特表 2023-545968 低減された凝集能及び低減された疎水性を有する改善された抗ｏｘＭＩＦ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-01

(54)【発明の名称】低減された凝集能及び低減された疎水性を有する改善された抗ｏｘＭＩＦ抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231025BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231025BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/30 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K45/00

A61P29/00

A61P35/00

A61P11/06

A61P9/00

A61P19/02

A61P31/04

A61P11/00

A61P13/12

A61P1/04

A61P17/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023520044

(86)(22)【出願日】2021-10-01

(85)【翻訳文提出日】2023-05-31

(86)【国際出願番号】 EP2021077106

(87)【国際公開番号】W WO2022069712

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】20199829.1

(32)【優先日】2020-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520476488

【氏名又は名称】オンコワン・リサーチ・アンド・ディベロップメント・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(72)【発明者】

【氏名】シナグル，アレクサンデル

(72)【発明者】

【氏名】ミルキナ，イリナ

(72)【発明者】

【氏名】ケルスバウメル，ランドルフ

(72)【発明者】

【氏名】ティーレ，ロベルト・ミヒャエル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA59

4C084ZA68

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZB35

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、改善された特性、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により低減された凝集能及び低減された疎水性、並びに、場合により、重鎖定常領域における更なる置換により増加されたエフェクター機能を有する抗ｏｘＭＩＦ抗体、並びにｏｘＭＩＦ関連疾患の治療におけるそれらの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、
以下の可変ドメイン：
（ａ１）配列番号９及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号９を含み、３６位に保存されたチロシン、及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／若しくはＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／若しくはＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン
のうちの１つの重鎖可変ドメインを含み、
アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、凝集能及び疎水性が、アミノ酸置換を欠く配列番号６及び配列番号９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減される、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

アミノ酸置換Ｗ９３Ｆ及び／又はＷ９７Ｙを含む、請求項１に記載の組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項3】

（ａ）配列番号２若しくは配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｂ）配列番号３若しくは配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、２６８Ｆ、３２４Ｔ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｃ）配列番号４若しくは配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｄ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３５Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、及び３９６Ｌを含む重鎖定常領域
を含む、重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置がＥＵ付番指標に従って付番される、
増強されたエフェクター機能を有する、請求項１又は２に記載の組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項4】

配列番号８、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項5】

配列番号６、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項6】

配列番号７、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項7】

配列番号７、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項8】

配列番号８、１１及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号３９、又は配列番号４０を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項9】

配列番号８、１３及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号４１、又は配列番号４２を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項10】

配列番号８、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項11】

配列番号３９、４０、４１又は４２を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項12】

配列番号３９、４４、４１又は４５を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項13】

二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、異なる種の２つの単鎖抗体の融合タンパク質（ＢｉＴＥ）、及びミニボディからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【請求項14】

医薬の調製における使用のためである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体を、場合により医薬担体又はアジュバントと共に含む医薬組成物。

【請求項16】

１０～２５０ｍｇ／ｍｌの請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体、具体的には＞５０ｍｇ／ｍｌを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

皮下投与のために製剤化されている、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

単独物質として、又は、好ましくは、抗ウイルス物質、抗炎症物質、抗癌物質、抗血管新生物質及び抗生物質からなる群から選択される、１つ若しくは複数の活性物質を含む更なる医薬組成物との投与のためである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

炎症性疾患、過剰増殖性障害、感染性疾患又は癌を患う患者の治療、具体的には、喘息、脈管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、毒素ショック症候群、後天性呼吸促迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎及び乾癬、大腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、および肺癌の治療における使用のための、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸分子（複数可）を含む発現ベクター。

【請求項22】

請求項２０に記載の核酸又は請求項２１に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。

【請求項23】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項２２に記載の宿主細胞を培養する工程及び細胞培養から前記抗体を回収する工程を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改善された特性、例えば、軽鎖及び重鎖可変ドメインにおける選択されたアミノ酸置換により低減された凝集能及び低減された疎水性、並びに、場合により、重鎖定常領域における更なる置換により増加されたエフェクター機能を有する抗ｏｘＭＩＦ抗体、並びにｏｘＭＩＦ関連疾患の治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

サイトカインマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、早くも１９６６年には記載されている（Ｄａｖｉｄ，Ｊ．Ｒ．，１９６６；Ｂｌｏｏｍ Ｂ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔ，Ｂ．，１９６６）。しかしながら、ＭＩＦは、構成的に発現され、細胞質に貯蔵され、健常な対象の循環中に存在するため、他のサイトカイン及びケモカインとは著しく異なる。このタンパク質の遍在性に起因して、ＭＩＦは、治療的介入には不適切な標的と考えられうる。しかしながら、ＭＩＦは、還元型ＭＩＦ（ｒｅｄＭＩＦ）及び酸化型ＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）と称される２つの免疫学的に別個の立体構造的なアイソフォームで存在する（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＲｅｄＭＩＦは、細胞質において、及び任意の対象の循環中に見出されうるＭＩＦの大量に発現されるアイソフォームであることがわかった。ｒｅｄＭＩＦは、潜在型の非活性貯蔵形態を表すようである（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0003】

対比して、ｏｘＭＩＦは、腫瘍組織、具体的にはｏｘＭＩＦの高い腫瘍特異性を示す結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌及び肺癌を有する患者由来の腫瘍組織（Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）において検出されうるが、炎症性疾患を有する患者の循環（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）においても検出されうる生理学的に関係のある疾患関連のアイソフォームであるようである。

【0004】

上述のｏｘＭＩＦの陽性表示のような癌を治療するための首尾よい薬物標的の数は限られている。例えば、３００個を超える潜在的な免疫腫瘍学の標的が記載されているが、多くの臨床研究は、抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤＬ１抗体を重視している（Ｔａｎｇ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２０１８）。したがって、科学界及び医学界は、予後が乏しい癌患者にとって治療選択肢を増やすための腫瘍特異的抗原を標的とする創薬を切望している。

【0005】

国際公開第２００９／０８６９２０ Ａ１号において、モノクローナル抗ＭＩＦ抗体が記載されている。
ｏｘＭＩＦを標的とする抗体は、炎症及び癌のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて有効性を示した（Ｈｕｓｓａｉｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｃｈｉｎａｇｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ｏｘＭＩＦ特異的抗体（イマルマブ）は、許容可能な安全性プロフィール、申し分のない組織浸透及び第１相臨床試験における抗腫瘍活性の適応を示した（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ．２０２０）。

【0006】

国際公開第２０１９／２３４２４１ Ａ１号において、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体が開示されている。
タンパク質凝集、具体的には、抗体凝集は、タンパク質発現、精製及び保存を含むバイオプロセスのいくつかの段階で頻繁に観察される。抗体凝集は、治療用タンパク質製造工程の全収率に影響し、治療用抗体の安定性及び免疫原性に寄与しうる。

【0007】

したがって、抗体のタンパク質凝集は、それらの発生性に重大な問題であり続け、抗体産生における重要な関心事のままである。抗体凝集は、単量体－単量体会合後、核生成及び凝集体増殖をもたらす、そのドメインの部分的なアンフォールディングによって誘発されうる。抗体及び抗体ベースのタンパク質の凝集傾向は、外部実験条件によって影響されうるが、それらは、それらの配列及び構造によって決定される潜在的な抗体特性に強く依存する。

【0008】

例えば、凝集に対する耐性は、天然状態（即ち、アンフォールディングに抵抗する）を安定化することによるか、又は凝集体へのタンパク質のアンフォールド若しくは部分的にフォールドした状態の特性を低減させることにより達成されうる。天然状態を安定化することの不都合な点は、それらがアンフォールドする環境にタンパク質が曝露される可能性があることである。一般に、タンパク質が変性又はアンフォールドされる場合、通常タンパク質の内側における分子内接触を媒介するアミノ酸残基が曝露される。そのような曝露は、タンパク質が分子間接触及び凝集体を形成しやすくさせることが多い。アンフォールディングに耐性なタンパク質と対照的に、アンフォールドされた場合に、凝集する特性が低減したタンパク質は、そのような環境への曝露後に、生理活性の非凝集状態へと単に再フォールドされる。

【0009】

抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質の凝集耐性又は凝集傾向は、通常、そこに含有される多くの凝集傾向ドメイン（複数可）によって、及び（存在する場合）周辺ドメインとのその相互作用の強度によって制限される。

【0010】

これは、一度そのドメインがアンフォールドするためであり、再フォールディングできない場合、それは同じタンパク質又は他のタンパク質内の他のドメインと相互作用し、凝集体を形成しうる。抗体の定常ドメインは、一般に、凝集せず、大きく変化しない。したがって、凝集能及び安定性に関して抗体の最も弱いドメインは、一般に、可変ドメインであると考えられる（例えば、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び／又は軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００３）。これに関して、凝集傾向のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインの、他の安定な組換え抗体産物への組み込みは、これらの一般に望ましくない特性を新しい組換え設計に付与することが多い。したがって、可変ドメインを凝集耐性であるように操作することは、その可変ドメインを含みうるタンパク質全体を凝集耐性にする可能性が最も高い。可変ドメインの凝集を低減させるための様々な戦略、例えば、凝集耐性タンパク質の合理的設計、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植、又は可変ドメインへのジスルフィド結合の導入が提案されている。凝集耐性タンパク質の合理的設計は、一般に、インシリコ解析を使用して、タンパク質の凝集傾向への点突然変異の効果を予測することを含む。しかしながら、このアプローチにはいくつかの困難がある。例えば、アンフォールドタンパク質の凝集を低減させるようである突然変異を単に同定することは十分ではない。むしろ、突然変異はまた、フォールドタンパク質の凝集を増加させない、又はフォールドタンパク質の機能、特に結合特性、例えば抗体の場合、親和性若しくは特異性に影響してはならない。更に、合理的設計は、改善される特定のタンパク質の詳細な構造解析を必要とし、したがって、完全には特徴付けられていないタンパク質による使用は困難であり、様々な異なるタンパク質に容易に適用できない。ＣＤＲ移植は、１つの可変ドメインからのＣＤＲを別の可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）へと移植することを含む。この戦略は、抗ＥＧＰ－２ｓｃＦｖの安定化に有用であることが示された（Ｗｉｌｌｕｄａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９）。このアプローチの不都合な点は、ＣＤＲ移植後に生じうる親和性の減少を含む。この親和性の低下は、ＦＲに突然変異を導入することによって克服されうるが、そのような突然変異は、タンパク質に免疫原性エピトープを産生し、それにより、タンパク質を治療の観点から望ましくなくさせうる。更に、ＣＤＲ移植は、一般に、移植の適合性を評価する、ドナー及びアクセプター可変ドメインの結晶構造若しくは相同性モデリングの解析を必要とする。そのようなアプローチは手がかかり、専門的な知識を必要とする。更に、各可変ドメインは異なる構造を有するため、方法は、様々な分子にわたり容易には適用されない。ジスルフィド結合を可変ドメインへと導入する工程を含む方法に関し、結合はタンパク質が正しく再フォールドされることを補助しうるが、可変ドメインに硬性も導入する。そのような硬性は、抗原ヘの抗体の親和性を低減しうる。更に、全ての可変ドメインが、親和性を損なうことなく、又は免疫原性エピトープを導入することなくジスルフィド結合形成に必須のシステイン残基の導入を支持しうるわけではない。更に、高タンパク質濃度下でのジスルフィド結合の形成はタンパク質凝集をもたらし、したがって、結合の任意のプラスの効果の可能性を打ち消しうる。

【0011】

しかしながら、凝集傾向の低減は、発現力価の増加を伴うことが示されており、タンパク質凝集の低減が発生プロセスを通して有益であり、臨床試験へのより効率的な道をもたらしうることを示している。治療用タンパク質のため、凝集体は、患者における有害な免疫応答の重大な危険因子であり、様々なメカニズムを介して形成しうる。凝集の制御は、タンパク質の安定性、製造能、減少率、安全性、製剤化、力価、免疫原性、及び可溶性を改善しうる（Ｗｅｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａｎｔ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0012】

タンパク質の更に固有の特性、例えば疎水性も、抗体安定性に重要な役割を果たす。表面疎水性によるこれらの治療用タンパク質の低い可溶性は、製剤開発をより困難にすることが示されており、ｉｎ ｖｉｖｏでの不十分な生体内分布、望ましくない薬物動態挙動及び免疫原性をもたらしうる。したがって、候補モノクローナル抗体の全体的な表面疎水性を減少させることは、精製及び投与レジメンに関して利益及びコスト削減を提供しうる。

【0013】

複数のメカニズムが、抗癌作用に関与すると考えられている。特に、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）ＩＩＩＡ依存的及びＦｃγＲＩＩＡ依存的エフェクター機能は、治療用Ａｂの臨床的有効性を担う重要で主要なメカニズムの２つでありうる。ＦｃγＩＩＩＡは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の主な誘発性受容体であることが公知であり、ＦｃγＲＩＩＡは、マクロファージにおける抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の主な誘発性受容体であることが公知である。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体の別のエフェクター機能も、可能な抗腫瘍メカニズムであると考えられる。薬剤として認可及び開発されたほとんどの治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであり、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘導しうる。これらのエフェクター機能は、ＦｃγＲ又は補体とのＦｃの相互作用によって活性化され、相互作用は、抗体Ｆｃ領域に接着したＮ結合型二分岐複合型オリゴ糖によって影響される（Ｎａｔｓｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が、癌細胞に対する作用の主要モードであることを実証した。Ａｂと抗体のＦｃ領域の受容体（ＦｃＲ）の間の直接相互作用の必要性は、これらの抗体の抗腫瘍効果を実証した。結果として、ＦｃＲ担持免疫エフェクター細胞は、これらの効果の媒介に重要な役割を果たす（Ｉａｎｅｌｌｏ Ａ．ａｎｄ Ａｈｍａｄ Ａ．，２００５）。しかしながら、当技術分野で公知のＭＩＦ抗体は、ＭＩＦ応答細胞の補体依存性細胞溶解又は抗体依存性細胞傷害のいずれも誘導しない（Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0014】

米国特許出願公開第２０１１／２３６３７５Ａ１号は、エフェクター機能が増強されたＦｃ変異体を記載する。
低減された凝集能と低減された疎水性の組合せは、抗体特性を非常に有益にするであろう。当技術分野において、疎水性が低減されたｏｘＭＩＦに対する凝集耐性抗体、またエフェクター機能が増強された抗ｏｘＭＩＦ抗体の必要性があるが、現在の抗体改変によってはまだ達成されていない。

【発明の概要】

【0015】

本発明の目的は、ｏｘＭＩＦを標的化し、低減された凝集傾向及び疎水性を有する改善された抗体又はその抗原結合断片を提供することである。
この目的は、本発明の主題によって解決される。

