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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-06
(54)【発明の名称】自閉症スペクトラムを治療するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20231027BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/194 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/575 20060101ALI20231027BHJP
A61K 31/201 20060101ALI20231027BHJP
A61K 35/745 20150101ALI20231027BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20231027BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20231027BHJP
C12R 1/01 20060101ALN20231027BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74
A61P25/00
A61K31/198
A61K31/194
A61K31/575
A61K31/201
A61K35/745
A61K35/741
C12N1/20 E ZNA
C12R1:01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524192
(86)(22)【出願日】2021-10-19
(85)【翻訳文提出日】2023-06-02
(86)【国際出願番号】 US2021055698
(87)【国際公開番号】W WO2022087030
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】63/093,763
(32)【優先日】2020-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506253388
【氏名又は名称】オレゴン ステイト ユニバーシティー
(71)【出願人】
【識別番号】519336517
【氏名又は名称】セカンド ゲノム インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100175477
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 林太郎
(72)【発明者】
【氏名】川名 祥子
(72)【発明者】
【氏名】シャオチェン イン
(72)【発明者】
【氏名】マリー ぺラス
(72)【発明者】
【氏名】トッド ゼット デサンティス
(72)【発明者】
【氏名】ブリアナ クリスマン
(72)【発明者】
【氏名】デニス ウォール
(72)【発明者】
【氏名】クリスティン タタル
(72)【発明者】
【氏名】モード エム デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドラ ローズ フィリップス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AC20
4B065CA44
4B065CA46
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA11
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4C206MA03
4C206MA04
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4C206MA57
4C206MA63
4C206MA72
4C206ZA01
4C206ZC75
(57)【要約】
グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、５－ドデセン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（ＣＥＧＡＢＡ）などの１以上の代謝物を使用して、かつ／または、１以上の細菌種（例えば、レンサ球菌科、ラクノスピラ科、ルミノコッカス科、バクテロイデス科、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃａｃｅａｅ科および／もしくはパスツレラ科；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａおよび／もしくはＡｇａｔｈｏｂａｃｕｌｕｍ属からの細菌種、またはＢｌａｕｔｉａ ｗｅｘｌｅｒａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖａｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓおよび／もしくはＡｇａｔｈｏｂａｃｕｌｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）を使用して、対象の自閉症スペクトラム障害を処置する方法および組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における自閉症スペクトラム障害の治療方法であって、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される2以上の代謝物を治療有効量含む組成物を対象へ投与することを含む方法。
【請求項2】
組成物が、2、3、4、またはそれ以上の代謝物を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
組成物が、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、またはカルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）を含む、請求項1から2のいずれか1項に記載の方法。
【請求項4】
対象における自閉症スペクトラム障害を治療する方法であって、該方法は、以下からなる群から選択される2種以上の細菌種を含む組成物を対象に投与することを含む：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルクジェラ・マシリアン、プリボテラコプリ、Romboutsia timonensis、Blautia wexlerae、ルミニクロストリジウム・シラエウム、腸内細菌、フェッカリカテナ・ラクタリ、インビジター、及びルミノコッカス カリダス。
【請求項5】
対象における自閉症スペクトラム障害の治療または不安の調節方法であって、該方法は、以下からなる群から選択される細菌科の2種以上の細菌を含む組成物を該対象に投与することを含む：レンサ球菌科、Lachnospiraceae科、ミニコッカス科、バクテロイド科、Butyricicoccaceae科、およびパスツール科。
【請求項6】
前記2種以上の細菌が、以下からなる群から選択される細菌属のものである、請求項5に記載の方法：ストレプトコッカス、ブラウティア、ヘモフィルス、フェーカリバクテリウム、バクテロイデス、ローズブリア、フシカテニバクター、ラクノスピラ、アガトバクラム。
【請求項7】
請求項5～6のいずれか1項に記載の方法であって、2種以上の細菌種が、以下からなる群から選択される細菌種であることを特徴とする：Blautia wexlerae、バクテロイデス・ヴァルガタス、バクテロイデス・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター・サッカリボランス、およびアガットバクラムブチリシプロデュース。
【請求項8】
前記2種以上の細菌種が、以下からなる群から選択される16S rRNAを有する、請求項5～7のいずれか一項に記載の方法：SEQ ID NO 1～13。
【請求項9】
請求項1～8に記載の方法であって、該方法は、被験者からのサンプルにおいて、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することをさらに含む。
【請求項10】
試料が糞便試料である、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することが、被験者からのサンプルにおける細菌遺伝子発現を決定することを含む、請求項9～10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、被験者からのサンプル中の細菌組成を決定することを含む、請求項9～11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することが、アッケシソウ科、ラクノスピラ科、連鎖球菌科、パスツレラ科、ルミノコックス科の細菌種を決定することを含む、請求項9～12のいずれか1項に記載の方法である、被験者からのサンプルで枯渇しているバクテロイデス科、酪農科、レプトコッカス属、ブラウチア属、ヘモフィルス属、フェカリバクテリウム属、バクテロイデス属、ローズブリア属、フシカテニバクター属、ラクノスピラ属、アガソバクラム属またはそれらの組合せである。
【請求項14】
被験者からのサンプルにおいて枯渇している細菌種が、以下からなる群から選択される、請求項13に記載の方法：Blautia wexlerae、バクテロイデス・ヴァルガタス、バクテロイデス・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター・サッカリボランス、およびアガットバクラムブチリシプロデュース。
【請求項15】
自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することが、バクテロイデス科、ラクノスピラ科、オシロスピラ科の細菌種を決定することを含む、請求項9～12のいずれか1項に記載の方法、ウコギ科、エリマキトカゲ科、クリステンセネラ科、バクテリオデス属、ブラウチア属、ホルデマニア属、ボークファルキ属、アナエロティグナム属、フェカリスエット族、またはそれらの組み合わせが被験者からのサンプルに濃縮されている。
【請求項16】
被験者からのサンプルにおいて濃縮される細菌種が、以下からなる群から選択される、請求項15に記載の方法：バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ボルバルキ・セフトリアクセンシス、およびフェーカリカテナ・トルケス。
【請求項17】
対象者が重度の自閉症である、請求項1～16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項18】
重度の自閉症が、モバイル自閉症リスク評価（MARA）を用いて識別される、請求項17に記載の方法。
【請求項19】
請求項1～18のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、1日あたり1回、2回、または3回、該組成物を該対象に投与することを含む。
【請求項20】
組成物が、任意に錠剤、カプセル、粉末、または液体として、経口投与用に処方される、請求項1～19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項21】
本方法は、自閉症スペクトラム障害の別の治療法を被験者に投与することをさらに含む、請求項1～20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
被験者が、自閉症スペクトラム障害であると以前に確認されていた、請求項1～21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項23】
被験者がヒトである、請求項1～22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項24】
グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選ばれた2種類以上の代謝産物を含む組成物をいう。
【請求項25】
組成物が、3つ、4つ、またはそれ以上の代謝産物を含む、請求項24に記載の組成物。
【請求項26】
組成物が、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、カルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）を含む、請求項24～25のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項27】
以下からなる群から選択される2種以上の細菌種を含む組成物である：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルギエラ・マシリアン、プレボテラ・コプリ、ロンバウチア・ティモネンシス、ブラウチア ウェクスラーエ、ルミニクロストリジウム・シラエウム、バクテロイデス・インテスティナリス、フェカリカテナ・ラクタリ、ダイアリスター・インビスカス、及びルミノコッカス カリダス。
【請求項28】
以下からなる群から選択される細菌科の2種以上の細菌を含む組成物：レンサ球菌科、ラクリス菌科、ルミノコッカス科、バクテロイド科、酪酸菌科、およびパスツレラ科。
【請求項29】
前記2種以上の細菌が、以下からなる群から選択される細菌属のものである、請求項28に記載の組成物：ストレプトコッカス、ブラウティア、ヘモフィルス、フェーカリバクテリウム、バクテロイデス、ローズブリア、フシカテニバクター、ラクノスピラ、アガトバクラム。
【請求項30】
１つ以上の細菌種が、以下からなる群から選択される細菌種である、請求項29に記載の組成物：Blautia wexlerae、バクテロイデス・ヴァルガタス、バクテロイデス・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、およびフシカテニバクター・サッカリボランス。
【請求項31】
組成物が、任意に錠剤、カプセル、粉末、または液体として、経口投与のために処方される、請求項24～30のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項32】
請求項24～31のいずれかに記載の組成物であって、該組成物が1日1回、2回、または3回、被験者に投与されることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、2020年10月19日に出願された米国仮出願第63／093，763号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
[連邦政府委託研究明細書]
【0003】
本発明は、米国国立衛生研究所から授与されたDA042954号、 National Institutes of Healthから授与された。政府は、本発明について一定の権利を有している。
【技術分野】
【0004】
本開示は、代謝物、例えば、細菌種からの代謝物、および対象における自閉症スペクトラム障害の治療のための代謝物の使用に関する。
【背景技術】
【0005】
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、社会的・行動的障害を特徴とする神経発達症である。神経症状に加えて、ASD患者は消化器系の異常にも悩まされることが多く、腸内細菌叢とASDの消化器系病態生理との間に関連性がある可能性を示唆している。動物モデルやヒト糞便微生物叢移植試験で因果関係が示唆される中、腸内微生物の代謝が腸脳軸に与える影響は、創薬目的で注目されている。特に、腸内微生物が生産または変換する低分子は、腸内で局所的に作用するだけでなく、腸関門を通過し、さらに血液脳関門を通過して、疾患表現型に関連する脳活動を直接調節できる可能性があるため、注目されている。
【発明の概要】
【0006】
本明細書に提供されるのは、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される2以上の代謝物を治療有効量含む組成物を被験者に投与することを含む被験者の自閉症スペクトラム障害の処置のための方法である。
【0007】
また、本明細書では、（a）対象からのサンプルにおいて自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出すること；および（b）グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコードキシコール酸およびカルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）からなる群から選ばれた1以上の代謝物を含む組成物を対象へ投与することを含む、対象に対する自閉症スペクトラム障害の処置方法が提供されている。
【0008】
いくつかの実施形態では、組成物は、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の代謝産物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、またはカルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）を含有する。
【0009】
また、本明細書では、以下からなる群から選択される2つ以上の細菌種を含む組成物を被験者に投与することを含む、被験者の自閉症スペクトラム障害を治療するための方法が提供される：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルクジェラ・マシリアン、プリボテラコプリ、Romboutsia timonensis、Blautia wexlerae、ルミニクロストリジウム・シラエウム、腸内細菌、フェッカリカテナ・ラクタリ、インビジター、及びルミノコッカス カリダス。
【0010】
