特表 2023-546759 腫瘍壊死因子－アルファおよびトランスフォーミング増殖因子－ベータの二機能性アンタゴニストならびにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-07

(54)【発明の名称】腫瘍壊死因子－アルファおよびトランスフォーミング増殖因子－ベータの二機能性アンタゴニストならびにその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231030BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20231030BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231030BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231030BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231030BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231030BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20231030BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/46 ZNA

C07K16/24

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P7/00

A61P7/06

A61P43/00 105

A61P1/16

A61P11/00

A61P13/12

A61P9/00

A61P21/00

A61P17/00

A61P27/02

A61P35/00

A61P35/02

A61P21/04

A61P25/00

A61P9/10

A61P29/00

A61P35/04

A61P19/08

A61P19/10

A61P9/04

A61P3/10

A61P19/02

A61P1/04

A61P31/14

A61P37/02

A61P31/04

A61P17/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549958

(86)(22)【出願日】2021-10-22

(85)【翻訳文提出日】2023-06-19

(86)【国際出願番号】 US2021056282

(87)【国際公開番号】W WO2022087435

(87)【国際公開日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】63/104,850

(32)【優先日】2020-10-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

２．トライトン

(71)【出願人】

【識別番号】523151768

【氏名又は名称】ハン，ハック

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮ，Ｈｑ

(71)【出願人】

【識別番号】523151779

【氏名又は名称】シュウ，シャオラン

【氏名又は名称原語表記】ＺＨＯＵ，Ｘｉａｏｌａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】ハン，ハック

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，シャオラン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明の開示は、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βを並行して隔離する能力を高度に有する、少なくとも１つのＴＮＦ－α結合性ドメインおよび少なくとも１つのＴＧＦ－β結合性ドメインを含む新規の二機能性アンタゴニストポリペプチドを提供する。そのような二機能性ポリペプチドアンタゴニストの医薬組成物、ならびに、その病理発生がＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－ＫＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の両方の活性化を伴う様々な複合疾患状態を処置するためのそれらの使用もまた提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む単離された二機能性アンタゴニスト分子であって、ＴＮＦシグナル伝達およびＴＧＦ－βシグナル伝達を強力な方式において同時に中和する、前記単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項2】

前記第１の抗原結合性分子が、配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドからなる群から選択されるＴＮＦリガンドに特異的に結合し、および前記第２の抗原結合性分子が、配列番号６～９に記載されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－βリガンドからなる群から選択されるＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する、請求項１に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項3】

ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する前記第１の抗原結合性分子（「ＴＮＦ－α結合性ポリペプチド」）が、抗ＴＮＦ－α抗体、抗ＴＮＦ－α抗体の断片、野生型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン、ならびにＴＮＦ－αリガンドを標的化するファージディスプレイ由来ポリペプチドからなる群から選択され；ならびにＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する前記第２の抗原結合性分子（「ＴＧＦ－β結合性ポリペプチド」）が、抗ＴＧＦ－β抗体、抗ＴＧＦ－β抗体の断片、野生型ＴＧＦ－β ２型受容体（ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢを含む）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢ細胞外ドメイン、ならびにＴＧＦ－βリガンドを標的化するファージディスプレイ由来アンタゴニストポリペプチドからなる群から選択される、請求項１～２のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項4】

前記ＴＮＦ結合性ポリペプチドが、配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群から選択され、および前記ＴＧＦ－β結合性ポリペプチドが、配列番号６～９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項5】

前記ＴＮＦ結合性ポリペプチドが、単離された抗ＴＮＦ抗体、またはその抗原結合性断片を含み、および前記ＴＧＦ－β結合性ポリペプチドが、単離された抗ＴＧＦ－β抗体、またはその抗原結合性断片を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項6】

前記単離された抗ＴＮＦ抗体またはその抗原結合性断片および単離された抗ＴＧＦ－β抗体またはその抗原結合性断片が、モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）、ポリクローナルＡｂ、Ａｂ断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラＡｂ、ミニＡｂまたはドメインＡｂ（ｄＡｂ）、二重特異性Ａｂ、二特異性Ａｂ、ヘテロコンジュゲートＡｂ、単鎖Ａｂ（ＳＣＡ）、単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）、ヒト化Ａｂ、完全ヒトＡｂ、および要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の任意の他の改変された構成からなる群から選択される、請求項５に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項7】

前記単離された抗体またはその抗原結合性断片が、完全ヒト、ヒト化およびキメラ抗体からなる群から選択される、請求項５～６のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項8】

前記ＴＮＦ結合性ポリペプチドが、配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号２２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である、請求項５～７のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項9】

前記ＴＧＦ－β結合性ポリペプチドが、配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である、請求項５～８のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項10】

前記二機能性分子が、配列番号３０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３１に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子；ならびに配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子からなる群から選択される、請求項１～２のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項11】

前記二機能性分子が、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；および配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子からなる群から選択される、請求項１～２のいずれか１項に記載の単離された二機能性アンタゴニスト分子。

【請求項12】

医薬的に許容される担体と混合された治療有効量の請求項１～１１のいずれか１項に記載の二機能性アンタゴニスト分子を含む医薬組成物。

【請求項13】

その病理発生がＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の両方の活性化を伴う疾患状態を処置または予防する方法であって、前記対象に治療有効量の請求項１２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項14】

前記疾患状態が、血液障害、無効赤血球生成、貧血、汎血球減少症、骨髄異形成症候群；線維性疾患：ＮＡＳＨ、肝臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、多発性嚢胞腎疾患、心臓線維症、筋肉線維症、骨髄線維症、皮膚線維症、目の線維症、手の線維症、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、黒色腫、筋ジストロフィー、脊髄筋萎縮症、脊髄傷害、卒中、侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛、サルコペニア、がん悪液質、神経性食欲不振、骨転移、骨脆弱性、骨折、骨減少症、骨粗しょう症、肺高血圧症、肺動脈高血圧症、心筋梗塞、心不全、インスリン抵抗性、糖尿病性腎症、慢性腎臓疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、サイトカインストーム症候群、敗血症、および熱傷からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の二機能性アンタゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸分子を含む組換えベクター。

【請求項17】

請求項１３に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。

【請求項18】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の二機能性アンタゴニスト分子を製造する方法であって、ａ）前記二機能性アンタゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、ｂ）前記二機能性アンタゴニスト分子の発現のために好適な条件下で前記宿主細胞を培養するステップおよびｃ）培養物から前記二機能性アンタゴニスト分子を回収するステップを含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連する特許出願
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１０月２３日に出願された米国仮出願第６３／１０４，８５０号の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景技術
腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）は、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を媒介し、細胞増殖、分化、アポトーシス、および免疫応答のモジュレーションおよび炎症の誘導を含む、様々な生理学的なおよび病理学的なプロセスにおいて重要な役割を果たす。ＴＮＦは、２つの受容体、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体－１）およびＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体－２）を通じて作用する。ＴＮＦ－αは、炎症応答、プログラム細胞死および組織壊死において極めて重要な役割を果たす。増加したＴＮＦ－αシグナル伝達は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病および乾癬を含む、多数の炎症性疾患に結び付けられており、抗ＴＮＦ療法、例えばアダリムマブ、インフリキシマブおよびエタネルセプトは、そのような炎症性疾患の処置において高度に有効であることが示されている。上昇したＴＮＦ－αレベルおよび増加したＴＮＦ－αシグナル伝達はまた、貧血、白血病、多発性骨髄腫、線維症、高血圧、筋消耗、骨減少症、神経変性、敗血症、線維症、疼痛、慢性腎臓疾患、肝臓疾患、および心不全を含む多くの他の疾患状態の病理発生および進行に結び付けられている。

【0003】

ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を含む、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）は、細胞表面上の高親和性受容体ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＢの結合および活性化を通じてＳｍａｄ２／３シグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ－βは、免疫機能、細胞増殖および分化、上皮間葉転換、線維化、造血、筋発生ならびに骨リモデリングを含む、広範囲の生物学的活性の調節において不可欠な役割を果たす。上昇したＴＧＦ－βレベルおよび結果的に増加したＳｍａｄ２／３シグナル伝達は、がん、貧血、骨転移、骨減少症、線維症、疼痛、筋肉喪失、インスリン抵抗性、慢性腎臓疾患、肝臓疾患、および心臓血管疾患を含む多くの疾患状態の病理発生および進行に結び付けられている。

【0004】

多くの複合障害は、その活性が病理発生および進行を促進するＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の並行した活性化を伴うことを増加する証拠は指し示している。そのような複合障害の例は、ある特定の血液学的障害、例えば難治性貧血および骨髄異形成症候群、心臓血管疾患、例えば肺高血圧症および鬱血性心不全、骨障害、例えば骨転移および骨折、臓器不全、例えば腎不全、肝不全または骨髄不全、ならびに線維性疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎、硬変および肺線維症、ならびに疼痛、例えば侵害受容性または神経障害性疼痛を含む。

【0005】

これらの複合障害に対する現行の処置オプションは限られている。これらの障害における１つより多くの疾患シグナル伝達機序の関与に起因して、単一の疾患機序を標的化するために設計された現行で利用可能な療法は、典型的には、不良な有効性および低い奏効率を有する。ＴＮＦ－α－ＮＦ－ｋＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β－Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の両方は疾患病理発生および進行に不可欠に関与するので、２つの疾患シグナル伝達経路を並行して阻害する能力を有する新規の二機能性アンタゴニストを開発することは明確に重要である。

【発明の概要】

【0006】

発明の開示
１つの態様において、本発明は、ＴＮＦ－αシグナル伝達およびＴＧＦ－βシグナル伝達を強力な方式において同時に中和するために特異的に設計された新規のポリペプチドベースの二機能性アンタゴニスト分子を提供する。様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、図１において描写されるように設計される。様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、図２において描写されるように設計される。様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、図３において描写されるように設計される。

【0007】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子（「ＴＮＦ－α結合性ポリペプチド」）およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子（「ＴＧＦ－β結合性ポリペプチド」）を含む二機能性分子である。様々な実施形態において、「ＴＮＦ－α結合性ポリペプチド」は、抗ＴＮＦ抗体、抗ＴＮＦ抗体の断片、野生型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン、ならびにＴＮＦ－αリガンドを標的化するファージディスプレイ由来ポリペプチドからなる群から選択され、ならびに「ＴＧＦ－β結合性ポリペプチド」は、抗ＴＧＦ－β抗体、抗ＴＧＦ－β抗体の断片、野生型ＴＧＦ－β ２型受容体（ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢを含む）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢ細胞外ドメイン、ならびにＴＧＦ－βリガンドを標的化するファージディスプレイ由来アンタゴニストポリペプチドからなる群から選択される。

【0008】

様々な実施形態において、二機能性分子は、ＴＮＦ－αに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片、およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片を含む。様々な実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）、ポリクローナルＡｂ、Ａｂ断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラＡｂ、ミニＡｂまたはドメインＡｂ（ｄＡｂ）、二重特異性Ａｂ、二特異性Ａｂ、ヘテロコンジュゲートＡｂ、単鎖Ａｂ（ＳＣＡ）、単鎖可変領域断片（ＳｃＦｖ）、ヒト化Ａｂ、完全ヒトＡｂ、および要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の任意の他の改変された構成からなる群から選択される。様々な実施形態において、二機能性分子は、完全ヒト、ヒト化およびキメラ抗体からなる群から選択される単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0009】

様々な実施形態において、第１の抗原結合性分子は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第１の抗原結合性分子は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第１の抗原結合性分子は、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第１の抗原結合性分子は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第１の抗原結合性分子は、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むＴＮＦリガンドに特異的に結合する。

【0010】

様々な実施形態において、第２の抗原結合性分子は、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第２の抗原結合性分子は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第２の抗原結合性分子は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する。様々な実施形態において、第２の抗原結合性分子は、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含むＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する。

【0011】

様々な実施形態において、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子は、配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号１２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である。

【0012】

様々な実施形態において、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子は、配列番号１４に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１５に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１４に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１５に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号１６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である。

【0013】

様々な実施形態において、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子は、配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２０に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２１に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号２０に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２１に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である。

【0014】

様々な実施形態において、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子は、配列番号２２に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２３に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２２に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号２３に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号２４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である。

【0015】

様々な実施形態において、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子は、配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２８に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；配列番号２９に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体；ならびに配列番号２８に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２９に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体からなる群から選択される単離された抗体である。

【0016】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二機能性分子であり、ＴＮＦ－αリガンド結合性分子は、配列番号１～５および１０～２５に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群から選択され、ならびにＴＧＦ－βリガンド結合性分子は、配列番号６～９および２６～２９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群から選択される。

【0017】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二機能性分子であり、二機能性分子は、配列番号３０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３１に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子；ならびに配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含む二機能性分子からなる群から選択される。

【0018】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二機能性分子であり、二機能性分子は、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子；および配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を含む二機能性分子からなる群から選択される。

【0019】

別の態様において、本開示は、本開示の二機能性アンタゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。様々な実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含み、および本明細書に記載される少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるリンカーまたはヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0020】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを提供する。様々な実施形態において、ベクターは発現ベクターである。別の態様において、本開示は、本開示の核酸を含む単離された細胞を提供する。様々な実施形態において、細胞は、本開示の発現ベクターを含む宿主細胞である。別の態様において、二機能性アンタゴニスト分子を製造する方法であって、該タンパク質またはポリペプチドの発現を促進する条件下で宿主細胞を培養することによる、方法が提供される。

【0021】

別の態様において、提供されるのは、本明細書に記載されているＴＮＦ－αに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二機能性アンタゴニスト分子を製造する方法であって、ａ）前記二機能性アンタゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、ｂ）二機能性アンタゴニスト分子の発現のために好適な条件下で宿主細胞を培養するステップおよびｃ）培養物から二機能性アンタゴニスト分子を回収するステップを含む、方法である。本発明はまた、本発明の方法により製造される二機能性アンタゴニスト分子を包含する。

【0022】

別の態様において、本開示は、医薬的に許容される担体と混合された単離された二機能性アンタゴニスト分子を含む医薬組成物を提供する。

【0023】

別の態様において、本開示は、その病理発生がＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の両方の活性化を伴う様々な複合疾患状態を処置または予防する方法を提供する。

【0024】

様々な実施形態において、本発明の新規の二機能性アンタゴニスト分子は、以下の状態：血液障害：無効赤血球生成、貧血、汎血球減少症、骨髄異形成症候群；線維性疾患：ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、肝臓線維症、肺線維症、腎臓線維症、多発性嚢胞腎疾患、心臓線維症、筋肉線維症、骨髄線維症、皮膚線維症、手の線維症および目の線維症；がん：多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、黒色腫；チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１および抗ＣＴＬ４抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞療法と組み合わせたがん処置；神経筋疾患：筋ジストロフィー、脊髄筋萎縮症、脊髄傷害、卒中；疼痛：侵害受容性疼痛、神経障害性疼痛；消耗性障害：サルコペニア、がん悪液質、神経性食欲不振；骨障害：骨転移、骨脆弱性、骨折、骨減少症、骨粗しょう症；心臓血管疾患：肺高血圧症、肺動脈高血圧症、心筋梗塞、心不全；代謝障害：インスリン抵抗性、糖尿病性腎症、慢性腎臓疾患；炎症性疾患：関節リウマチ、炎症性腸疾患；感染症：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、サイトカインストーム症候群、敗血症；ならびに外傷：熱傷を含むが、これらに限定されない、様々な障害の処置のための広い応用を有してもよい。