【0016】

本発明は、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、以下の可変ドメイン：
（ａ１）配列番号９及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号９を含み、３６位に保存されたチロシン、及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン
のうちの１つの重鎖可変ドメインを含み、
ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、凝集能及び疎水性が、アミノ酸置換を欠く配列番号６及び配列番号９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減される、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片を開示する。

【0017】

低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、以下の可変ドメイン：
（ａ）配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン又は３６位にチロシンを含む配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、並びに
（ｂ）配列番号６及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを更に含む重鎖可変ドメイン
を含み、ここで、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、凝集能及び疎水性が、アミノ酸置換を欠く配列番号６及び配列番号９を含む抗体又はその抗原結合断片と比較して低減される、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片が本明細書中で開示される。

【0018】

具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号９を参照してアミノ酸置換Ｗ９３Ｆを含む。
具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号６を参照してアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む。

【0019】

更なる特定の実施形態によれば、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、アミノ酸置換Ｗ９３Ｆ及びＷ９７Ｙを含む。
驚くべきことに、選択された位置は、ＣＤＲドメイン内でさえも、ｏｘＭＩＦ結合親和性への負の効果を持たずに置換して凝集能及び／又は疎水性を低減させうることが示された。

【0020】

具体的には、軽鎖可変ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てのアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆを含む。
具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３８の定常軽（ＣＬ）ドメインを含む。

【0021】

特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体は、増強されたエフェクター機能も有し、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｂ）配列番号３若しくは配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、２６８Ｆ、３２４Ｔ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｃ）配列番号４若しくは配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｄ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３５Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、及び３９６Ｌを含む重鎖定常領域
を含む重鎖定常領域を含み、
ここで、アミノ酸位置はＥＵ付番指標に従って付番される。

【0022】

具体的には、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号７、８、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するＶＨ又はＶＬドメインを含有する。

【0023】

代替的な実施形態によれば、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号６、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含有する。
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号７、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含有する。

【0024】

更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号７、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含有する。
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号８、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含有する。

【0025】

更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号８、１１及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号３９、又は配列番号４０を含有する。
更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号８、１３及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号４１、又は配列番号４２を含有する。

【0026】

本明細書中で、配列番号３９、４０、４１若しくは４２を含む、請求項１～３のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体、又は配列番号３９、４４、４１若しくは４５を含む抗ｏｘＭＩＦ抗体が更に提供される。

【0027】

より具体的には、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片は、二特異性抗体である。
特定の実施形態において、本明細書中に記載する抗ｏｘＭＩＦ抗体は、単一特異性及び二特異性抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合タンパク質（例えば、ＢｉＴＥ）、ミニボディ、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ＤｕｔａＭａｂ（商標）、ＤＡＲＴ、及びＣｒｏｓｓＭａｂ（登録商標）からなる群から選択される。

【0028】

具体的には、本明細書中に記載する抗体は、医薬の調製における使用のためである。
具体的には、本発明の抗体を、場合により医薬担体又はアジュバントと共に含む医薬組成物が本明細書中で提供される。

【0029】

具体的には、組成物は、約１０～２５０ｍｇ／ｍｌ、具体的には≧５０ｍｇ／ｍｌの本明細書中に記載する抗体を含む。
具体的には、前記医薬組成物は、皮下投与のために製剤化されている。

【0030】

より具体的には、医薬組成物は、ｏｘＭＩＦ関連状態の治療のために使用されうる。
具体的には、組成物は、単独物質として、又は好ましくは、抗ウイルス物質、抗炎症物質、抗癌物質、抗血管新生物質及び抗生物質からなる群から選択される、１つ若しくは複数の活性物質を含む更なる医薬組成物と組み合わせた投与のためである。

【0031】

更なる実施形態において、医薬組成物は、炎症性疾患、過剰増殖性障害、感染性疾患又は癌を患う患者の治療における、具体的には、喘息、脈管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、毒素ショック症候群、後天性呼吸促迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎及び乾癬、大腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、及び肺癌の治療における使用のためである。

【0032】

本明細書中で、本発明の抗体をコードする単離核酸が更に提供される。
本明細書中に記載する核酸分子（複数可）を含む発現ベクターも、本明細書中で提供される。

【0033】

更なる実施形態において、本明細書中に記載する核酸又は発現ベクターを含有する、宿主細胞が提供される。
本発明の抗体を産生する方法であって、宿主細胞を培養する工程及び細胞培養物から抗体を回収する工程を含む方法が更に提供される。

【0034】

本明細書中で、本発明の抗体を産生するための方法であって、宿主細胞において抗体をコードする核酸を発現する工程を含む方法が更に提供される。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1-1】アミノ酸配列を示す図である。

【図1-2】アミノ酸配列を示す図である。

【図1-3】アミノ酸配列を示す図である。

【図1-4】アミノ酸配列を示す図である。

【図1-5】アミノ酸配列を示す図である。

【図2A】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善されたＳＥＣ（Ａ、Ｂ）及びＨＩＣ（Ｃ）プロフィールを示す図である。

【図2B】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善されたＳＥＣ（Ａ、Ｂ）及びＨＩＣ（Ｃ）プロフィールを示す図である。

【図2C】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善されたＳＥＣ（Ａ、Ｂ）及びＨＩＣ（Ｃ）プロフィールを示す図である。

【図3】固定化されたＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合（ＫＤ決定）を示す図である。

【図4】ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の差次的結合を示す図である。

【図5】改変されたＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおける新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の増強されたエフェクター機能を示す図である。

【図6-1】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸潤を示す図である。Ａ：Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｂ：Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｃ：未処置の対照マウス。

【図6-2】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸潤を示す図である。Ａ：Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｂ：Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｃ：未処置の対照マウス。

【図6-3】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸潤を示す図である。Ａ：Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｂ：Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｃ：未処置の対照マウス。

【図6-4】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸潤を示す図である。Ａ：Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｂ：Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｃ：未処置の対照マウス。

【図6-5】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸潤を示す図である。Ａ：Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｂ：Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の生体内分布；Ｃ：未処置の対照マウス。

【図7】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の改善された産生を示す図である。

【図8】増強されたエフェクター機能を有するが、Ｃ０００８のＶＨ及びＶＬドメインを含むそれらのそれぞれの対応物と比較した、増強されたエフェクター機能並びに低減された疎水性及び凝集傾向を有する、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善された産生を示す図である（Ｃ００９７対Ｃ００６４、Ｃ００９８対Ｃ００６５、及びＣ０１００対Ｃ００６７の比較）。

【図9】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す図である。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計したＣ０１０８及びＣ０１０９の溶出プロフィールの比較；（Ｂ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８及びＣ０１０９の溶出プロフィールの比較。

【図10】ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞における新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す図である。Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００９０、Ｃ０１０９（Ａ）；Ｃ００８３、Ｃ０１０８（Ｂ）又は対照抗対Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧによって染色した。生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。

【図11】固定化されたｏｘＭＩＦに対する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（Ｋ_Ｄ推定）を示す図である；抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は参照抗体として使用した。

【図12】ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗体の差次的結合を示す図である。Ｃ０００８は参照抗体として、アイソタイプＩｇＧは陰性対照として使用した。

【図13】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０の薬物動態を示す図である。抗体の血漿濃度は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｏｘＭＩＦ抗体の単回静脈内注射の４、１０、２４、４８及び９６時間後に、定量的抗ｏｘＭＩＦ ＥＬＩＳＡによって決定し、半減期は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの単相減衰モデルによって算出した。

【図14-1】レポーターアッセイによって決定した新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたエフェクター機能を示す図である。（Ａ～Ｂ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖは高応答アロタイプ、Ｆは低応答アロタイプ）を安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。平均及びＳＥＭが示される（ｎ＝２～４）。

【図14-2】レポーターアッセイによって決定した新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたエフェクター機能を示す図である。（Ａ～Ｂ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖは高応答アロタイプ、Ｆは低応答アロタイプ）を安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。平均及びＳＥＭが示される（ｎ＝２～４）。

【図15】ＰＢＭＣ媒介細胞傷害性アッセイによって決定されたＦｃ部分においてＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたＡＤＣＣ活性を示す図である。ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９並びにエフェクター細胞としてＰＢＭＣ（Ａ：２２％ ＮＫ細胞、Ｂ：７％ ＮＫ細胞）及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦによるＡＤＣＣバイオアッセイ。２人の健常ドナーからのＰＢＭＣを使用する２つ又は３つの複製の平均及びＳＥＭが示される。

【図16】新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ヒトＰＢＭＣからの強く低減された非特異的サイトカイン放出を示す図である。Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９（７０ｎＭ）並びに対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８（７０ｎＭ）を、ヒトＰＢＭＣと終夜インキュベートし、上澄み液を、ヒトＩＬ－６（Ａ）及びヒトＭＣＰ－１（Ｂ）についてＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリービーズアッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で解析した。サイトカイン濃度についての平均＋／－ＳＥＭは、３人の異なるＰＭＢＣドナーから示される。

【発明を実施するための形態】

【0036】

他に指定又は定義しない限り、本明細書中で使用する全ての用語は、当技術分野において通常の意味を有し、当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（４ｔｈ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）；Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘｉ”，Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，（２０１７）、及びＭｕｒｐｈｙ ＆ Ｗｅａｖｅｒ，“Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”（９ｔｈ Ｅｄ．，又はより最新版），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｉｎｃ，２０１７を参照する。

【0037】

請求項の主題は、具体的には、人工産物又はそのような人工産物を用いるか若しくは産生する方法に関し、それは天然（野生型）産物の変異体でありうる。天然の構造に対してある程度の配列同一性がありうるが、本発明の材料、方法及び使用、例えば具体的には、単離核酸配列、アミノ酸配列、融合構築物、発現構築物、形質転換された宿主細胞及び改変タンパク質を指すものは、「人工」又は合成であり、したがって「自然の法則」の結果として考えられないことが十分に理解される。

【0038】

「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「を有する（ｈａｖｅ）」及び「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、同義的に使用することができ、広い定義として理解されるべきであり、更なる成員又は部品又は要素を可能にする。「からなる」は、構成している定義特性の更なる要素を伴わない最も閉じた定義と解釈される。したがって、「を含んでいる」はより広義であり、「からなる」の定義を含有する。

【0039】

「約」という用語は、本明細書中で使用する場合、同じ値又は所与の値の＋／－５％異なる値を指す。
本明細書中及び請求項中で使用される場合、単数形、例えば「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数を包含する。

【0040】

本明細書中で使用する場合、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の自然発生のアミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる：
「中性」アミノ酸を、各々の３文字コード及び１文字コード並びに極性と併せて、以下に示す：アラニン（Ａｌａ、Ａ；無極性、中性）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ；極性、中性）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ；無極性、中性）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ；極性、中性）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ；無極性、中性）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ；無極性、中性）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ；無極性、中性）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ；無極性、中性）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ；無極性、中性）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ；無極性、中性）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ；極性、中性）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ；極性、中性）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ；無極性、中性）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ；極性、中性）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ；無極性、中性）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ；極性、正（１０％）中性（９０％））。

【0041】

「正に」帯電したアミノ酸は：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ；極性、正）、及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ；極性、正）である。
「負に」帯電したアミノ酸は：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ；極性、負）、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ；極性、負）である。

【0042】

本発明の抗体又は抗原結合断片は、ｏｘＭＩＦを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を含み、可変重鎖及び軽鎖ドメインにおける標的化アミノ酸置換により、前記アミノ酸置換を欠く非改変抗体と比較して、低減された凝集傾向及び低減された疎水性を示す。

【0043】

凝集能の低減は、本明細書中に記載する抗体の可変ドメイン内の選択された位置におけるアミノ酸置換による。
抗体凝集のレベルは、マススペクトロメトリー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、光遮蔽（ＬＯ）、動的画像粒子解析（ＤＩＰ Ａ）技術、例えばマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）、及びコールターカウンター（ＣＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を包含する様々な公知の技術を使用して測定されうる。

【0044】

本明細書中で使用する場合、低減された疎水性及び低減された凝集能は、本明細書中に開示される配列番号１、６、３８及び９を含む、抗体Ｃ０００８のような参照抗体と比較して、新しく設計した抗体の表面疎水性の低減及び低減された凝集能を指す。Ｃ０００８の配列は、Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＩＮＮ Ｌｉｓｔ １１１（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，２０１４）で公表されたイマルマブの配列を含有するが、Ｃ末端リジンを欠く。測定は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又はアフィニティーキャプチャー自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ，Ｅｓｔｅｐ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）を包含するが、これらに限定されない様々な公知の技術を使用して実施されうる。

【0045】

一実施形態において、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する本発明のｏｘＭＩＦ抗体は、具体的には、配列番号６を含む重鎖可変ドメインと組み合わせて、又はＫａｂａｔ付番に従うアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを有する配列番号６を含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換Ｌ５Ｑ、Ｗ９７Ｙを更に含む重鎖可変ドメインと組み合わせてのいずれかで、Ｋａｂａｔ付番に従うアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｌ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを有する軽鎖可変ドメイン、又は３６位に天然チロシン並びに更に少なくとも１つのアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆを含む配列番号９に対して少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0046】

代替的な実施形態において、配列番号９を含む軽鎖可変ドメインは、３６位の天然チロシンが保存され、更に少なくとも１つのアミノ酸がＭ３０、Ｆ４９、Ａ５１、Ｐ８０、Ｗ９３位において置換されるという条件で、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのアミノ酸置換を有する。

【0047】

具体的には、Ｗ９３及びＷ９７位におけるアミノ酸置換が好まれる。
更に、Ｆ４９位におけるアミノ酸置換が好まれる。
更に、本明細書中に、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する、具体的には、配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン、又は３６位にチロシンを含む配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、並びに配列番号６及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙ又はアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及びＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、場合によりＬ５Ｑと組み合わせてアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを更に含む重鎖可変ドメインを含む、抗ｏｘＭＩＦ抗体が記載される。

【0048】

軽鎖の３６位の天然チロシンは、未改変のままであり、本明細書中に記載される抗体の結合特性を保存される。前記アミノ酸位置における任意の改変は、望まない結合特性障害をもたらしうる。

【0049】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１０を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号７を含有する。
具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１０を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号８を含有する。

【0050】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１１を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号６である。
具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１１を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号７を含有する。

【0051】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１１を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号８を含有する。
具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１２を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号６である。

【0052】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１２を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号８を含有する。
具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１３を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号６である。

【0053】

具体的には、可変軽鎖ドメインは配列番号１３を含有し、可変重鎖ドメインは配列番号８を含有する。
本明細書中で使用する場合、「エフェクター機能」は、Ｆｃ受容体又はリガンドとの抗体Ｆｃ領域の相互作用から生じる生化学イベントを意味する。エフェクター機能は、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣを包含する。

