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特表2023-545972アルファ－シヌクレイン発現を抑制するための新規ジンクフィンガータンパク質転写因子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-01
(54)【発明の名称】アルファ－シヌクレイン発現を抑制するための新規ジンクフィンガータンパク質転写因子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231025BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231025BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231025BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20231025BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231025BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231025BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231025BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231025BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231025BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20231025BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231025BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231025BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231025BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20231025BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231025BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231025BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20231025BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20231025BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231025BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/47
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
C12N5/0735
C12N15/12
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12N5/079
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61K35/761
A61K48/00
A61K31/7088
A61K35/30
A61K35/545
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023520130
(86)(22)【出願日】2021-10-01
(85)【翻訳文提出日】2023-05-30
(86)【国際出願番号】 US2021053166
(87)【国際公開番号】W WO2022072826
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】63/087,164
(32)【優先日】2020-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508241200
【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ハタミ，アサ
(72)【発明者】
【氏名】ザイトラー，ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，レイ
(72)【発明者】
【氏名】パション，デイビッド エマニュエル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA56
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA161
4C084ZA162
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA56
4C086MA65
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB45
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA56
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA16
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、神経系においてアルファ-シヌクレインの発現を阻害するジンクフィンガー融合タンパク質、ならびにパーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、および他の神経変性疾患を治療するためにそのタンパク質を使用する方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ＺＦＰドメインがヒトアルファ－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ遺伝子）の標的領域に結合する、融合タンパク質。
【請求項2】
前記標的領域が、前記ＳＮＣＡ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ以内にある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＴＳＳがＴＳＳ１、２ａ、または２ｂである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記標的領域が、ＳＮＣＡ遺伝子の、ＴＳＳ１の上流５００ｂｐ以内、ＴＳＳ１の下流５００ｂｐ以内、ＴＳＳ２ａの上流５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ｂの下流５００ｂｐ以内にある、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ＺＦＰドメインが６つのジンクフィンガーを含み、前記融合タンパク質が所望により前記ＳＮＣＡ遺伝子の発現を少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％抑制し、検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたは検出可能な最小限である、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記転写抑制ドメインが、ヒトＫＯＸ１由来のＫＲＡＢドメインアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＺＦＰドメインが、ペプチドリンカーを介して前記転写抑制因子に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＺＦＰドメインが、表１に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＺＦＰドメインが、表１の単一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記コード配列が、転写調節要素に作動可能に連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物。
【請求項11】
前記転写調節要素が、脳細胞において構成的に活性であるか誘導可能な哺乳類プロモーターであり、前記プロモーターが所望によりヒトシナプシンＩプロモーターである、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項12】
請求項１０または１１に記載の核酸構築物を含む、組換えウイルス。
【請求項13】
前記組換えウイルスが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載の組換えウイルス。
【請求項14】
請求項１０または１１に記載の核酸構築物または請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項15】
請求項１０または１１に記載の核酸構築物、または請求項１２または１３に記載の組換えウイルスを含む、宿主細胞。
【請求項16】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項17】
前記宿主細胞が脳細胞または多能性幹細胞であり、前記幹細胞が所望により胚性幹細胞または誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項18】
ヒト脳細胞においてアルファ－シヌクレインの発現を阻害する方法であって、所望により請求項１０または１１に記載の核酸構築物または組換え体または請求項１２または１３に記載のウイルスの導入を介して、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞に導入し、それによって細胞内のアルファ－シヌクレインの発現を阻害することを含む、方法。
【請求項19】
前記ヒト脳細胞が、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞が、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、または別のシヌクレイノパチーに罹患しているかまたはそれらを発症するリスクのある患者の脳内にある、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記融合タンパク質を発現する組換えウイルスを前記細胞に導入することを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記組換えウイルスが、所望により血清型９のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
患者においてシヌクレイノパチーを処置する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを患者に投与することを含む、方法。
【請求項24】
前記ＡＡＶが、静脈内、くも膜下腔内、脳室内、大槽内、線条体内もしくは黒皮内注射、または任意の脳領域への注射を介して患者に導入される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸構築物、請求項１２または１３に記載の組換えウイルス、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項27】
請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法における薬剤の製造のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の核酸構築物、請求項１２または１３に記載の組換えウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１０月２日に出願された米国仮出願６３／０８７，１６４号の優先権を主張しており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２日に出願された米国仮出願６３／０８７，１６４号の優先権を主張しており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年９月３０日に作成された配列表の電子コピーは、０２５２９７＿ＷＯ０３５＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは１６７，３６１バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年９月３０日に作成された配列表の電子コピーは、０２５２９７＿ＷＯ０３５＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは１６７，３６１バイトである。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
パーキンソン病（ＰＤ）は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。ＰＤ患者の約５０％が最終的に認知症を発症する。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に蔓延している神経変性疾患である。米国には約１００万人のＰＤ患者がおり、毎年５０，０００～６０，０００人の新規患者が発生している。散発性ＰＤの典型的な発症年齢は６０～７０歳である。一般に、最初の診断からＰＤ合併症による死亡まで１５～２０年の期間がある。
