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特表2023-546669抗体媒介性後天性原発型または再発型特発性ネフローゼ症候群を同定および処置する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-07
(54)【発明の名称】抗体媒介性後天性原発型または再発型特発性ネフローゼ症候群を同定および処置する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20231030BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20231030BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231030BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231030BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231030BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
A61K31/573
A61K39/395 N
A61K38/16
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524509
(86)(22)【出願日】2021-10-22
(85)【翻訳文提出日】2023-06-09
(86)【国際出願番号】 US2021056157
(87)【国際公開番号】W WO2022087341
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】63/104,306
(32)【優先日】2020-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503146324
【氏名又は名称】ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ．
(71)【出願人】
【識別番号】309020703
【氏名又は名称】ボストン メディカル センター コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ウェインス，アストリッド
(72)【発明者】
【氏名】レンケ，ヘルムート ジー．
(72)【発明者】
【氏名】ヘンダーソン，ジョエル エム．
(72)【発明者】
【氏名】ワッツ，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】ケラー，キース
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084NA14
4C084ZC01
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA10
4C086DA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC01
(57)【要約】
循環性抗ネフリン自己抗体の存在に基づいて、微小変化疾患を診断および処置するため、ならびに腎臓移植の前に適格性または処置のために対象を同定するための方法およびキットが本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において微小変化疾患（ＭＣＤ）を診断する方法であって、ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルを参照レベルと比較すること；および
参照レベルよりも高い前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、ＭＣＤを有するか、または発症するリスクがあるとして診断すること
を含む方法。
【請求項2】
前記対象へのＭＣＤに対する処置を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対象において微小変化疾患（ＭＣＤ）を処置する方法であって、ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルを参照レベルと比較すること；
参照レベルよりも高い前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、ＭＣＤを有するか、または発症するリスクがあるとして同定すること；および
ＭＣＤに対する処置を前記対象に投与すること
を含む方法。
【請求項4】
ＭＣＤに対する前記処置が、グルココルチコイド、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、またはＢ細胞を標的化する処置のうちの１つまたは複数の前記対象への投与を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記グルココルチコイドが、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、またはメチルプレドニゾロンである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
Ｂ細胞標的化療法が、Ｂ細胞を枯渇させる標的化された療法またはＢリンパ球刺激の阻害剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
Ｂ細胞を枯渇させる前記標的化された療法が、抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体；または抗ＢＡＦＦ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
Ｂリンパ球刺激の前記阻害剤が、ベリムマブ、タバルマブ、またはアタシセプトである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
抗ネフリン抗体のレベルを低減させる前記処置がプラスマフェレーシスである、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
前記対象からその後の試料を得ること；前記試料中の抗ネフリン抗体のその後のレベルを決定すること；
抗ネフリン抗体の前記その後のレベルを参照レベルと比較すること
をさらに含み、
（ｉ）前記その後の試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルが参照レベルよりも高い場合に、前記方法が、前記対象への前記処置の投与を継続するか、もしくはＭＣＤに対する異なる処置を前記対象に投与することをさらに含むことができるか、または
（ｉｉ）前記その後の試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルが前記参照レベルよりも低い場合に、前記方法が、前記処置を中止することをさらに含むことができる、
請求項４に記載の方法。
【請求項11】
ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；および前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること
を含む方法。
【請求項12】
前記試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルを参照レベルと比較すること；ならびに前記レベルおよび前記参照レベルを健康管理提供者および／または前記対象に提供すること
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
腎臓移植のための末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する対象の適格性を決定する方法であって、前記対象からの試料を用意すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；
前記試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルを参照レベルと比較すること；
参照レベルよりも高い前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、移植のために不適格であるとして同定すること
を含む方法。
【請求項14】
グルココルチコイド、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、またはＢ細胞を標的化する処置のうちの１つまたは複数の前記対象への投与を含む処置を選択し、任意選択的に前記対象に投与すること；前記対象からその後の試料を得ること；
前記試料中の抗ネフリン抗体のその後のレベルを決定すること；
抗ネフリン抗体の前記その後のレベルを参照レベルと比較すること
をさらに含み、
（ｉ）前記その後の試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルが参照レベルよりも高い場合に、前記方法が、前記対象への前記処置の投与を継続するか、もしくは異なる処置を前記対象に投与することをさらに含むことができるか、または
（ｉｉ）前記その後の試料中の抗ネフリン抗体の前記レベルが前記参照レベルよりも低い場合に、前記方法が、前記対象を、移植のために適格であるとして同定することをさらに含むことができる、
請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記試料が、前記対象からの腎臓生検組織、全血、血漿、または血清を含む、請求項１～１４に記載の方法。
【請求項16】
前記試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定することが、ウエスタンブロット；酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；免疫沈降アッセイ；または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行うことを含む、請求項１～１４に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２０年１０月２２日に出願された米国仮出願第６３／１０４，３０６号の利益を主張する。上記出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２２日に出願された米国仮出願第６３／１０４，３０６号の利益を主張する。上記出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府により支援された研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＤＫ００７０５３号の下での政府の支援と共に為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＤＫ００７０５３号の下での政府の支援と共に為された。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本明細書に記載されるのは、循環性抗ネフリン自己抗体の存在に基づいて、微小変化疾患（minimal change disease）を診断および処置するため、ならびに腎臓移植の前に適格性または処置のために対象を同定するための方法およびキットである。
本明細書に記載されるのは、循環性抗ネフリン自己抗体の存在に基づいて、微小変化疾患（minimal change disease）を診断および処置するため、ならびに腎臓移植の前に適格性または処置のために対象を同定するための方法およびキットである。
【背景技術】
【0004】
微小変化を伴うびまん性ポドサイトパチー（podocytopathy）（微小変化疾患（Minimal Chance Disease；ＭＣＤ））は、ネフローゼ症候群（ＮＳ）を有する成人および小児における重要なおよび一般的な病理学的診断である。ＭＣＤは、未知の病因のポドサイトパチーであり、成人および小児の両方が罹患し、Ｂ細胞の役割をサポートする証拠を有する１０～１３。それは、光顕微鏡法によっては微小変化であるが、電子顕微鏡法（ＥＭ）により、高電子密度沈着物のない、びまん性の足突起消失（foot process effacement；ＦＰＥ）およびスリット膜（slit diaphragm；ＳＤ）の喪失を伴う糸球体ポドサイトへの大規模な傷害により特徴付けられる１。これらの変化の帰結は、糸球体濾過障壁（ＧＦＢ）の不全に続く大量のタンパク尿であり、ＧＦＢの完全性は、指状嵌入性（interdigitating）ポドサイト足突起を連結する特殊な接合部ＳＤタンパク質複合体に決定的に依存している。
【発明の概要】
【0005】
本明細書において提供されるのは、対象において微小変化疾患（ＭＣＤ）を診断する方法である。方法は、ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを参照レベルと比較すること；および参照レベルよりも高い試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、ＭＣＤを有するか、または発症するリスクがあるとして診断することを含む。
【0006】
一部の実施形態において、方法は、対象へのＭＣＤに対する処置を選択することを含む。
【0007】
本明細書において提供されるのはまた、対象において微小変化疾患（ＭＣＤ）を処置する方法である。方法は、ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを参照レベルと比較すること；参照レベルよりも高い試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、ＭＣＤを有するか、または発症するリスクがあるとして同定すること；およびＭＣＤに対する処置を対象に投与することを含む。
【0008】
一部の実施形態において、ＭＣＤに対する処置は、グルココルチコイド、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、またはＢ細胞を標的化する処置のうちの１つまたは複数の対象への投与を含む。一部の実施形態において、グルココルチコイドは、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、またはメチルプレドニゾロンである。一部の実施形態において、Ｂ細胞標的化療法は、Ｂ細胞を枯渇させる標的化された療法またはＢリンパ球刺激の阻害剤である。一部の実施形態において、Ｂ細胞を枯渇させる標的化された療法は、抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１９抗体；または抗ＢＡＦＦ抗体である。一部の実施形態において、Ｂリンパ球刺激の阻害剤は、ベリムマブ、タバルマブ、またはアタシセプトである。一部の実施形態において、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置は、プラスマフェレーシスであるか、またはプラスマフェレーシスを含む。
【0009】
一部の実施形態において、方法は、対象からその後の試料を得ること；試料中の抗ネフリン抗体のその後のレベルを決定すること；抗ネフリン抗体のその後のレベルを参照レベルと比較することをさらに含み；（ｉ）その後の試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも高い場合に、方法は、対象への処置の投与を継続するか、もしくはＭＣＤに対する異なる処置を対象に投与することをさらに含むことができるか、または（ｉｉ）その後の試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも低い場合に、方法は、処置を中止することをさらに含むことができる。
【0010】
追加的に、本明細書において提供されるのは、対象、任意選択的にＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料を用意すること；および試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定することを含む方法である。
【0011】
一部の実施形態において、方法は、試料中の抗ネフリン抗体のレベルを参照レベルと比較すること；ならびにレベルおよび参照レベルを健康管理提供者および／または対象に提供すること、ならびに任意選択的に参照範囲を健康管理提供者に提供すること、ならびに対象が参照レベルよりも高いか、または低いかの指標を得ることをさらに含む。
【0012】
