▶ セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-02
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインを含むキメラ抗原
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20231026BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20231026BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231026BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20231026BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61K39/39
A61P35/00
C07K14/705 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524660
(86)(22)【出願日】2021-09-28
(85)【翻訳文提出日】2023-06-13
(86)【国際出願番号】 CU2021050008
(87)【国際公開番号】W WO2022083805
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】2020-0075
(32)【優先日】2020-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304012895
【氏名又は名称】セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】モレーラ ディアス、ヤネリス
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス ラミレス、ハヴィエル
(72)【発明者】
【氏名】カナン － ヘイデン アヤラ、カミラ
(72)【発明者】
【氏名】ベケット ロメロ、モニカ
(72)【発明者】
【氏名】アヤラ アヴィラ、マルタ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス モヤ、イザベル
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス ブランコ、ソニア
(72)【発明者】
【氏名】リモンタ フェルナンデス、ミラディス
(72)【発明者】
【氏名】エスピノーサ ロドリゲス、ルイス アリエル
(72)【発明者】
【氏名】ベサダ ペレス、ウラディミール アルマンド
(72)【発明者】
【氏名】ガヴィロンド コウリー、ホルヘ ヴィクトール
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085AA38
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF02
4C085FF11
4C085FF14
4C085FF21
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
ネイティブＰＤ－Ｌ１分子と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインの多量体凝集体を含むキメラ抗原。本発明はさらに、上記キメラ抗原および少なくとも薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物を開示する。キメラ抗原は、がんまたはその転移を処置するための薬物の製造に使用される。本発明はまた、がんまたはその転移の処置を必要とする対象においてがんまたはその転移を処置する方法であって、本明細書に記載のキメラ抗原を含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする方法を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体凝集体を形成するヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを含む、キメラ抗原。
【請求項2】
細菌におけるその発現を増加させるためのアミノ末端セグメントと、アフィニティークロマトグラフィーによるその精製を容易にするためのカルボキシ末端セグメントとを含む、請求項１に記載のキメラ抗原。
【請求項3】
配列番号１として特定されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のキメラ抗原。
【請求項4】
ａ）ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に結合する能力が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにｂ）少なくとも１つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項5】
前記ワクチンアジュバントが、オイルアジュバント、鉱物塩、プロテオリポソーム、およびガングリオシドにコンジュゲートしたプロテオリポソームによって構成される群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ワクチンアジュバントがアルミニウム塩である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
がんまたはその転移を処置するための薬物を製造するための、ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを含むキメラ抗原の使用。
【請求項8】
がんを処置するための前記薬物が、能動的免疫治療のためのワクチンである、請求項７に記載のキメラ抗原の使用。
【請求項9】
ａ）ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにｂ）少なくとも１つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする、必要性のある個体におけるがんまたはその転移を処置するための方法。
【請求項10】
前記キメラ抗原を含む前記組成物の前記投与が、受動的免疫治療または標準的ながん治療と同時にまたは順次に組み合わされる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記受動的免疫治療が、ヒトＰＤ－Ｌ１またはヒトプログラム細胞死タンパク質受容体１（ＰＤ－１）に対する抗体を用いて実施される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーおよびヒトの健康の分野に関する。本発明は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外ドメインの２００を超えるアミノ酸を含むキメラワクチン抗原の詳細を提供する。本発明はまた、上記抗原および少なくとも１つのアジュバントを含むワクチン組成物を提供する。この組成物は、ＰＤ－Ｌ１に特異的な免疫応答を誘導し、ＰＤ－Ｌ１が媒介する生物学的効果に対して中和活性を有し、したがって、がんおよびその転移の処置に使用することができる。
【背景技術】
【0002】
ＰＤ－Ｌ１として公知のプログラム死リガンド１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質受容体である。ＰＤ－Ｌ１は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）およびＣＤ８０として公知の別の膜受容体と特異的かつ機能的な相互作用を有する。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトゲノムの９番染色体上に位置するＣｄ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸のタンパク質である。正常組織では、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞、樹状細胞、非リンパ器官からの非造血細胞上に発現されるが、様々な種類の腫瘍でも発現される（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６：９：５０２３－３９，Ｓａｌｍａｎｉｎｅｊａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１９：２３４：１６８２４－３７）。
【0003】
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、免疫系攻撃を回避する腫瘍誘導免疫抑制環境に関連する様々な機序に関与している。Ｔ細胞上のＰＤ－１と腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１との間の結合は、Ｔリンパ球の増殖および分化を減少させることによって免疫応答の抑制を誘導する。さらに、この相互作用は、Ｔ細胞アポトーシス、アネルギーおよびそれらの機能的疲弊の活性化を誘導する。ＰＤ－Ｌ１は、多くの悪性腫瘍において過剰発現し、予後不良に関連する。
【0004】
分子とこの天然受容体との相互作用を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体などの免疫治療剤の使用は、がんの処置における有望な代替法と考えられてきた。この抗体群の中で、ＦＤＡは、特に転移性尿路上皮癌、メルケル細胞癌、扁平上皮非小細胞肺がんおよび腎細胞癌を含む進行期腫瘍のいくつかのがん型を有する患者を処置するためにアテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブを承認している（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１９：２４：１１９０）。
【0005】
抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体による処置は、いくらかの臨床的成功を示すが、治療薬の頻繁な投与および高い用量を必要とし、高コストにつながり、とりわけ、間質性肺炎、心筋炎、大腸炎などの有害作用をもたらす（Ｗａｎｇ ｙ Ｘｕ，ＪＡＭＩＡ Ｏｐｅｎ，２０１８：２：１７３－８）。多くの場合、これらの毒性の重度は、受動的治療の遅延または中断を引き起こす。
【0006】
一方、他の戦略は、ＰＤ－Ｌ１を抗原とする能動的免疫治療アプローチをとることによってこれらの問題に対処しようとしたものであり、例えばタンパク質またはそのペプチドの大部分をカバーするポリペプチドを使用したものである。Ｍｕｎｉｒらは、２つのＰＤ－Ｌ１ペプチドを用いてインビトロ試験を行い、ＤＣｖａｃｃと呼ばれるワクチンで処置した進行黒色腫がん患者から単離した末梢血単核細胞を刺激する能力を評価した。ワクチンは、腫瘍関連抗原ｐ５３およびテロメラーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞の患者への投与を伴った。これらの患者からの末梢血単核細胞は、ＤＣｖａｃｃに対する限られた反応性のみを有した。しかしながら、これらの細胞をＰＤＬｏｎｇ１（本明細書において配列番号２３として特定される）およびＰＤＬｏｎｇ２（本明細書において配列番号２４として特定される）と呼ばれる２つのＰＤ－Ｌ１由来ペプチドでインビトロ刺激した場合、ワクチンに対するＴ細胞反応性が有意に増加した（Ｍｕｎｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３：２：ｅ２３９９１）。
【0007】
上述の知見および他のさらなるデータに基づいて、抗原としてＰＤＬｏｎｇ１ペプチドを使用して、ＰＤ－Ｌ１に対するペプチドワクチンを開発した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球のエピトープを含むこのペプチドをアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）と混合し、第Ｉ相臨床研究において多発性骨髄腫を有する患者に投与した。この抗原調製物は、ヒトにおいて安全かつ免疫原性であった。ワクチン接種がん患者の皮膚生検から得られたリンパ球をペプチドの存在下で活性化した。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体応答は免疫化患者では検出されなかった（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，ＨｅｍａＳｐｈｅｒｅ，２０１９：３：６３１－２）。抗体応答がこの種の処置の有効性における関連因子であることが実証されているので、この要素は制限を表し得る。このリガンドに対する抗体は、ＰＤ－Ｌ１とその受容体との間の相互作用を遮断することができ、Ｔ細胞媒介性抗がん免疫も増強することができる。
