特表 2023-546910 組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-08

(54)【発明の名称】組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/40 20060101AFI20231031BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231031BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231031BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231031BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20231031BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231031BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231031BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231031BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231031BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20231031BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20231031BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231031BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20231031BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20231031BHJP

   C07K 14/18 20060101ALI20231031BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20231031BHJP

【ＦＩ】

C12N15/40 ZNA

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/85 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N7/01

A61K38/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61P37/04

A61K39/00 H

A61P31/12

G01N33/53 D

G01N33/536 C

G01N33/543 545A

C07K14/18

C07K16/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023524114

(86)(22)【出願日】2021-10-19

(85)【翻訳文提出日】2023-06-13

(86)【国際出願番号】 CN2021124794

(87)【国際公開番号】W WO2022083600

(87)【国際公開日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/121786

(32)【優先日】2020-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】520359778

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ （チャイナ） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】チェン ニン

(72)【発明者】

【氏名】リウ フアンフアン

(72)【発明者】

【氏名】トン チャオ

(72)【発明者】

【氏名】ワン ジアイン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064AG32

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA94Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA45

4C084AA02

4C084AA13

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB33

4C085AA03

4C085BA51

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、動物の健康の分野に関する。特に、本発明は、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープに少なくとも１つの突然変異を含む組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む免疫原性組成物、ならびに動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置するための免疫原性組成物の使用を提供する。さらに、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するための方法およびキットを提供する。さらに、本発明は、Ｅ２タンパク質を産生するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位、４１位、又は６４位の６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、未修飾の６Ｂ８エピトープが、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項2】

Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異が、このような突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８モノクローナル抗体の結合の特異的阻害をもたらす、請求項１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項3】

６Ｂ８モノクローナル抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、または
（ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、または
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、または
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
請求項１または２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項4】

６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、少なくともＥ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４位／２５位、１０位、４１位、及び／又は６４位にあるアミノ酸残基によって定義される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項5】

６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｅ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１および／もしくはＲ６４によって定義される、または少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｇ２４、Ｇ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１および／もしくはＲ６４によって定義される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項6】

Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位／２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項7】

Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸が、Ｒ、Ｄ、若しくはＩに置換されており、Ｒが好ましく、Ｅ２タンパク質の２４位及び２５位のアミノ酸が、それぞれ、Ｒ、Ｄ、若しくはＩに（Ｒが好ましい）及びＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰに（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）置換されており、Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸が、Ｋ、Ｑ、若しくはＲに置換されており、Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸が、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳに置換されており、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましく、Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸が、Ａ若しくはＰに置換されており、Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸が、Ａ、Ｎ、若しくはＥに置換されており、並びに／又はＥ２タンパク質の６４位のアミノ酸が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷに置換されており、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項8】

Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥ若しくはＧからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥ若しくはＧからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、並びに／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項9】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｃ株または野外株ＱＺ０７もしくはＧＤ１８に由来する、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項10】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、野外株ＱＺ０７に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）及びアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換を含んでもよい、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項11】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、野外株ＧＤ１８に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）及びアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換を含んでもよい、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項12】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｃ株に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＧからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）をさらに含んでもよい、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項13】

配列番号１５～２０、２２～３３、３５～４０、４９～７２、および７４～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項14】

豚Ｆｃ断片などのＦｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており、好ましくは、豚Ｆｃ断片などのＦｃ断片が、好ましくはペプチドリンカーを介してＥ２タンパク質のＣ末端に連結されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする組換え核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含むベクター。

【請求項17】

請求項１５に記載の核酸又は請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である宿主細胞。

【請求項18】

（ｉ）請求項１６に記載の宿主細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、および
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離する、および任意に精製するステップ
を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法。

【請求項19】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＥ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）。

【請求項20】

弱毒化されている、請求項１９に記載の組換えＣＳＦＶ。

【請求項21】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、請求項１５に記載の組換え核酸、請求項１６に記載のベクター、及び／又は請求項１９若しくは２０に記載の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物。

【請求項22】

ワクチン、例えばマーカーワクチンまたはＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）ワクチンである、請求項２１に記載の免疫原性組成物。

【請求項23】

請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法において使用するための、請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物。

【請求項24】

請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法。

【請求項25】

ａ）サンプルを得るステップ、および
ｂ）前記サンプルを免疫試験において試験するステップ
を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法。

【請求項26】

免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープまたはその抗原結合断片を特異的に認識する抗体がサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合し得るかどうかを試験するステップを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップ、および／または組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の突然変異した６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップを含む、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

免疫試験が、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、または
（ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、または
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、または
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープまたはその抗原結合断片を特異的に認識する抗体を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、請求項２１または２２に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキット。

【請求項31】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ、
ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法。

【請求項32】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）培地での高密度懸濁培養に適応させたＣＨＯ細胞を増殖させるステップ、
ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は請求項１～１４のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法。

【請求項33】

ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約３２～３７℃、好ましくは約３２℃で培養される、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項34】

ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項35】

組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物の健康の分野に関する。特に、本発明は、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープに少なくとも１つの突然変異を含む組換え古典的豚熱ウイルスＥ２タンパク質に関する。さらに、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む免疫原性組成物、ならびに動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置するための免疫原性組成物の使用を提供する。さらに、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するための方法およびキットを提供する。さらに、本発明は、Ｅ２タンパク質を産生するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

古典的豚熱（ＣＳＦ）は、著しい経済損失を生じさせる、豚およびイノシシの高伝染性の疾患である。この疾患の原因物質は、古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）である。中国では、予防的ワクチン接種および根絶戦略の組み合わせが、ＣＳＦのアウトブレイクを制御するために実行されている。しかし、孤発性のＣＳＦアウトブレイクおよび持続的な感染が、中国のほとんどの地域において依然として報告されている。

【発明の概要】

【0003】

当技術分野において、安全で、効果的で、かつ、それをワクチン接種された動物を、野生型の野外株に感染している動物から区別することができる、新規なＣＳＦＶワクチンが依然として必要とされている。
一態様において、本発明は、Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、（未修飾の）６Ｂ８エピトープが６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする単離核酸を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一態様において、本発明は、それぞれ本発明に従った、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸、またはこのような核酸をコードするベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の免疫原性組成物をそれを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法を提供する。
一態様において、本発明は、ａ）動物からサンプルを得ること、およびｂ）前記サンプルを免疫試験において分析することを含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】ＣＳＦＶ Ｅ２の構造および６Ｂ８エピトープの重要なアミノ酸を示す図である。

【図2】野生型ＣＳＦＶ Ｅ２および６Ｂ８エピトープに様々な置換を有する突然変異ＣＳＦＶ Ｅ２の構築を示す図である。

【図3】ｍＡｂ ６Ｂ８がほとんどのＣＳＦＶ株を認識するがＢＶＤＶウイルスとの反応は有さないことを示す図である。

【図4】ＣＳＦＶ単離体、ＢＶＤＶ株、および一部の他のペスチウイルスの配列アラインメントを示す図である。

【図5】１４位、２２位、または２４位／２５位のアミノ酸残基がｍＡｂ ６Ｂ８の結合に重要であることを示すＩＦＡの結果を示す図である。（図５Ａ－５Ｃ）

【図6】Ａ）－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングの両方によって確認された、ｗｔ－Ｅ２及びＥ２－ＫＡＲＤ又はＥ２－ＫＲＤの精製結果（図６Ａ）、及びＢ）－ 精製されたＥ２－ＫＡＲＤ又はＥ２－ＫＲＤが、６Ｂ８染色で負の結果を示した（図６Ｂ）ことを示す図である。

【図7】ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングの両方によって確認された、ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴの精製結果を示す図である。

【図8】有効性研究におけるチャレンジ後の体温を示す図である。

【図9】有効性研究におけるチャレンジ後の白血球数を示す図である。

【図10】有効性研究におけるチャレンジ後の死亡率を示す図である。

【図11】有効性研究におけるチャレンジ後の臨床スコアを示す図である。

【図12】有効性研究の間の血清応答を示す図である。

【図13】Ｅ２タンパク質がＣＨＯ系において高収量で発現されたことを示す図である。

【図14】ＣＨＯ系で発現されたＥ２タンパク質が免疫原性であることを示す図である。

【図15】Ｅ２における６Ｂ８結合のための追加の重要な残基の同定を示す図である。ＣＨＯ細胞発現系におけるＥ２タンパク質の突然変異形態のＩＦＡ検出は、１０、４１、又は６４位のアミノ酸残基が、ｍＡｂ ６Ｂ８結合に重要であることを示す。

【図16】ＣＨＯ細胞発現系におけるＥ２タンパク質の突然変異形態のウェスタンブロット検出を示す図である。

【図17】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２２位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図18】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２４位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図19】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための２５位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【図20】Ｅ２における６Ｂ８結合を阻害するための６４位の追加のアミノ酸の同定を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本発明の態様を記載する前に、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、複数形での言及を含むことに留意されなくてはならない。したがって、例えば、「エピトープ（ａ ｏｒ ａｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）」への言及は複数のエピトープを含み、「ウイルス」への言及は、１つまたは複数のウイルスおよび当業者に公知のこれらの同等物への言及であり、他もまた同様である。用語「および／または」は、この用語によって接続される項目の任意の組み合わせを包含することを意図しており、全ての組み合わせを個別に列挙していることに等しい。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「ＡおよびＢ」、「ＡおよびＣ」、「ＢおよびＣ」、ならびに「ＡおよびＢおよびＣ」を包含する。別段の規定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものに類似のまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料がここでは記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物において報告されているウイルス株、細胞系、ベクター、および方法論を記載および開示する目的で、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書において記載されるいずれの刊行物も、先行発明を理由に本発明がこのような開示に先行する権利を有するものではないと承認すると解釈されるものではない。

【0006】

一態様において、本発明は、Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、（未修飾の）６Ｂ８エピトープが６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を提供する。
本明細書において使用される用語「ＣＳＦＶ」は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科のペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属の古典的豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）種に属する全てのウイルスを指す。

【0007】

用語「組換え」は、遺伝子操作によって改変されている、再配列されている、または修飾されているタンパク質または核酸を指す。しかし、この用語は、自然発生的な突然変異などの天然の事象の結果生じるポリヌクレオチド、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列における改変は指さない。
一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は単離される。
ポリペプチドまたは核酸分子は、これらのネイティブな生物学的由来源および／またはこれらが得られた元である反応培地もしくは培養培地中においてこれらに通常付随している少なくとも１種の他の成分、例えば、別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的成分もしくは高分子、または少なくとも１種の汚染物質、不純物、もしくは微量成分から、これらが分離されている場合、例えば前記由来源または培地と比較して、「単離されている」とみなされる。特に、ポリペプチドまたは核酸分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、および最大１０００倍、またはそれを超えて精製されている場合、「単離されている」とみなされる。「単離された形態の」ポリペプチドまたは核酸分子は、適切な技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定すると、好ましくは本質的に均質である。

【0008】

本明細書における「Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ」はまた、本明細書において開示されている６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質のエピトープも指す。６Ｂ８エピトープは立体構造エピトープであり得る。６Ｂ８エピトープは、Ｅ２タンパク質の２４、２５、１４、２２、１０、４１、及び／又は６４位に規定のアミノ酸を含み得る。例えば、６Ｂ８エピトープは、Ｅ２タンパク質の１４位にＳ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを含み得る。

【0009】

用語「６Ｂ８モノクローナル抗体」は、６Ｂ８モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を指し、６Ｂ８モノクローナル抗体は、６Ｂ８エピトープ、特にＥ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを少なくとも含む６Ｂ８エピトープを特異的に認識する。好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体を指す。好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体を指す。さらに好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むモノクローナル抗体を指す。さらに好ましくは、６Ｂ８モノクローナル抗体という用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を指す。

【0010】

本明細書において使用される場合、「抗体」は、完全長免疫グロブリンの結合特異性能力を保持する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するその任意の断片を含む、天然の、または部分的にもしくは完全に合成によって産生された、例えば組換えによって産生された、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片を指す。したがって、抗体には、免疫グロブリンの抗原結合ドメインに相同なまたは実質的に相同な結合ドメイン（抗体結合部位）を有するあらゆるタンパク質が含まれる。抗体には、抗体断片が含まれる。本明細書において使用される場合、抗体という用語としては、したがって、合成抗体、組換産生抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、および抗体断片が含まれる。本明細書において提供される抗体には、任意の免疫グロブリン型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーが含まれる。

【0011】

本明細書において使用される用語「可変領域」は、当技術分野においておよび以下で「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」とそれぞれ呼ばれる４つの「フレームワーク領域」から基本的になる免疫グロブリンドメインを意味する。これらのフレームワーク領域には、当技術分野においておよび以下で「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれる３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」が介在している。したがって、免疫グロブリン可変領域の一般的な構造または配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。ＶＨまたはＶ_Hは重鎖可変領域を指し、ＶＬまたはＶ_Lは軽鎖可変領域を指す。同様に、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３は、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をそれぞれ指す。ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をそれぞれ指す。

【0012】

本明細書において使用される場合、「抗体断片」または抗体の「抗原結合断片」は、完全長よりは短いが、抗原を結合する抗体可変領域の少なくとも一部分（例えば、１つもしくは複数のＣＤＲおよび／または１つもしくは複数の抗体結合部位）を有し、したがって完全長抗体の結合特異性、および特異的結合能力の少なくとも一部を保持する、完全長抗体の任意の部分を指す。したがって、抗原結合断片は、抗体断片が由来する元である抗体と同一の抗原に結合する抗原結合部分を有する抗体断片を指す。抗体断片には、完全長抗体の酵素処理によって産生された抗体誘導体、ならびに合成によって、例えば組換えによって産生された誘導体が含まれる。抗体断片は、抗体に含まれる。抗体断片の例としては、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、ＦｄおよびＦｄ’断片、ならびに、修飾断片を含む他の断片が含まれる（例えば、Methods in Molecular Biology， Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003)； Chapter 1； p 3-25， Kipriyanovを参照されたい）。断片は、例えばジスルフィド架橋および／またはペプチドリンカーによって共に連結された複数の鎖を含み得る。抗原結合断片は、（例えば、対応する領域を置き換えることによって）抗体フレームワークに挿入されると、抗原に免疫特異的に結合する（すなわち、少なくともまたは少なくとも約１０⁷～１０⁸Ｍ^-1のＫａを示す）抗体を生じさせる、任意の抗体断片を含む。

