特表 2023-545878 新規なグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-01

(54)【発明の名称】新規なグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20231025BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231025BHJP

   C12P 19/32 20060101ALI20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/14 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P19/32 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022551745

(86)(22)【出願日】2021-12-17

(85)【翻訳文提出日】2022-08-26

(86)【国際出願番号】 KR2021019303

(87)【国際公開番号】W WO2023048343

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】10-2021-0125841

(32)【優先日】2021-09-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514199250

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クォン，ナラ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ジ ヒュン

(72)【発明者】

【氏名】ペ，ヒュン－ジュン

(72)【発明者】

【氏名】キム，デ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウン ジ

(72)【発明者】

【氏名】フー，ラン

(72)【発明者】

【氏名】ヨー，ヒョリュン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ビナ

(72)【発明者】

【氏名】ソン，スン クァン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF23

4B064CA02

4B064CA19

4B064CB01

4B064CC24

4B064DA10

4B065AA24X

4B065AA24Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA23

4B065BC01

4B065CA23

4B065CA41

(57)【要約】

本発明は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３の２９番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体。

【請求項2】

前記他のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びヒスチジンから選択されるものである、請求項１に記載のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体。

【請求項3】

請求項１に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項4】

配列番号３の第２９番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、微生物。

【請求項5】

前記微生物はコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項４に記載の微生物。

【請求項6】

請求項４または５に記載の微生物を培養する段階を含むプリンヌクレオチドの生産方法。

【請求項7】

前記生産方法は、培養培地または微生物からプリンヌクレオチドを回収する段階をさらに含む、請求項６に記載のプリンヌクレオチドの生産方法。

【請求項8】

配列番号３の２９番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体、前記変異体を含む微生物及び前記微生物を培養した培地中の一つ以上を含むプリンヌクレオチド生産用組成物。

【請求項9】

請求項１に記載の変異体を発現するように微生物を変形する段階を含む、微生物のプリンヌクレオチド生産能を増加させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸系物質の一つであるプリンヌクレオチドは、食品調味添加剤または食品用に広く利用されている物質であり、呈味性核酸系調味料として脚光を浴びている。

【0003】

プリンヌクレオチドを生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。例えば、プリンヌクレオチドの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、または生合成に不要な遺伝子を除去するなどの目的物質特異的アプローチが主に利用されている（EP 3722430 A1, US 2020-0347346 A1）。

【0004】

プリンヌクレオチドの需要が増加するにつれて、効果的なプリンヌクレオチドの生産のための研究が依然として必要なのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】EP 3722430 A1

【特許文献2】US 2020-0347346 A1

【特許文献3】米国登録特許US 7662943 B2

【特許文献4】米国登録特許US 10584338 B2

【特許文献5】米国登録特許US 10273491 B2

【特許文献6】韓国登録特許KR 10-0655902 B1

【特許文献7】米国特許公開番号US 2013-0095529 A1

【特許文献8】韓国公開特許番号第10-2020-0136813号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献7】[CARILLO ET AL.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989

【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8

【非特許文献13】Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793

【非特許文献14】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012

【非特許文献15】Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986

【非特許文献16】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16

【非特許文献17】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の目的は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体を提供することにある。

【0009】

本発明のもう一つの目的は、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

【0010】

本発明のもう一つの目的は、前記変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供することにある。

【0011】

本発明のもう一つの目的は、前記微生物を培養する段階を含むプリンヌクレオチドの生産方法を提供することにある。

【発明の効果】

【0012】

本発明の変異体を用いて高収率のプリンヌクレオチドの生産が可能である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明を具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本明細書で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本明細書で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本発明の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本発明の範囲が制限されることはない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【0014】

本発明の一の態様は、配列番号３の第２９番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体を提供する。

【0015】

前記グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素の活性を有するポリペプチドまたはグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素において、配列番号３のＮ末端から２９番目の位置に対応するアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含む変異体を意味する。

【0016】

本発明において、「グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素（glutamine-hydrolyzing GMP synthase）」は、５’－キサンチル酸（5'-xanthosine monophosphate; XMP）を５’－グアニン酸（5'-guanosine monophosphate；以下、GMP）に変換するのに関与する酵素である。

