特表 2023-545998 疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＤＮＡプラスミド調製物からのＲＮＡ及び不純物の改善された除去

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-01

(54)【発明の名称】疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＤＮＡプラスミド調製物からのＲＮＡ及び不純物の改善された除去

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 112Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023521118

(86)(22)【出願日】2021-10-05

(85)【翻訳文提出日】2023-05-24

(86)【国際出願番号】 EP2021077428

(87)【国際公開番号】W WO2022073995

(87)【国際公開日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】20200088.1

(32)【優先日】2020-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521262714

【氏名又は名称】ザルトリウス ビーアイエー セパレーションズ ディー．オー．オー．

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ガニオン、ピーター スタンリー

(72)【発明者】

【氏名】セキルニーク、ロック

(72)【発明者】

【氏名】ボジッチ、クレメン

(57)【要約】

ｐＤＮＡと不純物とを含むサンプルから精製されたｐＤＮＡ調製物を作製する方法が開示される。前記方法は、ｐＤＮＡ及び不純物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に吸着させる濃度のコスモトロピック塩を含有する溶液中で、サンプルをＨＩＣ材料と接触させる工程、ＨＩＣ材料へのｐＤＮＡの吸着に続いて中性塩の存在下でコスモトロピック塩の濃度を希釈する工程、それにより、不純物を中性塩の継続的な存在下で吸着させつつ、ＨＩＣ材料からｐＤＮＡを脱離させる工程、並びに、ｐＤＮＡ調製物を得る工程を含む。さらに、本発明の方法又は他の精製方法（特に、ＨＩＣ材料の存在下でサンプルを中性塩に曝すことによる陰イオン交換クロマトグラフィー）に供されるサンプルを調製する方法が開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｐＤＮＡと不純物とを含むサンプルから精製されたｐＤＮＡ調製物を作製する方法であって、
ｐＤＮＡ及び不純物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に吸着させる濃度の中性塩及びコスモトロピック塩を含有する溶液中で、サンプルをＨＩＣ材料と接触させる工程、
ＨＩＣ材料へのｐＤＮＡの吸着に続いて中性塩の存在下でコスモトロピック塩の濃度を低下させる工程、
それにより、不純物を中性塩の継続的な存在下で吸着させつつ、ＨＩＣ材料からｐＤＮＡを脱離させる工程、並びに、
ｐＤＮＡ調製物を得る工程
を含む、精製されたｐＤＮＡ調製物を作製する方法。

【請求項2】

前記コスモトロピックが、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記コスモトロピック塩の濃度が、１．０Ｍ～２．５Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．２５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０、又は１．７Ｍ～１．９Ｍである、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

中性塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記中性塩の濃度が、０．５Ｍ～５．０Ｍ、又は０．７５Ｍ～４．０Ｍ、又は１．０Ｍ～３．０Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０Ｍの範囲である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記サンプルがプラスミドＤＮＡを含有する原核細胞の溶解物（lysate）である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記不純物が、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＡ－タンパク質凝集体、ＤＮＡ－タンパク質凝集体、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体からなる群より選択される、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＨＩＣ材料が疎水性リガンドを有するポリマーである、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記疎水性リガンドは、フェニル及び／又はベンジルリガンド等の芳香族性、又はブチル、ヘキシル、及び／又はオクチルリガンド等のアルキル性、又はこれらの組み合わせである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＨＩＣ材料がクロマトグラフィーカラムに配置されている、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記中性塩の濃度は、前記接触工程及び前記希釈工程の間変化しない、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

