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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-07
(54)【発明の名称】抗ＣＤ７３抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20231030BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231030BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231030BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231030BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231030BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231030BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231030BHJP
C12N 5/12 20060101ALI20231030BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231030BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231030BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231030BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231030BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N5/12
C07K16/46
C12N15/62 Z
A61K39/395 P
A61P35/00
A61K39/395 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548995
(86)(22)【出願日】2021-10-22
(85)【翻訳文提出日】2023-06-20
(86)【国際出願番号】 CN2021125564
(87)【国際公開番号】W WO2022083723
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】202011152518.9
(32)【優先日】2020-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519063026
【氏名又は名称】中山康方生物医▲藥▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＥＳＯ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】６ Ｓｈｅｎｎｏｎｇ Ｒｏａｄ，Ｔｏｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２８４３７ （ＣＮ）
(71)【出願人】
【識別番号】523150026
【氏名又は名称】アケソ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＥＳＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】リ，バイヨン
(72)【発明者】
【氏名】シア，ユ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ジョンミン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA92X
4B065AB01
4B065AB05
4B065BA02
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB12
4C085CC02
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ＣＤ７３抗体及びその使用に関する。前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５～１７に示されるＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１８～２０に示されるＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＤ７３（例えばヒトＣＤ７３）抗体又はその抗原結合断片であって、そのうち、ＩＭＧＴナンバリングシステムによれば、前記抗ＣＤ７３抗体は、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによれば、前記抗ＣＤ７３抗体は、
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ１と、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ２と、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ３と、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ１と、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ２と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列、前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ３と、を含む、
抗ＣＤ７３（例えばヒトＣＤ７３）抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、且つ
前記抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％を有し、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる、
請求項１に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２に示され、且つ前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４にに示され、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、且つ前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８に示され、
前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示され、又は
前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４に示される、
請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗体の重鎖定常領域がＩｇ ｇａｍｍａ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域がＩｇ ｋａｐｐａ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８３４である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ／ｃ、相補性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体又は二重特異性抗体から選ばれる、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
以下、（１）配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に示される配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示される配列を更に含む、単離されたポリペプチド；
（２）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示される配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は、配列番号１５、配列番号１６と配列番号１７に示される配列を更に含む、単離されたポリペプチド；
（３）配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は、それぞれ配列番号４、配列番号８又は配列番号１２に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む、単離されたポリペプチド；
（４）配列番号４、配列番号８又は配列番号１２に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は、それぞれ配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む、単離されたポリペプチド；
（５）配列番号１０に示される配列、又は前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は、それぞれ配列番号１４に示される配列、又は前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、：８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列同一性を有する配列、又は前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む、単離されたポリペプチド；及び
（６）配列番号１４に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、前記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、前記抗体は、それぞれ配列番号１０に示される配列、或いは前記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは前記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む、単離されたポリペプチド
からなる群より選ばれる、単離されたポリペプチド。
【請求項8】
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項７に記載の単離されたポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項10】
請求項８に記載の核酸分子、或いは請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及びコンジュゲート部分を含むコンジュゲートであって、そのうち、前記コンジュゲート部分が精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識であり、好ましくは、前記コンジュゲート部分が放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、有色物質、ポリエチレングリコール又は酵素である、コンジュゲート。
【請求項12】
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、融合タンパク質又は多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）。
【請求項13】
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のコンジュゲート或いは請求項１２に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体を含むキットであって、好ましくは、前記キットは前記抗体を特異的に識別する第二抗体を更に含み、任意選択的に、前記第二抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、有色物質又は酵素を更に含み、好ましくは、前記キットは、ＣＤ７３のサンプルにおける存在又はそのレベルの検出に用いられる、キット。
【請求項14】
請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のコンジュゲート或いは請求項１２に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体を含む医薬組成物であって、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤を更に含み、好ましくは、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射での投与に適する形態である、医薬組成物。
【請求項15】
