特表 2023-545893 ヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞及び応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-01

(54)【発明の名称】ヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞及び応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231025BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231025BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20231025BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231025BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K16/30

C07K19/00

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/15

A61K35/17

A61P35/00

A61K38/17

A61K39/395 N

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023509649

(86)(22)【出願日】2021-07-13

(85)【翻訳文提出日】2023-02-09

(86)【国際出願番号】 CN2021106097

(87)【国際公開番号】W WO2022037323

(87)【国際公開日】2022-02-24

(31)【優先権主張番号】202010836034.X

(32)【優先日】2020-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523045825

【氏名又は名称】▲蘇▼州易慕峰生物科技有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001896

【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】沈 青山

(72)【発明者】

【氏名】▲刑▼ ▲凱▼旋

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084CA53

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZB261

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB50

4C085CC05

4C085DD62

4C085GG02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB42

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合されるヒト化抗体を提供する。本発明は、さらにヒト化抗体に関連するキメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞及び応用を提供する。本発明により提供されるヒト化抗体において、前記重鎖可変領域配列は配列番号１に示される配列、配列番号２に示される配列、及び配列番号３に示される配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、及び配列番号６に示される配列を含む。ＥｐＣＡＭに特異的に結合されるヒト化抗体は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞として構築された後、ＥｐＣＡＭ陽性の腫瘍細胞を特異的に認識して殺傷することが可能であり、且つ、動物体内の腫瘍を排除することが可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域配列は、それぞれ第１重鎖相補性決定領域の配列、第２重鎖相補性決定領域の配列、第３重鎖の相補性決定領域の配列として、配列番号１に示される配列、配列番号２に示される配列及び配列番号３に示される配列を含み、
前記軽鎖可変領域配列は、それぞれ第１軽鎖相補性決定領域の配列、第２軽鎖相補性決定領域の配列及び第３軽鎖相補性決定領域の配列として、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列及び配列番号６に示される配列を含む、ことを特徴とするヒト化抗体。

【請求項2】

前記重鎖可変領域配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のいずれかと少なくとも９０％同一であり、
前記軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のいずれかと少なくとも９０％同一である、ことを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。

【請求項3】

細胞外抗原結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、
前記細胞外抗原結合領域は、請求項１～２のいずれか一項に記載のヒト化抗体或いは前記ヒト化抗体のフラグメントを含む、ことを特徴とするキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記ヒンジ領域の配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＩｇＧの少なくとも１つに由来し、
前記膜貫通領域の配列は、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ３ζ及びＣＤ３εの少なくとも１つに由来し、
前記細胞内シグナル領域の配列は、Ｔｏｌｌ様受容体、及びＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３εの少なくとも１つに由来する、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記キメラ抗原受容体の配列は、配列番号１８～２９に示されるいずれかの配列から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

請求項１～２のいずれか一項に記載のヒト化抗体をコードする抗体配列または配列フラグメントを含む、ことを特徴とする核酸。

【請求項7】

請求項３～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列または配列フラグメントを含む、ことを特徴とする核酸。

【請求項8】

請求項６～７に記載の核酸を含む、ことを特徴とするベクター。

【請求項9】

請求項６～７に記載の核酸または請求項８に記載のベクターを含む、ことを特徴とする細胞。

【請求項10】

前記生物学的産物は、ヒト腫瘍を検出するための試薬の調製、またはヒト腫瘍を治療するための薬剤の調製に応用され、
前記生物学的産物は、請求項１～２のいずれか一項に記載のヒト化抗体、請求項３～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６～７のいずれか一項に記載の核酸、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の細胞である、ことを特徴とする生物学的産物の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の技術分野に関し、特にヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞及び応用に関する。

【背景技術】

【0002】

抗腫瘍免疫療法のポイントは、選択された抗体が腫瘍部位に高発現する抗原を選択的に認識できることにある。上皮細胞接着分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule、ＥｐＣＡＭ）は、ヒト食道癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎癌、肝細胞癌、膵臓癌などの上皮性腫瘍に関連する主な表面抗原であり、さまざまなヒト上皮腫瘍細胞及びその前駆細胞及び幹細胞に高度に発現する可能性があるため、抗腫瘍免疫療法の重要な標的となる可能性がある。

【0003】

今のところ、マウス源抗体は依然として免疫治療薬の重要な供給源であるが、マウス源抗体はヒトに免疫原性を有し、人体で異種タンパク質として除去されやすく、治療の有効性を弱めるため、マウス源抗体に対してヒト化改造を行うことにより、ヒト免疫系の識別を回避し、ヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibody、ＨＡＭＡ）応答の誘導を回避する必要がある。

【0004】

従って、従来技術に存在する上記問題を回避するために、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するヒト化抗体及びその応用を設計する必要がある。

【発明の概要】

【0005】

本発明の目的は、ヒト化抗体、前記ヒト化抗体を含むキメラ抗原受容体、前記ヒト化抗体及びキメラ抗原受容体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び細胞を提供することにある。該抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター及び細胞は、ヒトＥｐＣＡＭ陽性腫瘍を治療するための薬剤、及びヒトＥｐＣＡＭ陽性腫瘍を検出するための試薬の調製に適用することができる。

