特表 2023-546627 バナメイエビのビブリオ抵抗性関連ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーおよびその特異のプライマー並びに検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-06

(54)【発明の名称】バナメイエビのビブリオ抵抗性関連ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーおよびその特異のプライマー並びに検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20231027BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231027BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20231027BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N15/09 Z ZNA

C12Q1/686 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548987

(86)(22)【出願日】2021-05-18

(85)【翻訳文提出日】2023-04-24

(86)【国際出願番号】 CN2021094239

(87)【国際公開番号】W WO2022068215

(87)【国際公開日】2022-04-07

(31)【優先権主張番号】202110405484.8

(32)【優先日】2021-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511282070

【氏名又は名称】中国科学院南海海洋研究所

(71)【出願人】

【識別番号】523153979

【氏名又は名称】広東金陽生物技術有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002468

【氏名又は名称】弁理士法人後藤特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】王 艶紅

(72)【発明者】

【氏名】胡 超群

(72)【発明者】

【氏名】羅 鵬

(72)【発明者】

【氏名】李 卓波

(72)【発明者】

【氏名】李 活

(72)【発明者】

【氏名】任 春華

(72)【発明者】

【氏名】江 暁

(72)【発明者】

【氏名】陳 廷

(72)【発明者】

【氏名】劉 錦上

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA06

4B063QQ02

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、バナメイエビのビブリオ抵抗性関連ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーおよびその特異的プライマー並びに検出方法を開示する。本発明は、構築したトランスクリプトームライブラリーを用いて，Ｌｖ‐Ｖｐ００１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９およびＬｖ‐Ｖｐ０４１とそれぞれ番号付けた６種類の高多型性バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーを開発して取得し、その特異的プライマーをそれぞれ設計する。本発明のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＳＲマーカーおよびプライマーは、バナメイエビ遺伝的多様性の研究および優良品種の育種の支援に使用することができる。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーであって、前記ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカー番号がＬｖ‐Ｖｐ００１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９およびＬｖ‐Ｖｐ０４１であり、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ００１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０１１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０１２のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０２３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０２９のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０４１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される、ことを特徴とするバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカー。

【請求項2】

請求項１に記載のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーの増幅プライマーであって、前記増幅プライマーは、以下を含み、
Ｌｖ‐Ｖｐ００１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ００１‐Ｆ：５’‐ＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＴＡＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ００１‐Ｒ：５’‐ ＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｆ：５’‐ ＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＧＡＡＣＣＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｒ：５’‐ ＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｆ：５’‐ ＡＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｒ：５’‐ ＣＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２３遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ２３‐Ｆ：５’‐ ＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２３‐Ｒ：５’‐ ＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＡＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２９遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ２９‐Ｆ：５’‐ ＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２９‐Ｒ：５’‐ ＴＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴ‐３’、
Ｌｖ‐ Ｖｐ４１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ４１‐Ｆ：５’‐ ＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＴＴＣＣＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ４１‐Ｒ：５’‐ ＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴ‐３’である、ことを特徴とするバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーの増幅プライマー。

【請求項3】

前記増幅プライマーのフォワードプライマーの５’末端に蛍光基が標識されている、ことを特徴とする請求項２に記載の増幅プライマー。

【請求項4】

前記蛍光基はＦＡＭまたはＨＥＸである、ことを特徴とする請求項３に記載の増幅プライマー。

【請求項5】

（１）バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
（２）ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ、上記Ｌｖ‐Ｖｐ００１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ００１‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０２３‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０２９‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０４１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０４１‐Ｆ／Ｒに対してＰＣＲ増幅を行うステップと、
（３）シークエンサーを用いてＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップと、を含む、ことを特徴とするバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーの検出方法。

【請求項6】

前記ＰＣＲ増幅は、その２５μＬの反応系では、Ｍｇ²⁺を含有する１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ、Ｔａｑ宋２ Ｕ、１０μＭフォワードプライマー１μＬ、１０μＭリバースプライマー１μＬ、ＤＮＡテンプレート１０ｎｇを含み、残りは滅菌二重蒸留水を用いて２５μＬまで補充する、ことを特徴とする請求項５に記載の検出方法。

【請求項7】

前記ＰＣＲ増幅は、その反応手順が、９５℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒間変性し、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、１０回繰り返し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３５回繰り返し、７２℃で再び５～８分間伸長することを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の検出方法。

【請求項8】

請求項１に記載のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーまたは請求項２に記載の増幅プライマーの、バナメイエビ集団の遺伝的多様性研究、遺伝子局在化、遺伝連鎖地図の構築、生殖質の同定、種類分類または分子マーカー支援育種への用途。