さらに、本明細書において提供されるのは、腎臓移植のための末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する対象の適格性を決定する方法である。方法は、対象からの試料を用意すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定すること；試料中の抗ネフリン抗体のレベルを参照レベルと比較すること；および参照レベルよりも高い試料中の抗ネフリン抗体のレベルを有する対象を、移植のために不適格であるとして同定することを含む。一部の実施形態において、方法は、グルココルチコイド、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、またはＢ細胞を標的化する処置のうちの１つまたは複数の対象への投与を含む処置を選択し、任意選択的に対象に投与すること；対象からその後の試料を得ること；試料中の抗ネフリン抗体のその後のレベルを決定すること；抗ネフリン抗体のその後のレベルを参照レベルと比較することをさらに含み；（ｉ）その後の試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも高い場合に、方法は、対象への処置の投与を継続するか、もしくは異なる処置を対象に投与することをさらに含むことができるか、または（ｉｉ）その後の試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも低い場合に、方法は、対象を、移植のために適格であるとして同定することをさらに含むことができる。
【0013】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、試料は、対象からの腎臓生検組織、全血、血漿、または血清を含む。
【0014】
一部の実施形態において、試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定することは、ウエスタンブロット；酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；免疫沈降アッセイ；または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行うことを含む。
【0015】
他に定義されなければ、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料が本発明における使用のために本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および例は実例的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む、本明細書が優先される。
【0016】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1-1】ネフリンに対する循環性自己抗体は、ＮＥＰＴＵＮＥ研究コホートからのＭＣＤ患者のサブセットにおいて存在し、疾患活動性と相関する。（Ａ）組換えヒトネフリンの細胞外ドメインに対する抗体（ｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９）を間接的なＥＬＩＳＡにより測定した。各々の個々の患者試料について重複ｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９被覆ウェルの平均ＯＤ４５０ｎｍから重複非被覆ウェルの平均ＯＤ４５０ｎｍ（非特異的バックグラウンド）を引くことにより抗原特異的結合を決定した。１０００単位／ｍｌを含有するとして定義される１：１００の希釈を伴う単一の陽性患者試料を使用して生成された標準曲線から相対的な抗体力価を次に決定した。抗ネフリン抗体陽性性の閾値（１８７単位／ｍｌ）は最大抗体力価として定義したが、これは、コホートは正常に分布しておらず、健常対照集団（ｎ＝３０）において特異性を最大化する既知の腎臓疾患（点線）はなかったからである。活動性疾患（試料収集の日において尿タンパク質－クレアチニン比（ＵＰＣＲ）＞３ｇ／ｇ）の間に利用可能な最初期の血清試料は、ＮＥＰＴＵＮＥコホートからのＭＣＤと証明された生検を用いて６２人の患者のうちの１８人（２９％）において抗ネフリン抗体について陽性であった。臨床的なＥＬＩＳＡおよびＩＩＦＴアッセイ（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）により決定された、抗ヒトホスホリパーゼＡ２受容体（ｈＰＬＡ２Ｒ＋）抗体を有する５４人のネフローゼ対照患者のうちの５３人（９８％）は、抗ネフリン抗体について陰性であった。抗ネフリン抗体ＥＬＩＳＡについての分散のアッセイ内およびアッセイ間係数はそれぞれ５．５６％および１４．３６％であった。ＮＥＰＴＵＮＥ患者および対照についての抗体力価を表２に与えている。（Ｂ）活動性疾患の間に抗ネフリン抗体陽性（青色バー）であった１８人のＮＥＰＴＵＮＥ患者のうちの１１人は、すべての症例において抗ネフリン抗体陰性（赤色バー）であると試験された完全寛解（試料収集の日においてＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇ）の間に利用可能なその後の血清試料を有した。点線は陽性抗体力価の閾値（１８７単位／ｍｌ）を指し示す。スチューデントｔ検定を使用して、活動性試料と寛解試料との間の差異を比較した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図1-2】ネフリンに対する循環性自己抗体は、ＮＥＰＴＵＮＥ研究コホートからのＭＣＤ患者のサブセットにおいて存在し、疾患活動性と相関する。（Ｃ）（Ｂ）においてＮＥＰＴＵＮＥコホートからのＥＬＩＳＡにより評価された同じ血清試料を、ＨＧＥ（非疾患ヒト腎臓に由来する）からネフリンを免疫沈降させるそれらの能力について評価した。ＥＬＩＳＡの結果と合致して、活動性疾患の間に得られた血清（その上のＡと共に矢印により指し示される（青色））のみがネフリンを免疫沈降させた一方、寛解の間に得られた血清（その上の「Ｒ」と共に矢印により指し示される）はそうでなかった。全ＩｇＧは、各々の患者について活動性試料と寛解試料との間で同等であった。（Ｄ、Ｅ）ＮＥＰＴＵＮＥコホートにおける完全寛解（ＣＲ）および無再発期間についてのカプラン－マイヤー概算値。（Ｄ）登録から完全寛解までの時間は、ログランク検定により抗ネフリン抗体（Ａｂ）陽性群（メジアン時間４．４か月）と陰性群（メジアン時間５．４か月）との間で類似していた（ｐ＝０．７２８８）。
【図1-3】ネフリンに対する循環性自己抗体は、ＮＥＰＴＵＮＥ研究コホートからのＭＣＤ患者のサブセットにおいて存在し、疾患活動性と相関する。（Ｄ、Ｅ）ＮＥＰＴＵＮＥコホートにおける完全寛解（ＣＲ）および無再発期間についてのカプラン－マイヤー概算値。（Ｅ）ＣＲ後の無再発期間は、抗ネフリン抗体陰性群（メジアン時間２１．５７か月）と比較して抗体陽性群（メジアン時間６か月）においてより短かったが、この発見はログランク検定により統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０９４５）。ＣＲはＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇとして定義した。再発は、ＣＲに達した後のＵＰＣＲ＞３ｇ／ｇの場合として定義した。
【図2-1】ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ７＋）のルーチンな臨床的落射蛍光顕微鏡法、周期酸シッフ（Periodic Acid Schiff；ＰＡＳ）染色光顕微鏡法および電子顕微鏡法（ＥＭ）画像。（Ａ）ＦＩＴＣコンジュゲートＩｇＧ抗体を用いて見られる散在性の点状染色はアルブミン染色によっては見られない。近位尿細管再吸収小滴における陽性アルブミン染色に留意されたい。スケールバー ＩＦおよびＰＡＳ：２０μｍ。スケールバー ＥＭ：１μｍ。
【図2-2】ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ７＋）のルーチンな臨床的落射蛍光顕微鏡法、周期酸シッフ（Periodic Acid Schiff；ＰＡＳ）染色光顕微鏡法および電子顕微鏡法（ＥＭ）画像。（Ｂ）ＩｇＧサブタイプについての染色は、点状染色の制限がないことを裏付け、この場合、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプと比較してＩｇＧ１およびＩｇＧ２についてのより高い免疫反応性が観察された。スケールバー ＩＦおよびＰＡＳ：２０μｍ。スケールバー ＥＭ：１μｍ。
【図2-3】ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ７＋）のルーチンな臨床的落射蛍光顕微鏡法、周期酸シッフ（Periodic Acid Schiff；ＰＡＳ）染色光顕微鏡法および電子顕微鏡法（ＥＭ）画像。（Ｃ）カッパおよびラムダ軽鎖についての染色は、等しい強度およびＩｇＧ染色を忠実に映し出す外見を示す。ＰＡＳ染色は最小の光学顕微鏡的変化を示し、ＥＭはびまん性のポドサイト足突起消失を実証する。スケールバー ＩＦおよびＰＡＳ：２０μｍ。スケールバー ＥＭ：１μｍ。
【図3-1】ＭＣＤと証明された生検を有する患者における腎臓生検イメージング研究。（Ａ）ＩｇＧおよびポドサイトスリット膜タンパク質ネフリン（赤）について染色された、ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ１＋／ＭＣＤ７＋）およびＩｇＧ陰性ＭＣＤ（ＭＣＤ５－）における糸球体の代表的な共焦点顕微鏡画像。ＭＣＤ＋生検（ＭＣＤ１＋／ＭＣＤ７＋）（白矢印）において見られるが、ＭＣＤ－生検においては見られないように、ＩｇＧとネフリンとの間、特に点状ＩｇＧとの間に明確なオーバーラップ（黄）があるが、バックグラウンドとの間にはない。右パネルは、ＭＣＤ１＋およびＭＣＤ７＋生検のボックスで囲った区画の拡大された画像を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図3-2】ＭＣＤと証明された生検を有する患者における腎臓生検イメージング研究。（Ｂ）点状ＩｇＧ（白矢印で指し示される）および細胞骨格ポドサイトマーカーシナプトポジン（赤）について染色された、ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ１＋／ＭＣＤ７＋）およびＩｇＧ陰性ＭＣＤ（ＭＣＤ５－）における糸球体の代表的な共焦点顕微鏡画像。それらのいずれの場合においてもＩｇＧとシナプトポジンとの間に認識可能なオーバーラップはない。右パネルは、ＭＣＤ１＋およびＭＣＤ７＋生検のボックスで囲った区画の拡大された画像を示す。スケールバー：１０μｍ。
【図3-3】ＭＣＤと証明された生検を有する患者における腎臓生検イメージング研究。（Ｃ）０．１２５ｍｍの個々のＺスライスの超高分解能構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）画像であり、これは、ネフリンがＧＢＭと会合したままであって、曲線パターンを形成している、代表的な腎臓生検（ＭＣＤ１＋）からのポドサイト接合部の正面図を示す。左の画像は、右の画像に示される足突起会合性シナプトポジンとの相互排他性とは対照的に、スリット膜タンパク質ネフリン（赤）とのＩｇＧの共局在性（黄）を示し、ポドサイトスリット膜に沿ったネフリンとの緊密な空間的関連性を指し示す。（完全な画像スタックは図Ｓ７に示される）。スケールバー：１μｍ。（Ｄ）ネフリンがより顆粒状のパターンに再分布している代表的な腎臓生検（患者ＭＣＤ７＋）からの０．１２５μｍの個々のＺスライスのＳＩＭ画像。左の画像は、右の画像に示される足突起会合性シナプトポジンとの相互排他性とは対照的に、スリット膜タンパク質ネフリン（赤）とのＩｇＧの共局在性（黄）を示し、再分布したネフリンとのＩｇＧの継続した緊密な空間的関連性を指し示す。（完全な画像スタックはサプリメンタルの図Ｓ７に示される）。スケールバー：１。
【図4】ＭＣＤと証明された生検を有する患者における抗ネフリン抗体についての血清学的試験。（Ａ）生検上のＭＣＤおよびＩｇＧ沈着を有する患者のすべて（ｎ＝９）は抗ネフリン抗体陽性であった一方、ＤＮ（ｎ＝２）、アミロイドーシス（ｎ＝１）、ＩｇＧ陰性ＦＳＧＳ（ｎ＝２）、ＩｇＧ陰性ＴＬ（ｎ＝１）、正常（ｎ＝１）、腫瘍腎摘除術の無疾患領域（ｎ＝２）およびＩｇＧ陰性ＭＣＤ（ｎ＝３）からなる、生検上のＩｇＧ沈着を欠いた対照対象のすべては抗ネフリン抗体陰性であった（ｎ＝１２）。マン－ホイットニーＵ検定を使用して群間の差異を比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｂ）血清／血漿試料を、活動性疾患（ＮＳでの診察の７日以内）の間のＩｇＧ陽性ＭＣＤ（ＭＣＤ＋）と証明された生検を有する患者から得、フォローアップ試料を、試料収集の日における完全（ＭＣＤ４＋、ＭＣＤ７＋）または部分（ＭＣＤ８＋）寛解の間に得た。ＭＣＤ３＋について、フォローアップ血清試料を、持続的な完全寛解の期間に入った約３週後に得た。１８７Ｕ／ｍｌの陽性抗ネフリン抗体力価の閾値（点線により指し示される）は健常対照集団の上限に基づいた。血清／血漿中の抗ネフリン抗体は、検出不可能であったか、または、活動性疾患の間のもの（青色バー）と比較して臨床的寛解の間に陽性性の閾値（赤色バー）よりも低くまで有意に低減された。完全寛解は、尿タンパク質クレアチニン比（ＵＰＣＲ）＜０．３ｇ／ｇまたは尿アルブミンクレアチニン比（ＵＡＣＲ）＜０．２ｇ／ｇとして定義した。部分寛解は、０．３ｇ／ｇを下回らないタンパク尿（ＵＰＣＲ）における＞５０％の低減として定義した。スチューデントｔ検定を使用して、活動性試料と寛解試料との間の差異を比較した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図5-1】高いレベルの移植前抗ネフリン抗体は、早期の大量の移植後タンパク尿再発と関連付けられる。（Ａ）ＦＳＧＳを示すその後の生検と共にＥＳＫＤまで進行した小児期発症性、ステロイド依存性ＭＣＤを有する患者の臨床経過。グラフの上に示されるプラスマフェレーシスおよびリツキシマブでの処置に迅速に応答した死後小児ドナー腎臓移植後に、患者は早期の、大量のタンパク尿再発を発症した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡにより抗ネフリン抗体について陽性であると試験された２つの移植前血清試料（－６１７日目、－５２８日目）および初期プラスマフェレセート（plasmapheresate）（シェード付きボックス）（ｄ１３（ＰＰ）；（Ａ）において矢印により指し示される）（点線は１８７Ｕ／ｍｌの陽性性の閾値を指し示す）。ｄ２７（ｄ２７；（Ａ）において矢印により指し示される）およびｄ３６５（ＵＣＰＲ＜０．３ｇ／ｇ）において処置応答後に評価された血清試料は、抗ネフリン抗体について陰性であった。
【図5-2】高いレベルの移植前抗ネフリン抗体は、早期の大量の移植後タンパク尿再発と関連付けられる。（Ｃ）同様に、移植前の血清およびプラスマフェレセートは、ＥＬＩＳＡでの発見と合致して、ＨＧＥ（無疾患ヒト腎臓に由来する）からネフリンを免疫沈降させた。
【図6-1】活動性タンパク尿および療法に対する部分奏功を伴うＮＥＰＴＵＮＥコホートからの単一の患者についての臨床的および抗ネフリン抗体データ。（Ａ）活動性疾患（約１０ｄにおける黒境界を伴う大きい灰色の丸）と部分寛解（約２４０ｄにおける黒境界を伴う大きい丸）との間の利用可能な血清試料を用いた患者の臨床経過であり、ＵＰＣＲ（ｇ／ｇ）（点線は３ｇ／ｇのＵＰＣＲを指し示す）、血清クレアチニン（Ｃｒ）および処置（グラフの上に示される）を示す。
【図6-2】活動性タンパク尿および療法に対する部分奏功を伴うＮＥＰＴＵＮＥコホートからの単一の患者についての臨床的および抗ネフリン抗体データ。（Ｂ）部分寛解と関連付けられる抗ネフリン抗体力価における有意な低減（＊ｐ＝０．０１）（点線は、健常対照集団に基づく１８７Ｕ／ｍｌの陽性抗体力価についての閾値を指し示す）。
【図6-3】活動性タンパク尿および療法に対する部分奏功を伴うＮＥＰＴＵＮＥコホートからの単一の患者についての臨床的および抗ネフリン抗体データ。（Ｃ）２０日目（ｄ２０）および２４４日目（ｄ２４４）に採取された血清試料の両方は、無疾患ヒト腎臓に由来するＨＧＥからネフリンを免疫沈降させ、バンド強度はＥＬＩＳＡによる抗体力価を忠実に映し出している。日；登録後の日数。部分寛解は、試料間のＵＰＣＲにおける＞５０％の低減として定義した。
【図7-1】ＩｇＧ、ＩｇＧ／ネフリンおよびＩｇＧ／シナプトポジン染色の免疫蛍光顕微鏡画像。（Ａ）ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２抗体（ａｂ）を使用してＩｇＧについて染色された糸球体の臨床的落射蛍光画像。右パネルは、点線の四角のより拡大した図を示す。正常な糸球体は、すべての基底膜に沿った低強度の直線状の染色を示す。ＭＣＤのサブセット（ここで示されるＭＣＤ４＋）において、ＩｇＧについての繊細な点状染色が、ＧＢＭ（白矢印）と密接に関連付けられる、毛細血管外コンパートメントにおいて観察される。対照的に、ＭＮ（ここで示されるＭＮ１）における顆粒状ＩｇＧ染色ははるかにより強い強度である。ＤＮ（ここで示されるＤＮ１）を有する患者におけるものを含む、他のタンパク尿状態において顆粒状染色も点状染色も観察されない。
