▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-07
(54)【発明の名称】活性が増強されたナチュラルキラー細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20231030BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231030BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231030BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231030BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231030BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231030BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
A61K35/17
A61P37/04
A61P35/00
C12N5/10
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023522387
(86)(22)【出願日】2021-10-27
(85)【翻訳文提出日】2023-06-08
(86)【国際出願番号】 US2021056761
(87)【国際公開番号】W WO2022093901
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/105,978
(32)【優先日】2020-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508228061
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】カウフマン，ダン エス．
(72)【発明者】
【氏名】ヤマモト，ケンタ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
【要約】
内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子の不活性化変異を含む、操作された免疫細胞、任意選択的に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する、幹細胞、任意選択的に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から産生される、ＡＤＡＭ１７欠損免疫細胞。当該操作された免疫細胞を含む医薬組成物。操作された免疫細胞及び医薬組成物を作製するための方法、並びに使用方法が提供される。
【選択図】図２
内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子の不活性化変異を含む、操作された免疫細胞、任意選択的に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する、幹細胞、任意選択的に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から産生される、ＡＤＡＭ１７欠損免疫細胞。当該操作された免疫細胞を含む医薬組成物。操作された免疫細胞及び医薬組成物を作製するための方法、並びに使用方法が提供される。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を含む、操作された免疫細胞。
【請求項2】
前記操作された免疫細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の免疫細胞である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項3】
前記操作された免疫細胞が、末梢血（ＰＢ）由来の免疫細胞である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項4】
前記操作された免疫細胞が、臍帯血（ＣＢ）由来の免疫細胞である、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
【請求項5】
前記操作された免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項6】
前記ＡＤＡＭ１７不活性化変異が、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックアウトである、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項7】
前記操作された免疫細胞が、ＡＤＡＭ１７－／－免疫細胞である、請求項６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項8】
前記ＡＤＡＭ１７不活性化変異が、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックダウンである、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項9】
前記操作された免疫細胞が、ＣＤ５６＋、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、ＮＫｐ４４＋、及びＮＫｐ４６＋である、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項10】
前記操作された免疫細胞が、刺激剤による刺激後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１６ａ、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の増加した発現を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項11】
前記操作された免疫細胞におけるＣＤ１６ａの発現が、培養物中での増殖中に少なくとも約６週間、安定して維持される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項12】
前記免疫細胞が、ヒト免疫細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞のうちの１つ以上を含む、精製細胞組成物。
【請求項14】
操作された免疫細胞の少なくとも約７１％が、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する、請求項１３に記載の精製細胞組成物。
【請求項15】
操作された免疫細胞の少なくとも約４２％が、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する、請求項１３又は１４に記載の精製細胞組成物。
【請求項16】
前記操作された免疫細胞が、疾患細胞株及び前記疾患細胞株に特異的な抗体と共インキュベーションした後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１０７ａ及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の増加した発現を有する、請求項１３に記載の精製細胞組成物。
【請求項17】
前記疾患細胞株が、Ｂリンパ腫細胞株であり、前記疾患細胞株に特異的な前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項１６に記載の精製細胞組成物。
【請求項18】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、請求項１７に記載の精製細胞組成物。
【請求項19】
前記操作された免疫細胞が、ＣＤ１０７ａの少なくとも約４５％増加した発現を示す、請求項１７又は１８に記載の精製細胞組成物。
【請求項20】
前記操作された免疫細胞が、ＩＦＮγの少なくとも約３６％増加した発現を示す、請求項１７又は１８に記載の精製細胞組成物。
【請求項21】
前記疾患細胞株が、扁平上皮がん細胞株であり、前記疾患細胞株に特異的な前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項１６に記載の精製細胞組成物。
【請求項22】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項２１に記載の精製細胞組成物。
【請求項23】
前記操作された免疫細胞が、ＣＤ１０７ａの少なくとも約２９％増加した発現を示す、請求項２１又は２２に記載の精製細胞組成物。
【請求項24】
前記操作された免疫細胞が、ＩＦＮγの少なくとも約３９％増加した発現を示す、請求項２１又は２２に記載の精製細胞組成物。
【請求項25】
前記操作された免疫細胞が、操作されていない免疫細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の精製細胞組成物。
【請求項26】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を作製する方法であって、ａ）内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を幹細胞に導入することと、
ｂ）前記幹細胞を免疫細胞に分化させることと、を含む、方法。
【請求項27】
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項29】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項30】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞、又は請求項２９に記載の医薬組成物と、使用説明書と、を含む、キット。
【請求項31】
疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞又は請求項２９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項32】
前記疾患又は障害が、悪性腫瘍である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記悪性腫瘍が、腫瘍関連抗原を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記疾患又は障害が、ウイルス感染症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記ウイルス感染症が、ウイルス感染関連抗原を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記投与することが、前記操作された免疫細胞、又は前記操作された免疫細胞を含む医薬組成物を、疾患に特異的な抗体と組み合わせて投与することを更に含む、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
疾患に特異的な前記抗体が、抗ＣＤ２０抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
疾患に特異的な前記抗体が、抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、セツキシマブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、細胞培養物。
【請求項42】
前記ＮＫ細胞が、人工多能性幹細（ｉＰＳＣ）から産生されている、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項43】
前記ＮＫ細胞が、末梢血細胞又は臍帯血細胞から産生されている、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項44】
前記ＮＫ細胞が、ヒトＮＫ細胞である、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項45】
前記ＮＫ細胞が、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項46】
前記ＮＫ細胞が、細胞表面マーカーＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を発現する、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項47】
前記ＮＫ細胞が、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増加した細胞表面マーカーＣＤ１６、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌを発現する、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項48】
前記ＮＫ細胞が、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮを用いて、ＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変されている、請求項４１に記載の細胞培養物。
【請求項49】
請求項４１～４８のいずれか一項に記載の遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ＮＫ細胞の培養物からのＮＫ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項50】
必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項４９に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項51】
前記必要とする対象が、ＮＫ耐性の耐性がんを患っている、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記必要とする対象が、慢性ウイルス感染症を患っている、請求項５０に記載の方法。
【請求項53】
前記投与が、疾患細胞に特異的な抗体を更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項54】
前記投与が、ＣＤ２０に特異的な抗体を更に含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項55】
細胞を、ＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変することを含む、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞培養物を製造する方法。
【請求項56】
前記細胞が、ｉＰＳＣである、請求項５５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０５，９７８号の優先権の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０５，９７８号の優先権の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府資金援助
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＣＡ２０３３４８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＣＡ２０３３４８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【0003】
本発明は、概して、活性が増強されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に関する。ＮＫ細胞は、幹細胞に由来し得る。本発明の他の態様及び利点は、本発明の以下の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
【背景技術】
【0004】
養子細胞療法は、がんを治療する有望な新しい方法として急速に関心を集めている。特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、最近２０１７年に承認された、がんを治療するための唯一のＵＳＦＤＡ承認されたリンパ球ベースの養子がん細胞療法であり、難治性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において顕著な有効性を示している。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の成功は、より効果的な養子細胞療法選択肢の開発に対する楽観主義を促進している。現在承認されているＣＡＲ－Ｔ治療レジメンは、元の患者からの白血球除去輸血によって採取されたエクスビボ修飾及び増殖されたＴ細胞の自己移植に依存している。このプロセスには３～４週間かかり、個々の患者からの採取されたＴ細胞の質に関するドナーの変動性は、治療成績に広く影響を与える可能性がある。更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けた一部の患者は、潜在的に致命的な副作用、特にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び神経毒性を経験する。したがって、最小限の副作用でタイムリーに患者に投与することができる、定義された一貫した品質を有する標準化された「既製の」細胞療法製品の開発は、非常に望ましく、大きな商業的関心を有する。
【0005】
この文脈では、焦点は、「既製の」細胞療法のための好適な細胞源としてのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に向けられている。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の抗原プライミングなしに、腫瘍及びウイルス感染細胞を殺傷する天然の能力を有する。更に、ＮＫ細胞は、移植片対宿主病を回避するためにＨＬＡマッチングを必要とするＴ細胞とは異なり、ＨＬＡアロタイプにわたって患者に投与することができる。同種ＮＫ細胞の養子移入を利用した多くの試験では、標準化学療法に耐性のある急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者で完全な寛解が実証された。別の最近の臨床研究では、最小限の副作用で、同種ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を使用したリンパ性悪性腫瘍の効果的な治療を実証した。したがって、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞に対して、多様な悪性腫瘍を治療するための安全で効果的な「既製の」養子細胞療法製品として使用されることを可能にするいくつかの利点を有する。
【0006】
ドナー末梢血（ＰＢ）、臍帯血（ＣＢ）、及び確立されたＮＫ腫瘍細胞株から供給されるＮＫ細胞に加えて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成されるＮＫ細胞は、同種ＮＫ細胞にとって有望な供給源である。最も顕著なことに、ｉＰＳＣは、改善された抗腫瘍活性を媒介するためにＮＫ細胞の細胞毒性活性を増強するために利用され得る、遺伝子改変、すなわち、遺伝子欠失／変異又は過剰発現に、より適している。対照的に、ＣＢ及びＰＢ由来のＮＫ細胞は、遺伝子操作がより困難であり、より不均一な遺伝子改変された細胞集団を産生し、ドナーの変動性もまた、下流の細胞療法有効性に影響を与える可能性がある。ヒトｉＰＳＣはまた、未分化状態で培養において無限に成長し、ｉＰＳＣからＮＫ細胞を誘導するために開拓され、洗練された方法は現在、臨床スケールでｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞の産生を可能にする。
