特表 2023-546158 ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型系のためのＤＮＡ含有ポリヌクレオチドおよびガイド、ならびにこれらを製造する方法および使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-01

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型系のためのＤＮＡ含有ポリヌクレオチドおよびガイド、ならびにこれらを製造する方法および使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20231025BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20231025BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231025BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20231025BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231025BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20231025BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20231025BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231025BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231025BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/09 110

C12N5/10

C12N9/22

C12N15/62 Z

A61P35/00

A61K47/68

A61K35/17

A61K35/545

A61K39/395 D

A61K39/395 N

C12N15/55

C12N5/078

C12N15/13

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023523535

(86)(22)【出願日】2021-10-18

(85)【翻訳文提出日】2023-06-07

(86)【国際出願番号】 US2021055394

(87)【国際公開番号】W WO2022086846

(87)【国際公開日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】63/093,459

(32)【優先日】2020-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/127,648

(32)【優先日】2020-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/229,870

(32)【優先日】2021-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＤＡＬＩ

(71)【出願人】

【識別番号】515251115

【氏名又は名称】カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ポール・ダニエル・ドノヒュー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085BB11

4C085EE01

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本開示は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系での使用のためのガイドであって、リボヌクレオチド塩基と、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基とを含むガイドを提供する。少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含むＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ガイド、およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２タンパク質とそのようなガイドとの核タンパク質複合体も説明されている。同様に開示されているのは、デオキシリボヌクレオチド含有ポリヌクレオチドおよびガイドを製造する方法および使用する方法、ならびに核タンパク質複合体を製造する方法および使用する方法である。同様に開示されているのは、ＣＡＲ発現細胞を製造するためにＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して細胞を操作する方法；および適応細胞療法でのそのようなＣＡＲ発現細胞の使用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＲＩＳＰＲガイド分子であって、
標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域と、
リボヌクレオチドの代わりに少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含むＲＮＡ配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵを含む活性化領域であって、Ｃａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能である活性化領域と
を含むＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項2】

活性化領域中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項3】

活性化領域中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１０箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項4】

イノシン、デオキシイノシン、デオキシウラシル、キサントシン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチル イソ－デオキシシトシン、イソ デオキシグアノシン、デオキシウリジン、イソ－デオキシシチジン、および脱塩基部位を含む塩基改変、ならびにホスホロチオエート改変を含む骨格改変からなる群から選択される１つまたはそれ以上の化学的改変を含む、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項5】

ターゲティング領域は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的としており、かつＲＮＡ配列ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含み、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項6】

ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項7】

ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項8】

ターゲティング領域は、配列番号５１～１３３から選択される配列にハイブリダイズし得る、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項9】

配列番号２１２～２３１、２７５～３１５、および３３１～３５０から選択される配列を含む、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項10】

配列番号４１６の配列を含む、請求項５に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項11】

ターゲティング領域は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的としており、かつＲＮＡ配列ＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含み、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項12】

ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項13】

ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項14】

ターゲティング領域は、配列番号１５～２０から選択される配列にハイブリダイズし得る、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項15】

配列番号２３３～２５２、３１７～３２９、４９１～４９２、および５０８から選択される配列を含む、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項16】

化学的改変をさらに含み、配列番号５１２～５１７から選択される配列を含む、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項17】

配列番号４１５の配列を含む、請求項１１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項18】

ターゲティング領域は、ＣＩＳＨ遺伝子を標的としており、かつ配列番号１５７～１６５から選択される配列にハイブリダイズし得る、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項19】

配列番号５０９および５１９～５２９から選択される配列を含む、請求項１８に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項20】

ターゲティング領域は、ＰＤＣＤ１遺伝子を標的としており、かつ配列番号１３５～１５５から選択される配列にハイブリダイズし得る、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項21】

ターゲティング領域は、ＣＢＬＢ遺伝子を標的としており、かつ配列番号１６７～１８９から選択される配列にハイブリダイズし得る、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項22】

配列番号５１０の配列を含む、請求項２１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【請求項23】

ＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物であって、
請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子と、
Ｃａｓ１２タンパク質と
を含むＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【請求項24】

Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、リンカー、および配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有配列を含むＣａｓ１２タンパク質である、請求項２３に記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【請求項25】

請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物を含む細胞であって、リンパ球、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－マクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ細胞から分化した細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞である細胞。

【請求項26】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞を製造する方法であって、
ａ）細胞中におけるＴＲＡＣ配列を含む第１の標的核酸と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第１の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域、およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第１の標的核酸配列を切断し得ること；
ｂ）同一の細胞中におけるＢ２Ｍ配列を含む第２の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第２の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域、およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第２の標的核酸配列を切断し得ること；
ｃ）ｓｃＦｖ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および活性化ドメインを含むＣＡＲをコードする第１のドナーポリヌクレオチドを準備することであって、ＣＡＲは、第１の標的核酸配列中の切断部位に挿入され得ること；
ｄ）Ｂ２Ｍ分泌シグナル、ＨＬＡ－Ｇペプチドシグナル配列、第１のリンカー配列、Ｂ２Ｍ配列、第２のリンカー配列、およびＨＬＡ－Ｅ配列を含むＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物をコードする第２のドナーポリヌクレオチドを準備することであって、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物は、第２の標的核酸配列中の切断部位に挿入され得ること；
ｅ）第１の標的核酸配列を切断し、切断部位に第１のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を挿入すること；および
ｆ）第２の標的核酸配列を切断し、切断部位に第２のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を挿入すること
を含む方法。

【請求項27】

第２のドナーポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物の５’末端においてＰ２Ａ配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

第１のドナーポリヌクレオチドは、配列番号４１３を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

第２のドナーポリヌクレオチドは、配列番号４１４を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

ＣＡＲ中のｓｃＦｖは、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ４、ＣＳ１、ＰＤ－Ｌ１、ＮＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＰＳＣＡ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＡＣＩ、ＶＥＧＦＲ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ３７１、ＣＥＡ、クローディン１８．１、クローディン１８．２、ＣＳＰＧ４、ＥＦＧＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、上皮増殖因子受容体、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＡＰ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＩＬ１３受容体アルファ、ルイスＹ／ＬｅＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＤ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ７２、ＵＬＢＰおよびＭＩＣＡ／Ｂタンパク質、ＶＥＧＦ２、ならびにＷＴ１からなる群から選択される細胞標的に結合し得る、請求項２６に記載の方法。

【請求項31】

ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合し得、かつ配列番号４７４のアミノ酸配列を含む第１の可変領域、配列番号４７５のアミノ酸配列を含む第２の可変領域、および配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、第１の可変領域と第２の可変領域との間のリンカーを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項32】

ｓｃＦｖは、配列番号４７７のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項33】

ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲに由来する、請求項２６に記載の方法。

【請求項34】

ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、またはＤＡＰ１０に由来する、請求項２６に記載の方法。

【請求項35】

ＣＡＲは、ＣＤ８、４－ＩＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ活性化ドメインに由来する膜貫通ドメインを含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項36】

ＣＡＲ配列を含むベクターは、配列番号４７８の核酸配列を有するリーダー配列を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項37】

触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、リンカー、および配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有配列を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項38】

ａ．同一の細胞中における第３の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第３の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域；およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第３のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第３の標的核酸配列を切断し得ること；
ｂ．第３の標的核酸配列を切断し、切断部位で第３の標的核酸配列から１つまたはそれ以上のヌクレオチドを欠失させることであって、第３の標的核酸配列は、ＰＤＣＤ遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、およびＣＢＬＢ遺伝子から選択されること
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項39】

ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞リンパ球から産生された同種ＣＡＲ－Ｔ細胞または自己ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項40】

リンパ球、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＩＬ、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－Ｍ、ｉＰＳＣ細胞、ｉＰＳＣ細胞から分化した細胞、ＮＫ細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される、請求項２６に記載の方法により製造されたＣＡＲ発現細胞。

【請求項41】

適応細胞療法の方法であって、それを必要とする対象に、請求項４０に記載のＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法。

【請求項42】

適応細胞療法は、ＢＣＭＡ陽性がん細胞を死滅させることを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

ＢＣＭＡ陽性がん細胞は、多発性骨髄腫がん細胞を含む、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、全て、参照によって本明細書に組み入れる、２０２１年８月５日に出願された米国仮出願第３／２２９，８７０号、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮出願第６３／１２７，６４８号、および２０２０年１０月１９日に出願された米国仮出願第６３／０９３，４５９号に対する優先権を主張する。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
該当なし

【0003】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。前記ＡＳＣＩＩコピー（２０２１年１０月１５日に作成）は、名称がＣＢＩ０３９．３０＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが１６５キロバイトである。

【0004】

本開示は、概して、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系に関する。具体的には、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２系での使用のためのＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびガイドであって、リボヌクレオチド塩基と、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基とを含むように設計されているＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドおよびガイドに関する。本開示は、さらに、設計されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２ガイドおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２タンパク質を含むＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体と、そのようなＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体を使用する改変細胞の製造とに関する。本開示は、さらに、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド、Ｃａｓ１２ガイド、およびＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体を含む組成物、ならびにこれらを製造する方法および使用する方法に関する。さらになお、本開示は、例えば、がんの処置のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の生成における、本開示のＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体を使用して改変された細胞の製造および治療的使用に関する。

【背景技術】

【0005】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質系は、多くの原核生物（細菌および古細菌）のゲノムで見出されている。これらの系は、原核生物において外来侵入者（例えば、ウイルス、バクテリオファージ）に対する適応免疫を提供する。このようにして、ＣＲＩＳＰＲ系は一種の免疫系として機能し、原核生物を外来侵入者から防御するのに役立つ。例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照されたい。

【0006】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫系には、下記の３つの主な段階が存在している：（１）獲得、（２）発現、および（３）干渉。獲得は、侵入するウイルスおよびプラスミドのゲノムを切断すること、ならびにゲノムＤＮＡのセグメント（プロトスペーサーと呼ばれる）を宿主生物のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことを含む。宿主ゲノムに組み込まれるセグメントは、スペーサーとして既知であり、同一の（または十分に関連した）ウイルスまたはプラスミドによるその後の攻撃からの保護を媒介する。発現は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写と、それぞれ単一のスペーサー配列を含む短い成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを生成するためのその後の酵素プロセシングとを含む。干渉は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡがＣａｓタンパク質と会合してエフェクター複合体が形成された後に誘発されており、次いで、外来遺伝子要素中の相補的プロトスペーサーを標的にして核酸分解を誘発する。

【0007】

様々なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、それらの天然宿主中で、ＤＮＡターゲティング（クラス１ Ｉ型；クラス２ ＩＩおよびＶ型）、ＲＮＡターゲティング（クラス２ ＶＩ型）、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡが合わさったターゲティング（クラス１ ＩＩＩ型）が可能である。例えば、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、および非特許文献１１を参照されたい。

【0008】

Ｖ型系は、いくつかの異なるサブタイプ（例えば、Ｖ－Ａ、Ｖ－Ｂ、Ｖ－Ｃ、Ｖ－Ｄ、Ｖ－Ｅ、Ｖ－Ｆ、Ｖ－Ｇ、Ｖ－Ｈ、Ｖ－Ｉ、Ｖ－Ｊ、Ｖ－Ｋ、およびＶ－Ｕを含む）に分類される。例えば、非特許文献７および非特許文献１２を参照されたい。Ｖ－Ａサブタイプは、Ｃａｓ１２ａタンパク質（以前はＣｐｆ１として知られている）をコードする。Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９タンパク質のそれぞれのドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有しているが、Ｃａｓ９タンパク質中に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いている。

【0009】

Ｖ型系は、下記が挙げられるいくつかの細菌で同定されている：パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ３ Ｃｐｆ１）、ブチリビブリオ・プロテオクラスティカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）（ＢｐＣｐｆ１）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、アイダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ポルホロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）（ＰｍＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウムＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、ポルホロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）（ＰｃＣｐｆ１）、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）（ＰｄＣｐｆ１）、モラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、スミセラ属種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）（ＬｉＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウムＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、フランシスセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１），カンジダタス・メタノプラスマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）（ＣＭｔＣｐｆ１）、およびユーバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）（ＥｅＣｐｆ１）。

【0010】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、特定の核酸配列を欠失させるか、挿入するか、変異させるか、または置換することによる部位特異的ゲノム編集の強力なツールを提供する。これらの変更は、遺伝子特異的であるかまたは場所特異的であり得る。ゲノム編集は、Ｃａｓタンパク質およびそのコグネートポリヌクレオチド等の部位特異的ヌクレアーゼを使用して標的核酸を切断し得、それにより変更部位が生成される。ある特定の場合では、この切断により、標的ＤＮＡ配列中に二本鎖切断（ＤＳＢ）が導入される。ＤＳＢは、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、または相同性依存的修復（ＨＤＲ）により修復される。ＨＤＲは、修復のためのテンプレートの存在に依存する。このゲノム編集の一部の例では、ドナーポリヌクレオチドまたはその一部を、切れ目に挿入し得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｂａｒｒａｎｇｏｕ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７、３１５：１７０９～１７１２頁）

【非特許文献2】Ｍａｋａｒｏｖａ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１９：４６７～４７７頁）

【非特許文献3】Ｇａｒｎｅａｕ他（Ｎａｔｕｒｅ、２０１０、４６８：６７～７１頁）

【非特許文献4】Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１、３９：９２７５～９２８２頁）

【非特許文献5】Ｋｏｏｎｉｎ他（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１７、３７：６７～７８頁）

【非特許文献6】Ｓｈｍａｋｏｖ他（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１７、１５（３）：１６９～１８２頁）

【非特許文献7】Ｍａｋａｒｏｖａ他（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０２０、１８：６７～８３頁）

【非特許文献8】Ｍａｋａｒｏｖａ他（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１５、１３：７２２～７３６頁）

【非特許文献9】Ｓｈｍａｋｏｖ他（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０１７，１５：１６９～１８２頁）

【非特許文献10】Ａｂｕｄａｙｙｅｈ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６、３５３：１～１７頁）

【非特許文献11】Ｍａｋａｒｏｖａ他（Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１８，１：３２５～３３６頁）

【非特許文献12】Ｐａｕｓｃｈ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０２０、３６９（６５０１）：３３３～３３７頁）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本開示は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系での使用のための新規のポリヌクレオチドおよびガイドの発見に基づくものであり、このポリヌクレオチドおよびガイドは、リボヌクレオチド塩基と、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基とを含む。本開示のガイドは、Ｃａｓ１２ａ等のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質と複合体化した場合には、頑強なオンターゲット編集と、低いオフターゲットゲノム編集とが可能である。

【0013】

このゲノム編集プロセスは、治療用途で有用な遺伝子改変細胞の作成に特に有用である。例えば、このゲノム編集プロセスにより、免疫細胞（例えばＴ細胞）を、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変し得る。そのようなＣＡＲ発現細胞は、例えば養子免疫治療で有用であり、この治療では、Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）等のＣＡＲ発現免疫細胞を患者に注入して、ＣＡＲにより認識される標的抗原（例えば、外来抗原、またはがん関連抗原）を発現する細胞を標的とし得る。

【0014】

本開示の非限定的な実施例は、下記の通りである。

【0015】

［１］ＣＲＩＳＰＲガイド分子であって、標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域と、Ｃａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域とを含み、リボヌクレオチド塩基と、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基とを含むＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0016】

［２］活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0017】

［３］イノシン、デオキシイノシン、デオキシウラシル、キサントシン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチル イソ－デオキシシトシン、イソ デオキシグアノシン、デオキシウリジン、およびイソ デオキシシチジンからなる群から選択される１つまたはそれ以上の塩基類似体をさらに含む、［１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0018】

［４］１つまたはそれ以上の脱塩基部位をさらに含む、［１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0019】

［５］ＲＮＡ配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含むＣＲＩＳＰＲガイド分子であって、配列中の塩基の少なくとも１つは、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基に置き換えられており、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩機部位に置き換えられている、ＣＲＩＳＰＲガイド分子；およびＲＮＡ配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含むＣＲＩＳＰＲガイド分子であって、配列中の塩基の少なくとも１つは、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基に置き換えられており、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩機部位に置き換えられている、ＣＲＩＳＰＲガイド分子から選択される、［１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0020】

［６］ＣＲＩＳＰＲガイド分子中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、ＣＲＩＳＰＲガイド分子の全サイズの割合として、５０％以下である、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0021】

［７］ＣＲＩＳＰＲガイド分子中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、ガイド分子の全サイズの割合として、２５％以下である、［６］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0022】

［８］ターゲティング領域中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、ターゲティング領域の全サイズの割合として、２５％以下である、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0023】

［９］ターゲティング領域中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、ターゲティング領域の全サイズの割合として、５％以下である、［８］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0024】

［１０］活性化領域中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、活性化領域の全サイズの割合として、５０％以下である、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0025】

［１１］活性化領域中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、活性化領域の全サイズの割合として、２５％以下である、［１０］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0026】

［１２］標的核酸配列に結合し、Ｃａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成し得、ＲＮＡのみのＣＲＩＳＰＲガイド分子と比較してオフターゲット活性が低い、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0027】

［１３］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0028】

［１４］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０位のうちの１５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１３］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0029】

［１５］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０位のうちの１２箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１４］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0030】

［１６］ＲＮＡ配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵを含む活性化領域であって、配列中の塩基の少なくとも１つは、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基に置き換えられており、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている、活性化領域を含む、［２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0031】

［１７］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１６］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0032】

［１８］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１０箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１７］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0033】

［１９］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの８箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［１８］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0034】

［２０］ＲＮＡ配列ＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含むターゲティング領域であって、配列中の塩基の少なくとも１つは、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基に置き換えられており、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている、ターゲティング領域を含む、［２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0035】

［２１］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２０］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0036】

［２２］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0037】

［２３］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの３箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0038】

［２４］ＲＮＡ配列ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含むターゲティング領域であって、配列中の塩基の少なくとも１つは、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基に置き換えられており、場合により、配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている、ターゲティング領域を含む、［２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0039】

［２５］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２４］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0040】

［２６］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0041】

［２７］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの３箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２６］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0042】

［２８］配列ＴＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＴＧＵＡＧＡＵＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含み、配列中の２、４、５、６、８、９、１１、１３、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９位は、リボヌクレオチド塩基を含み、かつ配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１９、２１、３１、および４０位は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0043】

［２９］配列ＴＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＴＧＵＡＧＡＵＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＴを含み、配列中の２、４、５、６、８、９、１１、１３、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９位は、リボヌクレオチド塩基を含み、かつ配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１９、２１、３１、および４０位は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［５］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0044】

［３０］活性化領域は、２０塩基長であり、２０個のヌクレオチドの活性化領域配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0045】

［３１］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１０箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［３０］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0046】

［３２］配列中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの８箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［３１］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0047】

［３３］ターゲティング領域は、２０塩基長であり、２０個のヌクレオチドのターゲティング領域配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［２］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0048】

［３４］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの５箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［３３］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0049】

［３５］配列中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの３箇所以下は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む、［３４］に記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子。

【0050】

［３６］ＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物であって、［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子と、Ｃａｓ１２タンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【0051】

［３７］ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、Ｃａｓ１２タンパク質との複合体で存在している、［３６］に記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【0052】

［３８］Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質である、［３６］に記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【0053】

［３９］Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リンカーおよびＮＬＳ含有配列を含む、［３６］～［３８］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【0054】

［４０］リンカーおよびＮＬＳ含有配列は、配列番号４８３、４８５、４８７、および４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［３９］に記載のＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物。

【0055】

［４１］細胞であって、［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む細胞。

【0056】

［４２］Ｃａｓ１２タンパク質をさらに含む、［４１］に記載の細胞。

【0057】

［４３］Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質である、［４２］に記載の細胞。

【0058】

［４４］Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リンカーおよびＮＬＳ含有配列を含む、［４２］または［４３］に記載の細胞。

【0059】

［４５］リンカーおよびＮＬＳ含有配列は、配列番号４８３、４８５、４８７、および４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［４４］に記載の細胞。

【0060】

［４６］ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、Ｃａｓ１２タンパク質との複合体で存在している、［４２］～［４５］のいずれか１つに記載の細胞。

【0061】

［４７］原核細胞または真核細胞である、［４１］～［４６］のいずれか１つに記載の細胞。

【0062】

［４８］単細胞真核生物、真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞、藻細胞、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞、脊椎動物由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、幹細胞、および前駆細胞からなる群から選択される真核細胞である、［４７］に記載の細胞。

【0063】

［４９］リンパ球、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－マクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞である、［４８］に記載の細胞。

【0064】

［５０］ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［４９］に記載の細胞。

【0065】

［５１］ドナーポリヌクレオチドをさらに含む［４１］～［５０］のいずれか１つに記載の細胞。

【0066】

［５２］標的核酸配列を切断する方法であって、第１の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、および第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子は、［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含み、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子のターゲティング領域は、第１の標的核酸配列にハイブリダイズし得、核タンパク質複合体は、第１の標的核酸配列を切断し得ることを含む方法。

【0067】

［５３］ドナーポリヌクレオチドを準備することをさらに含む［５２］に記載の方法。

【0068】

［５４］標的核酸配列を切断して切断部位を得、標的核酸配列を改変することをさらに含む、［５３］に記載の方法。

【0069】

［５５］改変することは、切断部位でドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を挿入することを含む、［５４］に記載の方法。

【0070】

［５６］改変することは、切断部位で１つまたはそれ以上のヌクレオチドを欠失させることを含む、［５４］に記載の方法。

【0071】

［５７］標的細胞配列は、細胞中に存在している、［５５］に記載の方法。

【0072】

［５８］細胞は、真核細胞を含む、［５７］に記載の方法。

【0073】

［５９］ドナーポリヌクレオチドは、ＣＡＲ発現ベクターを含む、［５８］に記載の方法。

【0074】

［６０］ウイルスベクターを使用して、細胞にＣＡＲ発現ベクターを導入することをさらに含む［５９］に記載の方法。

【0075】

［６１］前記導入することは、形質導入を含む、［６０］に記載の方法。

【0076】

［６２］得られた細胞は、リンパ球、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＩＬ、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－Ｍ、ＮＫ細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む、［５７］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。

【0077】

［６３］第１の標的核酸配列は、ＴＲＡＣ；ＴＲＢＶ；ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡ－４；ＬＡＧ－３；ＴＩＧＩＴ；ＴＩＭ３；ＨＬＡ－Ｅ；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－Ｂ；ＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＡＤＡＭ１７；ＢＴＬＡ；ＣＤ１６０；ＳＩＧＬＥＣ１０；２Ｂ４；ＬＡＩＲ１；ＣＤ５２；ＣＤ９６；ＶＳＩＲ；ＶＩＳＴＡ；ＫＩＲ２ＤＬ１；ＫＩＲ２ＤＬ２；ＫＩＲ２ＤＬ３；ＣＥＡＣＡＭ１；ＣＢＬＢ；ＣＩＳＨ；ＩＬ－１Ｒ８；ＡＨＲ；アデノシン２Ａ受容体；ＧＭＣＳＦ；ＶＩＳＴＡ；ＣＩＩ２Ａ；およびＮＫＧ２Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする標的遺伝子内に存在している、［５２］～［６２］のいずれか１つに記載の方法。

【0078】

［６４］ＣＡＲ発現ベクターは、細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲをコードする、［５９］～［６１］のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

［６５］ＣＡＲ発現ベクターは、ヒンジ領域、膜貫通領域、および１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達領域をさらにコードする、［６４］に記載の方法。

【0080】

［６６］細胞外リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、［６４］または「６５］に記載の方法。

【0081】

［６７］ｓｃＦｖは、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ４、ＣＳ１、ＰＤ－Ｌ１、ＮＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＰＳＣＡ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＡＣＩ、ＶＥＧＦＲ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ－細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ３７１、ＣＥＡ、クローディン１８．１、クローディン１８．２、ＣＳＰＧ４、ＥＦＧＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、上皮増殖因子受容体、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＡＰ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＩＬ１３受容体アルファ、ルイスＹ／ＬｅＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＤ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ７２、ＵＬＢＰおよびＭＩＣＡ／Ｂタンパク質、ＶＥＧＦ２、ならびにＷＴ１からなる群から選択される細胞標的に結合し得る、［６６］に記載の方法。

【0082】

［６８］ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ３７１、ＲＯＲ－１、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１６、グリピカン３、ＰＳＣＡ、およびクローディン１８．２からなる群から選択される細胞標的に結合し得る、［６７］に記載の方法。

【0083】

［６９］ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合し得る、［６８］に記載の方法。

【0084】

［７０］ｓｃＦｖは、ＣＤ３７１に結合し得る、［６８］に記載の方法。

【0085】

［７１］細胞中の第２の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質および第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子は、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子とは異なる標的核酸配列に結合し得る［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＳＩＰＲガイド分子を含み、第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子のターゲティング領域は、第２の標的核酸配列にハイブリダイズし得、核タンパク質複合体は、第２の標的核酸配列を切断し得ることをさらに含む、［５７］～［６２］および［６４］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。

【0086】

［７２］前記第１および第２の標的核酸配列は、それぞれ独立して、ＴＲＡＣ；ＴＲＢＶタンパク質；ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＣＴＬＡ－４；ＬＡＧ－３；ＴＩＧＩＴ；ＴＩＭ３；ＨＬＡ－Ｅ；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－Ｂ；ＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＡＤＡＭ１７；ＢＴＬＡ；ＣＤ１６０；ＳＩＧＬＥＣ１０；２Ｂ４；ＬＡＩＲ１；ＣＤ５２；ＣＤ９６；ＶＳＩＲ；ＶＩＳＴＡ；ＫＩＲ２ＤＬ１；ＫＩＲ２ＤＬ２；ＫＩＲ２ＤＬ３；ＣＥＡＣＡＭ１；ＣＢＬＢ；ＣＩＳＨ；ＩＬ－１Ｒ８；ＡＨＲ；アデノシン２Ａ受容体；ＧＭＣＳＦ；ＶＩＳＴＡ；ＣＩＩ２Ａ；およびＮＫＧ２Ａからなる群から選択されるタンパク質をコードする標的遺伝子内に存在している、［７１］に記載の方法。

【0087】

［７３］ドナーポリヌクレオチドは、ＣＡＲ発現ベクターを含み、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインを含み、細胞外リガンド結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む、［７１］または［７２］に記載の方法。

【0088】

［７４］ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合し得る、［７３］に記載の方法。

【0089】

［７５］ｓｃＦｖは、ＣＤ３７１に結合し得る、［７３］に記載の方法。

【0090】

［７６］前記第１の標的核酸配列は、ＴＲＡＣタンパク質をコードする遺伝子内に存在しており、第２の標的核酸配列は、ＰＤ１タンパク質をコードする遺伝子内に存在している、［７２］に記載の方法。

【0091】

［７７］前記第１の標的核酸配列は、ＴＲＡＣタンパク質をコードする遺伝子内に存在しており、前記第２の標的核酸配列は、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子内に存在している、［７２］に記載の方法。

【0092】

［７８］細胞に、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物を含む第２のドナーポリヌクレオチドを提供することであって、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物を含む第２のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部は、第２の標的核酸配列の切断部位で挿入されており、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物は、Ｎ末端からＣ末端へと、Ｂ２Ｍ分泌シグナル、ＨＬＡ－Ｇペプチドシグナル配列、第１のリンカー配列、Ｂ２Ｍ配列、第２のリンカー配列、およびＨＬＡ－Ｅ配列を含む融合タンパク質をコードすることをさらに含む［７７］に記載の方法。

【0093】

［７９］抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、［６９］または［７４］に記載の方法。

【0094】

［８０］ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間にリンカーをさらに含む、［７９］に記載の方法。

【0095】

［８１］リンカーは、配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、［８０］に記載の方法。

【0096】

［８２］前記ｓｃＦｖは、配列番号４７７のアミノ酸配列を含む、［８１］に記載の方法。

【0097】

［８３］ＣＡＲは、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；および活性化ドメインを含む、［６４］または［７３］に記載の方法。

【0098】

［８４］膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲに由来する膜貫通ドメインである、［８３］に記載の方法。

【0099】

［８５］膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含む、［８４］に記載の方法。

【0100】

［８６］共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、またはＤＡＰ１０に由来する共刺激ドメインである、［８３］に記載の方法。

【0101】

［８７］共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、［８６］に記載の方法。

【0102】

［８８］活性化ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、［８３］に記載の方法。

【0103】

［８９］膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含み、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、活性化ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、［８３］に記載の方法。

【0104】

［９０］ＶＨは、配列番号４７４のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４７５のアミノ酸配列を含む、［８３］に記載の方法。

【0105】

［９１］前記ＣＡＲ発現ベクター中のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、５’末端においてリーダー配列を有する、［５９］～［６２］、［６４］～［７０］、［７３］～［７５］、および［７８］～［９０］のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

［９２］リーダー配列は、配列番号４７８の核酸配列を含む、［９１］に記載の方法。

【0107】

［９３］ＣＡＲ発現ベクターは、プロモーターを含む、［９１］に記載の方法。

【0108】

［９４］プロモーターは、ＭＮＤプロモーターを含む、［９３］に記載の方法。

【0109】

［９５］Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リンカーおよびＮＬＳ含有配列を含む、［５２］～［９４］のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

［９６］リンカーおよびＮＬＳ含有配列は、配列番号４８３、４８５、４８７、および４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［９５］に記載の方法。

【0111】

［９７］［５７］～［９６］のいずれか１つに記載の方法により製造された細胞。

【0112】

［９８］［５９］～［９６］のいずれか１つに記載の方法により製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞。

【0113】

［９９］同種ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［９８］に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【0114】

［１００］自己ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［９８］に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。

【0115】

［１０１］ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法であって、細胞としてＴリンパ球を使用して、［５９］～［９６］のいずれか１つに記載の方法を実施することを含む方法。

【0116】

［１０２］養子細胞療法の方法であって、それを必要とする対象に、［５７］～［９６］のいずれか１つに記載の方法により製造された細胞を投与することを含む方法。

【0117】

［１０３］養子細胞療法の方法であって、それを必要とする対象に、［５９］～［９６］のいずれか１つに記載の方法により製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含む方法。

【0118】

［１０４］ＢＣＭＡ陽性がん細胞を死滅させる方法であって、ＢＣＭＡ陽性がん細胞と、［６９］、［７４］、および［９０］のいずれか１つに記載の方法により製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞とを接触させることを含む方法。