【0054】

本明細書中で使用する場合、「エフェクター細胞」は、１つ又は複数のＦｃ受容体を発現し、１つ又は複数のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、限定はされないが、単球、マイクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞が挙げられ、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを包含する任意の生物由来でありうる。特定の実施形態において、本明細書中に記載される抗ｏｘＭＩＦ抗体は、重鎖定常領域において選択された位置でのアミノ酸置換により、増強されたエフェクター機能も有する。増強された補体及びＦｃγＲ媒介活性による、これらの抗体の増加されたエフェクター機能は、増強された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を包含しうる。Ｆｃ受容体媒介ＡＤＣＣは、それにより抗体が除去するための疾患細胞を標的化する作用の重要なメカニズムである。標的結合抗体のＦｃエフェクター部分が、エフェクター細胞の細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体にも結合する場合、２つの細胞型の複数の架橋が起こり、ＡＤＣＣの経路活性化をもたらす。

【0055】

増強された補体活性を有する抗体は、細胞ベースのＣＤＣアッセイによって決定され、Ｃ１ｑへの改善された結合は、例えばＳＰＲ又はＥＬＩＳＡによって決定されうる。
改善された又は増加されたＣＤＣ活性は、参照、即ち非改変、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも１．５倍、具体的には、少なくとも１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、より具体的には、少なくとも５倍、より具体的には、少なくとも６倍増加されると決定される。

【0056】

増加されたＡＤＣＣ活性は、参照抗体、即ち非改変、野生型抗体、例えばＣ０００８と比較して、少なくとも１．５倍、具体的には、少なくとも１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、より具体的には、少なくとも５倍、より具体的には、少なくとも６倍増加した能力であると決定される。

【0057】

上記の軽鎖及び重鎖可変ドメインに加えて、ｏｘＭＩＦ抗体は、ＥＵ付番指標に従い、少なくともアミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅを有する配列番号１を含む重鎖定常領域、又は配列番号１に対して少なくとも９５％、具体的には少なくとも９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有し、少なくともアミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ及び場合により更なるアミノ酸置換Ｈ２６８Ｆ及び／又はＳ３２４Ｔを含む機能性バリアントを更に含みうる。

【0058】

具体的には、ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２を含む重鎖定常領域又は配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域を含有する。

【0059】

代替として、ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３を含む重鎖定常領域又は配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、２６８Ｆ、３２４Ｔ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域を含有する。

【0060】

或いは、ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４を含む重鎖定常領域又は配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域を更に含みうる。

【0061】

更なる代替的な実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５の重鎖定常領域又は配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３５Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、及び３９６Ｌを含む重鎖定常領域を更に含みうる。

【0062】

更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、７、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、７、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、７、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、７、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、７、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、８、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、８、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、８、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、８、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、８、１０、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、６、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、６、１１、及び３８を含む。

【0063】

更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、６、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、６、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、６、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、７、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、７、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、７、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、７、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、７、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、８、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、８、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、８、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、８、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、８、１１、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、６、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、６、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、６、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、６、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、６、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、７、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、７、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、７、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、７、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、７、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、８、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、８、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、８、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、８、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、８、１２、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、６、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、６、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、６、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、６、１３、及び１５０を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、６、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、７、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、７、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、７、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、７、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、７、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号１、８、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号２、８、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号３、８、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号４、８、１３、及び３８を含む。更なる実施形態において、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、配列番号５、８、１３、及び３８を含む。

【0064】

本明細書中に記載される抗体のｏｘＭＩＦ結合部位は、ＭＩＦの酸化形態に、即ち動物、具体的には哺乳動物ｏｘＭＩＦ、例えば、限定はされないがマウス、ラット、サル及びヒト、具体的にはヒトｏｘＭＩＦに特異的であるが、還元型ＭＩＦの実質的な交差反応性を示さない。ｏｘＭＩＦは、炎症性疾患を有する対象の循環において、また癌患者の腫瘍組織において、特異的に且つ優勢に検出されうるＭＩＦの疾患関連の構造アイソフォームである。一実施形態において、ヒト化又はヒト抗ｏｘＭＩＦ結合部位は、本明細書中に記載するヒト化若しくはヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域、例えば、配列番号９、１０、１１、１２又は１３に含まれるＣＤＲ及び／又は本明細書中に記載するヒト化若しくはヒト抗ｏｘＭＩＦ結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域、例えば配列番号６、７、又は８を含む。

【0065】

ｏｘＭＩＦ結合特異性は、ｏｘＭＩＦに対する選択的結合を決定するために適切な任意のアッセイ、例えばｏｘＭＩＦに対する結合に関して、対照抗体、例えばイムルマブに対する任意の競合アッセイ又は当技術分野で公知の及び本明細書中で開示される様々なアッセイによって決定されうる。

【0066】

本明細書中の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、リンカー配列を有するか、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインからなるか、若しくはそれらを含むポリペプチド又はタンパク質を包含する。上記用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体等の多特異性抗体、及びそれらが、所望の抗原結合活性を示す限り、即ちｏｘＭＩＦに結合する抗体断片を含むがこれらに限定されない各種抗体構造を包含する。用語は、融合タンパク質、例えば免疫毒素との融合体又は抗体コンジュゲート、例えばｏｘＭＩＦに結合する抗体薬コンジュゲートも包含する。

【0067】

抗体ドメインは、自然構造を有しうるか、又は例えば、抗原結合特性、或いはＦｃＲｎ及び／又はＦｃ－ガンマ受容体等のＦｃ受容体への結合のような安定性又は機能特性等の任意の他の特性を修飾するために、突然変異誘発又は誘導体化によって修飾されうる。ポリペプチド配列は、ループ配列によって結合された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ－バレル構造を含む場合に、抗体ドメインであるとみなされる。

【0068】

「抗体」という用語は、それらの抗原結合誘導体及び断片を包含することが理解されよう。誘導体は、本発明の１つ又は複数の抗体ドメイン又は抗体及び／又は本発明の抗体の任意のドメインが、他の抗体又は抗体型式等の１つ又は複数の他の結合タンパク質の任意の位置で融合されうる融合タンパク質の任意の組合せ、例えば、ＣＤＲループ、受容体ポリペプチド、更にはリガンド、スキャフォールドタンパク質、酵素、標識、毒素等を含む結合構造である。

【0069】

「抗体」という用語は、標的抗原ｏｘＭＩＦに対して結合特性を示すポリペプチド又はタンパク質について特に言及する。
「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原を結合する無傷の抗体の抗原結合部分を含む無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＳｃＦｖ－Ｆｃ、二特異性抗体、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；線状抗体；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する、即ち、ＶＬドメインと一緒に集合することが可能であるか、又はＶＬドメインの特徴を有する、即ち、機能性抗原結合部位に対してＶＨドメインと一緒に集合することが可能であり、それにより、完全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。本明細書中で言及される抗体断片はまた、Ｆｃａｂ（商標）等の抗原結合領域を含有する１つ又は複数の構造ループ領域を含むＦｃドメイン、又はＦｃ領域が、第２の別個の抗原結合部位を含有するＦｃａｂ（商標）によって置き換えられたＩｇＧ構造を有する完全長抗体型式を包含する。

【0070】

「機能性変異体」又は「機能的に活性な変異体」という用語は、自然発生の対立遺伝子変異体、並びに突然変異体又は任意の他の非自然発生の変異体も包含する。当技術分野で公知のように、対立遺伝子変異体（又は相同体とも呼ばれる）は、核酸又はポリペプチドの生物機能を基本的に変更しない１つ若しくは複数のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる核酸又はペプチドの代替形態である。具体的には、機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は付加、又はこれらの組合せを含んでもよく、その置換、欠失及び／又は付加は保存的改変であり、抗原結合特性を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能性変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個以下、又はまでのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存改変であり、抗体の機能を変更しない。具体的には、本明細書中に記載される機能的に活性な変異体は、１５個まで、好ましくは１０個又は５個までのアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含み、それは保存的改変であり、抗体の機能を変更しない。

【0071】

機能性変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列における配列変更、例えば１つ又は複数の点突然変異によって得られ、ここで、配列変更は、本発明の組合せ中で使用される場合、未変更のポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更は、（保存）置換、付加、欠失、突然変異及び挿入を包含しうるが、これらに限定されない。保存置換は、それらの側鎖及び化学特性と関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、無電荷極性側鎖、小側鎖、大側鎖等を有するアミノ酸である。

【0072】

点突然変異は、種々のアミノ酸に関して１つ又は複数の単一（不連続）アミノ酸或いは二重アミノ酸の置換又は交換、欠失又は挿入における、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。

【0073】

本明細書中で使用する場合、「Ｆａｂ断片又はＦａｂ」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。本発明の抗体は、少なくとも１つのＦａｂ断片を含むことができ、ここで、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換される。可変領域又は定常領域のいずれかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片はまた、「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成物が可能であり、本発明の抗体に含まれる。Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換することができ、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖を含みうる。このクロスオーバーＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称される。

【0074】

「（ｓｃＦｖ）２」は、約５０キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる抗体又は同じ抗体のいずれかの２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなるか、又は４つ若しくは２つの異なる遺伝子由来の融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。

【0075】

「ｂｓ（ｓｃＦｖ）２」は、約５０キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる標的抗原を有する抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。

【0076】

「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で下記の順序：ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬを有してもよく、上記リンカーは、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、具体的には、３２個～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。上記単鎖Ｆａｂ断片ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されうる。更に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化されうる。

【0077】

「Ｎ末端」という用語は、Ｎ－末端の最終アミノ酸を意味する。
「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最終アミノ酸を意味する。
「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」の「ＢｉＴＥ」は、約５０キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、又は４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である人工モノクローナル抗体を指す。ｓｃＦｖの一方は、例えば、ＣＤ３を介してＴ細胞に結合するがそれに限定されず、他方は、ｏｘＭＩＦを介して腫瘍細胞に結合する。具体的には、ＢｉＴＥは、約５０ｋＤを有する。

【0078】

「ミニボディ」という用語は、ＣＨ３ドメインを介して連結される単鎖Ｆｖ断片（単鎖Ｆｖ－ＣＨ３）、及びヘテロ二量体化プロセスにより前者の部分に対形成される、別個の特異性を有するＦｖの対で構成される抗体を指す（Ｈｕ Ｓ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３０５５－３０６１）。ヘテロ二量体化効率を促進するために、単一残基突然変異を、各ＣＨ３ドメインに導入して、「ノブイントゥホール」アプローチを達成することができる。それよりもはるかに多く、更なるシステイン残基もまた、ＣＨ３ドメインに導入して、二重特異性ミニボディ構造を安定化することができる。ミニボディの１つのバージョンであるＴｒｉＢｉミニボディは、２つのそのＦｖ断片を介して抗原を認識するように設計されている鎖を含むのに対して、Ｆｖ断片を保有する他の鎖は、Ｔ細胞障害性細胞又はＮＫ細胞等のエフェクター細胞の動員の管理を引き受ける。この外部の結合ドメインの付加に伴って、ＴｒｉＢｉミニボディのアビディティは、二重特異性ミニボディのアビディティよりも高い。具体的には、ミニボディは、約７５ｋＤａを有する。

【0079】

「ＤＡＲＴ（登録商標）」という用語は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の最も簡素な形態である二重親和性リターゲティング抗体を指す。ＤＡＲＴ分子は、それら自身のＶＨが他方の分子と交換された２つの操作されたＦｖ断片からなる。Ｆｖ１は、抗体Ａ由来のＶＨ及び抗体Ｂ由来のＶＬからなるのに対して、Ｆｖ２は、Ａｂ－Ｂ由来のＶＨ及びＡｂ－Ａ由来のＶＬからなる。Ｆｖドメインの相互交換は、短い連結ペプチドによる立体構造的制約から変異体断片を放出する。

【0080】

「ＤｕｔａＭａｂ（商標）」という用語は、単一免疫グロブリン鎖における２つの非依存性パラトープを連結させることによって形成されるＢｓＡｂの１つの型式を指す。
「ＴａｎｄＡｂ（登録商標）」又は「タンデム抗体」という用語は、２つの別個のＦｖ由来の２つのＶＬ／ＶＨ対をタンデムで有する抗体を指し、この用語はまた、Ｆｃドメインを保有しないタンデム抗体を意味する。ＴａｎｄＡｂは、全ＩｇＧ又はＩｇＧ由来の二重特異性Ａｂよりも小さいが、単一ドメイン二重特異性Ａｂよりも大きい。中規模サイズはまた、ＴａｎｄＡｂに、組織浸透能力の増加及びより長い血清片元気を付与する。更に、各抗原に関しては二価を意味する四価特性は、その結合効率、及び結果としての治療成績を改善させることができる。具体的には、ＴａｎｄＡｂは、約１００ｋＤａを有する。

【0081】

「二特異性抗体」という用語は、小さなペプチドリンカーによって結合される重鎖可変（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域からなる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の非共有結合的二量体を指す。二特異性抗体の別の形態は、２つのｓｃＦＶ断片が互いに共有結合的に連結される単鎖（ＦＶ）_２である。更に、内部リンカーを用いて、各鎖における遺伝子をタンデムに連結させることによって、４つのＶＨ及びＶＬドメインは、タンデムに発現されて、単鎖二特異異性効果（ｓｃＤｂ）としてフォールディングさせることができ、これはまた、二重特異性抗体産生にとって有効な戦略である。更に、組換え可変ドメインをＦｃ領域又はＣＨ３ドメインに融合させること（ｓｃＤｂ－Ｆｃ及びｓｃＤＢ－ＣＨ３、二特異性抗体－ＣＨ３）により、最終産物の結合価は二倍となりうる。サイズの増加はまた、血清中の二特異性抗体の半減期を延長させることができる。具体的には、二特異性抗体－ＣＨ３は、約１２５ｋＤａを有する。

【0082】

「ｃｒｏｓｓＭａｂ（登録商標）」という用語（ここで、ｍａｂは、モノクローナル抗体を指す）は、非依存性親抗体に由来する二重特異性Ａｂの１つの型式である。重鎖不対合形成は、ノブ－イントゥ－ホール（ＫＩＨ）法を適用させることによって回避される。軽鎖不対合形成は、二重特異性抗体が抗体ドメイン交換で産生される場合に回避される一方で、一方のＦａｂアームの可変ドメイン又は定常ドメイン（ＣＬ及びＣＨ１）のいずれかは、軽鎖と重鎖との間で取り替えられる。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を保持して、また軽鎖不対合形成を回避するために２つの異なるアームを保存する。ＣｒｏｓｓＭａｂの例は、種々の領域で交換されるＦａｂ、ＶＨ－ＶＬ及びＣＨ１－ＣＬでありうるが、これらに限定されない。ＣｒｏｓｓＭＡｂ Ｆａｂでは、完全ＶＨ－ＣＨ１領域及びＶＬ－ＣＬ領域が交換され、ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＶＨ－ＶＬ型式では、ＶＨ領域及びＶＬ領域のみが交換され、ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＣＨ１－ＣＬ１型式では、二重特異性抗体のＣＨ１及びＣＬ領域が交換される。具体的には、ＣｒｏｓｓＭａｂは、約１５０ｋＤａを有する。