【0013】

用語「６Ｂ８モノクローナル抗体の抗原結合断片」は、６Ｂ８モノクローナル抗体の断片を指すか、又は６Ｂ８エピトープ、特にＥ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、及び／又は６４位にＲを少なくとも含む６Ｂ８エピトープを特異的に認識するアミノ酸配列を少なくともコードする。この用語は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３をコードするアミノ酸断片をさらに包含する。さらに、この用語はまた、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むアミノ酸断片も包含する。さらに好ましくは、この用語は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によってコードされるアミノ酸断片を包含し、このアミノ酸断片は、６Ｂ８エピトープに特異的に結合する。

【0014】

用語「突然変異」は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含む。突然変異という用語は当業者に周知であり、当業者は、さらなる苦労を伴うことなく突然変異を生成させることができる。
一態様において、本発明のＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異は、このような突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８モノクローナル抗体の結合の特異的阻害をもたらす。

【0015】

用語「特異的に阻害する又は特異的な阻害」は、６Ｂ８抗体が、未修飾の６Ｂ８エピトープと比較して、特に、Ｅ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｓ、２２位にＧ、２４位にＥ若しくはＧ、２５位にＧ、１０位にＹ、４１位にＤ、６４位にＲ、又はそれらの組合せを有する未修飾の６Ｂ８エピトープと比較して、少なくとも２分の１、好ましくは５分の１、さらに好ましくは１０分の１、及びまたさらに好ましくは５０分の１の親和性で、突然変異６Ｂ８エピトープに結合することを意味する。「親和性」は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と単一のエピトープとの間の相互作用である。親和性は、会合定数ＫＡ＝ｋ会合／ｋ解離、または解離定数ＫＤ＝ｋ_解離／ｋ_会合によって表される。さらに好ましくは、用語「特異的に阻害するまたは特異的な阻害」は、６Ｂ８モノクローナル抗体、特に、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が、特異的免疫蛍光アッセイにおいて、好ましくは実施例５で記載される特異的免疫蛍光アッセイにおいて、または、特異的ドットブロットアッセイにおいて、好ましくは実施例６で記載される特異的ドットブロットアッセイにおいて、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープに検出可能に結合しないことを意味する。特異的免疫蛍光アッセイおよび特異的ドットブロットアッセイの両方は、特異的阻害を判定するために使用することができるが、２つのアッセイから得られた結果が一致しない場合には、ドットブロットアッセイから得られた結果が優先される。

【0016】

用語「置換」は、アミノ酸が同一の位置で別のアミノ酸によって置き換えられていることを意味する。したがって、置換という用語は、アミノ酸の除去／欠失と、その後の、同一の位置での別のアミノ酸の挿入とを網羅する。
用語「Ｅ２タンパク質」は、ＣＳＦＶのポリプロテイン（Ｎｐｒｏ－Ｃ－Ｅｒｎｓ－Ｅ１－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂ）からの最終切断産物として生じる、プロセシングされたＥ２タンパク質を指す。当業者には、ＣＳＦＶのあらゆるＥ２タンパク質を本発明において使用することができることが認識されよう。本発明の一態様において、組換えＥ２タンパク質は、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される６Ｂ８エピトープを有する野生型Ｅ２タンパク質に由来する。例えば、Ｅ２タンパク質は、Ｃ株などの公知のＣＳＦＶ株に、または本明細書において定義されるＱＺ０７もしくはＧＤ１８などの新たな単離体に由来し得る。例えば、野外株ＱＺ０７のＥ２タンパク質は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有し、野外株ＧＤ１８のＥ２タンパク質は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、野外株ＧＤ１９１のＥ２タンパク質は、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有し、そして、Ｃ株のＥ２タンパク質は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する。

【0017】

本発明の一態様において、組換えＥ２タンパク質は、配列番号９、１０、３４および２１のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、本明細書において開示されている６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含む。
２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一のアミノ酸のパーセンテージを示す。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の配列同一性のレベルを評価するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、配列分析ソフトウェアが、アミノ酸配列の同一性を決定するために頻繁に使用される。例えば、同一性は、ＮＣＢＩデータベースにあるＢＬＡＳＴプログラムを使用することによって決定することができる。配列同一性の決定については、例えば、Computational Molecular Biology， Lesk， A.M.， ed.， Oxford University Press， New York， 1988、Biocomputing: Informatics and Genome Projects， Smith， D.W.， ed.， Academic Press， New York， 1993、Computer Analysis of Sequence Data， Part I， Griffin， A.M.， and Griffin， H.G.， eds.， Humana Press， New Jersey， 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology， von Heinje， G.， Academic Press， 1987、およびSequence Analysis Primer， Gribskov， M. and Devereux， J.， eds.， M Stockton Press， New York， 1991を参照されたい。

【0018】

本発明の好ましい態様において、本明細書において開示されている６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を有する組換えＥ２タンパク質は、免疫原性であり、好ましくは、ＣＳＦＶに対する防御免疫を付与する。Ｅ２タンパク質は、４つの抗原性ドメインであるＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、およびＤドメインを有し、これらのドメインの全ては、Ｅ２タンパク質のＮ末端に位置する。これら４つのドメインは、一方がＢ／Ｃドメインの単位であり、他方がＡ／Ｄドメインを含む、２つの独立した抗原性単位を構成している。Ｂ／Ｃドメインはアミノ酸１位から８４位／１１１位であり、Ｄ／Ａドメインは、アミノ酸７７位から１１１位／１７７位に位置している。さらに、Ｂ／Ｃドメインは、アミノ酸４Ｃと４８Ｃとの間の推定上のジスルフィド結合によって連結されており、一方、単位Ｄ／Ａは、一方がアミノ酸１０３Ｃと１６７Ｃとの間であり、他方がアミノ酸１２９Ｃと１３９Ｃとの間である、２つのジスルフィド結合で形成されている。これらのシステイン残基は、Ｅ２タンパク質の立体構造の抗原性構造に不可欠である。抗原性モチーフ（８２～８５ＬＬＦＤ）は、回復期血清の結合のためのＥ２タンパク質の抗原性構造に重要である。別のモチーフ（ＲＹＬＡＳＬＨＫＫＡＬＰＴ、アミノ酸６４～７６位）もまた、Ｅ２タンパク質の立体構造エピトープの認識の構造的完全性に重要であると同定されている。加えて、上記の抗原性ドメインの１つのみを有するＥ２タンパク質が免疫原性を維持しており、感染性ＣＳＦＶのチャレンジから豚を防御し得ることが報告されている。したがって、本発明の好ましい態様において、本明細書において記載される、６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの修飾を有する組換えＥ２タンパク質は、上記の抗原性ドメインのうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも１つを保持している。好ましくは、本発明の組換えＥ２タンパク質は、ＣＳＦＶに対する防御免疫を付与し得る。一態様において、本明細書において定義される６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異を、ＣＳＦＶに対する組換えＥ２タンパク質の防御免疫原性にほとんど影響することなく導入することができる。

【0019】

本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、少なくともＥ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２４及び２５（「２４／２５」）位、１０位、４１位、並びに／又は６４位のアミノ酸残基によって定義される。
本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、例えば単離体ＱＺ０７、ＧＤ１８、またはＧＤ１９１では、少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｅ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、および／またはＲ６４によって定義される。本発明の一態様において、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープは、例えばＣ株では、少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｇ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、および／またはＲ６４によって定義される。

【0020】

アミノ酸残基の番号付けは、プロセシングされたＥ２タンパク質におけるＮ末端からのアミノ酸位置、例えば、配列番号９または１０において典型的な様式で示されるアミノ酸位置を指す。しかし、アミノ酸位置は、ポリプロテイン（Ｎｐｒｏ－Ｃ－Ｅｒｎｓ－Ｅ１－Ｅ２－ｐ７－ＮＳ２－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５Ａ－ＮＳ５Ｂを有する）と比較して、例えば、配列番号１１または１２において典型的な様式で示されるアミノ酸位置と比較してさらに定義することができる。例えば、Ｅ２タンパク質の１４位、２２位、２４位、２５位、１０位、４１位、及び６４位のアミノ酸残基は、ポリプロテインの７０３位、７１１位、７１３位、７１４位、６９９位、７３０位、及び７５３位のアミノ酸残基に対応する。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位／２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換を含み、アミノ酸６４位での置換が好ましい。

【0021】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換を含み、アミノ酸６４位での置換が好ましい。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換及びＥ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。

【0022】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位での置換、及びＥ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。

【0023】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換及びＥ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位での置換、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。

【0024】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶタンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換及びＥ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。

【0025】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換からなる群から選択され、アミノ酸６４位での置換が好ましい少なくとも１つのさらなる置換を含む。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、およびＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換を含む。
本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、以下の表１～７に定義される、Ｅ２タンパク質のアミノ酸位置での置換を含む。例えば、表１の２行目は、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位（「１０位」）に置換を含むことを意味し、表１の３行目は、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位及び１４位に置換を含むことを意味する、などである。

【0026】

【表1】

【0027】

【表2】

【0028】

【表3】

【0029】

【表4】

【0030】

【表5】

【0031】

【表6】

【0032】

【表7】

【0033】

【表8】

【0034】

本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質では、Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸はＡ若しくはＰに置換されており、Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲに置換されており、Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳに置換されており、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましく、Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ、若しくはＩに置換されており、Ｒが好ましく、Ｅ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰに置換されており、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましく、Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸は、Ａ、Ｎ、若しくはＥに置換されており、並びに／又はＥ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷに置換されており、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい。

【0035】

本発明の一態様において、表１～７に記載のアミノ酸置換は、上記段落に記載の特定の置換であると理解される。例えば、表１～７に記載のＥ２タンパク質の１０位のアミノ酸は、Ａ若しくはＰに置換され得、表１～７に記載のＥ２タンパク質の１４位のアミノ酸は、Ｋ、Ｑ、若しくはＲに置換され得、表１～７に記載のＥ２タンパク質の２２位のアミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳに置換され得、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましく、表１～７に記載のＥ２タンパク質の２４位のアミノ酸は、Ｒ、Ｄ、若しくはＩに置換され得、Ｒが好ましく、表１～７に記載のＥ２タンパク質の２５位のアミノ酸は、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰに置換され得、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましく、表１～７に記載のＥ２タンパク質の４１位のアミノ酸は、Ａ、Ｎ、若しくはＥに置換され得、並びに／又は表１～７に記載のＥ２タンパク質の６４位のアミノ酸は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷに置換され得、Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい。表１～７内の全ての考え得る並び替えを実施し、例えば、突然変異１０Ａを突然変異１４Ｋ、１４Ｑ、若しくは１４Ｒと組み合わせるか、又は突然変異１０Ｐを突然変異１４Ｋ、１４Ｑ、若しくは１４Ｒと組み合わせることなどは、当業者の知識内にある。

【0036】

本発明の一態様において、本発明に従ったＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内のアミノ酸置換は、Ｅ２タンパク質の１０位にアミノ酸Ａ若しくはＰ、Ｅ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｋ、Ｑ、若しくはＲ、Ｅ２タンパク質の２２位にアミノ酸Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳ、Ｅ２タンパク質の２４位にアミノ酸Ｒ、Ｄ、若しくはＩ、Ｅ２タンパク質の２５位にアミノ酸Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰ、Ｅ２タンパク質の４１位にアミノ酸Ａ、Ｎ、若しくはＥ、及び／又はＥ２タンパク質の６４位にアミノ酸Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷを含み、アミノ酸２２位ではＡ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましく、アミノ酸２４位ではＲが好ましく、アミノ酸２５位ではＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましく、Ｅ２タンパク質のアミノ酸６４位ではＡ、Ｋ、及びＷが好ましい突然変異６Ｂ８エピトープをもたらす。

【0037】

当業者には、６Ｂ８エピトープが様々なＣＳＦＶ株の間で進化的に保存されていることから、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が様々なＣＳＦＶ単離体に由来し得ることが認識されよう。
本発明の一態様において、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ジェノグループ２．１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば野外株ＧＤ１８またはＱＺ０７に由来する。野外株ＱＺ０７は、配列番号１３で示される完全長ヌクレオチド配列を有するか、または、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するポリプロテインを含むかもしくは発現する。野外株ＧＤ１８は、配列番号１４で示される完全長ヌクレオチド配列を有するか、または、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するポリプロテインを含むかもしくは発現する。
本発明の一態様において、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ジェノグループ１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、当技術分野において周知のＣ株に由来する。

【0038】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＱＺ０７に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、並びに／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む。

【0039】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＱＺ０７に由来し、かつアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換をさらに含んでもよい。

【0040】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＱＺ０７に由来し、かつアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、又はＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、又はＥへの置換（Ａ及びＲが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、又はＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＧＤ１８に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含んでもよい。

【0041】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＧＤ１８に由来し、かつアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換を含んでもよい。

【0042】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、野外株ＧＤ１８に由来し、かつアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、又はＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、又はＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、又はＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む。

【0043】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｃ株に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＧからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換を含んでもよい。

【0044】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｃ株に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＧからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換を含んでもよい。

【0045】

本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｃ株に由来し、かつアミノ酸２４位でのＧからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、又はＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、又はＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、又はＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む。

【0046】

本発明の一態様において、可溶性Ｅ２タンパク質を得るために、本発明に従った組換えＥ２タンパク質を、膜貫通ドメインを除去するためにトランケートすることができる。例えば、無傷の本発明に従ったＥ２タンパク質のＣ末端の最後の約４０個のアミノ酸（例えば、４２個または４３個のアミノ酸）を欠失させてもよい。
本発明の一態様において、分泌形式の本発明に従った組換えＥ２タンパク質を得るために、シグナルペプチドをＥ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。例えば、Ｅ１タンパク質の最後の約２０個のアミノ酸、特に最後の１６個のアミノ酸（例えばＣ株では）、または２１～２３個のアミノ酸（例えば、ＧＤ１８もしくはＱＺ０７では）を、本発明に従った組換えＥ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。一態様において、シグナルペプチドは、配列番号４１～４３から選択されるアミノ酸配列を含み得る。当業者には、隠れた発現を可能にする他のシグナルペプチドもまた本発明において適用され得ることが認識されよう。
本発明の一態様において、Ｅ２タンパク質を、膜貫通ドメインを除去するためにトランケートすることができ、また、シグナルペプチドを、可溶性の分泌されたＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２タンパク質のＮ末端に付加することができ、例えば、無傷のＥ２タンパク質の最後の４３個のアミノ酸を欠失させてよく、そしてＥ１タンパク質の最後の１６個のアミノ酸または２１～２３個のアミノ酸を、Ｅ２タンパク質のＮ末端に付加することができる。