さらなるクロマトグラフィー工程が前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの前又は後に使用される、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記さらなるクロマトグラフィー工程が陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｐＤＮＡと不純物とを含むサンプルから、精製されたｐＤＮＡ調製物を作製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プロデューサー細胞の溶解（lysis）により得られるＤＮＡプラスミドは、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＡ－タンパク質凝集体、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体によって一般に夾雑されている。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の精製法として知られるツールの１つである［１］。高濃度の沈殿塩を含有する溶液中のＨＩＣカラムにサンプルが付与される。ｐＤＮＡが結合し、不純物も結合する。カラムでは、塩濃度を低下させるグラジエントで溶出が行われる。スーパーコイル（ｓｃ）、オープンサーキュラー（ｏｃ）、リニアｐＤＮＡ等のプラスミドアイソフォーム同士では良好な分離を行うことができるが、ＲＮＡが所望のｓｃＤＮＡとかなりの程度共溶出する。宿主細胞タンパク質、ＲＮＡ－タンパク質凝集体、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体からのｐＤＮＡの良好な分離も達成される。残る不純物をＨＩＣによって完全に除去できないことは、ほとんどの場合、ＨＩＣと陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）とを組み合わせることで補っている。

【発明の概要】

【0003】

驚くべきことに、ＨＩＣによるｐＤＮＡ調製物からの不純物の除去は、カラム溶出時にコスモトロピック塩（第１の塩）の濃度を中性塩（第２の塩）の存在下で低下させることで増進できることがわかった。ｐＤＮＡは、中性塩の継続的な存在下でコスモトロピック塩の濃度を低下させることにより回収される。ＲＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ－タンパク質凝集体、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体は、第２の塩の継続的な存在下でカラムに結合したままである。中性塩が不純物を疎水性カラムに強く結合したままにさせると考えられる。これは、中性塩の非存在下でコスモトロピック塩濃度を下げることにより生じる単純なグラジエントで各種不純物をｐＤＮＡと共溶出させる従来の溶出アプローチとは対照的である。このアプローチは、ｐＤＮＡ画分中の不純物の量を減少させ、ｐＤＮＡ画分中に残存する不純物の範囲（spectrum）を変化させる。よって、本発明の方法及び別のクロマトグラフィー法の組み合わせにより、通常行われているＨＩＣ及び別のクロマトグラフィー法の組み合わせと比較して、より高度に精製されたｐＤＮＡが生成される。

【0004】

本発明の主題は、ｐＤＮＡと不純物とを含むサンプルから精製されたｐＤＮＡ調製物を作製する方法であり、前記方法は、
ｐＤＮＡ及び不純物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料に吸着させる濃度のコスモトロピック塩を含有する溶液中で、サンプルをＨＩＣ材料と接触させる工程、
ＨＩＣ材料へのｐＤＮＡの吸着に続いて中性塩の存在下でコスモトロピック塩の濃度を希釈する工程、
それにより、不純物を中性塩の継続的な存在下で吸着させつつ、ＨＩＣ材料からｐＤＮＡを脱離させる工程、並びに、
ｐＤＮＡ調製物を得る工程、
を含む。

【0005】

用語「沈殿塩」は、タンパク質化学の分野においてキャリーオーバーを表し、特定の塩がタンパク質の沈殿に有効であることが知られている。硫酸アンモニウムはその一例である。塩酸グアニジニウム（guanidinium hydrochloride）等の他の種は沈殿を防ぐ強力な可溶化剤である。塩化ナトリウム等の一部のアルト（alts）はタンパク質の沈殿を促進する能力が劇的に低い。タンパク質の溶解性に対する各種塩の影響は、ホフマイスターシリーズにおける各々の序列と相関することが知られている［２］。

【0006】

沈殿を促進する塩は一般にコスモトロピック塩又はリオトロピック塩に分類される。溶解を促進する塩は一般にカオトロピック塩に分類される。塩化ナトリウム等の中間的な性質の塩は一般に中性塩に分類される。

【0007】

この文脈における用語「中性塩」は、塩が溶解している水溶液のｐＨを指すものではないと理解される。そうではなく、用語「中性塩」は、陽イオンと陰イオンの組み合わせと平均化による寄与が、カオトロピックでもなくコスモトロピックでもない、すなわち中性的な効果を生じる任意の塩として理解される。典型的には、１価の金属ハロゲン塩及び１価の金属アセテート塩が中性塩として認識されている。

