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特表2023-546382カチオン性タンパク質画分の精製方法及びそれにより得られる画分
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-02
(54)【発明の名称】カチオン性タンパク質画分の精製方法及びそれにより得られる画分
(51)【国際特許分類】
C07K 1/34 20060101AFI20231026BHJP
【ＦＩ】
C07K1/34
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521685
(86)(22)【出願日】2021-10-12
(85)【翻訳文提出日】2023-04-07
(86)【国際出願番号】 EP2021078094
(87)【国際公開番号】W WO2022078976
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】2010423
(32)【優先日】2020-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506341803
【氏名又は名称】コンパニー レチエル ユロペンヌ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】御子神 隆
(72)【発明者】
【氏名】レシュヴァン、カリーヌ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045CA40
4H045CA43
4H045GA10
(57)【要約】
本発明は、エンドトキシン除去によりカチオン性タンパク質画分を精製する方法に関するものであり、またこのようにして得られた精製画分に関するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップを含む、カチオン性タンパク質画分を精製する方法：ａ）
‐ ６．５～７．５のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ ４５ｍＳ／ｃｍより大きい導電率を有する、
溶液を得る；
ｂ）カチオン性タンパク質の前記溶液を、１０ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ以下、さらに好ましくは１ｍＳ／ｃｍ以下の導電率が得られるまで、５～５０ｋＤａのカットオフ閾値を有する限外ろ過膜を用いて、エンドトキシンを含まない水、好ましくは限外ろ過浸透水により透析ろ過し、この透析ろ過の間、この溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜又はモノリシック媒体に連続して通す；
ｃ）任意選択で、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いた精密ろ過を行う；
ｄ）任意選択で、この溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥する。
【請求項2】
以下のステップを含む、カチオン性タンパク質単離物の精製方法：ａ）
‐ ６．５～７．５のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ １ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する、
溶液を得る；
ｂ）前記溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜又はモノリシック媒体に通す；溶液は好ましくはアニオン交換媒体に数回、好ましくは少なくとも３回通す；
ｃ）任意選択で、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いた精密ろ過を行う；
ｄ）任意選択で、溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、粉末のカチオン性タンパク質単離物を得る。
【請求項3】
エンドトキシン含有量が０．１ＩＵ／ｍｇタンパク質未満であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法によって得られ得るカチオン性タンパク質画分。
【請求項4】
５ＩＵ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１ＩＵ／ｍｇタンパク質未満、さらに好ましくは０．１ＩＵ／ｍｇタンパク質未満のエンドトキシン含量を有することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法により得られるカチオン性タンパク質画分。
【請求項5】
画分のカチオン性タンパク質が乳に由来することを特徴とする、請求項３又は請求項４に記載のカチオン性タンパク質画分。
【請求項6】
カチオン性タンパク質がラクトフェリンから主としてなることを特徴とする、請求項３～５のいずれか１項に記載のカチオン性タンパク質画分。
【請求項7】
カチオン性タンパク質がラクトペルオキシダーゼから主としてなることを特徴とする、請求項３～５のいずれか１項に記載のカチオン性タンパク質画分。
【請求項8】
カチオン性タンパク質がリボヌクレアーゼから主としてなることを特徴とする、請求項３～５のいずれか１項に記載のカチオン性タンパク質画分。
【請求項9】
カチオン性タンパク質が、２０μｇ／ｇタンパク質より大きいのＴＧＦ‐βを含むことを特徴とする、請求項３～５のいずれか１項に記載のカチオン性タンパク質画分。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エンドトキシンの除去によりカチオン性タンパク質画分を精製する方法に関するものであり、このようにして得られた精製画分に関するものでもある。
【背景技術】