【0083】

「ＩｇＧ－ｓｃＦｖ」という用語は、２つのｓｃＦｖを、それぞれ単一特異性ＩｇＧに融合させることによって二重特異性に関して操作された二重特異性抗体の一種を指す。各ｓｃＦｖの特異性は、同じでありうるか、又は異なりうる。更に、軽鎖若しくは重鎖それぞれのアミノ又はＣ末端のいずれかに、対形成される抗体可変ドメインを付加させることができ、これが、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ ＢｓＡｂの多様なタイプ：ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ：ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、完全長ＩｇＧ ＨＣのＣ末端に連結された同じ特異性を有する２つのｓｃＦｖ；ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖと同じようであるが、但し、ｓｃＦｖがＨＮ Ｎ末端に連結されることを除くｓｃＦＶ－（Ｈ）ＩｇＧの産生を引き起こす。ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ：ＩｇＧ軽鎖のＣ末端若しくはＮ末端に結合された２つの同じｓｃＦｖは、それぞれ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧを形成する。２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ又はＩｇＧ－２ｓｃＦｖは、Ｎ末端（２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ）又はＣ末端（ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ）のいずれかに対して異なる特異性を有する２つの対形成されたｓｃＦｖを融合することによって生成される。具体的には、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖは、約２００ｋＤａである。

【0084】

特定の実施形態によれば、本明細書中に記載する抗体は、例えば、親和性タグ、溶解度増強タグ及びモニタリングタグであるが、これらに限定されない、精製及び／又は検出用の１つ又は複数のタグを含みうる。

【0085】

具体的には、親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、抗体用のペプチド基質、キチン結合ドメイン、ＲＮＡ分解酵素Ｓペプチド、プロテインＡ、β－ガラクトシダーゼ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、及びｃ－Ｍｙｃタグからなる群から選択され、具体的には、タグは、１つ又は複数のＨを含むＨｉｓタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグである。

【0086】

「融合される」又は「結合される」とは、構成成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。

【0087】

「リンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、ペプチドリンカーを指し、２、３、４、５、６、７又はそれ以上のアミノ酸長、好ましくは２アミノ酸長～１０アミノ酸長、より好ましくは３アミノ酸長～５アミノ酸長を有するアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。

【0088】

「免疫グロブリン」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィドで結合されている２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。重鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、軽鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向かって、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結される本質的に２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインからなる。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに帰属させてもよく、それらのいくつかは、サブタイプ、例えば、γ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）に更に分類されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに帰属されうる。

【0089】

「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来するのに対して、重鎖及び／又は軽鎖の残部が、異なる供給源又は種に由来する、通常は組換えＤＮＡ技法によって調製される抗体を指す。キメラ抗体は、ウサギ又はマウスの可変領域と、ヒト定常領域とを含みうる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を産生する方法は、従来の組換えＤＮＡに関与し、遺伝子トランスフェクション技法が当該技術分野で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４）。

【0090】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト供給源に由来する抗体、又は他のヒト抗体コード配列のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有する。ヒト抗体のこの定義は、具体的に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。また、キメラ抗体及びヒト化抗体に関して言及されるように、「ヒト抗体」という用語はまた、本明細書中で使用する場合、例えば、「クラススイッチング」、即ちＦｃ部分の変化又は突然変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への変化、及び／又はＩＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、定常領域において修飾されるかかる抗体を含む。

【0091】

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＨＥＫ細胞、ＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子にとってトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離される抗体、或いは宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体等の、組換え手段によって調製、発現、創出又は単離されるヒト抗体全てを包含すると意図される。組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列配列に由来し、且つそれらに関連する一方で、天然ではｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体レパートリー内に存在しない可能性がある配列である。

【0092】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１に記載されるようなサブグループである。

【0093】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基とを含む、ヒト化を受けたキメラ抗体を指す。或る特定の実施形態において、ヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも１つの、通常は２つの可変ドメインを含み、ここで、全て又は実質的に全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のＨＶＲに相当し、全て又は実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のＦＲに相当する。ヒト化抗体は、任意選択により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。本発明によって包含されるヒト化抗体の他の形態は、例えばＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、新たな特性を発するように、定常領域が元の抗体の定常領域から更に修飾又は変更されている抗体である。

【0094】

「二重特異性」という用語は、本明細書中で使用される場合、少なくともｏｘＭＩＦ抗原と更なる抗原、例えば限定はされないが、ＣＤ３抗原との結合反応を指す。二重特異性抗体は、具体的には、特異的結合特性を有する少なくとも２つの部位を含むことができ、２つの異なる標的抗原、ｏｘＭＩＦと更なる抗原が抗体によって認識される。例示的な二重特異性抗体フォーマットは２つの結合部位を含み、各結合部位は、異なる抗原、例えばＣＤ３とｏｘＭＩＦに特異的に結合することができる。更なる例示的な二重特異性フォーマットは、２つ以上の結合部位を含み、１つ又は複数の結合部位はｏｘＭＩＦに結合し、１つ又は複数の結合部位は、１つ又は複数の異なる抗原、例えばＣＤ３に特異的に結合することができる。

【0095】

本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は、本明細書中に記載する完全長抗体又は抗体断片として調製されうる。免疫グロブリンＦｃヘテロ二量体は、各ドメイン上の異なる突然変異によるＣＨ３ドメイン界面への改変によって操作されることがあり、ＣＨ３変異体対を持つ、操作したＦｃ断片は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する（Ｈａ Ｊ－Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。二重特性抗体の型式の例は、Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１５及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．，２０１７に記載されるような二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）、更なる結合部位部分が付加されたＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、ＢｓＡｂコンジュゲート、ハイブリッドｂｓＩｇＧ、可変ドメインのみの二重特性抗体分子、ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、Ｆａｂ融合タンパク質、修飾Ｆｃ及びＣＨ３融合タンパク質、付加されたＩｇＧ－ＨＣ融合体、付加されたＩｇＧ－ＬＣ融合体、付加されたＩｇＧ－ＨＣ及びＬＣ融合体、Ｆｃ融合体、ＣＨ３融合体、ＩｇＥ／ＩｇＭ ＣＨ２融合体、Ｆ（ａｂ’）_２融合体、ＣＨ１／ＣＬ、修飾ＩｇＧ、非免疫グロブリン融合タンパク質、Ｆｃ修飾されたＩｇＧ、二特異性抗体等でありうるが、これらに限定されない。

【0096】

本発明のｏｘＭＩＦ抗体は、例えばＣＤ３の更なるエピトープ、具体的には、細胞表面上に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤε（イプシロン）鎖を包含するヒトＣＤ３のエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの結合部位を更に含みうる。例えば固定化された抗ＣＤ３抗体による、Ｔ細胞上でのＣＤ３のクラスター形成は、Ｔ細胞受容体の会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に類似しているが、そのクローン定型の特異性に依存しないＴ細胞活性化をもたらす。或る特定の実施形態において、本明細書中に記載する抗体のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３と強力なＣＤ３結合親和性を示すだけでなく、各々のカニクイザルＣＤ３タンパク質と優れた交差反応性も示す。場合によっては、抗体のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザル由来のＣＤ３と交差反応性である。一実施形態において、抗ＣＤ３結合部位は、本明細書中に記載する抗ＣＤ３結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域、及び／又は本明細書中に記載する抗ＣＤ３結合ドメインの１つ又は複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域を含み、例えば、抗ＣＤ３結合ドメインは、１つ又は複数の、例えば３つ全てのＬＣ ＣＤＲと、１つ又は複数の、例えば、３つ全てのＨＣ ＣＤＲとを含む。

【0097】

具体的には、抗ｏｘＭＩＦ抗体は、国際公開第２０１９２３４２４１ Ａ１号に記載されるようにＣＤ３に対する第２の又は更なる結合特異性を有する。そのような二重特異性抗ｏｘＭＩＦ抗体は、
（ａ）ＲＹＴＭＨ（配列番号１４）、ＧＹＧＭＨ（配列番号１５）及びＳＦＰＭＡ（配列番号１６）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲ１－Ｈ２配列、並びに、
ＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号１７）、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１８）、及びＴＩＳＴＳＧＧＲＴＹＹＲＤＳＶＫＧ（配列番号１９）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲ２－Ｈ２、並びに
ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ（配列番号２０）、ＱＭＧＹＷＨＦＤＬ（配列番号２１）、ＦＲＱＹＳＧＧＦＤＹ（配列番号２２）、及びＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹ（配列番号２３）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３－Ｈ２
を含む重鎖可変領域、並びに
（ｂ）ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ（配列番号２４）、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ（配列番号２５）、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号２６）及びＴＬＳＳＧＮＩＥＮＮＹＶＨ（配列番号２７）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲ１－Ｌ２、並びに、
ＤＴＳＫＶＡＳ（配列番号２８）、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号２９）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号３０）及びＤＤＤＫＲＰＤ（配列番号３１）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲ２－Ｌ２、並びに
ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号３２）、ＱＱＷＳＳＮＰＦＴ（配列番号３３）、ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号３４）、ＳＱＷＬＹＧＭＤＶ（配列番号３５）、及びＱＱＷＳＳＮＰ（配列番号３６）からなる群から選択される配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には、８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲ３－Ｌ２
を含む軽鎖可変領域
を含む、ＣＤ３を特異的に認識する結合部位を含みうる。

【0098】

より具体的には、二重特異性抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３抗体は、上記に列挙したＣＤＲ配列それぞれにおいて、０個、１個、又は２個の点突然変異を含む。
更なる特定の実施形態は、相当する可変重鎖領域（ＶＨ）及び相当する可変軽鎖領域（ＶＬ）が、ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－Ｖ_Ｌ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）、ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）又はＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＣＤ３）－ＶＬ（ｏｘＭＩＦ）－ＶＨ（ｏｘＭＩＦ）の順で、Ｎ末端からＣ末端へ配置される、抗ｏｘＭＩＦ／抗ＣＤ３ｂｓ（ｓｃＦｖ）２について言及する。

【0099】

更なる実施形態において、抗体は、具体的には二重特異性ＩｇＧ、ＣＤ３結合部位が付加されたＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、ＢｓＡｂコンジュゲートからなる群から選択される二重特異性抗体である。

【0100】

「抗原」という用語は、本明細書中で用語「標的」又は「標的抗原」と交換可能に使用される場合、抗体結合部位によって認識される全標的分子又はかかる分子の断片を指す。具体的には、抗原の下部構造、一般的に、免疫学的に関連性のある「エピトープ」、例えばＢ－細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープと称される抗原、例えば、ポリペプチド又は炭水化物構造は、かかる結合部位によって認識されうる。

【0101】

「エピトープ」という用語は、本明細書中で使用する場合、特に、特異的な結合パートナーを完全に構成しうるか、又は本発明の抗体型式の結合部位に対する特異的な結合パートナーの一部でありうる分子構造を指す。エピトープは、炭水化物、ペプチド構造、脂肪酸、有機物質、生化学物質若しくは無機物質又はそれらの誘導体及びそれらの任意の組合せで構成されうる。エピトープが、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質等のペプチド構造に含まれる場合、エピトープは通常、少なくとも３アミノ酸、具体的には５アミノ酸～４０アミノ酸、及び具体的には１０アミノ酸以下、具体的には４アミノ酸～１０アミノ酸を含む。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造的エピトープのいずれかでありうる。線状エピトープは、ポリペプチド又は炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。線状エピトープは、近接しうるか、又は重複しうる。立体構造的エピトープは、ポリペプチドをフォールディングして、三次構造を形成することによって一緒にまとめられたアミノ酸又は炭水化物で構成され、アミノ酸は、線状配列において、必ずしも互いに隣接するとは限らない。かかるｏｘＭＩＦエピトープは、ｏｘＭＩＦの中心領域内に位置する配列ＥＰＣＡＬＣＳ（配列番号４３）でありうる。

【0102】

「抗原結合ドメイン」又は「結合ドメイン」又は「結合部位」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、また抗原の一部又は全てに相補的な区域を含む抗原結合部分の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分にのみ結合する場合があり、その特定の部分は、エピトープと称される。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。

【0103】

「結合部位」という用語は、本発明の抗体に関して本明細書中で使用する場合、抗原と結合相互作用が可能な分子構造を指す。通常、結合部位は、各種抗原に結合機能を付与する様々な構造を有する特異的な領域である、本明細書中で「ＣＤＲ結合部位」とも称される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。様々な構造は、抗体の天然レパートリー、例えば、マウス又はヒトレパートリーに由来しうるか、或いは例えば突然変異誘発によって、具体的には無作為化技法によって、組換え的に又は合成的に産生されうる。これらには、突然変異誘発されたＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に、抗体のＣＤＲループ、例えばＶＬ及び／又はＶＨ抗体ドメインのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ループが包含される。本明細書により使用される場合の抗体型式は通常、それぞれが抗原に特異的な１つ又は複数のＣＤＲ結合部位を含む。

【0104】

「特異的な」という用語は、本明細書中で使用する場合、分子の異種集団において目的の同族リガンドを決定する結合反応を指す。本明細書中では、結合反応は、少なくともｏｘＭＩＦ抗原との反応である。したがって、指定条件、例えば、イムノアッセイ条件下で、特定の標的に特異的に結合する抗体は、試料中に存在する他の分子に、著しい量では結合せず、具体的には、その抗体は、還元型ＭＩＦへの実質的な交差反応性を示さない。

【0105】

特異的な結合部位は通常、他の標的と交差反応しない。依然として、特異的な結合部位は、標的の１つ又は複数のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合しうるか、又は他の関連標的抗原、例えば、相同体若しくは類似体に対して交差反応でありうる。

【0106】

特異的な結合は、結合が、選択に応じて、標的同一性、高、中若しくは低の親和性又はアビディティに関して選択されることでを意味する。選択的な結合は通常、ｏｘＭＩＦ等の標的抗原に対する結合定数又は結合動態が、標的抗原ではない抗原に対する結合定数又は結合動態と比較して、少なくとも１０倍異なり、好ましくは、その差が少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である場合に達成される。

【0107】

「価」という用語は、本出願内で使用する場合、抗体分子における指定数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗体分子における、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表す。

【0108】

「一価」という用語は、抗体の結合部位に関して本明細書中で使用する場合、標的抗原に対して向けられた唯一の結合部位を含む分子を指す。したがって、「結合価」という用語は、抗原の同じエピトープ又は異なるエピトープを特異的に結合する同じ標的抗原に対して向けられた結合部位の数と理解される。

【0109】

本発明の抗体は、ｏｘＭＩＦを特異的に結合する一価、二価、四価又は多価の結合部位を含むと理解される。
更なる実施形態によれば、抗体は、エフェクターＴ細胞、ＮＫ細胞又はマクロファージ上で発現される１つ又は複数の抗原、具体的には、ＣＤ３、ＡＤＡＭ１７、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ６９、ＣＤ７４、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ１３７、ＣＤ１７７、ＣＥＡＥＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＨＬＡ－Ｄｒａ ｃａｈｉｎ、ＫＩＲ、ＬＳＥＣｔｉｎ又はＳＬＣ４４Ａ２の１つ又は複数を特異的に認識する１つ又は複数の更なる結合部位を含みうる。