【0008】

本発明の方法の実施形態では、コスモトロピック塩は、コスモトロピック陰イオン、コスモトロピック陽イオン、又はその両方を含有する塩であり得、特に、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。典型的には、コスモトロピック塩の濃度は、１．０Ｍ～２．５Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．２５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０、又は１．７Ｍ～１．９Ｍの範囲であってもよい。多くのコスモトロピック塩は、水への溶解度が低いためその使用は制限されている。リン酸ナトリウムはその一例である。リン酸ナトリウムは約０．８Ｍで飽和するが、この濃度は本発明の方法又は任意の沈殿ベースの技術に利用するには低すぎる。リン酸カリウムはこれよりずっと高い濃度で溶解性を維持することから有用性がある。

【0009】

本発明の方法の別の実施形態では、中性塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸アンモニウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。典型的には、中性塩の濃度は、０．５Ｍ～５．０Ｍ、又は０．７５Ｍ～４．０Ｍ、又は１．０Ｍ～３．０Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０Ｍの範囲であり得る。

【0010】

本発明の方法のさらに別の実施形態では、サンプルはプラスミドＤＮＡを含有する原核細胞の溶解物（lysate）であり得る。

【0011】

本発明の方法のさらなる実施形態では、不純物は、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＡ－タンパク質凝集体、ＤＮＡ－タンパク質凝集体、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体からなる群より選択され得る。

【0012】

本発明の方法のさらに別の実施形態では、ＨＩＣ材料は、疎水性リガンドを有するポリマーであり得る。

【0013】

本発明の方法のさらなる実施形態では、疎水性リガンドは、フェニル及び／又はベンジルリガンド等の芳香族性、又はブチル、ヘキシル、及び／又はオクチルリガンド等のアルキル性、又はこれらの組み合わせであり得る。

【0014】

本発明の方法の別の実施形態では、ＨＩＣ材料はクロマトグラフィーカラムに配置され得る。

【0015】

一実施形態では、本発明の方法は、ｐＤＮＡから不純物を除去する単一の方法である。本発明のさらなる実施形態は、他の精製方法（特に、陰イオン交換クロマトグラフィー）に供するサンプルを調製するための前精製方法である。特に、前精製方法が採用される場合、中性塩は塩化リチウム又は塩化カルシウムであり得る。別の実施形態では、本発明の方法は、別の方法（特に、陰イオン交換クロマトグラフィー）によって調製されたｐＤＮＡの純度を高めるための後精製方法である。

【0016】

本発明の前精製方法の実施形態では、ＨＩＣ材料は、疎水性深層濾過（hydrophobic depth filtration）材料、又は多孔質疎水性粒子若しくはナノファイバーで充填されたカラムであり得る。

【0017】

本発明の前精製方法の別の実施形態では、コスモトロピック塩がサンプルに添加されてもよい。密接に関連した変形例では、コスモトロピック塩が液体濃縮物として添加されてもよい。斯かる一実施形態では、添加は、均質な混合を迅速に達成するために混合装置によって行ってもよい。斯かる一実施形態では、混合は、サンプルがカラムに接触する前に沈殿物が形成するのを最小限にするために、混合物をＨＩＣカラムと接触させる直前に行ってもよい。

【0018】

本発明の前精製方法の別の実施形態では、サンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィー用のサンプルを調製するために水又は低導電率バッファーで希釈され得る。

【0019】

本発明の後精製方法の実施形態では、陰イオン交換体から溶出されたｐＤＮＡであって、陰イオン交換体から溶出させるのに使用された中性塩を含有したままのｐＤＮＡをコスモトロピック塩と組み合わせて、ＨＩＣカラムへのｐＤＮＡの結合を媒介してもよい。一般事項として、このアプローチは本発明の前精製方法に比べて複雑でなく、より円滑な包括的プロセスフローをサポートする。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、本発明の方法の各段階を示す。

【図2】図２は、コスモトロピック塩のグラジエントにおけるＤＮＡの溶出を示す。

【図3】図３は、中性塩の濃度が一定に保持された状態でのコスモトロピック塩のグラジエントにおけるプラスミドＤＮＡの溶出を示す。

【図4】図４は、ＲＮＡの溶出挙動を示し、ＲＮＡはコスモトロピック塩の濃度が低下されつつ中性塩の濃度が一定に保持されている間は結合したままであり、中性塩の濃度が低下されると溶出する。