【0006】

上記目的を達成するために、本発明の前記ヒト化抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域配列は、それぞれ第１重鎖相補性決定領域の配列、第２重鎖相補性決定領域の配列及び第３重鎖相補性決定領域の配列とする配列番号１に示される配列、配列番号２に示される配列、配列番号３に示される配列を含み、前記軽鎖可変領域配列は、それぞれ第１軽鎖相補性決定領域の配列、第２軽鎖相補性決定領域の配列及び第３軽鎖相補性決定領域の配列とする配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、配列番号６に示される配列を含む。

【0007】

いくつかの好ましい例では、前記重鎖可変領域の配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１のいずれかと少なくとも９０％同一であり、前記軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のいずれかと少なくとも９０％同一である。

【0008】

いくつかの好ましい例では、前述したＥｐＣＡＭを特異的に認識する抗体は、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びその誘導体、又は他の形態の抗体であってもよい。

【0009】

いくつかの好ましい例では、前述したＥｐＣＡＭを特異的に認識する抗体はヒト化抗体であってもよい。

【0010】

いくつかの好ましい例において、前記ヒト化抗体は全長抗体であり、サブタイプはｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３及びｈＩｇＧ４のいずれかの一つである。

【0011】

いくつかの実施例では、前記第１重鎖相補性決定領域と第２重鎖相補性決定領域との間、前記第２重鎖相補性決定領域と第３重鎖相補性決定領域との間、及び前記第３重鎖相補性決定領域は、それぞれ第１重鎖フレームワーク領域、第２重鎖フレームワーク領域及び第３重鎖フレームワーク領域に結合される。

【0012】

いくつかの実施例では、前記第１軽鎖相補性決定領域と第２軽鎖相補性決定領域との間、前記第２軽鎖相補性決定領域と第３軽鎖相補性決定領域との間、及び前記第３軽鎖相補性決定領域は、それぞれ第１軽鎖フレームワーク領域、第２軽鎖フレームワーク領域、及び第３軽鎖フレームワーク領域に結合される。

【0013】

本発明の核酸は、ヒト化抗体をコードする抗体配列又は配列フラグメント、及び前記キメラ抗原受容体のヌクレオチド配列又は配列フラグメントを含む。

【0014】

本発明のベクターは、核酸を含む。

【0015】

本発明の細胞は、前記核酸又は前記ベクターを含む。

【0016】

本発明は、ヒト腫瘍検出用の試薬の調製における、前記ヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター及び細胞のいずれか1つの応用を提供する。

【0017】

本発明は、ヒト腫瘍治療用の医薬の調製における、前記ヒト化抗体、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター及び細胞のいずれか１つの応用を提供する。例えば、抗ヒトＥｐＣＡＭモノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体結合薬物（ＡＤＣ）等の薬物の調製における応用である。

【0018】

本発明の前記キメラ抗原受容体の細胞外抗原結合領域は、前記ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含む。

【0019】

好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、さらにシグナルペプチドを含み、前記シグナルペプチドの配列は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８α及びＣＤ２８の少なくとも１つに由来する。

【0020】

好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、さらにヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域の配列はＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＩｇＧの少なくとも１つに由来する。

【0021】

好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、さらに膜貫通領域を含み、前記膜貫通領域の配列はＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ３の少なくとも１つに由来する。

【0022】

好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、さらに細胞内シグナル領域を含み、前記細胞内シグナル領域の配列はＴｏｌｌ様受容体と、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζ及びＣＤ３εなどの少なくとも一つに由来する。

【0023】

いくつかの実施例では、前記細胞内シグナル領域の配列はＣＤ１１ａに由来する。

【0024】

いくつかの実施例では、前記細胞内シグナル領域の配列はＣＤ１８に由来する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ｍＨｍＬ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３とＳＷ４８０との結合性能曲線である。

【図2】図２は、Ｈ１Ｌ４及びＨ１Ｌ３とＳＷ４８０との結合性能曲線である。

【図3】図３は、ｍＨｍＬ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３とＨＣＴ１１６との結合性能曲線である。

【図4】図４は、Ｈ１Ｌ４及びＨ１Ｌ３とＨＣＴ１１６との結合性能曲線である。

【図5】図５は、ＥｐＣＡＭを標的とするキメラ抗原受容体の概略構造図である。

【図6】図６は、参照サンプル及びＣＡＲ－Ｔのフロー解析結果の比較図である。

【図7】図７は、ＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９及びＭＩＡＰａＣＡ－２のＥｐＣＡＭ発現レベルの比較図である。

【図8】図８は、異なるエフェクター細胞対標的細胞比（ＥＴ比）の下での異なる腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ及び参照Ｔ細胞ｕｎＴの殺傷効率の比較図である。

