▶ メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-06
(54)【発明の名称】がん治療のためのフェロトーシスの誘導
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20231027BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231027BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/4439 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/4375 20060101ALI20231027BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K31/4439
A61K31/436
A61K31/7088
A61K31/4375
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523112
(86)(22)【出願日】2021-10-16
(85)【翻訳文提出日】2023-06-13
(86)【国際出願番号】 US2021055326
(87)【国際公開番号】W WO2022082078
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】63/093,151
(32)【優先日】2020-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500213834
【氏名又は名称】メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，シュエジュン
(72)【発明者】
【氏名】トンプソン，クレイグ ビー
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，ジアジュン
(72)【発明者】
【氏名】イー，ジュンメイ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084AA20
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC71
4C086BC82
4C086CB09
4C086CB22
4C086EA16
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA09
4C086GA10
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、処置を必要とする対象にＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路(またはＳＲＥＢＰおよびＳＣＤ１などのこの経路の下流要素)の阻害剤およびフェロトーシスを誘導する薬剤を投与することにより、がんを処置する方法を提供する。本発明はまた種々の関連組成物および関連方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
処置を必要とする哺乳動物対象における腫瘍を処置する方法であって、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤および(ｂ)フェロトーシスの誘導剤両者の有効量を対象に投与することを含み、それにより対象における腫瘍の増殖を低減するおよび／または退縮を引き起こす、方法。
【請求項2】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある腫瘍またはＰＴＥＮ欠失がある腫瘍を有する、請求項１の方法。
【請求項3】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある腫瘍を有する、請求項１の方法。
【請求項4】
対象がＰＴＥＮ欠失がある腫瘍を有する、請求項１の方法。
【請求項5】
対象が乳房腫瘍を有する、請求項１～４の何れかの方法。
【請求項6】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある乳房腫瘍を有する、請求項５の方法。
【請求項7】
対象が前立腺腫瘍を有する、請求項１～４の何れかの方法。
【請求項8】
対象がＰＴＥＮ欠失がある前立腺腫瘍を有する、請求項７の方法。
【請求項9】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、ＭＴＯＲＣ１阻害剤、ＳＲＥＢＰ阻害剤およびＳＣＤ１阻害剤からなる群から選択される、請求項１～８の何れかの方法。
【請求項10】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項11】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＧＤＣ－０９４１、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＡＲ２４５４０８、ＢＹＬ－７１９、ＧＤＣ－０９８０、ワートマニン、Ｌｙ２９４００２、デメトキシビリジン、ペリホシン、デラリシブ、イデラリシブ、ＰＸ－８６６、ＩＰＩ－１４５、ＢＡＹ ８０－６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ １２０２、ＲＰ５２６４、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＢＫＭ１２０、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、ＣＵＤＣ－９０７およびＡＥＺＳ－１３６からなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項12】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＡｋｔ阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項13】
Ａｋｔ阻害剤がＭＫ－２２０６、ＭＫ－２２０６、ペリホシン、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ(ＧＤＣ－００６８)、ＡＺＤ５３６５、アフレセルチブ(ＧＳＫ２１１０１８３)、Ａｔ１３１４８、ＰＦ－０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、トリシリビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ～６７４５６３、ＰＨＴ０４２７、ミルテホシン、ホノキオールおよびＴＩＣ１０からなる群から選択される、請求項１２の方法。
【請求項14】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＭＴＯＲ阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項15】
ＭＴＯＲ阻害剤がＳＡＲ２４５４０９、ＧＤＣ－０９８０、ＣＣＩ－７７９、ＫＵ－００６３７９４、ラパマイシン、没食子酸エピガロカテキン(ＥＧＣＧ)、カフェイン、クルクミン、レスベラトロール、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスおよびリダホロリムスからなる群から選択される、請求項１４の方法。
【請求項16】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＭＴＯＲＣ１阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項17】
ＭＴＯＲＣ１阻害剤がテムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)、ＴｏｒｉｎおよびＲＡＰＴＯＲの短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)阻害剤からなる群から選択される、請求項１６の方法。
【請求項18】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤がＳＲＥＢＰ阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項19】
ＳＲＥＢＰ阻害剤がファトスタチンＡである、請求項１８の方法。
【請求項20】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤がＳＣＤ１阻害剤である、請求項１～９の何れかの方法。
【請求項21】
ＳＣＤ１阻害剤がＣＡＹ１０５６６である、請求項２０の方法。
【請求項22】
フェロトーシスの誘導剤がＲＳＬ３、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)、スルファサラジン、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルテスナート、ＭＬ－１６２およびＭＬ－２１０からなる群から選択される、請求項１～２１の何れかの方法。
【請求項23】
Ａ処置を必要とする対象における腫瘍の処置に使用するための、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤、(ｂ)フェロトーシスの誘導剤および(ｃ)治療上許容される担体を含む、治療組成物。
【請求項24】
処置を必要とする対象における腫瘍の処置に使用するための、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤および(ｂ)フェロトーシスの誘導剤の組み合わせ剤。
【請求項25】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある腫瘍またはＰＴＥＮ欠失がある腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項26】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項27】
対象がＰＴＥＮ欠失がある腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項28】
対象が乳房腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項29】
対象がＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある乳房腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項30】
対象が前立腺腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項31】
対象がＰＴＥＮ欠失がある前立腺腫瘍を有する、請求項２３の組成物または請求項２４の組み合わせ剤。
【請求項32】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、ＭＴＯＲＣ１阻害剤、ＳＲＥＢＰ阻害剤およびＳＣＤ１阻害剤からなる群から選択される、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項33】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＰＩ３Ｋ阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項34】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＧＤＣ－０９４１、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＡＲ２４５４０８、ＢＹＬ－７１９、ＧＤＣ－０９８０、ワートマニン、Ｌｙ２９４００２、デメトキシビリジン、ペリホシン、デラリシブ、イデラリシブ、ＰＸ－８６６、ＩＰＩ－１４５、ＢＡＹ ８０－６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ １２０２、ＲＰ５２６４、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＢＫＭ１２０、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、ＣＵＤＣ－９０７およびＡＥＺＳ－１３６からなる群から選択される、請求項３３の組成物または組み合わせ剤。
【請求項35】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＡｋｔ阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項36】
Ａｋｔ阻害剤がＭＫ－２２０６、ＭＫ－２２０６、ペリホシン、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ(ＧＤＣ－００６８)、ＡＺＤ５３６５、アフレセルチブ(ＧＳＫ２１１０１８３)、Ａｔ１３１４８、ＰＦ－０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、トリシリビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ～６７４５６３、ＰＨＴ０４２７、ミルテホシン、ホノキオールおよびＴＩＣ１０からなる群から選択される、請求項３５の組成物または組み合わせ剤。
【請求項37】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＭＴＯＲ阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項38】
ＭＴＯＲ阻害剤がＳＡＲ２４５４０９、ＧＤＣ－０９８０、ＣＣＩ－７７９、ＫＵ－００６３７９４、ラパマイシン、没食子酸エピガロカテキン(ＥＧＣＧ)、カフェイン、クルクミン、レスベラトロール、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスおよびリダホロリムスからなる群から選択される、請求項３７の組成物または組み合わせ剤。
【請求項39】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤がＭＴＯＲＣ１阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項40】
ＭＴＯＲＣ１阻害剤がテムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)、ＴｏｒｉｎおよびＲＡＰＴＯＲの短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)阻害剤からなる群から選択される、請求項３９の組成物または組み合わせ剤。
【請求項41】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤がＳＲＥＢＰ阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項42】
ＳＲＥＢＰ阻害剤がファトスタチンＡである、請求項４１の組成物または組み合わせ剤。
【請求項43】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤がＳＣＤ１阻害剤である、請求項２３～３１の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【請求項44】
ＳＣＤ１阻害剤がＣＡＹ１０５６６である、請求項４３の組成物または組み合わせ剤。
【請求項45】
フェロトーシスの誘導剤がＲＳＬ３、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)、スルファサラジン、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルテスナート、ＭＬ－１６２およびＭＬ－２１０からなる群から選択される、請求項２３～４４の何れかの組成物または組み合わせ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１６日出願の米国仮出願６３／０９３,１５１に基づく優先権の利益を主張し、その内容を引用により全体として本明細書に包含させる。
本出願は、２０２０年１０月１６日出願の米国仮出願６３／０９３,１５１に基づく優先権の利益を主張し、その内容を引用により全体として本明細書に包含させる。
【0002】
配列表
本願発明は、ASCII形式で電子的に提出しており、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２１年１０月１５日に作成し、MSKCC_051_WO1_SL.txtなる名称であり、４,６１５バイトサイズである。
本願発明は、ASCII形式で電子的に提出しており、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２１年１０月１５日に作成し、MSKCC_051_WO1_SL.txtなる名称であり、４,６１５バイトサイズである。
【0003】
連邦政府資金による研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可番号ＣＡ２０１３１８、ＣＡ２０４２３２およびＣＡ００８７４８の下、政府の支持によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可番号ＣＡ２０１３１８、ＣＡ２０４２３２およびＣＡ００８７４８の下、政府の支持によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0004】
