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特表2023-546137多量の薬物／遺伝子装填用のポリマーコンジュゲートマイクロバブル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-01
(54)【発明の名称】多量の薬物／遺伝子装填用のポリマーコンジュゲートマイクロバブル
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20231025BHJP
A61K 9/00 20060101ALI20231025BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20231025BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20231025BHJP
A61K 47/06 20060101ALI20231025BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20231025BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20231025BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20231025BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231025BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231025BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231025BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231025BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231025BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61K9/00
A61K47/18
A61K47/36
A61K47/06
A61K47/24
A61K47/60
A61K38/02
A61K31/7088
A61K48/00
A61K47/68
A61K9/08
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523087
(86)(22)【出願日】2021-10-13
(85)【翻訳文提出日】2023-06-08
(86)【国際出願番号】 US2021054820
(87)【国際公開番号】W WO2022081738
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】63/091,204
(32)【優先日】2020-10-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522440647
【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ラックス，ジェイクス
(72)【発明者】
【氏名】コールサンディ，シーナ
(72)【発明者】
【氏名】デ グラシア ラックス，キャロライン
(72)【発明者】
【氏名】マットリー，ロバート，エフ．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA19
4C076AA95
4C076BB31
4C076CC26
4C076CC47
4C076DD35A
4C076DD49H
4C076DD63
4C076EE23
4C076EE30
4C076EE41
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA03
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA24
4C084MA63
4C084NA05
4C084NA11
4C084ZB21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA24
4C086MA63
4C086NA05
4C086NA11
4C086ZB21
(57)【要約】
スペルミン装飾されたマイクロバブル及びそれを生成する方法、並びに薬物送達のためにスペルミン装飾されたマイクロバブルを使用するための方法が、記載される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１以上の細胞にペイロードを送達するためのマイクロバブル組成物であって、複数のスペルミン装飾マイクロバブルを含み、界面活性剤シェルによりカプセル化されたガスのコアをそれぞれ含み、かつ複数のスペルミン分子が、各マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面と会合される、マイクロバブル組成物。
【請求項2】
前記複数のスペルミン分子が、各マイクロバブルの外面に非共有結合される、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項3】
前記複数のスペルミン分子が、各マイクロバブルの外面に共有結合される、請求項１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項4】
前記複数のスペルミン分子が、各マイクロバブルの外面に直接結合される、請求項３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項5】
前記複数のスペルミン分子が、連結ポリマーにより各マイクロバブルの外面に間接的に結合される、請求項３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項6】
前記連結ポリマーが、１以上のスペルミン分子により各マイクロバブルの外面に共有結合で架橋される、請求項５に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項7】
前記連結ポリマーが、足場ポリマーであり、前記複数のスペルミン分子の複数のスペルミン分子が各足場ポリマーに共有結合される、請求項５に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項8】
前記足場ポリマーが、線状である、請求項７に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項9】
前記足場ポリマーが、分岐状である、請求項７に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項10】
前記足場ポリマーが、デキストランである、請求項８又は９に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項11】
前記デキストランが、少なくとも５ｋＤａの平均分子量を含む、請求項１０に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項12】
前記デキストランが、少なくとも１０ｋＤａの平均分子量を含む、請求項１１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項13】
前記デキストランが、約２０ｋＤａ～５０ｋＤａの平均分子量を含む、請求項１２に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項14】
前記デキストランが、約３５ｋＤａ～４５ｋＤａの平均分子量を含み、任意に前記平均分子量が、約４０ｋＤａである、請求項１３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項15】
前記ガスのコアが、パーフルオロカーボンを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項16】
前記パーフルオロカーボンが、デカフルオロブタンである、請求項１５に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項17】
前記界面活性剤シェルが、脂質を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項18】
前記脂質が、リン脂質である、請求項１７に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項19】
前記リン脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂質の一方又は両方を含む、請求項１８に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項20】
前記界面活性剤シェルが、ペグ化された分子を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項21】
前記界面活性剤シェルが、前記界面活性剤シェルの外面に露出された複数の反応基を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項22】
前記反応基が、マレイミドである、請求項２１に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項23】
前記反応基が、ＰＥＧリンカーにより界面活性剤分子に連結される、請求項２１又は２２に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項24】
前記連結ポリマーが、生分解性リンカーを介して前記マイクロバブルに結合され、任意に前記生分解性リンカーが、リソソーム内のｐＨで切断可能である、請求項５～２３のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項25】
各マイクロバブル上の複数のスペルミン分子が、複数のペイロード分子と会合される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項26】
前記ペイロード分子が、タンパク質を含む、請求項２５に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項27】
前記ペイロード分子が、核酸を含む、請求項２５に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項28】
前記核酸が、ＤＮＡを含み、任意に前記ＤＮＡが、プラスミドである、請求項２７に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項29】
前記マイクロバブルが、マイクロバブル当たり少なくとも約３０,０００個の核酸又は少なくとも約０．０２５μｇ／μｍ２の核酸で装填される、請求項２７又は２８に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項30】
前記マイクロバブルが、前記界面活性剤シェルの外面上に標的化分子をさらに含み、前記標的化分子が１以上の細胞を結合するように構成される、請求項１～２９のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項31】
前記標的化分子が、抗体を含む、請求項３０に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項32】
前記マイクロバブル組成物の平均マイクロバブルサイズが、約１μｍ～１０μｍである、請求項１～３１のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項33】
前記平均マイクロバブルサイズが、約１μｍ～約５μｍである、請求項３２に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項34】
前記平均マイクロバブルサイズが、約３μｍである、請求項３３に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項35】
前記複数のスペルミン分子が、ポリスペルミンを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項36】
１以上のスペルミンが、生分解性リンカーにより別のスペルミンに又は連結ポリマーに連結され、任意に前記生分解性リンカーが、リソソーム内のｐＨで切断可能である、請求項１～３５のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項37】
前記生分解性リンカーが、シスタミンビスアクリルアミド又はビスアクリルアミドケタールを含む、請求項３６に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項38】
少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％の前記マイクロバブルが、スペルミンを介して別のマイクロバブルに架橋される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項39】
約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％以下の前記マイクロバブルが、スペルミンを介して別のマイクロバブルに架橋される、請求項１～３８のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物。
【請求項40】
１以上の細胞にペイロードを送達するためのマイクロバブル組成物を作製する方法であって、スペルミン分子を含む溶液をマイクロバブルの溶液と混合することを含み、前記マイクロバブルが、界面活性剤シェルによりカプセル化されたガスのコアを各々含む、方法。
【請求項41】
マイクロバブル組成物を作製する前記方法が、請求項１～３９の一項に記載のマイクロバブル組成物を作製するための方法である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
スペルミン分子を含む溶液が、ポリマーにコンジュゲートされたスペルミンを含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項43】
前記ポリマーが、足場ポリマーであり、複数のスペルミン分子が前記足場ポリマーに共有結合される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記足場ポリマーが、線状である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記足場ポリマーが、分岐状である、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
前記足場ポリマーが、デキストランである、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
スペルミン分子を含む前記溶液が、少なくとも５ｋＤａの平均分子量を有するデキストランを使用して作製される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記平均分子量が、少なくとも１０ｋＤａである、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記平均分子量が、約２０ｋＤａ～５０ｋＤａである、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記平均分子量が、約３５ｋＤａ～４５ｋＤａである、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
スペルミン分子を含む前記溶液が、ポリスペルミンを含み、任意にポリスペルミン内の複数のスペルミンが、生分解性リンカーにより連結される、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記マイクロバブル溶液が、スペルミン分子による前記マイクロバブルの飽和を可能にするためにスペルミン分子を含む溶液中に徐々に添加される、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記マイクロバブル溶液が、前記混合プロセスの間にスペルミン分子を含む溶液中に添加される、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
前記スペルミン分子を含む溶液が、前記スペルミン分子を介するマイクロバブルの架橋を促進するために前記マイクロバブル溶液中に徐々に添加される、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
スペルミン分子を含む前記溶液が、複数の第１の反応基を含みかつ前記マイクロバブル溶液が、前記マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面で露出される複数の第２の反応基を含み、前記第１及び第２の反応基が前記マイクロバブルに前記スペルミン分子を共有結合するように構成される、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記第１の反応基が、チオールでありかつ前記第２の反応基が、マレイミドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
スペルミン分子を含む前記溶液と前記マイクロバブル溶液の混合物が、少なくとも２：１の第１の反応基対第２の反応基のモル比を含む、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項59】
第１の反応基対第２の反応基の前記モル比が、少なくとも５：１である、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
第１の反応基対第２の反応基の前記モル比が、少なくとも１０：１である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
第１の反応基対第２の反応基の前記モル比が、少なくとも２０：１である、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記マイクロバブル溶液が、約１：２０の第２の反応基分子対界面活性剤分子のモル比を含む、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記マイクロバブル溶液が、１×１０８～１×１０１０個のマイクロバブル／ｍＬを含む、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記マイクロバブル溶液が、およそ１．１０×１０９個のマイクロバブル／ｍＬを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
ペイロード分子を含む溶液中で混合することをさらに含む、請求項４０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記ペイロード溶液が、前記マイクロバブル溶液と混合する前にスペルミン分子を含む前記溶液と混合される、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
スペルミン分子を含む前記溶液が、前記ペイロード溶液と混合する前に前記マイクロバブル溶液と混合される、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
マイクロバブルを含む前記溶液が、前記ペイロード分子による前記マイクロバブルの飽和を可能にするために前記ペイロード溶液中に徐々に添加される、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
マイクロバブルを含む前記溶液が、混合しながら前記ペイロード溶液中に添加される、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記ペイロード分子が、タンパク質を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記ペイロード分子が、核酸を含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記核酸が、ＤＮＡ含み、任意に前記ＤＮＡが、プラスミドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
マイクロバブルを含む前記溶液と前記ペイロード溶液の混合物が、少なくとも１×１０－８μｇ／マイクロバブル、任意に少なくとも２×１０－８μｇ／マイクロバブルのペイロード質量対マイクロバブル数の比を含み、かつ／又は前記混合物が、約１：１、１：２、１：５、又は１：１０のスペルミンアミン：ペイロードリン酸（Ｎ：Ｐ）の比を含む、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項74】
平均で少なくとも５,０００；少なくとも１０,０００；少なくとも２０,０００；又は少なくとも３０,０００個のペイロード分子／マイクロバブルを有するマイクロバブル組成物を生成する、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記マイクロバブル組成物が平均で、少なくとも３０,０００個のペイロード分子／マイクロバブルを有する、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
スペルミン－デキストラン装飾マイクロバブル組成物を生成し、かつ前記マイクロバブル組成物が平均で、マイクロバブル当たり少なくとも１．０×１０－１４ｇのスペルミン－デキストランを含む、請求項４０～７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
標的化分子を含む溶液と前記マイクロバブルを含む溶液を混合することをさらに含む、請求項４０～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
標的化分子を含む前記溶液が、スペルミン分子を含む溶液と同じ溶液である、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
標的化分子を含む前記溶液が、ペイロード溶液と同じ溶液である、請求項７７に記載の方法。
【請求項80】
標的化分子を含む前記溶液が、スペルミン分子を含む前記溶液の後に前記マイクロバブル溶液へ添加される、請求項７７に記載の方法。
【請求項81】
標的化分子を含む前記溶液が、スペルミン分子を含む前記溶液の前に前記マイクロバブル溶液へ添加される、請求項７７に記載の方法。
【請求項82】
前記標的化分子が、抗体である、請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
請求項４０～８２のいずれか一項により生成されるマイクロバブル組成物。
【請求項84】
ソノポレーションを使用して１以上の細胞にペイロードを送達する方法であって、複数のスペルミン装飾マイクロバブルに前記１以上の細胞を曝露することおよび次いで前記１以上の細胞をソノポレートするように構成された超音波刺激に前記１以上の細胞を曝露することを含む、方法。
【請求項85】
前記超音波が、約１～２Ｗ／ｃｍ２で、任意に５０％のデューティサイクルにより送達される、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記超音波が、約３０～６０秒間送達される、請求項８４又は８５に記載の方法。
【請求項87】
前記細胞が、超音波刺激を送達する前に少なくとも約１０分間前記マイクロバブルに曝露される、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記１以上の細胞をソノポレートするように構成された前記超音波刺激を送達する前に前記マイクロバブルを視覚化するために超音波を使用することをさらに含み、前記マイクロバブルを可視化するために使用される前記超音波の強度が、前記超音波刺激の強度よりも低い、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
インビボ法であり、前記複数のマイクロバブルに前記１以上の細胞を曝露することが対象に前記複数のマイクロバブルを含む組成物を投与することを含む、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
インビトロ法である、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記複数のマイクロバブルが、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、又は３０個のマイクロバブル／細胞の濃度で前記１以上の細胞とインキュベートされる、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記複数のマイクロバブルが、約１５～約２０個のマイクロバブル／細胞の濃度で前記１以上の細胞とインキュベートされる、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記複数のマイクロバブルが、前記１以上の細胞と混合される、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記複数のマイクロバブルが、請求項１～３９又は８３のいずれか一項に記載のマイクロバブル組成物により提供される、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
本明細書に開示される前記マイクロバブル組成物のいずれか、及び任意に前記マイクロバブル組成物と混合するためのペイロード分子の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年１０月１３日出願の米国仮出願第６３／０９１，２０４号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月１３日出願の米国仮出願第６３／０９１，２０４号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
開示の分野
本開示は、マイクロバブルを介して薬物送達を行うためのマイクロバブル組成物、並びに特にソノポレーションと組み合わせて、マイクロバブル組成物を作製する及び使用する方法に関する。
本開示は、マイクロバブルを介して薬物送達を行うためのマイクロバブル組成物、並びに特にソノポレーションと組み合わせて、マイクロバブル組成物を作製する及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
薬物送達はしばしば、薬物又は治療薬（例えば、遺伝子又は治療用タンパク質）を細胞に送達するための、および任意に細胞による治療薬の取り込み（例えば、細胞原形質膜を横切る移動）を誘導するための担体の使用を伴う。薬物送達担体はさらに、特定の細胞型を標的とするのに役立ち、かつインビボで全身送達される薬物について特定の組織に対する治療薬のバイオアベイラビリティを改善し得る。薬物送達は、高い薬物／担体装填効率、安定な装填、生分解からの治療薬の保護、特定の組織及び細胞型の標的化、並びに細胞による薬物の効率的取り込みの促進を達成する上で多くの課題に直面している。遺伝子治療は、特に、疾患に対する単一の治療治癒効果を提供する見込みがある。臨床遺伝子治療の大部分はウイルスベクターを利用し、これらは、潜在的な変異誘発、免疫原性、及び非特異的送達により制限される。マイクロバブルは、臨床的に使用される超音波造影剤であり、標的薬物送達のための有望なビヒクルと見なされてきた。しかし、カチオン性マイクロバブルを利用する薬物送達の報告は、ＤＮＡなどのペイロードへの非常に弱く不安定な結合しか示しておらず、かつ許容できない毒性の懸念も特定している。