【請求項9】

抗菌性および／または耐ボーリング性関連のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーまたは増幅プライマーへの用途である、ことを特徴とする請求項８に記載の用途。

【請求項10】

前記抗菌性および／または耐ボーリング性はビブリオ・ハージアヌスおよび／またはエビ肝蛭子に対する耐性である、ことを特徴とする請求項９に記載の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体分子マーカーの技術分野に属し、具体的にバナメイエビのビブリオ抵抗性関連ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーおよびその特異のプライマー並びに検出方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）は、パシフィックホワイトシュリンプ（Ｗｈｉｔｅ ｐａｃｉｆｉｃ ｓｈｒｉｍｐ）とも呼ばれる。野生個体群は、メキシコからチリに至る通常２０Ｃ^o以上の太平洋の沿岸海域に生息し、典型的なトロピカルなエビである。中国の南から北にかけての沿岸部や内陸部で、海水と淡水の両方で養殖されている。現在、バナメイエビは世界一の養殖エビで、世界の養殖エビ生産の約７０％、中国のエビ養殖生産の８０％～９０％を占めている。現在、中国は、年間１６０万トン以上のバナメイエビを生産している。近年、エビ白点症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）病や早期死亡症候群（ＥＭＳ）細菌病などの頻発、養殖水環境の異常変動により、養殖エビが大量に死亡する事態が発生しており、一方で、養殖エビの品質に対する市場の要求もますます高くなっている。市場の変化、病気の流行、育種環境の変化により、耐病性のある新しい育種がますます急務となっている。

【0003】

従来の育種法は、リードタイムが長く、効率が悪いという問題がある。水生分野における現代バイオテクノロジーと遺伝学技術の急速な変容に伴い、形質関連機能遺伝子を用いた分子マーカー技術は、水生遺伝育種のキーテクノロジーの１つとなっている。マイクロサテライト配列（シンプルリピート配列Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ、ＳＳＲ、またはショートタンデムリピート配列ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ, ＳＴＲとも呼ばれる）などの分子マーカー技術に基づく分子マーカー支援育種技術は、現在の水産物育種のキーテクノロジーになっている。抗菌性ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）ベースのＳＳＲマーカーは、現在ほとんど開発されていない。

【発明の概要】

【0004】

本発明の目的は、従来技術の欠点を克服するために、バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーおよびその増幅プライマー、検出方法並びにその用途を提供し、バナメイエビの遺伝的多様性分析および分子マーカーの育種支援に多型性の分子マーカーを提供する。

【0005】

上記発明の目的を達成するために、本発明者らは、ビブリオ・ハージアヌスＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉに感染したバナメイエビ苗からチームが構築したトランスクリプトームライブラリーデータを利用して、構築したシーケンスライブラリーをＢＧＩ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＢＧＩ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、中国・深せん）のＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、 ＵＳＡ）でシーケンシングを行った。データベースから得られたバナメイエビＥＳＴ‐ＳＳＲ配列を利用して、バナメイエビ多型性ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーを開発し、多型プライマーを提供し、バナメイエビの遺伝的多様性研究および優良品種の育種の支援に多型性の分子マーカーを提供することができる。

【0006】

本発明は、ビブリオ・ハージアヌス感染のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＳＲデータベースから、機能予測およびコア領域の繰り返し差の結果に基づいて、５０対のプライマーを選択してバナメイエビのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行い、６対のプライマーが標的バンドを安定的に増幅することができる。３７３０ｘｌ装置を用いてＳＴＲサンプルを検出し、Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒソフトウェアを用いてＳＳＲデータを分析し、最終的に６種類の高多型性バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーを特定することができる。

【0007】

本発明の第１目的は、バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーを提供することであり、前記ＥＳＴ‐ＳＴＲマーカー番号はＬｖ‐Ｖｐ００１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９およびＬｖ‐Ｖｐ０４１であり、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ００１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０１１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０１２のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０２３のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０２９のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、
前記Ｌｖ‐Ｖｐ０４１のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される。