【0047】

本発明の一態様において、組換えＥ２タンパク質はまた、同定および／または精製のための融合タグも含み得る。ＨｉｓタグまたはＦＬＡＧタグなどのこのようなタグは、当技術分野において周知である。
本発明の一態様において、免疫グロブリンＦｃ断片が、Ｅ２タンパク質に連結されていてもよい。本明細書において使用される用語「免疫グロブリンＦｃ断片」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、さらに特に、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変領域並びに軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質を指す。この用語は、免疫グロブリンのヒンジ領域又はヒンジ領域の部分（つまり、重鎖定常領域のヒンジ領域）をさらに含んでもよい。また、免疫グロブリンＦｃ断片は、重鎖定常領域１（ＣＨ１）の一部を含んでもよい。本明細書において使用される用語「免疫グロブリンＦｃ断片」は、「Ｆｃ断片」と等価であることが理解される。

【0048】

本明細書において使用される用語「連結された」は、特に、ポリペプチド内で免疫グロブリンＦｃ断片をＥ２タンパク質のＣ末端又はＮ末端に接続するためのあらゆる手段を指す。連結手段の例には、免疫グロブリンＦｃ断片とＥ２タンパク質との共有結合による直接連結が含まれ得る。一態様において、Ｆｃ断片は、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結され得る。
一態様において、免疫グロブリンＦｃ断片は、ペプチドリンカーを介してＥ２タンパク質に連結され得る。本明細書において使用される用語「ペプチドリンカー」は、1つ又は複数のアミノ酸残基を含むペプチドを指す。さらに特に、本明細書において使用される用語「ペプチドリンカー」は、2つの可変タンパク質及び／又はドメイン、例えばＥ２タンパク質及び免疫グロブリンＦｃ断片を接続し得るペプチドを指す。本明細書において言及されるペプチドリンカーは、好ましくは、長さが３～２０アミノ酸残基であるアミノ酸配列である。例えば、リンカー部分は、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸残基であるペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーの例示的な配列は、ＧＧＳ、ＧＳＧＧＳＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。一態様では、ペプチドリンカーのアミノ酸配列はＧＧＳ（配列番号９１）である。

【0049】

一態様では、免疫グロブリンＦｃ断片は豚ＩｇＧ Ｆｃ断片である。一態様において、Ｆｃ断片は、Ｅ２タンパク質のＣ末端に連結され得る。一態様において、Ｆｃ断片は、ペプチドリンカーを介してＥ２タンパク質のＣ末端に連結され得る。一態様では、豚Ｆｃ断片のアミノ酸配列は、配列番号９５によって示される。Ｆｃ断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９６によって示される。
本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、配列番号１５～２０、２２～３３、３５～４０、４９～７２、および７４～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含む。
本発明の一態様において、本発明の組換えＥ２タンパク質は、６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異を有する、配列番号１５～２０、２２～３３、３５～４０、４９～７２、および７４～８１のいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0050】

一態様において、本発明は、本発明の組換えＥ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）を提供する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは弱毒化されている。
当業者には、６Ｂ８エピトープが様々なＣＳＦＶ株の間で進化的に保存されていることから、本発明の組換えＣＳＦＶが様々なＣＳＦＶ単離体に由来し得ることが認識されよう。本発明の一態様において、本発明の組換えＣＳＦＶは、ジェノグループ１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは、例えば野外株ＧＤ１８又はＱＺ０７に由来する。本発明の一態様では、本発明の組換えＣＳＦＶは、ジェノグループ１の単離体に由来する。本発明の一態様において、組換えＣＳＦＶは、当技術分野において周知のＣ株に由来する。

【0051】

一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質及び／又は本発明の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物を提供する。
本明細書において使用される用語「免疫原性組成物」は、免疫原性組成物が投与される宿主において免疫学的応答を引き起こす少なくとも１種の抗原を含む組成物を指す。このような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性および／または抗体介在性の免疫応答であり得る。宿主はまた、「対象」とも記載される。好ましくは、本明細書において記載または言及される宿主または対象はいずれも、動物である。

【0052】

通常、「免疫学的応答」には、限定はしないが、以下の影響の１つまたは複数が含まれる：本発明の免疫原性組成物に含まれる１種または複数種の抗原に特異的に向けられる抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはガンマ－デルタＴ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は、防御免疫応答または治療応答のいずれかを示す。
「防御免疫応答」は、感染した宿主によって通常示される臨床徴候の低減または欠如のいずれか、より短い回復時間および／もしくは感染期間の短縮、または、感染した宿主の組織もしくは体液もしくは排出物における病原体力価の低下によって示される。
本明細書において使用される「抗原」は、限定はしないが、このような抗原またはその免疫学的に活性な成分を含む、宿主において目的の免疫原性組成物またはワクチンに対する免疫学的応答を引き起こす成分を指す。
宿主が防御免疫応答を示し、その結果、新たな感染に対する耐性が増強されるおよび／または疾患の臨床的重症度が低減するケースでは、免疫原性組成物は「ワクチン」と記載される。

【0053】

一態様において、本発明の免疫原性組成物はワクチンである。
本明細書において理解される用語「ワクチン」は、抗原性物質を含む獣医学的使用のためのワクチンであり、ＣＳＦＶ感染によって引き起こされる疾患に対する特異的かつ活性な免疫を誘発する目的で投与される。
好ましくは、本発明に従ったワクチンは、宿主動物において防御免疫応答を引き起こす、好ましくは本明細書において記載されるような組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む、サブユニットＣＳＦＶワクチンである。
ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。

【0054】

免疫応答を増強させるためのさらなる成分は、「アジュバント」と一般に呼ばれる構成成分、または、ワクチンに添加される、もしくはこのようなさらなる成分によるそれぞれの誘導の後に身体によって生成される、補助分子、例えば限定はしないが、インターフェロン、インターロイキン、もしくは成長因子である。本明細書において使用される「アジュバント」としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＧＰＩ－０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケンの、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化の結果生じる油；直鎖状アルキル基を有する酸またはアルコールのエステル、さらに特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリレート／カプレート）、グリセリルトリ（カプリレート／カプレート）、またはプロピレングリコールジオレエート；分枝鎖状の脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルをベースにしているものであり得る。油は、エマルジョンを形成するために乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特に、任意にエトキシ化されている、ソルビタンの、マンニド（例えば、アンヒドロマンニトールオレエート）の、グリコールの、ポリグリセロールの、プロピレングリコールの、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシンオレイン酸、またはヒドロキシステアリン酸のエステル、ならびにポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al.， The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull， D. E. S.)， JohnWiley and Sons， NY， pp51-94 (1995)、およびTodd et al.， Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。典型的なアジュバントは、“Vaccine Design， The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman， Plenum Press， 1995の第１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこれと同一の本の第１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。

【0055】

アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルと架橋している、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8， No. 2， June 1996）。当業者はまた、少なくとも３つの、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を有し、これら少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋している、このようなアクリルポリマーを記載している、米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２～４個の炭素原子を有するラジカル、例えば、ビニル、アリル、および他のエチレン不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体、メチルなどの他の置換基を有し得る。カーボポールという名称で市販されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適切である。これらは、アリルショ糖またはアリルペンタエリスリトールと架橋している。これらのうち、カーボポール９７４Ｐ、９３４Ｐ、および９７１Ｐに言及することができる。最も好ましいものは、カーボポール９７１Ｐの使用である。無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のコポリマーとしては、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）があり、これは、無水マレイン酸およびエチレンのコポリマーである。水中にこれらのポリマーを溶解すると酸性の溶液が生じ、この溶液は、免疫原性の免疫学的組成物またはワクチン組成物自体を組み込むアジュバント溶液を作製するために、好ましくは生理学的ｐＨに中和される。

【0056】

さらなる適切なアジュバントとしては、数ある中でとりわけ、限定はしないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質－アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（組換えまたはその他）の易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４もしくはムラミルジペプチド、あるいは、天然のもしくは組換えのサイトカインもしくはこれらの類似体または内因性サイトカイン放出の刺激物質が含まれる。

【0057】

一態様において、免疫原性組成物は、適切なアジュバントと共に、油中水型エマルジョンに製剤される。アジュバントは、油および界面活性剤を含み得る。一態様において、アジュバントは、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ７１Ｒ ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ Ｉｎｃによる製造、カタログ番号：３６５１８７）である。一態様において、アジュバントは、Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６である。アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加され得る。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量で添加される。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約５００μｇ～約５ｍｇの量で添加される。またさらに好ましくは、アジュバントは、用量当たり約７５０μｇ～約２．５ｍｇの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは、用量当たり約１ｍｇの量で添加される。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、用量当たり、アジュバントを含有する約７割の油相、および本発明のＥ２タンパク質を含有する約３割の水相を含む。

【0058】

本発明の一態様において、上記で定義される、６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異、例えば、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位／２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換は、マーカーとして使用される。
本明細書において使用される用語「マーカー」は、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープを指す。本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ配列（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）と異なる。したがって、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープによって、典型的な免疫試験および／またはゲノム解析試験を使用して、突然変異していない６Ｂ８エピトープを有する天然に感染した動物を、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープを有するワクチン接種された動物から区別することが可能となる。

【0059】

本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物は、マーカーワクチンまたはＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ））ワクチンである。
用語「マーカーワクチン」または「ＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）」は、上記に示すマーカーを有するワクチンを指す。したがって、マーカーワクチンは、ワクチン接種された動物を天然に感染した動物から区別するために使用することができる。本発明の免疫原性組成物はマーカーワクチンとして作用するが、それは、野生型ＣＳＦＶでの感染とは対照的に、本発明のワクチンを接種された動物において、本発明に従った置換型６Ｂ８エピトープが検出され得るためである。典型的な免疫試験および／またはゲノム解析試験によって、本発明に従った置換型６Ｂ８エピトープは、野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ配列（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）から区別され得る。最後に、マーカーエピトープは、家畜内に存在し得る他の生物によって誘導される偽陽性の血清学的結果を避けるために、病原体に特異的であるべきである。しかし、６Ｂ８エピトープは進化的に保存されている（配列アラインメントによる）ため、ＣＳＦＶに特異的である（６Ｂ８ ｍＡｂはＢＶＤＶに結合しない）。したがって、本発明に従った置換型６Ｂ８エピトープは、マーカーワクチンにおける使用に非常に適している。
有効なマーカーワクチンの主な利点は、ワクチンが、急性に感染した豚、またはワクチン接種された豚集団においてサンプルを採取するある程度（例えば、少なくとも約３週間）前に感染した豚の検出を可能とし、したがって、豚集団におけるＣＳＦＶの拡大または再導入をモニタリングする能力を提供することである。したがって、ワクチンは、ある程度の信頼レベルで、実験室での試験結果に基づいて、ワクチン接種された豚集団がＣＳＦＶを有していないと断言することを可能にする。

【0060】

本発明のマーカーワクチンは、豚の発熱の検出またはアウトブレイクのケースにおける緊急のワクチン接種に理想的に適している。マーカーワクチンは、迅速かつ効果的な投与を容易にし、野外ウイルス（疾患に関連する）に感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別を可能にする。
本発明の一態様において、本発明の免疫原性組成物で処置された動物は、天然の豚熱ウイルスに感染した動物から、免疫試験および／またはゲノム解析試験を使用する前記動物から得たサンプルの分析を介して、区別され得る。
用語「サンプル」は、体液のサンプル、分離された細胞のサンプル、または組織もしくは器官のサンプルを指す。体液のサンプルは周知の技術によって得ることができ、これには、好ましくは、血液、血漿、血清、または尿のサンプル、さらに好ましくは、血液、血漿、または血清のサンプルが含まれる。組織または器官のサンプルは、例えば生検によって、任意の組織または器官から得ることができる。分離された細胞は、遠心分離または細胞選別などの分離技術によって、体液または組織または器官から得ることができる。

【0061】

「得られた」という用語は、沈殿、カラムなどを好ましくは使用する、当業者に公知の単離および／または精製ステップを含み得る。
用語「免疫試験」および「ゲノム解析試験」は、以下に詳述される。しかし、前記「免疫試験」および「ゲノム解析試験」の分析はそれぞれ、本発明に従った免疫原性組成物をワクチン接種された動物と、天然の（疾患に関連する）豚熱ウイルスに感染した動物とを区別するための基礎である。
本発明の一態様において、前記免疫原性組成物は、単回用量投与のために製剤される。
有利には、本発明によって提供される実験データは、本発明の免疫原性組成物の単回用量投与が防御免疫応答を確実にかつ効果的に刺激したことを開示している。したがって、本発明の一態様において、前記免疫原性組成物は、単回用量投与のために製剤され、単回用量投与によって効果的である。

【0062】

また、本発明は、医薬品として使用するための本発明の免疫原性組成物の使用も提供する。
一態様において、本発明は、本発明に従った免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法を提供する。一態様において、ＣＳＦＶに関連する疾患は、ＣＳＦである。
本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物のいずれかを動物に投与することを含む、動物を免疫化するための方法に関する。本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物のいずれかを動物に単回投与することを含む、動物を免疫化するための方法に関する。好ましくは、動物を免疫化するための方法は、このような動物への本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって効果的である。
用語「免疫化」は、免疫化される動物に免疫原性組成物を投与し、これによって、このような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫学的応答を生じさせることによる、能動免疫化に関連する。
免疫化は、群れにおける特定のＣＳＦＶ感染の発生の減少、または、特定のＣＳＦＶ感染によって生じるもしくは特定のＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。好ましくは、免疫化は、本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって、群れにおける特定のＣＳＦＶ感染の発生の減少、または、特定のＣＳＦＶ感染によって生じるもしくは特定のＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。

【0063】

本発明の一態様に従うと、本明細書で提供される免疫原性組成物での、必要とする動物の免疫化は、好ましくは本発明に従った免疫原性組成物の単回投与によって、ＣＳＦＶ感染による対象の感染の予防をもたらす。またさらに好ましくは、免疫化は、ＣＳＦＶ感染に対する効果的な、長期の、免疫学的応答をもたらす。前記期間は、２カ月間超、好ましくは３カ月間超、さらに好ましくは４カ月間超、さらに好ましくは５カ月間超、さらに好ましくは６カ月間超、継続することが理解されよう。免疫化は、免疫化された動物の全てにおいて効果的でなくてもよいことが理解される。しかし、この用語は、群れにおける有意な割合の動物が効果的に免疫化されることを要する。
好ましくは、この文脈において、通常は、すなわち免疫化されていないと、ＣＳＦＶ感染によって通常生じるまたはＣＳＦＶ感染に関連する臨床徴候を発症する動物の群れが想定される。群れの動物が効果的に免疫化されているかどうかは、当業者によって、さらなる苦労を伴うことなく決定され得る。好ましくは、免疫化は、所与の群れの動物の少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％における臨床徴候が、発生または重症度において、免疫化されていないまたは本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫化されているがその後ＣＳＦＶに感染している動物と比較して少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、またさらに好ましくは少なくとも３０％、またさらに好ましくは少なくとも４０％、またさらに好ましくは少なくとも５０％、またさらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％低下している場合、効果的であるとされるべきである。