【図5】図５は、プラスミドＤＮＡとＲＮＡの各々の溶出挙動を示し、ｐＤＮＡは中性塩の濃度が一定に保持されつつコスモトロピック塩の下降するグラジエントで溶出し、中性塩の濃度が低下されるとＲＮＡが溶出する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

一部の実施形態では、本発明の方法によって処理されるサンプルは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含有する濾過された細菌溶解物である。斯かる一部の実施形態では、細菌宿主は大腸菌（Escherichia coli.）である。他の実施形態では、本発明の方法によって処理されるサンプルは、塩化カルシウムで処理されてＲＮＡの一部を沈殿させた、濾過されたｐＤＮＡ含有細菌溶解物である。他の実施形態では、本発明の方法によって処理されるサンプルは、別の方法によるクロマトグラフィー用に調製される。他の実施形態では、本発明の方法によって処理されるサンプルは部分的に精製される。他の実施形態では、サンプルは、だいたい精製されているが任意の量又は相対割合のタンパク質、ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体で依然夾雑されているスーパーコイルプラスミドＤＮＡである。他の実施形態では、本発明の方法によって処理される部分的に精製されたｐＤＮＡは、陰イオン交換クロマトグラフィーで部分的に精製された。

【0022】

一部の実施形態では、本発明の方法を実施するために使用されるＨＩＣ材料は疎水性リガンドを有するポリマーである。ＨＩＣリガンドは、芳香族性でもアルキル性でも混合性（mixed character）でもよい。芳香族ＨＩＣ媒体としてはフェニル及びベンジル媒体が挙げられる。アルキルＨＩＣ媒体としては、ブチル、ヘキシル、及びオクチル媒体が挙げられる。いずれのタイプもｐＤＮＡの精製に使用され、またいずれも各種物理的形態で世界中で広く市販されている。斯かる形態には、多孔質粒子、モノリス、メンブレン、及びナノファイバーで充填されたカラムが含まれ、中でも、クロマトグラフィーの実施を容易にするためにクロマトグラフィー装置において採用され通常はカラムと呼ばれるものが含まれる。

【0023】

一部の実施形態では、コスモトロピック塩は、硫酸アンモニウム、又は硫酸ナトリウム、又はリン酸カリウム、又はクエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウム、又は他のコスモトロピック塩である。コスモトロピック塩が硫酸アンモニウムである斯かる一実施形態では、ＤＮＡをＨＩＣカラムに結合させるために使用される硫酸アンモニウムの濃度は、ＨＩＣカラムの疎水性に応じて、１．０Ｍ～２．５Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．２５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０、又は１．７Ｍ～１．９Ｍの範囲であってもよい。ＨＩＣカラムにｐＤＮＡを結合させるためのコスモトロピック塩濃度の決定方法は当業界で周知である。一般事項として、カラムの疎水性が高いほど所望の効果を得るのに必要な塩の濃度は低くなる。

【0024】

一部の実施形態では、中性塩は、塩化ナトリウム、又は塩化カリウム、又は塩化リチウム、又は塩化アンモニウム、又は酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウム、又は酢酸リチウム、又は酢酸アンモニウム、又は他の中性塩である。中性塩が塩化ナトリウムである斯かる一実施形態では、ＨＩＣカラムへのＲＮＡ及び宿主細胞ＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体の結合を維持するために使用される塩化ナトリウムの濃度は、ＨＩＣカラムの疎水性に応じて、０．５Ｍ～５．０Ｍ、又は０．７５Ｍ～４．０Ｍ、又は１．０Ｍ～３．０Ｍ、又は１．２５Ｍ～２．５Ｍ、又は１．５Ｍ～２．０Ｍの範囲であってもよい。コスモトロピック塩と同様に、適切な塩濃度の決定方法は当業界で周知である。