【0008】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチンに基づく能動的免疫治療戦略も開発されている。このＤＮＡワクチンは、ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインをコードするプラスミドで形質転換した弱毒生菌（サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）種）を使用して口腔経路で投与される。この戦略は、国際公開第２０１８／１６７２９０号パンフレットに開示されている。細菌感染機序を利用して、細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球を生成し、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩに関連するＰＤ－Ｌ１ペプチドを提示する樹状細胞によって活性化した。これらの細胞傷害性リンパ球は、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞を排除することができた。免疫応答の細胞分岐の活性化に加えて、このワクチンは、ＰＤ－Ｌ１に特異的な抗体応答も誘導した。それにもかかわらず、誘発された抗体レベルは比較的低かった（Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１８：３６：７４）。この要素は、能動的免疫治療のこの変異体の成功にとって好ましくない可能性がある。
【0009】
ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（Ｐｈｅ １９－Ｇｌｕ ２２８）およびジフテリア毒素（ＤＴＴ）に基づく融合ポリペプチドによる能動的免疫治療が、国際公開第２０１４／１８３６４９号パンフレットに記載されている。この第２のポリペプチドセグメントは、強いＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を促進するために含められた。ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインは、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）発現系において産生された。この発現系は、その正しい折り畳みおよび三次元立体配座を保証し、融合タンパク質の構造的完全性を保証する。フロイントアジュバントと混合したワクチン抗原（４３．５ｋＤａ）は、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体応答および細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導した。この免疫応答のエフェクターは、腫瘍成長および転移移植を阻害した（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，２０１９：１４：２２２－３２）。しかしながら、誘発された抗体のレベルは、現在最も強いアジュバントと考えられているフロイントアジュバントの使用を考慮すると、比較的中程度と考えられ得る。
【0010】
したがって、より高い免疫原性ならびに抑止された腫瘍促進活性を有する新しいＰＤ－Ｌ１ベースのワクチン抗原の開発は、関心のある領域として残っている。この戦略は、投与される抗原の量を増加させる必要なく、活発な体液性および細胞性免疫応答を同時に生じさせることができなければならない。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、ネイティブＰＤ－Ｌ１タンパク質と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体凝集体を形成するプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の細胞外ドメインを含むキメラ抗原を提供することによって、前述の問題を解決する。上記キメラ抗原は構造的に凝集しており、これにより、このポリペプチド中に存在するＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインの立体配座が、ネイティブリガンド中の上記ドメインの立体配座と比較して改変される。
【0012】
本発明では、ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインは、ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸Ｐｈｅ １９～Ａｒｇ ２３８の領域を指す。本発明の一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１のヒト細胞外ドメインを含むキメラ抗原はまた、細菌におけるその発現を増加させるためのアミノ末端と、アフィニティークロマトグラフィーによるその精製を容易にするためのカルボキシル末端とを含む。本発明の一実施形態では、キメラ抗原は、配列番号１として特定されるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0013】
配列表において配列番号１として特定される抗原は、ＰＤ－Ｌ１分子の細胞外ドメイン（Ｐｈｅ １９～Ａｒｇ ２３８）である、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＬｐｄＡタンパク質のアミノ末端の最初の４７アミノ酸を含む。両方の領域は、両方のポリペプチド間のリンカーとして機能する１３個のアミノ酸によって分離されている。本発明の目的のタンパク質は、１８個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術による遺伝子の組み立てから出発して得られた。発現ベクターにおけるクローニングのために、発現ベクターの特徴に従って設計されたプライマーを使用し、ＤＮＡを挿入し、最終的に配列決定した。この配列を、識別子Ｑ９ＮＺＱ７を有するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＺＱ７）で刊行されたＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインについて報告された配列と比較し、その同一性を確認した。上記の方法によって得られたポリペプチドを、ウイルス、細菌、酵母、ファージ、植物または哺乳動物細胞中の発現ベクターにクローニングし、それに応じて挿入部位を変化させることができる。遺伝子構築が得られると、その配列は従来の自動配列決定法を使用して検証されなければならない。
【0014】
特定の実施形態では、キメラポリペプチドを得るために、他の要素の中でもトリプトファンプロモーター、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質のアミノ末端に対応する４７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列（欧州特許第０８１６５０６号明細書）、６つのヒスチジンのセグメントをコードするヌクレオチド配列およびＴ４ターミネーターを含むｐＭ２３８大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現ベクターを使用した。この発現ベクターはまた、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を有する。得られた融合ポリペプチドをＰＫＰＤ－Ｌ１と命名した。
【0015】
キメラポリペプチドを精製したら、サイズ排除ＨＰＬＣによる分析を実施し、これは、カラムの空隙体積で溶出し、カラムに適用された総タンパク質の９０％を占める主要なピークを示した。この主要なピークは、６７０ｋＤａより大きい分子量を有する凝集タンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１を含み、これは、ＰＤ－Ｌ１ネイティブタンパク質の細胞外ドメインに対応する２６ｋＤａの分子量とは異なる（例２）。驚くべきことに、この融合ポリペプチドは、高分子量凝集体の形成をもたらしたその構造の変化を有する。これらの凝集体の安定な形成は、以下の特徴を有するＰＤ－Ｌ１変異体をもたらす：（１）天然ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１相互作用の特定の化学量論を改変し、生物学的に活性なネイティブＰＤ－Ｌ１の変異体と比較して、融合ポリペプチドの上記受容体への結合の低下を引き起こす、いくつかのＰＤ－Ｌ１分子の空間的配置、（２）いくつかのＰＤ－Ｌ１分子の結合が、上記凝集の結果としてエピトープの反復露出をもたらし、これが、ＰＤ－Ｌ１がそのネイティブの三次元構造においてモノマーとして見出される場合に得られるものと比較して、免疫原性の増加を引き起こすこと。これらの知見は、がんの制御に適用することができる、はるかに有効かつより安全な新規治療法の開発を支持する。
【0016】
本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較してＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体を形成する）の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物を開示する。構造的に凝集しているというＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの特有の特徴、および安全性プロファイルを損なうことなく、アジュバントと組み合わせた場合のその増強された免疫原性は、他のＰＤ－Ｌ１変異体と比較した場合、このポリペプチドに免疫学的利点を与える。その安全性は、さらに利点を示す。すなわち、それが、特異的抗体による受動的免疫治療戦略と比較して（処置の慢性性のために）繰り返し投与されるワクチンの一部であるためである。これらの要素は、ＰＫＰＤ－Ｌ１を、ＰＤ－Ｌ１発現の増加に関連する疾患の処置のための高い可能性を有する抗原にする。本発明は、アジュバントと組み合わせた、ヒトＰＤ－Ｌ１を代表する構造的に凝集した組換えキメラポリペプチドの投与を特徴とする特異的な能動的免疫治療を記載する。
【0017】
本発明の一実施形態では、医薬組成物において、ワクチンアジュバントは、オイルアジュバント、鉱物塩、プロテオリポソームおよびガングリオシドにコンジュゲートしたプロテオリポソームによって構成される群から選択される。免疫応答の発生を刺激するために、本発明のキメラ抗原は、免疫増強剤および／またはアジュバントと組み合わせることができる。これらの化合物の性質は通常多様であり、例えば鉱物塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム）；可溶性サイトカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１８）；膜受容体（すなわち、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ型の不変鎖、ＬＦＡ３）；サポニン（すなわち、ＱＳ２１）；ＣｐＧなどのオリゴヌクレオチド；リポ多糖などの糖脂質；エマルジョン（すなわち、フロイントアジュバント、合成アジュバント製剤（ＳＡＦ）、ＭＦ５９、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標））、リポソーム、ナノ粒子およびビロソーム；微粒子アジュバント、ポロキサマー、ウイルス起源のアジュバント（すなわち、ＨＢｃＡｇ、ＨＣｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ）および細菌起源のアジュバント（すなわち、ＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ、Ｎ－ＧｌｉＧＭ３－ＶＳＳＰ）；粘膜アジュバント、例えば、熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素および変異毒素（すなわち、ＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）の化合物である。
【0018】
免疫原は、毒性でなく、有害な治療効果を示さず、当業者に公知の医薬用途に許容されるビヒクル中で投与することができる。本発明で提示される例は、特定の緩衝液または緩衝液の組み合わせの使用、およびその安定性の増加に寄与する賦形剤の使用さえも決して制限しない。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、がんまたはその転移を処置するための薬物を製造するための、ネイティブ型のＰＤ－Ｌ１と比較した場合にＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインを含むキメラ抗原の使用を提供する。これは、タンパク質の非融合変異体またはＰＤ－Ｌ１ペプチドの混合物と比較した場合に免疫原性特性を増加させる、融合ポリペプチドＰＫＰＤ－Ｌ１のかなり安定な立体配座および高分子量に起因する。アジュバントであるリン酸アルミニウムまたはＶＳＳＰ（非常に小さいサイズのプロテオリポソーム、米国特許第６１４９９２１号明細書；国際公開第２０１９８６０５６号パンフレット）と共に投与された融合タンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１は、自己分子に対する免疫寛容を破ることができ、ネイティブＰＤ－Ｌ１に対する特異的な体液性および細胞性免疫応答を誘導することができるワクチンを作り出す。この免疫応答は、モノクローナル抗体による受動的免疫治療と比較した場合、またはネイティブＰＤ－Ｌ１タンパク質もしくはＰＤ－Ｌ１ペプチドの混合物に基づく抗原によって生じる免疫応答と比較した場合、定性的および定量的に優れている。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの免疫原性におけるこの増加は、抗腫瘍活性における増大を促し、これは、他の評価された戦略によってもたらされるものよりも優れている。