【0007】
したがって、ｉＰＳＣは、増強された細胞毒性を有する、標準化された、遺伝子編集された、及び均一な養子ＮＫ細胞療法を生成するための理想的な鋳型として機能する。したがって、いくつかの知名度の高いバイオテクノロジー会社及び製薬会社は、「既製の」ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞療法製品を積極的に開発しており、すでに臨床試験に入っている会社もある。ＮＫ細胞媒介性細胞毒性を増強するための遺伝子改変戦略を同定することは、様々な悪性腫瘍を治療するためのより強力な養子ＮＫ細胞療法製品の生成を可能にするため、非常に活発な研究分野であり、多大な商業的意味を有する。
【0008】
したがって、ＮＫ細胞は養子細胞療法において有用であり得るが、それらの使用はしばしば、生物学的制約によって制限され、次善の有効性をもたらす。したがって、当該細胞及びそれらの使用方法を含む組成物の満たされない必要性が存在する。
【発明の概要】
【0009】
一態様では、本開示は、内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を含む、操作された免疫細胞を提供する。
【0010】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、末梢血（ＰＢ）由来の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、臍帯血（ＣＢ）由来の免疫細胞である。
【0011】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭ１７不活性化変異は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックアウトである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＡＤＡＭ１７－／－免疫細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭ１７不活性化変異は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックダウンである。
【0013】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、ＮＫｐ４４＋、及びＮＫｐ４６＋である。
【0014】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、刺激剤による刺激後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１６ａ、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の増加した発現を有する。
【0015】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞におけるＣＤ１６ａの発現は、培養物中での増殖中に少なくとも約６週間、安定して維持される。
【0016】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヒト免疫細胞である。
【0017】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞のうちの１つ以上を含む精製細胞組成物を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約７１％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約４２％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。
【0019】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、疾患細胞株及び当該疾患細胞株に特異的な抗体と共インキュベーションした後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１０７ａ及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の増加した発現を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、Ｂリンパ腫細胞株であり、当該疾患細胞株に特異的な抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約４５％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３６％増加した発現を示す。
【0021】
いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、扁平上皮がん細胞株であり、当該疾患細胞株に特異的な抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約２９％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３９％増加した発現を示す。
【0022】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されていない免疫細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。
【0023】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞を作製する方法であって、ａ）内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を幹細胞に導入することと、ｂ）幹細胞を免疫細胞に分化させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞である。
【0024】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0025】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞又は本開示の医薬組成物と、使用説明書と、を含む、キットを提供する。
【0026】
一態様では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、本開示の操作された免疫細胞又は本開示の医薬組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、ウイルス感染関連抗原を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、投与することは、操作された免疫細胞、又は当該操作された免疫細胞を含む医薬組成物を、疾患に特異的な抗体と組み合わせて投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、疾患に特異的な抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、疾患に特異的な抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。
【0028】
一態様では、本開示は、遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、細胞培養物を提供する。実施形態では、ＮＫ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、末梢血細胞又は臍帯血細胞から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。
【0030】
実施形態では、ＮＫ細胞は、細胞表面マーカーＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を発現する。実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞が、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増加した細胞表面マーカーＣＤ１６、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌを発現することを提供する。
【0031】
実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、又は他の遺伝子編集技術を用いて、ＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変されている。
【0032】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ＮＫ細胞の培養物からのＮＫ細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【0033】
一態様では、本開示は、必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。実施形態では、本発明は、必要とする対象が、ＮＫ耐性がんを患っていることを提供する。実施形態では、本発明は、必要とする対象が、慢性ウイルス感染症を患っていることを提供する。
【0034】
実施形態では、投与は、疾患細胞に特異的な抗体を更に含む。実施形態では、本発明は、投与が、ＣＤ２０に特異的な抗体を更に含むことを提供する。
【0035】
一態様では、本開示は、細胞をＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変することを含む、本明細書に記載のＮＫ細胞培養物を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】本発明のある実施形態の概略図を示す。
【図2】リツキシマブ（抗ＣＤ２０）の存在下で、ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞が、ＲＡ ＪＩ細胞に対する増強された細胞毒性を実証することを示す。
【図3A-F】ＡＤＡＭ１７欠損ｉＰＳＣが、造血前駆細胞及び機能的ＮＫ細胞に効率的に分化することを示す。図３Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＡＤＡＭ１７でエクソン１を標的化するためのゲノム位置を示す。赤色の配列は、使用される非限定的な例示的な短いガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、及び以下の領域内の対応するコードされたアミノ酸を示す。ヒトゲノムアセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３に基づくｓｇＲＮＡ配列に対応する染色体２上の数値ゲノム位置。図３Ｂは、野生型対照（ＷＴ）及びＡＤＡＭ１７欠損（ＡＤＡＭ１７－ＫＯ）ｉＰＳＣ上の多能性マーカーＳＳＥＡ－４及びＴＲＡ－１－８１、並びにＡＤＡＭ１７の表面マーカー発現を示す。赤いグレースケールヒストグラム－アイソタイプ対照。青いグレースケールヒストグラム－示されたマーカーの染色。図３Ｃは、播種７日後にＷＴ及びＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣから生成された解離スピン胚様体（ＥＢ）上のＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４５の表面マーカー発現を示す。図３Ｄは、ＷＴ及びＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣから生成されたｉＰＳＣ－ＮＫ細胞、並びに健康なドナー末梢血ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ）の代表的な表面マーカー発現を示す。赤いグレースケールヒストグラム－アイソタイプ対照。青いグレースケールヒストグラム－示されたマーカーの染色。図３Ｅは、ＥＢ形成後、かつＮＫ分化条件下で２７～３５日で生成された、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ上のＣＤ１６表面発現を分析する複数の実験からの、％ＣＤ１６＋細胞（（Ｃ）、ＣＤ１６パネルのように）の定量化を示す。各ドットは、生成されたｉＰＳＣ－ＮＫ細胞バッチの生物学的複製を表す。等分散を前提としたＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定によって判定された＊＊Ｐ＜０．００５。エラーバーは±Ｓ．Ｄ．を示す。図３Ｆは、Ｋ５６２赤白血病細胞及び示されたＮＫ細胞を、示された効果対標的（Ｅ：Ｔ）比で共インキュベートした後の細胞死及びアポトーシス（カスパーゼ３／７、７－ＡＡＤ）を測定する４時間の細胞毒性アッセイを示す。
【図4A-D】１６濃縮ＡＤＡＭ１７欠損ＮＫ細胞が、ＣＤ１６、ＣＤ６２Ｌを保持し、活性化時にＴＮＦα表面発現を蓄積することを示す。図４Ａは、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の濃縮のための概略図を示す。図４Ｂは、未処理の、又はホルボール－１２－ミリスチン酸１３－酢酸塩（８０ｎＭ）及びイオノマイシン（１３０μＭ）（ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ）で４時間刺激し、ＣＤ１６表面発現について評価した、ＣＤ１６濃縮（（図４Ａ）のように）ＷＴ、ＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ、及びＰＢ－ＮＫを示す。図４Ｃは、図４Ｂのように、未処理と比較した、％ＣＤ１６＋細胞の定量化を示す。各ドットは、個別の実験の複製を表す。等分散を前提としたＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定によって判定された＊＊＊Ｐ＜０．００１。示されているエラーバーは、実験の複製からの±Ｓ．Ｄ．を示す。図４Ｄは、未処理の、又はＰＭＡ／イオノマイシンで４時間刺激し、ＴＮＦａ及びＣＤ６２Ｌ表面発現について評価した、ＣＤ１６濃縮ＷＴ、ＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ、及びＰＢ－ＮＫを示す。
【図5A-C】ＡＤＡＭ１７欠損ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞が、増強された抗体由来細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性発現を実証することを示す。図５Ａは、ＣＤ１０７ａ対ＩＦＮγを示し、図５Ｂは、示された条件での４時間のインキュベーション後のＣＤ１６濃縮ＷＴ、ＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ、及びＰＢ－ＮＫ上のＴＮＦα対ＩＦＮγを示す。腫瘍細胞株（Ｋ５６２、ＲＡＪＩ、ＣＡＬ２７）との共培養条件を、１：１の効果対標的比でインキュベートし、示されるプロットを、ＣＤ５６＋細胞上でゲーティングした。リツキシマブ（抗ＣＤ２０）を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）を１μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、同じそれぞれの濃度でヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照とインキュベートした細胞と比較した。固定化後及び透過性化後のＩＦＮγ及びＴＮＦαレベルを評価するために、細胞内染色を実施した。図５Ｃは、％ＣＤ１０７＋（左）、％ＩＦＮγ（中央）、及び％ＴＮＦα（右）の定量化を示す。それぞれの条件の各ドットは、独立して実施された実験から分析された％陽性細胞を示す。等分散を前提としたＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定ごとの＊Ｐ＜０．０５。エラーバーは、実験の複製からの±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図6A-B】ＡＤＡＭ１７欠損ｉＰＳＣ－ＮＫが、治療抗体による増強された細胞毒性を実証することを示す。図５Ａは、（Ａ）１０μｇ／ｍＬのリツキシマブ（抗ＣＤ２０）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を有するＲＡＪＩ細胞と共インキュベートした、ＣＤ１６濃縮ＷＴ、ＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ、及びＰＢ－ＮＫの２４時間細胞毒性アッセイを示すか、又は図６Ｂは、１μｇ／ｍＬのセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を有するＣＡＬ２７細胞を示す。細胞死は、無傷細胞の数に対して正規化したカスパーゼ３／７陽性イベントとして検出された（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ）。各条件について示されたデータは、０時間でのバックグラウンド細胞死に対して正規化した。画像を２４時間にわたって１時間間隔で取得し、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用して死滅／生細胞数の変化を評価した。エラーバーは、条件／時点ごとに３ウェルにわたって撮影された１２枚の画像で計算された細胞死の±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本開示は、部分的には、操作されていない免疫細胞と比較して、幹細胞から産生される、操作された免疫細胞であるＡＤＡＭ１７欠損ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し、かつ他のＡディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ１７基質の中でもとりわけＣＤ１６ａの拡張した安定発現を有するという、本発明者らによる驚くべき発見に関する。本開示は、これらの発見を利用する、操作された細胞、組成物、及び方法を提供する。
【0038】
一態様では、本開示は、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する、人工多能性幹細胞－ナチュラルキラー（ｉＰＳＣ－ＮＫ）細胞などのＮＫ細胞を産生するための新規の遺伝子操作戦略を提供する。ＡＤＣＣは、抗体オプソニン化標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を媒介し、抗腫瘍抗体の治療有効性を媒介するのを助ける重要な経路である。ＮＫ細胞では、ＡＤＣＣは、抗体コーティングされた標的細胞と活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）との係合を介して発生し、炎症性サイトカインアップレギュレーション、脱顆粒、及び標的細胞死をもたらす。細胞活性化時に、ＣＤ１６ａ細胞外ドメインは、Ａディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）としても知られるＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）によって、ＮＫ細胞表面から切断される。細胞外ドメインの切断は、ＮＫ細胞活性を低下させるＣＤ１６ａを介した更なる抗体結合及びシグナル伝達を防止する。したがって、ＡＤＡＭ１７活性を欠くＮＫ細胞は、ＮＫ活性化時にＣＤ１６ａが脱落するのを防ぎ、ＡＤＣＣ活性を増強することができる。更に、約８０のＡＤＡＭ１７基質、中でも特にＴＮＦβ及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）が、同定されており、ＮＫ細胞活性化時に切断を受け、細胞毒性に影響を及ぼし得ることも指摘されている。ＡＤＡＭ１７発現を欠くｉＰＳＣに由来するＡＤＡＭ１７欠損（ＡＤＡＭ１７－ＫＯ）ＮＫ細胞は、本明細書に記載される。ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、未改変の野生型ｉＰＳＣ－ＮＫ（ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ）及び末梢血－ナチュラルキラー（ＰＢ－ＮＫ）細胞対照と比較して、治療抗体と組み合わせて、ＮＫ耐性腫瘍細胞に対する増強されたＡＤＣＣ活性及びより強力な細胞毒性を有する。