【0025】

当業界の経験者は、組み合わせによって溶解度積定数が小さいゆえに塩が自発的に沈殿するのを回避するために、塩含有バッファー間でイオン連続性（ionic continuity）を維持することの利点を認識するであろう。例えばリン酸カリウムを塩化ナトリウムと混合すると、リン酸カリウム塩よりも大幅に溶解度が小さいリン酸ナトリウム塩が沈殿するリスクがある。リン酸カリウムと塩化カリウムを混合することでこのリスクを抑える。同様の例で、高濃度の硫酸アンモニウムと塩化ナトリウムを混合すると、溶解度が小さい硫酸ナトリウムが沈殿するリスクがある。硫酸アンモニウムが塩化アンモニウムと混合された場合、あるいは硫酸ナトリウムが塩化ナトリウムと混合された場合、この問題は発生しない。この留意事項は、塩の溶解性の問題を生じ得るあらゆる組み合わせを阻止するものではない。そうではなく、問題が生じ得ることが判明した場合に、その問題を扱う意識の必要性への注意が求められる。

【0026】

一部の実施形態では、本発明の方法は概ね中性のｐＨで実施されてもよい。「概ね中性のｐＨ」とは約ｐＨ６．５～約ｐＨ７．５の範囲内を意味すると理解される。他の実施形態では、方法全体、あるいは異なるセグメント若しくはバッファーの方法は、より広い範囲、例えばｐＨ６．０～ｐＨ８．０、又はｐＨ５．５～ｐＨ８．５、又はｐＨ５．０～ｐＨ９．０、又はｐＨ４．０～ｐＨ９．０のｐＨ値で実施されてもよい。当業界の経験者は、ｐＨが７．０を超えるアンモニウム塩の使用は推奨されないことを認識するであろう。なぜなら、アンモニウムイオンが自発的にアンモニアガスに変換され、このアンモニアガスがバッファーを不安定にし、安全上の問題を生じ、所望のＤＮＡプラスミドを損傷する可能性があるためである。

【0027】

一部の実施形態では、ＨＩＣカラムへのｐＤＮＡの最初の（original）結合の際に中性塩が存在しなくてもよい。重要な要件は、ＤＮＡの溶出中に中性塩がコスモトロピック塩と共に存在することである。一実施形態では、ｐＤＮＡは、第１のコスモトロピック塩のみに結合してもよく、中性塩は、ＤＮＡプラスミドの溶出中に存在するように後続の工程で導入されてもよい。

【0028】

一部の実施形態では、コスモトロピック塩の濃度は、中性塩の濃度を一定に維持しながら漸減させられる。第１の塩の漸減は、いわゆるリニアグラジエント、より具体的には下降するリニアグラジエントの形成をもたらす。一部の実施形態では、コスモトロピック塩の濃度は、中性塩の濃度を一定に維持しながら段階的に減少させられる。段階的な減少は、いわゆるステップグラジエント、より具体的には下降するステップグラジエントの形成をもたらす。一部の実施形態では、溶出グラジエントは、ステップセグメント及びリニアセグメントを含んでいてもよい。

【0029】

一部の実施形態では、中性塩の濃度を本方法の実施中に変化させてもよい。

【0030】

一部の実施形態では、本方法は、コスモトロピック塩のみを含むバッファーの存在下でｐＤＮＡが結合し、グラジエント終点バッファーが中性塩のみを含むように構成されてもよい。斯かる構成では、グラジエント終点バッファー中の第２の塩の濃度は、ｐＤＮＡが溶出するにつれてＲＮＡ、タンパク質、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体の結合を維持するために必要な第２の塩の閾値濃度に達するように十分に高くなければならないことが簡単な計算から明らかである。斯かる一実施形態では、ｐＤＮＡ結合バッファー中の第１の塩の濃度が２Ｍであり、グラジエント終点バッファー中の第２の塩の濃度が４Ｍである場合、第１の塩が１Ｍの濃度まで低下するにつれて、第２の塩の濃度は２Ｍの濃度へと上昇する。１つの成分が開始バッファー中に集中し、別の成分が終点バッファー中に集中するグラジエントを形成するこのアプローチは、当業界では交差（ｃｒｏｓｓｅｄ）グラジエントとして知られる。