【図9】図９は、ＣＡＲ－Ｔ及び参照Ｔ細胞ｕｎＴと異なる腫瘍細胞との相互作用後のＩＦＮ－γ放出量との比較図である。

【図10】図１０は、実験時間内における各群のマウスの平均腫瘍体積変化の比較図である。

【図11】図１１は、実験時間内における各群のマウスの平均体重変化の比較図である。

【図12】図１２は、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３群におけるマウスの組織解剖の検出結果である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明の実施例の目的、技術的解決方法、及び利点をより明確にするために、以下で、本発明の実施例における技術的解決方法を明確かつ完全に説明する。説明される実施例は、本発明の一部の実施形態であり、全ての実施形態ではないことは明らかである。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な労働を行うことなく得られる他の全ての実施形態は、全て本発明の保護範囲に属する。特に定義されない限り、本明細書に記載される技術的用語または科学的用語は、当業者によって理解される通常の意味を有するものとする。本明細書に記載される「含む」等の類義語は、該単語の前に現れる要素または項目が、該単語の後にリストされる要素または項目、及びそれらの等価物をカバーすることを意味するものであり、他の要素または項目を排除するものではない。

【0027】

本発明に記載される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じまたは類似の意味を有する。本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下のように定義する：

【0028】

本発明における「抗体」とは、免疫系の抗原結合タンパク質を意味し、抗原結合領域を有する完全な全長抗体、及びそのうち「抗原結合部分」又は「抗原結合領域」に保持されるその任意のフラグメント、又は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）等のその単鎖を含む。天然抗体とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖又はその抗原結合フラグメントを含む糖タンパク質を意味する。「抗体」は、さらに原核細胞で発現される抗体、非グリコシル化抗体、及び抗原に結合される抗体フラグメント及び誘導体等の抗体（特に本明細書で説明する抗体）の全ての組換え形態を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略記）及び重鎖定常領域（ＣＨと略記）により構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略記）及び軽鎖定常領域（ＣＬと略記）により構成される。ＶＨ及びＶＬは、さらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分化することが可能であり、それらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保守的な領域に散在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲにより構成され、アミノ末端からカルボキシル末端の方向で、次の順位で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、該免疫グロブリンと宿主組織又は因子との結合を媒介することが可能であり、前記宿主組織又は因子は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む。

【0029】

抗体フラグメントは以下を含むが、これらに限定されない：
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインにより構成されるＦａｂフラグメント（Ｆａｂ’及びＦａｂ’－ＳＨを含む）、（ii）ＶＨ及びＣＨ１ドメインにより構成されるＦｄフラグメント、（iii）モノクローナル抗体のＶＬ及びＶＨドメインにより構成されるＦｖフラグメント、（iv）単一の可変領域により構成されるｄＡｂフラグメント、（v）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、（vi）単鎖Ｆｖ分子抗原結合部位、（vii）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、（viii）「二量体」又は「三量体」（遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性フラグメント）、及び（ix）同一又は異なる抗体に遺伝的に融合されるｓｃＦｖ。

【0030】

本発明における用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」には、第１定常領域免疫グロブリンドメイン以外の抗体定常領域を含むポリペプチドが含まれる。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含むことが可能である。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３、及びＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般的に、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０が含まれると定義され、そのうち、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。ヒトＩｇＧ１の場合、本明細書ではＦｃは、残基Ｐ２３２からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、そのうち、番号付けはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。Ｆｃは、分離された該領域意味する場合もあれば、抗体等のＦｃポリペプチド、環境中の領域を意味する場合もある。上記「ヒンジ」は、抗体の第１定常ドメインと第２定常ドメインとの間に含まれるアミノ酸の柔軟なポリペプチドを含む。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ２３７で始まる。

【0031】

本発明における「置換により得られる変異配列」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを意味する。本発明における「置換または欠失により得られる変異配列」中の「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸が欠失することを意味する。

【0032】

本発明における「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、抗原に結合することができる細胞外抗原結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、細胞内シグナル領域とは、決定されたシグナル伝達経路を介して、第２メッセンジャーを生成することにより情報を細胞に伝達して細胞活性を調節するタンパク質、又はそのようなメッセンジャーに対応することによりエフェクターとして機能するタンパク質を意味し、一次シグナル伝達ドメインを含み、さらに以下に定義される刺激分子に由来する機能シグナル伝達ドメイン（即ち、共刺激シグナル伝達ドメイン）を含むことができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進できるシグナルを生成し、免疫エフェクター機能の例として挙げられるのは、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞には、サイトカイン分泌を含む細胞溶解活性及び補助活性が含まれる。

【0033】

「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、「共刺激分子」、即ちＴ細胞上の関連結合性リガンドを意味し、共刺激リガンドに特異的結合することにより、増殖であるが、これに限定されないＴ細胞の共刺激応答を媒介する。共刺激分子は、有効な免疫応答に必要な非抗原受容体の細胞表面分子又はそのリガンドである。共刺激分子には、Ｔｏｌｌ様受容体、及びＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζ及びＣＤ３ε等が含まれるが、これらに限定されない。