【0064】

本発明の一態様において、動物は豚である。一態様において、動物は子豚である。子豚は通常、３～４週齢よりも若い。一態様において、子豚は、１～４週齢の間にワクチン接種される。一態様において、動物は雌豚である。一態様において、動物は、妊娠中の雌豚である。
本発明の一態様において、免疫原性組成物は、真皮内、気管内、膣内、筋肉内、鼻腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、髄腔内、皮下、皮内、心臓内、葉内（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌ）、髄内、肺内、およびこれらの組み合わせで投与される。しかし、化合物の性質および作用機序に応じて、免疫原性組成物は、他の経路でも投与され得る。
本発明はまた、本発明に従った免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、ＣＳＦに関連する１つまたは複数の臨床徴候の発生または動物における重症度を低減させる方法であって、１つまたは複数の臨床徴候の発生または重症度の低減が、免疫原性組成物を投与されていない動物と比較される方法を提供する。好ましくは、本方法は、単回用量の免疫原性組成物の投与を含み、また、免疫原性組成物のこのような単回投与によって、１つまたは複数の臨床徴候の発生または重症度の低減において効果的である。

【0065】

本明細書において使用される用語「臨床徴候」は、動物のＣＳＦＶ感染の徴候を指す。臨床徴候は、以下でさらに定義される。しかし、臨床徴候としてはまた、限定はしないが、生きている動物から直接観察可能な臨床徴候も含まれる。生きている動物から直接観察可能な臨床徴候の例には、鼻および眼の排出物、嗜眠、咳、喘鳴、動悸、発熱、体重増加または体重減少、脱水、下痢、関節の腫れ、跛行、衰弱、皮膚の蒼白、発育不全、およびそれに類するものが含まれる。Ｍｉｔｔｅｌｈｏｌｚｅｒら（Vet.Microbiol., 2000. 74(4): p. 293-308）は、ＣＳＦの動物実験において臨床スコアを決定するためのチェックリストを開発した。このチェックリストは、活気、身体の緊張、体形、呼吸、歩行、皮膚、眼／結膜、食欲、排便、および強制給餌の食べ残しというパラメータを含む。
好ましくは、臨床徴候は、発生または重症度において、処置されていないまたは本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されているがその後ＣＳＦＶに感染している対象と比較して少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、またさらに好ましくは少なくとも３０％、またさらに好ましくは少なくとも４０％、またさらに好ましくは少なくとも５０％、またさらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは少なくとも７０％、またさらに好ましくは少なくとも８０％、またさらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％低下する。

【0066】

本発明の一態様において、免疫原性組成物は１回投与され、また、このような単回投与によって有効である。
しかし、単回用量投与が好ましいものの、免疫原性組成物は２回または数回投与することもでき、第１の用量は、第２の（ブースター）用量の投与の前に投与される。好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１５日後に投与される。さらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１５～４０日後の間に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１７日後に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１７～３０日後の間に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも１９日後に投与される。またさらに好ましくは、第２の用量は、第１の用量の１９～２５日後の間に投与される。最も好ましくは、第２の用量は、第１の用量の少なくとも２１日後に投与される。２回投与レジメンの好ましい態様において、免疫原性組成物の第１の用量および第２の用量の両方は、同一の量で投与される。第１および第２の用量レジメンに加えて、別の実施形態は、さらなるその後の用量を含む。例えば、第３、第４、または第５の用量を、これらの態様において投与することができる。好ましくは、その後の第３、第４、および第５の用量のレジメンは、第１の用量と同一の量で投与され、用量間の時間枠は、上記の第１の用量と第２の用量との間の時間と一致する。

【0067】

本発明の一態様において、１つまたは複数の臨床徴候は、呼吸窮迫、努力呼吸、咳、くしゃみ、鼻炎、頻呼吸、呼吸困難、肺炎、耳および外陰部の赤／青の変色、黄疸、リンパ球浸潤、リンパ節腫脹、肝炎、腎炎、食欲不振、発熱、嗜眠、乳汁分泌不全（ａｇａｌａｔｉａ）、下痢、鼻からの排出物、結膜炎、進行性の体重減少、体重増加の低減、皮膚の蒼白、胃潰瘍、器官および組織での肉眼的および顕微鏡的な病変、リンパの病変、死亡を免れない状態、ウイルス誘発性の流産、死産、子豚の奇形、ミイラ変性、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一態様において、本発明はまた、
ａ）サンプルを得るステップ、および
ｂ）前記サンプルを免疫試験において試験するステップ
を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明に従った免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法も提供する。

【0068】

用語「免疫試験」は、ＣＳＦＶのＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープに特異的な抗体を含む試験を指す。抗体は、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープに、または野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的であり得る。しかし、用語「免疫試験」は、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープペプチドまたは野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープペプチド（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を含む試験も指す。免疫試験の例としては、任意の酵素免疫学的または免疫化学的検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）、電気化学発光サンドイッチ免疫アッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離－増強ランタニドフルオロ免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）もしくは固相免疫試験、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）、免疫組織染色、ウェスタンブロット分析、または当業者に利用可能なあらゆる他の適切な方法などが含まれる。使用するアッセイに応じて、抗原または抗体は、酵素、フルオロフォア、または放射性同位体によって標識することができる。例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994);およびFrye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987を参照されたい。

【0069】

好ましくは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープに特異的な抗体は、野生型ＣＳＦＶに感染していることが疑われる、または本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物（豚など）の血清中細胞（白血球など）または単離された器官（扁桃腺、脾臓、腎臓、リンパ節、回腸の遠位部分など）のクリオスタット切片におけるＣＳＦＶ抗原を検出するために使用される。このようなケースでは、野生型ＣＳＦＶに感染した動物のサンプルのみが、前記６Ｂ８エピトープ特異的抗体による陽性結果を示す。逆に、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物のサンプルは、本発明に従った６Ｂ８エピトープ内での突然変異を理由に、前記６Ｂ８エピトープ特異的抗体による結果を示さない。代替的な試験では、ＣＳＦＶは、例えば、野生型ＣＳＦＶに感染した、感染していることが疑われる、またはワクチン接種された動物の器官（動物の扁桃腺など）または血清中細胞（白血球など）から単離され、ウイルスでの細胞の感染のために、適切な細胞系（ＳＫ－６細胞またはＰＫ－１５細胞など）とインキュベートされる。複製したウイルスはその後、野外（野生型、疾患に関連する）ＣＳＦＶと本発明に従った組換えＣＳＦＶとの間を区別する６Ｂ８エピトープ特異的抗体を使用して、細胞において検出される。さらに、ペプチドを、非特異的な交差反応性をブロックするために使用することができる。さらに、野生型ＣＳＦＶの他のエピトープに特異的な抗体を、ポジティブコントロールとして使用することができる。

【0070】

さらに好ましくはＥＬＩＳＡが使用され、この場合、感染した豚を、本発明に従ったワクチンを接種された豚から区別するために、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体がマイクロウェルアッセイプレートに架橋される。前記架橋は、好ましくは、例えばポリ－Ｌ－リジンなどのアンカータンパク質を介して行われる。このような架橋を利用するＥＬＩＳＡは、通常、受動的にコーティングされる技術を利用するＥＬＩＳＡと比較した場合、感度が高い。野生型（疾患に関連する）ＣＳＦＶは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体に結合する。野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープに特異的な抗体への野生型ＣＳＦＶウイルスの結合の検出は、ＣＳＦＶに特異的なさらなる抗体によって行うことができる。このようなケースでは、感染した豚のサンプルのみが、６Ｂ８エピトープ特異的抗体による陽性結果を示す。さらに、ペプチドを、非特異的な交差反応性をブロックするために使用することができる。さらに、野生型ＣＳＦＶの他のエピトープに特異的な抗体を、ポジティブコントロールとして使用することができる。

【0071】

あるいは、マイクロウェルアッセイプレートを、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体以外の、ＣＳＦＶに特異的な抗体と架橋させてもよい。野生型（疾患に関連する）ＣＳＦＶは、架橋した抗体に結合する。架橋した抗体への野生型ＣＳＦＶの結合の検出は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に特異的な抗体によって行うことができる。
上記で既に示したように、６Ｂ８エピトープは進化的に保存されており、野生型ＣＳＦＶに特異的である。
したがって、さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡは、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープまたは野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）に対する抗体をサンプルにおいて検出するために使用される。このような試験は、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープペプチドまたは野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープペプチド（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を含む。

【0072】

このような試験は、マイクロウェルアッセイプレートに架橋した本発明に従った置換型６Ｂ８エピトープまたは野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）を有するウェルを例えば含み得る。前記架橋は、好ましくは、例えばポリ－Ｌ－リジンなどのアンカータンパク質を介して行われる。突然変異体または野生型６Ｂ８エピトープを得るための発現系は、当業者に周知である。あるいは、前記６Ｂ８エピトープは、化学的に合成することができる。突然変異６Ｂ８エピトープまたは野生型６Ｂ８エピトープはこうして、本発明に従った試験において使用することができるが、完全なＥ２タンパク質を含むタンパク質または前記６Ｂ８エピトープを含むＥ２タンパク質の断片を、比較的短いエピトープの代わりにそのまま使用することが都合が良い可能性があることが理解されるべきである。特に、エピトープが、標準的なＥＬＩＳＡ試験におけるウェルのコーティング剤に例えば使用される場合、エピトープを含む、より大きなタンパク質をコーティングステップに使用することが、より効率的であり得る。

【0073】

本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むワクチンを接種された動物は、野生型６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生しなかった。しかし、このような動物は、本発明に従った置換型６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生している。その結果、野生型６Ｂ８エピトープでコーティングしたウェルに結合する抗体はない。逆に、ウェルが本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープでコーティングされている場合、抗体は、前記突然変異６Ｂ８エピトープに結合する。
野生型ＣＳＦＶに感染した動物は、しかし、ＣＳＦＶの野生型エピトープに対する抗体を産生している。しかし、このような動物は、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープに対する抗体を産生していない。その結果、本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープでコーティングされたウェルに結合する抗体はない。逆に、ウェルが野生型６Ｂ８エピトープでコーティングされている場合、抗体は、野生型６Ｂ８エピトープに結合する。
本発明に従った突然変異６Ｂ８エピトープまたは野生型ＣＳＦＶの６Ｂ８エピトープ（遺伝子修飾されていない６Ｂ８エピトープ）への抗体の結合は、当業者に周知の方法によって行うことができる。

【0074】

好ましくは、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチタイプのＥＬＩＳＡである。さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡは競合ＥＬＩＳＡである。最も好ましくは、ＥＬＩＳＡは二重競合ＥＬＩＳＡである。しかし、様々なＥＬＩＳＡ技術が当業者に周知である。ＥＬＩＳＡは典型的には、Wensvoort G. et al., 1988 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140)によって、Robiolo B. et al., 2010 (J. Virol. Methods. 166(1-2): 21-27)によって、およびColijn, E.O. et al., 1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)によって記載されている。
本発明の一態様において、免疫試験は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の無傷の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合しているかどうかの試験を含む。本発明の一態様において、免疫試験は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかの試験、および／または、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の突然変異した６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかの試験を含む。このような突然変異した６Ｂ８エピトープは、本明細書において定義される６Ｂ８エピトープにおける突然変異を含む。
本発明の一態様において、免疫学的試験は、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。本発明の一態様において、ＥＬＩＳＡは、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、または二重競合ＥＬＩＳＡであり、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである。
一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸も提供する。

【0075】

用語「核酸」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、または誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチドも二本鎖ポリヌクレオチドも包含する。本発明の核酸は、組換えポリヌクレオチド（すなわち、その天然の背景からの組換え）および遺伝子修飾された形態を包含する。さらに、天然の修飾されたポリヌクレオチド、例えばグリコシル化もしくはメチル化されたポリヌクレオチド、または人工的に修飾されたポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドを含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。さらに、本発明の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、縮重した遺伝子コードを理由として多くのポリヌクレオチドによってコードされ得ることを理解されたい。本発明の一態様において、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸は、核酸が導入されることになる宿主細胞に応じてコドン最適化されている。
一態様において、本発明はまた、本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターも提供する。一態様において、ベクターは発現ベクターである。

【0076】

用語「ベクター」は、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、および人工染色体、例えば細菌または酵母の人工染色体を包含する。さらに、この用語はまた、ゲノムＤＮＡへの標的化構築物のランダムなまたは部位特異的な組み込みを可能にする、標的化構築物も指す。このような標的構築物は、好ましくは、以下に詳述するような相同組換えまたは非相同組換えに十分な長さのＤＮＡを含む。本発明の核酸を包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖および／または選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターは、当技術分野において周知の様々な技術によって宿主細胞に組み込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿もしくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿に、または荷電した脂質との複合体に、またはフラーレンなどの炭素ベースのクラスターに、導入することができる。あるいは、プラスミドベクターは、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスである場合には、ベクターは、宿主細胞に適用する前に、適切なパッケージング細胞系を使用してインビトロでパッケージングしてよい。レトロウイルスベクターは、複製増殖型または複製欠損型であり得る。後者のケースでは、ウイルス増殖は一般に、補完性の宿主／細胞でのみ生じる。さらに好ましくは、ポリヌクレオチドは発現制御配列に作動可能に連結しており、その結果、原核細胞もしくは真核細胞またはこれらの単離画分における発現を可能にする。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当技術分野において周知である。これらは、好ましくは、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに任意に、転写の終結および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが含まれ得る。原核宿主細胞における発現を可能にする、考えられる調節エレメントは、例えば、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または、哺乳動物細胞および他の動物細胞のＣＭＶ－プロモーター、ＳＶ４０－プロモーター、ＲＳＶ－プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ－エンハンサー、ＳＶ４０－エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。さらに、誘導性の発現制御配列を、本発明によって包含される発現ベクターにおいて使用してもよい。このような誘導性ベクターは、ｔｅｔもしくはｌａｃオペレーター配列、または熱ショックもしくは他の環境因子によって誘導可能な配列を含み得る。適切な発現制御配列は、当技術分野において周知である。例えば、この技術は、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)において記載されている。好ましくは、本発明のベクターは、バキュロウイルスベクターである。さらに好ましくは、本発明のベクターは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞における発現のための哺乳動物発現ベクターである。