【0039】
本開示の様々な更なる態様及び実施形態は、以下の説明によって提供される。
【0040】
定義
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。
【0041】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の材料及び方法を、本発明を実施するために使用することができる。本発明の実施は、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用し得、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技法については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－ １９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）などの文献に詳細に説明されている。本明細書で記載されるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料が、本発明の実施で使用され得るのであるが、例示的な方法、装置及び材料が、本明細書に記載されている。本開示の目的のために、以下の用語を以下に定義する。追加の定義は、本開示を通して示される。
【0042】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「それによって特徴付けられる」、又はそれらの任意の他の変形は、明示的に示される任意の限定に従って、列挙される構成要素の非排他的な網羅を包含することが意図されている。例えば、操作された免疫細胞、医薬組成物、及び／又は要素（例えば、構成要素、特徴、又はステップ）の列挙を「含む」方法は、必ずしもそれらの要素（又は構成要素、又はステップ）のみに限定されないが、操作された免疫細胞、医薬組成物、及び／又は方法に明示的に列挙されていない、又は固有の他の要素（又は構成要素、又はステップ）を含み得る。本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態（ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態（ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な場所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すものではない。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態では、任意の好適な方法で組み合わされ得る。
【0043】
２つ以上の項目の列挙において「及び／又は」という用語が使用される場合、列挙された項目のいずれか１つを単独で使用しても、又は列挙された項目のいずれか１つ以上と組み合わせて使用してもよいことを意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、Ａ及びＢの一方又は両方、すなわち、Ａのみ、Ｂのみ、又はＡとＢの組み合わせを意味することが意図される。「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、又はＡとＢとＣの組み合わせを意味することが意図される。
【0044】
本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、別段の指示がない限り、列挙された構成要素のうちの「１つ以上」を指すことを理解されたい。代替物（例えば、「又は」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
【0045】
範囲形式での説明は、便宜上かつ簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、考えられる全ての部分範囲とその範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、及び６が具体的に開示されているとみなされるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。また、本明細書では、値又は範囲は、「約」、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値まで、として表され得る。そのような値又は範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。
【0046】
本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることが更に理解されよう。実施形態では、「約」は、例えば、基準量、レベル、値、数、周波数、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して最大で１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％変動する基準量、レベル、値、数、周波数、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを意味するために使用されることができる。様々な実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％に関する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
【0047】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかの如く同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0048】
本明細書で使用されるセクション見出しは、構成の目的のみのためのものであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0049】
操作された細胞
一態様では、本開示は、内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を含む、操作された免疫細胞を提供する。
一態様では、本開示は、内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を含む、操作された免疫細胞を提供する。
【0050】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、末梢血（ＰＢ）由来の免疫細胞である。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、臍帯血（ＣＢ）由来の免疫細胞である。
【0051】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ細胞」又は「ｉＰＳＣ」は、増殖、選択可能な分化、及び成熟が可能である、多能性状態に再プログラムされた体細胞に由来する細胞を指すために使用される。
【0052】
本明細書で使用される場合、「末梢血」又は「末梢血細胞」は、循環血に由来し、かつ増殖、選択可能な分化、及び成熟が可能である造血幹細胞を含む、細胞を指すために使用される。
【0053】
本明細書で使用する場合、「臍帯血細胞」は、臍帯及び胎盤に由来し、かつ増殖、選択可能な分化、及び成熟が可能である造血幹細胞を含む、細胞を指すために使用される。
【0054】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【0055】
本明細書で使用する場合、及び別途指定されない限り、「ナチュラルキラー細胞」又は「ＮＫ細胞」は、先天性免疫系の主要成分を構成する細胞毒性リンパ球である、細胞を指すために使用される。ヒトでは、ナチュラルキラー細胞は通常、表面マーカーＣＤ１６（ＦＣｙＲＩＩＩ）及びＣＤ５６を発現する。ＮＫ細胞は、細胞毒性であり、細胞質中の小さな顆粒であり、グランザイムとして知られるパーフォリン及びプロテアーゼなどの特別なタンパク質を含有する。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞に迅速な応答を提供し、形質転換細胞に応答する。殺傷が予定されている細胞に近接して放出されると、パーフォリンは、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、孔を通ってグランザイム及び関連分子が入ることができ、アポトーシスを誘導する。したがって、ＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫及び抗感染免疫におけるリンパ球集団のエフェクターとして作用し得る。
【0056】
典型的には、免疫細胞は、感染細胞の表面上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される病原体からペプチドを検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解又はアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、病原体からのペプチドがＭＨＣ分子上に存在するかどうかにかかわらず、ストレス細胞を認識する能力を有するため、ユニークである。ＮＫ細胞は、標的を殺すために事前の活性化を必要としないという当初の考えのために「ナチュラルキラー」と命名された。ＮＫ細胞は、大きな顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、骨髄中で分化し、成熟することが知られており、骨髄から循環に入る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋ＣＤ３－であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋ＣＤ３３－であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ３３－であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫｐ４４＋ＮＫｐ４６＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫｐ４４＋ＮＫｐ４６＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０＋ＮＫｐ４４＋ＮＫｐ４６＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫｐ４４＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫｐ４６＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ９４＋ＮＫＧ２＋であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、阻害性キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ＋）であることを特徴とする。
【0057】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ９４＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、ＮＫｐ４４＋、及びＮＫｐ４６＋である。
【0058】
本明細書で使用する場合、「操作された」、又は「遺伝子改変された」、又は「形質転換された」は、互換的に使用され、細胞は、ゲノム配列の分子リプログラミング（例えば、挿入、欠失、又は置換）によって操作されている。当該細胞は、継代の数にかかわらず、一次形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなく、変異を含有し得る。最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
【0059】
いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭ１７不活性化変異は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックアウトである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＡＤＡＭ１７－／－免疫細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭ１７不活性化変異は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子のノックダウンである。いくつかの実施形態では、細胞は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を阻害する外因性ポリヌクレオチドを発現する。
【0060】
本明細書で使用される場合、「不活性化変異」は、野生型又は天然に存在するゲノム核酸配列と比較して、転写物又は翻訳産物の形成の欠如をもたらすゲノム核酸の変異、すなわち、挿入、欠失、又は置換を記述するために使用される。不活性化変異は、発現のために天然に存在する核酸配列を機能的に不活性化するか、又は非機能的及び／又は不作動にする。
【0061】
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」又は「ＫＯ」は、遺伝子操作を指すために使用され、この操作は、遺伝子が無効にされ、及び／又は遺伝子の機能が大部分又は完全に排除されることをもたらす。ノックアウトは、当該技術分野で既知の様々な方法、例えば、早期停止コドンの組み込み、又は遺伝子を不作動にする程度の挿入及び／若しくは欠失を介して達成され得る。
【0062】
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」又は「ＫＤ」は、遺伝子操作を指すために使用され、この操作は、遺伝子の発現が減少することをもたらす。ノックダウンは、遺伝子の転写の減少をもたらす遺伝子改変の使用によって、又は機能的遺伝子転写産物の欠乏をもたらす遺伝子若しくはｍＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有する短いＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする外因性ポリペプチドを導入することを使用して達成され得る。
【0063】
「外因性」及び「異種」という用語は、生物の外に由来する核酸、タンパク質又はペプチド、小分子化合物などを含む、任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、「内因性」という用語は、生物内に由来する（すなわち、生物によって自然に産生される）任意の分子を指す。
【0064】
本明細書で使用される場合、「ＡＤＡＭ１７－／－」という用語は、内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子の両方の対立遺伝子に不活性化変異を有し、それによって細胞をダブルノックアウトにし、細胞は、両方の遺伝子の発現が存在しない、又はほぼ存在しないことを示す、細胞を指す。
【0065】
免疫細胞が異常な要素を標的にし、その後排除する能力は、無数の潜在的なデバイスを伴う。例えば、１つのそのようなデバイスには、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の使用が含まれ、免疫細胞は、抗体オプソニン化標的に対する細胞毒性を媒介する。エフェクター細胞は、標的抗原に結合した特異的抗体によってマークされた標的細胞に結合することによってＡＤＣＣを利用し、その結果、エフェクター細胞の脱顆粒化により、細胞毒性因子を放出し、標的を死滅させる。エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（活性化受容体）は、抗原刺激性ＡＤＣＣに結合した抗体のＦｃ領域に結合する。
【0066】
Ｆｃ受容体の細胞外ドメインは、細胞活性化後に酵素による分解を受ける。例えば、ＣＤ１６受容体は、酵素Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）の多くの暫定的基質の１つとして同定されている。エフェクター細胞ＣＤ１６受容体の破壊は、細胞を、抗体結合及びシグナル伝達を不可能にし、結果としてＡＤＣＣの低減をもたらすであろう。
【0067】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞、Ｆｃ受容体を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化後、完全に無傷のままであるか、又は分解されない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）受容体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６受容体は、ＦｃＩ３ＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６受容体は、ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６受容体は、ＣＤ１６ａ及び／又はＣＤ１６ｂである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、
である。
【数1】
である。
【0068】
操作された免疫細胞は、野生型細胞対応物と比較して、特定の細胞表面マーカーのアップレギュレーション及び／又は安定化を示し得る。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、野生型細胞対応物と比較して、ＣＤ１６の安定化を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、野生型対応物と比較して、ＣＤ６２Ｌの安定化を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、野生型対応物と比較して、ＴＮＦαの増強された表面発現を示す。
【0069】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、刺激剤による刺激後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１６ａ、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の増加した発現を有する。
【0070】
刺激剤としては、ＮＫ細胞の活性化を誘発する分子が挙げられる。例示的な種類の刺激剤としては、ＣＤ１６又はホルボールエステルを誘発することができる分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0071】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞におけるＣＤ１６ａの発現は、培養物中での増殖中に少なくとも約６週間、安定して維持される。