【0020】
本発明において実証された腫瘍成長に対する阻害効果は、それらの可能な組み合わせを除外することなく、異なる機序に基づくものであり得る。ワクチン接種によって生じたポリクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体応答は、腫瘍細胞表面に発現されるＰＤ－Ｌ１リガンドと細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の膜に発現されるＰＤ－１との間の相互作用を遮断することができ、その機能的不活性化を回避する。一方、ワクチン接種によって生じた抗体は、内在化プロセスを通して、腫瘍細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１のレベルを減少させることができる。ＰＤ－Ｌ１の減少は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を不活性化する悪性細胞の能力の低下をもたらし得る。さらに、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１リガンドの低発現は、上皮細胞と同様の表現型を獲得することを促し、したがって、その転移能を負に調節する。抗体応答のポリクローナル性は、上記の生物学的事象の有効性における重要な因子である。
【0021】
さらに、ＰＫＰＤ－Ｌ１による免疫化は、原発腫瘍細胞およびそれらの転移に対する特異的細胞傷害性リンパ球を誘導し、これらは、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩとの関連においてＰＤ－Ｌ１ペプチドを潜在的に提示する。これは、より多数のリンパ球を生成するそれらの能力に加えて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の両方を活性化し、それによってそれらのクローンの多様性を達成することができるという、ＰＫＰＤ－Ｌ１融合タンパク質による免疫化の利点である。ＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外領域からの２００個を超えるアミノ酸を含むキメラタンパク質で免疫することによって、（１）ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球および細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球の両方を活性化することができる線状エピトープを同時に提示し、それにより腫瘍に対するより効果的な免疫応答を保証すること、（２）ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球および細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球に対して制限されたいくつかのエピトープが存在し、両方の細胞型について異なる細胞クローンの存在を保証し、腫瘍に対するより効果的な免疫応答にさらに変換することができること、（３）いくつかのエピトープの存在がまた、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの異なる対立遺伝子を有する患者の集団におけるワクチン接種との関連において、特異的抗ＰＤ－Ｌ１体液性応答および／または細胞性応答を有する個体の数の増加を可能にすることが保証される。これらの要素が構成する有益な利点は、免疫化が主要組織適合遺伝子複合体の１つの対立遺伝子のみに制限されたペプチドを含む場合、存在しないかまたは非常に限定される。
【0022】
ＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質による免疫化後に生じた免疫応答のこれらの特性はすべて、ネイティブＰＤ－Ｌ１分子による能動的免疫治療戦略と比較した場合、より大きな関連性を獲得する。重要な要素は、同じ量の抗原で優れた免疫応答が達成されることである。この特徴は、ＰＫＰＤ－Ｌ１を伴うヒトにおける免疫治療戦略が、生産的観点および安全性の観点からの利点を有することを暗示する。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、ネイティブ変異体と比較して生物学的活性が低い分子であり、したがって、高用量の抗原の投与はその安全性プロファイルを損なわない。
【0023】
本発明はまた、ａ）ネイティブ形態のＰＤ－Ｌ１と比較した場合、ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対する結合能が低下した多量体を形成するヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインを含むキメラ抗原、ならびにｂ）少なくとも１つの薬学的に許容されるワクチンアジュバントを含む医薬組成物の治療有効量の投与を特徴とする、必要性のある個体におけるがんまたはその転移を処置するための方法を提供する。上述のキメラ抗原による免疫化を含むこの方法は、原発腫瘍の発生をより効果的に低減することができ、遠隔転移の発生を防止し、がん患者の生存を増加させるための利点を提供する。
【0024】
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を含む組成物の投与を含む方法は、受動的免疫治療または同時にもしくは順次に適用される標準的ながん治療と組み合わされる。この処置方法は、他の化学的、放射線学的または生物学的抗腫瘍剤と関連してまたは関連せずに、１番目または２番目の治療として使用することができる。
【0025】
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を含むワクチンの投与は、ボーラス注射、または腫瘍成長に関連する抗原もしくは腫瘍誘導免疫抑制に関与する抗原に特異的なモノクローナル抗体もしくはその断片の制御放出と組み合わされる。キメラ抗原を含むワクチン調製物は、治療有効量で哺乳動物、好ましくはヒトに投与されるが、それらの獣医学的使用を除外しない。免疫原としても公知の抗原－アジュバント混合物は、皮下、筋肉内、粘膜、腹腔内、リンパ内、局所を含む様々な経路によって、または吸入によって、投与することができる。好ましい実施形態では、キメラＰＫＰＤ－Ｌ１抗原を含む免疫原の投与の経路は皮下である。本発明で示される例は、アジュバントとの抗原の使用または特定の投与経路の使用を制限しない。
【0026】
使用される抗原用量は、異なるパラメータに従って確立することができる。これらの用量は、投与経路、問題の病態、および処置期間に依存する。以下の例に記載されているものとは異なる用量の投与間隔または投与経路の変更は、本発明の本質から逸脱するものではなく、ＰＤ－Ｌ１に対するより良好な特異的免疫応答を得るために免疫化スキームの最適化を達成することが可能である。
【0027】
本発明の一実施形態では、キメラ抗原を用いた能動的免疫治療は、ヒトＰＤ－Ｌ１リガンドまたはヒトＰＤ－１受容体に対する抗体を用いて行われる受動的免疫治療と組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ＥＬＩＳＡによって測定した、アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（Ａ）またはリン酸アルミニウム（Ｂ）と組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化後にラットにおいて生じた抗体応答である。抗体レベルは、１：２５０血清希釈物について４５０ｎｍでの吸光度単位として表した。異なる文字は、テューキー検定による統計的有意性を表す。
【図2】アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（Ａ）またはリン酸アルミニウム（Ｂ）と組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質で免疫したラットからの血清の、ＰＤ－１受容体とそのＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の相互作用を遮断する能力である。競合ＥＬＩＳＡで評価した。
【0029】
例
例１．組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１および変異体ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯのクローニングおよび発現。
ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインの成熟領域に対応するＤＮＡを、識別子Ｑ９ＮＺＱ７を有するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＺＱ７）の配列に従って増幅した。１８個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを設計した（配列番号２～配列番号１９）。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（商標）試薬セット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して遺伝子を増幅および組み立てた。ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子の組み立て後、この目的を達成するように設計された２つのプライマーを使用して酵素の制限部位を加えた。これらのプライマーは、それぞれ酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨ Ｉの制限部位を含んでいた。次いで、得られたＤＮＡをｐＭ２３８発現ベクターにクローニングした（配列番号２０および配列番号２１）。ＰＤ－Ｌ１の成熟領域（Ｐｈｅ １９からＡｒｇ ２３８までのアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列をベクターｐＭ２３８に含めることにより、このセグメントを、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質のアミノ末端から４７アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に融合した（欧州特許第０８１６５０６号明細書）。これらの領域は、１３アミノ酸のリンカーをコードするＤＮＡによって接続されている。融合ポリペプチドのカルボキシル末端に向かって、その精製を容易にするために、６つのヒスチジンの領域を加えた。クローニングから得られたプラスミドをｐＰＫＰＤ－Ｌ１と命名した。このプラスミドのヌクレオチド配列は１００％検証されている。配列表において、組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号２２として特定される。融合ポリペプチドはＰＫＰＤ－Ｌ１と呼ばれ、そのアミノ酸配列は配列表において配列番号１として特定される。
例１．組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１および変異体ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯのクローニングおよび発現。
ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインの成熟領域に対応するＤＮＡを、識別子Ｑ９ＮＺＱ７を有するＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＺＱ７）の配列に従って増幅した。１８個の部分的に重複するオリゴヌクレオチドを設計した（配列番号２～配列番号１９）。ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（商標）試薬セット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して遺伝子を増幅および組み立てた。ＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインをコードする遺伝子の組み立て後、この目的を達成するように設計された２つのプライマーを使用して酵素の制限部位を加えた。これらのプライマーは、それぞれ酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨ Ｉの制限部位を含んでいた。次いで、得られたＤＮＡをｐＭ２３８発現ベクターにクローニングした（配列番号２０および配列番号２１）。ＰＤ－Ｌ１の成熟領域（Ｐｈｅ １９からＡｒｇ ２３８までのアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列をベクターｐＭ２３８に含めることにより、このセグメントを、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質のアミノ末端から４７アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に融合した（欧州特許第０８１６５０６号明細書）。これらの領域は、１３アミノ酸のリンカーをコードするＤＮＡによって接続されている。融合ポリペプチドのカルボキシル末端に向かって、その精製を容易にするために、６つのヒスチジンの領域を加えた。クローニングから得られたプラスミドをｐＰＫＰＤ－Ｌ１と命名した。このプラスミドのヌクレオチド配列は１００％検証されている。配列表において、組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号２２として特定される。融合ポリペプチドはＰＫＰＤ－Ｌ１と呼ばれ、そのアミノ酸配列は配列表において配列番号１として特定される。