引用による取り込み
引用による取り込みを許容する法域のみでの目的で、本明細書で引用する全引用文献を、全体として引用により本明細書に包含させる。さらに、ここに引用または記載するあらゆる製品についてのあらゆる製造業者の指示またはカタログを、引用により本明細書に包含させる。本明細書に引用により組み込まれた文献またはその中のあらゆる教示を、本発明の実施に際して使用できる。
引用による取り込みを許容する法域のみでの目的で、本明細書で引用する全引用文献を、全体として引用により本明細書に包含させる。さらに、ここに引用または記載するあらゆる製品についてのあらゆる製造業者の指示またはカタログを、引用により本明細書に包含させる。本明細書に引用により組み込まれた文献またはその中のあらゆる教示を、本発明の実施に際して使用できる。
【背景技術】
【0005】
背景
細胞代謝の副産物であるリン脂質過酸化物の蓄積は、フェロトーシスと称される鉄依存性形態の細胞死に至り得る(１、２)。フェロトーシスの生理学的機能はなお不明瞭であるが、その虚血性臓器傷害、神経変性およびがんを含む種々の病態への関与が最近示されている(１、６～８)。特に、フェロトーシスが腫瘍抑制に役割を有し得ること(９～１２)およびフェロトーシスの活性化が免疫チェックポイント遮断(１３)および放射線療法(１４～１６)などのあるがん処置に対する応答に寄与し得ることを示す山のような証拠がある。重要なことに、間葉性性質またはＥカドヘリン－ＮＦ２－Ｈｉｐｐｏ経路変異を有するがんは、フェロトーシスに関連する酸化還元／鉄恒常性および代謝過程の変更により、フェロトーシスによる細胞死に高度に感受性であることが示されている(１７～１９)。しかしながら、大部分のがんについて、フェロトーシスが疾患に役割を有するか否かについて、ほとんど知られていない。同様に、特定の腫瘍形成変異または遺伝的背景が特定のがんのフェロトーシスに対する感受性に役割を有し得るか否かについて、ほとんど知られていない。
細胞代謝の副産物であるリン脂質過酸化物の蓄積は、フェロトーシスと称される鉄依存性形態の細胞死に至り得る(１、２)。フェロトーシスの生理学的機能はなお不明瞭であるが、その虚血性臓器傷害、神経変性およびがんを含む種々の病態への関与が最近示されている(１、６～８)。特に、フェロトーシスが腫瘍抑制に役割を有し得ること(９～１２)およびフェロトーシスの活性化が免疫チェックポイント遮断(１３)および放射線療法(１４～１６)などのあるがん処置に対する応答に寄与し得ることを示す山のような証拠がある。重要なことに、間葉性性質またはＥカドヘリン－ＮＦ２－Ｈｉｐｐｏ経路変異を有するがんは、フェロトーシスに関連する酸化還元／鉄恒常性および代謝過程の変更により、フェロトーシスによる細胞死に高度に感受性であることが示されている(１７～１９)。しかしながら、大部分のがんについて、フェロトーシスが疾患に役割を有するか否かについて、ほとんど知られていない。同様に、特定の腫瘍形成変異または遺伝的背景が特定のがんのフェロトーシスに対する感受性に役割を有し得るか否かについて、ほとんど知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、一部、本特許明細書の実施例部分にさらに詳述する、一連の重要な発見に基づく。例えば、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達経路の活性化により、がん細胞が下流ＳＲＥＢＰ１介在脂質生合成上方制御によりフェロトーシスに耐性となり得ることが本発明により発見された。さらにおよび重要なことに、哺乳動物対象にフェロトーシスを誘導する薬剤と共に、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路(またはＳＲＥＢＰおよびＳＣＤ１などのこの経路の下流要素)阻害剤を投与することは、ＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異を有する腫瘍の顕著な抑制をもたらし － 故に、がんの大きくかつ重要な一群の新規治療アプローチを提供することも本発明により発見された。ここに提示されるこれらの発見および他の発見を足場として、本発明は、種々のがんの治療のための多様な新規かつ改善された方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
従って、ある実施態様において、本発明は、処置を必要とする哺乳動物対象において腫瘍を処置する方法であって、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤および(ｂ)フェロトーシスの誘導剤両者の有効量を対象に投与することを含み、それにより、対象における腫瘍を処置する、方法を提供する。
【0008】
他の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象における腫瘍の処置に使用するための、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤、(ｂ)フェロトーシスの誘導剤および(ｃ)治療上許容される担体を含む、治療組成物を提供する。
【0009】
さらに他の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象における腫瘍の処置に使用するための、(ａ)ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤および(ｂ)フェロトーシスの誘導剤の組み合わせ剤を提供する。
【0010】
ある実施態様において、対象は、ＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある腫瘍を有する。ある実施態様において、対象はＰＴＥＮ欠失がある腫瘍を有する。ある実施態様において、対象は乳房腫瘍を有する。ある実施態様において、対象はＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に活性化変異がある乳房腫瘍を有する。ある実施態様において、対象は前立腺腫瘍を有する。あるこのような実施態様において、対象はＰＴＥＮ欠失がある前立腺腫瘍を有する。
【0011】
ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、ＭＴＯＲＣ１阻害剤、ＳＲＥＢＰ阻害剤およびＳＣＤ１阻害剤からなる群から選択される。
【0012】
ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤はＰＩ３Ｋ阻害剤である。ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＧＤＣ－０９４１、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＡＲ２４５４０８、ＢＹＬ－７１９、ＧＤＣ－０９８０、ワートマニン、Ｌｙ２９４００２、デメトキシビリジン、ペリホシン、デラリシブ、イデラリシブ、ＰＸ－８６６、ＩＰＩ－１４５、ＢＡＹ ８０－６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ １２０２、ＲＰ５２６４、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＢＫＭ１２０、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、ＣＵＤＣ－９０７およびＡＥＺＳ－１３６からなる群から選択される。
【0013】
ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤はＡｋｔ阻害剤である。ある実施態様において、Ａｋｔ阻害剤はＭＫ－２２０６、ＭＫ－２２０６、ペリホシン、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ(ＧＤＣ－００６８)、ＡＺＤ５３６５、アフレセルチブ(ＧＳＫ２１１０１８３)、Ａｔ１３１４８、ＰＦ－０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、トリシリビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ－６７４５６３、ＰＨＴ０４２７、ミルテホシン、ホノキオールおよびＴＩＣ１０からなる群から選択される。
【0014】
ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤はＭＴＯＲ阻害剤である。ある実施態様において、ＭＴＯＲ阻害剤はＳＡＲ２４５４０９、ＧＤＣ－０９８０、ＣＣＩ－７７９、ＫＵ－００６３７９４、ラパマイシン、没食子酸エピガロカテキン(ＥＧＣＧ)、カフェイン、クルクミン、レスベラトロール、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスおよびリダホロリムスからなる群から選択される。
【0015】
ある実施態様において、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤はＭＴＯＲＣ１阻害剤である。ある実施態様において、ＭＴＯＲＣ１阻害剤はテムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)、ＴｏｒｉｎおよびＲＡＰＴＯＲの短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)阻害剤からなる群から選択される。
【0016】
ある実施態様においてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤はＳＲＥＢＰ阻害剤である。ある実施態様において、ＳＲＥＢＰ阻害剤はファトスタチンＡである。
【0017】
ある実施態様においてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達軸の阻害剤はＳＣＤ１阻害剤である。ある実施態様において、ＳＣＤ１阻害剤はＣＡＹ１０５６６である。
【0018】
ある実施態様において、フェロトーシスの誘導剤はＲＳＬ３、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)、スルファサラジン、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルテスナート、ＭＬ－１６２およびＭＬ－２１０からなる群から選択される。
【0019】
本発明のこれらおよび他の態様は、本特許明細書の下の詳細な記載、図面、実施例および特許請求の範囲の部分にさらに記載される。さらに、当業者は、本特許明細書をとおして記載される本発明の種々の実施態様が種々の異なる方法で組み合わせることができ、そのような組み合わせは本発明の範囲内であることを認識する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１Ａ～Ｄ。ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達経路の発がん性活性化はフェロトーシスに対する耐性に寄与する。(Ａ)分析したがん細胞株の遺伝的背景およびＲＳＬ３に対する感受性。(Ｂ)細胞を９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播種し、一夜インキュベートした。細胞死を、示す濃度のＲＳＬ３の２４時間処理により誘導した。細胞死を、方法に詳述するとおり、Sytox Green染色により測定した。(Ｃ)ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路における示すタンパク質要素を、示す細胞型でウェスタンブロットで検出した。(Ｄ)細胞を、示すとおり、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＧＤＣ－０９４１(２μM)、ＡＫＴ阻害剤ＭＫ－２２０６(２μM)、ＲＳＬ３(１μM)またはフェロトーシス阻害剤フェロスタチン－１(Ｆｅｒ－１、１μM)存在下または非存在下に１２時間(ＢＴ４７４)または２４時間(ＭＤＡ－ＭＢ－４５３)処理した。細胞死を測定した。Ｐ値の指示記号(全ての他の図で同じ)：＊＊＊＊、Ｐ≦０.０００１；＊＊＊、Ｐ≦０.００１；＊＊、Ｐ≦０.０１；＊、Ｐ≦０.０５；ｎｓ、Ｐ＞０.０５
【0021】
【図2】図２Ａ～Ｅ。ｍＴＯＲＣ２ではなくｍＴＯＲＣ１はフェロトーシスを抑制する。(Ａ)ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＢＴ４７４を示すとおり、ＣＣＩ－７７９(０.５μM)、ＲＳＬ３(ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM)およびＦｅｒ－１(１μM)で処理した。(Ｂ)細胞を、４×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、一夜インキュベートした。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＢＴ４７４細胞を示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。細胞を８時間処理後、５μM Ｃ１１－ＢＯＤＩＰＹで染色し、続いてフローサイトメトリーした。(Ｃ)３Ｄスフェロイドを示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＲＳＬ３、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。上部パネル、死んだ細胞をSYTOX Greenで染色した(スケールバー、１００μm)。下部パネル、細胞生存能を、細胞ＡＴＰレベルの測定によりアッセイした。(Ｄ)ＲＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲをターゲティングするｓｈＲＮＡを発現する細胞を、示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＲＳＬ３、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｅ)パネルＤにおけるようなサンプルの脂質過酸化反応を測定した。
【0022】
【図3】図３Ａ～Ｅ。ＮＲＦ２はｍＴＯＲＣ１のフェロトーシス抑制活性の主要媒介因子ではない。(Ａ)ＢＴ４７４細胞を示すとおり８時間処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM。ウェスタンブロットを実施して、ｐ－Ｔ３８９ Ｓ６、総Ｓ６ＫおよびＮＲＦ２を測定した。(Ｂ)ＮＲＦ２を、ＨＴ１０８０細胞でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーにより枯渇させた。ＮＲＦ２レベルをウェスタンブロットにより測定した。(Ｃ)対照またはＮＲＦ２枯渇細胞を示すとおり処理した。エラスチン、０.５μM；ＲＳＬ３、２５nM。hnM(Ｄ)ＮＲＦ２枯渇があるまたはないＨｅｐＧ２細胞を、示すとおり、ＣＣＩ－７７９(０.５μM)存在下または非存在下、シスチン飢餓で処理した。Sytox Greenを、細胞死染色のために４８時間後加えた(スケールバー、１００μm)。(Ｅ)ＮＲＦ２枯渇があるまたはないＰＣ－３細胞を、示すとおり、ＣＣＩ－７７９(０.５μM)存在下または非存在下、シスチン飢餓で処理した。Sytox Greenを、細胞死染色のために４８時間後加えた(スケールバー、１００μm)。
【0023】
【図4】図４Ａ～Ｆ。ｍＴＯＲＣ１活性化は、ＳＲＥＢＰ１上方制御により、フェロトーシスを抑制する。(Ａ)ＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。細胞ライセートを、ｐ－Ｔ３８９ Ｓ６、総Ｓ６Ｋ、未加工ＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＢＰ１(ｐ))および加工、成熟ＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＢＰ１(ｍ))を検出するウェスタンブロットのために、ＢＴ４７４細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞についてそれぞれ８時間および２４時間の処理後集めた。(Ｂ)細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＢＴ４７４細胞について０.５μMおよびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｃ)細胞をパネルＢにおけるとおり処理した。脂質過酸化反応を測定した。(Ｄ)対照またはＳＲＥＢＦ１ ｓｇＲＮＡを有するＢＴ４７４細胞由来の３Ｄスフェロイドを、示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＲＳＬ３、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。上部、Sytox Greenで染色した細胞死(スケールバー、１００μm)。下部、細胞生存能。(Ｅ)ＳＲＥＢＰ１ｍはＢＴ４７４細胞で過剰発現され、ウェスタンブロットにより決定された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。細胞死を測定した(下部パネル)。(Ｆ)ＢＴ４７４細胞由来３Ｄスフェロイドを示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。上部、Sytox Greenで染色した細胞死(スケールバー、１００μm)。下部、細胞生存能。
【0024】