【0017】

本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、本発明で提供するグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体を製造するために変形が加えられるグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素またはグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。

【0018】

具体的には、天然に発生するポリペプチドまたは野生型ポリペプチドであってもよく、その成熟ポリペプチドであってもよく、その変異体または機能的断片を含んでもよいが、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体の母体（parent）となることができる限り、制限なく含まれる。

【0019】

一具現例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、コリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）由来であってもよく、より具体的にはコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）由来であってもよいが、これに限定されない。

【0020】

一具現例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、配列番号３のポリペプチドであってもよい。一具現例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、配列番号３のポリペプチドと約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであってもよく、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一または対応する活性を有する場合であれば、制限なくグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素の範囲に含まれる。具体的には、前記グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、配列番号３で記載のアミノ酸配列を有するか、含むか、前記アミノ酸配列から必須で構成される（essentially consisting of）ものであってもよいが、これに限定されない。

【0021】

本発明において変異の対象となる前記グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）由来のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素であってもよく、具体的には、配列番号３で記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド／タンパク質であってもよいが、同じ活性を有するポリペプチド／タンパク質は制限なく含まれてもよい。一例として、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれと８０％以上の相同性（homology）または同一性（identity）を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド／タンパク質も、このような相同性または同一性を有し、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素活性を示すポリペプチド／タンパク質であれば、本出願の変異の対象となるポリペプチド／タンパク質の範囲内に含まれることは自明である。

【0022】

本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。一例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、ｇｕａＡ遺伝子によりコードされるポリペプチドであってもよい。一例として、本出願のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素は、Corynebacterium stationis、Corynebacterium caseiまたはCorynebacterium ammoniagenes由来であってもよく、その例としてNCBI Reference sequence WP_194285183.1, WP_006823296.1またはWP_040355890.1で示される酵素であってもよいが、これに限定されない。

【0023】

本発明において、用語「相同性（homology）」または「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。

【0024】

保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（homologous）または同一の（identical）配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（stringent conditions）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。

【0025】

任意の２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994,及び[CARILLO ET AL.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。

【0026】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482において公知となっているように、例えば、Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）、及びSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)により開示されているように、Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745の加重比較マトリックス（またはEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；（３）末端ギャップのための無ペナルティを含む。

【0027】

本発明において、用語「変異体（variant）」とは、１つ以上のアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／または変形（modification）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（functions）または特性（properties）が維持されるポリペプチドを指す。そのような変異体は、一般に、ポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形ポリペプチドの特性を評価して同定（identify）されてもよい。すなわち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変化しないか、または減少されうる。また、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（transmembrane domain）などの１つ以上の部分が除去された変異体を含んでもよい。他の変異体は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／またはＣ末端から一部分が除去された変異体を含んでもよい。前記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異タンパク質、変異及び変異体などの用語（英語表現では、modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergentなど）を混用することができ、変異された意味で使用される用語であれば、これに限定されない。

【0028】

また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含んでもよい。例えば、変異体のＮ末端には、翻訳と同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移動（translocation）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートされてもよい。また、前記変異体は、確認、精製、または合成可能に、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。

【0029】

本発明で提供されるグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体は、配列番号３の２９番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。具体的には、前記他のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びヒスチジンから選択されるものであってもよい。

【0030】

前記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であれば限定されない。一方、本発明において「特定アミノ酸が置換された」と表現する場合、他のアミノ酸で置換されたと特に表記しなくても、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換されることは自明である。

【0031】

一具現例として、本発明の変異体は、比較（reference）タンパク質である配列番号３のアミノ酸配列において２９番目の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸である変異体であってもよい。具体的には、前記変異体の配列番号３の２９番目の位置に対応するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン及びヒスチジンから選択されるものであってもよい。

【0032】

一具現例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体は、配列番号３で記載されたアミノ酸配列の２９番目の位置に対応するアミノ酸がアルギニン以外のアミノ酸であり、前記配列番号３で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．８％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0033】

一例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるか、これと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、または９９．８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み得るが、これらに限定されない。