パーキンソン病（ＰＤ）は、運動障害を特徴とする神経変性疾患である。ＰＤ患者の約５０％が最終的に認知症を発症する。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に蔓延している神経変性疾患である。米国には約１００万人のＰＤ患者がおり、毎年５０，０００～６０，０００人の新規患者が発生している。散発性ＰＤの典型的な発症年齢は６０～７０歳である。一般に、最初の診断からＰＤ合併症による死亡まで１５～２０年の期間がある。
【0004】
ＰＤ患者は、運動緩慢、固縮、前かがみの姿勢、仮面表情、体幹の前傾、腕の振りの減少、肘、手首、股関節および膝の屈曲、姿勢の不安定性、安静時の四肢の震え、および引きずり、小刻みな歩き方などの一連の運動症状を示す。患者は、嗅覚障害、睡眠障害、腸の運動性の低下、神経障害性疼痛、認知症などの非運動症状を有することもよくある。例えば、Jeanjean および Aubert, Lancet (2011) 378(9805):1773-4; Kalia および Lang, Lancet (2015) 386(9996):896-912を参照されたい。
【0005】
ＰＤ患者の脳は、黒質と呼ばれる領域におけるドーパミン産生（ドーパミン作動性）ニューロンの喪失を特徴とする。ＰＤ患者の脳は、ニューロン内に形成されるタンパク質の凝集体または塊であるレビー小体と、レビー小体に類似したタンパク質凝集体を含有する神経突起（ニューロンの突起）であるレビー神経突起の存在によっても特徴付けられる。レビー小体は、１９１２年にＦｒｉｅｄｒｉｃｈ ＬｅｗｙによってＰＤ患者の脳内で最初に発見され、その後、凝集した不溶性形態のアルファ－シヌクレインの原線維を含有することが判明した (Goedert and Spillantini, Mol Psychiatry. (1998) 3(6):462-5; Spillantini et al., Neurosci Lett. (1998) 251(3):205-8; Spillantini et al., Nature (1997) 388(6645):839-40）。アルファ－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ）の変異は、１９９７年にＰＤを有する家族で同定された（例えば、Polymeropoulos et al., Science (1997) 276(5321):2045-7を参照されたい）。その後、ＳＮＣＡ遺伝子の重複と三重重複、およびアルファ－シヌクレインの追加の点突然変異が、ＰＤの遺伝的または家族的形態と相関することが示された。さらに、アルファ－シヌクレインの発現レベルを制御するゲノム部分の変化は、大規模かつ公平な集団研究（ゲノムワイド関連研究、ＧＷＡＳ）においてＰＤのリスク増加と関連していることが示されている。
【0006】
アルファ－シヌクレインは、ニューロンのシナプス前末端での小胞放出に関与する膜結合タンパク質である。また、ＤＮＡ修復にも役割を果たしている可能性がある。成熟アルファ－シヌクレインは、ＮＡＣ（アルツハイマー病アミロイドの非Ａβ成分）領域として知られる疎水性アミノ酸を含有する中心コア領域（残基６１～９５）を有する小さな１４ｋＤタンパク質である。ＮＡＣはタンパク質の凝集に寄与する。ミスフォールドされたアルファ－シヌクレインポリペプチドは凝集してオリゴマーおよびプロトフィブリルになり、それらが集まってレビー小体に見られる大きな不溶性凝集体を形成する。蓄積されている証拠は、アルファ－シヌクレインのミスフォールディングおよび凝集が、ＰＤで発生する細胞損傷において中心的な役割を果たし、最終的には黒質のニューロンの死につながることを示している。さらに、プリオン病で見られるものと同様に、アルファ－シヌクレインの小さな凝集体が細胞から細胞へ移動し、脳全体に広がることが示されている。アルファ－シヌクレインの凝集を阻害すると、ニューロンへの損傷が軽減され、ＰＤの進行が遅くなったり、進行が停止したりする可能性がある。
【0007】
アルファ－シヌクレインのレベルを低下させる現在のアプローチは、ＲＮＡレベルでアルファ－シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、および細胞外のアルファ－シヌクレインの特定の３Ｄ形状または立体構造を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用を含む。しかしながら、アルファ－シヌクレインを標的とする臨床的に有効なＰＤを処置する方法が依然として緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近傍の部位を標的とするジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインを提供する。本開示のＺＦＰドメインは、ＤＮＡレベルでヒトＳＮＣＡ遺伝子の発現を特異的に阻害するために転写因子に融合されてもよい。これらの融合タンパク質は、（ｉ）ＳＮＣＡ遺伝子の標的領域に特異的に結合するＺＦＰドメイン、および（ｉｉ）遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含有する。
【0009】
一態様において、本開示は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここで、ＺＦＰドメインは、ヒトアルファ－シヌクレイン遺伝子（ＳＮＣＡ遺伝子）の標的領域に結合する。いくつかの実施形態において、標的領域（すなわち、標的部位）は、ＳＮＣＡ遺伝子内の転写開始部位（ＴＳＳ、例えば、ＴＳＳ１、２ａ、または２ｂ）の約１ｋｂ以内にある。さらなる実施形態において、標的領域は、図１～３に示されるように、ＳＮＣＡ遺伝子のＴＳＳ２ａの上流約５００ｂｐ以内、ＴＳＳ２ｂの下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ１の上流もしくは下流約５００ｂｐ以内にある。標的領域の非限定的な例を表１に示す。
【0010】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のジンクフィンガーを含む。それは、ＳＮＣＡ遺伝子の発現を少なくとも約４０％、７５％、９０％、９５％、または９９％抑制することができ、好ましくは、検出可能なオフターゲット結合または活性（例えば、ＳＮＣＡ遺伝子でない遺伝子への結合）が全くないかまたは検出可能な最小限である。ジンクフィンガードメインの非限定的な例を表１に示す。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、表１に示す１つまたは複数の認識ヘリックス配列を含む。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、単一の行からの認識ヘリックス配列の一部またはすべてを含む。示された骨格変異の有無にかかわらず、特定の実施形態において、融合タンパク質は、表２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質の転写抑制ドメインは、ＫＯＸ１タンパク質のＫＲＡＢドメインに由来する。ジンクフィンガードメインは、ペプチドリンカーを介して転写抑制ドメインに連結されてもよい。別の態様において、本開示は、本融合タンパク質のコード配列を含む核酸構築物を提供し、コード配列は、脳細胞において構成的に活性であるか誘導可能な哺乳類プロモーターなどの転写調節要素に作動可能に連結されている。ここで、プロモーターは所望によりヒトシナプシンＩプロモーターである。本開示はまた、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、脳細胞または多能性幹細胞などのヒト細胞であってもよく、幹細胞は所望により胚性幹細胞または誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。
【0012】
別の態様において、本開示は、ヒト脳細胞におけるアルファ－シヌクレインの発現を阻害する方法を提供し、該方法は、細胞に本融合タンパク質を導入し（例えば、核酸構築物またはＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、またはそれらのハイブリッド）などの組換えウイルスの導入を介して）、それによって細胞内のアルファ－シヌクレインの発現を阻害することを含む。脳細胞は、ニューロン、グリア細胞、上衣細胞、または神経上皮細胞であってもよい。パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、または他のシヌクレイノパチーに罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある患者の脳内に細胞が存在してもよい。
【0013】
本開示はまた、患者におけるシヌクレイノパチーを処置する（例えば、進行を遅らせる）方法であって、本開示の融合タンパク質をコードする組換えＡＡＶを患者に投与することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、静脈内、くも膜下腔内、脳室内、大槽内、線条体内、もしくは黒皮内注射、または任意の脳領域への注射を介して患者に導入される。患者はパーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、または多系統萎縮症を有してもよい。
【0014】
本開示はまた、上記の方法で使用するための融合タンパク質、および上記の方法で使用するための薬剤の製造における本融合タンパク質の使用を提供する。
【0015】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく例示のみを目的として与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
図１は、遺伝子内の１８塩基対を認識する、操作された６フィンガージンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）によるＳＮＣＡ遺伝子の特異的標的化を示す。ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子に結合すると、ＳＮＣＡ転写が減少し、その結果、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡおよびアルファ－シヌクレインタンパク質レベルが減少する。この図は、例示的な操作されたＺＦＰ（ＳＢＳ－８２１１０）のゲノム標的配列（結合配列；配列番号２２６）を開示す。
【0017】
図２Ａは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子のゲノム構造を示す図である。この遺伝子は７つのエクソン（２つの非タンパク質コーディングおよび５つのタンパク質コーディング）を有し、各転写物は５つのイントロンを含有する。ＴＳＳ１、ＴＳＳ２ａ、ＴＳＳ２ｂと名付けられた３つの転写開始部位（ＴＳＳ）があり、それぞれ非コーディングエクソン１、２ａ、２ｂで始まる転写物が生成される。すべての転写産物の最初のタンパク質をコードするエクソンはエクソン３である。
【0018】
図２Ｂは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の上流ゲノム領域を示す図である。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ配列は赤いバーで示されている。遺伝子の下のクラスター内の小さな三角形は、本明細書に例示される４１６の代表的なＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるＳＮＣＡ遺伝子内の領域を示す。この図は、ＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡによるトランスフェクションの２４時間後に採取されたＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経芽腫細胞におけるヒトＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の減少に対する各ＺＦＰ－ＴＦの効果も示している。メッセンジャーＲＮＡレベルはＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。正規化されたＳＮＣＡ発現レベルは、勾配バー「ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ」によって示される。最も濃い（赤色）色は１００％減少を示す。最も明るい色（白）は０％減少を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲデータは、２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ＢおよびＥＩＦ４Ａ２）のｍＲＮＡレベルの平均に対して正規化された。右向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。
【0019】
図３Ａ～３Ｅは、本明細書に記載の４１６個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーからのスクリーニング結果を示すグラフである。スクリーニングは、ＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経上皮細胞株で行われた。各グラフのｙ軸は、２つのハウスキーピング遺伝子（ＥＩＦ４Ａ２およびＡＴＰ５Ｂ）の幾何平均に正規化され、さまざまなＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡでトランスフェクションの２４時間後に評価されたアルファ－シヌクレインｍＲＮＡ発現である。ＲＮＡの投与量は左から右に増加する（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ＺＦＰ－ＴＦの内部参照番号である。