【0034】

本発明において：
「ＣＤ３ζ」は、ＧｅｎＢａｎアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１によって提供されるタンパク質、又はマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基として定義される。「ＣＤ３ζドメイン」は、ζ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義され、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分である。一態様では、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６３、その機能的ポインティングホモログ（マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基）を含む。

【0035】

「ＣＤ２８」は、ＧｅｎＢａｎアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１によって提供されるタンパク質、又はマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基として定義される。「ＣＤ２８シグナル領域」は、ＣＤ２８の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義され、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを伝達することができる。その配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１の残基１８０～２２０、その機能的ポインティングホモログ（マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基）を含む。「ＣＤ２８ヒンジ領域」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１の残基１１４～１５２、その機能的ポインティングホモログ（マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基）を含む。「ＣＤ２８ヒンジ膜貫通領域」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１の残基１５３～１７９、その機能的ポインティングホモログ（マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基）を含む。

【0036】

「４－１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１５５２．２のアミノ酸配列、又はマウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを意味する。「４－１ＢＢシグナル領域」は、４－１ＢＢの細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義され、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを伝達することができる。その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６１３０．１の残基２１４～２５５、その機能的ポインティングホモログ（マウス、げっ歯類動物、サル、類人猿等の非ヒト種由来の同等の残基）を含む。

【0037】

本発明の実施例に記載のＥｐＣＡＭは、上皮細胞接着分子である。前記ヒト化抗体は、関連する腫瘍で発現するＥｐＣＡＭに特異的に結合する。前記関連する腫瘍には、上皮性腫瘍が含まれ、具体的には食道癌、胃癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、腎癌、肝細胞癌及び膵臓癌が含まれる。

【0038】

本発明の実施例において、前記ヒト化抗体はヒト化全長抗体であり、サブタイプはｈＩｇＧ１である。

【0039】

いくつかの実施例において、前記ヒト化抗体は単鎖抗体であり、サブタイプはｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３及びｈＩｇＧ４のいずれか１つである。

【0040】

いくつかの実施例において、前記重鎖可変領域配列は、配列番号１に示される配列、配列番号２に示される配列、及び配列番号３に示される配列を含み、それぞれＣＤＲ－Ｈ１の配列、ＣＤＲ－Ｈ２の配列及びＣＤＲ－Ｈ３の配列として示され、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３はそれぞれ第１重鎖相補性決定領域、第２重鎖相補性決定領域及び第３重鎖相補性決定領域である。

【0041】

いくつかの実施例において、ＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２との間の第１重鎖フレームワーク領域の配列は、QVQLVQSGAEVKKPGX6SVKVSCKASGX7TFX8であり、そのうち、Ｘ６はＡ及びＳのいずれか１つであり、Ｘ７はＹ及びＧのいずれか１つであり、Ｘ８はＴ及びＳのいずれか１つである。

【0042】

いくつかの実施例において、ＣＤＲ－Ｈ２とＣＤＲ－Ｈ３との間の第２重鎖フレームワーク領域の配列は、WVRQAPGQGLEWMG及びWVRQAPGQGLEWIGのいずれか１つである。

【0043】

いくつかの実施例において、ＣＤＲ－Ｈ３に連結された第３重鎖フレームワーク領域の配列は、X9VTX10TX11DX12STSTX13YMELSSLRSEDTAVYYCARであり、Ｘ９はＲ及びＫのいずれか１つであり、Ｘ１０はＭ、Ｌ及びＩのいずれか１つであり、Ｘ１１はＲ、Ｔ、Ａ及びＶのいずれか１つであり、Ｘ１２はＴ及びＥのいずれか１つであり、Ｘ１３はＶ及びＡのいずれか１つである。

【0044】

いくつかの実施例において、前記軽鎖可変領域配列は、配列番号４に示される配列、配列番号５に示される配列、及び配列番号６に示される配列を含み、それぞれＣＤＲ－Ｌ１の配列、ＣＤＲ－Ｌ２の配列及びＣＤＲ－Ｌ３の配列として示され、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３は、順に第１軽鎖相補性決定領域、第２軽鎖相補性決定領域、及び第３軽鎖相補性決定領域である。

【0045】

本発明の実施例は、さらにＥｐＣＡＭを特異的に標的とするキメラ抗原受容体を提供し、前記キメラ抗原受容体の抗原結合領域は、前記ヒト化抗体又はヒト化抗体のフラグメントを含む。

【0046】

好ましくは、いくつかの実施例において、前記ＥｐＣＡＭを標的とする抗体フラグメントは単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）であり、前記単鎖可変領域の構造はＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ又はＶＬ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨであり、前記Ｌｉｎｋｅｒアミノ酸配列は配列番号３０に示されたように、GGGGSGGGGSGGGGSである。

【0047】

いくつかの実施例において、前記キメラ抗原受容体は、さらにヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域の配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＩｇＧの少なくとも１つに由来する。

【0048】

いくつかの実施例において、前記キメラ抗原受容体は、さらに膜貫通領域を含み、前記膜貫通領域の配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ３の少なくとも１つに由来する。