【0077】

一態様において、本発明はまた、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、または例えば昆虫（ｉｎｓｅｔ）細胞などの真核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はＳＦ９細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。

【0078】

一態様において、本発明はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むか又は本明細書において別様に開示される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法であって、
（ｉ）本明細書において定義される宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離する、および任意に精製するステップ
を含む方法を提供する。

【0079】

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の精製は、例えば、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着した融合タグ又は融合ペプチドを介して、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又は存在する場合はＦｃ断片を介して行うことができる。
一態様において、本発明はまた、（ｉ）Ｅ２タンパク質を発現し得る発現ベクターを有する細胞を培養すること、および（ｉｉ）本明細書において上記で定義されている６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含むＥ２タンパク質または当該Ｅ２タンパク質を含む細胞培養物全体を採取することを含む、免疫原性組成物を調製する方法も提供する。

【0080】

本発明の一態様において、発現ベクターは、本発明の核酸分子を含む組換え哺乳動物発現ベクターである。一態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、商品に由来する。一態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する。一態様において、細胞は哺乳動物細胞である。一態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。

【0081】

一態様において、この方法は、ユーザーマニュアル（改訂版Ｄ．０、２０１８年５月２５日、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１３３）を使用することによって実施される。一実施形態において、ＣＨＯ細胞は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１２７で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞である。一実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞を、例えばＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）を使用して、本発明の組換え哺乳動物発現ベクターに感染させるステップを含む。

【0082】

本発明の一態様において、発現ベクターは、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスである。一態様において、組換えバキュロウイルスは、商品に由来する。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルスという商標で販売されている商品（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に由来する。一態様において、細胞は昆虫細胞である。一態様において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。
本発明の一態様において、本方法は、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製するステップを含む。一態様において、組換えバキュロウイルスは、商品に由来する。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。
本発明の一態様において、本方法は、本発明の組換えバキュロウイルスで細胞を感染させるステップを含む。一実施形態において、細胞は昆虫細胞である。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。

【0083】

本発明の一態様において、本方法は、本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製すること、および組換えバキュロウイルスで昆虫細胞を感染させることを含む。一実施形態において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。
本発明の一態様において、本方法は、（ｉ）本発明の核酸分子を含む組換えバキュロウイルスを調製すること、（ｉｉ）組換えバキュロウイルスで昆虫細胞を感染させること、（ｉｉｉ）昆虫細胞を培養培地において培養すること、および（ｉｖ）本発明のＥ２タンパク質または本発明のＥ２タンパク質を含む細胞培養物全体を採取することを含む。一態様において、組換えバキュロウイルスは、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）バキュロウイルス（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）という商標で販売されている商品に由来する。一実施形態において、昆虫細胞はＳＦ＋細胞である。一実施形態において、ＳＦ＋細胞は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）によって販売されている商品である。

【0084】

本発明の一態様において、本発明の細胞を培養するための培養培地は、当業者によって決定される。一態様において、培養培地は、無血清昆虫細胞培地である。一態様において、培養培地は、Ｅｘ－ＣＥＬＬ ４２０（昆虫細胞用のＥｘ－ＣＥＬＬ（登録商標）４２０無血清培養培地、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１４４２０Ｃ）である。
本発明の一態様において、昆虫細胞は、Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養される。一態様において、昆虫細胞は、最長１０日間、好ましくは約２日間～約１０日間、さらに好ましくは約４日間～約９日間、およびまたさらに好ましくは約５日間～約８日間の期間にわたりインキュベートされる。一態様において、昆虫細胞の培養に適した条件は、約２２～３２℃の間、好ましくは約２４～３０℃の間、さらに好ましくは約２５～２９℃の間、またさらに好ましくは約２６～２８℃の間、および最も好ましくは約２７℃の温度を含む。
本発明の一態様において、本方法は、本発明の細胞培養物を不活化するステップをさらに含む。限定はしないが化学的および／または物理学的処理を含む任意の従来の不活化方法を、本発明の目的に使用することができる。

【0085】

一態様において、不活化ステップは、好ましくは約１～約２０ｍＭの、好ましくは約２～約１０ｍＭの、さらに好ましくは約５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度の、環化バイナリエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含む。一実施形態において、不活化ステップは、ＮａＯＨ中で環化してＢＥＩを形成する２－ブロモエチレンアミンヒドロブロミドの溶液の添加を含む。
一態様において、不活化ステップは、２５～４０℃の間、好ましくは２８～３９℃の間、さらに好ましくは３０～３９℃の間、さらに好ましくは３５～３９℃の間で行われる。一実施形態において、不活化ステップは、２４～７２時間、好ましくは３０～７２時間、さらに好ましくは４８～７２時間行われる。通常、不活化ステップは、検出可能なウイルスベクターの複製がなくなるまで行われる。

【0086】

本発明の一態様において、本方法は、不活化ステップの後に中和ステップをさらに含む。中和ステップは、溶液中の不活化剤を中和する等量の薬剤の添加を含む。一実施形態において、不活化剤はＢＥＩである。一態様において、中和剤はチオ硫酸ナトリウムである。一態様において、不活化剤がＢＥＩである場合、等量のチオ硫酸ナトリウムが添加される。例えば、ＢＥＩが最終濃度５ｍＭまで添加される場合、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液が、全ての残留ＢＥＩを中和するための最終最小濃度５ｍＭとなるまで添加される。一態様において、中和ステップは、不活化剤がＢＥＩである場合、チオ硫酸ナトリウム溶液を最終濃度１～２０ｍＭ、好ましくは２～１０ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭまたは１０ｍＭまで添加することを含む。一態様において、中和剤は、不活化ステップが完了した後、すなわち、ウイルスベクターの複製が検出され得なくなった後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが２４時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが３０時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが４８時間行われた後に添加される。一態様において、中和剤は、不活化ステップが７２時間行われた後に添加される。

【0087】

本発明の一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はさらに精製される。例えば、本発明に従ったＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着している、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又はＦｃ断片などの融合ペプチドを含み得る。Ｈｉｓタグを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性（ニトリロ三酢酸にカップリングされたニッケル²⁺イオン）によって精製することができる。ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体によって精製することができる（市販のキットは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１アガロース親和性ゲル））。Ｆｃ断片に連結されたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、プロテインＡ親和性又はプロテインＧ親和性のいずれかによって精製することができる。

【0088】

一態様において、本発明はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むか又は本明細書において別様に開示される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ、
ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むか又は本明細書において別様に開示される組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法を提供する。

【0089】

一態様において、本発明はまた、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）培地での高密度懸濁培養に適応させたＣＨＯ細胞を増殖させるステップ、
ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は本発明に従った組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法を提供する。

【0090】

一実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する。
一実施形態において、ＣＨＯ細胞は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１２７で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞である。
一実施形態において、この方法で使用される培地は、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１００で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地である。
一実施形態において、適応させたＣＨＯ細胞は、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）を使用することによってトランスフェクトされる。
一実施形態において、ステップｃ）では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、約３２～３７℃、好ましくは約３２℃で培養される。
一実施形態において、ステップｃ）では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される。

【0091】

一実施形態において、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄが、ステップｃ）にて添加される。
一実施形態において、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される。

【0092】

本発明の一態様において、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質はさらに精製される。例えば、本発明に従ったＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に付着している、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、又はＦｃ断片などの融合ペプチドを含み得る。Ｈｉｓタグを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性（ニトリロ三酢酸にカップリングされたニッケル²⁺イオン）によって精製することができる。ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体によって精製することができる（市販のキットは、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ１アガロース親和性ゲル））。Ｆｃ断片に連結されたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、例えば、プロテインＡ親和性又はプロテインＧ親和性のいずれかによって精製することができる。
一態様において、本発明は、ＣＳＦＶに感染した動物を、本発明の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキットを提供する。一態様において、キットは、本明細書において定義される抗体もしくはその抗原結合断片、６Ｂ８エピトープに突然変異を有する本発明の組換えＥ２タンパク質、および／または本明細書において定義される６Ｂ８エピトープを含むＣＳＦＶの野生型Ｅ２タンパク質を含む。キットはまた、使用説明書も含み得る。

【0093】

以下の項もまた本明細書において記載され、本発明の開示の一部である。
１． ６Ｂ８エピトープ内に少なくとも１つの突然変異を含む組換えＣＳＦＶ（古典的豚熱ウイルス）Ｅ２タンパク質であって、未修飾の６Ｂ８エピトープが６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識される、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
２． Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の少なくとも１つの突然変異が、このような突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８モノクローナル抗体の結合の特異的阻害をもたらす、項１に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
３． ６Ｂ８モノクローナル抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、または
（ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、または
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、または
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
項１または２に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0094】

４． ６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、少なくともＥ２タンパク質の１０位、１４位、２２位、２４位、２４位／２５位、４１位、及び／又は６４位にあるアミノ酸残基によって定義される、項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
５． ６Ｂ８モノクローナル抗体によって特異的に認識されるＥ２タンパク質の６Ｂ８エピトープが、少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｅ２４、Ｅ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、および／もしくはＲ６４によって定義される、または少なくともＥ２タンパク質のアミノ酸残基Ｓ１４、Ｇ２２、Ｇ２４、Ｇ２４／Ｇ２５、Ｙ１０、Ｄ４１、および／もしくはＲ６４によって定義される、項１～３のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
６． Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位／２５位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位での置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位での置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位での置換を含む、項１～５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
７． Ｅ２タンパク質の２４位のアミノ酸がＲに置換されており、Ｅ２タンパク質の２４位及び２５位のアミノ酸がそれぞれＲ及びＤに置換されており、Ｅ２タンパク質の１４位のアミノ酸がＫ、Ｑ、若しくはＲに置換されており、Ｅ２タンパク質の２２位のアミノ酸がＡ、Ｒ、Ｑ、若しくはＥに置換されており、Ａ及びＲが好ましく、Ｅ２タンパク質の１０位のアミノ酸がＡ若しくはＰに置換されており、Ｅ２タンパク質の４１位のアミノ酸がＡ、Ｎ、若しくはＥに置換されており、並びに／又はＥ２タンパク質の６４位のアミノ酸がＡ、Ｓ、若しくはＥに置換されており、Ａ及びＳが好ましい、項１～６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0095】

８． Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥ若しくはＧからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥ若しくはＧからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、並びに／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）を含む、項１～７のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
９． ６Ｂ８エピトープ内のアミノ酸置換が、Ｅ２タンパク質の２４位にアミノ酸Ｒ、Ｄ、若しくはＩ、Ｅ２タンパク質の２５位にアミノ酸Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰ、Ｅ２タンパク質の１４位にアミノ酸Ｋ、Ｑ、若しくはＲ、Ｅ２タンパク質の２２位にＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳ、Ｅ２タンパク質の１０位にアミノ酸Ａ若しくはＰ、Ｅ２タンパク質の４１位にアミノ酸Ａ、Ｎ、若しくはＥ、及び／又はＥ２タンパク質の６４位にアミノ酸Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷを含む突然変異６Ｂ８エピトープをもたらす、項１～８のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0096】

１０． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｃ株又は野外株ＱＺ０７若しくはＧＤ１８に由来する、項１～９のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１１． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、野外株ＱＺ０７に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲへの置換及びアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換をさらに含んでもよい、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１２． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、野外株ＧＤ１８に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＥからＲ、Ｄ、若しくはＩへの置換（Ｒが好ましい）及びアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、若しくはＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫ、Ｑ、若しくはＲへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換をさらに含んでもよい、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0097】

１３． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｃ株に由来し、かつＥ２タンパク質のアミノ酸２４位でのＧからＲ、Ｄ、又はＩへの置換（Ｒが好ましい）、及びＥ２タンパク質のアミノ酸２５位でのＧからＤ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｅ、又はＰへの置換（Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、及びＶが好ましい）を含み、また、Ｅ２タンパク質のアミノ酸１４位でのＳからＫへの置換、又はＥ２タンパク質のアミノ酸２２位でのＧからＡ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、若しくはＳへの置換（Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＳが好ましい）、並びにＥ２タンパク質のアミノ酸１０位でのＹからＡ若しくはＰへの置換、Ｅ２タンパク質のアミノ酸４１位でのＤからＡ、Ｎ、若しくはＥへの置換、及び／又はＥ２タンパク質のアミノ酸６４位でのＲからＡ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ｌ、Ｐ、Ｋ、若しくはＷへの置換（Ａ、Ｋ、及びＷが好ましい）からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる置換をさらに含んでもよい、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。

【0098】

１４． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、表１～７において定義されるＥ２タンパク質のアミノ酸位置に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１５． 配列番号１５～２０、２２～３３、３５～４０、４９～７２、および７４－８１からなる群から選択されるアミノ酸配列の１つを含む、項１～１０のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１６． 豚Ｆｃ断片などのＦｃ断片が、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に連結されており、好ましくは、豚Ｆｃ断片などのＦｃ断片が、好ましくはペプチドリンカーを介してＥ２タンパク質のＣ末端に連結されている、項１～１５のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質。
１７． 項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする組換え核酸。
１８． 項１７の核酸を含むベクターであって、好ましくは、哺乳動物発現ベクターであるベクター。
１９． 項１７に記載の核酸又は項１８に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくはＣＨＯ細胞である宿主細胞。
２０． 項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む組換えＣＳＦＶ。

【0099】

２１． 弱毒化されている、請求項２０に記載の組換えＣＳＦＶ。
２２． 項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、項１７に記載の組換え核酸、項１８に記載のベクター、項１９に記載の宿主細胞、及び／又は項２０若しくは２１に記載の組換えＣＳＦＶを含む免疫原性組成物。
２３． ワクチン、好ましくはマーカーワクチンまたはＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種された動物との間の区別）ワクチンである、項２２に記載の免疫原性組成物。
２４． 項２２または２３に記載の免疫原性組成物を、動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法において使用するための、項２２または２３に記載の免疫原性組成物。
２５． 項２２又は２３に記載の豚である動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。
２６． 項２２又は２３に記載の子豚である動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。

【0100】

２７． 項２２又は２３に記載の１～４週齢の子豚である動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。
２８． 項２２又は２３に記載の雌豚である動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。
２９． 項２２又は２３に記載の妊娠中の雌豚である動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。
３０． １回のみ投与される、項２２又は２３に記載の動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防及び／又は処置する方法において使用するための、項２２又は２３に記載の免疫原性組成物。
３１． 動物に１回のみ投与され、かつ、免疫原性組成物の前記単回投与の後にＣＳＦＶに関連する疾患の予防および／または処置において効果的である、項２２または２３に記載の動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法において使用するための、項２２または２３に記載の免疫原性組成物。