【0020】
図４は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の上流ゲノム領域を示す図である。ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ配列は赤いバーで示されている。遺伝子の下のクラスター内の小さな三角形は、１、２、または３個のリン酸接触変異を有する２７の代表的なＺＦＰ－ＴＦによって標的とされるＳＮＣＡ遺伝子内の領域を示している。この図は、ＺＦＰ－ＴＦ ｍＲＮＡによるトランスフェクションの２４時間後に採取されたＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経芽腫細胞におけるヒトＳＮＣＡ ｍＲＮＡ発現の減少に対する各ＺＦＰ－ＴＦの効果も示している。メッセンジャーＲＮＡレベルはＲＴ－ｑＰＣＲによって測定された。正規化されたＳＮＣＡ発現レベルは、勾配バー「ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ」によって示される。最も濃い（赤）色は１００％減少を示す。最も明るい色（白）は０％減少を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲデータは、２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ＢおよびＥＩＦ４Ａ２）のｍＲＮＡレベルの平均に対して正規化された。右向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のセンス鎖に結合することを示す。左向きの三角形は、ＺＦＰ－ＴＦが遺伝子のアンチセンス鎖に結合することを示す。
【0021】
図５は、１、２、または３個のリン酸接触変異を有する２７個の代表的なＺＦＰ－ＴＦのライブラリーからの例示的なスクリーニング結果を示す。スクリーニングは、ＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経上皮細胞株で行われた。各グラフのｙ軸は、２つのハウスキーピング遺伝子（ＥＩＦ４Ａ２およびＡＴＰ５Ｂ）の幾何平均に正規化され、さまざまなＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡでトランスフェクションの２４時間後に評価されたアルファ－シヌクレインｍＲＮＡ発現である。ＲＮＡの投与量は左から右に増加する（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）。バーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。グラフの下の数字は、ＺＦＰ－ＴＦの内部参照番号である。
【0022】
図６Ａおよび６Ｂは、４０のアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦがＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経芽腫細胞およびヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて一連のアルファ－シヌクレイン抑制活性を示したことを示すグラフのパネルである。表１および表２に記載されている２０の例示的なＺＦＰ－ＴＦが、パネルＡに示されている。図３Ａ～３Ｅに特徴づけられるが表１および２には記載されない例示的ＺＦＰ－ＴＦが、パネルＢに示されている。ｙ軸は、２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ＢおよびＥＩＦ４Ａ２）の幾何平均に正規化され、異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡをＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞にトランスフェクションした２４時間後、または異なるＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶ６をｉＰＳＣ由来ニューロンに形質導入した２８日後に評価されるアルファ－シヌクレインｍＲＮＡ発現である。使用したＲＮＡまたはＡＡＶ６の量は、ＲＮＡ（３、１０、３０、１００、３００、および１，０００ｎｇ）またはＡＡＶ６（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５）の左から右に増加する用量とともにｘ軸に示されている。青およびオレンジのバーは４つの技術的反復の平均を表し、エラーバーは標準偏差を表す。滴定スケールの拡大版が図の下部に示されている。
【0023】
図７Ａ～７Ｄは、マウス初代ニューロン（ＡおよびＢ）およびヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（ＣおよびＤ）における４０個のアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性を示すボルケーノプロットのパネルである。簡単に参照できるように、図１～図４の棒グラフを示す。ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＺＦＰ－ＴＦの抑制活性を示す図６Ａ～６Ｂは、対応するＺＦＰ－ＴＦのボルケーノプロットの隣に示されている。ボルケーノプロットは、形質導入７日後のマウス初代ニューロン（ＡおよびＢ）または形質導入１９日後のヒトｉＰＳＣ由来ニューロン（ＣおよびＤ）のトランスクリプトームの変化を示すマイクロアレイデータを要約している。黄色の丸はヒトアルファ－シヌクレインを示す。緑色の円（各ボルケーノプロットの右側）は、２倍を超えて有意に上方制御された遺伝子を表す。これらの遺伝子の数は緑色のテキストで示される。赤い丸は、２倍を超えて有意にダウンレギュレートされた遺伝子を表す。これらの遺伝子の数は赤い文字で示される。
【0024】
図８Ａおよび８Ｂは、（Ａ）ＺＦＰ－ＴＦおよびアルファ－シヌクレインのｍＲＮＡ発現レベル、または（Ｂ）グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（ＩＢＡ１）、および雌性ＰＡＣシヌクレインマウスの異なる脳領域におけるＮｅｕＮのｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフのパネルである（Kuo et al., Hum Mol Genet. (2010) 19(9):1633-50）。動物には、線条体の２つの部位に、指定された試験品またはビヒクルをコードするＡＡＶ９を両側に投与した。すべての遺伝子発現データは、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化されている。ｙ軸は指定された遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル、ｘ軸は脳領域である。赤い四角は、ＺＦＰ－ＴＦ８２１９５を投与したｎ＝３匹の動物の平均発現データを示し、緑の三角は、ＺＦＰ－ＴＦ８２２６４を投与したｎ＝３匹の動物の平均発現データを示す。パネルＡでは、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡ発現は、３匹のビヒクル処置動物の平均値であり、ＺＦＰ－ＴＦ発現は入力ＲＮＡ １ｎｇあたりのコピー数として対数スケールで提供される。パネルＢでは、すべての発現データが３匹のビヒクル処置動物の平均に対して正規化されている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてダネットの多重比較検定を使用して実行された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊,ｐ＜０．００１、＊＊＊,ｐ＜０．０００１。
【0025】
発明の詳細な説明
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近傍の部位（すなわち、配列）を標的とするＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の機能性分子またはドメインに結合または融合されていてもよい。本開示のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子のＲＮＡへの転写を抑制するために転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質はジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と呼ばれる。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインと、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロン内のアルファ－シヌクレインのレベルを低下させると、アルファ-シヌクレインのオリゴマー（より小さな可溶性凝集体）またはフィブリル（より大きな不溶性凝集体）形態への集合を阻害（例えば、減少または停止）することが期待される。アルファ－シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は細胞の品質管理機構を使って、ミスフォールドされた有毒なアルファ－シヌクレインを適時に除去する能力を有するようになる。その結果、アルファ－シヌクレインの凝集および細胞間の伝播が減少または防止される。
本開示は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近傍の部位（すなわち、配列）を標的とするＺＦＰドメインを提供する。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の機能性分子またはドメインに結合または融合されていてもよい。本開示のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子のＲＮＡへの転写を抑制するために転写因子に融合されてもよい。融合タンパク質はジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ－ＴＦ）と呼ばれる。これらのＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの標的領域に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインと、遺伝子の転写を低下させる転写抑制ドメインを含む。ＺＦＰ－ＴＦを患者の脳に導入することによってニューロン内のアルファ－シヌクレインのレベルを低下させると、アルファ-シヌクレインのオリゴマー（より小さな可溶性凝集体）またはフィブリル（より大きな不溶性凝集体）形態への集合を阻害（例えば、減少または停止）することが期待される。アルファ－シヌクレインの凝集が減少すると、脳細胞は細胞の品質管理機構を使って、ミスフォールドされた有毒なアルファ－シヌクレインを適時に除去する能力を有するようになる。その結果、アルファ－シヌクレインの凝集および細胞間の伝播が減少または防止される。
【0026】
アルファ－シヌクレイン阻害に対する我々のＺＦＰ－ＴＦアプローチは、他者によって試験されている現在のアプローチと比較して、いくつかの利点を有する。ＺＦＰ－ＴＦは（ＺＦＰ－ＴＦ発現構築物を患者に導入することにより）１回のみ投与する必要があるが、ＡＳＯは反復投与が必要である。さらに、ＺＦＰ－ＴＦアプローチでは、各細胞のゲノム内のＳＮＣＡ遺伝子の２つの対立遺伝子を関与させるだけで済む。対照的に、ＡＳＯは各細胞内のＳＮＣＡ ｍＲＮＡの多数のコピーに関与する必要がある。
【0027】
我々のＺＦＰ－ＴＦアプローチは、抗体がアルファ－シヌクレインの形状または立体構造のサブセットにしか結合できないため、抗体アプローチよりも有利である。これでは確実な治療効果を得るには十分ではない可能性がある。対照的に、ＺＦＰ－ＴＦはアルファ－シヌクレインの発現をＤＮＡレベルで抑制し、あらゆる形態のアルファ－シヌクレインのレベルを低下させる。したがって、ＺＦＰ－ＴＦは、抗体とは異なり、有毒種の形態に依存しない。さらに、抗体は主に細胞内または細胞外のアルファ－シヌクレインに作用すると考えられているが、ＺＦＰ－ＴＦは細胞内のアルファ－シヌクレインを直接減少させ、間接的に細胞外のアルファ－シヌクレインレベルを低下させることができる。したがって、アルファ－シヌクレインは主に細胞内タンパク質であるため、ＺＦＰ－ＴＦアプローチはより効果的であると予想される。さらに、抗体は反復投与する必要があるが、ＺＦＰ－ＴＦは発現構築物の送達を１回だけ必要とする。
【0028】
Ｉ．ＺＦＰドメインの標的
本融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近傍の標的領域に特異的に結合する。図１は、ＺＦＰドメインの標的ＳＮＣＡ遺伝子配列への結合を示す。該図のＺＦＰドメインは６つのジンクフィンガーを有する。しかしながら、以下でさらに説明するように、より少ないまたはより多くのジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインも使用することができる。
本融合タンパク質のＺＦＰドメインは、ヒトＳＮＣＡ遺伝子内またはその近傍の標的領域に特異的に結合する。図１は、ＺＦＰドメインの標的ＳＮＣＡ遺伝子配列への結合を示す。該図のＺＦＰドメインは６つのジンクフィンガーを有する。しかしながら、以下でさらに説明するように、より少ないまたはより多くのジンクフィンガーを有するＺＦＰドメインも使用することができる。