【0110】

代替の実施形態によれば、本発明の抗体は、モスネツズマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ又はフォラルマブ（ｆｏｒａｌｕｍａｂ）のＣＤ３可変結合ドメインの１つ又は複数を更に含む二重特異性抗体である。

【0111】

特定の実施形態によれば、抗ＣＤ３結合部位は、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ブリナツモマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブ、モスネツズマブ、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１及びＷＴ－３１並びに適用可能であれば、それらの任意のヒト化誘導体からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

【0112】

具体的には、抗ＣＤ３可変領域の１つ若しくは複数のＣＤＲ、又はムロモナブ、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、ソリトマブ、ブリナツモマブ、パソツキシズマブ、シビサタマブ、モスネツズマブのＣＤＲ配列のいずれかに対して少なくとも７０％、具体的には８０％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む、又は有するＣＤＲは、本発明に従ってＣＤ３結合ドメインとして使用されうる。

【0113】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書中で使用する場合、配列において超可変性であり、及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域それぞれを指す。概して、自然四鎖抗体は、ＶＨにおける３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬにおける３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは概して、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関連して、本明細書中で交換可能に使用される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて様々である。抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかどうかを、当業者は日常的に決定することができる。

【0114】

Ｋａｂａｔは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列に対する付番システムを規定した。当業者は、「Ｋａｂａｔ付番」のこのシステムを、配列自体を超えるいかなる実験データに頼らずに、任意の可変領域配列に一義的に帰属させることができる。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準」Ｋａｂａｔ付番配列との、抗体の配列の相同性の領域におけるアライメントにより、所与の抗体について決定されうる。本明細書中で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」によって記載される付番システムを指す。別記しない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基位置の付番への言及は、Ｋａｂａｔ付番システムに従う。定常領域の付番は、ＥＵ付番指標に従う。

【0115】

ＣＤＲはまた、「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含み、これらは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、簡易ＣＤＲ、又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。別記されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中では上述のＫａｂａｔらに従って付番される。

【0116】

「点突然変異」は、種々のアミノ酸に関して１つ又は複数の単一（不連続）アミノ酸或いは二重アミノ酸の置換又は交換、欠失又は挿入における、操作されていないアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に認識される。好ましい点突然変異は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６１個のトリプレットコドンによってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸を指す。これら２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分割することができる。

【0117】

本明細書中で同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）の配列同一性」は、最大のパーセントの配列同一性を達成するように、必要に応じて、配列を整列させて、ギャップを導入した後の、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義され、配列同一性の一部として、いかなる保存的置換も考慮しない。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0118】

本発明によれば、可変又は定常領域配列の配列同一性は、本明細書中に記載する各々の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％である。

【0119】

「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物として、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施形態において、個体又は対象は、ヒトである。

【0120】

「単離核酸」は、その天然環境の構成成分と分離された核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を包含するが、核酸分子は、染色体外で、又はその天然染色体位置とは異なる染色体位置で存在する。

【0121】

「抗ｏｘＭＩＦをコードする単離核酸」は、単一ベクター又は別々のベクター中にかかる核酸分子を包含する、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子、及び宿主細胞における１つ又は複数の位置で存在するかかる核酸分子を指す。

【0122】

「実質的な交差反応なし」は、分子（例えば、抗体）が、特に当該標的抗原と比較した場合に、分子（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）の実際の標的抗原とは異なる抗原、具体的には還元型ＭＩＦを認識しないか、又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に、約１０％未満～約５％未満結合しうるか、又は約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％、又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の実際の標的抗原とは異なる抗原からなる量で、実際の標的抗原とは異なる抗原を結合しうる。結合は、例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって決定されうる。

【0123】

本発明の抗体の組換え産生は、好ましくは、例えば、抗体型式をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物又はベクターを包含する発現系を含む。
「発現系」という用語は、動作可能な連結で所望のコード配列及び制御配列を含有する核酸分子を指し、その結果、これらの配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされるタンパク質を産生することが可能である。形質転換を達成するためには、発現系は、ベクター上に含まれうるが、続いて、関連ＤＮＡは、宿主染色体に組み込まれうる。或いは、発現系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳に使用することができる。

【0124】

本明細書中で使用する「発現ベクター」は、適切な宿主生物におけるクローニングされる組換えヌクレオチド配列の、即ち組換え遺伝子の転写、及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、更に、宿主細胞における自己複製のための起源又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択可能マーカー（例えば、アミノ酸合成遺伝子又はゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８又はハイグロマイシン等の抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子）、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写終結因子を通常含み、これらの構成成分は、動作可能に一緒に連結される。「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、自己複製ヌクレオチド配列及びゲノム組み込みヌクレオチド配列を包含する。

【0125】

具体的には、上記用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）、例えば本発明の抗体型式をコードするヌクレオチド配列が、宿主を形質転換するように宿主細胞に導入され、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進しうるビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。

【0126】

ベクターは通常、外来遺伝子が挿入される伝播性物質のＤＮＡを含む。ＤＮＡの一方のセグメントを、ＤＮＡの別のセグメントに挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を包含する。

【0127】

「カセット」は、規定の制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコード配列又はセグメントを指す。カセット制限部位は、適正なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するよう設計されている。概して、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位で挿入され、続いて、ベクターによって伝播性ベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞へ運搬される。発現ベクター等のＤＮＡが挿入又は付加されたＤＮＡのセグメント又は配列はまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれうる。ベクターの一般的なタイプはプラスミドであり、これは概して、更なる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二重鎖ＤＮＡの自己完結式分子であり、適切な宿主細胞に容易に導入されうる。本発明のベクターは多くの場合、コードＤＮＡ及び発現制御配列、例えば、プロモーターＤＮＡを含有し、外来ＤＮＡを挿入するのに適した１つ又は複数の制限部位を有する。コードＤＮＡは、本発明の抗体型式等の特定のポリペプチド又はタンパク質に関する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、調節するか、又は他の場合には媒介するか、若しくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、又は異なる遺伝子由来であってもよく、同じか、又は異なる生物由来であってもよい。本発明の組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニング若しくは発現用の１つ又は複数の複製系、宿主における選択用の１つ又は複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ又は複数の発現カセットを包含する。

【0128】

例えば、本発明の要素を提供又コードするＤＮＡ配列、及び／又は目的のタンパク質、プロモーター、終結因子及び更なる配列をそれぞれライゲーションして、組み込み又は宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載される。

【0129】

宿主細胞は、具体的には、本発明によるベクター等の発現構築物でトランスフェクトされた細胞、組換え細胞又は細胞株と理解される。
「宿主細胞株」という用語は、本明細書中で使用する場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の樹立されたクローンを指す。宿主細胞株という用語は、本発明の組換え抗体型式等のポリペプチドを産生するように内因性又は組換え遺伝子を発現するのに使用される場合の細胞株を指す。

【0130】

「産生宿主細胞」又は「産生細胞」は、産生プロセスの産物である本発明の組換え抗体型式を得るように、バイオリアクターにおける培養のための使用準備済の細胞の細胞株又は培養物であると一般的に理解される。本発明による宿主細胞型は、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。

【0131】

「組換え」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば、具体的には組換えベクター又は組換え宿主細胞において取り込まれた異種配列を用いた「遺伝子操作によって調製されること」又は「遺伝子操作の結果」を意味する。

【0132】

本発明の抗体は、任意の既知の十分に樹立された発現系及び組換え細胞培養偽術を使用して、例えば、細菌宿主（原核生物系）又は酵母、真菌、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物系における発現によって産生されうる。本発明の抗体分子は、ヤギ、植物又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を有し、且つマウス抗体産生を欠損している操作されたマウス株であるトランスジェニックマウス等のトランスジェニック生物において産生されうる。抗体はまた、化学合成によって産生されてもよい。

【0133】

特定の実施形態によれば、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ハイブリドーマ及びジャーカットからなる群から選択される細胞の産生細胞株である。より具体的には、宿主細胞はＣＨＯ細胞から得られる。

【0134】

本発明の宿主細胞は、具体的には、例えば、血清に代わるものとして、血漿タンパク質、ホルモン及び成長因子等の他の構成成分を含む無血清培養物中で培養又は維持される。
宿主細胞は、樹立されて、適応されて、無血清下で、任意選択により、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で完全に培養される場合に最も好ましい。

【0135】

本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。
「医薬製剤」という用語は、調製物中に含有される有効成分の生物活性が有効であるのを可能にするような形態で存在し、製剤が投与される対象にとって受け入れられないほど毒性である更なる構成成分を含有しない調製物を指す。

【0136】

「薬学的に許容可能な担体」は、対象にとって無毒性である有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリシン若しくはヒスチジンなどのアミノ酸、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにそれらの組合せである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを包含することが好適である。薬学的に許容可能な物質の更なる例は、湿潤剤、又は少量の、湿潤剤若しくは乳化剤、防腐剤又は緩衝液等の補助物質であり、これらは、抗体の寿命又は有効性を高める。

【0137】

本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」は、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の経過中に実施されうる。治療の所望の効果として、疾患の発症又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的若しくは間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の向上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるのに、又は疾患の進行を減速させるのに使用される。

【0138】

本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体及びそれを含む医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤、診断剤又は予防剤と組み合わせて投与されうる。更なる治療剤として、治療されるべき疾患に応じて、他の抗癌剤、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、化学療法剤、ステロイド、又はチェックポイント阻害剤が挙げられる。

【0139】

本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソーム及び坐剤等の液体、半固形及び固形の投薬形態で存在しうる。好ましい形態は、対象とする投与様式及び治療用途に応じる。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫に使用されるものに類似した組成物等の注射可能な溶液又は注入可能な溶液の形態で存在する。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好ましい実施形態において、抗体は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体は、筋内注射又は皮下注射によって投与される。当業者によって理解されるように、投与経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて様々なである。

【0140】

本発明の抗体の最適化され、有利な特性により、高用量の抗体組成物が投与されうる。具体的には、組成物は、約１０～２５０ｍｇ／ｍｌ、具体的には、２５～１００ｍｇ／ｍｌ、具体的には、≧５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む。

【0141】

抗ｏｘＭＩＦ抗体は、１回投与されてもよいが、より好ましくは、複数回投与される。例えば、抗体は、１日３回～６カ月又はそれより長い期間毎に１回、投与されてもよい。投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週に１回、２週毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回及び６カ月毎に１回等のスケジュールで行われうる。

【0142】

本発明は、ＭＩＦ関連症状、具体的には、炎症性疾患及び過剰増殖性疾患などの免疫疾患のための治療を必要とする対象の治療のための、抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合部分を含む組成物にも関する。一部の実施形態において、治療を必要とする対象はヒトである。

【0143】

「癌」という用語は、本明細書中で使用する場合、増殖性疾患、具体的には、結腸直腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、黒色腫、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（例えば、頭頸部癌、食道癌、及び口腔癌）、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、腎臓癌、甲状腺髄様癌、星細胞腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、及び悪性セミノーマ（上記癌の任意の難治性バーションを含む）、或いは上記癌の１つ又は複数の組合せを指す。

【0144】

本明細書の抗ｏｘＭＩＦ抗体によって治療されうる癌疾患又は癌などの過剰増殖性障害は、任意の組織又は臓器に関与し、脳癌、肺癌、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、頭部癌、頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸結腸癌、食道癌、婦人科癌、鼻咽頭癌、又は甲状腺癌、黒色腫、リンパ腫、白血病又は多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。特に、本発明の抗ｏｘＭＩＦ抗体は、卵巣、膵臓、大腸及び肺の癌の治療に有用である。

【0145】

特定の実施形態において、癌疾患の治療、具体的には、固形腫瘍の治療に非常に好適な抗体は、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、以下の可変ドメイン：
（ａ１）配列番号９及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号９を含み、３６位に保存されたチロシン、及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン
のうちの１つの重鎖可変ドメインを含み、
アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、凝集能及び疎水性が、アミノ酸置換を欠く配列番号６及び配列番号９を含む抗体と比較して低減される、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片である。

【0146】

或いは、固形腫瘍の治療は、配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン、又は３６位にチロシンを含む配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、並びに配列番号６及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを更に含む重鎖可変ドメインを含む、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体によって実施されうる。

【0147】

更に特定の実施形態において、癌疾患の治療、具体的には、固形腫瘍の治療に非常に好適な抗体は、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ及び３３２Ｅを含む機能性変異体；又は
（ｂ）配列番号３若しくは配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、２６８Ｆ、３２４Ｔ及び３３２Ｅを含む機能性変異体；又は
（ｃ）配列番号４若しくは配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、及び３３２Ｅを含む機能性変異体；又は
（ｄ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３５Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、及び３９６Ｌを含む機能性変異体
を含む重鎖定常領域を有する、増強されたエフェクター機能も有する記載された組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体である。

【0148】

本発明は、治療上有効な量の抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合部分を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む、ヒトを含む対象における炎症性疾患、例えば、脈管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、毒素ショック症候群、後天性呼吸促迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎、アトピー性皮膚炎、喘息、結膜炎、発熱、マラリア、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、多発性骨髄腫、急性及び慢性膵炎、１型糖尿病、ＩｇＡ腎症、間質性膀胱炎、ＣＯＶＩＤ後遺症、乾癬、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、腎炎及び腹膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ－ループス腎炎を含む）、喘息、関節リウマチ（ＲＡ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のための方法も包含する。

【0149】

特定の実施形態において、炎症性疾患又は感染性疾患の治療に非常に好適な抗体は、低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、以下の可変ドメイン：
（ａ１）配列番号９及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン、又は
（ａ２）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号９を含み、３６位に保存されたチロシン、及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ１）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｂ２）配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は
（ｂ３）１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸置換を有する配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ及び／又はＷ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン
のうちの１つの重鎖可変ドメインを有し、
アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔに従って付番され、凝集能及び疎水性が、アミノ酸置換を欠く配列番号６及び配列番号９を含む抗体と比較して低減される、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片である。

【0150】

或いは、炎症性疾患又は感染性疾患の治療は、配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン、又は３６位にチロシンを含む配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、並びに配列番号６及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙ及び／又はＬ５Ｑを更に含む重鎖可変ドメインを含む、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体によって実施されうる。

【0151】

更に特定の実施形態において、炎症性疾患又は感染性疾患の治療に非常に好適な抗体は、阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢに対して増加された優先結合も有する、又は高α２，６－Ｎ結合シアリル化を有する、記載する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体である。