【図7-2】ＩｇＧ、ＩｇＧ／ネフリンおよびＩｇＧ／シナプトポジン染色の免疫蛍光顕微鏡画像。（Ｂ）一次非コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧおよびヒツジ抗ヒトネフリン抗体を使用してＩｇＧおよびネフリンについて染色された同じ症例の共焦点顕微鏡画像。右パネルは、点線の四角のより拡大した図を示す。ネフリン染色強度の低減がすべてのタンパク尿状態において見られ得るが、ネフリンとのＩｇＧの共局在性はＭＣＤ＋においてのみ観察される（白矢印）。
【図7-3】ＩｇＧ、ＩｇＧ／ネフリンおよびＩｇＧ／シナプトポジン染色の免疫蛍光顕微鏡画像。（Ｃ）一次非コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧおよびモルモット抗ヒトシナプトポジン抗体を使用してＩｇＧおよびシナプトポジンについて染色された同じ症例の共焦点顕微鏡画像。右パネルは、点線の四角のより拡大した図を示す。細胞内アクチン会合性シナプトポジンとのＩｇＧ染色の認識可能な共局在性は、正常腎臓、ＭＣＤ＋、ＭＮまたはＤＮにおいて見られない。スケールバー：２０μｍ。
【図8-1】生検ＩｇＧ＋ ＭＣＤ患者血清または血漿は、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）からのネフリンおよびヒトネフリンのアフィニティー精製された組換え細胞外ドメインの両方を免疫沈降させる。（Ａ）ネフリンは、生検ＩｇＧ陽性ＭＣＤ（＋）を有する患者からの血清を用いて、健常ドナー腎臓に由来するヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）から免疫沈降されたが、腎臓生検においてＩｇＧを欠いた対照患者からのものではそうではなかった。
【図8-2】生検ＩｇＧ＋ ＭＣＤ患者血清または血漿は、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）からのネフリンおよびヒトネフリンのアフィニティー精製された組換え細胞外ドメインの両方を免疫沈降させる。（Ｂ）ヒトネフリンの精製された組換え細胞外ドメイン（ｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９）は、腎臓生検中にＭＣＤおよび点状ＩｇＧを有する患者（ＭＣＤ２＋、１３＋、１４＋、１５＋、１６＋）からの血清または血漿により免疫沈降されたが、生検中にＩｇＧ沈着を有しない対照患者（Ｎｘ１、腫瘍腎摘除術の無疾患区画）によってはそうではなかった。インプットレーンは、免疫沈降のために使用された組換えｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９タンパク質（血清またはプロテインＧビーズとインキュベートされなかった）の出発量を示す。
【図8-3】生検ＩｇＧ＋ ＭＣＤ患者血清または血漿は、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）からのネフリンおよびヒトネフリンのアフィニティー精製された組換え細胞外ドメインの両方を免疫沈降させる。（Ｃ）ネフリンは、活動性疾患の間の４人のＭＣＤ＋患者におけるＨＧＥから沈殿されたが、寛解後にそうではなかった。免疫沈降物を還元条件下で電気泳動にかけ、一次ヒツジ抗ヒトネフリン抗体および二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（上）または単独での一次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ（下）を用いるウエスタンブロット分析に供した。
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
ネフリンは、ＳＤの必須の構成要素であり２、３、これは、フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ）の基礎となる、ネフリン細胞表面局在性の完全な欠如を引き起こすネフリン中の遺伝子突然変異（ＮＰＨＳ１）により例証される４、５。確立された遺伝学的基礎を有する先天性ＮＳとは対照的に、小児および成人の両方における非先天性ＮＳの原因は概しては未知のままである。潜在的な原因性の循環性因子を伴う免疫調節異常をサポートする強い証拠があるが、その素性は解明されないままである６、７。グルココルチコイドは寛解の誘導において有効であるが、再発、ステロイド依存性および不耐性が一般的であり、多くの場合に代替的な免疫抑制剤を要求する８。末期腎臓疾患（ＥＳＫＤ）まで進行し、腎臓移植を要求するステロイド依存性ＮＳを有する患者において、疾患はアログラフトにおいて急速に再発することがあり１、壊滅的なおよび処置困難な合併症となる。
ネフリンは、ＳＤの必須の構成要素であり２、３、これは、フィンランド型の先天性ネフローゼ症候群（ＣＮＦ）の基礎となる、ネフリン細胞表面局在性の完全な欠如を引き起こすネフリン中の遺伝子突然変異（ＮＰＨＳ１）により例証される４、５。確立された遺伝学的基礎を有する先天性ＮＳとは対照的に、小児および成人の両方における非先天性ＮＳの原因は概しては未知のままである。潜在的な原因性の循環性因子を伴う免疫調節異常をサポートする強い証拠があるが、その素性は解明されないままである６、７。グルココルチコイドは寛解の誘導において有効であるが、再発、ステロイド依存性および不耐性が一般的であり、多くの場合に代替的な免疫抑制剤を要求する８。末期腎臓疾患（ＥＳＫＤ）まで進行し、腎臓移植を要求するステロイド依存性ＮＳを有する患者において、疾患はアログラフトにおいて急速に再発することがあり１、壊滅的なおよび処置困難な合併症となる。
【0019】
抗ＣＤ２０ Ｂ細胞標的化療法は、頻繁に再発するかまたはステロイド依存性のＮＳを有する小児において９～１１および成人において１２有効であるという最近の発見は、潜在的な自己抗体媒介性の病因を示唆する。しかしながら、この可能性は、腎臓生検におけるＩｇＧ沈着を欠いたＭＣＤという伝統的な見解と両立することは困難である１３。びまん性のポドサイト関連ＩｇＧがＭＣＤにおいて記載されているが、それは膜性腎症（ＭＮ）において見られるものと比較して極小であり、ＥＭによる高電子密度沈着物の非存在を考慮すると、それは、ほとんど意義を持たない非特異的なタンパク質再吸収に一般に帰せられる１４。
【0020】
必須のＳＤ成分ネフリンを標的化する抗体は、動物モデルにおいて投与された場合１５～１７ならびにＣＮＦおよび完全なネフリン欠損を有する小児において腎臓移植後にアロ抗体として生じた場合１８に、大量のタンパク尿を引き起こすことが示されている。動物モデル１５、１６および培養されたポドサイト７、１９の両方において、抗ネフリン抗体は、ＮＳを有する患者の腎臓生検において観察されるものと同一のネフリンの再分布を引き起こす２０、２１。隣接するポドサイトの間の細胞間接合部の分離と共にＳＤから離れるネフリンのこの再分布は、これらの患者におけるタンパク尿を説明するための論理的な概念として長く提唱されてきたが；この再分布の原因は未知のままである。
【0021】
本発明者らは、ネフリンに対する自己抗体は、ＳＤ複合体の完全性に干渉することにより非先天性ＭＣＤの原因となり得るという仮説を立てた。
【0022】
本発明は、非先天性、小児期および成人発症ＭＣＤを有する患者のサブセットにおける、ポドサイトＳＤの必須の構成要素、ネフリンの細胞外ドメインに対する循環性自己抗体の発見に少なくとも部分的に基づく。これらのネフリン自己抗体は、ＭＣＤ腎臓生検中に特異的に存在して、ネフリンと共に特徴的なクラスターを形成する。これらの観察は、自己免疫性の水疱性皮膚状態である天疱瘡と際立った並列性を共有し、天疱瘡において循環性自己抗体は、隣接するケラチノサイトを連結するデスモソーム細胞接着複合体の基礎的な構造タンパク質、デスモソーム細胞接着分子デスモグレイン（ｄｓｇ）を標的化し２２、これは隣接するポドサイトの間の特殊なＳＤ接合部複合体におけるネフリンと類似している。天疱瘡において、これらのｄｓｇ自己抗体は、デスモソームの完全性を妨害する再分布、クラスター化およびエンドサイトーシスを通じて細胞接着に直接的に干渉する２２。ネフリン同種親和性相互作用の実験的抗ネフリン抗体媒介性妨害の先行する報告は、ＭＣＤにおけるこの潜在的な機序をさらにサポートする３。さらには、天疱瘡は、グルココルチコイド処置に対して急速な応答（数日から数週以内）を呈し、これは、ＩｇＧ合成の低減のみによっては説明できず、ケラチノサイトにおける代償的なデスモグレイン合成に起因する可能性がある２５。同様に、ＭＣＤのほとんどの症例は、培養されたヒトポドサイトにおいてネフリン細胞表面発現を上方調節することも示されているグルココルチコイドに対して急速に応答する（数週以内）２６。ＭＣＤ腎臓生検においてネフリンと共局在化するＩｇＧは、ネフリン自己抗体のｉｎ ｓｉｔｕ結合を示し得ることを本開示の発見は指し示す。理論により縛られることを望まないが、この標的化された結合は、ネフリン同種親和性相互作用を妨害して、ＳＤ完全性の早期の喪失に繋がるために十分である可能性があり、その標的ネフリンと共にＩｇＧの再分布は、ポドサイト足突起の基部に沿って進行性に蓄積する大きいＩｇＧ免疫複合体凝集物を標識する膜性腎症で見られるはるかにより激しい染色とは対照的に、この微妙な点状の染色パターンを説明する可能性がある。
【0023】
幸運なことに、ＥＳＫＤへのＭＣＤの進行は希少であるが、進行する患者において、またはより一般的に進行する原発性ＦＳＧＳの初期診断を有する患者において、疾患はアログラフトにおいて急速に再発することがある。移植後早期の大量のタンパク尿におけるネフリン自己抗体の役割は、ＦＳＧＳを示すその後の生検と共に最終的にＥＳＫＤまで進行したステロイド依存性ＭＣＤを有する患者により例証される。移植後早期の大量のタンパク尿は、移植前および疾患再発の時点の両方において同定された循環性ネフリン自己抗体の存在下で起こり、プラスマフェレーシス／リツキシマブで成功裏に処置されて、それらの消失と関連付けられる持続的な寛解に繋がった。これらの発見は、アログラフトにおける疾患再発と関連するネフリンに対するアロ抗体を発生させ、プラスマフェレーシス／リツキシマブに応答するＣＮＦ患者における先行する研究と合致している１９、３６。重要なことに、不可欠な区別は、この患者において、ネフリン自己抗体は移植前および疾患再発の時点の両方において存在した一方、ＣＮＦにおいてそれらは、ネフリンに対するアロ免疫化に起因して移植の直接的な帰結として生じるということである１９。ＦＳＧＳおよびＭＣＤは、一部の重要な類似性、例えば区別不可能な超微細構造変化およびＢ細胞療法に対する応答を共有し３７、この実例的な症例と共に、ネフリン自己抗体の本発明者らの発見はまた、原発性非遺伝性ＦＳＧＳの診断を有する患者のサブセットに拡張され得ることを本発明者らは推測する。
【0024】
そのため、Ｂ細胞標的化療法は、ＮＳ患者のサブセットにおいて使用可能であり、抗ネフリン抗体陽性ＮＳに対する標的化された治療戦略から最も利益を受ける患者を分子的に同定する方法を提供できることを本開示の結果は指し示す。
【0025】
対象
本発明の方法は、ネフローゼ症候群（ＮＳ）を有するか、または有することが疑われる、例えば、微小変化を伴うびまん性ポドサイトパチー（微小変化ネフローゼ症候群、ＭＣＮＳ）または微小変化疾患（ＭＣＤ；リポイドネフローゼもしくはｎｉｌ病（nil disease）としても公知）を有する対象（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト成人および小児を含む、ヒトまたは非ヒト獣医学的対象）において使用され得る。対象を同定する方法は当技術分野において公知であり；例えば、Vivarelli et al., Clin J Am Soc Nephrol. 2017; 12(2):332-345を参照。一部の実施形態において、対象は、尿タンパク質－クレアチニン比（ＵＰＣＲ）＞３ｇ／ｇ、著明なタンパク尿および楕円形の脂肪体、血液量減少症、高血圧、血栓塞栓症、低アルブミン血症（小児において２．５ｇ／ｄＬ未満）、高脂血症、ならびに／または顔面浮腫を有する。小児における診断のための臨界的なレベルは、４０ｍｇ／ｈ／ｍ２より多くのタンパク尿の存在であり、３．５ｇ／ｄ／１．７３ｍ２の閾値は成人において有用である。例えば、emedicine.medscape.com/article/243348において利用可能なMansur et al., “Minimal-Change Disease,” Mescape, Jan 2021を参照。本開示の方法は、例えば、公式には診断されていない対象において、例えば、診断および／もしくは処置の選択を補助するために、または診断された対象において、処置の選択を補助するために、使用され得る。
本発明の方法は、ネフローゼ症候群（ＮＳ）を有するか、または有することが疑われる、例えば、微小変化を伴うびまん性ポドサイトパチー（微小変化ネフローゼ症候群、ＭＣＮＳ）または微小変化疾患（ＭＣＤ；リポイドネフローゼもしくはｎｉｌ病（nil disease）としても公知）を有する対象（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト成人および小児を含む、ヒトまたは非ヒト獣医学的対象）において使用され得る。対象を同定する方法は当技術分野において公知であり；例えば、Vivarelli et al., Clin J Am Soc Nephrol. 2017; 12(2):332-345を参照。一部の実施形態において、対象は、尿タンパク質－クレアチニン比（ＵＰＣＲ）＞３ｇ／ｇ、著明なタンパク尿および楕円形の脂肪体、血液量減少症、高血圧、血栓塞栓症、低アルブミン血症（小児において２．５ｇ／ｄＬ未満）、高脂血症、ならびに／または顔面浮腫を有する。小児における診断のための臨界的なレベルは、４０ｍｇ／ｈ／ｍ２より多くのタンパク尿の存在であり、３．５ｇ／ｄ／１．７３ｍ２の閾値は成人において有用である。例えば、emedicine.medscape.com/article/243348において利用可能なMansur et al., “Minimal-Change Disease,” Mescape, Jan 2021を参照。本開示の方法は、例えば、公式には診断されていない対象において、例えば、診断および／もしくは処置の選択を補助するために、または診断された対象において、処置の選択を補助するために、使用され得る。
【0026】
ネイティブな腎臓における急性ネフローゼ症候群の病歴を有する患者における「再発性限局性分節性糸球体硬化症」（ｒＦＳＧＳ）として参照される、アログラフトにおける再発性急性ネフローゼ症候群は、ＭＣＤから形態学的に区別不可能である。したがって、次にＦＳＧＳおよび最終的にＥＳＫＤに進行したネイティブな腎臓におけるＭＣＤの初期診断を有する移植患者における研究もまた含まれる。この患者は、ｒＦＳＧＳと合致する移植後の急性のおよび高いタンパク尿を急速に発症し、これは生検によって確認されなかった；しかし、彼女の移植前の血清は、抗ネフリン抗体の高いレベルを示し、抗ネフリン抗体はリツキシマブおよびプラスマフェレーシスでの積極的かつ成功裏の処置後に減少した；この患者は、持続的寛解に入り、移植片を保持した。そのため、患者のこの群（急性ネフローゼ症候群の病歴を有し、ＦＳＧＳおよび次にＥＳＫＤを発症しており、次に移植のために考慮される）における抗ネフリン抗体の分析は、予後の決定、ならびに、（例えば、リツキシマブおよびプラスマフェレーシスを使用して）抗ネフリン抗体を低減させるために処置される必要があるか、または移植適格性から除外されるべき対象の同定において役立ち得る。
【0027】
診断方法
本明細書に含まれるのは、ＭＣＤもしくは抗体媒介性後天性特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）を有する対象を診断するため、ならびに／または本明細書に記載されているある特定の療法から利益を受けるであろう（および一部の実施形態において該療法で処置されるべき）対象、例えば、ＭＣＤまたは急性後天性ネフローゼ症候群もしくはＦＳＧＳを有する対象を同定するための方法である。方法は抗ネフリン抗体の検出に依拠する。方法は、対象からの試料を得ること、ならびに試料中の抗ネフリン抗体の存在および／またはレベルを評価すること、ならびに存在および／またはレベルを１つまたは複数の参照、例えば、抗ネフリン抗体の正常なレベル、例えば、罹患していない対象におけるレベルを示す対照参照、および／またはＭＣＤと関連付けられる抗ネフリン抗体のレベルを示す疾患参照、例えば、ＭＣＤを有する対象におけるレベルと比較することを含む。好適な参照値は、実施例１に示されるか、または実施例１に記載されるように決定されるものを含むことができる。