薬物送達はしばしば、薬物又は治療薬（例えば、遺伝子又は治療用タンパク質）を細胞に送達するための、および任意に細胞による治療薬の取り込み（例えば、細胞原形質膜を横切る移動）を誘導するための担体の使用を伴う。薬物送達担体はさらに、特定の細胞型を標的とするのに役立ち、かつインビボで全身送達される薬物について特定の組織に対する治療薬のバイオアベイラビリティを改善し得る。薬物送達は、高い薬物／担体装填効率、安定な装填、生分解からの治療薬の保護、特定の組織及び細胞型の標的化、並びに細胞による薬物の効率的取り込みの促進を達成する上で多くの課題に直面している。遺伝子治療は、特に、疾患に対する単一の治療治癒効果を提供する見込みがある。臨床遺伝子治療の大部分はウイルスベクターを利用し、これらは、潜在的な変異誘発、免疫原性、及び非特異的送達により制限される。マイクロバブルは、臨床的に使用される超音波造影剤であり、標的薬物送達のための有望なビヒクルと見なされてきた。しかし、カチオン性マイクロバブルを利用する薬物送達の報告は、ＤＮＡなどのペイロードへの非常に弱く不安定な結合しか示しておらず、かつ許容できない毒性の懸念も特定している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
薬物送達（例えば、遺伝子治療用途）用のマイクロバブル上に、核酸又は他の医薬送達物などの、大量のペイロードを効果的に装填するためのマイクロバブル組成物が、本明細書に開示される。薬物送達のためのマイクロバブル組成物を含むキット、マイクロバブル組成物の製造方法、及びマイクロバブル組成物の使用方法も本明細書に開示される。マイクロバブル組成物の外面は、ペイロードに効果的に結合するためのスペルミン分子で装飾され得る。多量のスペルミン分子が、マイクロバブルに１以上のスペルミン分子を連結できる、デキストランなどの連結ポリマーを介してマイクロバブルと会合され得る。ペイロードは、ソノポレーション技術を使用して、空間的かつ時間的に標的化された様式で細胞膜を横切って効果的に送達され得る。
【発明の効果】
【0005】
本開示の一態様では、１以上の細胞にペイロードを送達するためのマイクロバブル組成物は、複数のスペルミン装飾マイクロバブルを含む。マイクロバブルは各々、界面活性剤シェルによってカプセル化されたガスのコアを含み、複数のスペルミン分子は、各マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面と会合される。
【0006】
複数のスペルミン分子は、各マイクロバブルの外面に非共有的に結合され得る。複数のスペルミン分子は、各マイクロバブルの外面に共有結合され得る。複数のスペルミン分子は、各マイクロバブルの外面に直接結合され得る。複数のスペルミン分子は、連結ポリマーによって各マイクロバブルの外面に間接的に結合され得る。連結ポリマーは、１以上のスペルミン分子によって各マイクロバブルの外面に共有結合的に架橋され得る。
【0007】
連結ポリマーは、各足場ポリマーに共有結合される多数のスペルミン分子の多重のスペルミン分子を有する足場ポリマーであり得る。足場ポリマーは、線状であり得る。足場ポリマーは、分岐状であり得る。足場ポリマーは、デキストランであり得る。デキストランは、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～５０ｋＤａ、又は約３５ｋＤａ～４５ｋＤａの平均分子量を有し得る。平均分子量は、約４０ｋＤａであり得る。
【0008】
ガスのコアは、パーフルオロカーボンを含み得る。パーフルオロカーボンは、デカフルオロブタンであり得る。界面活性剤シェルは、脂質を含み得る。脂質は、リン脂質であり得る。リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）脂質の一方又は両方を含み得る。界面活性剤シェルは、ペグ化された分子を含む。界面活性剤シェルは、界面活性剤シェルの外面で露出される複数の反応基を含み得る。反応基は、マレイミドであり得る。反応基は、ＰＥＧリンカーによって界面活性剤分子に連結され得る。連結ポリマーは、生分解性リンカーを介してマイクロバブルに結合され、生分解性リンカーは任意に、リソソーム内のｐＨで切断可能であり得る。
【0009】
各マイクロバブル上の複数のスペルミン分子は、複数のペイロード分子と会合され得る。ペイロード分子は、タンパク質を含み得る。ペイロード分子は、核酸を含み得る。核酸は、ＤＮＡを含み得、それは任意に、プラスミドであり得る。マイクロバブルは、マイクロバブル当たり少なくとも約３０,０００個の核酸、又は少なくとも約０．０２５μｇ／μｍ２の核酸で装填され得る。
【0010】
マイクロバブルは、１以上の細胞を結合するように構成された界面活性剤シェルの外面上に標的化分子をさらに含み得る。標的化分子は、抗体であり得る。
【0011】
マイクロバブル組成物の平均マイクロバブルサイズは、約１μｍ～１０μｍ、約１μｍ～約５μｍ、又は約３μｍである。
【0012】
複数のスペルミン分子は、ポリスペルミンを含み得る。
【0013】
スペルミンで装飾されたマイクロバブルの１以上のスペルミンは、生分解性リンカーによって別のスペルミン又は連結ポリマーに連結され得る。生分解性ポリマーは、リソソーム内のｐＨで切断可能であり得る。生分解性リンカーは、シスタミンビスアクリルアミド又はビスアクリルアミドケタールを含み得る。
【0014】
組成物中のマイクロバブルの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％は、スペルミンを介して別のマイクロバブルに架橋され得る。あるいは、組成物中のマイクロバブルの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％以下が、スペルミンを介して別のマイクロバブルに架橋され得る。
【0015】
本開示の別の態様では、１以上の細胞にペイロードを送達するためのマイクロバブル組成物を作製する方法は、スペルミン分子を含む溶液をマイクロバブルの溶液と混合することを含む。マイクロバブルは各々、界面活性剤シェルによってカプセル化されたガスのコアを含む。本方法は、上記のマイクロバブル組成物のいずれか１つを作製するための方法であり得る。
【0016】
スペルミン分子を含む溶液は、ポリマーにコンジュゲートされたスペルミンを含み得る。ポリマーは、足場ポリマーに共有結合される複数のスペルミン分子を有する足場ポリマーであり得る。足場ポリマーは、線状又は分岐状であり得る。足場ポリマーは、デキストランであり得る。スペルミン分子を含む溶液は、少なくとも５ｋＤａ、少なくとも１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～５０ｋＤａ、又は約３５ｋＤａ～４５ｋＤａの平均分子量を有するデキストランを用いて作製され得る。スペルミン分子を含む溶液は、ポリスペルミンを含み得る。ポリスペルミン内の複数のスペルミンは、生分解性リンカーによって連結され得る。
【0017】
マイクロバブル溶液は、任意に混合プロセス中に、スペルミン分子によるマイクロバブルの飽和を可能にするために、スペルミン分子を含む溶液に徐々に添加され得る。スペルミン分子を含む溶液は、スペルミン分子を介するマイクロバブルの架橋を促進するために、マイクロバブル溶液に徐々に添加され得る。
【0018】
スペルミン分子を含む溶液は、複数の第１の反応基を含み、マイクロバブル溶液は、マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面で露出される複数の第２の反応基を含み得る。第１及び第２の反応基は、マイクロバブルにスペルミン分子を共有結合するように構成され得る。第１の反応基は、チオールであり、第２の反応基は、マレイミドであり得る。スペルミン分子を含む溶液とマイクロバブル溶液の混合物は、少なくとも２：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、又は少なくとも２０：１の第１の反応基対第２の反応基のモル比を含み得る。マイクロバブル溶液は、約１：２０の第２の反応基分子対界面活性剤分子のモル比を含み得る。マイクロバブル溶液は、１×１０８～１×１０１０のマイクロバブル／ｍＬを含み得る。マイクロバブル溶液は、およそ１．１０×１０９マイクロバブル／ｍＬを含み得る。
【0019】
本方法は、ペイロード分子を含む溶液中での混合をさらに含み得る。ペイロード溶液は、マイクロバブル溶液と混合する前にスペルミン分子を含む溶液と混合され得る。スペルミン分子を含む溶液は、ペイロード溶液と混合する前にマイクロバブル溶液と混合され得る。マイクロバブルを含む溶液は、任意に混合しながら、ペイロード分子によるマイクロバブルの飽和を可能にするために、ペイロード溶液に徐々に添加され得る。ペイロード分子は、タンパク質を含み得る。ペイロード分子は、核酸を含む。核酸は、ＤＮＡを含み得、それは任意に、プラスミドであり得る。マイクロバブルを含む溶液とペイロード溶液の混合物は、少なくとも１×１０－８μｇ／マイクロバブル、任意に少なくとも２×１０－８μｇ／マイクロバブルのマイクロバブル数に対するペイロード質量の比を含み得、かつ／又は混合物は、約１：１、１：２、１：５、又は１：１０のスペルミンアミン：ペイロードリン酸（Ｎ：Ｐ）比を含む。マイクロバブルを作製する方法は、平均して少なくとも５,０００；少なくとも１０,０００；少なくとも２０,０００；又は少なくとも３０,０００ペイロード分子／マイクロバブルを有するマイクロバブル組成物を生成し得る。本方法は、マイクロバブル当たり少なくとも１．０×１０－１４ｇのスペルミン－デキストランを有するスペルミン－デキストラン装飾マイクロバブル組成物を生成し得る。
【0020】
本方法はさらに、標的化分子を含む溶液とマイクロバブルを含む溶液を混合することを含み得る。標的化分子を含む溶液は、スペルミン分子を含む溶液と同じ溶液であり得る。標的化分子を含む溶液は、ペイロード溶液と同じ溶液であり得る。標的化分子を含む溶液は、スペルミン分子を含む溶液の後で又はスペルミン分子を含む溶液の前にマイクロバブル溶液に添加され得る。標的化分子は、抗体であり得る。
【0021】
本開示の別の態様では、マイクロバブルを作製する前述の方法のいずれかによって生成されたマイクロバブル組成物が開示される。
【0022】
本開示の別の態様では、ソノポレーションを使用して１以上の細胞にペイロードを送達する方法は、複数のスペルミン装飾マイクロバブルに１以上の細胞を曝露すること、および次いで、１以上の細胞をソノポレートするように構成された超音波刺激に１以上の細胞を曝露することを含む。超音波は、約１～２Ｗ／ｃｍ２で、任意に５０％のデューティサイクルで送達され得る。超音波は、約３０～６０秒間送達され得る。細胞は、超音波刺激を送達する前に少なくとも約１０分間マイクロバブルに曝露され得る。本方法は、１以上の細胞をソノポレートするように構成された超音波刺激を送達する前にマイクロバブルを視覚化するために超音波を使用することをさらに含み得る。マイクロバブルを可視化するために使用される超音波の強度は、超音波刺激の強度よりも低くてよい。
【0023】
本方法は、複数のマイクロバブルに１以上の細胞を曝露することが、対象に複数のマイクロバブルを含む組成物を投与することを含む、インビボ法であり得る。
【0024】
本方法は、インビトロ法でもよい。複数のマイクロバブルは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、又は３０個のマイクロバブル／細胞の濃度で１以上の細胞とインキュベートされ得る。複数のマイクロバブルは、約１５～約２０個のマイクロバブル／細胞の濃度で１以上の細胞とインキュベートされ得る。複数のマイクロバブルは、１以上の細胞と共に混合され得る。複数のマイクロバブルは、上記のマイクロバブル組成物のいずれによって提供され得る。
【0025】
本開示の別の態様では、上記のマイクロバブル組成物のいずれか、及び任意にマイクロバブル組成物と混合するためのペイロード分子の組成物を含有するキットである。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図7】図７は、装填されないスペルミン－デキストラン及びｐＤＮＡ単独の対照に対する、１：１、１：２、１：５、及び１：１０のＮ：Ｐ比で装填されたスペルミン－デキストラン／ｐＤＮＡポリプレックスのアガロースゲル電気泳動実験を示す。
【図8】図８は、当技術分野で知られるＤＳＴＡＰマイクロバブルと比較した、本開示に従って調製されたスペルミン－デキストランマイクロバブルについてマイクロバブル当たりのＤＮＡ分子数に関して測定されたｐＤＮＡ装填能力を示す。
【図9】図９は、ｐＤＮＡを装填したスペルミン－デキストラン－ＲＯＲ１マイクロバブルとインキュベートされた対照ＪｅＫｏ細胞（上）及びソノポレートしたＪｅＫｏ細胞（下）についてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
マイクロバブル組成物
マイクロバブル
本明細書で使用される「マイクロバブル」は、ガスのコアを封入する界面活性剤シェルによって形成される気泡を指し得る。界面活性剤シェルは、ガスのコアと生理的環境などの外部水性環境の間の界面張力を低下させる１種類以上の分子を含み得る。シェルは、例えば、脂質（例えば、リン脂質）、タンパク質（例えば、アルブミン）、糖、及び／又はポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、気泡は、直径が約１０μｍ以下であり得る。特に明記しない限り、本明細書で使用されるマイクロバブルは、例えば、約１００ｎｍ～１μｍ、約２００ｎｍ～１μｍ、又は約３００ｎｍ～１μｍの気泡などの１μｍ未満の気泡（すなわち、ナノバブル）を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物内の平均マイクロバブルサイズは、少なくとも約１、２、３、４、又は５μｍである。いくつかの実施形態では、平均マイクロバブルサイズは、およそ１、２、３、４、又は５μｍである。いくつかの実施形態では、平均マイクロバブルサイズは、およそ１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、２～５、２～４、２～３、３～５、又は３～４μｍである。
マイクロバブル組成物
マイクロバブル
本明細書で使用される「マイクロバブル」は、ガスのコアを封入する界面活性剤シェルによって形成される気泡を指し得る。界面活性剤シェルは、ガスのコアと生理的環境などの外部水性環境の間の界面張力を低下させる１種類以上の分子を含み得る。シェルは、例えば、脂質（例えば、リン脂質）、タンパク質（例えば、アルブミン）、糖、及び／又はポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、気泡は、直径が約１０μｍ以下であり得る。特に明記しない限り、本明細書で使用されるマイクロバブルは、例えば、約１００ｎｍ～１μｍ、約２００ｎｍ～１μｍ、又は約３００ｎｍ～１μｍの気泡などの１μｍ未満の気泡（すなわち、ナノバブル）を含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物内の平均マイクロバブルサイズは、少なくとも約１、２、３、４、又は５μｍである。いくつかの実施形態では、平均マイクロバブルサイズは、およそ１、２、３、４、又は５μｍである。いくつかの実施形態では、平均マイクロバブルサイズは、およそ１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、２～５、２～４、２～３、３～５、又は３～４μｍである。
【0028】
ガスのコアは、１種以上のガスを含み得る。いくつかの実施形態では、ガスのコアは、１以上のパーフルオロカーボンを含む。１種以上のパーフルオロカーボンは、オクタフルオロプロパン（ＯＦＰ）／パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）、デカフルオロブタン（ＤＦＢ）／パーフルオロブタン（ＰＦＢ）、ドデカフルオロペンタン（ＤＤＦＰ）／パーフルオロペンタン／ペルフレナペント、テトラデカフルオロヘキサン／パーフルオロヘキサン、又はヘキサデカフルオロヘプタン／パーフルオロヘプタン、オクタデカフルオロデカリン／パーフルオロデカリン、又はパーフルオロ（２－メチル－３－ペンタノン）（ＰＦＭＰ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ガスのコアは、以下のフルオロカーボン：１，２－ビス（Ｆ－アルキル）エテン；１，２－ビス（Ｆ－ブチル）エテン、１－Ｆ－イソプロピル，２－Ｆ－ヘキシルエテン；１，２－ビス（Ｆ－ヘキシル）エテン；パーフルオロメチルデカリン；パーフルオロジメチルデカリン；パーフルオロメチルアダマンタン及びジメチルアダマンタン；パーフルオロメチル－、ジメチル－及びトリメチル－ビシクロ（３，３，１）ノナン及びそれらの同族体；パーフルオロパーヒドロフェナントレン；式：（ＣＦ３）２ＣＦＯ（ＣＦ２ＣＦ２）２ＯＣＦ（ＣＦ３）２、（ＣＦ３）２ＣＦＯ（ＣＦ２ＣＦ２）３ＯＣＦ（ＣＦ３）２、（ＣＦ３）２ＣＦＯ（ＣＦ２ＣＦ２）２Ｆ、（ＣＦ３）２ＣＦＯ（ＣＦ２ＣＦ２）３Ｆ、Ｆ［ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ］２ＣＨＦＣＦ３、ｕ＝１、３、又は５の［ＣＦ３ＣＦ２ＣＦ２（ＣＦ２）ｕ］２Ｏのエーテル並びにアミンＮ（Ｃ３Ｆ７）３、Ｎ（Ｃ４Ｆ９）３、及びＮ（Ｃ５Ｆ１１）３：パーフルオロ－Ｎ－メチルパーヒドロキノリン及びパーフルオロ－Ｎ－メチルパーヒドロイソキノリン；並びに、Ｃ６Ｆ１３Ｈ、Ｃ８Ｆ１７Ｈ、Ｃ８Ｆ１６Ｈ２などのパーフルオロアルキル水素化物、及びハロゲン化誘導体Ｃ６Ｆ１３Ｂｒ、（パーフルブロン）、Ｃ６Ｆ１３ＣＢｒ２ＣＨ２Ｂｒ、１－ブロモ４－パーフルオロイソプロピルシクロヘキサン、Ｃ８Ｆ１６Ｂｒ２、及びｕ＝２又は３のＣＦ３Ｏ（ＣＦ２ＣＦ２Ｏ）ｕＣＦ２ＣＨ２ＯＨの１以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ガスのコアは、空気を含む。いくつかの実施形態では、ガスのコアは、六フッ化硫黄を含む。いくつかの実施形態では、ガスのコアは、窒素を含む。高分子量ガスは一般的に、低分子量ガスよりも安定なマイクロバブルを形成し得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、界面活性剤シェルは、親水性の外面と親油性又は疎水性の内面を形成するために、特定の条件下で自己整列するリン脂質などの脂質を含み得る。リン脂質は、マイクロバブル、ナノ液滴、ミセル、リポソームなどを形成するために当技術分野で使用される任意の標準的なリン脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、及びホスホイノシチド（例えば、ポスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）及びホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）などのジアシルグリセリド構造を含み得る。いくつかの実施形態では、リン脂質は、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、及びセラミドホスホリル脂質などのホスホスフィンゴ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤分子は、ポリ（エチレングリコール）などのポリマー鎖に結合され得る（すなわち、界面活性剤シェル／マイクロバブルは、ＰＥＧ化され得る）。例えば、界面活性剤分子は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）を含み得る。マイクロバブルのＰＥＧ化は、マイクロバブルの抗凝集／コロイド安定性、抗免疫原性、親水性、生体適合性、及び／又は生体内循環時間／バイオアベイラビリティを改善し得る。マイクロバブルの外面のＰＥＧ化は、マイクロバブル表面を官能化するコンジュゲーションを行うための好ましい状態（例えば、立体的な）を提供し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤シェルは、２種類の界面活性剤分子を含み得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤シェルは、３種類の界面活性剤分子を含み得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤シェルは、４種類以上の界面活性剤分子を含み得る。いくつかの実施形態では、およそ０～２５％、０～２０％、０～１５％、０～１０％、０～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、０～１０％、１０～２０％、０～１５％、又は１５～２５％の界面活性剤分子が、ＰＥＧ化される。例えば、界面活性剤分子のおよそ１０％が、ＰＥＧ化され得る。いくつかの実施形態では、およそ０～２５％、０～２０％、０～１５％、０～１０％、０～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、０～１０％、１０～２０％、０～１５％、又は１５～２５％の界面活性剤分子が、界面活性剤シェルの外面で露出されるように構成された（例えば、スペルミン分子又は標的化分子に連結するための）官能基を含む。例えば、いくつかの実施形態では、界面活性剤分子のおよそ５％が、官能化される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化界面活性剤分子のおよそ半分が、官能基を含み得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、界面活性剤分子は、マイクロバブルシェルに追加の分子を共有結合するように構成された、コンジュゲーション反応において反応性である官能基を含有し得る。官能基は、バイオコンジュゲーションを行うために当技術分野で一般的に使用される任意の標準的な反応基から選択され得る。例えば、官能基は、アミン、イソチオシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、グアナジノ（ｇｕａｎａｄｉｎｏ）基、チオール、ハロアセチル又はハロゲン化アルキル誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢチオール、ジスルフィド還元剤、ビニルスルホン誘導体、ジアゾアルカン又はジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール、ヒドロキシル、イソシアネート、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン誘導体、シッフ塩基、ジアゾニウム誘導体、ベンゾフェノン、アントラキノン、ジアジリン誘導体、ソラレン化合物、ボロン酸誘導体、又は上記のいずれかと反応する官能基を含み得る。いくつかの実施形態では、官能基は、銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、ひずみ促進アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、ひずみ促進アルキン－ニトロン環化付加（ＳＰＡＮＣ）、ひずみアルケンとアジド[３＋２]環化付加、ひずみアルケンとテトラジンの逆要請型（ｉｎｖｅｒｓｅ－ｄｅｍａｎｄ）ディールス－アルダー反応、ひずみアルケンとテトラゾールのフォトクリック反応などの、クリック反応に関与するものであり得る。いくつかの実施形態では、官能基は、非共有結合反応に関わるように構成され得る。例えば、官能基は、ストレプトアビジン又はビオチン、抗体若しくは抗原、又は受容体若しくはリガンドを含み得る。官能基は、界面活性剤シェルの外面に存在し得る。官能基は、界面活性剤分子に直接コンジュゲートされ得るか、又はＰＥＧリンカーなどのリンカーによって分離され得る。例えば、界面活性剤シェルは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００）を含み得る。
【0031】
本明細書に記載のマイクロバブル組成物のマイクロバブルは一般的に、当技術分野で公知の任意のプロセスに従って形成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、超音波処理によって生成される。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、振盪によって生成される。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、高圧乳化から生成される。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、液体のコアのナノ液滴の相転移を活性化することによって生成される。マイクロバブルは、例えば、Ｒｅｉｓｓらの米国特許第６，１１３，９１９号（２００ 年９月５日発行）又はＵｎｇｅｒの米国特許出願公開第２００２／０１５０５３９号（２００２年１０月１７日）；Ｄａｙｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１３／０３３６８９１号（２０１３年１２月１９日公開）；ｄｅ Ｇｒａｃｉａ Ｌｕｘらの米国特許出願公開第２０１８／０２７２０１２号（２０１８年９月２７日公開）に開示された方法のいずれかによって生成されてよく、これらの特許の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
スペルミン装飾
スペルミン（１，１２－ジアミノ－４，９－ジアザドデカン、Ｎ，Ｎ’－ビス（３－アミノプロピル）ブタン－１，４－ジアミンとしても知られる）は、全ての真核細胞に見られる細胞代謝に関与するポリアミン、特に有機ジアルキルアミンである。スペルミン合成の前駆体は、アミノ酸のオルニチンである。それは、いくつかの細菌における必須成長因子である。それは、生理的ｐＨでポリカチオンとして見出される。スペルミンは、核酸と会合しており、特にウイルスにおいて、らせん構造を安定化させると考えられる。スペルミン分子のアミノ基は、図１に示すように、およそ１０．９、８．４、７．９、及び１０．１のｐＫａを有する。スペルミンは一般的に、生理的ｐＨ（すなわちｐＨ７．４）の水性環境で完全にプロトン化される。比較として、図２に描かれる分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、７．９～９．６のｐＫａ値を有すると報告されており、アミン基の少なくとも５０％は一般的に、生理的ｐＨでプロトン化されると予想される。
スペルミン（１，１２－ジアミノ－４，９－ジアザドデカン、Ｎ，Ｎ’－ビス（３－アミノプロピル）ブタン－１，４－ジアミンとしても知られる）は、全ての真核細胞に見られる細胞代謝に関与するポリアミン、特に有機ジアルキルアミンである。スペルミン合成の前駆体は、アミノ酸のオルニチンである。それは、いくつかの細菌における必須成長因子である。それは、生理的ｐＨでポリカチオンとして見出される。スペルミンは、核酸と会合しており、特にウイルスにおいて、らせん構造を安定化させると考えられる。スペルミン分子のアミノ基は、図１に示すように、およそ１０．９、８．４、７．９、及び１０．１のｐＫａを有する。スペルミンは一般的に、生理的ｐＨ（すなわちｐＨ７．４）の水性環境で完全にプロトン化される。比較として、図２に描かれる分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、７．９～９．６のｐＫａ値を有すると報告されており、アミン基の少なくとも５０％は一般的に、生理的ｐＨでプロトン化されると予想される。
【0033】
本明細書で使用されるスペルミンは、図１に描かれるようなスペルミン分子、又はその誘導体若しくは類似体（例えば、サーモスペルミン）を指し、スペルミン及びスペルミジン（スペルミン合成の前駆体）から合成される分子を含み、全ては用語「スペルミン分子」に包含され得る。スペルミンから合成される分子は、ポリスペルミンを含んでよく、それらは、場合により中間架橋剤により、共に共有結合で連結される２以上のスペルミンを含み得る。本開示の実施形態では、スペルミンに実質的に類似しているか又はスペルミンから設計されたスペルミン様分子（例えば、ポリＤＡＥ）は、それが本明細書の他の箇所に記載されるのと実質的に同じ効果を達成するならば、スペルミン分子と置換されてよい。