【0025】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されている任意の障害または状態の処置用の医薬を製造するための、二機能性アンタゴニスト分子の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、本発明の代表的な二機能性アンタゴニスト分子を描写する。この図式に示されている「ＴＮＦ結合性ポリペプチド」は、抗ＴＮＦ抗体、抗ＴＮＦ抗体の断片、野生型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２細胞外ドメイン、ならびにＴＮＦ－αを標的化するファージディスプレイ由来ポリペプチドを含むが、これらに限定されない、ＴＮＦ－αに結合する能力を有する任意のポリペプチドを指す。この図式に示されている「ＴＧＦ－β結合性ポリペプチド」は、抗ＴＧＦ－β抗体、抗ＴＧＦ－β抗体の断片、野生型ＴＧＦ－β ２型受容体（ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢを含む）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、改変型ＴＧＦβＲＩＩＡおよびＴＧＦβＲＩＩＢ細胞外ドメイン、ならびにＴＧＦ－βに結合してそれを中和する能力を有するファージディスプレイ由来アンタゴニストポリペプチドを含むが、これらに限定されない、ＴＧＦ－β（すなわち、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２またはＴＧＦ－β３）に結合する能力を有する任意のポリペプチドを指す。この図式に示されている「リンカー」は、任意のペプチドリンカーまたは化学的リンカーの使用を含むが、これらに限定されない、異なるポリペプチド融合パートナーを融合させて二特異性および多特異性分子を生成する様々な方法を指す。

【図2】図２は、（Ａ）ＴＮＦ－α結合性ポリペプチドが抗ＴＮＦ－α抗体であり、およびＴＧＦ－β結合性ポリペプチドが、抗ＴＮＦ－α抗体の重鎖ＣＨ３にリンカーを介して取り付けられたＴＧＦ－β受容体ＥＣＤであるか；または（Ｂ）ＴＧＦ－β結合性ポリペプチドが抗ＴＧＦ－β抗体であり、およびＴＮＦ－α結合性ポリペプチドが、抗ＴＧＦ－β抗体の重鎖ＣＨ３にリンカーを介して取り付けられたＴＮＦ受容体ＥＣＤである、本発明の２つの代表的な二機能性アンタゴニスト分子を描写する。代替的な実施形態において、ＴＧＦ－β受容体ＥＣＤ（またはＴＮＦ受容体ＥＣＤ）は、抗ＴＮＦ－α抗体（または抗ＴＧＦ－β抗体）抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）においてリンカーを介して取り付けられている。代替的な実施形態において、ＴＧＦ－β受容体ＥＣＤ（またはＴＮＦ受容体ＥＣＤ）は、抗ＴＮＦ－α抗体（または抗ＴＧＦ－β抗体）抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）においてリンカーを介して取り付けられている。代替的な実施形態において、ＴＧＦ－β受容体ＥＣＤ（またはＴＮＦ受容体ＥＣＤ）は、抗ＴＮＦ－α抗体（または抗ＴＧＦ－β抗体）抗体の重鎖ＣＨ３、ＶＬ、またはＶＨ部位ではなく内部部位においてリンカーを介して取り付けられている。

【図3】図３は、（Ａ）抗ＴＧＦ－β抗体に由来する可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ならびに（Ｂ）抗ＴＮＦ抗体の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む、二特異性抗体の形態の本発明の代表的な二機能性アンタゴニスト分子を描写する。図３に図示される二特異性抗体は１つの特有の構成において示されているが、抗ＴＧＦ－βおよび抗ＴＮＦ抗体の両方からの可変領域を含む二特異性抗体は、多様な構成において当業者により構築され得ることが留意される。

【図4】図４は、二機能性アンタゴニスト分子Ａ－１１９は、細胞ベースのアッセイにおいてＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１、およびＴＧＦ－β３を強力に中和することを示す線グラフを描写する。細胞ベースのＴＮＦ－α中和およびＴＧＦ－β中和ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出およびプロットした。

【図5】図５は、二機能性アンタゴニスト分子Ａ－１２０は、細胞ベースのアッセイにおいてＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１、およびＴＧＦ－β３を強力に中和することを示す線グラフを描写する。細胞ベースのＴＮＦ－α中和およびＴＧＦ－β中和ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出およびプロットした。

【図6】図６Ａ～図６Ｇは、異なる処理条件下でのヒト初代肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）の細胞増殖および細胞形態における変化を描写し、二機能性アンタゴニストＡ１２０は、ＰＡＳＭＣのＴＮＦα－およびＴＧＦ－β１誘導性過形成および肥大を高度に有効な方式において予防したことを示す。

【図7】図７Ａ及び図７Ｂは、上昇したＴＮＦαおよびＴＧＦ－β１の文脈において、Ａ１２０は、ＰＡＳＭＣの過形成および肥大の両方の予防において抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃよりも有効であったことを示す棒グラフを描写する。ＰＡＳＭＣの形態計測学的分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。

【図8】図８Ａ～図８Ｆは、Ｈ＆Ｅ染色された肺切片の組織学的画像およびＡｓｈｃｒａｆｔスコアに関する棒グラフを描写し、Ａ１２０は、ブレオマイシン誘導性肺線維症マウスにおける肺組織損傷および線維化の低減において抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃよりも有効であったことを示す。

【図9】図９Ａ～図９Ｆは、マッソントリクローム染色された肺切片の組織学的画像およびコラーゲン沈着面積の定量的分析に関する棒グラフを描写し、Ａ１２０は、ブレオマイシンで処置されたマウスにおいて抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃよりも有効に肺線維症を減弱したことを示す。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｅは、肺切片におけるαＳＭＡ染色の組織学的画像を描写し、Ａ１２０は、ブレオマイシンで処置されたマウスの肺組織におけるαＳＭＡの誘導の予防において抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃよりも有効であったことを示す。肺切片は、抗αＳＭＡ抗体およびＨＲＰ標識された二次抗体を用いて免疫化学的に染色した。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本開示を実行するための形態
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。様々な実施形態において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、そのアルファ炭素がペプチド結合を通じて連結されているアミノ酸の鎖である。鎖の１つの末端（アミノ末端）における末端アミノ酸はしたがって遊離アミノ基を有し、鎖の他の末端（カルボキシ末端）における末端アミノ酸は遊離カルボキシル基を有する。本明細書において使用される場合、「アミノ末端」（Ｎ末端と略記される）という用語は、ペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸上の遊離α－アミノ基またはペプチド内の任意の他の位置におけるアミノ酸のα－アミノ基（ペプチド結合に参加する場合にイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端における遊離カルボキシル基またはペプチド内の任意の他の位置におけるアミノ酸のカルボキシル基を指す。ペプチドはまた、ペプチド模倣物、例えばアミド結合とは対照的にエーテルにより接合されたアミノ酸を含むが、これらに限定されない、本質的に任意のポリアミノ酸を含む。

【0028】

本開示のポリペプチドは、例えば、（１）タンパク質加水分解に対する感受性を低減させるため、（２）酸化に対する感受性を低減させるため、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するため、（４）結合親和性を変更するため、および（５）他の物理化学的または機能的特性を付与または改変するために任意の仕方でおよび任意の理由で改変されているポリペプチドを含む。

【0029】

アミノ酸「置換」は、本明細書において使用される場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置における１つのアミノ酸の、異なるアミノ酸でのポリペプチド中の置換を指す。アミノ酸置換は、当技術分野において周知の遺伝学的または化学的方法を使用して生成され得る。例えば、単一のまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列中（例えば、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分中）で行われてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸の、機能的に類似したアミノ酸でのポリペプチド中の置換を指す。以下の６つの群の各々は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、およびバリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）

【0030】

「非保存的アミノ酸置換」は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラスからのメンバーによる置換を指す。そのような変化を行う際に、様々な実施形態にしたがって、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮されてもよい。各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷的特徴に基づいてハイドロパシー指数を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）である。

【0031】

タンパク質への相互作用性生物学的機能の付与におけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は当技術分野において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３１を参照）。ある特定のアミノ酸は、類似したハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されて、類似した生物学的活性を依然として保持し得ることが公知である。ハイドロパシー指数に基づいて変化を行う際に、様々な実施形態において、そのハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。様々な実施形態において、±１以内であるものが含まれ、様々な実施形態において、±０．５以内であるものが含まれる。

【0032】

似たアミノ酸の置換は親水性に基づいて有効に行うことが可能であり、これは特には、それにより作り出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、本明細書に開示されように、免疫学的な実施形態における使用のために意図される場合に該当することもまた当技術分野において理解される。様々な実施形態において、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるような、タンパク質の最大の局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。

【0033】

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に対して割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋－．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋－．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５．＋－．１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）およびトリプトファン（－３．４）。類似した親水性値に基づいて変化を行う際に、様々な実施形態において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、様々な実施形態において、±１以内であるものが含まれ、様々な実施形態において、±０．５以内であるものが含まれる。

【0034】

例示的なアミノ酸置換が表１に記載される。

【0035】

当業者は、周知の技術を使用して本明細書に記載されているポリペプチドの好適なバリアントを決定することができる。様々な実施形態において、当業者は、活性のために重要ではないと考えられる領域を標的化することにより活性を破壊することなく変化され得る分子の好適な区画を同定してもよい。他の実施形態において、当業者は、類似したポリペプチドの間で保存されている分子の残基および部分を同定することができる。さらなる実施形態において、生物学的活性のためまたは構造のために重要であり得る区画であっても、生物学的活性を破壊することもポリペプチド構造に悪影響を与えることもなく保存的アミノ酸置換に供され得る。

【0036】

追加的に、当業者は、活性または構造のために重要な類似したポリペプチド中の残基を同定する構造－機能研究を検討することができる。そのような比較を考慮して、当業者は、類似したポリペプチドにおいて活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基のための化学的に類似したアミノ酸置換を選択してもよい。

【0037】

当業者はまた、類似したポリペプチドにおける３次元構造およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報を考慮して、当業者は、その３次元構造に関してポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを予測してもよい。様々な実施形態において、当業者は、ポリペプチドの表面上にあることが予測されるアミノ酸残基に対して抜本的な変化を行わないように選択してもよく、その理由は、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各々の所望されるアミノ酸残基における単一のアミノ酸置換を含有する試験バリアントを生成してもよい。バリアントは次に、当業者に公知の活性アッセイを使用してスクリーニングされ得る。そのようなバリアントは、好適なバリアントについての情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊されたか、望ましくなく低減されたか、または好適でない活性を結果としてもたらすことが発見された場合、そのような変化を有するバリアントは回避され得る。換言すれば、そのようなルーチンの実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でまたは他の突然変異と組み合わせて回避されるべきアミノ酸を容易に決定することができる。

【0038】

「ポリペプチド断片」および「切断されたポリペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、対応する全長タンパク質と比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。様々な実施形態において、断片は、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００または少なくとも１０００アミノ酸の長さであることができる。様々な実施形態において、断片はまた、例えば、最大で１０００、最大で９００、最大で８００、最大で７００、最大で６００、最大で５００、最大で４５０、最大で４００、最大で３５０、最大で３００、最大で２５０、最大で２００、最大で１５０、最大で１００、最大で５０、最大で２５、最大で１０、または最大で５アミノ酸の長さであることができる。断片は、その末端のいずれかまたは両方において、１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、異なる天然に存在するタンパク質からのアミノ酸の配列（例えば、Ｆｃもしくはロイシンジッパードメイン）または人工的なアミノ酸配列（例えば、人工的なリンカー配列）をさらに含むことができる。

【0039】

「ポリペプチドバリアント」、「ハイブリッドポリペプチド」および「ポリペプチド突然変異体」という用語は、本明細書において使用される場合、別のポリペプチド配列と比べて１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。様々な実施形態において、挿入、欠失、または置換されるアミノ酸残基の数は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００アミノ酸の長さであることができる。本開示のハイブリッドは融合タンパク質を含む。

【0040】

ポリペプチドの「誘導体」は、化学的に修飾されている、例えば、別の化学的部分、例えば、ポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）へのコンジュゲーション、リン酸化、およびグリコシル化をされているポリペプチドである。

【0041】

「％の配列同一性」（配列同一性％）という用語は、「％の同一性」（同一性％）という用語と本明細書において交換可能に使用され、配列アライメントプログラムを使用してアライメントされた場合の、２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列同一性のレベルまたは２つ以上のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書において使用される場合、８０％の同一性は、定義されたアルゴリズムにより決定される８０％の配列同一性と同じことを意味し、所与の配列が別の配列に対して少なくとも８０％同一であることを意味する。様々な実施形態において、同一性％は、所与の配列に対する例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはより高い配列同一性から選択される。様々な実施形態において、同一性％は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

【0042】

「％の配列相同性」（配列相同性％）という用語は、「％の相同性」（相同性％）という用語と本明細書において交換可能に使用され、配列アライメントプログラムを使用してアライメントされた場合の、２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列相同性のレベルまたは２つ以上のヌクレオチド配列の間のヌクレオチド配列相同性のレベルを指す。例えば、本明細書において使用される場合、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムにより決定される８０％の配列相同性と同じことを意味し、よって所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにかけて８０％より高い配列相同性を有する。様々な実施形態において、相同性％は、所与の配列に対する例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％またはより高い配列相同性から選択される。様々な実施形態において、相同性％は、例えば、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、または約９５％～約９９％の範囲内である。

【0043】

２つの配列の間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータプログラムは、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいてインターネット上で公開されている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮを含むが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０（公開されたデフォルトの設定、すなわち、パラメーターｗ＝４、ｔ＝１７が特に参照される）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２，１９９７も参照。配列検索は、典型的には、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公的なデータベース中のアミノ酸配列と比べて所与のアミノ酸配列を評価する場合にＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して実行される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公的なデータベース中のアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレームにおいて翻訳された核酸配列を検索するために好ましい。ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティ、および１．０のエクステンデッドギャップペナルティのデフォルトのパラメーターを使用して実行され、ＢＬＯＳＵＭ－６２マトリックスを利用する。

【0044】

配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７，１９９３を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの指標は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、参照核酸との試験核酸の比較における最小和確率が、例えば、約０．１より低い、約０．０１より低い、または約０．００１より低い場合に、核酸は参照配列に類似していると考えられる。

【0045】

「修飾」または「改変」（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）という用語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチドのペプチド骨格（例えば、アミノ酸配列）または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）の任意のマニピュレーションを指す。

【0046】

「抗原結合性分子」という用語は、本明細書において使用される場合、その最も広い意味において、抗原決定因子に特異的に結合する分子を指す。抗原結合性分子の例は、抗体、抗体断片およびスキャフォールド抗原結合性タンパク質である。参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合性分子」は、競合アッセイにおいてその抗原への参照分子の結合を５０％またはより大きく遮断する抗原結合性分子を指し、反対に、参照分子は、競合アッセイにおいてその抗原への抗原結合性分子の結合を５０％またはより大きく遮断する

【0047】

本明細書において使用される場合、「抗原結合性部位」という用語は、抗原決定因子に特異的に結合する抗原結合性分子の部分を指す。より特には、「抗原結合性部位」という用語は、抗原の部分または全体に特異的に結合する、および該部分または全体に相補的な区画を含む抗体の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合性分子は抗原の特定の部分にのみ結合することがあり、該部分はエピトープと称される。抗原結合性部位は、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。好ましくは、抗原結合性部位は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0048】

本明細書において使用される場合、「抗原決定因子」という用語は「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合性部分が結合して抗原結合性部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続するストレッチまたは連続しないアミノ酸の異なる領域から作られるコンホメーション配置）を指す。有用な抗原決定因子は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の疾患細胞の表面上、免疫細胞の表面上、遊離して血清中、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出され得る。本明細書において抗原として有用なタンパク質は、他に指し示されなければ、哺乳動物、例えば霊長動物（例えば、ヒト）ならびに齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）を含む、任意の脊椎動物供給源からの任意のネイティブな形態のタンパク質であることができる。様々な実施形態において、抗原はヒトタンパク質である。

【0049】

本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味において使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性および多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ならびに所望される抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0050】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

【0051】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、およびＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、および典型的には２つの、可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生成するために元々の抗体のものから追加的に改変または変化を受けている抗体である。

【0052】

「ヒト」抗体は、ヒトもしくはヒト細胞により産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コーディング配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0053】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、起こり得るバリアント抗体、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の製造の間に生じるものを除いて、同一であり、および／または同じエピトープに結合し、そのようなバリアントは一般に微量で存在する。異なる決定因子（エピトープ）に対して方向付けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子に対して方向付けられている。