本明細書に含まれるのは、ＭＣＤもしくは抗体媒介性後天性特発性ネフローゼ症候群（ＩＮＳ）を有する対象を診断するため、ならびに／または本明細書に記載されているある特定の療法から利益を受けるであろう（および一部の実施形態において該療法で処置されるべき）対象、例えば、ＭＣＤまたは急性後天性ネフローゼ症候群もしくはＦＳＧＳを有する対象を同定するための方法である。方法は抗ネフリン抗体の検出に依拠する。方法は、対象からの試料を得ること、ならびに試料中の抗ネフリン抗体の存在および／またはレベルを評価すること、ならびに存在および／またはレベルを１つまたは複数の参照、例えば、抗ネフリン抗体の正常なレベル、例えば、罹患していない対象におけるレベルを示す対照参照、および／またはＭＣＤと関連付けられる抗ネフリン抗体のレベルを示す疾患参照、例えば、ＭＣＤを有する対象におけるレベルと比較することを含む。好適な参照値は、実施例１に示されるか、または実施例１に記載されるように決定されるものを含むことができる。
【0028】
本明細書において使用される場合、「試料」という用語は、本明細書に記載される方法を使用して抗ネフリン抗体の存在について試験されるべき材料を指す場合、とりわけ、腎臓生検組織、全血、血漿、または血清を含み；一部の実施形態において、方法は、血漿／血清中の循環性自己抗体の存在について試験すること、および次に組織において試験して、生検組織における結合を確認することを含む。使用される試料の種類は、方法が使用される臨床的な状況に依存して変動し得る。試料中の抗ネフリン抗体の同定のための様々な方法が当技術分野において周知である。
【0029】
抗ネフリン抗体の存在および／またはレベルは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、ウエスタンブロット；酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；タンパク質アレイ検出；ラジオイムノアッセイ；免疫組織化学（ＩＨＣ）；免疫沈降アッセイ；ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）；質量分析を含むがこれらに限定されない、標準的な電気泳動および定量的イムノアッセイ方法を使用して評価され得る（Kim (2010) Am J Clin Pathol 134:157-162; Yasun (2012) Anal Chem 84(14):6008-6015; Brody (2010) Expert Rev Mol Diagn 10(8):1013-1022; Philips (2014) PLOS One 9(3):e90226; Pfaffe (2011) Clin Chem 57(5): 675-687）。方法は、典型的には、標識、例えば直接的にまたは間接的にシグナルを提供する蛍光、化学発光、放射性、および酵素的または色素分子を明らかにすることを含む。本明細書において使用される場合、「標識」という用語は、検出可能な物質、例えば放射活性剤またはフルオロフォア（例えばフィコエリトリン（ＰＥ）もしくはインドシアニン（Ｃｙ５））の、プローブ（例えば、ネフリンタンパク質）へのカップリング（すなわち物理的な連結）の他に、検出可能な物質との反応性によるプローブ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）の間接的な標識化を指す。
【0030】
一部の実施形態において、ＥＬＩＳＡ方法が使用されてもよく、該方法において、表面、例えばマイクロタイタープレートのウェルはネフリンタンパク質抗原で被覆される。抗ネフリン抗体を含有するかまたは含有することが疑われる試料は次にウェルに適用される。抗体－抗原複合体が形成されたであろう十分な長さの時間の後に、プレートは洗浄されて任意の未結合の部分は除去され、検出可能に標識された分子が加えられる。再び、十分なインキュベーションの期間の後に、プレートは洗浄されて、任意の過剰な、未結合の分子は除去され、標識された分子の存在が、当技術分野において公知の方法を使用して決定される。ＥＬＩＳＡ方法のバリエーション、例えば競合ＥＬＩＳＡまたは競合アッセイ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡもまた使用されてもよく、これらは当業者に周知である。
【0031】
一部の実施形態において、ＩＨＣ方法が使用されてもよい。ＩＨＣは、ｉｎ ｓｉｔｕで生物学的マーカーを検出する方法を提供する。生物学的マーカーの存在および正確な細胞位置が検出され得る。典型的には試料はホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで固定され、パラフィン中に包埋され、染色および共焦点顕微鏡法によるその後の検査のために切片に切断される。ＩＨＣの現行の方法は、直接的なまたは間接的な標識化を使用する。試料はまた、ＩＨＣのバリエーションとして、免疫蛍光（ＩＦ）が行われる場合に蛍光顕微鏡法により検査されてもよい。
【0032】
一部の実施形態において、抗ネフリン抗体の存在および／またはレベルは、疾患参照におけるタンパク質の存在および／またはレベルと同等であり、ならびに対象は、ＭＣＤと関連付けられる１つまたは複数の症状を有し、よって対象はＭＣＤを有すると診断される。一部の実施形態において、対象は、ＭＣＤの顕性の徴候または症状を有しないが、評価されるタンパク質のうちの１つまたは複数の存在および／またはレベルは、疾患参照におけるタンパク質の存在および／またはレベルと同等であり、よって対象は、ＭＣＤを発症する増加したリスクを有する。一部の実施形態において、人物がＭＣＤを有するか、またはＭＣＤを発症する増加したリスクを有すると一旦決定されたら、例えば、当技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載されている、処置が投与され得る。
【0033】
好適な参照値は、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、標準的な臨床試験方法論および統計分析を使用して、決定され得る。参照値は、任意の妥当な形態を有することができる。一部の場合において、参照は、抗ネフリン抗体の意味のあるレベル、例えば、抗ネフリン抗体の正常なレベル、例えば、罹患していない対象もしくは本明細書に記載される疾患を発症するリスクがない対象（もしくはそのような対象のコホート）におけるレベルを示す対照参照レベル、および／またはＭＣＤと関連付けられる抗ネフリン抗体のレベルを示す疾患参照のための予め決定された値を含む。
【0034】
予め決定されたレベルは、上位または下位四分位数、三分位数、または他のセグメントから統計的に異なると決定される臨床試験集団の他のセグメントの境界を定義する単一のカットオフ値（閾値）、例えばメジアンもしくは平均、またはレベルであることができる。それは、カットオフ値（または閾値）の範囲、例えば信頼区間であることができる。それは、比較群、例えば、１つの定義された群における疾患を発症するリスクまたは疾患の存在との関連性が、別の定義された群における疾患のリスクまたは存在よりもある倍数（例えば、約２倍、４倍、８倍、１６倍またはより大きい倍数）でより高い、またはより低い比較群に基づいて確立され得る。それは、範囲、例えば、対象（例えば、対照対象）の集団が、群、例えば低リスク群、中リスク群および高リスク群、または最下位四分位数が最も低いリスクを有する対象であり、および最上位四分位数が最も高いリスクを有する対象である四分位数、またはｎ－分位数の最下位が最も低いリスクを有する対象であり、およびｎ－分位数の最上位が最も高いリスクを有する対象であるｎ－分位数（すなわち、ｎ個の周期的なスペースの間隔）に均等に（または不均等に）分割される範囲であることができる。
【0035】
一部の実施形態において、予め決定されたレベルは、例えば、異なる時点、例えば、より早い時点における、同じ対象におけるレベルまたは発生率である。
【0036】
予め決定された値は、選択される対象（例えば、ヒト対象）の特定の集団に依存することができる。例えば、見たところ健常な集団は、本明細書に記載される障害（例えば、ＭＣＤ）を有するか、有する可能性が高いか、または有するリスクがより高い対象の集団とは異なる、抗ネフリン抗体のレベルの「正常な」範囲を有する。よって、選択される予め決定された値は、対象（例えば、ヒト対象）が含まれるカテゴリー（例えば、性別、年齢、健康状態、リスク、他の疾患の存在）を考慮に入れてもよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者によりルーチンに過ぎない実験を用いて選択され得る。
【0037】
可能性、またはリスクの特徴付けにおいて、多数の予め決定された値が確立され得る。
【0038】
処置方法
本明細書に記載される方法は、参照レベルよりも高い抗ネフリン抗体のレベルを有するとして、例えば、抗ネフリン抗体の存在と関連付けられる障害を有するとして、本明細書に記載される方法を使用して同定された対象を処置する方法を含む。一部の実施形態において、障害はＭＣＤである。一般に、方法は、治療有効量の本明細書に記載されている処置を、本明細書に記載される方法によりそのような処置を必要とすると決定された対象に投与することを含む。
本明細書に記載される方法は、参照レベルよりも高い抗ネフリン抗体のレベルを有するとして、例えば、抗ネフリン抗体の存在と関連付けられる障害を有するとして、本明細書に記載される方法を使用して同定された対象を処置する方法を含む。一部の実施形態において、障害はＭＣＤである。一般に、方法は、治療有効量の本明細書に記載されている処置を、本明細書に記載される方法によりそのような処置を必要とすると決定された対象に投与することを含む。
【0039】
この文脈において使用される場合、「処置する」ことは、抗ネフリン抗体と関連付けられる障害、例えば、ＭＣＤの少なくとも１つの症状を改善させることを意味する。多くの場合に、ＭＣＤは、上昇した尿タンパク質－クレアチニン比（ＵＰＣＲ）（例えば、＞３ｇ／ｇ）、著明なタンパク尿および楕円形の脂肪体、血液量減少症、高血圧、血栓塞栓症、低アルブミン血症（小児において２．５ｇ／ｄＬ未満）、高脂血症、ならびに／または顔面浮腫を結果としてもたらし；そのため、処置は、上記のいずれかにおける低減ならびに正常な尿タンパク質－クレアチニン比（ＵＰＣＲ）（例えば、３ｇ／ｇ未満）、タンパク尿の正常レベルおよび楕円形の脂肪体の非存在、正常血液量（normoolemia）、正常血圧、正常アルブミン血（小児において２．５ｇ／ｄＬより高い）、正常な脂質レベル、および／または顔面浮腫の低減もしくは非存在への復帰または接近を結果としてもたらすことができる。抗ネフリン抗体と関連付けられる状態の処置のための治療有効量の本明細書に記載される処置の投与は、抗ネフリン抗体の減少したレベルを結果としてもたらす。
【0040】
「有効量」は、有益なまたは所望される結果をもたらすために十分な量である。例えば、治療的な量は、所望される治療効果を達成する量である。この量は、予防有効量と同じまたは異なることができ、予防有効量は、疾患または疾患症状の開始を予防するために必要な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬において投与され得る。治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効な投薬量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、隔日毎に１回を含む；１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回で投与され得る。疾患または障害の重症度、先行する処置、対象の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因は、対象を有効に処置するために要求される投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを当業者は理解する。さらに、治療有効量の本明細書に記載される治療用化合物での対象の処置は、単一の処置または処置のシリーズを含むことができる。
【0041】
本開示の方法において使用され得る処置は、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン、もしくはメチルプレドニゾロン）またはＢ細胞標的化療法（例えば、Ｂ細胞を枯渇させる標的化された療法、例えば、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ（ocratuzamab）、イブリツモマブ、オビヌツズマブ、トシツモマブ、ウブリツキシマブ（ublitiximab）、ＴＲＵ－０１５、もしくはオルブリツキシマブ（orublituximab）；抗ＣＤ１９抗体、例えばブリナツモマブ、コルツキシマブ・ラブタンシン（coltuximabravtansine）、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ－５５１、デニンツズマブ・マホドチン（denintuzumabmafodotin）、ＳＡＲ３４１９（ｈｕＢ４－ＤＭ４）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、タプリツモマブ・パプトックス（taplitumomabpaptox）、ＸｍＡｂ ５８７１、ＭＤＸ－１３４２、ＡＦＭ１１、イネビリズマブ、タファシタマブ、もしくは米国特許第８６９１９５２号明細書に記載される抗体（例えば、Naddafi and Davami, Int J Mol Cell Med. 2015 Summer; 4(3): 143-151を参照）；または抗ＢＡＦＦ抗体、例えばベリムマブの他に、Ｂリンパ球刺激の阻害剤、例えばベリムマブもしくはタバルマブ；またはアタシセプト（ＢＬｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子；B-Lymphocyte Stimulator）およびＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド；A PRoliferation-Inducing Ligand）の両方の受容体の結合性部分を含むヒト組換え融合タンパク質）（Hartung et al., Ther Adv Neurol Disord. 2010 Jul; 3(4): 205-216を参照）のうちの１つまたは複数の投与を含む。一部の実施形態において、処置はプラスマフェレーシスを含む（例えば、Kaplan, J Clin Apher 28, 3-10 (2013)を参照）。
【0042】
プラスマフェレーシスを含む、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置もまた、本明細書に記載される方法において使用され得る。
【0043】
一部の実施形態において、本開示の方法は、ＭＣＤを有するか、または有することが疑われる対象からの試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定することを含む。試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも高い場合に、方法は、ＭＣＤを有するか、または発症するリスクがあるとして対象を同定すること、および任意選択的に本明細書に記載されている処置、例えば、グルココルチコイド、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、例えばプラスマフェレーシス、またはＢ細胞を低減させる処置を、対象に投与することをさらに含むことができる。
【0044】
一部の実施形態において、本開示の方法は、ＥＳＲＤを有し、および腎臓移植を受けようとしている対象からの試料中の抗ネフリン抗体のレベルを決定することを含む。試料中の抗ネフリン抗体のレベルが参照レベルよりも高い場合に、方法は、移植後に重度のタンパク尿および腎臓疾患を発症するリスクがあるとして対象を同定すること、ならびに任意選択的に本明細書に記載されている処置、例えば、抗ネフリン抗体のレベルを低減させる処置、例えばプラスマフェレーシス、またはＢ細胞を低減させる処置を、対象に投与することをさらに含むことができる。
【0045】
キット
本明細書において提供されるのはまた、本開示の方法における使用のためのキットである。キットは、ネフリンタンパク質プローブ、例えば、ネフリンの細胞外ドメインを含むものを含むことができる。ネフリンの細胞外ドメインの例示的な配列（ａａ１～１０５９）は以下の通りである：
本明細書において提供されるのはまた、本開示の方法における使用のためのキットである。キットは、ネフリンタンパク質プローブ、例えば、ネフリンの細胞外ドメインを含むものを含むことができる。ネフリンの細胞外ドメインの例示的な配列（ａａ１～１０５９）は以下の通りである：
【0046】
【化1】
【0047】