【0030】
組換えプラスミドＰＫＰＤ－Ｌ１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株に形質転換した。細菌を、５Ｌのバイオリアクター中、１０％カゼイン加水分解物、グルコース４０％および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した５ＬのＭ９培地中、３７℃で３時間培養した。ｐＨを７．０に維持した。ＰＫＰＤ－Ｌ１の発現を誘導するために、３β－インドールアクリル酸を４０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加し、培養物を２８℃で１６時間成長させた。
【0031】
ネイティブＰＤ－Ｌ１を代表するポリペプチドを得るために、哺乳動物細胞におけるその発現のための遺伝子構築を行った。このネイティブＰＤ－Ｌ１変異体（ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯと呼ばれる）は、ｐｃＤＮＡ ３．１／ｍｙｃ－Ｈｉｓ Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入されたリガンドの細胞外ドメイン（Ｐｈｅ １９～Ｇｌｕ ２３８）をコードするＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトすることによって得た。細胞培養上清を、１００％コンフルエンスに達した７日後に回収した。タンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【0032】
例２．ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの凝集状態の取得、精製および評価。
細菌ペレット（例１に記載）を超音波処理して、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；３００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．８）中で細胞構造を破壊した。細胞破壊後の不溶性画分を６Ｍ尿素による変性条件下でリン酸緩衝液に可溶化した。可溶性画分を、Ｎｉ－ＮＴＡマトリックス中の金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過によるＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質精製に使用した。
細菌ペレット（例１に記載）を超音波処理して、リン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４；３００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．８）中で細胞構造を破壊した。細胞破壊後の不溶性画分を６Ｍ尿素による変性条件下でリン酸緩衝液に可溶化した。可溶性画分を、Ｎｉ－ＮＴＡマトリックス中の金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過によるＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質精製に使用した。
【0033】
Ｎ末端およびＣ末端の完全性を実証し、アミノ酸配列を検証するために、直交ハイブリッドＱＴＯＦ－２ＴＭタンデム質量分析計でのエレクトロスプレーイオン化質量分析によってタンパク質を特徴付けた。ＥＳＩ－ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルにより、タンパク質のアミノ酸配列がｃＤＮＡから推測されたものと一致することが確認された。９４％のアミノ酸配列を検証した。タンパク質のＮ末端およびＣ末端を含むＧｌｕ－Ｃペプチドを配列決定し、それらの配列決定は予想される配列と一致した。
【0034】
ＰＫＰＤ－Ｌ１分子量を推定する目的で、予めＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））カラムにおけるサイズ排除分析ＨＰＬＣを使用した。分子量は、ゲル濾過標準（ＢｉｏＲａｄ（商標））と比較して、保持時間を用いて推定した（表１）。
【表1】
【0035】
カラムの空隙体積で溶出し、適用されたタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１の９０％を占める主要なピークが得られた。このピークは、６７０ｋＤａより高い分子量（標準からの最高分子量）を有するタンパク質凝集体を含む。保持時間および標準成分の既知の分子量を用いて作成された曲線から得られた補間結果に基づいて、ＰＫＰＤ－Ｌ１凝集体の推定分子量は約１０７８ｋＤａである。この値は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドのモノマーの理論分子量（３１ｋＤａ）とは異なる。したがって、調製物は融合ポリペプチドの多量体によって構成されていると推論することができる。ＰＫＰＤ－Ｌ１凝集体の推定分子量（１０７８ｋＤａ）はまた、リガンドＰＤ－Ｌ１ＣＨＯの計算された分子量（３２ｋＤａ）よりも高く、これは、それらのネイティブの立体配座で得られ、生物学的に活性な分子である。
【0036】
例３．ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に対するＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合能の評価。
キメラタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１の、ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に結合する能力を、Ｆｃ融合タンパク質としてこれらの分子の生物学的に活性な変異体を使用する間接ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＤ－１／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））またはＣＤ８０／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。続いて、ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＰＫＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１ＣＨＯタンパク質を異なる濃度で添加した。最後に、受容体のそれらのリガンドへの結合を検出するために、ヒトＰＤ－Ｌ１ビオチン化抗体（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を添加し、続いてストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ（商標））を添加した。
キメラタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１の、ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体に結合する能力を、Ｆｃ融合タンパク質としてこれらの分子の生物学的に活性な変異体を使用する間接ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＤ－１／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））またはＣＤ８０／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。続いて、ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃ（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））、ＰＫＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ１ＣＨＯタンパク質を異なる濃度で添加した。最後に、受容体のそれらのリガンドへの結合を検出するために、ヒトＰＤ－Ｌ１ビオチン化抗体（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を添加し、続いてストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ（商標））を添加した。
【0037】
表２は、ＰＤ－Ｌ１／ＦｃおよびＰＤ－Ｌ１ＣＨＯに対するＰＤ－１／ＦｃおよびＣＤ８０／Ｆｃの結合が類似していたことを示し、哺乳動物細胞で発現されたＰＤ－Ｌ１ＣＨＯタンパク質が、市販の生物学的に活性なタンパク質と比較して類似の結合特性を有することを示した。それにもかかわらず、ＰＤ－１受容体に対するＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの結合は、ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃ分子とＰＤ－１との間の相互作用よりも１４２０倍弱かった。さらに、ＣＤ８０受容体に対するＰＫＰＤ－Ｌ１の結合は、同じ分子に対するＰＤ－Ｌ１／Ｆｃの同じ結合よりも６８９倍低かった。
【表2】
【0038】
これらの結果は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドが、生物学的に活性なネイティブのＰＤ－Ｌ１変異体と比較して、ＰＤ－１およびＣＤ８０受容体と相互作用する能力が低下していることを示している。おそらく、高分子量凝集体を形成する多くのＰＫＰＤ－Ｌ１モノマーの空間的配置は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合またはＣＤ８０／ＰＤ－Ｌ１結合の特定の化学量論を変化させる。この特性は、高い腫瘍促進活性を有するタンパク質の投与に関連するリスクを低減することができるので、好ましい。
【0039】
例４．ＰＫＰＤ－Ｌ１タンパク質による免疫化後に生じた抗体応答。
ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの免疫原性を評価するために、雌ウィスターラットを、２つのアジュバントと組み合わせてこのポリペプチドで皮下免疫した。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質にコンジュゲートした２つのＰＤ－Ｌ１合成ペプチド（配列表において配列番号２３および配列番号２４として特定される）の混合物も評価した。生物学的に活性なポリペプチドＰＤ－Ｌ１ＣＨＯをこの実験にさらに含めた。すべての場合において、各ラットは、用量あたり２００μｇのポリペプチドまたはコンジュゲートを受けた。リン酸アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ（商標））およびｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（分子免疫学センター（キューバ、ハバナ）によって開発されたアジュバント）をアジュバントとして使用した。陰性対照として、ラットの群を各アジュバントと組み合わせた賦形剤（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で免疫した。
ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの免疫原性を評価するために、雌ウィスターラットを、２つのアジュバントと組み合わせてこのポリペプチドで皮下免疫した。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質にコンジュゲートした２つのＰＤ－Ｌ１合成ペプチド（配列表において配列番号２３および配列番号２４として特定される）の混合物も評価した。生物学的に活性なポリペプチドＰＤ－Ｌ１ＣＨＯをこの実験にさらに含めた。すべての場合において、各ラットは、用量あたり２００μｇのポリペプチドまたはコンジュゲートを受けた。リン酸アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ（商標））およびｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（分子免疫学センター（キューバ、ハバナ）によって開発されたアジュバント）をアジュバントとして使用した。陰性対照として、ラットの群を各アジュバントと組み合わせた賦形剤（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）で免疫した。
【0040】
ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰアジュバント（２００μｇ／用量）による免疫化スケジュールは、８回の毎週のワクチン接種を含んでいたが、その間に、リン酸アルミニウム（０．７ｍｇのＡＬ３＋／用量）を使用し、スケジュールは、４回の隔週投与を含んでいた。最後の免疫化の１週間後に血清を収集した（各アジュバントに応じて）。
【0041】
ヒトＰＤ－Ｌ１に対する特異的抗体を検出するために間接ＥＬＩＳＡを開発した。ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃタンパク質（ＲγＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を、ＥＬＩＳＡプレートに固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的なポリクローナルヒツジ抗体で捕捉した。ラット血清を１：２５０希釈で添加した。最後に、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体を検出するために、ラットＩｇＧ特異的ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ（商標））を使用した。
【0042】
図１は、吸光度単位で表される、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的なＩｇＧ抗体のレベルの評価からの結果を示す。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチド（高分子量凝集体を形成する）を上述のアジュバントと組み合わせて投与することにより、ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃ生物学的活性タンパク質に対する特異的抗体を生成することができた。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化によって生じた抗体レベルは、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯの投与によって誘導された抗体レベル（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）およびＰＤ－Ｌ１ペプチド混合物についての抗体レベル（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）よりも有意に高かった。リン酸アルミニウムアジュバントを使用した場合も同様の結果が得られ、ポリペプチドＰＫＰＤ－Ｌ１によって生じた特異的抗体力価は、他の２つの研究された変異体によって誘導された力価より高かった（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１合成ペプチドの混合物またはＰＤ－Ｌ１ネイティブ分子と比較して、より高い免疫原性を有することを示している。ＰＫＰＤ－Ｌ１抗原特性の増大は、融合ポリペプチドの高い凝集によって説明することができる。この凝集により、ネイティブＰＤ－Ｌ１タンパク質内に見出され得る数と比較して、抗原決定基の数が増加する。さらに、構造変化を生じさせることができ、構造中にあまり露出していない決定基の露出を支持し、これらのエピトープに対する免疫系の耐性が低いので、より高いレベルの免疫応答を誘導することができる。
【0043】
例５．ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合に対する、ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットからの血清の遮断活性の評価。
ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットからの血清の、ＰＤ－Ｌ１とそのＰＤ－１受容体との相互作用を遮断する能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。例４に記載したように、１：１００希釈で血清を得て、５００ｎｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／Ｆｃタンパク質と共に３７℃で２時間インキュベートした。この混合物を、（例４でＰＤ－Ｌ１タンパク質を捕捉したのと同様の条件を使用して）ＰＤ－１／Ｆｃタンパク質を捕捉したＥＬＩＳＡプレートに添加した。捕捉されたＰＤ－１分子に結合したＰＤ－Ｌ１の量を、特異的抗ＰＤ－Ｌ１ビオチン化抗体を用いて検出し、その後、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。最大結合吸光度値は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用が競合剤の非存在下で進行する条件から得られた。血清によって引き起こされるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の阻害を、以下の式を使用して百分率として表した：
％阻害＝１００％－［（４５０ｎｍの血清試料／４５０ｎｍの最大結合）×１００］。
ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットからの血清の、ＰＤ－Ｌ１とそのＰＤ－１受容体との相互作用を遮断する能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。例４に記載したように、１：１００希釈で血清を得て、５００ｎｇ／ｍＬのＰＤ－Ｌ１／Ｆｃタンパク質と共に３７℃で２時間インキュベートした。この混合物を、（例４でＰＤ－Ｌ１タンパク質を捕捉したのと同様の条件を使用して）ＰＤ－１／Ｆｃタンパク質を捕捉したＥＬＩＳＡプレートに添加した。捕捉されたＰＤ－１分子に結合したＰＤ－Ｌ１の量を、特異的抗ＰＤ－Ｌ１ビオチン化抗体を用いて検出し、その後、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。最大結合吸光度値は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用が競合剤の非存在下で進行する条件から得られた。血清によって引き起こされるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の阻害を、以下の式を使用して百分率として表した：
％阻害＝１００％－［（４５０ｎｍの血清試料／４５０ｎｍの最大結合）×１００］。
【0044】
図２は、ＰＤ－１受容体とそのＰＤ－Ｌ１リガンドとの間の相互作用に対する、ＰＫＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ、およびＰＤ－Ｌ１ペプチドの混合物で免疫したラットにおいて誘導された、血清の遮断活性の結果を百分率で示している。ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰまたはリン酸アルミニウムと組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１の投与は、ＰＤ－１受容体とそのＰＤ－Ｌ１リガンドとの結合を遮断する高い能力を有する抗体応答を生じた。この遮断活性は、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ変異体またはＰＤ－Ｌ１コンジュゲートペプチドの混合物による免疫化によって生成された抗体で得られたものよりも阻害率に関して高かった（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）。この結果は、前述のアジュバントを用いて得られた。
【0045】
例６．ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットからの血清の、ＰＤ－Ｌ１と上記リガンドに特異的なモノクローナル抗体との相互作用を遮断する能力の評価。
キメラＰＫＰＤ－Ｌ１抗原による免疫化後に誘導された抗体がヒトＰＤ－Ｌ１の異なる抗原決定基に対するものであるかどうかを評価するために、競合ＥＬＩＳＡを実施した。ヒトＰＤ－Ｌ１上の結合部位によるモノクローナル抗体アテゾリズマブ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（商標））、デュルバルマブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（商標））およびアベルマブ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（商標））と競合する（例４の実験からの）血清の能力を評価した。これらの抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、異なる腫瘍の処置のためにＦＤＡによって承認されており、ＰＤ－Ｌ１分子上の異なるエピトープを認識した（Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｃｅｌｌ，２０１８：９：１３５－９）。競合ＥＬＩＳＡを開発するために、モノクローナル抗体をビオチンにコンジュゲートし、ＰＤ－Ｌ１および前述のビオチン化ｍＡｂとの相互作用のＥＣ５０を決定した。キメラＰＤ－Ｌ１／Ｆｃタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。続いて、ビオチン化ｍＡｂを異なる濃度で添加し、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて抗原抗体結合を検出した。ＰＤ－Ｌ１とビオチン化抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの相互作用について、それぞれ５．２ｎｇ／ｍＬ、５．８ｎｇ／ｍＬおよび３．１ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０が得られた。条件が確立されると、競合ＥＬＩＳＡが開発され、免疫血清（血清希釈１：２５）がヒトＰＤ－Ｌ１結合部位について（前述のＥＣ５０で）ｍＡｂと競合する。ＰＤ－Ｌ１と各モノクローナル抗体の各々との相互作用がラット血清の非存在下で起こる条件を用いて、最大結合に対応する吸光度値を得た。リン酸アルミニウムと組み合わせて、ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットの血清によってもたらされる、モノクローナル抗体とＰＤ－Ｌ１との相互作用に対する阻害を（例５に記載の式を使用して）百分率として表した。結果を表３に示す。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（賦形剤）およびリン酸アルミニウムで免疫したラットからの血清を陰性対照として使用した。
キメラＰＫＰＤ－Ｌ１抗原による免疫化後に誘導された抗体がヒトＰＤ－Ｌ１の異なる抗原決定基に対するものであるかどうかを評価するために、競合ＥＬＩＳＡを実施した。ヒトＰＤ－Ｌ１上の結合部位によるモノクローナル抗体アテゾリズマブ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（商標））、デュルバルマブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（商標））およびアベルマブ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（商標））と競合する（例４の実験からの）血清の能力を評価した。これらの抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、異なる腫瘍の処置のためにＦＤＡによって承認されており、ＰＤ－Ｌ１分子上の異なるエピトープを認識した（Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｃｅｌｌ，２０１８：９：１３５－９）。競合ＥＬＩＳＡを開発するために、モノクローナル抗体をビオチンにコンジュゲートし、ＰＤ－Ｌ１および前述のビオチン化ｍＡｂとの相互作用のＥＣ５０を決定した。キメラＰＤ－Ｌ１／Ｆｃタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。続いて、ビオチン化ｍＡｂを異なる濃度で添加し、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いて抗原抗体結合を検出した。ＰＤ－Ｌ１とビオチン化抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの相互作用について、それぞれ５．２ｎｇ／ｍＬ、５．８ｎｇ／ｍＬおよび３．１ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０が得られた。条件が確立されると、競合ＥＬＩＳＡが開発され、免疫血清（血清希釈１：２５）がヒトＰＤ－Ｌ１結合部位について（前述のＥＣ５０で）ｍＡｂと競合する。ＰＤ－Ｌ１と各モノクローナル抗体の各々との相互作用がラット血清の非存在下で起こる条件を用いて、最大結合に対応する吸光度値を得た。リン酸アルミニウムと組み合わせて、ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫したラットの血清によってもたらされる、モノクローナル抗体とＰＤ－Ｌ１との相互作用に対する阻害を（例５に記載の式を使用して）百分率として表した。結果を表３に示す。４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（賦形剤）およびリン酸アルミニウムで免疫したラットからの血清を陰性対照として使用した。