【0034】

また、そのような相同性または同一性を有し、本発明の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本発明の範囲内に含まれることは自明である。
例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／または内部に本発明の変異体の機能を変形しない配列の追加または欠失、自然に起こり得る突然変異、潜在性突然変異（silent mutation）または保存的置換を有する場合である。

【0035】

前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。そのようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／または両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて起こり得る。通常、保存的置換はタンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または全く影響を及ぼさない。

【0036】

本発明において、用語「対応する（corresponding to）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本発明で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（reference）タンパク質における類似または対応する位置を指す。

【0037】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号３と整列（align）し、これに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本発明に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「問い合わせ配列」ともいう）に比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。

【0038】

そのような整列には、例えば、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000、Trends Genet. 16: 276-277）などを用いることができるが、これに限定されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

【0039】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0040】

本発明において、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であり、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。

【0041】

一例として、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列をコードする配列を有するか、または含むことができる。例えば、前記グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の配列からなるか、必須に構成されてもよい。

【0042】

本発明のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）または本発明の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、本発明の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。

【0043】

具体的には、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するか、含むか、または配列番号４の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるか、または必須に構成されてもよいが、これらに限定されない。このとき、前記相同性または同一性を有する配列において、配列番号３の２９番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アルギニン以外のアミノ酸をコードするコドンのうちの一つであってもよい。

【0044】

また、本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造することができるプローブ、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であれば、制限なく含まれる。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8を参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリッド化し、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、 １×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。

【0045】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、配列全体に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。

【0046】

具体的には、本発明のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節することができる。

【0047】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野においてよく知られている（例えば、J. Sambrook et al., 同上）。

【0048】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これらに限定されない。

【0049】

本発明の「ベクター」は、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を制御する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。

【0050】

本発明で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0051】

一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行われてもよいが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選別可能表現型を付与するマーカーを使用することができる。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。

【0052】

本発明における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体以外に位置するかに関係なく、それらの全部を含み得る。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含み得る。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。

【0053】

また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。

【0054】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。

【0055】

本発明の微生物は、本発明の変異体、それをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでもよい。

【0056】

本発明において、「微生物（または、菌株）」とは、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、または内在的遺伝子の活性が増強されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、目的のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のための遺伝的変形（modification）を含む微生物であってもよい。

【0057】

本発明の微生物は、本発明の変異体、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド及び本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む微生物；本発明の変異体または本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを発現するように変形された微生物；本発明の変異体、または本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを発現する微生物（例えば、組換え菌株）；または、本発明の変異体活性を有する微生物（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これらに限定されない。

【0058】

本発明の微生物は、プリンヌクレオチド生産能を有し得る。

【0059】

本発明の微生物は、天然にグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素またはプリンヌクレオチド生産能を有する微生物；または、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素またはプリンヌクレオチド生産能のない親菌株に、本発明の変異体またはそれをコードするポリヌクレオチド（または前記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されるか、及び／またはプリンヌクレオチド生産能が与えられた微生物であってもよいが、これに限定されない。一例として、本発明の微生物は、本発明のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体が導入され、プリンヌクレオチド生産能が与えられた微生物であってもよい。一例として、本発明の微生物は、本出願のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体が導入され、プリンヌクレオチド生産能が増加した微生物であってもよい。しかし、これに限定されない。

【0060】

一例として、本発明の菌株は、本発明のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本発明の変異体を発現する細胞または微生物であり、本発明の目的上、本発明の菌株は、本発明の変異体を含めてプリンヌクレオチドを生産することができる全ての微生物を含んでもよい。例えば、本発明の菌株は、天然の野生型微生物、またはプリンヌクレオチドを生産する微生物に本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体が発現され、プリンヌクレオチド生産能が増加した組換え菌株であってもよい。前記プリンヌクレオチド生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物またはグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素非変形微生物（すなわち、野生型グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素（配列番号３）を発現する微生物；または変異型タンパク質を発現しない微生物）に比べてプリンヌクレオチド生産能が増加した微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0061】

本発明において、用語「非変異型微生物」とは、微生物に自然に生じ得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質変化する前の菌株を意味してもよい。例えば、前記非変形微生物は、本明細書に記載のグルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体が導入されないか、または導入される前の菌株を意味してもよい。「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変異前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。