【図5】図５Ａ～Ｈ。ＳＲＥＢＰ１はＳＣＤ１活性を介して細胞をフェロトーシスから保護する。(Ａ)対照およびＳＲＥＢＦ１－ｓｇＲＮＡ細胞におけるＳＲＥＢＰ１およびその標的ＳＣＤ１、ＦＡＳＮおよびＡＣＡＣＡの発現をウェスタンブロットにより検出した。(Ｂ)ＳＲＥＰＦ１およびその標的遺伝子ＳＣＤのｍＲＮＡレベルをＲＴ－ＰＣＲにより測定した。(Ｃ)細胞を、一夜５μM ＣＡＹ１０５６６存在下または非存在下に前処理し、次いで示す処理に付した。ＲＳＬ３、ＢＴ４７４細胞について０.５μMおよびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μM；ＣＡＹ１０５６６、５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｄ)対照またはＳＣＤ－ｓｇＲＮＡを発現する細胞を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｅ)対照またはＳＣＤ－ｓｇＲＮＡを有するＢＴ４７４細胞由来３Ｄスフェロイドを、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。左、細胞死染色(スケールバー、１００μm)。右、細胞生存能。(Ｆ)ＳＣＤ１はＢＴ４７４細胞で過剰発現され、ウェスタンブロットにより決定された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。(Ｇ)対照またはＳＣＤ１過剰発現するＢＴ４７４細胞由来３Ｄスフェロイドを、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。左、細胞死染色(スケールバー、１００μm)。右、細胞生存能。(Ｈ)細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＢＴ４７４について０.５μMおよびＭＤＡ－ＭＢ－４５３について１μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；オレイン酸(ＯＡ)、０.５mM；ステアリン酸(ＳＡ)、０.５mM。
【0025】
【図6】図６Ａ～Ｆ。ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせはインビボで腫瘍退縮をもたらす。(Ａ)ウェスタンブロットによりモニターした、ＢＴ４７４細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在、Ｄｏｘ誘導型ＧＰＸ４ノックアウト(ＧＰＸ４－ｉＫＯ)。(Ｂ)ＧＰＸ４－ｉＫＯ ＢＴ４７４細胞異種移植マウスからの切除腫瘍の画像。示すとおり、数群のマウスをＣＣＩ－７７９および／またはＤｏｘで処置した(ｎ＝６／群)。詳細については方法参照。(Ｃ)代表的ヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)ならびにＧＰＸ４、Ｋｉ６７、ＰＴＧＳ２およびｐＳ２３５／２３６ Ｓ６(全てヘマトキシリン(青色)で対比染色)の免疫染色画像を異種移植腫瘍切片で示す。スケールバー、５０μm。(Ｄ)各群のＢＴ４７４腫瘍の増殖曲線。データを、実際の腫瘍サイズについて線形目盛(上部パネル)または腫瘍変化倍率についてｌｏｇ２目盛(下部パネル)上に、平均±ｓ.ｄ.、ｎ＝６としてプロットする。(Ｅ)実際の腫瘍サイズについて線形目盛(上部パネル)または腫瘍変化倍率サイズについてｌｏｇ２目盛(下部パネル)上の各群のＰＣ－３腫瘍の増殖曲線(ｎ＝６)。(Ｆ)ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の発がん性活性化はＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在脂質生合成を介してフェロトーシスを抑制することを説明するモデル。
【0026】
【図7】図７Ａ～Ｊ。ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達はフェロトーシス感受性を制御する。(Ａ)細胞を示すとおり処理した。ＧＤＣ－０９４１、２μM；ＭＫ－２２０６、２μM；ＲＳＬ３、１μM；Ｆｅｒ－１、１μM。脂質過酸化反応を測定した。(Ｂ)細胞を、示す条件で処理した。Ｔｏｒｉｎ、１μM；ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。細胞死を測定した。(Ｃ)細胞を、示す条件で処理した。ＲＳＬ３、ＭＣＦ細胞およびＰＣ－３細胞について１０μM、Ｔ４７Ｄ細胞について５μM、ＨｅｐＧ２細胞について１μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。(Ｄ)細胞を示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM；Ｆｅｒ－１、１μM。細胞死をヨウ化プロピジウム(ＰＩ)(赤色)またはSytox Green(緑色)により染色した(スケールバー、１００μm)。(Ｅ～Ｆ)ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞およびＭＣＦ７細胞の３Ｄスフェロイドを示すとおり処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＭＣＦ７細胞について５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。上部パネル、細胞死染色(スケールバー、１００μm)。下部パネル、細胞生存能。(Ｇ)ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞を示すとおり２４時間処理した。ＲＳＬ３、１μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＧＤＣ－０９４１、２μM；ＭＫ－２２０６、２μM；ダブラフェニブ、２μM；ＳＣＨ７７２９８４、２μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｈ)ウェスタンブロットを、ＲＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲノックダウン効率を検出するために実施した。(Ｉ)ＨＴ１０８０細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞(両者とも野生型ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路を有する)を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＨＴ１０８０について０.１μMおよびＭＤＡ－ＭＢ－２３１について０.２５μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。細胞死を測定した。(Ｊ)２系統のＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路野生型細胞(ＨＴ１０８０およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１)および２系統の経路の活性化変異を有する細胞(ＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３)を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.２５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。ウェスタンブロットを、ｐＴ３８９ Ｓ６Ｋの検出のために実施した。
【0027】
【図8】図８Ａ～Ｄ。ＮＲＦ２はｍＴＯＲＣ１のフェロトーシス抑制活性介在の主役ではない。(Ａ)ＮＲＦ２を、ＨｅｐＧ２細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーにより枯渇させた。ＮＲＦ２レベルをウェスタンブロットにより測定した。(Ｂ)ＮＲＦ２を、ＰＣ－３細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーにより枯渇させた。ＮＲＦ２レベルをウェスタンブロットにより測定した。(Ｃ)ＮＲＦ２を、ＭＣＦ７細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーにより枯渇させた。(左)ＮＲＦ２レベルをウェスタンブロットにより測定した。(右)ＮＲＦ２枯渇があるまたはないＭＣＦ７細胞を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。細胞死を測定した。(Ｄ)Ｋｅａｐ１を、ＢＴ４７４細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーにより枯渇させた。(左)ＮＲＦ２およびＫｅａｐ１レベルをウェスタンブロットにより測定した。(右)Ｋｅａｐ１枯渇があるまたはないＢＴ４７４細胞を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM；Ｆｅｒ－１、１μM。
【0028】
【図9】図９Ａ～Ｆ。ＳＲＥＢＰ１は細胞をフェロトーシスから保護する。(Ａ)ＭＣＦ７細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。細胞ライセートを、ｐ－Ｔ３８９ Ｓ６、総Ｓ６Ｋ、ＳＲＥＢＰ１(Ｐ)およびＳＲＥＢＰ１(ｍ)を検出するウェスタンブロットのため処理２４時間後集めた。(Ｂ)細胞を５μM ファトスタチンＡで一夜前処理し、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＢＴ４７４細胞について０.５μM、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３について１μMおよびＭＣＦ７細胞について５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｃ)ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＭＣＦ７細胞におけるＳＲＥＢＦ１ノックアウト効率を、ウェスタンブロットによりモニターした。(Ｄ)ＭＣＦ７細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｅ)細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM；Ｔｏｒｉｎ、１μM；ＧＤＣ－０９４１、２μM；ＭＫ－２２０６、２μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。(Ｆ)ＳＲＥＢＰ１ｍはＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＡ５４９細胞で過剰発現され、ウェスタンブロットにより決定された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＣＦ７細胞について５μM、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について０.５μMおよびＡ５４９細胞について０.２５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。
【0029】
【0030】
【図11】図１１Ａ～Ｈ。ＳＣＤ１は細胞をフェロトーシスに対して保護する。(Ａ)細胞は、５μM ＣＡＹ１０５６６で一夜前処理した細胞であった。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３について１μMおよびＢＴ４７４について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM；ＣＡＹ１０５６６、５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｂ)ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＭＣＦ７細胞におけるＳＣＤノックアウト効率を測定するウェスタンブロット。(Ｃ)ＭＣＦ細胞(ｓｇＣｔｒｌ、ｓｇＳＣＤ＃１およびｓｇＳＣＤ＃２)を、示すとおり処理した。ＲＳＬ３、５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｄ)細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。(Ｅ)細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞について１μMおよびＢＴ４７４細胞について０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＧＤＣ－０９４１、２μM；ＭＫ－２２０６、２μM。(Ｆ)ＳＣＤ１はＢＴ４７４細胞で過剰発現された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。脂質過酸化反応を測定した。(Ｇ)ＳＣＤ１はＡ５４９細胞で過剰発現され、ウェスタンブロットにより決定された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.２５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM。脂質過酸化反応および細胞死を、それぞれ処理６時間および２４時間後に測定した(Ｈ)ＳＣＤ１はＳＲＥＢＦ１ノックアウトを有するＢＴ４７４細胞で過剰発現された。ＳＣＤ１およびＳＲＥＢＰ１レベルはウェスタンブロットにより決定された。細胞を示すとおり処理した。ＲＳＬ３、０.５μM；ＣＣＩ－７７９、０.５μM；Ｆｅｒ－１、１μM。
【0031】
【0032】
【図13】図１３Ａ～Ｅ。ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせは腫瘍退縮をもたらす。(Ａ) ＧＰＸ４－ｉＫＯ ＢＴ４７４細胞を示すとおり３０時間処理した。ＣＣＩ－７７９、０.５μM；ＤＯＸ、１００ng／ml；Ｔｒｏｌｏｘ、２００μM。死んだ細胞をSytox Greenで染色した(スケールバー、１００μm)。(Ｂ) ＢＴ４７４腫瘍体積を各マウスで毎日測定した。各個々のマウスのｌｏｇ２腫瘍体積変化倍率をプロットした。(Ｃ)ＰＣ－３細胞異種移植マウスからの切除腫瘍の画像。数群のマウスを示すとおりＣＣＩ－７７９および／またはＩＫＥで処置した(ｎ＝６／群)。詳細については方法参照。(Ｄ)代表的ヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)ならびにＫｉ６７、ＰＴＧＳ２およびｐＳ２３５／２３６ Ｓ６(全てヘマトキシリン(青色)で対比染色)の免疫染色画像は、ＰＣ－３異種移植腫瘍の切片から示す。スケールバー、５０μm。(Ｅ)ＰＣ－３腫瘍体積を各マウスで毎日測定した。各個々のマウスのｌｏｇ２腫瘍体積変化倍率をプロットした。
【発明を実施するための形態】
【0033】
詳細な記載
本発明の主実施態様の一部は、本特許明細書の発明の概要、実施例および特許請求の範囲の部分に記載されているが、この詳細な記載部分は、本発明に関連するある付加的記載を提供し、本特許出願の全ての他の部分と関連して読まれることが意図される。
本発明の主実施態様の一部は、本特許明細書の発明の概要、実施例および特許請求の範囲の部分に記載されているが、この詳細な記載部分は、本発明に関連するある付加的記載を提供し、本特許出願の全ての他の部分と関連して読まれることが意図される。
【0034】
他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。
【0035】
本明細書および添付する特許請求の範囲において、単数表現、文脈から他のことが明らかに示されない限り、複数を含む。用語「ある」ならびに用語「１以上」および「少なくとも１個」は相互交換可能に使用され得る。
【0036】
さらに、「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない２個の特定の特性または要素の各々の具体的開示として解釈される。故に、「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される用語「および／または」は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ(単独)およびＢ(単独)を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用される用語「および／または」は、Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；およびＣ(単独)を含むことが意図される。
【0037】
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(ＳＩ)により許容された形態で示される。ここに提供される数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。
【0038】
数値的用語の前に「約」または「おおよそ」があるとき、該用語は示す数値および該数値の値±１０％を含む。さらに、数値的用語の前に修飾語句「約」があるときは、「約」修飾語句がない厳密な記載された数値を有する別の実施態様も意図され、また本発明の範囲内に入る。逆に、本発明の実施態様が特定の数値をいうとき、「約」限定を有する別の実施態様も意図され、また本発明の範囲内に入る。
【0039】
用語「含む」、「からなる」および／または「本質的にからなる」は、米国特許法により許容される意味を有する。実施態様が用語「含む」を使用して記載されるとき、用語「からなる」および／または「本質的にからなる」で記載されるその他は類似する実施態様が包含される。
【0040】
Ｉ. 活性剤および組成物
本発明により提供される方法および組成物は、次のものを含むが、これらに限定されない種々の異なる活性剤が関与する：