【0031】

交差グラジエントアプローチを用いる関連した実施形態では、コスモトロピック塩を含有する結合バッファーは中性塩を含んでいてもよく、ここで、結合バッファー中の中性塩の濃度は、グラジエント終点バッファー中の中性塩の濃度とは異なる。斯かる一実施形態では、グラジエント開始バッファー中の第２の塩の濃度は、グラジエント終点バッファー中の第２の塩の濃度よりも低い。他の実施形態では、グラジエント終点バッファーは、グラジエント開始バッファー中のコスモトロピック塩の濃度よりも低い濃度のコスモトロピック塩を含有していてもよい。

【0032】

一部の実施形態では、カラムは、所望のｐＤＮＡの溶出後すぐに洗浄工程によって再生されてもよい。斯かる一部の実施形態では、洗浄工程の配合は、１ＭのＮａＯＨ、又はより低い濃度のＮａＯＨ、又はより高い濃度のＮａＯＨ、又は１ＭのＮａＯＨと２ＭのＮａＣｌ、又は５００ｍＭのＮａＯＨと３ＭのＮａＣｌ、又はＮａＯＨとＮａＣｌの任意の他の組み合わせ、又はＫＯＨとＫＣｌの任意の組み合わせであってよい。洗浄溶液はまた、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤を１ｍＭ～１００ｍＭの範囲の濃度で含んでいてもよい。

【0033】

一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドの溶出後、不純物を回収するために中性塩の濃度を低下させた第２の溶出が行われてもよい。斯かる一実施形態では、第２の溶出は、不純物の分析を容易にするために不純物が集中するように単一の工程で行われてもよい。別の斯かる実施形態では、第２の溶出は、各種不純物の相対的なリテンションを評価するためにマルチステップグラジエント又はリニアグラジエントとして実施されてもよい。

【0034】

低分子不純物、ＲＮＡ、宿主細胞ＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ、及びタンパク質不純物を除去しつつｐＤＮＡを濃縮し、オープンサーキュラーｐＤＮＡからスーパーコイルｐＤＮＡを分画するために第１の塩の能力を意図的に犠牲にすることを目的とする一部の実施形態では、中性塩の存在を維持しつつコスモトロピック塩を低減又は排除する工程でｐＤＮＡを溶出させてもよい。

【0035】

一部の実施形態では、サンプルは、不純物の一部を沈殿させる目的で、最初に中性塩に曝すことによってＨＩＣカラムへの付与のために調製されてもよい。斯かる沈殿物が形成される限りにおいて、サンプルをＨＩＣカラムに結合させる前に第１のコスモトロピック塩をサンプルに添加する前に、不純物を除去することができる。

【0036】

一部の実施形態では、サンプルは、疎水性粒子の存在下で最初に中性塩に曝すことによってＨＩＣカラムへの付与のために調製されてもよく、これによりタンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ不純物が粒子に結合してそれらの沈降を助ける。斯かる一実施形態では、中性塩は、塩化リチウムであってもよいし、塩化カルシウムであってもよい。プラスミドＤＮＡ精製の分野の知識がある者には、このことが、最初のクロマトグラフィー精製工程前に、ＲＮＡの夾雑を減らすために塩化カルシウムで沈殿を行う一般的作業に取って代わることができるか、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体をより効果的に除去するためにカルシウム沈殿と組み合わせて使用できることが認識されよう。

【0037】

一実施形態では、サンプル調製方法は遊離粒子（loose particles）以外の疎水性表面で実施される。斯かる一実施形態では、サンプル調製方法は、多孔質疎水性粒子又はナノファイバーで充填されたカラムを有し得る疎水性深層濾過装置又は疎水性表面（複数可）を収容する別の装置を用いて実施される。一実施形態では、疎水性表面の存在下で中性塩で処理することによるサンプル調製に続いて、本発明の方法を実施するための調製物として処理されたサンプルにコスモトロピック塩を引き続き添加してもよい。別の実施形態では、疎水性表面の存在下で中性塩で処理することによるサンプル調製に続いて、サンプルを水又は低導電率バッファーで希釈して陰イオン交換クロマトグラフィー用のサンプルを調製してもよい。別の実施形態では、疎水性表面の存在下で中性塩で処理することによるサンプル調製に続いて、サンプルを別のタイプの処理のために平衡化してもよい。