【0002】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の菌壁の成分である。これらの細菌が溶解又は破壊される際に放出されると、エンドトキシンはこの種の細菌による感染症で敗血症性ショックのような全身性の炎症症状の原因となる。このため、医薬品や注射剤（水など）には、ＦＤＡ（https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens）などの当局により、エンドトキシン含有量の上限が定められている。また、注射剤以外の用途でも、化粧品、医療機器、栄養剤などの分野では、使用する成分のエンドトキシン含有量の低減がますます求められるようになってきている。
【0003】
エンドトキシンはリポ多糖（ＬＰＳ）とも呼ばれ、脂質（リピドＡ）に糖鎖が結合したものからなる。糖鎖部分は、コアオリゴ糖と呼ばれる部分とＯ側鎖多糖（Ｏ抗原）と呼ばれる部分の２つから構成される。図１にその模式図を示す（Ｍａｅｓｈｉｍａ ＆ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ２０１３）。各ＬＰＳ分子は、脂質Ａのリン酸基と酸基、及びコアオリゴ糖からの複数の負電荷を帯びている。エンドトキシンは、熱的・化学的に安定であることが知られている。エンドトキシン含有量は、１ＥＵ（エンドトキシン単位）に相当するＩＵ（国際単位）で表される（３．４ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ‐ ９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。目安として、ＬＰＳ １ｎｇは約１０ＥＵ（ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ，３ｒｄ ＩＳ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）に対応するが、細菌株の起源により異なる場合がある。
【0004】
バイオテクノロジーの手法や生物学的材料の実装に由来するタンパク質に基づく医薬品の開発の範囲では、エンドトキシンを除去するために、タンパク質の精製の様々な方法が開発されている。これらの方法は、例えば、溶媒抽出、アフィニティクロマトグラフィー（ポリミキシンＢグラフト樹脂など、ただし、食品の調製には認められていない処理）、膜技術（限外ろ過など）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｅｔｓｃｈ、Ｄ、２０００．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．（タンパク質溶液からのエンドトキシン除去。）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６，９７‐１１９； Ｏｎｇｋｕｄｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈｅｗ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｄａｎｑｕａｈ，Ｍ．Ｋ．，２０１２． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ： Ａ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．（エンドトキシンのクロマトグラフィーによる除去：バイオプロセスエンジニアの視点。）ＩＳＲＮ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ２０１２，１‐９）。
【0005】
しかし、リゾチーム（Ｐｅｔｓｃｈ，Ｄ．，Ｄｅｃｋｗｅｒ，Ｗ．‐Ｄ．，Ａｎｓｐａｃｈ，Ｆ．Ｂ．，１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ａｓｓａｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（プロテイナーゼＫによるタンパク質の消化は、カブトガニ変形細胞溶解物アッセイによる細菌性エンドトキシンの検出を改善する：カチオン性タンパク質からのエンドトキシン除去への応用。）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９，４２‐４７）、リボヌクレアーゼＡ及びラクトフェリン（Ｅｌａｓｓ‐Ｒｏｃｈａｒｄ，Ｅ．，Ｒｏｓｅａｎｕ，Ａ．，Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｄ．，Ｔｒｉｆ，Ｍ．，Ｓａｌｍｏｎ，Ｖ．，Ｍｏｔａｓ，Ｃ．，Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ，Ｊ．，Ｓｐｉｋ，Ｇ．，１９９５．Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ‐ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ： ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ２８‐３４ ｌｏｏｐ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈ‐ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０５５Ｂ５ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．（ラクトフェリン‐リポ多糖相互作用：大腸菌０５５Ｂ５リポ多糖への高親和性結合におけるヒトラクトフェリンの２８‐３４ループ領域の関与。）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３１２，８３９‐８４５）などのカチオン性タンパク質の多くは、数個の負電荷を持つＬＰＳ分子と強い相互作用を有するため、カチオン性タンパク質画分からエンドトキシンを除去することは困難であることが知られている。
【0006】