【0072】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヒト免疫細胞である。
精製細胞組成物
精製細胞組成物
【0073】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞のうちの１つ以上を含む精製細胞組成物を提供する。
【0074】
本明細書で使用する場合、「精製細胞集団」又は「精製細胞組成物」を含有する組成物は、組成物中の細胞の少なくとも３０％、５０％、６０％、典型的に少なくとも７０％、より好ましくは８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれ以上が、特定された種類のものであることを意味する。
【0075】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、刺激剤による刺激の後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約５０％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約６０％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約７０％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約８０％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約９０％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約１００％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の約７１％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約７１％は、刺激剤による刺激後に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約３０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約４０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約５０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約６０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約７０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約８０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約９０％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約１００％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の約４２％で、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞の少なくとも約４２％は、刺激剤による刺激後にＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）を発現する。
【0076】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、疾患細胞株及び当該疾患細胞株に特異的な抗体と共インキュベーションした後に、操作されていない免疫細胞と比較して、ＣＤ１０７ａ及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の増加した発現を有する。いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、悪性腫瘍を含む細胞株である。いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、ウイルス感染症を含む細胞株である。
【0077】
いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、Ｂリンパ腫細胞株であり、当該疾患細胞株に特異的な抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約２０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約３０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約４０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約５０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約６０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約７０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約８０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約９０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの約４５％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約４５％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約２０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約４０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約５０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約６０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約７０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約８０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約９０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの約３６％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３６％増加した発現を示す。
【0078】
いくつかの実施形態では、疾患細胞株は、扁平上皮がん細胞株であり、当該疾患細胞株に特異的な抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約１０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約２０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約３０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約４０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約５０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約６０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約７０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約８０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約９０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの約２９％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ１０７ａの少なくとも約２９％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約２０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約４０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約５０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約６０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約７０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約８０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約９０％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約１００％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの約３９％増加した発現を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、ＩＦＮγの少なくとも約３９％増加した発現を示す。
【0079】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されていない免疫細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約５０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約６０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約７０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約８０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約９０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも約１００％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、標的化された細胞に特異的な抗原特異的抗体の存在下にある。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、約８０％の標的化された細胞死が可能であり、本開示の免疫細胞は、抗原特異的抗体の存在下にある。
【0080】
ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣは、造血前駆細胞に正常に分化し、その後、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を含む典型的なＮＫ細胞表面マーカーを均一に発現するＮＫ細胞に分化する。ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞は、野生型ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞（ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞）及び健常なドナー由来の末梢血ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ細胞）と比較して、機能性であり、Ｋ５６２赤白血病細胞をインビトロで殺傷する。驚くべきことに、分化すると、ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞と比較して約２０％低いＣＤ１６ａ表面発現を発現するが、ＣＤ１６ａ＋細胞を濃縮した後、培養において６週間の増殖にわたって、ＣＤ１６ａ発現を安定的に保持する。ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞及びＰＢ－ＮＫ細胞は、ホルボールエステルによる刺激時にＣＤ１６ａ表面発現を急速に失うが、ＡＤＡＭ１７ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、この刺激後に、９０％を超えるＣＤ１６ａ発現を維持する。加えて、有意に高い割合のＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣは、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ（７％ＴＮＦ－α＋、２％Ｌ－セレクチン＋）及びＰＢ－ＮＫ（２％ＴＮＦ－α＋、１％Ｌ－セレクチン＋）と比較して、ホルボールエステルで４時間刺激した後に、細胞表面上で、ＴＮＦ－α（７１％）及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）（３６％）－２つの他の既知のＡＤＡＭ１７基質を発現する。ＣＤ１６ａ＋ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６ａ＋ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ（３２％ＣＤ１０７ａ＋，１１％ＩＦＮγ）及びＰＢ－ＮＫ（３７％ＣＤ１０７ａ＋，７％ＩＦＮγ）細胞と比較して、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの存在下で、ＲＡＪＩ Ｂリンパ腫細胞と共インキュベートしたときに、増加したＣＤ１０７ａ（４５％）及びＩＦＮγ（３９％）発現を媒介する。同様に、ＣＤ１６ａ＋ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６ａ＋ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ（１２％ＣＤ１０７ａ＋，８％ＩＦＮγ）及びＰＢ－ＮＫ（１４％ＣＤ１０７ａ＋，６％ＩＦＮγ）と比較して、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの存在下で、ＣＡＬ２７扁平上皮がん細胞と共インキュベートしたときに、増加したＣＤ１０７ａ（２９％）及びＩＦＮγ（４２％）発現をアップレギュレートする。リツキシマブの存在下でのＲＡＪＩ細胞に対する長期（２４時間）細胞毒性アッセイは、経時的に、ＣＤ１６ａ＋ ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ、及びＣＤ１６ａ＋ ＰＢ－ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ１６ａ＋ ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞において高い細胞毒性を実証する。
【0081】
操作されていない免疫細胞と比較した本開示の操作された免疫細胞の増強された属性は、以下の表１に提供される。
【表1】
【0082】
ともに、これは、遺伝子編集されたｉＰＳＣの再生可能源に由来するＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞が、増強されたＡＤＣＣ可能性を有し、治療抗体と併せて、標準化された既製のＮＫ細胞ベースの治療に使用される有望な候補を提供することを実証する。
【0083】
作製する方法
本開示は、本明細書に記載のＮＫ細胞培養物を作製する方法であって、細胞をＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変することを含む、方法を提供する。
本開示は、本明細書に記載のＮＫ細胞培養物を作製する方法であって、細胞をＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変することを含む、方法を提供する。
【0084】
本明細書で使用する場合、別途指定されない限り、「ＡＤＡＭ１７欠損である」又は「ＡＤＡＭ１７欠損」は、天然に存在する、又は野生型の免疫細胞におけるＡＤＡＭ１７遺伝子発現と比較して、ＡＤＡＭ１７遺伝子の発現のための天然に存在する核酸配列の少なくとも一部が欠如していることを意味する。このような欠損は、本明細書に開示されるような不活性化変異の結果であり得る。
【0085】
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞を作製する方法であって、ａ）内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を幹細胞に導入することと、ｂ）幹細胞を免疫細胞に分化させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞である。
【0086】
いくつかの実施形態では、本開示の操作された免疫細胞を作製する方法は、ａ）幹細胞を免疫細胞に分化させることと、ｂ）内因性Ａディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ１７（ＡＤＡＭ１７）遺伝子における不活性化変異を当該免疫細胞に導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞は、導入された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、末梢血細胞、又は臍帯血細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞である。
【0087】
ゲノム編集ツールを使用して、細胞を操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）及び／又は操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ）することができる。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮゲノム編集ツールのいずれかを用いて操作され得る。
【0088】
クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）システムなどのゲノム編集ツールを使用して、細胞を遺伝子改変し得る。ＣＲＩＳＰＲは、多種多様な生物で使用（例えば、特定遺伝子の配列を追加、破壊、又は変更するために使用）可能である。本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集」は、一組のクラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し、又はそのような一組の繰り返しを含むシステムを指す。本明細書で使用される「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、標的遺伝子を沈黙させる、ノックアウトする、又は変異させるために使用することができるＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓに由来するシステムを指す。