【0119】

［１０５］ＢＣＭＡ陽性がん細胞は、多発性骨髄腫がん細胞を含む、［１０４］に記載の方法。

【0120】

［１０６］多発性骨髄腫がん細胞は、ヒト細胞を含む、［１０５］に記載の方法。

【0121】

［１０７］接触させることは、腫瘍内である、［１０４］に記載の方法。

【0122】

［１０８］ＣＡＲ発現細胞を製造する方法であって、細胞中の第１の標的核酸と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質および第１のＣＲＳＩＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子は、［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含み、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子のターゲティング領域は、第１の標的核酸配列にハイブリダイズし得、核タンパク質複合体は、第１の標的核酸配列を切断し得ること；同一細胞中の第２の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質および第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子は、第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子とは異なる標的核酸配列に結合し得る［１］～［３５］のいずれか１つに記載のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含み、第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子のターゲティング領域は、第２の標的核酸配列にハイブリダイズし得、核タンパク質複合体は、第２の標的核酸配列を切断し得ること；および前記細胞に、ＣＡＲ発現ベクターを含むドナーポリヌクレオチドを提供することであって、前記ＣＡＲ発現ベクターを含むドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部は、前記第１の標的核酸配列中の切断部位で挿入さ得、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインを含むことを含む方法。

【0123】

［１０９］ＣＡＲ発現ベクターを含むドナーポリヌクレオチドを、ウイルスベクターを使用して細胞に導入する、［１０８］に記載の方法。

【0124】

［１１０］ＣＡＲ発現ベクターは、ヒンジ領域、膜貫通領域、および１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達領域をさらにコードする、［１０８］に記載の方法。

【0125】

［１１１］前記第１の標的核酸配列は、ＴＲＡＣタンパク質をコードする遺伝子内に存在しており、前記第２の標的核酸配列は、ＰＤ１タンパク質をコードする遺伝子内に存在している、［１０８］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。

【0126】

［１１２］前記第１の標的核酸配列は、ＴＲＡＣタンパク質をコードする遺伝子内に存在しており、前記第２の標的核酸配列は、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子内に存在している、［１０８］～［１１０］のいずれか１つに記載の方法。

【0127】

［１１３］細胞外リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、［１０８］～［１１２］のいずれか１つに記載の方法。

【0128】

［１１４］ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合し得る、［１１３］に記載の方法。

【0129】

［１１５］ｓｃＦｖは、ＣＤ３７１に結合し得る、［１１３］に記載の方法。

【0130】

［１１６］抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号４７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、［１１４］に記載の方法。

【0131】

［１１７］ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間にリンカーをさらに含む、［１１６］に記載の方法。

【0132】

［１１８］リンカーは、配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、［１１７］に記載の方法。

【0133】

［１１９］前記ｓｃＦｖは、配列番号４７７のアミノ酸配列を含む、［１１４］に記載の方法。

【0134】

［１２０］前記細胞に、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物を含む第２のドナーポリヌクレオチドを提供することであって、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物を含む第２のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部は、第２の標的核酸配列の切断部位で挿入され得、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物は、Ｎ末端からＣ末端へと、Ｂ２Ｍ分泌シグナル、ＨＬＡ－Ｇペプチドシグナル配列、第１のリンカー配列、Ｂ２Ｍ配列、第２のリンカー配列、およびＨＬＡ－Ｅ配列を含む融合タンパク質をコードすることをさらに含む［１０８］～［１１９］のいずれか１つに記載の方法。

【0135】

［１２１］ＣＡＲは、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；および活性化ドメインを含む、［１０８］～［１２０］のいずれか１つに記載の方法。

【0136】

［１２２］膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲに由来する膜貫通ドメインを含む、［１２１］に記載の方法。

【0137】

［１２３］膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含む、［１２２］に記載の方法。

【0138】

［１２４］共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、またはＤＡＰ１０に由来する共刺激ドメインを含む、［１２１］に記載の方法。

【0139】

［１２５］共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、［１２４］に記載の方法。

【0140】

［１２６］活性化ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、［１２１］に記載の方法。

【0141】

［１２７］膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含み、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、活性化ドメインは、ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む、［１２１］に記載の方法。

【0142】

［１２８］ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［１０８］～［１２７］のいずれか１つに記載の方法。

【0143】

［１２９］ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［１２８］に記載の方法。

【0144】

［１３０］ＣＡＴ－Ｔ細胞は、自己ＣＡＲ－Ｔ細胞である、［１２８］に記載の方法。

【0145】

［１３１］第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子と複合体化したＣａｓ１２タンパク質、および／または第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子と複合体化したＣａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、リンカーおよびＮＬＳ含有配列を含む、［１０８］～［１３０］のいずれか１つに記載の方法。

【0146】

［１３２］第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子と複合体化したＣａｓ１２タンパク質、および／または第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子と複合体化したＣａｓ１２タンパク質は、配列番号４８３、４８５、４８７、および４８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［１３１］に記載の方法。

【0147】

［１３３］第２のドナーポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物のＮ末端において、Ｐ２Ａ配列をさらに含む、［７８］に記載の方法。

【0148】

［１３４］第２のドナーポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物配列のＮ末端において、Ｐ２Ａ配列をさらに含む、［１２０］に記載の方法。

【0149】

一部の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲガイド分子であって、標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域と、リボヌクレオチドの代わりに少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含むＲＮＡ配列ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵを含む活性化領域とを含み、活性化領域は、Ｃａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成し得る、ＣＲＩＳＰＲガイド分子である。一部の実施形態では、活性化領域中の１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１箇所またはそれ以上（例えば１０箇所以下）は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、この分子は、イノシン、デオキシイノシン、デオキシウラシル、キサントシン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチル イソ－デオキシシトシン、イソ デオキシグアノシン、デオキシウリジン、イソ－デオキシシチジン、および脱塩基部位を含む塩基改変、ならびにホスホロチオエート改変を含む骨格改変からなる群から選択される１つまたはそれ以上の化学的改変を含む。

【0150】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドのターゲティング領域は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的としており、かつＲＮＡ配列ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含み、場合により、この配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上（例えば５箇所以下）は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、配列番号５１～１３３から選択される配列にハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、配列番号２１２～２３１、２７５～３１５、および３３１～３５０から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、配列番号４１６の配列を含む。

【0151】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドのターゲティング領域は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的としており、かつＲＮＡ配列ＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含み、場合により、この配列中の塩基の少なくとも１つは、塩基類似体または脱塩基部位に置き換えられている。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上（例えば５箇所以下）は、デオキシリボヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、配列番号１５～２０から選択される配列にハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、配列番号２３３～２５２、３１７～３２９、４９１～４９２、および５０８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、化学的改変をさらに含み、かつ配列番号５１２～５１７から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、配列番号４１５の配列を含む。

【0152】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、ＣＩＳＨ遺伝子を標的としており、かつ配列番号１５７～１６５から選択される配列にハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、配列番号５０９および５１９～５２９から選択される配列を含む。

【0153】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、ＰＤＣＤ１遺伝子を標的としており、かつ配列番号１３５～１５５から選択される配列にハイブリダイズし得る。

【0154】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、ＣＢＬＢ遺伝子を標的としており、かつ配列番号１６７～１８９から選択される配列にハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドは、配列番号５１０の配列を含む。

【0155】

一部の実施形態では、本発明は、上記で説明されているＣＲＩＳＰＲガイド分子と、Ｃａｓ１２タンパク質とを含むＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質であって、Ｃ末端において、リンカー、および配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有配列を含むＣａｓ１２ａタンパク質である。

【0156】

一部の実施形態では、本発明は、上記で説明されているＣＲＩＳＰＲ核酸／タンパク質組成物を含む細胞であって、リンパ球、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－マクロファージ（ＣＡＲ－Ｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ細胞から分化した細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞である細胞である。

【0157】

一部の実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞を製造する方法であって、細胞中におけるＴＲＡＣ配列を含む第１の標的核酸と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第１の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域；およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第１のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第１の標的核酸配列を切断し得ること；同一の細胞中におけるＢ２Ｍ配列を含む第２の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第２の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域、およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第２のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第２の標的核酸配列を切断し得ること；ｓｃＦｖ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および活性化ドメインを含むＣＡＲをコードする第１のドナーポリヌクレオチドを準備することであって、ＣＡＲは、第１の標的核酸配列中の切断部位に挿入され得ること；Ｂ２Ｍ分泌シグナル、ＨＬＡ－Ｇペプチドシグナル配列、第１のリンカー配列、Ｂ２Ｍ配列、第２のリンカー配列、およびＨＬＡ－Ｅ配列を含むＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物をコードする第２のドナーポリヌクレオチドを準備することであって、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物は、第２の標的核酸配列中の切断部位に挿入され得ること；第１の標的核酸配列を切断し、切断部位に第１のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を挿入すること；および第２の標的核酸配列を切断し、切断部位に第２のドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部を挿入することを含む方法である。一部の実施形態では、第２のドナーポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物の５’末端においてＰ２Ａ配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のドナーポリヌクレオチドは、配列番号４１３を含む。一部の実施形態では、第２のドナーポリヌクレオチドは、配列番号４１４を含む。

【0158】

一部の実施形態では、ＣＡＲ中のｓｃＦｖは、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ４、ＣＳ１、ＰＤ－Ｌ１、ＮＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＰＳＣＡ、ＣＤ７９Ｂ、ＴＡＣＩ、ＶＥＧＦＲ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ－細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ３７１、ＣＥＡ、クローディン１８．１、クローディン１８．２、ＣＳＰＧ４、ＥＦＧＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、上皮増殖因子受容体、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＡＰ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン３、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、ＩＬ１３受容体アルファ、ルイスＹ／ＬｅＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＤ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ－１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ７２、ＵＬＢＰおよびＭＩＣＡ／Ｂタンパク質、ＶＥＧＦ２、ならびにＷＴ１からなる群から選択される細胞標的に結合し得る。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合し得、配列番号４７４のアミノ酸配列を含む第１の可変領域、配列番号４７５のアミノ酸配列を含む第２の可変領域、および配列番号４７６のアミノ酸配列を含む、第１の可変領域と第２の可変領域との間のリンカーを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦは、配列番号４７７のアミノ酸配列を含む。

【0159】

一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲに由来する。一部の実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、またはＤＡＰ １０に由来する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ活性化ドメインに由来する膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲ配列を含むベクターは、配列番号４７８の核酸配列を有するリーダー配列を含む。

【0160】

一部の実施形態では、本方法で使用される触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質は、Ｃ末端において、リンカー、および配列番号４７９～４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）含有配列を含む。

【0161】

一部の実施形態では、本方法は、同一の細胞中における第３の標的核酸配列と、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、ならびに第３の標的核酸配列に結合可能なターゲティング領域、およびＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成可能な活性化領域を有する第３のＣＲＩＳＰＲガイド分子を含む核タンパク質複合体とを接触させることであって、前記ＣＲＩＳＰＲガイド分子は、活性化領域、ターゲティング領域、または両方中に、リボヌクレオチド塩基、および少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、核タンパク質複合体は、第３の標的核酸配列を切断し得ること；第３の標的核酸配列を切断し、切断部位で第３の標的核酸配列から１つまたはそれ以上のヌクレオチドを欠失させることであって、第３の標的核酸配列は、ＰＤＣＤ遺伝子ｋＣＩＳＨ遺伝子、およびＣＢＬＢ遺伝子から選択されることを含む。

【0162】

一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞リンパ球から産生された同種ＣＡＲ－Ｔ細胞または自己ＣＡＲ－Ｔ細胞である。

【0163】

一部の実施形態では、本発明は、上記で説明されている方法により製造されたＣＡＲ発現細胞であって、リンパ球、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ細胞、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＩＬ、ＣＡＲ ＴＩＬ、樹状細胞、ＣＡＲ－ＤＣ、マクロファージ、ＣＡＲ－Ｍ、ｉＰＳＣ細胞、ｉＰＳＣ細胞から分化した細胞、ＮＫ細胞、またはＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される細胞である。

【0164】

一部の実施形態では、本発明は、適応細胞療法の方法であって、それを必要とする対象に、上記で説明されているＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法である。一部の実施形態では、この適応細胞療法は、ＢＣＭＡ陽性がん細胞（例えば、多発性骨髄腫がん細胞）を死滅させることを含む。

【0165】

参照による組入れ
本明細書で引用されている全ての特許、刊行物、および特許出願は、各個々の特許、刊行物、または特許出願が、全ての目的のために、その全体を参照によって組み入れるように具体的にかつ個々に示されていたかのように、参照によって本明細書に組み入れる。

【0166】

本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用されている例示的な実施形態を説明する下記の詳細な説明と、添付の図面とを参照することにより得られるだろう。図は、比例的に描写されておらず、縮尺通りでもない。標識の位置は、おおよそのものである。

【図面の簡単な説明】

【0167】

【図1】図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｇａガイドＲＮＡの例を示す図である。

【図2】Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドの切断を示す図である。

【図3】図３Ａ～図３Ｉは、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドでの使用のための様々な標準および非標準のヌクレオチドを示す図である。

【図4】Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドの切断を示す図である。

【図5】Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡガイドを示す図である。

【図6】活性化領域および標的結合配列中にＤＮＡ塩基を含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドを示す図である。

【図7】活性化領域および標的結合配列中にＤＮＡ塩基および化学的に改変された核酸を含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドを示す図である。

【図8】Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の形成および標的ポリヌクレオチドの結合を示す図である。

【図9】Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドにおける挿入または欠失（インデル）の発生を示す図である。

【図10】Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドにおけるドナーポリヌクレオチド配列の挿入を示す図である。

【図11】Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドのニッキングを示す図である。

【図12】２つのＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドのタンデムニッキング、および標的ポリヌクレオチドにおけるドナーポリヌクレオチド配列の挿入を示す図である。

【図13】標的結合配列中に個々のＤＮＡ塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の平均正規化編集率を示す図である。

【図14】活性化領域中に個々のＤＮＡ塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の正規化編集率を示す図である。

【図15】図１５Ａおよび図１５Ｂは、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型および細胞傷害プロファイルを示すグラフである。

【図16】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ポリペプチドリンカーおよび核局在化配列（ＮＬＳ）配置が異なるＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の編集活性を示すグラフである。

【図17】異なるポリペプチドリンカーおよび核局在化配列（ＮＬＳ）配置で複数の遺伝子を同時に標的とした場合でのＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の編集活性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0168】

本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定することは意図されていないことを理解しなければならない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含み、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」への言及は、１つまたはそれ以上のベクターを含む。

【0169】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本開示では、本明細書で説明されているものと同様のまたは等価の他の方法および材料が有用であり得るが、本明細書では、好ましい材料および方法を説明する。

【0170】

「ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）」および「ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ」という用語は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）でプログラムされたＣａｓ９を使用して生成されたゲノムＤＮＡ内の切断部位の配列を同定する生化学的方法を指す。このアッセイは、Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．，他、（２０１７）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４２８４）で完全に説明されている。

【0171】

本明細書の教示を考慮して、当業者は、例えば下記の標準的なテキストにより教示されるように、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えポリヌクレオチドの従来の技術を適用し得る：Ａｂｂａｓ他（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、第９版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ ９７８－０３２３４７９７８３）；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ他（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２０１７、第１版、Ｄｅｍｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＩＳＢＮ ９７８－１６２０７００９７６）；Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６、第９版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ ９７８－０８１５３４５０５３）；Ｓｔｅｖｅｎｓ他（ＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、２０１６、第４版、Ｄａｖｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＩＳＢＮ ９７８－０８０３６４４６６３）；Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１４、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－１－９３６１１３－８１－１）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１６，第７版、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ＩＳＢＮ ９７８－１１１８８７３６５６）；Ｃ．Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２０１４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ ９７８－０１２４１０４９０７）；Ｈ．Ｈｅｄｒｉｃｈ（Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｕｓｅ、２０１２、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０１２３８２００８２）；Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ他（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１３、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－１９３６１１３０１９）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ他（ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０１９９６３４２４８）；Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＳＮ １０６４－３７４５）；Ｒｉｏ他（ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９８９１１）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｅｅｎ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１２、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－１６０５５００５６０）；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１３、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０１２３８２２３９０）。

【0172】

規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）および関連するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを構成する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの分類は、何度も繰り返されている。Ｍａｋａｒｏｖａ他（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０２０、１８：６７～８３頁）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの個々のタイプおよびサブタイプに特異的なシグネチャーｃａｓ遺伝子を考慮した分類体系を提案した。この分類はまた、複数の共有Ｃａｓタンパク質間の配列類似性、最も保存されたＣａｓタンパク質の系統発生、遺伝子組織、およびＣＲＩＳＰＲアレイの構造も考慮していた。このアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを下記の２つの異なるクラス：クラス１およびクラス２に分割する分類スキームを提供した。

【0173】

クラス２、Ｖ型システムでは、ｃｒＲＮＡおよび標的の結合には、標的核酸切断と同様に、Ｃａｓ１２が関与する。例えば、Ｃａｓ１２ａのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインは、標的核酸の両方の鎖をスタガード配置で切断し、５’オーバーハングを生じるが、これは、Ｃａｓ９切断により生成された平滑末端とは対照的である。この５’オーバーハングにより、相同組換え法によるＤＮＡの挿入が容易になる場合がある。

【0174】

Ｖ型 ｃｒＲＮＡならびに標的結合および切断に関連する他のタンパク質として、Ｃａｓ１２ｂ（以前はＣ２ｃ１）およびＣａｓ１２ｃ（以前はＣ２ｃ３）が挙げられる。Ｃａｓ１２ｂタンパク質およびＣａｓ１２ｃタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ クラス２ ＩＩ型 Ｃａｓ９タンパク質およびＣＲＩＳＰＲ クラス２ Ｖ型 Ｃａｓ１２ａタンパク質と同様の長さであり、約１，１００個のアミノ酸～約１，５００個のアミノ酸の範囲である。Ｃ２ｃ１タンパク質およびＣ２ｃ３タンパク質はまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインも含み、Ｃａｓ１２ａと類似する構造を有する。Ｃ２ｃ１タンパク質は、標的結合および切断に関してｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするという点でＣａｓ９タンパク質と類似しているが、最適な切断温度は５０℃である。Ｃ２ｃ１タンパク質は、ＡＴリッチＰＡＭを標的としており、これは、Ｃａｓ１２ａと同様に、標的配列の５’に存在している。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２０１５、６０（３）：３８５～３９７頁）を参照されたい。

【0175】

ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型サブタイプは、Ｃａｓ１２タンパク質を含み、幅広い配列およびサイズの多様性を示すが、Ｃａｓ１２サブタイプは、ＩＳ６０５様トランスポゾンによりコードされるＴｎｐＢヌクレアーゼからの共通の進化的起源を共有する。Ｃａｓ１２タンパク質の低い配列類似性、および複数の独立した組換え事象を通じた進化の可能性に起因して、それぞれのサブタイプへのＣａｓ１２タンパク質の分類により、複数の命名規則がもたらされた。表１は、Ｖ型 Ｃａｓ１２タンパク質の分類および名称、ならびにそのおおよそのサイズ、ガイド要件、好ましい標的ポリヌクレオチド、および代表的な起源生物を表す。

【0176】

【表1】

【0177】

Ｃａｓ１２相同体を、当業者に公知の配列類似性検索法を使用して同定し得る。典型的には、Ｃａｓ１２タンパク質は、コグネートＣａｓ１２ガイドと相互作用して、標的核酸配列に結合可能なＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体を形成し得る。本開示の一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質またはその相同体は、Ｃａｓ１２ａタンパク質またはその相同体である。

【0178】

Ｃａｓ１２ａタンパク質としては、パルクバクテリア・バクテリウムＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（ＰｂＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウムＭＣ２０１７（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス（ＢｐＣｐｆ１）、ペレグリニバクテリア・バクテリウムＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０（ＰｅＣｐｆ１）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・マカカエ（ＰｍＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウムＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（ＰｃＣｐｆ１）、プレボテラ・ディシエンス（ＰｄＣｐｆ１）、モラクセラ・ボーボクリ２３７（ＭｂＣｐｆ１）、スミセラ種（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐｐ．）ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７（ＳｓＣｐｆ１）、レプトスピラ・イナダイ（ＬｉＣｐｆ１）、ラクノスピラセ・バクテリウムＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、フランシセラ・ノビサイダＵ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノプラスマ・テルミツム（ＣＭｔＣｐｆ１）、およびユーバクテリウム・エリジェンス（ＥｅＣｐｆ１）由来のＣａｓ１２ａが挙げられるが、これらに限定されない。

【0179】

Ｖ型システムでは、核酸標的配列の結合には、核酸標的配列の切断と同様に、典型的には、Ｃａｓ１２タンパク質およびｃｒＲＮＡが関与する。Ｖ型のシステムでは、Ｃａｓ１２タンパク質のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが、核酸標的配列の両方の鎖を順次切断し（Ｓｗａｒｔｓ他（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２０１７、６６：２２１～２３３頁）を参照されたい）、５’オーバーハングを生じるが、これは、Ｃａｓ９タンパク質切断により生成された平滑末端とは対照的である。

【0180】

Ｖ型システムのＣａｓ１２タンパク質切断活性は、ｔｒａｃｒＲＮＡから独立し得（例えばＶ－Ａ型）；一部のＶ型システムは、内部二重鎖を形成するステム－ループ構造を有する単一のｃｒＲＮＡのみを必要とする。Ｃａｓ１２タンパク質は、ステムループと、核酸標的配列にハイブリダイズする、ステムループに隣接する配列（特に、スペーサー配列の５’ヌクレオチド）とを認識することにより、配列特異的におよび構造特異的にｃｒＲＮＡに結合する。このステム－ループ構造は、典型的には、１５～２２ヌクレオチド長の範囲である。このステム－ループ二重鎖を破壊する置換により、切断活性が消失するが、ステム－ループ二重鎖を破壊しない他の置換では、切断活性は消失しない。ある特定のＶ型システム（例えば、Ｖ－Ｆ１、Ｖ－Ｇ、Ｖ－Ｃ、Ｖ－Ｅ（ＣａｓＸ）、Ｖ－Ｋ、およびＶ－Ｂ型）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間でのハイブリダイゼーションを必要とする。Ｙａｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１９、３６３（６４２２）：８８～９１頁）を参照されたい。

【0181】

「ガイド」および「ガイドポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓタンパク質と核タンパク質複合体を形成する１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指しており、この核タンパク質複合体は、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列に（核酸標的配列を含まないポリヌクレオチドと比較して）優先的に結合する。そのようなガイドは、下記を含み得る：リボヌクレオチド塩基（例えばＲＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド塩基（例えばＤＮＡ）、リボヌクレオチド塩基とデオキシリボヌクレオチド塩基との組合わせ（例えばＲＮＡ／ＤＮＡ）、ヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、および同類のもの、ならびに合成の、天然に存在する、および天然に存在しない改変骨格残基または連結を含み得る。多くのそのようなガイドが公知であり、例えば、限定されないが、単一ガイドＲＮＡ（例えば、小型のおよび切頭型の単一ガイドＲＮＡを含む）、ｃｒＮＡ、二重ガイドＲＮＡ、例えば、限定されないが、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ分子、ならびに同類のものであり、これらの使用は、特定のＣａｓタンパク質に依存する。例えば、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２会合ガイド」とは、コグネートＣａｓ１２タンパク質と特異的に会合して核タンパク質複合体を形成するガイドである。

【0182】

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチド」とは、ガイド分子の一部を含むポリヌクレオチド配列のことである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲポリヌクレオチドは、ターゲティング領域および／または活性化領域を含む。

【0183】

ガイド分子に関して、「スペーサー」、「スペーサー配列」、「スペーサーエレメント」、または「ターゲティング領域」は、本明細書で使用される場合、標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列を指す。ターゲティング領域は、相補的な塩基対（即ち、対の塩基）間の水素結合により、標的核酸配列と相互作用する。ターゲティング領域は、選択された核酸標的配列に結合する。一部の実施形態では、標的配列は、インビトロ、エクスビボ（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成における等）、またはインビボ（例えば、組成物を対象に直接投与する場合）のいずれにおいても、細胞のゲノム内の配列である。ガイド分子は、任意の標的配列を標的とするように選択された任意の配列を含み得るか、またはこの任意の配列からなり得る。例示的な標的配列として、標的ゲノムに固有のものが挙げられる。従って、ターゲティング領域は、核酸標的結合配列である。ターゲティング領域は、Ｃａｓ１２タンパク質の部位特異的結合および核酸分解切断の位置を決定する。ターゲティング領域に関する機能的な長さの可変性は、当該技術分野で公知である。

【0184】

本明細書で使用される場合、「活性化領域」という用語は、Ｃａｓ１２ａポリペプチド等のＣａｓ１２ポリペプチドと会合可能かまたは結合可能なポリヌクレオチドの一部を指す。

【0185】

本明細書で使用される場合、「脱塩基」、「脱塩基部位」、「脱塩基ヌクレオチド」、「脱プリン／脱ピリミジン部位」、および「ＡＰ部位」という用語は、互換的に使用され、ヌクレオチド配列においてプリン塩基またはピリミジン塩基を欠く部位を指す。ある特定の実施形態では、脱塩基部位は、デオキシリボース部位を含む。他の実施形態では、脱塩基部位は、リボース部位を含む。なおさらなる実施形態では、脱塩基部位は、改変骨格（例えば、ホスホロチオエート骨格またはモルホリノ骨格）を含む。脱塩基部位は、窒素塩基を含まないことから、ＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドの相補的な窒素塩基と水素塩基対結合を形成しない。

【0186】

本明細書で使用される場合、「塩基類似体」、「非標準塩基」、および［化学的改変塩基」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡに存在している標準的なプリン塩基またはピリミジン塩基に構造的に類似している化合物を指す。塩基類似体は、ＤＮＡまたはＲＮＡに天然に存在しているプリン塩基またはピリミジン塩基と比較した場合に、改変糖および／または改変核酸塩基を含み得る。一部の実施形態では、塩基類似体は、イノシンまたはデオキシイノシン例えば２’－デオキシイノシンである。他の実施形態では、塩基類似体は、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－リボヌクレオチドであり、ここで、核酸塩基は、改変塩基（例えば、キサンチン、ウリジン、オキサニン（オキサノシン）、７－メチルグアノシン、ジヒドロウリジン、５－メチルシチジン、Ｃ３スペーサー、５－メチル ｄＣ、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチル イソ－デオキシシトシン、イソ デオキシグアノシン、デオキシウリジン、イソ デオキシシチジン、他の０－１プリン類似体、Ｎ－６－ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７－デアザ ヒポキサンチン、他の７－デアザプリン、および２－メチルプリン）を含む。一部の実施形態では、塩基類似体は、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホラミダイト－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシン、および２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択される。「塩基類似体」という用語はまた、例えば、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－リボヌクレオチドも含み、ここで、核酸塩基は、置換ヒポキサンチンである。例えば、置換ヒポキサンチンを、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素で置換し得る。一部の実施形態では、塩基類似体は、フルオロイノシンまたはクロロイノシンであり得、例えば、２－クロロイノシン、６－クロロイノシン、８－クロロイノシン、２－フルオロイノシン、６－フルオロイノシン、または８－フルオロイノシンであり得る。他の実施形態では、塩基類似体は、デオキシウリジンである。他の実施形態では、塩基類似体は、核酸模倣物（例えば、人口核酸およびゼノ核酸（ＸＮＡ））である。

【0187】

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡガイド」（ｃｈＲＤＮＡ）という用語は、ターゲティング領域を含むポリヌクレオチドガイド分子を指しており、ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドに設計されたＤＮＡを有するＲＮＡを含む。本明細書の実施形態では、Ｃａｓ１２ａガイドのｃｒＲＮＡ成分は、ｃｈＲＤＮＡである。

【0188】

本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体」という用語は、Ｃａｓ１２タンパク質と複合体化して核タンパク質複合体を形成しているｃｈＲＤＮＡガイド分子を指しており、この核タンパク質複合体は、ｃｈＲＤＮＡガイド分子中に存在している核酸標的結合配列に相補的な核酸標的配列に部位特異的に結合し得る。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体」という用語は、Ｃａｓ１２ａタンパク質と複合体化して核タンパク質複合体を形成しているｃｈＲＤＮＡガイド分子を指しており、この核タンパク質複合体は、ｃｈＲＤＮＡガイド分子中に存在している核酸標的結合配列に相補的な核酸標的配列に部位特異的に結合し得る。

【0189】

本明細書で使用される場合、「ステムエレメント」または「ステム構造」は、二本鎖領域を形成する核酸の２本の鎖（「ステムエレメント」）を指す。「ステム－ループエレメント」または「ステム－ループ構造」は、ある鎖の３’末端配列が、典型的には一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチド配列（「ステム－ループエレメントヌクレオチド配列」）により、第２の鎖の５’末端配列に共有結合しているステム構造を指す。一部の実施形態では、ループエレメントは、約３～約２０ヌクレオチド長の、好ましくは約４～約１０ヌクレオチド長のループエレメントヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ループエレメントヌクレオチド配列は、ループエレメントヌクレオチド配列内にステムエレメントを生じさせるために水素結合形成を介して相互作用しない不対核酸塩基の一本鎖ヌクレオチド配列である。本明細書中では、ステム－ループ構造を指すために「ヘアピンエレメント」という用語も使用されている。そのような構造は、当該技術分野では周知である。塩基対形成は、正確であり得るが、当該技術分野で公知であるように、ステムエレメントは、正確な塩基対形成を必要としていない。そのため、ステムエレメントは、１つまたはそれ以上の塩基ミスマッチまたは不対塩基を含んでいてもよい。ステム－ループエレメントは、シュードノット構造をさらに含んでいてもよい。

【0190】

「リンカーエレメントヌクレオチド配列」、「リンカーヌクレオチド配列」、および「リンカーポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、第１の核酸配列に共有結合的に付着した１つまたはそれ以上のヌクレオチドの配列（５’－リンカーヌクレオチド配列－第１の核酸配列－３’）を指す。一部の実施形態では、リンカーヌクレオチド配列は、２つの別個の核酸配列を接続して、単一のポリヌクレオチドを形成する（例えば、５’－第１の核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－第２の核酸配列－３’）。リンカー配列の他の例としては、５’－第１の核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－３’、および５’－リンカーヌクレオチド配列－第１の核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－３’が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リンカーエレメンヌクレオチド配列は、リンカーエレメントヌクレオチド配列内の二次構造（例えば、ステム－ループ構造）を生じさせるように水素結合形成を介して互いに相互作用しない不対核酸塩基の一本鎖ヌクレオチド配列であり得る。一部の実施形態では、２つの一本鎖リンカーエレメントヌクレオチド配列は、２つのリンカーエレメントヌクレオチド配列間の水素結合を介して互いに相互作用し得る。一部の実施形態では、リンカーエレメントヌクレオチド配列は、約１～約５０ヌクレオチド長の間であり得、好ましくは約１～約１５ヌクレオチド長の間であり得る。

【0191】

本明細書で使用される場合、「コグネート」という用語は、典型的には、Ｃａｓ１２タンパク質（例えばＣａｓ１２ａ）、および１種またはそれ以上のガイドのうちの１つに存在している核酸標的結合配列に相補的な核酸標的配列に部位特異的に結合可能な核タンパク質複合体を形成し得る１種またはそれ以上のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡｓ１２関連ガイド（例えばＣＡｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド）を指す。