【0062】

一具現例として、本発明の微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。例えば、本発明の微生物は、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であってもよい。具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニスであってもよいが、これに限定されない。

【0063】

本発明において、「プリンヌクレオチド」は、プリン系構造を含むヌクレオチドを意味する。プリンヌクレオチドは、ＸＭＰ、ＩＭＰ、ＧＭＰまたはＡＭＰであってもよく、具体的にはＩＭＰ、ＸＭＰまたはＧＭＰであってもよい。より具体的には、ＸＭＰまたはＧＭＰであってもよいが、これらに限定されない。

【0064】

本発明の「IMP(inosine 5'-monophosphate, 5'-inosinic acid)」、「GMP(guanosine-5'-monophosphate, 5'-Guanylic acid）」は核酸生合成代謝系の中間物質であり、体内で生理的に重要な役割を果たし、食品、医薬品などに広く利用されている。具体的には、ＩＭＰは自ら牛肉の味を出し、ＸＭＰに由来するＧＭＰはキノコの味を出すことが知られており、両物質はいずれもグルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られており、呈味性核酸系調味料として脚光を浴びている。

【0065】

一具現例として、ＧＭＰはＸＭＰから転換して製造されてもよいが、これらに限定されない。その例として、生産量が増加したＸＭＰからＧＭＰも転換され、その生産量を増加させることができるところ、前記ＧＭＰも本発明の範囲に含まれることは自明である。

【0066】

本発明の「ＸＭＰ」は、ｘａｎｔｈｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５’－Ｘａｎｔｈｙｌｉｃ ａｃｉｄとも呼ばれ、ＩＭＰデヒドロゲナーゼの作用を通じてＩＭＰから形成されたり、ＧＭＰ合成酵素の作用を通じてＧＭＰに変換され得る。

【0067】

本発明において、「プリンヌクレオチドを生産する微生物」とは、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が起こった微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が増強または不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、目的のプリンヌクレオチドの生産のために遺伝的変異が起こったり、活性を強化した微生物であってもよい。

【0068】

本発明のプリンヌクレオチドを生産する微生物は、グルタミン加水分解ＧＭＰ合成酵素変異体を含め、目的のプリンヌクレオチドの生産能が増加したことを特徴とすることができる。

【0069】

一具現例として、本発明においてプリンヌクレオチドを生産する微生物またはプリンヌクレオチド生産能を有する微生物は、プリンヌクレオチド生合成経路内の遺伝子の一部が強化または弱化されたり、またはプリンヌクレオチド分解経路内の遺伝子の一部が強化または弱化された微生物であってもよい。

【0070】

本発明における用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（inactivation）、欠乏（deficiency）、下方制御（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）、減衰（attenuation）などの用語と混用され得る。

【0071】

前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質転換前の親菌株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質転換前の親菌株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。

【0072】

そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成することができる（例えば、Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など）。

【0073】

具体的には、本発明のポリペプチドの弱化は、
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域
をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ribosome）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Reverse transcription engineering, RTE）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。

【0074】

例えば、
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。

【0075】

また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換又はこれらの組み合わせで発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列が含むが、これらに限定されるものではない。

【0076】

また、前記３）及び４）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに限定されない。

【0077】

また、前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これらに限定されない。

【0078】

前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986］を参照することができる。

【0079】

前記７）リボソーム（ribosome）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。

【0080】

前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Reverse transcription engineering, RTE）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。

【0081】

本発明において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方制御（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、増加（increase）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、もしくは内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親菌株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親菌株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／または濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。

【0082】

前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／または濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。

【0083】

前記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない（例えば、Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など）。

【0084】

具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選別して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。

【0085】

より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させることができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われてもよいが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。

【0086】

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。

【0087】

公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国特許US 7662943 B2）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬプロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許US 10584338 B2）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許US 10273491 B2）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。

【0088】

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。

【0089】

前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは前述の通りである。

【0090】

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選別して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加されてもよい。

【0091】

前記７）ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。

【0092】

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。

【0093】

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0094】

本発明の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集及び／または（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／または化学物質の処理により誘導され得るが、これらに限定されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（homologous recombination）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。