一部の実施形態において、ネフリンタンパク質は、組換えにより製造され、および／またはタグ付加もしくは標識される。標識はフルオロフォアまたは放射性標識を含むことができる。タグは、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（例えば、（６ＸＨＩＳ））、ｃ－ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．）配列タグを含むことができ、ネフリンタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて融合され得る。ネフリンは溶液中にあることができるか、または表面、例えば、マイクロタイタープレートのウェルもしくはビーズ、例えば、磁気もしくはポリマービーズに吸着させることができる。キットは、ネフリンタンパク質プローブに結合した抗ネフリン抗体を検出するための抗ヒトＩｇＧ抗体、および／または、例えば、対照としての使用のためのもしくは、例えば、組織試料中の、ＩｇＧ抗体とのネフリン共局在性を検出するための、抗ネフリン抗体を含むことができる。任意選択的に、抗ヒトＩｇＧおよび／または抗ネフリン抗体は、標識されているか、または他に検出可能である（例えば、比色検出のための酵素もしくは基質を含む）。任意選択的に、キットは、標識されているか、または他に検出可能な（例えば、比色検出のための酵素もしくは基質を含む）二次抗体をさらに含む。
【実施例】
【0048】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、該実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【0049】
方法
以下の材料および方法を以下の実施例において使用した。
以下の材料および方法を以下の実施例において使用した。
【0050】
臨床試料（腎臓組織および血清／血漿）
４つの施設：Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＭＣ）およびＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃにわたる腎臓病理医の共同研究により腎臓生検を独立的に評価した。それらの施設に通院した患者から、元々は臨床的な分析のために収集された廃棄される試料（ＢＷＨ／ＢＭＣ／Ｍａｙｏ ｃｌｉｎｉｃ）またはＫｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｉｏｂａｎｋからのアーカイブ試料（腎臓生検の時点において血清／血漿収集のために同意したＢＷＨもしくはＭＧＨに通院した患者についてＰａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＲＢ Ａｐｐｒｏｖａｌにしたがって、Ｄｒ． Ｓｕｓｈｒｕｔ Ｗａｉｋａｒ、Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの好意による）のいずれかとして血清／血漿を得た。組織学的研究を、ルーチンの臨床評価のために受け取ったアーカイブ腎臓組織に対して行い、該研究は、びまん性ポトサイトパチー、他のネフローゼ状態、および腫瘍腎摘除術からの非新生物性腎臓実質を含んだ。医療記録の検討、組織学的および血清学的研究は、それらの施設のためのそれぞれの治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。遺伝学的試験は、移植後の再発性疾患を有する患者についてのみ行い、ＮＥＰＴＵＮＥコホートの外側で登録された他の患者については行わなかった。
４つの施設：Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＭＣ）およびＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃにわたる腎臓病理医の共同研究により腎臓生検を独立的に評価した。それらの施設に通院した患者から、元々は臨床的な分析のために収集された廃棄される試料（ＢＷＨ／ＢＭＣ／Ｍａｙｏ ｃｌｉｎｉｃ）またはＫｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｂｉｏｂａｎｋからのアーカイブ試料（腎臓生検の時点において血清／血漿収集のために同意したＢＷＨもしくはＭＧＨに通院した患者についてＰａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＲＢ Ａｐｐｒｏｖａｌにしたがって、Ｄｒ． Ｓｕｓｈｒｕｔ Ｗａｉｋａｒ、Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの好意による）のいずれかとして血清／血漿を得た。組織学的研究を、ルーチンの臨床評価のために受け取ったアーカイブ腎臓組織に対して行い、該研究は、びまん性ポトサイトパチー、他のネフローゼ状態、および腫瘍腎摘除術からの非新生物性腎臓実質を含んだ。医療記録の検討、組織学的および血清学的研究は、それらの施設のためのそれぞれの治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。遺伝学的試験は、移植後の再発性疾患を有する患者についてのみ行い、ＮＥＰＴＵＮＥコホートの外側で登録された他の患者については行わなかった。
【0051】
同様に、活動性疾患（尿タンパク質クレアチニン比（ＵＰＣＲ）＞３ｇ／ｇ）の間の、および利用可能な場合に寛解における、Ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｓｔｕｄｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＥＰＴＵＮＥ）縦断的研究２３からの微小変化疾患（ＭＣＤ）と証明された生検を有する患者から血清を得た。完全寛解はＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇとして定義し、部分寛解はタンパク尿における＞５０％の低減として定義した。ステロイド依存性ネフローゼ症候群（ＳＤＮＳ）は、ステロイドの漸減の間またはその停止の１４日以内における２回またはより多くの連続する再発を伴うＳＳＮＳとして定義した。特有の除外基準は適用しなかった。
【0052】
健常対照血清はＰａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｂａｎｋから無作為に選択し、任意の腎臓または自己免疫疾患を有する対象を特に除外した。商用の酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および間接免疫蛍光試験（ＩＩＦＴ）（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）を使用してＭＧＨ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて抗ｈＰＬＡ２Ｒ抗体についてネフローゼ患者からの血清を評価した。患者匿名性を保つために試料をコード化した。
【0053】
ＮＥＰＴＵＮＥコホートの全ゲノムシークエンシング
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ－ｓｅｑを使用して３０ｘの目標メジアン深さを有する全ゲノムシークエンシングを行った。標準的なパイプライン、Ｇｏｔｃｌｏｕｄを配列アライメントおよびバリアントコーリングのために適用した２７、２８。バリアント分析は、メンデルＮＳに結び付けられる約７０個の遺伝子に集中した。７０個の以前に結び付けられたメンデルＮＳ遺伝子において病原性バリアントをスクリーニングするために、本発明者らは、以前に報告されたもの２９に類似したパイプラインを用いた。ＡＣＭＧ標準およびガイドライン３０にしたがって病原性バリアントを最終的に分類した。分析された遺伝子：ＡＣＴＮ４、ＡＤＣＫ４、ＡＬＧ１、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＶＩＬ、ＣＤ１５１、ＣＤ２ＡＰ、ＣＤＫ２０、ＣＦＨ、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＱ２、ＣＯＱ６、ＣＲＢ２、ＤＧＫＥ、ＤＬＣ１、ＥＭＰ２、ＦＡＴ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＮＦ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＳＮ１、ＩＴＳＮ２、ＪＡＧ１、ＫＡＮＫ１、ＫＡＮＫ２、ＫＡＮＫ４、ＬＡＧＥ３、ＬＡＭＢ２、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＡＧＩ２、ＭＴＴＬ１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１Ｅ、ＭＹＯ５Ｂ、ＮＥＩＬ１、ＮＰＨＳ１、ＮＰＨＳ２、ＮＵＰ１０７、ＮＵＰ２０５、ＮＵＰ９３、ＮＸＦ５、ＯＣＲＬ、ＯＳＧＥＰ、ＰＡＸ２、ＰＤＳＳ２、ＰＬＣＥ１、ＰＭＭ２、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＰＲＯ、ＳＣＡＲＢ２、ＳＧＰＬ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＴＮＳ２、ＴＰ５３ＲＫ、ＴＰＲＫＢ、ＴＲＰＣ６、ＴＴＣ２１Ｂ、ＵＭＯＤ、ＷＤＲ７３、ＷＴ１、ＸＰＯ５、ＺＭＰＳＴＥ２４。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ－ｓｅｑを使用して３０ｘの目標メジアン深さを有する全ゲノムシークエンシングを行った。標準的なパイプライン、Ｇｏｔｃｌｏｕｄを配列アライメントおよびバリアントコーリングのために適用した２７、２８。バリアント分析は、メンデルＮＳに結び付けられる約７０個の遺伝子に集中した。７０個の以前に結び付けられたメンデルＮＳ遺伝子において病原性バリアントをスクリーニングするために、本発明者らは、以前に報告されたもの２９に類似したパイプラインを用いた。ＡＣＭＧ標準およびガイドライン３０にしたがって病原性バリアントを最終的に分類した。分析された遺伝子：ＡＣＴＮ４、ＡＤＣＫ４、ＡＬＧ１、ＡＮＬＮ、ＡＲＨＧＡＰ２４、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＶＩＬ、ＣＤ１５１、ＣＤ２ＡＰ、ＣＤＫ２０、ＣＦＨ、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＱ２、ＣＯＱ６、ＣＲＢ２、ＤＧＫＥ、ＤＬＣ１、ＥＭＰ２、ＦＡＴ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＮＦ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＳＮ１、ＩＴＳＮ２、ＪＡＧ１、ＫＡＮＫ１、ＫＡＮＫ２、ＫＡＮＫ４、ＬＡＧＥ３、ＬＡＭＢ２、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＡＧＩ２、ＭＴＴＬ１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１Ｅ、ＭＹＯ５Ｂ、ＮＥＩＬ１、ＮＰＨＳ１、ＮＰＨＳ２、ＮＵＰ１０７、ＮＵＰ２０５、ＮＵＰ９３、ＮＸＦ５、ＯＣＲＬ、ＯＳＧＥＰ、ＰＡＸ２、ＰＤＳＳ２、ＰＬＣＥ１、ＰＭＭ２、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＰＲＯ、ＳＣＡＲＢ２、ＳＧＰＬ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＴＮＳ２、ＴＰ５３ＲＫ、ＴＰＲＫＢ、ＴＲＰＣ６、ＴＴＣ２１Ｂ、ＵＭＯＤ、ＷＤＲ７３、ＷＴ１、ＸＰＯ５、ＺＭＰＳＴＥ２４。
【0054】
ヒト糸球体抽出物
Beck et al３１により以前に記載されたようにヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）を調製した。簡潔に述べれば、糸球体は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｄｏｎｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから得られた移植のために好適でないとみなされたヒト腎臓（医学的研究における使用のために承認されたもの）から、等級付けされた篩分け、続いてＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）中での糸球体タンパク質の単離により単離した。ＩｇＧを組織溶解液からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｌｕｓ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とのインキュベーションにより予備クリアランスした。ルーチンの楔状生検において、２０％未満の大域的糸球体硬化を伴う腎臓のみを糸球体単離のために使用した。
Beck et al３１により以前に記載されたようにヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）を調製した。簡潔に述べれば、糸球体は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｄｏｎｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから得られた移植のために好適でないとみなされたヒト腎臓（医学的研究における使用のために承認されたもの）から、等級付けされた篩分け、続いてＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）中での糸球体タンパク質の単離により単離した。ＩｇＧを組織溶解液からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｌｕｓ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）とのインキュベーションにより予備クリアランスした。ルーチンの楔状生検において、２０％未満の大域的糸球体硬化を伴う腎臓のみを糸球体単離のために使用した。
【0055】
ルーチンの腎臓生検処理
生検取得後に、腎臓皮質を光（１０％の中性緩衝化ホルマリン）、免疫蛍光（Ｚｅｕｓ輸送培地）および電子顕微鏡法（カルノフスキーの固定液）処理に直ちに割り当てた。ルーチンの臨床的免疫蛍光のために、４μｍの凍結切片を９５％のエタノール中で１０分間固定し、１：２０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナルウサギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ；Ｆ０３１５）とインキュベートした。１：２０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートヒツジ抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ；それぞれＡＦ００６、ＡＦ００７、ＡＦ００８、ＡＦ００９）をＩｇＧサブクラス評価のために使用した。１：３０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナルウサギ抗ヒトアルブミン（Ｄａｋｏ；Ｆ０１１７）を使用してアルブミンを検出した。＃１．５カバースリップと共にＤａｋｏ蛍光封入剤（Ｄａｋｏ；Ｓ３０２３）を使用して切片をマウントした。１５０ｍｓの露光でＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７２カメラを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３顕微鏡上で免疫蛍光画像を取得した。
生検取得後に、腎臓皮質を光（１０％の中性緩衝化ホルマリン）、免疫蛍光（Ｚｅｕｓ輸送培地）および電子顕微鏡法（カルノフスキーの固定液）処理に直ちに割り当てた。ルーチンの臨床的免疫蛍光のために、４μｍの凍結切片を９５％のエタノール中で１０分間固定し、１：２０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナルウサギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ；Ｆ０３１５）とインキュベートした。１：２０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートヒツジ抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ；それぞれＡＦ００６、ＡＦ００７、ＡＦ００８、ＡＦ００９）をＩｇＧサブクラス評価のために使用した。１：３０に希釈されたＦＩＴＣコンジュゲートポリクローナルウサギ抗ヒトアルブミン（Ｄａｋｏ；Ｆ０１１７）を使用してアルブミンを検出した。＃１．５カバースリップと共にＤａｋｏ蛍光封入剤（Ｄａｋｏ；Ｓ３０２３）を使用して切片をマウントした。１５０ｍｓの露光でＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７２カメラを用いてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３顕微鏡上で免疫蛍光画像を取得した。