【0049】

いくつかの実施例において、前記キメラ抗原受容体は、さらに細胞内シグナル領域を含み、前記細胞内シグナル領域の配列は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζ及びＣＤ３εの少なくとも１つに由来する。

【0050】

好ましくは、前記ＣＡＲ分子配列は以下の表に示されるとおりである：

【0051】

【表1】

【0052】

本発明の実施例は、関連する腫瘍に高度に発現されるＥｐＣＡＭ抗原を特異的に標的とすることを含む、前記キメラ抗原受容体の応用をさらに提供する。

【0053】

本発明の実施例は、前記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸をさらに提供する。

【0054】

本発明の実施例は、前記核酸を含むベクターをさらに提供する。

【0055】

本発明の実施例は、前記ベクターを含む細胞をさらに提供する。

【0056】

〈実施例１．ヒト化抗体の設計〉
本実施例は、以下のステップを含む前記ヒト化抗体の設計方法を提供する：
Ｓ１：配列番号１６に示されるマウス抗体ＶＨ配列、配列番号１７に示されるマウス抗体ＶＬ配列を得る。
Ｓ２：マウス抗体配列とヒト抗体データベースとを照合して、相同性の最も高いヒト抗体生殖系列を見つける。
Ｓ３：コンピューターモデリングを行い、抗原との結合に影響を与える可能性のある抗体構造内の部位、復帰突然変異キー部位及び組み合わせをシミュレートし、最適な構造解を選別する。

【0057】

そのうち、ＶＨ設計は、相同性の最も高いＩＧＨＶ１をヒト化設計テンプレートとして選択し、ＶＬ設計は、優先的にＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ３、及びＩＧＫＶ４をヒト化設計テンプレートとして選択する。一般的なペアリング方法はＩＧＨＶ１－ＫＶ１、ＩＧＨＶ１－ＫＶ３である。

【0058】

そのうち、それぞれDiscovery Studio及びSchroedinger Antibody Modelingを使用して、相同性モデリング手法によって５～１０個の最適な構造ソリューションを選択する。

【0059】

具体的には、Ｌｏｏｐ領域は、一般的に相同性モデリング法を用いてモデリングされる。例えば、ＣＤＲアミノ酸配列の比較結果、相同性が５０％未満を示す場合、ＤＥ ＮＯＶＯモデリング法を用いてＣＤＲ３構造モデルを構築する。ＰＤＢ ＢＬＡＳＴを用いて、配列の最も近い１０個の構造解像度が２．５オングストローム以上の抗体結晶構造モデルを取得し、自動モデリングモデルと比較して、最適な構造モデルを選択する。

【0060】

上記ヒト化抗体のいくつかのペアをヒト生殖系列配列と比較して、得られたヒト化率及び復帰突然変異部位の数については表２を参照されたい。

【0061】

【表2】

【0062】

〈実施例２．ヒト化抗体の発現、精製及びＥｐＣＡＭの特異的結合力の検出〉
本実施例において、前記ヒト化抗体の応用は、ｐＣＤＮＡ３．４ベクター及びＥｘｐｉＣＨＯ－ｓ発現系を用いて前記ヒト化抗体を発現させることを含む。

【0063】

さらに、配列番号７～１１の各配列をそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターにクローニングしていくつかの重鎖遺伝子発現ベクターを取得し、配列番号１２～１５の各配列をそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターにクローニングしていくつかの軽鎖遺伝子発現ベクターを取得し、次いで前記いくつかの重鎖遺伝子発現ベクター及び前記いくつかの軽鎖遺伝子発現ベクターをペアリングした後、それぞれＥｘｐｉＣＨＯ－ｓ発現系によってトランスフェクトして、それぞれＨ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、及びＨ１Ｌ３として示されるいくつかの組換え抗体を得る。ｍＨｍＬはＥｐＣＡＭ抗体の配列である。具体的なクローニング及びトランスフェクションプロセスは、当業者の通常の技術的手段であり、ここでは詳述しない。

【0064】

さらに、本発明は、空のプローブ、ｍＨｍＬ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、及びＨ１Ｌ３とＨｕｍａｎ－ＥｐＣＡＭ－Ｐｒｏｔｅｔｉｎ－Ｈｉｓとの結合解離曲線をそれぞれ測定した。具体的な測定方法は以下のとおりである：Ｔｗｅｅｎ ２０をＰＢＳ緩衝液に溶解して得られた０．０２５％濃度のＰＢＳＴ緩衝液を用いて、各組換え抗体を５０ｎＭの濃度に希釈し、Ｈｕｍａｎ－ＥｐＣＡＭ－Ｐｒｏｔｅｔｉｎ－Ｈｉｓを５００ｎＭ～３１．３ｎＭの濃度勾配で希釈し、プロテインＡをバイオセンサーに結合させ、上記ＰＢＳＴ緩衝液で１０分間活性化し、ローディング時間は１２０秒、結合時間は３００秒、解離時間は３００秒とする。結果は親和定数ＫＤ値として表３に示す。表３に示すように、組換え抗体とＥｐＣＡＭ抗原との親和定数は、１．０×１０^-8ｍｏｌ～１０^-10ｍｏｌである。