【0095】

本発明のもう一の態様は、本発明の変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養する段階を含む、プリンヌクレオチド生産方法を提供する。

【0096】

本発明のプリンヌクレオチド生産方法は、本発明の変異体またはそれをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むベクターを含む微生物を培地で培養する段階を含んでもよい。

【0097】

本発明において、用語「培養」とは、本発明の微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／または流加式であってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0098】

本発明において、用語「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本発明の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨ等を調節しながら培養することができる。

【0099】

例えば、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、文献［"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)］で見ることができる。

【0100】

本発明において、前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。

【0101】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用され得る。これらの窒素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。

【0102】

前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはそれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／または適切な前駆体などが含まれ得る。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるものではない。

【0103】

また、本発明の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方法で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。

【0104】

本発明の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。

【0105】

本発明の培養により生産されたプリンヌクレオチドは、培地中に分泌されるか、または細胞内に残存してもよい。

【0106】

本発明のプリンヌクレオチド生産方法は、本発明の微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順は無関係、in any order）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。

【0107】

本発明のプリンヌクレオチド生産方法は、前記培養による培地（培養済み培地）または前記微生物からプリンヌクレオチドを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。

【0108】

前記回収は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて目的のプリンヌクレオチドを回収（collect）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から目的のプリンヌクレオチドを回収することができる。

【0109】

また、本発明のプリンヌクレオチド生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本発明のプリンヌクレオチド生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、もしくは同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。

【0110】

一例として、本発明におけるＧＭＰ生産方法は、ＸＭＰをＧＭＰに転換する段階をさらに含んでもよい。本発明のＧＭＰ生産方法において、前記転換する段階は、前記培養する段階または前記回収する段階の後にさらに含むことができる。前記転換する段階は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。例えば、前記転換は、コリネ型微生物、大腸菌または５’－キサンチル酸アミナーゼを用いて行うことができるが（KR 10-0655902 B1, US 2013-0095529 A1など）、これに限定されない。

【0111】

本発明の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、プリンヌクレオチドなどは、前記他の態様で記載した通りである。

【0112】

本発明のもう一つの態様は、本出願の変異体、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または本発明のポリヌクレオチドを含む微生物；これを培養した培地；あるいは、それらの組み合わせを含むプリンヌクレオチド生産用組成物を提供することである。

【0113】

本発明の組成物は、プリンヌクレオチド生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0114】

本発明の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、培地、プリンヌクレオチドなどは、前記他の態様で記載した通りである。

【0115】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体を発現するように微生物を変形する段階を含む、微生物のプリンヌクレオチド生産能を増加させる方法を提供することである。

【0116】

本発明の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、培地、プリンヌクレオチドなどは、前記他の態様で記載した通りである。

【0117】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体のプリンヌクレオチド生産における使用を提供する。

【0118】

本発明のもう一つの態様は、本発明の変異体、それをコードするポリヌクレオチド、またはそれを含むベクターを含む微生物のプリンヌクレオチド生産における使用を提供する。

【0119】

前記変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などは、他の態様で説明した通りである。

【0120】

以下、本発明を実施例及び実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例及び実験例は本出願を例示的に説明するためのことであり、本発明の範囲がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

【0121】

実施例１：ｇｕａＡ合成酵素弱化変異体の製造
ＸＭＰの生産のためのｇｕａＡ変異体を発掘するために、それをコードする遺伝子であるｇｕａＡの変異ライブラリーを作製した。

【0122】

実施例１－１．ｇｕａＡを含むベクターの作製
ｇｕａＡ変異ライブラリーを作製するために、まずｇｕａＡを含む組換えベクターを作製した。コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、これをｐＣＲ－ｇｕａＡと命名した。

【0123】

【表1】

【0124】

実施例１－２：ｇｕａＡ変異ライブラリーの作製
前記実施例１－１で作製したｐＣＲ－ｇｕａＡベクターを鋳型として、ｇｕａＡ変異ライブラリーを作製した。ライブラリーはｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（clontech DiversifyR PCR Random Mutagenesis Kit）を用い、配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いて製造社のマニュアル通りにランダムに突然変異を誘発させ、配列が互いに異なるｇｕａＡ変異ＰＣＲ産物を得た。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いてクローニングした後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。このように形質転換された大腸菌コロニーを採取してプラスミドを抽出し、これをｐＣＲ－ｇｕａＡ－ｌｉｂｒａｒｙと命名した。