【0038】

一部の実施形態では、本発明の方法は、プラスミドＤＮＡの精製プロセスにおける第１のクロマトグラフィー工程として実施される。他の実施形態では、本発明の方法は、プラスミドＤＮＡの精製プロセスにおける第２のクロマトグラフィー工程又はそれ以降のクロマトグラフィー工程として実施される。

【0039】

一部の実施形態では、本発明の方法の後に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が実施される。他の実施形態では、本発明の方法の前に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が実施される。別の実施形態では、本発明の方法は、金属アフィニティークロマトグラフィー工程と組み合わされる。別の実施形態では、本発明の方法は、別のクロマトグラフィー工程と組み合わされる。別の実施形態では、本発明の方法は、複数の追加のクロマトグラフィー工程と組み合わされる。斯かる一実施形態では、本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び金属アフィニティークロマトグラフィー工程と組み合わされる。別の斯かる実施形態では、本発明の方法は、陰イオン交換若しくは金属アフィニティークロマトグラフィー工程、及び、別のクロマトグラフィー工程と組み合わされる。上記いずれの実施形態においても、追加のクロマトグラフィー工程は、サイズ排除クロマトグラフィー工程であってもよい。他の実施形態では、本発明の方法は、本クロマトグラフィー工程のみであってもよい。

【0040】

ｐＤＮＡ調製物のＲＮＡ夾雑が多様であることは当業者によって認識されよう。広範なサイズのＲＮＡが含まれている可能性があり、ＲＮＡは通常タンパク質と強く結合し（associated）、精製されたＲＮＡとは異なるクロマトグラフィー挙動を示す複合体を生成する。本発明の方法は、特に、大きなＲＮＡ、ＲＮＡ－タンパク質複合体、及びＲＮＡ－タンパク質－ＤＮＡ複合体の除去を増進するであろう。極めて小さいＲＮＡの集団が、ＤＮＡを溶出させるためのコスモトロピック塩の減少中に溶出することもあるが、このＲＮＡの集団は、単純なコスモトロピック塩グラジエントで溶出させる通常の従来の条件下でＨＩＣが行われた場合、ｐＤＮＡを夾雑するＲＮＡよりも陰イオン交換クロマトグラフィーによってより効果的に減少するだろう。
参考文献

【0041】

本明細書中で引用された全ての参考文献は、本明細書中の明示的な教示と矛盾しない範囲においてその全文が参照により本明細書に組み込まれる。

【0042】

［１］ Ｃ Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｃ Ｒｏｓｅ， Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６９６ （１９８２） ３２３－３３１

【0043】

［２］ Ｗ Ｍｅｌａｎｄｅｒ， Ｃ Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｓａｌｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ａｎ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ ｓｅｒｉｅｓ， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １８３ （１９７７） ２００－２１５

【0044】

本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。

【実施例】

【0045】

実施例１
プラスミドＤＮＡ調製物からのタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ－タンパク質－ＲＮＡ凝集体、及び低分子量不純物の除去
ＨＩＣ用のブチルモノリスを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．８Ｍの硫酸アンモニウム、１．８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０の組み合わせに平衡化させる。塩化カルシウム沈殿と上清の濾過によって処理された大腸菌溶解物（E. coli lysate）を含有するサンプルをｐＨ７．０に滴定し、硫酸アンモニウムを最終濃度である１．８Ｍまで添加する。サンプルをカラムに付与し、カラムを平衡化バッファーで洗浄し、結合していない低分子量不純物を除去する。次いで、塩化ナトリウムの濃度を一定に保ちながら、硫酸アンモニウムの濃度を下げるリニアグラジエントでプラスミドＤＮＡを溶出させる。図１を参照されたい（ｆｔ：フロースルー、ｓｃ：スーパーコイル、ｏｃ：オープンサーキュラー）。