【0101】

３２． １回または複数回投与される、項２２または２３に記載の動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法において使用するための、項２２または２３に記載の免疫原性組成物。
３３． 動物に１回または複数回投与され、かつ、免疫原性組成物の前記単回投与または複数回投与の後にＣＳＦＶに関連する疾患の予防および／または処置において効果的である、項２２または２３に記載の動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法において使用するための、項２２または２３に記載の免疫原性組成物。
３４． 項２２または２３に記載の免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与するステップを含む、動物におけるＣＳＦＶに関連する疾患を予防および／または処置する方法。
３５． ａ）サンプルを得るステップ、および
ｂ）前記サンプルを免疫試験において試験するステップ
を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、項２２または２３に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別する方法。

【0102】

３６． 免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープまたはその抗原結合断片を特異的に認識する抗体がサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に結合し得るかどうかを試験するステップを含む、項３５に記載の方法。
３７． 免疫試験が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップ、および／または組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の突然変異した６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体がサンプル中に存在するかどうかを試験するステップを含む、項３５または３６に記載の方法。
３８． 免疫試験が、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、好ましくは二重競合ＥＬＩＳＡである、項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
３９． ６Ｂ８エピトープを特異的に認識する抗体が、
（ｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される、または
（ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（Ｖ_H）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む、または
（ｉｉｉ）受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、または
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、
項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
４０． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープまたはその抗原結合断片を特異的に認識する抗体を含む、ＣＳＦＶに感染した動物を、項２２または２３に記載の免疫原性組成物をワクチン接種された動物から区別するためのキット。

【0103】

４１． （ｉ）項１９に記載の宿主細胞を、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を単離し、任意に精製するステップ
を含む、項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を産生するための方法。
４２． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞を培地での高密度懸濁培養に適応させるステップ、
ｂ）ステップａ）の適応させたＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法。

【0104】

４３． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＣＨＯ細胞において産生するための方法であって、
ａ）培地での高密度懸濁培養に適応させたＣＨＯ細胞を増殖させるステップ、
ｂ）ステップａ）のＣＨＯ細胞に、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、好ましくは、表１～７において定義される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、又は項１～１６のいずれか１項に記載の組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップｂ）のトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、
ｄ）組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を回収し、任意に精製するステップ
を含む方法。

【0105】

４４． ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約３２～３７℃、好ましくは、約３２℃で培養される、項４２又は４３に記載の方法。
４５． ステップｃ）において、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、約５～８％ＣＯ₂の加湿雰囲気で培養される、項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
４６． 組換えＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、トランスフェクションの約２～１４日後、例えば、トランスフェクションの約４～１２日後、又はトランスフェクションの約８～１０日後に回収される、項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
４７． ＣＨＯ細胞が、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１２７で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞である、項４２～４６のいずれか１項に記載の方法。
４８． 上記方法で使用される培地が、Ｇｉｂｉｃｏからカタログ番号Ａ２９１００で販売されているＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地である、項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
４９． 適応させたＣＨＯ細胞が、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）を使用することによってトランスフェクトされる、項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。

【0106】

５０． ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄが、ステップｃ）において添加される、項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。
５１． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質がさらに精製される、項４２～５０のいずれか１項に記載の方法。
５２． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が融合ペプチドを含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の精製が、融合ペプチドに特異的に結合するマトリックスに対する親和性によって行われる、項４２～５１のいずれか１項に記載の方法。
５３． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、Ｈｉｓタグを融合ペプチドとして含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＨｉｓタグを介してＮｉ－ＮＴＡに結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＮｉ－ＮＴＡから放出させることによって精製される、項４２～５２のいずれか１項に記載の方法。
５４． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＦＬＡＧタグを融合ペプチドとして含み、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、ＦＬＡＧタグを介して、ＦＬＡＧタグに特異的に結合するモノクローナル抗体に結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をそのようなモノクローナル抗体から放出させることによって精製される、項４２～５２のいずれか１項に記載の方法。
５５． ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質がＦｃ断片に連結されており、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をＦｃ断片を介してプロテインＡ又はプロテインＧに結合させ、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質をプロテインＡ又はプロテインＧから放出させることによって精製される、項４２～５２のいずれか１項に記載の方法。

【実施例】

【0107】

以下の実施例は、本発明を例示的な様式でさらに説明する。本発明は以下に記載されるような実施例のいずれかに限定されるものではないことを理解されたい。当業者には、これらの実施例の性能、結果、および所見が本発明の全体的な記載に照らしてより広い意味で適合および適用され得ることが理解される。
材料および方法
１． 細胞の培養
ｓｆ９細胞系を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と共にＥｘｃｅｌｌ ４２０で培養し、ＣＯ₂の不存在下で２７℃でインキュベートした。
ｓｆ＋細胞系をＥｘｃｅｌｌ ４２０で培養し、２７℃の振とう器で１２０ｒｐｍの速さでインキュベートした。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と共に培養し、５％ＣＯ₂の存在下で３７℃でインキュベートした。

【0108】

２． ＱＺ０７－Ｅ２及びＱＺ０７－Ｅ２突然変異のためのｐＶｌ１３９３ベースシャトルプラスミドの構築
ＱＺ０７－Ｅ２配列、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＲＤ配列、およびＱＺ０７－Ｅ２－ＫＡＲＤ配列を、昆虫発現系に従ってそれぞれコドン最適化し（それぞれ配列番号４４～４６）合成した。可溶性かつ分泌された形態のＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な最適化配列において欠失させ、一方、Ｅ１タンパク質の最後の２１ａａをシグナルペプチドとして付加した。発現させようとしているＥ２構造の略図を図１に示した。それぞれ合成された配列を、ＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ ＩによってｐＶＬ１３９３シャトルプラスミドにクローニングして、さらなるコトランスフェクションのためのｐＶＬ１３９３－シャトルプラスミドを完成させた。ＣＳＦＶ Ｅ２および６Ｂ８エピトープの突然変異を有するＣＳＦＶ Ｅ２の全構築プロセスは、図２を参照する。ＫＡＲＤは、Ｓ１４Ｋ、Ｇ２２Ａ、およびＥ２４Ｒ／Ｇ２５Ｄ突然変異を意味し、アミノ酸の番号付けは、配列番号９などのＥ２タンパク質を参照している。ＫＲＤ（Ｓ１４Ｋ、およびＥ２４Ｒ／Ｇ２５Ｄ）などの突然変異の他の組み合わせもまた、Ｅ２タンパク質にそれぞれ導入した。

【0109】

Ｃ－Ｅ２配列およびＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤ配列（それぞれ配列番号４７および４８）をそれぞれ合成した。可溶性かつ分泌された形態のＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４２個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な配列において欠失させ、一方、Ｅ１タンパク質の最後の１６ａａをシグナルペプチドとして付加した。発現させようとしているＥ２構造の略図は、図１に示すものと同一であった。それぞれ合成された配列を、ＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ ＩによってｐＶＬ１３９３シャトルプラスミドにクローニングして、さらなるコトランスフェクションのためのｐＶＬ１３９３－シャトルプラスミドを完成させた。ＣＳＦＶ Ｅ２および６Ｂ８エピトープの突然変異を有するＣＳＦＶ Ｅ２の全構築プロセスは、図２を参照する。ＫＡＲＤは、Ｓ１４Ｋ、Ｇ２２Ａ、およびＧ２４Ｒ／Ｇ２５Ｄ突然変異を意味し、アミノ酸の番号付けは、配列番号２１などのＥ２タンパク質を参照している。

【0110】

３． Ｅ２発現カセットを有する組換えバキュロウイルスの構築
１ウェルのＳＦ９細胞（１．０×１０⁶個）を、トランスフェクションのために６ウェルプレート内に調製し、別のウェルを、細胞コントロールとして使用した。細胞を１時間インキュベーションした後に、表面全体に等しく分配した。ＤＮＡリポプレックストランスフェクション混合物を以下のように調製した：１つの試験管において、０．５ｍｌの無血清グレース昆虫培地（添加物なし）および３μｌのＤＮＡシャトルトランスフェクション試薬の混合物を添加した。別の試験管において、１μｌのサファイアバキュロウイルスＤＮＡ、１μｇのトランスファープラスミド、および０．５ｍｌの無血清グレース昆虫培地（添加物なし）を添加した。両試験管の内容物を１つにまとめ、穏やかに混合し、そして室温で２０分間置いた。培地を細胞から除去し、単層を、１ｍｌの無血清グレース昆虫培地（添加物なし）で毎回２回ずつすすぎ、次いで培地を細胞から除去し、そしてＤＮＡ／トランスフェクション試薬混合物を添加した。細胞単層を４～５時間、２７℃でインキュベートし、そして、トランスフェクション混合物を、２ｍｌのＥｘｃｅｌｌ ４２０および５％ＦＢＳで置き換えた。インキュベーションを２７℃で５～６日間継続した。細胞および細胞培養培地を、３０００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離機によって回収した。

【0111】

４． 組換えバキュロウイルスでのプラーク精製プロセス
ｓｆ９細胞（１．５×１０⁶個細胞／ウェル）を有する６ウェルプレートを準備し、室温で１時間置いた。各ウイルスの１０^-1～１０^-6希釈の１０倍連続希釈物（５０μＬのウイルスおよび４５０μＬの培地）を調製した。細胞培養培地をプレートから除去し、ウェル当たり１００μＬの１０^-3～１０^-6希釈のウイルスを、各皿の中央に滴下様式で添加した（希釈当たり２つのウェルを感染させた）。次いで、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション期間の間、１％（ｗ／ｖ）ＬＧＴアガロース培地を３７℃の水浴で調製した。ウイルス接種材料を各ウェルから除去し、そして２ｍｌの１％（ｗ／ｖ）ＬＧＴアガロース培地をピペッティングし、各ウェルに被せる。プレートを、固まるまで、室温で約１５分間インキュベートした。次いで、ウェル当たり１ｍｌの昆虫細胞培養培地をアガロースオーバーレイの一番上に添加し、２７℃で５日間インキュベートした。最後に、液体オーバーレイを除去し、１ｍｌのニュートラルレッド（培地で１：２０）を各ウェルに添加し、２～４時間、２７℃でインキュベートした。プラークを透明にするために、皿を反転させて４時間暗所に置いた。プラーク数を数え、そしてウイルス力価を計算した。個々のプラークをピペットチップで採取し、そして２００μＬの培地に溶解し、増殖するまで４℃で保存した。

【0112】

５． Ｅ２タンパク質の精製
３００ｍｌの培養上清を遠心分離し、その後、濾過した。濾過上清をＮｉセファロースｅｘｃｅｌビーズと２時間インキュベートして、標的タンパク質を捕捉した。ビーズをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次いで、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭのイミダゾールをそれぞれ含有する緩衝液で洗浄し、最後に、２００ｍＭのイミダゾールおよび５００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液によって溶出した。ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを行って、標的タンパク質の純度および濃度を確認した。

【0113】

６． ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴ及びＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－突然変異のためのＥ２発現カセットを有する組換えプラスミドの構築、並びにＣＨＯ細胞での発現
ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴ配列（ＣＳＦＶ Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質）及び６Ｂ８エピトープ突然変異を有するＣＳＦＶ Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質を、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の使用説明書に従ってコドン最適化及び合成した。可溶性かつ分泌された形態のＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な最適化配列において欠失させ、一方、Ｅ１タンパク質の最後の２１個のａａをシグナルペプチドとして付加した。また、Ｅ２タンパク質とＦｃ断片の間にペプチドリンカーを付加した。ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴ配列（「ＱＺ０７－Ｅ２－ＷＴ－ＦＬ－Ｆｃ」ともいう）のアミノ酸配列を配列番号９７に示した。合成した配列をそれぞれｐＣＤＮＡ３．４プラスミドにクローニングした。ＣＳＦＶ Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質及び６Ｂ８エピトープ突然変異（６４位での突然変異など）を有するＣＳＦＶ Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質の構築プロセス全体は、図２を参照することができる。

【0114】

また、トランスフェクション及び培養を、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系ガイドの使用説明書に従うことによって行った。
トランスフェクションの前日（－１日目）、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）培養物を、３×１０⁶～４×１０⁶生存細胞／ｍＬの最終密度に分割し、細胞の一晩増殖を可能にした。トランスフェクションの当日（０日目）に、生存細胞密度及び生存率を決定した。細胞が約７×１０⁶～１０×１０⁶生存細胞／ｍＬの密度に達し、生存率が９５～９９％だったら、細胞を、新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で６×１０⁶生存細胞／ｍＬの最終密度に希釈した。フラスコを穏やかに回旋させて細胞を混合した。冷却試薬（４℃）を使用してＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製した。試薬を単に冷蔵庫から取り出し、ＤＮＡ複合体形成を開始させた。以下のステップが含まれていた：ａ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬ボトルを４～５回を穏やかに逆さにして混合するステップ、ｂ）プラスミドＤＮＡを冷却ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、チューブを回旋させることによって及び／又は逆さにすることによって混合するステップ、ｃ）ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬をＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、チューブを回旋させることによって及び／又は逆さにすることによって又は２～３回穏やかにピペッティングすることによって混合し、チューブを回旋させることによって又は逆さにすることによって混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体（ステップｄからの）を室温で１～５分間インキュベートし、次いで溶液をゆっくりとシェーカーフラスコに移し、添加中はフラスコを穏やかに旋回させるステップ。１日目、トランスフェクションの翌日（１日目、トランスフェクションの１８～２２時間後）、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄをフラスコに添加し（ガイドに従った容積を添加）、続いて添加中はフラスコを穏やかに回旋させた。フラスコを、空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気を有する３２℃インキュベーターに移し、振盪しながら６～１０日間培養した。細胞培養培地を、４℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離することによって回収した。

【0115】

７． Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質及び６Ｂ８エピトープ突然変異を有するＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製
Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質及び６Ｂ８エピトープ突然変異を有するＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、それぞれ、ＴｈｅｒｍｏのプロテインＡアガロースを使用することによって実施した。精製溶液は、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）を含む。精製プロセスは、以下のステップを含む：プロテインアガロース及び全ての緩衝液を室温に平衡化するステップ；カラムに付属の使用説明書に従って、カラムに、０．５ｍｌ（ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴ及び６４位の突然変異などのＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ突然変異のため）の樹脂スラリーを慎重に充填するステップ；５ｍｌの結合緩衝液を添加することによってカラムを平衡化し、溶液がカラムから排出されることを可能にするステップ；サンプルをプロテインＡカラムにアプライする前に結合緩衝液で１：２に希釈して、最適な結合のために適正なイオン強度及びｐＨを維持するステップ；希釈したサンプルをカラムにアプライし、サンプルが樹脂へと完全に流れ込むことを可能にするステップ；１０ｍｌの結合緩衝液でプロテインＡカラムを洗浄するステップ；５ｍＬの溶出緩衝液で抗体を溶出し、画分を回収するステップ；１００μｌの中和緩衝液を１ｍｌの溶出物に添加することによって、溶出画分を生理学的ｐＨへと直ちに調整するステップ；溶出物を遠心分離フィルターに移し、６ｍｌのＰＢＳを添加するステップ；チューブを１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離するステップ；１０ｍｌのＰＢＳを使用してチューブを洗浄するステップ；遠心分離ステップを繰り返して、サンプルを１～２ｍｌに濃縮するステップ；Ｑｕｂｉｔキットを使用して、精製緩衝液交換サンプルを測定するステップ；並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって産物を確認するステップ。