本発明により提供される方法および組成物は、次のものを含むが、これらに限定されない種々の異なる活性剤が関与する：
【0041】
ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、ＭＴＯＲＣ１阻害剤、ＳＲＥＢＰ阻害剤およびＳＣＤ１阻害剤を含むが、これらに限定されないＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＭＴＯＲシグナル伝達軸の阻害剤；
【0042】
ＧＤＣ－０９４１、ＳＡＲ２４５４０９、ＳＡＲ２４５４０８、ＢＹＬ－７１９、ＧＤＣ－０９８０、ワートマニン、Ｌｙ２９４００２、デメトキシビリジン、ペリホシン、デラリシブ、イデラリシブ、ＰＸ－８６６、ＩＰＩ－１４５、ＢＡＹ ８０－６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ １２０２、ＲＰ５２６４、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＢＫＭ１２０、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＲＰ６５０３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ－４７７、ＣＵＤＣ－９０７およびＡＥＺＳ－１３６を含むが、これらに限定されないＰＩ３Ｋ阻害剤；
【0043】
ＭＫ－２２０６、ＭＫ－２２０６、ペリホシン、ＧＳＫ６９０６９３、イパタセルチブ(ＧＤＣ－００６８)、ＡＺＤ５３６５、アフレセルチブ(ＧＳＫ２１１０１８３)、Ａｔ１３１４８、ＰＦ－０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、トリシリビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ－６７４５６３、ＰＨＴ０４２７、ミルテホシン、ホノキオールおよびＴＩＣ１０を含むが、これらに限定されないＡｋｔ阻害剤；
【0044】
ＳＡＲ２４５４０９、ＧＤＣ－０９８０、ＣＣＩ－７７９、ＫＵ－００６３７９４、ラパマイシン、没食子酸エピガロカテキン(ＥＧＣＧ)、カフェイン、クルクミン、レスベラトロール、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムスおよびリダホロリムスを含むが、これらに限定されないＭＴＯＲ阻害剤；
【0045】
テムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)、ＴｏｒｉｎおよびＲＡＰＴＯＲの短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)阻害剤を含むが、これらに限定されないＭＴＯＲＣ１阻害剤；
【0046】
ファトスタチンＡを含むが、これに限定されないＳＲＥＢＰ阻害剤；
【0047】
ＣＡＹ１０５６６を含むが、これに限定されないＳＣＤ１阻害剤；および
【0048】
ＲＳＬ３、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)、スルファサラジン、ソラフェニブ、アルトレタミン、アルテスナート、ＭＬ－１６２およびＭＬ－２１０を含むが、これらに限定されないフェロトーシス誘導体。
【0049】
ある実施態様において、本発明は、ここに記載する活性剤の１以上および治療上許容される担体を含む治療組成物を提供する。「治療上許容される担体」は、生存対象(例えば生存ヒト対象)への投与に適する組成物の調製に有用であり、一般に安全かつ非毒性である物質であるまたはそれを含む。適当な「治療上許容される担体」は、食塩水溶液(例えば、リン酸緩衝化食塩水溶液)、水、エマルジョン(例えば油／水または水／油エマルジョン)、湿潤剤、希釈剤、増量剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、脂質または生存対象への投与に適する組成物の調製への使用について当分野で知られるあらゆる他の物質であり得るかまたはこれを含み得る。
【0050】
II. 処置方法
本発明は種々の処置方法を提供する。ここで使用する用語「処置する」および「処置」は、腫瘍(例えば特定のタイプの腫瘍)と関連する１以上の臨床的指標または症状を、検出可能な程度までの改善(または改善する方法)をいう。例えば、このような用語は、腫瘍(または腫瘍細胞)増殖速度減少、腫瘍(または腫瘍細胞)増殖停止、腫瘍(または腫瘍細胞)退縮誘導、腫瘍サイズ減少(例えば腫瘍体積または腫瘍塊の点で測定して)、腫瘍悪性度減少、腫瘍(または腫瘍細胞)除去などを含むが、これらに限定されない。ある組成物または方法の処置における有効性は、ある／「試験」組成物または方法の有効性と「対照」組成物または方法を比較する方法などの当分野で知られる標準法を使用して証明または評価され得る。例えば、ある組成物または方法の腫瘍における有効性は、プラセボ対照などの対照組成物または対照方法と比較した腫瘍の１以上の臨床的指標または症状を改善する能力の比較により、証明または評価され得る。例えば、比較は異なる対象間であり得る(例えば、試験群対象間または対照群対象間)であり得る。同様に、ある組成物または方法の処置における有効性は、対象の処置前後の腫瘍の比較により、単一対象で証明または評価され得る。
本発明は種々の処置方法を提供する。ここで使用する用語「処置する」および「処置」は、腫瘍(例えば特定のタイプの腫瘍)と関連する１以上の臨床的指標または症状を、検出可能な程度までの改善(または改善する方法)をいう。例えば、このような用語は、腫瘍(または腫瘍細胞)増殖速度減少、腫瘍(または腫瘍細胞)増殖停止、腫瘍(または腫瘍細胞)退縮誘導、腫瘍サイズ減少(例えば腫瘍体積または腫瘍塊の点で測定して)、腫瘍悪性度減少、腫瘍(または腫瘍細胞)除去などを含むが、これらに限定されない。ある組成物または方法の処置における有効性は、ある／「試験」組成物または方法の有効性と「対照」組成物または方法を比較する方法などの当分野で知られる標準法を使用して証明または評価され得る。例えば、ある組成物または方法の腫瘍における有効性は、プラセボ対照などの対照組成物または対照方法と比較した腫瘍の１以上の臨床的指標または症状を改善する能力の比較により、証明または評価され得る。例えば、比較は異なる対象間であり得る(例えば、試験群対象間または対照群対象間)であり得る。同様に、ある組成物または方法の処置における有効性は、対象の処置前後の腫瘍の比較により、単一対象で証明または評価され得る。
【0051】
用語「腫瘍」は、当分野でのその通常の使用法に従い使用され、多様な種々の腫瘍タイプを含む。
【0052】
ここに記載する処置方法の実施に際し、あらゆる適当な投与方法または経路を、ここに記載する活性剤またはそれらの組み合わせの送達に使用し得る。用語「投与」は、対象に特定の組成物または薬剤を導入または送達するあらゆる経路を含む。ある実施態様において、活性剤またはそれらの組み合わせは全身投与される。ある実施態様において、活性剤またはそれらの組み合わせは局所投与される。「全身投与」は、例えば、循環またはリンパ系への侵入を介して、対象の身体の広域(例えば、身体の５０％超)に組成物または薬剤を導入または送達する経路を介する、対象への特定の組成物または薬剤の導入または送達をいう。対照的に、「局所投与」は、薬剤を投与した点の領域またはそれにすぐ隣接する領域に導入または送達し、薬剤を治療に意味のある量で漸新世に誘導しない経路を介する、対象への特定の組成物または薬剤の導入または送達をいう。例えば、局所投与された薬剤は、投与した点の近位局所で容易に検出可能であるが、対象の身体の園医部分では検出不可能であるか無視できる量で検出可能である。
【0053】
ある実施態様において、投与は、腫瘍内、静脈内、皮下、経口、局所、経皮、経真皮、筋肉内、関節内、非経腸、細動脈内、皮内、脳室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入、埋め込み型リザーバー、非経腸(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内および頭蓋内注射または点滴技術)などを含む、当分野で知られるあらゆる適当な経路により実施され得る。投与は自己投与および他者による投与を含む。ある投与経路または手段の適性は、医師により容易に決定され得る。
【0054】
２以上の活性剤が投与されるとき、これら薬剤は、同時に、逐次的にまたは時間的に重複して投与され得る。同様に、２以上の活性剤が投与されるとき、これら薬剤は同じ組成物で一緒に投与されても、異なる組成物で別に投与されてもよい。
【0055】
ここで使用する用語「有効量」は、ここでの「処置」に列記されたアウトカムの１以上を達成するまたは達成に向けて貢献するのに十分なここに記載する活性剤の量をいう。各個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの当分野で知られる標準技術を使用して決定でき、所望の投与経路(例えば、全身対局所)、所望の投与頻度などの因子を考慮に入れて、決定され得る。さらに、「有効量」は、使用される何らかの共投与の状況で決定され得る。当業者は、例えば、本特許明細書の実施例部分に記載するもの － 対象 － 例えば、投与試験の実施について薬学で日常的に使用される動物対象 － へのここに記載する薬剤の投与を含む － などのアッセイを使用して、使用するための適切な用量を決定するためのこのような投与試験(単剤または複数薬剤の組み合わせの何れを使用しても)を実施できる。
【0056】
例えば、ある実施態様において、本発明の活性剤の用量は、活性剤の有効性および／または有効量の決定のために実施される、ヒトまたは他の哺乳動物における試験に基づき計算され得る。投与量および投与頻度もしくはタイミングは、当分野で知られる方法により決定でき、活性剤の医薬形態、投与経路、活性剤を１個だけまたは複数活性剤を使用するか(例えば、必要な第一活性剤の投与量は、そのような薬剤を第二活性剤と組み合わせて使用するとき低い可能性がある)および年齢、体重または薬物代謝に影響する何らかの医学的状態の存在を含む患者特徴などの因子に依存し得る。
【0057】
マウス試験に基づき、投与すべき薬剤の特定の用量をいうここに記載する実施態様において、当業者は、例えば、ここに記載するタイプの投与試験および計算を使用して、マウス用量に基づき、ヒト試験のための同等な用量を容易に決定できる。
【0058】
ある実施態様において、ここに記載する種々の活性剤の適当な用量は、例えば、出発点として、本特許明細書の実施例部分でマウスで有効であると示された投与量を使用して、用量漸増試験などの当分野で標準的なタイプの投与試験を実施することにより決定され得る。
【0059】
投与レジメンも、例えば、出発点として、本特許明細書の実施例部分でマウスで有効であると示された投与レジメンを使用して、当分野で標準的なタイプの投与試験を実施することにより調節および最適化し得る。ある実施態様において、活性剤は連日または週２回または毎週または２週毎または毎月投与される。
【0060】
ある実施態様において、ここに提供される組成物および処置方法を、外科的方法(例えば、腫瘍切除のため)、放射線療法方法、化学療法剤での処置、抗体での処置、免疫療法剤での処置、細胞治療方法での処置、チロシンキナーゼ阻害剤での処置などを含むが、これらに限定されない腫瘍治療に有用であることが知られる他の組成物および処置方法と一緒に用い得る。同様に、ある実施態様において、ここに提供される処置方法を、生検方法および診断方法(例えば、ＭＲＩ方法または他の造影方法)などの疾患状態／進行をモニターするために使用される方法と共に用い得る。
【0061】
例えば、ある実施態様において、ここに記載する方法および／またはここに記載する薬剤および組成物を、例えば、外科的切除前に腫瘍を縮小させるために、腫瘍の外科的切除前に対象に用いるまたは投与することができる。他の実施態様において、ここに記載する方法および／またはここに記載する薬剤および組成物を、腫瘍の外科的切除の実施前後両方に対象に用いるまたは投与することができる。
【0062】
III. 対象
ここで使用する用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類(例えばラット、マウスおよびモルモット)、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど － 畜産で使用される全哺乳動物種ならびにペットとしておよび動物園で飼育される動物を含む － を含むが、これらに限定されない全哺乳動物種を含む。ある実施態様において、対象はヒトである。このような対象は、典型的に処置を必要とする１個の腫瘍(または複数の腫瘍)を有する。
ここで使用する用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類(例えばラット、マウスおよびモルモット)、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど － 畜産で使用される全哺乳動物種ならびにペットとしておよび動物園で飼育される動物を含む － を含むが、これらに限定されない全哺乳動物種を含む。ある実施態様において、対象はヒトである。このような対象は、典型的に処置を必要とする１個の腫瘍(または複数の腫瘍)を有する。
【0063】
本発明を次の非限定的実施例およびその中で言及される図においてさらに記載する。
【実施例】
【0064】
リン脂質の鉄依存性過酸化反応により駆動される壊死制御の一形態であるフェロトーシは、細胞代謝、酸化還元恒常性およびがんに関連する種々のシグナル伝達経路により制御される。この試験において、ヒトがんで非常に頻繁な事象であるＰＩ３Ｋの活性化変異またはＰＴＥＮ機能の喪失が、がん細胞におけるフェロトーシス耐性に寄与し、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達軸の阻害によりがん細胞がフェロトーシス誘導に対して感作されることを発見した。機構的に、この耐性は持続したｍＴＯＲＣ１の活性化および脂質代謝を制御する中心的転写因子であるステロール調節配列結合タンパク質１(ＳＲＥＢＰ１)のｍＴＯＲＣ１依存性誘導を必要とする。さらに、ＳＲＥＢＰ１の転写標的ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１(ＳＣＤ１)は、一不飽和脂肪酸の産生により、ＳＲＥＢＰ１のフェロトーシス抑制活性を媒介する。ＳＲＥＢＰ１またはＳＣＤ１の遺伝的または薬理学的除去は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路変異を有するがん細胞におけるフェロトーシスを感作した。逆に、ＳＲＥＰＢ１またはＳＣＤ１の異所性発現は、ｍＴＯＲＣ１が阻害されているときでも、これら細胞におけるフェロトーシス耐性を回復させた。ＰＩ３Ｋ変異乳がんおよびＰＴＥＮ欠損前立腺がんの異種移植マウスモデルにおいて、ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせは、ほぼ完全な腫瘍退縮をもたらした。結論として、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達の過活性変異は、ＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在脂質生合成を介してがん細胞を酸化的ストレスおよびフェロトーシス死から保護し、ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせは、前臨床モデルにおいて治療見込みを示す。
【0065】
結果
ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達経路の発がん性活性化は、フェロトーシスに対する耐性に寄与する
ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達経路の発がん性活性化は、フェロトーシスに対する耐性に寄与する
【0066】
フェロトーシスとがんでしばしば変異されるシグナル伝達経路の間の機能的相互作用を探索するために、明らかな遺伝的変異を有する一団のヒトがん細胞株を分析した。フェロトーシスを、ＧＰＸ４の薬理学的阻害剤であるＲＳＬ３により誘導した。フェロトーシス誘導に対する感受性は、試験した系列で変わった。顕著なことに、ＰＩＫ３ＣＡ活性化変異またはＰＴＥＮ欠失を有するがん細胞は、ＲＳＬ３により抵抗性であるように見えた(図１、Ａ～Ｃ)。これらの変異は、ヒトがんで最も高頻度で改変されるシグナル伝達経路の一つである発がん性ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴシグナル伝達経路の活性化に至る(２６～２８)。
【0067】
フェロトーシスに対する耐性がＰＩ３Ｋ－ＡＫＴシグナル伝達経路活性化の結果であるか否かを決定するために、この経路の薬理学的阻害ががん細胞をフェロトーシス誘導に対して感作するか否かを試験した。実際、ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＰＩ３Ｋｉ)ＧＤＣ－０９４１およびＡＫＴ阻害剤(ＡＫＴｉ)ＭＫ－２２０６両者がＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞(いずれも本経路の活性化変異を有する)をフェロトーシス(図１Ｄ)および脂質過酸化反応(図７Ａ)に感受性とした。さらに、触媒的阻害剤Ｔｏｒｉｎによる、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路の主要下流プレーヤーであるｍＴＯＲ阻害も、これら細胞をＲＳＬ３により誘導されるフェロトーシスに感作した(図７Ｂ)。従って、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路の持続した活性化は、がん細胞をフェロトーシス細胞死から保護する。顕著なことに、フェロトーシス阻害におけるｍＴＯＲＣ１の役割は、心筋細胞の状況などにおいて以前に報告されているが(２９)、根柢の機構は理解しづらいままである。