【0192】

「野生型」、「天然に存在している」、および「非改変」という用語は、本明細書では、典型的な（または最も一般的な）形態、外観、表現型、または天然に存在している株を意味するために使用されており；例えば、天然の供給源中に存在しており、かつこの供給源から単離される細胞、生物、ポリヌクレオチド、タンパク質、巨大分子複合体、遺伝子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはゲノムの典型的な形態を意味するために使用される。野生型の形態、外観、表現型、または株は、意図された改変前の元の親として機能する。そのため、変異体形態、バリアント形態、操作形態、組換え形態、および改変形態は、野生型形態ではない。

【0193】

「単離された」は、ポリペプチドに言及する場合には、示された分子が、この分子が自然界で見出される生物全体から分離した、別個のものであることを意味するか、または同一タイプの他の生物学的巨大分子が実質的に存在していない状態で存在していることを意味する。ポリヌクレオチドに関する「単離された」という用語は、自然界で通常付随する配列の全てもしくは一部を欠いている核酸分子のことであるか；または自然界で存在している通りのものであるが異種配列が付随している配列のことであるか；または染色体に付随していない分子のことである。

【0194】

「精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは、同一分子の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくは少なくとも９５重量％、および最も好ましくは少なくとも９８重量％が存在していることを意味する。

【0195】

「操作された」、「遺伝的に操作された」、「遺伝的に改変された」、「組換えの」、「改変された」、「天然には存在しない」、および「非天然の」という用語は、生物または細胞のゲノムの意図的なヒト操作を示す。これらの用語は、本明細書で定義されるようなゲノム編集を含むゲノム改変の方法、ならびに遺伝子の発現または不活性化を変更する技術、酵素工学、指向性進化、知識ベースの設計、ランダム変異誘発方法、遺伝子シャッフリング、コドン最適化、および同類のものを包含する。遺伝子操作の方法は、当該技術分野で公知である。

【0196】

「共有結合」、「供給結合的に付着した」、「共有結合した」、「共有結合的に連結された」、「共有結合的に接続された」、および「分子結合」は、本明細書では互換的に使用されており、原子間での電子対の共有を伴う化学結合を指す。共有結合の例として、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合が挙げられるが、これらに限定されない。

【0197】

「非共有結合」、「非共有結合的に付着した」、「非共有結合した」、「非共有結合的に連結された」、「非共有結合的相互作用」、および「非共有結合的に接続された」は、本明細書で互換的に使用されており、電子対の共有を伴わないあらゆる比較的弱い化学結合を指す。複数の非共有結合は、多くの場合、巨大分子の高次構造を安定化させ、分子間の特異的相互作用を媒介する。非共有結合の例として、水素結合、イオン相互作用（例えばＮａ^＋Ｃｌ^－）、ファンデルワールス相互作用、および疎水結合が挙げられるが、これらに限定されない。

【0198】

本明細書で使用される場合、「水素結合」、「水素－塩基対形成」、および「水素結合した」は、互換的に使用されており、「ワトソン・クリック水素結合塩基対」（Ｗ－Ｃ水素結合塩基対またはＷ－Ｃ水素結合）；「フーグスティーン水素結合塩基対」（フーグスティーン水素結合）；および「ウォブル水素結合塩基対」（ウォブル水素結合）が挙げられるがこれらに限定されない標準的な水素結合および非標準的な水素結合を指す。Ｗ－Ｃ水素結合（逆Ｗ－Ｃ水素結合を含む）は、プリン－ピリミジン塩基対結合を指しており、即ち、アデニン：チミン、グアニン：シトシン、およびウラシル：アデニンを指す。フーグスティーン水素結合（逆フーグスティーン水素結合を含む）は、核酸中での塩基対形成の変形を指しており、この変形では、２つの核酸塩基（各鎖上に１つ）が、主溝内において水素結合により互いに保持されている。この非Ｗ－Ｃ水素結合により、第３の鎖が二重鎖に巻き付いて三重鎖らせんを形成することが可能となり得る。ウォブル水素結合（逆ウォブル水素結合を含む）は、ワトソン・クリック塩基対規則に従わない、ＲＮＡ分子中における２つのヌクレオチド間の対形成を指す。下記の４つの主要なウォブル塩基対が存在している：グアニン：ウラシル、イノシン（ヒポキサンチン）：ウラシル、イノシン：アデニン、およびイノシン：シトシン。また、イノシン：チミンおよびイノシン：グアニン間にはウォブル塩基相互作用が起こることも知られている。イノシン塩基およびデオキシイノシン塩基は、標準的なＤＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基と水素結合し得ることから、「ユニバーサル対形成塩基」と称される。例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、３３（１９）：６２５８～６７頁）を参照されたい。標準的な水素結合および非標準的な水素結合の規則は、当業者に公知である。例えば、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、２００５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９７３９６）；Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、１９９９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９５６１３）；Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、第１版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、１９９３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、９７８－０８７９６９４５６２）（例えば、Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ａｔ Ｌｅａｓｔ Ｔｗｏ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄｓ、Ｉ、Ｔｉｎｏｃｏを参照されたい）；Ｗ．Ｓａｅｎｇｅｒ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９８８，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ、ＩＳＢＮ ９７８－０－３８７－９０７６１－１）；Ｓ．Ｎｅｉｄｌｅ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００７、第１版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ９７８－０１２３６９５０７９１）を参照されたい。

【0199】

「接続する（ｃｏｎｎｅｃｔ）」、「接続された」、および「接続する（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）」は、本明細書で互換的に使用されており、２つの巨大分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、および同類のもの）間の共有結合または非共有結合を指す。

【0200】

本明細書で使用される場合、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的であり、ヌクレオチドのポリマー形態を指す。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つの５’末端および１つの３’末端を有し、１つまたはそれ以上の核酸配列を含み得るヌクレオチドのポリマー形態を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、これらの類似体、またはこれらの組合せであり得、任意の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の機能を実施し得、様々な二次構造および三次構造を有し得る。これらの用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分で改変されているヌクレオチドを包含する。特定のヌクレオチドの類似体は、塩基対形成特異性が同一である（例えば、ＡとＴとの塩基対の類似性）。ポリヌクレオチドは、１つの改変ヌクレオチドまたは複数の改変ヌクレオチドを含み得る。改変ヌクレオチドの例として、フッ化ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、化学的に改変された糖、およびヌクレオチド類似体が挙げられる。ヌクレオチド構造は、ポリマーが組み立てられる前または後に改変される。重合後、ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分または標的結合成分とのコンジュゲーションにより、さらに改変される。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分を組み込み得る。これらの用語はまた、合成の、天然に存在している、および／または天然には存在していない改変骨格残基または連結を含み、基準ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）と同様の結合特性を有する核酸も包含する。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））（ＥｘｉｑｏｎＷｏｂｕｒｎＭＡ）ヌクレオシド、グリコール核酸、架橋核酸、およびモルホリノ構造が挙げられるが、これらに限定されない。

【0201】

ペプチド－核酸（ＰＮＡ）は、ポリヌクレオチドのリン酸－糖骨格が柔軟な偽ペプチドポリマーに置き換えられている、核酸の合成相同体である。核酸塩基は、このポリマーに連結されている。ＰＮＡは、ＲＮＡおよびＤＮＡの相補的配列に高い親和性および特異性でハイブリダイズする能力を有する。

【0202】

ホスホロチオエート核酸では、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合により、ポリヌクレオチドのリン酸骨格中において、硫黄原子が非架橋酸素に置換されている。この改変により、ヌクレオチド間の連結は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性を示すようになる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端配列または３’末端配列の最後の３～５個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合が導入されており、エキソヌクレアーゼ分解が阻害されている。同様に、オリゴヌクレオチド全体を通したホスホロチオエート結合の配置は、エンドヌクレアーゼによる分解の低減に役立つ。

【0203】

トレオース核酸（ＴＮＡ）は、人工的な遺伝子ポリマーである。ＴＮＡの骨格構造は、ホスホジエステル結合により連結された反復トレオース糖を含む。ＴＮＡポリマーは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を示す。ＴＮＡは、塩基対水素結合により二重鎖構造へと自己集合し得る。

【0204】

「リバースホスホロアミダイト」の使用により、ポリヌクレオチド中に連鎖反転を導入し得る（例えば、ｗｗｗ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｄｎａｌａｂ／ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／－ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ｌｉｎｋａｇｅｓを参照されたい）。ポリヌクレオチドの末端における３’－３’連結は、２つの５’－ＯＨ末端を有するが３’－ＯＨ末端を欠くオリゴヌクレオチドを生じさせることにより、このポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ分解に対して安定化させる。典型的には、そのようなポリヌクレオチドは、５’－ＯＨ位でホスホロアミダイト基を有しており、３’－ＯＨ位でジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有している。通常、ＤＭＴ保護基は、５’－ＯＨ上に位置しており、ホスホロアミダイトは、３’－ＯＨ上に位置している。

【0205】

ポリヌクレオチド配列は、本明細書中では、別途示されない限り、従来の５’から３’への方向で示されている。

【0206】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、一般には、様々な重み付けパラメーターを有するアルゴリズムを使用して第１のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとをそれぞれ比較するヌクレオチド塩基またはアミノ酸の同一性パーセントを指す。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の配列同一性を、様々な方法、ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）およびＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．）が挙げられるがこれらに限定されないサイトでワールドワイドウェブを介して利用可能なコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥＲ、Ｌ－ＡＬＩＧＮ、および同類のもの）による配列アラインメントを使用して決定し得る。２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の間の配列同一性を、一般には、様々な方法またはコンピュータプログラムの標準的なデオフォルトパラメーターを使用して算出する。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の高程度の配列同一性とは、典型的には、基準ポリペプチドの長さにわたる約９０％同一性～１００％同一性のことであり、例えば、約９０％以上の同一性、好ましくは約９５％以上の同一性、より好ましくは約９８％以上の同一性のことである。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の中程度の配列同一性とは、典型的には、基準ポリペプチドの長さにわたる約８０％同一性～約８５％同一性の間のことであり、例えば、約８０％以上の同一性、好ましくは約８５％以上の同一性のことである。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の低程度の配列同一性は、典型的には、基準ポリペプチドの長さにわたる約５０％同一性～７５％同一性の間のことであり、例えば、約５０％同一性、好ましくは約６０％同一性、より好ましくは約７５％同一性のことである。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、アミノ酸置換を含むＣａｓ１２）は、その長さにわたり、基準Ｃａｓ１２タンパク質（例えば野生型Ｃａｓ１２）に対して、その長さにわたり、低程度の配列同一性、中程度の配列同一性、または高程度の配列同一性を有し得る。別の例として、ガイド分子は、基準Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、その長さにわたり、Ｃａｓ１２と複合体を形成するポリヌクレオチド）と複合体化する基準野生型ガイド分子と比較して、その長さにわたり、低程度の配列同一性、中程度の配列同一性、または高程度の配列同一性を有し得る。

【0207】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズしている」とは、２つの相補的な一本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を組み合わせて、水素塩基対形成を介して単一の二本鎖分子（例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ）を形成するプロセスのことである。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、典型的には、ハイブリダイゼーション温度、およびハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度により決定されており、例えば、高温および低塩により、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が実現される。異なるハイブリダイゼーション条件のための塩濃度範囲および温度範囲の例は、下記の通りである：高ストリンジェンシー、約０．０１Ｍ～約０．０５Ｍの塩、ハイブリダイゼーション温度 Ｔ_ｍよりも５℃～１０℃低い；中程度のストリンジェンシー、約０．１６Ｍ～約０．３３Ｍの塩、ハイブリダイゼーション温度 Ｔ_ｍよりも２０℃～２９℃低い；および低ストリンジェンシー、約０．３３Ｍ～約０．８２Ｍの塩、ハイブリダイゼーション温度 Ｔ_ｍよりも４０℃～４８℃低い。二重鎖核酸配列のＴ_ｍは、当該技術分野で周知の標準的な方法により算出される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｃａｓｅｙ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７７、４：１５３９～１５５２頁）；Ｂｏｄｋｉｎ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８５、１０（１）：４５～５２頁）；およびＷａｌｌａｃｅ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８１、９（４）：８７９～８９４頁）を参照されたい。Ｔ_ｍを推定するためのアルゴリズム予測ツールも、広く利用可能である。ハイブリダイゼーションに関する高ストリンジェンシー条件は、典型的には、標的配列と相補的なポリヌクレオチドがこの標的配列と主にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、中程度のストリンジェンシーであり、好ましくは高ストリンジェンシーである。

【0208】

本明細書で使用される場合、「相補性」は、（例えば、標準的なワトソン・クリック塩基対形成を介して）別の核酸配列と水素結合を形成する核酸配列の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成し得る核酸配列中の残基のパーセンテージを示す。２つの核酸配列が１００％の相補性を有する場合には、これら２つの配列は完全に相補的であり、即ち、第１のポリヌクレオチドの全ての連続残基が、第２のポリヌクレオチド中の同数の連続残基と水素結合する。

【0209】

本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド塩基に関する「対応するデオキシリボヌクレオチド塩基」という用語は、このリボヌクレオチド塩基と同一の塩基に、相補的な（ワトソン・クリック）塩基対形成を介して結合するデオキシリボヌクレオチド塩基（例えば、標準的なデオキシリボヌクレオチド塩基の改変バージョンまたはバリアントバージョンを含む）を指す。例えば、リボヌクレオチド塩基Ａ、Ｃ、およびＧの場合には、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基は、それぞれ、Ａ、Ｃ、およびＧであり得る。リボヌクレオチド塩基Ｕの場合には、対応するデオキシリボヌクレオチド塩基は、例えばＴであり得る。

【0210】

本明細書で使用される場合、「結合する」は、巨大分子間（例えば、タンパク質とポリヌクレオチドとの間、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとの間、またはタンパク質とタンパク質との間、および同類のもの）での非共有結合的な相互作用を指す。そのような非共有結合的な相互作用はまた、「会合する」または「相互作用する」とも称される（例えば、第１の巨大分子が第２の巨大分子と相互作用する場合には、この第１の巨大分子は、第２の巨大分子に非共有結合的に結合する）。結合相互作用の一部は、配列特異的であり得る（「配列特異的な結合」、「配列特異的に結合する」、「部位特異的な結合」、および「部位特異的に結合する」という用語は、本明細書では互換的に使用される）。配列特異的な結合は、典型的には、タンパク質（例えばＣａｓ１２）と複合体を形成して、このタンパク質を、核酸標的結合配列（例えばＤＮＡ標的結合配列）を含まない第２の核酸配列（例えば第２のＤＮＡ配列）と比較して、核酸標的配列（例えば標的ＤＮＡ配列）を含む核酸配列（例えばＤＮＡ配列）に優先的に結合させ得る１種またはそれ以上のガイド分子を指す。結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、タンパク質と、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）。結合相互作用を、解離定数（Ｋｄ）で特徴付け得る。「結合親和性」は、結合相互作用の強度を指す。増大した結合親和性は、より低いＫＤと相関する。

【0211】

本明細書で使用される場合、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体が、ポリヌクレオチド内の核酸標的配列でこのポリヌクレオチドに結合するかまたはこのポリヌクレオチドを切断する場合には、このポリヌクレオチドを「標的とする」と言われる。

【0212】

「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓ１２タンパク質結合認識配列を含む二本鎖核酸配列を指しており、Ｃａｓ１２タンパク質のアミノ酸は、この認識配列と直接相互作用する（例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＡＭ ５’－ＴＴＴＮ－３’またはＰＡＭ ５’－ＴＴＴＶ－３’と相互作用する）。ＰＡＭ配列は、非標的鎖上に存在しており、標的相補配列の５’または３’であり得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａシステムでは、ＰＡＭ ５’－ＴＴＴＮ－３’配列またはＰＡＭ ５’－ＴＴＴＶ－３’配列は、非標的配列上に存在しており、標的相補配列の５’である）。ＰＡＭは、標的配列の巻き戻し、および標的配列と核酸標的結合配列との間の水素塩基対結合の前に、Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質（例えばＣａｓ１２ａタンパク質）により認識される。

【0213】

「標的」、「標的配列」、「核酸標的配列」、「標的核酸配列」、および「オンターゲット配列」は、本明細書では、Ｃａｓ１２ポリヌクレオチドの核酸標的結合配列（例えばターゲティング領域）に対して完全にまたは部分的に相補的である核酸配列を指すために互換的に使用される。典型的には、核酸標的結合配列は、Ｃａｓ１２核タンパク質複合体の結合が導かれる核酸標的配列に対して１００％相補的であるように選択されるが、核酸標的配列への結合を弱めるために、より低い相補性パーセントを使用し得る。

【0214】

核酸標的結合配列が、核酸標的結合配列に含まれている脱塩基部位を除いて標的配列に対して１００％相補的である場合には、この標的核酸は、「オンターゲット」と称される。オンターゲット配列結合は、核酸標的結合配列（スペーサー）の非脱塩基部位部分に対する１００％の相補性を有する核酸配列へのＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体の結合を指す。核酸標的結合配列（スペーサー）が、この核酸標的結合配列に含まれている脱塩基部位を除いて標的配列に対して１００％未満の相補性を有する場合には、この標的配列は、「オフターゲット」と称される。オフターゲット配列結合は、核酸標的結合配列（スペーサー）の非脱塩基部位部分に対して１００％未満の相補性を有する核酸配列へのＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体の結合を指す。核酸標的配列は、二本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子であり得る。標的配列は、二本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子であり得る。標的配列は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子であり得る。標的配列は、ＰＡＭ配列の反対鎖上に存在し得る。

【0215】

本明細書で使用される場合、「二本鎖切断」（ＤＳＢ）は、ＤＮＡの二本鎖セグメントの両方の鎖が切断されることを指す。ある場合には、そのような切断が起こると、一方の鎖は、ヌクレオチドが露出しておりかつ他方の鎖上のヌクオレチドに水素結合していない「粘着末端」を有すると言われる。他の場合では、両方の鎖が互いに完全に塩基対形成したままである「平滑末端」が生じ得る。

【0216】

「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーオリゴヌクレオチド」、「ドナーテンプレート」、「非ウイルスドナー」、および「非ウイルステンプレート」は、本明細書では互換的に使用されており、二本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）、一本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはこれらの組合せであり得る。ドナーポリヌクレオチドは、挿入配列（例えば、ＤＮＡ中のＤＳＢ）に隣接する相同アームを含み得る。各側部での相同アームは、長さが様々であり得る。ドナーポリヌクレオチドの設計および構築のためのパラメーターは、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒａｎ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１３、８（１１）：２２８１～２３０８頁）；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ他（Ｎａｔｕｒｅ、１９８５、３１７：２３０～２３４頁）；Ｔｈｏｍａｓ他（Ｃｅｌｌ、１９８６、４４：４１９～４２８頁）；Ｗｕ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００８、３：１０５６～１０７６頁）；Ｓｉｎｇｅｒ他（Ｃｅｌｌ、１９８２、３１：２５～３３頁）；Ｓｈｅｎ他（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８６、１１２：４４１～４５７頁）；Ｗａｔｔ他（ＰＮＡＳ、１９８５、８２：４７６８～４７７２頁）；Ｓｕｇａｗａｒａ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２、１２（２）：５６３～５７５頁）；Ｒｕｂｎｉｔｚ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８４、４（１１）：２２５３～２２５８頁）；Ａｙａｒｅｓ他（ＰＮＡＳ、１９８６、８３（１４）：５１９９～５２０３頁）；およびＬｉｓｋａｙ他（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８７、１１５（１）：１６１～１６７頁）を参照されたい。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは，キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0217】

本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」（ＨＤＲ）は、例えばＤＮＡ中のＤＳＢの修復中に、細胞中で行なわれるＤＮＡ修復を指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要としており、ドナーポリヌクレオチドを使用して、ＤＳＢ（例えば、標的ＤＮＡ配列内のＤＳＢ）が生じた配列を修復する。ドナーポリヌクレオチオドは、一般に、このドナーポリヌクレオチドが修復に好適なテンプレートとして機能し得るのに必要な、ＤＳＢに隣接する配列との配列相同性を有している。ＨＤＲにより、例えばドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡ配列へと、遺伝情報が伝達される。ドナーポリヌクレオチド配列が標的ＤＮＡ配列と異なり、このドナーポリヌクレオチドの一部または全てがこの標的ＤＮＡ配列に組み込まれている場合には、ＨＤＲにより、標的ＤＮＡ配列が変更される（例えば、挿入、欠失、または変異）場合がある。一部の実施形態では、全ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーは、標的ＤＮＡ配列の部位で組み込まれている。例えば、ドナーポリヌクレオチドを、標的ＤＮＡ配列中での切断の修復に使用し得、この修復により、ＤＮＡ中での切断の部位または近傍で、ドナーポリヌクレオチドからの遺伝情報（例えばポリヌクレオチド配列）が伝達される。従って、新規の遺伝情報（例えばポリヌクレオチド配列）を、標的ＤＮＡ配列で挿入し得るか、またはコピーし得る。

【0218】

本明細書で使用される場合、「相同性非依存性標的組込み」（ＨＩＴＩ）は、例えばＤＮＡ中のＤＳＢの修復中に、細胞中で行なわれるＤＮＡ修復を指す。ＨＩＴＩは、ＨＤＲとは異なり、ヌクレオチド配列の相同性を必要としておらず、ドナーポリヌクレオチドを使用して、ＤＳＢ（例えば、標的ＤＮＡ配列中のＤＳＢ）が生じた配列を修復する。ＨＩＴＩにより、例えばドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡ配列へと、遺伝情報が伝達される。ドナーポリヌクレオチド配列が標的ＤＮＡ配列と異なり、このドナーポリヌクレオチドの一部または全てがこの標的ＤＮＡ配列に組み込まれている場合には、ＨＩＴＩにより、標的ＤＮＡ配列が変更される（例えば、挿入、欠失、または変異）場合がある。一部の実施形態では、全ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーは、標的ＤＮＡ配列の部位で組み込まれている。例えば、ドナーポリヌクレオチドを、標的ＤＮＡ配列中での切断の修復に使用し得、この修復により、ＤＮＡ中での切断の部位または近傍で、ドナーポリヌクレオチドからの遺伝情報（例えばポリヌクレオチド配列）が伝達される。従って、新規の遺伝情報（例えばポリヌクレオチド配列）を、標的ＤＮＡ配列で挿入し得るか、またはコピーし得る。

【0219】

「ゲノム領域」とは、核酸標的配列部位のいずれかの側部で存在するか、または核酸標的配列部位の一部も含む、宿主細胞のゲノム中の染色体のセグメントである。ドナーポリヌクレオチドの相同アームは、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドの相同アームは、核酸標的配列部位に直ぐ隣接するゲノム領域に対して顕著な配列相同性を共有しており；相同アームを、核酸標的配列部位から遠いゲノム領域に対して十分な相同性を有するように設計し得ることが認識される。

【0220】

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（ＮＨＥＪ）は、ドナーポリヌクレオチドを必要とすることのない、切断の一方の末端の切断の他方の末端への直接的なライゲーションによる、ＤＮＡ中のＤＳＢの修復を指す。ＮＨＥＪは、修復テンプレートを使用することなくＤＮＡを修復するための、細胞に利用可能なＤＮＡ修復経路である。ドナーポリヌクレオチドの非存在下でのＮＨＥＪにより、ＤＳＢの部位でヌクレオチドが無作為に挿入されるかまたは欠失することが多い。

【0221】

「マイクロ相同性媒介末端結合（Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）」（ＭＭＥＪ）は、ＤＮＡ中のＤＳＢを修復するための経路である。ＭＭＥＪは、ＤＳＢに隣接している欠失、および結合前に、切断部位の内側にあるマイクロ相同配列のアラインメントを伴う。ＭＭＥＪは、遺伝的に定義されており、例えば、ＣｔＩＰ、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、ＤＮＡポリメラーゼシータ（Ｐｏｌ θ）、ＤＮＡリガーゼ１（Ｌｉｇ １）、またはＤＮＡリガーゼ３（Ｌｉｇ ３）の活性を必要とする。さらなる遺伝的成分は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｓｆｅｉｒ他（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１５、４０：７０１～７１４頁）を参照されたい。

【0222】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ修復」は、それによって、細胞に含まれるＤＮＡ分子への損傷を細胞の機構が修復するあらゆるプロセスを包含する。修復される損傷として、一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）が挙げられる。ＤＳＢを修復するために、下記の少なくとも３つの機構が存在している：ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、およびＭＭＥＪ。「ＤＮＡ修復」はまた、本明細書中では、例えばヌクレオチドを挿入するか、欠失させるか、または置換する（これらは全て、ゲノム編集の形態を表す）ことにより標的遺伝子座が改変されているヒト操作に由来するＤＮＡ修復を指すためにも使用される。

【0223】

本明細書で使用される場合、「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。

【0224】

本明細書で使用される場合、「調節配列」、「調節エレメント」、および「制御エレメント」という用語は、互換的であり、発現されるポリヌクレオチド標的の上流（５’非コード配列）、このポリヌクレオチド標的内、またはこのポリヌクレオチド標的の下流（３’非コード配列）であるポリヌクレオチド配列を指す。調節配列は、例えば、転写のタイミング、転写の量もしくはレベル、ＲＮＡのプロセシングもしく安定性、および／または関連する構造ヌクレオチド配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、転写開始部位、リプレッサー結合配列、ステム－ループ構造、翻訳開始配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、翻訳リーダー配列、転写終結配列（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）、翻訳終結配列、プライマー結合部位、および同類のものが挙げられる。

【0225】

調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主においてヌクレオチド配列の構成的な、誘導性の、または抑制可能な発現を導くもの、およびある特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、１つもしくはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター、１つもしくはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター、またはこれらの組合せを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としてＵ６プロモーターおよびＨ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例として、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する：例えばＢｏｓｈａｒｔ他（Ｃｅｌｌ、１９８５、４１：５２１～５３０頁）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望される発現のレベル、および同類のもの等の因子に依存し得ることが、当業者に理解されるだろう。ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書で説明されているような核酸配列によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、転写産物、タンパク質、またはペプチドが生成される。

【0226】

「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、エクソンおよび関連する調節配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、イントロンおよび／または非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。

【0227】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、互いに機能的に関係するように配置されたポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。例えば、調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサ－）は、この調節配列がポリヌクレオチドの転写を調節するかまたはこの転写の調節に寄与する場合には、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結され」ている。作動可能に連結された調節エレメントは、典型的には、コード配列と連続している。しかしながら、エンハンサーは、プロモーターから最大数キロ塩基以上離れている場合にも機能し得る。従って、一部の調節エレメントは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されるが、このポリヌクレオチド配列と連続していない場合がある。同様に、翻訳調節エレメントは、ポリヌクレオチドからのタンパク質発現の調節に寄与する。

【0228】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ＤＮＡテンプレートからのポリヌクレオチドの転写を指しており、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または他のＲＮＡ転写産物（例えば、非コード、例えば構造または足場ＲＮＡ）が生じる。この用語は、転写されたｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスをさらに指す。転写産物およびコードされたポリペプチドを、「遺伝子産物」とまとめて称し得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合には、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0229】

「コード配列」、または選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、好適な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＡＮの場合）かつ翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子のことである。コード配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。転写終結配列は、コード配列の３’に位置し得る。

【0230】

本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、機能の数、程度、または量の変化を指す。例えば、本明細書で開示されているＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体は、プロモーターでまたはプロモーターの近くで核酸標的配列に結合することにより、プロモーター配列の活性を調節し得る。結合後に生じる作用に応じて、Ｃａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体は、プロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を誘発し得るか、増強し得るか、抑制し得るか、または阻害し得る。そのため、遺伝子発現の「調節」は、遺伝子活性化および遺伝子抑制の両方を含む。

【0231】

調節を、標的遺伝子の発現により直接的にまたは間接的に影響を受ける任意の特徴を決定することによりアッセイし得る。そのような特徴として、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のレベル、タンパク質活性、生成物レベル、遺伝子の発現、またはレポーター遺伝子の活性レベルの変化が挙げられる。従って、遺伝子の「発現を調節する」、「発現を阻害する」、および「発現を活性化させる」という用語は、遺伝子の転写を変化させるか、活性化するか、または阻害するＣａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体の能力を指し得る。

【0232】

「ベクター」および「プラスミド」は、本明細書で使用される場合、細胞中に遺伝物質を導入するためのポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクターは、直鎖状であってもよいし、環状であってもよい。ベクターは、好適な宿主細胞中でベクターの複製を引き起こし得る複製配列（例えば複数起点）を含み得る。好適な宿主の形質転換時に、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製して機能し得るか、または宿主ゲノムに組み込まれる。ベクターの設計は、特に、意図される用途、およびこのベクター用の宿主細胞に依存しており、特定の用途および宿主細胞のためのベクターの設計は、当業者のレベル内である。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人口染色体である。典型的には、ベクターは、複数起点、マルチクロニーング部位、および／または選択マーカーを含む。発現ベクターは、典型的には、発現カセットを含む。「組換えウイルス」は、例えばウイルスゲノムまたはその一部への異種核酸構築物の付加または挿入により遺伝的に変更されているウイルスを意味する。

【0233】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、組換え法を使用して生成されたかまたは合成手段により生成されており、かつ選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結されて宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの発現を促進する調節配列を含むポリヌクレオチド構築物を指す。例えば、調節配列は、宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの転写を促進し得るか、または宿主細胞中での選択されたポリヌクレオチドの転写および翻訳を促進し得る。発現カセットは、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、またはベクター中に存在していて発現ベクターを形成し得る。

【0234】

本明細書で使用される場合、「ターゲティングベクター」とは、標的遺伝子または核酸標的配列（例えばＤＳＢ）のエレメントに隣接する調整されたＤＮＡアーム（ゲノムＤＮＡに相同）を典型的に含む組換えＤＮＡ構築物である。ターゲティングベクターは、ドナーポリヌクレオチドを含む。標的遺伝子のエレメントを、欠失および／または挿入を含むいくつかの方法で改変し得る。不完全な標的遺伝子を、機能的標的遺伝子に置き換え得るか、または択一的に、機能遺伝子をノックアウトし得る。場合により、ターゲティングベクターのドナーポリヌクレオチドは、標的遺伝子に導入される選択可能マーカーを含む選択カセットを含む。標的遺伝子に隣接するかまたは標的遺伝子内のターゲティング領域を使用して、遺伝子発現の調節に影響を及ぼし得る。

【0235】

「遺伝子編集」または「ゲノム編集」は、本明細書で使用される場合、遺伝的改変（例えば、細胞ゲノム中の特定の部位でのヌクレオチド配列もしくは単一塩基の挿入、欠失、または置き換え）を引き起こす遺伝子操作の一種を意味する。この用語は、本明細書で定義される異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモーターの挿入または欠失、核酸変異、および破壊的遺伝子改変を含むが、これらに限定されない。