【0152】

本発明は、下記の項目を更に包含する：
１．低減された凝集能及び低減された疎水性を有する組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片であって、
ｉ）以下の可変ドメイン：
（ａ）配列番号９及びアミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号９を含み、３６位に保存されたチロシンを更に含み、アミノ酸置換Ｍ３０Ｌ、Ｆ４９Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｐ８０Ｓ、Ｗ９３Ｆの少なくとも１つを更に含む軽鎖可変ドメイン；並びに
（ｂ）配列番号６を含む重鎖可変ドメイン；又は
（ｃ）配列番号６及びアミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＷ９７Ｙの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、アミノ酸置換Ｌ５Ｑ又はＱ９７Ｙの少なくとも１つを更に含む重鎖可変ドメイン
の１つ、又は、
ｉｉ）以下の可変ドメイン
（ａ）配列番号９を含む軽鎖可変ドメイン又は３６位にチロシンを含む配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン、及び
（ｂ）配列番号６及びアミノ酸置換Ｗ９７Ｙを含む重鎖可変ドメイン、又は１つ、２つ、３つ、４つ、若しくは５つのアミノ酸置換を有する配列番号６を含み、アミノ酸置換Ｗ９７Ｙを更に含む重鎖可変ドメイン
を含む、組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体又はその抗原結合断片。

【0153】

２．（ａ）配列番号２若しくは配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｂ）配列番号３若しくは配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、２６８Ｆ、３２４Ｔ及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｃ）配列番号４若しくは配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３９Ｄ、及び３３２Ｅを含む重鎖定常領域；又は
（ｄ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、アミノ酸２３５Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、及び３９６Ｌを含む重鎖定常領域
を含む、重鎖定常領域を含む、増強されたエフェクター機能を有する、項目１の組換え抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0154】

３．配列番号８、１０、１１、１２、及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。
４．配列番号６、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0155】

５．配列番号７、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。
６．配列番号７、１１及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0156】

７．配列番号８、１１及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号３９、又は配列番号４０を含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。
８．配列番号８、１３及び配列番号１、２、３、４若しくは５のいずれか１つ、又は配列番号４１、又は配列番号４２を含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0157】

９．配列番号８、９及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。
１０．配列番号８、１０及び配列番号１、２、３、４又は５のいずれか１つを含む、項目１又は２の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0158】

１１．二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２－Ｆｃ、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）の融合タンパク質（例えば、ＢｉＴＥ）、ミニボディ、ＴａｎｄＡｂ（登録商標）、ＤｕｔａＭａｂ（商標）、ＤＡＲＴ、及びＣｒｏｓｓＭａｂ（登録商標）からなる群から選択される、項目１～１０のいずれか一項記載の抗ｏｘＭＩＦ抗体。

【0159】

１２．医薬の調製における使用のためである、項目１～１１のいずれか一項記載の抗体。
１３．項目１～１１のいずれか一項記載の抗体を、場合により医薬担体又はアジュバントと共に含む医薬組成物。

【0160】

１４．約１０～２５０ｍｇ／ｍｌの項目１～１１のいずれか一項の抗体、具体的には≧５０ｍｇ／ｍｌを含む、項目１３記載の医薬組成物。
１５．皮下投与のために製剤化されている、項目１３又は１４記載の医薬組成物。

【0161】

１６．単独物質として投与されるか、又は治療が、好ましくは、抗ウイルス物質、抗炎症物質、抗癌物質、抗血管新生物質及び抗生物質からなる群から選択される、１つ若しくは複数の活性物質を含む更なる医薬組成物と組み合わされる、項目１３～１５のいずれか一項記載の医薬組成物。

【0162】

１７．炎症性疾患、過剰増殖性障害、感染性疾患又は癌を患う患者の治療、具体的には、喘息、脈管炎、関節炎、敗血症、敗血症性ショック、エンドトキシンショック、毒素ショック症候群、後天性呼吸促迫症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹膜炎、腎炎及び乾癬、大腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、及び肺癌の治療における使用のための、項目１３～１６のいずれか一項記載の医薬組成物。

【0163】

１８．項目１～１１のいずれか一項の抗体をコードする単離核酸。
１９．項目１８の核酸分子（複数可）を含む発現ベクター。
２０．項目１８の核酸又は項目１９の発現ベクターを含有する宿主細胞。

【0164】

２１．項目１～１１のいずれか一項の抗体を産生する方法であって、項目２０の宿主細胞を培養する工程及び細胞培養物から前記抗体を回収する工程を含む方法。
２２．項目１～１１のいずれか一項の抗体を産生するための方法であって、宿主細胞において前記抗体をコードする核酸を発現させる工程を含む方法。

【実施例】

【0165】

本明細書中に記載される実施例は、本発明の例示であり、それを限定することを意図しない。本発明の範囲を逸脱することなく、多くの改変及びバリエーションが本明細書中に記載及び例示される技術に行われうる。したがって、実施例が例示のみであり、本発明の範囲を限定しないことが理解されるはずである。

【0166】

実施例１：新しく設計した抗体の低減された凝集能及び低減された疎水性

【0167】

【表1】

【0168】

疎水性及び凝集を評価するため、新しく設計した抗体は、２つの異なるＳＥＣカラム及びランニング緩衝液条件を使用するゲル濾過（ＳＥＣ）によって、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって解析し、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較した。

【0169】

ＳＥＣのため、試料を、０．０２％Ｔｗｅｅｎを含む５×リン酸緩衝生理食塩水（５×ＰＢＳＴ）中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌの試料を０．７５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、２２℃で、５×ＰＢＳＴ中で実施した。タンパク質ピークは、２１４ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析した。更に、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、２２℃で、１×ＰＢＳ中で実施した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。結果は、メインピークの保持容量（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けした。

【0170】

ＨＩＣ解析のため、全ての試料を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ６．９を使用して、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。抗体の高度に精製された試料を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム上に独立してロードした。５０μｌの試料を注入し、カラム流速を２２℃で１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。ピークの分離は、０～１００％Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容量（ＣＶ）で実行した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析した。結果は、各ピークについて、最大ピークでのＶｒ（ｍｌ）で報告する。

【0171】

結果：対照抗体（Ｃ０００８）は、サイズ排除カラムの総容量（約２４ｍｌ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、約１８ｍｌ Ｅｎｒｉｃｈ６５０）に近い保持容量を示し、それはヒトＩｇＧで予測されるよりもはるかに小さい分子量に相当する（図２Ａ及びＢ）。異常に長い保持は、主に、固定相表面との疎水性相互作用による。更に、高保持容量には、Ｃ０００８では、顕著な量のＩｇＧ二量体及び凝集体が存在した。全ての新しく設計した抗体は、低減された保持容量（Ｖｒ）を示し、カラムとの相互作用の低減、したがって分子の疎水性の低減を実証した（表２、図２Ａ及びＢ）。Ｃ００８３及びＣ００９０は、最低の保持容量（表２、図２Ｂ）を示し、分子量標準と比較した場合、Ｖｒは単量体ヒトＩｇＧの分子量に相当した。更に、抗体二量体及び凝集体は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０の試料中で著しく低減された（図２Ａ及びＢ）。特にＣ００８３及びＣ００９０は、単一の単量体ピークを示した。

【0172】

ＨＩＣカラム保持容量を使用して、抗体は、最少から最大（最低から最高の保持容量）の疎水性ＩｇＧまで順位付けし（図２Ｃ、表３）、結果はＳＥＣ解析からのデータを確証した。新しく設計した抗体Ｃ００８３（保持容量１２．３７）は疎水性が最少であったが、Ｃ０００８（保持容量１４．９２ｍｌ）は疎水性が最大であった。

【0173】

【表2】

【0174】

【表3】

【0175】

図２は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）移動相として５×ＰＢＳＴを使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬゲル濾過カラム上での、Ｃ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｂ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。（Ｃ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体の溶出プロフィールの比較。

【0176】

実施例２：固定化されたＭＩＦへの新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合（Ｋ_Ｄ測定）
ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加した。最後に、結合された抗体を、プロテインＬ－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ＯＤを４５０ｎＭで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する４パラメーターフィットによって決定した（２つの実験の平均が示される）。

【0177】

結果：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する新しく設計した抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図３に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ０００８）を、ｏｘＭＩＦ結合の参照として使用した。結合曲線及びＫ_Ｄを表す算出したＥＣ_５０値は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７６、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０が、Ｃ０００８（ＥＣ５０ ０．７ｎＭ）と比較して、ｏｘＭＩＦへのそれらの親和性を保持したことを明確に示した（ＥＣ５０範囲０．５～１．６ｎＭ、アッセイの変動性内である）（図３Ａ）。驚くべきことに、Ｃ００７７は、Ｃ００７６と比較してＶＬに１つの更なる点突然変異（Ｙ３６Ｆ）だけでｏｘＭＩＦへの親和性が５分の１に減少したが（図３Ａ）、Ｃ００７７の疎水性は著しく減少した（図２Ａ）。

【0178】

別のセットの実験では、エフェクター機能を増加するようにＦｃ部分に突然変異を持つ新しく設計した抗体は、０．４～０．８ｎＭの範囲のＥＣ_５０値を示し、対照抗体Ｃ０００８の明らかな親和性とも正確に一致する（図３Ｂ）。

【0179】

図３は、固定化されたＭＩＦに対する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合を示す（Ｋ_Ｄ測定）。（Ａ）野生型Ｆｃ部分を有する新しく設計した抗体の結合曲線。（Ｂ）エフェクター機能を増加するようにＦｃ部分に突然変異を持つ新しく設計した抗体の結合曲線。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。

【0180】

【表4】

【0181】

実施例３：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の差次的結合
抗ｏｘＭＩＦ抗体を、１５ｎＭの濃度で、４℃で終夜マイクロプレートに固定化した。ブロッキングした後、ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌのｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代理ＮＴＢ－ＭＩＦ（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とインキュベートした。捕捉したｏｘＭＩＦは、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートによって検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって染色し、発色反応を３０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加により停止させた。ＯＤを４５０ｎＭで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、２つ又は３つの実験の平均が示される。

【0182】

結果：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対する新しく設計した抗体の結合は、図４に示される。結果は、新しく設計した抗体Ｃ００７３、Ｃ００７６、Ｃ００７８、Ｃ００８３及びＣ００９０がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには結合しないことを明確に示し、したがって、低減された疎水性及び凝集を有する抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別するそれらの能力を保持する。新しく設計した抗体は、対照抗体Ｃ０００８と比較して類似のＯＤを示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）（図４Ａ）。驚くべきことに、Ｃ００７７は、Ｃ００７６と比較してＶＬに１つの更なる点突然変異（Ｙ３６Ｆ）だけでｏｘＭＩＦへの結合が著しく減少したことを示した（図４Ａ）。Ｃ００７７は明らかに低減した疎水性を示す（図２Ａ）が、結合特性は維持できなかった。

【0183】

別のセットの実験では、エフェクター機能を増加するようにＦｃ部分（Ｃ００９７～Ｃ０１００）に突然変異を含有する新しく設計した抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別する能力も維持し、抗体Ｃ０００８と比較して類似のＯＤを示した（図４Ｂ）。

【0184】

図４は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計した抗体の差次的結合を示す。（Ａ）野生型Ｆｃ部分を有する新しく設計した抗体の差次的結合。（Ｂ）エフェクター機能を増加するようにＦｃ部分に突然変異を持つ新しく設計した抗体の差次的結合。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。

【0185】

実施例４：Ｆｃ変異した新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体により増強されたエフェクター機能
上記のように、Ｆｃ部分における突然変異による抗体のＡＤＣＣ能を増加させる努力がなされた。Ｆｃ受容体媒介抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＣ）は、それにより、抗体が排除のための疾患細胞を標的化する作用の重要なメカニズムである。標的結合抗体のＦｃエフェクター部分が、エフェクター細胞の細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体にも結合する場合、２つの細胞型の複数の架橋結合が生じ、ＡＤＣＣの経路活性化をもたらす。エフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体、Ｖ１５８（高親和性）変異体、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する操作したジャーカット細胞を使用して、抗体のＡＤＣＣ活性を決定し、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として、産生されたルシフェラーゼにより定量した。

【0186】

ＡＤＣＣ受容体アッセイは、基本的に、一部を改変し、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｇ７０１０）によって推奨されるように実施された。簡潔に述べれば、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、本明細書に記載の新しく設計した抗体（Ｃ００９７～Ｃ０１００）の段階希釈を、ジャーカットエフェクター細胞と共に添加し、プレートを加湿したインキュベーター内で３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。最後に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加し、発光（ＲＬＵ）をＴｅｃａｎマルチプレートリーダーで測定した（０．５ｓ積算時間）。Ｃ０００８を参照抗体として使用した。

【0187】

結果：Ｆｃ突然変異を持つ全ての新しく設計した変異体（Ｃ００９７～Ｃ０１００）は、漸増濃度の新しく設計した抗体による著しい用量応答を示したが、抗体Ｃ０００８はジャーカットレポーター細胞のＦｃγＲＩＩＩＡ媒介活性化を誘導しなかった（図５）。

【0188】

図５は、改変ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｇ７０１０）における新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の増強されたエフェクター機能を示す。Ｃ０００８と対照的に、全ての新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ジャーカットレポーター細胞のＦｃγＲＩＩＩＡ媒介活性化を誘導する（ｎ＝２）。

【0189】

実施例５：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の生体内分布
Ｃ０００８と比較した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の生体内分布は、同系大腸癌モデルＣＴ２６の皮下腫瘍を持つ雌のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて調べた。雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、ＰＢＳ中３×１０^５個のＣＴ２６細胞の皮下注射を片側に受けた（１００μｌ／動物）。個々の腫瘍容積が１５０～３００ｍｍ^３に達すると、マウスは治療群に割り当てられ、５ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ標識Ｃ００８３の単回皮下投与を受けた。２匹のマウスを、未処置の「無シグナル」対照として使用した。

【0190】

Ｃ０００８及びＣ００８３は、製造業者の説明書に従ってＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ Ｐｒｏｔｅｉｎ標識キット－高ＭＷを使用して、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷによって標識した。標識プロセス後及び標識抗体のマウスへの注入前に、タンパク質濃度及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の標識効率を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して決定し、マウスは、標識後のタンパク質濃度に基づいて投与された。Ｉｎ ｖｉｖｏ画像化は、以下の時点：投与後１、６～８、２４、４８、７２、９６、１６８時間での標識抗体の投与時に、ＬＩ－ＣＯＲ Ｐｅａｒｌ（登録商標）Ｔｒｉｌｏｇｙ画像化装置で実施した。画像解析を実施し、腫瘍における抗体の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を定量した（ＲＦＵ＝ＲＦＵ腫瘍面積－ＲＦＵバックグラウンド）。

【0191】

結果：静脈内投与した８００ＣＷ標識Ｃ０００８（図６Ａ）及びＣ００８３（図６Ｂ）の、２４ｈがピークの顕著な腫瘍内分布及び７日までの腫瘍保持を決定した。これは、Ｃ００８３の腫瘍浸透特性が保持されるか又は対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して改善さえされることを明確に実証した。２つの抗体を個々の実験で試験し、画像のスケーリングをそれぞれの実験について最適化した。しかしながら、両方の実験に同じスケーリングを使用すると、Ｃ０００８と比較したＣ００８３の改善された腫瘍浸透及び保持がより明確になった（図６Ｄ）。腫瘍領域のピクセル強度がデジタル的に評価される場合、Ｃ００８３の改善された腫瘍浸透及び保持が更により明らかになった（図６Ｅ）。未処置の対照マウスではシグナルは検出されなかった（図６Ｃ）。