【0068】
ｍＴＯＲＣ２ではなくｍＴＯＲＣ１はフェロトーシスを抑制する
ｍＴＯＲシグナル伝達は２つの枝、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２により媒介される(２８)。どの枝が観察されるフェロトーシス制御を担うかを決定するために、まずｍＴＯＲＣ１活性を阻害するが、ｍＴＯＲＣ２を阻害しないラパログテムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)を試験した。Ｔｏｒｉｎに類似して、ＣＣＩ－７７９はがん細胞をフェロトーシス誘導および脂質過酸化反応に対して感作した(図２、Ａ～Ｂおよび図７、Ｃ～Ｄ)。一貫して、３次元(３Ｄ)腫瘍スフェロイド系において、ｍＴＯＲ阻害はこれら変異体がん細胞におけるフェロトーシスの誘導にＲＳＬ３と相乗作用した(図２Ｃおよび図７、Ｅ～Ｆ)。対照的に、ＥＲＫまたはＢＲＡＦの阻害剤はそうできなかった(図７Ｇ)。
ｍＴＯＲシグナル伝達は２つの枝、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２により媒介される(２８)。どの枝が観察されるフェロトーシス制御を担うかを決定するために、まずｍＴＯＲＣ１活性を阻害するが、ｍＴＯＲＣ２を阻害しないラパログテムシロリムス(ＣＣＩ－７７９)を試験した。Ｔｏｒｉｎに類似して、ＣＣＩ－７７９はがん細胞をフェロトーシス誘導および脂質過酸化反応に対して感作した(図２、Ａ～Ｂおよび図７、Ｃ～Ｄ)。一貫して、３次元(３Ｄ)腫瘍スフェロイド系において、ｍＴＯＲ阻害はこれら変異体がん細胞におけるフェロトーシスの誘導にＲＳＬ３と相乗作用した(図２Ｃおよび図７、Ｅ～Ｆ)。対照的に、ＥＲＫまたはＢＲＡＦの阻害剤はそうできなかった(図７Ｇ)。
【0069】
ラパログＣＣＩ－７７９およびｍＴＯＲ触媒的阻害剤Ｔｏｒｉｎ両方がフェロトーシス感受性を回復できたため、ｍＴＯＲＣ２ではなくｍＴＯＲＣ１がＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ経路変異を有するがん細胞の耐性を担うと仮説立てた。この考えに一致して、ＲＩＣＴＯＲ(ｍＴＯＲＣ２の要素)ではなくＲＡＰＴＯＲ(ｍＴＯＲＣ１の要素)の短ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)介在サイレンシングが、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３およびＢＴ４７４細胞をＲＳＬ３に感作した(図２、Ｄ～Ｅおよび図７Ｈ)。
【0070】
次に、野生型ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路を発現し、フェロトーシス誘導に対して感受性であるがん細胞を試験した。これら野生型細胞を、どのように本経路の基底活性がフェロトーシス誘導を可能とするかおよび本経路の薬理学的阻害がさらにフェロトーシスを増強できるか否かについて試験した。野生型ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路を有する２細胞株、ＨＴ１０８０およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１を使用した。低濃度のＲＳＬ３単独はこれら細胞でフェロトーシスを誘導するには不十分であったが、ｍＴＯＲ阻害剤の追加はさらにフェロトーシスを増強した(図７Ｉ)。顕著なことに、ｍＴＯＲＣ１活性は、Ｓ６Ｋリン酸化により測定して、これら野生型細胞で経時的にＲＳＬ３により阻害された(図７Ｊ)。対照的に、経路変異を有する細胞は、同じ時点でＲＳＬ３処理による活性ｍＴＯＲＣ１を維持した(図７Ｊ)。興味深いことに、脂質過酸化物捕捉剤フェロスタチン－１(Ｆｅｒ－１)での処理は、野生型細胞でｍＴＯＲＣ１活性のＲＳＬ３誘導不活性化を阻止し(図７Ｊ)、脂質過酸化反応がＲＳＬ３に応答したｍＴＯＲＣ１不活性化を担い、先行することが示唆された。しかしながら、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路変異を有するがん細胞で、ＲＳＬ３誘導脂質過酸化反応は、本経路が阻害されたときのみ明白であり(図７Ａおよび図２)、ｍＴＯＲ阻害がこれら変異体細胞で脂質過酸化物の相当な蓄積を担うことが示唆された。これらの結果は、ｍＴＯＲＣ１活性が脂質過酸化物の毒性効果防止に作用し、一方細胞におけるＲＯＳおよび脂質過酸化物蓄積がｍＴＯＲＣ１活性を減弱することを示す。そのような方法で、フェロトーシス誘導により、野生型細胞における基底ｍＴＯＲＣ１活性低下は脂質過酸化物蓄積を可能とし、これが続いてｍＴＯＲＣ１活性の阻害および脂質過酸化反応加速に至る；しかし、変異体がん細胞において、より強力かつ持続したｍＴＯＲＣ１活性は脂質過酸化物蓄積を阻止し、故にフェロトーシスに対する耐性を引き起こす。
【0071】
ＮＲＦ２はｍＴＯＲＣ１のフェロトーシス抑制活性の主要媒介因子ではない
フェロトーシスの特性である(１)高レベルの細胞ＲＯＳは、ＮＲＦ２転写因子のＫｅａｐ１介在プロテアソーム分解抑制により、抗酸化剤経路を誘導する(３０)。ｍＴＯＲＣ１がｐ６２リン酸化によりｐ６２とＫｅａｐ１の結合を促進し、Ｋｅａｐ１の分解および故にＮＲＦ２蓄積に至ることは報告されている(３１)。このｐ６２－Ｋｅａｐ１－ＮＲＦ２軸は、肝細胞がん細胞をフェロトーシスから保護することが報告されている(３２)。さらに、ＮＲＦ２シグナル伝達はまたフェロトーシス阻害によるｍＴＯＲの効果を媒介することも示唆されている(３３)。しかしながら、ＲＳＬ３誘導型ＮＲＦ２蓄積がＴｏｒｉｎ処理により除去されることを発見したが(図３Ａ)、ＨＴ１０８０細胞におけるＮＲＦ２ノックアウトはエラスチン(系ｘｃ－シスチン／グルタメート交換輸送体の化学阻害剤)により誘導されるフェロトーシスを中程度にしか増強せず、ＲＳＬ３誘導型フェロトーシスに測定可能な効果はなかった(図３、ＢおよびＣ)；ＰＩ３Ｋ経路変異を有する複数細胞株で、ＮＲＦ２がノックアウトされた後でも、フェロトーシス誘導はなおｍＴＯＲ阻害剤により強力に感作できた(図３、Ｄ～Ｅおよび図８、Ａ～Ｃ)。さらに、ＢＴ４７４細胞におけるＫｅａｐ１ノックアウトおよび結果的ＮＲＦ２蓄積は、ｍＴＯＲＣ１阻害により誘導されるフェロトーシス感作の中程度の減少のみもたらした(図８Ｄ)。これらの結果は、ｍＴＯＲＣ１阻害によるフェロトーシス感作が主にＮＲＦ２非依存的機構を介することを示す。
フェロトーシスの特性である(１)高レベルの細胞ＲＯＳは、ＮＲＦ２転写因子のＫｅａｐ１介在プロテアソーム分解抑制により、抗酸化剤経路を誘導する(３０)。ｍＴＯＲＣ１がｐ６２リン酸化によりｐ６２とＫｅａｐ１の結合を促進し、Ｋｅａｐ１の分解および故にＮＲＦ２蓄積に至ることは報告されている(３１)。このｐ６２－Ｋｅａｐ１－ＮＲＦ２軸は、肝細胞がん細胞をフェロトーシスから保護することが報告されている(３２)。さらに、ＮＲＦ２シグナル伝達はまたフェロトーシス阻害によるｍＴＯＲの効果を媒介することも示唆されている(３３)。しかしながら、ＲＳＬ３誘導型ＮＲＦ２蓄積がＴｏｒｉｎ処理により除去されることを発見したが(図３Ａ)、ＨＴ１０８０細胞におけるＮＲＦ２ノックアウトはエラスチン(系ｘｃ－シスチン／グルタメート交換輸送体の化学阻害剤)により誘導されるフェロトーシスを中程度にしか増強せず、ＲＳＬ３誘導型フェロトーシスに測定可能な効果はなかった(図３、ＢおよびＣ)；ＰＩ３Ｋ経路変異を有する複数細胞株で、ＮＲＦ２がノックアウトされた後でも、フェロトーシス誘導はなおｍＴＯＲ阻害剤により強力に感作できた(図３、Ｄ～Ｅおよび図８、Ａ～Ｃ)。さらに、ＢＴ４７４細胞におけるＫｅａｐ１ノックアウトおよび結果的ＮＲＦ２蓄積は、ｍＴＯＲＣ１阻害により誘導されるフェロトーシス感作の中程度の減少のみもたらした(図８Ｄ)。これらの結果は、ｍＴＯＲＣ１阻害によるフェロトーシス感作が主にＮＲＦ２非依存的機構を介することを示す。
【0072】
ｍＴＯＲＣ１活性化は、ＳＲＥＢＰ１上方制御により、フェロトーシスを抑制する。
フェロトーシス細胞死はリン脂質過酸化反応を必要とする。ｍＴＯＲＣ１が細胞脂質代謝調節を介してフェロトーシスを制御するかを探索するために、脂質合成の中心的制御因子ＳＲＥＢＰ１(２０、２１)を試験し、これは、最近ｍＴＯＲＣ１活性の下流標的として示された(２２、２５、３４、３５)。実際、複数タイプのＲＳＬ３耐性がん細胞において、ｍＴＯＲＣ１阻害剤ＣＣＩ－７７９は、下流転写標的を制御するために核に転座できる成熟形態のＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＢＰ１ｍ)のレベルを減少した(図４Ａ、図９Ａ)。機能的に、ファトスタチンＡによるＳＲＥＢＰ活性の薬理学的阻害(３６)またはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９によるＳＲＥＢＦ１遺伝子の遺伝的欠失は、これら細胞のフェロトーシスおよび脂質過酸化反応を感作した(図４、Ｂ～Ｄおよび図９、Ｂ～Ｄ)。さらに、これらのＳＲＥＢＦ１ノックアウト細胞において、ｍＴＯＲ阻害剤(ＴｏｒｉｎおよびＣＣＩ－７７９)、ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＧＤＣ－０９４１)およびＡＫＴ阻害剤(ＭＫ－２２０６)はすべてＲＳＬ３誘導型フェロトーシスをさらに増強することができなかった(図９Ｅ)。逆に、構成的に活性な核形態のＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＰＢ１ｍ)の異所性発現は、２Ｄ細胞培養および３Ｄ腫瘍スフェロイド実験両方で試験して、(１)そうでなければＲＳＬ３感受性Ａ５４９細胞を耐性とし、そして(２)複数ＲＳＬ３耐性細胞株をＣＣＩ－７７９とＲＳＬ３の組み合わせにもはや応答しなくした(図４、Ｅ～Ｆおよび図９Ｆ)。結論として、ｍＴＯＲＣ１は、ＳＲＥＢＰ１機能の上方制御を介して、がん細胞フェロトーシスに対する耐性誘導を促進する。
フェロトーシス細胞死はリン脂質過酸化反応を必要とする。ｍＴＯＲＣ１が細胞脂質代謝調節を介してフェロトーシスを制御するかを探索するために、脂質合成の中心的制御因子ＳＲＥＢＰ１(２０、２１)を試験し、これは、最近ｍＴＯＲＣ１活性の下流標的として示された(２２、２５、３４、３５)。実際、複数タイプのＲＳＬ３耐性がん細胞において、ｍＴＯＲＣ１阻害剤ＣＣＩ－７７９は、下流転写標的を制御するために核に転座できる成熟形態のＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＢＰ１ｍ)のレベルを減少した(図４Ａ、図９Ａ)。機能的に、ファトスタチンＡによるＳＲＥＢＰ活性の薬理学的阻害(３６)またはＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９によるＳＲＥＢＦ１遺伝子の遺伝的欠失は、これら細胞のフェロトーシスおよび脂質過酸化反応を感作した(図４、Ｂ～Ｄおよび図９、Ｂ～Ｄ)。さらに、これらのＳＲＥＢＦ１ノックアウト細胞において、ｍＴＯＲ阻害剤(ＴｏｒｉｎおよびＣＣＩ－７７９)、ＰＩ３Ｋ阻害剤(ＧＤＣ－０９４１)およびＡＫＴ阻害剤(ＭＫ－２２０６)はすべてＲＳＬ３誘導型フェロトーシスをさらに増強することができなかった(図９Ｅ)。逆に、構成的に活性な核形態のＳＲＥＢＰ１(ＳＲＥＰＢ１ｍ)の異所性発現は、２Ｄ細胞培養および３Ｄ腫瘍スフェロイド実験両方で試験して、(１)そうでなければＲＳＬ３感受性Ａ５４９細胞を耐性とし、そして(２)複数ＲＳＬ３耐性細胞株をＣＣＩ－７７９とＲＳＬ３の組み合わせにもはや応答しなくした(図４、Ｅ～Ｆおよび図９Ｆ)。結論として、ｍＴＯＲＣ１は、ＳＲＥＢＰ１機能の上方制御を介して、がん細胞フェロトーシスに対する耐性誘導を促進する。
【0073】
ＳＲＥＢＰ１はＳＣＤ１活性を介して細胞をフェロトーシスから保護する。
ＳＲＥＢＰ１は、数ある代謝遺伝子の中で、ＡＣＬＹ、ＡＣＡＣＡ、ＦＡＳＮおよびＳＣＤを含む複数脂質合成関連遺伝子を制御する転写因子である(図１２Ａ)(２０)。ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路変異を有する試験細胞株において、ＳＲＥＢＦ１ノックアウトは、他の標的より有意にＳＣＤ１(ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル両方)の発現を減少させた(図５、Ａ～Ｂおよび図１０)。この結果および最近報告されたＳＣＤ１の抗フェロトーシス機能(３７)により、ＳＣＤ１がフェロトーシスに対する耐性誘導に介在するＳＲＥＢＰ１の主要下流標的であるか否かの試験が鼓舞された。薬理学的に、ＳＣＤ１阻害剤ＣＡＹ１０５６６はフェロトーシス(図５Ｃ)および脂質過酸化反応(図１１Ａ)誘導に対するＲＳＬ３の効果を感作した。遺伝的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ＳＣＤノックアウトも細胞をフェロトーシス誘導および脂質過酸化反応に感作した(図５、Ｄ～Ｅおよび図１１、Ｂ～Ｄ)。さらに、ＳＣＤノックアウトにより、ｍＴＯＲＣ１、ＰＩ３ＫまたはＡＫＴの阻害は、がん細胞をフェロトーシスにさらに感作できなかった(図１１Ｅ)。逆に、ＳＣＤ１過剰発現は、がん細胞をＲＳＬ３とｍＴＯＲ阻害またはＳＲＥＢＦ１ノックアウトの組み合わせにより誘導されるフェロトーシスから保護した(図５、Ｆ～Ｇおよび図１１、Ｆ～Ｈ)。
ＳＲＥＢＰ１は、数ある代謝遺伝子の中で、ＡＣＬＹ、ＡＣＡＣＡ、ＦＡＳＮおよびＳＣＤを含む複数脂質合成関連遺伝子を制御する転写因子である(図１２Ａ)(２０)。ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路変異を有する試験細胞株において、ＳＲＥＢＦ１ノックアウトは、他の標的より有意にＳＣＤ１(ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベル両方)の発現を減少させた(図５、Ａ～Ｂおよび図１０)。この結果および最近報告されたＳＣＤ１の抗フェロトーシス機能(３７)により、ＳＣＤ１がフェロトーシスに対する耐性誘導に介在するＳＲＥＢＰ１の主要下流標的であるか否かの試験が鼓舞された。薬理学的に、ＳＣＤ１阻害剤ＣＡＹ１０５６６はフェロトーシス(図５Ｃ)および脂質過酸化反応(図１１Ａ)誘導に対するＲＳＬ３の効果を感作した。遺伝的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ＳＣＤノックアウトも細胞をフェロトーシス誘導および脂質過酸化反応に感作した(図５、Ｄ～Ｅおよび図１１、Ｂ～Ｄ)。さらに、ＳＣＤノックアウトにより、ｍＴＯＲＣ１、ＰＩ３ＫまたはＡＫＴの阻害は、がん細胞をフェロトーシスにさらに感作できなかった(図１１Ｅ)。逆に、ＳＣＤ１過剰発現は、がん細胞をＲＳＬ３とｍＴＯＲ阻害またはＳＲＥＢＦ１ノックアウトの組み合わせにより誘導されるフェロトーシスから保護した(図５、Ｆ～Ｇおよび図１１、Ｆ～Ｈ)。
【0074】
ＳＣＤ１は、飽和脂肪酸を一不飽和脂肪酸(ＭＵＦＡ)に変換する酵素である(図１２Ａ)。ＭＵＦＡがフェロトーシスを阻害できることが報告されており(３８)、観察についての機構的説明を提供する。実際、飽和脂肪酸パルミチン酸(１６：０、ＰＡ)またはステアリン酸(１８：０、ＳＡ)ではなく、ＭＵＦＡパルミトレイン酸(１６：１、ＰＯ)またはオレイン酸(１８：１、ＯＡ)の追加が、ＣＣＩ－７７９＋ＲＳＬ３での処理によるフェロトーシス耐性をもたらす(図５Ｈおよび図１２、Ｂ～Ｃ)。纏めると、これらの結果は、ＳＲＥＢＰ１が主にＳＣＤ１の上方制御によりがん細胞をフェロトーシスから保護することを示す。顕著なことに、ＳＣＤ１は、本質的に酸化反応である脂肪酸不飽和化を触媒する鉄依存性酵素であり；そして、本発明によりこの鉄依存性、酸化酵素反応が、鉄依存性、酸化形態の細胞死であるフェロトーシスを軽減し得ることを発見した。
【0075】
ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせはインビボで腫瘍退縮をもたらす
ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせのがん治療能を探索するために、ヒトがんに対する２種のマウス異種移植モデルを分析した。最初のモデルにおいて、ＰＩ３Ｋ変異ＢＴ４７４乳がん細胞でドキシサイクリン(Ｄｏｘ)誘導性にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ＧＰＸ４ノックアウトを産生した(図６Ａ)。これらの細胞において、ＧＰＸ４ノックアウトとｍＴＯＲＣ１阻害のいずれか単独ではなく、組み合わせのみが、強力なフェロトーシスを誘導した(図１３Ａ)。これらの細胞を異種移植したマウスにおいて、平均腫瘍体積を約４００mm３に到達させ、次いでＣＣＩ－７７９投与によりｍＴＯＲＣ１阻害を開始した(Ｄｏｘ投与は２日早く開始していた)。ＣＣＩ－７７９投与は腫瘍増殖を減速させたが、驚くほどに、Ｄｏｘ処置とＣＣＩ－７７９の組み合わせは、腫瘍のほぼ完全な退縮を引き起こした(図６Ｂ、６Ｄおよび図１３Ｂ)。酸化的ストレスおよびフェロトーシス(３)のマーカーであるＰＴＧＳ２の免疫組織学的分析は、インビボでの腫瘍フェロトーシス誘導におけるＧＰＸ４およびｍＴＯＲＣ１の組み合わせ阻害のこのような相乗効果を支持した(図６Ｃ)。他方のマウスモデルで、インビボ使用について確認されている(３９)、エラスチンの強力かつ代謝的に安定なアナログであるイミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)を、ＧＰＸ４の遺伝的欠失の代わりに使用して、腫瘍細胞フェロトーシスを誘導した。ＰＴＥＮ欠損ＰＣ－３前立腺がん細胞を使用して、マウスにおいて異種移植腫瘍を産生した(ＰＴＥＮ欠損により前立腺がんの予後不良が予測される(４０))。ＢＴ４７４異種移植実験で観察されたものに類似して、ここで、ＩＫＥ単独は腫瘍増殖に効果を有しなかったが、ＣＣＩ－７７９との組み合わせは、劇的腫瘍退縮をもたらした(図６Ｅおよび図１３、Ｃ～Ｅ)。纏めると、これら２種のインビボ実験は、ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせがＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路の活性化変異を有するがんの処置に有望な治療アプローチであることを証明する。
ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせのがん治療能を探索するために、ヒトがんに対する２種のマウス異種移植モデルを分析した。最初のモデルにおいて、ＰＩ３Ｋ変異ＢＴ４７４乳がん細胞でドキシサイクリン(Ｄｏｘ)誘導性にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ＧＰＸ４ノックアウトを産生した(図６Ａ)。これらの細胞において、ＧＰＸ４ノックアウトとｍＴＯＲＣ１阻害のいずれか単独ではなく、組み合わせのみが、強力なフェロトーシスを誘導した(図１３Ａ)。これらの細胞を異種移植したマウスにおいて、平均腫瘍体積を約４００mm３に到達させ、次いでＣＣＩ－７７９投与によりｍＴＯＲＣ１阻害を開始した(Ｄｏｘ投与は２日早く開始していた)。ＣＣＩ－７７９投与は腫瘍増殖を減速させたが、驚くほどに、Ｄｏｘ処置とＣＣＩ－７７９の組み合わせは、腫瘍のほぼ完全な退縮を引き起こした(図６Ｂ、６Ｄおよび図１３Ｂ)。酸化的ストレスおよびフェロトーシス(３)のマーカーであるＰＴＧＳ２の免疫組織学的分析は、インビボでの腫瘍フェロトーシス誘導におけるＧＰＸ４およびｍＴＯＲＣ１の組み合わせ阻害のこのような相乗効果を支持した(図６Ｃ)。他方のマウスモデルで、インビボ使用について確認されている(３９)、エラスチンの強力かつ代謝的に安定なアナログであるイミダゾールケトンエラスチン(ＩＫＥ)を、ＧＰＸ４の遺伝的欠失の代わりに使用して、腫瘍細胞フェロトーシスを誘導した。ＰＴＥＮ欠損ＰＣ－３前立腺がん細胞を使用して、マウスにおいて異種移植腫瘍を産生した(ＰＴＥＮ欠損により前立腺がんの予後不良が予測される(４０))。ＢＴ４７４異種移植実験で観察されたものに類似して、ここで、ＩＫＥ単独は腫瘍増殖に効果を有しなかったが、ＣＣＩ－７７９との組み合わせは、劇的腫瘍退縮をもたらした(図６Ｅおよび図１３、Ｃ～Ｅ)。纏めると、これら２種のインビボ実験は、ｍＴＯＲＣ１阻害とフェロトーシス誘導の組み合わせがＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路の活性化変異を有するがんの処置に有望な治療アプローチであることを証明する。
【0076】
考察
結論として、この研究は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路の発がん性活性化が、下流ＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在脂質生合成を介してがん細胞におけるフェロトーシスを抑制する、新規フェロトーシス制御機構を明らかにした(図６Ｆ)。先にグルタミノリシスおよびミトコンドリアＴＣＡサイクル(１１、４１)などの種々の代謝過程がフェロトーシスに寄与することは報告されている。この試験は、フェロトーシス制御におけるＳＲＥＢＰ介在脂質代謝の機能を明らかにしていない。従って、アミノ酸、炭水化物および脂質を含む細胞代謝がフェロトーシスを制御し得る。がん細胞は、通常代謝および増殖性負荷の増加により酸化的ストレス上昇に耐える(４２、４３)。結果として、酸化的ストレスに対抗する経路、特にＮＲＦ２シグナル伝達(３０)が、がん細胞でしばしば活性化される。この研究は、ｍＴＯＲＣ１も細胞酸化還元恒常性の重要なモジュレーターであり、ＮＲＦ２介在シグナル伝達およびＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在ＭＵＦＡ合成両方を介してそれを行うことを示す。後者の機構は、おそらくより破壊的なタイプの酸化的ストレスである、フェロトーシス誘導脂質過酸化反応の抑制に重要である。ＭＵＦＡのフェロトーシス阻害性活性の根底にある厳密な機構は規定されていないが、この活性は先に証明されており(３８)、フェロトーシス抑制の際の発がん性ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路に役割を担うことは留意されるべきである。
結論として、この研究は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路の発がん性活性化が、下流ＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在脂質生合成を介してがん細胞におけるフェロトーシスを抑制する、新規フェロトーシス制御機構を明らかにした(図６Ｆ)。先にグルタミノリシスおよびミトコンドリアＴＣＡサイクル(１１、４１)などの種々の代謝過程がフェロトーシスに寄与することは報告されている。この試験は、フェロトーシス制御におけるＳＲＥＢＰ介在脂質代謝の機能を明らかにしていない。従って、アミノ酸、炭水化物および脂質を含む細胞代謝がフェロトーシスを制御し得る。がん細胞は、通常代謝および増殖性負荷の増加により酸化的ストレス上昇に耐える(４２、４３)。結果として、酸化的ストレスに対抗する経路、特にＮＲＦ２シグナル伝達(３０)が、がん細胞でしばしば活性化される。この研究は、ｍＴＯＲＣ１も細胞酸化還元恒常性の重要なモジュレーターであり、ＮＲＦ２介在シグナル伝達およびＳＲＥＢＰ１／ＳＣＤ１介在ＭＵＦＡ合成両方を介してそれを行うことを示す。後者の機構は、おそらくより破壊的なタイプの酸化的ストレスである、フェロトーシス誘導脂質過酸化反応の抑制に重要である。ＭＵＦＡのフェロトーシス阻害性活性の根底にある厳密な機構は規定されていないが、この活性は先に証明されており(３８)、フェロトーシス抑制の際の発がん性ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲＣ１経路に役割を担うことは留意されるべきである。
【0077】
がんに関連して、この試験は、ヒトがんで最も変異されている経路の一つであるＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達の発がん性改変(２６～２８)が、がん細胞をフェロトーシス誘導により耐性とすることを示す。興味深いことに、最近、同様にヒトがんにおいてしばしば変異されているシグナル伝達経路であるＥカドヘリン－ＮＦ２－Ｈｉｐｐｏ－ＹＡＰ経路における発がん性変異が、むしろがん細胞をフェロトーシスに感受性とすることが報告された(１８)。従って、特定のがん駆動変異ががん細胞フェロトーシスを増強または抑制するか否かおよびその方法は、遺伝子産物が代謝および酸化還元および鉄恒常性などのフェロトーシスに関連する細胞プロセスに依存する。いずれの場合も、これらの機構的知見は、将来的なフェロトーシス誘導がん治療に非常に価値のある洞察を提供する：Ｅカドヘリン－ＮＦ２－Ｈｉｐｐｏ－ＹＡＰ経路における悪性変異を、単剤療法としてのフェロトーシス誘導に対するがん細胞応答性を予測するバイオマーカーとして使用できる；そしてＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路に腫瘍形成変異を有する患者を、フェロトーシス誘導とｍＴＯＲＣ１または本経路の他の要素の阻害剤を組み合わせる治療により有効に処置でき、その薬剤の多くは臨床的に利用可能である。両経路が種々のタイプの悪性腫瘍で高度に変異しているため、フェロトーシス誘導はがん処置に対して多大なる可能性を有する。
【0078】
材料および方法
使用薬剤
ＲＳＬ３(1219810-16-8, Cayman)、Ｔｏｒｉｎ(10997, Cayman)、テムシロリムス(CCI-779, NSC 683864, Selleck)、フェロスタチン－１(17729, Caymen)、ＭＫ－２２０６(S1078, Selleck Chemicals)、ＧＤＣ－０９４１(S1065, Selleck Chemicals)、ＣＡＹ１０５６６(10012562, Cayman Chemicals)、ファトスタチンＡ(4444, Tocris)、SYTOX Green(S7020, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)、ヨウ化プロピジウム(556463, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、BODIPY 581/591 C11(Thermo Fisher, Cat #D3861)、オレイン酸(O1383, Sigma-Aldrich)、ステアリン酸(S4751, Sigma)、パルミチン酸(P0500, Sigma-Aldrich)、パルミトレイン酸(P9417, Sigma)、イミダゾールケトンエラスチン(IKE, HY-114481, MCE)。
使用薬剤
ＲＳＬ３(1219810-16-8, Cayman)、Ｔｏｒｉｎ(10997, Cayman)、テムシロリムス(CCI-779, NSC 683864, Selleck)、フェロスタチン－１(17729, Caymen)、ＭＫ－２２０６(S1078, Selleck Chemicals)、ＧＤＣ－０９４１(S1065, Selleck Chemicals)、ＣＡＹ１０５６６(10012562, Cayman Chemicals)、ファトスタチンＡ(4444, Tocris)、SYTOX Green(S7020, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)、ヨウ化プロピジウム(556463, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、BODIPY 581/591 C11(Thermo Fisher, Cat #D3861)、オレイン酸(O1383, Sigma-Aldrich)、ステアリン酸(S4751, Sigma)、パルミチン酸(P0500, Sigma-Aldrich)、パルミトレイン酸(P9417, Sigma)、イミダゾールケトンエラスチン(IKE, HY-114481, MCE)。
【0079】
細胞培養
KellyをSigma-Adlrichから得た。ＭＥＦ、ＨＴ１０８０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、Ｕ８７ＭＧ、ＨｅｐＧ２、ＰＣ－３、ＤＵ１４５、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＬＮ２２９およびＳＫ－ＭＥＬ－２をAmerican Tissue Culture Collection(ＡＴＣＣ)から得て、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃で、ＡＴＣＣが推奨する培地条件で培養した。培地をMSKCC Media Preparation Core Facilityで調製した。全細胞株は、ＡＴＣＣまたはMSKCC IGO Core Facilityを介するＳＴＲ認証を受けた。
KellyをSigma-Adlrichから得た。ＭＥＦ、ＨＴ１０８０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ４７４、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、Ｕ８７ＭＧ、ＨｅｐＧ２、ＰＣ－３、ＤＵ１４５、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＬＮ２２９およびＳＫ－ＭＥＬ－２をAmerican Tissue Culture Collection(ＡＴＣＣ)から得て、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃で、ＡＴＣＣが推奨する培地条件で培養した。培地をMSKCC Media Preparation Core Facilityで調製した。全細胞株は、ＡＴＣＣまたはMSKCC IGO Core Facilityを介するＳＴＲ認証を受けた。
【0080】
三次元スフェロイドの産生
スフェロイドを、腫瘍細胞を１０３／ウェルでＵ底Ultra Low Adherence(ＵＬＡ)９６ウェルプレート(Corning, Tewksbury, MA, USA)に播種することにより産生した。最適三次元構造を、６００ｇで５分遠心分離し、続いて２.５％マトリゲル(Corning)を加えることにより達成した。プレートを、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度でインキュベートし、細胞の単一スフェロイドを形成させた。次いで、スフェロイドを、マトリゲルを含む新鮮培地中のＲＳＬ３で、示す時間処理した。
スフェロイドを、腫瘍細胞を１０３／ウェルでＵ底Ultra Low Adherence(ＵＬＡ)９６ウェルプレート(Corning, Tewksbury, MA, USA)に播種することにより産生した。最適三次元構造を、６００ｇで５分遠心分離し、続いて２.５％マトリゲル(Corning)を加えることにより達成した。プレートを、７２時間、３７℃、５％ＣＯ２、９５％湿度でインキュベートし、細胞の単一スフェロイドを形成させた。次いで、スフェロイドを、マトリゲルを含む新鮮培地中のＲＳＬ３で、示す時間処理した。
【0081】
細胞死定量および細胞生存能測定
細胞をプレートに適切な細胞密度で播種し、一夜、５％ＣＯ２を含む３７℃でインキュベートし、次いで個々の実験について記載する処理に付した。細胞を総細胞数をモニターするためのhoechst 33342(０.１μg／ml)および細胞死をモニターするためのSytox Green(５nM)で染色した。培養プレートを、示す時点でCytation 5で読んだ。細胞死のパーセンテージを、総細胞数に対するSytox Green陽性細胞数として計算した。３Ｄスフェロイドについて、細胞生存能を市販の細胞生存能アッセイ(Promega, Madison, WI, USA)で、製造業者の指示に従い決定した。生存能を、サンプルのＡＴＰレベルを陰性対照(処理なしの通常の完全培地中のスフェロイド)に対して正規化することにより、計算した。
細胞をプレートに適切な細胞密度で播種し、一夜、５％ＣＯ２を含む３７℃でインキュベートし、次いで個々の実験について記載する処理に付した。細胞を総細胞数をモニターするためのhoechst 33342(０.１μg／ml)および細胞死をモニターするためのSytox Green(５nM)で染色した。培養プレートを、示す時点でCytation 5で読んだ。細胞死のパーセンテージを、総細胞数に対するSytox Green陽性細胞数として計算した。３Ｄスフェロイドについて、細胞生存能を市販の細胞生存能アッセイ(Promega, Madison, WI, USA)で、製造業者の指示に従い決定した。生存能を、サンプルのＡＴＰレベルを陰性対照(処理なしの通常の完全培地中のスフェロイド)に対して正規化することにより、計算した。
【0082】
脂質過酸化反応の測定
脂質過酸化反応をフローサイトメトリーにより分析した。細胞を、適切な密度で６ウェルプレートに播種し、一夜、ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を、指示する処理後、５μM BODIPY C11(Thermo Fisher, Cat# D3861)で３０分間染色した。標識された細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、次いでフローサイトメトリー分析に付した。
脂質過酸化反応をフローサイトメトリーにより分析した。細胞を、適切な密度で６ウェルプレートに播種し、一夜、ＤＭＥＭで増殖させた。細胞を、指示する処理後、５μM BODIPY C11(Thermo Fisher, Cat# D3861)で３０分間染色した。標識された細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、次いでフローサイトメトリー分析に付した。
【0083】
ウェスタンブロット
細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、５％スキムミルク中、１時間、室温でインキュベートし、次いで遮断緩衝液で希釈した一次抗体と４℃で一夜インキュベートした。次の一次抗体を使用した：ＰＴＥＮ(9559L, CST)、ホスホ－Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３(4060, CST)、Ａｋｔ(2920, CST)、βアクチン(Sigma-Aldrich, A1978)、ＧＡＰＤＨ(SC-47724, Santa Cruz)、Ｒａｐｔｏｒ(2280, CST)、Ｒｉｃｔｏｒ(9476, CST)、総Ｓ６Ｋ(2708, CST)、ホスホ－ｐ７０ Ｓ６キナーゼＴｈｒ３８９(9205, CST)、ＡＴＧ５(A0731, Sigma)、ＬＣ３ Ｉ／II(L7543, Sigma)、ＳＲＥＢＰ１(SC-13551, Santa Cruz)、ＳＣＤ１(ab39969, Abcam)、ＦＡＳＮ(3180, CST)、ＡＣＡＣＡ(3662, CST)、ＮＲＦ２(16396-1-AP, Proteintech Group, Inc.)、Ｋｅａｐ１(8047S, CST)、ＧＰＸ４(ab125066, Abcam)およびＣａｓ９(14697S, CST)。３回洗浄後、膜をヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体またはロバ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体(Invitrogen)と室温で１時間インキュベートし、ClarityTMウェスタンＥＣＬ基質(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用する化学発光に付した。Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)を最終検出に使用した。