【0116】

（実施例１）
ＤＩＶＡ部位の同定および組み込み
所望の新規なワクチンの主要な特徴は、ワクチン接種された動物を、感染した動物から区別する（ＤＩＶＡ）その能力である。ＤＩＶＡ特徴は、従来のＣＳＦＶ Ｅ２サブユニットワクチンからの本質的な改善であり、重要な技術的利点を有する。ＤＩＶＡ特徴を導入する戦略は、免疫優性のＥ２タンパク質の表面における１つまたは複数の重要なエピトープを改変すること、および、ＥＬＩＳＡを使用して、野生型エピトープを認識する抗体の不存在を、ワクチン接種の指標として示すことである（負のＤＩＶＡ）。

【0117】

この戦略を実行するために、本発明者らは、強力に中和性のマウスｍＡｂ ６Ｂ８を選択する。ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体６Ｂ８を浙江大学から入手し、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣ（（ＣＨＩＮＡ ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＴＹＰＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ）、武漢大学、Ｗｕｈａｎ ４３００７２、Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）に、２０１８年６月１３日に寄託した。モノクローナル抗体６Ｂ８のシーケンシングによって、この抗体が、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を有することが明らかになった。この抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔの方法などの当技術分野において公知の様々な方法によって容易に決定することができる。例えば、ｍＡｂ ６Ｂ８は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３で示されるアミノ酸配列のＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号６で示されるアミノ酸配列のＶＬ ＣＤＲ３を含む。

【0118】

１． ６Ｂ８ ｍＡｂの特徴付け
ｍＡｂ ６Ｂ８をほとんどのＣＳＦＶに使用できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ｍＡｂ ６Ｂ８と、様々なＣＳＦウイルス、例えば、群１のＣＳＦＶ（Ｓｈｉｍｅｎ株およびＣ株を含む）ならびに群２のＣＳＦＶ（ＱＺ０７およびＧＤ１８を含む）との結合、コントロールとしての２つのＢＶＤＶとの結合を試験した。結果を図３に示した。遺伝子型群２のさらなる８つの野外ＣＳＦＶ単離体もまた、６Ｂ８ ｍＡｂ陽性として試験した（データは示していない）。これらのデータは、６Ｂ８が、ＣＳＦウイルスのほとんどに存在する保存されたエピトープを認識するが、ＢＶＤＶウイルスとは反応しないことを示した。

【0119】

２． ６Ｂ８の結合のための重要なアミノ酸の同定
Ｃ株ウイルスをｍＡｂ ６Ｂ８の存在下でＰＫ／ＷＲＬ細胞培養物において連続継代した後、エスケープ突然変異体が生じ、これは、中和濃度の６Ｂ８抗体の存在下で成長することができる。このようなエスケープ突然変異体の４つのクローンを得、これらは全て、６Ｂ８の結合からのエスケープを生じた。これらのＥ２遺伝子をシーケンシングし、シーケンシングの結果は、２つのコドンにおける２つのヌクレオチド突然変異（ＧＧＡＧＧＴからＡＧＡＧＡＴ）を示した。これらの変化は、連続する２４位および２５位での２つのアミノ酸突然変異に翻訳された（Ｇｌｙ－ＧｌｙからＡｒｇ－Ａｓｐ、またはＧＧからＲＤ）。
次いで、Ｅ２配列のアラインメント（ＱＺ０７、ＧＤ１８、ＧＤ１９１、およびＣ株）をＢＶＤＶおよび他のペスチウイルスのＥ２と行って、６Ｂ８結合のための他の潜在的な重要なアミノ酸を同定した（図４）。このアプローチによって、１４位および２２位のアミノ酸などのさらなる潜在的な重要なアミノ酸が同定された。

【0120】

全てのこれらの潜在的な突然変異（Ｓ１４Ｋ、Ｇ２２Ａ、Ｅ２４Ｒ／Ｇ２５Ｄ）をＥ２発現ベクターに個々に導入して、６Ｂ８結合に対するその影響を試験した。Ｅ２遺伝子をｐＣＩ－ｎｅｏ－Ｔａｇベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１８４１）にクローニングして、発現ベクターを得た。Ｅ２タンパク質の正確な発現を確認した後、全ての突然変異をＥ２発現ベクターに導入した。これらのベクターを次いで、２４ウェルプレート内でリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３００００１５）を使用してＰＫ／ＷＲＬ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、次いで、０．１％トリトンＸ－１００で処理した。細胞を次いで、ＩＦＡ（免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌｕｏｓｃｅｎｔ）アッセイ）試験において、ｍＡｂ ６Ｂ８またはＣＳＦＶに対するウサギポリクローナル抗体（修飾された６Ｂ８エピトープを有するＣＳＦＶを検出するためのポジティブコントロールとして使用した）、および対応するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート型二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１２０６）で染色する。図５Ａに示すように、顕微鏡的検査によって、Ｓ１４Ｋ、Ｇ２２Ａ、Ｅ２４Ｒ／Ｇ２５Ｄ突然変異が６Ｂ８結合の無効化に重要であることが明らかとなった。

【0121】

本発明者らはまた、６Ｂ８抗体との結合に対する１４位、２２位、２４位、および２５位の他の突然変異の影響を個別に試験した。図５Ｂに示すように、突然変異Ｓ１４Ｑ、Ｓ１４Ｒ、およびＧ２２Ｒは、６Ｂ８の結合を完全に無効化したが、Ｇ２２Ｅ、Ｇ２２Ｑは、６Ｂ８の結合に部分的に影響し、このことは、１４位および２２位が６Ｂ８の結合に重要であることをさらに示している。図５Ｃに示すように、単一の突然変異Ｇ２４Ｋ（Ｃ株で）は６Ｂ８の結合を完全に無効化し、このこともまた、２４位が６Ｂ８の結合に重要であることを裏付けている。Ｇ２５Ｓ単独では、６Ｂ８の結合を無効化することはできない。しかし、２５位のＧｌｙからＡｓｐへの突然変異は２４位での突然変異と共に現れるため、これら２つの突然変異は１つの突然変異（２４／２５突然変異）とみなすことができる。
この結果は、１４位、２２位、２４位、および／または２４位／２５位での突然変異をＤＩＶＡに使用し得ることを示唆している。この結果はまた、突然変異したＥ２タンパク質がＣＳＦＶに対するポリクローナル抗体によって依然として認識され得ることから、６Ｂ８エピトープの突然変異がＥ２タンパク質の全体的な免疫原性をほとんど変化させないことも示唆している。

【0122】

（実施例２）
バキュロウイルス発現系の構築
各構築物のバキュロウイルス発現系を、市販のキット（ＳａｐｐｈｉｒｅバキュロウイルスＤＮＡおよびトランスフェクションキット：Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＢＰ－ＢＶＤ－１０００２９）による、ｐＶｌ１３９３－ＱＺ０７－Ｅ２、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＡＲＤ、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＲＤ、Ｃ－Ｅ２、およびＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤと、バキュロウイルスゲノムＤＮＡとの、ｓｆ９細胞へのコトランスフェクションによって構築し、そして、各Ｅ２発現カセットを有する組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞系でのプラーク精製によって精製した。トランスフェクトした細胞を６ウェルプレートで培養し、２７℃で５日間インキュベートした。トランスフェクトした各サンプルの上清を回収し、さらなるプラーク精製のために４℃で保存した。
プラーク精製アッセイを次いで、上記方法で記載されているように、各構築物について回収された上清で行った。２ラウンドの精製の後、各Ｅ２発現カセットを有する最終的な組換えバキュロウイルスが成功裏に構築された。

【0123】

（実施例３）
Ｅ２およびＥ２－ＫＡＲＤまたはＥ２－ＫＲＤの発現および精製のスケールアップ
ＱＺ０７－Ｅ２、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＡＲＤ、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＲＤ、Ｃ－Ｅ２、およびＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤ発現カセットを有する組換えバキュロウイルスを、ＭＯＩ５でのＳＦ＋細胞系の感染によって増幅させた。感染した各ＳＦ＋細胞から回収された３００ｍｌの上清を、方法で記載されているように、精製に使用した。
最終産物を、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングアッセイの両方によって検証した。精製されたＥ２は、二量体形態で１１０ｋＤａおよび一量体形態で５５ｋＤａの正確な分子量を示した（図６Ａ）。
さらなるドットブロットアッセイは、精製されたＱＺ０７－Ｅ２－ＫＡＲＤ、ＱＺ０７－Ｅ２－ＫＲＤ、およびＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤと、６Ｂ８ ｍＡｂとの反応を示さず（図６Ｂ）、このことは、Ｅ２の各ＤＩＶＡが成功裏に精製されたこと、およびサブユニットワクチンとしてさらに適用され得ることを示している。結果はまた、突然変異したＥ２タンパク質が、複数の回復期の豚血清およびＣ株をワクチン接種された血清によって依然として認識され得ることから、６Ｂ８エピトープの突然変異がＥ２タンパク質の全体的な免疫原性をほとんど変化させないことも示唆している。

【0124】

（実施例４）
組換えプラスミド－ＣＨＯ発現系の構築及び精製
ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－ＷＴ配列及びＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－６４位突然変異を、ＣＨＯ発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の使用説明書に従ってコドン最適化及び合成した。可溶性かつ分泌された形態のＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な最適化配列において欠失させ、一方、Ｅ１タンパク質の最後の２１個のａａをシグナルペプチドとして付加した。また、Ｅ２タンパク質とＦｃ断片の間にペプチドリンカーを付加した。合成した突然変異配列をそれぞれ、ｐＣＤＮＡ３．４プラスミドにクローニングした。次いで、各構築物のトランスフェクション及び培養を、上記の方法に記載のように実施した。最後に、各構築物を含む上清の回収に成功した。

【0125】

Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質及び６４位に６Ｂ８エピトープ突然変異を有するＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製を、それぞれ、ＴｈｅｒｍｏのプロテインＡアガロースを使用することによって実施した。次いで、上記の方法に記載のように精製プロセスを実施した。Ｅ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製産物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって確認した（図７）。６４位に６Ｂ８エピトープ突然変異を有するＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製産物も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって確認した。精製産物は、ＷＨ３０３染色及びＳＤＳ－ＰＡＧＥではＥ２－Ｆｃ融合体タンパク質と同様の結果を示すが、６Ｂ８染色については負の結果を示す。

【0126】

（実施例５）
Ｅ２およびＥ２－ＫＡＲＤの有効性の評価
この実施例の目的は、３週齢の子豚における候補サブユニットワクチンの有効性を評価することであった。
２つのＩＶＰ（試験用獣医医薬品（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））である、実施例２で示した免疫賦活化したＣ－Ｅ２およびＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤを、有効性の評価にかける。
簡潔に述べると、全部で２０頭の子豚（３週齢）を４つの群（群１、２、３、および４）に割り当て、群１（Ｃ－Ｅ２）および群２（Ｃ－Ｅ２－ＫＡＲＤ）でそれぞれ５頭の子豚をＩＶＰ試験に使用し、一方、群３の別の５頭の子豚をチャレンジコントロールとして用いた。群４の残りの５頭の子豚は、厳密な（ネガティブ）コントロールとして用いた。０日目に、群１および群２の動物に、子豚当たり２ｍＬのＳｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６アジュバントＣ－Ｅ２（５４．２μｇ／ｍｌ）またはＣ－Ｅ２－ＫＡＲＤ（５５．２μｇ／ｍｌ）をそれぞれ接種した（ＩＭ）。群３には、０日目に、２ｍＬのＰＢＳ＋アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ ２０６）を接種し（ＩＭ）、チャレンジコントロールとして用いた。群１、２、および３の動物に、１０⁵ＭＬＤ／ｍＬ以上の用量のＣＳＦＶ Ｓｈｉｍｅｎ株を２１日目に接種した（ＩＭ）。全ての子豚は、０日目に、臨床的に健康であり、ＣＳＦＶ抗体およびＰＲＲＳＶ抗体を有しておらず、また、ＢＶＤＶ、ＰＲＶを含む抗原を有していなかった。全ての動物は、免疫化の時点で健康であった。

【0127】

直腸温および臨床的所見を、２１日目～３７日目まで、１日に１回回収した。血清サンプルを、－７日目から開始して７日間ごとに回収した。２１日目、２４日目、２８日目、３１日目、および３７日目（チャレンジ後０日目、３日目、７日目、１０日目、１６日目）に、全ての動物の全血サンプルおよび鼻スワブ（ｓｗａｐ）サンプルを回収した。
体温
図８に示すように、チャレンジコントロール群（群３）の平均体温はチャレンジ後に大きく変動し、豚が瀕死の状態となると体温は低下した。群１および群２の体温は、チャレンジ後の数日間（２日目～４日目）以内に高く上昇したが、すぐに、厳密なコントロール群と類似のレベルまで低下している。
白血球数
図９に示すように、チャレンジコントロール群の白血球数はチャレンジ後に大きく減少したが、ワクチン接種群における動物の白血球数はチャレンジ後にわずかに減少し、その後、上昇した。

【0128】

死亡率
図１０に示すように、チャレンジコントロール群では子豚は全て死亡した（群３）。他の群では死亡した子豚はいなかった。
臨床的所見
臨床的所見は、表８に示すような、活気、身体の緊張（こわばり、けいれん）、体形（身体状態、筋肉組織の痩せ）、呼吸、歩行、皮膚、結膜の外観、食欲、および排便の評価からなる。ゼロは臨床徴候がないことを示し、臨床スコアの増大は、臨床徴候の重症度の程度の増大を示す。個々の動物が２を上回る全臨床スコアを示す場合、３つの連続的な所見ポイントが、ＣＳＦに関連する臨床徴候として考慮される。

【0129】

【表9】

図１１に示すように、チャレンジコントロール群（群３）の平均臨床スコアは、チャレンジ後に増々と上昇した。群１、群２、および群４の平均臨床スコアは、研究中、全て０であった。