腫瘍（例えば固形腫瘍、好ましくは非小細胞肺癌、前立腺癌（転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）を含む）、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、大腸癌（マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とミスマッチ修復機能欠陥／マイクロサテライト不安定性（ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－ｈｉｇｈ）型を含む）、胃癌（マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とミスマッチ修復機能欠陥／マイクロサテライト不安定性（ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－ｈｉｇｈ）型を含む）、メラノーマ、頭頸部癌、腎細胞癌又は膵管腺癌を治療及び／又は予防する薬物の製造、又は腫瘍の診断に用いられる薬物の製造における、請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のコンジュゲート或いは請求項１２に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体の使用。
【請求項16】
中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託しており、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７であるＬＴ０１４から選ばれる、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項17】
（１）請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のコンジュゲート或いは請求項１２に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体と、（２）抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体と、場合により取扱説明書を含むキットであって、好ましくは、前記抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５に示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６に示されるものである、キット。
【請求項18】
患者に治療有効量の薬物Ａと治療有効量の薬物Ｂを投与する腫瘍を治療及び／又は予防する方法であって、そのうち、薬物Ａは、請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１１に記載のコンジュゲート或いは請求項１２に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体を含み、薬物Ｂは、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体を含み、好ましくは、薬物Ａと薬物Ｂを同時に又は順次に投与し、そのうち、前記順次に投与するのは、先に薬物Ａ又は先に薬物Ｂを投与することを指し、好ましくは、前記抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５に示されるものであり、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６に示されるものである、腫瘍を治療及び／又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学の分野に関する。具体的には、抗ＣＤ７３抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
エクト－５’－ヌクレオチダーゼ（Ｅｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）、即ち、ＣＤ７３タンパク質は、ＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされるタンパク質分子量７０ＫＤの多機能糖タンパク質であり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ｇｌｙｏｃｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＧＰＩ）によって細胞膜にアンカーされている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １９９２； ２８５： ３４５-３６５）。
【0003】
ＣＤ７３はヒト組織細胞の表面に広く分布しており、これまでの研究では、腫瘍微小環境の癌細胞、樹状細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）など、複数種の固形腫瘍でＣＤ７３が高発現されることが発見されている。低酸素は、低酸素誘導因子－１（ＨＩＦ－１）などの分子のアップレギュレーションを誘導し、その結果、腫瘍微小環境におけるＣＤ７３の広い発現をもたらす（Ｓｙｎｎｅｓｔｖｅｄｔ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００２； １１０： ９９３-１００２．）。臨床腫瘍サンプルに対する分析によれば、ＣＤ７３の高発現は、乳腺癌、肺癌、卵巣癌、腎癌、胃癌、頭頸部癌などを含む様々な種類の腫瘍の予後不良に密接に関連する潜在的な生物的マーカーである。
【0004】
ＣＤ７３は加水分解酵素活性と非加水分解酵素作用の両方を有する。ＣＤ７３の酵素的及び非酵素的機能は、腫瘍関連プロセスに存在し、互いに促進して腫瘍の進行を維持する。ますます多くの研究からわかるように、ＣＤ７３はインビトロでは腫瘍細胞の増殖、転移及び浸潤、インビボでは腫瘍血管新生と腫瘍の免疫回避機構を制御する重要な因子であり、そのうち、最も重要な免疫抑制機構の１つはＣＤ７３－アデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）代謝シグナル伝達経路により媒介され、ＣＤ７３の上流にあるＣＤ３９は、ＡＴＰからのアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の生成を触媒し、生成されたＡＭＰはＣＤ７３によってアデノシンに変換され、アデノシンは下流のアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）に結合し、Ａ２ＡＲはプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）とＣｓｋキナーゼを活性化することで、ＬＣＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＣなどの免疫活性化に関連する一連のシグナル伝達経路を阻害し、Ｔ細胞の免疫殺傷作用を阻害することにより、免疫抑制作用を発揮する（Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１３； １３： ８４２-８５７．）。
【0005】
膜貫通受容体ＰＤ－１（プログラム細胞死－１）はＣＤ２８遺伝子ファミリーのメンバーの１つであり、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞で発現している。ＰＤ－１のリガンドＰＤＬ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤＬ－１とも略称される）及びＰＤＬ２（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ ２、ＰＤＬ－２とも略称される）は何れもＢ７スーパーファミリーに属し、そのうち、ＰＤＬ１はＴ細胞、Ｂ細胞及び内皮細胞と上皮細胞を含む多種の細胞に発現されるが、ＰＤＬ２は樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞にのみ発現される。
【0006】
ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路は、免疫寛容、微生物感染及び腫瘍の免疫回避の調節において重要な役割を果たしている。ＰＤ－１は主にＴ細胞などの免疫細胞に発現されるが、ＰＤ－１のリガンドＰＤＬ１は主に多くのヒト腫瘍組織で高発現される。ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路を遮断することにより、抑制されたＴ細胞が活性化され、ひいては癌細胞を攻撃することができる。ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路を遮断することにより、腫瘍抗原特異性Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮し、ひいては局所腫瘍の増殖を抑制できる（Ｊｕｌｉｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３６６： ２４５５-２４６５）。また、ＰＤＬ１を高発現する腫瘍は検出困難な癌を伴う（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２００７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４： ３３６０－５）。実施が効果的な方法は、抗ＰＤ－１抗体を体内に注射してＰＤ－１の発現を制御することである。ＰＤ－１経路に対する抗体は、ＰＤ－１抗体の幅広い抗腫瘍性の有望さ及び驚くべき薬効のために、非小細胞性肺癌、腎細胞癌、卵巣癌、黒色腫（Ｈｏｍｅｔ Ｍ． Ｂ．， Ｐａｒｉｓｉ Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ４２（３）： ４６６－４７３）、白血病及び貧血（Ｈｅｌｄ ＳＡ， Ｈｅｉｎｅ Ａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． １３（７）： ７６８－７４）の治療に用いられる多種の腫瘍の突破の進行をもたらすと業界において一般的に考えられている。
【0007】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４、ＣＴＬＡ４とも略称される）は、遺伝子構造、染色体位置、配列の相同性及び遺伝子発現においてＣＤ２８分子と非常に密接に関連し、両方とも共刺激分子Ｂ７の受容体であり、主に活性化されたＴ細胞の表面に発現される。ＣＴＬＡ４は、Ｂ７と結合することでマウス及びヒトＴ細胞の活性化を抑制でき、Ｔ細胞の活性化において負の調節作用を果たしている。
【0008】
ＣＴＬＡ４抗体（又は抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体）又はＣＴＬＡ４リガンドは、ＣＴＬＡ４とその天然リガンドの結合を阻害し、それによってＣＴＬＡ４のＴ細胞への負の調節シグナルの伝達を遮断し、様々な抗原に対するＴ細胞の応答性を増強することができ、この点に関してインビボとインビトロ研究の結果は基本的に一致している。現在、ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、既に前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、悪性黒色腫などの治療のために臨床試験中又は承認されている（Ｇｒｏｓｓｏ ＪＦ．， Ｊｕｒｅ－Ｋｕｎｋｅｌ ＭＮ．， ２０１３， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ． １３： ５．）。
【0009】
ＣＴＬＡ４及びＣＴＬＡ４抗体は、Ｔ細胞の機能状況に影響を与える重要な因子として、生体の免疫微小環境に介入することで作用する。インビトロ及びインビボ試験において、ＣＴＬＡ４抗体は生体に対するＣＴＬＡ４の免疫抑制を特異的に解除し、Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ－２の産生を誘導することができ、抗腫瘍及び寄生虫などの疾患の遺伝子治療において広範な応用の将来性がある。ＣＴＬＡ４抗体は疾患に対して特異的な治療効果且つ高い治療効果を発揮し、従来の薬物療法を補完し、遺伝子治療の新たな道を切り開くことができる。
【0010】
ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、即ち、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用は、抗体のＦａｂ断片がウイルス感染細胞又は腫瘍細胞の抗原エピトープに結合し、そのＦｃ断片はキラー細胞（ＮＫ細胞、マクロファージなど）の表面のＦｃ受容体（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦｃＲ）に結合し、キラー細胞を介在して標的細胞を直接殺傷することを指す。
【0011】
ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、即ち、補体依存性細胞傷害活性は、抗体が細胞膜表面の対応する抗原に特異的に結合することで複合体を形成し、補体系を活性化し、ひいては標的細胞の表面にＭＡＣを形成して標的細胞を溶解させることを指す。補体は、様々な細菌やその他の病原体の細胞を溶解させ、病原体の感染を抵抗する生体の重要な防御機構である。
【0012】
Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ領域を認識して免疫応答を媒介するために、特定の免疫細胞表面に発現される免疫グロブリンファミリーのタンパク質である。抗体のＦａｂ領域が抗原を認識した後、その抗体Ｆｃ領域は免疫細胞（例えば、キラー細胞）上のＦｃ受容体に結合し、食作用及びＡＤＣＣなどの免疫細胞の応答機能を開始させる。Ｆｃ受容体が認識する抗体の種類や発現細胞の違いによれば、ＦｃγＲＩＩＩａがＡＤＣＣ効果に密接に関係していることが発見されている。ＦｃγＲＩＩＩａはＡＤＣＣを媒介する最も主要な分子である（Ｈｏｇａｒｔｈ ＰＭ， Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ＧＡ． ２０１２， ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ， １１（４）： ３１１－３３１）。
【0013】
ＩｇＧファミリーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４つのメンバーを含み、それらの重鎖定常領域の結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）領域にアミノ酸の差異が存在するため、ＦｃγＲｓに対する親和性がそれぞれ異なる。ＩｇＧ１は、ヒトの体内に最も多く存在するアイソフォームで、モノクローナル抗体薬剤において最も使用されるアイソフォームであり、ＩｇＧ１は、様々なＦｃγＲｓと結合することができ、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を引き起こせる。抗体におけるＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの存在は、不必要な標的組織の損傷を引き起こし、薬物薬理学に悪影響を及ぼす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明者らは、鋭意研究と創造的な努力を重ね、哺乳動物細胞発現系を利用して組換えヒトＣＤ７３を抗原として発現させてマウスを免疫し、マウス脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合によってハイブリドーマ細胞を得る。発明者らは、多数のサンプルに対するスクリーニングにより、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７である）を得ている。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、驚くべきことに、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４は、ヒトＣＤ７３に特異的に結合する特異性モノクローナル抗体（１９Ｆ３と命名する）を分泌することができ、且つ当該モノクローナル抗体はＣＤ７３の酵素活性反応を非常に効果的に非基質競合的に阻害し、アデノシンの産生を抑制し、Ｔ細胞の活性を促進し、腫瘍増殖を抑制する効果を発揮することができる。
【0016】
更に、本発明者らは、抗ヒトＣＤ７３のヒト化抗体（１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と命名する）を創造的に作製し、また、抗ＣＤ７３抗体はＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を除去するためにアミノ酸の変異を導入し、抗体によって媒介される不必要な毒性効果を回避する。
【0017】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗体と抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の併用は、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体単剤又は抗ＣＤ７３抗体単剤より優れた腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制する薬理学効果を有する。
【0018】
本発明の別の態様は、更に、抗体に関し、そのうち、上記抗ＣＤ７３抗体は、
配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによれば、上記抗ＣＤ７３抗体は、
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ１と、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ２と、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ３と、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ１と、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ２と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ３と、を含む。
配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによれば、上記抗ＣＤ７３抗体は、
配列番号１５に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ１と、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ２と、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＨＣＤＲ３と、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ１と、
配列番号１９に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ２と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列、上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、又は上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１個、２個又は３個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなるＬＣＤＲ３と、を含む。
【0019】
本発明の幾つかの実施形態において、
上記抗体の重鎖可変領域は、
配列番号２、配列番号６又は配列番号１０、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、且つ
上記抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。
上記抗体の重鎖可変領域は、
配列番号２、配列番号６又は配列番号１０、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、且つ
上記抗体の軽鎖可変領域は、
配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは配列番号４、配列番号８、配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。
【0020】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４に示され、
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８に示され、
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示され、又は
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４に示される。
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８に示され、
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示され、又は
上記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示され、且つ上記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４に示される。
【0021】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗体の重鎖定常領域はＩｇ ｇａｍｍａ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域はＩｇ ｋａｐｐａ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である。
【0022】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗体の重鎖定常領域はＩｇ ｇａｍｍａ－１鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７の上で、第２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を導入し、第２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）を導入し、軽鎖定常領域はＩｇ ｋａｐｐａ鎖Ｃ領域、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４であり、アミノ酸配列は配列番号２２に示される。
【0023】
軽鎖及び重鎖の可変領域が抗原の結合を決定し、各鎖の可変領域は、何れも３つの高可変領域を含み、相補性性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる（重鎖（Ｈ）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、それはＫａｂａｔらによって命名され、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍ．ｄ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １９９１； １－３： ９１－３２４２を参照されたい）。
【0024】
好ましくは、ＣＤＲはＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義され、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ， ａｎｄ Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９； ３８（ｓｕｐｐｌ＿１）： Ｄ３０１－Ｄ３０７を参照されたい。
【0025】
当業者に周知される技術的手段により、例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースでＩＭＧＴ定義に従ってモノクローナル抗体配列のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を解析した。
【0026】
本発明に係る抗体１９Ｆ３、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）は同じＣＤＲを有する。
【0027】
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号１５）、
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号１６）、
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号１７）、
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号１５）、
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＡＧＴ（配列番号１６）、
ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＥＹＲＹＧＧＤＹＦＤＹ（配列番号１７）、
【0028】
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１８）、
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号１９）、
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号２０）。
ＬＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１８）、
ＬＣＤＲ２：ＦＡＳ（配列番号１９）、
ＬＣＤＲ３：ＱＱＨＹＤＴＰＹＴ（配列番号２０）。
【0029】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗体はモノクローナル抗体である。
【0030】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗体はヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。
【0031】
本発明の幾つかの実施形態において、上記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ／ｃ、相補性性決定領域断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体又は二重特異性抗体から選ばれる。