【0034】
いくつかの実施形態では、ポリスペルミンは、場合により中間架橋剤を使用して、スペルミンを一緒に重合することによって生成され得る。いくつかの実施形態では、複数のスペルミンは、図１に描かれた第一級アミンの一方又は両方が反応後に遊離のまま残されるように、図１に描かれた第二級アミンを介して共に連結されてよい。いくつかの実施形態では、これらの第一級アミンの１以上はその後、本明細書の他の箇所に記載されるように、スペルミン分子をマイクロバブルに又は連結ポリマーに連結するために使用され得る。いくつかの実施形態では、スペルミン分子の第一級アミンは、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、エチルトリフルオロアセテート、又はフタルイミドなどの保護基と反応され得る。保護基は、ポリスペルミン又はスペルミンを含むポリマーなどのより大きな分子を合成するときに、スペルミン分子の第一級アミンを保護するために使用され得る。保護基は、本明細書の他の箇所に記載されるように、第一級アミノ基がさらなる反応（例えば、連結ポリマー及び／又はマイクロバブルへのコンジュゲーション）に関わること又はペイロード分子に静電的に結合することを可能にするために、当技術分野で公知の標準剤を使用して除去され得る。
【0035】
いくつかの実施形態では、ポリスペルミンは、２以上のスペルミン基の間で生分解性／切断性リンカーを使用して形成（例えば、重合）され得る。生分解性リンカーは、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｌｆｅｒｉｅｖらの米国特許第８，５８０，５４５号（２０１３年１１月１２日発行）に記載のリンカーを含む。生分解性リンカーは、特定の生理的環境（例えば、低ｐＨ）において、及び／又は生理的環境内で予測可能な時間後に切断される（例えば、加水分解される）ように構成され得る。例えば、スペルミン分子は、分解性シスタミンビスアクリルアミドによって連結されたスペルミンを含む、ポリスペルミンＣＢＡ（例えば、実施例２３参照）を含み得、これは、７．４の生理的ｐＨ未満のｐＨで還元／切断される傾向がある。別の例として、スペルミン分子は、生分解性ビスアクリルアミドケタールによって連結されたスペルミンを含み得る（例えば、実施例２１参照）。
【0036】
本明細書に記載のマイクロバブルは、スペルミン分子で装飾され得る。スペルミン装飾マイクロバブルの組成物は一般的に、複数のスペルミン分子が組成物内の各々又は実質的に各々のマイクロバブルの界面活性剤シェルの外面と会合されるマイクロバブルを含む。いくつかの実施形態では、各マイクロバブルは、およそ１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、又は１０，０００，０００のスペルミン分子で装飾され得る。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、マイクロバブル表面と非共有結合的に会合し得る。例えば、スペルミン分子は、スペルミン上の１以上のアミノ基の正電荷とマイクロバブル表面上の負電荷（例えば、リン脂質の頭部上の負に帯電したリン酸基）の間の静電相互作用などの、静電相互作用を介してマイクロバブル表面と会合し得る。いくつかの実施形態では、官能化されたスペルミン分子は、受容体－リガンド結合、抗体－抗原結合、ストレプトアビジン－ビオチン結合などの、非共有結合相互作用を介して、マイクロバブル表面上の官能基と非共有結合的に会合し得る。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、本明細書の他の箇所に記載されるものを含む、当技術分野で公知のコンジュゲーション化学を介してマイクロバブル表面に共有結合し得る。
【0037】
いくつかの実施形態では、スペルミン分子中の１以上の第一級アミンを使用して、マイクロバブルの界面活性剤シェル中の界面活性剤分子に（反応性官能基を介して）、又はマイクロバブルにスペルミン分子を連結するように構成された連結ポリマーにスペルミン分子を共有結合させてよい。いくつかの実施形態では、第一級アミンを、マイクロバブル表面上に若しくは連結ポリマー上に提示されるイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン誘導体、又はグアニジノ基と共有結合させてよい。例えば、いくつかの実施形態では、第一級アミンを、ケトン、アルデヒド、又はグリオキサールとコンジュゲートさせてシッフ塩基を形成してよく、これは還元により（例えば、水素化ホウ素又は水素化シアノホウ素による）化学的に安定化され得る。例えば、スペルミン分子の１以上の第一級アミンを、本明細書の他の箇所に記載されるように、酸化デキストラン中のアルデヒド、又は他の酸化多糖類と反応させてよい。
【0038】
連結ポリマー
いくつかの実施形態では、スペルミン分子の少なくともいくつか又は全部は、連結ポリマーを介してマイクロバブルと会合される。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、連結ポリマーにコンジュゲートされ、次いで連結ポリマーは、マイクロバブルに連結され得る（例えば、共有結合され得る）。いくつかの実施形態では、マイクロバブルが、最初に連結ポリマーで装飾され（例えば、共有結合され）、次にスペルミン分子が、連結ポリマーにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、スペルミン分子、マイクロバブル組成物、及び連結ポリマーを含む溶液を一度に一緒に混合することなどにより、実質的に同時にスペルミン分子及びマイクロバブルに接合され得る。
いくつかの実施形態では、スペルミン分子の少なくともいくつか又は全部は、連結ポリマーを介してマイクロバブルと会合される。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、連結ポリマーにコンジュゲートされ、次いで連結ポリマーは、マイクロバブルに連結され得る（例えば、共有結合され得る）。いくつかの実施形態では、マイクロバブルが、最初に連結ポリマーで装飾され（例えば、共有結合され）、次にスペルミン分子が、連結ポリマーにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、スペルミン分子、マイクロバブル組成物、及び連結ポリマーを含む溶液を一度に一緒に混合することなどにより、実質的に同時にスペルミン分子及びマイクロバブルに接合され得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、少なくとも２つのスペルミン分子とコンジュゲートされてよく、スペルミン分子の少なくとも１つを使用して、マイクロバブルに連結ポリマーを連結してよい。例えば、スペルミン上の第一級アミンの一方は、連結ポリマーに共有結合で連結され、他方の第一級アミンは、マイクロバブルに連結され得る。２つの連結する第一級アミンは、同じ種類のコンジュゲーションを介して、又は異なる（例えば、双直交の）コンジュゲーションを介して、連結ポリマー及びマイクロバブルに結合され得る。スペルミン分子は、本明細書の他の箇所に記載のコンジュゲーション化学又は非共有結合相互作用のいずれかによってマイクロバブルの連結ポリマーのいずれかにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、スペルミン分子上の遊離第一級アミンの一部は、マイクロバブル表面へのコンジュゲーションのためにチオール化され得る（例えば、２－イミノチオランを介して）。スペルミン分子上のチオールは、マイクロバブル表面で露出されるマレイミドなどのチオール反応基にコンジュゲートされてよい。いくつかの実施形態では、スペルミン分子内の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個、若しくは５０個ごとの遊離第一級アミノ基のうちおよそ１個、及び／又はおよそ５％、１０％、１５％、２０％、若しくは２５％の遊離第一級アミノ基が、マイクロバブルへの結合のために官能化され得る。
【0040】
スペルミン分子を使用してマイクロバブルに連結ポリマーを連結する場合、それは、連結ポリマーにも連結される１以上の追加のスペルミンをマイクロバブルに間接的に連結するように設計される。いくつかの実施形態では、複数のスペルミン分子は、連結ポリマーを介してマイクロバブルに間接的に連結される。マイクロバブルに間接的に連結される複数のスペルミン分子への言及は、スペルミン分子のいくつかがマイクロバブルに直接結合される実施形態、例えば、１以上のスペルミン分子が、マイクロバブルに連結ポリマーを接合するための架橋剤として使用される実施形態を含むことを理解されたい。いくつかの実施形態では、デキストラン（例えば、４０ｋＤａデキストラン）などの各連結ポリマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のスペルミンに連結される。いくつかの実施形態では、デキストラン（例えば、４０ｋＤａデキストラン）などの各連結ポリマーは、１～１０、１０～５０、５０～１００、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、又は９０～１００個のスペルミンに連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００個の連結されたスペルミン分子及び／又は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の連結されたスペルミン分子は、「遊離の」スペルミンである。本明細書で使用される場合、遊離スペルミンは、本明細書の他の箇所に記載されるように、その第一級アミンの少なくとも１つが、任意の他の部分に共有結合的に反応せず、かつ負に帯電したペイロードと相互作用するために「遊離の」状態にあるスペルミンである。遊離スペルミンは、その他の第一級アミノ基により、又は例えば第二級アミンにより、マイクロバブルの連結ポリマーにコンジュゲートされ得る。各スペルミン上に少なくとも１つの遊離第一級アミノ基を含むポリスペルミンは、遊離スペルミンを含むと考えられる。マイクロバブルに連結ポリマーを架橋するスペルミン分子、又は２つの連結ポリマーを一緒に架橋するスペルミン分子は、遊離ではない。
【0041】
いくつかの実施形態では、１以上のスペルミンは、本明細書の他の箇所に記載のものなどの、生分解性リンカーを介して連結ポリマーに連結され得る。いくつかの実施形態では、１以上の連結ポリマーは、本明細書の他の箇所に記載のものなどの、生分解性リンカーを介してマイクロバブルに連結され得る。
【0042】
連結ポリマーは、複数の遊離スペルミン分子が各連結ポリマーと会合される足場ポリマーであり得る。足場ポリマーは、各マイクロバブルと会合される遊離スペルミンの数をマイクロバブルと連結ポリマーの間の連結（例えば、共有結合）の数よりも大きくさせることによりスペルミン装飾マイクロバブル組成物中のスペルミンの装填容量を増加させるために使用されてよい。いくつかの実施形態では、マイクロバブルへの共有結合ごとに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個の遊離スペルミン分子が存在する。
【0043】
いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、線状（非分岐状）ポリマーを含む。１以上のスペルミンが、各連結ポリマーにコンジュゲートされ得る。使用される連結ポリマー及びコンジュゲーション化学に応じて、スペルミン分子は、ポリマー鎖の末端に及び／又は鎖骨格内の反応基にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、１以上の分岐鎖が線状ポリマー鎖の骨格から延びる分岐ポリマーを含む。分岐は、線形であっても、又はそれ自体が分岐状であってもよい。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、線状ポリマー鎖骨格と会合される。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、１以上のポリマー分岐と会合される。いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、分岐状の連結ポリマーの複数の分岐と会合される。本明細書に記載の方法のいくつかの実施において、分岐状の足場ポリマーの使用は、類似の分子量のスペルミン装飾線状ポリマーよりも小さい流体力学的半径を有するスペルミン装飾ポリマー分子をもたらし得る。分岐ポリマーは、類似の分子量の線状ポリマーに対してマイクロバブルのスペルミン運搬能力を増加させ得る。本明細書に記載の方法のいくつかの実施において、分岐状の足場ポリマーの使用は、類似の流体力学的半径のスペルミン装飾線状ポリマーよりも高いスペルミン／ペイロード密度を有するスペルミン装飾ポリマー分子をもたらし得る。スペルミンで装飾されたポリマーの流体力学的半径を減少させること、かつ／又は所与の半径のスペルミン装飾ポリマーのスペルミン／ペイロード密度を増加させることは、確立される一過性の細孔が限られた寸法を有するソノポレート細胞において、ペイロードの細胞取り込みを増加させ得る。
【0044】
連結ポリマーは、薬物送達ビヒクル（例えば、ポリプレックス又はナノ粒子）を形成するために当技術分野で使用される任意のポリマーであり得る。連結ポリマーは、多糖類（例えば、グルカン）などの生体ポリマー又は細胞外マトリックスポリマー若しくはその成分（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸などのプロテオグリカン）であり得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、デキストランを含み得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、直鎖ＰＥＧを含み得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、分岐ＰＥＧ（例えば、４アーム又は８アームの星型ＰＥＧ）を含み得る。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、ポリ（オルトエステル）、ポリホスファゼン又はそれらの共重合体の１以上を含み得る。連結ポリマーは、そのスペルミン装填能力について選択され得る。連結ポリマーは、その生体適合性（例えば、低毒性）について選択され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、複数種類の連結ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、連結ポリマーは、線状ポリマーと分岐状ポリマーの両方を含む。
【0045】
連結ポリマーは、デキストランであり得る。本明細書で使用されるデキストランは、かなりの数の（１→６）－結合－α－Ｄ－グルコピラノシル残基を含むＤ－グルカンを指す。デキストランの大部分は、基質としてスクロース上で増殖する細菌によって生成される。天然に存在するデキストランは、グルコースの縮合からの複雑な分岐グルカンである。デキストラン鎖は、様々な長さ（３～２０００ｋＤａ）のものである。ポリマー主鎖は、図３に示すように、α－１，３結合からの分岐を有する、グルコースモノマー間のα－１，６グリコシド結合からなる。分岐は、わずか２若しくは３個のグルコース単位～５０個超のグルコース単位の長さを有してよく、低分子量デキストランは、高分子量デキストランよりも少ない分岐および狭い分子量分布を示す。１０，０００グルコース単位より大きい分子量を有するデキストランは、それらが非常に分岐しているように振る舞う。天然デキストランは、９００万～５億グルコース単位の範囲の分子量（ＭＷ）を有することが見出されている。分子量が増加するにつれて、デキストラン分子は、より大きな対称性を得る。２,０００～１０,０００グルコース単位の分子量を有するデキストランは、拡張可能なコイルの特性を示す傾向がある。２，０００未満のグルコース単位の分子量では、デキストランは、より棒状になる傾向がある。デキストランの線状形態（分岐を欠く）は、化学的に合成できる。マイクロバブルをデキストランで装飾することは、マイクロバブルの抗凝結／コロイド安定性、抗免疫原性、親水性、生体適合性、及び／又はインビボ循環時間／バイオアベイラビリティを改善し得る。デキストランは、特にＰＥＩと比較して、インビボ用途に適する比較的無毒のポリマーである。
【0046】
いくつかの実施形態では、デキストランは、およそ５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１ＭＤａ、１．５ＭＤａ、又は２ＭＤａの平均分子量（マイクロバブル組成物全体で）を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランは、少なくともおよそ５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１ＭＤａの平均分子量を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランは、およそ５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１ＭＤａ、１．５ＭＤａ、又は２ＭＤａ以下の平均分子量を含み得る。いくつかの実施形態では、デキストランは、およそ５～１００ｋＤａ、１０～８０ｋＤａ、１５～７０ｋＤａ、２０～６５ｋＤａ、２５～６０ｋＤａ、３０～５５ｋＤａ、３５～５０ｋＤａ、４０～４５ｋＤａ、又は３５～４５ｋＤａ、３５～４０ｋＤａ、又は２０～５０ｋＤａの平均分子量を含み得る。様々な実施形態では、連結ポリマーは、組成物から低分子量種を除去するために、１以上の分子量カットオフで透析され得る。ポリマーは、スペルミン分子への結合前、スペルミン分子への結合後、又はその両方の時点で透析され得る。
【0047】
スペルミンによるデキストランの装飾は、ポリマーの有効分子量をおよそ１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、１０～５０％、又はそれを超えて増加させ得る。いくつかの実施形態では、デキストラン分子中およそ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、１０～２５、２５～５０、又は１０～５０個ごとに１個のグルコースモノマーが、スペルミンで装飾される。しかし、スペルミンコンジュゲーションから生じるアミノ分解は、ポリマーの分子量を１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、１０～５０％、５０～７５％、５０～６０％、７０％～８０％、５０～７５％、又はそれを超えて低下させ得る。例えば、いくつかの実施形態では、４０ｋＤａのデキストランが、スペルミンとのコンジュゲーション後におよそ１０ｋＤａに低下され得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物中の各マイクロバブルは最終的に、マイクロバブル当たり、約１×１０－１５～１×１０－１３、１×１０－１５～１×１０－１４、又は１×１０－１４～１×１０－１３ｇのスペルミン装飾デキストランなどの連結ポリマーで装飾される。例えば、いくつかの実施形態では、各マイクロバブルは、少なくとも約１．０×１０－１４、１．１×１０－１４、１．２×１０－１４、１．３×１０－１４、１．４×１０－１４、１．５×１０－１４、１．６×１０－１４、１．７×１０－１４、１．８×１０－１４、１．９×１０－１４、２．０×１０－１４、３．０×１０－１４、４．０×１０－１４、５．０×１０－１４、６．０×１０－１４、７．０×１０－１４、８．０×１０－１４、又は９．０×１０－１４ｇ／マイクロバブルで装飾される。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物中の各マイクロバブルは最終的に、少なくとも約２５,０００、５０,０００、７５,０００、１００,０００、１５０,０００、２００,０００、３００,０００、４００,０００、５００,０００、６００,０００、７００,０００、８００,０００、９００,０００、又は１,０００,０００個のスペルミン装飾デキストランスなどの連結ポリマーで装飾される。
【0049】
マイクロバブル標的化
マイクロバブルはさらに、特定の細胞型又は他の生物学的構造に結合する標的化分子で装飾され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、タンパク質又は他の生体分子（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）であり得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、細胞外マトリックスポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸などのプロテオグリカン）などの、生体ポリマー又はその成分であり得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、抗原結合特性を有する抗体に由来する／モデル化された抗体断片若しくはペプチドを含む、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。例えば、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、組換えＩｇＧ、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド、又は当技術分野で周知の抗原結合特性を有する任意の他の抗体断片若しくは生体分子であり得る。抗体は、標的細胞型の細胞表面上で発現される抗原（例えば、細胞表面受容体）に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、癌性細胞／腫瘍細胞を標的とするように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞など）を標的とするように構成され得る。標的化分子は、マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面に共有結合され得る。
マイクロバブルはさらに、特定の細胞型又は他の生物学的構造に結合する標的化分子で装飾され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、タンパク質又は他の生体分子（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）であり得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、細胞外マトリックスポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸などのプロテオグリカン）などの、生体ポリマー又はその成分であり得る。いくつかの実施形態では、標的化分子は、抗原結合特性を有する抗体に由来する／モデル化された抗体断片若しくはペプチドを含む、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。例えば、抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、組換えＩｇＧ、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド、又は当技術分野で周知の抗原結合特性を有する任意の他の抗体断片若しくは生体分子であり得る。抗体は、標的細胞型の細胞表面上で発現される抗原（例えば、細胞表面受容体）に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、癌性細胞／腫瘍細胞を標的とするように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞など）を標的とするように構成され得る。標的化分子は、マイクロバブルの界面活性剤シェルの外面に共有結合され得る。
【0050】
標的化分子は、スペルミン分子と同じ様式でマイクロバブルの外面と会合され得る。例えば、標的化分子は、スペルミン分子と同じ様式で界面活性剤シェルの外面上の官能基に共有結合で連結され得る（例えば、マイクロバブルは、標的化分子に又は連結ポリマーに連結され得る）。標的化分子は、マイクロバブル上の、スペルミン分子と同じ官能基に（例えば、同じ反応基の対若しくは官能化されたスペルミン分子が行うように同じ反応基と反応する第３の反応基を使用して）連結され得るか、又は異なる官能基に連結され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子及びスペルミン分子は、双直交反応を使用してマイクロバブルに連結されてよく、そこでは標的化分子とスペルミン分子の間、スペルミン分子と結合するように構成されたマイクロバブル表面上の官能基と標的化分子の間、又は標的化分子を結合するように構成されたマイクロバブル表面上の官能基とスペルミン分子の間に交差反応性はない。標的化分子は、標的化分子をマイクロバブル組成物とインキュベートする（例えば、標的化分子を含む溶液とマイクロバブル組成物を含む溶液を混合する）ことによって、マイクロバブルに結合され得る。標的化分子は、マイクロバブルにスペルミン分子を結合させる前、それと同時に、又はその後にマイクロバブルに結合され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子及びスペルミン分子は、連結ポリマーがスペルミン分子及び標的化分子の両方をマイクロバブルに連結するように、同じ連結ポリマーに結合され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物中の各マイクロバブルは、少なくとも約５，０００、１０，０００、１５,０００、２０,０００、２５,０００、５０,０００、７５,０００、１００,０００、２００,０００、３００,０００、４００,０００、５００,０００、６００,０００、７００,０００、８００,０００、９００,０００、又は１,０００,０００個の標的化分子で装飾される。
【0051】
マイクロバブルペイロード
本明細書に記載のマイクロバブルは、本明細書の他の箇所に記載のソノポレーションを介するなどの、薬物送達用のペイロードを結合するために使用され得る。様々な実施形態では、スペルミンで装飾されたマイクロバブルのスペルミン分子は、ペイロードに結合することによりペイロード用の薬物送達ビヒクル（例えば、トランスフェクション剤）として機能する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質治療薬などの、タンパク質を含む。タンパク質治療薬は、例えば、抗体ベースの薬物、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質足場、酵素、Ｆｃ融合タンパク質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤などを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、核酸を含む。核酸は、例えば、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、又はダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、遺伝子治療の一部として送達され得る、ＤＮＡであり得る。遺伝子治療は、体細胞又は生殖細胞のいずれかを標的としてよく、免疫不全症、血友病、サラセミア、及び嚢胞性線維症などの状態を治療するために使用できる。遺伝子治療は、エキソビボで、いくつかの用途では、造血幹細胞に対して実施され得る。送達され得る遺伝子の例としては、第ＩＸ因子、ヒト線維芽細胞増殖因子－４、ＮＤ４タンパク質、ＩＮＦアルファ－２ｂ、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＢＣＤ１遺伝子）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、コネキシン４３、ＲＥＰ１、アリールスルファターゼＡ、５Ｔ４腫瘍胎児抗原、チミジンキナーゼ、ＡＣ６、シトシンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、肝細胞増殖因子（例えば、ＨＧＦ７２８、ＨＧＦ７２３）、ＳＭＮタンパク質、β－グロビンなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり得る。様々な実施形態では、核酸は、修飾され得る。例えば、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの両方を含む分子を含む、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。