【0056】
共焦点顕微鏡法
共焦点顕微鏡法のために、ヒト腎臓生検の４μｍの凍結切片を９５％のエタノール中に１０分間固定し、その後に０．２％の魚ゼラチン、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。すべての抗体をこのブロッキング溶液中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌの一次ポリクローナルヒツジ抗ヒトネフリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ４２６９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１０９９）を使用してネフリンを検出した。１：１０００に希釈された抗シナプトポジン（Ｎ末端）モルモットポリクローナル抗血清（Ｐｒｏｇｅｎ；ＧＰ９４－Ｎ）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１０７５）抗体を使用してシナプトポジンを検出した。それぞれ１：５００および１：３００に希釈された一次ポリクローナルウサギ抗ヒトポドシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ；Ｐ０３７２）および一次モノクローナルウサギ抗ヒトＷＴ１クローンＳＣ０６－４１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＡ５－３２２１５）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１００４２）を使用してポドシンおよびウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を検出した。１：７５０に希釈された一次モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ２００６９９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ４８８コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１２０２）を使用してＩｇＧ免疫沈着物を検出した。すべての二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）コンジュゲート抗体は１：５００に希釈した。＃１．５カバースリップと共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｈ－１０００）を使用して切片をマウントし、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰＥ顕微鏡上で画像を取得した。
共焦点顕微鏡法のために、ヒト腎臓生検の４μｍの凍結切片を９５％のエタノール中に１０分間固定し、その後に０．２％の魚ゼラチン、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。すべての抗体をこのブロッキング溶液中に希釈し、室温で１時間インキュベートした。１μｇ／ｍｌの一次ポリクローナルヒツジ抗ヒトネフリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ４２６９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１０９９）を使用してネフリンを検出した。１：１０００に希釈された抗シナプトポジン（Ｎ末端）モルモットポリクローナル抗血清（Ｐｒｏｇｅｎ；ＧＰ９４－Ｎ）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１０７５）抗体を使用してシナプトポジンを検出した。それぞれ１：５００および１：３００に希釈された一次ポリクローナルウサギ抗ヒトポドシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ；Ｐ０３７２）および一次モノクローナルウサギ抗ヒトＷＴ１クローンＳＣ０６－４１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＡ５－３２２１５）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１００４２）を使用してポドシンおよびウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を検出した。１：７５０に希釈された一次モノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ２００６９９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ４８８コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１２０２）を使用してＩｇＧ免疫沈着物を検出した。すべての二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）コンジュゲート抗体は１：５００に希釈した。＃１．５カバースリップと共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止封入剤（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、Ｈ－１０００）を使用して切片をマウントし、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰＥ顕微鏡上で画像を取得した。
【0057】
構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）
共焦点顕微鏡法のための上述のプロトコールにしたがって処理された４μｍの固定された、凍結されたヒト腎臓生検切片に対して構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）イメージングを行った。３つの水冷ＰＣＯ．ｅｄｇｅ ｓＣＭＯＳカメラ、４８８ｎｍ、５６８ｎｍのレーザー線、および５２８／４８ｎｍ、６０９／３７ｎｍのエミッションフィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ）を備えたＯＭＸ Ｖ４ Ｂｌａｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）顕微鏡を使用してすべての画像を収集した。画像は、８０ｎｍの最終ピクセルサイズと共に６０Ｘ／１．４２ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。４～８μｍのＺスタックを０．１２５μｍのｚ間隔で取得し、平面当たり１５個の未加工画像（各々５つの面と共に３回転）を取得した。浸漬油マッチング（immersion oil matching）２４を使用して各々の試料について球面収差を最小化した。ＣＵＤＡ加速３Ｄ－ＳＩＭ再構築コード（CUDA-accelerated 3D-SIM reconstruction code）３２を使用して、チャンネル特異的な、測定光学的トランスファー機能（channel-specific, measured optical transfer function）、および０．００１のウィーナーフィルター定数を用いて未加工データセットから超高分解能画像を計算的に再構築した。同じ組織凍結切片上で一次マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ２００６９９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ４８８コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１２０２）抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１０３１）抗体の両方で染色されたヒト腎臓組織を用いて調製された、単一の生物学的算出スライドを使用して、軸方向および横方向の色ずれを決定した。ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）のｉｍｗａｒｐ機能を使用して実験データセットを次に登録した３３。
共焦点顕微鏡法のための上述のプロトコールにしたがって処理された４μｍの固定された、凍結されたヒト腎臓生検切片に対して構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）イメージングを行った。３つの水冷ＰＣＯ．ｅｄｇｅ ｓＣＭＯＳカメラ、４８８ｎｍ、５６８ｎｍのレーザー線、および５２８／４８ｎｍ、６０９／３７ｎｍのエミッションフィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ）を備えたＯＭＸ Ｖ４ Ｂｌａｚｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）顕微鏡を使用してすべての画像を収集した。画像は、８０ｎｍの最終ピクセルサイズと共に６０Ｘ／１．４２ Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。４～８μｍのＺスタックを０．１２５μｍのｚ間隔で取得し、平面当たり１５個の未加工画像（各々５つの面と共に３回転）を取得した。浸漬油マッチング（immersion oil matching）２４を使用して各々の試料について球面収差を最小化した。ＣＵＤＡ加速３Ｄ－ＳＩＭ再構築コード（CUDA-accelerated 3D-SIM reconstruction code）３２を使用して、チャンネル特異的な、測定光学的トランスファー機能（channel-specific, measured optical transfer function）、および０．００１のウィーナーフィルター定数を用いて未加工データセットから超高分解能画像を計算的に再構築した。同じ組織凍結切片上で一次マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ；ａｂ２００６９９）、続いて二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ４８８コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ２１２０２）抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標） ５６８コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１１０３１）抗体の両方で染色されたヒト腎臓組織を用いて調製された、単一の生物学的算出スライドを使用して、軸方向および横方向の色ずれを決定した。ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）のｉｍｗａｒｐ機能を使用して実験データセットを次に登録した３３。
【0058】
組換えヒトネフリンおよびホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ）の生成
両方ともＣ末端ポリヒスチジン（６ＸＨＩＳ）タグを有する、８つのＩｇ様Ｃ２型ドメインおよび単一のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む、ヒトネフリンの細胞外サブドメイン（アミノ酸１～１０５９）、ならびに、Ｎ末端リシンドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメインおよび８つのＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含む、ヒトホスホリパーゼＡ２受容体（ｈＰＬＡ２Ｒ）をコードする別々のプラスミドを標準的なクローニング技術により生成した。正確な配列を全プラスミドシークエンシング（ＭＧＨ ＤＮＡ ｃｏｒｅ）により確認した。１．５μｇのＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を使用して１０６個の細胞当たり０．５μｇのプラスミドを用いてＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）へのトランスフェクションを行った。プラスミドおよびＰＥＩを２０分間、最終体積の１０分の１のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中でプレインキュベートし、次に滴下で細胞に加えた。３～５日後に、細胞生存が＞９５％であれば、細胞培養培地を遠心分離（３００×ｇ、１０分間）により採取した。イミダゾールを１０ｍＭの最終濃度まで加え、培地を氷上でフィルター滅菌（０．２μｍ）した。ニッケルＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）をＰＢＳ中の１０ｍＭのイミダゾールで３回洗浄し、次に濾過された培地と終夜４℃でローラーミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上でインキュベートした。ニッケルＮＴＡ樹脂を次にＰＢＳ中の１０ｍＭのイミダゾールで３回洗浄し、組換えタンパク質をＰＢＳ中の３００ｍＭのイミダゾールで溶出させた。溶出された画分の純度を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、一緒にプールし、１０Ｋ分子量カットオフを有するＡｍｎｉｃｏｎ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１ｍｌまで濃縮した。得られたタンパク質をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）３００カラムに流し、０．５ｍｌの画分を収集した。溶出された画分の純度を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することにより濃度を決定した。精製されたネフリンの免疫反応性を、還元条件下で一次ヒツジ抗ヒトネフリン抗体（Ｒ＆Ｄ）、続いて二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ならびに精製されたｈＰＬＡ２Ｒの免疫反応性を、非還元条件下で患者からの血清を使用して、１：１０００に希釈された既知の抗ＰＬＡ２Ｒ抗体（商用のＥＬＩＳＡおよびＩＩＦＴ（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）により決定される）ならびに二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ウエスタンブロット分析により確認した。