【0032】
本発明の別の態様は、単離されたポリペプチドに関し、次の各項からなる群より選ばれる。
【0033】
（１）配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に示される配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示される配列を更に含む。
【0034】
（２）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０に示される配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７に示される配列を更に含む。
【0035】
（３）配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は、それぞれ、配列番号４、配列番号８又は配列番号１２に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む。
【0036】
（４）配列番号４、配列番号８又は配列番号１２に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は、それぞれ、配列番号２、配列番号６又は配列番号１０に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む。
【0037】
（５）配列番号１０に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は、それぞれ、配列番号１４に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む。
【0038】
（６）配列番号１４に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、そのうち、上記ポリペプチドは抗ＣＤ７３抗体の一部としてＣＤ７３に特異的に結合し、上記抗体は、それぞれ、配列番号１０に示される配列、或いは上記配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列、或いは上記配列と比べて１つ又は複数（好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の保存的アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を更に対応して含む。
【0039】
本発明の別の態様は、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は上記単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。
【0040】
本発明の更なる態様は、本発明の単離された核酸分子を含むベクターに関する。
【0041】
本発明の更なる態様は、本発明の単離された核酸分子、又は本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【0042】
本発明の更なる態様は、抗体及びコンジュゲート部分を含むコンジュゲートに関し、そのうち、上記抗体は本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片であり、上記コンジュゲート部分は精製タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、検出可能な標識であり、好ましくは、上記コンジュゲート部分は放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物質、ポリエチレングリコール又は酵素である。
【0043】
本発明の更なる態様は、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、融合タンパク質又は多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）に関する。
【0044】
本発明の更なる態様は、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のコンジュゲート、融合タンパク質又は多重特異性抗体を含むキットに関し、好ましくは、上記キットは第二抗体を更に含み、それは上記抗体を特異的に識別し、任意選択的に、上記第二抗体は、検出可能な標識を更に含み、例えば放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、有色物質又は酵素である。
【0045】
本発明の更なる態様は、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のコンジュゲート、融合タンパク質又は多重特異性抗体のキットの調製における使用に関し、上記キットはＣＤ７３のサンプルにおける存在又はそのレベルの検出に用いられる。
【0046】
本発明の更なる態様は、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のコンジュゲート、融合タンパク質又は多重特異性抗体を含む医薬組成物に関し、任意選択的に、上記医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤を更に含む。好ましくは、上記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射での投与に適する形態である。
【0047】
本発明の更なる態様は、腫瘍（例えば固形腫瘍、好ましくは非小細胞肺癌、前立腺癌（転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）を含む）、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、大腸癌（マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とミスマッチ修復機能欠陥／マイクロサテライト不安定性（ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－ｈｉｇｈ）型を含む）、胃癌（マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）とミスマッチ修復機能欠陥／マイクロサテライト不安定性（ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－ｈｉｇｈ）型を含む）、メラノーマ、頭頸部癌、腎細胞癌又は膵管腺癌を治療及び／又は予防する薬物の調製、又は腫瘍の診断に用いられる薬物の調製における、本発明の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のコンジュゲート、融合タンパク質又は多重特異性抗体の使用に関する。
【0048】
本発明の更なる態様は、中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託しており、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｃ２０１８１３７であるハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４に関する。
【0049】
本発明の更なる態様は、（１）本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明に記載のコンジュゲート又は本発明に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体、と（２）抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体、と任意選択的に、取扱説明書を含むキットに関する。
【0050】
本発明の更なる態様は、患者に治療有効量の薬物Ａと治療有効量の薬物Ｂを投与する腫瘍を治療及び／又は予防する方法に関し、そのうち、薬物Ａは、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明に記載のコンジュゲート又は本発明に記載の融合タンパク質又は多重特異性抗体を含み、薬物Ｂは、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体を含み、好ましくは、薬物Ａと薬物Ｂを同時に又は順次に投与し、そのうち、上記順次に投与するのは、先に薬物Ａ又は先に薬物Ｂを投与することを指す。
【0051】
本発明の幾つかの実施形態において、上記ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５に示され、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６に示される。
【0052】
本発明において、特に言及しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。また、本明細書で用いられる細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学的実験室操作手順は当技術分野で広く使用されている通常手順である。同時に、本発明をより良く理解するために、以下に関連用語の定義及び説明を提供する。
【0053】
本明細書で使用されるように、用語ＥＣ５０は、最大効果の５０％をもたらすことができる濃度を指す、半最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）を指す。
【0054】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、一般に２つの対のポリペプチド鎖（各対が１つの「軽」（Ｌ）鎖及び１つの「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεに分けられ、且つ抗体のアイソタイプは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義される。軽鎖と重鎖では、可変領域と定常領域は、約１２個又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を通じて連結され、重鎖はまた約３個又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を更に含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子（免疫系の各細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、高可変性を有する領域（相補性性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分することもできる。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ基端末からカルボキシル基端末まで配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍ． ｄ． （１９８７ ａｎｄ １９９１））、又はＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８７； １９６： ９０１－９１７； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ １９８９； ３４２： ８７８－８８３又はＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義され、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ， Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｋａａｓ， ａｎｄ Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ． “ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ ａｎｄ ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ： ａ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ＭＨＣ， ＩｇＳＦ ａｎｄ ＭｈｃＳＦ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９； ３８ （ｓｕｐｐｌ＿１）： Ｄ３０１－Ｄ３０７．の定義を参照する。用語「抗体」は、抗体を産生する任意の特定の方法によって限定されない。例えば、これには、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、異なるアイソタイプの抗体であってもよく、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソフォーム）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体である。