【0192】

図６は、皮下ＣＴ２６腫瘍を持つマウスのｉｎｆｒａ－ｒｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ画像化による、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の腫瘍浸透を示す。写真は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体の注射の１ｈ、６ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ及び１６８ｈ後に撮った。Ａ：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ０００８（５ｍｇ／ｋｇ）を受けたマウス；Ｂ：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を受けたマウス；Ｃ：未処置の対照マウス、Ｄ：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識Ｃ００８３（５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を受けたマウスであり、画像はＡと同じスケーリングを使用して示した；Ｅ：デジタル画像解析によって定量したＣ００８３及びＣ０００８の腫瘍浸透及び保持。

【0193】

実施例６：新しく設計した抗体Ｃ００８３の産生の改善
新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３は、Ｃ０００８と比較して、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）における一過的発現によって産生した。簡潔に述べると、５０～２００ｍｌの指数関数的に増加するＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して一過的にトランスフェクトし、製造業者の説明書「標準プロトコール」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に従って、加湿したインキュベーター内で、３７℃で８日間培養した。細胞を遠心分離によって除去し、上澄み液を、４０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２で１：１に希釈した。希釈した上澄み液を、０．２μｍで濾過し、室温でＮＧＣ ＱＵＥＳＴ １０クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に適用した。カラムは、１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２によって洗浄し、抗体は、１０カラム容量の１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５中に溶出した。抗体は、すぐにｐＨ５に中和し、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ Ｐ－６脱塩カートリッジによって１×ＰＢＳ ｐＨ７．２中で調製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離装置（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ技術及びそれらのそれぞれの吸光係数を使用して決定した。Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａ及び中和後の精製抗体の量（それぞれの抗体の最終収率）を細胞培養容積によって割り、結果の値は、本明細書中では抗体力価（ｍｇ／Ｌ）と呼ばれる。

【0194】

結果：Ｃ０００８と比較して、Ｃ００８３の３つの個々の産生は、新しく設計した抗体Ｃ００８３が著しくよく産生されたことを明確に示した（独立ｔ検定、ｐ＝０．０３）。Ｃ０００８（９３ｍｇ／Ｌ）と比較して高い抗体力価（１１７ｍｇ／Ｌ）が得られた（図７）。

【0195】

図７は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３の改善された産生を示す。
実施例７：増強されたＡＤＣＣ活性を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善された産生
疎水性及び凝集傾向を低減する突然変異を持つが、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ突然変異も持つ抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ００９７、Ｃ００９８及びＣ０１００）は、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）における一過的発現によって産生した。簡潔に述べると、５０ｍｌの指数関数的に増殖するＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して一過的にトランスフェクトし、製造業者の説明書（「標準プロトコール」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に従って、加湿したインキュベーター内で、３７℃で８日間培養した。細胞を遠心分離によって除去し、１／１０容量の２００ｍＭリン酸ナトリウム、１５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２を上澄み液に添加した。希釈した上澄み液を、０．２μｍで濾過し、室温でＮＧＣ ＱＵＥＳＴ １０クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して、ＨｉＴｒａｐ Ｆｉｂｒｏ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に適用した。カラムは、１０カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２によって洗浄し、抗体は、１０カラム容量の１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．５中に溶出した。抗体は、グリシンによってすぐにｐＨ５に中和し、最終濃度２５０ｍＭのグリシンにした。タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ技術及びそれらのそれぞれの吸光係数を使用して決定した。ＨｉＴｒａｐ Ｆｉｂｒｏ Ｐｒｉｓｍ Ａ及び中和後の精製抗体の量（それぞれの抗体の最終収率）を細胞培養容積によって割り、結果の値を、本明細書中では抗体力価（ｍｇ／Ｌ）と呼ぶ。比較のため、疎水性／凝集に関するＶＨ／ＶＬ最適化はしないが、ＡＤＣＣ活性を改善する同一のＦｃ突然変異を持つ抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ００６４、Ｃ００６５及びＣ００６７）を、同じ手順によって産生した。

【0196】

結果：改善された疎水性／凝集傾向を有する抗ｏｘＭＩＦ抗体（Ｃ００９７、Ｃ００９８及びＣ０１００）の産生は、Ｃ０００８のＶＨ及びＶＬドメインを含むそれらのそれぞれの対応物（Ｃ００６４、Ｃ００６５及びＣ００６７）と比較して著しく高い力価をもたらした（図８）。

【0197】

図８は、増強されたエフェクター機能を有するが、Ｃ０００８のＶＨ及びＶＬドメインを含むそれらのそれぞれの相対物と比較した、増強されたエフェクター機能並びに低減された疎水性及び凝集能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の改善された産生を示す（Ｃ００９７対Ｃ００６４、Ｃ００９８対Ｃ００５６、及びＣ０１００対Ｃ００６７の比較）。

【0198】

実施例８：増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集傾向及び低減された疎水性
疎水性及び凝集を評価するため、抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、新しく設計した抗体をゲル濾過（ＳＥＣ）により及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により解析した。

【0199】

ＳＥＣのため、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの試料を１．２５ｍｌ／ｍｉｎの流速でＥｎｒｉｃｈ６５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）ゲル濾過カラムに適用した。分離及び平衡は、室温で、１×ＰＢＳ中で実施した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、ＣｈｒｏｍＬａｂソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用して解析した。結果は、メインピークの保持容積（Ｖｒ、ｍｌ）で報告し、凝集体の存在は手動で順位付けした。

【0200】

ＨＩＣ解析のため、全ての試料を、５０ｍＭリン酸及び０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８を使用して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。抗体の高度に精製された試料（約１００μｇ）を、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム上に独立してロードした。１００μｌの試料を注入し、カラム流速を室温で１ｍｌ／ｍｉｎに維持した。ピークの分離は、０～１００％Ｂ（緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸、２０％イソプロパノール；ｐＨ７．０）の勾配の２０カラム容積（ＣＶ）で実行した。タンパク質ピークは、２８０ｎｍの吸光度を使用してモニターし、スペクトルは、Ｕｎｉｃｏｒｎエマルションソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して解析した。結果は、各ピークについて、最大ピークでのＶｒ（ｍｌ）で報告した。

【0201】

結果：対照抗体Ｃ０００８は、サイズ排除カラムの総容量（約１６ｍｌ）に近い保持容量を示し、それはヒトＩｇＧで予測されるよりもはるかに小さい分子量に相当する（図９Ａ）。異常に長い保持は、主に、固定相表面との疎水性相互作用による。更に、高保持容量には、Ｃ０００８では、顕著な量のＩｇＧ二量体及び凝集体が存在した。新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、著しく低減された保持容量（Ｖｒ）を示し、カラムとの相互作用の低減、したがって分子の疎水性の低減を実証した（図９Ａ、表５）。分子量標準と比較した場合、Ｖｒは単量体ヒトＩｇＧの分子量に相当する。更に、抗体二量体及び凝集は、新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の試料中には存在しなかった（図９Ａ）。

【0202】

ＨＩＣを使用して、Ｖｒは、解析した抗体の疎水性に正比例し、即ち、より高いＶｒは分子がより疎水性である。新しく設計した抗体（Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８及びＣ０１０９）のＨＩＣ解析は、対照抗体Ｃ０００８（図９Ｂ、保持容量２０．８ｍｌ、表６）と比較して、それらの疎水性が著しく低い（図９Ｂ、保持容量１５．２～１６．２ｍｌ、表６）ことを確認した。

【0203】

結論：新しく設計した抗体が、改善された生化学特性、特に低減された疎水性及び凝集傾向を有することは、ＳＥＣ及びＨＩＣ解析から明らかである。

【0204】

【表5】

【0205】

【表6】

【0206】

図９は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された凝集及び疎水性を実証するクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）移動相として１×ＰＢＳを使用する、Ｅｎｒｉｃｈ６５０ゲル濾過カラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）と、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の溶出プロフィールの比較；（Ｂ）ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ ＨＩＣカラムにおけるＣ０００８（対照抗体、グレー領域）及び新しく設計した抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８及びＣ０１０９の溶出プロフィールの比較。

【0207】

実施例９：Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞への、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０の低減された非特異的結合
Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞株は、Ａ２７８０卵巣癌細胞株におけるヒトＭＩＦ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって生成した。Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞株における内因性ヒトＭＩＦタンパク質の不在は、ポリクローナル抗ヒトＭＩＦ抗体を使用するサンガーシークエンシング及びウェスタンブロッティングによって確認した。

【0208】

Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｉｐｐｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ＃２５－０５６－Ｃ１）によって剥がし、染色緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）によって洗浄し、９６ウェルのＵ底プレートにウェル当たり２×１０^５個の細胞をプレートした。細胞を、ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏ７８０（ＰＢＳ中で１：２０００希釈）によって４℃で２０分間染色し、染色緩衝液によって洗浄した。細胞を、５０μｌの染色緩衝液中に再懸濁し、５０μｌの段階希釈の新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８、Ｃ０１０９、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８又はアイソタイプＩｇＧ（最終濃度３７ｎＭ～９．４ｎＭ）を添加した。４℃で４０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、１００μｌの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、１：１００希釈）中に再懸濁した。４℃で３０分間インキュベーション後、細胞を染色緩衝液によって洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中に再懸濁し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ－Ｓフローサイトメーターで獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏによって解析し、生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで抗体濃度に対してプロットした。

【0209】

結果及び結論：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、それらのＧｅｏＭｅａｎがアイソタイプＩｇＧ陰性対照のものに非常に近いため、Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞に結合しないことが図１０から明らかである。反対に、参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８は、Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞に顕著な結合を示したが、それらはＭＩＦを発現しない。したがって、疎水性の低減は、Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－への、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３、Ｃ００９０、Ｃ０１０８及びＣ０１０９の非特異的結合の強い低減又は除去をもたらしたが、抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８は、その疎水性により細胞表面に非特異的に結合する。

【0210】

図１０は、ＦＡＣＳによって決定したＡ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞における新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の低減された非特異的結合を示す。Ａ２７８０ＭＩＦ^－／－細胞は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００９０、Ｃ０１０９（Ａ）；Ｃ００８３、Ｃ０１０８（Ｂ）又は対照抗体Ｃ０００８並びに陰性対照としてアイソタイプＩｇＧによって染色した。生存細胞のＧｅｏＭｅａｎ（ＡＦ４８８の平均蛍光強度）を抗体濃度に対してプロットした。

【0211】

実施例１０：固定化されたＭＩＦへの、増強したエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合（Ｋ_Ｄ予測）
ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦを、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレートに固定化した（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５に従って、ＭＩＦをｏｘＭＩＦに変換）。ブロッキングした後、抗ｏｘＭＩＦ抗体の段階希釈を、プレートに添加した。最後に、結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲート、及び基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって検出した。発色反応を３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。異なる実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用する４パラメーターフィットによって決定した（２つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される）。

【0212】

結果及び結論：固定化されたＭＩＦ（ｏｘＭＩＦ）に対する、増強したエフェクター機能を有する新しく設計した抗体の結合を広範な濃度にわたり測定し、生じる結合曲線を図１１に示す。抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、ｏｘＭＩＦ結合の参照として使用した。結合曲線及びＫ_Ｄを表す算出したＥＣ_５０値は、新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９が、Ｃ０００８と比較して、ｏｘＭＩＦへのそれらの低ナノモルの親和性を保持したことを明確に示した（図１１、表７）。

【0213】

図１１は、固定化されたｏｘＭＩＦに対する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の結合曲線（Ｋ_Ｄ予測）を示す；抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を参照抗体として使用した。

【0214】

【表7】

【0215】

実施例１１：ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体の差次的結合
抗ｏｘＭＩＦ抗体及び無関係のヒトＩｇＧ対照を、１５ｎＭの濃度で、４℃で終夜マイクロプレートに固定化した。ブロッキングした後、ウェルを、５０ｎｇ／ｍｌのｒｅｄＭＩＦ又はｏｘＭＩＦ代理ＮＴＢ－ＭＩＦ（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８）とインキュベートした。捕捉したｏｘＭＩＦは、ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦ抗体及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰによって検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によって染色し、発色反応を３０％Ｈ_２ＳＯ_４の添加により停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで測定した。２つの実験からのデータを、それぞれの実験の抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８の最大ＯＤ（＝１００％）に対して正規化し、２つ又は３つの実験の平均＋／－ＳＥＭが示される。

【0216】

結果及び結論：可溶性ｏｘＭＩＦ及びｒｅｄＭＩＦに対する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体の結合は、図１２に示される。結果は、新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９がｏｘＭＩＦに強く結合するが、ｒｅｄＭＩＦには検出可能に結合しないことを明確に示した。新しく設計した抗体は、参照抗体Ｃ０００８と非常に類似したＯＤを示し、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別することが記載された（Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。無関係のＩｇＧ１対照では、特異的結合は観察されなかった。したがって、増強されたエフェクター機能並びに低減された疎水性及び凝集を有する新しく設計した抗体は、ｏｘＭＩＦとｒｅｄＭＩＦを区別するそれらの能力を保持した。

【0217】

図１２は、ｒｅｄＭＩＦと比較したｏｘＭＩＦへの、新しく設計したＦ抗体の差次的結合を示す。Ｃ０００８は参照抗体として、アイソタイプＩｇＧは陰性対照として使用した。

【0218】

実施例１２：ＳＰＲを使用するヒト及びマウスｏｘＭＩＦに対する新しく設計した抗体の親和性決定
新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９、並びに対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、標準的なアミンカップリング条件を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５光学センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に、それぞれフローセルＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４に約２５００、１５００又は１００ＲＵの密度に固定化した。ＦＣ１を参照セルとして使用し、緩衝液とのみ反応させた。マウス又はヒト組換えＭＩＦを、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中で、０．２％プロクリン３００（活性構成成分５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン；Ｓｉｇｍａ社）の存在下で、５０、７５、１００又は１５０ｎＭの濃度に希釈して、室温で３時間、ＭＩＦをｏｘＭＩＦ代替物に変換した（Ｔｈｉｅｌｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。プロクリン３００で処置したＭＩＦを、固定化された抗ｏｘＭＩＦ抗体に、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、３分間３０μｌ／ｍｉｎの流速で適用した。解離時間は３００秒であり、チップは、３分間１０ｍＭ ＨＣｌを使用して再生した。一連の濃度の動態を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によって提供される質量輸送の埋め合わせを有する反復性ラングミュア１：１相互作用モデルを使用して、参照セル（ＦＣ１）からバックグラウンドを差し引いた後、各結合曲線への局所的な同時結合／解離フィッティングによって解析した。データは、フローセル２～４の算出したＫ_Ｄ値の平均＋／－ＳＤ（標準偏差）として表す。