両方ともＣ末端ポリヒスチジン（６ＸＨＩＳ）タグを有する、８つのＩｇ様Ｃ２型ドメインおよび単一のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む、ヒトネフリンの細胞外サブドメイン（アミノ酸１～１０５９）、ならびに、Ｎ末端リシンドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメインおよび８つのＣ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を含む、ヒトホスホリパーゼＡ２受容体（ｈＰＬＡ２Ｒ）をコードする別々のプラスミドを標準的なクローニング技術により生成した。正確な配列を全プラスミドシークエンシング（ＭＧＨ ＤＮＡ ｃｏｒｅ）により確認した。１．５μｇのＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を使用して１０６個の細胞当たり０．５μｇのプラスミドを用いてＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）へのトランスフェクションを行った。プラスミドおよびＰＥＩを２０分間、最終体積の１０分の１のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中でプレインキュベートし、次に滴下で細胞に加えた。３～５日後に、細胞生存が＞９５％であれば、細胞培養培地を遠心分離（３００×ｇ、１０分間）により採取した。イミダゾールを１０ｍＭの最終濃度まで加え、培地を氷上でフィルター滅菌（０．２μｍ）した。ニッケルＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）をＰＢＳ中の１０ｍＭのイミダゾールで３回洗浄し、次に濾過された培地と終夜４℃でローラーミキサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上でインキュベートした。ニッケルＮＴＡ樹脂を次にＰＢＳ中の１０ｍＭのイミダゾールで３回洗浄し、組換えタンパク質をＰＢＳ中の３００ｍＭのイミダゾールで溶出させた。溶出された画分の純度を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、一緒にプールし、１０Ｋ分子量カットオフを有するＡｍｎｉｃｏｎ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１ｍｌまで濃縮した。得られたタンパク質をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）３００カラムに流し、０．５ｍｌの画分を収集した。溶出された画分の純度を４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上のＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２８０ｎｍで吸光度を測定することにより濃度を決定した。精製されたネフリンの免疫反応性を、還元条件下で一次ヒツジ抗ヒトネフリン抗体（Ｒ＆Ｄ）、続いて二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ならびに精製されたｈＰＬＡ２Ｒの免疫反応性を、非還元条件下で患者からの血清を使用して、１：１０００に希釈された既知の抗ＰＬＡ２Ｒ抗体（商用のＥＬＩＳＡおよびＩＩＦＴ（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）により決定される）ならびに二次ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ウエスタンブロット分析により確認した。
【0059】
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標） ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を被覆緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中に希釈された１μｇ／ｍｌのヒトネフリンの組換え細胞外ドメインまたはｈＰＬＡ２Ｒのいずれかで被覆し、４℃で終夜インキュベートした。非被覆対照ウェルを使用して各々の患者試料についての非特異的結合（抗原の非存在下）を決定し、これによりバックグラウンドサブトラクションを可能とした。プレートを３００μｌのＰＢＳ ＋ ０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。プレートを３００μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１時間室温でブロッキングし、次に０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＳｕｐｅｒＴ）中に１：１００で希釈された１００μｌの患者試料と４℃で終夜インキュベートした。初期高力価を有する試料をその後に１：２００または１：４００まで希釈した。プレートを３００μｌのＰＢＳＴでさらに５回洗浄し、続いて、５００ｒ．ｐ．ｍで１時間室温で振盪しながら、ＳｕｐｅｒＴ中に０．７５μｇ／ｍｌまで希釈された１００μｌのビオチンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、高度ｘ線吸収抗体（highly x-absorbed antibody）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、５００ｒ．ｐ．ｍで３０分間室温で振盪しながら、ＳｕｐｅｒＴ中に１：２０００まで希釈された１００μｌのＨＲＰコンジュゲートアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とインキュベートした。ＰＢＳＴでの５回の最終洗浄後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、プレートを１０分間室温でインキュベートした。１００μｌの停止溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各々の個々の患者試料について重複抗原被覆ウェルの平均ＯＤから重複非被覆ウェルの平均ＯＤを引くことによりバックグラウンドサブトラクションを行った３４。１：１００の希釈は１，０００単位／ｍｌを含有することとして任意に定義された、陽性患者試料（ＭＣＤ１５＋）の連続２倍希釈系列から導出された標準曲線を使用して抗ネフリン抗体力価を次に決定した。
Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標） ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を被覆緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）中に希釈された１μｇ／ｍｌのヒトネフリンの組換え細胞外ドメインまたはｈＰＬＡ２Ｒのいずれかで被覆し、４℃で終夜インキュベートした。非被覆対照ウェルを使用して各々の患者試料についての非特異的結合（抗原の非存在下）を決定し、これによりバックグラウンドサブトラクションを可能とした。プレートを３００μｌのＰＢＳ ＋ ０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。プレートを３００μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１時間室温でブロッキングし、次に０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＳｕｐｅｒＴ）中に１：１００で希釈された１００μｌの患者試料と４℃で終夜インキュベートした。初期高力価を有する試料をその後に１：２００または１：４００まで希釈した。プレートを３００μｌのＰＢＳＴでさらに５回洗浄し、続いて、５００ｒ．ｐ．ｍで１時間室温で振盪しながら、ＳｕｐｅｒＴ中に０．７５μｇ／ｍｌまで希釈された１００μｌのビオチンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、高度ｘ線吸収抗体（highly x-absorbed antibody）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、５００ｒ．ｐ．ｍで３０分間室温で振盪しながら、ＳｕｐｅｒＴ中に１：２０００まで希釈された１００μｌのＨＲＰコンジュゲートアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とインキュベートした。ＰＢＳＴでの５回の最終洗浄後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、プレートを１０分間室温でインキュベートした。１００μｌの停止溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。各々の個々の患者試料について重複抗原被覆ウェルの平均ＯＤから重複非被覆ウェルの平均ＯＤを引くことによりバックグラウンドサブトラクションを行った３４。１：１００の希釈は１，０００単位／ｍｌを含有することとして任意に定義された、陽性患者試料（ＭＣＤ１５＋）の連続２倍希釈系列から導出された標準曲線を使用して抗ネフリン抗体力価を次に決定した。
【0060】
免疫沈降およびウエスタンブロット
１体積の患者血清または血漿を、５体積の、ＨＧＥ、または１００ｎｇのヒトネフリンの組換え細胞外ドメインを含有するＲＩＰＡ緩衝液と混合し、終夜（Ｏ／Ｎ）４℃でインキュベートした。ＩｇＧ－抗原複合体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｐｌｕｓアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて２時間４℃で沈殿させた。ビーズを遠心分離により収集し、０．２％のＴｗｅｅｎ－２０を補充したＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、蒸留水で最終の洗浄を行った。タンパク質をビーズから溶出させ、９５℃で５分間、２．５％のベータ－メルカプトエタノールを含有する１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中で加熱することにより還元条件下で変性させた。試料を、プレキャストされた７．５％ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ Ｔｒｉｓ－グリシンゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードし、Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳランニングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の存在下１００Ｖで９０分間、電気泳動にかけた。２５Ｖ、１．３Ａで１０分間Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｔｔｅｒシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にタンパク質を転写した。膜を１時間室温で、５％のスキムミルク（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳＴ中でブロッキングし、続いて、２％のスキムミルク（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳＴ中に希釈された１μｇ／ｍｌのポリクローナルヒツジ抗ヒトネフリン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ４２６９）と４℃で終夜インキュベートした。すべての他の抗体を、５％のスキムミルクを含有するＴＢＳＴ中に希釈し、１時間室温でインキュベートした。膜をＴＢＳＴで各々５分間で３回洗浄し、続いて１：２０，０００に希釈された二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；７１３－０３５－１４７）。１：１０，０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；７０９－０３５－１４９）を使用してヒトＩｇＧ重鎖を検出した。最後に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標） Ｗｅｓｔ ＰＩＣＯ ＰＬＵＳまたはＦＥＭＴＯ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と３分間インキュベートし、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｏｏｄ ＩＩＩゲルドックシステム（Ｂｉｏｒａｄ）上で画像を取得した。
１体積の患者血清または血漿を、５体積の、ＨＧＥ、または１００ｎｇのヒトネフリンの組換え細胞外ドメインを含有するＲＩＰＡ緩衝液と混合し、終夜（Ｏ／Ｎ）４℃でインキュベートした。ＩｇＧ－抗原複合体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｐｌｕｓアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて２時間４℃で沈殿させた。ビーズを遠心分離により収集し、０．２％のＴｗｅｅｎ－２０を補充したＴｒｉｓ緩衝化食塩水（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、蒸留水で最終の洗浄を行った。タンパク質をビーズから溶出させ、９５℃で５分間、２．５％のベータ－メルカプトエタノールを含有する１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中で加熱することにより還元条件下で変性させた。試料を、プレキャストされた７．５％ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ Ｔｒｉｓ－グリシンゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードし、Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳランニングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の存在下１００Ｖで９０分間、電気泳動にかけた。２５Ｖ、１．３Ａで１０分間Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｔｔｅｒシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にタンパク質を転写した。膜を１時間室温で、５％のスキムミルク（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳＴ中でブロッキングし、続いて、２％のスキムミルク（ｗ／ｖ）を含むＴＢＳＴ中に希釈された１μｇ／ｍｌのポリクローナルヒツジ抗ヒトネフリン抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ４２６９）と４℃で終夜インキュベートした。すべての他の抗体を、５％のスキムミルクを含有するＴＢＳＴ中に希釈し、１時間室温でインキュベートした。膜をＴＢＳＴで各々５分間で３回洗浄し、続いて１：２０，０００に希釈された二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートロバ抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；７１３－０３５－１４７）。１：１０，０００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；７０９－０３５－１４９）を使用してヒトＩｇＧ重鎖を検出した。最後に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（商標） Ｗｅｓｔ ＰＩＣＯ ＰＬＵＳまたはＦＥＭＴＯ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と３分間インキュベートし、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｏｏｄ ＩＩＩゲルドックシステム（Ｂｉｏｒａｄ）上で画像を取得した。
【0061】
臨床症例の詳細
早期の大量の移植後タンパク尿の再発における移植前のネフリン自己抗体の潜在的な役割を例証するために、本発明者らは、ステロイド依存性（ＳＤＮＳ）となり、最終的に進行してその後の生検でＦＳＧＳを示したエージ２（age 2）のステロイド応答性ＭＣＤの初期診断を有する２７歳の女性の症例を提示する。重要なことに、臨床的全エクソームシークエンシング（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）では、バリアントを引き起こす既知のＮＳ疾患は見出されなかった。彼女は最終的にＥＳＫＤを発症し、最初に血液透析を５年間受け、次に即時のグラフト機能と共に死亡小児ドナー腎臓を与えられた（低温虚血時間：１９時間）（図５Ａ）。算出されたパネル反応性抗体（ｃＰＲＡ）は０であり、誘導療法はバシリキシマブからなり、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムスおよびプレドニゾロンの維持療法を伴った。下肢浮腫と関連付けられる、早期の大量の移植後タンパク尿の再発の状況において、彼女は５エピソードのプラスマフェレーシス（ｘ５）および２用量のリツキシマブで処置された。彼女のタンパク尿は急速に改善し、彼女はアログラフト生検を要求しなかった（図５Ａ）。２つの血清試料を移植の１７および２０か月前に得、これと共に第１のプラスマフェレセート試料を移植後タンパク尿再発に対する処置の間に得、これらはすべて、ＥＬＩＳＡにより抗ネフリン抗体について陽性であると試験され（図５Ｂ）、健常ヒト腎臓由来ＨＧＥからネフリンを免疫沈降させた（図５Ｃ）。２７日目の処置応答後および移植の１年後の完全寛解の間に評価された血清試料の両方は、ＥＬＩＳＡによりネフリン自己抗体について陰性であると試験された（図５Ｂ）。