【0055】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」又は類する用語は、相同性の高い一連の抗体分子のうちの１つの抗体又は抗体の１つの断片に由来するものを指し、即ち、自発的に出現する自然変異を除いて、完全に同じである一連の抗体分子である。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対する高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して、一般的には、抗原上の異なるエピトープを一般的に認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般に、最初にＫｏｈｌｅｒらによって発表されたハイブリドーマ技術（Ｋoｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ［Ｊ］． ｎａｔｕｒｅ， １９７５； ２５６（５５１７）： ４９５）を用いて得ることができ、組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ４，８１６，５６７を参照する）を用いて得ることもできる。
【0056】
本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲ領域の全て又は一部が、非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置換された後に得られる抗体又は抗体断片を指し、そのうち、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギ）であり得る。更に、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の幾つかのアミノ酸残基はまた、抗体の性能を更に改良又は最適化するために、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基又は他の抗体のアミノ酸残基と置換され得る。ヒト化抗体の更なる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８６； ３２１：５２２－５２５； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９８８； ３３２：３２３－３２９； Ｐｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １９９２； ２：５９３－５９６；和Ｃｌａｒｋ Ｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ： ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ‘Ｅｍｐｅｒｏｒ’ｓ ｎｅｗ ｃｌｏｔｈｅｓ’？［Ｊ］． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， ２０００； ２１（８）： ３９７－４０２を参照することができる。
【0057】
本明細書で使用されるように、「単離する」又は「単離される」という用語は、天然の状態から手作業で得られることを指す。特定の「単離」物質又は成分が自然界に存在する場合、それが存在する自然環境が変化したか、又は自然環境から物質が単離されたか、又はその両方である可能性がある。例えば、天然に存在する単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドは、動物の生体内で天然に存在し、そのような天然の状態から単離された、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドの高純度のものは、単離と呼ばれる。用語「単離する」又は「単離される」は、人工物質又は合成物質の混合物を排除するものではなく、また、物質の活性に影響を及ぼしない他の不純物の存在を排除するものでもない。
【0058】
本明細書で使用されるように、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビークルを指す。ベクターは、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入され、それが保持する遺伝物質エレメントを宿主細胞において発現させることができる。ベクターは当業者に周知であり、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コックスプラスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、バクテリオファージ、例えばラムダファージ又はＭ１３ファージ、及び動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パピローマバキュロウイルス（ＳＶ４０など）が含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されず、複数の発現制御エレメントを含み得る。また、ベクターは、複製開始部位を含んでいてもよい。
【0059】
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」は、ベクターの導入に有用な細胞を指し、大腸菌又は枯草菌などの原核細胞、酵母細胞又はアスペルギルスなどの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞又はＳｆ９などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＧＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞又はヒト細胞などの動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
本明細書で使用されるように、用語「特異的結合」は、２つの分子間の非ランダム結合反応、例えば、抗体と、それが向けられる抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、抗原に特異的に結合する抗体（又は抗原に対して特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５ Ｍ未満、例えば、約１０－６ Ｍ未満、約１０－７ Ｍ未満、約１０－８ Ｍ未満、約１０－９ Ｍ未満、約１０－１０ Ｍ未満又はそれ以下の親和性（ＫＤ）で当該抗原に結合することを指す。
【0061】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」は、抗体と抗原との間の結合親和性を記述するために使用される、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合がより密であり、抗体と抗原との間の親和性がより高い。一般に、抗体は、約１０－５ Ｍ未満、例えば、約１０－６ Ｍ未満、約１０－７ Ｍ未満、約１０－８ Ｍ未満、約１０－９ Ｍ未満、約１０－１０ Ｍ未満又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（例えば、ＰＤ－１タンパク質）に結合する。当業者に知られている種々の方法でＫＤを測定し、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子相互作用装置を用いて測定する。
【0062】
本明細書で使用されるように、用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体」は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、用語「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同じ意味を有し、交換可能に使用される。また、本発明において、アミノ酸は、当該技術分野において周知の略号、略号の単語で通常表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａで表すことができる。
【0063】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容され得る担体及び／又は賦形剤」とは、薬理学及び／又は生理学的に対象及び活性成分に適合する担体及び／又は賦形剤を指し、これは当分野で周知される事項であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ， １９ｔｈ ｅｄ． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５を参照する）、且つｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含み、但しそれらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、リン酸塩緩衝液を含むが、これに限定されず、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ－８０などのカチオン性、アニオン性又は非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されず、イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
【0064】
本明細書で使用されるように、用語「有効量」は、所望の効果を達成するのに、又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍）を予防する有効量とは、疾患（例えば、腫瘍）の発生を予防、阻止又は遅延するのに十分な量を指し、疾患を治療する有効量とは、疾患を有している患者の疾患及びその合併症を治癒し又は少なくとも一部阻止するのに十分な量を指す。
【発明の効果】
【0065】
本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤ７３によく特異的に結合することができ、且つＣＤ７３の酵素活性反応を非常に効果的に非基質競合的に阻害し、アデノシンの産生を抑制し、Ｔ細胞の活性と腫瘍増殖を抑制する効果を促進することができる。同時に、本発明の抗体と抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の併用は、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体単剤又は抗ＣＤ７３抗体単剤より優れた腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制する薬理学効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）とＣ１ｑとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図2】ＭＥＤＩ９４４７とＣ１ｑとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図3】ＩｇＧ１野生型抗体とＣ１ｑとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図4】１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）とＦｃγＲＩＩＩａとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図5】ＭＥＤＩ９４４７とＦｃγＲＩＩＩａとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図6】ＩｇＧ１野生型抗体とＦｃγＲＩＩＩａとの結合の動態親和性データフィッティング曲線である。
【図7】群分け後の２３日目の各群のマウスの腫瘍重量である。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図8】Ｄａｙ ０と比べて、実験中の各群の動物の体重変化率である。
【図9】抗ＣＤ７３抗体はＣＤ７３の酵素活性を効果的に抑制する。
【発明を実施するための形態】
【0067】
以下、実施例を参照しながら本発明の実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、以下の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではないと理解すべきである。実施例で具体的な技術又は条件が明記されていない場合、当分野の文献に記載された技術又は条件に従って（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照する）、又は製品の説明書に従って行われる。使用される試薬又は機器は、メーカーが明記されていない場合、市販されている一般的な製品であってもよい。
【0068】
本発明の下記実施例で使用するＢＡＬＢ／ｃマウスは、広東医学実験動物センターより購入される。
【0069】
本発明の下記実施例において、使用する陽性対照抗体ＭＥＤＩ９４４７（Ｏｌｅｃｌｕｍａｂ）は、中山康方生物医薬有限公司から生産され、その配列は、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ ＬｉｍｉｔｅｄがＷＨＯウェブサイトで公開して記載されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ （ＩＮＮ）に記載する抗体配列と同じである（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （２０１６）． “Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ （ＩＮＮ）． Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＩＮＮ： Ｌｉｓｔ １１６” （ＰＤＦ）． ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ３０ （４） ， Ｐ６６１－６６２．）。