【0125】

【表2】

【0126】

実施例１－３：作製したライブラリー評価及び菌株の選別
前記実施例１－２で作製したｐＣＲ－ｇｕａＡ－ｌｉｂｒａｒｙをコリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２野生型菌株にエレクトロポレーション法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株５，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）１からＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）５０００までと命名した。

【0127】

－ 栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス１％、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２（蒸留水１リットルを基準）

【0128】

確保された５，０００個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した後、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた種培地１００μｌに接種し、９６ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅでマイクロプレート振とう器（Microplate shaker (TAITEC)）を用いて３０℃の温度、１２００ｒｐｍで２４時間振とう培養し、種培養液として使用した。加圧滅菌した発酵培地３２０μｌ（本培地２４０μｌ＋別途殺菌培地８０μｌ）を９６ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分注した後、種培養液１５μｌずつ接種し、前記条件と同様に７２時間振とう培養した。

【0129】

培養液で生産されたＸＭＰの生産量を分析するために、培養終了後、培養液に滅菌水を６４０μｌを分注して４０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後、上層液３μｌを蒸留水２９７μｌが分注された９６ｗｅｌｌ ＵＶ－ｐｌａｔｅに移した。次に、マイクロプレートリーダー（Microplate reader）を用いて、３０秒間ｓｈａｋｉｎｇし、２５℃、波長２６０ｎｍでスペクトロフォトメーターで吸光度を測定し、野生型菌株比吸光度が増加した変異株１０個のコロニーを選別した。その他のコロニーは対照群に比べて類似または減少した吸光度を示した。

【0130】

選別された１０個の菌株は前記と同様の方法で吸光度の測定によるＸＭＰ生産量の確認を繰り返して行い、野生型菌株比ＸＭＰ生産能が著しく向上した菌株１種（C.st ATCC6872_pCR_guaA(mt)726）を選別した。

【0131】

最終選別された菌株の有効性を検証するために発酵力価の評価を行った。

【0132】

下記種培地２．５ｍｌを含有する１４ｍｌのチューブにコリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２野生型菌株及び前記選別されたＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）７２６菌株を接種し、３０℃で、２４時間１７０ｒｐｍで振とう培養した。下記の生産培地３２ｍｌ（本培地２４ｍｌ＋別途殺菌培地８ｍｌ）を含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに０．７ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７５時間１７０ｒｐｍで振とう培養した。

【0133】

前記種培地、本培地及び別途殺菌培地の組成は以下の通りである。

【0134】

＜ＸＭＰフラスコの種培地＞
グルコース３０ｇ／Ｌ、ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、尿素３ｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０（蒸留水１リットルを基準）

【0135】

＜ＸＭＰフラスコ生産培地（本培地）＞
グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．８ｍｇ、ヒスチジン２０ｍｇ／Ｌ、システイン１５ｍｇ／Ｌ、β－アラニン１５ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００ｕｇ／Ｌ、チアミン５ｍｇ／Ｌ、アデニン５０ｍｇ／Ｌ、グアニン２５ｍｇ／Ｌ、ナイアシン１５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０（蒸留水１リットルを基準）

【0136】

＜ＸＭＰフラスコ生産培地（別途滅菌培地）＞
リン酸第１カリウム１８ｇ／Ｌ、リン酸第２カリウム４２ｇ／Ｌ、尿素７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ（蒸留水１リットルを基準）

【0137】

培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定した結果は、下記表３の通りである。

【0138】

【表3】

【0139】

前記表３に示すように、野生型菌株比 Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）７２６においてＸＭＰ濃度が４．８３ｇ／Ｌ生成されることを確認した。

【0140】

実施例１－４：遺伝子シーケンシングを通じた変異の確認
前記Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）７２６菌株のｇｕａＡ変異体配列を確認するために、配列番号８及び配列番号９のプライマーを用いてＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）７２６菌株でＰＣＲ及び塩基配列の分析を行った。野生型菌株ｇｕａＡ遺伝子配列と比較した結果、Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２＿ｐＣＲ＿ｇｕａＡ（ｍｔ）７２６菌株ｇｕａＡ遺伝子の２９番目のアミノ酸がアルギニン（Arginine）からシステイン（Cysteine）に置換された変異（８５番目のヌクレオチドがｃからｔに置換：配列番号２）を含んでいることを確認した。