【表3】
【0046】
表３は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの投与（アジュバントであるリン酸アルミニウムと組み合わせて）が、ＰＤ－Ｌ１とモノクローナル抗体であるアテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブとの結合を遮断する特異的抗体を誘導したことを示す。遮断活性は、陰性対照群で得られたものと有意に異なっていた（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１）。アジュバントと組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１抗原による免疫化後、ポリクローナル抗体応答が誘導され、異なるヒトＰＤ－Ｌ１エピトープに向けられる。免疫血清は、異なるエピトープを認識する３つの抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の結合を損なった。さらに、免疫化は、ＰＤ－Ｌ１上の関連エピトープを標的とするポリクローナル抗体応答を誘導し、これは異なる腫瘍の処置に承認されたモノクローナル抗体アテゾリズマブ、デュルバルマブおよびアベルマブによって遮断される。
【0047】
例７．ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫した非ヒト霊長類の血清から精製したＩｇＧによって示されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する能力の評価。
実験の目的は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化後に誘導された抗体が、細胞ベースのアッセイにおいてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用によって媒介される生物学的効果を遮断することができるかどうかを評価することであった。この目的のために、これらの２つの分子間の相互作用を遮断する生物製剤の作用機序を模倣するＰｒｏｍｅｇａ（商標）Ｊ１２５０アッセイを使用した。アッセイは、２つの遺伝子改変細胞ラインに基づく。第１のものは、その細胞膜上にヒトＰＤ－１および発光を誘導するシグナルを伝達するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、いわゆるエフェクター細胞である。第２のもの、いわゆる抗原提示細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＴＣＲ活性化タンパク質を発現する。２つの細胞型が共培養される場合、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、ＴＣＲシグナル伝達によって媒介される発光の誘導を阻害する。しかしながら、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の生物学的阻害剤の存在は、反対の効果を誘導する。
実験の目的は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化後に誘導された抗体が、細胞ベースのアッセイにおいてＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用によって媒介される生物学的効果を遮断することができるかどうかを評価することであった。この目的のために、これらの２つの分子間の相互作用を遮断する生物製剤の作用機序を模倣するＰｒｏｍｅｇａ（商標）Ｊ１２５０アッセイを使用した。アッセイは、２つの遺伝子改変細胞ラインに基づく。第１のものは、その細胞膜上にヒトＰＤ－１および発光を誘導するシグナルを伝達するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、いわゆるエフェクター細胞である。第２のもの、いわゆる抗原提示細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＴＣＲ活性化タンパク質を発現する。２つの細胞型が共培養される場合、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用は、ＴＣＲシグナル伝達によって媒介される発光の誘導を阻害する。しかしながら、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の生物学的阻害剤の存在は、反対の効果を誘導する。
【0048】
ヒト生物学に密接に関連する自己非ヒト霊長類モデルにおいて免疫応答を誘導するＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの能力を試験するために、クロロセブス・エチオプス・サバエウス（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ ｓａｂａｅｕｓ）サルにおいて免疫原性を評価した。霊長類を、リン酸アルミニウムでアジュバント添加した２００μｇのキメラポリペプチドで皮下免疫した。さらに、この実験では、リン酸アルミニウムでアジュバント添加した髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬｐｄＡタンパク質（２００μｇ／用量）にコンジュゲートした２つのＰＤ－Ｌ１合成ペプチド（配列表において配列番号２３および配列番号２４として特定される）の混合物も評価した。アジュバント添加混合物（各抗原用量を０．７ｍｇのＡｌ３＋と組み合わせた）を２週間ごとに投与し、合計４回の免疫化を行った。４回目の免疫化の１週間後に血清を収集した。
【0049】
各実験群（ｎ＝５）から得られた血清をプールし、ＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標））によって精製した。細胞ベースのアッセイを製造者の説明書に従って実施し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断するための陽性対照としてアテゾリズマブを使用した。さらに、ＰＤ－１＋エフェクター細胞／ＰＤ－Ｌ１＋宿主細胞系で評価した各条件も、ＰＤ－１＋エフェクター細胞／ＰＤ－Ｌ１＋宿主細胞陰性および最大発光制御系に供した。各場合において、６つの複製を各条件について評価した。両細胞ラインの同時培養の３０分後に発光を読み取った。このアッセイでは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断活性は、ルシフェラーゼ活性の増加によって証明される。その結果、遮断活性は発光値の増加に正比例する。
【表4】
【0050】
表４は、リン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの高分子量凝集体の投与が、陰性対照群（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１）と比較して、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する生物学的に活性なＩｇＧ抗体を生成することができることを示す。精製血清ＩｇＧ画分について検出され、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫した霊長類から得られた発光は、陰性対照群について観察された値よりも３．５６倍高かった。ＰＤ－Ｌ１ペプチドによる能動的免疫化戦略の場合、この比は、対応する陰性対照群よりも１．４倍高かった（マン・ホイットニー検定、ｐ＜０．００２２）。これらの結果は、ＰＤ－Ｌ１ペプチド混合物によって生成された抗体と比較して、ＰＫＰＤ－Ｌ１変異体によって誘導された特異的抗体の優れた生物学的活性を示している。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫したサルの血清から精製したＩｇＧ画分の生物学的活性は、２０μｇ／ｍＬにおいてアテゾリズマブ陽性対照と類似していた。
【0051】
例８．ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫したマウスからのリンパ球の、ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍細胞を直接溶解する能力の評価。
ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドが特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することができるかどうかを評価するために、免疫適格性マウスの脾臓から単離されたリンパ球を腫瘍細胞と共培養するアッセイを開発した。リンパ球の細胞傷害性活性を腫瘍細胞の溶解率として表した。マウス株Ｃ５７Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃとそれぞれ同系の腫瘍ラインＭＣ３８およびＣＴ２６を実験に使用した。これらの細胞は膜上でＰＤ－Ｌ１を発現し、主要Ｉ型組織適合遺伝子複合体に関連するこのタンパク質のペプチドを提示することができる。
ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドが特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することができるかどうかを評価するために、免疫適格性マウスの脾臓から単離されたリンパ球を腫瘍細胞と共培養するアッセイを開発した。リンパ球の細胞傷害性活性を腫瘍細胞の溶解率として表した。マウス株Ｃ５７Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃとそれぞれ同系の腫瘍ラインＭＣ３８およびＣＴ２６を実験に使用した。これらの細胞は膜上でＰＤ－Ｌ１を発現し、主要Ｉ型組織適合遺伝子複合体に関連するこのタンパク質のペプチドを提示することができる。
【0052】
Ｃ５７Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃマウスを、アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰ（１００μｇ）と組み合わせた１００μｇの異なるＰＤ－Ｌ１変異体で皮下免疫した。動物（ｎ＝５）に、上述のアジュバントと組み合わせたＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ、ＰＫＰＤ－Ｌ１またはコンジュゲートペプチドの混合物を２ヶ月間にわたって毎週投与した。最後の免疫化の１週間後、脾臓を外科的に除去し、灌流し、赤血球を溶解した。続いて、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ培地にリンパ球を懸濁した。このリンパ球（エフェクター細胞）を抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））抗体で標識し、フローサイトメトリーによって計数した。細胞ラインＭＣ３８およびＣＴ２６を蛍光試薬カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、標的細胞として使用した。ＣＦＳＥ標識細胞をフローサイトメトリーによって計数した。
【0053】
Ｃ５７Ｂｌ６マウスからのリンパ球（２×１０６個のＣＤ３＋）を直ちに２×１０４個のＭＣ３８細胞と混合した（１００：１の比）。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離したリンパ球を、最初に３０μｇ／ｍＬのネイティブＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１／Ｆｃ）でインビトロで６日間活性化し、３日目に１０単位／ｍＬのＩＬ－２を添加した。活性化後、同じ比を使用して、エフェクター細胞をＣＴ２６標的細胞と共インキュベートした。両方の場合において、陰性溶解対照を使用し、エフェクター細胞を添加する代わりに、ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ培地と共に標的細胞をインキュベートした。エフェクター細胞を標的細胞と共に４時間インキュベーションした後、混合物をＰＢＳに再懸濁し、ＣＦＳＥ陽性標的細胞をフローサイトメトリー（ＰＡＲＴＥＣサイトメーター、ドイツ）によって計数した。結果を表５に示す。細胞傷害性を、発現に従って標的細胞（腫瘍細胞）の溶解の百分率として表した：
％溶解＝１００％－［（エフェクター細胞と共にインキュベートしたＣＦＳＥ陽性標的細胞の数）／（培地と共にインキュベートしたＣＦＳＥ陽性標的細胞の数）×１００］
％溶解＝１００％－［（エフェクター細胞と共にインキュベートしたＣＦＳＥ陽性標的細胞の数）／（培地と共にインキュベートしたＣＦＳＥ陽性標的細胞の数）×１００］
【表5】
【0054】