【0070】
本発明の下記実施例において、使用する陽性対照抗体野生ＩｇＧ１対照抗体の重鎖定常領域は、Ｉｇ ｇａｍｍａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８５７を採用し、軽鎖定常領域は、Ｉｇ ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８３４を採用する。
【0071】
本発明の下記実施例において、使用するＣ１ｑは、ｆｉｚｇｅｒａｌｄより購入され、貨物番号がＡ１６０５０２０１である。
【0072】
本発明の下記実施例において、使用するＦｃγＲＩＩＩａ－ｂｉｏは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌより購入され、貨物番号がＬＣ０９ＪＡ０４０７である。
【0073】
本発明の下記実施例において、使用するＣＤ７３（５′－ヌクレアーゼ）特異性阻害剤ＡＰＣＰ（ａｌｐｈａ、ｂｅｔａ―ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－５′－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５’－α、β－メチレン－ジリン酸アデノシン）は、ｓｉｇｍａに由来し、貨物番号がＭ３７６３－１０ＭＧである。
【0074】
本発明の下記実施例において、使用するアイソタイプ対照抗体は、ヒト抗鶏卵リソソーム抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ＩｇＧ、即ちａｎｔｉ－ＨＥＬ抗体、又はｈｕｍａｎ ＩｇＧ、ｈＩｇＧと略称し、又はアイソタイプ対照）であり、その配列は、Ａｃｉｅｒｎｏらより発表されたＡｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓにおけるＦａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列（Ａｃｉｅｒｎｏら． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００７； ３７４（１）： １３０－１４６．）に由来する。
【実施例】
【0075】
実施例１：抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
１、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４の調製
抗ＣＤ７３抗体が使用する抗原は、ヒトＮＴ５Ｅ－Ｈｉｓ（ＮＴ５ＥがＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２、中山康方生物医薬有限公司で調製される）。免疫後のマウスの脾細胞を取ってマウスの骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を作製する。ヒトＮＴ５Ｅ（ＮＴ５ＥがＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）－Ｂｉｏｔｉｎ（ＮＴ５Ｅ－Ｂｉｏｔｉｎ、中山康方生物医薬有限公司で調製される）を抗原とし、ハイブリドーマ細胞を間接ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、ＣＤ７３に特異的に結合する抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞を取得する。スクリーニングして取得したハイブリドーマ細胞に対し、有限希釈法で安定したハイブリドーマ細胞株を取得した。以上のハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４と命名し、それが分泌したモノクローナル抗体を１９Ｆ３と命名する。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも称する）であって、２０１８年６月２１日より中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｃ２０１８１３７であり、寄託住所が中国武漢・武漢大学であり、郵便番号が４３００７２である。
１、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４の調製
抗ＣＤ７３抗体が使用する抗原は、ヒトＮＴ５Ｅ－Ｈｉｓ（ＮＴ５ＥがＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２、中山康方生物医薬有限公司で調製される）。免疫後のマウスの脾細胞を取ってマウスの骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を作製する。ヒトＮＴ５Ｅ（ＮＴ５ＥがＧｅｎｂａｎｋＩＤ：ＮＰ＿００２５１７．１、位置：１－５５２）－Ｂｉｏｔｉｎ（ＮＴ５Ｅ－Ｂｉｏｔｉｎ、中山康方生物医薬有限公司で調製される）を抗原とし、ハイブリドーマ細胞を間接ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、ＣＤ７３に特異的に結合する抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞を取得する。スクリーニングして取得したハイブリドーマ細胞に対し、有限希釈法で安定したハイブリドーマ細胞株を取得した。以上のハイブリドーマ細胞株をハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４と命名し、それが分泌したモノクローナル抗体を１９Ｆ３と命名する。
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ０１４（ＣＤ７３－１９Ｆ３とも称する）であって、２０１８年６月２１日より中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｃ２０１８１３７であり、寄託住所が中国武漢・武漢大学であり、郵便番号が４３００７２である。
【0076】
２、抗ＣＤ７３抗体１９Ｆ３の調製
ＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ）で作製された上記ＬＴ０１４細胞株をそれぞれ培養する（ＣＤ培地は、１％のペニシリン・ストレプトマイシンを含み、５％のＣＯ２で、３７℃でセルインキュベーターに培養する）。７日後、細胞培養上清を回収し、高速遠心で、微多孔膜により真空を引いて濾過し、ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラムでの精製を経て、抗体１９Ｆ３を取得する。
ＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ）で作製された上記ＬＴ０１４細胞株をそれぞれ培養する（ＣＤ培地は、１％のペニシリン・ストレプトマイシンを含み、５％のＣＯ２で、３７℃でセルインキュベーターに培養する）。７日後、細胞培養上清を回収し、高速遠心で、微多孔膜により真空を引いて濾過し、ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラムでの精製を経て、抗体１９Ｆ３を取得する。
【0077】
実施例２：抗ＣＤ７３の抗体１９Ｆ３の配列分析
培養細胞／細菌総ＲＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ、貨物番号：ＤＰ４３０）の方法により、実施例１に培養されたＬＴ０１４細胞株からｍＲＮＡを抽出する。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲキット説明書により、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅を行う。
ＰＣＲ増幅産物に対して直接ＴＡクローニングを行い、具体的な操作は、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ ＣＴ１０１）キット説明書を参照して行われる。
ＴＡクローニングの産物に対して直接配列決定を行い、抗ＣＤ７３の抗体１９Ｆ３の配列分析の配列決定結果は、以下のようである。
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示すように、長さが１２１ａａである。
そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号３に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号４に示すように、長さが１１３ａａである。
そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
培養細胞／細菌総ＲＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ、貨物番号：ＤＰ４３０）の方法により、実施例１に培養されたＬＴ０１４細胞株からｍＲＮＡを抽出する。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲキット説明書により、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅を行う。
ＰＣＲ増幅産物に対して直接ＴＡクローニングを行い、具体的な操作は、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ ＣＴ１０１）キット説明書を参照して行われる。
ＴＡクローニングの産物に対して直接配列決定を行い、抗ＣＤ７３の抗体１９Ｆ３の配列分析の配列決定結果は、以下のようである。
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示すように、長さが１２１ａａである。
そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号３に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号４に示すように、長さが１１３ａａである。
そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
【0078】
実施例３：抗ヒトＣＤ７３のヒト化抗体の軽鎖と重鎖の設計と調製
ヒトＣＤ７３タンパク質の３次元結晶構造（Ｈａｇｅ Ｔ， Ｒｅｉｎｅｍｅｒ Ｐ， Ｓｅｂａｌｄ Ｗ． Ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ａ １：１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９８； ２５８（２）：８３１－６．）及び実施例２で取得した抗体１９Ｆ３の配列により、コンピュータによる抗体モデルをシミュレーションし、モデルに基づいて変異を設計し、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の可変領域配列を取得する。
上記ヒト化抗体の設計した可変領域配列は、以下のようである。
ヒトＣＤ７３タンパク質の３次元結晶構造（Ｈａｇｅ Ｔ， Ｒｅｉｎｅｍｅｒ Ｐ， Ｓｅｂａｌｄ Ｗ． Ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ａ １：１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９８； ２５８（２）：８３１－６．）及び実施例２で取得した抗体１９Ｆ３の配列により、コンピュータによる抗体モデルをシミュレーションし、モデルに基づいて変異を設計し、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の可変領域配列を取得する。
上記ヒト化抗体の設計した可変領域配列は、以下のようである。
【0079】
（１）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号５に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号６に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号７に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号８に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号５に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号６に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号７に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号８に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
【0080】