【0089】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つの要素に基づいている。第１の要素は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ）である第２の要素が結合する部位を持つエンドヌクレアーゼ、すなわちＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９及びＭＡＤ７）である。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）は、Ｃａｓタンパク質を配列相同性に基づいて二本鎖ＤＮＡ鋳型に誘導する。次に、Ｃａｓタンパク質はそのＤＮＡ鋳型を切断する。Ｃａｓタンパク質及び適切なガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を細胞に送達することにより、生物のゲノムが所望の位置で切断される。Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体による標的化されたゲノム配列の切断後、２つの代替的ＤＮＡ修復メカニズム、すなわち、１）ｇＲＮＡ切断部位にてＤＮＡの少数の塩基対（ｂｐ）の挿入及び／又は欠失を生じさせる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、又は２）ｇＲＮＡ切断部位にまたがる追加の「つなぎ」ＤＮＡ鋳型を介して損傷部位を修正することができる相同組換え修復（ＨＤＲ）のうちの１つは、染色体の完全性を復元することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、クラス及び型によって分類される。クラス２システムは、現在、３つの異なる型（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）に分類される単一の干渉タンパク質を表す。遺伝子編集に好適な任意のクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、又はＶＩ型システムは、本開示の範囲内で想定される。例示的なクラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムとしては、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、及びＣａｓ４が挙げられる。例示的なクラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムとしては、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ及びＣａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）が挙げられる。例示的なクラス２ ＶＩ型システムとしては、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄが挙げられる。
【0090】
ＣＲＩＳＰＲ配列は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもあり、交互にリピート及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲでは、スペーサーは、通常、プラスミド又はファージ配列などの、細菌に外来の配列を含む。本明細書に記載されるように、スペーサー配列はまた、「標的化配列」とも称され得る。遺伝子操作のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサーは、標的遺伝子配列（ｇＮＡ）に由来する。
【0091】
標的化配列は、当業者に既知のコンピュータプログラムを使用して設計又は選択され得る。コンピュータプログラムは、予測される融解温度、二次構造形成、予測されるアニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生の頻度（例えば、同一であるか又は類似しているが、ミスマッチ、挿入、又は欠失の結果として１つ以上のスポットで変化する配列の頻度）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。利用可能なコンピュータプログラムは、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ、公式遺伝子記号、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ、ゲノム座標、又はＤＮＡ配列を入力として取り出し、入力として指定された適切なゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する出力ファイルを作成することができる。コンピュータプログラムはまた、標的遺伝子に対するｓｇＲＮＡのオンターゲット及びオフターゲット結合を示す統計量及びスコアの概要を提供し得る（Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４：１８４－１９１（２０１６））。
【0092】
標的配列は、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的であり、ｇＲＮＡの標的化配列とハイブリダイズする。標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０個を超えるヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、少なくとも、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、最大でも、５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
【0093】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、塩基対を付加若しくは欠失させること、早期停止コドンを導入すること、又はしたがって標的の発現を部分的若しくは完全に減少させるフレームシフト変異を導入することによって、本明細書に記載の細胞内で編集するための標的とされる遺伝子のような標的遺伝子を編集することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、代替的に、ＲＮＡ干渉のように使用され、可逆的な方法で標的遺伝子をオフにすることができる。例えば、哺乳類細胞において、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的遺伝子プロモーターに導き、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
【0094】
当業者に知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの更なる態様は、ＰＣＴ公開第２０１７／０４９２６６号及び第２０１７／２２３５３８号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のＮＫ細胞を生成するための、ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどの、これら及び他の周知の新しい技術は、本発明によって企図される。
【0095】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞は、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集を使用して編集される。「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＡＬＥＮ遺伝子編集」は、標的遺伝子を編集するために使用される人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって人工的に産生される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、ＴＣＲサブユニット、ＭＨＣクラスＩ複合体成分、又はＣＤ５２などの標的遺伝子の一部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって、標的遺伝子配列を含む任意の所望のＤＮＡ配列に特異的である制限酵素を産生することができる。次いで、これらを細胞に導入することができ、そこでそれらをゲノム編集に使用することができる。Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－６、及びＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１２；Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：３５０１．
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞は、ＺＦＮ遺伝子編集を使用して編集される。「ＺＦＮ」又は「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ遺伝子編集」は、標的遺伝子を編集するために使用することができる人工ヌクレアーゼであるジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合されたフォールドヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １８８：７７３－７８２、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１５６－１１６０．
【0097】
本明細書に記載の免疫細胞は、当該技術分野で既知である方法を使用して改変され得る。本明細書に記載の様々な遺伝子編集システムを使用して、免疫細胞を改変して、標的遺伝子又は標的遺伝子産物の機能を欠失させるか、不活性化させるか、発現を低減させるか、又は別様に阻害し得る。
【0098】
ＮＫ細胞又はｉＰＳＣなどの細胞は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮ技術などの任意の既知又は発見された遺伝子編集方法によって、ＡＤＡＭ１７欠損、又はＡＤＡＭ１７ノックアウト（ＡＤＡＭ１７ＫＯ）であるように遺伝子改変することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、遺伝子編集方法によって、ＡＤＡＭ１７欠損、又はＡＤＡＭ１７ノックアウト（ＡＤＡＭ１７ＫＯ）であるように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、遺伝子編集方法によって、ＡＤＡＭ１７欠損、又はＡＤＡＭ１７ノックアウト（ＡＤＡＭ１７ＫＯ）であるように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、遺伝子編集方法によって、ＡＤＡＭ１７欠損、又はＡＤＡＭ１７ノックダウン（ＡＤＡＭ１７ＫＤ）であるように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、遺伝子編集方法によって、ＡＤＡＭ１７欠損、又はＡＤＡＭ１７ノックダウン（ＡＤＡＭ１７ＫＤ）であるように遺伝子改変される。
【0099】
いくつかの実施形態では、本開示は、ａ）内因性ＡＤＡＭ１７遺伝子の不活性化変異が両方の対立遺伝子で生じ、それによってＡＤＡＭ１７－／－ｉＰＳＣを生成する、ＡＤＡＭ１７ｇＲＮＡ及びＭＡＤ７構築物でｉＰＳＣを形質導入することと、ｂ）ＡＤＡＭ１７－／－ｉＰＳＣをＮＫ細胞に分化させ、それによってＡＤＡＭ１７－／－ＮＫ細胞を生成することと、を含む、操作された免疫細胞を作製する方法を提供する。
【0100】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡなどのＤＮＡ及びＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。核酸は、本開示の遺伝子改変を可能にする配列に加えて、当該遺伝子改変を可能にする核酸の転写及び／又は翻訳に必要なものなどの更なる配列を含み得る。これには、プロモーター、エンハンサー、転写及び／若しくは翻訳開始及び／若しくは終結配列、選択マーカー、ＲＮＡを保護若しくは指示する配列、並びに／又は細胞内での遺伝子改変を可能にする配列が含まれ得る。これらの配列の選択及び組み合わせは、当業者の知識の範囲内であり、核酸が意図される細胞に従って選択され得る。
【0101】
本開示の遺伝子改変を可能にするポリヌクレオチドは、単離された核酸として、又はベクター内で細胞に送達され得る。単離された核酸又はベクターは、リポソームなどの脂質又は脂質ベースの送達系で送達され得る。あるいは、ベクターは、ベクターがウイルスベクターである場合などに、ウイルスタンパク質を含み得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、標的化された細胞の形質転換又は形質導入を指示するように設計された遺伝物質からなる構築物を指す。ベクターは、核酸カセット内の核酸が転写され、必要に応じてトランスフェクトされた細胞内で翻訳され得るように、他の必要な要素と位置的かつ連続的に配向された複数の遺伝子要素を含有する。本明細書で使用される場合、ベクターという用語は、核酸、例えば、特定のタンパク質をコードする、プラスミド、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、又は核酸の１つ以上の断片が挿入又はクローニングされ得る他のタイプのウイルスに由来するＤＮＡを指すことができる。本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、染色体外遺伝物質、通常は染色体ＤＮＡとは独立して複製することができるＤＮＡの環状二本鎖からなる構築物を指す。プラスミドは、必ずしも複製するとは限らない。
【0102】
任意の好適なベクターは、本開示の範囲内で想定される。本開示の遺伝子改変を可能にするポリヌクレオチドを、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、本開示の遺伝子改変を可能にするポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に関心のあるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で、免疫細胞などの細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
【0103】
ベクターの目的は、細胞又は組織内に核酸配列を提供することである。発現は、挿入された遺伝子又は核酸配列の効率的な転写を含む。発現産物は、タンパク質、ポリペプチド、又はＲＮＡであり得る。核酸配列は、核酸カセットに含有されることができる。核酸の発現は、連続的、構成的、又は調節されることができる。ベクターはまた、細菌中のプラスミドの複製のための、及び細菌中のプラスミドの維持のための選択のための原核細胞要素として使用することができる。
【0104】
遺伝子を細胞内に導入及び発現する方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【0105】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のための１つの方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【0106】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【0107】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系が挙げられる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【0108】
いくつかの実施形態では、形質導入は、リン酸カルシウム媒介遺伝子導入、ＤＥＡＥデキストラン媒介遺伝子導入、リポソーム媒介遺伝子導入、エレクトロポレーション媒介遺伝子導入、ウイルスベクター媒介遺伝子導入、又は核融合媒介遺伝子導入のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、形質導入は、リン酸カルシウム媒介遺伝子導入によって達成される。いくつかの実施形態では、形質導入は、リポソーム媒介遺伝子導入によって達成される。いくつかの実施形態では、形質導入は、エレクトロポレーション媒介遺伝子導入によって達成される。いくつかの実施形態では、形質導入は、ウイルスベクター媒介遺伝子導入によって達成される。いくつかの実施形態では、形質導入は、核融合媒介遺伝子導入によって達成される。
【0109】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するため、又はゲノム調節の効果を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって、特定のペプチドの存在若しくは不在を検出することなどの「生化学的」アッセイ、又は他のアッセイが挙げられる。
【0110】
一般に、人工多能性細胞を分化させるための技術は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び／又は小分子ベースのアプローチを使用して、直接的又は間接的に、特定の細胞経路の調節を伴う。細胞の発生力は、例えば、細胞を１つ以上の調節物質と接触させることによって調節され得る。本明細書で使用される場合、「接触させること」は、１つ以上の因子（例えば、小分子、タンパク質、ペプチドなど）の存在下で細胞を培養することを伴うことができる。いくつかの実施形態では、細胞を１つ以上の薬剤と接触させて、細胞分化を誘導する。かかる接触は、例えば、インビトロ培養中に１つ以上の薬剤を細胞に導入することによって生じ得る。したがって、接触は、栄養細胞培養培地中で１つ以上の薬剤を細胞に導入することによって生じ得る。細胞は、細胞が、所望である分化表現型を達成するのに十分な期間、１つ以上の薬剤を含む培養培地中に維持され得る。
【0111】
幹細胞の分化には、培養培地中の刺激薬剤の変化、又は細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要である。従来の戦略は、系統特異的分化を開始するための一般的かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。ＥＢは、三次元クラスターであり、三次元領域内で多数の系統を生じさせるため、胚発達を模倣することが示されている。分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化するために誘発される凝集した多能性幹細胞）は、成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、その時点で、それらは、分化を継続するために更に処理される。ＥＢ形成は、三次元の多層細胞クラスターにおいて、多能性幹細胞を互いに近接してもたらすことによって開始される。典型的には、これは、多能性細胞を液滴中に沈殿させること、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈殿させること、又は機械的攪拌によること含むいくつかの方法のうちの１つによって達成される。ＥＢ発達を促進するために、多能性幹細胞凝集塊は、多能性培養維持培地で維持される凝集塊が適切なＥＢを形成しないため、更なる分化キューを必要とする。これに続いて、ｉＰＳＣを造血細胞に分化させ、次に造血前駆細胞をナチュラルキラー（ＮＫ）に変換する追加の刺激を行い得る。
【0112】
操作された細胞を作製及び使用するための例示的な方法は、国際特許出願第２０１３／１６３１７１ Ａ１号、同第２０１７／０７８８０７ Ａ１号、及び同第２０１８／１４７８０１号に提供されており、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0113】