カチオン性タンパク質、特にラクトフェリンに結合したエンドトキシンを除去する方法がＷＯ２００９／００９７０６（Ｇｌａｎｂｉａ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓ）に提案されている；この方法は、ａ）タンパク質をカチオン交換樹脂に結合するステップ；ｂ）界面活性剤を添加しない状態で低イオン強度溶液でエンドトキシンを溶出するステップ；ｃ）タンパク質を高イオン強度溶液で溶出するステップを含む。この方法により、１ＩＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含むラクトフェリン単離物を得ることができる。
【0007】
ラクトフェリンに結合したエンドトキシンを除去するための同様の方法が、ＷＯ２０１０／１１２９８８（Ｊｅａｎ‐Ｐａｕｌ Ｐｅｒｒａｕｄｉｎ）に提案されている。この方法により、５０ｐｇ／ｍｇ未満（すなわち約０．５ＩＵ／ｍｇ）のエンドトキシンを含むラクトフェリン単離物を得ることができる。
【0008】
これら２つの方法は、ラクトフェリンのような、カチオン交換樹脂との親和性の高いカチオン性タンパク質を含む画分から、このカチオン性タンパク質をこれらの樹脂に固定した後、このカチオン性タンパク質をカチオン交換樹脂から剥離させずに、低～中イオン強度の溶液（０．２５～０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液）で、このカチオン性タンパク質に結合したエンドトキシンを解離除去できることを示す。このカチオン交換樹脂との親和性は、カチオン性タンパク質を構成するカチオン性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）に由来する正電荷（その大きさとその位置）に依存している。しかし、これらの方法では、カチオン交換樹脂と低～中程度の親和性を有するカチオン性タンパク質又はカチオン性タンパク質の画分に存在する又は結合したエンドトキシンは、これらのタンパク質がエンドトキシンとともに溶出するため、効果的に除去することができない。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、カチオン性タンパク質の画分に存在するエンドトキシン又はカチオン性タンパク質又はカチオン性タンパク質の画分と結合したタンパク質を、その正電荷の大きさや位置に関係なく効率的に除去することを可能にする方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0010】
従って、本発明は、以下のステップａ）～ｄ）を含むカチオン性タンパク質画分を精製する方法に関する：
ａ）
‐ ６．５～７のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ ４５ｍＳ／ｃｍより大きい、好ましくは５０ｍＳ／ｃｍ又は６０ｍＳ／ｃｍより大きい導電率を有する、
溶液を得る；
例示的にかつ限定なしで、このような溶液は、以下から選択され得る：
‐ カチオン交換樹脂（例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から１００ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で溶出した牛乳由来のラクトフェリンを含有する溶液；
‐ カチオン交換樹脂（例えばＳＰＥＣ７０ＳＬＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）から１０％のＮａＣｌで溶出した牛乳由来のカチオン性タンパク質の全画分を含む溶液；
‐ カチオン交換樹脂（例えばＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から４０ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で溶出した、牛乳由来のカチオン性タンパク質（ラクトペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ラクトフェリンを含む）の全画分を含む溶液に、６０ｍＳ／ｃｍの導電率まで飽和ＮａＣｌ溶液を補足した溶液；
‐ １００ｍＳ／ｃｍの溶出液からの限外ろ過によるウシラクトフェリンの濃縮溶液；
‐ ６０ｍＳ／ｃｍの導電率まで飽和ＮａＣｌ溶液で補足された、精密ろ過（マイクロフィルター）された乳清カチオン性タンパク質単離物（タンパク質／乾燥物＞９０％）の溶液；
‐ ５％生理食塩水で再構成したヤギラクトフェリンの粉末；
‐ ０．５ＭのＮａＣｌ溶液で再構成された卵白のリゾチーム粉末。
ｂ）カチオン性タンパク質の前記溶液を、５～５０ｋＤａのカットオフ閾値を有する限外ろ過膜を用いて、エンドトキシンを含まない水、好ましくは限外ろ過浸透水で透析ろ過し、カットオフ閾値は溶液のカチオン性タンパク質の分子量の関数として選ばれるものであり、それは一般に５～５０ｋＤａであるが、２０ｋＤａ以下、又は１～２０ｋＤａ、又は５～２０ｋＤａ、又は２０ｋＤａ、１０ｋＤａ以下、又は１～１０ｋＤａ、又は５～１０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ、５ｋＤａ以下、又は１～５ｋＤａ、又は５ｋＤａ、又は１ｋＤａであり得、透析ろ過は、１０ｍＳ／ｃｍ以下の、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ以下の、さらに好ましくは１ｍＳ／ｃｍ以下の導電率が得られるまで実施し、この透析ろ過の間、カチオン性タンパク質の溶液の導電率を４５ｍＳ／ｃｍ超から１０ｍＳ／ｃｍ未満に低下させ、この溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜媒体（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はモノリシック媒体（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＱＡ、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）に連続的に通し、この媒体は、溶液中に存在するエンドトキシンを実質的にすべて吸着して除去するために、立体排除効果をほとんど持たないものである；