【0029】
ヒトＳＮＣＡ遺伝子は約１１７ｋｂに及び、ｃｈｒ４：８９，７２４，０９９－８９，８３８，３１５（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にマッピングされている。そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００４バージョン０００００４．１２で入手できる。この遺伝子は７つのエクソン（２つの非タンパク質コーディングおよび５つのタンパク質コーディング）を有し、各転写物は５つのイントロンを有する（図２Ａ）。この遺伝子は３つの転写開始部位（ＴＳＳ）を有し、１つはエクソン１の先頭に、２つはエクソン２にあり、その結果、エクソン２ａと２ｂが発現する。最初のタンパク質をコードするエクソンはエクソン３である。Touchman et al., Genome Res. (2001) 11:78-86も参照されたい。ヒトアルファ－シヌクレインのアイソフォーム１（全長）を以下に示す：
【化1】
【0030】
アイソフォーム２～４は、アミノ酸残基１０３～１３０が欠失している点でアイソフォーム１とは異なる。アイソフォーム２～５は、アミノ酸残基４１～５４が欠落している点でアイソフォーム１とは異なる。アルファ－シヌクレインの遺伝子分析は、遺伝子コピーの増幅を指摘している（例えば、Brueggemann et al., Neurology (2008) 71:1294; Troiano et al., Neurology (2008) 71:1295; Uchiyama et al., Neurology (2008) 71:1289-90を参照されたい)、および特定の点変異は、PDおよびレビー小体型認知症などのシヌクレイノパチーの潜在的な原因として挙げられる。 例えば、以下のアルファ－シヌクレイン点突然変異が、一部のＰＤ患者において同定されている：Ａ３０Ｐ（Kruger et al., Nature Genet. (1998) 18:106-8); E46K (Zarranz et al., Ann Neurol. (2004) 55:164-73; Choi et al., FEBS Lett. (2004) 576:363-8); H50Q (Khalaf et al., J Biol Chem. (2014) 289:21856-76); G51D (Lesage et al., Ann Neurol. (2013) 73:459-71); およびA53T (Polymeropoulos et al., Science (1997) 276:2045-7）。
【0031】
ＺＦＰ－ＴＦのＤＮＡ結合ＺＦＰドメインは、融合タンパク質をＳＮＣＡ遺伝子の標的領域に導き、融合タンパク質の転写抑制ドメインを標的領域に導く。次に、リプレッサードメインは、ＲＮＡポリメラーゼによるＳＮＣＡ遺伝子の転写を抑制する。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、遺伝子発現の抑制を可能にするＳＮＣＡ遺伝子内またはその近くの任意の適切な部位であり得る。例として、標的領域は、ＳＮＣＡＴＳＳまたはＳＮＣＡ転写調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位など）を含むか、またはそれら（の下流または上流のいずれか）に隣接する。
【0032】
上述したように、ヒトＳＮＣＡ遺伝子は３つの転写開始点（ＴＳＳ）を有する。それらは、５’から３’まで、ＴＳＳ１、ＴＳＳ２ａ、およびＴＳＳ２ｂであり、エクソン１（ＴＳＳ１）、エクソン２ａ、およびエクソン２ｂ（ＴＳＳ２ａおよび２ｂ）の５’末端に位置する（図２Ｂ）。３つのＴＳＳでの転写により、異なる長さのＲＮＡアイソフォームが生成される。しかしながら、アルファ－シヌクレインの翻訳はエクソン３から始まるため、異なるＴＳＳから生成されたＲＮＡは同じタンパク質の形成につながる。いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦのゲノム標的領域は、ＴＳＳ１（例えば、塩基対５２９～１５２９）またはＴＳＳ２ａおよび２ｂ（例えば、塩基対１６１３～２９４９）にわたるか、またはその近傍にある。特定の実施形態において、標的領域は、ＴＳＳ１の上流または下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ａの上流または下流約５００ｂｐ以内、および／またはＴＳＳ２ｂの上流または下流約５００ｂｐ以内にある。
【0033】
いくつかの実施形態において、ゲノム標的領域は少なくとも８ｂｐの長さである。例えば、標的領域は、８ｂｐ～４０ｂｐの長さ、例えば、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、または３６ｂｐの長さであってもよい。標的配列は、遺伝子のセンス鎖上に存在する場合もあれば、遺伝子のアンチセンス鎖上に存在する場合もある。ターゲティング精度を確保し、ＺＦＰ－ＴＦによるオフターゲット結合または活性を低減するために、選択されたＳＮＣＡ標的領域の配列は、他の遺伝子の配列に対して好ましくは７５％未満（例えば、７０％未満、６５％未満、６０％未満、または５０％未満）の相同性を有する。特定の実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、長さが１５～１８ｂｐであり、ＴＳＳ１、２ａ、または２ｂの５００ｂｐ以内に存在する。対象領域の例を図２Ｂおよび表１に示す。
【0034】
いくつかの実施形態において、本発明の操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示されるように、標的部位（すなわち、結合配列）に結合し、好ましくは検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたはほとんどない。
【0035】
標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、かかるセグメントまたは関連セグメントに結合するＺＦＰの事前の入手可能性、所与の標的セグメントに結合する新しいＺＦＰの設計の容易さ、およびオフターゲット結合のリスクを含む。
【0036】
ＩＩ．ＺＦＰドメイン
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは配列特異的な方法でＤＮＡに結合する。ＺＦＰの個々のＤＮＡ結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは２～４塩基対のＤＮＡ、通常は３塩基対または４塩基対のＤＮＡに結合する。各ジンクフィンガーは通常、約３０個のアミノ酸で構成され、亜鉛をキレートする。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作手法は、合理的な設計やさまざまな種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられる。例えば、U.S. Pats. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539;および8,586,526；および国際特許公開WO95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; およびWO 03/016496に詳細に記載されているＺＦＰ設計方法を参照されたい。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の分子、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるＺＦＰ融合体は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、局所的超突然変異（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的化組み込み（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチル－トランスフェラーゼドメイン）、塩基編集（塩基編集ドメインなど）、または標的化されたＤＮＡ切断（ヌクレアーゼドメインなど）を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を表１に示す。
「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、亜鉛によって安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を指す。ＺＦＰは配列特異的な方法でＤＮＡに結合する。ＺＦＰの個々のＤＮＡ結合ユニットは、ジンク「フィンガー」と呼ばれる。各フィンガーは、通常７つのアミノ酸残基で構成され、ＤＮＡ結合の特異性を決定するＤＮＡ結合「認識ヘリックス」を含有する。ＺＦＰドメインは少なくとも１つのフィンガーを有し、各フィンガーは２～４塩基対のＤＮＡ、通常は３塩基対または４塩基対のＤＮＡに結合する。各ジンクフィンガーは通常、約３０個のアミノ酸で構成され、亜鉛をキレートする。操作されたＺＦＰは、天然に存在するＺＦＰと比較して、新しい結合特異性を有することができる。操作手法は、合理的な設計やさまざまな種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と関連付けられる。例えば、U.S. Pats. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,200,759; 6,453,242; 6,534,261; 6,979,539;および8,586,526；および国際特許公開WO95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/016536; WO 02/099084; およびWO 03/016496に詳細に記載されているＺＦＰ設計方法を参照されたい。本明細書に記載のＺＦＰドメインは、別の分子、例えばタンパク質に結合または融合されてもよい。かかるＺＦＰ融合体は、遺伝子活性化（例えば、活性化ドメイン）、遺伝子抑制（例えば、抑制ドメイン）、リガンド結合（例えば、リガンド結合ドメイン）、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンド結合ドメイン）、局所的超突然変異（例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼドメイン）、クロマチン修飾（例えば、ヒストンデアセチラーゼドメイン）、組換え（例えば、リコンビナーゼドメイン）、標的化組み込み（例えば、インテグラーゼドメイン）、ＤＮＡ修飾（例えば、ＤＮＡメチル－トランスフェラーゼドメイン）、塩基編集（塩基編集ドメインなど）、または標的化されたＤＮＡ切断（ヌクレアーゼドメインなど）を可能にするドメインを含んでもよい。操作されたＺＦＰドメインの例を表１に示す。
【0037】
本発明の操作されたＺＦＰ融合タンパク質のＺＦＰドメインは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、またはそれ以上）のジンクフィンガーを含んでもよい。１本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、３つまたは４つのヌクレオチドを含む標的部位を認識する。２本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、６または８ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。３本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、９または１２ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。４本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１２～１５個のヌクレオチドを含む標的部位を認識する。５本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、通常、１５～１８ヌクレオチドを含む標的部位を認識する。６本のフィンガーを有するＺＦＰドメインは、１８～２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識できる。
【0038】
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、表１に示すＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１に示すＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、またはＦ６の配列を含んでもよい。
【0039】
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示されているＦ１－Ｆ２、Ｆ２－Ｆ３、Ｆ３－Ｆ４、Ｆ４－Ｆ５、またはＦ５－Ｆ６の配列を含んでもよい。
【0040】
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。例えば、操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示されているＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、およびＦ６（例えばＦ１～Ｆ６）の配列を含んでもよい。
【0041】