細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を、５％スキムミルク中、１時間、室温でインキュベートし、次いで遮断緩衝液で希釈した一次抗体と４℃で一夜インキュベートした。次の一次抗体を使用した：ＰＴＥＮ(9559L, CST)、ホスホ－Ａｋｔ Ｓｅｒ４７３(4060, CST)、Ａｋｔ(2920, CST)、βアクチン(Sigma-Aldrich, A1978)、ＧＡＰＤＨ(SC-47724, Santa Cruz)、Ｒａｐｔｏｒ(2280, CST)、Ｒｉｃｔｏｒ(9476, CST)、総Ｓ６Ｋ(2708, CST)、ホスホ－ｐ７０ Ｓ６キナーゼＴｈｒ３８９(9205, CST)、ＡＴＧ５(A0731, Sigma)、ＬＣ３ Ｉ／II(L7543, Sigma)、ＳＲＥＢＰ１(SC-13551, Santa Cruz)、ＳＣＤ１(ab39969, Abcam)、ＦＡＳＮ(3180, CST)、ＡＣＡＣＡ(3662, CST)、ＮＲＦ２(16396-1-AP, Proteintech Group, Inc.)、Ｋｅａｐ１(8047S, CST)、ＧＰＸ４(ab125066, Abcam)およびＣａｓ９(14697S, CST)。３回洗浄後、膜をヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体またはロバ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体(Invitrogen)と室温で１時間インキュベートし、ClarityTMウェスタンＥＣＬ基質(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用する化学発光に付した。Amersham Imager 600(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)を最終検出に使用した。
【0084】
ＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡを、trizol試薬(Invitrogen)を用いて調製した。２０％クロロホルムを各サンプルに加えた。サンプルを１５秒間激しく振盪し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、サンプルを１２,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。水相を新しいチューブに移し、等体積のイソプロパノールを加えた。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、続いて１２,０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ｍＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプログラムは次のとおりであった：９５℃、３０秒間；４０サイクル(各サイクルについて、９５℃、１５秒間；５５℃、４０秒間)。プライマーは次のとおりであった：
総ＲＮＡを、trizol試薬(Invitrogen)を用いて調製した。２０％クロロホルムを各サンプルに加えた。サンプルを１５秒間激しく振盪し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、サンプルを１２,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。水相を新しいチューブに移し、等体積のイソプロパノールを加えた。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、続いて１２,０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。ｍＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプログラムは次のとおりであった：９５℃、３０秒間；４０サイクル(各サイクルについて、９５℃、１５秒間；５５℃、４０秒間)。プライマーは次のとおりであった：
【表1】
【0085】
レンチウイルス介在ｓｈＲＮＡ干渉
ＲＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲをターゲティングするレンチウイルスｓｈＲＮＡクローンをSigma-Aldrichから購入した。レンチウイルスを、ＰＥＩを使用してレンチウイルスベクターとデルタ－ＶＰＲエンベロープおよびＣＭＶ ＶＳＶ－Ｇパッケージングプラスミドを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることにより産生した。培地をトランスフェクション８時間後交換した。上清をトランスフェクション４８時間後回収し、０.４５μmフィルターを篩過した。細胞を感染性粒子と、４μg／mlポリブレン(Sigma-Aldrich)存在下に一夜インキュベートし、細胞に新鮮完全培地を与えた。４８時間後、細胞を適切な抗生物質選択下においた。
ＲＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲをターゲティングするレンチウイルスｓｈＲＮＡクローンをSigma-Aldrichから購入した。レンチウイルスを、ＰＥＩを使用してレンチウイルスベクターとデルタ－ＶＰＲエンベロープおよびＣＭＶ ＶＳＶ－Ｇパッケージングプラスミドを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることにより産生した。培地をトランスフェクション８時間後交換した。上清をトランスフェクション４８時間後回収し、０.４５μmフィルターを篩過した。細胞を感染性粒子と、４μg／mlポリブレン(Sigma-Aldrich)存在下に一夜インキュベートし、細胞に新鮮完全培地を与えた。４８時間後、細胞を適切な抗生物質選択下においた。
【0086】
レトロウイルス介在遺伝子過剰発現
ＳＲＥＢＰ１およびＳＣＤ１の誘導性発現のために、ｃＤＮＡを得て、修飾バージョンのレトロウイルスベクターにサブクローン化した。レトロウイルスを、レトロウイルスベクターとｇａｇ／ｐｏｌおよびＶＳＶ－Ｇを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションして産生した。ウイルスを集め、０.４５μmフィルターを篩過させた。感染細胞を、ハイグロマイシン含有培地で選択した。遺伝子発現を培養培地に１００ng／mlドキシサイクリンを加えて誘導した。
ＳＲＥＢＰ１およびＳＣＤ１の誘導性発現のために、ｃＤＮＡを得て、修飾バージョンのレトロウイルスベクターにサブクローン化した。レトロウイルスを、レトロウイルスベクターとｇａｇ／ｐｏｌおよびＶＳＶ－Ｇを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションして産生した。ウイルスを集め、０.４５μmフィルターを篩過させた。感染細胞を、ハイグロマイシン含有培地で選択した。遺伝子発現を培養培地に１００ng／mlドキシサイクリンを加えて誘導した。
【0087】
誘導性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ＧＰＸ４ノックアウト
レンチウイルスドキシサイクリン(ＤＯＸ)誘導性ｐＣＷ－Ｃａｓ９ベクターおよびｐＬＸ－ｓｇＲＮＡを、誘導性遺伝子ノックアウト(ｉＫＯ)のために使用した。ヒトＧＰＸ４をターゲティングするｓｇＲＮＡ配列はCACGCCCGATACGCTGAGTG(配列番号１９)である。レンチウイルスを２９３Ｔ細胞に封入した。培地をトランスフェクション８時間後交換し、ウイルス含有上清をトランスフェクション４８後集め、濾過した。６ウェル組織培養プレートのＢＴ４７４細胞を、４μg／mLポリブレン含有ｐＣＷ－Ｃａｓ９ウイルス上清で感染させた。細胞を感染４８時間後２μg／mlピューロマイシンで選択した。単一クローンをＤＯＸ誘導性Ｃａｓ９発現についてスクリーニングした。Ｃａｓ９発現をする単一クローンを、４μg／mlポリブレンと共にＧＰＸ４ ｓｇＲＮＡウイルス含有上清で感染させた。細胞を、感染４８時間後１０μg／mlブラストサイジンで選択した。ＤＯＸ誘導性Ｃａｓ９発現およびＧＰＸ４ノックアウトを有する単一クローンを増幅し、使用した。
レンチウイルスドキシサイクリン(ＤＯＸ)誘導性ｐＣＷ－Ｃａｓ９ベクターおよびｐＬＸ－ｓｇＲＮＡを、誘導性遺伝子ノックアウト(ｉＫＯ)のために使用した。ヒトＧＰＸ４をターゲティングするｓｇＲＮＡ配列はCACGCCCGATACGCTGAGTG(配列番号１９)である。レンチウイルスを２９３Ｔ細胞に封入した。培地をトランスフェクション８時間後交換し、ウイルス含有上清をトランスフェクション４８後集め、濾過した。６ウェル組織培養プレートのＢＴ４７４細胞を、４μg／mLポリブレン含有ｐＣＷ－Ｃａｓ９ウイルス上清で感染させた。細胞を感染４８時間後２μg／mlピューロマイシンで選択した。単一クローンをＤＯＸ誘導性Ｃａｓ９発現についてスクリーニングした。Ｃａｓ９発現をする単一クローンを、４μg／mlポリブレンと共にＧＰＸ４ ｓｇＲＮＡウイルス含有上清で感染させた。細胞を、感染４８時間後１０μg／mlブラストサイジンで選択した。ＤＯＸ誘導性Ｃａｓ９発現およびＧＰＸ４ノックアウトを有する単一クローンを増幅し、使用した。
【0088】
構成的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ノックアウトの産生
Ｋｅａｐ１、ＮＲＦ２およびＳＲＥＢＰ１枯渇細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ノックアウト系で産生した。ｓｇＲＮＡ配列をレンチＣＲＩＳＰＲＶ２にクローン化した。ＳＣＤ１枯渇細胞を、安定なＣａｓ９発現細胞およびサンガーＣＲＩＳＰＲクローンを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ノックアウト系で産生した。レンチウイルスを、ＰＥＩを使用してレンチウイルスベクターとｐｓＰＡＸ２(Addgene)およびＶＳＶ－Ｇ(Addgene)を２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることにより産生した。感染細胞をピューロマイシン含有培地で選択して、その後実験に進んだ。この試験で使用したｓｇＲＮＡ配列を下に挙げる：
Ｋｅａｐ１、ＮＲＦ２およびＳＲＥＢＰ１枯渇細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ノックアウト系で産生した。ｓｇＲＮＡ配列をレンチＣＲＩＳＰＲＶ２にクローン化した。ＳＣＤ１枯渇細胞を、安定なＣａｓ９発現細胞およびサンガーＣＲＩＳＰＲクローンを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在ノックアウト系で産生した。レンチウイルスを、ＰＥＩを使用してレンチウイルスベクターとｐｓＰＡＸ２(Addgene)およびＶＳＶ－Ｇ(Addgene)を２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることにより産生した。感染細胞をピューロマイシン含有培地で選択して、その後実験に進んだ。この試験で使用したｓｇＲＮＡ配列を下に挙げる：
【表2】
【0089】
インビボ異種移植マウスモデル
１７－β－エストラジオール６０日間放出ペレットを、腫瘍接種７日前、左脇腹に皮下移植した。ＧＰＸ４ ｉＫＯ ＢＴ４７４細胞を、６～８週齢雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に５×１０６細胞を皮下注射することにより接種した。腫瘍増殖を外的キャリパー測定により定期的にモニターした。腫瘍が意図したサイズに到達したとき、マウスを無作為に４群に分けた：(１)媒体群(媒体毎日ｉ.ｐ.および通常餌)、(２)ＣＣＩ－７７９群(２mg／kgのＣＣＩ－７７９毎日ｉ.ｐ.および通常餌)、(３)Ｄｏｘ群(媒体毎日ｉ.ｐ.およびＤｏｘ餌)、(４)Ｄｏｘ＋ＣＣＩ－７７９群(２mg／kgのＣＣＩ－７７９毎日ｉ.ｐ.およびＤＯＸ餌)。マウスに０.９％無菌食塩水またはＤｏｘ(毎日１００mg／kg体重、ｉ.ｐ.)をＣＣＩ－７７９処置直前に２日間腹腔内注射した。その後、マウスに毎日Ｄｏｘ群およびＤｏｘ＋ＣＣＩ－７７９群についてＤｏｘ餌を、示すとおり、ＣＣＩ－７７９処置を伴いまたは伴わずに与えた。ＣＣＩ－７７９をエタノールに溶解し、無菌水中５％Ｔｗｅｅｎ ８０および５％ＰＥＧ４００の溶液で希釈し、ｉ.ｐ.注射により投与した。腫瘍の最大幅(Ｘ)および長さ(Ｙ)を毎日測定し、体積(Ｖ)を式：Ｖ＝(Ｘ２Ｙ)／２を使用して、計算した。腫瘍増殖を経時的にモニターした。全実験について、マウスを予定した終点で屠殺した。何れかの腫瘍が体積２０００mm３、直径１.５cmまたは体重の１０％を超えたならば、マウスを直ぐに屠殺した。試験終了時、マウスをＣＯ２で屠殺し、腫瘍を摘出して重量測定し、その後免疫組織化学染色した。結果を平均腫瘍体積±ＳＤとして示す。
１７－β－エストラジオール６０日間放出ペレットを、腫瘍接種７日前、左脇腹に皮下移植した。ＧＰＸ４ ｉＫＯ ＢＴ４７４細胞を、６～８週齢雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に５×１０６細胞を皮下注射することにより接種した。腫瘍増殖を外的キャリパー測定により定期的にモニターした。腫瘍が意図したサイズに到達したとき、マウスを無作為に４群に分けた：(１)媒体群(媒体毎日ｉ.ｐ.および通常餌)、(２)ＣＣＩ－７７９群(２mg／kgのＣＣＩ－７７９毎日ｉ.ｐ.および通常餌)、(３)Ｄｏｘ群(媒体毎日ｉ.ｐ.およびＤｏｘ餌)、(４)Ｄｏｘ＋ＣＣＩ－７７９群(２mg／kgのＣＣＩ－７７９毎日ｉ.ｐ.およびＤＯＸ餌)。マウスに０.９％無菌食塩水またはＤｏｘ(毎日１００mg／kg体重、ｉ.ｐ.)をＣＣＩ－７７９処置直前に２日間腹腔内注射した。その後、マウスに毎日Ｄｏｘ群およびＤｏｘ＋ＣＣＩ－７７９群についてＤｏｘ餌を、示すとおり、ＣＣＩ－７７９処置を伴いまたは伴わずに与えた。ＣＣＩ－７７９をエタノールに溶解し、無菌水中５％Ｔｗｅｅｎ ８０および５％ＰＥＧ４００の溶液で希釈し、ｉ.ｐ.注射により投与した。腫瘍の最大幅(Ｘ)および長さ(Ｙ)を毎日測定し、体積(Ｖ)を式：Ｖ＝(Ｘ２Ｙ)／２を使用して、計算した。腫瘍増殖を経時的にモニターした。全実験について、マウスを予定した終点で屠殺した。何れかの腫瘍が体積２０００mm３、直径１.５cmまたは体重の１０％を超えたならば、マウスを直ぐに屠殺した。試験終了時、マウスをＣＯ２で屠殺し、腫瘍を摘出して重量測定し、その後免疫組織化学染色した。結果を平均腫瘍体積±ＳＤとして示す。
【0090】
ＰＣ－３腫瘍モデルについて、５～６週齢雄無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに、右脇腹に５×１０６ ＰＣ－３細胞を注射した。腫瘍を毎日キャリバーで測定した。腫瘍が平均体積２００mm３に達したら、マウスを４群に無作為化した：(１)媒体群(毎日ｉ.ｐ.６５％Ｄ５Ｗ(５％デキストロース水溶液)、５％Ｔｗｅｅｎ－８０、３０％ＰＥＧ－４００)；(２)ＩＫＥ群(毎日ｉ.ｐ.６５％Ｄ５Ｗ(５％デキストロース水溶液に溶解した５０mg／kg ＩＫＥ)、５％Ｔｗｅｅｎ－８０、３０％ＰＥＧ－４００)；(３)ＣＣＩ－７７９群(毎日ｉ.ｐ.２mg／kgのエタノールに溶解し、無菌水中５％Ｔｗｅｅｎ ８０および５％ＰＥＧ４００で希釈したＣＣＩ－７７９)；(４)ＩＫＥ＋ＣＣＩ－７７９群(毎日ｉ.ｐ.５０mg／kg ＩＫＥおよび２mg／kgのＣＣＩ－７７９)。試験終了時、マウスをＣＯ２で屠殺し、腫瘍を摘出して、重量測定した。
【0091】
免疫組織化学
ホルマリン固定、パラフィン包埋標本を集め、日常的Ｈ＆Ｅスライドをまず評価した。抗原回復を、市販の抗原回復系を使用して実施した。免疫組織化学染色を、ウサギ抗ＧＰＸ４、マウス抗Ｋｉ－６７、ウサギ抗ＰＴＧＳ２およびウサギ－抗ｐＳ２３５／２３６ Ｓ６抗体を使用して、５μm厚パラフィン包埋切片で、標準的アビジン－ビオチンＨＲＰ検出系で実施した。組織をヘマトキシリンで対比染色し、脱水和し、マウントした。
ホルマリン固定、パラフィン包埋標本を集め、日常的Ｈ＆Ｅスライドをまず評価した。抗原回復を、市販の抗原回復系を使用して実施した。免疫組織化学染色を、ウサギ抗ＧＰＸ４、マウス抗Ｋｉ－６７、ウサギ抗ＰＴＧＳ２およびウサギ－抗ｐＳ２３５／２３６ Ｓ６抗体を使用して、５μm厚パラフィン包埋切片で、標準的アビジン－ビオチンＨＲＰ検出系で実施した。組織をヘマトキシリンで対比染色し、脱水和し、マウントした。
【0092】
統計解析
全データは、当てはまるならば、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤで表した。群差異を両側ｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、実施した。Ｐ＜０.０５を統計的有意とみなした。
全データは、当てはまるならば、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤで表した。群差異を両側ｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、実施した。Ｐ＜０.０５を統計的有意とみなした。