【0054】

「単一特異性」抗体という用語は、本明細書において使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにその各々が結合する１つ以上の結合性部位を有する抗体を表す。「二特異性」という用語は、抗体が少なくとも２つの別個の抗原決定因子に特異的に結合できることを意味し、例えば２つの結合性部位の各々は、異なる抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のペアにより形成される。そのような二特異性抗体は１＋１フォーマットである。他の二特異性抗体フォーマットは２＋１フォーマット（第１の抗原もしくはエピトープのための２つの結合性部位および第２の抗原もしくはエピトープのための１つの結合性部位を含む）または２＋２フォーマット（第１の抗原もしくはエピトープのための２つの結合性部位および第２の抗原もしくはエピトープのための２つの結合性部位を含む）である。典型的には、二特異性抗体は、その各々が異なる抗原決定因子に特異的である２つの抗原結合性部位を含む。

【0055】

「価」（ｖａｌｅｎｔ）という用語は、本出願内において使用される場合、抗原結合性分子における指定される数の結合性部位の存在を表す。そのため、「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、抗原結合性分子中のそれぞれ２つの結合性部位、４つの結合性部位、および６つの結合性部位の存在を表す。本発明による二特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」（例えば、「四価」もしくは「六価」）であってもよい。様々な実施形態において、本発明の抗体は、２つ以上の結合性部位を有し、二特異性である。すなわち、抗体は、２つより多くの結合性部位がある（すなわち抗体は三価または多価である）場合であっても二特異性であり得る。特に、本発明は、特異的に結合する各々の抗原のための１つの結合性部位を有する二特異性二価抗体に関する。

【0056】

「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全体抗体」という用語は、ネイティブな抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために本明細書において交換可能に使用される。「ネイティブな抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合した２つの軽鎖および２つの重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各々の重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各々の軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、アルファ（ＩｇＡ）、デルタ（ＩｇＤ）、イプシロン（ＩｇＥ）、ガンマ（ＩｇＧ）、またはミュー（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの種類のうちの１つに割り当てられ得、これらの一部は、サブタイプ、例えば、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、ガンマ４（ＩｇＧ４）、アルファ１（ＩｇＡ１）およびアルファ２（ＩｇＡ２）にさらに分けられ得る。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。

【0057】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；抗体断片から形成される多特異性抗体および単一ドメイン抗体を含むがこれらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説のために、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説のために、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）；そしてまた国際公開第９３／１６１８５号；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含み、および増加したインビボ半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論のために、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価または二特異性であり得る２つの抗原結合性部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディおよびテトラボディもまたＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４ （２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体もしくは部分または軽鎖可変ドメインの全体もしくは部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。追加的に、抗体断片は、ＶＬドメインと共に機能的な抗原結合性部位にアセンブルできるというＶＨドメインの特徴、またはＶＨドメインと共に機能的な抗原結合性部位にアセンブルできるというＶＬドメインの特徴を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供できる単鎖ポリペプチドを含む。抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化分解の他に、本明細書に記載されるように、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはファージ）による製造を含むがこれらに限定されない、様々な技術により製造され得る。

【0058】

インタクトな抗体のパパイン消化は２つの同一の抗原結合性断片を生成し、該抗原結合性断片は「Ｆａｂ」断片とも呼ばれ、各々は、重鎖および軽鎖可変ドメインならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含有する。本明細書において使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬドメインおよび軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、ならびにＶＨドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）およびＦｃ領域の部分を有するＦ（ａｂ’）_２断片をもたらす。

【0059】

「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの１つを有し；ならびに前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化される。追加的に、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けにしたがって可変重鎖中の４４位および可変軽鎖中の１００位）を介する鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定化され得る。

【0060】

「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常は、柔軟性のためのグリシンの他に、溶解性のためのセリンまたはスレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができるか、またはその逆である。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元々の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６に記載されている。追加的に、抗体断片は、ＶＬドメインと共に機能的な抗原結合性分子にアセンブルできるというＶＨドメインの特徴、またはＶＨドメインと共に機能的な抗原結合性分子にアセンブルできるというＶＬドメインの特徴を有し、それにより全長抗体の抗原結合特性を提供できる単鎖ポリペプチドを含む。

【0061】

本明細書における「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。特には、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端まで伸長している。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、または存在しなくてもよい。重鎖のアミノ酸配列は常にＣ末端リジンと共に示されるが、Ｃ末端リジンを有しないバリアントは本発明に含まれる。

【0062】

ＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ ＣＨ２およびＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常は、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで伸長する。１つの実施形態において、炭水化物鎖がＣＨ２ドメインに取り付けられている。本明細書におけるＣＨ２ドメインはネイティブ配列ＣＨ２ドメインまたはバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端にある残基のストレッチ（すなわちＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域はネイティブ配列ＣＨ３ドメインまたはバリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その１つの鎖における導入された「隆起」（「ノブ」）およびその他の鎖における対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）であってもよい。そのようなバリアントＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されている２つの非同一の抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用されてもよい。本明細書において他に指定されなければ、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付けシステムによるものである。

【0063】

「ノブ－イントゥー－ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般に、方法は、第１のポリペプチドの境界面において隆起（「ノブ」）を、および第２のポリペプチドの境界面において対応する空洞（「ホール」）を導入し、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進しおよびホモ二量体形成を邪魔するように空洞中に配置され得るようにすることを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの境界面からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同一のまたは類似したサイズの代償的な空洞は、大きいアミノ酸側鎖を、より小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることにより第２のポリペプチドの境界面において作り出される。隆起および空洞は、例えば、部位特異的な突然変異誘発により、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより、またはペプチド合成により作られ得る。特有の実施形態において、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにおけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ならびにホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他の１つにおけるアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらなる特有の実施形態において、ノブ改変を含むＦｃドメインのサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを追加的に含み、およびホール改変を含むＦｃドメインのサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを追加的に含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの間のジスルフィドブリッジの形成を結果としてもたらし、そのため二量体をさらに安定化させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0064】

「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在するアレルバリアントの他に、置換、付加、または欠失を生成するが、エフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に減少させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な喪失なしに免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。そのようなバリアントは、活性に対して最小の効果を有するように当技術分野において公知の一般的な規則にしたがって選択され得る（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照）。

【0065】

「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプと共に変動する、抗体のＦｃ領域に帰せられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化を含む。

【0066】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域によるエンゲージメント後に、エフェクター機能を行うように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特定の活性化Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）である。

【0067】

「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するかまたは低減させる抗体である。一部の実施形態において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。例えば、本発明の二特異性抗体は、ＴＮＦ－α－ＮＦ－ｋＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β－Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路を阻害するようにＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βを通じたシグナル伝達を遮断する。

【0068】

本明細書において使用される場合、「特異的結合」は、結合が抗原のために選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用から識別され得ることが意味される。特異的な抗原に結合する抗原結合性分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者が精通している他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器上で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、および伝統的な結合アッセイのいずれかを通じて測定され得る（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））。

【0069】

「親和性」または「結合親和性」という用語は、本明細書において使用される場合、分子（例えば、抗体）の単一の結合性部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総計の強さを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）により一般に表すことができ、ＫＤは、解離および会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。親和性を測定する特定の方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。本明細書において使用される場合、抗体の「高い親和性」という用語は、抗体が標的抗原に対して１０^－９Ｍまたはより低い、よりいっそう特には１０^－１０Ｍまたはより低いＫｄを有することを指す。抗体の「低い親和性」という用語は、抗体が１０^－８Ｍまたはより高いＫｄを有することを指す。「低減した結合」という用語は、本明細書において使用される場合、例えばＳＰＲにより測定された場合の、それぞれの相互作用についての親和性における減少を指す。反対に、「増加した結合」は、それぞれの相互作用についての結合親和性における増加を指す。

【0070】

「ＴＮＦ－αに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二特異性抗体」、「ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βに特異的に結合する二特異性抗体」、「ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βに特異的な二特異性抗原結合性分子」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、抗体が診断および／または治療剤としてＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの標的化において有用であるような十分な親和性でＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βに結合する能力を有する二特異性抗体を指す。

【0071】

「抗ＴＮＦ－α抗体」および「ＴＮＦ－αに結合する抗原結合性部位を含む抗体」という用語は、抗体が診断および／または治療剤としてＴＮＦ－αの標的化において有用であるような十分な親和性でＴＮＦ－α、特に細胞表面上に発現されるＴＮＦ－αポリペプチドに結合する能力を有する抗体を指す。１つの実施形態において、無関連の非ＴＮＦ－αタンパク質に対する抗ＴＮＦ－α抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりまたはバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用して表面プラズモン共鳴アッセイにより、測定された場合に、ＴＮＦ－αに対する抗体の結合の約１０％より低い。ある特定の実施形態において、ヒトＴＮＦ－αに結合する抗原結合性分子は、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍの、ヒトＴＮＦ－αへの結合についての結合親和性のＫＤ値を有する。１つの好ましい実施形態において、結合親和性のそれぞれのＫＤ値は、ＴＮＦ－α結合親和性のためにヒトＴＮＦ－αの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＴＮＦ－α－ＥＣＤ）を使用して表面プラズモン共鳴アッセイにおいて決定される。「抗ＴＮＦ－α抗体」という用語はまた、ＴＮＦ－αおよび第２の抗原に結合する能力を有する二特異性抗体を包含する。

【0072】

「抗ＴＧＦ－β抗体」および「ＴＧＦ－βに結合する抗原結合性部位を含む抗体」という用語は、抗体が診断および／または治療剤としてＴＧＦ－βの標的化において有用であるような十分な親和性で、ＴＧＦ－β、特に細胞表面上に発現されるＴＧＦ－βポリペプチドに結合する能力を有する抗体を指す。１つの実施形態において、無関連の非ＴＧＦ－βタンパク質への抗ＴＧＦ－β抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によりまたはバイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用して表面プラズモン共鳴アッセイにより、測定された場合に、ＴＧＦ－βに対する抗体の結合の約１０％より低い。ある特定の実施形態において、ヒトＴＧＦ－βに結合する抗原結合性分子は、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍの、ヒトＴＧＦ－βへの結合についての結合親和性のＫＤ値を有する。１つの好ましい実施形態において、結合親和性のそれぞれのＫＤ値は、ＴＧＦ－β結合親和性のためにヒトＴＧＦ－βの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＴＧＦ－β－ＥＣＤ）を使用して表面プラズモン共鳴アッセイにおいて決定される。「抗ＴＧＦ－β抗体」という用語はまた、ＴＧＦ－βおよび第２の抗原に結合する能力を有する二特異性抗体を包含する。

【0073】

「融合タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、別々のタンパク質を元々はコードしていた２つ以上の遺伝子を含む融合ポリペプチド分子であって、融合タンパク質の構成要素が、直接的にまたはペプチドリンカーを通じて、ペプチド結合により互いに連結されているものを指す。「融合した」という用語は、本明細書において使用される場合、直接的にまたは１つ以上のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により連結された構成要素を指す。

【0074】

「リンカー」は、共有結合的に、またはイオン、ファンデルワールスもしくは水素結合を通じて、２つの他の分子を接合する分子、例えば、５’末端において１つの相補的配列に、および３’末端において別の相補的配列にハイブリダイズし、そのため２つの非相補的配列を接合する核酸分子を指す。「切断可能なリンカー」は、分解または他に切断されて、切断可能なリンカーにより接続された２つの構成要素を分離させることができるリンカーを指す。切断可能なリンカーは、一般に、酵素、典型的にはペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、およびリパーゼなどにより切断される。切断可能なリンカーはまた、環境上のキュー、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度における変化などにより切断されてもよい。

【0075】

「ペプチドリンカー」という用語は、本明細書において使用される場合、１つ以上のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野において公知であるか、または本明細書に記載されている。好適な、非免疫原性のリンカーペプチドは、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎまたはＧ_４（ＳＧ_４）ｎペプチドリンカーを含む。「ｎ」は一般に１～１０、典型的には２～４の数である。

【0076】

「医薬組成物」は、動物における医薬的な使用のために好適な組成物を指す。医薬組成物は、薬理学的に有効な量の活性剤および医薬的に許容される担体を含む。「薬理学的に有効な量」は、意図される薬理学的な結果を生成するために有効な剤の量を指す。「医薬的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体、媒体、緩衝剤、および賦形剤、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、５％のデキストロースの水性溶液、ならびにエマルション、例えば油／水または水／油エマルション、ならびに様々な種類の湿潤剤および／または佐剤のいずれかを指す。好適な薬学的担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．２００５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎに記載されている。「医薬的に許容される塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む、医薬的な使用のために化合物中に配合され得る塩である。

【0077】

本明細書において使用される場合、「処置」（およびその文法的変形、例えば「処置する」（ｔｒｅａｔ）または「処置する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ））は、処置されている個体における疾患の自然経過を変更する試みでの臨床的介入を指し、予防のためまたは臨床的な病理の経過の間のいずれかで行われ得る。処置の望ましい効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的なまたは間接的な病的な帰結の縮小、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解または一時的緩和、および軽快または改善された予後を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、疾患、障害または状態を「軽減する」ことは、疾患、障害、または状態の症状の重症度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、「処置」への本明細書における言及は、治癒的な、姑息的なおよび予防的な処置への言及を含む。

【0078】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、指定される障害、状態または疾患を処置するため、例えばその症状の１つ以上を寛解させ、緩和し、減少させ、および／または遅延させるために十分な化合物または組成物の量を指す。がんまたは他の望ましくない細胞増殖に関して、有効量は、（ｉ）がん細胞の数を低減させるため；（ｉｉ）腫瘍サイズを低減させるため；（ｉｉｉ）末梢臓器中へのがん細胞浸潤を阻害し、遅延させ、何らかの程度まで緩慢化させ、好ましくは停止させるため；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（すなわち、何らかの程度まで緩慢化させ、好ましくは停止させる）ため；（ｖ）腫瘍成長を阻害するため；（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発を予防するかもしくは遅延させるため；ならびに／または（ｖｉｉ）がんと関連付けられる症状の１つ以上を何らかの程度まで緩和するために十分な量を含む。有効量は１つ以上の投与において投与され得る。

【0079】

「投与する」または「投与されることを引き起こす」という語句は、医療専門家（例えば、医師）、または患者の医療看護を管理する者により為される、患者への問題とする剤／化合物の投与を制御および／または許容する行為を指す。投与されることを引き起こすことは、診断および／もしくは適切な治療レジメンの決定、ならびに／または患者のための特定の剤／化合物の処方を伴うことができる。そのような処方は、例えば、処方箋のフォームを記述すること、および医療記録をアノテートすることなどを含むことができる。投与が本明細書に記載される場合、「投与されることを引き起こすこと」もまた想定される。

【0080】

「患者」、「個体」、および「対象」という用語は、交換可能に使用されて、哺乳動物、好ましくはヒトまたは非ヒト霊長動物を指すことができるが、飼いならされた哺乳動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験室用哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）も指すことができる。様々な実施形態において、患者は、外来、または他の臨床的状況として、病院、精神医学的看護施設において医師または他の医療従事者の看護下にあるヒト（例えば、成人男性、成人女性、思春期男性、思春期女性、男児、女児）であることができる。様々な実施形態において、患者は、原発性免疫不全症、ＡＩＤＳ；がんを有する患者、およびある特定の免疫抑制薬を取っている移植患者；および免疫系に影響する遺伝性疾患（例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠損症）を有する患者を含むが、これらに限定されない免疫不全患者または弱くなった免疫系を有する患者であってもよい。様々な実施形態において、患者は、膀胱がん、肺がん、黒色腫、および突然変異の高い率を有することが報告されている他のがんを含むが、これらに限定されない、免疫原性がんを有する（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４９９（７４５７）：２１４－２１８，２０１３）。

【0081】

「免疫療法」という用語は、特異的な腫瘍抗原に対する枯渇性抗体を使用する処置；抗体－薬物コンジュゲートを使用する処置；共刺激または共阻害分子（免疫チェックポイント）、例えばＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＳＩＲＰ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、シグレック８、シグレック９、シグレック１５、ＴＩＧＩＴおよびＶＩＳＴＡに対するアゴニスト、アンタゴニスト、または遮断抗体を使用する処置；二特異性Ｔ細胞エンゲージング抗体（ＢｉＴＥ（登録商標））、例えばブリナツモマブを使用する処置：生物学的応答改変剤、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βおよびＩＦＮ－γの投与を伴う処置；治療ワクチン、例えばシプリューセル－Ｔを使用する処置；カルメット－ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を使用する処置；樹状細胞ワクチン、または腫瘍抗原ペプチドワクチンを使用する処置；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を使用する処置；ＣＡＲ－ＮＫ細胞を使用する処置；腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用する処置；養子移入された抗腫瘍Ｔ細胞（エクスビボ拡大増殖および／またはＴＣＲトランスジェニック）を使用する処置；ＴＡＬＬ－１０４細胞を使用する処置；ならびに免疫賦活剤、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストＣｐＧおよびイミキモドを使用する処置を含むが、これらに限定されないがん処置を指す。