ＺＦＰドメインの標的特異性は、例えば、U.S. Pat. Pub. 2018/0087072に記載されているように、ＺＦＰ骨格配列に対する突然変異によって改善されてもよい。この変異は、ＤＮＡ骨格上のリン酸と非特異的に相互作用する可能性があるが、ヌクレオチド標的特異性には関与しない、ＺＦＰ骨格内の残基に生じた変異を含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。いくつかの実施形態において、これらの変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。さらなる実施形態において、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して位置（－５）、（－９）および／または（－１４）で行われる。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）に１つまたは複数の突然変異を含んでもよい。さらなる実施形態において、マルチフィンガーＺＦＰドメイン内の１つまたは複数のジンクフィンガーは、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）に変異を含んでもよい。いくつかの実施形態において、位置（－５）、（－９）および／または（－１４）のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）に変異される。１、２、または３個の骨格変異を有する操作されたＺＦＰの例を図１～３に示す。表１の記号「＾」は、示された認識ヘリックスの最初のアミノ酸の上流４番目の位置にあるアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変更されていることを示す。各認識ヘリックス配列では、７つのＤＮＡ結合アミノ酸の位置に－１、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、および＋６の番号が付けられる。したがって、ＲからＱへの置換の位置には（－５）と番号が付けられる。
【0042】
いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、表１に示すＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。いくつかの実施形態において、本操作されたＺＦＰは、表１の単一行に示されているＤＮＡ結合認識ヘリックス配列および関連する骨格変異を含む。
【0043】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、表２の単一行に示される配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰは、配列の認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。翻訳後修飾後に出現する配列を表２の単一行に示す。例えば、翻訳後修飾により、表２に示すように配列から開始メチオニン残基が除去されてもよい。
【0044】
いくつかの実施形態において、本発明のＺＦＰ－ＴＦは、１つ以上のジンクフィンガードメインを含む。ドメインは、例えば、１つのドメインが１つまたは複数（例えば、４、５、または６）のジンクフィンガーを含み、別のドメインが追加の１つまたは複数（例えば、４、５、または６）のジンクフィンガーを含むように、伸長可能な柔軟なリンカーを介して一緒に連結されてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが８、９、１０、１１または１２以上のフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカーなどの非定型リンカーである。例えば、２つのＺＦＰドメインは、（Ｎ末端からＣ末端への）ＺＦＰ－ＺＦＰ－ＴＦ、ＴＦ－ＺＦＰ－ＺＦＰ、ＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ、またはＺＦＰ－ＴＦ－ＺＦＰ－ＴＦ（２つのＺＦＰ－ＴＦ融合タンパク質がリンカーを介して融合されている）の構成で転写抑制因子ＴＦに連結されてもよい。
【0045】
いくつかの実施形態において、ＺＦＰ－ＴＦは「両手型」である、すなわち、それらは、２つのＺＦＰドメインが２つの不連続な標的部位に結合するように、介在アミノ酸によって分離された２つのジンクフィンガークラスター（２つのＺＦＰドメイン）を含有する。両手タイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例はＳＩＰ１である。ＳＩＰ１では、４つのジンクフィンガーのクラスターがタンパク質のアミノ末端に位置し、３つのジンクフィンガーのクラスターがカルボキシル末端に位置している (Remacle et al., EMBO J. (1999) 18(18):5073-84を参照されたい)。これらのタンパク質のジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は多くのヌクレオチドを含む可能性がある。
【0046】
ＩＩＩ．ジンクフィンガータンパク質転写因子
本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は、転写リプレッサードメインであってもよく、ＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、あるいは二量体化（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介する）によって互いに結合していてもよい。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」とは、共有結合したドメインを有するポリペプチド、および非共有結合を通じて互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
本明細書に記載されるＺＦＰドメインは、転写因子に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ドメインおよび転写因子ドメイン（すなわち、ＺＦＰ－ＴＦ）を含有する。いくつかの実施形態において、転写因子は、転写リプレッサードメインであってもよく、ＺＦＰおよびリプレッサードメインは、直接ペプチジル結合もしくはペプチドリンカーによって、あるいは二量体化（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介する）によって互いに結合していてもよい。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」とは、共有結合したドメインを有するポリペプチド、および非共有結合を通じて互いに結合したポリペプチドの複合体を指す。転写抑制ドメインは、ＺＦＰドメインのＣ末端またはＮ末端を含む任意の適切な位置でＺＦＰドメインと結合することができる。
【0047】
いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦは、約２５ｎＭ未満のＫＤでその標的に結合し、ヒトＳＮＣＡ遺伝子の転写を２０％以上（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上）抑制する。いくつかの実施形態において、本ＺＦＰ－ＴＦの２つ以上が患者において同時に使用され、ＺＦＰ－ＴＦは、ＳＮＣＡ発現の最適な抑制を達成するために、ＳＮＣＡ遺伝子内の異なる標的領域に結合する。
【0048】
Ａ．転写抑制因子ドメイン
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載の操作されたＺＦＰドメインと、ＳＮＣＡ遺伝子の転写活性を弱める１つ以上の転写抑制ドメインとを含む。１つ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つ以上の転写抑制ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２のＫＲＡＢドメインである。 例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; および Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、本明細書に記載の操作されたＺＦＰドメインと、ＳＮＣＡ遺伝子の転写活性を弱める１つ以上の転写抑制ドメインとを含む。１つ以上の操作されたＺＦＰドメインおよび１つ以上の転写抑制ドメインは、柔軟なリンカーによって結合されてもよい。転写抑制ドメインの非限定的な例は、ＫＯＸ１、ＫＡＰ－１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＧＲ－１、ＥＲＤ、ＳＩＤ、ＴＧＦ－β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ＥＲＢ－Ａ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＴＲａ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、核ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体または甲状腺ホルモン受容体）、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２のＫＲＡＢドメインである。 例えば、Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; および Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342を参照されたい。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えば、Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; およびWu et al. (2000) Plant J. 22:19-27を参照されたい。
【0049】
いくつかの実施形態において、転写抑制ドメインは、ヒトジンクフィンガータンパク質１０／ＫＯＸ１（ＺＮＦ１０／ＫＯＸ１）のクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインからの配列を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１５３９４．４）。ＫＲＡＢドメイン配列の例は次のとおりである：
このＫＲＡＢ配列の変異体も、同一または類似の転写抑制機能を有する限り使用することができる。
【化2】
【0050】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１の単一行に示されるように、標的部位に結合し、好ましくは検出可能なオフターゲット結合または活性が全くないかまたはほとんどない。オフターゲット結合は、例えば、オフターゲット遺伝子におけるＺＦＰ－ＴＦの活性を測定することによって決定されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１の単一行に示される２つの隣接するＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表１の単一行に示されるＤＮＡ結合認識ヘリックス配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、認識ヘリックスおよび骨格部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、表２の一行に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、配列の認識ヘリックスおよび骨格部分は、翻訳後修飾後に出現する配列として表２の単一行に示されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたＺＦＰ－ＴＦは、翻訳後修飾後に現れるであろう配列として、表２の単一行に示されるアミノ酸配列を含む。例えば、翻訳後修飾により、表２に示すように配列から開始メチオニン残基が除去されてもよい。
【0051】
Ｂ．ペプチドリンカー
本発明のＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写抑制因子ドメインおよび／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のアミノ酸）の非切断性ペプチドリンカーを介して連結されてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。例えば、上記の説明；およびU.S. Pats. 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; および9,163,245; およびWO2011/139349を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号４）、ＧＧＲＲ（配列番号５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号８）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号９）、およびＴＧＳＱＫＰ（配列番号１０）である。