【0093】
参考文献
1. Stockwell BR, et al. (2017) Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell 171(2):273-285.
2. Dixon SJ, et al. (2012) Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 149(5):1060-1072.
3. Yang WS, et al. (2014) Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell 156(1-2):317-331.
4. Bersuker K, et al. (2019) The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature 575(7784):688-692.
5. Doll S, et al. (2019) FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature 575(7784):693-698.
6. Gao M & Jiang X (2018) To eat or not to eat-the metabolic flavor of ferroptosis. Current opinion in cell biology 51:58-64.
7. Friedmann Angeli JP, Krysko DV, & Conrad M (2019) Ferroptosis at the crossroads of cancer-acquired drug resistance and immune evasion. Nature reviews. Cancer 19(7):405-414.
8. Hassannia B, Vandenabeele P, & Vanden Berghe T (2019) Targeting Ferroptosis to Iron Out Cancer. Cancer cell 35(6):830-849.
9. Zhang Y, et al. (2018) BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature cell biology 20(10):1181-1192.
10. Jiang L, et al. (2015) Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression. Nature 520(7545):57-62.
11. Gao M, et al. (2019) Role of Mitochondria in Ferroptosis. Molecular cell 73(2):354-363 e353.
12. Jennis M, et al. (2016) An African-specific polymorphism in the TP53 gene impairs p53 tumor suppressor function in a mouse model. Genes & development 30(8):918-930.
13. Wang W, et al. (2019) CD8(+) T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy. Nature 569(7755):270-274.
14. Lang X, et al. (2019) Radiotherapy and Immunotherapy Promote Tumoral Lipid Oxidation and Ferroptosis via Synergistic Repression of SLC7A11. Cancer discovery 9(12):1673-1685.
15. Ye LF, et al. (2020) Radiation-Induced Lipid Peroxidation Triggers Ferroptosis and Synergizes with Ferroptosis Inducers. ACS chemical biology 15(2):469-484.
16. Lei G, et al. (2020) The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression. Cell research 30(2):146-162.
17. Viswanathan VS, et al. (2017) Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature 547(7664):453-457.
18. Wu J, et al. (2019) Intercellular interaction dictates cancer cell ferroptosis via NF2-YAP signalling. Nature 572(7769):402-406.
19. Hangauer MJ, et al. (2017) Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature 551(7679):247-250.
20. Shimano H & Sato R (2017) SREBP-regulated lipid metabolism: convergent physiology - divergent pathophysiology. Nature reviews. Endocrinology 13(12):710-730.
21. Horton JD, Goldstein JL, & Brown MS (2002) SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of clinical investigation 109(9):1125-1131.
22. Duvel K, et al. (2010) Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular cell 39(2):171-183.
23. Ruiz R, et al. (2014) Sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) is required to regulate glycogen synthesis and gluconeogenic gene expression in mouse liver. The Journal of biological chemistry 289(9):5510-5517.
24. Ricoult SJ, Yecies JL, Ben-Sahra I, & Manning BD (2016) Oncogenic PI3K and K-Ras stimulate de novo lipid synthesis through mTORC1 and SREBP. Oncogene 35(10):1250-1260.
25. Yecies JL, et al. (2011) Akt stimulates hepatic SREBP1c and lipogenesis through parallel mTORC1-dependent and independent pathways. Cell metabolism 14(1):21-32.
26. Zhang Y, et al. (2017) A Pan-Cancer Proteogenomic Atlas of PI3K/AKT/mTOR Pathway Alterations. Cancer cell 31(6):820-832 e823.
27. Fruman DA, et al. (2017) The PI3K Pathway in Human Disease. Cell 170(4):605-635.
28. Saxton RA & Sabatini DM (2017) mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease. Cell 169(2):361-371.
29. Baba Y, et al. (2018) Protective effects of the mechanistic target of rapamycin against excess iron and ferroptosis in cardiomyocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 314(3):H659-H668.
30. Rojo de la Vega M, Chapman E, & Zhang DD (2018) NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer cell 34(1):21-43.
31. Ichimura Y, et al. (2013) Phosphorylation of p62 activates the Keap1-Nrf2 pathway during selective autophagy. Molecular cell 51(5):618-631.
32. Sun X, et al. (2016) Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology 63(1):173-184.
33. Woo Y, Lee HJ, Jung YM, & Jung YJ (2019) mTOR-Mediated Antioxidant Activation in Solid Tumor Radioresistance. Journal of oncology 2019:5956867.
34. Owen JL, et al. (2012) Insulin stimulation of SREBP-1c processing in transgenic rat hepatocytes requires p70 S6-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(40):16184-16189.
35. Porstmann T, et al. (2008) SREBP activity is regulated by mTORC1 and contributes to Akt-dependent cell growth. Cell metabolism 8(3):224-236.
36. Kamisuki S, et al. (2009) A small molecule that blocks fat synthesis by inhibiting the activation of SREBP. Chemistry & biology 16(8):882-892.
37. Tesfay L, et al. (2019) Stearoyl-CoA Desaturase 1 Protects Ovarian Cancer Cells from Ferroptotic Cell Death. Cancer research 79(20):5355-5366.
38. Magtanong L, et al. (2019) Exogenous Monounsaturated Fatty Acids Promote a Ferroptosis-Resistant Cell State. Cell chemical biology 26(3):420-432 e429.
39. Zhang Y, et al. (2019) Imidazole Ketone Erastin Induces Ferroptosis and Slows Tumor Growth in a Mouse Lymphoma Model. Cell chemical biology 26(5):623-633 e629.
40. Jamaspishvili T, et al. (2018) Clinical implications of PTEN loss in prostate cancer. Nature reviews. Urology 15(4):222-234.
41. Gao M, Monian P, Quadri N, Ramasamy R, & Jiang X (2015) Glutaminolysis and Transferrin Regulate Ferroptosis. Molecular cell 59(2):298-308.
42. Pavlova NN & Thompson CB (2016) The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell metabolism 23(1):27-47.
43. Hoxhaj G & Manning BD (2019) The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nature reviews. Cancer.
44. Zuber J, et al. (2011) Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature biotechnology 29(1):79-83.
1. Stockwell BR, et al. (2017) Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell 171(2):273-285.
2. Dixon SJ, et al. (2012) Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 149(5):1060-1072.
3. Yang WS, et al. (2014) Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell 156(1-2):317-331.
4. Bersuker K, et al. (2019) The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature 575(7784):688-692.
5. Doll S, et al. (2019) FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature 575(7784):693-698.
6. Gao M & Jiang X (2018) To eat or not to eat-the metabolic flavor of ferroptosis. Current opinion in cell biology 51:58-64.
7. Friedmann Angeli JP, Krysko DV, & Conrad M (2019) Ferroptosis at the crossroads of cancer-acquired drug resistance and immune evasion. Nature reviews. Cancer 19(7):405-414.
8. Hassannia B, Vandenabeele P, & Vanden Berghe T (2019) Targeting Ferroptosis to Iron Out Cancer. Cancer cell 35(6):830-849.
9. Zhang Y, et al. (2018) BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature cell biology 20(10):1181-1192.
10. Jiang L, et al. (2015) Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression. Nature 520(7545):57-62.
11. Gao M, et al. (2019) Role of Mitochondria in Ferroptosis. Molecular cell 73(2):354-363 e353.
12. Jennis M, et al. (2016) An African-specific polymorphism in the TP53 gene impairs p53 tumor suppressor function in a mouse model. Genes & development 30(8):918-930.
13. Wang W, et al. (2019) CD8(+) T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy. Nature 569(7755):270-274.
14. Lang X, et al. (2019) Radiotherapy and Immunotherapy Promote Tumoral Lipid Oxidation and Ferroptosis via Synergistic Repression of SLC7A11. Cancer discovery 9(12):1673-1685.
15. Ye LF, et al. (2020) Radiation-Induced Lipid Peroxidation Triggers Ferroptosis and Synergizes with Ferroptosis Inducers. ACS chemical biology 15(2):469-484.
16. Lei G, et al. (2020) The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression. Cell research 30(2):146-162.
17. Viswanathan VS, et al. (2017) Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature 547(7664):453-457.
18. Wu J, et al. (2019) Intercellular interaction dictates cancer cell ferroptosis via NF2-YAP signalling. Nature 572(7769):402-406.
19. Hangauer MJ, et al. (2017) Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature 551(7679):247-250.
20. Shimano H & Sato R (2017) SREBP-regulated lipid metabolism: convergent physiology - divergent pathophysiology. Nature reviews. Endocrinology 13(12):710-730.
21. Horton JD, Goldstein JL, & Brown MS (2002) SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of clinical investigation 109(9):1125-1131.
22. Duvel K, et al. (2010) Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular cell 39(2):171-183.
23. Ruiz R, et al. (2014) Sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) is required to regulate glycogen synthesis and gluconeogenic gene expression in mouse liver. The Journal of biological chemistry 289(9):5510-5517.
24. Ricoult SJ, Yecies JL, Ben-Sahra I, & Manning BD (2016) Oncogenic PI3K and K-Ras stimulate de novo lipid synthesis through mTORC1 and SREBP. Oncogene 35(10):1250-1260.
25. Yecies JL, et al. (2011) Akt stimulates hepatic SREBP1c and lipogenesis through parallel mTORC1-dependent and independent pathways. Cell metabolism 14(1):21-32.
26. Zhang Y, et al. (2017) A Pan-Cancer Proteogenomic Atlas of PI3K/AKT/mTOR Pathway Alterations. Cancer cell 31(6):820-832 e823.
27. Fruman DA, et al. (2017) The PI3K Pathway in Human Disease. Cell 170(4):605-635.
28. Saxton RA & Sabatini DM (2017) mTOR Signaling in Growth, Metabolism, and Disease. Cell 169(2):361-371.
29. Baba Y, et al. (2018) Protective effects of the mechanistic target of rapamycin against excess iron and ferroptosis in cardiomyocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology 314(3):H659-H668.
30. Rojo de la Vega M, Chapman E, & Zhang DD (2018) NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer cell 34(1):21-43.
31. Ichimura Y, et al. (2013) Phosphorylation of p62 activates the Keap1-Nrf2 pathway during selective autophagy. Molecular cell 51(5):618-631.
32. Sun X, et al. (2016) Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology 63(1):173-184.
33. Woo Y, Lee HJ, Jung YM, & Jung YJ (2019) mTOR-Mediated Antioxidant Activation in Solid Tumor Radioresistance. Journal of oncology 2019:5956867.
34. Owen JL, et al. (2012) Insulin stimulation of SREBP-1c processing in transgenic rat hepatocytes requires p70 S6-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109(40):16184-16189.
35. Porstmann T, et al. (2008) SREBP activity is regulated by mTORC1 and contributes to Akt-dependent cell growth. Cell metabolism 8(3):224-236.
36. Kamisuki S, et al. (2009) A small molecule that blocks fat synthesis by inhibiting the activation of SREBP. Chemistry & biology 16(8):882-892.
37. Tesfay L, et al. (2019) Stearoyl-CoA Desaturase 1 Protects Ovarian Cancer Cells from Ferroptotic Cell Death. Cancer research 79(20):5355-5366.
38. Magtanong L, et al. (2019) Exogenous Monounsaturated Fatty Acids Promote a Ferroptosis-Resistant Cell State. Cell chemical biology 26(3):420-432 e429.
39. Zhang Y, et al. (2019) Imidazole Ketone Erastin Induces Ferroptosis and Slows Tumor Growth in a Mouse Lymphoma Model. Cell chemical biology 26(5):623-633 e629.
40. Jamaspishvili T, et al. (2018) Clinical implications of PTEN loss in prostate cancer. Nature reviews. Urology 15(4):222-234.
41. Gao M, Monian P, Quadri N, Ramasamy R, & Jiang X (2015) Glutaminolysis and Transferrin Regulate Ferroptosis. Molecular cell 59(2):298-308.
42. Pavlova NN & Thompson CB (2016) The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell metabolism 23(1):27-47.
43. Hoxhaj G & Manning BD (2019) The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nature reviews. Cancer.
44. Zuber J, et al. (2011) Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature biotechnology 29(1):79-83.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】