本明細書に記載のマイクロバブルは、本明細書の他の箇所に記載のソノポレーションを介するなどの、薬物送達用のペイロードを結合するために使用され得る。様々な実施形態では、スペルミンで装飾されたマイクロバブルのスペルミン分子は、ペイロードに結合することによりペイロード用の薬物送達ビヒクル（例えば、トランスフェクション剤）として機能する。いくつかの実施形態では、ペイロードは、タンパク質治療薬などの、タンパク質を含む。タンパク質治療薬は、例えば、抗体ベースの薬物、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質足場、酵素、Ｆｃ融合タンパク質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血栓溶解剤などを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、核酸を含む。核酸は、例えば、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、又はダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、遺伝子治療の一部として送達され得る、ＤＮＡであり得る。遺伝子治療は、体細胞又は生殖細胞のいずれかを標的としてよく、免疫不全症、血友病、サラセミア、及び嚢胞性線維症などの状態を治療するために使用できる。遺伝子治療は、エキソビボで、いくつかの用途では、造血幹細胞に対して実施され得る。送達され得る遺伝子の例としては、第ＩＸ因子、ヒト線維芽細胞増殖因子－４、ＮＤ４タンパク質、ＩＮＦアルファ－２ｂ、副腎白質ジストロフィータンパク質（ＡＢＣＤ１遺伝子）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）、コネキシン４３、ＲＥＰ１、アリールスルファターゼＡ、５Ｔ４腫瘍胎児抗原、チミジンキナーゼ、ＡＣ６、シトシンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、肝細胞増殖因子（例えば、ＨＧＦ７２８、ＨＧＦ７２３）、ＳＭＮタンパク質、β－グロビンなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり得る。様々な実施形態では、核酸は、修飾され得る。例えば、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの両方を含む分子を含む、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。
【0052】
ペイロードは、マイクロバブル表面上の正電荷（例えば、スペルミン分子の正に帯電した第一級及び／又は第二級アミノ基）と、核酸の糖リン酸骨格上の負に帯電したリン酸基などの、ペイロード分子上で露出された負電荷との間の静電的相互作用を介してマイクロバブルに結合し得る。本明細書に記載のマイクロバブル組成物は、ペイロード組成物内の負電荷の核酸リン酸基（Ｐ）の数に対するマイクロバブル組成物のマイクロバブルを装飾する正電荷アミン基（Ｎ）の数の比に応じて核酸で装填され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９又は１：２０のＮ：Ｐ比で装填され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、少なくとも約１：５、１：１０、１：１５、又は１：２０のＮ：Ｐ比で装填され得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、マイクロバブル当たりおよそ１×１０－７～１×１０－１０、１×１０－７～１×１０－９、１×１０－７～１×１０－８、１×１０－８～１×１０－１０、又は１×１０－８～１×１０－９μｇのペイロード（例えば、ｐＤＮＡ）の濃度で調製され得る。マイクロバブル組成物は、例えば、少なくとも約１×１０－８、２×１０－８、３×１０－８、４×１０－８、５×１０－８、６×１０－８、７×１０－８、８×１０－８、９×１０－８μｇ／マイクロバブルの濃度で調製され得る。
【0053】
マイクロバブル組成物が最終的に運ぶことができる核酸の量は、利用可能な正電荷の量（例えば、マイクロバブル表面上のアミノ基の表面密度）並びに核酸を安定に結合する正電荷ポリマーの能力に部分的に依存する。マイクロバブル組成物の結合安定性は一般的に、より高い装填能力で低下し得る。本開示のマイクロバブル組成物は一般的に、当技術分野で知られるマイクロバブル組成物よりも安定な装填を示し、より高い正電荷の数及び／又は密度を有するマイクロバブル組成物よりも高い装填能力を効果的に達成し得る。例えば、ＰＥＩは、ポリマー１ｍｇ当たりおよそ８．２モルの第一級アミン密度を提供する。図４に示すように他の全てのグルコース単位がスペルミンに結合されるスペルミン－デキストランは、ポリマー１ｍｇ当たりおよそ２．０モルの密度を提供する。さらに、本明細書に開示される結果は、本明細書に記載のスペルミン装飾マイクロバブルが、２グルコース単位ごとに１個よりもはるかに少ないデキストランがスペルミンに効果的にコンジュゲートされる場合でも、ＰＥＩコンジュゲートマイクロバブルよりも顕著に多くのＤＮＡを装填できることを実証する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるマイクロバブル組成物は、マイクロバブル当たり少なくとも約５，０００、１０,０００、１５,０００、２０,０００、２５,０００、３０,０００、又は３５,０００個の核酸分子の装填能力を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるマイクロバブル組成物は、マイクロバブル組成物の計算された表面積に対して少なくとも約０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、又は０．１００ｐｇ／μｍ２の核酸の装填能力を示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるマイクロバブル組成物は、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２７５、２００、２５０、又は５００個のスペルミンごとに少なくとも約１個の核酸の装填能力を示し得る。
【0054】
マイクロバブル組成物を作製する方法
スペルミン装飾マイクロバブルを含むマイクロバブル組成物は一般的に、マイクロバブル、スペルミン分子、任意にデキストランなどの連結ポリマー、任意に核酸などのペイロード分子、及び任意に抗体などの標的化分子を含む前述の成分を含む溶液を組み合わせることによって調製され得る。各溶液は、本明細書の他の箇所に記載されるように調製され得る。異なる溶液は、本明細書の他の箇所に記載の方法に従って組み合わされ得る。本明細書に記載の簡単な調製は、ペイロードの層ごとの堆積により装填されたマイクロバブルを上回る利便性及び速さの利点を提供する。
スペルミン装飾マイクロバブルを含むマイクロバブル組成物は一般的に、マイクロバブル、スペルミン分子、任意にデキストランなどの連結ポリマー、任意に核酸などのペイロード分子、及び任意に抗体などの標的化分子を含む前述の成分を含む溶液を組み合わせることによって調製され得る。各溶液は、本明細書の他の箇所に記載されるように調製され得る。異なる溶液は、本明細書の他の箇所に記載の方法に従って組み合わされ得る。本明細書に記載の簡単な調製は、ペイロードの層ごとの堆積により装填されたマイクロバブルを上回る利便性及び速さの利点を提供する。
【0055】
様々な実施形態では、２つの溶液を組み合わせる順序及び／又は溶液が組み合わされる速さは、得られる組成物に影響を与え得る。例えば、第１の成分を含む溶液は、第２の成分が第１の成分より過剰である条件下で第１の成分が第２の成分と反応することが望まれる場合、第２の成分を含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加され得る。第２の成分にゆっくりと又は徐々に（例えば、滴下又は時間調整シリンジポンプ下で）第１の成分を添加することは、第１の成分の１分子が第２の成分の複数分子と反応できる状況において、第２の成分による第１の成分の飽和を促進し得る。ゆっくりと又は徐々には、実質的な飽和を促進する速さすなわち速度であると理解され、特定の反応の動態に依存し得る。得られる混合物の最終的なモル比もまた、飽和の程度に影響を与え得る。第１の溶液内の対応する反応基の数より実質的に過剰である第２の溶液内の反応基の数の最終モル比を有する混合物は、第２の成分による第１の成分の飽和を促進し得る。いくつかの実施形態では、第２の溶液内の反応基の数は、第２の成分による第１の成分の飽和を促進するために、第１の溶液内の反応基の数に対して少なくとも約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、７５：１又は１００：１の最終モル比で存在し得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、デキストラン（例えば、酸化デキストラン）などの連結ポリマーを含む溶液は、各連結ポリマーがスペルミン分子により実質的に飽和されるように、スペルミン分子を含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。スペルミン溶液にポリマー溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、スペルミンによるポリマー間の架橋量を最小限にする。いくつかの実施形態では、ポリマーはこの段階で実質的に架橋されない。例えば、ポリマーの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１５％未満が、別のポリマーに架橋される。スペルミンの第一級アミンが連結ポリマーに共有結合される実施形態では、飽和を促進することかつポリマーの分子間のスペルミン架橋剤の数を減少させることは、後続の反応に関わるか又はペイロードと結合するために利用できる遊離スペルミン及び遊離第一級アミノ基の数を増加させる。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾ポリマーの溶液は、後続の調製工程の前に未反応のスペルミンを除去するために透析され得る。
【0057】
他の実施形態では、スペルミン分子を含む溶液は、デキストランなどの連結ポリマーを含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。ポリマー溶液にスペルミン分子を含む溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、ポリマー間の架橋の増加を促進し得る。例えば、ポリマー分子の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％未満のポリマー分子が、少なくとも１つの追加のポリマー分子に架橋され得る。架橋ポリマーは、スペルミン・ポリマー複合体の有効分子量を増加させ得る。架橋ポリマーは、マイクロバブル表面を装飾するポリマーにおける分岐の相対量を効果的に増加させ得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、スペルミン分子は、デキストランなどの連結ポリマーに連結された後のマイクロバブルとの会合（例えば、共有結合）のために官能化される。スペルミン装飾ポリマーは、マイクロバブル表面と反応するための官能基による第一級アミノ基の飽和を防止する、モル比などの条件下で官能化され得る。いくつかの実施形態では、スペルミン分子内の５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは５０個の遊離アミノ基ごとにおよそ１個、及び／又は遊離第一級アミノ基のおよそ約５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％が、チオール基などにより、マイクロバブルへの結合のために官能化され得る。
【0059】
いくつかの実施形態では、マイクロバブルを含む溶液は、各マイクロバブルがスペルミン分子／スペルミン装飾ポリマーで実質的に飽和されるように、スペルミン分子又はスペルミン装飾デキストランなどのスペルミン装飾ポリマーを含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。スペルミン含有溶液にマイクロバブル溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、スペルミン又はスペルミン修飾ポリマーによるマイクロバブル間の架橋量を最小限にし得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルはこの段階で実質的に架橋されない。例えば、マイクロバブルの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１５％未満が、別のマイクロバブルに架橋される。マイクロバブルの飽和を促進すること、およびマイクロバブル間の架橋の数を減らすことは、後続の反応に関わるか又はペイロードと結合するために利用できる遊離スペルミンと遊離第一級アミノ基の数を増加させ得る。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルの溶液は、後続の調製ステップの前に、未結合のスペルミン及び／又はポリマーを除去するために透析又は洗浄され得る。
【0060】
他の実施形態では、スペルミン分子又はスペルミン装飾ポリマーを含む溶液は、マイクロバブルを含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。マイクロバブル溶液にスペルミンを含む溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、マイクロバブル間の架橋の増加を促進し得る。例えば、マイクロバブルの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％未満のマイクロバブルが、少なくとも１つの追加のマイクロバブルに架橋され得る。いくつかの実施形態では、平均のマイクロバブルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の追加のマイクロバブルに架橋され得る。マイクロバブルを架橋することは、１つのマイクロバブル又は共に架橋された複数のマイクロバブルを含み得る、個々の粒子の有効サイズ及び表面積を増加させ、粒子当たりのペイロード装填能力を増大させ得る。本明細書に記載の方法のいくつかの実施において、粒子当たりのペイロード装填能力を増加させることは、本明細書の他の箇所に記載される、いくつかのソノポレーション適用においてなどの、細胞へのペイロード送達の効率を増加させ得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル粒子の有効直径は、およそ１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、又は１０μｍ超であり得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルを含む溶液は、各スペルミン装飾マイクロバブルがペイロード分子で実質的に飽和されるように、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ又はｐＤＮＡ）などのペイロードを含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。ペイロード溶液にスペルミン装飾マイクロバブル溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、ペイロード分子によるマイクロバブル間の架橋量を最小限にする。いくつかの実施形態では、マイクロバブル又はスペルミン架橋若しくはポリマー架橋されたマイクロバブルを含む粒子は、この段階で実質的に架橋（又はさらに架橋）されない。例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１５％未満のマイクロバブルが、別のマイクロバブルに架橋される。ペイロードによるマイクロバブル又はマイクロバブル粒子の飽和を促進することは、本明細書の他の箇所に記載のいくつかのソノポレーション適用においてなどの、細胞へのペイロード送達の効率を増加し得る。
【0062】
他の実施形態では、ペイロード溶液は、スペルミン装飾マイクロバブルを含む溶液にゆっくりと又は徐々に添加される。スペルミン装飾マイクロバブル溶液にペイロード溶液をゆっくりと又は徐々に添加することは、マイクロバブル間の増加された架橋を促進し得る。例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、又は５０％未満のマイクロバブルが、少なくとも１つの追加のマイクロバブルに架橋され得る。いくつかの実施形態では、平均のマイクロバブルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の追加のマイクロバブルに架橋され得る。マイクロバブルを架橋することは、１つのマイクロバブル又は共に架橋された複数のマイクロバブルを含み得る、個々の粒子の有効サイズ及び表面積を増加させ、粒子当たりのペイロード装填能力を増大させ得る。本明細書に記載の方法のいくつかの実施において、粒子当たりのペイロード装填能力を増加させることは、本明細書の他の箇所に記載のいくつかのソノポレーション適用においてなどの、細胞へのペイロード送達の効率を増加し得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブル粒子の有効直径は、およそ１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、又は１０μｍ超であり得る。
【0063】
様々な実施形態では、スペルミン、ポリマー、スペルミン装飾ポリマー、マイクロバブル、スペルミン装飾マイクロバブル、及び／又はペイロードを含む溶液は、当技術分野で公知の標準的な手段により共に組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、溶液は、例えば、シリンジポンプ又は滴定フラスコを使用して、本明細書の他の箇所に記載されるようにゆっくりと又は徐々に組み合わされ得る。溶液は、およそ５分、１０分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、又は２４時間にわたり、又は反応を実質的に完了させるのに必要な期間にわたり組み合わされ得る。溶液は、回転、攪拌、振盪などを含む、当技術分野で公知の標準的な手段により、溶液の組み合わせ中及び／又は組み合わせ後に混合され得る。溶液は、組み合わせた後、およそ１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、又は２４時間にわたり混合され得る。いくつかの実施形態では、第１の成分は、乾燥形態にあり（例えば、凍結乾燥される）、第２の成分中に第１の成分を溶解することにより、溶液中で第２の成分と混合される。いくつかの実施形態では、乾燥成分は、溶液にゆっくりと又は徐々に添加される、成分であり得る。様々な工程において、遠心分離が、マイクロバブルを洗浄するか、又はそうでなければマイクロバブルを反応溶液中の他の成分から分離するために、使用され得る。マイクロバブルは、浮揚性の上清中に捕集され得る。
【0064】
薬物送達のためにマイクロバブル組成物を使用する方法
ソノポレーション
本開示の一態様では、ソノポレーション技術により本明細書に記載のマイクロバブルを使用して１以上の細胞にペイロードを送達するための方法が提供される。ソノポレーションは、膜を横切るかつ細胞内へのペイロードの送達を容易にするために細胞原形質膜の透過性を増大させるために、典型的には超音波周波数で、音を使用する。ソノポレーションは、血液脳関門又は血液腫瘍関門を越えてペイロードを送達するのに特に有益であり得る。インビボ適用の場合、超音波は非侵襲的な様式で対象の組織の奥深くまで浸透しかつ非標的組織への最小限の副作用で又は副作用なしに空間的及び時間的に標的化された送達を提供できるので、ソノポレーションは、薬物送達の有利な手段であり得る。マイクロバブルは、超音波媒介薬物送達において音響キャビテーションの核として機能でき、マイクロバブルの高い圧縮性のため超音波を効果的に散乱させる。ソノポレーションは、細胞原形質膜における一過性細孔の形成を介して細胞透過性の一時的な増加を誘導すると考えられる。理論に束縛されることなく、マイクロバブルを崩壊させることは、近くの細胞膜を透過できる局所的な衝撃波、ウォータージェット、及びせん断力をもたらし得る。ソノポレーションは、細胞サイトゾル中への、核酸などの治療薬の直接送達（すなわち、エンドソーム輸送経路の外側で）を可能にし得る。
ソノポレーション
本開示の一態様では、ソノポレーション技術により本明細書に記載のマイクロバブルを使用して１以上の細胞にペイロードを送達するための方法が提供される。ソノポレーションは、膜を横切るかつ細胞内へのペイロードの送達を容易にするために細胞原形質膜の透過性を増大させるために、典型的には超音波周波数で、音を使用する。ソノポレーションは、血液脳関門又は血液腫瘍関門を越えてペイロードを送達するのに特に有益であり得る。インビボ適用の場合、超音波は非侵襲的な様式で対象の組織の奥深くまで浸透しかつ非標的組織への最小限の副作用で又は副作用なしに空間的及び時間的に標的化された送達を提供できるので、ソノポレーションは、薬物送達の有利な手段であり得る。マイクロバブルは、超音波媒介薬物送達において音響キャビテーションの核として機能でき、マイクロバブルの高い圧縮性のため超音波を効果的に散乱させる。ソノポレーションは、細胞原形質膜における一過性細孔の形成を介して細胞透過性の一時的な増加を誘導すると考えられる。理論に束縛されることなく、マイクロバブルを崩壊させることは、近くの細胞膜を透過できる局所的な衝撃波、ウォータージェット、及びせん断力をもたらし得る。ソノポレーションは、細胞サイトゾル中への、核酸などの治療薬の直接送達（すなわち、エンドソーム輸送経路の外側で）を可能にし得る。
【0065】
超音波の強度及びマイクロバブルシェルの組成は、ソノポレーションの有効性に影響を及ぼし得る。マイクロバブルシェルは、小さな圧力摂動に耐えるのに十分に剛性であるが、超音波に応答して振動するのに十分に弾性である必要がある。マイクロバブルサイズにおけるより低いポリ分散度が、より高い割合のマイクロバブル組成物が同じ振幅の超音波に敏感であるように、望ましい場合がある。理論に束縛されることなく、低強度の超音波に供されたマイクロバブルは、安定キャビテーションと呼ばれる共鳴直径（ｒｅｓｏｎａｎｔ ｄｉａｍｅｔｅｒ）の周りで安定に振動し得る。安定なキャビテーションは、局所的なせん断力と音響マイクロストリーミングを生成する。より高い圧力振幅では、マイクロバブルは、それらを慣性キャビテーションと呼ばれるイベントで爆発させる大きなサイズ変動を受ける傾向があり、崩壊はウォータージェッティング、衝撃波及び他の慣性現象を生じる。安定なマイクロバブルキャビテーションと一過性のマイクロバブルキャビテーションの両方が、細胞膜透過処理を誘導し得る。ソノポレーションは、エンドサイトーシスとは無関係の細胞内薬物送達への経路を提供すると考えられる。いくつかの実施形態では、マイクロバブルによるソノポレーションの超音波誘発は、約０．１ＭＨｚ～約１０ＭＨｚ、約０．５ＭＨｚ～約５ＭＨｚ、又は約１ＭＨｚ～約３ＭＨｚの周波数で実行され得る。いくつかの実施形態では、超音波誘発は、約１００ｍＷ／ｃｍ２～約１ｋＷ／ｃｍ２、約１００ｍＷ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約３００ｍＷ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約５００ｍＷ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約７００ｍＷ／ｃｍ２～約１Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約５００Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約１００Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約１００Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約５０Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約２０Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約１０Ｗ／ｃｍ２、約１Ｗ／ｃｍ２～約５Ｗ／ｃｍ２、又は約１Ｗ／ｃｍ２～約２Ｗ／ｃｍ２の強度で実行され得る。いくつかの実施形態では、超音波誘発は、例えば、およそ７２０ｍＷ／ｃｍ２（診断用超音波の場合）などの、規制機関（例えば、ＦＤＡ）によって許可される最大強度で実行され得る。いくつかの実施形態では、超音波誘発は、約１０％～１００％、約２０％～約９０％、約３０％～約８０％、約４０％～約７０％、又は約５０％～約６０％のデューティサイクルで実行され得る。いくつかの実施形態では、デューティサイクルは約５０％である。いくつかの実施形態では、超音波の機械的指数（ＭＩ）は、約０．０５～約５、約０．１～約５、約０．５～約５、約１～約５、約２～約５、約３～約５、約４～約５であり得る。いくつかの実施形態では、超音波誘発は、例えば、およそ１．９（診断用超音波の場合）などの、規制機関（例えば、ＦＤＡ）によって許可される最大機械的指数で実行され得る。いくつかの実施形態では、超音波誘発は、約１０秒～３分、１０秒～２分、１０秒～１分、１０秒～５０秒、１０秒～４０秒、１０秒～３０秒、３０秒～３分、３０秒～２分、３０秒～１分、３０秒～５０秒、３０秒～４０秒、１分～３分、又は１分～２分、２分～３分の間送達され得る。
【0066】
エンドサイトーシスによる薬物送達