ｃ）任意選択で、微生物の負荷を低減するために、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いて精密ろ過（マイクロフィルター）する；
ｄ）任意選択で、溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、粉末のカチオン性タンパク質単離物を得る。
ａ）
‐ ６．５～７のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ ４５ｍＳ／ｃｍより大きい、好ましくは５０ｍＳ／ｃｍ又は６０ｍＳ／ｃｍより大きい導電率を有する、
溶液を得る；
例示的にかつ限定なしで、このような溶液は、以下から選択され得る：
‐ カチオン交換樹脂（例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から１００ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で溶出した牛乳由来のラクトフェリンを含有する溶液；
‐ カチオン交換樹脂（例えばＳＰＥＣ７０ＳＬＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）から１０％のＮａＣｌで溶出した牛乳由来のカチオン性タンパク質の全画分を含む溶液；
‐ カチオン交換樹脂（例えばＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から４０ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で溶出した、牛乳由来のカチオン性タンパク質（ラクトペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ラクトフェリンを含む）の全画分を含む溶液に、６０ｍＳ／ｃｍの導電率まで飽和ＮａＣｌ溶液を補足した溶液；
‐ １００ｍＳ／ｃｍの溶出液からの限外ろ過によるウシラクトフェリンの濃縮溶液；
‐ ６０ｍＳ／ｃｍの導電率まで飽和ＮａＣｌ溶液で補足された、精密ろ過（マイクロフィルター）された乳清カチオン性タンパク質単離物（タンパク質／乾燥物＞９０％）の溶液；
‐ ５％生理食塩水で再構成したヤギラクトフェリンの粉末；
‐ ０．５ＭのＮａＣｌ溶液で再構成された卵白のリゾチーム粉末。
ｂ）カチオン性タンパク質の前記溶液を、５～５０ｋＤａのカットオフ閾値を有する限外ろ過膜を用いて、エンドトキシンを含まない水、好ましくは限外ろ過浸透水で透析ろ過し、カットオフ閾値は溶液のカチオン性タンパク質の分子量の関数として選ばれるものであり、それは一般に５～５０ｋＤａであるが、２０ｋＤａ以下、又は１～２０ｋＤａ、又は５～２０ｋＤａ、又は２０ｋＤａ、１０ｋＤａ以下、又は１～１０ｋＤａ、又は５～１０ｋＤａ、又は１０ｋＤａ、５ｋＤａ以下、又は１～５ｋＤａ、又は５ｋＤａ、又は１ｋＤａであり得、透析ろ過は、１０ｍＳ／ｃｍ以下の、好ましくは５ｍＳ／ｃｍ以下の、さらに好ましくは１ｍＳ／ｃｍ以下の導電率が得られるまで実施し、この透析ろ過の間、カチオン性タンパク質の溶液の導電率を４５ｍＳ／ｃｍ超から１０ｍＳ／ｃｍ未満に低下させ、この溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜媒体（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はモノリシック媒体（例えば、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＱＡ、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）に連続的に通し、この媒体は、溶液中に存在するエンドトキシンを実質的にすべて吸着して除去するために、立体排除効果をほとんど持たないものである；
ｃ）任意選択で、微生物の負荷を低減するために、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いて精密ろ過（マイクロフィルター）する；
ｄ）任意選択で、溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、粉末のカチオン性タンパク質単離物を得る。
【0011】
【0012】
あるいは、本発明は、以下のａ）～ｄ）のステップを含むカチオン性タンパク質単離物の精製方法に関する：
ａ）
‐ ６．５～７．５のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ １ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する、
溶液を得る；
特定の実施形態によれば、この第２の方法は、前の方法によって得られた単離物に適用される。
ｂ）前記溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜媒体（例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はモノリシック媒体（例えばＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＱＡ、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒｔｉｏｎｓ）に通し、その媒体は、溶液中に存在するエンドトキシンを実質的にすべて吸着及び除去するために、立体排除効果をほとんど持たないものであり；溶液は好ましくは数回、好ましくは少なくとも３回カチオン交換媒体に通す；
ｃ）任意選択で、完成品の適合性のために微生物負荷を許容レベルまで低減するために、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いて精密ろ過（マイクロフィルター）する；
ｄ）任意選択で、溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、粉末のカチオン性タンパク質単離物を得る。
ａ）
‐ ６．５～７．５のｐＨを有する、