また、本明細書では、（a）対象からのサンプルにおいて自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出すること；および（b）以下からなる群から選択される2以上の細菌種を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における自閉症スペクトラム障害の治療方法が提供される：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルクジェラ・マシリアン、プリボテラコプリ、Romboutsia timonensis、Blautia wexlerae、ルミニクロストリジウム・シラエウム、腸内細菌、フェッカリカテナ・ラクタリ、インビジター、及びルミノコッカス カリダス。
【0011】
また、本明細書では、以下からなる群から選択される細菌科の2種以上の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における自閉症スペクトラム障害の治療または不安の変調の方法が提供される：レンサ球菌科、Lachnospiraceae科、ミニコッカス科、バクテロイド科、Butyricicoccaceae科、およびパスツール科。
【0012】
また、本明細書では、（a）対象からのサンプルにおいて自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出すること；および（b）以下からなる群から選択される細菌科の2種以上の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における自閉症スペクトラム障害の治療または不安の調節が提供される：レンサ球菌科、Lachnospiraceae科、ミニコッカス科、バクテロイド科、Butyricoccaceae、およびパスツール科。
【0013】
いくつかの実施形態において、2つ以上の細菌種は、以下からなる群から選択される細菌属のものである：レンサ球菌、ブラウチア菌、ヘモフィルス、フェカリバクテリウム、バクテロイデス、ローズブリア、フシカテニバクター、ラクネスピラ、およびアガットバキューム。いくつかの実施形態において、2つ以上の細菌種は、以下からなる群から選択される細菌種である：Blautia wexlerae、バクテロイデス ・ヴァルガタス、バクテロイデス ・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、及びアガットバキューム 酪酸菌。いくつかの実施形態において、2つ以上の細菌種は、以下からなる群から選択される16S rRNAを有する：SEQ ID NO 1-13。
【0014】
本明細書で提供される方法のいずれかは、対象からのサンプルにおいて自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することも含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料である。
【0015】
いくつかの実施形態では、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、対象からのサンプルにおける細菌遺伝子発現を決定することを含む。いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオーシスを検出することは、対象からのサンプルにおける細菌組成を決定することを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、アッケシソウ科、ラクウショウ科、連鎖球菌科、パスツール科、ルミノコックス科、バクテロイデス科からの細菌種を決定することを含む、酪酸菌科、ストレプトコッカス属、ブラウティア属、ヘモフィルス属、フェカリバクテリウム属、バクテロイデス属、ローズブリア属、フシカテニバクター属、ラクノスピラ属、アガソバクラム属またはそれらの組み合わせであって、対象からの試料において枯渇している。いくつかの実施形態において、対象からのサンプルにおいて枯渇している細菌種は、以下からなる群から選択される：Blautia wexlerae、バクテロイデス ・ヴァルガタス、バクテロイデス ・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、及びアガットバキューム 酪酸菌。
【0017】
いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、バクテロイド科、Lachnospiraceae科、Oscillospiraceae科、Anaerovoraceae科の細菌種を決定することを含んでいる、エリシペロトリカス科、クリステンセネラ科、バクテリオデス属、ブラウティア属、ホルデマニア属、ボルクファルキ属、アネロティグナム属、フェカリカテナ属、またはそれらの組み合わせが、対象からの試料において濃縮される。いくつかの実施形態において、対象からのサンプルにおいて濃縮される細菌種は、以下からなる群から選択される：バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ボルバルキ・セフトリアクセンシス、およびファエカリカテナ・トルケス（Faecalicatena torques）。
【0018】
いくつかの実施形態では、対象は、重度の自閉症を有する。いくつかの実施形態において、重度の自閉症は、モバイル自閉症リスク評価（MARA）を使用して識別される。
【0019】
いくつかの実施形態において、本方法は、1日あたり1回、2回、または3回、組成物を被験者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、任意選択で、錠剤、カプセル、粉末、または液体として、経口投与用に処方される。
【0020】
本明細書で提供される方法のいずれかは、自閉症スペクトラム障害の別の治療法を被験者に投与することも含み得る。
【0021】
いくつかの実施形態では、対象は、自閉症スペクトラム障害を有すると以前に同定された。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
【0022】
また、本明細書では、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される2以上の代謝物を含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、3つ、4つ、またはそれ以上の代謝産物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、カルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）を含有する。
【0023】
また、本明細書では、以下からなる群から選択される2種以上の細菌種を含む組成物も提供される：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルクジェラ・マシリアン、プリボテラコプリ、Romboutsia timonensis、Blautia wexlerae、ルミニクロストリジウム・シラエウム、腸内細菌、フェッカリカテナ・ラクタリ、インビジター、及びルミノコッカス カリダス。
【0024】
また、本明細書では、以下からなる群から選択される細菌科の2種以上の細菌を含む組成物も提供される：レンサ球菌科、Lachnospiraceae科、ミニコッカス科、バクテロイド科、Butyricicoccaceae科、およびパスツール科。いくつかの実施形態において、2つ以上の細菌種は、以下からなる群から選択される細菌属のものである：レンサ球菌、ブラウチア菌、ヘモフィルス、フェカリバクテリウム、バクテロイデス、ローズブリア、フシカテニバクター、ラクネスピラ、およびアガットバキューム。いくつかの実施形態において、2つ以上の細菌種は、以下からなる群から選択される細菌種である：Blautia wexlerae、バクテロイデス ・ヴァルガタス、バクテロイデス ・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、及びアガットバキューム 酪酸菌。
【0025】
いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択で、錠剤、カプセル、粉末、または液体として、経口投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、1日あたり1回、2回、または3回、被験者に投与される。
【0026】
本明細書で使用する場合、活性剤または成分、あるいは薬学的活性剤または成分の「有効量」または「治療上有効量」という語句は、投与時に障害の1つまたは複数の症状を軽減または除去する、または治癒をもたらすのに十分な薬学的活性剤の量を意味する。薬学的活性剤の有効量は、選択された薬学的活性剤の種類、治療される特定の状態または条件、状態の重症度、治療の期間、使用される組成物の特定の成分、および同様の要因によって変化するであろう。
【0027】
「有効量」または「治療上有効な量」の活性剤または成分、あるいは薬学的に活性な剤または成分は、障害の1つまたは複数の症状を軽減または除去するのに十分な、あるいは場合によっては投与により治癒をもたらすのに十分な、2つ以上の活性剤の組み合わせ、または活性剤と別の治療（例えば、行動療法、心理療法、教育療法）との組み合わせの量も指すことがある。例えば、活性剤の「治療上有効な量」とは、自閉症スペクトラム障害の活性剤（複数可）および／または治療薬（複数可）の単独投与と比較して、併用により相加効果または相乗効果が認められる場合の活性剤の組み合わせまたは活性剤と別の治療薬（行動療法、心理療法および教育療法など）との組み合わせの量を指し得る。
【0028】
本明細書で使用する場合、細菌種の「有効量」という表現は、障害の1つまたは複数の症状を軽減または除去するのに十分な、または場合によっては投与時に治癒をもたらすのに十分な細菌種の量を指し得る。細菌種の有効量は、選択された細菌種、治療される特定の状態または条件、状態の重症度、治療の期間、使用される組成物の特定の成分、および同様の因子によって変化する。有効量」はまた、2種以上の細菌種の組み合わせ、または細菌種と別の治療法および／または他の補助療法の組み合わせのうち、障害の1つまたは複数の症状を軽減または除去するのに十分な量、または場合によっては、投与時に治癒をもたらす量を指すことがある。例えば、「有効量」は、自閉症スペクトラム障害の細菌種および／または治療薬（複数可）の単独投与と比較して、組み合わせにより相加効果または相乗効果が観察される場合の、細菌種の組み合わせまたは細菌種と別の治療薬（例えば、治療薬）との組み合わせの量を指すことがある。
【0029】
本明細書において、「被験者」または「患者」とは、診断、予後、または治療が望まれる任意の被験者、特にヒトなどの哺乳類の被験者を指す。
【0030】
本明細書において、疾患、障害、または状態の「治療」または「処置」は、その少なくとも1つの症状の緩和、その重症度の軽減、またはその進行の遅延もしくは抑制を包含する。治療は、疾患、障害、または状態が完全に治癒されることを意味する必要はない。本明細書の有用な組成物は、疾患、障害、または状態の重症度を軽減し、それに関連する1つまたは複数の症状の重症度を軽減し、または患者または被験者の生活の質を改善することだけを必要とする。
【0031】
本明細書で使用される用語「予防する」とは、本明細書に記載される疾患もしくは状態、またはその症状の全部または一部の発症、再発、または拡散を予防することを意味する。
【0032】
用語「投与」または「投与」は、活性剤、またはその組成物、細菌種、またはその組成物、または自閉症スペクトラム障害の治療薬および／または他の補助療法の量を被験者に与える方法を指す。投与方法は、様々な要因、例えば、組成物の成分、疾患の部位、及び疾患の重症度によって変化し得る。
【0033】
"マイクロバイオーム "とは、ある環境から採取された微生物やウイルスおよび／またはその遺伝子の集合体を指す。例えば、"マイクロバイオーム "は、ヒトの胃腸管から採取された微生物およびウイルスおよび／またはその遺伝子の集合体を指すことができる。"微生物群 "とは、特定の環境に存在する微生物を指す。
【0034】
"ディスバイオシス "とは、例えば、対照集団における腸または他の身体領域の微生物叢またはマイクロバイオームの状態と比較して、生態系ネットワークの多様性および／または機能が破壊されている対象（すなわち、宿主）の腸または他の身体領域（例えば、粘膜または皮膚表面または他の任意の微生物叢ニッチ）の微生物叢またはマイクロバイオームの状態を指す。対照集団は、疾患または障害（例えば、対象者と同じ疾患または障害）と診断されていない個人；疾患または障害に対する既知の遺伝的素因を有していない個人（例えば、対象者の治療および／または回復を妨げるような既知の素因を有さない個体、または疾患または障害（例えば、対象者と同じ疾患または障害）に対する既知の環境素因を有さない個体である。いくつかの実施形態では、対照集団の個体は、上記の対照集団の資格のうちの1つを満たす。いくつかの実施形態において、対照集団の個体は、上記の対照集団の資格のうちの2つを満たす。いくつかの実施形態において、対照集団の個体は、上記対照集団の資格のうち3つを満たす。いくつかの実施形態において、制御集団の個体は、上記制御集団の資格のうち4つを満たす。いくつかの実施形態では、対照集団は、資格のうちの少なくとも1つに関して均質である。対照集団の微生物叢または微生物叢と比較して、対象（すなわち、宿主）の微生物叢または微生物叢における任意の崩壊は、そのような異種生物症が対象の健康の検出可能な減少をもたらさないとしても、異種生物症と見なされ得る。対象者のディスバイオシスは、対象者にとって不健康である（例えば、対象者の疾患状態をもたらす）、特定の条件下でのみ対象者にとって不健康である（例えば、特定の条件下でのみ疾患状態をもたらす）、または対象者がより健康になるのを妨げる（例えば、対象者が治療に対する反応または疾患もしくは障害からの回復を妨げる）場合がある。ディスバイオシスは、微生物叢集団組成の多様性の低下（例えば、1つ以上の細菌種の枯渇、1つ以上の細菌種の過剰増殖、またはそれらの組み合わせ）、病原体の1つ以上の集団の過剰増殖（例えば、病原性細菌の集団）または病原体の過剰増殖、被験者に特定の遺伝子および／または環境条件が存在する場合にのみ疾患を引き起こすことができる共生生物の存在および／または過剰増殖、あるいは宿主に有益な機能をもはや提供せず、したがってもはや健康を促進しない生態系ネットワークへのシフトが挙げられる。
【0035】
本明細書で使用する場合、「微生物」または「微生物」という用語は広義にとらえるべきである。これらの用語は互換的に使用され、2つの原核生物ドメインである細菌および古細菌、ならびに真核生物の真菌および原生生物を含むが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、本開示は、"細菌 "または "微生物 "に言及する。この特徴付けは、微生物の同定された分類学的細菌属だけでなく、同定された分類学的種、および細菌種も参照し得る。「株」は、通常、最初の単一コロニーから最終的に派生した培養物の連続からなる純粋培養における単一分離の子孫を含むことができる。いくつかの実施形態では、菌株は、表現型特性、遺伝子型特性、またはその両方によって、同じ属および種の他の単離株と区別することができる単離株または単離株のグループを含む。
【0036】
本明細書で使用される用語「相対的存在量」は、被験者の消化管または他の微生物叢ニッチに存在する全微生物の数または割合に対する、眼球、胎盤、肺、皮膚、泌尿器、または口腔微生物叢ニッチなどの、被験者の消化管または他の微生物叢ニッチに存在する微生物の数または割合のことを言う。相対的存在量はまた、存在する細菌、真菌、ウイルス、および／または原生動物の総数または割合に対する、細菌、真菌、ウイルス、および／または原生動物などの特定のタイプの微生物について決定することができる。相対的存在量は、アレイまたはマイクロアレイハイブリダイゼーション、配列決定、定量PCR、および胃腸管または他の微生物叢ニッチからのサンプルに対して実行されるコロニー形成単位（cfu、CFU）アッセイまたはプラーク形成単位（pfu、PFU）アッセイの培養および実行が含まれるが、これらに限定されない、当業者に容易に知られている多数の方法によって決定することができる。
【0037】
本明細書で使用する場合、微生物に関する「単離」及び「分離」などの用語は、微生物が特定の環境（例えば、胃腸液、胃腸組織、ヒト消化液、ヒト消化組織など）において関連する材料の少なくとも1つから分離されていることを意味することが意図される。したがって、「単離された微生物」は、その自然に発生する環境には存在しない。いくつかの実施形態では、単離された微生物、例えば、細菌種は、例えば、生物学的に純粋な培養物として、またはヒトへの投与に適した薬学的に許容できる賦形剤と関連した芽胞（または細菌種の他の形態）として存在し得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の微生物が単離され得る。例えば、「分離された微生物」は、特定の環境においてそれらが関連する材料の少なくとも1つから分離された2つ以上の微生物の混合物を指すことができる。
【0038】