本発明のＺＦＰ－ＴＦのＺＦＰドメインおよび転写抑制因子ドメインおよび／またはＺＦＰドメイン内のジンクフィンガーは、ペプチドリンカー、例えば、約５～２００アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のアミノ酸）の非切断性ペプチドリンカーを介して連結されてもよい。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質として合成される柔軟なアミノ酸部分配列である。例えば、上記の説明；およびU.S. Pats. 6,479,626; 6,903,185; 7,153,949; 8,772,453; および9,163,245; およびWO2011/139349を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、適切なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、ＤＧＧＧＳ（配列番号２）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３）、ＬＲＱＫＤＧＥＲＰ（配列番号４）、ＧＧＲＲ（配列番号５）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号６）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号８）、ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）２ＥＲＰ（配列番号９）、およびＴＧＳＱＫＰ（配列番号１０）である。
【0052】
いくつかの実施形態において、ＴＧＥＫＰＦＡ（配列番号１５）および／またはＴＧＳＱＫＰＦＱ（配列番号１６）は、ＺＦＰドメイン内にジンクフィンガーを連結し、および／またはＬＲＱＫＤＡＡＲＧＳＧＧ（配列番号１７）またはＬＲＧＳＧＧ（配列番号１８）は、ＺＦＰドメインを転写抑制ドメインに連結する。
【0053】
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、長さが３～２０アミノ酸残基であり、Ｇおよび／またはＳが豊富である。かかるリンカーの非限定的な例は、Ｇ４Ｓ型リンカー（配列番号１１）、すなわち、１つ以上（例えば、２、３、または４）のＧＧＧＧＳ（配列番号１１）モチーフ、またはモチーフのバリエーション（モチーフから１つ、２つ、または３つのアミノ酸が挿入、欠失、および置換されているものなど）を含有するリンカーである。
【0054】
ＩＶ．ＺＦＰ－ＴＦの発現
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。核酸分子は、ＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子であってもよい。核酸分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコード配列の発現を可能にする、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
本開示のＺＦＰ－ＴＦは、それをコードする核酸分子を介して患者に導入されてもよい。核酸分子は、ＲＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子であってもよい。核酸分子は、脂質：核酸複合体（例えば、リポソーム）を含む組成物の注射によって患者の脳に導入されてもよい。あるいは、ＺＦＰ－ＴＦは、ＺＦＰ－ＴＦをコードする配列を含む核酸発現ベクターを介して患者に導入されてもよい。発現ベクターは、神経系の細胞におけるＺＦＰ－ＴＦのコード配列の発現を可能にする、プロモーター、エンハンサー、転写シグナル配列、および転写終結配列などの発現制御配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、安定なエピソームとして細胞内に存在し続ける。他の実施形態において、発現ベクターは細胞のゲノムに組み込まれる。
【0055】
いくつかの実施形態において、脳内でのＺＦＰ－ＴＦ発現を指示すためのベクター上のプロモーターは、構成的活性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。適切なプロモーターは、限定されないが、レトロウイルスＲＳＶＬＴＲプロモーター（所望によりＲＳＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶプロモーター（所望によりＣＭＶエンハンサーを有する）、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＭｏＭＬＶＬＴＲプロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Niwa et al., Gene(1991)108(2):193-9）、およびＲＵ－４８６応答性プロモーターを含む。シナプシンＩプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＭＫＩＩプロモーター、ＰｒＰプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、またはニューロンおよび／またはグリア細胞への発現を制限する操作されたプロモーターまたは天然プロモーターなどの脳細胞特異的プロモーターも、使用されてもよい。
【0056】
限定されないがエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、核局在化シグナルと組み合わされるリポソーム、天然に存在するリポソーム（例えば、エクソソーム）、またはウイルス形質導入を含む、ヌクレオチド配列を細胞に導入する任意の方法が、使用されてもよい。
【0057】
発現ベクターのインビボ送達について、ウイルス形質導入を使用することができる。当業者であれば、当技術分野で公知の様々なウイルスベクター、例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポキシウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクター。いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、長期発現のために安定なエピソーム構造として存在し、免疫原性が非常に低いため、ＣＮＳ遺伝子送達に特に適している（Hadaczek et al., Mol Ther. (2010) 18:1458-61; Zaiss, et al., Gene Ther. (2008) 15:808-16）。任意の適切なＡＡＶ血清型を使用することができる。例えば、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、もしくはＡＡＶ２／９、または本明細書に列挙されるＡＡＶ血清型の１つの変異体もしくは誘導体である血清型（すなわち、複数の血清型に由来するＡＡＶ；例えば、ｒＡＡＶは、そのゲノム中にＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびＡＡＶ８、５、６、または９キャプシドを含む）などの偽型であってもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターはＡＡＶウイルスベクターであり、ゲノムが構築物を含む組換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入され、これは昆虫細胞／バキュロウイルス産生系または哺乳動物細胞産生系などの産生系におけるＡＡＶビリオンの産生を可能にするために、両端にＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）配列を有することを含む。ＡＡＶは、そのキャプシドタンパク質がヒトまたは非ヒト霊長類において免疫原性を低下させるか、または形質導入能力を増強するように操作されてもよい。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９が使用される。本明細書に記載されるウイルスベクターは、当技術分野で知られている方法を使用して産生されてもよい。ウイルス粒子を生成するために、任意の適切な許容細胞またはパッケージング細胞を使用することができる。例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞をパッケージング細胞株として使用することができる。
【0058】
Ｖ．医薬品への適用
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、アルファ－シヌクレイン発現の下方制御を必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、および任意の他のシヌクレイノパチーなどの神経変性疾患に罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある。リスクにさらされている患者は、遺伝的素因を有する患者、脳震盪などの脳損傷を反復して受けた患者、環境神経毒にさらされた患者を含む。本開示は、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患（例えば、神経変性疾患）を処置する方法であって、対象の神経系に治療有効量（例えば、ＳＮＣＡ発現の十分な抑制を可能にする量）のＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）を導入することを含む方法を提供する。「処置する」なる用語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存期間の延長を含む。
本発明のＺＦＰ－ＴＦは、アルファ－シヌクレイン発現の下方制御を必要とする患者を処置するために使用することができる。患者は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、多系統萎縮症、および任意の他のシヌクレイノパチーなどの神経変性疾患に罹患しているかまたはそれらを発症するリスクがある。リスクにさらされている患者は、遺伝的素因を有する患者、脳震盪などの脳損傷を反復して受けた患者、環境神経毒にさらされた患者を含む。本開示は、処置を必要とするヒト患者などの対象において神経疾患（例えば、神経変性疾患）を処置する方法であって、対象の神経系に治療有効量（例えば、ＳＮＣＡ発現の十分な抑制を可能にする量）のＺＦＰ－ＴＦ（例えば、それを発現するｒＡＡＶベクター）を導入することを含む方法を提供する。「処置する」なる用語は、症状の緩和、症状の発症の予防、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、および生存期間の延長を含む。
【0059】
本開示は、その組換えゲノムがＺＦＰ－ＴＦの発現カセットを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）などのウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ブドウ糖、グリセロール、スクロース、乳糖、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、またはペクチンなどの薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。さらに、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を高める他の試薬などの補助物質を含有してもよい。医薬組成物は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、および小胞などの送達ビヒクルを含有してもよい。
【0060】
本開示の治療薬によって標的とされる細胞は、限定されないが、神経細胞（例えば、運動ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、またはセロトニン作動性ニューロン）；グリア細胞（例えば、希突起膠細胞、星状膠細胞、周皮細胞、シュワン細胞、またはミクログリア細胞）；上衣細胞；または神経上皮細胞を含む、脳内の細胞である。治療薬の標的となる脳領域は、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質または他の脳領域など、シヌクレイノパチーで最も深刻な影響を受ける領域であってもよい。これらの領域には、線条体内注射、黒質内注射、脳内注射、大槽内（ＩＣＭ）注射、またはより一般的には実質内注射、脳室内（ＩＣＶ）注射、くも膜下腔内注射、または静脈内注射によって直接到達できる。他の投与経路は、脳室内、鼻腔内、または眼内投与を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、例えば髄腔内および／または脳室内注射、または大槽内注射を介して脳脊髄液（ＣＳＦ）に直接投与された後、ＣＮＳ組織全体に広がる。他の実施形態において、ウイルスベクターは、静脈内投与後に血液脳関門を通過し、対象のＣＮＳ組織全体に広範囲に分布する。他の実施形態において、ウイルスベクターは、実質内注射を介して標的領域に直接送達される。場合によっては、ウイルスベクターは、実質内送達後に他の脳領域への逆行性または順行性輸送を受ける可能性がある。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、安定した非毒性の遺伝子導入を高効率で達成する、独特のＣＮＳ組織標的化能力（例えば、ＣＮＳ組織指向性）を有する。
【0061】
一例として、医薬組成物は、例えば右側脳室、左側脳室、第３脳室、または第４脳室などの患者の前脳の脳室領域への脳室内投与を通じて患者に提供されてもよい。医薬組成物は、脳内投与、例えば、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、大脳、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、頭蓋内腔、髄膜、硬膜、くも膜、または脳の軟膜内またはその近くへの組成物の注射によって患者に提供されてもよい。脳内投与は、場合によっては、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）への薬剤の投与を含んでもよい。