【0008】

本発明の第２目的は、上記のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーの増幅プライマーを提供することであり、前記増幅プライマーは、以下を含み、
Ｌｖ‐Ｖｐ００１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ００１‐Ｆ：５’‐ＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＴＡＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ００１‐Ｒ：５’‐ ＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｆ：５’‐ ＡＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＧＡＡＣＣＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｒ：５’‐ ＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｆ：５’‐ ＡＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｒ：５’‐ ＣＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＧＣ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２３遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ２３‐Ｆ：５’‐ ＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２３‐Ｒ：５’‐ ＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＧＡＴＡＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２９遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ２９‐Ｆ：５’‐ ＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ２９‐Ｒ：５’‐ ＴＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴ‐３’、
Ｌｖ‐ Ｖｐ４１遺伝子座の場合：
Ｌｖ‐Ｖｐ４１‐Ｆ：５’‐ ＣＴＴＴＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣＴＴＴＣＣＡ‐３’、
Ｌｖ‐Ｖｐ４１‐Ｒ：５’‐ ＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴ‐３’。

【0009】

好ましくは、前記増幅プライマーのフォワードプライマーの５’末端に蛍光基が標識されている。

【0010】

好ましくは、前記蛍光基はＦＡＭまたはＨＥＸである。

【0011】

本発明の第３目的は、バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーの検出方法を提供することであり、この方法は、
（１）バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
（２）ステップ（１）で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、それぞれ上記のＬｖ‐Ｖｐ００１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ００１‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０１１‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０１２‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０２３‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０２９‐Ｆ／Ｒ、Ｌｖ‐Ｖｐ０４１遺伝子座の場合のプライマーを用いてＬｖ‐Ｖｐ０４１‐Ｆ／Ｒに対してＰＣＲ増幅を行うステップと、
（３）シークエンサーを用いてＰＣＲ増幅産物をタイピングするステップと、を含む。

【0012】

好ましくは、前記ＰＣＲ増幅は、その２５μＬ反応系では、Ｍｇ²⁺を含有する１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ、Ｔａｑ宋２Ｕ、１０μＭフォワードプライマー１μＬ、１０μＭリバースプライマー１μＬ、ＤＮＡテンプレート１０ｎｇを含み、残りは滅菌二重蒸留水で２５μＬまで補充する。

【0013】

好ましくは、前記ＰＣＲ増幅は、その反応手順は、９５℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒間変性し、６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、１０回繰り返し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３５回繰り返し、７２℃で再び５～８分間伸長することを含む。

【0014】

本発明の第４目的は、上記のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーまたは増幅プライマーの、バナメイエビ集団遺伝的多様性研究、遺伝子局在化、遺伝連鎖地図の構築、生殖質の同定、種類分類または分子マーカーの育種支援への用途を提供することである。

【0015】

好ましくは、前記用途は、抗菌性および／または耐ボーリング性関連のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーまたは増幅プライマー中の応用。

【0016】

好ましくは、前記抗菌性および／または耐ボーリング性はビブリオ・ハージアヌスおよび／またはエビ肝蛭子に対する耐性である。

【0017】

本発明は、ＮＣＢＩデータベースから得られたバナメイエビＥＳＴ配列を利用して、６種類の高多型性バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーを開発し、番号がそれぞれＬｖ‐Ｖｐ００１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９およびＬｖ‐Ｖｐ０４１である。本発明のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーは、バナメイエビ遺伝的関係分析および分子マーカーの育種支援に利用でき、バナメイエビの遺伝的多様性研究および優良品種の育種の支援の基礎を築くことができる。

【0018】

本発明により発現されたバナメイエビ抗菌性状関連の分子マーカーは、強い抗菌能力を有するバナメイエビの種苗のスクリーニングや優れた抗菌種のスクリーニングに大きな価値を有すると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】Ｌｖ‐Ｖｐ００１遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【図2】Ｌｖ‐Ｖｐ０１１遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【図3】Ｌｖ‐Ｖｐ０１２遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【図4】Ｌｖ‐Ｖｐ０２３遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【図5】Ｌｖ‐Ｖｐ０２９遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【図6】Ｌｖ‐Ｖｐ０４１遺伝子座のプライマーで増幅された２０匹のバナメイエビのゲノムＤＮＡのＳＴＲタイピング図であり、Ｓ１～Ｓ２０は２０個のサンプルを表す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下の実施例は本発明のさらなる説明であり、本発明の制限ではない。

【0021】

以下の実施例中の実験方法は、特に指定しない限り、通常の方法またはキットの説明書に従った方法である。以下の実施例で使用される材料、試薬などは、特に指定しない限り、市販されているものである。プライマー合成およびシーケンシングは上海生物工学有限公司によって行われた。

