍｌ^－１ストレプトマイシンを含む）中の１２ウェルプレート（ウェル当たり２．５×１０^５ Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－８１）が播種されたもの）に接種した。ウイルスを３７℃で１時間吸着し、プラークアッセイオーバーレイ培地（２×ＭＥＭ／１．５％Ａｇａｒ／４％ＦＢＳ最終）でオーバーレイした。その後、ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ｂｏｘで３７℃で３日間インキュベートした。培養プレートを固定し、染色して、プラークを計数した。各ウェルの細胞変性効果（ＣＰＥ）を顕微鏡で記録し、５０％保護条件の希釈水で中和力価を計算した。実験結果を図９および図１０に示した。

【0120】

図９および１０に示すように、前記実施例１で調製したプラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、ｐＧＬＳ－スパイク接種群と同様のレベルの優れた中和抗体免疫応答が確認された。

【0121】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを用いて前記と同様の方法で実験した。

【0122】

その結果、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを接種した試験群は、中和抗体が高いことが確認された。

【0123】

実施例７．ＡＣＥ受容体競合（ＡＣＥ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）の評価
ウイルススパイク糖タンパク質（ＲＢＤ）の受容体結合ドメインとＡＣＥ２細胞表面受容体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ｃａｔ＃Ｌ００８４７）との間の相互作用を遮断するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する循環中和抗体を検出した。別々のチューブに希釈した対照群および試験群の血清を、１：１の体積比で希釈したＨＲＰ－ＲＢＤ溶液と混合した。前記試験群血清は、マウスに電気穿孔接種法により前記実施例１で調製されたプラスミドｐＧＯ－１００２を筋肉内接種（２週間間隔で２回）したマウスから得たものであり、対照群血清は、プラスミドｐＧＬＳ－１０１またはｐＧＬＳ－スパイクを接種したマウスから得たものである。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。対照群をそれぞれ１００μｌずつプレートの各ウェルに入れた後、プレートシーラーでプレートを覆い、３７℃で１５分間インキュベートした。プレートシーラーを除去した後、１×洗浄溶液２６０μｌでプレートを４回洗浄した。洗浄後にウェルに残った液体を除去するために、紙タオルにプレートを叩いた。各ウェルにＴＭＢ溶液１００μｌを加え、２０～２５℃の条件である暗室で１５分間インキュベートし、各ウェルに停止溶液５０μｌを加えて反応を終了させた。マイクロタイタープレートリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。カットオフ値は、確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者の血清および健常対照群の血清に対するＧｅｎＳｃｒｉｐｔパネルの検証に基づいて以下の式で計算した。

【0124】

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＝（１－ＯＤ Ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ／ＯＤ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）＊１００％

【0125】

カットオフ値の解釈を表１に示した。

【0126】

【表1】

【0127】

ＡＣＥ受容体の競合評価の結果を図１１に示した。図１１に示すように、前記実施例１で調製したプラスミドｐＧＯ－１００２を接種した試験群（ｐＧＬＳ－スパイク－ＯＲＦ３ａ）は、ｈＡＣＥ２タンパク質との競合的結合能が著しく高いことが確認された。

【0128】

また、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを用いて前記と同様の方法で実験した。

【0129】

その結果、前記実施例１で作製されたスパイクおよびヌクレオカプシドをコードする遺伝子を含むバイシストロニックベクターを接種した試験群は、ｈＡＣＥ２タンパク質との競争的結合能力が高いことが確認された。

【0130】

総合的に、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＤＮＡワクチン、すなわち抗原タンパク質をコードする遺伝子であるスパイクおよびＯＲＦ３ａ遺伝子を含むバイシストロニックベクター；およびスパイクおよびヌクレオカプシド遺伝子を含むバイシストロニックベクター；を調製した。前記バイシストロニックベクターは、生体内で発現および翻訳後修飾によって２つの抗原タンパク質を産生し、得られた抗原タンパク質は、顕著な免疫原性を示すことが確認された。より具体的には２つの抗原のそれぞれに対して明確な抗体免疫応答を誘導することができるだけでなく、強いＴ細胞免疫応答を誘導できることが確認された。したがって、本発明によるバイシストロニックベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症の予防分野において多様に活用されてもよい。

【0131】

以下、製剤例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。製剤例は本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が製剤例によって限定されるものと解釈されない。

【0132】

製剤例１．ワクチン組成物
プラスミドｐＧＯ－１００２
クエン酸ナトリウム水和物（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）
塩化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
滅菌注射用水（ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）

【0133】

以上、本開示内容の特定の部分を詳細に記載したので、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい実施形態に過ぎないものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言える。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2023545862000001.app

【国際調査報告】