【0065】

【表3】

【0066】

本実施例は、さらにフローサイトメトリー蛍光ソーティング法によって、ヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６及び結腸癌ＲＫＯ細胞に対する組換え抗体の結合活性を調べてみた。その結果、各組換え抗体は、ＲＫＯ細胞への結合は弱いが、ヒト結腸癌細胞ＳＷ４６０及びヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６への結合活性は良好であることが示された。

【0067】

具体的には、各フローチューブ内の細胞数は１×１０⁵であり、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を遠心分離洗浄する；再懸濁後、各フローチューブに１００μｌのＦＡＣＳ希釈液を加え、４℃で６０分間インキュベートする；ＦＡＣＳ緩衝液を用いて５回の遠心分離洗浄を行った後、各フローチューブに１００μｌのフルオレセインＦＩＴＣ及びＦｃγ受容体を添加した後、４℃で３０分間インキュベートする；最後に、ＦＡＣＳ希釈液を用いて遠心分離洗浄を行った後、ＦＡＣＳ希釈液を用いて細胞を再懸濁し、テストに使用して、図１に示すｍＨｍＬ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３とＳＷ４８０との結合性能曲線、及び図２に示すＨ１Ｌ４、Ｈ１Ｌ３とＳＷ４８０との結合性能曲線、図３に示すｍＨｍＬ、Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ１、Ｈ３Ｌ１、Ｈ３Ｌ２、Ｈ４Ｌ１、Ｈ５Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３とＨＣＴ１１６との結合性能曲線、及び図４に示すＨ１Ｌ４、Ｈ１Ｌ３とＨＣＴ１１６との結合性能曲線を得た。図１～４の統計によって、表３に示すＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６における各組換え抗体のＥＣ５０値を得た。その結果、表４に示すように、ＥｐＣＡＭに結合する各ヒト化抗体のＥＣ５０は、元の抗体ｍＨｍＬと類似し、ヒト化形質転換が抗体親和性に有意な影響を与えていないことを示している。

【0068】

【表4】

【0069】

〈実施例３．ＥｐＣＡＭを標的とするＣＡＲ分子設計、レンチウイルスパッケージング〉
本実施例は、さらにＥｐＣＡＭを標的とするキメラ抗原受容体（ＥｐＣＡＭ－ＣＡＲと略す）を提供し、その構造は図５に示すとおりであり、シグナルペプチド、抗原結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0070】

具体的には、ＥｐＣＡＭ－ＣＡＲの配列は、配列番号１９に示すとおりであり、配列番号１９を参照されたい。

【0071】

ＧＭ－ＣＳＦシグナルペプチドの配列は、MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPである。

【0072】

ヒト化抗体のＶＨ配列は以下のとおりである：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSYIYTNYNQEFKDKVTLTVDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSPYGYDEYGLDYWGQGTTVTVSS。

【0073】

Ｇ４Ｓ ｘ３リンカー領域の配列は、GGGGSGGGGSGGGGSである。

【0074】

ヒト化抗体のＶＬ配列は以下のとおりである：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSLLNTRNQKNYLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYVYPLTFGQGTKLEIK。

【0075】

ＣＤ２８のヒンジ領域の配列は以下のとおりである：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP。

【0076】

ＣＤ２８膜貫通領域の配列は、FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWである。

【0077】

ＣＤ２８共刺激シグナル領域の配列は以下のとおりである：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS。

【0078】

ＣＤ３ζ共刺激シグナル領域の配列は以下のとおりである：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

【0079】

本発明の実施例において、ＥｐＣＡＭ－ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクタープラスミドはレンチウイルスにパッケージ化され、ＥｐＣＡＭ－ＣＡＲ及び第３世代レンチウイルスベクターの主鎖により構成されるＣＡＲプラスミドは和元生物技術（上海）株式会社から提供される。

【0080】

具体的なパッケージ化方法は以下のとおりである：
Ｔ７５培養フラスコに２９３Ｔ細胞を接種し、コンフルエンスが約７０％～８０％になるまで培養した後、等量の液体交換を行い、トランスフェクトするサンプルを取得する。そのうち、培養フラスコ内のコントロール細胞数は５ｘ１０⁶であり、培養量は２０ｍｌである；
２ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ及び５５μｌのＬｉｐｏ３０００を用いてチューブＡ溶液を構成し、２ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ、４６μｌのＰ３０００、１８μｇのヘルパープラスミド及び６μｇのＥｐＣＡＭ－ＣＡＲメインプラスミドを用いてチューブＢ溶液を構成する；
チューブＡとチューブＢとを混合し、室温で１５分間インキュベートした後、前記トランスフェクトするサンプルを加え、４８時間インキュベートする；
トランスフェクションの４８時間後、上清液を回収し、５００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を遠心チューブにろ過して密封し、１００００ｇ、４℃で一晩遠心分離して白色ウイルス沈殿物を取得し、白色ウイルス沈殿物を抽出し且つＡＩＭ－Ｖ培地２００μｌで溶解した後、２μｌを採取し、以下の手順に従って力価を測定し、残りは－８０℃で保存する。