‐ ７．５より大きい等電点を有するカチオン性タンパク質と６．５未満の等電点を有する酸性タンパク質を、全タンパク質の重量に対して１重量％未満の含量で含む、
‐ １ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する、
溶液を得る；
特定の実施形態によれば、この第２の方法は、前の方法によって得られた単離物に適用される。
ｂ）前記溶液をアニオン交換媒体、好ましくは膜媒体（例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ、Ｓａｒｔｏｒｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）又はモノリシック媒体（例えばＣＩＭｍｕｌｔｕｓ ＱＡ、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒｔｉｏｎｓ）に通し、その媒体は、溶液中に存在するエンドトキシンを実質的にすべて吸着及び除去するために、立体排除効果をほとんど持たないものであり；溶液は好ましくは数回、好ましくは少なくとも３回カチオン交換媒体に通す；
ｃ）任意選択で、完成品の適合性のために微生物負荷を許容レベルまで低減するために、０．２～１．４μｍのカットオフ閾値を有する膜を用いて精密ろ過（マイクロフィルター）する；
ｄ）任意選択で、溶液を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、粉末のカチオン性タンパク質単離物を得る。
【0013】
図４は、本発明による代替的方法の実施を可能にする装置の配置図を示す。
【0014】
本発明はまた、本発明による方法によって得られ得る、又は得られるようなカチオン性タンパク質画分であって、５ＩＵ／ｍｇタンパク質未満、好ましくは１ＩＵ／ｍｇタンパク質未満、なおより好ましくは０．１ＩＵ／ｍｇタンパク質未満のエンドトキシン含有量を有するようなものに関する。
【0015】
一実施形態によれば、画分のカチオン性タンパク質は、乳に由来し、その後、ラクトフェリンから主としてなるか、又はラクトペルオキシダーゼから主としてなるか、又はリボヌクレアーゼから主としてなるか、又はＴＧＦ‐βを２０μｇ／ｇ超、好ましくは５０μｇ／ｇ超、最も好ましくは１００～２００μｇ／ｇタンパク質の含量で含んでもよい。「から主としてなる」とは、乾物の重量に対して、少なくとも５０重量％、さらには９０重量％又は９５重量％超のタンパク質を含む画分を意味する。本発明による画分は、乳又は乳清のカチオン性タンパク質の混合物を主として含むこともできる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＬＰＳの概略図（Ｍａｅｓｈｉｍａ ＆ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ２０１３）。
【図2】カチオン性タンパク質単離物の精製方法の概略図。
【図3】カチオン性タンパク質単離物の精製方法の略図の例。Ａ：透析ろ過とアニオン交換媒体を並列に組み合わせた方法、Ｂ：透析ろ過とアニオン交換媒体を直列に組み合わせた方法。
【図4】カチオン性タンパク質単離物を精製するための代替方法の概略図である。
【実施例】
【0017】
例１：液体ウシラクトフェリン濃縮物を用いたベンチテスト
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、低温殺菌した脱脂牛乳を通し、次いで３６ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液と１１０ｍＳ／ｃｍの同溶液で連続して溶出し、最後に２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で第２の溶出液を濃縮することにより、牛乳由来ラクトフェリンの液体濃縮物を得た。
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、低温殺菌した脱脂牛乳を通し、次いで３６ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液と１１０ｍＳ／ｃｍの同溶液で連続して溶出し、最後に２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で第２の溶出液を濃縮することにより、牛乳由来ラクトフェリンの液体濃縮物を得た。
【0018】
タンパク質濃度は１３ｍｇ／ｍＬ、タンパク質に対するウシラクトフェリンの純度は９５％、この溶液の導電率は６５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨは６．８（「濃縮物ＬＦ１」）である。
【0019】
２）６５ｍＳ／ｃｍのこの液体ウシラクトフェリン濃縮物７５ｍＬを、Ｓｔａｒｔ ＡＸＨ限外ろ過中空糸モジュール（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）を備えたＡＫＴＡ ｆｌｕｘ ｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてベンチスケールで透析ろ過した。透析ろ過は、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で調製した超高純度脱塩水で５ｍＳ／ｃｍまで不連続的に実施し、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の体積が初期体積の５０％に達した時点で超純水を初期体積にまで添加し、これを５回繰り返した。こうして、脱塩ウシラクトフェリン濃縮物を得た（「濃縮物ＬＦ２」）。
【0020】
上記と同様の透析ろ過手順を行ったが、この透析ろ過により導電率が６５から５ｍＳ／ｃｍに漸減する間に、今度は濃縮物（保持液）をＱタイプ（第４級アンモニウム）のアニオン交換膜カートリッジ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）に流速１５ｍＬ／分で８０分間再循環させ、並行に通した。こうして、透析ろ過により脱塩し、アニオン交換膜で処理したウシラクトフェリン濃縮物を得た（「濃縮物ＬＦ３」）。