【0236】

本明細書で使用される場合、「の間」という用語は、所与の範囲の端値を含む（例えば、約１～約５０ヌクレオチド長の間は、１個のヌクレオチドおよび５０個のヌクレオチドを含む）。

【0237】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然および合成の（非天然の）アミノ酸を指しており、アミノ酸類似体、改変アミノ酸、ペプチド模倣体、グリシン、およびＤまたはＬ光学異性体が挙げられる。

【0238】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的であり、アミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチドは、任意の長さであり得る。ポリペプチドは、分岐していてもよいし、直鎖状であってもよく、非アミノ酸により中断されていてもよく、かつ改変アミノ酸を含んでいてもよい。この用語はまた、例えば、アセチル化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ペグ化、ビオチン化、架橋、および／または（例えば、標識成分もしくはリガンドとの）コンジュゲーションを介して改変されているアミノ酸ポリマーも指す。ポリペプチド配列は、別途示されない限り、本明細書では、従来のＮ末端からＣ末端への向きで示されている。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、分子生物学の分野での日常的な技術を使用して製造し得る。さらに、本質的に任意のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、商業的供給源から入手可能である。

【0239】

「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、天然には単一タンパク質中に一緒に存在していない２種以上のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質断片を連結することにより作製された単一タンパク質を指す。

【0240】

融合タンパク質はまた、エピトープタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）タグ、Ｍｙｃタグ）、レポータータンパク質配列（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質）、および／または核酸配列結合ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメインまたはＲＮＡ結合ドメイン）も含み得る。融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ＮＬＳまたはヌクレオプラスミンＮＬＳ）を含み得る。融合タンパク質はまた、アクチベータードメイン（例えば、熱ショック転写因子、ＮＦＫＢアクチベーター）、またはリプレッサードメイン（例えばＫＲＡＢドメイン）も含み得る。Ｌｕｐｏ他（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３、１４（４）：２６８～２７８頁）により説明されているように、ＫＲＡＢドメインは、強力な転写抑制モジュールであり、ほとんどのＣ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質のアミノ末端列内に位置している。例えば、Ｍａｒｇｏｌｉｎ他（ＰＮＡＳ、１９９４、９１：４５０９～４５１３頁）；およびＷｉｔｚｇａｌｌ他（ＰＮＡＳ、１９９４、９１：４５１４～４５１８頁（１９９４））を参照されたい。ＫＲＡＢドメインは、典型的には、タンパク質－タンパク質相互作用を介して共リプレッサータンパク質および／または転写因子に結合して、ＫＲＡＢジンクフィンガータンパク質（ＫＲＡＢ－ＺＦＰ）が結合する遺伝子の転写抑制を引き起こす。例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ他（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９６、１０：２０６７～２６７８頁）を参照されたい。一部の実施形態では、リンカー核酸配列を使用して、２つ以上のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質断片を連結する。

【0241】

本明細書で使用される場合、「核局在化配列」（ＮＬＳ）または「核局在化シグナル」という用語は、細胞の核へのタンパク質の細胞内局在化を優先的に増加させるタンパク質のポリペプチド配列を指す。ＮＬＳ配列は、典型的には、タンパク質のアミノ末端（「Ｎ末端」）に位置しているか、カルボキシル末端（「Ｃ末端」）に位置しているか、または内部に位置しているアミノ酸の正荷電ストレッチ（またはこれらの組合せ、即ち、Ｎ末端における１つもしくはそれ以上のＮＬＳ、およびＣ末端における１つもしくはそれ以上のＮＬＳ）である。ＮＬＳ配列は、タンパク質に直接的に共有結合により連結されているか、またはリンカーポリペプチドを介して連結されている。リンカー配列の長さを、タンパク質の構造的特性（例えば、末端の溶媒アクセス可能性、末端における他の重要な機能性ペプチド配列の存在等）に基づいて最適化して、コグネートインポーチンタンパク質の結合および輸送のためのＮＬＳ配列のアクセス可能性を確保し得る。加えて、最適なリンカー長を、経験的にスクリーニングし得る（例えば、実施例１１を参照されたい）。ＮＬＳ配列は、完全に合成されたものであり得るか、または内在性もしくは外来性のタンパク質配列に由来し得る。計算ツールを使用して、タンパク質中のＮＬＳ配列を予測し得る（例えば、ｍｏｓｅｓｌａｂ．ｃｓｂ．ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ＮＬＳｔｒａｄａｍｕｓ／、またはｎｌｓ－ｍａｐｐｅｒ．ｉａｂ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＮＬＳ＿Ｍａｐｐｅｒ＿ｆｏｒｍ．ｃｇｉを参照されたい）。ＮＬＳ配列の例を、表２で表す。

【0242】

【表2】

【0243】

「部分」は、本明細書で使用される場合、分子の一部を指す。部分は、官能基であり得るか、または（例えば共通の構造的特徴を共有する）複数の官能基を有する分子の一部を説明し得る。「部分」および「官能基」という用語は、典型的には互換的に使用されるが、「官能基」は、より具体的には、いくつかの共通の化学的挙動を含む分子の一部を指し得る。「部分」は構造的説明として使用されることが多い。一部の実施形態では、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端（例えば、第１のステムエレメントにおける非天然５’末端および／または非天然３’末端）は、１つまたはそれ以上の部分を含み得る。

【0244】

「改変タンパク質」、「変異タンパク質」、「タンパク質バリアント」、および「工学的タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には、非天然配列を含むように改変されているタンパク質を指す（即ち、改変タンパク質は、非改変タンパク質と比較して固有の配列を有する）。

【0245】

「形質転換」は、本明細書で使用される場合、挿入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば形質転換は、直接的取込み、トランスフェクション、感染、および同類のものによるものであり得る。外来性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（例えばエピソーム）として維持されてもよいし、または宿主ゲノムに組み込まれてもよい。

【0246】

「宿主細胞」とは、外来性ＤＮＡ配列により形質転換されているかまたは形質転換可能な細胞である。宿主細胞は、１つまたはそれ以上の細胞を有する任意の生物に由来し得る。宿主細胞の例としては、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞、藻類細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞、またはキノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞、脊椎動物由来の細胞、例えば哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト等）由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、宿主細胞は、幹細胞もしくは前駆細胞であり得るか、または免疫系の細胞（例えば、本明細書で説明されている免疫系の細胞のうちのいずれか）であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、リンパ球、または造血幹細胞等の幹細胞であり得る。リンパ球としては、細胞媒介性細胞傷害性適応免疫のためのＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞）；細胞媒介性細胞傷害性自然免疫で機能するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；および液性抗体駆動性適応免疫のためのＢ細胞が挙げられる。同様に含まれるのは、リンパ球系細胞を生じる造血幹細胞である。加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞、例えば、ＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＣＡＲ ＴＩＬ、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、および同類のものを、本明細書の技術を使用して改変し得る。一部の実施形態では、ヒト細胞は、ヒトの体外にある。一部の実施形態では、生存生物の身体（例えばヒトの身体）の細胞は、エクスビボ（即ち、生体の外側）で操作されている。エクスビボは、多くの場合、処置または手術のために生体（例えばヒトの身体）から臓器、細胞、または組織を採取し、次いで生体に戻す医療手順を指す。インビボは、多くの場合、生体（例えばヒトの身体）内の臓器、細胞、または組織を処置または手術に供する医療手順を指す。

【0247】

「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用されており、脊索動物門（ｐｈｙｌｕｍ Ｃｈｏｒｄａｔａ）のあらゆるメンバーを指しており、ヒトおよび他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えば、アカゲザル、チンパンジー、および他のサル、ならびに類人猿種；農園動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ；家畜哺乳動物、例えば、イヌおよびネコ；実験動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、およびモルモット；鳥類、例えば、家畜、野生、および狩猟用の鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ならびに他の家禽鳥類、カモ、およびガチョウ；および同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。そのため、この用語は、成体の、若い、および生まれたばかりの個体を含み、雄および雌を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、対象に由来する（例えば、リンパ球、幹細胞、前駆細胞、または組織特異的細胞）。一部の実施形態では、対象は、非ヒト対象である。

【0248】

組成物または薬剤（例えば、本明細書で提供される遺伝子操作された養子細胞）の「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望される応答をもたらすのに十分な量の組成物または薬剤を指す。好ましくは、有効量により、１種またはそれ以上の有害な副作用が予防されるか、回避されるか、または除去される。そのような応答は、問題となっている特定の疾患によって決まる。例えば、養子細胞療法を使用してがんが処置される患者では、所望される応答は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）、宿主対移植片拒絶反応、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストームの影響の処置または予防、および投与された遺伝的改変細胞の発がん性形質転換の低減のうちの１つまたはそれ以上を含み得るか、予防し得るか、回避し得るか、または除去し得る。必要とされる正確な処置量は、対象の種、年齢、および全身状態、処置される状態の重症度、ならびに使用される特定の改変リンパ球、投与様式、ならびに同類のものに応じて、対象毎に異なる。あらゆる個々の症例での適した「有効」量は、日常の実験を使用して当業者により決定される。

【0249】

特定の疾患（例えば、がんの症状またはＧｖＨＤ）の「処置」または「処置すること」は、下記を含む：疾患を予防すること、例えば、疾患に罹りやすいが疾患の症状をまだ経験していないかもしくは示していない対象において、疾患の進展を予防するかもしくは疾患をより低い強度で発症させること；疾患を阻害すること、例えば、進行速度を低減させるか、進行を抑制するか、もしくは疾患状態を反転せること；ならびに／または疾患の症状を軽減すること、例えば、対象が経験する症状の数を減少させること。

【0250】

Ｃａｓ１２ガイド
本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、Ｃａｓ１２ａタンパク質等のコグネートＣａｓ１２タンパク質と核タンパク質複合体を形成し得、この複合体は、ターゲティング領域（スペーサー配列）と相補的な標的配列を標的とし得る。

【0251】

図１Ａは、ステム－ループ二重鎖（図１Ａ、１０２）を含む活性化領域（図１Ａ、１０１）；および標的結合配列（図１Ａ、１０４）を含むスペーサー配列（図１Ａ、１０３）を含むアシダミノコッカス種ＢＶ３ｌ６ Ｃａｓ１２ａガイド分子の一例を示す。図１Ｂは、ステム－ループ二重鎖（図１Ｂ、１０６）を含む活性化領域（図１Ｂ、１０５）；ならびに標的結合配列（図１Ｂ、１０８）および３’伸長（図１Ｂ、１０９）を含むスペーサー配列（図１Ｂ、１０７）を含む代替のＣａｓ１２ａガイド分子を示す。３’伸長（図１Ｂ、１０９）を、リンカー配列を介してスペーサー配列（図１Ｂ、１０７）に接続し得る。図１Ｃは、ステム－ループ二重鎖（図１Ｃ、１１１）、およびリンカーヌクレオチド（図１Ｃ、１１４）、および５’伸長（図１Ｃ、１１５）を含む活性化領域（図１Ｃ、１１０）；および標的結合配列（図１Ｃ、１１３）を含むスペーサー配列（図１Ｃ、１１２）を含む代替のＣａｓ１２ａガイド分子を示す。

【0252】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子において、ターゲティング領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み得る。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る。ある特定の実施形態では、ターゲティング領域はまた、他の塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、および同類のもの、ならびに合成の、天然に存在する、および天然に存在しない改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せも含み得る。

【0253】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子において、活性化領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含み得る。一部の実施形態では、活性化領域は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る。ある特定の実施形態では、活性化領域はまた、他の塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、および同類のもの、ならびに合成の、天然に存在する、および天然に存在しない改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せも含み得る。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域に隣接している。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の下流に存在している。ある特定の実施形態では、活性化領域は、ターゲティング領域の上流に存在している。

【0254】

一部の実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、リボヌクレオチド塩基と、約２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、１０％以下、１１％以下、１２％以下、１３％以下、１４％以下、１５％以下、１６％以下、１７％以下、１８％以下、１９％以下、２０％以下、２１％以下、２２％以下、２３％以下、２４％以下、２５％以下、２６％以下、２７％以下、２８％以下、２９％以下、３０％以下、３１％以下、３２％以下、３３％以下、３４％以下、３５％以下、３６％以下、３７％以下、３８％以下、３９％以下、４０％以下、４１％以下、４２％以下、４３％以下、４４％以下、４５％以下、４６％以下、４７％以下、４８％以下、４９％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、または７５％以下のデオキシリボヌクレオチド塩基とを含む核酸配列、またはそのバリアントもしくは改変誘導体を含む。

【0255】

本開のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドは、例えば、脱塩基部位を含めて３０～７５塩基長である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドは、脱塩基部位を含めて３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５塩基長である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドは、脱塩基部位を含めて４０塩基長である。

【0256】

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド、活性化領域、またはターゲティング領域）の「全長の割合として」は、例えば、脱塩基部位、ならびに改変塩基およびバリアント塩基を含むポリヌクレオチド配列の全長を指す。

【0257】

一部の実施形態では、活性化領域は、脱塩基部位を含めて１０～２５塩基長の間である。一部の実施形態では、活性化領域は、脱塩基部位を含めて１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基長である。一部の実施形態では、活性化領域は、脱塩基部位を含めて２０塩基長である。

【0258】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、脱塩基部位を含めて１０～３０塩基長の間である。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、脱塩基部位を含めて１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基長である。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、脱塩基部位を含めて２０塩基長である。

【0259】

本明細書の実施形態では、活性化領域および／またはターゲティング領域は、リボヌクレオチド塩基と、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基とを含む。活性化領域および／またはターゲティング領域はまた、一部の実施形態では、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、またはこれらの組合せを含むさらなる改変も含み得る。一部の実施形態では、活性化領域および／またはターゲティング領域は、合成の、天然に存在する、または天然に存在しない改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せを含み得る。

【0260】

１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、ターゲティング領域中の任意の１箇所またはそれ以上の位置で存在し得る。例えば、脱塩基部位を含めて３０塩基長のターゲティング領域の場合には、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。より小さいターゲティング領域の場合には、それに応じて、これらの位置は減少する。例えば、脱塩基部位を含めて２０塩基長のターゲティング領域の場合には、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。

【0261】

１つまたはそれ以上のさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）は、ターゲティング領域中の任意の１箇所またはそれ以上の位置で存在し得る。例えば、脱塩基部位を含めて３０塩基長のターゲティング領域の場合には、１つまたはそれ以上のさらなる改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。より小さいターゲティング領域の場合には、それに応じて、これらの位置は減少する。例えば、脱塩基部位を含めて２０塩基長のターゲティング領域の場合には、１つまたはそれ以上のさらなる改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。

【0262】

１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、活性化領域中の任意の１箇所またはそれ以上の位置で存在し得る。例えば、脱塩基部位を含めて２５塩基長の活性化領域の場合には、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。より小さい活性化領域の場合には、それに応じて、これらの位置は減少する。例えば、脱塩基部位を含めて２０塩基長の活性化領域の場合には、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。

【0263】

１つまたはそれ以上のさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）は、活性化領域中の任意の１箇所またはそれ以上の位置で存在し得る。例えば、脱塩基部位を含めて２５塩基長の活性化領域の場合には、１つまたはそれ以上のさらなる改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。より小さい活性化領域の場合には、それに応じて、これらの位置は減少する。例えば、脱塩基部位を含めて２０塩基長の活性化領域の場合には、１つまたはそれ以上のさらなる改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０位のうちの１箇所またはそれ以上で存在し得る。

【0264】

一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めたＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めたＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0265】

一部の実施形態では、さらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）の量は、脱塩基部位を含めたＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、さらなる改変の量は、脱塩基部位を含めたＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0266】

一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めたターゲティング領域の全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めたターゲティング領域の全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0267】

一部の実施形態では、さらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）の量は、脱塩基部位を含めたターゲティング領域の全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、さらなる改変の量は、脱塩基部位を含めたターゲティング領域の全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0268】

一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めた活性化領域の全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド塩基の量は、脱塩基部位を含めた活性化領域の全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0269】

一部の実施形態では、さらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）の量は、脱塩基部位を含めた活性化領域の全サイズの割合として、好ましくは７５％以下である。一部の実施形態では、さらなる改変の量は、脱塩基部位を含めた活性化領域の全サイズの割合として、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、または５％以下である。

【0270】

一部の実施形態では、活性化領域および／またはターゲティング領域中のデオキシリボヌクレオチド塩基の量は、例えば、デオキシリボヌクレオチド塩基を含まない対応する活性化領域および／またはターゲティング領域と比較して、統計的に有意な差異を提供するように調整されている。一部の実施形態では、この統計的に有意な差異は、オンターゲット編集またはオフターゲット編集での差異である。

【0271】

一部の実施形態では、活性化領域およびターゲティング領域はそれぞれ、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含む。一部の実施形態では、活性化領域は、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、ターゲティング領域は、デオキシリボヌクレオチド塩基を全く含まない（例えば、ＲＮＡおよび／または改変リボヌクレオチドのみを含む）。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を含み、活性化領域は、デオキシリボヌクレオチド塩基を全く含まない（例えば、ＲＮＡおよび／または改変リボヌクレオチドのみを含む）。

【0272】

一部の実施形態では、活性化領域およびターゲティング領域はそれぞれ、１つまたはそれ以上のさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）を含む。一部の実施形態では、活性化領域は、１つまたはそれ以上のさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）を含み、ターゲティング領域は、さらなる改変を全く含まない（即ち、ＲＮＡまたはＤＮＡのみを含む）。一部の実施形態では、ターゲティング領域は、１つまたはそれ以上のさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合せ）を含み、活性化領域は、さらなる改変を全く含まない（即ち、ＲＮＡまたはＤＮＡのみを含む）。

【0273】

図２は、標的結合配列（図２、２０５）を含むコグネートＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図２、２０４）に結合したＣａｓ１２ａタンパク質（図２、２０６）を示す。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドをほどき、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列（図２、２０５）は、標的配列（図２、２０７）に、水素結合（図２、ポリヌクレオチド間の縦線で示されている）を介して接続している。図２では、標的ポリヌクレオチドは、標的配列（図２、２０７）を含む標的鎖（図２、２０１）と、ＰＡＭ配列（図２、２０３）を含む非標的鎖（図２、２０２）とを含む。ＰＡＭ配列（図２、２０３）は、典型的には、非標的鎖（図２、２０２）上の標的配列（図２、２０７）の上流（即ち、５’方向）で生じる。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列（図２、２０５）と、標的配列（図２、２０７）との間の水素結合の形成により、標的鎖（図２、２０１）と非標的鎖（図２、２０２）とのスタガード切断（図２、２０８）が生じる。

【0274】

図３Ａ～図３Ｉは、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子での使用のための様々な標準的および非標準的なヌクレオチドを示す。表３は、図３Ａ～図３Ｉで使用される一連の標識を表す。

【0275】

【表3】

【0276】

図４は、標的結合配列（図４、４０５）を含むコグネートＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図４、４０４）に結合したＣａｓ１２ａタンパク質（図４、４０６）であって、標的結合配列（図４、４０５）は、非ＲＮＡヌクレオチド（図４、４０９）を含み、例えば、図３Ｂ～図３Ｉで表される標準的なおよび非標準的なヌクレオチドを含む、Ｃａｓ１２ａタンパク質を示す。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドをほどき、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列（図４、４０５）は、標的配列（図４、４０７）に、水素結合（図４、ポリヌクレオチド間の縦線で示されている）を介して接続している。図４では、標的ポリヌクレオチドは、標的配列（図４、４０７）を含む標的鎖（図４、４０１）と、ＰＡＭ配列（図４、４０３）を含む非標的鎖（図４、４０２）とを含む。ＰＡＭ配列（図４、４０３）は、典型的には、非標的鎖（図４、４０２）上の標的配列（図４、４０７）の上流（即ち、５’方向）で生じる。ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列（図４、４０５）と、標的配列（図４、４０７）との間の水素結合の形成により、標的鎖（図４、４０１）と非標的鎖（図４、４０２）とのスタガード切断（図４、４０８）が生じる。

【0277】

図５は、下記を含むアシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡガイド分子の一例を示す：ステム－ループ二重鎖（図５、５０２）を含む活性化領域（図５、５０１）；および標的結合配列（図５、５０４）を含むスペーサー（図５、５０３）。活性化領域（図５、５０１）およびスペーサー（図５、５０３）中の各ヌクレオチド位置は、このガイド分子の５’末端から標識されており、活性化領域および標的結合領域はそれぞれ、ＲＮＡを含む。

【0278】

図６は、下記を含むアシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の一例を示す：ステム－ループ二重鎖（図６、６０２）を含む活性化領域（図６、６０１）；および標的結合配列（図６、６０４）を含むスペーサー（図６、６０３）。活性化領域（図６、６０１）中、スペーサー（図６、６０３）中の各ヌクレオチド位置は、このガイド分子の５’末端から標識されており、活性化領域は、ＲＮＡ（白色の塗りつぶし）およびＤＮＡ（灰色の塗りつぶし）の混合物を含み、標的結合領域は、ＲＮＡ（白色の塗りつぶし）およびＤＮＡ（灰色の塗りつぶし）の混合物を含む。

【0279】

図７は、下記を含むアシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の一例を示す：ステム－ループ二重鎖（図７、７０２）を含む活性化領域（図７、７０１）；および標的結合配列（図７、７０４）を含むスペーサー（図７、７０３）。活性化領域（図７、７０１）およびスペーサー（図７、７０３）中の各ヌクレオチド位置は、このガイド分子の５’末端から標識されており、活性化領域は、ＲＮＡ（白色の塗りつぶし）およびＤＮＡ（灰色の塗りつぶし）の混合物を含む。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、他の非標準的なヌクレオチド例えば、化学的に改変された糖ヌクレオチド（図７、７０５）、脱塩基リボヌクレオチド（図７、７０６）、骨格が化学的に改変されているデオキシリボヌクレオチド（図７、７０７）、骨格が化学的に改変されているリボヌクレオチド（図７、７０８）、および脱塩基デオキシリボヌクレオチド（図７、７０９）をさらに含む。

【0280】

図８は、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の形成であって、Ｃａｓ１２タンパク質（図８、８０１）はＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図８、８０２）に結合して、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体（図８、８０３）が形成される、形成を示す。Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体（図８、８０３）は、標的ポリヌクレオチド（図８、８０４）に結合し、この標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列に相補的な標的配列を含み、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列と標的配列（図８，８０５）との間に水素結合が生じる。

【0281】

図９は、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドにおける挿入または欠失（インデル）の発生であって、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図９、９０２）と複合体化したＣａｓ１２タンパク質（図９、９０１）は、ＰＡＭ（図９、９０４）を含む標的ポリヌクレオチド（図９、９０３）に結合しており、標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により切断されている（図９、９０５）、発生を示す。ターゲティングが起きた後、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドから解離し（図９、９０６）、標的ポリヌクレオチドは、ＰＡＭ（図９、９０４）に対して上流（即ち、５’方向）鎖（図９、９０７）および下流（即ち、３’方向）鎖（図９、９０８）を含む。細胞内ＤＮＡ修復機構は、標的ポリペプチド中の切断部位周辺での配列の挿入または欠失（図９、９１０）を通して、標的ポリヌクレオチドを修復する。上流鎖（図９、９１１）および下流鎖（図９、９１２）は再連結され、編集された標的ポリヌクレオチド（図９、９１４）は、切断部位でインデル（図９、９１３）を含み、編集された標的ポリヌクレオチドは、未編集の標的ポリヌクレオチドと比較して配列が異なる。一部の実施形態では、細胞内にて、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による標的ポリヌクレオチド中での挿入または欠失（インデル）の発生が起こる。

【0282】

図１０は、標的ポリヌクレオチドへのドナーポリヌクレオチド配列の組込みであって、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図１０、１００２）と複合体化したＣａｓ１２タンパク質（図１０、１００１）は、ＰＡＭ（図１０、１００４）を含む標的ポリヌクレオチド（図１０，１００３）に結合しており、標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により切断されている（図１０、１００５）、組込みを示す。ターゲティングが起きた後、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドから解離し（図１０、１００６）、標的ポリヌクレオチドは、ＰＡＭ（図１０、１００４）に対して上流（即ち、５’方向）鎖（図１０、１００７）および下流（即ち、３’方向）鎖（図１０、１００８）を含み、ドナーポリヌクレオチドが生じる（図１０、１００９）。細胞内ＤＮＡ修復機構は、このドナーポリヌクレオチド（図１０、１０１１）を使用して標的ポリヌクレオチド（図１０、１０１０）を修復する。得られた編集された標的ポリヌクレオチド（図１０、１０１０）は、標的部位でドナー配列（図１０、１０１１）を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドへのドナーポリヌクレオチド配列の組込みは、細胞内で起こる。

【0283】

図１１は、標的ポリヌクレオチドのニッキングであって、標的結合配列（図１１、１１０６）中にＤＮＡ塩基を含む、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（図１１、１１０２）と複合体化したＣａｓ１２タンパク質（図１１、１１０１）は、ＰＡＭ（図１１、１１０４）を含む標的ポリヌクレオチド（図１１、１１０３）に結合し、標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により、この標的ポリヌクレオチドの一方の鎖中にのみ切り込みが入る（図１１、１１０５）、ニッキングを示す。

【0284】

図１２は、標的ポリヌクレオチド中にスタガード型の二本鎖切断を発生させるための、２つのニッキングＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質複合体の使用であって、第１のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的ポリヌクレオチドの上流（即ち、５’方向）標的配列に結合して（図１２、１２０１）、標的ポリヌクレオチド中に第１の切り込みが入り（図１２、１２０２）、第２のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体が、標的ポリヌクレオチドの下流（即ち、３’方向）標的配列に結合して（図１２、１２０３）、標的ポリヌクレオチド中に第２の切り込みが入る（図１２、１２０４）、使用を示す。タンデム型のニッキングが起きた後、切断後の標的ポリヌクレオチドは、５’オーバーハングを有する上流（即ち、５’方向）鎖（図１２、１２０５）および下流（即ち、３’方向）鎖（図１２、１２０６）を含む。ドナーポリヌクレオチドが生じ、細胞内ＤＮＡ修復機構は、このドナーポリヌクレオチド（図１２、１２０８）を使用して、標的ポリヌクレオチド（図１２、１２０７）を修復する。得られた編集された標的ポリヌクレオチド（図１２、１２０９）は、タンデム型に切り込みが入った部位でドナー配列（図１２、１２１０）を含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド中でのスタガード型のＤＳＢを発生させるための２つのニッキングＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の使用は、細胞内で起こる。

【0285】

図１３は、ＤＮＡ塩基に適している、アシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列中の位置を示す。ｙ軸は、標的結合配列中の単一の位置での、ＤＮＡによる複数の標的の正規化された編集率（実施例５を参照されたい）を表している（エラーバーは、標準偏差を示す）。ｘ軸は、標的結合配列中における各位置の位置（５’から３’へ）を示す。標的結合配列は、グラフの上側に示されており（図１３、１３０１）、ＤＮＡ塩基利用の好ましい位置（即ち、７０％超の平均正規化編集）が、灰色の塗りつぶしで示されている。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ活性化領域の位置も示されている（図１３、１３０２）。

【0286】

図１４は、ＤＮＡ塩基に適している、アシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の活性化領域中の位置を示す（実施例８を参照されたい）。ｙ軸は、活性化領域中の単一の位置での、ＤＮＡによるガイド分子の正規化された編集率を表している。ｘ軸は、活性化領域中における各位置の位置（５’から３’へ）を示す。活性化領域は、グラフの左側に示されており（図１４、１４０１）、ＤＮＡ塩基利用の好ましい位置（即ち、７０％超の平均正規化編集）が、灰色の塗りつぶしで示されている。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド標的結合配列の位置も示されている（図１４、１４０２）。

【0287】

図１５Ａおよび図１５Ｂは、Ｃａｓ１２ａ／ｃｈＲＤＡ核タンパク質複合体を使用して操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図１５Ａは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（図１５Ａ、１５０１）、ＴＲＡＣタンパク質（図１５Ａ、１５０２）、およびＢ２Ｍタンパク質（図１５Ａ、１５０３）を発現する細胞の割合を示す。ｘ軸は、処理されていない細胞（図１５Ａ、１５０４）、ＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子の両方を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトされた細胞（図１５Ａ、１５０５）、ならびにＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子の両方を標的とする両方Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトされており、かつ抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子およびＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合遺伝子をそれぞれコードするＤＮＡドナーを含む２種のウイルスで形質導入されている細胞（図１５Ａ、１５０６）を示す。ｙ軸は、フローサイトメトリーで測定された場合での様々な細胞表面マーカーに対する陽性細胞の割合を表す。図１５Ｂは、ＢＣＭＡ陽性標的細胞株に対する抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞（灰色の円形）、およびコントロールＴＲＡＣ ＫＯ Ｔ細胞（黒色の円形）に関するインビトロでの細胞傷害性アッセイの結果を示す。ｙ軸は、標的細胞の死滅率を表しており、ｘ軸は、使用されたＥ：Ｔ比を示す。各データ点は、各Ｅ：Ｔ比での３つの共培養ウェルの平均を表す。

【0288】

図１６Ａおよび図１６Ｂは、複数のリンカーおよび核局在化配列（ＮＬＳ）配置を含むＣａｓ１２ａ／ｃｈＲＤＮＡ核タンパク質複合体の細胞編集活性を示す。図１６Ａおよび図１６Ｂ中のグラフのｙ軸は、次世代配列決定により測定された場合での編集率を示した。図１６Ａでは、ｘ軸は、各リンカーＮＬＳ配置を示しており、各データ点は、測定の反復を表す。図１６Ｂでは、ｘ軸は、図１６Ａで示された上位４つのリンカー－ＮＬＳ設計および「最適化されていない」リンカー－ＮＬＳ配置（図１６Ｂ、１６１３）のＣａｓ１２ａおよびｃｈＲＤＮＡガイド（２０：６０または８０：２４０ｐｍｏｌ）のｐｍｏｌ濃度を示す。各データ点は、固有のガイド標的配列を表しており、かつデータ点毎に３回反復した測定の平均値である。図１７は、単一のトランスフェクション反応で複数のＣａｓ１２ａガイドを共送達する場合での、ＧＳ－ＳＶ４０（図７、１７０８；配列番号４７９）および（Ｇ４Ｓ）２－ＮＰＬ（図７、１７１２；配列番号４８９）を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の細胞編集活性を示す。図１７のｙ軸は、次世代配列決定により測定された場合での編集率を示した。図１７では、ｘ軸は、ＴＲＡＣ遺伝子（図１７、１７０１；配列番号３６）、Ｂ２Ｍ遺伝子（図１７、１７０２；配列番号６２）、ＣＩＳＨ遺伝子（図１７、１７０３；配列番号１５８）、またはＣＢＬＢ遺伝子（図１７、１７０４；配列番号１７１）として標的遺伝子を示す。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、トランスフェクション毎に単一のターゲティング複合体として使用したか（図１７、１７０５、および図１７、１７０９）、トランスフェクション毎に２つのターゲティング複合体として使用したか（図１７、１７０６、および図１７、１７１０）、またはトランスフェクション毎に４つのターゲティング複合体として使用した（図１７、１７０７、および図１７、１７１１）。各バーは、２～３回の反復の平均を表す。