表５は、高分子量凝集体の形態で会合したＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの投与が細胞性免疫に対してプラスの効果を有することを示す。Ｃ５７Ｂｌ６株を用いた実験では、対照群と比較して、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ（テューキー検定、ｐ＝０．０１６９）；ＰＫＰＤ－Ｌ１（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）およびペプチド混合物（テューキー検定、ｐ＝０．０３３２）で免疫した群の脾臓から単離したリンパ球との共インキュベーション後に、ＭＣ３８腫瘍細胞の溶解の有意な増加が検出された。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドは、ネイティブ変異体ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯについて（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）、またはＰＤ－Ｌ１ペプチド混合物について（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）得られたリンパ球よりも有意に高い細胞傷害性活性を有するリンパ球を生成することができた。
【0055】
Ｂａｌｂ／ｃ株を用いた実験では、対照群と比較して、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ（テューキー検定、ｐ＝０．００６５）およびＰＫＰＤ－Ｌ１（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）で免疫した群の脾臓から単離したリンパ球で、ＣＴ２６腫瘍細胞の溶解の有意な増加が検出された。それにもかかわらず、ペプチド混合物で免疫したマウスから単離したリンパ球は、細胞傷害性活性を誘導しなかった（テューキー検定、ｐ＝０．７８５７）。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドはまた、異なる遺伝的背景を有するこのマウス株において免疫原性における優位性を示した。ＰＫＰＤ－Ｌ１で免疫した後、単離されたリンパ球は、ネイティブ変異体ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯで免疫したマウスから得られたリンパ球よりも高い活性を有していた（テューキー検定、ｐ＝０．０００９）。
【0056】
例９．ＰＤ－Ｌ１変異体による免疫化後のＦ３ＩＩ乳癌マウスモデルにおける抗腫瘍および抗転移効果
アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと組み合わせた異なるＰＤ－Ｌ１変異体の投与後の抗腫瘍および抗転移活性を、Ｆ３ＩＩ乳癌マウスモデルを使用して評価した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（９匹／群）を、例８に記載されているように、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加した１００μｇの抗原で皮下免疫した。Ｆ３ＩＩ細胞ラインは、肺に自然に転移する能力を有するＢＡＬＢ／ｃ移植可能乳癌のクローン亜集団から生成した。４回目の免疫化の４日後に、免疫化部位とは反対側の脇腹に、２０万個のＦ３ＩＩ細胞を背側領域に皮下投与した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な成長を検出した後、腫瘍体積を記録した。
アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと組み合わせた異なるＰＤ－Ｌ１変異体の投与後の抗腫瘍および抗転移活性を、Ｆ３ＩＩ乳癌マウスモデルを使用して評価した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（９匹／群）を、例８に記載されているように、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加した１００μｇの抗原で皮下免疫した。Ｆ３ＩＩ細胞ラインは、肺に自然に転移する能力を有するＢＡＬＢ／ｃ移植可能乳癌のクローン亜集団から生成した。４回目の免疫化の４日後に、免疫化部位とは反対側の脇腹に、２０万個のＦ３ＩＩ細胞を背側領域に皮下投与した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な成長を検出した後、腫瘍体積を記録した。
【0057】
腫瘍チャレンジの３５日後、マウスを安楽死させ、続いて肺を除去した。マクロ転移を計数するために、肺をブアン溶液（Ｓｉｇｍａ（商標））に少なくとも４８時間浸漬した。立体鏡（Ｚｅｉｓｓ（商標））を使用してマクロ転移を計数した。結果を表６に示す。
【表6】
【0058】
表６は、Ｆ３ＩＩマウス腫瘍細胞によるチャレンジの１８日後の腫瘍体積評価からの結果を示す。アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰを有するＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの投与は、陰性対照群と比較した場合、腫瘍成長を有意に低減した（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）。ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯ変異体の投与も腫瘍成長の低減を誘導したが、このパラメータへの影響は少なかった（テューキー検定、ｐ＝０．００５２）。対照的に、コンジュゲートペプチドの混合物では腫瘍成長の減少は証明されなかった（テューキー検定、ｐ＝０．１５９８）。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化は、ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯによる能動的免疫治療によって生じる効果と比較して、腫瘍体積のより大きな減少を引き起こした（テューキー検定、ｐ＜０．００５８）。
【0059】
表６はまた、異なるＰＤ－Ｌ１変異体で免疫した動物における自然肺転移の数を示す。アジュバントｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰとの関連で融合ポリペプチドＰＫＰＤ－Ｌ１または変異体ＰＤ－Ｌ１ＣＨＯの投与は、アジュバントおよび賦形剤で処置した対照群の動物の肺に見られる転移と比較して、肺への転移の移植を阻害した（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）。対照的に、転移の移植の低減に対する効果は、コンジュゲートペプチドの混合物で免疫した場合には証明されなかった（テューキー検定、ｐ＝０．４３１１）。腫瘍体積に関して、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによって生じた免疫応答は、ネイティブＰＤ－Ｌ１変異体（テューキー検定、ｐ＝０．０００４）またはこのリガンドからの２つのペプチドの混合物（テューキー検定、ｐ＜０．０００１）による能動的免疫治療後に生じた免疫応答の効果と比較した場合、転移の数の低減において優れた能力を有していた。
【0060】
例１０．マウスにおける肺転移の処置におけるＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドの投与の有効性。
肺転移は、がん死の主な原因である。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化は、強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。この融合ポリペプチドの投与後に生じた免疫応答エフェクターの抗転移能をいくつかのモデルで評価した。１２匹のマウスの群を、１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと組み合わせた１００μｇのポリペプチドで免疫した。マウスを２ヶ月間免疫し、１週間に１回用量を皮下投与した。各モデルの要件に従って腫瘍チャレンジを行った。転移負荷の分析は、肺重量によって、または解剖顕微鏡下での転移計数によって評価した。マウス株Ｃ５７Ｂｌ／６での研究のために、転移性肺癌３ＬＬＤ１２２の２．５×１０５個の細胞を、４回目の免疫化の３日後にフットパッドに接種した。原発腫瘍を移植の２０日後に手術によって除去し、動物を手術の１５日後に屠殺したが、これは肺自然転移の発生が予想される時間であった。この場合、肺の重量を各群で決定した。
肺転移は、がん死の主な原因である。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化は、強力な体液性および細胞性免疫応答を誘導する。この融合ポリペプチドの投与後に生じた免疫応答エフェクターの抗転移能をいくつかのモデルで評価した。１２匹のマウスの群を、１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰと組み合わせた１００μｇのポリペプチドで免疫した。マウスを２ヶ月間免疫し、１週間に１回用量を皮下投与した。各モデルの要件に従って腫瘍チャレンジを行った。転移負荷の分析は、肺重量によって、または解剖顕微鏡下での転移計数によって評価した。マウス株Ｃ５７Ｂｌ／６での研究のために、転移性肺癌３ＬＬＤ１２２の２．５×１０５個の細胞を、４回目の免疫化の３日後にフットパッドに接種した。原発腫瘍を移植の２０日後に手術によって除去し、動物を手術の１５日後に屠殺したが、これは肺自然転移の発生が予想される時間であった。この場合、肺の重量を各群で決定した。
【0061】
第２の実験では、実験的転移モデルを使用した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、マウスＭＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０４個）を尾静脈によって、６回目の免疫化の４日後に接種した。１７日後、動物を屠殺し、肺の黒色の着色コロニーを計数した。
【0062】
ＢＡＬＢ／ｃマウス株では、後眼窩叢を通して５×１０４個のＣＴ２６結腸直腸癌細胞を静脈内接種した後、４回目の免疫化の５日後に投与した後に、肺転移を評価した。腫瘍チャレンジの３０日後にマウスを屠殺し、肺内のコロニーを計数した。これらの実験の結果を表７にまとめる。
【表7】
【0063】
対照に対する各ＰＫＰＤ－Ｌ１処置群からの結果の比較を、各実験モデルについて独立して行った。表７に観察されるように、研究したすべてのモデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１で免疫したマウスからの肺における転移負荷は、それらの対照群と比較して有意に低かった（スチューデントｔ検定：３ＬＬＤ１２２，ｐ＜０．０００１；ＭＢ１６Ｆ１０，ｐ＝０．０４７５；ＣＴ２６ ｐ＝０．００４６）。
【0064】
例１１．ＰＤ－Ｌ１に特異的な受動的および能動的免疫治療の組み合わせ。
ＰＤ－Ｌ１に特異的な受動的免疫治療と能動的免疫治療との組み合わせの抗腫瘍活性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝９／群）を、例４に記載のスキームを使用して、０．７ｍｇのリン酸アルミニウムをアジュバント添加した２００μｇのＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで皮下免疫した。２回目の免疫化の１２日後、免疫化部位とは反対側の背側領域に２×１０４個のＣＴ２６細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジの１日後、ＰＤ－Ｌ１遮断抗体（ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ；クローン１０Ｆ．９Ｇ２；ＢＩＯＸＣＥＬＬ）を週に１回投与して、４回の投与処置期間を完了した。抗体を１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路で投与した。免疫治療の各タイプについて、陰性対照群を使用した。受動的免疫治療では、対照抗体、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（商標）、ＢＥ００９０）を投与し、能動的免疫治療では、ＰＢＳおよびリン酸アルミニウムアジュバントを受けた群を陰性対照として使用した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な腫瘍を検出した後、腫瘍体積を記録した。
ＰＤ－Ｌ１に特異的な受動的免疫治療と能動的免疫治療との組み合わせの抗腫瘍活性をＣＴ２６マウス腫瘍モデルで評価した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝９／群）を、例４に記載のスキームを使用して、０．７ｍｇのリン酸アルミニウムをアジュバント添加した２００μｇのＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで皮下免疫した。２回目の免疫化の１２日後、免疫化部位とは反対側の背側領域に２×１０４個のＣＴ２６細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジの１日後、ＰＤ－Ｌ１遮断抗体（ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ；クローン１０Ｆ．９Ｇ２；ＢＩＯＸＣＥＬＬ）を週に１回投与して、４回の投与処置期間を完了した。抗体を１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内経路で投与した。免疫治療の各タイプについて、陰性対照群を使用した。受動的免疫治療では、対照抗体、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（商標）、ＢＥ００９０）を投与し、能動的免疫治療では、ＰＢＳおよびリン酸アルミニウムアジュバントを受けた群を陰性対照として使用した。腫瘍細胞を移植し、測定可能な腫瘍を検出した後、腫瘍体積を記録した。