いくつかの実施形態では、単離された微生物は、単離された生物学的に純粋な培養物として存在する。本明細書で使用される場合、「生物学的に純粋な」という用語は、微生物の種または菌株を含む組成物を指し、ここで、組成物は、微生物が単離または生産された材料および他の微生物（例えば、他の種または菌株および異なる分類の他の微生物）から実質的に遊離されている。いくつかの実施形態において、「生物学的に純粋な」は、細菌種が単離または生産された材料から、および他の微生物、例えば、同じ細菌種の他の株、同じ細菌の他の種、および異なる分類学的分類の他の細菌および／または微生物）から実質的に自由である細菌種の株を含む組成物を指し得る。特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、当該培養物が他の生物を実質的に含まず（科学的理由の範囲内で）、問題の個々の微生物のみを含むことを示すことが、当業者によって理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「実質的にフリー」とは、微生物の種または株を含む組成物が、その微生物が単離または生産された材料および他の微生物から少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％またはそれ以上フリーであることを意味する。いくつかの実施形態では、生物学的に純粋な組成物は、典型的な細菌学的技術によって検出され得る量の他の細菌種を含有しない。
【0039】
本明細書で使用される場合、「プロバイオティック」は、実質的に純粋な微生物（すなわち、単一の単離物）または微生物の混合物を指し、対象における微生物叢またはマイクロバイオームを回復または変更するために、対象（例えば、ヒト）に投与することができる任意の追加成分を含むこともできる。いくつかの実施形態では、プロバイオティックまたは微生物接種剤組成物は、微生物（複数可）が消化管の環境を生き残るように、すなわち、低pHに抵抗するように、および／または消化管環境で成長するようにするための薬剤とともに投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、プロバイオティクスを含む。
【0040】
本明細書で使用される場合、「プレバイオティック」は、1つまたは複数の微生物の数および／または活性を増加させる薬剤を指す。そのような微生物は、被験者の微生物叢またはマイクロバイオームを回復または変化させるための微生物を含み得る。プレバイオティックの非限定的な例としては、フラクトオリゴ糖（例えば、オリゴフラクトース、イヌリン、またはイヌリン型フルクタン）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコールが挙げられる。例えば、Ramirez-Fariasら（2008. Br. J Nutr. 4:1-10）およびPool-ZobelとSauer（2007. J Nutr. 137:2580-2584）を参照。
【0041】
本明細書で使用する「生きた生物治療製品」または「LBP」は、以下の生物学的製品を指す：1）細菌などの生きた生物を含み、2）被験者の疾患または状態の予防、治療、および／または治癒に適用される。
【0042】
2つ以上の細菌、例えば、細菌種の「組み合わせ」は、同じ材料または製品のいずれかにおける、細菌の物理的共存を指すことができる。いくつかの実施形態では、2つ以上の細菌の組み合わせは、2つ以上の細菌の時間的共投与または共局在化を含むことができる。
【0043】
一般に、細菌種のゲノム配列は、16S rRNA配列の複数のコピーを含む。16S rRNA配列は、属、種、および株の区別をするために使用することができる。例えば、16S rRNA配列の1つ以上が参照配列との配列同一性が97％未満である場合、その配列が得られた2つの生物は異なる種または系統である可能性がある。
【0044】
"配列同一性の割合 "は、比較ウィンドウにわたって最適に整列された2つの配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適アライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較のウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を乗じて配列同一性の割合を得ることによって算出する。
【0045】
用語「同一」またはパーセント「同一性」は、2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定された割合を有する2つ以上の配列またはサブセンスを指す（すなわち、後述のデフォルトパラメータを用いたBLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズム、あるいは手動アライメントおよび目視検査によって測定される、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大対応について比較およびアライメントしたときに、約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または指定領域におよぶ高い同一性）（例、参照：、NCBI web site ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ on the world wide web など）。このような配列は、その後、"実質的に同一である "と言われる。 この定義は、試験配列の相補性についても言及し、または適用することができる。また、この定義には、置換を有する配列だけでなく、欠失及び／又は付加を有する配列も含まれる。後述するように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮することができる。好ましくは、長さが少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって同一性が存在し、より好ましくは、長さが50～100アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【0046】
本明細書で使用する用語「併用療法」は、自閉症スペクトラム障害の1つ以上の活性剤（例えば、代謝物）および1つ以上の他の治療法の期間中の投与レジメンを指し、活性剤（複数可）および他の治療法（例えば、行動療法、心理療法、教育療法、プレバイオティクス、プロバイオティクス、またはそれらの組み合わせ）が、医療管理者によって、または規制機関に従って処方される方法で一緒にまたは別々に投与される。当技術分野で理解され得るように、組み合わせ療法は、ある期間、患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、この期間は、以下の1つまたは複数の投与後に生じる：異なる細菌種、異なる治療／治療薬、および治療／治療薬の異なる組み合わせの対象への投与。いくつかの実施形態では、期間は、対象への、異なる活性剤、異なる治療、および治療／治療剤の異なる組み合わせのうちの1つまたは複数の投与の前に生じる。
【0047】
用語「固定組み合わせ」は、本明細書に記載の1つ以上の活性剤、またはその組成物、および少なくとも1つの他の治療法（例えば、プレバイオティクス、プロバイオティクス、またはそれらの組み合わせ）が、ともに単一の組成物または投与量の形態で被験者に同時に投与されることを意味する。
【0048】
非固定組み合わせ」という用語は、本明細書に記載の1つ以上の活性剤、またはその組成物、および少なくとも1つの他の治療薬（例えば、プレバイオティクス、プロバイオティクス、またはそれらの組み合わせ）が、可変の介在する時間制限で被験者に同時にまたは連続して投与され得るように、別々の組成物または用量として処方されていることをいう。これらはまた、カクテル療法、例えば、3つ以上の治療薬の投与にも適用される。
【0049】
用語「約」への言及は、同じ効果を達成することができる量の合理的な変動を許容するための組成物の文脈におけるその通常の意味を有し、また本明細書では、提供される値のプラスまたはマイナス10％の値を指す。例えば、「約20」は、18から22までの量を意味し、またはそれを含む。
【0050】
文脈上別段の定めがない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、特に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、「an」賦形剤は、1つまたは複数の賦形剤を含む。本明細書に記載される本発明の態様および変形は、「からなる」および／または「から本質的になる」態様および変形を含むことが理解される。
【0051】
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0052】
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明で使用するために本明細書に記載されているが、当該技術分野で知られている他の、適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は、例示的なものであり、限定することを意図していない。本明細書に記載されたすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配的となる。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図2】図2は、コホート情報を示す表である。16S NGS：16S rRNAアンプリコンシーケンス、MTG：メタゲノミクス、*MTT：メタトランスクリプトミクスNMR：核磁気共鳴、LC-MS：液体クロマトグラフィー-質量分析計。
【図14】図14は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスの高架式プラス迷路の閉じた腕の中で過ごした時間（秒）をプロットした図である。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図15】図15は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスの高架式プラス迷路の閉じたアームにおける活動時間（秒）のプロットである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図17】図17は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスが毎日移動した総距離をプロットしたものである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図18】図18は、様々な代謝産物を補充した餌を与えたマウスがメイロノ中心で過ごした時間のプロットである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図19】図19は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスの総歩行時間をプロットしたものである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図20】図20は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスの迷路の中心部における歩行時間のプロットである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を補充；GCD＝グリコデオキシコール酸を補充；UDC＝ウルソデオキシコール酸を補充した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図22】図22は、3室社会性試験において、新規マウス（「新」）または既知マウス（「旧」）と過ごした時間をプロットしたものである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を添加；GCD＝グリコデオキシコール酸を添加；UDC＝ウルソデオキシコール酸を添加した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図23】図23は、3室社交性試験において、新規マウスと過ごした時間のプロットである。コントロール＝サプリメント化合物なし；5D＝5-ドデセン酸を添加；GCD＝グリコデオキシコール酸を添加；UDC＝ウルソデオキシコール酸を添加した。有意性はウィルコックス検定で判定した。
【図24】図24は、様々な代謝物を補充した餌を与えたマウスが経時的に移動した平均距離のプロットである。Controlaverage＝サプリメントを含まないコントロールフードを与えられたマウスの平均移動距離；FiveDodecenoateAvg＝5-ドデセン酸を補充したフードを与えられたマウスの平均移動距離；GDC＿Average＝グリコデオキシコール酸を補充したフードを与えられたマウスの平均移動距離；UDC＿Average＝ウルソードキシコール酸を補充したフードを与えられたマウスの平均移動距離。
【図26】図26は、2つの独立した対比方法においてASDコホートと有意に関連するASVsの相対存在量カウントを示すプロットである。ASVsの16Sアンプリコンの分類学的注釈（科、属、種にて）と、3つの時点における少なくとも2つの独立した対比方法（ANCOM及び／又はMetagenomeSeq及び／又はDESeq2）において同定した11分類群についての対応する相対存在量である。
【図27】図27A～27Dは、データの異なるサブセットを使用するバイナリ表現型分類器の性能および可変重要度を示すプロットである。図27Aは、メタデータとASVを用いた予測モデルの性能を示すプロットである。灰色の線は、7フォールドクロスバリデーションにおけるフォールドの間の関係を示す。図27Bは、個々のライフスタイル変数の予測値を示すプロットである。X軸は、変数の除去に伴うジニ指数の変化を示す。図27Cは、ASV入力のみを使用した予測モデルの性能を示すプロットである。11種類のバイオマーカーセット（表4）は、0.66の平均ROC AUCで分類し、追加の関連分類群を追加しても、性能は有意に向上しない。図27Dは、ASVとその分類学的注釈の予測値を示すプロットである。
【図28】図28A～28Cは、不安の変化と相対的な分類群存在量のlog2倍変化との間の相関を示すプロットである。図28Aは、コホート全体にわたって、不安スコアの変化と相関するASVs存在量の変化を示すプロットである。x軸上の正／負の値は、個体内のタイムポイント間の不安の増加／減少をそれぞれ意味する。y軸の正/負の値は、同一個体内のタイムポイント間におけるASVの相対存在量のlog2倍変化の増加/減少を表している。R2およびp値は、スピアマン相関からの結果を表す。図28Bは、両コホートにわたる不安スコアの変化と相関するASVを示すプロットであり、ASDコホートのみを考慮した場合、依然として有意である。図28Cは、ASDコホートにおける不安と負の相関を示すASVが、サンプルのα多様性（Shannon evenness index）と相関することを示すプロットである。
【発明の詳細な説明】
【0054】
本書は、自閉症スペクトラム障害（ASD）を有する被験者を治療するための組成物および方法、ならびに1つまたは複数の代謝物および／または1つまたは複数の細菌種を用いて被験者における自閉症スペクトラム障害の併存疾患（例えば、不安）を変調させるための組成物および方法を提供する。ASDは、社会的コミュニケーションの障害および制限／反復行動を含む行動症状によって特徴付けられ得る、複雑な神経発達性脳障害である。例えば、Eissa ら. Front Neurosci.2018; 12: 304.症状の重症度は大きく異なり、知的障害、てんかん、不安、睡眠、および胃腸障害を含む重大な併存疾患によって複合化することもある。Cheroni ら. Mol Autismを参照。2020; 11: 69.ASDの子どもは、腸内細菌叢の組成に異常があり（腸内細菌叢異常）、それが全身性の炎症や中枢神経系の神経炎につながる可能性があることがエビデンスで示されている。井上ら、2019年参照。J. Clin.Biochem.Nutr. 64, 217-223 を参照されたい。
【0055】
本明細書に提供される方法は、治療上有効な量の代謝物を含む組成物を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される1つまたは複数の（例えば、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上）代謝物を含む治療上有効な量を含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、組成物は、以下からなる群から選択される2つ以上の代謝物（例えば、本明細書に記載の代謝物の任意の2、3、4、5、6、7または全8）の治療上有効量を含む：グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコードキシコーレートおよびカルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）。いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される3以上の代謝物を治療上有効な量で含む。いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコーレート、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコーレート、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）からなる群から選択される4以上の代謝物の治療上有効量を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リンゴ酸塩を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ウルソデオキシコール酸塩を含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、5-ドデセノエートを含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、N-アセチル-L-グルタミン酸を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸塩を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、グリコデオキシコール酸塩を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、CEGABAを含んでなる。