【0141】

前記確認された変異体配列は、下記表４の通りである。

【0142】

【表4】

【0143】

したがって、以下の実施例では、前記ｇｕａＡ変異がＸＭＰの生成に影響を及ぼすことを確認しようとした。

【0144】

実施例２：ｇｕａＡ変異体効果の確認
実施例２－１：ｇｕａＡ変異体の発現のためのベクターの作製
ｇｕａＡ酵素アミノ酸配列の２９番目の位置のアルギニンがシステインに置換された変異体（Ｒ２９Ｃ；配列番号１）がＸＭＰの生産に及ぼす影響を確認するために、その発現菌株の作製のためのベクターをコリネバクテリウム染色体内の遺伝子の挿入及び交換のためのプラスミドｐＤＣＭ２（大韓民国公開番号第１０－２０２０－０１３６８１３号）を用いて下記のように作製した。

【0145】

コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体を鋳型として配列番号１０及び配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間の重合反応を行い、それぞれのＰＣＲ産物を得た。前記増幅産物をあらかじめＳｍａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤＣＭ２ベクターと混合してギブソン・アッセンブリー（DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得、これをｐＤＣＭ２－ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）と命名した。クローニングは、ギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子フラグメントを計算したモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することにより行った。

【0146】

実施例２－２：ｇｕａＡ変異体発現菌株の作製
コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２菌株に前記実施例で作製したｐＤＣＭ２－ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）ベクターをエレクトロポレーション法で形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別された一次菌株は再び二次交差（cross-over）を経て、標的遺伝子の変異が導入された菌株を選別した。最終形質転換された菌株の遺伝子変異導入の有無は、配列番号１４及び配列番号１５のプライマー対を用いたＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて確認し、これをＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）と命名した。

【0147】

実施例２－３：ｇｕａＡ変異体発現菌株のＸＭＰ生産能の比較
前記実施例２－２で作製したＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株及び野生型菌株のＸＭＰ生産能を前記実施例１－３の発酵力価の評価方法を通じて確認した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いてＸＭＰの生産量を測定し、培養結果は下記表５の通りである。

【0148】

前記実験を３回繰り返し、その分析結果の平均値を下記表５に示した。

【0149】

【表5】

【0150】

前記表５と同様に、Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株でＸＭＰ濃度が５．２１ｇ／Ｌ生成することを確認した。

【0151】

前記Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株はＣＮ０２－２２９９と命名し、ブダペスト条約の下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２１年８月９日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１３０２９Ｐを付与された。

【0152】

実施例３：ｇｕａＡ変異のアミノ酸を他のアミノ酸で置換
実施例３－１：ｇｕａＡ変異アミノ酸置換挿入用ベクターの作製
前記実施例により、ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）変異によりＸＭＰを生産できる点を確認した。これに、ｇｕａＡ変異の位置的重要性を確認するために、２９番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するベクターを作製し、ＸＭＰ生産能に影響を及ぼすかを確認した。前記実施例２－１で作製したｐＤＣＭ２－ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）ベクターを鋳型として部位特異的突然変異（Site-directed mutagenesis）を行った。

【0153】

具体的には、配列番号１０及び配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号１８、配列番号１９及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号２２、配列番号２３及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号２４、配列番号２５及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号２６、配列番号２７及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号２８、配列番号２９及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号３０、配列番号３１及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号３２、配列番号３３及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号３４、配列番号３５及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号３６、配列番号３７及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号３８、配列番号３９及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号４０、配列番号４１及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号４２、配列番号４３及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号４４、配列番号４５及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号４６、配列番号４７及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号４８、配列番号４９及び配列番号１３のプライマー対、配列番号１０及び配列番号５０、配列番号５１及び配列番号１３のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、このとき、重合酵素はＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒間の変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行い、それぞれのＰＣＲ産物を得た。前記それぞれの増幅産物を予めＳｍａＩ制限酵素で切断し、準備したｐＤＣＭ２ベクターと混合し、ギブソン・アッセンブリー法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを取得し、このように取得したプラスミド情報は表６の通りである。クローニングは、ギブソン・アッセンブリー試薬と各遺伝子断片を計算したモル数で混合した後、５０℃で１時間保存することにより行った。