【0289】

デオキシリボヌクレオチド塩基、および場合によりさらなる改変（例えば、塩基類似体、改変ヌクレオチド、脱塩基部位、改変骨格残基もしくは連結、またはこれらの組合わせ）を設計し得る特定のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を設計する方法は、公知である。例えば、Ｂｒｉｎｅｒ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２０１４，５６：３３３～３３９頁）を参照されたい。そのために、最初に、標的となる遺伝子のゲノム配列を同定する。選択された遺伝子の正確な領域は、具体的な用途によって決まるだろう。例えば、例えばＣＲＩＳＰＲ活性化またはＣＲＩＳＰＲ阻害を使用して標的遺伝子を活性化するかまたは抑制するために、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、目的の遺伝子の発現を駆動するプロモーターを標的とし得る。遺伝子ノックアウトの場合には、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、５’の構成的に発現されたエクソンを標的とするように設計して、代替スプライシングに起因するｍＲＮＡからの標的領域の除去の機会を低減させ得る。Ｎ末端付近のエクソンを標的とし得、なぜならば、ここでのフレームシフト変異は、機能していないタンパク質生成物の産生の可能性を増加させるからである。あるいは、コグネートＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、既知の必須タンパク質ドメインをコードするエクソンを標的とするように設計し得る。これに関して、挿入または欠失等の非フレームシフト変異は、タンパク質の機能に必須であるタンパク質ドメインで起こる場合には、タンパク質の機能を変更する可能性が高い。ＨＤＲを使用する遺伝子編集の場合には、標的配列は、所望の編集の場所に近くにあるべきである。この場合には、編集が望ましい場所を同定し、その近くの標的配列を選択する。

【0290】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体がＣａｓ１２タンパク質の切断部位の外側に結合し得るように設計し得る。この場合では、標的核酸は、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体と相互作用し得ず、標的核酸は切除される（例えば、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体から遊離する）。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体がＣａｓ１２タンパク質の切断部位の内側に結合し得るように設計し得る。この場合では、標的核酸は、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体と相互作用し得、標的核酸は結合し得る（例えば、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体に結合し得る）。

【0291】

Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＡガイド／核タンパク質複合体が核酸サンプル内の複数の位置にハイブリダイズし得るように設計し得る。複数のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、核酸サンプルに接触させ得る。複数のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、同一配列にハイブリダイズするように設計されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含み得る。複数のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、異なる標的配列にハイブリダイズするように設計されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含み得る。

【0292】

標的配列は、標的核酸内の異なる位置に存在し得る。これらの位置は、同一であるかまたは類似する標的核酸配列を含み得る。これらの位置は、異なる核酸配列を含み得る。これらの位置は、互いの距離に従って定義される。これらの位置は、１０キロベース（Ｋｂ）未満離れているか、８Ｋｂ未満離れているか、６Ｋｂ未満離れているか、４Ｋｂ未満離れているか、２Ｋｂ未満離れているか、１Ｋｂ未満離れているか、９００個未満のヌクレオチドで離れているか、８００個未満のヌクレオチドで離れているか、７００個未満のヌクレオチドで離れているか、６００個未満のヌクレオチドで離れているか、５００個未満のヌクレオチドで離れているか、４００個未満のヌクレオチドで離れているか、３００個未満のヌクレオチドで離れているか、２００個未満のヌクレオチドで離れているか、または１００個未満のヌクレオチドで離れている。

【0293】

Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、標的核酸を切断し得、その結果、下記の長さであり得る標的核酸を切除し得る：１０キロベース（Ｋｂ）未満の長さ、８Ｋｂ未満の長さ、６Ｋｂ未満の長さ、４Ｋｂ未満の長さ、２Ｋｂ未満の長さ、１Ｋｂ未満の長さ、９００個未満のヌクレオチドの長さ、８００個未満のヌクレオチドの長さ、７００個未満のヌクレオチドの長さ、６００個未満のヌクレオチドの長さ、５００個未満のヌクレオチドの長さ、４００個未満のヌクレオチドの長さ、３００個未満のヌクレオチドの長さ、２００個未満のヌクレオチドの長さ、または１００個未満のヌクレオチドの長さ。

【0294】

Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、１０キロベース（Ｋｂ）未満の長さ、８Ｋｂ未満の長さ、６Ｋｂ未満の長さ、４Ｋｂ未満の長さ、２Ｋｂ未満の長さ、１Ｋｂ未満の長さ、９００個未満のヌクレオチドの長さ、８００個未満のヌクレオチドの長さ、７００個未満のヌクレオチドの長さ、６００個未満のヌクレオチドの長さ、５００個未満のヌクレオチドの長さ、４００個未満のヌクレオチドの長さ、３００個未満のヌクレオチドの長さ、２００個未満のヌクレオチドの長さ、または１００個未満のヌクレオチドの長さであり得る断片化された標的核酸に結合し得る。

【0295】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、溶液中でのもしくは固体支持体上での化学等の公知の方法によりインビトロで合成し得るか、または、場合によっては、組換えにより製造し得る。単一の製造技術もしくは合成技術、または製造技術および合成技術の組合せを用いることができ、これらの技術では、デオキシリボヌクレオチド塩基および／または改変を、配列の長さにわたり１箇所またはそれ以上の位置で導入し得る。

【0296】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子、そのターゲティング領域、またはその活性化領域は、基準Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＡガイド分子、基準ターゲティング領域、または基準活性化領域（それぞれリボヌクレオチド塩基で構成されている）と比較した場合に、ある特定の位置でデオキシリボヌクレオチド塩基（および／または改変デオキシリボヌクレオチド塩基）を含むように設計されている。

【0297】

一部の実施形態では、基準Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、下記のＲＮＡ配列：ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含む。本開示のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（この基準ＲＮＡ配列に基づいて設計されている）として、１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０位のうちの１箇所またはそれ以上で１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を有するＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子が挙げられる。一部の実施形態では、これらの列挙された位置のうちの２３箇所以下、２２箇所以下、２１箇所以下、２０箇所以下、１９箇所以下、１８箇所以下、１７箇所以下、１６箇所以下、１５箇所以下、１４箇所以下、１３箇所以下、１２箇所以下、１１箇所以下、１０箇所以下、９箇所以下、８箇所以下、７箇所以下、６箇所以下、５箇所以下、４箇所以下、３箇所以下、２箇所以下、または１箇所は、デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基の全ては、標的配列と標準的な塩基対を形成する。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基のうちの少なくとも１つは、標的配列と標準的な塩基対を形成しない。

【0298】

一部の実施形態では、基準Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、下記のＲＮＡ配列：ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子（この基準ＲＮＡ配列に基づいて設計されている）として、１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０位のうちの１箇所またはそれ以上で１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子が挙げられる。一部の実施形態では、これらの列挙された位置のうちの２３箇所以下、２２箇所以下、２１箇所以下、２０箇所以下、１９箇所以下、１８箇所以下、１７箇所以下、１６箇所以下、１５箇所以下、１４箇所以下、１３箇所以下、１２箇所以下、１１箇所以下、１０箇所以下、９箇所以下、８箇所以下、７箇所以下、６箇所以下、５箇所以下、４箇所以下、３箇所以下、２箇所以下、または１箇所は、デオキシリボヌクレオチド塩基である。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基の全ては、標的配列と標準的な塩基対を形成する。一部の実施形態では、ターゲティング領域中の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基のうちの少なくとも１つは、標的配列と標準的な塩基対を形成しない。

【0299】

一部の実施形態では、基準活性化領域は、下記のＲＮＡ配列：ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵを含む。本開示のデオキシリボヌクレオチド塩基含有活性化領域（この基準ＲＮＡ配列に基づいて設計されている）として、１、３、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位のうちの１箇所またはそれ以上で１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を有する活性化領域が挙げられる。一部の実施形態では、これらの列挙された位置のうちの１１箇所以下、１０箇所以下、９箇所以下、８箇所以下、７箇所以下、６箇所以下、５箇所以下、４箇所以下、３箇所以下、２箇所以下、または１箇所は、デオキシリボヌクレオチド塩基である。

【0300】

一部の実施形態では、基準ターゲティング領域は、下記のＲＮＡ配列：ＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣを含む。本開示のデオキシリボヌクレオチド塩基含有ターゲティング領域（この基準ＲＮＡ配列に基づいて設計されている）として、１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上で１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を有するターゲティング領域が挙げられる。一部の実施形態では、これらの列挙された位置のうちの１２箇所以下、１１箇所以下、１０箇所以下、９箇所以下、８箇所以下、７箇所以下、６箇所以下、５箇所以下、４箇所以下、３箇所以下、２箇所以下、または１箇所は、デオキシリボヌクレオチド塩基である。

【0301】

一部の実施形態では、基準ターゲティング領域は、下記のＲＮＡ配列：ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。本開示のデオキシリボヌクレオチド塩基含有ターゲティング領域（この基準ＲＮＡ配列に基づいて設計されている）として、１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位のうちの１箇所またはそれ以上で１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド塩基を有するターゲティング領域が挙げられる。一部の実施形態では、これらの列挙された位置のうちの１２箇所以下、１１箇所以下、１０箇所以下、９箇所以下、８箇所以下、７箇所以下、６箇所以下、５箇所以下、４箇所以下、３箇所以下、２箇所以下、または１箇所は、デオキシリボヌクレオチド塩基である。

【0302】

一部の実施形態では、活性化領域は、配列ＴｒＡＡｒＵｒＵｒＵＣｒＵｒＡＣｒＵＣｒＵＴＧｒＵｒＡｒＧＡｒＵ（ここで、「ｒ」は、リボヌクレオチド塩基に先行しており；塩基に先行する「ｒ」の非存在は、デオキシリボヌクレオチド塩基を示す）を有する。

【0303】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、配列ＧｒＡｒＧｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＡＧｒＣｒＵｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＡＣ（ここで、「ｒ」は、リボヌクレオチド塩基に先行しており；塩基に先行する「ｒ」の非存在は、デオキシリボヌクレオチド塩基を示す）を有する。

【0304】

一部の実施形態では、ターゲティング領域は、配列ＡｒＧｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＧｒＵｒＧＡｒＡｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＧＴ（ここで、「ｒ」は、リボヌクレオチド塩基に先行しており；塩基に先行する「ｒ」の非存在は、デオキシリボヌクレオチド塩基を示す）を有する。

【0305】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドは、配列ＴｒＡＡｒＵｒＵｒＵＣｒＵｒＡＣｒＵＣｒＵＴＧｒＵｒＡｒＧＡｒＵＧｒＡｒＧｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＡＧｒＣｒＵｒＧｒＧｒＵｒＡｒＣｒＡＣ（ここで、「ｒ」は、リボヌクレオチド塩基に先行しており；塩基に先行する「ｒ」の非存在は、デオキシリボヌクレオチド塩基を示す）を有する。

【0306】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドは、配列ＴｒＡＡｒＵｒＵｒＵＣｒＵｒＡＣｒＵＣｒＵＴＧｒＵｒＡｒＧＡｒＵＡｒＧｒＵｒＧｒＧｒＧｒＧｒＧｒＵｒＧＡｒＡｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＵｒＧＴ（ここで、「ｒ」は、リボヌクレオチド塩基に先行しており；塩基に先行する「ｒ」の非存在は、デオキシリボヌクレオチド塩基を示す）を有する。

【0307】

Ｃａｓ１２タンパク質
本開示のＣａｓ１２タンパク質としては、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系由来のＣａｓ１２野生型タンパク質、改変Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１２タンパク質のバリアント、Ｃａｓ１２オルソログ、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、野生型Ｃａｓ１２ａタンパク質、改変Ｃａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｓ１２ａタンパク質のバリアント、Ｃａｓ１２ａオルソログ、またはこれらの組合せである。

【0308】

Ｃａｓ１２タンパク質を改変し得る。この改変は、アミノ酸に対する改変を含み得る。この改変はまた、一次アミノ酸配列、ならびに／また二次、三次、および／もしくは四次アミノ酸構造も変更し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を、このＣａｓ１２タンパク質の構造または機能に顕著な影響を及ぼすことなく変化させ得る。変異の種類は、タンパク質の一部の領域（例えば重要ではない領域）で変更が生じる場合には、重要ではない場合がある。置き換えの位置に応じて、変異は、結果として得られたバリアントの生物学的特性に大きな影響を及ぼさない場合がある。例えば、ある特定のＣａｓ１２バリアントの特性および機能は、野生型Ｃａｓ１２のものと同一タイプであり得る。

【0309】

一部の場合では、変異がＣａｓ１２タンパク質の構造および／または機能に決定的な影響を及ぼし得るかどうかを、配列および／または構造アラインメントを使用して決定し得る。配列アラインメントにより、ポリペプチドの類似しているおよび／または類似していない領域（例えば、保存されている、保存されていない、疎水性、親水性等）を同定し得る。ある場合では、他の配列と類似している目的の配列中の領域が、改変に適している。他の場合では、他の配列と類似していない目的の配列中の領域が、改変に適している。例えば、配列アライメントを、データベース検索、ペアワイズアラインメント、多重配列アラインメント、ゲノム解析、モチーフ発見、ベンチマーキング、ならびに／またはプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＨＨＰＲＥＤ、ｐｓｉ－ＢＬＡＳＴ、ＬＡＬＩＧＮ、ＰｙＭＯＬ、およびＳＥＱＡＬＮにより実施し得る。構造アラインメントを、Ｄａｌｉ、ＰＨＹＲＥ、Ｃｈｉｍｅｒａ、ＣＯＯＴ、Ｏ、およびＰｙＭＯＬ等のプログラムにより実施し得る。アラインメントを、データベース検索、ペアワイズアラインメント、多重配列アラインメント、ゲノム解析、モチーフ発見、もしくはベンチマーキング、またはこれらの任意の組合せにより実施し得る。

【0310】

Ｃａｓ１２タンパク質は、典型的には、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）、ヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）、Ｗｅｄｇｅ（ＷＥＤ）、およびＲｕｖＣドメインに対応する６つのドメインからなる。例えば、Ｙａｍａｎｏ他（Ｃｅｌｌ、２０１６、１６５（４）：９４９～９６２頁）を参照されたい。ＷＥＤドメインおよびＲｕｖＣドメインは、他のドメインからの配列により中断されている三連配列構造を有し得る。例えば、アシダミノコッカス種Ｃａｓ１２ａ ＷＥＤドメイン配列は、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、およびＰＩドメイン配列により中断されている。加えて、Ｃａｓ１２タンパク質のある特定のサブタイプは、ＲｕｖＣドメイン配列に隣接しているかまたはＲｕｖＣドメイン配列間に生じる架橋ヘリックスドメインを含む。

【0311】

Ｃａｓ１２タンパク質の領域を改変して、Ｃａｓ１２タンパク質の活性を調節し得る。例えば、ＰＩドメイン（５９８～７１８）およびにＷＥＤドメイン（５２６～５９７および７１９～８８３）の残基に対応するアシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａタンパク質の領域を改変して、ＰＡＭ特異性を変更し得る。例えば、Ｔｏｔｈ他（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０２０、４８（７）：３７２２～３７３３頁）を参照されたい。ＲＥＣ１（２４～３１９）およびＲＥＣ２（３２０～５２６）ドメインの残基に対応するアシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａタンパク質中の領域を改変して、ターゲットへの会合および切断の動態を変更し得る。ＲＥＣ１（２２６～３０４）およびＲＥＣ２（３６８～４３５）ドメインの領域は、標的結合配列および標的配列のＰＡＭ遠位末端と直接的に相互作用しており、標的配列の切断の効率を改変するように操作される。Ｎｕｃドメイン（１０６６～１２６１）およびＲｕｖＣドメイン（９４０～９５６、９５７～１０６５、および１２６１～１３０７）の領域を改変して、標的配列の標的鎖、非標的鎖、または標的鎖および非標的鎖の切断効率を変更し得る。これらの領域の操作は、変異の導入、他のＣａｓ１２オルソログからの対応する領域との置き換え、欠失、挿入等を含み得る。

【0312】

改変Ｃａｓ１２タンパク質を、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子と組み合わせて使用して、Ｃａｓ１２タンパク質の活性または特異性を変更し得る。一部の場合には、Ｃａｓ１２タンパク質を改変して、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子と複合体化した場合に活性または特異性を増強させ得、このＣａｓ１２改変は、ＲＥＣ１、ＲＥＣ２、ＲｕｖＣ、ＷＥＤ、および／またはＮｕｃのドメインで生じる。一部の場合には、Ｃａｓ１２タンパク質を改変して、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子と複合体化した場合に活性または特異性を増強させ得、このＣａｓ１２ａ改変は、２２６～３０４、３６８～４３５、９４０～９５６、９７８～１１５８、１１５９～１１８０、および１１８１～１２９８（アシダミノコッカス種Ｃａｓ１２ａ配列に基づく付番）の領域で生じる。

【0313】

そのような変異を、部位特異的変異誘発により生じさせ得る。変異として、置換、付加、欠失、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の場合には、変異により、変異するアミノ酸がアラニンへと変換される。他の場合には、変異により、変異するアミノ酸が別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）へと変換される。変異により、変異するアミノ酸が非天然アミノ酸（例えばセレノメチオニン）へと変換される。変異により、変異するアミノ酸がアミノ酸模倣物（例えばリン模倣物）へと変換される。変異は、保存的変異であり得る。例えば、変異により、変異するアミノ酸が、変異するアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、高次構造、および／または回転異性体と類似するアミノ酸へと変換される（例えば、システイン／セリン変異、リシン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。

【0314】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、ｎＣａｓ１２タンパク質である。ｎＣａｓ１２タンパク質は、ヌクレアーゼが欠損しているＣａｓ１２タンパク質のバリアントであり、「ニッキングＣａｓ１２」または「Ｃａｓ１２－ニッカーゼ」とも称される。そのような分子は、エンドヌクレアーゼ活性の一部を欠いており、従って、標的核酸の一方の鎖のみに切れ目を入れることができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１頁）を参照されたい。このことは、例えば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに変異を導入することにより達成される。そのような改変の非限定的な例として、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ１２ａタンパク質のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに対するＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、およびＤ１２２５Ａが挙げられる。ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの活性を低減させるための他の触媒残基の変異も当業者により実行されることが理解される。得られたｎＣａｓ１２タンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断し得ないが、ガイド分子と複合体化する能力、標的ＤＮＡ配列に結合する能力、および標的ＤＮＡの一方の鎖のみに切れ目を入れる能力を保持する。ターゲティング特異性は、ＰＡＭ配列へのＣａｓ１２タンパク質の結合、およびゲノム遺伝子座へのガイド分子の相補的な塩基対形成により決定される。本開示の一部の実施形態では、ｎＣａｓ１２タンパク質は、ｎＣａｓ１２ａタンパク質である。

【0315】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、ｄＣａｓ１２タンパク質である。ｄＣａｓ１２タンパク質は、ヌクレーゼで不活性化されているＣａｓ１２タンパク質のバリアントであり、「触媒的に不活性なＣａｓ１２タンパク質」、「酵素的に不活性なＣａｓ１２」、「触媒的に死滅したＣａｓ１２」、または「死滅Ｃａｓ１２」とも称される。そのような分子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠いており、従って、ＲＮＡガイド的に遺伝子を制御するために使用される。例えば、Ｊｉｎｅｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１頁）を参照されたい。当業者は、ＲｕｖＣドメインの活性を除去するための触媒残基の変異を実行し得る。得られたｄＣａｓ１２タンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断し得ないが、ガイド分子と複合体化する能力、および標的ＤＮＡ配列に結合する能力を保持する。ターゲティング特異性は、ＰＡＭ配列へのＣａｓ１２タンパク質の結合、およびゲノム遺伝子座へのガイド分子の相補的な塩基対形成により決定される。本開示の一部の実施形態では、ｄＣａｓ１２タンパク質は、ｄＣａｓ１２ａタンパク質である。

【0316】

ある特定のＣａｓ１２タンパク質サブタイプは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインの不活性化、またはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインの一部もしくは全部の欠落に起因して、ヌクレアーゼ活性を欠いている。そのようなサブタイプの１つであるＶ－Ｋ型および関連タンパク質Ｃａｓ１２ｋは、代わりに、Ｔｎ７様転位性エレメントｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ｔｎｉＱに関連している。例えば、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１９、３６４（６４４８）：４８～５３頁）を参照されたい。Ｃａｓ１２ｋは、ガイド分子と複合体化する能力、および標的ＤＮＡ配列に結合する能力を保持しており、関連するＴｎ７様タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされるＤＮＡ配列の転位を促進する。本開示の一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、Ｃａｓ１２ｋ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体である。

【0317】

他のアミノ酸変更として、グリコシル化形態のアミノ酸、他の分子との凝集性コンジュゲート、および無関係な化学実体（例えばペグ化分子）との共有結合的コンジュゲートが挙げられる。共有結合的バリアントを、アミノ酸鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基で見出される基と官能基とを連結することにより製造し得る。一部の場合では、変異した部位特異的ポリペプチドとして、対立遺伝子バリアントおよび種バリアントも挙げられる。

【0318】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質由来の第１のドメインと、Ｃｓｙ４タンパク質等の異なるタンパク質由来の第２のドメインとを含む融合タンパク質またはキメラタンパク質であり得る。Ｃａｓ１２タンパク質への融合改変により、改変Ｃａｓ１２タンパク質に追加の活性が付与される。そのような活性としては、核酸標的配列に関連するポリペプチド（例えばヒストン）を改変するヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、逆転写酵素活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、および／またはミリストイル化活性もしくは脱ミリストイル化活性が挙げられる。

【0319】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質は、１つまたはそれ以上のＮＬＳ配列（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質配列に付加されているおよび／またはその内に挿入されている）を含み得る。ＮＬＳ配列は、例えば、Ｎ末端に位置し得るか、Ｃ末端に位置し得るか、Ｃａｓ１２タンパク質（例えばＣａｓ１２ａタンパク質）内部に位置し得るか、またはこれらの組合せを含み得る（例えば、Ｎ末端における１つまたはそれ以上のＮＬＳ、およびＣ末端における１つまたはそれ以上のＮＬＳ）。

【0320】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含むＣａｓ１２タンパク質は、複数のＮＬＳ配列、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＮＬＳ配列を含み得る。複数のＮＬＳ配列は、Ｃａｓ１２ａタンパク質の単一の末端に存在し得る（例えば、ＮＬＳ配列は、Ｎ末端またはＣ末端のみに存在している）か、または両方の末端に存在し得る（例えば、Ｎ末端における１つまたはそれ以上のＮＬＳ配列、およびＣ末端における１つまたはそれ以上のＮＬＳ配列）。ＮＬＳ配列は、完全合成であり得るか、改変されているか、または内在性もしくは外来性のタンパク質配列に由来し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含むＣａｓ１２タンパク質は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、ヌクレオプラスミン、５３ＢＰ１、ＶＡＣＭ－１／ＣＵＬ５、ＣＸＣＲ４、ＶＰ１、ＩＮＧ４、ＩＥＲ５、ＥＲＫ５、ＵＬ７９、ＥＷＳ、Ｈｒｐ１、ｃＭｙｃ（１）、ｃＭｙｃ（２）、マウスｃ－ａｂｌｅ ＩＶ、Ｍａｔα２、およびＭＩＮＩＹＯから選択されるＮＬＳ配列を含み得るか、またはこのＮＳＬ配列から改変されているかもしくはこのＮＳＬ配列に由来し得る。

【0321】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質を含むＣａｓ１２タンパク質は、配列番号０４、０５、および４９３～５０７のうちのいずれかから選択されるＮＬＳ配列を含み得るか、またはこのＮＬＳ配列から改変されているかもしくはこのＮＬＳ配列由来し得る。改変されているかもしくは由来するＮＬＳ配列は、参照ＮＬＳ配列（例えば、配列番号０４、０５、および４９３～５０７のうちのいずれかから選択されるＮＬＳ配列）に関して、例えば、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個のアミノ酸置換；５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個のアミノ酸欠失、および／または５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、もしくは１個のアミノ酸付加を含み得る。

【0322】

一部の実施形態では、ＮＬＳ配列は、例えば、配列番号０４、０５、および４９３～５０７のうちのいずれかから選択されるＮＬＳ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

【0323】

ＮＬＳ配列は、直接的にまたはリンカーポリペプチドを介して、（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質に、別のＮＬＳ配列に、またはＣａｓ１２タンパク質に付着した融合ペプチド配列に）共有結合的に付着し得る。リンカー配列の長さは、特定のＣａｓ１２タンパク質の構造特性（例えば、末端の溶媒アクセス性、末端における他の重要な機能的ペプチド配列の存在等）に応じて最適化されて、コグネートインポーチンタンパク質の結合および輸送のためのＮＬＳ配列のアクセス性が確保される。加えて、本明細書の実施例１１で説明されているように、望ましいリンカー長を経験的にスクリーニングすることも可能である。

【0324】

一部の実施形態では、ＮＬＳ配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸を含むリンカー配列を介して、（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質に、別のＮＬＳ配列に、またはＣａｓ１２タンパク質に付着した融合ペプチド配列に）共有結合的に付着している。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１つのグリシン、セリン、および／またはスレオニン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基、および少なくとも１つのセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、複数のグリシン残基、および少なくとも１つのセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＧＳ配列からなるか、またはＧＳ配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ配列からなるか、またはＧＧＧＧＳ配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列からなるか、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ配列を含む。

【0325】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、少なくとも１つのリンカー配列、および少なくとも１つのＮＬＳ配列を含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのＮＬＳ配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、およびヌクレオプラスミン、またはそれらから改変されたかもしくはそれらに由来する配列から選択される。

【0326】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列、およびヌクレオプラスミンＮＬＳ配列を含み、ヌクレオプラスミンＮＬＳ配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列のＣ末端側に位置している。

【0327】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、少なくとも１つのＧＳリンカー配列、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列、およびヌクレオプラスミンＮＬＳ配列を含み、ヌクレオプラスミンＮＬＳ配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列のＣ末端側に位置している。その一部の実施形態では、第１のＧＳリンカー配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列のＮ末端側に存在しており、第２のＧＳリンカー配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列とヌクレオプラスミンＮＬＳ配列との間に存在している。

【0328】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、ＧＳリンカー配列、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列、およびヌクレオプラスミンＮＬＳ配列を含み、ヌクレオプラスミンＮＬＳ配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列のＣ末端側に位置している。その一部の実施形態では、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列のＮ末端側に存在しており、ＧＳリンカー配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列とヌクレオプラスミンＮＬＳ配列との間に存在している。

【0329】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列、およびＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列を含み、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー配列のＣ末端側に位置している。

【0330】

一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、Ｃ末端において、リンカーおよびＮＬＳ含有配列を含む。一部の実施形態では、このリンカーおよびＮＬＳ含有配列は、配列番号４７９～４９０から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、このリンカーおよびＮＬＳ含有配列は、配列番号４７９～４９０から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

【0331】

コグネートＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体をまた、当該技術分野で周知の方法を使用しても製造し得る。Ｃａｓ１２タンパク質成分を、組換えにより製造し、次いで、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子およびＣａｓ１２タンパク質を、当該技術分野で公知の方法を使用して合せて複合体化し得る。例えば、ガイド分子／Ｃａｓ１２タンパク質を含む核タンパク質複合体を構築する方法の非限定的な例を提供する実施例２を参照されたい。

【0332】

加えて、Ｃａｓ１２タンパク質を構成的に発現する細胞株を開発し得、かつＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド成分でトランスフェクトし得、複合体を、アフィニティ、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィー等、これらに限定されない標準的な精製技術を使用して細胞から精製し得る。例えば、Ｊｉｎｅｋ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１頁）を参照されたい。

【0333】

公知の方法によれば、Ｃａｓ１２タンパク質を、Ｃａｓ１２タンパク質をコードする発現カセットを使用して製造し得る。発現カセットは、典型的には、この発現カセットが導入される宿主細胞中で機能する調節配列を含む。調節配列は、下記のうちの１つまたはそれ以上に関与する：転写の調節、転写後調節、および翻訳の調節。発現カセットは、発現ベクター中に存在し得、かつ細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞を含む、多種多様な宿主細胞に導入される。

【0334】

Ｃａｓ１２タンパク質を、Ｃａｓ１２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）で製造し得る。Ｃａｓ１２タンパク質の製造に有用なベクターとして、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、および組込み可能な核酸断片（即ち、相同組換えにより宿主ゲノムに組込み可能な断片）が挙げられる。ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製して機能するか、または場合によっては、ゲノム自体に組み込まれる。好適な複製ベクターは、意図された発現宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよびコントロール配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または構成性プロモーターに作動可能に連結されている。発現ベクターは、タンパク質タグ（例えば、ポリＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質タグ、生物発光タグ、核局在化タグ）をコードするポリヌクレオチドも含み得る。そのようなタンパク質タグのコード配列は、コード配列と融合するか、または発現カセット（例えばターゲティングベクター）に含まれる。

【0335】

発現ベクターの構築のための一般的な方法は、当該技術分野で公知である。ほとんどの宿主細胞用の発現ベクターが市販されている。昆虫細胞の形質転換および昆虫細胞中での遺伝子発現用の昆虫細胞ベクター、細菌の形質転換および細菌細胞中での遺伝子発現用の細菌プラスミド、細胞の形質転換ならびに酵母および他の真菌中での遺伝子発現用の酵母プラスミド、哺乳動物細胞の形質転換および哺乳動物細胞または哺乳動物中での遺伝子発現用の哺乳動物ベクター、細胞の形質転換および遺伝子発現用のウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノウイルスベクターを含む）等の適切なベクターの選択およびその構築を容易にするように設計されたいくつかの市販のソフトウェア製品、ならびにそのようなポリヌクレオチドのクローニングを容易に可能にするための方法が存在している。例えば、ＳｎａｐＧｅｎｅ（商標）（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ、ＣｈｉｃａｇｏＩｌｌ．；ｓｎａｐｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｆｉｌｅｓ／ｙｏｕｒ＿ｔｉｍｅ＿ｉｓ＿ｖａｌｕａｂｌｅ／）は、ベクター、個々のベクター配列、およびベクターマップの幅広いリスト、ならびに多くのベクターの商業的供給源を提供する。使用に適した多数の哺乳動物ベクターが市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ；ＮｅｏＢｉｏｌａｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；ＡＴＵＭ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ；Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから）。