【0021】
３） 透析ろ過により得られた各脱塩ラクトフェリン濃縮物中のエンドトキシンの濃度は、Ｌｏｎｚａ社のｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ（動的色原体ＬＡＬ）（カブトガニ変形細胞溶解物）アッセイにより測定した。並行して、各濃縮物中のウシラクトフェリンの濃度をＨＰＬＣ ＰＩ法（カラムＣ１８ ３００Å，０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ｎｍで検出）により測定した。結果はＩＵ／ｍｇウシラクトフェリンとして表す。
【0022】
【表1】
【0023】
例２：ウシラクトフェリンの液体単離物を用いたベンチテスト
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、逆浸透膜で乾燥物量１３０ｇ／Ｌに濃縮した低温殺菌脱脂牛乳を通し、次いで３８ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で１０％で連続的に溶出し、次いで第２溶出液を２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で濃縮し、次いで１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で１ｍＳ／ｃｍまで浸透水を用いて透析ろ過し、最後に、透析ろ過後の保持液を、０．８μｍの二重層セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｒｏｘ（登録商標）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精密ろ過（マイクロフィルター）することにより、牛乳由来のラクトフェリンの液体精密ろ過物を得た。
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、逆浸透膜で乾燥物量１３０ｇ／Ｌに濃縮した低温殺菌脱脂牛乳を通し、次いで３８ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で１０％で連続的に溶出し、次いで第２溶出液を２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で濃縮し、次いで１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で１ｍＳ／ｃｍまで浸透水を用いて透析ろ過し、最後に、透析ろ過後の保持液を、０．８μｍの二重層セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｒｏｘ（登録商標）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精密ろ過（マイクロフィルター）することにより、牛乳由来のラクトフェリンの液体精密ろ過物を得た。
【0024】
２）この液体ウシラクトフェリン単離物を、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で調製した超高純度脱イオン水で希釈し、タンパク質濃度を１６ｍｇ／ｍｇ（ｗ／ｖ）、タンパク質に対するウシラクトフェリンの純度を９５％、この溶液の導電率を０．１５ｍＳ／ｃｍ、ｐＨを６．９とした（「単離物ＬＦ１」）。この液体ラクトフェリン単離物７５ｍＬをＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）に１３ｍＬ／分の流速で通し、９０分間再循環させた（以下「単離物ＬＦ２」）。
【0025】
３） 各ラクトフェリン単離物中のエンドトキシンの濃度は、Ｌｏｎｚａ社のｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ（動的色原体ＬＡＬ）（カブトガニ変形細胞溶解物）アッセイにより測定した。並行して、各濃縮物中のウシラクトフェリンの濃度をＨＰＬＣ ＰＩ法（カラムＣ１８ ３００Å、０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮグラジエント、２８０ ｎｍで検出）により測定した。結果は、ウシラクトフェリンのＩＵ／ｍｇとして表した。
【0026】
【表2】
【0027】
例３：ウシラクトフェリンの液体単離物を用いたベンチテスト
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、低温殺菌した脱脂牛乳を通し、次いで、３６ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液と１１０ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で連続して溶出し、次いで、第２溶出液を２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で濃縮し、次いで、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で１ｍＳ／ｃｍまでの浸透水で透析ろ過し、最後に透析ろ過した保持液を１．４μｍの二重層セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｒｏｘ（登録商標）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精密ろ過することにより、牛乳由来のラクトフェリンの液体精密ろ過物を得た。ろ過した。