【0058】
いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のグルタミン酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のリンゴ酸塩を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のウルソデオキシコール酸塩を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量の5-ドデセン酸塩を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のN-アセチル-L-グルタミン酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のクエン酸塩を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のグリコデオキシコール酸塩を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のCEGABAを含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、組成物は、グルタミン酸と、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、マレートと、グルタミン酸、ウルソデオキシコーレート、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコーレート、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたは複数とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ウルソデオキシコール酸塩と、グルタミン酸、リンゴ酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたは複数とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、5-ドデセン酸塩と、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上を含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、N-アセチル-L-グルタミン酸と、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、クエン酸塩と、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、ウルソデオキシコーレート、5-ドデセン酸塩、N-アセチル-L-グルタミン酸塩、グリコデオキシコーレート、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、グリコデオキシコール酸塩と、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、CEGABAと、グルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、およびグリコデオキシコール酸の1つまたは複数を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のグルタミン酸と、治療上有効な量のリンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノブチリック酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含んでいる。いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のマレートと、治療上有効な量のグルタミン酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のウルソデオキシコール酸塩と、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノブチル酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の5-ドデセン酸塩と、治療有効量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上を含有する。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のN-アセチル-L-グルタミン酸と、治療有効量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、クエン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のクエン酸塩と、治療有効量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、グリコデオキシコール酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1以上とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、治療上有効な量のグリコデオキシコール酸塩と、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、およびカルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）の1つまたはそれ以上を含んでなる。いくつかの実施形態では、組成物は、治療上有効な量のCEGABAと、治療上有効な量のグルタミン酸、リンゴ酸、ウルソデオキシコール酸、5-ドデセン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、クエン酸、およびグリコデオキシコール酸の1以上を含んでなる。
【0061】
本明細書で提供される方法は、細菌種を含む組成物を被験者に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、以下からなる群から選択される1つまたは複数の細菌種を含む：ビフィドバクテリウム・ビフィダム、エッゲルトヘラ・レンタ、アイゼンベルクジェラ・マシリアン、プリボテラコプリ、Romboutsia timonensis、Blautia wexlerae、ルミニクロストリジウム・シラエウム、腸内細菌、フェッカリカテナ・ラクタリ、インビジター、及びルミノコッカス カリダス、ASV1597 (Faecalicatena lactaris) およびASV876 (Dialister invisus. ) 。いくつかの実施形態において、細菌種は、対照（例えば、本明細書に記載されるようなディスバイオシスとして同定される）と比較して、対象において枯渇している。
【0062】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物に含まれるFaecalicatena lactarisは、16S rRNA遺伝子からのアンプリコン配列決定変異体（ASV）配列が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％．96％、97％、98％、99％）同一であるSEQ ID NO：1（GCAAGCGTTGTCCGAATCTGGTTAAAGGAGCgcaggcggatttgcaagttggaagtgaaacccatgggctcaacccatggactgctcaaaactgcagatctgagtggtagtaggcggaattcccggtaggtagcggtagaatgcagatgatcggggaacacagtggcagcggctgcactaactgacctcgaagcatgt）（ASV1597 ）を示す。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物に含まれるDialister invisusは、16S rRNA遺伝子からのASV配列が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％.96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：2 (GCAAGCGTTAtccggattactgggtgtaaagagcgtagacgggcaagtctgatgtgaagcaggctcaacccctggctgattgaaactgttcatctgagtgccagagtaagcggaattcctagtgtagcggcagtgaaatgcgtagatattagaggaacagtggcagcagcaggtgtgtgtagacagcaggtaactgactgactgacggggggtgagg)。(ASV )。876
【0063】
いくつかの実施形態では、組成物は、以下からなる群から選択される細菌科の1つまたは複数の細菌種を含む：レンサ球菌科、Lachnospiraceae科、ミニコッカス科、バクテロイド科、Butyricicoccaceae科、およびパスツール科。いくつかの実施形態において、組成物は、以下からなる群から選択される細菌属の1つまたは複数の細菌種を含む：レンサ球菌、ブラウチア菌、ヘモフィルス、フェカリバクテリウム、バクテロイデス、ローズブリア、フシカテニバクター、ラクネスピラ、およびアガットバキューム。いくつかの実施形態において、組成物は、Blautia wexlerae、バクテロイデス・ヴァルガタス、バクテロイデス ・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、およびアガットバキューム 酪酸菌を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、組成物は、16S rRNA遺伝子が少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％。96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：3（アカアグCGTTGTCCGAattactgggtgtaaagggcaggcgggagaacaagttgaagtgaaatccatggctcaatgaactgctcaaaactgtttcttgagtagtagcagtaggcgggaattcccggtgtagcggtgagaatgcagatagatcaggaggaacagtgcggcagctacacaactgcgacacacactgagctactcgaagtgt）。
【0065】
いくつかの実施形態では、組成物は、バクテロイデス vulgatusを含み、16S rRNA遺伝子が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％。96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：4（ccgagcgttatccggatttattgggt）である。ttaagggcgtagatgtttaagtcagttgtgaagttgcggctcaaccgtaaaattgcagttgatactggatcttagtgcagttgaggcaggaattcgtgtagcggtgaaatcttagatcagagaactccgattgcagcagctgctaactgacgacgacgacgcggtgcgctaagtgtcagtgtcGaatctaagtgtgtgtaagtgtgtgtaagtgtgt）。いくつかの実施形態では、組成物は、16S rRNA遺伝子が少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％。96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：5（CCGAGCGTTATCCGATTATGGTTTAAAGGGAGCGTAGATGGATGTTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGATATCTTGAGTGCAGTTGAGGCAGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCTAAGCTGCAACTGACATTGAGGCTCGAAAGTGTGGGT).
【0066】
いくつかの実施形態では、組成物は、ローズブリア イヌリニボランが、16S rRNA遺伝子が少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％。96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：6（GCAAGCGTTATCCGATTA）である。ctgggtgtaaagggcaggcggaagctaagtctgatgtgaaagcccggctcaacccggtactgcattgaaactggtcatagagtgtcgggtaagtggaattcctagtgtagcggtaggaatgcagatattaggaggaacagtggcaggcgtgactgactgactgtagaggcggg）。いくつかの実施形態において、組成物は、ローズブリア 腸内細菌を含み、16S rRNA遺伝子が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％である。96％、97％、98％、99％）同一であるSEQ ID NO：7（GCAAGCGTTATCCGATTACT）である。ggtgtaaaggagcgcgcgcgtagcaagtgagtgtgaggcgcagtgcagtgcagtcagtagtagggggggtatgcaatgcccgttttttgcgattaggagcccgggacggcgcccccggggtgcccccggacccctttttttttcgggaggagtgttcagagtcagtagtagtagtagtagtagtagtagtagtggtggtが、aaagctctctcagagagctcが）、aaaggtgtcが
【0067】
いくつかの実施形態では、組成物は、Faecalicatena torquesが、16S rRNA遺伝子が少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％。96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：8 (GCAAGCGTTATCCGGATTTACT GGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGATGGGCAAGTCTGATGTGAAAACCCGGGGCTCAACCCCGGGACTGCATTGGAAACTGTTCATCTAGAGTGCTGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACAGTAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGCGTGGGG).
【0068】
いくつかの実施形態では、組成物は、フシカテニバクター・サッカリボランスを含み、16S rRNA遺伝子が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％．96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：9 (GCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGCAAGGCAAGTCTGATGTGAAAACCCAGGGCTTAACCCTGGGACTGCATTGGAAACTGTCTGGCTCGAGTGCCGGAGAGGTAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACGGTAACTGACGTTGAGGCTCGAAAGCGTGGGG).
【0069】
いくつかの実施形態では、組成物は、16S rRNA遺伝子が少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％...）であるラクネスピラ spp.96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：10 (gcaagcgttatccggatttactgggtg taaagggtgtaggtccatgcaagtcagaagtgaaaatccggctcaacccggaactgcttgaaactgtaagctagtgcaggaggtgtggaattcctagtagcggtgaatggtgtagatcagagattagataggaggaacaccagtggcagaaggcctgactgactgactaacccggggtggtaagcttGAagagtgcggcagcgtgtgagcagcagcagcagcagcagtGagtGAATCATATATATATATATATATATATATATGTACCATATGTACTGAGGAGAGCATCGGCTGCT）。
【0070】
いくつかの実施形態では、組成物は、Lachnospiraceae科ファミリーの種を含み、16S rRNA遺伝子が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％．96％、97％、98％、99％）同一であるSEQ ID NO：11 (GCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGTGTAGGTGGTATCACAAGTCAGAAGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGGACTGCTTTTGAAACTGTGGAACTGGAGTGCAGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGG).