【0336】

哺乳動物ウイルスに由来するベクターも、哺乳動物細胞中で本方法のＣａｓ１２タンパク質成分を発現させるために使用し得る。これとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニア、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスに由来するベクターが挙げられる。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ他（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２０００、１６：１５１～１６０頁）；およびＣｏｏｒａｙ他（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０１２、５０７：２９～５７頁）を参照されたい。Ｃａｓ１２タンパク質コード配列に作動可能に連結された調節配列としては、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位、および同類のものが挙げられる。一般的に使用されるプロモーターは、構成性哺乳動物プロモーターであるＣＭＶ、ＭＮＤ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（マウスまたはヒト）、Ｕｂｃ、ＣＡＧ、ＣａＭＫＩＩａ、およびベータ－Ａｃｔであり、他は当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｈａｎ他（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、２０１３、３：２５７～２６３頁）を参照されたい。さらに、Ｈ１およびＵ６を含む、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用し得る。

【0337】

遺伝子産物の発現には、ＨＥＫ ２９３（ヒト胚性腎臓）およびＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）を含む、多くの哺乳動物細胞株が利用されている。この細胞株に、標準的な方法（例えば、リン酸カルシウムまたはポリエチレンイミン（ＥＰＩ）、またはエレクトロポレーションを使用する）によりトランスフェクトし得る。他の典型的な哺乳動物細胞株としては、ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、５４９、ＨＴ１０８０、ＣＡＤ、Ｐ１９、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｎ２ａ、ヒト胚腎２９３細胞、ＭＣＦ－７、Ｙ７９、ＳＯ－Ｒｂ５０、Ｈｅｐ Ｇ２、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、Ｊ５５８Ｌ、およびベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞は、Ｃａｓ１２タンパク質を製造するために使用される細胞の例である。

【0338】

ベクターを、原核生物に導入してそこで増殖させ得る。原核生物ベクターは、当該技術分野で周知である。典型的には、原核生物ベクターは、標的宿主細胞に適した複製起点（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｏｒｉＣ、ｐＢＲ３２２由来のｐＵＣ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）由来のｐＳＣ１０１）、１５Ａ起点（ｐ１５Ａ由来）、および細菌人口染色体を含む。ベクターは、選択可能マーカー（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、およびカナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子）を含み得る。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、および哺乳動物細胞株での選択に使用し得る。従って、いくつかの生物での選択作作業のためのＺｅｏｃｉｎ（商標）に対する１つの薬物耐性遺伝子のみを有するベクターを設計し得る。有用なプロモーターは、原核生物中でのタンパク質の発現で知られており、例えば、Ｔ５、Ｔ７、Ｒｈａｍｎｏｓｅ（誘導性）、Ａｒａｂｉｎｏｓｅ（誘導性）、およびＰｈｏＡ（誘導性）である。さらに、Ｔ７プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするベクターで広く使用されている。原核生物ベクターはまた、様々な強度のリボソーム結合部位、および分泌シグナル（例えば、ｍａｌ、ｓｅｃ、ｔａｔ、ｏｍｐＣ、およびｐｅｌＢ）も含み得る。加えて、ベクターは、ＮＡＴＮＡの発現用のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得る。原核生物のＲＮＡポリメラーゼの転写終結配列も周知である（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの転写終結配列）。

【0339】

原核生物中でのタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指示する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターにより、大腸菌中で頻繁に実行される。しかしながら、他の原核生物系を使用するタンパク質発現は、本開示の範囲内である。

【0340】

一部の実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターである。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２、およびｐｉｃＺが挙げられるが、これらに限定されない。酵母細胞での遺伝子発現の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００４、１９４巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡでの「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ Ａ」）を参照されたい。典型的には、酵母でのタンパク質コード遺伝子の発現には、目的のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、および転写ターミネーターが必要である。様々な酵母プロモーターを使用して、酵母での遺伝子の発現用の発現カセットを構築し得る。

【0341】

Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用する細胞のゲノム編集
本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子、Ｃａｓ１２タンパク質、およびＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの細胞への送達を、当業者に公知のいくつかの方法により達成し得る。これらの成分を細胞に導入するための非限定的な方法として、ウイルスベクター送達、ソノポレーション、細胞圧迫、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、パーティクルガン技術、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、または化学物質（例えば細胞透過ペプチド）が挙げられる。

【0342】

一部の実施形態では、エレクトロポレーションを使用して、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を細胞に送達し得る。エレクトロポレーションを使用して、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体も送達し得る。これらの方法では、ｃｈＲＤＮＡガイド分子またはＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、エレクトロポレーション緩衝液中で標的細胞と混合して、懸濁液を形成する。次いで、この懸濁液に、最適な電圧で電気パルスを印加し、それにより、細胞膜のリン脂質二重層に孔が一時的に形成され、この孔を通って（核酸およびタンパク質のような）荷電分子を細胞中に運ぶことが可能になる。エレクトロポレーションを実施するための試薬および機器は、市販されている。

【0343】

実施例３は、Ｃａｓ１２ガイド／核タンパク質複合体による活性化Ｔ細胞のヌクレオフェクションを示す。実施例５は、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による活性化Ｔ細胞のヌクレオフェクションを示す。

【0344】

Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して、標的核酸を切断し得るか、またはそれに結合し得る。Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を、Ｃａｓ１２タンパク質と共に細胞に導入し得、それにより、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体が形成される。Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ＰＡＭを含む、標的核酸にハイブリダイズし得る。一実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチド（例えば二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））中の核酸標的配列に結合する方法であって、細胞への導入のために１種またはそれ以上のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を準備すること、およびＣａｓ１２核タンパク質複合体を細胞中に送達し、それにより、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体と標的ポリヌクレオチド配列との接触を促進することを含む方法を包含する。一実施形態では、第１のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ポリヌクレオチド中の第１の核酸標的配列と相補的な第１のターゲティング領域エレメントを有するＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含み、第２のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ポリヌクレオチド中の第２の核酸標的配列と相補的な第２のターゲティング領域を有するＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含む。Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体とポリヌクレオチドとの接触により、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列に結合する。一実施形態では、ポリヌクレオチド中において、第１のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、第１の核酸標的配列に結合し；第２のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、第２の核酸標的配列に結合する。

【0345】

核酸標的配列に結合するそのような方法を、インビトロ（例えば、生化学反応中または培養細胞中；一部の実施形態では、培養細胞は、培養液中に留まっておりヒトには導入されないヒト培養細胞である）で実行し得るか；インビボで（例えば、生体の細胞中、但し、一部の実施形態では、生物は、非ヒト生物であるという条件で）実行し得るか；またはエクスビボで（例えば、対象から取り出された細胞、但し、一部の実施形態では、対象は、非ヒト対象であるという条件で）実行し得る。

【0346】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子、Ｃａｓ１２タンパク質、およびＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の細胞への送達を、この成分を生物学的区画にパッケージすることにより達成し得る。この成分を含む生物学的区画を、インビボで（例えば、生体の細胞中、但し、一部の実施形態では、生物は、非ヒト生物であるという条件で）投与し得る。生物学的区画としては、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノカプセル、小胞、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0347】

例えば、生物学的区画は、リポソームを含み得る。リポソームは、１つまたはそれ以上の脂質二重層を含む自己集合性構造であり得、これらの脂質二重層のそれぞれは、反対向きの両親媒性脂質分子を含む２つの単層を含み得る。両親媒性脂質は、１つもしくは２つまたはそれ以上の非極性（疎水性）アクリルまたはアルキル鎖に供給結合的に連結された極性（親水性）頭部基を含み得る。疎水性アシル鎖と周囲の水性媒体との間のエネルギー的に不利な接触により、両親媒性脂質分子は、極性頭部基が二重層の表面に向かって配向され、アシル鎖が二重層の内部に向かって配向されるように配置され、アシル鎖と水性環境との接触を効果的に遮断することができる。

【0348】

リポソームで使用される好ましい両親媒性化合物の例として、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質が挙げられ、これらの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、卵スフィンゴミエリン、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0349】

生物学的区画は、ナノ粒子を含み得る。ナノ粒子は、約４０ナノメートル～約１．５マイクロメートル、約５０ナノメートル～約１．２マイクロメートル、約６０ナノメートル～約１マイクロメートル、約７０ナノメートル～約８００ナノメートル、約８０ナノメートル～約６００ナノメートル、約９０ナノメートル～約４００ナノメートル、または約１００ナノメートル～約２００ナノメートルの直径を含み得る。一部の場合では、ナノ粒子のサイズが増加すると、放出速度が遅延されるかまたは延長され、ナノ粒子のサイズが減少すると、放出速度が増加する。

【0350】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、生物学的区画にパッケージする。一部の場合では、Ｃａｓ１２をコードする核酸、および化学的に合成されたｃｈＲＤＮＡガイドを、生物学的区画にパッケージする。一部の場合では、Ｃａｓ１２をコードするｍＲＮＡ、および化学的に合成されたｃｈＲＤＮＡガイドを、生物学的区画にパッケージする。

【0351】

核酸配列とポリペプチドとの間の相互作用を評価するためのおよび／または定量するための様々な方法が当該技術分野で公知であり、以下：免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡプルダウンアッセイ、ならびにマイクロプレート捕捉および検出アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法の多くを実施するために市販のキット、材料、および試薬が利用可能であり、例えば、下記の供給業者から入手し得る：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｓｉｇｎｏｓｉｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ポリペプチドと核酸配列との間の相互作用を検出するための一般的なアプローチは、ＥＭＳＡである（例えば、Ｈｅｌｌｍａｎ Ｌ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（８）：１８４９～１８６１頁（２００７）を参照されたい）。

【0352】

別の実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチド中の核酸標的配列を切断する（例えば、ｄｓＤＮＡ中での一本鎖切断、またはｄｓＤＮＡ中での二本鎖切断）方法であって、細胞への導入のために１種またはそれ以上のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を準備すること、およびＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を細胞中に送達し、それにより、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体とポリヌクレオチドとの接触を促進することを含む方法を包含する。一実施形態では、ポリヌクレオチド中の第１の核酸標的配列と相補的な第１のターゲティング領域を有する第１のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含む第１のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体；およびポリヌクレオチド中の第２の核酸標的配列と相補的な第２のターゲティング領域を有する第２のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を含む第２のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、細胞に導入する。この接触により、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体によってポリヌクレオチド（例えばｄｓＤＮＡ）中の核酸標的配列が切断される。一実施形態では、第１のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ｄｓＤＮＡ中の第１の核酸標的配列に結合してこのｄｓＤＮＡの第１の鎖を切断し；第２のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、ｄｓＤＮＡ中の第２の核酸標的配列に結合してこのｄｓＤＮＡの第２の鎖を切断する。一部の実施形態では、核酸標的配列は、ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。核酸標的配列に結合するそのような方法を、インビトロで、細胞中（例えば培養細胞中）で、エクスビボ（例えば、対象から取り出された幹細胞）で、およびインビボで実行する。

【0353】

標的核酸配列は、例えば、ポリヌクレオチド配列もしくはゲノム中の所望の位置、および／または欠失するかもしくは破壊されるポリヌクレオチド配列もしくはゲノム中の所望の遺伝子配列に基づいて適切に選択される。

【0354】

ポリヌクレオチド中の核酸標的配列を切断する追加の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドも細胞に導入して、このドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部の細胞のゲノムＤＮＡ中への組込みを促進し得る。典型的には、ドナーポリヌクレオチドは、部位特異的標的核酸切断に近接し、二本鎖切断の部位へのドナーポリヌクレオチドの挿入（例えば相同組換え）が増強される。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖切断を生じるＣａｓ１２タンパク質（例えばＣａｓ１２ａ）に結合することにより、標的核酸中の二本鎖切断の部位に近接する。

【0355】

ドナーポリヌクレオチド配列は、例えば追求される所望の改変に基づいて、適切に選択される。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、目的のタンパク質の全てまたは一部をコードし得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードし得る。

【0356】

本開示は、さらに、ウイルスによる細胞へのドナーポリヌクレオチドの送達であって、このドナーポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする、送達を包含する。

【0357】

一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、二本鎖であり得る。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、小環状であり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドであり得る。一部の実施形態では、プラスミドは、超らせんであり得る。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、メチル化されている。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、メチル化されていない。ドナーポリヌクレオチドは、改変を含み得る。改変として、本明細書で説明されているものが挙げられ、例えば、ビオチン化、化学的コンジュゲート、および合成ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0358】

治療用組成物、適用、および方法
本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子、およびＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、改変細胞（例えばＣＡＲ発現細胞）の製造で使用し得る。そのような改変細胞を、例えば、細胞療法（例えば、細胞の投与による疾患の処置または予防）の分野で使用し得、特に、養子細胞療法に使用し得る。そのように投与された細胞は、例えば、遺伝子改変養子細胞であり得る。遺伝子改変を、１つまたはそれ以上の送達技術を使用して、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド分子およびＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により養子細胞に導入し得る。本開示は、例えば、それらが投与されるレシピエントに関して自己であるかまたは同種である細胞の改変および投与を包含する。本明細書で使用される場合、「同種」という用語は、同一種の遺伝的に同一ではない、異なる個体を指す。例えば、同種細胞は、（この細胞が投与されるレシピエントに関して）同種の遺伝的に同一ではない、異なる個体に由来する細胞を指す。これに対して、「自己」という用語は、同一個体を指す。例えば、個体に投与される自己細胞は、その同じ個体に由来する細胞（改変もしくは非改変、またはその改変もしくは非改変子孫）を指す。

【0359】

「養子細胞」は、細胞療法処置での使用のために遺伝子改変される細胞を指す。養子細胞としては、幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、膵臓前駆細胞、および同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0360】

「幹細胞」は、自己再生能力（即ち、未分化状態を維持しつつ細胞分裂サイクルを多数繰り返す能力）を有する細胞を指す。幹細胞は、全能性、多能性、複能性、少能性、または単能性であり得る。幹細胞は、胚性幹細胞、胎児性幹細胞、羊水性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞である。

【0361】

「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、非多能性細胞（典型的には体細胞）から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種を指す。一部の実施形態では、体細胞は、ヒト体細胞である。体細胞の例としては、真皮線維芽細胞、骨髄由来間葉細胞、心筋細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、胃細胞、神経幹細胞、肺細胞、腎細胞、脾細胞、および膵細胞が挙げられるが、これらに限定されない。体細胞のさらなる例として、免疫系の細胞が挙げられ、この免疫系の細胞としては、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、先天性リンパ系細胞、巨核球、単球／マクロファージ、骨髄由来サプレッサ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、および造血幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。多能性幹細胞は、体細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ様細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞様細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞様細胞、樹状細胞、樹状様細胞、マクロファージ、およびマクロファージ様細胞を含む、複数の細胞型に分化される。多能性幹細胞を、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により、分化の前または後に編集し得る。ｉＰＳＣを、ＣＡＲをコードする配列等の外来性遺伝子または配列のゲノムへの導入により、分化の前または後にさらに改変し得る。

【0362】

「造血幹細胞」は、リンパ球等の造血細胞に分化する能力を有する未分化細胞を指す。

【0363】

「リンパ球」は、脊椎動物の免疫系の一部である白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））を指す。「リンパ球」という用語に同様に包含されるのは、リンパ球細胞を生じる造血幹細胞である。リンパ球としては、細胞媒介性細胞傷害性適応免疫のＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞；アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞；制御性Ｔ細胞、例えばＴｒｅｇ細胞；細胞媒介性細胞傷害性自然免疫で機能するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；および液性抗体駆動性適応免疫のためのＢ細胞；ＮＫ／Ｔ細胞；サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）；および抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞が挙げられる。リンパ球は、ヒト細胞等の哺乳動物細胞であり得る。

【0364】

「リンパ球」という用語に同様に包含されるのは、本明細書で使用される場合、標的細胞のタンパク質または（糖）脂質抗原を認識し得る１つまたはそれ以上の特定の天然に存在するかまたは操作されたＴ細胞受容体を発現するように遺伝的に操作されたＴ細胞受容体操作Ｔ細胞（ＴＣＲ）である。これらの抗原の小さい断片（例えばペプチドまたは脂肪酸）は、標的細胞表面に移されて、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の一部としてＴ細胞受容体に提示される。抗原負荷ＭＨＣへのＴ細胞受容体の結合により、リンパ球が活性化される。

【0365】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）もまた、本明細書中で使用される場合には、「リンパ球」という用語に包含される。ＴＩＬは、腫瘍内外の環境（「腫瘍微小環境」）に侵入した免疫細胞である。ＴＩＬは、典型的には、腫瘍細胞および腫瘍微小環境から単離されて、腫瘍抗原に対する高い反応性に関してインビトロで選択される。ＴＩＬは、インビボで存在する寛容化の影響を克服する条件下にてインビトロで増殖され、次いで、処置のために対象に導入される。

【0366】

「リンパ球」という用語はまた、遺伝子改変Ｔ細胞およびＮＫ細胞（例えば、Ｔ細胞表面またはＮＫ細胞表面でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように改変されたもの（ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞））も包含する。

【0367】

リンパ球を、対象（例えばヒト対象）から単離し得、例えば、例えばＴＩＬの場合等には血液もしくは固体腫瘍から単離し得るか、またはリンパ器官（例えば、胸腺、骨髄、リンパ節、および粘膜関連リンパ組織）から単離し得る。リンパ球を単離する技術は、当該技術分野で周知である。例えば、リンパ球を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し得、ＰＢＭＣは、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、血液の層を分離する親水性多糖、および密度勾配遠心分離を使用して全血から分離される。通常、抗凝固剤または脱線維血液検体は、Ｆｉｃｏｌｌ溶液の上部で層状になり、遠心分離されて細胞の異なる層が形成される。底部層は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））を含み、赤血球は、Ｆｉｃｏｌｌ培地により回収されるかまたは凝集され、底部まで完全に沈む。次の層は、顆粒球を主に含有し、顆粒球もまた、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ溶液を通過して下方に移動する。次の層は、リンパ球を含み、リンパ球は、典型的には、単球および血小板と一緒に、血漿とＦｉｃｏｌｌ溶液との界面に存在している。リンパ球を単離するために、この層を回収し、塩溶液で洗浄して血小板、Ｆｉｃｏｌｌ、および血漿を除去し、次いで再度遠心分離する。

【0368】

リンパ球を単離するための他の技術として、抗体がコーティングされたプラスチック表面に目的の細胞を結合させることにより、細胞集団を溶液から単離する、バイオパニングが挙げられる。次いで、望まれていない細胞を、特異的抗体および補体による処理により除去する。加えて、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析を使用して、リンパ球を検出および計数し得る。ＦＡＣＳ分析は、光散乱および蛍光の差異に基づいて、標識された細胞を分離するフローサイトメーターを使用する。

【0369】

ＴＩＬに関して、リンパ球を、腫瘍から単離し、例えば高用量ＩＬ－２中で増殖させ、自己腫瘍またはＨＬＡ一致腫瘍細胞株のいずれかに対するサイトカイン放出共培養アッセイを使用して選択する。急速な増殖のために、同種非ＭＨＣ一致コントロールと比較して特異的反応性が増加した証拠がある培地を選択し得、次いで、対象に導入してがんを処置し得る。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ他（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１１、１７：４５５０～４５５７頁）；Ｄｕｄｌｙ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９８：８５０～８５４頁）；Ｄｕｄｌｙ他（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００８、２６：５２３３～５２３９頁）；およびＤｕｄｌｅｙ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００３、２６：３３２～３４２頁）を参照されたい。

【0370】

単離すると、リンパ球を、特異性、頻度、および機能に関して特徴付け得る。頻繁に使用されるアッセイとして、Ｔ細胞応答の頻度を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイが挙げられる。

【0371】

単離後に、リンパ球を、増殖および特殊なエフェクターリンパ球への分化を促進するために、当該技術分野で周知の技術を使用して活性化し得る。活性化されたＴ細胞の表面マーカーとして、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１、ＩＬ２Ｒ、および同類のものが挙げられる。活性化された細胞傷害性リンパ球は、標的細胞の表面上のコグネート受容体との結合後に、標的細胞を死滅させ得る。ＮＫ細胞の表面マーカーとして、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および同類のものが挙げられる。

【0372】

単離、および場合により活性化の後、リンパ球を、養子Ｔ細胞免疫療法での使用のために、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して改変し得る。養子免疫療法は、典型的には、患者の免疫細胞（自己細胞）を利用してがんを処置する。しかしながら、養子免疫療法を生じる本方法はまた、第三者のドナー細胞（同種細胞）の使用も可能であり、「既製」療法がもたらされる。

【0373】

そのため、一部の実施形態では、養子免疫療法で使用されるリンパ球は、対象から単離され、エクスビボで改変され、次いで同一の対象に再導入される。この技術は、「自己リンパ球療法」として公知である。

【0374】

あるいは、リンパ球を単離し得、エクスビボで改変し、別の対象に導入し得る。この技術は、「同種リンパ球療法」として公知である。

【0375】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、同種細胞を含む治療用組成物の製造に使用する。好ましい実施形態では、同種細胞は、Ｔ細胞である。より好ましい実施形態では、このＴ細胞は、ＣＡＲを発現する。さらにより好ましい実施形態では、このＣＡＲは、がんと関連する抗原を標的とする。

【0376】

一部の実施形態では、Ｔ細胞を、より安全で効率的な同種療法を可能にするように改変し得る。例えば、Ｔ細胞受容体α定数（ＴＲＡＣ）は、αβ ＴＣＲの一部を形成するタンパク質コード遺伝子である。従って、ＴＲＡＣ中での選択された変異、およびＴＲＡＣの発現のノックアウトは、同種細胞療法中にＧｖＨＤを除去するのに役立ち得る。例えば、Ｐｏｉｒｏｔ他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１５、７５：３８５３～３８６４頁）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用してＴＲＡＣ遺伝子座にＣＤ１９特異的ＣＡＲを誘導することにより、腫瘍拒絶が起こり得ることが分かっている。例えば、Ｅｙｑｕｅｍ他（Ｎａｔｕｒｅ、２０１７、５４３：１１３）を参照されたい。同様に、αβ ＴＣＲの発現を防止するために、Ｔ細胞受容体β定数（ＴＲＢＣ）も標的とされる。例えば、Ｒｅｎ他（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１７、２３：２２５５～２２６６頁）を参照されたい。

【0377】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、およびＣＤ２７９としても既知である）は、免疫系の下方制御およびＴ細胞炎症活性を抑制することによる自己寛容の促進で重要な役割を果たす細胞表面受容体である。ＰＤＣＤ１は、そのコグネートリガンドである「プログラム死リガンド１」（ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７４、およびＢ７相同体１（Ｂ７－Ｈ１）としても既知である）に結合する。ＰＤ１は、リンパ節中の抗原特異的Ｔ細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を促進し、同時に抗炎症抑性Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞）のアポトーシスを低減させる二重機序により、自己免疫を防ぐ。これらの機序により、ＰＤ－１のＰＤ１結合により免疫系が阻害され、そのため自己免疫障害が予防されるが、免疫系ががん細胞を死滅させることも妨げられる。従って、ＰＤ１の産生を変異させるかまたはノックアウトすることは、Ｔ細胞療法に有益であり得る。

【0378】

ＰＤ１は、「免疫チェックポイント」分子の一例である。免疫チェックポイント分子は、免疫反応を下方に調節するかまたは阻害するのに役立つ。免疫チェックポイント分子としては、ＰＤ１、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても既知である）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても既知である）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても既知である）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても既知である）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても既知である）、ＴＩＧＩＴ（ＩＶＳＴＭ３としても既知である）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても既知である）、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても既知である）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、およびＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して、１種またはそれ以上の免疫チェックポイント分子を不活性化させる。一部の実施形態では、１種またはそれ以上の免疫チェックポイント分子の不活性化は、上記で説明したように、１種またはそれ以上のＴＣＲ成分の不活性化と組み合わされる。

【0379】

ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、有核細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子の成分である。ベータ－２ミクログロブリンは、腫瘍細胞等の細胞から血液中に放出され、ＨＬＡ Ｉ複合体の構築および発現に不可欠である。しかしながら、同種Ｔ細胞の表面上のＨＬＡの発現により、宿主免疫系のＴ細胞による急速な拒絶が引き起こされる。そのため、ベータ－２ミクログロブリンの発現を撹乱することはまた、同種Ｔ細胞療法の効率の向上にも望ましい。加えて、同種Ｔ細胞上でのＭＨＣクラスＩ分子の発現の欠如により、宿主免疫系によるクリアランスが引き起こされる。そのため、細胞の表面上でのＨＬＡ分子のサブセットのみ（好ましくはＨＬＡ－Ｅ）の提示が望ましい。

【0380】

さらなる遺伝子を、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの同様の標的にして、養子免疫細胞療法の有効性を増強し得る。好ましい遺伝子および染色体上の位置（ｈｇ３８ゲノムアセンブリ）の非限定的な例を、表４に示す。

【0381】

【表4-1】

【表4-2】

【0382】

一部の実施形態では、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドを使用して、細胞内で、ＴＲＡＣをコードする遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドを使用して、細胞内で、ＰＤ１をコードする遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドを使用して、細胞内で、Ｂ２Ｍをコードする遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドを使用して、細胞内で、ＴＲＡＣをコードする遺伝子およびＢ２Ｍをコードする遺伝子を標的とする。

【0383】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質複合体を使用して改変された細胞を、例えば、がんの処置のための養子細胞療法で使用し得る。その一部の実施形態では、この改変細胞は、遺伝子改変リンパ球である。そのような遺伝子改変リンパ球（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）を使用して、対象の様々なタイプのがんを処置し得、前立腺がん；卵巣がん；子宮頸がん；結腸直腸がん；腸がん；睾丸がん；皮膚がん；肺がん；甲状腺がん；骨がん；乳がん；膀胱がん；子宮がん；膣がん；膵がん；肝がん；腎がん；脳がん；脊髄がん；口腔がん、耳下腺腫瘍；血液がん；リンパ腫、例えば、Ｂ細胞リンパ腫；および白血病等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、そのような処置に、改変細胞の有効量を使用する。

【0384】

表５に、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して製造された養子細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）を使用して処置可能な代表的なＢ細胞白血病およびリンパ腫を列挙する。本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体により改変されたリンパ球は、表５で列挙されている疾患の処置に限定されないことを理解されたい。

【0385】

【表5】

【0386】

他の実施形態では、他の細胞増殖性障害を、本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して製造された養子細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）を使用して処置し得、前がん状態；血液障害；および免疫障害、例えば自己免疫疾患、例えば、限定されないが、アジソン病、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、橋本病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、強皮症、および全身性エリテマトーデスが挙げられる。

【0387】

本明細書で説明されている養子細胞療法処置を、同時にまたは異なる時間で、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法からなる群から選択される１つまたはそれ以上の追加の治療と組み合わせ得る。

【0388】

対象への本開示の改変細胞の投与を、任意の便利な様式で（例えば、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）によって）実行し得る。本明細書で説明されている組成物を、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内注射もしくはリンパ内注射により、または腹腔内で、患者に投与し得る。

【0389】

一実施形態では、本開示の改変細胞組成物を、好ましくは、静脈内注射により投与する。この投与は、体重１ｋｇ当たり１０^４～１０^９個の細胞（好ましくは、１０^５～１０^６個の細胞／ｋｇ体重）の投与を含み得る。細胞を、１回またはそれ以上の用量で投与し得る。一部の実施形態では、改変細胞の有効量を、単回用量として投与する。他の実施形態では、細胞の有効量を、ある期間にわたり複数回用量として投与する。特定の疾患または状態に関する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技能の範囲内である。

【0390】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞
一部の実施形態では、養子細胞は、ＣＡＲ発現細胞である。ＣＡＲは、特定の抗原またはエピトープを認識して結合するように操作された受容体である。この受容体は、抗原結合機能およびＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体へと組み合わせていることから、キメラである。ＣＡＲは、典型的には、抗原に結合可能な細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質である。細胞外リガンド結合ドメインは、１つまたはそれ以上のリンカーにより接続された２つ以上の可変領域の融合を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み得る。ＣＡＲは、ヒンジ領域をさらに含み得る。ＣＡＲは、「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることもある。

【0391】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、ユニバーサルＣＡＲ、自己駆動ＣＡＲ、武装化ＣＡＲ（Ａｒｍｏｒｅｄ ＣＡＲ）、自己破壊ＣＡＲ、条件付きＣＡＲ、マーキングされたＣＡＲ、ＴｅｎＣＡＲ、二重ＣＡＲ、またはｓＣＡＲであり得る。

【0392】

ＴＲＵＣＫ（ユニバーサルサイトカイン死滅のために再指向されたＴ細胞）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗腫瘍サイトカインを共発現する。サイトカイン発現は、構成的であるか、またはＴ細胞活性化によって誘発される。ＣＡＲ特異性により標的化されると、炎症誘発性サイトカインの局所的産生により、腫瘍部位に内因性免疫細胞が動員され、かつ抗腫瘍応答が増強される。

【0393】

ユニバーサル同種ＣＡＲ－Ｔ細胞は、もはや内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子を発現しないように操作されており、それにより、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または拒絶それぞれを予防する。

【0394】

自己駆動ＣＡＲは、腫瘍リガンドに結合するＣＡＲおよびケモカイン受容体を共発現し、それにより腫瘍ホーミングが増強される。

【0395】

免疫抑制に対して耐性を示すように操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞（武装化ＣＡＲ）は、免疫チェックポイントスイッチ受容体により、もはや様々な免疫チェックポイント分子（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））を発現しないように遺伝子改変されるか、または免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体と共に投与される。

【0396】

自己破壊ＣＡＲは、ＣＡＲをコードするためにエレクトロポレーションにより送達されるＲＮＡを使用して設計される。あるいは、Ｔ細胞の誘導性アポトーシスは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼへのガンシクロビル結合に基づいて達成されるか、または小分子二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）によるヒトカスパーゼ９の活性化のより最近説明された系に基づいて達成される。

【0397】

条件付きＣＡＲ－Ｔ細胞は、デフォルトでは、回路を完成させるための小分子の添加まで応答しないか、または「オフ」に切り換えられ、シグナル１およびシグナル２の両方の完全な形質導入を可能にし、それによりＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化される。あるいは、Ｔ細胞は、標的抗原に指向される、後に投与される二次抗体に対する親和性を有するアダプター特異的受容体を発現するように操作される。

【0398】

マーキングされたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲと、既存のモノクローナル抗体剤が結合する腫瘍エピトープとを発現する。容認し得ない有害作用の設定では、モノクローナル抗体の投与により、ＣＡＲ－Ｔ細胞が除去され、さらなるオフ腫瘍効果を伴うことなく症状が軽減される。