【0062】
場合によっては、脳内投与は、定位固定手順を使用する注射を含む。定位固定処置は当技術分野で周知であり、典型的には、特定の脳内領域、例えば心室領域への注入を誘導するために一緒に使用されるコンピュータおよび３次元走査装置の使用を含む。微量注入ポンプ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）も使用されてもよい。場合によっては、ウイルスベクターを含む組成物を送達するために微量注入ポンプが使用される。場合によっては、組成物の注入速度は、０．１μｌ／分～１００μｌ／分の範囲である。当業者には理解されるように、注入速度は、例えば、対象の種、対象の年齢、対象の体重／体格、ＡＡＶの血清型、必要な用量、および脳内領域が標的となる。したがって、当業者であれば、特定の状況では他の注入速度が適切であるとみなしてもよい。
【0063】
対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、静脈内投与によって達成されてもよい。特定の例では、ｒＡＡＶを脳組織、脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、神経細胞、グリア細胞、髄膜、星状細胞、希突起膠細胞、ミクログリア、間質腔などに局所的に送達することが望ましい場合がある。場合によっては、組換えＡＡＶは、心室領域への注射によってＣＮＳに直接送達されるほか、線条体、尾状核、被殻、黒質、中脳、嗅球、小脳、青斑核、橋、延髄、脳幹、淡蒼球、海馬、大脳皮質、またはその他の脳領域にも送達される。ＡＡＶは、定位注射などの当該技術分野で公知の神経外科技術を使用して、針、カテーテル、または関連機器を用いて送達されてもよい（例えば、Stein et al., J Vir. (1999) 73:3424-9; Davidson et al., PNAS. (2000) 97:3428-32; Davidson et al., Nat Genet. (1993) 3:219-223; および Alisky および Davidson, Hum. Gene Ther. (2000) 11:2315-29を参照されたい)。
【0064】
本明細書で別途定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に説明するが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本仕様が優先される。一般に、本明細書に記載される神経学、医学、医薬化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。酵素反応および精製技術は、当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。さらに、文脈により別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および実施形態を通じて、「有する（have）」および「含む（comprise）」なる語、または「有する（has）」、「有する（having）」、「含む（comprises）」、または「含む（comprising）」などの変形は、記載された整数または基を含むことを意味するものと理解される。しかしながら、他の整数または整数のグループは除外されない。本明細書で言及されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書では多数の文書が引用されているが、この引用は、これらの文書のいずれかが当該技術分野における共通一般知識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で使用される場合、１つまたは複数の対象の値に適用される「およそ」または「約」なる用語は、記載された基準値と同様の値を指す。特定の実施形態において、この用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかな場合を除き、記載の参考値のいずれかの方向に（より大きいかまたはより小さい）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に収まる値の範囲を指す。
【0065】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は説明のみを目的としており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0066】
実施例
実施例１：ＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
アルファ－シヌクレインの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、本発明者らは、５００ｂｐにわたるヒトＳＮＣＡ遺伝子の領域内の１５または１８ｂｐの配列に結合すると予測される４１６個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを設計し、スクリーニングした。ＴＳＳ１の上流からＴＳＳ１の５００ｂｐ下流まで、またはＴＳＳ２ａの５００ｂｐ上流からＴＳＳ２ｂの５００ｂｐ下流まで（図２Ｂ）。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、図２において矢印で示されている。矢印の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡ鎖（５’から３’）を示している。図４は、図３に表示されたものと同様のデータを示す。図２Ｂは、ＳＮＣＡ遺伝子のＴＳＳ２ａおよび２ｂを標的とする１、２、または３個のリン酸接触変化を有するＺＦＰ－ＴＦについてである。この研究では、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号１２）を転写リプレッサーとして使用し、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。４７の代表的なＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の表２に示す。インビトロ転写用の鋳型は、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１３）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１４））を使用してｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから生成した。メッセンジャーＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元の指示に従って使用して合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡを６用量希釈で９６ウェルプレートに等分した。
実施例１：ＺＦＰ－ＴＦのスクリーニング
アルファ－シヌクレインの発現を抑制するＺＦＰ－ＴＦを同定するために、本発明者らは、５００ｂｐにわたるヒトＳＮＣＡ遺伝子の領域内の１５または１８ｂｐの配列に結合すると予測される４１６個のＺＦＰ－ＴＦのライブラリーを設計し、スクリーニングした。ＴＳＳ１の上流からＴＳＳ１の５００ｂｐ下流まで、またはＴＳＳ２ａの５００ｂｐ上流からＴＳＳ２ｂの５００ｂｐ下流まで（図２Ｂ）。ＺＦＰ－ＴＦの標的領域は、図２において矢印で示されている。矢印の方向は、ＺＦＰ－ＴＦが結合するＤＮＡ鎖（５’から３’）を示している。図４は、図３に表示されたものと同様のデータを示す。図２Ｂは、ＳＮＣＡ遺伝子のＴＳＳ２ａおよび２ｂを標的とする１、２、または３個のリン酸接触変化を有するＺＦＰ－ＴＦについてである。この研究では、ＫＲＡＢドメイン配列（配列番号１２）を転写リプレッサーとして使用し、ＺＦＰドメインのＣ末端に融合させた。４７の代表的なＺＦＰ－ＴＦの配列を以下の表２に示す。インビトロ転写用の鋳型は、ＰＣＲ（フォワードプライマーＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号１３）；リバースプライマーＴ（１８０）ＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ（配列番号１４））を使用してｐＶＡＸ－ＺＦＰまたはｐＶＡＸ－ＧＦＰプラスミドから生成した。メッセンジャーＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元の指示に従って使用して合成し、ＲＮｅａｓｙ９６カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、各ＺＦＰ－ＴＦをコードするＲＮＡを６用量希釈で９６ウェルプレートに等分した。
【0067】
ＺＦＰ－ＴＦコード配列を有する組換えｒＡＡＶベクターを、周知の方法に従ってＨＥＫ２９３細胞中で生成した。ＡＡＶヘルパー遺伝子およびｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトしてから３日後、細胞を回収した。次いで、細胞を３回の凍結／融解によって溶解し、細胞破片を遠心分離によって除去した。ｒＡＡＶビリオンは、ポリエチレングリコールを使用して沈殿させた。再懸濁後、塩化セシウム勾配で一晩超遠心分離することによりビリオンを精製した。ビリオンを透析によって製剤化し、その後濾過滅菌した。ＡＡＶを等分し、使用するまで－８０°Ｃで保存した。ＡＡＶは解凍後に再凍結しなかった。
【0068】
スクリーニングを、ＳＫ－Ｎ－ＭＣヒト神経上皮細胞株において実施した。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞はヒトアルファ－シヌクレインを高レベルで発現するため、アルファ－シヌクレインの発現を低下させるＺＦＰ－ＴＦの検査に適している。ＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞を組織培養フラスコ内でコンフルエントになるまで培養した。細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり１５０，０００細胞で播種し、Ａｍａｘａ（登録商標）ＳＦ溶液に再懸濁した。次に細胞をＺＦＰ－ＴＦＲＮＡ（６用量：３、１０、３０、１００、３００、および１０００ｎｇ）と混合し、Ａｍａｘａ（登録商標）シャトルプレートウェルに移した。Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）機器（Ｌｏｎｚａ；プログラムＣＭ－１３７）を使用して細胞をトランスフェクトした。ＥａｇｌｅのＭＥＭ細胞培地をプレートの各ウェルに添加した。細胞を９６ウェル組織培養プレートに移し、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。
【0069】
ＺＦＰ－ＴＦを、ヒトｉＰＳＣ由来のＧＡＢＡ作動性ニューロン（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）においても試験した。細胞をポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした９６ウェルプレートにウェルあたり４０，０００細胞の密度で播種し、メーカーの指示に従って維持した。播種の４８時間後に、細胞を６つの異なるＭＯＩ（１Ｅ３、３Ｅ３、１Ｅ４、３Ｅ４、１Ｅ５、および３Ｅ５）で所望のＺＦＰ－ＴＦを発現するＡＡＶ６でトランスフェクトした。形質導入された細胞を最大３２日間維持した（５０～７５％の培地交換を３～５日ごとに行った）。ＡＡＶトランスフェクションの２８～３０日後に細胞を回収した。
【0070】
採取した細胞を溶解し、製造業者の指示に従ってＣ２ＣＴキットを使用して逆転写を行った。ＴａｑＭａｎ定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、ＳＮＣＡの発現レベルを測定した。ＳＮＣＡ発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＥＩＦ４Ａ２、ＡＴＰ５Ｂ、およびＧＡＰＤＨの発現レベルの幾何平均に対して正規化した。模擬トランスフェクションおよびＳＮＣＡを標的としないことが知られているＺＦＰ－ＴＦによるトランスフェクションを陰性対照として使用した。
【0071】
アルファ－シヌクレインの用量依存性抑制を、試験したＺＦＰ－ＴＦの多くで実証した。達成された最大抑制は９９％以上であったが、より低い程度（例えば、最高用量で約９０％、約７５％、または約４０％）アルファ－シヌクレインを抑制するＺＦＰ－ＴＦも同定した。図３Ａ～Ｅおよび５はスクリーニングデータを示す。
【0072】
実施例２：アルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット活性
全体的な遺伝子発現に対するアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット影響を評価するために、本発明者らは、代表的なアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処理したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから単離した全ＲＮＡに対してマイクロアレイ実験を行った。