【0071】
いくつかの実施形態では、組成物は、アガットバキューム 酪酸菌が、16S rRNA遺伝子が、少なくとも90％（例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％.96％、97％、98％、99％）と同一であるSEQ ID NO：12（GCAAGCGttatccggatttgggtgtaaagcgcaggcggccggcaagttggaagtgaaatctatggcttaacccataaactgctcaaaactgctgcttgagtgatgagcggcggaattccgtgtagcggtgaatgcgtatagatacagaggaaccagtggcaggcctgacattaactgctcgagggcagcagg)またはSEQ ID NO．13 （GCAAGCGTTATCCGATTActgggtgtaaagggcgcaggcggccggtaagttggaagtgaaatctatggcttaacccataaactgctcaaaactgctcttgagtgagagcaggcggaattccgtgtagcggtgaaatgcgtagatacagaggaacagtggcagcggcggcggcctgactgacattaacggctcggaagcgtgggg）。
【0072】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象からのサンプルにおいて、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを、例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を対象に投与する前に検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料である。いくつかの実施形態では、サンプルは、糞便（stool）サンプル、痰サンプル、唾液サンプル、粘液サンプル、鼻サンプル、鼻咽頭サンプル、口腔サンプル、または呼吸液サンプルである。いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料または便試料である。
【0073】
いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、対象からのサンプル（例えば、糞便サンプル）において細菌遺伝子およびその発現を決定することを含み得る。例えば、細菌遺伝子およびその発現は、例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を被験者に投与する前および／または本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を被験者に投与した後に、被験者からの試料において決定することができる。細菌遺伝子およびその発現を決定することは、例えば、RNAseqおよび／またはRT-qPCRを実行することを含み得る。いくつかの実施形態では、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、対象からのサンプル（例えば、糞便サンプル）中の細菌組成を決定することを含む。例えば、細菌組成は、例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を被験者に投与する前および／または本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を被験者に投与した後に、被験者からの試料において決定することができる。細菌組成を決定することは、例えば、細菌または試料（例えば、糞便または便試料）から1つまたは複数の核酸を配列決定することを含み得る。いくつかの実施形態では、細菌は、その16S rRNA遺伝子配列によって同定することができる。
【0074】
いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、アッケシソウ科、ラクウショウ科、連鎖球菌科、パスツール科、ルミノコックス科、バクテロイデス科からの細菌種を決定することを含む、被験者からのサンプルにおいて枯渇している、ブチコッカス科、ストレプトコッカス属、ブラウティア属、ヘモフィルス属、フェカリバクテリウム属、バクテロイデス属、ローズブリア属、フシカテニバクター属、ラクノスピラ属、アガトバクラム属またはそれらの組み合わせ（e．g.,糞便サンプルにおいて減少している、または被験者の胃腸管において減少している）。いくつかの実施形態において、対象からのサンプルにおいて枯渇している細菌種は、以下からなる群から選択される：Blautia wexlerae、バクテロイデス ・ヴァルガタス、バクテロイデス ・オヴァイタス、ローズブリア イヌリニボラン、ローズブリア 腸内細菌、フシカテニバクター サッカリボランズ、およびアガットバキューム 酪酸菌。いくつかの実施形態において、方法は、枯渇した細菌種を被験者に投与することを含み得る。
【0075】
いくつかの実施形態において、自閉症スペクトラム障害に関連するディスバイオシスを検出することは、バクテロイド科、Lachnospiraceae科、Oscillospiraceae科、Anaerovoraceae科の細菌種を決定することを含んでいる、Eryysipelotrichaceae科、Christensenellaceae科、Bacteriodes属、ブラウチア属、Holdemania属、Borkfalki属、アナエロティグナム属、Faecalicatena属、またはそれらの組み合わせが、対象からのサンプルにおいて濃縮されている（e．g.,は、糞便サンプルにおいて増加し、又は被験者の胃腸管において増加する）。いくつかの実施形態において、対象からのサンプルにおいて濃縮される細菌種は、以下からなる群から選択される：バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ボルバルキ・セフトリアクセンシス、およびフェカリカテナ・トルケス。いくつかの実施形態では、方法は、対象において濃縮された種を枯渇させるための処置、例えば、菌株、種、または属に特異的である抗生物質またはファージを使用することを含み得る。
【0076】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）を対象に1日あたり少なくとも1回投与することを含み得る。例えば、組成物は、1日あたり2回、3回、4回、またはそれ以上投与することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝産物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）を、毎日、隔日、3日おき、または1週間に1回、被験者に投与することを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種の有効量は、1回の用量で、例えば、1日1回投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種の有効量は、1回より多い用量、例えば、1日1回より多い用量で投与される。
【0078】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、ASDの1つまたは複数の他の治療と組み合わせて、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）を投与することを含み得る。ASDの他の治療法の非限定的な例としては、抗精神病薬、抗うつ薬、行動療法、心理療法、教育療法、作業療法、および言語療法が挙げられる。本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）および任意の他の治療法は、一緒に（例えば、同じ製剤で）投与することができ、または細菌種を含む組成物は、1以上の他の治療法と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。
【0079】
いくつかの実施形態では、プレバイオティックおよび／またはプロバイオティックは、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝産物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）と組み合わせて投与され得る。プロバイオティクスの非限定的な例としては、ビフィズス菌（例えば、B. animalis、B. breve、B. lactis、B. longum、B. infantis）、ラクトバチルス（例えば、B. longum、またはB. infantis）の1以上のものが挙げられる、L. acidophilus、L. reuteri、L. bulgaricus、L. lactis、L. casei、L. rhamnosus、L. plantarum、L. paracasei、または L. delbreuckii/bulgaricus）、サッカロミセスブーラディ、大腸菌 Nissle 1917、および 好熱性連鎖球菌。プレバイオティックの非限定的な例としては、フラクトオリゴ糖（例えば、オリゴフラクトース、イヌリン、またはイヌリン型フルクタン）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、またはアルコールが挙げられる。例えば、Ramirez-Fariasら（2008. Br. J Nutr. 4:1-10）およびPool-ZobelとSauer（2007. J Nutr. 137:2580-2584）を参照。
【0080】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）による処置後に対象をモニタリングして、対象において1つまたは複数の症状が緩和されたかどうか、1つまたは複数の症状の重症度が低下したか、疾患の進行が遅延または抑制されたかどうかを判定することを含み得る。自閉症スペクトラム障害の症状の非限定的な例としては、以下が挙げられる：アイコンタクトが少ない、または一貫性がない、人の話を見たり聞いたりしない傾向がある、物を指差したり見せたりして物や活動の楽しさを共有することが少ない、誰かが自分の名前を呼んだり、注意を引こうとする他の言葉に反応しない、または反応が遅い、会話の行き来が難しい、他の人が興味を持っていないことに気づかず、または他の人に答える機会を与えずに好きな話題についてよく長く話す；表情や動作、ジェスチャーが、言われていることと一致しない。g.,数字や詳細、事実など、特定の話題に強い関心を持ち続ける、動くものや物の一部に過度に集中する、日常生活のちょっとした変化に動揺する、光、騒音、衣服、温度などの感覚入力に他の人よりも敏感である、または鈍い。
【0081】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）による処置後に対象をモニタリングして、1つまたは複数の併存症が緩和されたかどうかまたは1つまたは複数の併存症の重症度が軽減されたかどうかを決定することを含み得る。自閉症スペクトラム障害の併存疾患の非限定的な例としては、知的障害、てんかん、不安、睡眠、および胃腸障害が挙げられる。Cheroni ら. Mol Autism.を参照。2020; 11: 69.ASDの治療における本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物又は本明細書に記載の細菌種を含む組成物）を投与することの効力を評価するために利用することができる多数のスコア及び臨床マーカーが存在する。いくつかの実施形態において、対象は、重度の自閉症を有する。いくつかの実施形態では、自閉症の重症度は、Mobile Autism Risk Assessment（MARA）を使用して測定される。例えば、Dudaら、J Autism Dev Disord.を参照されたい。2016; 46: 1953-1961.