本明細書で使用される場合、「分化させる」又は「分化した」は、未成熟（特殊化されていない）細胞が成熟（特殊化された）細胞になる特性を獲得し、それによって特定の形態及び機能を獲得するプロセス及び条件を指すために使用される。幹細胞（特殊化されていない）は、しばしば、当該幹細胞の特定の系統コミットメント又は分化を誘導するために、様々な条件（例えば、成長因子及び形態形成因子）に曝露される。特殊化されていない（「コミットされていない」）、又はそれほど特殊化されていない細胞が、例えば、血液細胞又は筋肉細胞などの特殊化細胞の特徴を獲得するプロセス。分化した細胞又は分化誘導細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置をとっている細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、細胞が特定の細胞タイプ又は細胞タイプのサブセットに分化し続けるであろう点まで分化経路で進行し、通常の状況下では、異なる細胞タイプに分化するか、又はより分化の少ない細胞タイプに戻ることができない細胞を指す。
【0114】
分化マーカー遺伝子は、細胞の分化状態を測定するために監視され得る。本明細書で使用される場合、「分化マーカー遺伝子」又は「分化遺伝子」という用語は、発現が、多能性細胞などの細胞内で生じる細胞分化を示す遺伝子を指す。分化マーカー遺伝子としては、以下の遺伝子：ＦＯＸＡ２、ＦＧＦ５、ＳＯＸ１７、ＸＩＳＴ、ＮＯＤＡＬ、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＴＸ２、ＤＵＳＰ６、ＥＯＭＥＳ、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ０Ｂ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＥＲＢＢ４、ＧＡＴＡ６、ＨＯＸＣ６、ＩＮＨＡ、ＳＭＡＤ６、ＲＯＲＡ、ＮＩＰＢＬ、ＴＮＦＳＦ１１、ＣＤＨ１１、ＺＩＣ４、ＧＡＬ、ＳＯＸ３、ＰＩＴＸ２、ＡＰＯＡ２、ＣＸＣＬ５、ＣＥＲ１、ＦＯＸＱ１、ＭＬＬ５、ＤＰＰ１０、ＧＳＣ、ＰＣＤＨ１０、ＣＴＣＦＬ、ＰＣＤＨ２０、ＴＳＨＺ１、ＭＥＧＦ１０、ＭＹＣ、ＤＫＫ１、ＢＭＰ２、ＬＥＦＴＹ２、ＨＥＳ１、ＣＤＸ２、ＧＮＡＳ、ＥＧＲ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＣＦ４、ＨＥＰＨ、ＫＤＲ、ＴＯＸ、ＦＯＸＡ１、ＬＣＫ、ＰＣＤＨ７、ＣＤ１Ｄ ＦＯＸＧ１、ＬＥＦＴＹ１、ＴＵＪ１、Ｔ遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ＺＩＣ１、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＰＡＸ５、ＲＢＰＪ、ＲＵＮＸ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ５が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
「培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、成長及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合において単数「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」）、「サプリメント」、及び「培地サプリメント」は、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
【0116】
「培養する」又は「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織外又は体外での細胞の支持、増殖（成長）、及び／又は分化を指す。「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」又は「維持すること」は、培養培地を、細胞を成長させる、及び／又は支持するのに役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として利用し得る。
【0117】
多能性造血幹細胞は、２つの主要な前駆細胞系統の基礎を提供する。第１の細胞系統は、一般的なリンパ系前駆細胞系統であり、多能性造血幹細胞（血球芽細胞）は、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、若しくはＢリンパ球に更に分化するか、又はＢリンパ球から形質細胞に更に分化する能力を有するリンパ系前駆細胞に分化する。他の主要な細胞系統は、一般的な骨髄前駆細胞系統であり、血球芽細胞は、巨核球、赤血球、血小板、肥満細胞、若しくは骨髄芽細胞に更に分化するか、骨髄芽細胞から好塩基球、好中球、好酸球、若しくは単球に更に分化するか、又は単球からマクロファージに更に分化する能力を有する骨髄前駆細胞に分化する。
【0118】
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞が身体又は体細胞（すなわち、胚体）の全ての系統を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つの胚葉の各々から細胞を形成することができる一種の多能性幹細胞である。したがって、本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、造血転換を介して造血幹細胞及び前駆細胞を生じさせることができる未分化細胞のサブセットを指す。
【0119】
本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」という用語は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞を含む成熟骨髄細胞及びリンパ系細胞の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋幹細胞を指す。
【0120】
本明細書で使用される場合、「造血前駆体」という用語は、造血細胞型への造血転換が可能な細胞を指す。いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ５６＋細胞であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ３－細胞であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞であることを特徴とする。
【0121】
いくつかの実施形態では、培養プラットフォームの培地のうちの１つ以上は、フィーダーフリー環境であり、任意選択的に、サイトカイン及び／又は成長因子を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカインなどのサプリメントを含有する。一般に、培養プラットフォームは、段階特異的なフィーダーを含まない、血清を含まない培地のうちの１つ以上を含み、その各々は、栄養素／抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン、及び培地添加剤のうちの１つ以上を更に含む。好適な栄養素／抽出物としては、例えば、多くの異なる哺乳類細胞の増殖をサポートするために広く使用される基礎培地である、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２）、ＫＯＳＲ（ノックアウト血清代替物）、Ｌ－ｇｌｕｔ、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）が挙げられ得る。他の培地添加剤としては、ＭＴＧ、ＩＴＳ、（ＭＥ、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の培養培地は、以下のサイトカイン又は成長因子：上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、様々なインターロイキン（ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、様々なコロニー刺激因子（顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）など）、様々なインターフェロン（ＩＦＮ－γなど）、並びに幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）などの幹細胞に影響を有する他のサイトカインのうちの１つ以上を含む。これらのサイトカインは、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）から市販され得、天然又は組換えのいずれかであり得る。いくつかの他の実施形態では、本発明の培養培地は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ４）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、造血成長因子（例えば、ＳＣＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ３、ＴＰＯ、ＥＰＯ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）のうちの１つ以上、並びに白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１１、ＩＬ１５からの１つ以上のサイトカインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、成長因子／マイトジェン及びサイトカインは、経験的に、又は確立されたサイトカイン技術によって指導されるように決定される濃度において、段階及び／又は細胞型特異的である。
【0122】
医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0123】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される組成物を指し、組成物は、医薬的活性剤を含み、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体を更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬的活性剤及び担体の組み合わせであり得る。
【0124】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒト及び／又は非ヒト哺乳動物での使用に安全な他の製剤に加えて、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、一般に認められている他の薬局方に収載されていることを意味する。
【0125】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤」又は「薬学的に許容される担体」という用語は、本開示のＮＫ細胞とともに投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又はビヒクルを指す。そのような担体は、水及び油などの無菌液体であってよく、油としては、石油、動物、植物、又は合成に由来する油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒が挙げられる。ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を作成する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、及び吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）を参照されたい。従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、組成物におけるそのような使用が企図される。
【0126】
投与に好適な医薬組成物の製剤は、通常、滅菌水又は滅菌等張生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売され得る。注射可能な製剤は、アンプル中又は防腐剤を含有する複数回投与容器中などの単位剤形で調製、包装、又は販売され得る。投与のための製剤としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペーストなどが挙げられるが、これらに限定されない。かかる製剤は、懸濁化剤、安定化剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の成分を更に含み得る。製剤はまた、塩、炭水化物、及び緩衝剤などの賦形剤、又は無菌のパイロジェンフリー水を含有し得る水溶液を含み得る。例示的な投与形態は、滅菌水溶液、例えば、プロピレングリコール水溶液又はデキストロース溶液中の溶液又は懸濁液を含み得る。このような剤形は、所望の場合、好適に緩衝することができる。
【0127】
本発明の組成物は、医薬組成物に従来見られる他の補助成分を更に含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、痒み止め剤、収縮剤、局所麻酔剤、又は抗炎症剤などの追加の、互換性のある、薬学的に活性な材料を含有し得るか、又は染料、防腐剤、抗酸化剤、不透明剤、増粘剤、及び安定剤など、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加の材料を含有し得る。しかしながら、そのような材料は、添加された場合、本開示の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に干渉してはならない。かかる製剤は、滅菌することができ、所望の場合、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、及び／又は製剤と有害に相互作用しない芳香物質などの助剤と混合することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、他の治療活性剤と組み合わせて、当該ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患細胞表現型に特異的な抗体と組み合わせて、当該ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、疾患細胞表現型は、悪性細胞のものである。いくつかの実施形態では、疾患細胞表現型は、ウイルス感染症のものである。
【0128】
「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせか、又は併用投与のためのパーツのキットのいずれかを指し、１つ以上の活性化合物及び組み合わせパートナー（例えば、「治療薬」又は「補助薬剤」とも称される、以下で説明される別の薬物）が、独立して同時に又は時間間隔内で別々に投与され得る。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で使用される「併用投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又は「併用投与（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路又は同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合又は組み合わせにより得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる製品を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物及び組み合わせパートナーの両方が単一の実体又は用量の形態で一斉に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば、化合物及び組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として一斉に、同時に、又は連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与により、２つの化合物が治療上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。
【0129】
キット
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞又は本開示の医薬組成物と、使用説明書と、を含む、キットを提供する。
一態様では、本開示は、本開示の操作された免疫細胞又は本開示の医薬組成物と、使用説明書と、を含む、キットを提供する。
【0130】
使用方法
本発明は、増強されたＡＤＣＣ活性を実証する、遺伝子編集されたｉＰＳＣの再生可能源に由来する、操作された免疫細胞を提供する。これらの細胞は、難治性悪性腫瘍、及び慢性ウイルス感染症などの潜在的な他の疾患を効果的に治療するために、治療抗体と併用した、標準化された既製のＮＫ細胞ベースの療法のための有望な使用を提供する。
本発明は、増強されたＡＤＣＣ活性を実証する、遺伝子編集されたｉＰＳＣの再生可能源に由来する、操作された免疫細胞を提供する。これらの細胞は、難治性悪性腫瘍、及び慢性ウイルス感染症などの潜在的な他の疾患を効果的に治療するために、治療抗体と併用した、標準化された既製のＮＫ細胞ベースの療法のための有望な使用を提供する。
【0131】
一態様では、本開示は、疾患又は障害の治療又は予防を必要とする対象において、それを行う方法であって、本開示の操作された免疫細胞又は本開示の医薬組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、腫瘍関連抗原を含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、ウイルス感染関連抗原を含む。
【0132】
「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書中で交換可能に使用される。インビボで得られたか、又はインビボで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫もまた包含される。本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、又は「個体」には、本明細書で企図される、ベクター、組成物、及び方法で治療することができる痛みを示す任意の動物が含まれる。好適な対象（例えば、患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、又はモルモットなど）、家畜、及び飼育動物又はペット（ネコ又はイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、及び好ましくは、ヒト患者が含まれる。
【0133】
いくつかの実施形態では、投与することは、治療有効量を対象に投与することを含む。
【0134】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益な又は所望の予防的又は治療的結果を達成するための、細胞の「有効である量」又は「有効量」を指す。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、疾患及び医学的状態に関連付けられた症状を、治療若しくは改善する、又は何らかの方法で軽減するのに十分である薬学的に活性な化合物の量を指す。方法に関して使用される場合、方法は、疾患又は状態に関連する症状を、治療若しくは改善する、又は何らかの方法で軽減するのに十分有効である。例えば、疾患に関して有効量とは、その発症を阻止又は予防するのに十分な量であるか、あるいは疾患病状が始まっている場合は、その疾患の進行を緩和する、改善する、安定化させる、逆戻りさせる若しくは疾患の進行を遅らせる、又はその疾患の病理学的結果を低減させる量である。いずれの場合も、有効量は単回投与で与えても分割投与で与えてもよい。
【0135】