（２）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号９に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１０に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１１に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１２に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号９に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１０に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１１に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１２に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
【0081】
（３）ヒト化モノクローナル抗体１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号９に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１０に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１３に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１４に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
重鎖可変領域の核酸配列は、配列番号９に示すように、長さが３６３ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１０に示すように、長さが１２１ａａであり、そのうち、重鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１５に示すように、重鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１６に示すように、重鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号１７に示すようである。
軽鎖可変領域の核酸配列は、配列番号１３に示すように、長さが３３９ｂｐである。
それがコードするアミノ酸配列は、配列番号１４に示すように、長さが１１３ａａであり、そのうち、軽鎖ＣＤＲ１の配列は、配列番号１８に示すように、軽鎖ＣＤＲ２の配列は、配列番号１９に示すように、軽鎖ＣＤＲ３の配列は、配列番号２０に示すようである。
【0082】
３、ヒト化１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３ （ｈＧ１ＤＭ）の調製
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の抗体の軽鎖定常領域は、Ｉｇ ｋａｐｐａ鎖Ｃ領域で、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮがＰ０１８３４である。
重鎖定常領域は、Ｉｇ ｇａｍｍａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８５７の上で、第２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を導入し、第２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）（配列番号２１）を導入し、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と命名するヒト化抗体を取得した。
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡをそれぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ジェンスクリプト社が提供）ベクターにクローニングし、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ２とｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ３を取得した。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ」で紹介された標準的な技術を参照し、ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩで合成した重鎖、軽鎖全長遺伝子を消化し、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）の消化で発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２とｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を取得し、更に組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子に対して配列決定分析を行う。続いて、対応する軽鎖、重鎖が含まれる組換えプラスミドに対して遺伝子組合せｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）／ ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２とｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を設計し、それぞれ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションした後、培養液を回収して精製した。正しい配列決定と検証した後、内毒素が含まれない発現プラスミドを調製してプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性コトランスフェクションして抗体を発現し、７日培養後、細胞培養液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを採用して親和性精製を行うことにより、ヒト化抗体を取得した。
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の抗体の軽鎖定常領域は、Ｉｇ ｋａｐｐａ鎖Ｃ領域で、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮがＰ０１８３４である。
重鎖定常領域は、Ｉｇ ｇａｍｍａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： Ｐ０１８５７の上で、第２３４位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３４Ａ）を導入し、第２３５位にロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２３５Ａ）（配列番号２１）を導入し、１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と命名するヒト化抗体を取得した。
１９Ｆ３Ｈ１Ｌ１（ｈＧ１ＤＭ）重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ２（ｈＧ１ＤＭ）重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡ、及び１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）の重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡをそれぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ジェンスクリプト社が提供）ベクターにクローニングし、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ１、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ２とｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１９Ｆ３Ｌ３を取得した。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ」で紹介された標準的な技術を参照し、ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩで合成した重鎖、軽鎖全長遺伝子を消化し、制限酵素（ＥｃｏＲＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩ）の消化で発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングし、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２とｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を取得し、更に組換え発現プラスミドの重鎖／軽鎖遺伝子に対して配列決定分析を行う。続いて、対応する軽鎖、重鎖が含まれる組換えプラスミドに対して遺伝子組合せｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ１（ｈＧ１ＤＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ１、ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）／ ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ２とｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｈ２（ｈＧ１ＤＭ）／ｐｃＤＮＡ３．１－１９Ｆ３Ｌ３を設計し、それぞれ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションした後、培養液を回収して精製した。正しい配列決定と検証した後、内毒素が含まれない発現プラスミドを調製してプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一過性コトランスフェクションして抗体を発現し、７日培養後、細胞培養液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを採用して親和性精製を行うことにより、ヒト化抗体を取得した。
【0083】
実施例４：抗ＣＤ７３抗体とＣ１ｑ及びＦｃγＲＩＩＩａの動態親和性測定
（１）抗ＣＤ７３抗体とＣ１ｑの動態親和性測定
サンプル希釈緩衝液がＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４である。５０μｇ／ｍＬの抗体をＦＡＢ２Ｇセンサに固定し、固定高さが約２．０ｎｍであり、センサを緩衝液に６０ｓ平衡化し、センサに固定された抗体は抗原Ｃ１ｑに結合し、抗原濃度が０．６３～１０ｎＭ（２倍勾配希釈）であり、時間が６０ｓであり、抗原抗体は緩衝液で解離し、時間が６０ｓである。センサは、１０ｍＭグリシンを使用し、ｐＨ１．７で再生し、時間が５ｓであり、４回繰り返した。試料板振動速度が１０００ｒｐｍであり、検出温度が３０度であり、検出周波数が０．６Ｈｚである。データを１：１モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を取得した。データ収集ソフトウェアが、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑμｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアが、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０である。
結果は、表１と図１－～３に示すように、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）とＭＥＤＩ９４４７ｈａは、いずれもＣ１ｑと結合活性がない。
（１）抗ＣＤ７３抗体とＣ１ｑの動態親和性測定
サンプル希釈緩衝液がＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４である。５０μｇ／ｍＬの抗体をＦＡＢ２Ｇセンサに固定し、固定高さが約２．０ｎｍであり、センサを緩衝液に６０ｓ平衡化し、センサに固定された抗体は抗原Ｃ１ｑに結合し、抗原濃度が０．６３～１０ｎＭ（２倍勾配希釈）であり、時間が６０ｓであり、抗原抗体は緩衝液で解離し、時間が６０ｓである。センサは、１０ｍＭグリシンを使用し、ｐＨ１．７で再生し、時間が５ｓであり、４回繰り返した。試料板振動速度が１０００ｒｐｍであり、検出温度が３０度であり、検出周波数が０．６Ｈｚである。データを１：１モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を取得した。データ収集ソフトウェアが、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑμｉｓｉｔｉｏｎ ７．０であり、データ分析ソフトウェアが、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０である。