【0082】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、自閉症スペクトラム障害のための別の治療法を被験者に投与することを含むことができる。治療法の非限定的な例としては、抗精神病薬（例えば、リスペリドンまたはアリピプラゾール）または刺激剤（例えば、メチルフェニデート、アトモキセチン、またはクロニジン）などの投薬、または行動療法、家族カウンセリング、言語療法および／または教育療法などの療法を挙げることができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）は、1つまたは複数の賦形剤を含み得、対象への投与に適した多数の送達システムのいずれかのために処方することができる。賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、保存剤、安定剤、結合剤、充填剤、潤滑剤、分散促進剤、崩壊剤、潤滑剤、湿潤剤、滑剤、香味剤、甘味料、および着色料が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、錠剤またはカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤などの賦形剤を用いて従来の手段で調製することができる。本明細書に記載の組成物のいずれかを、本明細書に記載のようにASDを治療するために対象に投与することができる。
【0084】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）は、経口送達のために処方され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、錠剤、チュアブル錠剤、カプセル、スティックパック、粉末、発泡性粉末、または液体として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、錠剤として製剤化することができる。いくつかの実施形態では、錠剤はコーティングされており、例えば、錠剤は腸溶性コーティングでコーティングされている。いくつかの実施形態では、錠剤は、定時放出のためのコーティングでコーティングされる。いくつかの実施形態では、錠剤は、即時放出のためのコーティングでコーティングされる。いくつかの実施形態では、錠剤はコーティングされていない。
【0085】
いくつかの実施形態において、 組成物は、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含むコーティングされたビーズを含むことができる。いくつかの実施形態では、代謝産物または細菌種を含む粉末は、投与のために水などの飲用可能な液体に懸濁または溶解させることができる。いくつかの実施形態では、組成物は、固体組成物である。
【0086】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、本明細書に記載の代謝物または本明細書に記載の細菌種を含む組成物）は、代謝物または細菌種の様々な即時および制御放出プロファイルのために処方することができる。例えば、制御放出製剤は、代謝産物または細菌種の上に配置された制御放出コーティングを含むことができる。いくつかの実施形態では、制御放出コーティングは、腸溶性コーティング、半腸溶性コーティング、遅延放出コーティング、またはパルス放出コーティングである。いくつかの実施形態において、コーティングは、活性放出（すなわち、代謝物または細菌種の放出）に適切なラグを提供する場合に好適であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、コーティング（例えば、腸溶性コーティング）を含む錠剤として処方することができる。
【0087】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものでない。
【実施例】
【0088】
例1.自閉症スペクトラム障害に関連する代謝物を同定する。
【0089】
M3コンソーシアム（Metabolite, Microbiome and the Mind）は、遺伝、食事、環境の影響を最小限に抑えるため、同じ年齢層のASD児1人と神経型（NT）兄弟1人を持つ111家族の大規模コホートを募集した。ASD対象者の自閉症の重症度は、Mobile Autism Risk Assessment (MARA)を用いて把握した。さらに、ASDのマイクロバイオームに対する環境要因の影響をさらに調査するために、家族間および家族内のばらつきを評価する365のメタデータ機能を収集した。便サンプルからの腸内細菌は、16S V4 rRNA領域次世代シーケンサー（16S NGS）、16S V1-V9 rRNA PhyloChip（商標登録） DNAマイクロアレイ（16S PC）、全メタゲノムショットガンシーケンサー（MTG）、メタトランスクリプトミクス（MTT）およびメタボロミクス（MTB）などのマルチオミック技術を使ってDNA、RNAおよび代謝物レベルで特徴づけられた。図1参照。
【0090】
マルチテクノロジーメタ解析（MTMA）は、M3コンソーシアムを含む11のASDコホートを用いて、インシリコ予測データと経験的代謝物測定データの両方を組み合わせ、メタ解析を行い、医薬品開発のためのASD関連代謝物を特定するために用いられた（図2）。インシリコによるメタボローム予測は、これらの被験者の糞便サンプルのマイクロバイオームシークエンスデータを使用して行われた。予測には、参照ベースの遺伝子から代謝物への予測戦略と、新たに学習させたモデルを用いた機械学習ベースの戦略の両方が採用された。メタボロームに関する予測結果、および観察された測定メタボロームデータは、ASDに関連する微生物代謝物の差異を特定するために分析され、メタアナリシスが行われた。図3を参照。
【0091】
ASDの重症度は、微生物の組成や機能性と相関があった。図4に示すように、ASDの最も深刻なケースについて、有意に減少したアルファ多様性があった（16S V4データセットにおけるpvalue < 0.05によるスピアマン検定）。図5に示すように、アッケシソウ科（16S PC）（図5A）とRXN A（反応A；MTG BioCyc；3.2.1） の相対存在量（padj ＜0.05、｜Rho｜＞0.3によるスピアマン検定）が有意に減少していた。132-RXN (EC 3.2.1.132 = キトサナーゼ) キトサナーゼは、一部アセチル化したキトサン中のD-グルコサミン残基間のβ-（1->4）-結合のエンド加水分解を触媒する）（図5B）ASDの最も重症の場合について述べた。RXN Aに関連する代謝物（キトサン）は、ディスバイオシスに対する重要な分子として報告されている。例えば、Wang, Jia, Cuili Zhang, Chunmei Guo, and Xinli Liを参照されたい。2019."Chitosan Ameliorates DSS-Induced Ulcerative Colitis Mice by Enhancing Intestinal Barrier Function and Improving Microflora.".International Journal of Molecular Sciences 20 (22). doi.org/10.3390/ijms20225751; Qian, Minyi, Qianqian Lyu, Yujie Liu, Haiyang Hu, Shilei Wang, Chuyue Pan, Xubin Duan, ら. 2019."キトサンオリゴ糖は食事誘発肥満マウスの非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）を改善する。"Marine Drugs 17 (7). doi.org/10.3390/md17070391; Zheng, Junping, Xubing Yuan, Gong Cheng, Siming Jiao, Cui Feng, Xiaoming Zhao, Heng Yin, Yuguang Du, and Hongtao Liu.2018."キトサンオリゴ糖は糖尿病マウスのグルコース代謝の乱れを改善し、腸内細菌叢のディスバイオシスを逆転させる。"カーボハイドレートポリマー 190 (June)：77-86. doi.org/10.1016/j.carbpol.2018.02.058; and Gao, Jing, Md A. K. Azad, Hui Han, and Dan Wan and TieJun Li.2020."Impact of Prebiotics on Enteric Diseases and Oxidative Stress".カレント・ファーマシューティカル・デザイン.2020年5月31日. eurekaselect.com/179241/article. アルファ多様性の低下は、被験者の腸内細菌叢に摂動を引き起こし、症状を際立たせるかもしれない。アッケシソウ科の存在量の減少は、ASDの重症度と関連している。このことは、重度のASDの子どもたちでは、他の子どもたちと比べて、腸管粘液バリアが薄いことを示しているのかもしれない。この結果は、重度のASD児における腸管透過性障害の間接的な証拠を反映しているのかもしれない（Wang ら.）
【0092】
ASDとNTの間の細菌および代謝物組成の有意差は、ASDの胃腸および神経発達症状の根底にあるかもしれない。図6は、3つのタイムポイントにわたるASDおよびNTグループ間の有意に異なる分類群の相対存在量を、属レベルで図6A、種レベルで図6Bで示す（16S V4データセットにおいてpadj<0.05でファミリーIDによって対になったKruskall Wallisテスト）。
【0093】
アナエロティグナム属は3つのタイムポイントにおいて一貫してASDで高い存在感を示し、ブラウチア属は3つのタイムポイントにおいて反対の傾向を示した。ブラウチア属は、いくつかのASD研究において、ASD被験者ではNTと比較して枯渇していることが報告されている。ASD児で検出されたブラウチア属の減少は、便秘と関連している可能性があり、腸内細菌異常の存在を示す証拠となるようだ（Inoue ら., 2019）。Blautia wexlerae種は、3つの時点においてASDで一貫して存在量が低いことが観察された。この種は抗炎症作用を示す（Benitez-Paez ら., 2020. mSystems. 5:2, e00857-19）。
【0094】
図7は、代謝物A（5-ドデセン酸）（図7A）および代謝物B（CEGABA）（図7B）のASD群とNT群間の測定強度を示す図である。ウェルチ検定は、代謝物ごとの最小値としてゼロがインプットされたlog2変換されたデータに対して行われた。
【0095】
代謝物Aは一価不飽和脂肪酸（MUFA）である。他の研究では、自閉症とMUFAの関連性が示されており、Bellらは、対照群と比較して退行性自閉症患者では総MUFAが有意に減少していることを明らかにした（Bell ら. 2010）。
【0096】
メタボライトBは、神経調節物質の生合成における代替代謝経路の中間体である。この神経伝達物質のシグナル伝達の異常が、ASDの症状の根底にあると仮定されている。この神経伝達物質は、他のASD研究でも枯渇していることが判明している。
【0097】
図8は、分類学的情報、ゲノム情報、代謝情報を活用し、メタボロームデータの変動をコミュニティ構成と関連付けた結果を示す図である（Noecker ら. 2016.mSystems.1:1, e00013-15）。図8Aは、アミノ酸および他の代謝物の変動に対する推定細菌寄与者であり、図8Bは、推定細菌寄与者の細菌寄与タイプの要約である。微生物組成（16S V4）からの遺伝子量は、ソフトウェアPiphillinを利用して予測された（Iwai ら.2016.Plos One.11:11, e0166104; Narayan ら. 2020.BMC Genomics.21:56, doi.org/10.1186/s12864-019-6427-1）99% IDカットオフを使用して正規化し、MUSiCCアルゴリズムを利用して、マイクロバイオームゲノム全体の各遺伝子の平均コピー数の推定値を得た（Manor and Borenstein 2015.Genome biology.16:53, doi.org/10.1186/s13059-015-0610-8).
【0098】
アミノ酸のカテゴリーで最も多くの代謝物が微生物の活動に寄与していた。ルミノコックス科ゲンミガー属の無名種とPrevotella copriが最も多くの代謝産物に寄与した。
【0099】
図9は、スピアマン検定（Padj <0.05および｜Rho｜>0.3）を用いてデータセット間の有意な相関を決定し、代謝物A（図9A）および代謝物B（図9B）を中心としたネットワークを構築した一対の相関を示している。Metabolite Aは、ASDグループで有意に枯渇しているBlautia wexlereaと有意に相関している。Metabolite Bは、ASV 1597と有意な相関があり、さらに神経調節経路に関与する微生物遺伝子と関連していることがわかった。
【0100】
以下の代謝物が確認された：
【0101】
1.グルタミン酸：BioCycを参照データベースとして使用する際にMelonnPanパイプライン（Mallick ら, 2019）に基づいてsg_project_id UNFII_FLembo_BIRD18_0289 16Sシーケンスデータから特定され、P値＝3.74E-06、P調整値＝5.53E-05、効果量はウェルチ検定後にベンジャミニ・ホックバーグ調整によりLog2FoldChange（ASD／NT）＝-2.5。
【0102】
2.リンゴ酸：sg_project_id UNFII_FLembo_BIRD18_0289 16S配列データからBioCycとKEGGを参照データベースとして使用した場合、MelonnPanパイプラインに基づき同定。BioCycを参照データベースとして用いた場合、P値＝2.49E-06、P調整値＝3.96E-05、Log2FoldChange（ASD/NT）のEffect size＝-3.3; KEGGを参照データベースとして用いた場合、ウェルチ検定とベンジャミニ・ホックバーグ調整によりP値＝1.81E-06、P調整値＝3.18E-05、Log2FoldChange（ASD/NT）のEffect size＝-2.5 となった。