【0022】

実施例１：
１、バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲ配列のスクリーニング
本発明はビブリオ・ハージアヌス感染のバナメイエビＥＳＴ‐ＳＳＲデータベースから、病気関連の機能予測およびコア領域の繰り返し差の結果に基づいて、５０対のＥＳＴ‐ＳＴＲプライマー（表１に示す）を選択して多型スクリーニングを行う。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【0023】

２、バナメイエビＥＳＴ‐ＳＴＲマーカープライマーのスクリーニングおよび結果分析

【0024】

２．１ バナメイエビのゲノムＤＮＡの抽出
ＤＮＡサンプルはそれぞれビブリオ感受性個体５個、非感受性個体５個、エビ肝蛭子耐性個体、対照５個、合計２０個サンプルであり、表２はサンプル状況を示し、広東省の深せん、珠海、湛江、徐聞、茂名などの２０個の農場からそれぞれバナメイエビ２０匹を選び、それぞれ筋肉組織を採取し、海洋動物組織ゲノムＤＮＡ抽出キット（天根生物化学科学技術有限公司、北京）を用いてバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出し、操作手順は説明書に従って厳密に実施された。ゲノムＤＮＡの定量はＮａｎｏＤｒｏｐ^TM２０００分光光度計で行い、品質はアガロース電気泳動で検出された。

【表2】

２．２プライマーの初期スクリーニング

【0025】

上記で抽出されたバナメイエビのゲノムＤＮＡからの５個をテンプレートとしてランダムに選択し、それぞれ表１中の５０対プライマーを用いてこのゲノムＤＮＡに対してＰＣＲグラディエント増幅を行い、２５μＬ反応系では、Ｍｇ²⁺を含有する１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μＬ、Ｔａｑ宋２Ｕ、１０μＭフォワードプライマー１μＬ、１０μＭリバースプライマー１μＬ、ＤＮＡテンプレート１０ｎｇを含み、残りは滅菌二重蒸留水で２５μＬまで補充する。反応手順は、９５℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒間変性し、５０℃～６０℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、１０回繰り返し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長し、３５回繰り返し、７２℃で再び５～８分間伸長することを含む。

【0026】

ＰＣＲ増幅産物を２％アガロース電気泳動で検出したところ、６対プライマーが特定のアニーリング温度下でバンドを安定的に増幅した。それぞれ増幅産物をシーケンシングした結果、この６対プライマーはいずれも標的バンドを増幅することができ、遺伝子座がそれぞれ：Ｌｖ‐Ｖｐ００１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される）およびＬｖ‐Ｖｐ０４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される）である。スクリーニングしたプライマーは表３に示される。

【表3】

【0027】

２．３多型プライマーのスクリーニングおよび結果分析
上記初期スクリーニングした６対プライマーのうち、上流プライマーの５’末端をそれぞれＦＡＭとＨＥＸで蛍光標識し、上記で抽出された２０個バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。反応系はステップ２．２と同様であり、反応手順は、アニーリング温度を６０℃とした以外にステップ２．２に記載のとおりである。ＰＣＲ増幅産物を３７３０ＸＬシークエンサーを用いてタイピングし、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ３．２ソフトウェアを用いてアレリックフラグメントの具体的な値を読み取り、多型バナメイエビ機能遺伝子を有する６種類のＥＳＴ‐ＳＴＲマーカー（図１～６を参照）を特定し、遺伝子座がそれぞれ：Ｌｖ‐Ｖｐ００１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される）、Ｌｖ‐Ｖｐ０２９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される）およびＬｖ‐Ｖｐ０４１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される）である。

【0028】

Ｃｅｒｖｕｓ３．０ソフトウェアを用いて予想ヘテロ接合度、観察ヘテロ接合度および多型情報量（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ、ＰＩＣ）を計算した。結果から分かるように、上記６種類の多型マイクロサテライトマーカーのアレリック数がそれぞれ５、２、１４、６、９および４であり、観察ヘテロ接合度がそれぞれ０．４５、０．００、０．３５、０．７０、０．６０および０．２０であり、予想ヘテロ接合度がそれぞれ０．７６５４、０．１８４６、０．９０１３、０．８２３１、０．８５００および０．６６７９であり、ＰＩＣ値がそれぞれ０．７０４０、０．１６３８、０．８６８７、０．７７３８、０．８０７１および０．５８３４であり（表４）、Ｌｖ‐Ｖｐ０１１以外に、すべて０．５よりも大きく、これは、６種類のＥＳＴ‐ＳＴＲマーカーがいずれも多型性を有し、バナメイエビの遺伝的関係分析および分子マーカーの育種支援に使用可能であることをを示す。

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】