【0399】

タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、異なる親和性を有しており、かつ１種またはそれ以上の細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合した２つの連結されたｓｃＦｖを含む単一ＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、標的細胞上に１種のみの抗原が存在していることが必要であるが、両方の抗原の存在により、相乗的な活性化が促進される。ある特定の実施形態では、ＴａｎＣＡＲのｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）、２つの重鎖可変領域（ＶＨ）の対、または２つの軽鎖可変領域（ＶＬ）の対を含む。別の実施形態では、ＴａｎＣＡＲの２つのｓｃＦｖは、積層構成で生じ得る。さらに別の実施形態では、ＴａｎＣＡＲの２つのｓｃＦｖは、連続して生じ得るか、またはループ構成で生じ得る。特定の実施形態では、タンデムＣＡＲのｓｃＦｖの少なくとも１つは、抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖであり、別のｓｃＦｖは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３０ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、または抗カッパ軽鎖 ｓｃＦｖ等のがん細胞の特定の抗原を標的とするように選択される。

【0400】

二重ＣＡＲ－Ｔ細胞は、リガンド結合標的が異なる下記の２種の別々のＣＡＲを発現し；一方のＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは、共刺激ドメインのみを含む。二重ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化には、腫瘍上の両方の標的の共発現が必要である。

【0401】

安全性ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）は、細胞内阻害ドメインと融合した細胞外ｓｃＦｖからなり、標準ＣＡＲを共発現するｓＣＡＲ－Ｔ細胞は、標準ＣＡＲ標的を有するがｓＣＡＲ標的を欠く標的細胞に遭遇する場合にのみ活性化されるようになる。

【0402】

ＣＡＲの細胞外（抗原認識）ドメインは、好ましくは一本鎖抗体であり、より好ましくはｓｃＦｖである。一実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。しかしながら、所与の標的に高い親和性で結合する任意の好適な部分を、抗原認識領域として使用し得る。抗原に結合可能なＣＡＲの細胞外ドメインは、例えば、ある特定の抗原に結合し得る任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【0403】

標的とされる所望の抗原に応じて、本開示のＣＡＲを、この所望の抗原標的に特異的である適切な抗原結合部分を含むように操作し得る。例えば、ＢＣＭＡが、標的とされる所望の抗原である場合には、ＢＣＭＡを標的とする抗体または抗体断片（例えばｓｃＦｖ）を、本開示のＣＡＲに組み込まれる抗原結合部分として使用し得る。

【0404】

好ましい細胞標的およびこれを標的とするＣＡＲ ｓｃＦｖ／結合タンパク質を、表６に記載する。

【0405】

【表6-1】

【表6-2】

【0406】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲが結合する細胞標的は、より好ましくは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４７、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ３７１、ＲＯＲ－１、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１６、グリピカン３、ＰＳＣＡ、およびクローディン１８．２から選択される。

【0407】

さらにより好ましい実施形態では、ＣＡＲが結合する細胞標的は、ＢＣＭＡである。

【0408】

さらにより好ましい実施形態では、ＣＡＲが結合する細胞標的は、ＣＤ３７１である。

【0409】

ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞中での生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすためのシグナルを伝達するドメインとして機能することが既知であるオリゴペプチドまたはポリペプチドであり得る。この細胞内ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または共受容体の細胞内シグナル伝達ドメインの全てまたは一部を含む活性化ドメインを含み得る。刺激的に作用するＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として既知であるシグナル伝達モチーフを含み得る。細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例として、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、およびＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものが挙げられる。

【0410】

好ましい実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインの活性化ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。

【0411】

本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン等の活性化ドメインを、それ自体で含むか、または本開示のＣＡＲの文脈において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計し得る。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインに加えて、ＣＤ３ζ鎖部分等の活性化ドメインを含み得る。この共刺激ドメインは、ＣＡＲの、共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を指す。

【0412】

共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な分子のことである。全てまたはその一部が本開示のＣＡＲの共刺激ドメインで使用されるそのような共刺激分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ－１、ＧＩＴＲ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７－Ｈ３が挙げられる。

【0413】

好ましい実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも４－１ＢＢに由来する共刺激ドメインを含む。

【0414】

膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合には、このドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、およびＰＡＧ／Ｃｂｐの膜貫通領域に由来し得る（即ち、その一部を少なくとも含み得る）。

【0415】

あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、この場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリン等の疎水性残基を主に含むことになる。一部の場合では、合成膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。２～１０個のアミノ酸長等の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと内質ドメインと間の連結を形成し得る。

【0416】

好ましい実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８に由来する。

【0417】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、複数の膜貫通ドメインを有しており、これらは、同一の膜貫通ドメインの反復であり得るか、または異なる膜貫通ドメインであり得る。

【0418】

ヒンジ領域は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸、ＣＤ８部分、またはＩＧｇ４領域、およびこれらの組み合せ等の可変長のポリペプチドヒンジを含み得る。

【0419】

好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８に由来する。

【0420】

ＣＡＲを、ＴＩＬ、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはＴＣＲにも組み込み得、ＣＡＲ－ＴＩＬ、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＡＲ－Ｍ、ＣＡＲ－ＤＣ、およびＴＣＲ操作ＣＡＲ－Ｔ細胞それぞれが得られる。ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法、およびその使用の説明に関して、例えば、Ｂｒｕｄｎｏ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２０１８，１５：３１～４６頁）；Ｍａｕｄｅ他（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１４、３７１：１５０７～１５１７頁）；およびＳａｄｅｌａｉｎ他（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃ．、２０１３、３：３８８～３９８頁）を参照されたい。

【0421】

一部の実施形態では、ＣＡＲ発現カセットが養子細胞に形質導入されており、このカセットは、Ｃａｓ１２タンパク質媒介性切断部位に組み込まれている。本明細書の実施例９では、ＣＡＲカセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによる初代細胞の形質導入が示されている。

【0422】

一部の実施形態では、ＣＡＲ発現カセットは、ＣＡＲ発現を駆動するためのプロモーターを含む。一般的に使用されるプロモーターとしては、構成的哺乳動物プロモーターＣＭＶ、ＭＮＤ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（マウスまたはヒト）、Ｕｂｃ、ＣＡＧ、ＣａＭＫＩＩａ、およびベータ－Ａｃｔ、ならびに当該技術分野で公知の他のものが挙げられる。例えば、Ｋｈａｎ他（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、２０１３、３：２５７～２６３頁）を参照されたい。あるいは、ＣＡＲ発現カセットは、リボソームスキッピング配列（自己切断ペプチドとも呼ばれている）を含み得、内因性発現遺伝子のインフレームに導入される。一般的に使用されるリボソームスキッピング配列として、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａが挙げられる。リボソームスキッピング配列およびその使用の説明に関して、例えば、Ｃｈｎｇ他（ＭＡｂｓ、２０１５、７（２）：４０３～４１２頁）を参照されたい。同様に、非ＣＡＲ発現カセットは、同様のプロモーターまたはリボソームスキッピング配列を含み得る。

【0423】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して、患者の単一対立遺伝子上に存在する病原性の常染色体「ドミナントネガティブ」変異により引き起こされる遺伝性障害を処置する。一部場合では、基礎となる遺伝子変異は、この対立遺伝子のうちの一方上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり得る。ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、ＳＮＰ対立遺伝子を標的とするが野生型対立遺伝性を標的としないように操作し得、それにより、ＳＮＰ対立遺伝子のみが破壊される。例えば、ＳＮＰを含むオフターゲット配列での編集を低減させ得る野生型配列を標的とするためにＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を設計する方法の非限定的な例を提供する実施例７を参照されたい。

【0424】

一部の実施形態では、野生型対立遺伝子を改変することなく、Ｃａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を使用して、ＳＮＰ含有対立遺伝子を選択的に編集し得る（例えば、ノックアウトし得るか、または相同性指向修復により野生型に戻し得る）。一部の実施形態では、そのような編集により遺伝子が破壊される。他の実施形態では、そのような編集により、対立遺伝子を例えば相同性指向修復によって「野生型」状態に戻し得る。例えば、進行性視力喪失をもたらすいくつかの遺伝性疾患は、病原性の常染色体「ドミナントネガティブ」変異に起因する。ドミナントネガティブ疾患のＳＮＰ補正戦略の例としては、網膜色素変性症を引き起こすロドプシン遺伝子でのＳＮＰ変異のターゲティング（例えば、Ｌｉ他（ＣＲＩＳＰＲ Ｊ．、２０１８、１（１）：５５～６４頁）を参照されたい）；角膜ジストロフィーを引き起こす形質転換成長因子であるベータ誘導性（ＴＧＦＢＩ）遺伝子でのＳＮＰ変異のターゲティング、（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ他（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１７、７（１）：１６１７４頁）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0425】

本開示のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、例えば、常染色体の病原性「ドミナントネガティブ」遺伝子変異の影響を受ける眼組織に送達される。その一部の実施形態では、ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、根本的な病理を処置するために、野生型対立遺伝子を標的とすることなく、疾患対立遺伝子を選択的に破壊するように設計されている。そのような疾患として、黄斑ジストロフィー、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－杆体ジストロフィー、または網脈絡膜症が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で開示されているＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体は、進行性視力喪失を引き起こす遺伝性疾患の処置に限定されないことが理解される。

【0426】

実験
本開示の非限定的な実施形態を、下記の実施例で示す。使用される数（例えば、量、濃度、変化率、および同類のもの）に関する正確さを確保するために努力を行なっているが、一部の実験誤差および偏差を考慮すべきである。別途指示されない限り、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。これらの実施例は、例示のみのために示されており、本発明者らが本開示の様々な実施形態とみなす範囲を限定することは意図されていないことを理解すべきである。各実施例で記載されている下記の工程の全てが必要なわけでなく、各実施例での工程の順序は提示されている通りでなければならないわけでもない。本明細書で使用される場合、別途記載されていない限り、ヌクレオチドに先行する「ｒ」は、ＲＮＡを示し、全ての他のヌクレオチドは、ＤＮＡである（例えば、表１５および表１７を参照されたい）。ホスホロチオエート結合を、隣接塩基間に^「＊」で表す。

【実施例1】

【0427】

ＰＢＭＣからの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣ８＋）の製造、および初代細胞の培養
本実施例は、ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の製造を示す。

【0428】

ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、本質的には下記の通りにドナーＰＢＭＣから製造した。Ｔ細胞を、ＲｏｂｏＳｅｐ－Ｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｇｉｂｃｏ Ａ２５９６１０２）、抗生物質－抗真菌剤（１００Ｘ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３０－００４－Ｃｌ））中の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）；Ｇｉｂｃｏ １１１３２Ｄ）の存在下で３日間、活性化した。３日後、ビーズを磁気分離により除去し、細胞を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地中において１日にわたり増殖させた。

【実施例2】

【0429】

Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体のクローニング、発現、産生、および構築
本実施例は、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体をクローニングし、発現させ、精製する方法、およびＣａｓ１２ａガイド成分を製造する方法を説明する。

【0430】

Ａ．Ｃａｓ１２タンパク質のクローニング
アシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）触媒活性Ｃａｓ１２ａタンパク質配列（配列番号１）を、大腸菌細胞中での発現にコドン最適化させた。Ｃ末端に、グリシン－セリンリンカーおよび１つの核局在化配列（ＮＬＳ）（配列番号４）を付加した。Ｃａｓ１２ａ－ＮＬＳタンパク質（下記の実施例ではＡｓＣａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ａタンパク質と称される）をコードするオリゴヌクレオチド配列を、合成のために商業製造業者に提供した。次いで、ＤＮＡ配列を、標準的なクローニング方法を使用して、適切な細菌発現ベクターにクローニングした。

【0431】

Ｂ．Ｃａｓ１２ａタンパク質の発現および精製
ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質を、発現ベクターを使用して大腸菌中で発現させ、本質的には例えばＳｗａｒｔｓ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、２０１７、６６：２２１～２３３頁）で説明されているように、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。

【0432】

Ｃ．Ｃａｓ１２ａガイド成分の製造
Ｃａｓ１２ａガイドを、ターゲティング領域を特定のＣａｓ１２ａガイド活性化領域に連結することにより製造した。ターテゲィング領域またはスペーサーは、好ましくは、２０個のヌクレオチドの標的結合配列を含んだ。標的結合配列は、５’－ＴＴＴＶまたは５’－ＴＴＴＮ ＰＡＭの下流（３’方向）で生じる標的配列に相補的であった。例示的なＣａｓ１２ａガイド活性化領域配列は、アシダミノコッカス種、Ｌ．バクテリウム（Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびＦ．ノビシダＣａｓ１２ａ種それぞれに関して配列番号６、配列番号８、および配列番号１０である。

【0433】

Ｃａｓ１２ａガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｃｈＲＤＮＡ）を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0434】

ガイドＲＮＡ成分（例えばｃｒＲＮＡ）を、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡテンプレート配列の５’末端にＴ７プロモーターを組み込むことにより、このｄｓＤＮＡテンプレートからインビトロ転写により製造し得る（例えば、Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。

【0435】

Ｄ．Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の構築
Ｃ末端核局在化配列（ＮＬＳ）でタグ付けされたアシダミノコッカス種Ｃａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａ）を、大腸菌中で組換え発現させ、クロマトグラフィー法を使用して精製した。核タンパク質複合体を、別途述べない限り、Ｃａｓ１２ａタンパク質 ８０ｐｍｏｌ：ガイド ２４０ｐｍｏｌの濃度で形成した。Ｃａｓ１２ａタンパク質との構築前に、ガイド成分のそれぞれ（例えば、ｃｒＲＮＡまたはｃｈＲＤＮＡ）を、１μｌの最終容量で所望の合計濃度（２４０ｐｍｏｌ）まで調整し、９５℃で２分間インキュベートし、サーモサイクラーから取り出し、室温まで平衡化させた。Ｃａｓ１２ａタンパク質を、１．５μｌの最終容量に、結合緩衝液（６０ｍＭ ＴＲＩＳ－酢酸塩、１５０ｍＭ 酢酸カリウム、３０ｍＭ 酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９）で適切な濃度まで希釈し、ガイド成分 １μｌと混合し、続いて１０分間、３７℃でインキュベートした。

【実施例3】

【0436】

Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体によるＰＢＭＣからのＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）のヌクレオフェクション
本実施例は、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体による活性化Ｔ細胞のヌクレオフェクションを説明する。

【0437】

実施例２のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェル Ｓｈｕｔｔｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用して、初代活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）（実施例１で説明したように製造した）にトランスフェクトした。Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、９６ウェルプレートの個々のウェルに、２．５μｌ最終容量で分注した。懸濁したＴ細胞を、２００×ｇでの１０分間遠心分離によりペレット化し、カルシウムおよびマグネシウムフリーリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞ペレットを、カルシウムおよびマグネシウムフリーＰＢＳ １０ｍｌに再懸濁させた。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）ＩＩ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して計数した。

【0438】

２．２×１０^７個の細胞を１５ｍｌコニカルチューブに移し、ペレット化した。ＰＢＳを吸引し、細胞を、１つのサンプル当たり２×１０^５～１×１０^６個の細胞／ｍｌの密度まで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｐ４またはＰ３（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）溶液に再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液２０μｌを、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体２．５μｌを含有する各ウェルに添加し、各ウェルからの全容量を、９６ウェル Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）のウェルに移した。プレートを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）９６ウェル Ｓｈｕｔｔｌｅ（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）に乗せて、ＣＡ１３７ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）プログラム（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）を使用して細胞導入した。ヌクレオフェクション後、各ウェルに、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地７７．５μｌを添加し、トランスフェクトされた細胞懸濁液の全容量を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充された、予熱されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地 １００μｌを含有する９６ウェル細胞培養プレートに移した。このプレートを、組織培養インキュベーターに移し、４８時間、５％ＣＯ_２中で３７℃にて維持した後、下流分析を行なった。

【実施例4】

【0439】

Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体によるヒト遺伝子のタイリング
本実施例は、ヒトＴ細胞中でヒトＴ細胞アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２）、プログラム細胞死１（ＰＤＣＤ１）、サイトカイン誘発性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）、およびＣｂｌがん原遺伝子Ｂ（ＣＢＬ－Ｂ）をコードする遺伝子を標的とするためのＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の設計および使用を説明する。

【0440】

Ａ．ＡｓＣａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡガイドの設計
ヒトＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤＣＤ１、ＣＩＳＨ、およびＣＢＬ－Ｂをコードする遺伝子のコード領域中における５’－ＴＴＴＶ ＰＡＭモチーフの下流（３’方向）の２０個のヌクレオチド配列全てを、ターゲティングのために選択した（配列番号１２～１８９）。標的選択基準には、ゲノム中の他の領域との相同性；Ｇ－Ｃ含有率；融解温度；およびスペーサー内のホモポリマーの存在が含まれていたが、これらに限定されなかった。

【0441】

同定された２０個のヌクレオチドの配列を、ＡｓＣａｓ１２ａ活性化領域配列（配列番号６）の下流（３’方向）に付加した。

【0442】

配列を、合成のために商業製造業者に提供した。次いで、個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、実施例２で説明したように製造し、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。

【0443】

Ｂ．ゲノム編集効率の決定
（１）ディープシークエンシングのための標的ｄｓＤＮＡ配列生成
ｇＤＮＡを、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体、および１つのウェル当たりＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）５０μＬを使用したトランスフェクションの４８時間後に、ヌクレオフェクトされた初代Ｔ細胞から単離し、続いて１０分間３７℃でインキュベートし、３０分間６５℃でインキュベートし、３分間９５℃でインキュベートして反応を停止させた。単離ｇＤＮＡを滅菌水５０μＬで希釈し、サンプルを－８０℃で保存した。

【0444】

単離ｇＤＮＡを使用し、１×濃度でＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して１回目のＰＣＲを実施し、Ｃａｓ１２ａ標的周辺の領域を増幅するように設計されたプライマーを、それぞれ０．５μＭで使用し、ｇＤＮＡ ３．７５μＬを、１０μＬの最終容量で使用した。増幅を、１分間９８℃での初期サイクル、９８℃での１０秒、および６０℃での２０秒、７２℃での３０秒の３５サイクル；および２分間７２℃での最終伸長により行なった。ＰＣＲ反応物を、水で１：１００に希釈した。

【0445】

バーコーディングＰＣＲ用のインデックスプライマーの固有のセットを使用して、各サンプルの多重配列決定を容易にした。バーコーディングＰＣＲを、１×濃度のＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、それぞれ０．５μＭのプライマー、および１０μＬの最終容量で１：１００に希釈された１回目のＰＣＲ １μＬを含む反応混合物を使用して実施した。この反応混合物を、下記の通りに増幅した：１分間９８℃；続いて９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、および７２℃での３０秒の１２サイクル；２分間の７２℃での最終伸長反応。

【0446】

（２）ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ精製
ＰＣＲ反応物をプールし、配列決定用の増幅産物のＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）ビーズベースの精製用の単一の微量遠心管に移した。

【0447】

増幅産物に、０．９倍容量のＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを添加し、混合し、１０分間、室温でインキュベートした。微量遠心管を、溶液が清澄化されるまで磁気チューブスタンドに置いた。上清を除去して廃棄し、残留するビーズを１容量の８５％エタノールで洗浄し、ビーズを、３０秒間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、エタノールを吸引し、ビーズを、１０分間、室温で風乾させた。微量遠心管を磁気スタンドから取り外し、ビーズに０．２５倍容量のＱｉａｇｅｎ ＥＢ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加し、激しく混合し、室温で２分間インキュベートした。微量遠心管を磁気に戻し、溶液が清澄化されるまでインキュベートし、精製された増幅産物を含む上清を、清潔な微量遠心管に分注した。精製された増幅産物を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して定量し、ライブラリー品質を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）およびＤＮＦ－９１０ ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用して分析した。

【0448】

（３）ディープシークエンシングの設定
プールした増幅産物を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ Ｓｙｓｔｅｍ値および増幅産物の平均サイズから算出された４ｎＭ濃度に正規化した。ライブラリーを、２回の１５１サイクルのペアエンドランおよび２回の８サイクルインデックスリードを伴う３００サイクルにわたり、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で分析した。

【0449】

（４）ディープシークエンシングのデータ分析
配列決定データにおける結果の同一性を、バーコードＰＣＲでの増幅産物に適応されたインデックスバーコード配列に基づいて決定した。ＭｉＳｅｑデータを処理するために、例えば下記のタスクを実行するコンピュータスクリプトを使用した：
ａ．Ｂｏｗｔｉｅ（ｂｏｗｔｉｅ－ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）ソフトウェアを使用して、リードをヒトゲノム（ｂｕｉｌｄ ＧＲＣｈ３８／３８）にアラインした；
ｂ．アラインされたリードを、予想される野生型ゲノム遺伝子座配列と比較し、野生型遺伝子座のいずれの部分にもアラインしていないリードを破棄した；
ｃ．野生型配列に一致するリードを集計した；
ｄ．インデル（塩基の挿入または欠失）を有するリードを、インデルタイプにより分類し、集計した；
ならびに
ｅ．総インデルリードを、野生型リードおよびインデルリードの合計で除算して、変異リードの割合を求めた。

【0450】

Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体により標的とされる領域でのインデル配列の同定により、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を決定した。この細胞内編集実験の結果を、表７に示す。

【0451】

【表7-1】

【表7-2】

【表7-3】

【表7-4】

【0452】

表７に示すデータから、Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡ／核タンパク質複合体が、ヒト初代Ｔ細胞中の複数の遺伝子のオン編集を可能にすることが実証される。本明細書の他の箇所で説明されているもの等の他の遺伝子を、ＡｓＣａｓ１２ａタンパク質または他のＣａｓ１２ａタンパク質（例えば、Ｌ．バクテリウムまたはＦ．ノビシダ）を使用して、同様に標的とし得る。

【実施例5】

【0453】

標的結合配列中にＤＮＡを有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ分子の操作
下記の実施例は、標的結合配列中にＤＮＡ塩基を含むためのＡｓＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の操作を説明する。

【0454】

Ａ．インシリコでのＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド設計
ＡｓＣａｓ１２ａガイドの２０個のヌクレオチドの標的結合配列を、操作のために選択し、個々のＤＮＡ塩基を、標的結合配列中の各位置で利用した。ＡｓＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の標的結合配列中におけるＤＮＡ塩基の位置を、表８に示す（ＤＮＡ塩基を、「ｄ」で示し、ＲＮＡ塩基を、「Ｒ」で示しており、コントロールｃｒＲＮＡも示す）。

【0455】

【表8】

【0456】

ヒトＢ２Ｍをコードする遺伝子中の３つの標的配列（Ｂ２Ｍ－ｔｇｔ１２、Ｂ２Ｍ－ｔｇｔ１、Ｂ２Ｍ－イントロン－ｔｇｔ１２）、ヒトＴＲＡＣをコードする遺伝子中の標的配列（ＴＲＡＣ－ｔｇｔ１２）、およびヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）をコードする遺伝子中の標的配列（ＤＮＭＴ１－ｔｇｔ１）を、編集のために選択した。各位置で単一のＤＮＡ塩基を含む標的結合配列を含む各標的のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド（表８を参照されたい）、およびＣａｓ１２ａ ｃｈＲＮＡコントロール配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0457】

Ｂ．細胞のトランスフェクションおよび分析
スクリーニングのための個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞内編集実験の結果を、表９に示す。

【0458】

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【0459】

表９の編集結果から、スペーサー中にＤＮＡを含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、複数の標的にわたりｃｒＲＮＡと同等の割合で編集し得ることが実証される（配列番号２１と配列番号２２４；配列番号２３２と配列番号２３４、または配列番号２７４と配列番号２９３の比較）。各標的に関して、表９中のｃｈＲＤＮＡガイド設計の編集率を、ｃｒＲＮＡの編集率に正規化した。平均正規化編集率を図１３に示し、標的結合配列内の位置が、平均正規化編集の関数としてプロットされている。ＤＮＡ塩基利用の好ましい位置（即ち、７０％超の平均正規化編集）は、灰色の塗りつぶしで示されており、１、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０位を含む。本実施例で示されているデータ、ならびに表９および図１３のデータを使用して、Ｃａｓ１２ａガイドの標的結合配列内のどの位置をＤＮＡとして編集できるかを決定し得る。

【実施例6】

【0460】

標的結合配列中に複数のＤＮＡ塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子
本実施例は、標的結合配列中に複数のＤＮＡ塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の設計および試験を説明する。

【0461】

Ａ．Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドのインシリコでの設計
ヒトＢ２Ｍをコードする遺伝子中の３つの標的の２０個のヌクレオチドの配列（Ｂ２Ｍ－ｔｇｔ１２、Ｂ２Ｍ－ｔｇｔ１、Ｂ２Ｍ－イントロン－ｔｇｔ１２）、ヒトＴＲＡＣをコードする遺伝子中の標的（ＴＲＡＣ－ｔｇｔ１２）、およびヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１をコードする遺伝子中の標的（ＤＮＭＴ１－ｔｇｔ１）を、編集のために選択した。各標的に関して、ＤＮＡの１～７個のヌクレオチドを、各ＡｓＣａｓ１２ａガイドの標的結合配列に設計した。ＤＮＡ塩基の位置の設計基準には、過去の単一位置スクリーニングデータ（表５を参照されたい）、ＤＮＡに寛容な位置の事前のコンセンサス（表１３を参照されたい）、標的結合配列中の個々のＤＮＡ塩基間の距離、およびオフターゲット配列中におけるミスマッチの既知の位置が含まれていたが、これらに限定されなかった。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド設計、およびｃｒＲＮＡコントロール配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0462】

Ｂ．細胞のトランスフェクションおよび分析
スクリーニングのための個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞内編集実験の結果、および各Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドの標的結合配列中におけるＤＮＡ塩基の位置を、表１０に示す。

【0463】

【表10-1】

【表10-2】

【0464】

表１０の編集結果から、標的結合配列中に複数のＤＮＡ塩基を含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子が複数の標的にわたりｃｒＲＮＡと同等の割合で編集し得ることが実証される（配列番号３１６と配列番号３２１；配列番号３３０と配列番号３３５、または配列番号３４５と配列番号３４７の比較）。

【実施例7】

【0465】

Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドによるオフターゲット編集の低減
本実施例は、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．他（２０１７）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁。ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４２８４）を使用したＣａｓ１２ａオフターゲットの同定と、Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡガイドと比較したＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドのオフターゲット編集率の低減とを説明する。

【0466】

Ａ．ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ
ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１で説明したように増殖させた。５０ｍｌコニカルチューブ中での細胞の増殖後、高分子量ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、製造業者のプロトコールに従ってＢｌｏｏｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ヒト初代Ｔ細胞から抽出した。

【0467】

ヒトＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ３２（ＲＰＬ３２）（ＲＰＬ３２－ｔｇｔ１）をコードする遺伝子およびＤＮＭＴ１（ＤＮＭＴ１－ｔｇｔ１）をコードする遺伝子中の２０個のヌクレオチドの標的を、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．他（２０１７）．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁）を使用する評価のために選択した。各Ｃａｓ１２ａガイド成分を、対応する核タンパク質濃度まで連続希釈し、２分間、９５℃でインキュベートし、次いで５分かけて室温まで緩やかに戻した。ＲＰＬ３２標的（配列番号３７５）およびＤＮＭＴ１標的（配列番号４０４）に対するＣａｓ１２ａ核タンパク質複合体を、切断反応緩衝液（６０ｍＭ ＴＲＩＳ－酢酸塩、１５０ｍＭ 酢酸カリウム、３０ｍＭ 酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９）中において、インキュベートしたＣａｓ１２ａガイドとＣａｓ１２ａタンパク質とを３：１の比で組み合わせることにより形成し、１０分間、３７℃でインキュベートした。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ） １０μｇの個々の切断は、５０μＬの総容量において、６種のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体濃度（８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、４８ｎＭ、６４ｎＭ、９６ｎＭ、および１２８ｎＭ）で起きた。陰性コントロール反応物（０ｎＭ）を並行して組み立て、この反応物は、いかなる核タンパク質複合体も含まなかった。陰性コントロールを含む全ての切断反応を、全て９６ウェルフォーマットプレートにおいて３連に組み立てた。切断反応物物を、４時間、３７℃でインキュベートした。

【0468】

ライブラリーの製造および配列決定を、核タンパク質複合体切断後のｄＡテーリング工程を除いて、本質的にはＣａｍｅｒｏｎ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈ．、２０１７、１４：６００～６０６頁）により説明されているように行なった。スタガード（５’突出）末端を生じるＣａｓ１２ａ核タンパク質複合体切断に起因して、さらなる酵素による末端修復工程が必要であった。添加する容量は同一のままであったが、元のｄＡテーリングキット成分を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓからのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ ＭｏｄｕｌのＥｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（３μＬ）および１０ｘ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）成分（ＮＥＢ ＃Ｅ７４４２Ｌ）と交換した。サンプルを、３０分間、２０℃でインキュベートし、次いで３０分間、６５℃でインキュベートし、標準的な手順を再開した。ＮＧＳ配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施し、各サンプルに関して約３００万個のリードを得た。オフターゲットモチーフが切断部位の１個のヌクレオチド内に位置しない、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．他（２０１７）．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁）により回収された任意の部位を、偽陽性と見なして廃棄した。ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）オフターゲットアッセイ実験から回収された標的部位の数を、表１１に示す。

【0469】

【表11】

【0470】

表１１に示すデータから、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイ（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．他（２０１７）．Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁）は、さらなる細胞内評価のためにＣａｓ１２ガイドの生物学的オフターゲットを回収することが実証される。

【0471】

Ｂ．ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）オフターゲットアッセイにより回収された部位の細胞内検証
表１１に示したＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）オフターゲット部位でのインデルの頻度を測定するために、最低（例えば、８ｎＭおよび１６ｎＭ）のＣａｓ１２ａ核タンパク質複合体濃度に関してＲＰＬ３２サンプルおよびＤＮＭＴ１サンプルで回収された部位のサブセットに対して、標的型ディープシーケンシング分析を実施した。ＲＰＬ３２サンプルからの２つのオフターゲット部位（配列番号３７１および配列番号３７２）、およびＤＮＭＴ１中の単一のオフターゲット（配列番号３７４）を、ｃｒＲＮＡによる細胞内オフターゲット編集率の評価のために選択した。各オフターゲット部位に関してフォワード増幅産物プライマーおよびリバース増幅産物プライマーを設計し、商業製造業者から取り寄せた。

【0472】

ヒト初代Ｔ細胞を、実施例１で説明したように培養した。ＲＰＬ３２（配列番号３７５）およびＤＮＭＴ１（配列番号４０４）Ｃａｓ１２ａ核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、得られたＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体のゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。細胞の、トランスフェクトされていない入プールを、野生型基準として使用した。変異体リード（インデル％）を、切断部位の２０塩基対（ｂｐ）内の任意の非基準バリアントコールとして定義した。配列決定適用範囲が低い（Ｃａｓ１２ａ核タンパク質複合体で処理されたサンプルの合計では１，０００個未満のリード、または基準サンプルでは２００個未満のリード）、または基準サンプルで２％超のバリアントコールの部位を廃棄した。Ｃａｓ１２ａ核タンパク質複合体で処理されたサンプルの合計では０．１％超の変異体リードが蓄積した場合には、部位を細胞オフターゲットとして集計した。回収されたＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｐ．他（２０１７）．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４（６）、６００～６０６頁）オフターゲット部位の標的型ディープシーケンシングの結果を、表１２に示し、ミスマッチヌクレオチドに下線を引いている。