いくつかの実施形態では、ペイロードの送達は、例えば、エンドサイトーシス（例えば、食作用、ピノサイトーシス、受容体媒介性エンドサイトーシス）により、ソノポレーションなしに生じる、かつ／又は誘導され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子及び又はスペルミン装飾マイクロバブルを装飾する別の分子は、受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する受容体と相互作用し得る。様々な実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルは、そこでのｐＨが約４．５～５．０である、リソソームに組み込まれ得る。様々な実施形態では、リソソーム内のｐＨの低下は、本明細書の他の箇所に記載のシスタミンビスアクリルアミドリンカーなどの、ｐＨ感受性生分解性リンカーの切断（例えば、ジスルフィド結合の低下による）を促進し得る。スペルミン分子間、スペルミン分子と連結ポリマーの間、及び／又は連結ポリマーとマイクロバブルの間の生分解性リンカーの分解は、スペルミン会合ペイロードを効果的に解放し、より効果的な送達を可能にし得る。例えば、マイクロバブルからのペイロードの分離は、いくつかの実施形態では核局在化を促進し得る。スペルミン装飾マイクロバブル及びペイロードは、本明細書の他の箇所に記載されるように調製され、かつ／又は細胞と組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、ペイロードの送達は、例えば、エンドサイトーシス（例えば、食作用、ピノサイトーシス、受容体媒介性エンドサイトーシス）により、ソノポレーションなしに生じる、かつ／又は誘導され得る。いくつかの実施形態では、標的化分子及び又はスペルミン装飾マイクロバブルを装飾する別の分子は、受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する受容体と相互作用し得る。様々な実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルは、そこでのｐＨが約４．５～５．０である、リソソームに組み込まれ得る。様々な実施形態では、リソソーム内のｐＨの低下は、本明細書の他の箇所に記載のシスタミンビスアクリルアミドリンカーなどの、ｐＨ感受性生分解性リンカーの切断（例えば、ジスルフィド結合の低下による）を促進し得る。スペルミン分子間、スペルミン分子と連結ポリマーの間、及び／又は連結ポリマーとマイクロバブルの間の生分解性リンカーの分解は、スペルミン会合ペイロードを効果的に解放し、より効果的な送達を可能にし得る。例えば、マイクロバブルからのペイロードの分離は、いくつかの実施形態では核局在化を促進し得る。スペルミン装飾マイクロバブル及びペイロードは、本明細書の他の箇所に記載されるように調製され、かつ／又は細胞と組み合わされ得る。
【0067】
インビトロ適用
いくつかの実施形態では、薬物送達（及び該当する場合ソノポレーション）は、インビトロで実行され得る。スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、接着細胞と又は溶液中の細胞と組み合わされ得る。マイクロバブルが溶液中の細胞に添加されると、ソノポレーションが、溶液中の細胞に対して実行されるか、又は細胞がその後、ソノポレーションの前に接着（プレートに播種されてよい）されてよい。マイクロバブルは、細胞当たり約１：１～１００：１、５：１～５０：１、５：１～２５：１、１０：１～５０：１、１０：１～３０：１、１０：１～２５：１、１０：１～２０：１、１０：１～１５：１、１５：１～２０：１、又は１５：１～２５：１のマイクロバブルの比率で細胞と組み合わされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、マイクロバブルと細胞は、細胞当たりおよそ１０：１、１５：１、又は２０：１のマイクロバブルの比率で組み合わされる。スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、スペルミン装飾マイクロバブルを細胞（例えば、標的化分子が組み込まれる）と十分に混合させ、かつ場合によっては細胞を標的化させるために、一定期間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間などの間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、特にマイクロバブルが溶液中で細胞と組み合わされる場合に、細胞と積極的に（例えば、回転により）混合され得る。マイクロバブルが接着細胞と組み合わされる実施形態では、細胞培養表面は、浮揚性マイクロバブルが接着細胞とより良好に相互作用することを可能にするために、組み合わせ期間の一部又は全体にわたって反転され得る。細胞／マイクロバブル組成物は、混合後に１回以上洗浄され得る。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルは、マイクロバブルを細胞と組み合わせる前に、ペイロード（例えば、ｐＤＮＡ）を予め装填される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルと実質的に同時に細胞と組み合わされる。例えば、ペイロードは、細胞との組み合わせの直前に、又は細胞と実質的に同時にマイクロバブル溶液中に組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルが細胞と混合しかつ／又は細胞を標的化することを可能にするために、インキュベーション期間中に細胞と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルが細胞と混合しかつ／又は細胞を標的化することを可能にされた後に細胞と組み合わされ得る。例えば、ペイロードは、細胞とマイクロバブルの組み合わせに続く洗浄工程の後に細胞と組み合わされ得る。マイクロバブルがペイロードを予め装填されないいくつかの実施形態では、ペイロードは、ペイロードをスペルミン装飾マイクロバブル上のスペルミンと相互作用させるためにソノポレーションの前に、一定期間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間などの間、細胞とインキュベートされ得る。細胞がマイクロバブル及びペイロードと十分に組み合わされた後に、ソノポレーションが、本明細書の他の箇所に記載されるように実行され得る。
いくつかの実施形態では、薬物送達（及び該当する場合ソノポレーション）は、インビトロで実行され得る。スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、接着細胞と又は溶液中の細胞と組み合わされ得る。マイクロバブルが溶液中の細胞に添加されると、ソノポレーションが、溶液中の細胞に対して実行されるか、又は細胞がその後、ソノポレーションの前に接着（プレートに播種されてよい）されてよい。マイクロバブルは、細胞当たり約１：１～１００：１、５：１～５０：１、５：１～２５：１、１０：１～５０：１、１０：１～３０：１、１０：１～２５：１、１０：１～２０：１、１０：１～１５：１、１５：１～２０：１、又は１５：１～２５：１のマイクロバブルの比率で細胞と組み合わされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、マイクロバブルと細胞は、細胞当たりおよそ１０：１、１５：１、又は２０：１のマイクロバブルの比率で組み合わされる。スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、スペルミン装飾マイクロバブルを細胞（例えば、標的化分子が組み込まれる）と十分に混合させ、かつ場合によっては細胞を標的化させるために、一定期間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間などの間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、特にマイクロバブルが溶液中で細胞と組み合わされる場合に、細胞と積極的に（例えば、回転により）混合され得る。マイクロバブルが接着細胞と組み合わされる実施形態では、細胞培養表面は、浮揚性マイクロバブルが接着細胞とより良好に相互作用することを可能にするために、組み合わせ期間の一部又は全体にわたって反転され得る。細胞／マイクロバブル組成物は、混合後に１回以上洗浄され得る。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブルは、マイクロバブルを細胞と組み合わせる前に、ペイロード（例えば、ｐＤＮＡ）を予め装填される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルと実質的に同時に細胞と組み合わされる。例えば、ペイロードは、細胞との組み合わせの直前に、又は細胞と実質的に同時にマイクロバブル溶液中に組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルが細胞と混合しかつ／又は細胞を標的化することを可能にするために、インキュベーション期間中に細胞と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、マイクロバブルが細胞と混合しかつ／又は細胞を標的化することを可能にされた後に細胞と組み合わされ得る。例えば、ペイロードは、細胞とマイクロバブルの組み合わせに続く洗浄工程の後に細胞と組み合わされ得る。マイクロバブルがペイロードを予め装填されないいくつかの実施形態では、ペイロードは、ペイロードをスペルミン装飾マイクロバブル上のスペルミンと相互作用させるためにソノポレーションの前に、一定期間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、１時間などの間、細胞とインキュベートされ得る。細胞がマイクロバブル及びペイロードと十分に組み合わされた後に、ソノポレーションが、本明細書の他の箇所に記載されるように実行され得る。
【0068】
インビボ適用
いくつかの実施形態では、薬物送達（及び該当する場合ソノポレーション）は、対象においてインビボで実行され得る。対象は、ペイロードの送達から有益な効果を経験できる任意の生物を含み得る。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニックの非ヒト動物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、薬物送達（及び該当する場合ソノポレーション）は、対象においてインビボで実行され得る。対象は、ペイロードの送達から有益な効果を経験できる任意の生物を含み得る。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及びトランスジェニックの非ヒト動物が挙げられる。
【0069】
本明細書に記載のマイクロバブル及び／又はペイロード組成物（治療用組成物）は、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、若しくは頭蓋内注入）又は局所適用による、個々の対象への投与によりインビボで送達できる。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、ペイロードを予め装填されたマイクロバブル組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、連続的に又は実質的に同時に投与される、別々のマイクロバブル組成物及びペイロード組成物を含み得る。連続して投与される場合、ペイロード組成物は、マイクロバブル組成物の投与の前又は後に対象に投与され得る。
【0070】
いくつかの実施形態では、組成物は、個々の対象から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）又はユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達されてよく、続いて、通常はペイロードを組み込んだ細胞の選択後に、対象中に細胞を再移植する。診断、研究のための、又は分子治療のためのエキソビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物内へのトランスフェクト細胞の再注入による）は、当業者に周知である。エクスビボトランスフェクションに適する様々な細胞型は、当業者に周知である。一実施形態では、幹細胞が、細胞トランスフェクション及び分子療法のためのエキソビボ手順において使用される。幹細胞は、公知の方法を使用して形質導入及び分化のために単離できる。
【0071】
治療用組成物は、インビボで細胞の形質導入用の生物に直接投与することもできる。投与は、注射、注入、局所適用及びエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、分子を血液又は組織細胞に導入し最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。このような治療用組成物を投与する適切な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、かつ特定の組成物を投与するために２以上の経路を使用できるが、特定の経路がしばしば、別の経路よりも即時かつより効果的な反応を提供できる。
【0072】
治療用組成物は、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、哺乳動物、例えばヒトへの投与に適する調製物を含む。本発明の化合物が医薬として哺乳動物、例えばヒトに投与される場合、それらは、それ自体で、又は医薬として許容される担体と組み合わせて、例えば０．１～９９．５％（より好ましくは０．５～９０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えられてよい。薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知であり、本開示の化合物を哺乳動物に投与するのに適する、薬学的に許容される物質、組成物又はビヒクルを含む。担体は、対象薬剤を１つの器官若しくは身体の一部から別の器官若しくは身体の一部への運搬又は輸送に関与する液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ患者に害を及ぼさないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として機能できる物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース、及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬品製剤に使用される他の毒性のない適合性物質、が挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤も、組成物中に存在してよい。
【0073】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；並びにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤などが挙げられる。
【0074】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法により一部には決定される。したがって、利用可能な医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある（例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、１９８９参照）。
【0075】
いくつかの実施形態では、治療用組成物は、単独で又は他の適切な成分と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらを「噴霧」できる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、加圧された許容される噴射剤中に入れられてよい。
【0076】
静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下の経路によるなどの、非経口投与に適する製剤は、水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液を含み、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含んでよい水性及び非水性の無菌懸濁液を含み得る。開示される組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に又は髄腔内に投与できる。化合物の製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数回用量の密封容器で提供できる。注射液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製できる。
【0077】
治療的用途の場合、対象に、又は対象に導入される細胞に投与される治療用組成物の用量は、本開示の文脈において、対象に有益な治療応答を経時的にもたらすのに十分である必要がある。加えて、特定の投薬計画は、実験環境において、例えば、機能ゲノミクス研究において、並びに細胞又は動物モデルにおいて表現型の変化を決定するために有用であり得る。用量は、使用される特定の組成物の有効性及びＫｄ、標的細胞の核容積、及び対象の状態、並びに治療される対象の体重又は表面積によって決定される。用量の大きさはまた、特定の対象における特定の化合物又はオリゴヌクレオチド剤の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定される。投与される投与量は、対象ごとに異なる。「治療的に有効な用量」は、例えば、腫瘍のサイズ若しくは増殖速度、又は腫瘍の成長期間、腫瘍数、癌細胞数、癌細胞の生存率、増殖速度及び増殖期間などの症状又は表現型をモニタリングすることによって決定できる。疾患の治療又は予防において投与される治療用組成物の有効量を決定する際に、医師は、マイクロバブル及び／又はペイロードの循環血漿レベル、潜在的な毒性、疾患の進行、及び抗治療抗体の産生を評価する。投与は、単回投与又は分割投与によって達成できる。
【0078】
様々な実施形態では、本明細書に記載のマイクロバブル組成物及び／又は薬物送達方法は、陰性対照と比較して、核酸ペイロードのトランスフェクション効率（例えば、ｐＤＮＡの発現）をおよそ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれより多く増強し得る。
【0079】
マイクロバブル組成物を含むキット
本明細書の他の箇所に記載の１以上の組成物を調製するためのキットもまた、本明細書で開示される。キットは、本明細書に記載の方法などの用途における使用のための、別々の保存容器（例えば、バイアル、パウチなど）中の１以上の成分を提供し得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の他の箇所に記載のスペルミン装飾マイクロバブル組成物を含む。ペイロードは、キットに含まれても含まれなくてもよい。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、ペイロードを予め装填される。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、スペルミンで装飾されないが、スペルミン分子は、マイクロバブル組成物と組み合わせることができる別の組成物（例えば、スペルミン装飾ポリマー組成物）中で提供される。いくつかの実施形態では、１以上の組成物は、溶液で提供される。溶液は、室温で液体形態であるように構成され得る。いくつかの実施形態では、溶液は、保存中に凍結されるように構成される。いくつかの実施形態では、溶液は、保存中に冷蔵されるように構成される。溶液は、当技術分野で一般的に知られるような安定化剤を含み得る。保存容器は、組成物を光から保護できる。いくつかの実施形態では、１以上の組成物は、乾燥又は固体形態で提供される。例えば、組成物を含む１以上の溶液は、凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾燥形態にされてよい。いくつかの実施形態では、１以上の乾燥組成物を液体形態に再構成するための試薬（例えば、溶液）が、キットの一部として提供される。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、水溶液並びにマイクロバブルのガスのコアを再構成するためのガスで再構成するのに適している。キットは、スペルミンをマイクロバブルと組み合わせること、又はスペルミン装飾マイクロバブルをペイロードと組み合わせることなどの、任意の組成物を組み合わせるのに必要な１以上の薬剤を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ソノポレーションを実行するのに必要な１以上の試薬又はツールを含む。
本明細書の他の箇所に記載の１以上の組成物を調製するためのキットもまた、本明細書で開示される。キットは、本明細書に記載の方法などの用途における使用のための、別々の保存容器（例えば、バイアル、パウチなど）中の１以上の成分を提供し得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の他の箇所に記載のスペルミン装飾マイクロバブル組成物を含む。ペイロードは、キットに含まれても含まれなくてもよい。いくつかの実施形態では、スペルミン装飾マイクロバブル組成物は、ペイロードを予め装填される。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、スペルミンで装飾されないが、スペルミン分子は、マイクロバブル組成物と組み合わせることができる別の組成物（例えば、スペルミン装飾ポリマー組成物）中で提供される。いくつかの実施形態では、１以上の組成物は、溶液で提供される。溶液は、室温で液体形態であるように構成され得る。いくつかの実施形態では、溶液は、保存中に凍結されるように構成される。いくつかの実施形態では、溶液は、保存中に冷蔵されるように構成される。溶液は、当技術分野で一般的に知られるような安定化剤を含み得る。保存容器は、組成物を光から保護できる。いくつかの実施形態では、１以上の組成物は、乾燥又は固体形態で提供される。例えば、組成物を含む１以上の溶液は、凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾燥形態にされてよい。いくつかの実施形態では、１以上の乾燥組成物を液体形態に再構成するための試薬（例えば、溶液）が、キットの一部として提供される。いくつかの実施形態では、マイクロバブル組成物は、水溶液並びにマイクロバブルのガスのコアを再構成するためのガスで再構成するのに適している。キットは、スペルミンをマイクロバブルと組み合わせること、又はスペルミン装飾マイクロバブルをペイロードと組み合わせることなどの、任意の組成物を組み合わせるのに必要な１以上の薬剤を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ソノポレーションを実行するのに必要な１以上の試薬又はツールを含む。
【0080】
本明細書で使用される場合、以下の実施例を含み、マイクロバブル組成物中の「それぞれの」マイクロバブル、又はマイクロバブルと会合するか又は組成物内の「それぞれの」ポリマーに言及する場合、又は個々のマイクロバブル若しくはポリマーが特に特徴付けられる場合、その特徴付けは、マイクロバブル／ポリマー組成物が組成物全体にわたり実質的に均質であることを前提としたバルクマイクロバブル又はポリマー組成物の特性／測定値に基づくことを理解されたい。したがって、平均数（マイクロバブルの測定若しくは推定される総数及び／又はポリマー全部の数若しくは質量に基づく）は、幾分かの変動が個々のマイクロバブル及び／又はポリマー間で予想されることを理解して組成物中の「それぞれの」マイクロバブル又はポリマーを特徴付けるために使用されてよい。組成物中の実質的にそれぞれの／全てのマイクロバブル又はマイクロバブルと会合するそれぞれの／全てのポリマーは、例えば、組成物内の８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、又は１００％のマイクロバブル／ポリマー（質量又は数による）を指してよい。組成物中の実質的にそれぞれの／全てのマイクロバブル、又はマイクロバブルと会合するそれぞれの／全てのポリマーは、本明細書の他の箇所に記載のペイロード装填量のいずれかを達成するのに必要な量を指してよい。
【0081】
本明細書に開示される任意の分子量平均値は、明示的に別段の記載がない限り、数平均化又は重量平均化のいずれかがなされ得る。本明細書に開示される任意の平均サイズ（例えば、マイクロバブルサイズ）は、明示的に別段の記載がない限り、数平均化又は重量平均化のいずれかがなされ得る。
【0082】
本明細書に開示される全ての測定値又は値は、明示的に別段の記載がない限り、近似値であると想定されるべきである。「約」又は「およそ」であるとみなされる測定値又は値は、本開示の文脈で当業者によって評価され得る。例えば、別段の指示がない限り、本明細書に開示される測定値又は値は、本明細書に記載の主題から効果的に逸脱することなく、２０％以下、好ましくは１０％以下、及びより好ましくは５％以下の偏差を有し得る。
【0083】
実施例
実施例１：酸化デキストラン（Ｏ－Ｄｅｘ）の合成
Ｏ－Ｄｅｘの合成は、図４に示す一連の反応の最初の化学反応により示される。過ヨウ素酸カリウム（１４３７ｍｇ、６．２５ミリモル）を、ｍｉｌｌｉＱ水（２０ｍＬ）中のデキストラン４０ｋ（１０００ｍｇ、６．２５ミリモルのグルコースモノマー）の溶液に添加した。反応液を、室温にて暗所で７時間、激しく撹拌し、次いで、水洗浄しながら４℃で１０分間４０００ｇにてＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）を使用して２回スピンろ過した。得られた保持液を、再生セルロース半透膜（ＭＷＣＯ ３．５～５ｋＤａ）を使用して水に対し１日透析した後、２日間凍結乾燥して、淡黄色固体としてＯ－Ｄｅｘを得た（８０％収率）。図５の上部に示す、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２０）６（ｐｐｍ）＝６．０２－４．８５（ｍ，０．４Ｈ），４．７１－４．２５（ｍ，０．５Ｈ），４．０５－３．４１（ｍ，１Ｈ）。
実施例１：酸化デキストラン（Ｏ－Ｄｅｘ）の合成
Ｏ－Ｄｅｘの合成は、図４に示す一連の反応の最初の化学反応により示される。過ヨウ素酸カリウム（１４３７ｍｇ、６．２５ミリモル）を、ｍｉｌｌｉＱ水（２０ｍＬ）中のデキストラン４０ｋ（１０００ｍｇ、６．２５ミリモルのグルコースモノマー）の溶液に添加した。反応液を、室温にて暗所で７時間、激しく撹拌し、次いで、水洗浄しながら４℃で１０分間４０００ｇにてＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）を使用して２回スピンろ過した。得られた保持液を、再生セルロース半透膜（ＭＷＣＯ ３．５～５ｋＤａ）を使用して水に対し１日透析した後、２日間凍結乾燥して、淡黄色固体としてＯ－Ｄｅｘを得た（８０％収率）。図５の上部に示す、１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２０）６（ｐｐｍ）＝６．０２－４．８５（ｍ，０．４Ｈ），４．７１－４．２５（ｍ，０．５Ｈ），４．０５－３．４１（ｍ，１Ｈ）。
【0084】
実施例２：スペルミンコンジュゲートデキストラン（Ｓｐｅ－Ｄｅｘ）の合成
Ｏ－ＤｅｘからのＳｐｅ－Ｄｅｘの合成は、図４に示される一連の反応の第２及び第３の化学反応により示される。Ｏ－Ｄｅｘ（７９０ｍｇ、４．９４ミリモルのグルコースモノマー）を、ｍｉｌｌｉＱ水（３８ｍＬ）に溶解し、シリンジポンプで５時間かけて、ホウ酸緩衝液（１９ｍＬ、０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中のスペルミン（４５７ｍｇ、２．９６ミリモル）溶液に加えた。得られた溶液を、室温で２４時間穏やかに撹拌した後、氷浴下でＮａＢＨ４（３５９ｍｇ、９．４８ミリモル）を加え、室温で４８時間撹拌した。ＮａＢＨ４（３５９ｍｇ、９．４８ミリモル）の追加分を、次いで加え、同じ条件下で２４時間攪拌を続けた。粗生成物を、２．５日間Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐａｒ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ＝３．５～５ｋＤａ）を使用して水に対し透析した後、２日間凍結乾燥して、白色のフワフワした固体としてＳｐｅ－Ｄｅｘを得た。図５の下部に示す、１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤｚＯ）６（ｐｐｍ）＝３．６６（ｓ，１Ｈ），２．７４（ｄ，Ｊ＝４９．５Ｈｚ，１．５Ｈ），１．８６－１．３９（ｍ，ｌＨ）。ＮＭＲは、デキストランのほぼ全ての他のグルコース分子がスペルミンにコンジュゲートされることを示唆する。