【0154】

【表6】

【0155】

実施例３－２：ｇｕａＡ変異体の変異が他のアミノ酸で置換された菌株の作製及びＸＭＰ生産能の比較
前記実施例３－１で製造した変異導入用ベクター１８種をそれぞれコリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２野生型菌株にエレクトロポレーション法で形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株が、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別された。選別された一次菌株は再び二次交差（cross-over）を経て、標的遺伝子に変異が導入された菌株を選別した。最終形質転換された菌株の遺伝子変異導入の有無は、配列番号１４及び配列番号１５のプライマー対を用いたＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて確認し、挿入された変異による菌株名は以下の表７の通りである。

【0156】

【表7】

【0157】

前記作製菌株とＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株及び野生型菌株を実施例１－３の発酵力価の評価方法で培養してＸＭＰの濃度を分析した。実験は３回繰り返し、その分析結果の平均値を下記表８に示した。

【0158】

【表8】

【0159】

前記表８を参照すると、ｇｕａＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の２９番目のアミノ酸がアルギニンではない、他のアミノ酸で置換されたｇｕａＡを含む菌株の場合、野生型菌株比ＸＭＰを生成することを確認することができた。すなわち、ｇｕａＡ遺伝子をコードするアミノ酸配列の２９番目のアミノ酸は、ＸＭＰの生産において主要な変異位置であり、より具体的には、前記ｇｕａＡ遺伝子がコードするアミノ酸配列の２９番目のアミノ酸がアルギニンではなく他のアミノ酸（システイン、グリシン、フェニルアラニン、セリン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、プロリン、スレオニン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、リジン及びグルタミン酸）で置換された場合、これを含む微生物のＸＭＰ生産量が大幅に増加され得ることを確認した。

【0160】

これにより、ｇｕａＡの２９番目のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された変異体がプリンヌクレオチドの生産に有用に使用できることが分かる。

【0161】

実施例４：ｇｕａＡ変異体発現菌株のＧＭＰ生産能の確認
ＸＭＰ生産菌株である Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）のＸＭＰ培養液を用いて下記の方法でＧＭＰ生産を確認した（韓国特許特許ＫＲ １０－０６５５９０２ Ｂ１、米国特許公開番号ＵＳ ２０１３－００９５５２９ Ａ１を参照） 。

【0162】

実施例１－３の発酵力価の評価方法でＣ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株を培養した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＸＭＰの生産量を測定した。生成されたＸＭＰをＧＭＰに転換反応を行うために、前記三角フラスコ発酵液に下記の転換反応添加物と大腸菌のＸＭＰアミナーゼ（XMP aminase）を加え、４０℃で２．５時間転換反応を行った。

【0163】

＜転換反応添加物＞
フィチン酸（phytic acid）１．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム４．８ｇ／Ｌ、ナイミーン（nymeen）３ｍｌ／Ｌ、キシレン（xylene）２％、アデニン１００ｍｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）７．７ｇ／Ｌ、グルタミン２ｇ／Ｌ、グルコース４６ｇ／Ｌ

【0164】

前記実験を行った結果、ＸＭＰ消費量に対するＧＭＰの生成量を意味する転換率の結果を表９に示す。

【0165】

【表9】

【0166】

前記表９に示すように、Ｃ．ｓｔ ＡＴＣＣ６８７２：：ｇｕａＡ（Ｒ２９Ｃ）菌株により生成されたＸＭＰから転換反応を通じてＧＭＰが３．５４ｇ／Ｌ生成されることを確認した。

【0167】

これにより、ｇｕａＡの２９番目のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された変異体がＧＭＰ生産を増加させることを確認したところ、本発明で提供する変異体がプリンヌクレオチドの生産に有用に使用できることが分かる。

【0168】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【配列表】

2023545878000001.app

【国際調査報告】