【0082】

「抵抗性または難治性がん」は、例えば、化学療法、手術、放射線療法、幹細胞移植、および免疫療法を含む以前の抗がん療法に応答しない腫瘍細胞またはがんを指す。腫瘍細胞は、処置の始めにおいて抵抗性もしくは難治性であることができるか、または処置の間に抵抗性もしくは難治性となってもよい。難治性腫瘍細胞は、処置の開始時に応答しないか、または最初に短い期間にわたり応答するが、処置に応答しない腫瘍を含む。難治性腫瘍細胞はまた、抗がん療法での処置に応答するが、その後のラウンドの療法に応答しない腫瘍を含む。本発明の目的のために、難治性腫瘍細胞はまた、抗がん療法での処置により阻害されるようであるが、処置が中止された５年後までに、場合により１０年後までにまたはより長期の後に再発する腫瘍を包含する。抗がん療法は、単独での化学療法剤、単独での放射線、単独での標的化療法、単独での免疫療法、単独での手術、またはこれらの組合せを用いることができる。記載の容易性のために、および限定ではなく、難治性腫瘍細胞は抵抗性腫瘍と交換可能であることが理解される。

【0083】

「ポリマー」という用語は、本明細書において使用される場合、ホモポリマー；コポリマー、例えば、ブロック、グラフト、ランダムおよび交互コポリマーなど；ならびに三元コポリマー；ならびにこれらのブレンド物および改変物を一般に含むが、これらに限定されない。さらには、他に特に限定されなければ、「ポリマー」という用語は、材料のすべての可能な幾何学的構成を含む。これらの構成は、アイソタクチックの、シンジオタクチックの、およびランダムな対称性を含むが、これらに限定されない。

【0084】

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位から構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸、例えばデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）の他に、核酸アナログを含む。核酸アナログは、天然に存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連結に関与するヌクレオチドを含むか、またはホスホジエステル結合以外の連結を通じて取り付けられた塩基を含むものを含む。そのため、ヌクレオチドアナログは、例えばおよび限定なく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）などを含む。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動化されたＤＮＡ合成装置を使用して、合成され得る。「核酸」という用語は典型的には大きいポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」という用語は典型的には短いポリヌクレオチド、一般に約５０個以下のヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列により表される場合（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解される。

【0085】

従来の表記は、ポリヌクレオチド配列を記載するために本明細書において使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’－方向として参照される。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’への付加の方向は転写方向として参照される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」として参照され；そのＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有し、およびＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」として参照され；ＲＮＡと同じ配列を有し、およびコーディングＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’にあるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」として参照される。

【0086】

「相補的な」は、２つのポリヌクレオチドの相互作用性表面のトポロジカルな適合性またはマッチングを指す。そのため、２つの分子は相補的として記載することが可能であり、さらには、接触表面の特徴は互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列に実質的に同一であるか、または第１のポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズできる場合に、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに相補的である。

【0087】

「～に特異的にハイブリダイズする」または「特異的なハイブリダイゼーション」または「～に選択的にハイブリダイズする」は、特定のヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複雑な混合物（例えば、全細胞）中に存在する場合に、核酸分子がストリンジェントな条件下でその配列に優先的に結合、二重化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的部分配列に優先的にハイブリダイズし、および他の配列により低い程度でハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザンおよびノーザンハイブリダイゼーションの文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境上のパラメーターの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する大規模なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹに見出され得る。

【0088】

一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて特有の配列についての熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完璧にマッチしたプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での約１００個より多くの相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％のホルマリンであり、ハイブリダイゼーションは終夜実行される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃、約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣでの洗浄、６５℃、１５分間である。ＳＳＣ緩衝剤の説明のためにＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照。高ストリンジェンシーの洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために低ストリンジェンシーの洗浄により先行され得る。例えば、約１００個より多くのヌクレオチドの、二重鎖のための例示的な中ストリンジェンシーの洗浄は、１×ＳＳＣ、４５℃、１５分間である。例えば、約１００個より多くのヌクレオチドの、二重鎖のための例示的な低ストリンジェンシーの洗浄は、４～６×ＳＳＣ、４０℃、１５分間である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関連のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比よりも２倍の（またはより高い）シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を指し示す。

【0089】

「プライマー」は、指定されるポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズし、および相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供する能力を有するポリヌクレオチドを指す。そのような合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下に置かれた場合に、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、および重合のための剤、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下で起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、多様な合成のおよび天然に存在するプライマーが多くの応用のために有用である。プライマーは、合成の開始のための部位として役立つためにプライマーがハイブリダイズするように設計された鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合において、鋳型へのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、色素生成性、放射性、または蛍光性の部分で標識され、検出可能な部分として使用され得る。

【0090】

「プローブ」は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、別のポリヌクレオチドの指定される配列に特異的にハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドを指す。プローブは、標的となる相補的なポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。そのような場合において、標的へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、色素生成性、放射性、または蛍光性の部分で標識され、検出可能な部分として使用され得る。プローブが相補的なポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供する事例において、プローブはまたプライマーであることができる。

【0091】

「ベクター」は、それに連結された別の核酸を細胞に導入するために使用され得るポリヌクレオチドである。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントがそれにライゲートされ得る直鎖状または環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別の種類のベクターはウイルスベクター（例えば、複製欠陥性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であり、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに導入され得る。ある特定のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞中で自律複製する能力を有する（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入で宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令することができるベクターの種類である。

【0092】

「調節配列」は、それが作動可能に連結された核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響する核酸である。調節配列は、例えば、調節される核酸に対して直接的に、または１つ以上の他の分子（例えば、調節配列および／もしくは核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じてその効果を発揮することができる。調節配列の例は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－０６に記載されている。ヌクレオチド配列は、調節配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響する場合に、調節配列に「作動可能に連結されている」。

【0093】

「宿主細胞」は、本開示のポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌であることができるか、または真核生物、例えば、単細胞の真核生物（例えば、酵母もしくは他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコもしくはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、もしくは昆虫細胞）もしくはハイブリドーマであることができる。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ得る培養される細胞であり、該核酸は次に宿主細胞中で発現され得る。「組換え宿主細胞」という語句は、発現されるべき核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされている宿主細胞を表すために使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、調節配列が該核酸と作動可能に連結されるように宿主細胞に導入されるまで、所望されるレベルで該核酸を発現しない細胞であることができる。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もまた指すことが理解される。ある特定の改変が、例えば、突然変異または環境上の影響に起因して、後続する世代において起こり得るので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でないことがあるが、該子孫は、本明細書において使用される場合の該用語の範囲内に依然として含まれる。

【0094】

「単離された分子」（分子は、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである）という用語は、その起源または由来となる供給源を理由として、（１）そのネイティブな状態においてそれと一緒にある天然に随伴される成分と随伴されていないか、（２）同じ種からの他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種からの細胞により発現されるか、または（４）天然に存在しない分子である。そのため、化学的に合成されたか、または分子が天然に起源とする細胞とは異なる細胞システムにおいて発現された分子は、その天然に随伴される成分から「単離されている」。分子はまた、当技術分野において周知の精製技術を使用して、単離により天然に随伴される成分を実質的に含まないようにされてもよい。分子の純度または均質性は、当技術分野において周知の多数の手段によりアッセイされてもよい。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および当技術分野において周知の技術を使用してポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイされてもよい。ある特定の目的のために、より高い分解能が、ＨＰＬＣまたは精製のための当技術分野において周知の他の手段を使用することにより提供されてもよい。

【0095】

試料の少なくとも約６０％～７５％が単一の種のポリペプチドを呈する場合に、タンパク質またはポリペプチドは、「実質的に純粋」、「実質的に均質」、または「実質的に精製されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は単量体または多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％ Ｗ／Ｗ、より通常は約９５％ Ｗ／Ｗを構成し、好ましくは９９％を上回って純粋である。タンパク質の純度または均質性は、当技術分野において周知の多数の手段、例えばタンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて当技術分野において周知の染色剤を用いてゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化することにより指し示されてもよい。ある特定の目的のために、より高い分解能が、ＨＰＬＣまたは精製のための当技術分野において周知の他の手段を使用することにより提供されてもよい。

【0096】

「標識」または「標識された」という用語は、本明細書において使用される場合、抗体中の別の分子の組込みを指す。１つの実施形態において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組込み、またはマーキングされたアビジン（例えば、光学的なもしくは熱量測定の方法により検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの取付けである。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療剤、例えば、薬物コンジュゲートまたは毒素であることができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例は、以下：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合性部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）、磁気的な剤、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログを含むが、これらに限定されない。様々な実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために様々な長さのスペーサーアームにより取り付けられる。

【0097】

「異種」という用語は、本明細書において使用される場合、ネイティブでも、天然に見出されるものでもない、例えば、既存の天然の組成物または状態を、別の供給源に由来するもので置き換えることにより達成され得る、組成物または状態を指す。同様に、タンパク質が天然に発現される生物以外の生物におけるそのタンパク質の発現は異種発現システムおよび異種タンパク質を構成する。

【0098】

本明細書に記載される開示の態様および実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。

【0099】

本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に方向付けられたバリエーションを含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0100】

本明細書および添付の請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「または」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の指示対象を含む。本明細書に記載される開示の態様およびバリエーションは、「からなる」および／または「から本質的になる」態様およびバリエーションを含むことが理解される。

【0101】

腫瘍壊死因子リガンド
ＴＮＦは、免疫プロセスのために要求される免疫調節性サイトカインである。ＴＮＦの調節されない活性は、炎症性疾患の発症に繋がり得る。細胞中の過剰な量の発現されたＴＮＦは、関節リウマチ、クローン病、乾癬性関節炎、および炎症性腸疾患を含む、免疫疾患の発症と関連付けられる。ＴＮＦの機能は、その２つの受容体、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）およびＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）への結合を要求する。ＴＮＦとＴＮＦＲとの間の相互作用の遮断は、炎症性または自己免疫疾患の処置における療法として成功裏に開発されている。

【0102】

様々な実施形態において、本発明の二機能性アンタゴニストは、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む二機能性分子である。様々な実施形態において、二機能性分子は、配列番号１～５に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ－αリガンドに結合する能力を有する：
ヒトＴＮＦＲ１ ＥＣＤ ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴ（配列番号１）

ヒトＴＮＦＲ２ ＥＣＤ
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号２）

ヒトＴＮＦＲ１／ＣＲＤ１－ＴＮＦＲ２／ＣＲＤ２／３／４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ
（配列番号３）

ヒトＴＮＦＲ１／ＣＲＤ１／２／３－ＴＮＦＲ２／ＣＲＤ４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号４）

ＴＮＦＲ１／ΔＣＲＤ４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣ（配列番号５）

【0103】

様々な実施形態において、二機能性分子は、表２に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ－αリガンドに結合する能力を有する：

【0104】

ＴＧＦ－βリガンド
ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を含む、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）は、細胞表面上の高親和性受容体ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＢの結合および活性化を通じてＳｍａｄ２／３シグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ－βは、免疫機能、細胞増殖および分化、上皮間葉転換、線維化、造血、筋発生、骨リモデリング、がんの進行および転移を含む、広範囲の生物学的活性の調節において不可欠な役割を果たす。上昇したＴＧＦ－βレベルおよび結果的に増加したＳｍａｄ２／３シグナル伝達は、がん、貧血、骨転移、骨減少症、線維症、疼痛、筋肉喪失、インスリン抵抗性、慢性腎臓疾患、肝臓疾患、および心臓血管疾患を含む多くの疾患状態の病理発生および進行に結び付けられている。

【0105】

様々な実施形態において、本発明の二機能性分子は、配列番号６～９に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ－βリガンドに結合する能力を有する：
ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩアイソフォーム１
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ
（配列番号６）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩ－ＥＣＤアイソフォーム１（ＴＧＦ－β ＲＩＩＢ－ＥＣＤ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号７）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩアイソフォーム２
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ（配列番号８）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩ－ＥＣＤアイソフォーム２（ＴＧＦ－β ＲＩＩＡ－ＥＣＤ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９）

【0106】

様々な実施形態において、二機能性分子は、表３に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＴＧＦ－βリガンドに結合する能力を有する：

【0107】

ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－β抗体ならびに抗体断片
ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βリガンドおよび／または受容体に結合する新規の抗体を生成する方法は当業者に公知である。例えば、ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するために有効な量の、ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βリガンドを含む免疫原性組成物をマウスに投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、ならびに抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含んでもよい。ハイブリドーマが一旦得られたら、ハイブリドーマは、任意選択的に、ハイブリドーマ由来細胞がＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件において、細胞培養において繁殖させることができる。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製されてもよい。抗原／抗体相互作用を試験して特に望ましい抗体を同定するために様々な異なる技術が次に利用可能である。

【0108】

必要な特異性の抗体を製造または単離する他の好適な方法が使用可能であり、これは、例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択するか、またはヒト抗体の完全なレパートリーを産生する能力を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化に依拠する方法を含む。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），９０：２５５１－２５５５，１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８，１９９３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５４５，８０６号；およびＳｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５４５，８０７号を参照。

【0109】

抗体は多数の仕方で操作され得る。抗体は、単鎖抗体（小モジュラー免疫医薬品またはＳＭＩＰｓ（商標）を含む）、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片などとして作られ得る。抗体は、ヒト化、キメラ化、脱免疫化、または完全ヒト抗体であることができる。多数の刊行物は、多くの種類の抗体およびそのような抗体を操作する方法を記載している。例えば、米国特許第６，３５５，２４５号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第６，４０７，２１３号；同第６，５４８，６４０号；同第５，５６５，３３２号；同第５，２２５，５３９号；同第６，１０３，８８９号；および同第５，２６０，２０３号を参照。

【0110】

キメラ抗体は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により製造され得る。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子は、マウスＦｃをコードする領域を除去するために制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等の部分で置換される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ、ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１－１０４３，１９８８；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４：３４３９－３４４３，１９８７；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：３５２１－３５２６，１９８７；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４：２１４－２１８，１９８７；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，４７：９９９－１００５，１９８７；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４４６－４４９，１９８５；およびＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＮａｔｌＣａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：１５５３－１５５９，１９８８を参照）。

【0111】

抗体をヒト化する方法は当技術分野において記載されている。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲに加えて、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６，１９８８）の方法にしたがって、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより本質的に行われ得る。よって、そのような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変領域よりも実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際上、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変領域残基および場合により一部のフレームワーク領域残基が齧歯動物抗体における類似の部位からの残基により置換されたヒト抗体である。

【0112】

Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌの米国特許第５，６９３，７６１号は、抗体をヒト化するためのＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．における精密化を開示しており、これは、立体的なまたは他の化学的な不適合のために、マウス抗体において見出される結合を可能とするコンホメーションへのＣＤＲのフォールディングに干渉する、ヒト化されたフレームワークにおける構造モチーフにおける問題にアビディティ喪失を帰せる前提に基づく。この問題に対処するために、Ｑｕｅｅｎは、ヒト化されるべきマウス抗体のフレームワーク配列に密接に相同的な直鎖状ペプチド配列中のヒトフレームワーク配列を使用することを教示している。よって、Ｑｕｅｅｎの方法は、種の間でフレームワーク配列を比較することに焦点を当てている。典型的には、すべての利用可能なヒト可変領域配列が特定のマウス配列と比較され、対応するフレームワーク残基の間の同一性パーセンテージが算出される。ヒト化プロジェクトのためのフレームワーク配列を提供するために、最も高いパーセンテージを有するヒト可変領域が選択される。Ｑｕｅｅｎはまた、ヒト化されたフレームワークにおいて、結合を可能とするコンホメーションにおけるＣＤＲをサポートするために不可欠なマウスフレームワークからのある特定のアミノ酸残基を保持することが重要であることを教示している。潜在的な不可欠性は分子モデルから評価される。保持のための候補残基は、典型的には、直鎖状配列においてＣＤＲに隣接するか、または物理的に任意のＣＤＲ残基の６Å以内にあるものである。