【0103】
3.ウルソデオキシコール酸塩：BioCycを参照データベースとして使用する際にMelonnPanパイプラインに基づいてsg_project_id UNFII_FLembo_BIRD18_0289 16Sシーケンスデータから特定され、P値=1.85E-06、P調整値=3.82E-05、効果量はWelch検定後にベンジャミニ・ホーチバーグ調整によりLog2FoldChange (ASD/NT) = -1.3である。
【0104】
4. 5-ドデセン酸（12:1n7）：M3メタボロームデータから同定され、P値＝1.17E-05、P adjust v.lue＝0.01 、Log2FoldChange（ASD/NT）における効果量＝-0.8と、ウェルチ検定後にベンジャミニ・ホックベルク調整で算出。
【0105】
5. N-アセチル-L-グルタミン酸：sg_project_id UNFII_FLembo_BIRD18_0289 16SシーケンスデータからBioCycを参照データベースとして使用する際にMelonnPanパイプラインに基づいて同定し、P値=6.65E-06、P調整値=7.18E-05、効果量をWelch検定後にベンジャミニ・ホックバーグ調整によりLog2FoldChange（ASD/NT）で-2.5。
【0106】
6.クエン酸：BioCycを参照データベースとした場合のMelonnPanパイプラインによるメタ解析から同定。P値=0.08、P調整値=0.63、Welch検定とBenjamini-Hochberg調整によるLog2FoldChange (ASD/NT) = -0.4 の効果量。
【0107】
7.グリコデオキシコール酸塩：BioCycを参照データベースとしたMelonnPanパイプラインによるメタ解析で、P値＝0.04、P調整値＝0.63、Log2FoldChange（ASD/NT）における効果量＝-0.04（ウェルチ検定、ベンジャミニ・ホーチベルク調整による）である。
【0108】
8.CEGABA(セガバ)カルボキシエチルアミノ酪酸（CEGABA）は、M3研究において、神経質な兄弟と比較して、自閉症スペクトラム障害の最も重症なケース（Mobile Autism Risk Assessmentスコア<8を持つ51人の被験者）で枯渇していることが判明した。ウェルチ検定（家族IDでペア）をlog2変換したデータで行い、代謝物ごとの最小値としてゼロをインプットし、グループ間で異なる量の代謝物にアクセスした。P値＝2.43e-5、Padjusted値＝0.0233（Padjusted値はBenjamini-Hochberg手順で計算）、Log2FoldChangeの効果量＝-1.18
【0109】
図10は、ASDの最重症例とその神経質な兄弟における代謝物の存在量を比較したWelch検定（家族IDでペア）の結果のボルケーノプロットを示している。CEGABAが最も有意に異なる代謝物であった。図7Bを参照。
【0110】
ASDとNTの違いを比較すると、16S NGSの構成では、菌株レベル（Wald検定）だけでなく、より高い分類学的レベル（Wilcoxon順位和検定）でも有意差が認められたが、16S PCやMTGによる差はなかった。また、MTGとMTTにおけるASDとNTのKEGGまたはBioCycの機能的な違いも特定された。さらに、ASD被験者の重症度（MARAスコア）に関連する細菌組成とKEGGまたはBioCycの機能差が同定された（スピアマンの順位相関とWald検定）。さらに統合的な解析により、NT被験者と比較してASD被験者で有意に存在量が少ない1つの代謝物と相関する特定の微生物分類群およびKEGGまたはBioCycの機能が明らかになった。
【0111】
実施例2.自閉症スペクトラム障害に関連する代謝物が、マウスの脳組織の遺伝子転写に及ぼす影響
【0112】
実施例1で同定した代謝物を用いて、マウス脳内の遺伝子転写パターンやマウス行動に影響を与えるかどうかを調べる実験を行った。
【0113】
マウスには、5-ドデカン酸（5D）、グリコデオキシコール酸（GDC）、ウルソデオキシコール酸（UDC）、または代謝物を添加しないコントロールフード（CTL）を混合した餌を与えた。マウスの体重と消費した餌（chow）の量は毎日記録した。1日目のマウスの体重は、初期のコントロール体重とした。混合飼料による給餌は2日目に開始した。1日目から2日目にかけて、すべてのマウスで体重の大きな減少が観察された。これは、ケージの交換、取り扱い、新しい餌の配置によるものと考えられる。マウスの体重に有意な減少は見られず、これらの化合物が安全であることが示された（図11）。さらに、マウスの餌に混ぜられた代謝物の同一性は、マウスの餌の消費量に影響を与えなかった（図12）。
【0114】
低用量、中用量、高用量のサプリメント代謝物を2週間摂取した12週齢のマウスの前頭前野から、トランスクリプトミクスデータ（RNAシーケンス）を収集した。RNAシーケンシングでは、脳組織を用いて、遺伝子転写の相対的な変化と行動の変化との間に起こりうる相関を評価した。有意水準0.05、0.1、0.15で発現が異なる遺伝子パスウェイの数を決定した（表1）。マウスの脳組織では、様々な代謝物や化合物の補給により、多くの遺伝子の発現が変化した。サプリメントを含まないコントロールフードを与えたマウスの脳組織では、発現に変化は見られなかった。
【0115】
[表１]
【0116】
実施例3．自閉症スペクトラム障害に関連する代謝物のマウスの行動への影響を試験する。
【0117】
マウスは4日間、全食品の80％を非補給食品（チャウ）として与えられた。次の2週間は、マウスに全食品の80%を非補給食品として与え、残りの20%は選択した代謝物（複数可）を添加した。マウスは、5-ドデカセノエート（5D）、グリコデオキシコール酸（GDC）、ウルソデオキシコール酸（UDC）、またはサプリメントを含まない対照食品（CTL）を含む様々な代謝物を補充した食品で飼育された。マウスの行動は、高架式プラス迷路（図13）、3室社交性試験、およびトラッキングホイール使用法を用いて試験された。試験中、マウスは全食品の80％を非補足食品として与えられ、残りの20％は選択された代謝物（複数可）を補充された。
【0118】
高架式プラス迷路の閉じた腕の中で過ごした時間を追跡することで、不安神経症的な行動をテストした。コントロールマウスは、サプリメントを含まない餌を与えられた。5DおよびUDCを補充した餌を与えられたマウスは、コントロールマウスよりも迷路の閉じたアームで過ごした時間が短く（図14）、迷路の閉じたアームでの活動時間が短かった（図15）。GDCを添加した餌を与えられたマウスは、コントロールマウスよりも閉じたアームで有意に多くの時間を過ごすことはなかった。
【0119】
高架式プラス迷路（図16）を用いて、慣れの有無をテストした。5DまたはGDCを補充した餌を与えられたマウスは、3日間にわたって慣れを示した。具体的には、5DまたはGDCを補充した餌を与えられたマウスは、3日間にわたり、より低い総移動距離および探索活性を示した（図17）。対照代謝物を添加した餌を与えたマウスは、2日目と3日目の間に馴化しなかった。UDCは、2日目と比較して3日目の総移動距離を減少させず、馴化の欠如を示した。有意性はANOVA検定で検証した。
【0120】
慣れは、チャンバーの中央で過ごした時間を追跡することによって測定された（図18）。5Dを補充した餌を与えたマウスは、他のすべての処置グループと有意に異なり、時間の経過とともにチャンバーの中心で過ごす時間が増加し、中心への馴化の傾向を示した。コントロールマウスは、時間の経過とともにチャンバーの中央で過ごす時間が短くなり、馴化が進まなかった。
【0121】
また、活動時間は、総歩行時間および中心歩行の時間として測定された。すべてのマウスは、時間の経過とともに総歩行時間が減少したが（図19）、5Dを添加した餌を与えられたマウスは、時間の経過とともに中心歩行の時間が増加し、探索行動を示した（図20）。
【0122】
さらに、代謝物の補給が社会性に及ぼす影響を、3室式社会性試験で測定した（図21）。この実験室では、社会的新奇性に対する反応をテストした。5Dを添加した餌を与えられたマウスは、以前に見たことのあるマウス（「古い」）よりも新しいマウス（「新しい」）と過ごす時間が長く（図22）、異なる処置の中で、新しいマウスと過ごす時間が最も長かった（図23）。
【0123】
[表２]
【0124】
最後に、様々な代謝物を添加した餌を与えたマウスに、マウスホイールを与え、移動距離を追跡した。どのグループも、初期ペースは同じであったが、平均してコントロールグループより有意に遠くまで移動した（図24；表3）。また、GDC、UDC、5Dについては代謝物投与後に夜間の活動量が増加した。
【0125】
[表３]
【0126】
例4.自閉症スペクトラム障害の有無の兄弟姉妹ペアにおける便関連微生物分類群の縦断的研究
【0127】
この例では、片方が自閉症ASD、もう片方が定型発達（TD）の、年齢が一致した100組以上のきょうだい（2～8歳）を募集した（計432サンプル）。4週間にわたって便サンプルを採取し、100以上のライフスタイルおよび食事の変数を追跡し、ASD症状に関連する行動指標を測定した。3つの時点すべてにおいて兄弟間で存在量が有意に異なるアンプリコンシークエンスバリアント（ASV）が117個同定され、そのうち11個は少なくとも2つの対照法によって支持された。さらに、コホート間で有意に異なる食事とライフスタイルの変数が同定され、それらが統計的に関連するASVとさらに関連づけられた。全体として、食事とライフスタイルの特徴は、ロジスティック回帰を用いてASDの表現型を説明するものであったが、グローバルな構成マイクロバイオームの特徴は、そうでなかった。縦断的行動アンケートを活用し、全個体内および全個体にわたる経時的な報告不安の変化と関連する11のASVが同定された。最後に、全体的なマイクロバイオーム構成（β多様性）は、特定のASD関連行動特性と関連していた。
【0128】
図25は、全体的な研究デザインを示している。各兄弟ペアは、1人のASD児とそれぞれのTD兄弟から構成されていた。食事、ライフスタイル、および他のホスト変数が収集された。DADA2パイプラインを使用して、16S V4アンプリコン配列を処理した。親の報告書やホームビデオで検証されていないASDの表現型を持つ兄弟ペアのサンプルは削除され、432サンプルが残された。フリードマン検定でタイムポイント間で有意に変動したASV、または3%以上のサンプルに存在しなかったASVは削除された。TDまたはASDコホートにおいて、117のASVが有意に濃縮されていることが判明した。これらのASVのうち11個は、上記に示した複数の対比法によって同定された。これらの11の有意な分類群の存在量カウントは、Random Forest Modelsの予測因子として使用される。
【0129】
方法
【0130】
募集とデータ収集
【0131】
2人の兄弟がいる家庭で、1人は医療機関でASDと診断されたことがあり、1人は定型発達している家庭が募集された。23カ月から8歳の子どもで、兄弟が2年以内であることが条件とされた。食事、ライフスタイル、人口統計学的情報、ホストヘルスの情報は、各個人の初回および隔週のアンケート（各回収集時）で収集された。一般的な食習慣と、その1週間前の最近の食事摂取量が収集された。合計で1432家族が募集サイトにアクセスした。
【0132】
各兄弟は、2週間の間隔をあけて、3つの便サンプルを提供した。合計701個のサンプルを受け取ったが、23ヶ月未満、現在母乳で育てている人、ASD基準を満たさないASD児（ASD診断の検証参照）を持つ兄弟ペアは削除され、合計72組の兄弟ペアが144人の異なる参加者から432個のサンプルで構成されることになった。
【0133】
自閉症スペクトラムの診断の検証
【0134】
ASDのリスクが高い子どもをスクリーニングするためにデザインされた親が報告する行動アンケート「Mobile Autism Risk Assessment（MARA）」を、ASD参加者から電子的に収集した。
【0135】
さらに、保護者は暗号化されたファイル共有を通じて、ASDのある子どもとない子どもの短いビデオを提出し、30種類の行動特徴についてASD症状の評価を受けた。複数の評価者によるスコアは、以前に発表された機械学習分類器に供給され、ASDリスクスコアを予測した。これらのリスクスコアと親が報告するスクリーニングツール（MARA）、および親が報告する医師の診断を組み合わせ、多数決によるコンセンサスで診断が確定された。コンセンサスが当初の親の診断と一致しなかった3人の子供とそのTD兄弟は除外された。
【0136】
スツールコレクションと収納
【0137】
2週間ごとに、参加者の世話人が付属のトイレ用採取キットでサンプルを採取し、保存用緩衝液（Norgen Biotek, ON, Canada）に入れて室温で返送した。最初のタイムポイントでは、世話人は2つ目のサンプルも採取し、自宅で-20℃で直ちに凍結した後、参加者に提供された2つのアイスパックで夜間に返送した。受け取った便サンプルは、処理するまで-80℃で保存された。
【0138】
DNAの抽出、増幅、塩基配列の決定
【0139】
DNA抽出の前に、便サンプルを解凍し、ペレット化し、上清を除去した。 ペレット化した便サンプルから、MagAttract PowerMicrobiome DNA/RNA Kit（Qiagen）を用いて、KingFisher Flex 96（ThermoFisher）で、製造者の説明書に従ってDNAを抽出した。DNAが品質基準を満たさない場合、Zymo ZR-96 DNA Clean-up kitを使用して追加のDNAクリーンアップ手順を実施した。すべてのサンプルは、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kitで定量化した。16S rRNA V4遺伝子領域の保存領域に対して設計された縮退プライマーを、イルミナのアダプターおよびインデキシングバーコードと融合させて、16S rRNA V4領域を増幅した。アダプター、パッド、リンカーを備えた以下のプライマー配列が使用された：