早期の大量の移植後タンパク尿の再発における移植前のネフリン自己抗体の潜在的な役割を例証するために、本発明者らは、ステロイド依存性（ＳＤＮＳ）となり、最終的に進行してその後の生検でＦＳＧＳを示したエージ２（age 2）のステロイド応答性ＭＣＤの初期診断を有する２７歳の女性の症例を提示する。重要なことに、臨床的全エクソームシークエンシング（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）では、バリアントを引き起こす既知のＮＳ疾患は見出されなかった。彼女は最終的にＥＳＫＤを発症し、最初に血液透析を５年間受け、次に即時のグラフト機能と共に死亡小児ドナー腎臓を与えられた（低温虚血時間：１９時間）（図５Ａ）。算出されたパネル反応性抗体（ｃＰＲＡ）は０であり、誘導療法はバシリキシマブからなり、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムスおよびプレドニゾロンの維持療法を伴った。下肢浮腫と関連付けられる、早期の大量の移植後タンパク尿の再発の状況において、彼女は５エピソードのプラスマフェレーシス（ｘ５）および２用量のリツキシマブで処置された。彼女のタンパク尿は急速に改善し、彼女はアログラフト生検を要求しなかった（図５Ａ）。２つの血清試料を移植の１７および２０か月前に得、これと共に第１のプラスマフェレセート試料を移植後タンパク尿再発に対する処置の間に得、これらはすべて、ＥＬＩＳＡにより抗ネフリン抗体について陽性であると試験され（図５Ｂ）、健常ヒト腎臓由来ＨＧＥからネフリンを免疫沈降させた（図５Ｃ）。２７日目の処置応答後および移植の１年後の完全寛解の間に評価された血清試料の両方は、ＥＬＩＳＡによりネフリン自己抗体について陰性であると試験された（図５Ｂ）。
【0062】
[実施例１]
微小変化疾患におけるネフリンを標的化する自己抗体の発見は新規の自己免疫の病因をサポートする
ネフリンに対する循環性自己抗体が、ＭＣＤと証明された生検を有し、および既知の遺伝学的基礎を有しない（確立されたメンデルＮＳ遺伝子における既知の病原性バリアントを欠いている）患者の血清中に検出可能かどうかを最初に決定するために、本発明者らは、４１人（６６％）の小児および２１人（３４％）の成人からなるＮｅｐｈｒｏｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｓｔｕｄｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＥＰＴＵＮＥ）縦断コホート研究２３から得られた血清を評価した（表２）。本発明者らは、組換えの、アフィニティー精製されたヒトネフリンの細胞外ドメイン（ｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９）を使用する間接的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発し、健常対照集団（ｎ＝３０）における最大力価に基づいて、抗ネフリン抗体（ａｂ）陽性性の閾値を確立した（図１Ａ）。活動性疾患（尿タンパク質対クレアチニン比、ＵＰＣＲ＞３ｇ／ｇ）の間に得られた最初期の血清試料の評価は、等しい数の成人および小児を含む、６２人の患者のうちの１８人（２９％）は、ネフリンに対する自己抗体について陽性であることを明らかにした（図１Ａ）。臨床的に検証されたＥＬＩＳＡおよび間接免疫蛍光試験（ＩＩＦＴ）アッセイにより、抗ｈＰＬＡ２Ｒ抗体について陽性であると試験された５４人の患者のうちの５３人（９８％）からの対照血清は、抗ネフリンａｂについて陰性であった（図１Ａ）。
微小変化疾患におけるネフリンを標的化する自己抗体の発見は新規の自己免疫の病因をサポートする
ネフリンに対する循環性自己抗体が、ＭＣＤと証明された生検を有し、および既知の遺伝学的基礎を有しない（確立されたメンデルＮＳ遺伝子における既知の病原性バリアントを欠いている）患者の血清中に検出可能かどうかを最初に決定するために、本発明者らは、４１人（６６％）の小児および２１人（３４％）の成人からなるＮｅｐｈｒｏｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｓｔｕｄｙ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＥＰＴＵＮＥ）縦断コホート研究２３から得られた血清を評価した（表２）。本発明者らは、組換えの、アフィニティー精製されたヒトネフリンの細胞外ドメイン（ｈＮｅｐｈｒｉｎＧ１０５９）を使用する間接的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発し、健常対照集団（ｎ＝３０）における最大力価に基づいて、抗ネフリン抗体（ａｂ）陽性性の閾値を確立した（図１Ａ）。活動性疾患（尿タンパク質対クレアチニン比、ＵＰＣＲ＞３ｇ／ｇ）の間に得られた最初期の血清試料の評価は、等しい数の成人および小児を含む、６２人の患者のうちの１８人（２９％）は、ネフリンに対する自己抗体について陽性であることを明らかにした（図１Ａ）。臨床的に検証されたＥＬＩＳＡおよび間接免疫蛍光試験（ＩＩＦＴ）アッセイにより、抗ｈＰＬＡ２Ｒ抗体について陽性であると試験された５４人の患者のうちの５３人（９８％）からの対照血清は、抗ネフリンａｂについて陰性であった（図１Ａ）。
【0063】
患者の臨床的特徴（表１）および登録から完全寛解（ＣＲ）までのメジアン時間は、抗ネフリンａｂ陽性群と陰性群との間で類似していた（それぞれ４．４か月と５．４か月；ｐ＝０．７２８８）（図Ｓ２）。しかしながら、無再発期間は、ａｂ陰性群と比較して抗ネフリンａｂ陽性群でより短く、但しこの発見は従来の統計的有意性のレベルに達しなかった（再発までのメジアン時間はそれぞれ６．０か月と２１．５７か月；ｐ＝０．０９４５）。
【0064】
その後の血清試料は、１８人の抗ネフリンａｂ陽性患者のうちの１２人から完全寛解（ＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇ）または部分寛解（タンパク尿における＞５０％の低減）のいずれかの間に利用可能であり、該患者において本発明者らはネフリン自己抗体の完全な非存在または有意な低減をそれぞれ観察した（図１Ｂ、図６Ａ～Ｃ）。ＥＬＩＳＡの結果と合致して、活動性疾患または部分寛解の間に得られた血清のみが、健常ドナー腎臓由来ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）からネフリンを免疫沈降させた一方、完全寛解の間に得られた血清はそうでなかった（図１Ｃ）。
【0065】
これらのネフリン自己抗体の潜在的な病原性役割をさらに調べるために、本発明者らは次に、それらがＭＣＤを有する患者の腎臓内に存在するかどうかを確立することを試みた。ＮＥＰＴＵＮＥコホートの１つの制限は、これらの患者からの生検材料はさらなる評価のために利用可能でなかったということであり、そこで本発明者らは、生検および血清試料のために本発明者ら自身の施設および共同研究者に転じた。
【0066】
長年にわたり、本発明者らは、バックグラウンドから別個の、ルーチンの免疫蛍光染色によるＭＣＤを有する患者（ＭＣＤ＋）のサブセットにおけるＩｇＧについての繊細な点状染色を観察してきた（図７Ａ）。それは、ＭＮにおいて観察される目立つＩｇＧ染色と比較した場合にはるかにより微妙であり（図７Ａ）、この特色は以前に記載されているが１４、その意義は十分に確立されていない。本発明者らはしたがって、この微妙なＩｇＧは、ネフリンを標的化する自己抗体を表し得るという仮説を立てた。染色のアーチファクトの可能性を制限するために、本発明者らは、すべて同一の染色パターンを示す別個の非コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ ａｂ、抗軽鎖ａｂおよびアイソタイプ特異的抗ＩｇＧ ａｂと共に本発明者らが独立的に検証した直接的にコンジュゲートされたＦＩＴＣ抗ヒト（anti-huma）ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２ ａｂをルーチンに使用する（図２Ａ～Ｃ）。重要なことに、本発明者らは、同時的な糸球体アルブミン染色の完全な欠如を観察し、これは、この特色はＩｇＧ選択的であり、非特異的なタンパク質再吸収を反映しないことを指し示した（図２Ａ～Ｃ）。
【0067】
本発明者らは、共焦点顕微鏡法を利用して、過去３年にかけて本発明者らが受領および処理した腎臓生検においてこの点状ＩｇＧをさらに評価した。本発明者らは、ＩｇＧ分布の２つの優勢的なパターン：ＧＢＭ会合性の微細な点状または曲線構造およびより頂端に位置する点状のおよび漠然と小胞性のクラスターを観察し、後者がより一般的であった。これらの全く異なる染色パターンは、抗体結合および／または再分布の異なるステージを反映する可能性がある。評価されたすべてのＭＣＤ＋生検において、本発明者らは、点状ＩｇＧを有し、およびバックグラウンドではない、ネフリンの特有の共局在性を観察し（図３Ａ、図７Ｂ）、これは、この点状ＩｇＧを欠いた対照生検においてさらに立証された（図３Ａ、図７Ｂ）。抗原特異性は、共焦点顕微鏡法（図３Ａ～Ｂ、図７Ｃ）およびよりいっそう高い空間分解能を達成する超高分解能構造化照明顕微鏡法（ＳＲ－ＳＩＭ）２４（図３Ｃ、Ｄ）により、ポドサイト足突起関連シナプトポジンとはそうではないがＳＤ関連ネフリンとのＩｇＧの明確な空間的関連性により立証された。さらには、ＳＤから離れたネフリンの顆粒状再分布を呈する生検において、ＭＣＤにおいて以前に記載されたように２０、２１、ＩｇＧは、３つの細胞内ポドサイト特異的タンパク質；シナプトポジン（足突起関連）、ポドシン（ＳＤ関連）およびＷＴ１（核）と共局在化しなかった。
【0068】
腎臓生検において点状ＩｇＧを有するＭＣＤ＋患者はネフリンに対する循環性自己抗体を実際に有することを確認するために、本発明者らは、該患者のうちの９人について特に活動性疾患の間に利用可能であった血清または血漿を評価した。予想されたように、９人すべての患者は、全員が血清学的に陰性であった腎臓生検において点状ＩｇＧを欠いた１２人の対照患者とは対照的に、ＥＬＩＳＡにより抗ネフリン抗体について血清学的に陽性であった（図４Ａ、表３）。フォローアップ血清または血漿試料が９人のＭＣＤ＋患者のうちの４人について利用可能であり、これらは、処置応答と合致した抗体力価における有意な低減を示した（図４Ｂ）。これらの発見はＩＰにより立証され（図８Ａ～Ｃ）、循環性ネフリン自己抗体について血清学的に陽性であったこの研究における患者のいずれも、ＰＬＡ２Ｒと交差反応しなかった。
【0069】
最後に、ＭＣＤから区別不可能な形態学的特色を一般に示す、移植後の疾患再発における移植前のネフリン自己抗体の潜在的な役割を強調するために、本発明者らは、腎臓移植を要求するＥＳＫＤに進行した、小児期発症性のステロイド依存性ＭＣＤを有し、背景となる遺伝学的基礎（臨床的全エクソームシークエンシングにより決定される）を有しない２７歳の患者を同定した（詳細な臨床歴は上記に与えている）。抗ネフリン自己抗体についての病原性役割と合致して、彼女は、移植後の早期に大量のタンパク尿を発症し、これは、ＣＮＦとは対照的に１８、１９、ネフリン自己抗体の高い移植前レベルと関連付けられた（図５Ａ～Ｃ）。フェレーシス前の患者血漿と比べた初期プラスマフェレセートの０．６７の希釈係数を考慮して３７、プラスマフェレセートにおける閾値よりも高い抗ネフリン自己抗体の検出は、タンパク尿再発の時点の患者における循環性抗ネフリン抗体の存在を指し示した（図５Ａ～Ｃ）。持続的な寛解に達した後に、循環性ネフリン自己抗体は移植の１年後にこの患者において検出可能でなかった（図５Ａ～Ｃ）。
【0070】
【表1】
【0071】
陽性抗ネフリン抗体（α－ネフリンＡｂ）レベルの閾値は、腎疾患を有しない無作為に選択された健常対照集団に基づいた。完全寛解はＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇとして定義した。部分寛解は、０．３ｇ／ｇを下回らないタンパク尿における＞５０％の低減として定義した。連続変数はメジアン（四分位数間範囲）として提示している。統計分析は、連続変数のためにマン－ホイットニー検定およびカテゴリカル変数のためにフィッシャーの直接検定を使用して行った（＊ｐ＜０．０５）。
【0072】
【表2】
【0073】
【表3】
【0074】
【表4】
【0075】
表２は、患者または対照についての関連する臨床情報を提供する。ＮＥＰＴＵＮＥコホートにおけるすべての患者は、微小変化疾患（ＭＣＤ）と証明された生検を有したが；腎臓生検ＩｇＧ沈着状態は報告されておらず、免疫蛍光画像も生検材料もさらなる評価のために利用可能でなかった。タンパク尿値（尿タンパク質クレアチニン比（ＵＰＣＲ））は、活動性疾患の間の抗ネフリン抗体（α－ネフリンＡｂ）試験のために血清試料が収集された同じ日（または１日以内）からのものである。＃患者Ｎ１３について、ＵＰＣＲは血清収集の日に３２３ｇ／ｇであると算出されたため、次の利用可能なＵＰＣＲの値（２０日後に評価されたもの）を与えている。ピークｓＣｒ（血清クレアチニン）は、フォローアップ期間の間に達した最も高い血清クレアチニンであった。部分寛解はＵＰＣＲにおける＞５０％の低減として定義し、完全寛解（ＣＲ）はＵＰＣＲ＜０．３ｇ／ｇとして定義した。患者は、ＣＲに最初に達した後にＵＰＣＲ＞３ｇ／ｇの場合に再発したとみなした。ＣＲに達しなかった患者において、再発状態は適用不可（Ｎ／Ａ）である。血清は、Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｂａｎｋからの無作為に選択された健常対照コホートから得た。陽性抗ネフリン抗体力価の閾値は、１８７Ｕ／ｍｌの健常コホートについての最大値に基づいた。抗体力価は、各々の患者について複製試料（ｎ≧３）の平均±Ｓ．Ｄ．として与えている。２つの臨床的に検証されたアッセイ、ＥＬＩＳＡおよびＩＩＦＴ（Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ）により抗ヒトＰＬＡ２Ｒ抗体について陽性（ｈＰＬＡ２Ｒ＋）と試験された患者からの血清は、ＭＧＨ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。略語：Ｐ、プレドニゾロン；ＣＮＩ、カルシニューリン阻害剤；ＭＭＦ、ミコフェノール酸モフェチル；ＣＴＸ、シクロホスファミド；ＲＩＴ、リツキシマブ；ＦＬＵ、フルシトシン；ＰＲＴＬ、部分；ＣＭＰＬＴ、完全；＊はヒスパニックまたはラテン民族性を指し示す。
【0076】
【表5】
【0077】
ＢＷＨ／ＭＧＨ／ＢＭＣ／Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃコホートは、腎臓生検が免疫蛍光染色（ＩＦ）によりＩｇＧについて評価され、および、利用可能な場合に、同時的な血清試料が抗ネフリン抗体について評価された患者からなる。ＲＣＣ（Ｎｘ１、Ｎｘ２）のための腫瘍腎摘除術を有した対照患者について、非新生物性腎臓実質の区画をＩＦにより評価した。タンパク尿値は、他に記載されなければ、ＵＰＣＲ（ｇ／ｇ）または尿ディップスティック（陰性、３＋、４＋）のいずれかとして与えている（＃患者ＭＣＤ１７－について、タンパク尿は尿アルブミンクレアチニン比（ＵＡＣＲ）（ｇ／ｇ）として与えている）。血清クレアチニン（血清Ｃｒ）およびタンパク尿値は、抗ネフリン抗体について評価された患者について血清採取の時点に最も近接したものであり、抗ネフリン抗体について評価されなかった患者について生検に最も近接したものである。優勢なＩｇＧサブクラスを、既知の場合に括弧内に与えている（ＮＤは、ＩｇＧサブクラスは追加の生検材料の欠如に起因して決定されなかったことを指し示す）。ＦＳＧＳ、限局性分節性糸球体硬化症；ＴＬ、先端病変；ＭＮ、膜性腎症；ＲＣＣ、腎臓細胞がん；ＭＣＤ、微小変化疾患。＊はヒスパニックまたはラテン民族性を指し示す。
参考文献
参考文献
【0078】
【表6-1】
【0079】
【表6-2】
【0080】
【表6-3】
【0081】
【表6-4】
【0082】
ネフリンＧ１０５９の細胞外断片
ＤＮＡ配列
ＤＮＡ配列
【0083】
【化2】
（太字の配列は、アフィニティー精製を可能とするためにタンパク質の末端に付加されたグリシン－セリン－６Ｘヒスチジンである）
【0084】
【化3】
【0085】
他の実施形態
本発明がその詳細な説明と組み合わせて記載されたが、以上の記載は、本発明の範囲を例証することが意図され、それを限定することは意図されず、該範囲は添付の特許請求の範囲により定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明がその詳細な説明と組み合わせて記載されたが、以上の記載は、本発明の範囲を例証することが意図され、それを限定することは意図されず、該範囲は添付の特許請求の範囲により定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲内である。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【国際調査報告】