本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、患者の疾患に関連する症状を少なくとも改善することを包含し、改善とは、広い意味で使用され、治療されている疾患又は状態に関連するパラメータ、例えば、症状の大きさが少なくとも低減することを指す。したがって、「治療」には、疾患、障害、又は病的状態、又は少なくともそれらに関連する症状が、完全に抑制される（例えば、発生が予防される）か又は停止され（ｓｔｏｐｐｅｄ）（例えば、停止（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ））、患者がそれ以上その状態、又は少なくともその状態を特徴付ける症状に苦しむことがないようにする状況が含まれる。
【0136】
本明細書で使用する場合、及び別途指定されない限り、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、疾患若しくは障害の発症、再発若しくは拡散、又はそれらの１つ以上の症状の予防を指す。ある特定の実施形態では、これらの用語は、症状の発症前に、特に本明細書で提供される疾患又は障害のリスクがある対象への、１つ以上の他の追加の活性剤の有無によらず、本明細書で提供される化合物又は剤形での治療又はその投与を指す。用語は、特定の疾患の症状の抑制又は低減を包含する。ある特定の実施形態では、疾患の家族歴を有する対象は、予防レジメンの可能性のある候補である。ある特定の実施形態では、再発症状の履歴を有する対象も、予防のための可能性のある候補である。この点で、「予防」という用語は、「予防的治療」という用語と互換的に使用され得る。
【0137】
本明細書で使用する場合、及び別段の定めがない限り、化合物の「予防有効量」は、疾患若しくは障害を予防するのに、又はその再発を予防するのに十分な量である。予防有効量の化合物は、疾患の予防における予防的利益を提供する、単独で又は１つ以上の他の薬剤と組み合わせた治療剤の量を意味する。「予防有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、又は別の予防剤の予防有効性を増強する量を包含し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作された免疫細胞、又は当該操作された免疫細胞を含む医薬組成物は、予防有効量で投与される。
【0138】
本開示の免疫細胞又は医薬組成物は、局所的又は全身的治療が所望されるかどうかに応じて、いくつかの方法で投与され得る。ＮＫ細胞又は医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適しており、投与は、対象の組織の物理的な突破、及び組織内の突破を介した医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路を含み、したがって、一般に、血流、筋肉、又は内臓器官への直接投与をもたらす。したがって、非経口投与としては、組成物の注射による、外科的切開を介した組成物の適用による、組織透過性の非外科的創傷を介した組成物の適用などによる、医薬組成物の投与が挙げられるが、これらに限定されない。特に、非経口投与としては、皮下、腹腔内、筋肉内、大腿内、静脈内、鼻腔内、気管内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、腫瘍内、眼内、皮内、滑液内注射又は注入、腫瘍内、及び腎臓透析注入技術が挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞、又は医薬組成物は、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞、又は医薬組成物は、腫瘍内投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞、又は医薬組成物は、未改変の末梢血免疫又はＮＫ細胞を使用する免疫細胞による治療法を用いた過去の臨床研究と同様の方法で患者に投与される。
【0139】
いくつかの実施形態では、本開示の操作された免疫細胞、又は当該免疫細胞を含む医薬組成物は、組み合わせパートナーと組み合わせて投与される。「組み合わせ」という用語は、１つの投薬単位形態における固定された組み合わせ、又は、併用投与のためのパーツのキットのいずれかを指し、本開示の当該操作された免疫細胞を含む、操作された免疫細胞又は医薬組成物、及び組み合わせパートナー（例えば、「治療薬」又は「補助薬剤」とも称される、以下で説明される別の薬物）を、独立して、同時又は時間間隔内で別々に投与し得る。いくつかの状況では、組み合わせパートナーは協同的効果、例えば、相乗効果を示す。本明細書で使用される「併用投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」又は「併用投与（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、選択された組み合わせパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することが包含されることを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路又は同じ時間で投与されるわけではない治療レジメンが含まれることを意図する。本明細書で使用される「医薬の組み合わせ」という用語は、２つ以上の活性成分の混合又は組み合わせにより得られ、活性成分の組み合わせが固定されているものも固定されていないものも含まれる製品を意味する。「固定された組み合わせ」という用語は、活性成分、例えば、化合物及び組み合わせパートナーの両方が単一の実体又は用量の形態で一斉に患者に投与されることを意味する。「固定されていない組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば、化合物及び組み合わせパートナーの両方が、特定の時間的制約を設けることなく別々の実体として一斉に、同時に、又は連続して患者に投与されることを意味し、ここで、そのような投与により、２つの化合物が治療上有効な濃度で患者の体内で提供される。後者は、カクテル療法、例えば、３つ以上の活性成分の投与にも適用される。
【0140】
いくつかの実施形態では、投与することは、操作された免疫細胞、又は当該操作された免疫細胞を含む医薬組成物を、疾患に特異的な抗体と組み合わせて投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、疾患に特異的な抗体は、抗ＣＤ２０抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブである。いくつかの実施形態では、疾患に特異的な抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。そのような組み合わせは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）をもたらし得る。
【0141】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、標的抗原に特異的に結合するか、又は標的抗原と特異的に相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味すると理解される。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む完全長免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ、ＶＨ、又はＶＨと略され得る）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ、ＶＬ、ＶＫ、ＶＫ、又はＶＬと略され得る）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）とも称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に更に細分化され得る。
【0142】
本明細書に記載されるように、「抗原結合分子」は、本明細書の他の場所に記載されるような抗体又はその抗原結合断片である。ある実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及びワンアームド抗体からなる群から選択される。
【0143】
好適な抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離されたＣＤＲ）、又は拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ワンアームド抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、及び小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）などの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語によって包含される。
【0144】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、標的抗原を認識し、それに結合する免疫グロブリン可変ドメインの領域を指す。各可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として同定される最大３つのＣＤＲ配列を含み得る。
【0145】
「特異的に結合する」又は「特異的結合」という用語は、生理学的条件下で、少なくともバックグラウンドの２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍を超える、２つの分子間の結合反応を指す。タンパク質である１つ以上の検出可能な結合剤を使用する場合、特異的結合は、タンパク質及び他の生物学的製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在を決定する。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗原結合分子は、特定の抗原決定基に結合し、それによってその存在を識別する。そのような条件下での抗原決定基への特異的結合は、その決定基に対するその特異性のために選択される抗原結合分子を必要とする。この選択は、他の分子と交差反応する抗原結合分子を取り去ることによって達成され得る。様々なイムノアッセイ形式を使用して、抗原結合分子（例えば、免疫グロブリン）を選択することができる（その結果、それらは特定の抗原と特異的に免疫反応する）。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。結合親和性及び特異性を決定する方法は、当該技術分野でも周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（上記）、Ｆｒｉｅｆｅｌｄｅｒ，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．１９７６）を参照されたい）。
【0146】
抗体は、それらが、目的の標的抗原部位及びそのアイソフォームへの結合の所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。「抗体断片」という用語は、完全長抗体の部分、概して、その抗原結合又は可変領域を含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、ヒト抗体、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体などを含むが、これらに限定されず、合成的に作製され得るか又は天然に存在し得る、任意の種及びリソースに由来する任意の抗体を包含する。
【0147】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられる異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して方向付けられる。「モノクローナル抗体」はまた、当該技術分野で知られる技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。
【0148】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然環境から除去される分子又は細胞を指すために使用される。本明細書で使用される場合、「非天然に存在する」という用語は、天然に見出される対応物とは著しく異なる構造を有する、単離された分子又は細胞を指すために使用される。
【0149】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、又は相同である一方で、鎖の残りは、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応する配列、並びにかかる抗体の断片と同一であるか、又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。本明細書で使用する場合、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、第２のポリペプチドに動作可能に連結された第１のポリペプチドを含む。キメラタンパク質は、任意選択的に、第１又は第２のポリペプチドに動作可能に連結された第３、第４若しくは第５又は他のポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、同じポリペプチドの複数のコピーを含み得る。キメラタンパク質はまた、１つ以上のポリペプチドにおける１つ以上の変異を含み得る。キメラタンパク質の作製方法は、当該技術分野で周知である。
【0150】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、悪性腫瘍を有するか、又は悪性腫瘍を有すると考えられる。多くの種類の悪性腫瘍は、内因性ＮＫ細胞からの攻撃を回避するための耐性メカニズムを発達させることができ、非限定的な例が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、エイズ関連リンパ腫（リンパ腫）、原発性中枢神経系リンパ腫（リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型畸形／横紋状腫瘍、皮膚の基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫及び骨肉腫、並びに悪性線維性組織細胞腫を含む）、脳腫瘍、乳がん、脳気管支支腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、がん腫、心臓腫瘍、非定型畸形／横紋状腫瘍、髄芽腫、胚細胞腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、胆管がん、脊髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、部位内管がん（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上皮腫、食道がん、関節神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚芽細胞腫瘍、腺外胚性芽細胞腫、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管がん、骨原発の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、胚細胞腫瘍、中枢神経胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛性疾患、有毛細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、組織球症（ランゲルハンス細胞）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、腎細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞、小細胞、肺肺芽胞芽腫、及び気管気管支腫瘍）、リンパ腫、男性乳がん、骨原発の線維性組織球腫及び骨肉腫、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性がん、原発不明転移性頸部扁平上皮がん、ＮＵＴ遺伝子変化を伴う中線がん、中咽頭がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、腹筋肉腫（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄異形成性／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄性白血病、急性（ＡＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び鼻副洞がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンリンパ腫、非小細胞性肺がん、膵臓がん、膵臓神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、再発がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、血管腫瘍、小腸がん、軟部組織肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺腫及び胸腺がん、腎臓骨盤及び尿管の移行がん、膣がん、外陰がん、又はウィルムス腫瘍を含み得る。
【0151】
いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、腫瘍関連抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、悪性腫瘍に特徴的な細胞マーカーを含み得る。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍に特徴的な細胞マーカーは、がん性表現型を有する細胞に起因する腫瘍関連抗原、受容体、又は他のタンパク質若しくは構造である。
【0152】
例示的な腫瘍関連抗原には、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ－Ｍｙｃ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ａ－Ｒａｆ、Ｂ－Ｒａｆ、及びＣ－Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＲＴ－１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、ＤＡＭ－１０、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＭＡＲＴ－１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１ＯＯ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサ１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩなど）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃファミリー、ｓｙｋ－ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、シグナルトランスデューサ及び転写の活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ、及びＳＴＡＴＥ、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ－１及びＨＩＦ－２）、核因子カッパＢ（ＮＦ－Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１－４）、ｃ－Ｍｅｔ、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ－３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞がん－５Ｔ４、ＳＭ２２－アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、中皮、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１、メラノサイトメラノーマ系統抗原（例えば、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ７５、ｍｄａ－７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、及びイディオタイプのうちの任意の１つ以上に由来するか、又はそれらを含む腫瘍抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【0153】