【0140】
フォワードプライマー：AATGATACGGCGACCGAGATCT ACACTATGTAATTGTGYCAGCMGCCGCGTAA（SEQ ID NO: 14）。
【0141】
リバースプライマー：CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATXXXXXXXXAGTCAGCCGGACTACNVGGTWTCTAAT (SEQ ID NO: 15) （ここで「XXXXXXXXXX」はインデキシングバーコードを表す）。
【0142】
PCR産物はAMPure XPビーズ（Beckman Coulter）を用いて洗浄し、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen）を用いて定量化した。ライブラリーをプールし、MiSeq Reagent Kit v2（500サイクル）とカスタムシーケンスプライマーを用いて、イルミナMiSeqでペアエンドシーケンス（2 x 250 bps）を実行した。サンプルあたり平均157,103リード（最小23,321、最大996,530）を取得した。
【0143】
塩基配列の処理、フィルタリング、分類学的アノテーション
【0144】
DADA2を用いて、フィルタリング、学習エラー、デリプリケーション、アンプリコン配列変異（ASV）推論、キメラ除去のデフォルト設定を適用し、生配列リードを処理した。Truncation Quality (truncQ) は2に設定し、各リードの各末端から10ヌクレオチドがトリミングされた。生リードを処理した結果、サンプルライブラリあたり平均156,246リードが残りました。株レベルのASV割り当てのために、ASVは、USCEARCH（usearch_global）を使用して、株データベース（StrainSelect、secondgenome.com/platform/data-analysis-tools/strainselect on the World Wide Web、バージョン2019（SS19））にマッピングされた。
【0145】
統計解析
【0146】
統計解析はRStudio Server Pro 1.2.5033-1を使用し、Rバージョン3.6.2を用いて実施した。以下のパッケージを使用した：shiny 1.5.0, tibble 3.0.2, data.table 1.13.0, devtools 2.3.1, knitr 1.29, tidyr 1.1.0, reshape2 1.4.4, dplyr 1.0.0, ggplot2 3.3.2, pander 0.6.3, DT 0.14, gridExtra 2.3, adegraphics1.0-15, statistics, smart 3.4-8, caret 6.0-86, randomforest 4.6-14, ROCR 1,0-11, exactRankTests 0.8-31, nlme 3.1-148, compositions 2.0-0, ggpubr 0.4.0, vegan 2.5-6, MetagenomeSeq 1.28.2, DESeq2 1.26.0, biomformat 1.14.0, phyloseq 1.30.0, ANCOM 2.1 はgithub.com/FrederickHuangLin/ANCOM.git からソースを得ている．
【0147】
正規化および分類学的フィルタリング
【0148】
濾過前に、最小読み取り深度2.3 * 104 リード、最大読み取り深度9.9 * 105 リードを達成することができた。サンプルの少なくとも3%に存在しない分類群については削除した。分類群の存在量は、実施したコントラスト分析に応じて、DESeq2またはCumulative Sum Scaling（CSS）を使用して正規化した。DESeq2はCSSよりもファミリー内のグループ内分散を最小化できるため、腸内細菌群集解析ではDESeq2を主要な正規化として使用した。
【0149】
さらに、食事や季節による変化ではなく、核となる表現型の特徴に直接関連する分類群を同定する可能性を高めるため、同一個体内で経時的に有意に変化する分類群を除去した。フリードマン検定を用いて、ASVの存在量を各個体のタイムポイントに依存するものとしてモデル化し、タイムポイントに有意に関連するASV（p < 0.1）を除去した。DESeq正規化データから64個のASVを、CSS正規化データから78個のASVを、非正規化データから72個のASVを削除した。
【0150】
結果
【0151】
11のASVは、少なくとも2つの差分分析法の組合わせによって決定されるように、ASD表現型と有意に関連している
【0152】
合計834個のASV（Amplicon Sequence Variants、DADA2を用いて割り当てられた）のうち、正規化およびろ過後に使用したコントラスト解析手法（DESeq2、MetagenomeSeq、ANCOM、方法参照）の少なくとも1つによってASDとTDコホートの間で有意差があることが確認できたのは117個でした。時間ポイント間で有意であることが判明した117のASVのうち、37がLachnospiraceae科に属していた。Oscillospiraceae科とバクテロイド科は2番目に多いファミリーで、これらのファミリーにはそれぞれ10個のASVが属していた。117個のASVのうち93個がDESEQ2で、28個がMetagenomeSeqで、4個がANCOMで有意なものとして検出された。45個のASVは、アンケートから抽出されたライフスタイルや食事の変数とは関連しなかった。最も注目すべきは、11個のASVが、少なくとも2つの差分解析手法によって同定されたことだ。
【0153】
表4は，2つのコントラスト法で独立して重複検出された11のASVと，該当する場合はそのライフスタイル/食事との関連性をまとめたものである。これらのうち2つはASDコホートとのみ関連し、他の食事やメタデータの共変量はなかった：ホールデマニア属から1つとLachnospiraceae科から1つである。興味深いことに、ブラウチア属は11のASVのうち3つで表現されていた。
【0154】
[表４]
【0155】
図26は、2つの方法によって有意であると同定されたASVの総和スケール存在量バープロットを示している。図26に示すように、11種類の中で最も存在量の多いASVはBlautia wexleraeに属し、NTでは約4％、ASDコホートでは約2.5～3％の相対存在量であった。バクテロイデス テアオタオミクロンと別のブラウチア ASVのASVは、0.005%-0.01%程度の値で、次に高い存在度であった。
【0156】
アノテーションされた属ごとに集計されたASVカウントに対して、3つのコントラスト法を用いて存在量の差の検定が行われた。表1より、有意差のあるASVの多くは、有意差のある属、すなわちバクテロイデス属、ボークファリ属、ヘモフィルス属、連鎖球菌属のメンバーであることが判明した。興味深いことに、Veillonella属は、3つの解析方法すべてにおいて、定型発達の参加者で増加していることが確認された。
【0157】
コホート間のデモグラフィック、食事、ライフスタイルの違い
【0158】
参加した各個人について、331の食事とライフスタイルの変数が記録された。ASDは男性に多く見られることから、ASDコホートの84.7%が男性であったのに対し、TDコホートの52.7%が男性であったことは意外であった。また、ASDコホートとTDコホートの間に人口統計学的な違いはなく、兄弟姉妹は同じ民族として記録されている。
【0159】
331個の変数のうち、合計14個がASDコホートとTDコホートの間で有意な差があった。コホート間のカイ二乗検定で有意なカテゴリー変数は、コホート年齢と帝王切開の出産状況と同様に、表5に示されている。特に、腸機能とGI症状は、ASD参加者で有意に多く観察され、特別な食事療法と栄養補助食品も同様であった（wilcoxon rank sum testまたはway repeated anovasで調整p<.05）。これらの変数のうち6つは、PERMANOVAで検証したBray-Curtis距離メトリックを用いた微生物群集の非類似性とも関連していた。これらの変数は、「食事制限」、「食事補助」、「3ヶ月以内のGI症状」、「今週のGI問題」、「習慣的な果物摂取」、「直近2週間の乳製品摂取」だった。
【0160】
ASDの表現型を説明するのは、グローバルなマイクロバイオーム組成の特徴ではなく、食事・ライフスタイルである
【0161】
ライフスタイル、微生物因子とASD表現型の間の全体的な関連を評価するために、以下のように異なる特徴セットを用いたロジスティック回帰を用いた：1）基本（年齢＋性別）、2）基本＋ライフスタイル／食事変数、3）基本＋マイクロバイオーム特性、4）基本＋ライフスタイル／食事変数＋マイクロバイオーム特性。マイクロバイオームの特徴は、Bray-Curtis距離を用いた主座標の順序に沿ったスコアとして算出した。さらに、特徴を一様にランダムに分布するノイズに置き換えて、ヌルモデルを作成した。
【0162】
ライフスタイル/食生活の変数を含めると、基本的な特徴よりもモデルの説明力が有意に向上した（図27）。マイクロバイオームの特徴は、ランダムなノイズ変数よりも表現型を有意に正確に説明した。ライフスタイルとマイクロバイオームの特徴を組み合わせても、ライフスタイルの特徴より有意に性能が向上することはなかった。
【0163】
[表５]
【0164】
1TDの回答が1件欠落している。2TDとASDの回答が11件欠落しているため、コホートあたり72件中61件がnとなる。3ASDとTDの両方で、2つのタイムポイントでの回答が欠落している。Mタイムポイントごとの食事消費量と不安の測定では、ASDの回答が13件、TDの回答が14件欠落しており、nは203または202となった。*この変数は、タイムポイントごと（2週間ごとに回答する質問）および初回評価時に有意であった。q値の欄は、変数のカテゴリーに基づくウィルコクソン順位和検定、カイ二乗検定、二元反復測定アノバからの調整p値である。年齢と帝王切開の出産状況は、この表に含まれる2つの変数のうち、コホート間で有意差がなかった唯一のものである。年齢は年単位で記載されている。人種人口統計情報および世帯情報は、各兄弟のペアについてコホート間で同じであるため、含まれていない。参加者は全員、米国出身である。
【0165】
相関性の高い変数は回帰モデルを用いて区別するのが難しいため、すべての有意なライフスタイル変数と他のライフスタイル変数の間のピアソン相関行列を計算した（図27B）。パン、マルチビタミン、発酵野菜、オリーブオイルの大量消費は、GI苦痛および非セリアック感受性とともに、ASDの有意な予測因子である。すぐに食べられる食事とは対照的に、家庭で調理された食事は、ASDの表現型およびGI苦痛の両方と逆相関していた。
【0166】
腸内細菌叢内の変動の主要な軸は、年齢と性別の上に追加の説明力を提示しなかったが、いくつかの軸は、表現型と統計的に有意に関連していた。軸の座標とライフスタイル変数の間の相関は、図27Cに見られる。最も注目すべきは、最もばらつきの大きい軸（軸1）に沿ったサンプルの位置がTD表現型と関連しており、この軸に沿ったスコアは、肉、魚介類に加えて、野菜、果物、脂肪/油の消費、および一般的に家庭料理を食べることと相関していた。
【0167】
いくつかの主成分軸は、どのライフスタイル特性とも明らかな相関はないものの、ASDに関連する8つのバイオマーカーまたはTDに関連する3つのバイオマーカーに対して濃縮されていた（図27、表4）。セットを8つのASDまたは3つのTDバイオマーカーとみなす修正遺伝子セット濃縮分析では、特定の有意な軸に沿ったバイオマーカーのスコアが、無作為の偶然によって予想されるよりも歪んでいた（gsea p < .05）（図27D）。
【0168】
11 個体内および個体間で不安スコアと相関する分類群
【0169】
各サンプル採取前の過去2週間における不安は、世話人によって「不安の上昇なし」、「やや上昇」、「上昇」（0、1、2）のスケールで報告された。この指標は、同一人物における不安の経時的変化を測定するために使用され、データの縦断的性質を十分に活用して、報告された不安と関連する特定のASVを特定することができた。10個のASVが有意に負の相関を示し、1個のASVが不安の増大と正の相関を示した（図28A～28B、表6）。酪酸産生菌であるA. 酪酸菌という種からの2つのASVは、ともに不安と負の相関があった。不安と負の相関を示す10個のASVのうち6個は、Lachnospiraceae科のメンバーであった。全コホートで不安と相関が認められたASVのうち3つは、ASDサンプルだけを考慮しても同様に不安と相関があった（図28B）。
【0170】
複数の多様性指標（Chao1、Shannon、FaithPD）は、ASD重症度スコア（MARA）や年齢と相関していたが、ASDとTDコホート間で多様性に有意差はなかった。
【0171】
[表６]
【0172】
ASDコホート内で10の行動変数が微生物構造と関連していること
【0173】
ASDコホートで収集したMobile Autism Risk Assessment（MARA）内の14の行動質問のうち、10が腸内細菌叢組成と有意に関連していた（表7）。有意な行動変数のそれぞれについて、DESEQ2正規化カウントのBray-Curtis距離を用いた制約付きPCOAを作成した。
【0174】
[表７]
【0175】
他の実施形態
【0176】
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことが理解されよう。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26-1】
【図26-2】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【配列表】
【国際調査報告】