【0081】

再懸濁したウイルス上清液２ｕｌを１９８ｕｌの１６４０培地に加えてウイルスを希釈した後、２４ウェルプレートの合計３ウェルに、１ウェルあたり２ｘ１０⁵ずつそれぞれ希釈したウイルス２ｕｌ、１０ｕｌ、５０ｕｌを添加し、最終濃度５ｕｌ／ｍｌのヘルパーウイルスを加えて４８時間感染させてレンチウイルスを得る。ウイルス感染終了後、ＥｐＣＡＭ－ＦＩＴＣ標識抗原を用いてウイルス力価を検出したところ、力価は２．５Ｅ＋０７～１．２Ｅ＋０８の間であった。

【0082】

〈実施例４．ＥｐＣＡＭを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の構築〉
本発明の実施例では、上記レンチウイルスを用いてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を感染させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔと略す）を構築した。具体的なプロセスは以下のとおりである：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＡＩＭ－Ｖ培地、５％のウシ胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍＬ、及び３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で構成された培地によって培養される；ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ社のＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８のＴ細胞活性化／増殖キットを用いてＴ細胞を活性化する。即ち、コーティングされた磁気ビーズは細胞と１：２の比率で混合され、最終的な細胞密度は５×１０⁶個／ｍＬ／ｃｍ²になり、混合後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、４８時間培養し、刺激する；Ｔａｋａｒａ社のレトロネクチンを２０μｇ／ｍｌに希釈し、培養プレート（非組織培養処理）にコーティングし、コーティング溶液４μｇ／ｃｍ２を、４℃の冷蔵庫に一晩入れる。Ｔ細胞活性化の４８時間後、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、Ｔ細胞を新鮮な培地で再懸濁し、Ｔａｋａｒａ社のレトロネクチンでコーティングされたプレートに移し、上記レンチウイルスを添加し、且つＭＯＩ＝５にコントロールし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する；同時に、リファレンスサンプルとして、レンチウイルス無添加のＴ細胞（ｕｎＴと略す）を調製する；レンチウイルス添加２４時間後、３００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、培地によりＴ細胞を懸濁し、ＣＡＲ－Ｔを得る。

【0083】

さらに、レンチウイルス添加４８時間後、サンプルを採取し、フローサイトメトリーにより形質導入率を検出し、ＥｐＣＡＭタンパク質を一次抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社の抗ＥｐＣＡＭ－ＦＩＴＣを二次抗体として用いて、図６に示す非形質導入Ｔ細胞（ｕｎＴ）とＣＡＲ－Ｔとのフローサイトメトリー解析結果の比較図を取得し、これはＣＡＲがＣＡＲ－Ｔ上で正常に発現されたことを示している。

【0084】

〈実施例５．ＥｐＣＡＭを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ標的細胞殺傷性能検証〉
本発明の実施例では、異なるＥｐＣＡＭ発現条件を有する腫瘍細胞株を選択して、ＣＡＲ－Ｔのインビトロ殺傷性能を調査した。図７は、ＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９、及びＭＩＡＰａＣＡ－２のＥｐＣＡＭ発現レベルの比較図である。図７に示すように、異なるＥｐＣＡＭ発現レベルを有する腫瘍細胞株はそれぞれ以下のとおりである：ＥｐＣＡＭを陽性に発現する細胞株はＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ及びＡ５４９であり、ＥｐＣＡＭを陰性に発現する細胞株はＭＩＡＰａＣＡ－２である。

【0085】

本発明の実施例は、ＣＡＲ－ＴのＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９及びＭＩＡＰａＣＡ－２に対するインビトロ殺傷を調査した。

【0086】

具体的には、９６ウェルプレートに、調製したＣＡＲ－Ｔ及び参照Ｔ細胞ｕｎＴを、異なるエフェクター細胞対標的細胞比に従って、それぞれ１×１０⁴個の腫瘍細胞と混合培養し、各群に３つの複製ウェルを設定し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで共培養する；２４時間後、ＨＣＴ１１６－ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９、ＭＩＡＰａＣＡ－２について、ＳＩＧＭＡ社のＬＤＨキットによって、標的細胞のＬＤＨの放出を検出して、殺傷効率を取得する。同時に、最高のエフェクター細胞対標的細胞比に相対する共培養ウェルの上清を取り、ＣＩＳＢＩＯ社のＨＴＲＦキットによって、ＩＦＮ－γの量を検出する。

【0087】

図８は、異なるエフェクター細胞対標的細胞比（ＥＴ比）の下での異なる腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ及び参照Ｔ細胞ｕｎＴの殺傷効率の比較図である。図８に示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞ＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９を特異的に殺傷するが、ＥｐＣＡＭ陰性腫瘍細胞ＭＩＡＰａＣＡ－２に対しては殺傷しない。