１）ラジアルフローカラム（Ａｌｂｅｒｔ Ｈａｎｄｔｍａｎｎ Ａｒｍａｔｕｒｅｎｆａｂｒｉｃｋ ＧｍｂＨ）において、工業用カチオン交換クロマトグラフィー法、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、低温殺菌した脱脂牛乳を通し、次いで、３６ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液と１１０ｍＳ／ｃｍのＮａＣｌ溶液で連続して溶出し、次いで、第２溶出液を２０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で濃縮し、次いで、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ限外ろ過で１ｍＳ／ｃｍまでの浸透水で透析ろ過し、最後に透析ろ過した保持液を１．４μｍの二重層セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｒｏｘ（登録商標）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で精密ろ過することにより、牛乳由来のラクトフェリンの液体精密ろ過物を得た。ろ過した。
【0028】
タンパク質濃度は１４７ｍｇ／ｍＬ、タンパク質に対するウシラクトフェリンの純度は９５％、この溶液の導電率は０．８ｍＳ／ｃｍ、ｐＨは６．８である（「単離物ＬＦ３」）。
【0029】
２）この液体ラクトフェリン単離物７０ｍＬをＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）に６ｍＬ／分の流速で通した（「単離物ＬＦ４」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（６５ｍＬ）をＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに通した後、回収したラクトフェリン液体単離物を再度Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに、合計３回通した（「単離物ＬＦ５」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（６０ｍＬ）を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに、６ｍＬ／分の流速で３０分間再循環させ、合計６回の均等の通過をさせた（「単離物ＬＦ６」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（５５ｍＬ）を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに３７分間、６ｍＬ／分の流速で循環させ、合計１０回の均等の通過をさせた（「単離物ＬＦ７」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（６５ｍＬ）をＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに通した後、回収したラクトフェリン液体単離物を再度Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに、合計３回通した（「単離物ＬＦ５」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（６０ｍＬ）を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに、６ｍＬ／分の流速で３０分間再循環させ、合計６回の均等の通過をさせた（「単離物ＬＦ６」）。
回収したラクトフェリン液体単離物（５５ｍＬ）を、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジに３７分間、６ｍＬ／分の流速で循環させ、合計１０回の均等の通過をさせた（「単離物ＬＦ７」）。
【0030】
３） 各ラクトフェリン単離物中のエンドトキシン濃度は、Ｌｏｎｚａ社のｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ（動的色原体ＬＡＬ）（カブトガニ変形細胞溶解物）アッセイにより測定された。結果は、ＩＵ／ｍｇタンパク質として表される。
【0031】
【表3】
【0032】
例４：牛乳由来のカチオン性タンパク質を含むＴＧＦ‐βの液体単離物を用いたベンチテスト
１）特許ＥＰ１９１２５１３号の実施例１に記載の方法に従い、牛乳由来のＴＧＦ‐β含有カチオン性タンパク質画分を得た。噴霧乾燥前に得られた精密ろ過液中のＥＬＩＳＡキット（Ｑｕｎｔｉｋｉｎｅ ＴＧＦ‐２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析したＴＧＦ‐β２含量は１１５μｇ／ｇタンパク質であった。
１）特許ＥＰ１９１２５１３号の実施例１に記載の方法に従い、牛乳由来のＴＧＦ‐β含有カチオン性タンパク質画分を得た。噴霧乾燥前に得られた精密ろ過液中のＥＬＩＳＡキット（Ｑｕｎｔｉｋｉｎｅ ＴＧＦ‐２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で分析したＴＧＦ‐β２含量は１１５μｇ／ｇタンパク質であった。
【0033】
２）ＴＧＦ‐βを含有するこの液体カチオン性タンパク質単離物を、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で調製した超高純度脱イオン水で希釈してタンパク質濃度を２．６ｍｇ／ｍｇ（ｗ／ｖ）、この溶液の導電率を０．８９ｍＳ／ｃｍ、ｐＨを７．１とした（「乳カチオン性タンパク質単離物１」）。この液体乳カチオン性タンパク質単離物５０ｍＬを、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ｎａｎｏ ３ｍＬカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を通して、５ｍＬ／分の流速で７０分間再循環した（「乳カチオン性タンパク質単離物２」）。
【0034】
３）各液体乳カチオン性タンパク質単離物中のエンドトキシンの濃度は、Ｌｏｎｚａ社のｋｉｎｅｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ＬＡＬ（動的色原体ＬＡＬ）（カブトガニ変形細胞溶解物）アッセイにより測定した。結果は、タンパク質のＩＵ／ｍｇとして表される。
【0035】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】