【0113】

「フレームワークシャッフリング」として参照される、抗体をヒト化する別の方法は、個々のヒト生殖系列フレームワークのプールにインフレームで融合された非ヒトＣＤＲ可変領域を有するコンビナトリアルライブラリーを生成することに依拠する（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：４３，２００５）。ライブラリーは次に、良好な結合を保持するヒト化抗体をコードするクローンを同定するためにスクリーニングされる。

【0114】

完全ヒト抗体を作る方法は当技術分野において記載されている。例として、抗ＴＮＦ－α抗体またはその抗原結合性断片を製造する方法は、ファージ上のヒト抗体のライブラリーを合成するステップ、ＴＮＦ－αポリペプチドまたはその抗体結合性部分を用いてライブラリーをスクリーニングするステップ、ＴＮＦ－αポリペプチドに結合するファージを単離するステップ、およびファージから抗体を得るステップを含む。別の例として、ファージディスプレイ技術における使用のための抗体のライブラリーを調製する１つの方法は、ＴＮＦ－αポリペプチドまたはその抗原性部分を用いてヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒト動物を免疫化して免疫応答を生じさせるステップ、免疫化された動物から抗体産生細胞を抽出するステップ；抽出された細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを単離するステップ、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを製造するステップ、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ、およびｃＤＮＡをファージディスプレイベクターに挿入して、抗体をファージ上に発現させるステップを含む。本発明の組換え抗ＴＮＦ－α抗体は、この仕方で得られてもよい。

【0115】

本発明の組換えヒト抗ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－β抗体はまた、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。好ましくは、ライブラリーは、Ｂ細胞から単離されるｍＲＮＡから調製されるヒトＶ_ＬおよびＶ_Ｈ ｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製およびスクリーニングする方法は当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットは商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７－９４００－０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標） ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおいて使用され得る他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／２０７９１号、国際公開第９２／１５６７９号、国際公開第９３／０１２８８号、国際公開第９２／０１０４７号、国際公開第９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７０－１３７２（１９９１）；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３：８１－８５，１９９２；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５－１２８１，１９８９；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４，１９９０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：７２５－７３４，１９９３；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６，１９９２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８，１９９１；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８９：３５７６－３５８０，１９９２；Ｇａｒｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３７３－１３７７，１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：４１３３－４１３７，１９９１；およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），８８：７９７８－７９８２，１９９１を参照；すべては参照により本明細書に組み込まれる）。

【0116】

ヒト抗体はまた、ヒトＩｇＥ抗原を用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖座位の一部または全部をそのゲノム内に含む非ヒトトランスジェニック動物、例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．／Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．－－Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）を免疫化することにより製造される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖座位の大きい断片を含み、ならびにマウス抗体産生が欠損した操作されたマウス系統である。例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３－２１，１９９４ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，９８５，６１５号、同第５，９９８，２０９号、同第６，０７５，１８１号、同第６，０９１，００１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１３０，３６４号、同第６，１６２，９６３号および同第６，１５０，５８４号を参照。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的なヒト抗体を生成する。一部の実施形態において、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）中のメガ塩基サイズの、ヒト重鎖座位およびカッパ軽鎖座位の生殖系列構成断片の導入を通じてヒト抗体Ｖ遺伝子レパートリーの約８０％を含有する。他の実施形態において、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒトラムダ軽鎖座位のおおよそすべてをさらに含有する。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６－１５６，１９９７；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：４８３－４９５，１９９８；および国際公開第９８／２４８９３号を参照。１つの態様において、本発明は、ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－βポリペプチドを用いてヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することにより非ヒト、非マウス動物から抗ＴＮＦ－αおよび／またはＴＧＦ－β抗体を製造する方法を提供する。上記において参照される文献に記載される方法を使用してそのような動物を製造することができる。

【0117】

抗ＴＮＦ－α抗体
ＦＤＡ承認済みの抗ＴＮＦ－α抗体、アダリムマブ（Ａｂｂｖｉｅ ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）；ＤｒｕｇＢａｎｋ ＤＢ０００５１）は、ヒトを処置するために使用されている。本発明の様々な実施形態において、抗ＴＮＦ－α抗体は、配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＶＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）
配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１１）
または配列番号１０に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１１に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片；
配列番号１２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
配列番号１３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）
または配列番号１２に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１３に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片である。

【0118】

様々な実施形態において、本発明は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方；重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む、抗体であって；重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域が、配列番号１０、１１、１３、または１３に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み；抗体がヒトＴＮＦ－αに特異的に結合する、抗体を提供する。

【0119】

ＦＤＡ承認済みの抗ＴＮＦ－α抗体、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）；ＤｒｕｇＢａｎｋ ＤＢ０００６５）は、ヒトを処置するために使用されている。本発明の様々な実施形態において、抗ＴＮＦ－α抗体は、配列番号１４に記載される重鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫＬＳＣＶＡＳＧＦＩＦＳＮＨＷＭＮＷＶＲＱＳＰＥＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＳＩＮＳＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＡＶＹＬＱＭＴＤＬＲＴＥＤＴＧＶＹＹＣＳＲＮＹＹＧＳＴＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１４）
配列番号１５に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＦＶＧＳＳＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＴＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＨＳＷＰＦＴＦＧＳＧＴＮＬＥＶＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１５）
または配列番号１４に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１５に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片；
配列番号１６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫＬＳＣＶＡＳＧＦＩＦＳＮＨＷＭＮＷＶＲＱＳＰＥＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＳＩＮＳＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＡＶＹＬＱＭＴＤＬＲＴＥＤＴＧＶＹＹＣＳＲＮＹＹＧＳＴＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列番号１６）
配列番号１７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＦＶＧＳＳＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＴＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＨＳＷＰＦＴＦＧＳＧＴＮＬＥＶＫ（配列番号１７）
または配列番号１６に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片である。

【0120】

様々な実施形態において、本発明は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方；重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む、抗体であって；重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域が、配列番号１４、１５、１６、または１７に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み；抗体がヒトＴＮＦ－αに特異的に結合する、抗体を提供する。

【0121】

ＦＤＡ承認済みの抗ＴＮＦ－α抗体、セルトリズマブ－ペゴル（ＵＣＢ ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）；ＤｒｕｇＢａｎｋ ＤＢ０８９０４）は、ヒトを処置するために使用されている。本発明の様々な実施形態において、抗ＴＮＦ－α抗体は、配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号１８）
配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
または配列番号１８に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号１９に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片；
配列番号２０に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号２０）
配列番号２１に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２１）
または配列番号２０に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２１に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片である。

【0122】

様々な実施形態において、本発明は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方；重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む、抗体であって；重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域が、配列番号１８、１９、２０、または２１に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み；抗体がヒトＴＮＦ－αに特異的に結合する、抗体を提供する。

【0123】

ＦＤＡ承認済みの抗ＴＮＦ－α抗体、ゴリムマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）；ＤｒｕｇＢａｎｋ ＤＢ０６６７４）は、ヒトを処置するために使用されている。本発明の様々な実施形態において、抗ＴＮＦ－α抗体は、配列番号２２に記載される重鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２２）
配列番号２３に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）
または配列番号２２に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号２３に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片；
配列番号２４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２４）
配列番号２５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号２５）
または配列番号２４に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２５に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片である。

【0124】

様々な実施形態において、本発明は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方；重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む、抗体であって；重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域が、配列番号２２、２３、２４、または２５に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含み；抗体がヒトＴＮＦ－αに特異的に結合する、抗体を提供する。

【0125】

抗ＴＧＦ－β抗体
本発明の様々な実施形態において、抗ＴＧＦ－β抗体は、配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２６）
配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７）
または配列番号２６に記載される重鎖アミノ酸配列および配列番号２７に記載される軽鎖アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片；
配列番号２８に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号２８）
配列番号２９に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片：
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号２９）
または配列番号２８に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２９に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むヒト抗体もしくは抗原結合性断片
である抗ＴＧＦ－β抗体である。

【0126】

様々な実施形態において、本発明は、重鎖、軽鎖、または重鎖および軽鎖の両方；重鎖可変領域、軽鎖可変領域、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む、抗体であって；重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域が、配列番号２６、２７、２８および２９に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む；抗体がヒトＴＧＦ－βに特異的に結合する、抗体を提供する。

【0127】

リンカー
様々な実施形態において、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子は、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子にリンカーおよび／またはヒンジリンカーペプチドにより取り付けられる。リンカーまたはヒンジリンカーは、二次構造を相対的に含まないか、またはα－ヘリックスコンホメーションを示す５、１０、１５、２０、３０、４０またはより多く個数の間のアミノ酸の人工的な配列であってもよい。

【0128】

ペプチドリンカーは、タンパク質ドメインの間の共有結合性連結ならびに追加の構造的および／または空間的柔軟性を提供する。当技術分野において公知のように、ペプチドリンカーは、柔軟なアミノ酸残基、例えばグリシンおよびセリンを含有する。様々な実施形態において、ペプチドリンカーは１～１００個のアミノ酸を含んでもよい。様々な実施形態において、スペーサーはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）のモチーフを含有することができる。他の実施形態において、リンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号５４）ｎのモチーフを含有することができ、ｎは１～１０の整数である。他の実施形態において、リンカーはまた、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含有することができる。別の実施形態において、リンカーは、α－ヘリックスコンホメーションの配列、例えばＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４９）を含むがこれに限定されない、他のタンパク質モチーフを含有することができる。様々な実施形態において、リンカーの長さおよび組成は、活性、または、発現レベルおよび凝集傾向を含むがこれらに限定されない、開発可能性を最適化するためにチューニングされ得る。別の実施形態において、ペプチドリンカーは、単純な化学結合、例えば、アミド結合（例えば、ＰＥＧの化学的コンジュゲーションによるもの）であることができる。

【0129】

例示的なペプチドリンカーは表４に提供される：

【0130】

二機能性アンタゴニスト分子
本発明は、ＴＮＦ－αシグナル伝達およびＴＧＦ－βシグナル伝達を強力な方式において同時に中和するために特異的に設計されており、ならびにＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する第１の抗原結合性分子およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する第２の抗原結合性分子を含む、新規のポリペプチドベースの二機能性アンタゴニスト分子を提供する。様々な実施形態において、二機能性分子は、ＴＮＦ－αに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片、およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片を含む。重要なことに、これらの二機能性アンタゴニストはまた、有利な特性、例えば生産可能性、安定性、結合親和性、生物学的活性、ある特定の細胞の特異的な標的化、標的化効率および低減した毒性を提供する。

【0131】

例示的な二機能性アンタゴニスト分子
様々な実施形態において、本発明の二機能性アンタゴニスト分子は、表５に記載されている設計されたおよび融合パートナーを含む分子の群から選択される：

【0132】

様々な実施形態において、本発明の二機能性アンタゴニスト分子は、表６に記載されている分子の群から選択される：

【0133】

ポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、本開示の二機能性アンタゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。対象核酸は一本鎖または二本鎖であってもよい。そのような核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびこれらの組合せを含む。二機能性アンタゴニスト分子をコードするゲノムＤＮＡは、多数の種のために入手可能なゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、オーバーラップするオリゴヌクレオチド断片の化学合成、続いてコーディング領域の部分または全体および隣接配列を再構成するための断片のアセンブリーにより入手可能である。ＲＮＡは、ｍＲＮＡの高レベルの合成を指令する原核発現ベクター、例えばＴ７プロモーターを使用するベクターおよびＲＮＡポリメラーゼから得られ得る。ｃＤＮＡは、二機能性アンタゴニスト分子を発現する様々な組織から単離されるｍＲＮＡから調製されるライブラリーから得られる。本開示のＤＮＡ分子は、全長遺伝子の他に、そのポリヌクレオチドおよび断片を含む。全長遺伝子はまた、Ｎ末端シグナル配列をコードする配列を含んでもよい。

【0134】

様々な実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含み、および本明細書に記載される少なくとも１つの異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるリンカーまたはヒンジリンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0135】

様々な実施形態において、本開示の組換え核酸は、発現構築物中で１つ以上の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結されていてもよい。調節配列は当技術分野において認識されており、二機能性アンタゴニスト分子の発現を指令するために選択される。よって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。典型的には、前記１つ以上の調節性ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含んでもよいが、これらに限定されない。当技術分野において公知のような構成的または誘導性プロモーターは本開示により想定される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１つより多くのプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであってもよい。発現構築物は、エピソーム、例えばプラスミド上で細胞中に存在してもよく、または発現構築物は染色体に挿入されてもよい。様々な実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能とするための選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞と共に変動する。

【0136】

本開示の別の態様において、対象核酸は、二機能性アンタゴニスト分子をコードするヌクレオチド配列を含み、および少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された発現ベクター中で提供される。「発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを指す。宿主細胞中での発現のために好適なベクターは容易に入手可能であり、核酸分子は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用してベクターに挿入される。そのようなベクターは、ＤＮＡ配列に作動可能に連結された場合に、二機能性アンタゴニスト分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得るＤＮＡ配列の発現を制御する多様な発現制御配列を含むことができる。そのような有用な発現制御配列は、例えば、ＳＶ４０の早期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより指令されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のための制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のためのプロモーター、酸ホスファターゼ、例えば、ＰｈｏＳのプロモーター、酵母ａ接合因子のプロモーター、バキュロウイルスシステムのポリヘドロンプロモーターならびに原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにこれらの様々な組合せを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質の種類などの要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、ベクターによりコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーのコピー数および発現を制御する能力もまた考慮されるべきである。

【0137】

本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子、またはその部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方における発現のために好適なベクターにライゲートすることにより製造され得る。組換え二機能性アンタゴニスト分子の製造のための発現媒体はプラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは、原核細胞、例えば大腸菌中での発現のための種類のプラスミド：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドを含む。

【0138】

一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの繁殖を促すための原核性配列、および真核細胞中で発現される１つ以上の真核性転写単位の両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションのために好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を促すために、細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２からの配列で改変されている。代替的に、ウイルス、例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）の誘導体は、真核細胞中でのタンパク質の一過性発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現システムの例は、以下の遺伝子療法送達システムの記載において見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる様々な方法が当技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方のための他の好適な発現システムの他に、一般的な組換え手順について、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９） Ｃｈａｐｔｅｒ １６および１７を参照。一部の事例において、バキュロウイルス発現システムの使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいことがある。そのようなバキュロウイルス発現システムの例は、ｐＶＬ由来ベクター（例えばｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えばｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えばＢ－ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）を含む。

【0139】

様々な実施形態において、ベクターは、ＣＨＯ細胞中での対象となる二機能性アンタゴニスト分子の製造のために設計され、これは例えばＰｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）である。明らかなように、対象遺伝子構築物は、例えば、精製のための、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含む、タンパク質を製造するために、培養において繁殖された細胞中での対象となる二機能性アンタゴニスト分子の発現を引き起こすために使用され得る。

【0140】

よって、本開示は、対象となる二機能性アンタゴニスト分子を製造する方法にさらに関する。例えば、二機能性アンタゴニスト分子をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞は、二機能性アンタゴニスト分子の発現が起こることを可能とするための適切な条件下で培養され得る。二機能性アンタゴニスト分子は、分泌され、細胞と、二機能性アンタゴニスト分子を含有する培地との混合物から単離されてもよい。代替的に、二機能性アンタゴニスト分子は、細胞質にまたは膜画分中に保持され、細胞が採取され、溶解され、タンパク質が単離されてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養のための好適な培地は当技術分野において周知である。