【0130】

ウイルスの単離
全血サンプル、鼻スワブサンプル、および扁桃腺サンプルにおけるウイルスの単離を、当技術分野における標準的な方法によって決定した。結果を以下の表９に示す。群１および群２から得た全てのサンプルは、全ての回収されたサンプルからのＶＩ（ウイルス単離）が陰性であった。

【0131】

【表10】

【0132】

血清応答
サンプルの抗体力価を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（カタログ番号９９－４３２２０）を使用して試験した。図１２で見ることができるように、２つのＩＶＰ群の抗体力価は、２１日目で陽性（＞４０％）であった。
結論
豚は、２つのＩＶＰをワクチン接種された後に防御され、死亡率および罹患率は全て０％であった。ウイルス血症または遮蔽はＩＶＰ群から検出され得ず、ＣＳＦＶ陽性の扁桃腺組織は見られなかった。２１日目の血清は、２つのＩＶＰ群で全て陽性であった。ＤＩＶＡ突然変異の導入（６Ｂ８エピトープへの）は、有効性に影響していない。

【0133】

（実施例７）
突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８ ｍＡｂの結合を決定するための免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌｕｏｓｃｅｎｔ）アッセイ（ＩＦＡ）
突然変異した６Ｂ８エピトープ（試験サンプル）への６Ｂ８ ｍＡｂの結合を、以下のステップに従った免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌｕｏｓｃｅｎｔ）アッセイ（ＩＦＡ）によって決定する：
１． ９６ウェルマイクロタイタープレートに１．０×１０⁶個のＳＦ９細胞／ウェルを播種し、その後、以下の組換えバキュロウイルスにＭＯＩ０．０１で感染させ、それぞれ２セット行う：
（ｉ）試験サンプル：修飾された６Ｂ８エピトープを有するＥ２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、
（ｉｉ）ポジティブコントロール：野生型６Ｂ８エピトープを有するＥ２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス；
（ｉｉｉ）ネガティブコントロール：本明細書において記載される６Ｂ８エピトープ内にＫＡＲＤ突然変異を有するＥ２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス。

【0134】

バキュロウイルスに感染した細胞を、約２７℃のインキュベーター内で５日間保持する。
２． 培養培地を廃棄し、細胞を１×ＰＢＳ（２００～２５０μＬ／ウェル）で１回すすぐ。
３． １００μｌの冷たいメタノール／アセトン（５０：５０）をウェルごとに添加し、室温で１０分間インキュベートする。
４． 固定剤を規定の廃棄物容器に廃棄し、プレートを、ヒュームフードの下で１５～３０分間乾燥させる。
５． ６Ｂ８特異的なｍＡｂ（受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される抗体など）を、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１：５００～１：１０００に希釈し、次いで、５０μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加する。プレートに蓋を被せ、３７℃で１～２時間インキュベートする。
６． アッセイプレートを１×ＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で３回すすぐ。

【0135】

７． 二次抗体である、６Ｂ８抗体に特異的に結合するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート型ロバ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２１２０２）を、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで４００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルでアッセイプレートに添加する。プレートに蓋を被せ、３７℃で１時間インキュベートする。
８． アッセイプレートを１×ＰＢＳ（２５０μＬ／ウェル）で３回すすぐ。最後に、１×ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加する。最終蛍光シグナルを倒立型蛍光顕微鏡法で読み取る。
（両セットにおける）このＩＦＡでの試験サンプルの負の結果は、Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の１つまたは複数の突然変異が、このような突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８モノクローナル抗体の結合の特異的阻害をもたらすことを示している。

【0136】

（実施例８）
突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８ ｍＡｂの結合を決定するためのドットブロットアッセイ
突然変異した６Ｂ８エピトープ（試験サンプル）への６Ｂ８ ｍＡｂの結合を、以下のステップに従ってドットブロットアッセイによって決定する。
１． １～５ｕｇの、ＰＢＳ中に希釈した各精製タンパク質をＮＣ膜（Ｐａｌｌ、カタログ番号６６４８５）にスポットし、ヒュームフードの下で３０分間以上空気乾燥する。
（ｉ）試験サンプル：修飾された６Ｂ８エピトープを有するＥ２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、
（ｉｉ）ポジティブコントロール：野生型６Ｂ８エピトープを有するＥ２タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス。
２． 膜を、ブロック溶液（ＰＢＳＴ中の５％脱脂乳）で、室温で１時間、ブロックする。
３． ６Ｂ８特異的ｍＡｂ（受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１８１２０の下でＣＣＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生される抗体など）を、５％脱脂乳を含有するＰＢＳＴで１：８００～１：１０００に希釈し、次いで、各ドット膜に１０ｍｌ／膜で添加する。膜を蓋で密封し、３７℃で１～２時間インキュベートする。
４． 一次抗体を廃棄し、各膜を３×ＰＢＳＴで３回洗浄する。

【0137】

５． 二次抗体である、６Ｂ８抗体に特異的に結合するＨＲＰコンジュゲート型抗マウス抗体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＳＴＡＲ１１７Ｐ）を、５％脱脂乳を含有するＰＢＳＴで２０００倍に希釈し、各ドット膜に１０ｍｌ／膜で添加する。膜を蓋で密封し、３７℃で１時間インキュベートする。
６． 二次抗体を廃棄し、各膜を３×ＰＢＳＴで３回洗浄する。
７． 各膜のブロットシグナルを、１～５ｍＬのスーパーシグナルキット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０８０）を用いて室温で発色させる。

【0138】

８． 発色時間は１～１０秒間であり、写真をｃｈｅｍｄｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で撮影する。
このドットブロットにおける試験サンプルの負の結果は、Ｅ２タンパク質の６Ｂ８エピトープ内の１つまたは複数の突然変異が、このような突然変異した６Ｂ８エピトープへの６Ｂ８モノクローナル抗体の結合の特異的阻害をもたらすことを示している。

【0139】

（実施例９）
ＣＨＯ系及びバキュロウイルス系におけるＥ２タンパク質の発現比較
ＱＺ０７－Ｅ２をコドン最適化し（ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）アルゴリズムを使用）（ＱＺ０７－Ｅ２のコドン最適化配列は配列番号８２に示される）、ＣＨＯ細胞発現系（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系、Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１３３）に従って合成した。可溶性かつ分泌された形態のＥ２タンパク質を得るために、Ｅ２の最後の４３個のアミノ酸（ａａ）を、最終的な最適化配列において欠失させ、一方、Ｅ１タンパク質の最後の２１個のａａをシグナルペプチドとして付加した。合成した突然変異配列を、ｐＣＤＮＡ３．４プラスミドにクローニングした。

【0140】

ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２７、これはＣＨＯ－Ｓ細胞系のクローン誘導体である）をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１０００１）での高密度懸濁培養に適応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２９）の使用説明書に従って、組換えｐｃＤＮＡ３．４プラスミドのトランスフェクションを実施した。発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系のユーザーガイド（改訂版Ｄ．０、２０１８年５月２５日、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）に従って、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ（高力価）法を使用して実施した。

【0141】

具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を、３７℃に予熱した新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地を有するフラスコに、６×１０⁶生存細胞／ｍｌの最終密度で接種した。フラスコを穏やかに回旋させて細胞を混合した。プラスミドＤＮＡを冷却ＯｐｔｉＰＲＯ培地で希釈し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬を冷却ＯｐｔｉＰＲＯ培地で希釈した。次いで、上記の２つを一緒に混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬／プラスミドＤＮＡ複合体を、室温で２分間インキュベートした。次いで、溶液をシェーカーフラスコにゆっくりと移し、添加中はフラスコを旋回させた。トランスフェクションの翌日、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを添加し、添加中はフラスコを穏やかに回旋させた。フラスコを、空気中５％ＣＯ₂の加湿雰囲気の３２℃インキュベーター内の１２５±５ｒｐｍのオービタルシェーカーに置いた。上清及び細胞を遠心分離によって分離し、トランスフェクション後４日目～１０日目に回収した。

【0142】

ＢＥＶＳ（バキュロウイルス発現ベクター系、上記を参照）での発現と比較した、ＣＨＯ細胞でのＱＺ０７－Ｅ２の発現結果を図１３に示す。ＣＨＯ発現系でのＥ２の収量は、ＢＥＶＳ系（約１０μｇ／ｍｌ）と比較して高かった（約１ｍｇ／ｍｌ）。
ＣＨＯ細胞及びＢＥＶＳで発現させたＥ２タンパク質の有効性を試験した。具体的には、５０μｇの未精製ＣＨＯ発現Ｅ２及び５０μｇの精製ＢＥＶＳ発現Ｅ２を、豚に１回投与（ＩＭ）した（ｎ＝１０匹の豚／群）。ワクチン接種２１日後の血清中のＣＳＦ抗体を試験した。結果を図１４に示す。Ｅ２を発現したＣＨＯは、豚においてその免疫原性を維持していることを見て取ることができる。

【0143】

（実施例１０）
Ｅ２タンパク質における６Ｂ８結合のための追加の重要な残基の同定
この実施例では、Ｅ２のアミノ酸１０位、４１位、及び６４位が、６Ｂ８ ｍＡｂ結合のための追加の重要な残基であると同定された。
Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、又はＲ６４Ｅを含む突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質（アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７４～８１に示されており、コドン最適化コード配列はそれぞれ配列番号８３～９０に示されている）を、それぞれＣＨＯ細胞で発現させ（前出の実施例に記載の方法に従って）、ＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）試験に供した（前出の実施例に記載の方法に従って）。結果を図１５に示す。置換Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、及びＲ６４Ｅは、それぞれ６Ｂ８ ｍＡｂ結合を阻害することができ、こうした突然変異をＤＩＶＡでも使用することができることを示す。
Ｙ１０Ａ、Ｙ１０Ｐ、Ｄ４１Ａ、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４１Ｅ、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、又はＲ６４Ｅを含む突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングによって検出した。結果を図１６に示す。突然変異Ｒ６４Ａ及びＲ６４Ｓは、ＣＨＯ細胞系におけるタンパク質発現分泌にわずかに影響を及ぼしたに過ぎなかった。したがって、残基６４での追加の突然変異を、発現及び有効性の評価のためにＫＡＲＤと組み合わせることになる。

【0144】

（実施例１１）
Ｅ２タンパク質における６Ｂ８結合を阻害するための追加の重要な残基の同定
この実施例では、Ｅ２のアミノ酸２２位、２４位、２５位、及び６４位でのより多くの突然変異が、６Ｂ８ ｍＡｂ結合を阻害するための追加の重要なものであると同定された。
２２位、２４位、２５位、及び６４位にそれぞれ様々な突然変異を含む突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質をＣＨＯ細胞で発現させ（前出の実施例に記載の方法に従って）、ＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）試験に供した（前出の実施例に記載の方法に従って）。２２位、２４位、２５位、及び６４位にそれぞれ様々な突然変異を含む突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２タンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングによって検出した。突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｄ、突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｈ、突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｔ、突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｇ、突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃ－Ｒ６４Ｋを含む一部の突然変異体を、タンパク質発現を増強するために突然変異体Ｅ２のＣ末端をＦｃ断片にさらに連結することによって調製した。突然変異体ＱＺ０７－Ｅ２－Ｆｃタンパク質の調製方法は、上記の実施例を参照することができる。結果を図１７～２０に示す。

【0145】

アミノ酸２２位の場合、Ｇ２２Ａ、Ｇ２２Ｑ、Ｇ２２Ｄ、Ｇ２２Ｅ、Ｇ２２Ｎ、及びＧ２２Ｓが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の両方の点で置換候補であり得る。
アミノ酸２４位の場合、Ｇ２４Ｒは、依然としてｍＡｂ ６Ｂ８との弱い反応性を示し、Ｇ２４Ｄ及びＧ２４Ｉ突然変異体は、ｍＡｂ ６Ｂ８と反応することができないが、収量が低い。
アミノ酸２５位の場合、Ｇ２５Ｄ、Ｇ２５Ｋ、Ｇ２５Ｌ、Ｇ２５Ｎ、Ｇ２５Ｒ、Ｇ２５Ｔ、及びＧ２５Ｖが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の両方の点で置換候補であり得る。
アミノ酸２６位の場合、Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｋ、及びＲ６４Ｗが、収量及びｍＡｂ ６Ｂ８との反応性の点で突然変異体候補である。

【0146】

（実施例１２）
突然変異体Ｅ２タンパク質の有効性評価
１０位、１４位、２２位、２４位、２４位／２５位、４１位、又は６４位に１つ又は複数の突然変異を有するＥ２タンパク質を、前出の実施例で使用した方法に従ってＣＨＯ細胞で発現させる。簡潔に述べると、突然変異体Ｅ２タンパク質をコードするコドン最適化配列を、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングし、得られた構築物を、それぞれＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１０００１）での高密度懸濁培養に適応させたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（Ｇｉｂｉｃｏ、カタログ番号Ａ２９１２７）にトランスフェクトし、トランスフェクションの約２～１４日後にタンパク質を回収する。

【0147】

発現された突然変異体Ｅ２タンパク質の有効性を、前出の実施例に記載の方法に従って評価する。簡潔に述べると、子豚（３週齢）を様々なＩＶＰ試験群（試験しようとする突然変異体Ｅ２タンパク質に応じて）、チャレンジコントロール群、及び厳密な（ネガティブ）コントロール群に割り当てる。０日目に、ＩＶＰ試験群の動物に、２ｍＬのアジュバント化（Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ２０６）突然変異体Ｅ２タンパク質（約５０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ接種（ＩＭ）する。０日目にチャレンジコントロール群の動物にＰＢＳ＋アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡ２０６）を接種（ＩＭ）する。２１日目に、ＩＶＰ試験群及びチャレンジコントロール群の動物にＣＳＦＶ Ｓｈｉｍｅｎ株を用量≧１０⁵ＭＬＤ／ｍＬで接種（ＩＭ）する。２１日目から３７日目まで、直腸温度及び臨床観察を毎日収集する。－７日目から開始して７日毎に血清サンプルを採取する。２１、２４、２８、３１、及び３７日目（ＤＰＣ０、３、７、１０、１６）に、全ての動物の全血サンプル及び鼻スワブサンプルを採取する。有効性の評価のために、体温、白血球数、死亡率、表８に列挙されている臨床スコア、ウイルス単離、及び血清学的応答を分析する。

【0148】

ＣＨＯ細胞での発現も、６Ｂ８エピトープへの追加の突然変異の導入も、有効性に悪影響を及ぼさない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【国際調査報告】