Ｏ－ＤｅｘからのＳｐｅ－Ｄｅｘの合成は、図４に示される一連の反応の第２及び第３の化学反応により示される。Ｏ－Ｄｅｘ（７９０ｍｇ、４．９４ミリモルのグルコースモノマー）を、ｍｉｌｌｉＱ水（３８ｍＬ）に溶解し、シリンジポンプで５時間かけて、ホウ酸緩衝液（１９ｍＬ、０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中のスペルミン（４５７ｍｇ、２．９６ミリモル）溶液に加えた。得られた溶液を、室温で２４時間穏やかに撹拌した後、氷浴下でＮａＢＨ４（３５９ｍｇ、９．４８ミリモル）を加え、室温で４８時間撹拌した。ＮａＢＨ４（３５９ｍｇ、９．４８ミリモル）の追加分を、次いで加え、同じ条件下で２４時間攪拌を続けた。粗生成物を、２．５日間Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐａｒ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ＝３．５～５ｋＤａ）を使用して水に対し透析した後、２日間凍結乾燥して、白色のフワフワした固体としてＳｐｅ－Ｄｅｘを得た。図５の下部に示す、１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤｚＯ）６（ｐｐｍ）＝３．６６（ｓ，１Ｈ），２．７４（ｄ，Ｊ＝４９．５Ｈｚ，１．５Ｈ），１．８６－１．３９（ｍ，ｌＨ）。ＮＭＲは、デキストランのほぼ全ての他のグルコース分子がスペルミンにコンジュゲートされることを示唆する。
【0085】
実施例３：Ｓｐｅ－Ｄｅｘアミン定量
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ上の第一級アミンの数を、スペルミンを標準物質としてＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）法を使用して定量化した。ＴＮＢＳと第一級アミンの反応は、その強度がポリマー中の第一級アミンの濃度に正比例する発色団を生成する。スペルミン標準物質を作製するために、２０μＬの新たに調製したＴＮＢＳ水溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を、６００μＬの水に溶解した０．０４～０．２μモルの範囲の様々な量のスペルミンを含むチューブに別々に加えた。２００μＬの重炭酸緩衝液（０．８Ｍ、ｐＨ＝８．５）を、各チューブに加え、混合物を、１分間ボルテックスし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、６００μＬの１ＭのＨＣｌを、各チューブに加えて反応を停止させ、混合物を、１分間ボルテックスし、次いで穏やかに超音波処理して全ての気泡を除去した。１００μＬの試料を、１回の実行当たり使用し、吸光度を、３４０ｎｍで測定した。この手順を、様々な質量のＳｐｅ－Ｄｅｘを使用して繰り返し、アミンの数を、標準曲線及び標識ポリマーの吸光度の式を使用して計算した。本方法は、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ１ミリグラム当たり０．７１μモルの第一級アミン数を報告した。４０ｋＤａのその開始分子量を維持するデキストラン分子については、得られた各スペルミン装飾デキストラン分子は理論的には、およそ３３個のスペルミン、２２２個のグルコース単位を含み、４６．７１ｋＤａの分子量を有し、デキストラン分子間の架橋がないと仮定すると、６～７個ごとにおよそ１個のグルコース分子がスペルミンにコンジュゲートされる。
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ上の第一級アミンの数を、スペルミンを標準物質としてＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）法を使用して定量化した。ＴＮＢＳと第一級アミンの反応は、その強度がポリマー中の第一級アミンの濃度に正比例する発色団を生成する。スペルミン標準物質を作製するために、２０μＬの新たに調製したＴＮＢＳ水溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を、６００μＬの水に溶解した０．０４～０．２μモルの範囲の様々な量のスペルミンを含むチューブに別々に加えた。２００μＬの重炭酸緩衝液（０．８Ｍ、ｐＨ＝８．５）を、各チューブに加え、混合物を、１分間ボルテックスし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、６００μＬの１ＭのＨＣｌを、各チューブに加えて反応を停止させ、混合物を、１分間ボルテックスし、次いで穏やかに超音波処理して全ての気泡を除去した。１００μＬの試料を、１回の実行当たり使用し、吸光度を、３４０ｎｍで測定した。この手順を、様々な質量のＳｐｅ－Ｄｅｘを使用して繰り返し、アミンの数を、標準曲線及び標識ポリマーの吸光度の式を使用して計算した。本方法は、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ１ミリグラム当たり０．７１μモルの第一級アミン数を報告した。４０ｋＤａのその開始分子量を維持するデキストラン分子については、得られた各スペルミン装飾デキストラン分子は理論的には、およそ３３個のスペルミン、２２２個のグルコース単位を含み、４６．７１ｋＤａの分子量を有し、デキストラン分子間の架橋がないと仮定すると、６～７個ごとにおよそ１個のグルコース分子がスペルミンにコンジュゲートされる。
【0086】
実施例４：ポリプレックスサイズの測定
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックスを、１μｇのＧＦＰ ｐＤＮＡ（５０μＬ，２０μｇ／ｍｌ）を１：１、１：２、１：５、及び１：１０のＮ：Ｐ比で等量のポリマー溶液とボルテックスした後、室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。５μＬの各ポリプレックス溶液を次いで、ＭＱ水（又は１０ｍＭのＮａＣｌ）で１ｍｌに希釈し、平均サイズとゼータ電位を、ＺｅｔａＶｉｅｗ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ ＮＴＡシステムを使用して測定した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックス粒子サイズの測定値を、１：１（左上）、１：２（右上）、１：５（左下）、及び１：１０（右下）のＮ：Ｐ比で生成したポリプレックスについて図６で示す。サイズの測定値は、全ての比率でＤＮＡの複合体化を示した。各比率のサイズとゼータは、次の通りであった：１：１＝１２３．８ｎｍ、３０．５３ｍＶ；１：２＝１９１．５ｎｍ、２７．５１ｍＶ；１：５＝１１９．１ｎｍ、－２５．５５ｍＶ；１：１０＝１０５．３ｎｍ、－３４．１８ｍＶ。
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックスを、１μｇのＧＦＰ ｐＤＮＡ（５０μＬ，２０μｇ／ｍｌ）を１：１、１：２、１：５、及び１：１０のＮ：Ｐ比で等量のポリマー溶液とボルテックスした後、室温で３０分間インキュベートすることによって調製した。５μＬの各ポリプレックス溶液を次いで、ＭＱ水（又は１０ｍＭのＮａＣｌ）で１ｍｌに希釈し、平均サイズとゼータ電位を、ＺｅｔａＶｉｅｗ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｔｒｉｘ ＮＴＡシステムを使用して測定した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックス粒子サイズの測定値を、１：１（左上）、１：２（右上）、１：５（左下）、及び１：１０（右下）のＮ：Ｐ比で生成したポリプレックスについて図６で示す。サイズの測定値は、全ての比率でＤＮＡの複合体化を示した。各比率のサイズとゼータは、次の通りであった：１：１＝１２３．８ｎｍ、３０．５３ｍＶ；１：２＝１９１．５ｎｍ、２７．５１ｍＶ；１：５＝１１９．１ｎｍ、－２５．５５ｍＶ；１：１０＝１０５．３ｎｍ、－３４．１８ｍＶ。
【0087】
実施例５：ゲル電気泳動アッセイ
０．８μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１％ｗ／ｖのアガロースゲルを、トリス－アセテート－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＡＥ）で調製した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックスを、実施例４の方法を使用して、１：１、１：２、１：５、及び１：１０のＮ：Ｐ比で調製した。各ポリプレックス試料１０μＬを、５μＬの６×ＴｒｉＴｒａｃｋ ＤＮＡ装填緩衝液で希釈し、１５μＬ全てを、ゲルにロードした。ゲルを、３０分間７０ｍＶで泳動し、次いでさらに３０分間１００ｍＶで泳動し、ＤＮＡバンドを、ＢｉｏＤｏｃ－ｌｔ２イメージングシステムを使用してＵＶイルミネーターで可視化した、その結果を図７に示す。ゲルアッセイは、定常バンドで示されるように、１：１及び１：２のＮ：Ｐ比でＤＮＡの完全な複合体化を確認したが、１：５及び１：１０の比では部分的な複合体化のみが確認され、これは、遊離ＤＮＡのバンドを示した。
０．８μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１％ｗ／ｖのアガロースゲルを、トリス－アセテート－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＡＥ）で調製した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ／ＤＮＡポリプレックスを、実施例４の方法を使用して、１：１、１：２、１：５、及び１：１０のＮ：Ｐ比で調製した。各ポリプレックス試料１０μＬを、５μＬの６×ＴｒｉＴｒａｃｋ ＤＮＡ装填緩衝液で希釈し、１５μＬ全てを、ゲルにロードした。ゲルを、３０分間７０ｍＶで泳動し、次いでさらに３０分間１００ｍＶで泳動し、ＤＮＡバンドを、ＢｉｏＤｏｃ－ｌｔ２イメージングシステムを使用してＵＶイルミネーターで可視化した、その結果を図７に示す。ゲルアッセイは、定常バンドで示されるように、１：１及び１：２のＮ：Ｐ比でＤＮＡの完全な複合体化を確認したが、１：５及び１：１０の比では部分的な複合体化のみが確認され、これは、遊離ＤＮＡのバンドを示した。
【0088】
実施例６：Ｓｐｅ－Ｄｅｘチオール化及びＦＩＴＣ標識
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ（５ｍｇ、３．５５モルのＮＨ２）を、ＰＢＳ １×、５ｍＭのＥＤＴＡ（０．５ｍｌ）で溶解した。これに、１ｍｇ／ｍｌの２－イミノチオランＨＣＬ（４．８８ｍｇ、３５．４５μモル）水溶液を、激しく攪拌しながら滴下した。得られた混合物を、１時間撹拌し、４８時間透析し（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）、４８時間凍結乾燥した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーの蛍光標識を、アミン反応性５／６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ－フルオレセイン）を使用して行った。簡単に説明すると、Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマー（５ｍｇ）を、１ｍｌの１×ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．５）に溶解した。ＮＨＳ－フルオレセイン（５ｍｇ、１０．５６２μモル）を、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、激しく攪拌しながらＳｐｅ－Ｄｅｘ溶液に滴下した。反応物を、１時間撹拌し、４８時間透析し（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）、４８時間凍結乾燥した。
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ（５ｍｇ、３．５５モルのＮＨ２）を、ＰＢＳ １×、５ｍＭのＥＤＴＡ（０．５ｍｌ）で溶解した。これに、１ｍｇ／ｍｌの２－イミノチオランＨＣＬ（４．８８ｍｇ、３５．４５μモル）水溶液を、激しく攪拌しながら滴下した。得られた混合物を、１時間撹拌し、４８時間透析し（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）、４８時間凍結乾燥した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーの蛍光標識を、アミン反応性５／６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ－フルオレセイン）を使用して行った。簡単に説明すると、Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマー（５ｍｇ）を、１ｍｌの１×ホウ酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．５）に溶解した。ＮＨＳ－フルオレセイン（５ｍｇ、１０．５６２μモル）を、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、激しく攪拌しながらＳｐｅ－Ｄｅｘ溶液に滴下した。反応物を、１時間撹拌し、４８時間透析し（ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）、４８時間凍結乾燥した。
【0089】
実施例７：Ｓｐｅ－Ｄｅｘチオールの定量
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ上のチオールの数を、標準物質としてシステインを用いエルマン試薬（５，５'－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸））を使用して定量化した。エルマンとチオールとの反応は、発色団を生成し、その強度は、ポリマー中のチオールの濃度に正比例する。標準物質を作製するために、１０～５００μＭの範囲の濃度のシステイン５０μＬを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５中に溶解された９５０μＬの０．１ｍＭエルマンに加え、短時間ボルテックスした。試料を次いで、ＲＴで２分間インキュベートした。１００μＬの試料を、１回の実行当たり使用し、吸光度を、４１２ｎｍで測定した。この手順を、様々な質量のＳｐｅ－Ｄｅｘを使用して繰り返し、チオールの数を、標準曲線の式及び標識ポリマーの吸光度を使用して計算した。本方法は、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ １ｍｇ当たり０．１１３μモルの第一級アミンの数を報告した。これは、６．２８個ごとにおよそ１個の第一級アミンのチオール化に相当し、デキストラン分子間の架橋がないと仮定すると、デキストラン分子当たりおよそ２７．８９個の第一級アミンを遊離のまま残す。
Ｓｐｅ－Ｄｅｘ上のチオールの数を、標準物質としてシステインを用いエルマン試薬（５，５'－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸））を使用して定量化した。エルマンとチオールとの反応は、発色団を生成し、その強度は、ポリマー中のチオールの濃度に正比例する。標準物質を作製するために、１０～５００μＭの範囲の濃度のシステイン５０μＬを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５中に溶解された９５０μＬの０．１ｍＭエルマンに加え、短時間ボルテックスした。試料を次いで、ＲＴで２分間インキュベートした。１００μＬの試料を、１回の実行当たり使用し、吸光度を、４１２ｎｍで測定した。この手順を、様々な質量のＳｐｅ－Ｄｅｘを使用して繰り返し、チオールの数を、標準曲線の式及び標識ポリマーの吸光度を使用して計算した。本方法は、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ １ｍｇ当たり０．１１３μモルの第一級アミンの数を報告した。これは、６．２８個ごとにおよそ１個の第一級アミンのチオール化に相当し、デキストラン分子間の架橋がないと仮定すると、デキストラン分子当たりおよそ２７．８９個の第一級アミンを遊離のまま残す。
【0090】
実施例８：マイクロバブル製剤
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌ）をそれぞれ、９０：５：５のモル比で２５０μＬのクロロホルムに溶解し、２０ｍＬのシンチレーションバイアルに加えた。追加のクロロホルム（２ｍＬ）を加え、溶液を、ロータリーエバポレーターで乾燥させて、バイアルの周囲に脂質膜を作製した。この膜を、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させて、残留クロロホルムを除去した。得られた乾燥脂質膜を、１０％プロピレングリコール及び１０％グリセロールを含むＰＢＳ １×緩衝液に再懸濁し、７０℃に加温した。溶液を、透明になるまで同じ温度で超音波処理した。溶液のヘッドスペースを、デカフルオロブタンガスで満たし、チップを７０％振幅で５秒間超音波処理した。マイクロバブル溶液を次いで、シリンジで吸引し、ＰＢＳ洗浄（ｐＨ＝６．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）しながら、３分間３００ｇで３回遠心分離した。マイクロバブルの平均サイズ及び数を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４を使用して得た。測定を、各実行について１０ｍｌのアイソトンへと希釈した２μＬのマイクロバブル溶液を用いて３連で行った。マレイミド官能化マイクロバブルの平均サイズは、２．９８１μｍ±０．０１μｍであり、２．２２×１０９±１．１８×１０８ＭＢ／ｍＬのカウントを有した。
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００]（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００]（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌ）をそれぞれ、９０：５：５のモル比で２５０μＬのクロロホルムに溶解し、２０ｍＬのシンチレーションバイアルに加えた。追加のクロロホルム（２ｍＬ）を加え、溶液を、ロータリーエバポレーターで乾燥させて、バイアルの周囲に脂質膜を作製した。この膜を、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させて、残留クロロホルムを除去した。得られた乾燥脂質膜を、１０％プロピレングリコール及び１０％グリセロールを含むＰＢＳ １×緩衝液に再懸濁し、７０℃に加温した。溶液を、透明になるまで同じ温度で超音波処理した。溶液のヘッドスペースを、デカフルオロブタンガスで満たし、チップを７０％振幅で５秒間超音波処理した。マイクロバブル溶液を次いで、シリンジで吸引し、ＰＢＳ洗浄（ｐＨ＝６．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）しながら、３分間３００ｇで３回遠心分離した。マイクロバブルの平均サイズ及び数を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４を使用して得た。測定を、各実行について１０ｍｌのアイソトンへと希釈した２μＬのマイクロバブル溶液を用いて３連で行った。マレイミド官能化マイクロバブルの平均サイズは、２．９８１μｍ±０．０１μｍであり、２．２２×１０９±１．１８×１０８ＭＢ／ｍＬのカウントを有した。
【0091】
実施例９：Ｓｐｅ－Ｄｅｘによるマイクロバブルコンジュゲーション
Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーを、Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマー上のチオール基にマイクロバブル表面のマレイミド末端基を共有結合させることにより、マイクロバブル上にコンジュゲートさせた。簡単に説明すると、マイクロバブルを最初に、シリンジ中で１．１０×１０９ＭＢ／ｍＬの濃度にＰＢＳ ｐＨ＝６．５ ｗ １ｍＭ ＥＤＴＡを使用して希釈した。これに、１：２０のマレイミド：ポリマーモル比でＳｐｅ－Ｄｅｘポリマー（１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ ｐＨ＝６．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた。懸濁液を、室温で４時間、２０回転／分の速さで転倒回転させた後、３分間３００ｇにてＰＢＳ １×で３回洗浄した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ装飾マイクロバブルの平均サイズは、３．１１９μｍであり、３．４２×１０９ＭＢ／ｍＬのカウントを有した。蛍光顕微鏡を使用して、マイクロバブルシェルへのＦｌ標識Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーのコンジュゲーションを確認した。
Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーを、Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマー上のチオール基にマイクロバブル表面のマレイミド末端基を共有結合させることにより、マイクロバブル上にコンジュゲートさせた。簡単に説明すると、マイクロバブルを最初に、シリンジ中で１．１０×１０９ＭＢ／ｍＬの濃度にＰＢＳ ｐＨ＝６．５ ｗ １ｍＭ ＥＤＴＡを使用して希釈した。これに、１：２０のマレイミド：ポリマーモル比でＳｐｅ－Ｄｅｘポリマー（１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ ｐＨ＝６．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた。懸濁液を、室温で４時間、２０回転／分の速さで転倒回転させた後、３分間３００ｇにてＰＢＳ １×で３回洗浄した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ装飾マイクロバブルの平均サイズは、３．１１９μｍであり、３．４２×１０９ＭＢ／ｍＬのカウントを有した。蛍光顕微鏡を使用して、マイクロバブルシェルへのＦｌ標識Ｓｐｅ－Ｄｅｘポリマーのコンジュゲーションを確認した。
【0092】
実施例１０：蛍光分光法によるマイクロバブルへのＳｐｅ－Ｄｅｘコンジュゲーションの定量
マイクロバブルにコンジュゲートしたＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの量を定量化するために、標準曲線を、ＤＭＳＯ中で最初にＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの１０ｍｇ／ｍＬ溶液を希釈すること（１：２０希釈）、次いで５ｍＭのＮａＯＨ中で希釈すること（１：２０希釈）により作成した。段階希釈を行って、ウェル内で４０～３２０ｎｇ／ｍＬのＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘを得た（Ｎ＝３）。検量線の線形回帰は、ｙ＝１．８３×１０７×－５４６．７の式を与え、０．９９７２のＲ２値を有した。Ｆｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘマイクロバブル試料を、標準物質と同様にＤＭＳＯ及び５ｍＭのＮａＯＨ中である量のマイクロバブル懸濁液を希釈することにより調製した。Ｆｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘ ＭＢ試料を次いで、２０秒間超音波処理し、ボルテックスして、マイクロバブルが破壊されたこと、およびＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘが溶液中に均一に分布されたことを確実にした。溶液を、４８８ｎｍで励起し、蛍光強度を、５２０ｎｍで読み取った。回帰曲線を使用して、マイクロバブル試料中のＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの濃度を、０．０４５ｍｇ／ｍＬであると測定した。実施例３のスペルミン－デキストランの計算によると、およそ１７万個のスペルミン装飾デキストラン分子が、各マイクロバブルに付着され、マイクロバブル当たりおよそ５６０万個のスペルミン（デキストラン間の架橋がないと仮定すると、４７０万個の遊離スペルミン）を含む。
マイクロバブルにコンジュゲートしたＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの量を定量化するために、標準曲線を、ＤＭＳＯ中で最初にＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの１０ｍｇ／ｍＬ溶液を希釈すること（１：２０希釈）、次いで５ｍＭのＮａＯＨ中で希釈すること（１：２０希釈）により作成した。段階希釈を行って、ウェル内で４０～３２０ｎｇ／ｍＬのＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘを得た（Ｎ＝３）。検量線の線形回帰は、ｙ＝１．８３×１０７×－５４６．７の式を与え、０．９９７２のＲ２値を有した。Ｆｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘマイクロバブル試料を、標準物質と同様にＤＭＳＯ及び５ｍＭのＮａＯＨ中である量のマイクロバブル懸濁液を希釈することにより調製した。Ｆｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘ ＭＢ試料を次いで、２０秒間超音波処理し、ボルテックスして、マイクロバブルが破壊されたこと、およびＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘが溶液中に均一に分布されたことを確実にした。溶液を、４８８ｎｍで励起し、蛍光強度を、５２０ｎｍで読み取った。回帰曲線を使用して、マイクロバブル試料中のＦｌ－Ｓｐｅ－Ｄｅｘの濃度を、０．０４５ｍｇ／ｍＬであると測定した。実施例３のスペルミン－デキストランの計算によると、およそ１７万個のスペルミン装飾デキストラン分子が、各マイクロバブルに付着され、マイクロバブル当たりおよそ５６０万個のスペルミン（デキストラン間の架橋がないと仮定すると、４７０万個の遊離スペルミン）を含む。
【0093】
実施例１１：Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢ ＤＮＡの装填