【0473】

【表12】

【0474】

表１２に示すデータから、ＳＩＴＥ－Ｓｅｑ（登録商標）アッセイにより、Ｃａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡガイドによりＴ細胞中で編集されるオフターゲットが回収されることが実証される。

【0475】

Ｃ．ｃｈＲＤＮＡガイドのインシリコでの設計
ヒトＲＰＬ３２をコードする遺伝子（ＲＰＬ３２－ｔｇｔ１）およびＤＮＭＴ１をコードする遺伝子（ＤＮＭＴ１－ｔｇｔ１）中の２０個のヌクレオチドの標的を、編集のために選択した。各標的に関して、ＤＮＡの１～４個のヌクレオチドを、各ＡｓＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドの標的結合配列に設計した。ＤＮＡ塩基の位置の設計基準には、過去の単一位置スクリーニングデータ（表５を参照されたい）、ＤＮＡに寛容な位置の事前のコンセンサス（表１３を参照されたい）、標的結合配列中の個々のＤＮＡ塩基間の距離、およびオフターゲット配列中におけるミスマッチの既知の位置が含まれていたが、これらに限定されなかった。Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド、およびＣａｓ１２ａ ｃｒＲＮＡコントロール配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0476】

Ｄ．細胞のトランスフェクションおよび分析
個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。この核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。ＲＰＬ３２標的（表１３）およびＤＮＭＴ１標的（表１４）に関して、このオンターゲットおよびオフターゲット（表１２を参照されたい）細胞編集実験の結果、ならびに各Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイドの標的結合配列中におけるＤＮＡ塩基の位置を示す。加えて、脱塩基デオキシリボース部位を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子も試験しており、脱塩基部位の位置をｄＮで示す。

【0477】

【表13-1】

【表13-2】

【0478】

【表14】

【0479】

表１３および表１４の編集結果から、たとえ単一ヌクレオチドミスマッチを有する部位であっても（例えば、表１２、配列番号３７１および配列番号３７２を参照されたい）、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子が、オフターゲット部位での編集を低減させ得ることが実証される。（配列番号３７５と配列番号３９１；配列番号３７５と配列番号３９４のオフターゲット編集の表１３での結果の比較；配列番号４０４と配列番号４０８；または配列番号４０４と配列番号４１２のオフターゲット編集の表１４での結果の比較）。

【実施例8】

【0480】

活性化領域中にＤＮＡ塩基を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子
本実施例は、活性化領域中にＤＮＡ塩基を有するＡｓＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子の設計および試験を説明する。

【0481】

Ａ．ｃｈＲＤＮＡガイドのインシリコでの設計
ＡｓＣａｓ１２ａガイドの２０個のヌクレオチドの活性化領域を、操作のために選択し、この活性化領域中の各位置で、個々のＤＮＡ塩基を利用した。ＡｓＣａｓ１２ａガイドの活性化領域中におけるＤＡＮ塩基の位置を、表１５に示す。

【0482】

【表15】

【0483】

ヒトＤＮＭＴ１をコードする遺伝子中の標的（配列番号３６１）を、編集のために選択した。ＤＮＭＴ標的結合配列を、各位置で単一のＤＮＡ塩基を含む活性化領域配列の下流（即ち、３’方向）に付加した（表１５を参照されたい）。配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0484】

Ｂ．細胞のトランスフェクションおよび分析
スクリーニングのための個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞内編集実験の結果を、表１６に示す。

【0485】

【表16】

【0486】

表１６の編集結果から、活性化領域中にＤＮＡを有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡは、複数の標的にわたりｃｒＲＮＡと同等の割合で編集し得ることが実証される（配列番号４３８と配列番号４４５；配列番号４３８と配列番号４５０、または配列番号４３８と配列番号４５７の比較）。表１６のｃｈＲＤＮＡ設計の編集率を、ｃｒＲＮＡの編集率に正規化した。平均正規化編集率を図１４に示し、活性化領域内の位置が、平均正規化編集の関数としてプロットされている。ＤＮＡ塩基利用の好ましい位置（即ち、７０％超の平均正規化編集）は、灰色の塗りつぶしで示されており、１、３、５、７、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、および１９位を含む。

【0487】

Ｄ．活性化領域中に複数のＤＮＡ塩基を有するｃｈＲＤＮＡ
表１０に示す結果に基づいて、個々のＤＮＡ位置を、複数のＤＮＡ塩基を含む活性化領域の設計に組み合わせた。ＡｓＣａｓ１２ａガイドの活性化領域の設計およびＤＮＡ塩基の位置を、表１７に示す。

【0488】

【表17】

【0489】

表１７に示す活性化領域の設計を、標的結合領域中にＤＮＡヌクレオチドを有するように設計されたヒトＴＲＡＣをコードする遺伝子中の２０個のヌクレオチドの標的配列と組み合わせた（配列番号３２１）。ＴＲＡＣ標的結合配列を、表１７に示す活性化領域配列の下流（即ち、３’方向）に付加し、ｃｈＲＤＮＡ設計およびｃｒＲＮＡコントロール配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0490】

Ｅ．細胞のトランスフェクションおよび分析
スクリーニングのための個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞内編集実験の結果、ならびに各ｃｈＲＤＮＡの活性化領域および標的結合配列中におけるＤＮＡ塩基の位置を、表１８に示す。

【0491】

【表18】

【0492】

表１８の編集結果から、活性化領域および標的結合配列の両方でＤＮＡを有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子は、ｃｒＲＮＡと同等の割合で編集し得ることが実証される（配列番号４６６と配列番号４６７；配列番号４６６と配列番号４６８、または配列番号４６６と配列番号４６９の比較）。

【実施例9】

【0493】

ＡＡＶドナーカセットのクローニング、ＡＡＶ製造、および初代細胞のＡＡＶ形質導入
本実施例は、ＤＮＡドナーカセットの設計およびＡＡＶベクターへのクローニング、ＡＡＶの製造、初代細胞へのＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の送達、および初代細胞へのＣＡＲ発現カセットの部位特異的組込みのためのＡＡＶによる初代細胞の形質導入を説明する。

【0494】

ＡＡＶを、哺乳動物細胞にＤＮＡドナーポリヌクレオチドを送達するように設計し得る。ＡＡＶ送達がゲノム切断事象と組み合わされ、ＡＡＶ中のＤＮＡドナーポリヌクレオチドが相同アームに隣接する場合には、例えばＥｙｑｕｅｍ他（Ｎａｔｕｒｅ、２０１７、５４３：１１３～１１７頁）で説明されているように、ＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、ＨＤＲによりゲノム切断部位にシームレスに挿入し得る。

【0495】

Ａ．ＡＡＶドナーカセットのインシリコでの設計、およびｒＡＡＶ製造
ＣＡＲ受容体の設計は、説明されている。例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２００９、３２：６８９～７０２頁）を参照されたい。ＣＡＲ構築物を、Ｎ末端分泌シグナル（ＣＤ８ａシグナルペプチド）、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ部分、それに続くＣＤ８ヒンジ領域および膜貫通部、４－１ＢＢエフェクター領域、ＣＤ３ζエフェクター領域、ならびにＣ末端ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列を含むように設計した。ＣＡＲポリヌクレオチドの上流に、哺乳動物プロモーター配列を挿入した。部位特異的切断後に宿主細胞ゲノムにＤＮＡドナーポリヌクレオチドを部位特異的に挿入するために、内在性ＴＲＡＣ遺伝子座で標的部位を選択した（配列番号２３）。次いで、切断部位の５’および３’の５００ｂｐ長の相同アームを同定した。ＤＮＡドナーポリヌクレオチドの末端に、５’相同アームおよび３’相同アームを付加し、ＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、相同アームに対して逆方向に（即ち、３’から５’へ）配向させた。得られたＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、配列番号４１３に示す。

【0496】

Ｂ２ＭおよびＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）の設計が説明されている。例えば、Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ他（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１７、３５（８）：７６５～７７２頁）を参照されたい。融合構築物を、Ｎ末端Ｂ２Ｍ分泌シグナル、それに続くＨＬＡ－Ｇ由来ペプチド配列、第１のリンカー配列、Ｂ２Ｍ配列、第２のリンカー配列、ＨＬＡ－Ｅ配列、およびＣ末端ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列で設計した。Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅポリヌクレオチドの上流に、ＥＦ１α哺乳動物プロモーター配列を挿入した。部位特異的切断後に宿主細胞ゲノムにＤＮＡドナーポリヌクレオチドを部位特異的に挿入するために、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座中の標的部位を選択した（配列番号６２）。次いで、切断部位の５’および３’の５００ｂｐ長の相同アームを同定した。ＤＮＡドナーポリヌクレオチドの末端に、５’相同アームおよび３’相同アームを付加し、ＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、相同アームに対して逆方向に（即ち、３’から５’へ）配向させた。得られたＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、配列番号４１４に示す。

【0497】

ＤＮＡドナーポリヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を、好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プラスミドへの合成のために商業製造業者に提供した。配列番号４１３を含むｒＡＡＶプラスミド、および配列番号４１４を含む別のｒＡＡＶプラスミドを、２つの別々のＡＡＶ６ウイルスへのパッケージングのために商業製造業者に提供した。

【0498】

Ｂ．ｒＡＡＶによる初代Ｔ細胞の形質導入
初代活性化Ｔ細胞を、実施例１で説明したようにＰＢＭＣから得た。ＴＲＡＣ（配列番号４１５）およびＢ２Ｍ（配列番号４１６）をコードする遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、実施例２で説明したように製造した。Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ（配列番号４２５）を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトし、ヌクレオフェクション後１分～４時間の間で、細胞に、１×１０^６のＭＯＩで、ＣＡＲドナー配列（配列番号４１３）がパッケージ化されたＡＡＶ６ウイルスを感染させた。加えて、Ｔ細胞を、Ｂ２Ｍ（配列番号４１６）を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトし、ヌクレオフェクション後１分～４時間の間で、細胞に、１×１０^６のＭＯＩで、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅドナー配列（配列番号４１４）がパッケージ化されたＡＡＶ６ウイルスを感染させた。Ｔ細胞を、形質導入後２４時間、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で培養した。翌日、形質導入されたＴ細胞を、５０ｍＬコニカルチューブに移し、約７～１０分間、３００×ｇで遠心分離して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを緩やかに再懸濁させ、Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の好適な容量にプールした。

【0499】

計数したＴ細胞を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に１×１０^６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、必要な数だけＴ－１７５懸濁フラスコに蒔いた（１つのフラスコ当たりの最大容量は２５０ｍＬである）。

【0500】

Ｃ．抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞の発現
抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびコントロール（ＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）およびＢ２Ｍ ＫＯ）、ならびに野生型Ｔ細胞のインビトロでのキャラクタリゼーションを、形質導入の７日後に実施した。

【0501】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートした組換えＢＣＭＡタンパク質を使用する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にコンジュゲートした抗ＴＣＲ ａ／ｂ特異的抗体を使用するＴＲＡＣの発現、またはＰＥにコンジュゲートした抗Ｂ２Ｍ特異的抗体を使用するＢ２Ｍ発現のいずれかに関して、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリー分析の結果を、図１５Ａに示しており、未処理の細胞（野生型Ｔ細胞、図１５Ａ、１５０４）、両方のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体のみでトランスフェクトされた細胞（ＴＲＡＣ ＫＯ／Ｂ２Ｍ ＫＯ；図１５Ａ、１５０５）、および両方のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトされかつ両方のウイルスで形質導入された細胞（抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ；図１５Ａ、１５０６）に関して、ＣＡＲ陽性（図１５Ａ、１５０１）、ＴＲＡＣ陽性（図１５Ａ、１５０２）、およびＢ２Ｍ陽性（図１５Ａ、１５０３）の割合を示す。ｙ軸は、様々な細胞表面マーカーに関する、ＦＡＣＳにより測定した場合の陽性細胞の百分率を表す。結果を表１９にも示す。

【0502】

【表19】

図１５Ａおよび表１９に示す結果から、内在性ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ発現のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド媒介性ＫＯ、ならびに抗ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび外来性Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅタンパク質のＡＡＶ６媒介性導入および発現が実証される。

【0503】

Ｄ．抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの細胞傷害性
ＢＣＭＡ抗原を提示する多発性骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株に対して、抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性をインビトロで評価した。ＴＲＡＣ ＫＯ Ｔ細胞を、ＣＡＲ媒介性死滅のコントロールとして使用した。簡潔に説明すると、標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９（Ｔ））を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃ３４５５７）で標識して、エフェクター抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ（Ｅ）と区別し、細胞を、０：１、１：２０、１：１０、１：５、１：３、１：１、３：１、および１０：１のＥ：Ｔ比で共培養した（３の共培養ウェル／Ｅ：Ｔ比）。細胞傷害性を、４８時間の共培養後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により測定したＣＴＶ細胞集団（標的細胞）および生細胞でゲーティングすることにより測定した。データを、フローサイトメトリー（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓ）で分析した。特異的溶解を、各ウェルに関して下記式を使用して算出した：特異的溶解＝１－（試験サンプル中の生きている標的細胞の数／コントロールサンプル中の生きている標的細胞の数）。

【0504】

抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞（灰色の円形）およびコントロールＴＲＡＣ ＫＯ Ｔ細胞（黒色の円形）に関するインビトロ細胞傷害性アッセイの結果を、図１５Ｂに示す。ｙ軸は、標的細胞死滅の百分率を表しており、ｘ軸は、使用したＥ：Ｔ比を示す。図１５Ｂに示すデータを、表２０にも示す。

【0505】

【表20】

【0506】

図１５Ｂおよび表２０に示す結果から、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を使用して製造されたＣＡＲ－Ｔ細胞は標的細胞を抗原特異的に死滅させ得ることが実証される。

【0507】

本明細書で示されている方法を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むドナーポリヌクレオチドの部位特異的導入のためにＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド分子を使用して他の細胞を製造し得る。非ＣＡＲポリペプチド（即ち、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物）を発現するさらなるドナーポリヌクレオチドも同様に、本明細書のガイダンスを使用して導入し得る。

【実施例10】

【0508】

Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合体の内在性Ｂ２Ｍプロモーター駆動発現を有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの生成
本実施例は、初代細胞のゲノムへのＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ媒介性切断部位でのＣＡＲポリヌクレオチドおよびＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅポリヌクレオチド発現カセットの部位特異的変更に関するＡＡＶによる初代細胞の形質導入の設計を説明する。

【0509】

Ａ．ＡＡＶドナーカセットのインシリコでの設計、およびｒＡＡＶ製造
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを、実施例９で説明したように設計した。

【0510】

Ｐ２Ａ－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ融合構築物のドナーカセットポリヌクレオチドを、Ｎ末端Ｂ２Ｍ分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド、それに続くＨＬＡ－Ｇ由来ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド、第１のリンカー配列をコードするポリヌクレオチド、Ｂ２Ｍ配列をコードするポリヌクレオチド、第２のリンカー配列をコードするポリヌクレオチド、ＨＬＡ－Ｅ配列をコードするポリヌクレオチド、およびＣ末端ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列をコードするポリヌクレオチドと共に設計した。Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅの上流に、Ｐ２Ａリボソームスキッピング配列をコードするポリヌクレオチドを挿入して、融合構築物の発現が内在性Ｂ２Ｍプロモーターの制御下にあるようにした。部位特異的切断後に宿主細胞ゲノム中にＤＮＡドナーポリヌクレオチドを部位特異的に挿入するために、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座中の標的部位を選択した（配列番号６２）。次いで、切断部位の５’および３’の５００塩基対長の相同アームを同定した。５’相同アームおよび３’相同アームを、ＤＮＡドナーポリヌクレオチドの５’末端および３’末端に付加し、ＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、相同アームに対して順方向に（即ち、５’から３’へ）配向させた。得られたＤＮＡドナーポリヌクレオチドを、配列番号４７９で示す。

【0511】

ＤＮＡドナーポリヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチド配列を、好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）プラスミドへの合成のために商業製造業者に提供した。配列番号４１３を含むｒＡＡＶプラスミド、および配列番号４７９を含む別のｒＡＡＶプラスミドを、２つの別々のＡＡＶ６ウイルスへのパッケージングのために商業製造業者に提供した。

【0512】

Ｂ．ｒＡＡＶによる初代Ｔ細胞の形質導入
初代活性化Ｔ細胞を、実施例１で説明したようにＰＢＭＣから得た。ＴＲＡＣ（配列番号４１５）およびＢ２Ｍ（配列番号４１６）をコードする遺伝子を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、実施例２で説明したように製造した。Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ（配列番号４２５）を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトし、ヌクレオフェクション後１分～４時間の間で、細胞に、１×１０^６のＭＯＩで、ＣＡＲドナー配列（配列番号４１３）がパッケージ化されたＡＡＶ６ウイルスを感染させた。加えて、Ｔ細胞を、Ｂ２Ｍ（配列番号４１６）を標的とするＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトし、ヌクレオフェクション後１分～４時間の間で、細胞に、１×１０^６のＭＯＩで、Ｐ２Ａ－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅドナー配列（配列番号４７９）がパッケージ化されたＡＡＶ６ウイルスを感染させた。Ｔ細胞を、形質導入後２４時間、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で培養した。翌日、形質導入されたＴ細胞を、５０ｍＬコニカルチューブに移し、約７～１０分間、３００×ｇで遠心分離して細胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを緩やかに再懸濁させ、Ｔ細胞を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の適量にプールした。

【0513】

計数したＴ細胞を、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）が補充されたＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ完全培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に１×１０^６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、必要な数だけＴ－１７５懸濁フラスコに蒔いた（１つのフラスコ当たりの最大容量は２５０ｍＬである）。

【0514】

Ｃ．ＣＡＲ－Ｔ細胞上での抗ＢＣＭＡ ＣＡＲおよびＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅの発現
抗ＢＣＭＡ、Ｐ２Ａ－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ細胞、およびコントロール（ＴＲＡＣノックアウト（ＫＯ）およびＢ２Ｍ ＫＯ）、ならびに野生型Ｔ細胞のインビトロでのキャラクタリゼーションを、形質導入の７日後に実施した。

【0515】

ＣＡＲ－Ｔ細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートした組換えＢＣＭＡタンパク質を使用する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの発現；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にコンジュゲートした抗ＴＣＲ ａ／ｂ特異的抗体を使用するＴＲＡＣの発現、またはＰＥにコンジュゲートした抗Ｂ２Ｍ特異的抗体を使用するＢ２Ｍの発現のいずれかに関して、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリー分析の結果を、表２１に示しており、未処理の細胞（野生型Ｔ細胞）、両方のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体のみでトランスフェクトされた細胞（ＴＲＡＣ ＫＯ／Ｂ２Ｍ ＫＯ）、および両方のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体でトランスフェクトされかつ両方のウイルスで形質導入された細胞（抗ＢＣＭＡ、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＣＡＲ－Ｔ）に関して、ＣＡＲ陽性、ＴＲＡＣ陽性、およびＢ２Ｍ陽性の割合を示す。

【0516】

【表21】

【0517】

表２１に示す結果から、内在性ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ発現のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド媒介性ＫＯ、ならびに抗ＢＣＭＡ ＣＡＲドナーカセットのＡＡＶ６媒介性導入および内在性発現、および外来性Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅドナーカセットの内在性Ｂ２Ｍプロモーター駆動発現が実証される。

【0518】

本明細書で示されている方法を使用して、他の標的のためのＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイド設計を同定し得る。他のＣａｓ１２ ｃｈＲＤＮＡガイドの活性化領域および標的結合配列を、本明細書で説明されている方法と同様にスクリーニングし得る。

【実施例11】

【0519】

代替のリンカー－ＮＬＳ構造を有するＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体
本実施例は、本出願の先の実施例で使用されたグリシン－セリンリンカーおよびサル空胞ウイルス４０大型Ｔ抗原ＮＬＳ（ＳＶ４０；配列番号０４）を有する「非最適化」設計と比較した、異なるリンカーおよび核局在化シグナル（ＭＬＳ）構造を有するＣａ１２ａガイド／核タンパク質複合体の設計および比較を説明する。

【0520】

Ａ．Ｃａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ配列のインシリコでの設計
アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａタンパク質（配列番号０１）を操作のために選択し、２つのＮＬＳ配列であるＳＶ４０（配列番号０４）およびヌクレオプラスミン配列（ＮＰＬ；配列番号０５）を、グリシン－セリン（ＧＳ）またはグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリン（Ｇ４Ｓ）アミノ酸リンカーの対のいずれかを使用するＣａｓ１２ａタンパク質への共有結合的付加のために選択した。可変リンカーと共に２つのＮＬＳを含む設計も、試験のために作成した。リンカー－ＮＬＳ配列の設計を、表２２に示す。

【0521】

【表22】

【0522】

表２２に示すＮＬＳ配列を、アシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａタンパク質（配列番号０１）のＣ末端にクローニングし、組換えタンパク質を、実施例２で説明したように発現させた。

【0523】

Ｂ．Ｃａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ設計の細胞活性
表２２に示すリンカー－ＮＬＳ配列を含む精製された組換えＣａｓ１２ａタンパク質を、実施例２で説明したように、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｃｈＲＤＮＡガイド（配列番号４６７）と複合体化させ、実施例３で説明したように、初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、各Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞編集実験の結果を、図１６Ａおよび表２３に示す。

【0524】

【表23】

【0525】

本実施例の図１６Ａおよび表２３に示すデータから、代替のリンカーおよびＮＬＳ配列は、単一のＧＳ－ＳＶ４０ ＮＬＳ構造を有する設計と比較して編集を増加させ得ることが示される。

【0526】

Ｃ．標的にわたる代替のＣａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ配列の細胞活性
表２３に示す上位４つのＣａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ構造（配列番号４８９、配列番号４８５、配列番号４８７、および配列番号４８３）、および「非最適化」設計（配列番号４７９）を、ｃｒＲＮＡおよびｃｈＲＤＮＡの混合パネルを使用する比較のために選択した。ｃｈＲＤＮＡ設計におけるＤＡＮ塩基の位置を含むターゲティング領域を、表２４に示す。

【0527】

【表24】

【0528】

表２４に示すターゲティング領域を、活性化領域（配列番号４５９）の３’末端に付加し、合成のために商業製造業者に提供した。

【0529】

各ガイドと複合体化した個々のＣａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ構造を、本質的には実施例２で説明したように製造したが、複合体を、各Ｃａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳおよびガイドの組合せに関してＣａｓ１２ａ対ガイドの２０：６０および８０：２４０ｐｍｏｌの２つの濃度で構築するという変更があった。Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られるゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。

【0530】

表２４に示す、ガイドと複合体化したＣａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳ構造の編集の結果を、図１６Ｂ、ならびに表２５および２６に示す。

【0531】

【表25】

【0532】

【表26】

【0533】

図１６Ｂならびに表２５および２６に示すデータから、ヒト初代Ｔ細胞における複数の標的にわたる様々なＮＬＳ構造の改善された活性が実証される（即ち、図１６Ｂ、図１６Ｂ １６１６または図１６Ｂ １６１７の平均編集と比較した図１６Ｂ １６１３の平均編集を参照されたい）。代替のＮＬＳ配列、リンカー、およびＣａｓヌクレアーゼを、本明細書で説明されている方法と同様にスクリーニングし得る。

【実施例12】

【0534】

Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による多重化
本実施例は、単一のトランスフェクション反応での複数のＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡの細胞への共送達（多重化）と、ＧＳ－ＳＶ４０（配列番号４７９：「非最適化ＮＬＳ」）および（Ｇ４Ｓ）２－ＮＰＬ（配列番号４８９：「最適化ＮＬＳ」）を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体の多重化編集率の比較とを説明する。

【0535】

Ａ．Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡリンカー－ＮＬＳ配列のインシリコでの設計
アシダミノコッカス種（株ＢＶ３Ｌ６）Ｃａｓ１２ａタンパク質（配列番号０１）を、第１のＣ末端リンカー－ＮＬＳ配列（配列番号４７９）または第２のＣ末端リンカー－ＮＬＳ配列（配列番号４８９）のいずれかで操作し、Ｃａｓ１２ａ組換えタンパク質を、実施例２で説明したように発現させた。

【0536】

Ｂ．Ｃａｓ１２ａリンカー－ＮＬＳの細胞多重化活性
リンカー－ＮＬＳ配列 配列番号４７９またはリンカー－ＮＬＳ配列 配列４８９のいずれかを含む精製された組換えＣａｓ１２ａタンパク質を、実施例２で説明したようにＴＲＡＣターゲティングｃｈＲＤＮＡ（配列番号５０８）、Ｂ２ＭターゲティングｃｈＲＤＮＡ遺伝子（配列番号４１６）、ＣＩＳＨターゲティングｃｈＲＤＮＡ（配列番号５０９）、またはＣＢＬＢターゲティングｃｈＲＤＮＡ（配列番号５１０）のいずれかと複合体化させたが、この複合体を、Ｃａｓ１２ａ対ガイドの４０：８０ｐｍｏｌの比で構築するという変更があった。各Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体を、単一ターゲティング複合体として使用したか；１つのミックスに組み合わされたＴＲＡＣおよびＢ２ＭターゲティングＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体両方として使用したか；１つのミックスに組み合わされたＣＩＳＨおよびＣＢＬＢターゲティングＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体両方として使用したか；または１つのミックスに組み合わされたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＳＨ、およびＣＢＬＢターゲティングＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体全てとして使用した。各Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質組成物を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、各Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞編集実験の結果を、図１７および表２７に示す。

【0537】

【表27】

【0538】

図１７および表２７に示すデータから、ヒト初代Ｔ細胞中での多重化に使用された場合のリンカー－ＮＬＳ構築物の活性の改善が実証される。例えば、非最適化ＧＳ－ＳＶ４０リンカー－ＮＬＳ（配列番号４７９、図１７ １７０８）による一連の図１７、１７０７の平均編集、および最適化（Ｇ４）２－ＮＰＬリンカーＮＬＳ（配列番号４８９、図１７、１７１２）による一連の図１７、１７１１の平均編集を参照されたい。代替のＮＬＳ配列、リンカー、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、および多重化の標的を、本明細書で説明されている方法と同様にスクリーニングし得る。

【実施例13】

【0539】

化学的改変を含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体による編集
本実施例は、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡの活性化領域およびターゲティング領域中にホスホロチオエート化学的改変を含むＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡの細胞編集活性を説明する。

【0540】

Ａ．化学的改変を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡのインシリコでの設計
ＴＲＡＣ標的－１２配列（配列番号３１６）を、操作のために選択した。２つのホスホロチオエート結合を、Ｃａｓ１２ａガイドの５’末端（即ち、活性化領域の５’末端ヌクレオチド）に設計し、２つのホスホロチオエート結合を、Ｃａｓ１２ａガイドの３’末端（即ち、ターゲティング領域の３’末端ヌクレオチド）に設計した。次いで、末端を保護するホスホロチオエート改変に加えて活性化領域にＤＮＡ塩基を有する一連のＣａｓ１２ａガイドを設計した。化学的改変を有するＣａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡの配列を、表２８に示す。この配列を、合成のために商業製造業者に提供した（列挙されたホスホロチオエート結合およびＤＮＡ塩基の位置は、図５に示す番号に対応する）。

【0541】

【表28】

【0542】

Ｂ．細胞のトランスフェクションおよび分析
個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定した。この細胞内編集実験の結果を、表２９に示す。

【0543】

【表29】

【0544】

表２９に示すデータから、ホスホロチオエート結合単独、またはホスホロチオエート結合およびＤＮＡ塩基のいずれかを含むＣａｓ１２ａガイドの編集活性が実証される。このガイドは、全ＲＮＡガイドと比較してヒト初代Ｔ細胞中で強固に編集し得る（即ち、配列番号５１２または配列番号５１５の平均編集と比較して配列番号５１１の表２９の平均編集を参照されたい）。化学的改変の代替の組合せおよび位置を、本明細書で説明されている方法と同様にスクリーニングし得る。

【実施例14】

【0545】

Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質複合体によるヒト人工多能性幹細胞のトランスフェクション
本実施例は、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡ／核タンパク質複合体によるヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の細胞編集を説明する。

【0546】

Ａ．ｃｈＲＤＮＡガイドのインシリコでの設計
ガイドの活性化領域中にＤＮＡ塩基を含むＣＩＳＨ遺伝子を標的とするＡｓＣａｓ１２ａガイド配列（配列番号５０９）を、さらなる操作およびターゲティング領域（配列番号５１８～配列番号５２９）へのさらなるＤＮＡ塩基の導入のために選択した。配列を、合成のために商業製造業者に提供した。

【0547】

Ｂ．細胞のトランスフェクションおよび分析
個々のＣａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体を、本質的には実施例２で説明したように製造した。核タンパク質複合体を、実施例３で説明したように初代Ｔ細胞にトランスフェクトした。

【0548】

ｉＰＳＣを、下記の変更を行ないつつ、実施例３で説明した初代Ｔ細胞を取り扱う方法およびトランスフェクトする方法と同様に取り扱ってトランスフェクトした。ｉＰＳＣを、トランスフェクション前に３７℃で３時間、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ阻害剤（「ＲＯＣＫｉ」、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が１０ｕＭの最終濃度で補充されたｍＴｅＳＲ－ｐｌｕｓ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で培養した。ｍＴｅＳＲ－ｐｌｕｓ／ＲＯＣＫｉ培地を除去し、ｉＰＳｃを、ＰＢＳ １０ｍＬで洗浄し、続いて、アキュターゼ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）３ｍＬを添加し、細胞を、３７℃で５～１０分間インキュベートした。次いで、細胞にｍＴｅＳＲ－ｐｕｌｓｅおよびＲＯＣＫｉ ７ｍＬを添加し、細胞を混合して計数した。次いで、細胞を遠心分離し、培地を除去し、細胞をＰＢＳ １０ｍＬで洗浄し、再度遠心分離してＰＢＳを除去した。細胞を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｐ３（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）溶液に、２×１０^５個の細胞／ｍＬの密度まで再懸濁させ、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体と混合し、パルスコードＣＡ１５８を使用してトランスフェクトした。Ｃａｓ１２ａガイド／核タンパク質複合体の得られたゲノム編集効率を、実施例４で説明したように決定し、表２９に示す。

【0549】

【表30】

【0550】

表２９に示すデータから、Ｃａｓ１２ａ ｃｈＲＤＮＡガイド／核タンパク質複合体をヒトｉＰＳＣの操作に使用し得ることが実証される。他の細胞型を、本明細書で説明されている方法と同様に編集し得る。

【0551】

当業者に明らかなように、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、上記実施形態の改変および変形を行ない得る。そのような改変および変更は、本開示の範囲内である。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【配列表】

2023546158000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-06-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0003】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、かつ全体を参照によって本明細書に組み入れる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２３年３月２０日に作成されており、ＣＢＩ０３９＿３０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、かつサイズが２０３，２５９バイトである。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2023546158000001.app

【国際調査報告】