【0141】

本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製技術にしたがって精製され得る。これらの技術は、１つのレベルにおいて、タンパク質性および非タンパク質性画分の粗分別を伴う。他のタンパク質からペプチドやポリペプチドが分離されたら、関心対象のペプチドまたはポリペプチドは、部分的なまたは完全な精製（または均質性までの精製）を達成するためにクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用してさらに精製され得る。「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、該ポリペプチドがその天然に取得可能な状態と比べて任意の程度まで精製されている、他の成分から単離可能な、組成物を指すことが意図される。精製されたポリペプチドはしたがってまた、ポリペプチドが天然に存在し得る環境から自由になった該ポリペプチドを指す。一般に、「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分別に供されており、およびその発現される生物学的活性を実質的に保持するポリペプチド組成物を指す。「実質的に精製された」という用語が使用される場合、この指定は、そのポリペプチドまたはペプチドが組成物の主な成分を形成する、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、または約９０％またはより多くを構成するペプチドまたはポリペプチド組成物を指す。

【0142】

精製における使用のために好適な様々な技術が当業者に周知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、および抗体（免疫沈降）などを用いるかまたは熱変性による沈殿、続いて遠心分離；クロマトグラフィー、例えばアフィニティークロマトグラフィー（プロテイン－Ａカラム）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらの技術の組合せを含む。当技術分野において一般に公知のように、様々な精製ステップを実行する順序が変更され得るか、またはある特定のステップが省略され得るが、依然として実質的に精製されたポリペプチドの調製のための好適な方法を結果としてもたらし得ると考えられる。

【0143】

医薬組成物
別の態様において、本開示は、医薬的に許容される担体と混合された単離された二機能性アンタゴニスト分子を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬的に許容される担体は周知であり、当業者に理解されており、広範に記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照）。医薬的に許容される担体は、例えば、組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を修飾、維持または保存する目的のために含まれてもよい。そのような医薬組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。好適な医薬的に許容される担体は、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）；抗微生物剤；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えばホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、他の有機酸）；充填剤（例えばマンニトールもしくはグリシン）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；複合体化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）；充填剤；単糖；二糖および他の炭水化物（例えばグルコース、マンノース、もしくはデキストリン）；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色剤；香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素）；溶媒（例えばグリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えばマンニトールもしくはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えばプルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トライトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増強剤（スクロースもしくはソルビトール）；張度増強剤（例えばアルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトール ソルビトール）；送達媒体；希釈剤；賦形剤ならびに／または医薬的佐剤を含むが、これらに限定されない。

【0144】

医薬組成物中の主要な媒体または担体は、水性または非水性のいずれかの性質であってもよい。例えば、好適な媒体または担体は、注射用の水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であってもよく、これらは場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を補充されていてもよい。中性緩衝化食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水はさらなる例示的な媒体である。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたはその好適な代用物をさらに含んでもよい。本開示の１つの実施形態において、組成物は、凍結乾燥されたケーキまたは水性溶液の形態において所望される程度の純度を有する選択された組成物を任意選択的な製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上掲）と混合することにより貯蔵のために調製されてもよい。さらに、治療用組成物は、適切な賦形剤、例えばスクロースを使用して凍結乾燥物として製剤化されてもよい。最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与の経路、送達フォーマット、および所望される投薬量に依存して、当業者により決定される。

【0145】

非経口投与が想定される場合、治療用医薬組成物は、医薬的に許容される媒体中に所望される二機能性アンタゴニスト分子を含む、パイロジェン非含有の、非経口的に許容される水性溶液の形態であってもよい。非経口注射のための特に好適な媒体は無菌蒸留水であり、無菌蒸留水中にポリペプチドは、適正に保存される無菌の等張溶液として製剤化される。様々な実施形態において、注射可能な投与のために好適な薬学的製剤は、水性溶液中に、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理緩衝食塩水中に製剤化されてもよい。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。追加的に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液として調製されてもよい。任意選択的に、懸濁液はまた、好適な安定化剤または化合物の溶解性を増加させるための剤を含有してもよく、高度に濃縮された溶液の調製を可能とし得る。

【0146】

様々な実施形態において、治療用医薬組成物は、コロイド分散システムを使用して標的化された送達のために製剤化されてもよい。コロイド分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。リポソーム製造において有用な脂質の例は、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドを含む。実例的なリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。リポソームの標的化はまた、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づいて可能であり、これは当技術分野において公知である。

【0147】

様々な実施形態において、医薬組成物の経口投与が想定される。この様式において投与される医薬組成物は、固体投薬形態、例えば錠剤およびカプセルの調合において慣習的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化され得る。経口投与用の固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、および顆粒など）において、本開示の１つ以上の治療用化合物は、１つ以上の医薬的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、ならびに／または以下：（１）充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／もしくはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／もしくはアカシアなど；（３）湿潤剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えばアガー－アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレイ；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤のいずれかと混合されてもよい。カプセル、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物はまた緩衝化剤を含んでもよい。類似した種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤の他に、高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。経口投与用の液体投薬形態は、医薬的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルを含む。活性成分に加えて、液体投薬形態は、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールならびにソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、佐剤、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤を含むことができる。

【0148】

様々な実施形態において、皮膚または粘膜のいずれかへの医薬組成物の外用投与が想定される。外用製剤は、皮膚または角質層透過増強剤として有効であることが公知の多様な剤の１つ以上をさらに含んでもよい。これらの例は、２－ピロリドン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。製剤を美容的に許容されるものとするために追加の剤がさらに含まれてもよい。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、芳香剤、防腐剤、安定化剤、および表面活性剤である。角質溶解剤、例えば当業者に公知のものもまた含まれ得る。例はサリチル酸および硫黄である。外用または経皮投与用の投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤を含む。活性化合物は、医薬的に許容される担体と、および要求され得る任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と無菌条件下で混合されてもよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本開示の対象化合物（例えば、二機能性アンタゴニスト分子）に加えて、賦形剤、例えば動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有してもよい。

【0149】

本明細書において使用のために想定される追加の医薬組成物は、持続または制御送達製剤中にポリペプチドを伴う製剤を含む。様々な他の持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。

【0150】

治療的に用いられる医薬組成物の有効量は、例えば、治療的な文脈および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルはそのため、送達される分子、ポリペプチドが使用されている適応症、投与の経路、ならびに患者のサイズ（体重、身体表面または臓器サイズ）ならびに条件（年齢および全般的健康状態）に部分的に依存して変動することを理解する。よって、臨床医は、最適な治療効果を得るために投薬量を滴定し、および投与の経路を改変することができる。典型的な投薬量は、上記される要因に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内またはより多くであってもよい。ポリペプチド組成物は、好ましくは、静脈内に注射または投与されてもよい。長期作用性の医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に依存して３～４日毎、毎週、または隔週で投与されてもよい。投薬の頻度は、使用される製剤中のポリペプチドの薬物動態パラメーターに依存する。典型的には、組成物は、所望される効果を達成する投薬量に達するまで投与される。組成物は、したがって、単回用量として、または（同じもしくは異なる濃度／投薬量の）複数回用量として経時的に、または連続注入として投与されてもよい。適切な投薬量のさらなる精密化は通常通りに為される。適切な投薬量は、適切な用量－応答データの使用を通じて確認されてもよい。

【0151】

医薬組成物の投与の経路は公知の方法に従い、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、もしくは腹腔内への注射を通じて；他に鼻腔内、腸内、外用、舌下、尿道、経膣、もしくは直腸手段で、持続放出システムにより、または埋め込みデバイスにより為される。所望される場合、組成物は、ボーラス注射によりまたは注入により連続的に、または埋め込みデバイスにより投与されてもよい。代替的に、または追加的に、組成物は、所望される分子が吸収または被包されている膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを介して局所的に投与されてもよい。埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは任意の好適な組織または臓器に埋め込まれてもよく、所望される分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または連続的な投与を介して為されてもよい。

【0152】

治療的使用
別の態様において、本開示は、その病理発生がＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路およびＴＧＦ－β媒介性Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達経路の活性化を伴う様々な複合疾患状態を処置または予防する方法を提供する。

【0153】

様々な実施形態において、本発明の新規の二機能性アンタゴニスト分子は、対象において、以下の状態：貧血、炎症、肺高血圧症、心不全、腎不全、筋ジストロフィー、関節炎、臓器線維症およびがんを含むが、これらに限定されない、様々な障害の処置のための広い応用を有してもよく、該処置は、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含み、そのような投与は、筋肉量の喪失および／または筋肉機能の喪失を減弱する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、単剤療法または免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、および抗ＣＴＬ４抗体と組み合わせた併用療法としての、血液障害（例えば無効赤血球生成、汎血球減少症、骨髄異形成症候群、骨髄不全、白血病、ベータ－サラセミア、および鎌状赤血球疾患）、線維性疾患（例えば非アルコール性脂肪性肝炎またはＮＡＳＨ、硬変、肺線維症、腎臓線維症、多発性嚢胞腎疾患、心臓線維症、筋肉線維症、骨髄線維症、皮膚線維症、および目の線維症）、筋ジストロフィー（例えばＤＭＤ、ベッカー型ＭＤ、肢帯型筋ジストロフィー、筋緊張性ＭＤおよびＦＳＨＤ）、筋炎（例えば多発性筋炎および皮膚筋炎）、ミオパチー（遺伝性ミオパチーおよび後天性ミオパチーを含む）、運動ニューロン疾患（例えばルー－ゲーリッグ病またはＡＬＳ）、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病）、がん悪液質、サルコペニア、骨脆弱性障害（例えば骨折およびがんにおける転移）、慢性心不全、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染症（例えばＡＩＤＳ、結核、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、および敗血症）の結果としてもたらされるサイトカインストーム、関節リウマチ（ＲＡ）および変形性関節症（ＯＡ）を含む関節炎、外傷（例えば熱傷またはオートバイ事故）、ＩＣＵ救命治療、除神経（例えば卒中または脊髄傷害）、長期化した床上安静、サルコペニック肥満症、ならびに年齢関連筋肉および骨減少（閉経後骨粗しょう症および年齢関連サルコペニアを含む）、臓器または組織移植（例えば心臓移植、腎臓移植および肝臓移植）、ならびに様々な悪性腫瘍（例えば白血病、黒色腫、乳がん、多発性骨髄腫、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、脳のがん、膀胱がん、および頭頸部がん）を含むが、これらに限定されない、様々な複合疾患の処置において有用である。

【0154】

本開示は、対象において心臓血管疾患を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含み、そのような投与が、血管系、ならびに、平滑筋、心筋および骨格筋を含む、筋肉の炎症および線維症を減弱する、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、心不全、肺動脈高血圧症を含む肺高血圧症、心筋炎、冠動脈疾患、心筋梗塞、心臓不整脈、心臓弁疾患、心筋症、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群および心臓萎縮症の処置において有用である。

【0155】

本開示は、有効量の二機能性アンタゴニスト分子を対象に投与することを含む、対象において心臓機能障害または心不全を処置する方法を提供する。モジュレーションは、前記対象の心臓機能を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％改善してもよい。心臓機能の改善は、１）排出される血液体積および排出の効率に焦点を当てた心臓ポンプ機能ならびに２）心筋収縮の強さに焦点を当てた心筋機能を測定するための心臓超音波検査法により評価され得る。

【0156】

本開示は、対象において代謝障害を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、肥満症、脂質異常症、糖尿病、インスリン抵抗性、サルコペニック肥満症、脂肪症、およびメタボリックシンドロームから選択される代謝性疾患の他に、糖尿病性ミオパチー、腎症、ニューロパチー、網膜症、骨減少症、耐糖能障害、高血糖症、およびアンドロゲン枯渇の処置において有用である。

【0157】

本開示は、対象においてがん細胞を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含み、そのような投与ががん細胞の成長および／または増殖を阻害する、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、がんとして特徴付けられる障害の処置において有用である。そのような障害は、固形腫瘍、例えば乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、目、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺のがんおよびそれらの遠隔転移、リンパ腫、肉腫、多発性骨髄腫ならびに白血病を含むが、これらに限定されない。乳がんの例は、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性腺管癌、および非浸潤性小葉癌を含むが、これらに限定されない。気道のがんの例は、小細胞および非小細胞肺癌の他に、気管支腺腫および肺胸膜芽細胞腫を含むが、これらに限定されない。脳のがんの例は、脳幹および視床下部（ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）神経膠腫、小脳および大脳星細胞腫、髄芽腫、上衣腫の他に、神経外胚葉および松果体腫瘍を含むが、これらに限定されない。男性生殖器の腫瘍は、前立腺および精巣がんを含むが、これらに限定されない。女性生殖器の腫瘍は、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、および外陰がんの他に、子宮の肉腫を含むが、これらに限定されない。消化管の腫瘍は、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸、および唾液腺がんを含むが、これらに限定されない。尿路の腫瘍は、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、および尿道がんを含むが、これらに限定されない。眼がんは、眼内黒色腫および網膜芽腫を含むが、これらに限定されない。肝臓がんの例は、肝細胞癌（線維層板状バリアントを伴うまたは伴わない肝細胞癌）、胆管癌（肝臓内胆管癌）、および混合型肝細胞胆管癌を含むが、これらに限定されない。皮膚がんは、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚がん、および非黒色腫皮膚がんを含むが、これらに限定されない。頭頸部がんは、鼻咽頭がん、および口唇がんを含むが、これらに限定されない。リンパ腫は、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病、および中枢神経系のリンパ腫を含むが、これらに限定されない。肉腫は、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性繊維性組織球腫、リンパ肉腫、および横紋筋肉腫を含むが、これらに限定されない。白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および有毛細胞白血病を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、がんは、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの高い発現を伴うがん、例えば、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸直腸がん、黒色腫、白血病、肺がん、前立腺がん、脳のがん、膀胱がん、および頭頸部がんである。

【0158】

本開示は、対象において慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含み、そのような投与が、腎臓機能の喪失を減弱し、および筋肉喪失を予防し、または腎臓線維症を阻害する、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、腎不全、間質性線維症、および腎臓透析を含むＣＫＤの他に、ＣＫＤと関連付けられるタンパク質エネルギー消耗（ＰＥＷ）の処置において有用である。モジュレーションは、前記対象のＣＫＤまたはＰＥＷを少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％改善してもよい。腎臓機能の改善は、尿中のタンパク質／クレアチニン比（ＰＣＲ）および糸球体濾過量（ＧＦＲ）を測定することにより評価され得る。ＰＥＷの改善は、アルブミンおよび炎症性サイトカインの血清レベル、タンパク質合成および分解の速度、体重、筋肉量、身体活動性ならびに栄養的アウトカムを測定することにより評価され得る。

【0159】

本開示は、対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、多発性硬化症、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、重症筋無力症、乾癬、全身性硬化症および全身性ループスエリテマトーデス、多発性筋炎ならびに原発性胆汁性肝硬変から選択される自己免疫障害の処置において有用である。

【0160】

本開示は、対象において関節炎を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、関節リウマチおよび変形性関節症から選択される関節炎の処置において有用である。

【0161】

本開示は、対象において食欲不振を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、神経性食欲不振および食欲不振－悪液質症候群から選択される食欲不振の処置において有用である。

【0162】

本開示は、対象において肝臓疾患を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪肝疾患、肝硬変、肝不全、自己免疫性肝炎および肝細胞癌から選択される肝臓疾患の処置において有用である。

【0163】

本開示は、対象において臓器または組織移植を行う方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。特に、本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸および胸腺の臓器移植または骨、腱、角膜、皮膚、心臓弁、神経および静脈の組織移植から選択される移植の処置において有用である。

【0164】

本開示は、対象において貧血を処置する方法であって、前記対象に治療有効量（単剤療法または併用療法レジメンのいずれかとして）の、医薬的に許容される担体中の本開示の二機能性アンタゴニスト分子を投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態において、貧血は、がん関連貧血、化学療法誘導性貧血、慢性腎臓疾患関連貧血、鉄欠乏貧血、サラセミア、鉄およびヘモクロマトーシス（ｉｒｏｎ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、鎌状赤血球疾患、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、汎血球減少症ならびに骨髄不全を含む様々な貧血障害から選択される。