【0219】

結果及び結論：ＳＰＲによって決定された、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体の、可溶性ヒト及びマウスｏｘＭＩＦに対する結合を表８に示す。結果は、新しく設計した抗体が、約３ｎＭのナノモル親和性を有し、それは対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と同じ範囲内であることを明確に示した。マウスｏｘＭＩＦに対する親和性は、全ての抗ｏｘＭＩＦ抗体で、ヒトｏｘＭＩＦと比較して約５～８分の１であった。したがって、増強したエフェクター機能並びに低減された疎水性及び凝集を有する新しく設計した抗体は、ヒト及びマウスｏｘＭＩＦに対してそれらの親和性を保持した。

【0220】

【表8】

【0221】

実施例１３：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０の薬物動態
新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０並びに対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに静脈内注射した。Ｋ_２－ＥＤＴＡコートキャピラリーを使用する尾静脈穿刺による注射の４、１０、２４、４８及び９６時間後に２０μｌの血液を回収し、６０μｌのＰＢＳを含有するＫ_２－ＥＤＴＡコートバイアルに移した。遠心分離後、上澄み液（＝１：４希釈血漿）を、定量的抗ｏｘＭＩＦ ＥＬＩＳＡによって解析した。

【0222】

簡潔に述べると、ＰＢＳ中に希釈した１μｇ／ｍｌの組換えヒトＭＩＦ（ＯｎｃｏＯｎｅ社）を、４℃で終夜ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）に固定化した。希釈緩衝液（ＤＢ、２％ Ｆｉｓｈ Ｇｅｌａｔｉｎｅ／ＴＢＳＴ）によりブロッキングした後、希釈した血漿試料（最終希釈１：１００～１：１００，０００）を、プレートに添加した。結合された抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰコンジュゲート（ＴＢＳＴ中１：４０，０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社＃３２４２０）を使用して検出した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社＃３４０２９）を基質として添加し、発色反応を５０μｌの３０％Ｈ_２ＳＯ_４で停止させ、ＯＤを４５０ｎＭで測定した。Ｃ０００８、Ｃ００８３及びＣ００９０の段階希釈を使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて双曲線回帰解析を使用して標準曲線を作成し、抗体の血漿濃度を算出した。時点当たりの抗体の平均濃度を回収時間に対してプロットし、半減期をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて単相減衰モデルによって算出した。

【0223】

結果：図１３は、単一指数関数的減衰関数に従って、抗ｏｘＭＩＦ抗体の薬物動態を示す。算出した半減期は、それぞれ、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８では１１時間であり、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０では１５時間であった。更に、単一指数関数的減衰関数下の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、全抗体曝露及び生物学的利用能を推定した。ＡＵＣは、Ｃ０００８、Ｃ００８３及びＣ００９０では、それぞれ１６００、３７８４及び３２６６であると算出された。

【0224】

新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０の薬物動態は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して示される。抗体の血漿濃度は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｏｘＭＩＦ抗体の単回静脈内注射の４、１０、２４、４８及び９６時間後に、定量的抗ｏｘＭＩＦ ＥＬＩＳＡによって測定し、半減期は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの単相減衰モデルによって算出した。

【0225】

結論：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ００８３及びＣ００９０の可変領域における置換は、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、１．４倍長い半減期及び＞２倍高い生物学的利用能（ＡＵＣ）をもたらした。

【0226】

実施例１４：レポーターアッセイによって決定された新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増加されたエフェクター機能
エフェクター細胞として、ＡＤＣＣを明らかにするヒトＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８（高親和性アロタイプ）又はＦ１５８（低親和性アロタイプ）、又はＡＤＣＰを明らかにするヒトＦｃγＲＩＩａ Ｈ１３１アロタイプ受容体のいずれかを安定に発現する操作したジャーカット細胞、及びホタルルシフェラーゼのＮＦＡＴ応答エレメント駆動発現を使用して、抗体の生物学的活性を、ＮＦＡＴ経路活性化の結果として産生されたルシフェラーゼにより定量した。

【0227】

高応答性の標的細胞を生成するため、ＨＣＴ１１６及びＡ２７８０細胞を、ｈｕＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってトランスフェクトし、ジェネテシンによって選択し、ＦＡＣＳによってソートして膜係留単量体ヒトＭＩＦを安定に発現する細胞株（ＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ）を生成し、即ちＭＩＦは、ｏｘＭＩＦエピトープが抗ｏｘＭＩＦ抗体に接近可能である単量体タンパク質として提示される（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８）。これらの細胞株は、細胞表面でのｏｘＭＩＦの提示の増加を示し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のための感度の良いツールである。

【0228】

ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰレポーターアッセイは、基本的に、製造業者によって推奨されるように実施した（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｇ７０１０及び＃Ｇ９９９１）。手短に言えば、１００μｌの培養培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ及び５％低ＩｇＧ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地）中の１×１０^４個の細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（図１４Ａ及びＣ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（図１４Ｂ）細胞を９６ウェルプレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートし、接着させた。その後、段階希釈の増強したエフェクター機能を有する新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９又はｗｔ Ｆｃを有する対照抗体Ｃ０００８（最終濃度０．０１～１００ｎＭ）及びジャーカットエフェクター細胞（図１４Ａ、Ｂ、ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞；図１４Ｃ、ＦｃγＲＩＩａ－エフェクター細胞）を、約６：１のエフェクター対標的細胞比で、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。最後に、アッセイプレートを室温に平衡化し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加した。Ｔｅｃａｎマルチプレートリーダーを使用して、１０～２０分のインキュベーション後に発光（ＲＬＵ）を測定した（０．５ｓ積算時間）。

【0229】

結果：Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、ＡＤＣＣ（図１４Ａ、Ｂ）又はＡＤＣＰ（図１４Ｃ）レポーター細胞の強い活性化を示すが、対照抗体Ｃ０００８は、それらがＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（図１４Ａ、Ｃ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（図１４Ｂ）細胞と共培養された場合、ジャーカットレポーター細胞のＦｃｙＲＩＩＩａ（ＡＤＣＣ、図１４Ａ、Ｂ）又はＦｃｙＲＩＩａ（ＡＤＣＰ、図１４Ｃ）媒介活性化を誘導しない、又はわずかにのみ誘導したことが、図１４Ａ～Ｃから明らかである。

【0230】

結論：Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、ｗｔ Ｆｃを担持する対照抗体Ｃ０００８と比較して、レポーターバイオアッセイにおいて非常に増加したＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を示した。

【0231】

図１４は、レポーターアッセイによって決定した新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたエフェクター機能を示す。（Ａ、Ｂ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩＩａ（Ｖは高応答アロタイプ、Ｆは低応答アロタイプ）を安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ（Ａ）又はＡ２７８０－ｐＭＩＦ（Ｂ）標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ；（Ｃ）ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、ＦｃｙＲＩＩａを安定に発現する操作したジャーカットエフェクター細胞及びＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦ標的細胞を使用する、増強されたエフェクター機能を有する新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９によるＡＤＣＰレポーターバイオアッセイ。平均及びＳＥＭが示される（ｎ＝２～４）。

【0232】

実施例１５：ＰＢＭＣ細胞溶解バイオアッセイによって決定された新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたＡＤＣＣ機能
このアッセイは、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体によって誘導される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）から生じる細胞溶解を決定するために実施した。細胞傷害性は、ＬｇＢｉｔ（ＬａｒｇｅＢｉＴ）及びフリマジン（基質）を含有する非溶解性検出試薬を使用する標的細胞からのＨｉＢｉＴタグタンパク質の放出を定量するＨｉＢｉＴ検出アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって測定した。ＨｉＢｉＴ及びＬｇＢｉＴは、機能性ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）酵素に自然にアセンブルし、基質の存在下で定量可能な発光シグナルを放出する。

【0233】

高度に感受性のレポーター標的細胞を生成するため、ＨＣＴ１１６細胞をＨａｌｏＴａｇ－ＨｉＢｉＴプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃ＣＳ１９５６Ｂ１７）によってトランスフェクトし、ブラストサイジンによって選択し、細胞プールとしてＦＡＣＳによってソートした。安定なＨｉＢｉＴ発現細胞プールを、次いで、ｈｕＭＩＦ－ｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってトランスフェクトし、ジェネテシンによって選択し、ＦＡＣＳによってソートして、細胞内ＨｉＢｉＴ及び膜係留単量体ヒトｏｘＭＩＦを安定に発現する細胞プール（ＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ）を生成し、即ちＭＩＦは、ｏｘＭＩＦエピトープが抗ｏｘＭＩＦ抗体に接近可能である単量体タンパク質として提示される（Ｓｃｈｉｎａｇｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８）。これらの細胞株は、細胞表面でのｏｘＭＩＦの提示の増加を示し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のための感度の良いツールである。

【0234】

手短に言えば、５０μｌの培養培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ／Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎ及び５％超低ＩｇＧ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地）中の１×１０^４個の細胞／ウェルのＨＣＴ１１６－ＨｉＢｉＴ－ｐＭＩＦ標的細胞を９６ウェルプレートに播種し、加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で終夜インキュベートし、接着させた。その後、５０μｌの培養培地中の段階希釈の新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９又はｗｔ Ｆｃを有する対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８（最終濃度０．０１～１００ｎＭ）及び２人の個々の健常ドナーからの５０μｌのヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（４×１０^５個の細胞／ウェル；エフェクター対標的細胞比；４０：１）をプレートに添加した。２人の異なるドナーのＰＢＭＣをＦＡＣＳ解析によって特徴付け、このアッセイの関連細胞型であるＮＫ細胞のそれらの含量を評価した。抗体及びＰＢＭＣの添加後、プレートは、加湿したインキュベーター内で、３７℃及び５％ＣＯ_２で、終夜インキュベートした。翌日、１０μｌのＮａｎｏ－Ｇｌｏ ＨｉＢｉＴ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｎ２４２１）を添加し、発光シグナル（ＲＬＵ、積算時間０．１ｓ）をＴｅｃａｎプレートリーダーで測定した。アッセイを実施して、二重又は三重の解析した試料及びドナーを含めた。

【0235】

結果：Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８と比較して、両ドナー（図１５Ａ、２２％ＮＫ細胞；図１５Ｂ、７％ＮＫ細胞）からのＰＢＭＣにより大きく増加したＡＤＣＣ活性を示した。

【0236】

結論：Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、ｗｔ Ｆｃを担持する対照抗ｏｘＭＩＦ抗体と比較して、ＰＢＭＣ媒介性細胞死滅アッセイにおいて非常に増加したＡＤＣＣ活性を示した。

【0237】

図１５は、ＰＢＭＣ媒介細胞傷害性バイオアッセイによって決定されたＦｃ部分においてＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９の増強されたＡＤＣＣ活性を示す。ｗｔ Ｆｃを有する抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８と比較した、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９並びにエフェクター細胞としてＰＢＭＣ（Ａ：２２％ ＮＫ細胞、Ｂ：７％ ＮＫ細胞）及び標的細胞としてＨＣＴ１１６－ｐＭＩＦによるＡＤＣＣバイオアッセイ。２人の健常ドナーからのＰＢＭＣを使用する２つ又は３つの反復の平均及びＳＥＭが示される。

【0238】

実施例１６：新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体は、強く低減されたヒトＰＢＭＣからの非特異的サイトカイン放出を示す。
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、様々な要因、例えば感染によって駆動されうる全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の形態である。ＣＳＲは、一部のモノクローナル抗体薬の有害作用としても公知である。ＣＲＳは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、及び単球を含む多くの白血球が活性化される場合に生じ、中でもＩＬ－６、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１のような炎症性サイトカインを放出し、病原性の炎症の正のフィードバックループにおいて、より白血球を活性化する。このプロセスは、調節不全な場合、全身性過炎症、低血圧性ショック、及び多臓器不全により生命に危機を及ぼしうる。したがって、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＰＭＢＣから炎症性サイトカインを放出するそれらの能力について評価した。

【0239】

手短に言えば、９６ウェルプレートにおいて、５％超低ＩｇＧ血清を補足した１５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９（両方とも７０ｎＭ）並びに抗ｏｘＭＩＦ対照抗体Ｃ０００８（７０ｎＭ）を、３人の健常ドナーからの新しく解凍したＰＢＭＣ（ウェル当たり４～５×１０^５個の細胞）とインキュベートした。加湿したインキュベーター内で、３７℃／５％ＣＯ_２で、終夜インキュベートした後、プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞をペレットにし、上澄み液を９６ウェルのＶ底プレートに移した。透明な上澄み液を、製造業者のプロトコールに従って、ヒトＩＬ－６及びヒトＭＣＰ－１について、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄアッセイによって解析した。測定は、９６ウェルプレートローダーを有するＣｙｔｏＦｌｅｘ－Ｓサイトメーターで行った（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）。ビーズ分類チャネルはＡＰＣ（レーザー６３８ｎｍからの励起、帯域通過フィルター６６０／１０ｎｍ）であったが、レポーターチャネルはＰＥ（イエローレーザー５６１ｎｍからの励起、帯域通過フィルター５８５／４２ｎｍ）であった。データは、ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘ解析ソフトウェア（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を使用して解析し、グラフはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで産生した。平均＋／－ＳＥＭは、３人の異なるＰＭＢＣドナーから示した。

【0240】

結果及び結論：Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９が、驚くべきことに、Ｃ０００８と比較して、７０ｎＭまでの濃度でＰＢＭＣからＩＬ－６及びＭＣＰ－１の放出を示さない、又は無視できることは図１６から明らかである。Ｃ０１０８及びＣ０１０９は、ｗｔ Ｆｃ部分を持つ参照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８よりも、Ｆｃｙ受容体に対する高親和性による高レベルのサイトカイン放出を誘導することが予測された。Ｃ０００８は同じ濃度（７０ｎＭ）でＩＬ－６及びＭＣＰ－１の顕著な放出を誘導したが、明らかに高い凝集能及びその疎水性による非特異的結合による。抗体治療の凝集は、たとえわずかであっても、免疫細胞からのサイトカイン放出を大きく強めることが公知である。

【0241】

図１６は、新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体が、ヒトＰＢＭＣからの強く低減された非特異的サイトカイン放出を示すことを示す。Ｆｃ部分にＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ増強突然変異を持つ新しく設計した抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０１０８及びＣ０１０９（７０ｎＭ）並びに対照抗ｏｘＭＩＦ抗体Ｃ０００８（７０ｎＭ）を、ヒトＰＢＭＣと終夜インキュベートし、上澄み液を、ヒトＩＬ－６（Ａ）及びヒトＭＣＰ－１（Ｂ）についてＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘサイトメトリービーズアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で解析した。サイトカイン濃度についての平均＋／－ＳＥＭは、３人の異なるＰＭＢＣドナーから示される。
参照文献
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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】