【0046】

実施例２
二本鎖ＤＮＡの結合と溶出
８０個の塩基対～１０，０００個の塩基１０，０００個の塩基対（10,000 base 10,000 base pairs）の範囲の異なるサイズの二本鎖ＤＮＡを含有するサンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．２の高密度ブチル（ＨＩＣ）モノリスに付与した。ロードされたカラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２．５Ｍの硫酸アンモニウム、１．２Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２に再平衡化した。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１．２Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２のリニアグラジエントでカラムから溶出させた。二本鎖ＤＮＡを当該グラジエントで溶出させた。図２を参照されたい。

【0047】

実施例３
一本鎖ＲＮＡの結合と非溶出
２００個の塩基～６，０００個の塩基の範囲の異なるサイズの一本鎖ＲＮＡを含有するサンプルを使用したことを除いて実施例１の条件を繰り返した。ＲＮＡは硫酸アンモニウムを低減させるグラジエントでは溶出せず、ＮａＣｌ中のカラムに結合したままであった。

【0048】

実施例４
中性塩の濃度を一定に保持しつつコスモトロピック塩の濃度を低下させることによるＨＩＣカラムからのｐＤＮＡの溶出
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１．２５Ｍの硫酸ナトリウム、３．０Ｍの塩化ナトリウムを含有し、ｐＨ７．２の結合バッファー濃縮物（バッファーＡ）を調製した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３．０Ｍの塩化ナトリウムを含有し、ｐＨ７．２のｐＤＮＡ溶出バッファー（バッファーＢ）を調製した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有し、ｐＨ７．２のＲＮＡ溶出バッファー（バッファーＣ）を調製した。１００μＬのブチルモノリスを、９０％のバッファーＡと１０％のバッファーＢの混合物を用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で平衡化した。約４．７ｋｂｐの精製されたＤＮＡプラスミドをカラムにロードし、次いで平衡化バッファーで１０分間洗浄した。次に、ｐＤＮＡを４分間のバッファーＢのリニアグラジエントで溶出させた。バッファーＢをもう４分間カラムに流した。バッファー組成物をバッファーＣに変更し、もう７分間継続した。結果を図３に示す。ｐＤＮＡは平衡化条件下でカラムに結合し、洗浄中も結合したままであった。ｐＤＮＡはバッファーＢのグラジエントで溶出した。細い実線はバッファーのベースラインを表す。

【0049】

実施例５
コスモトロピック塩の濃度を低下させ中性塩の濃度を一定に保持する間のＨＩＣカラムによるＲＮＡの保持と、後続の中性塩の濃度を低下させることによるＲＮＡの溶出。４４００ヌクレオチドの長さを有するｍＲＮＡからなるサンプルを用いたことを除いて実施例４の条件を再現した。結果を図４に示す。ｍＲＮＡは平衡化条件下でカラムに結合し、洗浄中も結合したままであった。ｍＲＮＡはバッファーＢのグラジエント及び後続のバッファーＢ中の洗浄において結合したままであった。ｍＲＮＡはバッファーＣの工程中に溶出した。細い実線はバッファーのベースラインを表す。

【0050】

実施例６
中性塩の濃度を一定に保持しつつコスモトロピック塩の濃度を低下させることによるＨＩＣカラムからのｐＤＮＡの溶出と、後続の中性塩の濃度を低下させることによるＲＮＡの溶出。４４００ヌクレオチドの長さを有するｍＲＮＡと混合した４．７ｋｂｐの長さを有するｐＤＮＡからなるサンプルを用いたことを除いて実施例３の条件を再現した。結果を図５に示す。実施例４と同様にｐＤＮＡを溶出した。実施例５と同様にｍＲＮＡを溶出した。細い実線はバッファーのベースラインを表す。

【0051】

本発明の方法の目的がより高度に精製されたｐＤＮＡ画分を形成することであることを踏まえると、中性塩濃度を低下させる第２の溶出工程が上記の実施例に含まれているのは、主に、異なるタイプの核酸及びその誘導体を制御するためにコスモトロピック塩及び中性塩の濃度を個別に操作できる点を説明するためであることが理解されよう。作製環境において、中性塩の濃度を下げることによって溶出させた不純物を得ることは殆ど若しくは全く意味がない。水酸化ナトリウムによる洗浄工程に直接進むことでプロセスを短縮及び簡素化する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】