いくつかの実施形態では、悪性腫瘍、又はこれらの細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２５、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、がん胚性抗原、アルファフェトタンパク質、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異したｐ５３、変異したｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－ｌエンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＨＩＶ－ｌエンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ４ｌ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－ｌｌＲａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＴＫ－７、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３８、ＣＬＬ－１、ＬｅＹ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＧＰＣ３、ＣＥＡ、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＨＰＶ１６－Ｅ６、ＩＬ１３Ｒａ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＲＴ１、ＭＵＣ１６、ＮＹ－ＥＳＯ－１及び／又はＰＳＣＡ、ＣＬＬ－１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＣＭＡ、ＴＲＯＰ２、ネクチン－４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＰＤ－１、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＡＬＰＰＬ２、又はＣＳＰ１を示す。
【0154】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、ウイルス感染症を患っているか、又はウイルス感染症を患っていると考えられる。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症哺乳類ウイルス感染症。哺乳類ウイルス感染の例としては、ＤＮＡウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス；エプスタインバーウイルス；サイトメガロウイルスなどのヘルペスウイルス；ヴァリオラ（小痘）ウイルスなどの痘ウイルス；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；パピローマウイルス；アデノウイルス）、ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＩＶ Ｉ、ＩＩ；ＨＴＬＶ Ｉ、ＩＩ；ポリオウイルス；Ａ型肝炎；オルソミキソウイルス（例えば、インフルエザウイルス）；パラミオウイルス（例えば、麻疹ウイルス）；狂犬病；Ｃ型肝炎）、コロナウイルス（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こす）、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ノルウイルス、ウェストナイルウイルス、黄熱、リフトバレーウイルス、ラッサ熱ウイルス、エボラウイルス、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、急性である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、慢性である。
【0155】
ウイルスに感染した細胞は、ウイルス感染関連抗原を提示し得る。ウイルス感染関連抗原の非限定的な例としては、コアタンパク質（Ｃタンパク質）、非構造タンパク質３（ＮＳ３）、非構造タンパク質５（ＮＳ５）、エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）、非構造タンパク質４（ＮＳ４）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、Ｆタンパク質、Ｎタンパク質、Ｇタンパク質、キャプシドタンパク質（Ｃ）、非構造タンパク質（ＮＳ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、前駆膜タンパク質（ｐｒＭ）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、Ｖｉｆ、キャプシドタンパク質Ｐ１（ＶＰ２）、キャプシドタンパク質Ｐ１（ＶＰ１）、及びキャプシドタンパク質Ｐ１（ＶＰ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0156】
細胞培養物
一態様では、本開示は、遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、細胞培養物を提供する。実施形態では、ＮＫ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、末梢血細胞又は臍帯血細胞から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
一態様では、本開示は、遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、細胞培養物を提供する。実施形態では、ＮＫ細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、末梢血細胞又は臍帯血細胞から産生されている。実施形態では、ＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
【0157】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。
【0158】
実施形態では、ＮＫ細胞は、細胞表面マーカーＣＤ５６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を発現する。実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞が、遺伝子改変されていないＮＫ細胞と比較して、増加した細胞表面マーカーＣＤ１６、ＴＮＦ－α、及びＣＤ６２Ｌを発現することを提供する。
【0159】
実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、又は他の遺伝子編集技術を用いて、ＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変されている。
【0160】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変されたＡＤＡＭ１７欠損ＮＫ細胞の培養物からのＮＫ細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【0161】
一態様では、本開示は、必要とする対象を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。実施形態では、本発明は、必要とする対象が、ＮＫ耐性がんを患っていることを提供する。実施形態では、本発明は、必要とする対象が、慢性ウイルス感染症を患っていることを提供する。
【0162】
実施形態では、投与は、疾患細胞に特異的な抗体を更に含む。実施形態では、本発明は、投与が、ＣＤ２０に特異的な抗体を更に含むことを提供する。
【0163】
一態様では、本開示は、細胞をＡＤＡＭ１７欠損であるように遺伝子改変することを含む、本明細書に記載のＮＫ細胞培養物を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【0164】
ここで、本開示は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、本開示は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含するように解釈されるべきである。
【0165】
更なる説明なしでは、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本開示の方法を作製及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本開示の実施形態を具体的に指摘しており、本開示の残りの部分をいかなる方法でも限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0166】
ここで、これらの実験に用いる材料及び方法を説明する。
【0167】
実施例１：ＡＤＡＭ１７欠損ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の産生
本発明は、増強された抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有するＮＫ細胞を生成するための、ヒトｉＰＳＣにおけるＡＤＡＭ１７発現の欠失を説明する最初のものである。加えて、このアプローチは、改善されたＣＤ１６発現をもたらすだけでなく、ＡＤＡＭ１７媒介切断を受けるＴＮＦ－α、ＣＤ６２Ｌ、及び潜在的に他の細胞表面分子の増加した発現ももたらす。
本発明は、増強された抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有するＮＫ細胞を生成するための、ヒトｉＰＳＣにおけるＡＤＡＭ１７発現の欠失を説明する最初のものである。加えて、このアプローチは、改善されたＣＤ１６発現をもたらすだけでなく、ＡＤＡＭ１７媒介切断を受けるＴＮＦ－α、ＣＤ６２Ｌ、及び潜在的に他の細胞表面分子の増加した発現ももたらす。
【0168】
以前の研究では、切断耐性ＣＤ１６分子の産生によるｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞における改善されたＣＤ１６発現が、改善されたＡＤＣＣ活性につながることが実証されており、このアプローチは現在、臨床試験（Ｆａｔｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＦＴ５１６及びＦＴ５９６臨床製品）に入っている。しかしながら、このアプローチは、ＣＤ１６発現の増加のみをもたらし、他のＡＤＡＭ１７媒介切断タンパク質の増加をもたらさない。
【0169】
ＡＤＡＭ１７によるＣＤ１６切断を同定した最初の研究は、ＡＤＡＭ１７活性を阻害することが、抗体被覆標的細胞と共インキュベートしたときにＮＫ細胞によるサイトカイン産生の増加をもたらすことを実証し、Ｒｏｍｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ．１２１（１８）：３５９９－６０８を参照されたい。ＡＤＡＭ１７活性を遮断するために、小分子阻害剤（ＢＭＳ５６６３９４）を使用することができ、Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２（７１１６２１）：１－９を参照されたい。本研究は、末梢血ＮＫ細胞上で行った。ＡＤＡＭ１７は、いくつかの異なる細胞型に発現されるため、臨床環境で小分子阻害剤を使用してＡＤＡＭ１７活性を遮断すると、治療有効性に悪影響を及ぼし得る非ＮＫ特異的効果がもたらされる。本発明の遺伝子ノックアウトアプローチは、ｉＰＳＣ－ＮＫを使用し、他の細胞における生理学的ＡＤＡＭ１７活性に影響を与えることなく、ＮＫ細胞上のＡＤＡＭ１７に特異的に影響を与える。
【0170】
別の研究では、末梢血ＮＫ細胞におけるＡＤＡＭ１７発現を中断するために、アデノ随伴ウイルスを使用する相同組換え鋳型の送達とともに、ＡＤＡＭ１７を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用が報告され、Ｐｏｍｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（１）：５２－６３を参照されたい。彼らは、ＡＤＡＭ１７破壊されたＮＫ細胞が、改善されたサイトカイン産物及びがん細胞に対する細胞毒性を示すことを報告している。この記事で報告されている戦略はまた、末梢血ＮＫ細胞を使用し、これは、ドナー変動性が生じやすく、不均一な遺伝子改変されたＮＫ細胞集団を生成する。本発明からのＡＤＡＭ１７欠損ｉＰＳＣ－ＮＫは、増強された抗腫瘍活性を有する一貫した遺伝子編集ＮＫ細胞を生成するための、より安定かつ均一なプラットフォームを提供する。
【0171】
ＮＫ細胞ＡＤＣＣ活性を増強するための戦略として、ＡＤＡＭ１７欠損（ＡＤＡＭ１７－ＫＯ）ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を生成した。簡潔に述べると、ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣは、臍帯血細胞由来のｉＰＳＣ上のＡＤＡＭ１７のエクソン１を標的とする短いガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いて、クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し／Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を使用して生成された。ＡＤＡＭ１７標的化ｓｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のトランスフェクション後、単一細胞クローンを単離し、ＰＣＲ及びサンガー配列決定によって、ＡＤＡＭ１７における変異について評価した。変異を含有しないトランスフェクトされた細胞を野生型対照として使用した。ＡＤＡＭ１７中のホモ接合変異を含有する１つのクローンを増殖し、野生型と比較して、フローサイトメトリーを使用して、表面ＡＤＡＭ１７タンパク質発現の欠如について検証した。
【0172】
ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣは、造血前駆細胞に正常に分化し、次いで、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を含む典型的なＮＫ細胞表面マーカーを均一に発現するＮＫ細胞に分化する。ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫは、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及び健常なドナー由来ＰＢ－ＮＫ細胞と比較して、機能的であり、Ｋ５６２赤白血病細胞をインビトロで殺傷する。驚くべきことに、分化時に、ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞と比較して、約２０％低いＣＤ１６ａ表面発現を発現する。したがって、我々は、磁気細胞分離を用いて、ＡＤＣＣが可能であるＡＤＡＭ１７－ＫＯ細胞のために、ＣＤ１６ａ＋を濃縮するために積極的に選択した。濃縮後、ＡＤＡＭ１７－ＫＯ細胞は、人工抗原提示細胞を使用した培養において６週間の増殖にわたってＣＤ１６ａ＋細胞を安定して発現した。ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＰＢ－ＮＫは、ホルボールエステルによる刺激時にＣＤ１６ａ表面発現を急速に失うが、ＡＤＡＭ１７ ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、この刺激後に、９０％を超えるＣＤ１６ａ発現を維持する。加えて、有意に高い割合のＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣは、ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＰＢ－ＮＫと比較して、ホルボールエステルで４時間刺激した後に、細胞表面上で、ＴＮＦ－ａ及びＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）２つの他の既知のＡＤＡＭ１７基質を発現する。
【0173】
ＡＤＣＣ活性は、典型的にＮＫ細胞殺傷に耐性のある腫瘍、及びこれらの腫瘍細胞上で発現される抗原に結合する治療抗体とのインキュベーション時のＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ発現を観察することによって評価した。ＲＡＪＩ Ｂリンパ腫細胞と共インキュベートした場合、ＣＤ１６ａ＋ ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＰＢ－ＮＫ細胞と比較して、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの存在下で、ＣＤ１６ａ＋ ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞が、増加したＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ発現を媒介する。同様に、ＣＤ１６ａ＋ ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６ａ＋ ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＰＢ－ＮＫと比較して、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブの存在下で、ＣＡＬ２７扁平上皮がん細胞と共インキュベートしたときに、増加したＣＤ１０７ａ及びＩＦＮγ発現をアップレギュレートする。リツキシマブ及びセツキシマブの存在下でのＲＡＪＩ及びＣａｌ２７細胞に対する長期（２４時間）細胞毒性アッセイは、それぞれ、経時的に、ＣＤ１６ａ＋ ＷＴ ｉＰＳＣ－ＮＫ及びＣＤ１６ａ＋ ＰＢ－ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ１６ａ＋ ＡＤＡＭ１７－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞において高い細胞毒性を実証する。
【0174】
参考文献
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４．Ｐｏｍｅｒｏｙ ＥＪ，Ｈｕｎｚｅｋｅｒ ＪＴ，Ｋｌｕｅｓｎｅｒ ＭＧ，Ｌａｈｒ ＷＳ，Ｓｍｅｅｓｔｅｒ ＢＡ，Ｃｒｏｓｂｙ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０２０；２８（１）：５２－６３．
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【国際調査報告】