【0165】

本開示は、対象において線維症を処置する方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、線維症は、肺線維症（例えば特発性肺線維症および嚢胞性線維症）、肝臓線維症（例えば非アルコール性脂肪性肝炎および肝硬変）、気道線維症（例えば喘息）、心臓線維症（例えば心筋梗塞、拡張期機能障害または心臓弁疾患）、腎臓線維症（例えば間質性線維症）、骨髄線維症、特発性後腹膜線維症、腎原性線維性皮膚障害、炎症性腸疾患における腸線維症（クローン病を誘導する）、ケロイド、強皮症、全身性硬化症、手の線維症（例えば、デュピュイトラン秒）、目の線維症ならびに関節線維症から選択される。

【0166】

本開示は、対象において疼痛を処置する方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、またはがん疼痛から選択される。

【0167】

本開示は、対象において骨疾患を処置する方法であって、治療有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、対象はヒト対象である。様々な実施形態において、骨疾患は、骨軟化症、骨粗しょう症、骨形成不全症、進行性骨化性線維異形成症、コルチコステロイド誘導性骨減少症、骨折、および骨転移から選択される。

【0168】

本開示は、対象において筋肉量および／または筋肉機能の喪失を阻害する方法であって、有効量の二機能性アンタゴニスト分子を対象に投与することを含む、方法を提供する。モジュレーションは、前記対象の筋肉量および／または機能の喪失を少なくとも５％、１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％減弱してもよい。筋肉量および機能の喪失の阻害は、イメージング技術および身体強度検査を使用することにより評価され得る。筋肉量評価のためのイメージング技術の例は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、およびコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を含む。筋肉機能検査の例は、握力検査、階段昇降検査、簡易身体測定バッテリー（ｓｈｏｒｔ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｂａｔｔｅｒｙ；ＳＰＰＢ）および６分歩行の他に、呼吸筋強度を測定するために使用される最大吸気圧（ＭＩＰ）および最大呼気圧（ＭＥＰ）を含む。

【0169】

「治療有効量」または「治療有効用量」は、処置されている障害の症状の１つ以上を何らかの程度まで緩和する投与されている治療剤の量を指す。

【0170】

治療有効用量は、ＩＣ_５０を決定することにより最初に細胞培養アッセイから概算され得る。用量は次に、細胞培養において決定されたようなＩＣ_５０を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定式化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿におけるレベルは、例えば、ＨＰＬＣにより、測定されてもよい。正確な組成物、投与の経路および投薬量は、対象の条件を考慮して個々の医師により選択され得る。

【0171】

投薬量レジメンは、最適な所望される応答（例えば、治療的なまたは予防的な応答）を提供するために調整され得る。例えば、単一のボーラスが投与可能であり、いくつかの分割された用量（複数または反復または維持）が経時的に投与可能であり、用量は、治療的な状況の緊急性により指し示されるように比例的に低減または増加され得る。投与の容易性および投薬量の均一性のために投薬単位形態において非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投薬単位形態は、本明細書において使用される場合、処置される哺乳動物対象のための単位投薬量として適した物理的に別々の単位であって；各々の単位が、要求される薬学的担体との関連で所望される治療効果を生成するために算出された予め決定された量の活性化合物を含有するものを指す。本開示の投薬単位形態のための仕様は、主に抗体の独特の特徴および達成されるべき特定の治療または予防効果により支配される。

【0172】

そのため、当業者は、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投薬レジメンは、治療分野において周知の方法にしたがって調整されることを理解する。すなわち、最大の許容できる用量は容易に確立可能であり、対象に検出可能な治療的な利益を提供する有効量もまた決定可能であり、対象に検出可能な治療的な利益を提供するために各々の剤を投与するための時間的な要求も同様に決定され得る。よって、ある特定の用量および投与レジメンが本明細書において例示されるが、これらの例は決して、本開示の実施において対象に提供され得る用量および投与レジメンを限定しない。

【0173】

投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度と共に変動してもよく、また単一のまたは複数の用量を含んでもよいことが留意されるべきである。任意の特定の対象のために、特有の投薬量レジメンは、個々の必要性および組成物を投与するかまたはその投与を監督する者の専門的な判断にしたがって経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載される投薬量範囲は例示的なものに過ぎず、クレームされた組成物の範囲または実施を限定することは意図されないことがさらに理解されるべきである。さらに、本開示の組成物を用いる投薬量レジメンは、疾患の種類、対象の年齢、体重、性別、医学的条件、状態の重症度、投与の経路、および用いられる特定の抗体を含む、様々な要因に基づいてもよい。そのため、投薬量レジメンは広く変動し得るが、標準的な方法を使用してルーチンで決定され得る。例えば、用量は、臨床的な効果、例えば毒性効果および／または実験値を含み得る、薬物動態または薬力学パラメーターに基づいて調整されてもよい。そのため、本開示は、当業者により決定されるような対象内の用量漸増を包含する。適切な投薬量およびレジメンの決定は関連技術分野において周知であり、本明細書に開示される教示を一旦提供されれば、当業者によりもたらされることが理解される。

【0174】

治療または予防有効量の本開示の二機能性アンタゴニスト分子のための例示的な、非限定的な１日当たりの投薬範囲は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～９０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～７０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～６０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～４０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１～５ｍｇ／ｋｇ、０．００１～４ｍｇ／ｋｇ、０．００１～３ｍｇ／ｋｇ、０．００１～２ｍｇ／ｋｇ、０．００１～１ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～４ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～３ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～２ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～１ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～４０ｍｇ／ｋｇ、０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～４ｍｇ／ｋｇ、０．１～３ｍｇ／ｋｇ、０．１～２ｍｇ／ｋｇ、０．１～１ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～４０ｍｇ／ｋｇ、１～３０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、１～５ｍｇ／ｋｇ、１～４ｍｇ／ｋｇ、１～３ｍｇ／ｋｇ、１～２ｍｇ／ｋｇ、または１～１ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度と共に変動してもよいことが留意されるべきである。任意の特定の対象のために、特有の投薬量レジメンは、個々の必要性および組成物を投与するかまたはその投与を監督する者の専門的な判断にしたがって経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載される投薬量範囲は例示的なものに過ぎず、クレームされた組成物の範囲または実施を限定することは意図されないことがさらに理解されるべきである。

【0175】

様々な実施形態において、投与される総用量は、例えば、約１～１０００μｇ／ｍｌ、約１～７５０μｇ／ｍｌ、約１～５００μｇ／ｍｌ、約１～２５０μｇ／ｍｌ、約１０～１０００μｇ／ｍｌ、約１０～７５０μｇ／ｍｌ、約１０～５００μｇ／ｍｌ、約１０～２５０μｇ／ｍｌ、約２０～１０００μｇ／ｍｌ、約２０～７５０μｇ／ｍｌ、約２０～５００μｇ／ｍｌ、約２０～２５０μｇ／ｍｌ、約３０～１０００μｇ／ｍｌ、約３０～７５０μｇ／ｍｌ、約３０～５００μｇ／ｍｌ、約３０～２５０μｇ／ｍｌの範囲内の、血漿抗体濃度を達成する。

【0176】

本開示の医薬組成物の毒性および治療指数は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順により決定され得る。毒性用量と治療的な有効用量との間の用量比は治療指数であり、治療指数は比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表され得る。大きい治療指数を呈する組成物は一般に好ましい。

【0177】

二機能性アンタゴニスト分子の医薬組成物の投与の投薬頻度は、療法の性質および処置されている特定の疾患に依存する。対象は、所望される治療結果が達成されるまで、定期的な間隔で、例えば週毎にまたは月毎に処置され得る。例示的な投薬頻度は、休薬なしで週に１回；週に１回で隔週毎；２週毎に１回；３週毎に１回；週毎に休薬なしで２週間、次に月毎；週毎に休薬なしで３週間、次に月毎；月毎；隔月毎に１回；３か月毎に１回；４か月毎に１回；５か月毎に１回；または６か月毎に１回、または年毎を含むが、これらに限定されない。

【0178】

併用療法
本明細書において使用される場合、本開示の二機能性アンタゴニスト分子および１つ以上の他の治療剤に言及する、「併用投与」、「併用投与される」および「～と組み合わせて」という用語は、以下を意味し、および言及し、および含むことが意図される：処置を必要とする対象への本開示の二機能性アンタゴニスト分子および治療剤のそのような組合せの同時の投与であって、そのような成分が、前記対象に実質的に同じ時間において前記成分を放出する単一の投薬形態となるように一緒に製剤化されている場合；処置を必要とする対象への本開示の二機能性アンタゴニスト分子および治療剤のそのような組合せの実質的に同時の投与であって、そのような成分が、前記対象により実質的に同じ時間において摂取される別々の投薬形態となるように互いから離して製剤化されており、前記摂取で前記成分が前記対象に実質的に同じ時間において放出される場合；処置を必要とする対象への本開示の二機能性アンタゴニスト分子および治療剤のそのような組合せの逐次的な投与であって、そのような成分が、各々の投与の間の有意な時間間隔と共に前記対象により連続する時間において摂取される別々の投薬形態となるように互いから離して製剤化されており、前記摂取で前記成分が前記対象に実質的に異なる時間において放出される場合；ならびに処置を必要とする対象への本開示の二機能性アンタゴニスト分子および治療剤のそのような組合せの逐次的な投与であって、そのような成分が、制御された方式において前記成分を放出する単一の投薬形態となるように一緒に製剤化されており、前記放出でそれらは、前記対象に同じおよび／または異なる時間において並行して、連続的に、および／またはオーバーラップして放出され、各々の部分が、同じまたは異なる経路により投与され得る場合。

【0179】

別の態様において、本開示は、対象において筋肉消耗性疾患を処置する方法であって、ａ）治療有効量の本開示の二機能性アンタゴニスト分子；およびｂ）第２の剤の組合せの投与を含む、方法に関する。この併用療法は、第２の剤を単独で使用する処置に対して抵抗性または難治性の筋肉消耗性疾患に対して特に有効であり得る。様々な実施形態において、第２の剤は、成長ホルモン、グレリン、ＩＧＦ１、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ－アルファおよびＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、ＩＬ－１ならびにそれらの受容体に対するアンタゴニスト、ならびにミオスタチンおよびアクチビンＡならびにそれらの受容体に対する他のアンタゴニストから選択される。

【0180】

様々な実施形態において、併用療法は、同じ医薬組成物中または別々の医薬組成物中のいずれかで、二機能性アンタゴニスト分子および第２の剤の組成物を同時に投与することを含む。様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子の組成物および第２の剤の組成物は逐次的に投与され、すなわち、二機能性アンタゴニスト分子の組成物は、第２の剤の組成物の投与の前または後のいずれかにおいて投与される。

【0181】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子の組成物および第２の剤の組成物の投与は同時発生的であり、すなわち、二機能性アンタゴニスト分子の組成物および第２の剤の組成物の投与期間は互いとオーバーラップする。

【0182】

様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子の組成物および第２の剤の組成物の投与は非同時発生的である。例えば、様々な実施形態において、二機能性アンタゴニスト分子の組成物の投与は、第２の剤の組成物が投与される前に終了される。様々な実施形態において、第２の剤の組成物の投与は、二機能性アンタゴニスト分子の組成物が投与される前に終了される。

【0183】

以下の実施例は、本開示をより十分に説明するために与えられるが、その範囲を限定するものとして解釈されない。

【実施例】

【0184】

実施例１
本開示の二機能性アンタゴニスト分子は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術にしたがって調製され得る。この実施例において、二機能性アンタゴニスト分子の調製が一般に記載される。

【0185】

様々な新規の二機能性アンタゴニストポリペプチドをコードするｃＤＮＡを遺伝子合成を介して生成し、哺乳動物発現プラスミドにサブクローニングした。ＣＨＯ細胞を、個々の二機能性ポリペプチドアンタゴニストをコードする哺乳動物発現プラスミドを用いて一過的にまたは安定的にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞または安定的にトランスフェクトされたＣＨＯプールを３２℃のＣＯ２振盪インキュベーター中の高密度懸濁培養物中で６～８日間増殖させた。０．２２μｍフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ）を通過させた後に培養培地を収集した。組換えにより発現された二機能性ポリペプチドを、ＡＫＴＡ ＰＦＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介して培養培地から精製した。

【0186】

実施例２
この実施例において、ヒトリガンドに対する個々の二機能性アンタゴニストの結合活性を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢＩＯ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定した。結合分析を、最初にポリペプチド二機能性アンタゴニストをバイオセンサーに捕捉することにより行った。会合および解離の速度を測定するために、二機能性アンタゴニストを捕捉させたバイオセンサーを、１ｘキネティック緩衝液中に希釈された異なる濃度のリガンド（例えばＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β３）を含有するウェル中に１０分間、続いて１ｘキネティック緩衝液中に１０～２０分間浸漬した。試験されたすべてのリガンドは、それらのヒト配列に基づいて組み換えにより製造されたことが留意される。二機能性ポリペプチドアンタゴニストを捕捉させたセンサーをまた、１ｘキネティック緩衝液を含有するウェルに浸して、捕捉された二機能性アンタゴニストの天然の解離を補償するための単一参照サブトラクション（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を可能とした。バイオセンサーに対して８チャネル検出モードを使用して結合センサーグラムを収集した。ＦｏｒｔｅＢＩＯ Ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェアｖ１１．１（ＦｏｒｔｅＢＩＯ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を使用してデータを取得し、分析した。

【0187】

表７に示されるように、Ａ１１９およびＡ１２０は、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β３に高い親和性で結合する。

【0188】

二特異性抗体の形態で設計された本発明の代表的な二機能性アンタゴニスト、Ａ１３１のリガンド結合親和性を、ＢＬＩ分析を使用して調べた。表８に示されるように、Ａ１３１は、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの両方に高い親和性で結合することができる。

【0189】

実施例３
この実施例において、ＴＮＦ－αシグナル伝達およびＴＧＦ－βシグナル伝達を感知する能力を有する細胞ベースのＮＦ－κＢおよびＳｍａｄ２／３レポーターアッセイを使用することにより二機能性アンタゴニストの中和活性を調べた。

【0190】

Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達アッセイ。Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達を感知する能力を有する操作されたルシフェラーゼレポーター細胞系、Ｃ２Ｃ１２－ＣＡＧＡ－ｌｕｃを使用して、細胞培養物においてＴＧＦ－βシグナル伝達活性を測定する。二機能性アンタゴニストの中和活性を測定するために、１ｎＭのヒトリガンド（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２またはＴＧＦ－β３）を、０．００００４ｎＭ、０．０００４ｎＭ、０．００４ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．４ｎＭ、４ｎＭ、４０ｎＭおよび４００ｎＭの増加性濃度の各々の二機能性アンタゴニストと室温で１時間プレインキュベートした。その後に、反応混合物をＣ２Ｃ１２－ＣＡＧＡ－ｌｕｃ細胞培養物に加えた。３７℃のＣＯ２インキュベーター中での５時間のインキュベーション後に、ＬｕｍｉｎｏＳｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによりＣ２Ｃ１２－ＣＡＧＡ－ｌｕｃレポーター培養物のルシフェラーゼ活性を測定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してＩＣ_５０値を分析し、プロットした。

【0191】

ＮＦ－κＢシグナル伝達アッセイ。ＴＮＦ－α中和活性を測定するために、ＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を感知する能力を有する安定的にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター細胞系Ｋ５３６－ＮＦ－κＢ－ｌｕｃを使用して、ＴＮＦ－α媒介性ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を遮断する各々の二機能性アンタゴニストのＩＣ５０値を定量化した。特に、ＴＮＦ－α中和活性を測定するために、０．０２ｎＭの最終濃度のＴＮＦ－αを、０．００００１ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの増加性濃度の個々の二機能性アンタゴニストと室温で１時間プレインキュベートした。反応混合物を次にＫ５３６－ＮＦ－ｋＢ－ｌｕｃレポーター細胞培養物に加えた。ＣＯ２インキュベーター中３７℃での５時間のインキュベーション後に、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによりＫ５３６－ＮＦ－ｋＢ－ｌｕｃレポーター培養物のルシフェラーゼ活性を測定した。細胞ベースのＴＮＦ－α中和ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出およびプロットした。

【0192】

図４および図５に描写されるように、Ａ－１１９およびＡ－１２０は、細胞ベースのアッセイにおいてＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１、およびＴＧＦ－β３を強く中和する。