全体的な遺伝子発現に対するアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのオフターゲット影響を評価するために、本発明者らは、代表的なアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦをコードするＡＡＶで処理したヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンから単離した全ＲＮＡに対してマイクロアレイ実験を行った。
【0073】
ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンを実施例１に記載のように処理した。マイクロアレイ分析のために、細胞をポリ－Ｌ－オルニチンおよびラミニンでコーティングした２４ウェルプレート上にウェル当たり２６０，０００細胞の密度で播種し、播種後４８時間で１Ｅ５ＶＧ／細胞でトランスフェクトし、そしてウイルストランスフェクションの１９日後に回収した。採取した細胞から単離したＲＮＡを、マイクロアレイ解析に使用した。
【0074】
初代マウス皮質ニューロンはＧｉｂｃｏから購入した。細胞をポリ－Ｄ－リジンでコーティングした２４ウェルプレートに２００，０００細胞／ウェルで播種し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）Ｉ添加物、Ｂ２７添加物、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＧｉｂｃｏ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを使用して製造業者の仕様書に従って維持した。播種から４８時間後（ＤＩＶ２で）、細胞を３Ｅ３ＶＧ／細胞のＭＯＩでＡＡＶ６に感染させ、７日後に回収した（ＤＩＶ９；３～４日ごとに５０％の培地交換を実施）。続いて、ＲＮＡの単離およびマイクロアレイ分析を行った。
【0075】
オフターゲット分析は、ＧｅｎｅＴｉｔａｎ（登録商標）プラットフォーム（ＣｌａｒｉｏｍＳキット）を製造業者の指示に従って使用して実施した。アッセイ結果を、ＴＡＣソフトウェアを使用して分析した。解析において、ＦＤＲ補正ｐ値≦０．０５で２倍以上制御されている、示差的に制御された遺伝子を呼び出した。オフターゲットが最小限であることが知られているＺＦＰ－ＴＦおよびモックトランスフェクションを陰性対照として使用した。
【0076】
図７Ａ～Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウス皮質ニューロンにおける４０の代表的なアルファ－シヌクレインＺＦＰ－ＴＦのマイクロアレイの結果を示す。さまざまなオフターゲット活性があり、一部のＺＦＰ－ＴＦは非常に低いオフターゲット活性を示すか、検出できないオフターゲット活性を示した。
【0077】
実施例３：アルファ－シヌクレインｍＲＮＡ発現のインビボ抑制
ヒトおよびマウスニューロンの両方において検出可能なオフターゲット活性が最小限または全くなく、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する２つの代表的なＺＦＰ－ＴＦ（８２１９５および８２２６４）を発現するＡＡＶ９構築物（８２１９５、～約９５％；８２２６４、～約８０％）を使用して、ＰＡＣシヌクレインマウスモデルにおけるヒトＳＮＣＡのインビボ抑制を実証した（Kuo et al., Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50）。このマウスモデルは、マウスアルファ－シヌクレイン－ヌルバックグラウンドで完全なヒトＳＮＣＡ配列とその上流制御配列を発現する。各ＺＦＰ－ＴＦおよびビヒクルを発現するＡＡＶ９ベクターを、８週齢雌性ＰＡＣシヌクレインマウス（各群ｎ＝３）の線条体の２か所に０．５μＬ／分の速度で両側投与した（半球あたり２部位：前線条体に５μＬ、後線条体に４μＬ、合計９μＬ／半球、１８μＬ／動物）。注入後、針を所定の位置に５分間放置して、試験物質を拡散させた。次いで、針を１～２分間かけてゆっくりと後退させた。注射の定位座標は次のとおりであった（吻側線条体－ＡＰ：＋１．４ｍｍ、ＭＬ：＋／－１．７ｍｍ、ＤＶ：－３．０ｍｍ、尾側線条体：ＡＰ：＋０．２ｍｍ、ＭＬ：＋／－２．３ｍｍ、ＤＶ：－２．７ｍｍ）。マウスを３週間後に安楽死させ、分子分析のために脳を収集した。安楽死の際、動物を経心的に０．９％生理食塩水で灌流し、脳を摘出して半切片にした。左半球を、さらに１２の異なる領域（嗅球、吻側、内側、および尾側皮質、吻側、内側、および尾側線条体、海馬、視床、腹側中脳、延髄、および小脳）に解剖した。ＲＮＡの完全性を維持するために、解剖した組織をＲＮＡＬａｔｅｒ中に置いた。２４時間後、ＲＮＡｌａｔｅｒを除去し、組織を液体窒素中で急速冷凍し、－８０°Ｃで保存するまでドライアイス上に維持した。
ヒトおよびマウスニューロンの両方において検出可能なオフターゲット活性が最小限または全くなく、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて異なる最大抑制活性を有する２つの代表的なＺＦＰ－ＴＦ（８２１９５および８２２６４）を発現するＡＡＶ９構築物（８２１９５、～約９５％；８２２６４、～約８０％）を使用して、ＰＡＣシヌクレインマウスモデルにおけるヒトＳＮＣＡのインビボ抑制を実証した（Kuo et al., Hum Mol Genet.(2010)19(9):1633-50）。このマウスモデルは、マウスアルファ－シヌクレイン－ヌルバックグラウンドで完全なヒトＳＮＣＡ配列とその上流制御配列を発現する。各ＺＦＰ－ＴＦおよびビヒクルを発現するＡＡＶ９ベクターを、８週齢雌性ＰＡＣシヌクレインマウス（各群ｎ＝３）の線条体の２か所に０．５μＬ／分の速度で両側投与した（半球あたり２部位：前線条体に５μＬ、後線条体に４μＬ、合計９μＬ／半球、１８μＬ／動物）。注入後、針を所定の位置に５分間放置して、試験物質を拡散させた。次いで、針を１～２分間かけてゆっくりと後退させた。注射の定位座標は次のとおりであった（吻側線条体－ＡＰ：＋１．４ｍｍ、ＭＬ：＋／－１．７ｍｍ、ＤＶ：－３．０ｍｍ、尾側線条体：ＡＰ：＋０．２ｍｍ、ＭＬ：＋／－２．３ｍｍ、ＤＶ：－２．７ｍｍ）。マウスを３週間後に安楽死させ、分子分析のために脳を収集した。安楽死の際、動物を経心的に０．９％生理食塩水で灌流し、脳を摘出して半切片にした。左半球を、さらに１２の異なる領域（嗅球、吻側、内側、および尾側皮質、吻側、内側、および尾側線条体、海馬、視床、腹側中脳、延髄、および小脳）に解剖した。ＲＮＡの完全性を維持するために、解剖した組織をＲＮＡＬａｔｅｒ中に置いた。２４時間後、ＲＮＡｌａｔｅｒを除去し、組織を液体窒素中で急速冷凍し、－８０°Ｃで保存するまでドライアイス上に維持した。
【0078】
脳組織を、氷上の０．６ｍＬのＴＲＩ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および２つの３．２ｍｍスチールビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含有する１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。試料は、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して４°Ｃで次のパラメーターを使用して溶解した：５サイクル、９０秒の持続時間、および２５．１周波数。短時間遠心した後、７０μＬの１－ブロモ－３－クロロプロパンを室温で各試料に添加した。試料を１０秒間ボルテックスし、４°Ｃ、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、各試料からの水相１２０μＬを９６ウェルプレートのウェルに移した。
【0079】
６０マイクロリットルのイソプロピルアルコールおよび１２μＬのＭａｇＭａｘ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、組織溶解物の水相を含有する各ウェルに添加した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＭａｇＭａｘキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、メーカーのプロトコールに従って組織溶解物からリボ核酸（ＲＮＡ）を単離した。磁気スタンドを使用して、１００マイクロリットルの溶出ＲＮＡを磁気ビーズから分離した。ＲＮＡの収量および品質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して評価した。
【0080】
相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を、１０μＬのＲＮＡおよび１０μＬのＲＴマスターミックス（１０×ＲＴ緩衝液、１０×ランダムプライマー、２５×ｄＮＴＰミックス、マルチスクライブ酵素、およびＲＮＡｓｅを含まない水）をデフォルトで有する高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して調製した。必要に応じて、ＲＮＡおよびＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの量を調整して、入力が１００～１，０００ｎｇの範囲になるようにした。逆転写を、次のプログラムを使用してＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｂｉｏｒａｄサーマルサイクラーで実行した：２５°Ｃで１０分間、３７°Ｃで１２０分間、８５°Ｃで５分間、４°Ｃで保持。
【0081】
ｃＤＮＡを、Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲに供した。ｃＤＮＡをヌクレアーゼを含まない水で１０倍に希釈し、４μＬの希釈ｃＤＮＡを各１０μＬのＰＣＲ反応液に加えた。各試料を技術的に４回繰り返してアッセイした。トリプレックスアッセイには２ｘ Ｆａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ）マスターミックスを使用し、他のアッセイにはＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。
【0082】
以下のサイクリング条件を使用した：Ｑｉａｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘマスターミックス→９５°Ｃで５分間、９５°Ｃで４５秒間、６０°Ｃで４５秒間、プレート読み取り、４０サイクル；Ｂｉｏｒａｄ ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄマスターミックス→９５°Ｃで９０秒、９５°Ｃで１２秒、６０°Ｃで４０秒、プレート読み取り、４２サイクル。
【0083】
ＲＮＡ回収率％を評価するために、ＲＮＡ単離工程の前と後のＧＦＰＲＮＡのスパイクを使用した。研究の動物から採取したプールしたＲＮＡの４試料の５倍希釈系列を標準曲線として使用した。試料データを、３つのハウスキーピング遺伝子ＡＴＰ５Ｂ、ＥＩＦ４Ａ２、およびＧＡＰＤＨの幾何平均に正規化した。
【0084】
実験からのアルファ－シヌクレイン、ＺＦＰ－ＴＦ、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、およびＮｅｕＮｍＲＮＡ発現データを図８Ａおよび８Ｂに示す。データは、ＺＦＰ－ＴＦ発現が顕著な脳領域でアルファ－シヌクレインの抑制があったことを示している。さらに、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、およびＮｅｕＮの発現データは、ＺＦＰ－ＴＦの投与により神経炎症マーカーの発現上昇または神経マーカーＮｅｕＮの発現低下が起こらなかったため、ＺＦＰ－ＴＦの忍容性が良好であることを示している。
【0085】
配列表
以下の表１は、本開示の４７の例示的な操作されたＺＦＰを列挙する。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（つまり、Ｆ１～Ｆ６）が単一行に表示される。以下の表の「＾」は、示されたヘリックスの最初のアミノ酸の上流４番目の位置にあるアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変更されていることを示す。各配列の配列番号は、配列の下の括弧内に示されている。列２の塩基配列において、ＺＦＰが接触する塩基を大文字で示す。
以下の表１は、本開示の４７の例示的な操作されたＺＦＰを列挙する。各ＺＦＰについて、ＺＦＰドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）およびＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（つまり、Ｆ１～Ｆ６）が単一行に表示される。以下の表の「＾」は、示されたヘリックスの最初のアミノ酸の上流４番目の位置にあるアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変更されていることを示す。各配列の配列番号は、配列の下の括弧内に示されている。列２の塩基配列において、ＺＦＰが接触する塩基を大文字で示す。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0086】
以下の表２は、本開示の４７の例示的なＺＦＰ－ＴＦの完全なアミノ酸配列を列挙しており、ＤＮＡ結合認識ヘリックス配列は太字であり、モジュール内リンカーおよびモジュール間リンカーには下線が引かれている。Ｒ（－５）Ｑ骨格変異は太字および下線で示されている。ＺＦＰドメインとＫＲＡＢドメインの間のリンカーには二重下線が引かれている。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【配列表】
【国際調査報告】