ｍＣｈｅｒｒｙ ｐＤＮＡ（０．４０３μｇ／μＬ）を、１ｍＬのシリンジ中でＰＢＳ １×でおよそ０．０５μｇ／μＬに希釈した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢの溶液（２０μＬ、２．４×１０９ＭＢ／ｍＬ、合計４．６×１０７ＭＢ）を、シリンジにゆっくりと加え、シリンジを、１８回転／分で１５分間回転させた後、室温で１５分間直立して置いた。マイクロバブルを、１００ｇで１分間遠心分離し、下澄液を、廃棄した。マイクロバブルは、サイズ変更され、４×１０８ＭＢ／ｍＬの濃度を有し、合計１×１０７ＭＢであった。ＭＢ／ＤＮＡ試料を次いで、２０秒間超音波処理し、ボルテックスして、マイクロバブルが破壊されたこと、およびＤＮＡが溶液中に均一に分布されたことを確実にした。試料の吸光度を、二重でＴａｋｅ３マルチボリュームプレート及び２μＬの試料を使用して２６０ｎｍで読み取った。ＤＮＡ濃度を、既知濃度のｍＣｈｅｒｒｙ ｐＤＮＡから調製した標準曲線を使用して計算した。本方法を使用して、マイクロバブル当たりのｐＤＮＡ数を、３１，７８８（Ｎ＝４）であると決定し、これは、カチオン性脂質（ＤＳＴＡＰ）マイクロバブルと比較してＤＮＡ装填における１０倍の、統計的に有意な増加である（図８）。実施例１０の計算によると、およそ１個のｐＤＮＡ分子が、約１４８個のスペルミンごとに装填された。マイクロバブルの平均サイズを考慮して、およそ０．０２８ｐｇ／μｍ２のＤＮＡ装填能力が達成され、これは、文献で報告されるように、ＰＥＩコンジュゲートマイクロバブルを使用して達成されたものよりおよそ５．６倍、かつカチオン性脂質で形成されたマイクロバブルで達成された装填より少なくとも４．６倍多い。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｉｒｓｉらの「固形腫瘍への超音波誘導プラスミドＤＮＡ送達用のポリプレックス－マイクロバブルハイブリッド（Ｐｏｌｙｐｌｅｘ－Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｈｙｂｒｉｄｓ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ） Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ；２０１２ Ｊａｎｕａｒｙ ３０； １５７（２）を参照されたい。
ｍＣｈｅｒｒｙ ｐＤＮＡ（０．４０３μｇ／μＬ）を、１ｍＬのシリンジ中でＰＢＳ １×でおよそ０．０５μｇ／μＬに希釈した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢの溶液（２０μＬ、２．４×１０９ＭＢ／ｍＬ、合計４．６×１０７ＭＢ）を、シリンジにゆっくりと加え、シリンジを、１８回転／分で１５分間回転させた後、室温で１５分間直立して置いた。マイクロバブルを、１００ｇで１分間遠心分離し、下澄液を、廃棄した。マイクロバブルは、サイズ変更され、４×１０８ＭＢ／ｍＬの濃度を有し、合計１×１０７ＭＢであった。ＭＢ／ＤＮＡ試料を次いで、２０秒間超音波処理し、ボルテックスして、マイクロバブルが破壊されたこと、およびＤＮＡが溶液中に均一に分布されたことを確実にした。試料の吸光度を、二重でＴａｋｅ３マルチボリュームプレート及び２μＬの試料を使用して２６０ｎｍで読み取った。ＤＮＡ濃度を、既知濃度のｍＣｈｅｒｒｙ ｐＤＮＡから調製した標準曲線を使用して計算した。本方法を使用して、マイクロバブル当たりのｐＤＮＡ数を、３１，７８８（Ｎ＝４）であると決定し、これは、カチオン性脂質（ＤＳＴＡＰ）マイクロバブルと比較してＤＮＡ装填における１０倍の、統計的に有意な増加である（図８）。実施例１０の計算によると、およそ１個のｐＤＮＡ分子が、約１４８個のスペルミンごとに装填された。マイクロバブルの平均サイズを考慮して、およそ０．０２８ｐｇ／μｍ２のＤＮＡ装填能力が達成され、これは、文献で報告されるように、ＰＥＩコンジュゲートマイクロバブルを使用して達成されたものよりおよそ５．６倍、かつカチオン性脂質で形成されたマイクロバブルで達成された装填より少なくとも４．６倍多い。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｉｒｓｉらの「固形腫瘍への超音波誘導プラスミドＤＮＡ送達用のポリプレックス－マイクロバブルハイブリッド（Ｐｏｌｙｐｌｅｘ－Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｈｙｂｒｉｄｓ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ） Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ；２０１２ Ｊａｎｕａｒｙ ３０； １５７（２）を参照されたい。
【0094】
実施例１２：ＣＤ４４又はＥｐＣＡｍ標的化マイクロバブルの製剤化
標的化部分（ＣＤ４４及び抗ＥｐＣＡＭ抗体に対するヒアルロン酸など）もまた、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢ上にコンジュゲートさせることができる。ＣＤ４４を標的とするために、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを最初に、１ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ ｐＨ６．５で希釈して、１．１０×１０９ＭＢ／ｍＬの濃度にした。チオール化ヒアルロン酸の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（ＭＷ＝１０，０００ｇ／モル、ＣｒｅａｔｉｖｅＰｅｇＷｏｒｋｓ）を、１：５のマレイミド：ポリマー比（全てのマレイミドが遊離であったと仮定する）でマイクロバブル溶液に加えた。この溶液を、４時間回転させ、２分間２５０ｇにてＰＢＳ １×で３回洗浄した。ＥｐＣＡｍを標的とするために、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを、同じ手順であるが２：１のマレマイド：抗体比を用いてチオール化抗ＥｐＣＡｍ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体（Ａｂ）とコンジュゲートさせた。
標的化部分（ＣＤ４４及び抗ＥｐＣＡＭ抗体に対するヒアルロン酸など）もまた、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢ上にコンジュゲートさせることができる。ＣＤ４４を標的とするために、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを最初に、１ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ ｐＨ６．５で希釈して、１．１０×１０９ＭＢ／ｍＬの濃度にした。チオール化ヒアルロン酸の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（ＭＷ＝１０，０００ｇ／モル、ＣｒｅａｔｉｖｅＰｅｇＷｏｒｋｓ）を、１：５のマレイミド：ポリマー比（全てのマレイミドが遊離であったと仮定する）でマイクロバブル溶液に加えた。この溶液を、４時間回転させ、２分間２５０ｇにてＰＢＳ １×で３回洗浄した。ＥｐＣＡｍを標的とするために、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを、同じ手順であるが２：１のマレマイド：抗体比を用いてチオール化抗ＥｐＣＡｍ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体（Ａｂ）とコンジュゲートさせた。
【0095】
実施例１３：Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ／Ａｂ－ＭＢ結合実験
円形平行板フローチャンバーキット（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ社）を使用して、ＨｅＬａ細胞上で発現されるＣＤ４４へのＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ－ＭＢの良好な標的化を確認した。ＰＢＳ溶液中の２％ＢＳＡ（非特異的結合を防ぐために）を、それが飽和されるまでチャンバーを通して流し、次いで真空を適用し、３５ｍｍのディッシュで増殖するＨｅＬａ細胞を、チャンバーの上部に置いた。２．５ｍＬ中の５×１０６ＭＢ／ｍＬを、シリンジポンプを使用して４５０μＬ／分の流速で５分間にわたって注入した。注入後に、細胞を、同じ流速を使用して１．３ｍＬの２％ＢＳＡで洗浄し、真空をオフにし、細胞を除去した。結合を、顕微鏡により確認し、視野中のマイクロバブルの数を、ＩｍａｇｅＪを使用して計数し、非標的化Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢと比較した。標的化は、視野中に４１３４個のマイクロバブルを示し、一方で非標的化は、視野中に８１５個のマイクロバブルを示した。
円形平行板フローチャンバーキット（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ社）を使用して、ＨｅＬａ細胞上で発現されるＣＤ４４へのＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ－ＭＢの良好な標的化を確認した。ＰＢＳ溶液中の２％ＢＳＡ（非特異的結合を防ぐために）を、それが飽和されるまでチャンバーを通して流し、次いで真空を適用し、３５ｍｍのディッシュで増殖するＨｅＬａ細胞を、チャンバーの上部に置いた。２．５ｍＬ中の５×１０６ＭＢ／ｍＬを、シリンジポンプを使用して４５０μＬ／分の流速で５分間にわたって注入した。注入後に、細胞を、同じ流速を使用して１．３ｍＬの２％ＢＳＡで洗浄し、真空をオフにし、細胞を除去した。結合を、顕微鏡により確認し、視野中のマイクロバブルの数を、ＩｍａｇｅＪを使用して計数し、非標的化Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢと比較した。標的化は、視野中に４１３４個のマイクロバブルを示し、一方で非標的化は、視野中に８１５個のマイクロバブルを示した。
【0096】
ＥｐＣＡＭへの標的化を試験するために、Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－Ａｂ－ＭＢを、懸濁液中のＫ５６２細胞と混合した。ＤＮＡと共にＳｐｅ－Ｄｅｘ－Ａｂ－ＭＢを、１．６５×１０５個のＫ５６２細胞（５０ＭＢ／細胞）に添加し、穏やかなピペッティングで混合し、１分間インキュベートした。ＭＢ／細胞の溶液を次いで、５分間３００ｇで遠心分離して、標的化されないマイクロバブルを分離し、上清を、除去した。得られたペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁し、細胞へと標的化された何らかのマイクロバブルについて顕微鏡下で可視化した。この手順を、対照として非標的Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを使用して繰り返した。Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－Ａｂ－ＭＢを有するペレットは、視野中に１４５ＭＢを示し、一方でＥｐＣＡＭ抗体とコンジュゲートされないＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢを有するペレットは、視野中にわずか２２個のマイクロバブルを示した。
【0097】
実施例１４：Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ－ＭＢを用いるＨｅＬａ細胞のソノポレーション
ＨｅＬａ細胞を、１つは媒体の入口として機能しもう１つは空気の出口として機能する２つの穴を蓋に開けた３５ｍｍディッシュからなるカスタムメイドの装置で、ソノポレートした。トランスフェクションの２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を、２ｍＬの完全ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ中の５００，０００個の細胞で、このディッシュに播種した。トランスフェクションの日に、２×１０７個のＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ－ＭＢを、９．６４μｇのｅＧＦＰ ｐＤＮＡ（Ｎ：Ｐ １：５）に加え、毎分２０回転の速さで１５分間回転させ、次いで室温で１５分間インキュベートした。マイクロバブルを次いで、２分間２５０ｇでの遠心分離により１回洗浄し、下澄液を、除去し、結合の定量のために保持した。細胞の培地を次いで、吸引除去し、マイクロバブルを、最終濃度２０ＭＢ／細胞で滴加した。ウェルを次いで、ひっくり返し、マイクロバブルが細胞を標的化できるように１０分間インキュベートした。その後ウェルをひっくり返し、蓋を、漏れを防ぐためにパラフィルムで覆った。ウェルを、ＯｐｔｉＭＥＭで満たし、次いで、逆さまに反転した。ＵＳ結合ゲルを、ウェルの底にアプライし、細胞を、トランスデューサをウェル上で前後に動かしながら、６０秒間１Ｗ／ｃｍ２、５０％ＤＣでソノポレートした。ソノポレーションの４時間後に、ＯｐｔｉＭＥＭを、吸引し、２ｍＬの完全ＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションを、蛍光顕微鏡を使用してソノポレーションの３日後に確認し、フローサイトメトリーにより評価した。ソノポレートされた細胞は、対照細胞と比較してＦＩＴＣシグナルの１４％の増加を示す。
ＨｅＬａ細胞を、１つは媒体の入口として機能しもう１つは空気の出口として機能する２つの穴を蓋に開けた３５ｍｍディッシュからなるカスタムメイドの装置で、ソノポレートした。トランスフェクションの２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を、２ｍＬの完全ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ中の５００，０００個の細胞で、このディッシュに播種した。トランスフェクションの日に、２×１０７個のＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＨＡ－ＭＢを、９．６４μｇのｅＧＦＰ ｐＤＮＡ（Ｎ：Ｐ １：５）に加え、毎分２０回転の速さで１５分間回転させ、次いで室温で１５分間インキュベートした。マイクロバブルを次いで、２分間２５０ｇでの遠心分離により１回洗浄し、下澄液を、除去し、結合の定量のために保持した。細胞の培地を次いで、吸引除去し、マイクロバブルを、最終濃度２０ＭＢ／細胞で滴加した。ウェルを次いで、ひっくり返し、マイクロバブルが細胞を標的化できるように１０分間インキュベートした。その後ウェルをひっくり返し、蓋を、漏れを防ぐためにパラフィルムで覆った。ウェルを、ＯｐｔｉＭＥＭで満たし、次いで、逆さまに反転した。ＵＳ結合ゲルを、ウェルの底にアプライし、細胞を、トランスデューサをウェル上で前後に動かしながら、６０秒間１Ｗ／ｃｍ２、５０％ＤＣでソノポレートした。ソノポレーションの４時間後に、ＯｐｔｉＭＥＭを、吸引し、２ｍＬの完全ＥＭＥＭと交換した。トランスフェクションを、蛍光顕微鏡を使用してソノポレーションの３日後に確認し、フローサイトメトリーにより評価した。ソノポレートされた細胞は、対照細胞と比較してＦＩＴＣシグナルの１４％の増加を示す。
【0098】
実施例１５：Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＲＯＲ１－ＭＢを用いるＪｅＫｏ－１細胞のソノポレーション
３×１０７個のＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＲＯＲ１－ＭＢを、２８．９３μｇのｅＧＦＰ ｐＤＮＡ（Ｎ：Ｐ １：１０）に加え、毎分２０回転の速さで１５分間回転させ、次いで室温で１５分間インキュベートした。２．５×１０６個のＪｅＫｏ－１細胞を、スピンダウンし、１ｍＬのＲＰＭＩに再懸濁し、５００，０００個の細胞を、１２ウェルプレートの対照ウェルに加えた。マイクロバブルを、残りの細胞に加え、懸濁液を、１５分間回転させて、細胞上のＲＯＲ１（およそ１５ＭＢ／細胞）へのマイクロバブルの標的化を可能にした。その後、懸濁液を、１０ｍＬに希釈し、２．５ｍＬを、各ウェルに加えた。プレートを、３５℃に設定したヒートバスの上に置き、ウェルを、３０秒間又は６０秒間、５０％ＤＣで１又は２Ｗ／ｃｍ２のいずれかにてソノポレートした。ソノポレーションの２．５時間後に、細胞を、スピンダウンし、１ｍＬの完全ＲＰＭＩに再懸濁した。３日後に、細胞を、フローサイトメトリーのために収集した（図９）。生細胞についてのゲーティングは、陰性対照試料（下；２Ｗ／ｃｍ２、５０％ＤＣ、６０秒）と比較して、ソノポレートされた細胞（上）について１１％のＧＦＰシグナルの最大の増加を示した。サイトメーターでＦＩＴＣチャンネル対ＰＥチャンネルをプロットすることは、自家蛍光と真のＧＦＰシグナルの分離を可能にし、これは、トランスフェクションをさらに確認した。しかし、生細胞についてのゲーティングは、自家蛍光シグナルを除去しただけであった。トランスフェクションをさらに確認するために、ＤＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ法を使用して対照細胞とソノポレート細胞の両方から単離した。単離されたＤＮＡを、ＰＣＲ及びｅＧＦＰのフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して増幅した。増幅されたＤＮＡをＤＮＡラダーと共に１％アガロースゲルで泳動し、ＥｔＢｒで染色し、ＢｉｏＤｏｃ－ｌｔ２イメージングシステムで可視化した（図１０）。ゲルは、フローサイトメトリーがＧＦＰ陽性として全てのソノポレート試料を示したにも関わらず、いくらかのソノポレートされた試料についてであるが全てについてではない、ＧＦＰバンドを示す。これは、プラスミドが分解される間にＧＦＰタンパク質がまだ細胞内に存在するためであり得る。
３×１０７個のＳｐｅ－Ｄｅｘ－ＲＯＲ１－ＭＢを、２８．９３μｇのｅＧＦＰ ｐＤＮＡ（Ｎ：Ｐ １：１０）に加え、毎分２０回転の速さで１５分間回転させ、次いで室温で１５分間インキュベートした。２．５×１０６個のＪｅＫｏ－１細胞を、スピンダウンし、１ｍＬのＲＰＭＩに再懸濁し、５００，０００個の細胞を、１２ウェルプレートの対照ウェルに加えた。マイクロバブルを、残りの細胞に加え、懸濁液を、１５分間回転させて、細胞上のＲＯＲ１（およそ１５ＭＢ／細胞）へのマイクロバブルの標的化を可能にした。その後、懸濁液を、１０ｍＬに希釈し、２．５ｍＬを、各ウェルに加えた。プレートを、３５℃に設定したヒートバスの上に置き、ウェルを、３０秒間又は６０秒間、５０％ＤＣで１又は２Ｗ／ｃｍ２のいずれかにてソノポレートした。ソノポレーションの２．５時間後に、細胞を、スピンダウンし、１ｍＬの完全ＲＰＭＩに再懸濁した。３日後に、細胞を、フローサイトメトリーのために収集した（図９）。生細胞についてのゲーティングは、陰性対照試料（下；２Ｗ／ｃｍ２、５０％ＤＣ、６０秒）と比較して、ソノポレートされた細胞（上）について１１％のＧＦＰシグナルの最大の増加を示した。サイトメーターでＦＩＴＣチャンネル対ＰＥチャンネルをプロットすることは、自家蛍光と真のＧＦＰシグナルの分離を可能にし、これは、トランスフェクションをさらに確認した。しかし、生細胞についてのゲーティングは、自家蛍光シグナルを除去しただけであった。トランスフェクションをさらに確認するために、ＤＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ法を使用して対照細胞とソノポレート細胞の両方から単離した。単離されたＤＮＡを、ＰＣＲ及びｅＧＦＰのフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して増幅した。増幅されたＤＮＡをＤＮＡラダーと共に１％アガロースゲルで泳動し、ＥｔＢｒで染色し、ＢｉｏＤｏｃ－ｌｔ２イメージングシステムで可視化した（図１０）。ゲルは、フローサイトメトリーがＧＦＰ陽性として全てのソノポレート試料を示したにも関わらず、いくらかのソノポレートされた試料についてであるが全てについてではない、ＧＦＰバンドを示す。これは、プラスミドが分解される間にＧＦＰタンパク質がまだ細胞内に存在するためであり得る。
【0099】
実施例１６：ｍＣｈｅｒｒｙコードプラスミドを装填したＳｐｅ－Ｄｅｘ ＭＢを用いたインビボでの選択的Ｔ細胞トランスフェクション
ラットにおけるインビボトランスフェクション：インビボ発現を、遺伝子を発現する細胞の割合及び遺伝子発現を最大化するように最適化する。インビボトランスフェクションは、マイクロバブル／細胞複合体の曝露時間を短縮する介在組織及び血流による超音波減衰からなる、インビトロで最適化されたトランスフェクション条件に依存し得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の３０％が存在する脾臓及び、大静脈又は心臓などの広い血液空間を超音波にさらすことによりトランスフェクトされる。まず、Ｔ細胞が安定である６匹のラットの脾臓を、ソノポレートする。最適なマイクロバブルの配合と、最適なマイクロバブル／細胞比を達成するための１０６個のＴ細胞／ｍＬ及び８０ｍＬの血液／ｋｇ体重と仮定する数を、静脈内注射する。実験を、マイクロバブル投与の１０分後に最適なエキソビボ超音波曝露により開始し、インビボトランスフェクションを、７２時間の時点で遺伝子を発現する循環Ｔ細胞の割合を測定することにより評価し、遺伝子発現を、上記のように定量化する。脾臓を、死後に分析する。脾臓を最初に、熱傷について評価する。半分を次いで、均質化し、半分を、固定する。ホモジネートを、Ｔ細胞を染色するためにＦＩＴＣ－ａＣＤ３を添加した後に蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーによって評価する。Ｈ＆Ｅ及びＦＩＴＣ－ａＣＤ３による免疫組織化学染色を行って、損傷を評価し、ｍＣｈｅｒｒｙとＦＩＴＣの共局在を探す。超音波ＳＡＴＡエネルギーを次いで、次の６匹のラットについて増加させ、インビボトランスフェクションを、前と同様に再評価する。組織を損傷することなくトランスフェクトＴ細胞の割合と遺伝子発現を最大化する曝露が次いで、血液を超音波にさらすときの曝露時間を最適化するために使用される。
ラットにおけるインビボトランスフェクション：インビボ発現を、遺伝子を発現する細胞の割合及び遺伝子発現を最大化するように最適化する。インビボトランスフェクションは、マイクロバブル／細胞複合体の曝露時間を短縮する介在組織及び血流による超音波減衰からなる、インビトロで最適化されたトランスフェクション条件に依存し得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の３０％が存在する脾臓及び、大静脈又は心臓などの広い血液空間を超音波にさらすことによりトランスフェクトされる。まず、Ｔ細胞が安定である６匹のラットの脾臓を、ソノポレートする。最適なマイクロバブルの配合と、最適なマイクロバブル／細胞比を達成するための１０６個のＴ細胞／ｍＬ及び８０ｍＬの血液／ｋｇ体重と仮定する数を、静脈内注射する。実験を、マイクロバブル投与の１０分後に最適なエキソビボ超音波曝露により開始し、インビボトランスフェクションを、７２時間の時点で遺伝子を発現する循環Ｔ細胞の割合を測定することにより評価し、遺伝子発現を、上記のように定量化する。脾臓を、死後に分析する。脾臓を最初に、熱傷について評価する。半分を次いで、均質化し、半分を、固定する。ホモジネートを、Ｔ細胞を染色するためにＦＩＴＣ－ａＣＤ３を添加した後に蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーによって評価する。Ｈ＆Ｅ及びＦＩＴＣ－ａＣＤ３による免疫組織化学染色を行って、損傷を評価し、ｍＣｈｅｒｒｙとＦＩＴＣの共局在を探す。超音波ＳＡＴＡエネルギーを次いで、次の６匹のラットについて増加させ、インビボトランスフェクションを、前と同様に再評価する。組織を損傷することなくトランスフェクトＴ細胞の割合と遺伝子発現を最大化する曝露が次いで、血液を超音波にさらすときの曝露時間を最適化するために使用される。
【0100】
脾臓トランスフェクションに使用したのと同じマイクロバブル製剤及び数を、注入する。エキソビボで決定されかつ脾臓トランスフェクションに使用される最適な曝露時間を、開始点として使用し、次いで曝露時間を、超音波パワーを増加させるにつれて短縮して一定のＳＡＴＡを維持する。なぜなら腎臓のレベルでの下大静脈と門脈は、それらが肝臓に入る前に超音波にさらされるからである。インビボトランスフェクションを、７２時間の時点で遺伝子を発現する循環Ｔ細胞の割合を測定すること、および上記のように遺伝子発現を定量化することにより評価する。脾臓もまた、上記のように脾臓ホモジネート及び組織蛍光を評価することにより診断する。これらの実験を、それぞれの反復について６匹のラットで行い、その差異を上記のように統計的に分析した。
【0101】
これらの最適化されたインビボＴ細胞トランスフェクション実験から得られたデータは、脾臓又は血液ソノポレーションが優れたトランスフェクション方法であるかどうかを決定するために使用され得る。両方の方法は、別段の明示的な記載がない限り、本明細書の他の箇所に記載のインビボトランスフェクション実験に使用され得る。他の方法よりも１５％未満のトランスフェクションをもたらす方法は、それほど効果的でないと見なされる場合がある。
【0102】
インビボでの遺伝子トランスフェクション半減期：インビボでの遺伝子トランスフェクション半減期を計算するために、３０匹のラットを、上記で決定した最適な超音波曝露及びトランスフェクション法を使用してトランスフェクトする。６匹のラットを、ソノポレーション後１、２、４、７、及び１４日目に屠殺し、トランスフェクトＴ細胞の割合を、上記の血液及び脾臓と同様に決定する。トランスフェクトされたＴ細胞の平均の割合及び遺伝子発現レベルを、経時的にプロットし、遺伝子発現半減期を、決定する。経時的な変化を、一元配置分散分析を使用して統計的に評価し、データポイントを対応のないスチューデントｔ検定を使用して比較する。遺伝子発現半減期は、トランスフェクトされたＴ細胞の割合がインビボトランスフェクション後に低い場合、エキソビボトランスフェクションのために決定された最適なパラメータを用いる４ｍＬのラット血液のエキソビボトランスフェクション後に計算されてよい。２×１０６個のＴ細胞を、濃縮し、同腹仔でソノポレーションの直後に注入する。
【0103】
インビボトランスフェクトされたＴ細胞の割合の最大化：３０匹のラットは、いくつかのトランスフェクションセッション（マイクロバブル注入及びソノポレーション）を受け、ここで各６匹のラットはＴ１／２／３、Ｔ１／２／２、Ｔ１／２、１．５ｘＴ１／２又は２ｘＴ１／２ごとに処置される。６匹の追加のラットは、対照として働く。ラットに、ｍＣｈｅｒｒｙが装填されたマイクロバブル及び非特異的なＩｇＧ標識マイクロバブルを注入し、ラットを実験グループの最短時間でソノポレートした。最後の処置の翌日、２００μＬの血液を、トランスフェクトされたＴ細胞の割合について分析し、次いで２、４、７、及び１４日目、並びにＴ１／２の３倍の時点で再び動物を屠殺し、血液と脾臓を上記のようにＴ細胞トランスフェクションについて分析する。トランスフェクトされたＴ細胞の平均数を、各処置群についてプロットして、トランスフェクトされたＴ細胞の血球数を決定し、時間と処置群が独立変数として機能する２元配置分散分析を使用して統計的有意性について分析する。細胞数は、処置間隔が短いほど最大になり、間隔がＴ１／２に等しいときにプラトーになり、間隔がＴ１／２を超えると減少すると予想される。
【0104】
インビトロでトランスフェクトされたラットＴ細胞における活性化及びＣＡＲ発現の検証：Ｔ細胞を、エキソビボトランスフェクションに最適な条件を使用して血液にトランスフェクトし、トランスフェクトされたＴ細胞を、単離し計数する。トランスフェクトされたＴ細胞を次いで、最適な培地を含有する各ウェルに添加された１×１０５ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して９６ウェル培養プレートの底でコートされるＦｃタグ付きＣＤ１９タンパク質と相互作用させる。ＩＬ２及びＩＦＮ－ガンマサイトカイン放出を、３０分、２、１２、２４及び４８時間後の上清において酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。これらの時点で、ＣＡＲ Ｔ細胞も収集し、フローサイトメトリーを実行して、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３発現をアッセイすることにより、Ｔ細胞の活性化、記憶及び枯渇に対するマーカーを定量化する。Ｔ細胞を、トランスフェクトされない血液から回収し、ｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトしたＴ細胞は、陰性対照として働く。他のタンパク質でコートしたウェルを、ＣＡＲ標的特異性を実証するために使用する。実験を三重で行う。
【0105】