【0088】

図９は、ＣＡＲ－Ｔ及び参照Ｔ細胞ｕｎＴと異なる腫瘍細胞との相互作用後のＩＦＮ－γ放出量の比較図である。殺傷実験の結果と一致して、図９に示すように、ＥｐＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出は、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞ＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ、ＳＷ４８０、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ、Ａ５４９によって特異的に活性化されるが、ＥｐＣＡＭ陰性腫瘍細胞ＭＩＡＰａＣＡ－２と共培養した場合には、明らかなＩＦＮ－γ放出の活性化は発生しない。

【0089】

〈実施例６．ＥｐＣＡＭを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞のマウスの腫瘍細胞に対する除去〉
本発明の実施例は、Ｍ－ＮＳＧマウスにおけるＨＣＴ１１６皮下腫瘍形成に対するＣＡＲ－Ｔの治療効果及び安全性を調査した。

【0090】

具体的には、ＨＣＴ１１６をＭ－ＮＳＧマウスに皮下接種して、ＨＣＴ１１６腫瘍モデルを確立する。接種後１０日目に、マウスの平均腫瘍体積は約１７０ｍｍ³である。ランダムブロック法により、マウスをＧ１～Ｇ５の５群に分ける。各群にはいずれも尾静脈投与を行い、Ｇ１にはＰＢＳを投与し、Ｇ２にはｕｎＴを投与し、Ｇ３群、Ｇ４群、及びＧ５群の各マウスには、それぞれ２０Ｅ６、２Ｅ６、０．２Ｅ６細胞数のＣＡＲ－Ｔを投与する。注射後１日目、８日目、１５日目、２２日目、２８日目、３６日目、４２日目に各群のマウスの目頭から採血し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、マウスの末梢血中のヒトＣＤ４５＋及びヒトＣＤ３＋の持続性及びＣＡＲ＋細胞の割合を検出する。週２回、腫瘍の直径を測定し、動物の体重を量り、動物の生活状態を観察し、異常状況を記録する。実験全体の間、マウスは実験要件に従って安楽死させ、解剖し、サンプルを採取し、切片分析を行う。統計分析のために用いられた各群のマウスの数は６匹である。

【0091】

図１０は、実験時間内における各群のマウスの平均腫瘍体積変化の比較図である。図１０に示すように、２１日目に、Ｇ１群の平均腫瘍体積は１５８６．６９±４３９．９６ｍｍ³であり、他の群の平均腫瘍体積は順に１７７０．２３±４６０．１５ｍｍ³、２７２．００±２６．４２ｍｍ³、２７２．００±２６．４２ｍｍ³、４９８．２２±４７．８５ｍｍ³及び３６０７．４４±５１０．５４ｍｍ³であり、対応する腫瘍抑制率は順に－１３．１１％、９２．９７％、７６．９９％、及び－１４２．９５％である。そのうち、Ｇ３群及びＧ４群の平均腫瘍体積は明らかにＧ１群より低く、ＣＡＲ－Ｔが２０Ｅ６及び２Ｅ６の実験濃度において腫瘍増殖を阻害するある程度の効果を示したことを示す。４２日目に、Ｇ４群のすべてのマウスの腫瘍組織が完全に消失し、完全寛解を達成した。

【0092】

図１１は、実験時間内における各群のマウスの平均体重変化の比較図である。図１１に示すように、２１日目に、各群のマウスの体重増加率は、順に－４．４２％、－５．２１％、６．８９％、１．４５％及び７．２８％である。そのうち、Ｇ３群、Ｇ４群、及びＧ５群のマウスは、実験期間中に体重を良好に維持でき、ＣＡＲ－Ｔが２０Ｅ６、２Ｅ６、０．２Ｅ６の３つの実験濃度において明らかな毒性を示さなかったことを示したが、Ｇ１群、Ｇ２群のマウスは、実験期間中に体重を良好に維持できなかった。

【0093】

さらに、Ｇ１、Ｇ２及びＧ３群のマウスを採取して組織学的解剖を行い、形成された組織切片における代表的なサンプル状況は図１２に示すとおりである。

【0094】

図１２に示すように、Ｇ１群のマウスの肺は、中等度の腫瘍細胞浸潤または転移を示した；Ｇ２群のマウスは、肺血管周囲の炎症性細胞浸潤、脾臓好中球の軽度増加、及び肝門脈領域の炎症性細胞の軽度浸潤を示した；Ｇ３群のマウスの肺血管周囲の炎症性細胞は軽度の浸潤を示したが、いずれも腫瘍細胞の浸潤または転移を示さず、いずれも腫瘍増殖を阻害するある程度の効果を示した。Ｇ３群の組織切片の病理組織学的変化は、担癌マウス及び被験物質、即ちＣＡＲ－Ｔの薬理作用に関連する可能性があり、ＣＡＲ－Ｔに関連する毒性反応は存在しない。

【0095】

以上、本発明の実施形態について詳細に説明したが、これらの実施形態に多様な修正及び変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。しかしながら、そのような修正及び変更は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲及び精神内にあることを理解されたい。さらに、本明細書に記載の本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または達成することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2023545893000001.app

【国際調査報告】