結果は、表１と図１－～３に示すように、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）とＭＥＤＩ９４４７ｈａは、いずれもＣ１ｑと結合活性がない。
【0084】
【表1】
【0085】
（２）抗ＣＤ７３抗体とＦｃγＲＩＩＩａの動態親和性測定
サンプル希釈緩衝液がＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４である。０．５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌに由来する）をＳＡセンサに固定し、時間が１２０ｓであり、センサを緩衝液で６０ｓ平衡化し、センサに固定されたＣＤ１６ａは各抗体に結合し、抗体濃度が３１．３～５００ｎＭ（２倍勾配希釈）であり、時間が６０ｓであり、抗体抗原は、緩衝液で解離し、時間が６０ｓである。センサは、１０ｍＭ ＮａＯＨで再生する。検出温度が３０℃であり、周波数が０．６Ｈｚである。データを１：１モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を取得した。
結果は、表２と図４～６に示すように、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）はＦｃγＲＩＩＩａに結合しないが、ＭＥＤＩ９４４７はＦｃγＲＩＩＩａと結合活性を有する。
サンプル希釈緩衝液がＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４である。０．５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌに由来する）をＳＡセンサに固定し、時間が１２０ｓであり、センサを緩衝液で６０ｓ平衡化し、センサに固定されたＣＤ１６ａは各抗体に結合し、抗体濃度が３１．３～５００ｎＭ（２倍勾配希釈）であり、時間が６０ｓであり、抗体抗原は、緩衝液で解離し、時間が６０ｓである。センサは、１０ｍＭ ＮａＯＨで再生する。検出温度が３０℃であり、周波数が０．６Ｈｚである。データを１：１モデルでフィッティングして分析し、親和性定数を取得した。
結果は、表２と図４～６に示すように、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）はＦｃγＲＩＩＩａに結合しないが、ＭＥＤＩ９４４７はＦｃγＲＩＩＩａと結合活性を有する。
【0086】
【表2】
【0087】
実施例５：抗ＣＤ７３抗体と抗ＣＴＬＡ－４／ＰＤ－１二重特異性抗体の併用による腫瘍細胞の成長への有効的な遮断
本実験は、抗ＣＤ７３抗体、即ち１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）は、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）（その重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５に示すように、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６に示すように、軽鎖及び重鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２３～配列番号３４に示すように）と併用して腫瘍成長を抑制する薬理学的活性を考察した。
結果は、図７に示すように、抗ＣＤ７３抗体と抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の併用は、抗ＣＤ７３抗体単剤、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体単剤と比べると、より優れた腫瘍への抑制作用を示し、且つマウスの体重に有意な影響がない（図８）。
本実験は、抗ＣＤ７３抗体、即ち１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）は、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）（その重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５に示すように、軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６に示すように、軽鎖及び重鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２３～配列番号３４に示すように）と併用して腫瘍成長を抑制する薬理学的活性を考察した。
結果は、図７に示すように、抗ＣＤ７３抗体と抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体の併用は、抗ＣＤ７３抗体単剤、抗ＰＤ－１／ＣＴＬＡ－４二重特異性抗体単剤と比べると、より優れた腫瘍への抑制作用を示し、且つマウスの体重に有意な影響がない（図８）。
【0088】
【表3】
【0089】
マウス結腸癌細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３（江蘇集萃薬康生物科技股フン有限公司が提供）を蘇生し、蘇生世代がＰｎ＋３世代である。対数成長期のＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３細胞を回収し、培養液を除去してＰＢＳで二回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３マウス（江蘇集萃薬康生物科技股フン有限公司が提供）（腫瘤前、腫瘤後、ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３細胞の生存率がそれぞれ９９．１％及び９６．４％である）に接種し、接種量が２＊１０６／１００μＬ／匹であり、接種位置がマウスの右前足である。接種後５日目、平均の腫瘍体積は８６．０２ｍｍ３に達する際、３２匹のマウスは、腫瘍体積によってランダムに４つの群に分けられ、群ごとに８匹である。群分け当日をＤａｙ０とし、表３によってＤａｙ０から投与を開始した。
細胞接種後、毎週、動物の正常な行動に対する腫瘍の影響を定期的に監視する。投与日期がＤａｙ０、Ｄａｙ３、Ｄａｙ７、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２２である。Ｄａｙ０、Ｄａｙ３、Ｄａｙ６、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ１３、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２０、Ｄａｙ２３に、腫瘍の大きさを観測してマウスの体重を秤量する。Ｄａｙ２３実験終了後、各群の動物の腫瘍組織を掘り取って秤量する。マウスの体重の変化率、腫瘍の重量等の実験結果は平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表示する。独立サンプルＴを採用し、異なる治療群が対照群と比べると有意差があるかどうかを検証し、Ｐ ＜ ０．０５は、有意差があると考えられる。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ又はＥｘｃｅｌでプロットする。
細胞接種後、毎週、動物の正常な行動に対する腫瘍の影響を定期的に監視する。投与日期がＤａｙ０、Ｄａｙ３、Ｄａｙ７、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２２である。Ｄａｙ０、Ｄａｙ３、Ｄａｙ６、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ１３、Ｄａｙ１７、Ｄａｙ２０、Ｄａｙ２３に、腫瘍の大きさを観測してマウスの体重を秤量する。Ｄａｙ２３実験終了後、各群の動物の腫瘍組織を掘り取って秤量する。マウスの体重の変化率、腫瘍の重量等の実験結果は平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表示する。独立サンプルＴを採用し、異なる治療群が対照群と比べると有意差があるかどうかを検証し、Ｐ ＜ ０．０５は、有意差があると考えられる。データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ又はＥｘｃｅｌでプロットする。
【0090】
実施例６：抗ＣＤ７３抗体による細胞内在性発現を抑制するＣＤ７３酵素活性の検出
実験ステップは、以下のようである。状態が良好な対数期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－２６に由来する）、血清がないＲＰＭＩ－１６４０培養液を取って細胞を再懸濁し、カウントした。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレート（３＊１０４個の細胞／１００μＬ／ウェル）に接種した。血清がないＲＰＭＩ－１６４０培養液で抗体を希釈し、開始濃度が２００μｇ／ｍＬであり、２．５倍で勾配希釈し、抗体を９６ウェルプレートに添加し、ウェルごとに５０μＬであり、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ウェルごとに５０μＬのＲＰＭＩ－１６４０で希釈された６００μＭのＡＭＰを添加し、３時間後、細胞培養液上清を２５μＬ取り、新しい９６ウェルプレートに移動し、ウェルごとに２５μＬの１００μＭのＡＴＰと５０μＬのＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ： Ｇ８４６１）発色液を添加し、発色させ、マルチラベルマイクロウェルプレート検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、貨物番号： ２１４０－００２０）でデータを読み取った。アイソタイプ対照抗体及びＣＤ７３特異性阻害剤ＡＰＣＰをそれぞれ陰性対照及び陽性対照とした。
実験結果は、図９に示すように、１９Ｆ３、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１で内在性発現のＣＤ７３酵素がＡＭＰをアデノシンＡに触媒する活性を用量依存的に抑制することにより、平均蛍光強度ＲＬＵの生産を用量依存的に減少した。
以上の実験結果は、添加したＡＭＰがＣＤ７３抗体による処理がない場合、細胞の表面にＭＤＡ－ＭＢ－２３１内在性発現するＣＤ７３酵素に触媒され、アデノシンに変換し、ルシフェリン酵素活性に対する抑制を解除する。しかし、抗体を添加した後、ＣＤ７３が抗体で結合されたため、その酵素触媒活性を減少し、ＡＭＰをアデノシンに変換できない。抗ＣＤ７３抗体は、非基質競争方式でＣＤ７３の酵素活性反応を効果的に抑制し、アデノシンの産生を減少することを示唆した。
実験ステップは、以下のようである。状態が良好な対数期ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－２６に由来する）、血清がないＲＰＭＩ－１６４０培養液を取って細胞を再懸濁し、カウントした。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレート（３＊１０４個の細胞／１００μＬ／ウェル）に接種した。血清がないＲＰＭＩ－１６４０培養液で抗体を希釈し、開始濃度が２００μｇ／ｍＬであり、２．５倍で勾配希釈し、抗体を９６ウェルプレートに添加し、ウェルごとに５０μＬであり、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、ウェルごとに５０μＬのＲＰＭＩ－１６４０で希釈された６００μＭのＡＭＰを添加し、３時間後、細胞培養液上清を２５μＬ取り、新しい９６ウェルプレートに移動し、ウェルごとに２５μＬの１００μＭのＡＴＰと５０μＬのＣＴＧ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ： Ｇ８４６１）発色液を添加し、発色させ、マルチラベルマイクロウェルプレート検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、貨物番号： ２１４０－００２０）でデータを読み取った。アイソタイプ対照抗体及びＣＤ７３特異性阻害剤ＡＰＣＰをそれぞれ陰性対照及び陽性対照とした。
実験結果は、図９に示すように、１９Ｆ３、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）、１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）と１９Ｆ３Ｈ２Ｌ３（ｈＧ１ＤＭ）は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１で内在性発現のＣＤ７３酵素がＡＭＰをアデノシンＡに触媒する活性を用量依存的に抑制することにより、平均蛍光強度ＲＬＵの生産を用量依存的に減少した。
以上の実験結果は、添加したＡＭＰがＣＤ７３抗体による処理がない場合、細胞の表面にＭＤＡ－ＭＢ－２３１内在性発現するＣＤ７３酵素に触媒され、アデノシンに変換し、ルシフェリン酵素活性に対する抑制を解除する。しかし、抗体を添加した後、ＣＤ７３が抗体で結合されたため、その酵素触媒活性を減少し、ＡＭＰをアデノシンに変換できない。抗ＣＤ７３抗体は、非基質競争方式でＣＤ７３の酵素活性反応を効果的に抑制し、アデノシンの産生を減少することを示唆した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】