インビトロでのＣＡＲを発現するラットＴ細胞の生物学的細胞毒性の検証：正常ラット血液のＥａｓｙＳｅｐ（商標）ラットＴ細胞及びＢ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１×１０５ＣＡＲ Ｔ細胞を、培養し、同数のＢ細胞でエキソビボトランスフェクトして、ＣＡＲ Ｔ細胞の生物学的細胞毒性を検証する。非トランスフェクトＴ細胞と培養されるＢ細胞は、陰性対照として働く。ＡＦ４８８－ＣＤ１９抗体及びＰＩ染色を用いるフローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞との混合前及び混合後３０分、２、１２、２４及び４８時間の時点で生きているＢ細胞の数を評価する。Ｂ細胞溶解もまた、非放射性比色細胞毒性アッセイであるＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））を使用して定量化する。簡単に説明すると、上清を、収集し、新しい９６ウェルプレートに移し、ＣｙｔｏＴｏｘ試薬を添加する。停止液を、反応終了時に加える。吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍで測定する。Ｂ細胞の自然の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を、ＣＡＲ Ｔ細胞を含まないウェルから測定し、最大放出を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００処理試料から測定する。細胞毒性パーセントを、１００×[（実験でのＬＤＨ放出－自然ＬＤＨ放出）／（最大ＬＤＨ放出－自然放出]]として計算する。実験を三重で行う。
【0106】
インビボＴ細胞トランスフェクション及びＣＤ１９＋細胞枯渇の検証：Ｔ細胞を、ＣＤ１９ ＣＡＲＴプラスミドを装填したＣＤ３標的化マイクロバブル（ｎ＝６）又は非標的化マイクロバブル（ｎ＝６）のいずれかで１２匹のラットにインビボでトランスフェクトする。トランスフェクトされたＴ細胞の最大の割合を生じる実験条件に、おそらく複数回の処置に沿って、従う。２００μＬの血液を、１２、２４、４８、及び７２時間の時点で採取し、Ｂ細胞枯渇について分析する。ＡＦ４８８－ａＣＤ１９を、血液試料に加え、Ｂ細胞を、フローサイトメトリー及びＰＩ染色を使用して生存率について評価する。肝臓、脾臓、骨髄、リンパ節、及び肺を、収集する。試料を均質化し、残りをＨ＆Ｅ及び蛍光標識抗ＣＤ１９抗体を用いる免疫組織化学（ＩＨＣ）で染色する。ホモジネートを、上記のようにトランスフェクトＴ細胞の数を定量化するために評価し、生きているＢ細胞を、ＡＦ４８８－ａＣＤ１９、ＡＦ－６４７－ａＣＤ３及びＳＹＴＯＸ（商標）Ｏｒａｎｇｅを用いてフローサイトメトリーによって評価する。
【0107】
インビトロでのＣＡＲ発現ＡＬＬ Ｔ細胞及び非オフターゲットＣＡＲトランスフェクションの活性化、Ｂ細胞の細胞傷害性の検証：ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及び生物活性を評価するために、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者由来のヒト血液を使用して、健康な患者とＡＬＬ患者のＴ細胞を、エキソビボでトランスフェクトし、治療的効果を、ヒトＢ細胞ＡＬＬ異種移植マウスモデルを用いて検証する。ＡＬＬ患者由来の血液試料を使用して、Ｔ細胞を、最適化条件を用いてエキソビボでトランスフェクトし、トランスフェクトされたＴ細胞を、計数する。トランスフェクトされたＴ細胞を、ラット血液と同様にＦｃタグ付きＣＤ１９タンパク質と相互作用させ、ＩＬ２及びＩＦＮ－ガンマサイトカイン放出を、３０分、２、１２、２４及び４８時間後にＥＬＩＳＡにより上清中で測定する。これらの時点で、ＣＡＲ Ｔ細胞を、収集し、フローサイトメトリーを実行して、ラットの血液と同様にＴ細胞の活性化、記憶、及び枯渇に対するマーカーを定量化する。トランスフェクトされない血液から回収したＴ細胞及びｍＣｈｅｒｒｙでトランスフェクトしたＴ細胞は、陰性対照として働く。他のタンパク質でコートしたウェルを、ＣＡＲ標的特異性を評価するために使用する。実験を三重で行う。
【0108】
インビトロでのＣＡＲを発現するヒトＴ細胞の生物学的細胞毒性の検証：浮揚性技術を使用して、Ｔ細胞とＢ細胞を、ＣＤ３又はＣＤ１９標的化マイクロバブルを使用して別々に分離する。Ｔ細胞を、エキソビボでトランスフェクトし、次いで７２時間培養し及び増殖させる。Ｔ細胞を次いで、単離し、１×１０５個の生きているＣＡＲ Ｔ細胞を、１：１、５：１、１０：１のＢ細胞対Ｔ細胞の比率でＢ細胞と混合して、生物学的細胞毒性を評価する。非トランスフェクトＴ細胞及びＷＢＣ（ＣＤ１９－）と混合したトランスフェクトされたＴ細胞は、陰性対照として働く。上清中に放出されたＩＬ２及びＩＦＮ－ガンマを、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＡＦ４８８－ＣＤ１９抗体を用いるフローサイトメトリー及びＰＩ染色を使用して、ＣＡＲ Ｔ細胞と混合する前、混合後３０分、２、１２、２４及び４８時間の時点で生きているＢ細胞の数を計数する。Ｂ細胞溶解を、上記のようにＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））を使用して定量化する。細胞毒性のパーセントを、測定し、計算する。実験を三重で行う。
【0109】
Ｂ－ＡＬＬのヒト異種移植モデル：５×１０６個のプレＢ－ＡＬＬ ＮＡＬＭ－６細胞の異種移植を、ＳＣＩＤマウスにて行う。７８匹の６～８週齢マウスを、生着を改善するために全身にわたり２５０ｃＧｙの亜致死線量で照射し、それを、抗ヒトＰＥ－ＣＤ１９及び抗ヒトＰＥ－ＣＤ４５で染色した後にフローサイトメトリーを使用して、ＲＢＣ溶解後の末梢血、並びに肝臓、脾臓、及び骨髄有核細胞における浸潤ヒト白血病細胞の数を数えることにより、６週及び８週の時点でそれぞれ３匹のマウスにおいて評価する。追加の試料をまた、ＰＥで標識した非特異的抗体で染色して、陽性染色のゲートを設定する。ＡＬＬ血液から単離したＴ細胞を、エキソビボでトランスフェクトして、上記のようにＣＤ１９－ＣＡＲを発現させ、７２時間培養する。２×１０６個の生きているＣＡＲ Ｔ細胞を、単離し、ＡＬＬ Ｂ細胞接種後６週（Ｎ＝９）又は８週（Ｎ＝９）の時点で１８匹のＳＣＩＤマウスに静脈内注射する。ＡＬＬ患者の血液から単離された２×１０６個の非トランスフェクトＴ細胞を、対照としてＡＬＬ Ｂ細胞接種後６週（Ｎ＝９）又は８週（Ｎ＝９）の時点で１８匹のＳＣＩＤマウスに静脈内注射する。各群からの３匹のマウスを、Ｔ細胞投与後２４、４８、及び７２時間の時点で採血する。ＡＦ４８８－ａＣＤ１９を、血液試料に加え、Ｂ細胞を、フローサイトメトリーとＰＩ染色を使用して生存率について評価する。肝臓、脾臓、骨髄、リンパ節、及び肺を、収集し、ＩＨＣを行って、ＣＤ１９＋細胞の存在を検出する。処置されたマウス（Ｎ＝１８）対対照（Ｎ＝１８）の生存も、モニタする。
【0110】
実施例１７：Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢによるＢ細胞のソノポレーション
スペルミン－デキストランマイクロバブル（Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢ）を、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＣＤ１５４をコードする遺伝子で装填し、マイコバブル表面に抗－ＲＯＲ－１抗体を接着させることによりＲＯＲ－１に標的化する。代理遺伝子としてルシフェラーゼを使用して、マイクロバブルの装填、用量及び超音波パラメータを、インビトロで細胞死を最小限にしながら遺伝子発現を最大化するように最適化する。Ｔ細胞の活性化、増殖及び悪性Ｂ細胞死滅を、インビトロで、次いでインビトロ実験で最適化された配合と超音波条件を採用するＢ細胞悪性腫瘍のマウスモデルを使用してインビボで、トランスフェクションの前および後に評価する。マイクロバブルを全身投与してから数分後に、それらは循環する悪性Ｂ細胞に接着するはずであり、それらは次いで、ＦＤＡ承認の送信電力以下で臨床超音波システムを使用して送達される超音波場にＭＢ／細胞複合体を曝露することによりトランスフェクトされる。ＣＤ１５４の生成が、すぐに始まるはずである。十分な細胞がトランスフェクトされると、それらはＴ細胞の活性化を誘導して、悪性Ｂ細胞の死滅を始める。
スペルミン－デキストランマイクロバブル（Ｓｐｅ－Ｄｅｘ－ＭＢ）を、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＣＤ１５４をコードする遺伝子で装填し、マイコバブル表面に抗－ＲＯＲ－１抗体を接着させることによりＲＯＲ－１に標的化する。代理遺伝子としてルシフェラーゼを使用して、マイクロバブルの装填、用量及び超音波パラメータを、インビトロで細胞死を最小限にしながら遺伝子発現を最大化するように最適化する。Ｔ細胞の活性化、増殖及び悪性Ｂ細胞死滅を、インビトロで、次いでインビトロ実験で最適化された配合と超音波条件を採用するＢ細胞悪性腫瘍のマウスモデルを使用してインビボで、トランスフェクションの前および後に評価する。マイクロバブルを全身投与してから数分後に、それらは循環する悪性Ｂ細胞に接着するはずであり、それらは次いで、ＦＤＡ承認の送信電力以下で臨床超音波システムを使用して送達される超音波場にＭＢ／細胞複合体を曝露することによりトランスフェクトされる。ＣＤ１５４の生成が、すぐに始まるはずである。十分な細胞がトランスフェクトされると、それらはＴ細胞の活性化を誘導して、悪性Ｂ細胞の死滅を始める。
【0111】
実施例１８：ＴＦＡ２－スペルミンの合成
ＴＦＡ２－スペルミンの合成を、図１１に示す。エチルトリフルオロアセテート（１．４７ｍＬ、１２．３６ミリモル）及び水（０．０８９ｍＬ、４．９４ミリモル）を、アセトニトリル（８ｍＬ）中のスペルミン（５００ｍｇ、２．４７ミリモル）溶液に加え、得られた混合物を、９０℃で３時間還流した。その後、反応混合物を室温に冷却して白色沈殿物を形成し、冷ＤＣＭ（２ｍＬ）を、徐々に加えて沈殿を完了させた。固体を、濾過し、冷ＤＣＭで洗浄し、真空乾燥させて、白色固体としてＴＦＡ２－スペルミンを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝３．４１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．１０－３．０１（ｍ，８Ｈ），２．００－１．９０（ｍ，４Ｈ），１.７８－１．７０（ｍ，４Ｈ）。
ＴＦＡ２－スペルミンの合成を、図１１に示す。エチルトリフルオロアセテート（１．４７ｍＬ、１２．３６ミリモル）及び水（０．０８９ｍＬ、４．９４ミリモル）を、アセトニトリル（８ｍＬ）中のスペルミン（５００ｍｇ、２．４７ミリモル）溶液に加え、得られた混合物を、９０℃で３時間還流した。その後、反応混合物を室温に冷却して白色沈殿物を形成し、冷ＤＣＭ（２ｍＬ）を、徐々に加えて沈殿を完了させた。固体を、濾過し、冷ＤＣＭで洗浄し、真空乾燥させて、白色固体としてＴＦＡ２－スペルミンを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝３．４１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），３．１０－３．０１（ｍ，８Ｈ），２．００－１．９０（ｍ，４Ｈ），１.７８－１．７０（ｍ，４Ｈ）。
【0112】
実施例１９：ＢＯＣ２－スペルミンの合成
ＢＯＣ２－スペルミンの合成を、図１２に示す。スペルミン（７０ｍｇ、０．３４６ミリモル）を、アルゴン雰囲気下でＴＨＦ（１．０５ｍＬ）中に溶解し、氷浴を使用して冷却した。この溶液に、ＴＨＦ（２．１１ｍＬ）中のＢＯＣ－ＯＮ（１７０ｍｇ，０．６９２ミリモル）を、滴下し、反応混合物を、氷浴中で２分間撹拌した後、室温で１時間撹拌した。反応を次いで、飽和炭酸ナトリウム（３．１５ｍＬ）で停止させ、ＤＣＭ（各６ｍＬ）で３回抽出した。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、１２ｇの１５μｍシリカカラム及び溶離液としてエタノール中２８％のＮＨ４ＯＨの５％を使用してＰｕｒｉＦｌａｓｈで精製して、粘性液体としてＢＯＣ２－スペルミンを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝５．３－５．２（ｂｒ，１Ｈ），３．２－３．１（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６－２.５（ｍ，２Ｈ），２．４－２．２（ｂｒ，１Ｈ），１．６４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５－１．４（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）。
ＢＯＣ２－スペルミンの合成を、図１２に示す。スペルミン（７０ｍｇ、０．３４６ミリモル）を、アルゴン雰囲気下でＴＨＦ（１．０５ｍＬ）中に溶解し、氷浴を使用して冷却した。この溶液に、ＴＨＦ（２．１１ｍＬ）中のＢＯＣ－ＯＮ（１７０ｍｇ，０．６９２ミリモル）を、滴下し、反応混合物を、氷浴中で２分間撹拌した後、室温で１時間撹拌した。反応を次いで、飽和炭酸ナトリウム（３．１５ｍＬ）で停止させ、ＤＣＭ（各６ｍＬ）で３回抽出した。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、１２ｇの１５μｍシリカカラム及び溶離液としてエタノール中２８％のＮＨ４ＯＨの５％を使用してＰｕｒｉＦｌａｓｈで精製して、粘性液体としてＢＯＣ２－スペルミンを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝５．３－５．２（ｂｒ，１Ｈ），３．２－３．１（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６－２.５（ｍ，２Ｈ），２．４－２．２（ｂｒ，１Ｈ），１．６４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５－１．４（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ）。
【0113】
実施例２０：ポリジアミノエタン（ポリＤＡＥ）の合成
ポリＤＡＥの合成を、図１３に示す。ＢＯＣ－ＤＡＥとメチレンビスアクリルアミドを、概念実証として行った。ＢＯＣ－ＤＡＥ（１００ｍｇ、０．６２４ミリモル）及びメチレンビスアクリルアミド（９６ｍｇ、０．６２４ミリモル）を、丸底フラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（０．６２ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、４日間アルゴンバルーン下６０℃、暗所で撹拌した。その後、反応物を、２５ｍＬの冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。固体を、濾別し、乾燥させ、次いで９７．５：２．５ｖ／ｖのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解し、４５分間撹拌してＢＯＣ保護基を除去した。生成物を次いで、２５ｍＬの冷ジエチルエーテル中で再び沈殿させ、ろ過し、乾燥させて、粘性液体としてポリＤＡＥを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝４．５４（Ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５８－３．２９（ｍ，１０Ｈ），２．７２（ｄｔ，Ｊ＝４８．１，６．５Ｈｚ，４Ｈ）。
ポリＤＡＥの合成を、図１３に示す。ＢＯＣ－ＤＡＥとメチレンビスアクリルアミドを、概念実証として行った。ＢＯＣ－ＤＡＥ（１００ｍｇ、０．６２４ミリモル）及びメチレンビスアクリルアミド（９６ｍｇ、０．６２４ミリモル）を、丸底フラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（０．６２ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、４日間アルゴンバルーン下６０℃、暗所で撹拌した。その後、反応物を、２５ｍＬの冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。固体を、濾別し、乾燥させ、次いで９７．５：２．５ｖ／ｖのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解し、４５分間撹拌してＢＯＣ保護基を除去した。生成物を次いで、２５ｍＬの冷ジエチルエーテル中で再び沈殿させ、ろ過し、乾燥させて、粘性液体としてポリＤＡＥを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝４．５４（Ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５８－３．２９（ｍ，１０Ｈ），２．７２（ｄｔ，Ｊ＝４８．１，６．５Ｈｚ，４Ｈ）。
【0114】
実施例２１：ポリスペルミンの合成
ポリスペルミンの合成を、図１４に示す。ＢＯＣ２－スペルミン（２００ｍｇ、０．４９７ミリモル）及びメチレンビスアクリルアミド（７７ｍｇ、０．４９７ミリモル）を、丸底フラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（０．７５ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、４日間アルゴン下、６０℃の暗所で撹拌した。その後、反応物を、３０ｍＬの冷エーテルに沈殿させた。固体を、濾別し、乾燥させ、次いで１ｍＬの９５：５ｖ／ｖ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏに溶解し、３０分間撹拌してＢＯＣ保護基を除去した。粗生成物を、３０ｍＬの冷エーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させた。生成物を、１日透析する（ＭＷＣＯ＝１ｋＤａ）ことによりさらに精製した後、凍結乾燥させて、白色粉末としてポリスペルミンを得た（３３ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝４．５４（ｓ，２Ｈ），３．００（ｐ，Ｊ＝９．６，８．７Ｈｚ，８Ｈ），２．８３－２．６０（ｍ，８Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），１．９０（ｑ，Ｊ＝８．２，７．７Ｈｚ，４Ｈ），１．５２（ｓ，４Ｈ）。
ポリスペルミンの合成を、図１４に示す。ＢＯＣ２－スペルミン（２００ｍｇ、０．４９７ミリモル）及びメチレンビスアクリルアミド（７７ｍｇ、０．４９７ミリモル）を、丸底フラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（０．７５ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、４日間アルゴン下、６０℃の暗所で撹拌した。その後、反応物を、３０ｍＬの冷エーテルに沈殿させた。固体を、濾別し、乾燥させ、次いで１ｍＬの９５：５ｖ／ｖ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏに溶解し、３０分間撹拌してＢＯＣ保護基を除去した。粗生成物を、３０ｍＬの冷エーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させた。生成物を、１日透析する（ＭＷＣＯ＝１ｋＤａ）ことによりさらに精製した後、凍結乾燥させて、白色粉末としてポリスペルミンを得た（３３ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝４．５４（ｓ，２Ｈ），３．００（ｐ，Ｊ＝９．６，８．７Ｈｚ，８Ｈ），２．８３－２．６０（ｍ，８Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），１．９０（ｑ，Ｊ＝８．２，７．７Ｈｚ，４Ｈ），１．５２（ｓ，４Ｈ）。
【0115】
実施例２２：ビスアクリルアミドケタールの合成
ビスアクリルアミドケタールの合成を、図１５に示す。ビスフタルイミドケタールジアミン（１０００ｍｇ、２．３７ミリモル）を、還流冷却器を取り付けた丸底フラスコに加えた。６ＭのＮａＯＨ（６．４１ｍＬ）を加え、反応混合物を、１００℃で一晩還流してフタルイミド保護基を除去した。保護されないケタールジアミンを次いで、ＣＨＣｌ３／ｉＰｒＯＨの１：１ｖ／ｖ混合物で抽出した（３回、１３ｍＬ）。ケタールジアミン（３８４ｍｇ、２．３７ミリモル）を次いで、氷浴中のＲＢフラスコに加え、６ＭのＮａＯＨ（１１．５ｍＬ）で溶解した。トリエチルアミン（１４．９ｍＬ、１０７ミリモル）及び塩化アクリロイル（２．８７ｍＬ、３５．５ミリモル）を、交互に少しずつ加えて、ｐＨを８以上に維持した。得られた混合物を、１５分間撹拌し、続いて冷１０％Ｋ２ＣＯ３溶液（２４ｍＬ）を加え、さらに１０分間撹拌した。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し（３回、１２ｍＬ）、溶離液として最初に１：１の酢酸エチル／ヘキサン次いで１００％酢酸エチルを使用してシリカカラムで精製した。最終生成物を次いで、酢酸エチル（１０５ｍｇ、２１．４％）で結晶化した。
ビスアクリルアミドケタールの合成を、図１５に示す。ビスフタルイミドケタールジアミン（１０００ｍｇ、２．３７ミリモル）を、還流冷却器を取り付けた丸底フラスコに加えた。６ＭのＮａＯＨ（６．４１ｍＬ）を加え、反応混合物を、１００℃で一晩還流してフタルイミド保護基を除去した。保護されないケタールジアミンを次いで、ＣＨＣｌ３／ｉＰｒＯＨの１：１ｖ／ｖ混合物で抽出した（３回、１３ｍＬ）。ケタールジアミン（３８４ｍｇ、２．３７ミリモル）を次いで、氷浴中のＲＢフラスコに加え、６ＭのＮａＯＨ（１１．５ｍＬ）で溶解した。トリエチルアミン（１４．９ｍＬ、１０７ミリモル）及び塩化アクリロイル（２．８７ｍＬ、３５．５ミリモル）を、交互に少しずつ加えて、ｐＨを８以上に維持した。得られた混合物を、１５分間撹拌し、続いて冷１０％Ｋ２ＣＯ３溶液（２４ｍＬ）を加え、さらに１０分間撹拌した。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し（３回、１２ｍＬ）、溶離液として最初に１：１の酢酸エチル／ヘキサン次いで１００％酢酸エチルを使用してシリカカラムで精製した。最終生成物を次いで、酢酸エチル（１０５ｍｇ、２１．４％）で結晶化した。
【0116】
実施例２３：フタルイミド－スペルミンの合成
フタルイミド－スペルミンの合成を、図１６に示す。スペルミン（４００ｍｇ、１．９８ミリモル）及びＮ－カルベトキシフタルイミド（８６７ｍｇ、３．９５ミリモル）を、丸底フラスコに加え、ＤＣＭ（７ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、３時間撹拌し、次いで蒸発乾固した。残留物を、溶離液として最初に１０：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ、次いで２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨを使用してシリカカラムで精製して、淡黄色固体としてフタルイミド－スペルミンを得た。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）Ｒｆ＝０．２（２：１ｖ／ｖのＤＣＭ／ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝７．８５－７．６３（ｍ，８Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．６８－２．５２（ｍ，８Ｈ），１．８５（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，５Ｈ）。
フタルイミド－スペルミンの合成を、図１６に示す。スペルミン（４００ｍｇ、１．９８ミリモル）及びＮ－カルベトキシフタルイミド（８６７ｍｇ、３．９５ミリモル）を、丸底フラスコに加え、ＤＣＭ（７ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、３時間撹拌し、次いで蒸発乾固した。残留物を、溶離液として最初に１０：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ、次いで２：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨを使用してシリカカラムで精製して、淡黄色固体としてフタルイミド－スペルミンを得た。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）Ｒｆ＝０．２（２：１ｖ／ｖのＤＣＭ／ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝７．８５－７．６３（ｍ，８Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．６８－２．５２（ｍ，８Ｈ），１．８５（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，５Ｈ）。
【0117】
実施例２４：ポリスペルミンシスタミンビスアクリルアミド（ポリスペルミンＣＢＡ）の合成
ポリスペルミンＣＢＡの合成を、図１７に示す。ＣＢＡＢＯＣ２－スペルミン（３４１．９ｍｇ、０．８４９ミリモル）及びシスタミンビスアクリルアミド（２２１．１３ｍｇ、０．８４９ミリモル）を、ＲＢフラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（１．２８ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、５日間アルゴンバルーン下、６０℃にて暗所で撹拌した。この後、１ｍＬの９５：５ｖ／ｖのＴＦＡ／Ｈ２Ｏを加え、得られた混合物を、４５分間攪拌して、ＢＯＣ保護基を除去した。粗生成物を、１日透析し（ＭＷＣＯ＝１ｋＤａ）、続いて凍結乾燥させて、白色粉末としてポリスペルミンＣＢＡを得た（６６．７ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝３．５２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），３．１２－２．９６（ｍ，１１Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．０９－１．９７（ｍ，４Ｈ），１．７６－１．６３（ｍ，４Ｈ）。
ポリスペルミンＣＢＡの合成を、図１７に示す。ＣＢＡＢＯＣ２－スペルミン（３４１．９ｍｇ、０．８４９ミリモル）及びシスタミンビスアクリルアミド（２２１．１３ｍｇ、０．８４９ミリモル）を、ＲＢフラスコに加え、アルゴンをフラッシュし、脱気した９：１ｖ／ｖのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ溶媒混合物（１．２８ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を、５日間アルゴンバルーン下、６０℃にて暗所で撹拌した。この後、１ｍＬの９５：５ｖ／ｖのＴＦＡ／Ｈ２Ｏを加え、得られた混合物を、４５分間攪拌して、ＢＯＣ保護基を除去した。粗生成物を、１日透析し（ＭＷＣＯ＝１ｋＤａ）、続いて凍結乾燥させて、白色粉末としてポリスペルミンＣＢＡを得た（６６．７ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）＝３．５２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），３．１２－２．９６（ｍ，１１Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），２．０９－１．９７（ｍ，４Ｈ），１．７６－１．６３（ｍ，４Ｈ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】