【0065】
表８は、平均±標準偏差として示された、ＣＴ２６マウス腫瘍細胞によるチャレンジの３０日後の腫瘍体積測定値を示した。
【表8】
【0066】
ラット抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体の投与は、アイソタイプ対照で処置した群と比較して、腫瘍体積の有意な低減を示した（ダネット検定、ｐ＝０．００３）。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫も、賦形剤＋アジュバントで処置した群と比較して、腫瘍体積の低減において有意な効果を示した（ダネット検定、ｐ＝０．０００１）。組み合わせ処置は、ＰＤ－Ｌ１ベースの能動的免疫治療（ダネット検定、ｐ＝０．０２３３）および抗ＰＤ－Ｌ１抗体による受動的免疫治療（Ｄｕｎｎｅｔの検定、ｐ＝０．０３３２）と比較して、腫瘍縮小に関して優れた結果を示した。これらの結果は、両方ともＰＤ－Ｌ１を標的とする受動的免疫治療と能動的免疫治療とを組み合わせることの可能性を示唆している。
【0067】
例１２．流入領域リンパ節および腫瘍浸潤リンパ球における細胞亜集団に対するＰＫＰＤ－Ｌ１投与の効果。
抗ＰＤ－Ｌ１治療がＰＤ－Ｌ１誘導免疫抑制の復帰に対する効果を有するかどうかを評価するために、リンパ節および腫瘍内の細胞集団の割合を試験した。この実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝９）に、２００μｇのキメラＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドとアジュバントとしての０．７ｍｇのリン酸アルミニウムとの混合物を含有して、１４日間のスケジュールで２回の皮下免疫化を行った。最初の免疫の３日後、免疫化の反対側に投与して、２×１０４個の結腸腫瘍細胞ＣＴ２６をマウスの皮下にチャレンジした。２回目の免疫化の７日後、マウスを屠殺して腫瘍および流入領域リンパ節を抽出した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球における平均蛍光強度として測定された膜ＰＤ－１レベルを、試料において評価した。
抗ＰＤ－Ｌ１治療がＰＤ－Ｌ１誘導免疫抑制の復帰に対する効果を有するかどうかを評価するために、リンパ節および腫瘍内の細胞集団の割合を試験した。この実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝９）に、２００μｇのキメラＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドとアジュバントとしての０．７ｍｇのリン酸アルミニウムとの混合物を含有して、１４日間のスケジュールで２回の皮下免疫化を行った。最初の免疫の３日後、免疫化の反対側に投与して、２×１０４個の結腸腫瘍細胞ＣＴ２６をマウスの皮下にチャレンジした。２回目の免疫化の７日後、マウスを屠殺して腫瘍および流入領域リンパ節を抽出した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球における平均蛍光強度として測定された膜ＰＤ－１レベルを、試料において評価した。
【0068】
１グラムの腫瘍塊を酵素的（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））および機械的解離に供した。死細胞を試薬キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））を用いて腫瘍懸濁液から除去した。生存細胞懸濁液を、選択マーカーＣＤ４５および磁気ビーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））の使用による陽性白血球選択に供した。ＣＤ４５＋細胞懸濁液の溶出後、リンパ球を抗ＣＤ３、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８および抗ＰＤ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））による多重免疫染色に供した。流入領域リンパ節をＲＰＭＩ培地中で柔らかくし、細胞懸濁液を３０μＭフィルターに通し、前の試料について記載したように多重標識に供した。流入領域リンパ節および腫瘍内に位置するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの膜上のＰＤ－１の存在の評価をフローサイトメトリーによって実施した。
【表9】
【0069】
表９に示すように；アジュバント添加ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫したマウスからの流入領域リンパ節内のＣＤ４＋Ｔリンパ球集団は、陰性対照群のマウスからのリンパ球で見られたものよりも有意に低いＰＤ－１膜レベルを有していた（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＝０．００５６）。ＣＤ８＋Ｔリンパ球集団の分析から同様の結果が得られた（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＝０．００１４）。この実験的証拠は、ＣＤ４＋（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＝０．０１５６）およびＣＤ８＋（対応のないスチューデントｔ検定、ｐ＝０．０２４０）腫瘍浸潤リンパ球についても得られた。したがって、キメラポリペプチドＰＫＰＤ－Ｌ１をワクチン抗原として用いるＰＤ－Ｌ１特異的能動的免疫治療は、活性化リンパ球の特有の表現型を有するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、具体的には腫瘍および流入領域リンパ節などの関連する免疫学的部位において生じさせる。
【0070】
例１３．ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドおよびアジュバントであるリン酸アルミニウムまたはｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰの投与後の安全性プロファイルの評価。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）および雌ニュージーランドウサギ（ｎ＝４）を、２００μｇのＰＫＰＤ－Ｌ１キメラポリペプチドで皮下免疫化した。アジュバントとしてＶＳＳＰを用いた免疫化スキームは、８回の毎週のワクチン接種を含んでいた。マウスでは、キメラポリペプチドに１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加し、ウサギでは２００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）および雌ニュージーランドウサギ（ｎ＝４）を、２００μｇのＰＫＰＤ－Ｌ１キメラポリペプチドで皮下免疫化した。アジュバントとしてＶＳＳＰを用いた免疫化スキームは、８回の毎週のワクチン接種を含んでいた。マウスでは、キメラポリペプチドに１００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加し、ウサギでは２００μｇのｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰをアジュバント添加した。
【0071】
ＰＫＰＤ－Ｌ１とリン酸アルミニウムとの組み合わせの場合、２００μｇのキメラポリペプチドに０．７ｍｇのリン酸アルミニウムをアジュバント添加し、用量を１４日ごとに、合計４回の免疫化について投与した。抗原とアジュバントとの各組み合わせについて、陰性対照群を各抗原製剤の賦形剤およびそれらのそれぞれのアジュバントで免疫した。
【0072】
マウス実験では、２つの追加の受動的免疫治療群を含めた。１つの群には、マウスＰＤ－Ｌ１に特異的なラット抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（商標）、クローン１０Ｆ．９Ｇ２、１２．５ｍｇ／ｋｇ）の４回の毎週の腹腔内投与を行った。他の群を、同じアイソタイプの無関係の抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ（商標）、クローンＢＥ００９０）で、同じ用量およびスケジュールを使用して処置した。
【0073】
両方の研究において、毎週の体重評価を、免疫化の間の異なる時間に実施した。免疫化が完了すると、生物学的試料を抽出し、これは、両方の動物種の動物の１００％で行うことができた。
【0074】
マウスの場合、免疫化スキームの最後に、心臓、肺、脾臓および他の１０個の器官を組織病理学のために処理した。肉眼および顕微鏡の両方で、器官の定性的評価を行った。顕微鏡的評価および組織学的診断のために、試料を各適切な方法で処理した。能動的または受動的免疫化群で変化が見られ、対応するプラセボ群では変化が検出されなかった場合、処置関連有害事象とみなした。
【0075】
ウサギの場合、２つの血液試料を、一方は免疫化を開始する前に、他方は最後の免疫化の１週間後に収集した。各血液抽出物を使用して、血漿（血液学的決定のため）および血清（臨床生化学的決定のため）を得た。血液学的決定は、他のパラメータの中でも、様々な細胞型の計数および／または百分率を含んでいた。血液生化学的決定は、とりわけ、ヘモグロビン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ酵素濃度、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素濃度、クレアチニン濃度を含んでいた。各パラメータについて、免疫化の前および後に得られた値間、処置群と対応するプラセボ群との間で比較を行い、種について報告された参照生理学的範囲とも比較した。ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫した群で変化が見られ、対応するプラセボ群では変化が観察されなかった場合、処置関連有害事象とみなした。
【0076】
除去された器官のグロス分析は、マウスＰＤ－Ｌ１に特異的なラット抗体による受動的免疫治療を受けた５匹のマウスのうち２匹の肺における出血の存在を示した。これら２匹のマウスのうち、１匹は胸腺出血も有していた。実験群の残りでは、器官は肉眼的変化を示さなかった。一方、顕微鏡分析により、２匹の上述のマウスにおいて肉眼レベルで検出された肺および胸腺で観察された出血事象が確認された。この群の他の３匹のマウスは、気管支のレベルで肺に炎症細胞の浸潤を有することを特徴とした。マウスＰＤ－Ｌ１に対する特異的抗体で処置した５匹のマウスでは、すべて、結腸のレベルで粘膜炎を示した。この群に属する器官の残りは、いかなる種類の顕微鏡的変化も示さなかった。対照的に、異なるプラセボ群に属するマウスの器官、または両方のアジュバントと組み合わせたＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドで免疫したマウスの器官では、顕微鏡的変化は観察されなかった。
【0077】
血液学および臨床生化学の結果は、ＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによるウサギの免疫化の前および後に行われた決定の間に有意な変化がないことを示した。免疫化群とその対応するプラセボ群との間に有意差はなかった。一般に、免疫化群およびプラセボ群のすべての血液学および生化学パラメータは生理学的範囲内であった。マウスおよびウサギの両方において、評価した時間が異なっていても、対応するプラセボ群で見られるものに対して、免疫化群の体重に有意な効果は検出されなかった。
【0078】
これらの結果は、ｓＮＡｃＧＭ３－ＶＳＳＰまたはリン酸アルミニウムの両方においてアジュバント添加されたキメラＰＫＰＤ－Ｌ１ポリペプチドによる免疫化が安全な免疫応答を生じることを示している。この能動的免疫治療戦略は、有害作用がないため、特異的モノクローナル抗体による受動的免疫治療戦略に関連して利点を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【0079】
配列表１ ＜２２３＞人工配列の記載：キメラ抗原ＰＫＰＤ－Ｌ１
配列表２０～２１ ＜２２３＞人工配列の記載：ｐＭ２３８をクローニングするための合成オリゴヌクレオチド
配列表２２ ＜２２３＞人工配列の記載：組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１のコード領域のヌクレオチド配列
配列表２０～２１ ＜２２３＞人工配列の記載：ｐＭ２３８をクローニングするための合成オリゴヌクレオチド
配列表２２ ＜２２３＞人工配列の記載：組換えタンパク質ＰＫＰＤ－Ｌ１のコード領域のヌクレオチド配列
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】