【0193】

実施例４
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、肺動脈平滑筋細胞の増殖および肥大に起因する肺動脈壁の肥厚の他に、増加した細胞外マトリックス沈着により特徴付けられる。ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βは、ＰＡＨを有する患者およびＰＡＨの動物モデルの肺組織において有意に上昇することが示されている。ＴＮＦ－αまたはＴＧＦ－βの阻害は肺高血圧症を減弱できることが示されている。したがって、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの両方はＰＡＨの病理発生に結び付けられる。

【0194】

この実施例において、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの存在下でヒト初代肺動脈平滑筋細胞培養物を使用することにより、肺動脈平滑筋細胞リモデリングに影響を及ぼす、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの二機能性アンタゴニスト、Ａ１２０の能力を抗ＴＮＦ抗体およびＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃと比較して調べた。

【0195】

３７℃のＣＯ２インキュベーター中、１０％のＦＢＳを補充した血管平滑筋培地中でヒト初代肺動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣ）を増殖させた。８０％のコンフルエンスに達したら、０．２％のＦＢＳを補充した培地中に細胞を再プレーティングし、以下：１）なし、２）ＴＮＦ－α、３）ＴＧＦ－β１、４）ＴＮＦ－α＋ＴＧＦ－β１、５）ＴＮＦ－α＋ＴＧＦ－β１＋抗ＴＮＦ抗体、６）ＴＮＦ－α＋ＴＧＦ－β１＋ＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃ、および７）ＴＮＦ－α＋ＴＧＦ－β１＋Ａ１２０の通りに様々な剤の追加のありまたはなしで異なる条件下でインキュベートした。７２時間のインキュベーション後に、デジタルカメラと連結させた倒立顕微鏡を用いて細胞培養物を写真撮影した。形態計測学的分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。

【0196】

図６および図７は、ヒト初代肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）における細胞増殖および細胞サイズに対するＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β１、およびＴＮＦ－αとＴＧＦ－β１との組合せの効果を描写する。さらに、図はまた、外因的に加えられたＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－β１の存在を伴う細胞培養物中のＰＡＳＭＣの増殖およびサイズに対するそれぞれ抗ＴＮＦ抗体、ＴＧＦ－β中和タンパク質ＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃおよび二機能性アンタゴニストＡ１２０の効果を示す。培養物へのＴＮＦ－αの追加は、加速された細胞増殖に起因するＰＡＳＭＣの過形成を結果としてもたらし（図６、パネルＢ）、培養物へのＴＧＦ－β１の追加は、細胞サイズにおける拡大に起因してＰＡＳＭＣの肥大に繋がり（図６、パネルＣ）、ならびに培養物への組合せでのＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－β１の追加は、細胞増殖および細胞サイズにおける並行した増加に起因してＰＡＳＭＣの過形成および肥大の両方を結果としてもたらした（図６、パネルＤ）ことをデータは実証する。したがって、上昇したＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－β１への曝露で、ＰＡＳＭＣは、過形成および肥大の両方により特徴付けられる劇的な病理学的なリモデリングを起こした。さらに、上昇したＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－β１の文脈において、抗ＴＮＦ抗体によるＴＮＦ－αの阻害は、ＰＡＳＭＣの過形成を予防したが肥大を予防せず（図６、パネルＥ）、ＴＧＦＲＩＩ－ＦｃによるＴＧＦ－β１の阻害は、ＰＡＳＭＣの肥大を減弱したが過形成を減弱せず（図６、パネルＦ）、ならびにＡ１２０によるＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－β１の並行した阻害は、ＰＡＳＭＣの過形成および肥大の両方を予防した（図６、パネルＧ）。細胞数（図７、パネルＡ）および細胞サイズ（図７、パネルＢ）に関する形態計測学的分析は、抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃと比較して、Ａ１２０はＰＡＳＭＣにおいて病理学的なリモデリングをより有効に阻害できたことを指し示す。ＰＡＳＭＣの過形成および肥大の両方を阻害するＡ１２０の優れた能力は、本発明において開示されるＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの新規の二機能性アンタゴニストは、ＰＡＨを処置するための有望な新たな治療アプローチとなることを示唆する。

【0197】

実施例５
繊維状組織での機能的な組織の置き換えにより特徴付けられる病理学的な状態である線維症は、実質的に任意の種類の組織または臓器において起こって様々な線維性疾患に繋がり得る。主要な線維性状態として、特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、持続した炎症および過度のコラーゲン原線維産生および細胞外マトリックスへの沈着に起因して肺組織における大規模な傷害を伴う。ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの発現レベルは、ＩＰＦを有する患者の他に肺線維症の動物モデルの肺組織において上方調節されることが示されている。上昇したＴＮＦ－αは肺炎を媒介し、そしてまた肺炎から線維症への遷移において役割を果たし、上昇したＴＧＦ－βは、コラーゲン原線維の過剰産生を刺激することにより肺線維症を直接的に促進することができる。

【0198】

この実施例において、ブレオマイシン誘導性肺線維症の疾患マウスモデルにおいて線維症を処置する能力について、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの新規の二機能性アンタゴニスト、Ａ１２０をそれぞれ抗ＴＮＦ抗体およびＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃと比較して評価した。

【0199】

ブレオマイシン誘導性肺線維症マウスモデル研究。動物を伴うすべての手順は、動物実験委員会により承認された。８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを１２時間の明／暗サイクルに維持し、水および齧歯動物用実験室飼料に自由にアクセスさせた。マウスを１週間順化させた後に処置を与えた。ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ）を無菌の０．９％食塩水に溶解させ、動物当たり０．５ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与した。対照動物には単独で食塩水を与えた。すべての動物に０日目にブレオマイシンまたは食塩水のいずれかの気管内注射（ＩＴ）滴下注入を与えた。マウスを以下の群：（１）ＩＴ食塩水（対照）；（２）ＩＴブレオマイシン（ブレオマイシン）、（３）ＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃ処置を伴うＩＴブレオマイシン（ブレオマイシン＋ＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃ）；（４）ＴＮＦ抗体処置を伴うＩＴブレオマイシン（ブレオマイシン＋ＴＮＦ Ａｂ）；（４）Ａ１２０処置を伴うＩＴブレオマイシン（ブレオマイシン＋Ａ１２０）に無作為に割り当てた。－２日目に開始して、ＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃ、抗ＴＮＦおよびＡ－１２０を個々のマウス群にそれぞれ、週当たり１回でＳＣ投与を介して、各々の剤の分子量で正規化された５～１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えた。２週の処置後に、動物を乱切し、右肺組織をカセットに収集し、中性緩衝ホルマリン中に固定した。組織学的評価のために、試料を、グレード付けされたエタノールシリーズ中で脱水し、キシレン中で清澄化し、パラフィン中に包埋した。４～６μｍの厚さの切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、マッソントリクローム（ＴＭ）、ならびにＨＲＰを連結させた抗アルファ－ＳＭＡ抗体で染色した。線維性肺傷害をＡｓｈｃｒｏｆｔスコアリングシステム（Ｈｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００８． ＰＭＩＤ： １８４７６８１５； ＤＯＩ： １０．２１４４／０００１１２７２９）を通じて組織学的に評価した。Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアを１０Ｘの倍率で分析した。

【0200】

図８は、対照およびブレオマイシン誘導性肺線維症マウスからのＨ＆Ｅ染色された肺切片の組織学的画像および肺切片のＡｓｈｃｒａｆｔスコアを示す。Ａ１２０によるＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの並行した阻害はブレオマイシン誘導性肺線維症を著しく低減させたが、抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃはブレオマイシン誘導性肺線維症を穏やかに阻害したことをデータは指し示す。Ａ１２０処置は、抗ＴＮＦ抗体処置またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃ処置と比較して肺線維症のより大きい低減を結果としてもたらすことをＡｓｈｃｒａｆｔスコアに関する分析は明らかにした。

【0201】

図９は、対照およびブレオマイシンで処置されたマウスからの肺切片におけるマッソントリクローム染色された肺切片の組織学的画像およびコラーゲン沈着面積の定量的分析を描写する。Ａ１２０は、抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃと比較してブレオマイシン誘導性コラーゲン沈着をより有効に減少させることができることをデータは実証した。

【0202】

図１０は、対照およびブレオマイシンで処置されたマウスからの肺切片における線維症のマーカー、アルファ－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の免疫化学染色を示す。抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃと比較して、Ａ１２０は、ブレオマイシンで処置されたマウスにおいてαＳＭＡ免疫反応性の誘導をより有効に減弱したことをデータは指し示す。

【0203】

以上を合わせると、Ａ１２０は、ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βを同時に中和することにより、線維症の予防において抗ＴＮＦ抗体またはＴＧＦＲＩＩ－Ｆｃよりも有効であることをブレオマイシン誘導性肺線維症マウスから得られたデータは実証する。Ａ１２０の増強された抗線維症効果は、本発明において開示されるＴＮＦおよびＴＧＦ－βの新規の二機能性アンタゴニストは様々な線維性疾患を処置するための有望な新たなアプローチとなることを示唆する。

【0204】

本出願において開示およびクレームされる物品および方法のすべては、本発明に照らして過度の実験なしに製造および実行され得る。本発明の物品および方法が好ましい実施形態の観点において記載されたが、バリエーションが本発明の精神および範囲から離れることなく物品および方法に適用され得ることは当業者に明らかである。当業者に明らかなすべてのそのようなバリエーションおよび均等物は、現存するものであれ後に開発されるものであれ、添付の請求項により定義される本発明の精神および範囲内にあるとみなされる。本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、本発明が関する技術分野の当業者の水準を指し示すものである。すべての特許、特許出願、および刊行物は、すべての目的のために、ならびに各々の個々の刊行物が任意のおよびすべての目的のために参照により全体が組み込まれることを特におよび個々に指し示されたのと同じ程度まで、参照により全体が本明細書に組み込まれる。好適に本明細書に実例的に記載される本発明は、本明細書に特に開示されていない任意の要素の非存在下で実施されてもよい。そのため、本発明が好ましい実施形態および任意選択的な特徴により特に開示されているが、本明細書に開示される概念の修飾およびバリエーションが当業者により取られてもよいこと、ならびにそのような修飾およびバリエーションは、添付の請求項により定義される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。

【0205】

配列表
添付の配列表に列記される核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２２において定義されている、ヌクレオチド塩基のための標準的な略記文字およびアミノ酸のための３文字コードを使用して示される。
配列番号１～５は様々なＴＮＦリガンドのアミノ酸配列である。
配列番号６～９は様々なＴＧＦ－βリガンドのアミノ酸配列である。
配列番号１０、１４、１８および２２は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する様々な抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１１、１５、１９および２３は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する様々な抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１２、１６、２０および２４は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する様々な抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１３、１７、２１および２５は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合する様々な抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号３０～３１は、ＴＮＦ－αリガンドおよびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する二機能性アンタゴニスト分子の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３２～４１は、ＴＮＦ－αリガンドに特異的に結合し、およびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する様々な二機能性アンタゴニスト分子のアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＴＮＦ－αリガンドおよびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する二機能性アンタゴニスト分子の重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ＴＮＦ－αリガンドおよびＴＧＦ－βリガンドに特異的に結合する二機能性アンタゴニスト分子の軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号４４～６３は様々なペプチドリンカー配列のアミノ酸配列である。

配列表

ヒトＴＮＦＲ１ ＥＣＤ
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＧＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴ（配列番号１）

ヒトＴＮＦＲ２ ＥＣＤ
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号２）

ヒトＴＮＦＲ１／ＣＲＤ１－ＴＮＦＲ２／ＣＲＤ２／３／４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号３）

ヒトＴＮＦＲ１／ＣＲＤ１／２／３－ＴＮＦＲ２／ＣＲＤ４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号４）

ＴＮＦＲ１／ΔＣＲＤ４
ＩＹＰＳＧＶＩＧＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣ（配列番号５）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩアイソフォーム１
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ
（配列番号６）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩ－ＥＣＤアイソフォーム１（ＴＧＦ－β ＲＩＩＢ－ＥＣＤ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号７）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩアイソフォーム２
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ（配列番号８）

ヒトＴＧＦ－β受容体ＩＩ－ＥＣＤアイソフォーム２（ＴＧＦ－β ＲＩＩＡ－ＥＣＤ）
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号９）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＶＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１１）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖アミノ酸配列
ＥＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫＬＳＣＶＡＳＧＦＩＦＳＮＨＷＭＮＷＶＲＱＳＰＥＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＳＩＮＳＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＡＶＹＬＱＭＴＤＬＲＴＥＤＴＧＶＹＹＣＳＲＮＹＹＧＳＴＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１４）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖アミノ酸配列
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＦＶＧＳＳＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＴＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＨＳＷＰＦＴＦＧＳＧＴＮＬＥＶＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１５）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫＬＳＣＶＡＳＧＦＩＦＳＮＨＷＭＮＷＶＲＱＳＰＥＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＳＫＳＩＮＳＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＡＶＹＬＱＭＴＤＬＲＴＥＤＴＧＶＹＹＣＳＲＮＹＹＧＳＴＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１６）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＦＶＧＳＳＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＭＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＴＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＨＳＷＰＦＴＦＧＳＧＴＮＬＥＶＫ（配列番号１７）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ（配列番号１８）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２１）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２２）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）

抗ＴＮＦ－α抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＩＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＮＧＬＥＷＶＡＦＭＳＹＤＧＳＮＫＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＧＩＡＡＧＧＮＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２４）

抗ＴＮＦ－α抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号２５）

抗ＴＧＦ－β抗体重鎖アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２６）

抗ＴＧＦ－β抗体軽鎖アミノ酸配列
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２７）

抗ＴＧＦ－β抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号２８）

抗ＴＧＦ－β抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号２９）

Ａ１１９重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３０）

Ａ１２０重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３１）

Ａ１２１アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３２）

Ａ１２２アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＴＣＨＡＦＦＬＲＥＮＥＣＶＳＣＳＮＣＫＫＳＬＥＣＴＫＬＣＬＰＱＩＥＮＶＫＧＴＥＤＳＧＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３３）

Ａ１２３アミノ酸配列
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３４）

Ａ１２４アミノ酸配列
ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３５）

Ａ１２５アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３６）
Ａ１２６アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３７）

Ａ１２７アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３８）

Ａ１２８アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号３９）

Ａ１２９アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号４０）

Ａ１３０アミノ酸配列
ＬＶＰＨＬＧＤＲＥＫＲＤＳＶＣＰＱＧＫＹＩＨＰＱＮＮＳＩＣＣＴＫＣＨＫＧＴＹＬＹＮＤＣＰＧＰＧＱＤＴＤＣＲＥＣＥＳＧＳＦＴＡＳＥＮＨＬＲＨＣＬＳＣＳＫＣＲＫＥＭＧＱＶＥＩＳＳＣＴＶＤＲＤＴＶＣＧＣＲＫＮＱＹＲＨＹＷＳＥＮＬＦＱＣＦＮＣＳＬＣＬＮＧＴＶＨＬＳＣＱＥＫＱＮＴＶＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ（配列番号４１）

Ａ１３１重鎖アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＮＶＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＴＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４２）

Ａ１３１軽鎖アミノ酸配列
ＥＴＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＬＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＡＤＳＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＲＹＮＲＡＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４３）

ペプチドリンカー配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４４）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＳ（配列番号４５）
ペプチドリンカー配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号４６）
ペプチドリンカー配列ＧＳＳＧＴ（配列番号４７）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４８）
ペプチドリンカー配列ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４９）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５０）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５１）
ペプチドリンカー配列ＧＳ（配列番号５２）
ペプチドリンカー配列ＧＧＳ（配列番号５３）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５４）
ペプチドリンカー配列ＧＧＳＧ（配列番号５５）
ペプチドリンカー配列ＳＧＧＧ（配列番号５６）
ペプチドリンカー配列ＧＳＧＳ（配列番号５７）
ペプチドリンカー配列ＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）
ペプチドリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５９）
ペプチドリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６０）
ペプチドリンカー配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６１）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６２）
ペプチドリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】