(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-09
(54)【発明の名称】スルフィン酸をスルホン酸に酵素的に酸化する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 11/00 20060101AFI20231101BHJP
C12N 9/04 20060101ALN20231101BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20231101BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20231101BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20231101BHJP
【ＦＩ】
C12P11/00 ZNA
C12N9/04 Z
C12N15/53
C12N15/60
C12N15/54
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023515049
(86)(22)【出願日】2021-07-05
(85)【翻訳文提出日】2023-05-01
(86)【国際出願番号】 EP2021068556
(87)【国際公開番号】W WO2023280382
(87)【国際公開日】2023-01-12
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】390008969
【氏名又は名称】ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｈａｎｎｓ－Ｓｅｉｄｅｌ－Ｐｌａｔｚ ４， Ｄ－８１７３７ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ルーペルト、ファラー
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AE61
4B064BJ07
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB11
4B064CC24
4B064CD11
4B064DA10
(57)【要約】
本発明は、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸を、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される酵素によって、前記酵素の基質の存在下で、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸に酵素的に酸化する方法、特に、Ｌ－システインスルフィン酸をＬ－システイン酸に、およびヒポタウリンをタウリンに酵素的に酸化する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸を、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される酵素によって、前記酵素の基質の存在下で、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸に酵素的に酸化する方法。
【請求項2】
前記Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼがアルコールオキシダーゼであり、前記存在する基質が第一級アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、前記存在する基質がグルコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記スルフィン酸がアミノアルキルスルフィン酸であり、前記スルホン酸がアミノアルキルスルホン酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
バッチ中のスルフィン酸の濃度が少なくとも１ｇ／ｌである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記スルフィン酸が２－アミノエタンスルフィン酸（ヒポタウリン）であり、形成される前記スルホン酸が２－アミノエタンスルホン酸（タウリン）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記スルホン酸が反応バッチから単離される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ヒポタウリンが、発酵産生からのヒポタウリンである、請求項６および７のいずれかまたは両方に記載の方法。
【請求項9】
前記ヒポタウリンが、細菌産生に由来する、すなわち、細菌産生株を用いて産生される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細菌産生株が大腸菌種の菌株である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記産生株が、調節解除されたシステイン生合成経路を有する株である、請求項９および１０のいずれかまたは両方に記載の方法。
【請求項12】
前記産生株が、大腸菌Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株またはＷ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株の１つである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記スルフィン酸がシステインスルフィン酸であり、形成される前記スルホン酸がシステイン酸である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
この反応で用いられる式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸および式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸の全モル濃度に対する式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸のモル収率が、少なくとも６０％である、請求項１～３または１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸を、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される酵素によって、前記酵素の基質の存在下で、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸に酵素的に酸化する方法、特に、Ｌ－システインスルフィン酸をＬ－システイン酸に、およびヒポタウリンをタウリンに酵素的に酸化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
スルフィン酸は、一般構造Ｒ－Ｓ（＝Ｏ）－ＯＨの有機的に結合した硫黄と酸素とを含む化合物のクラスであり、Ｒは有機ラジカルである。親物質であるスルフィン酸は、構造Ｈ－Ｓ（＝Ｏ）－ＯＨを有し、スルホキシル酸ＨＯ－Ｓ－ＯＨと互変異性である。スルフィン酸の塩はスルフィン酸塩である。
【0003】
スルホン酸は、一般構造Ｒ－ＳＯ２－ＯＨを有する有機硫黄化合物であり、Ｒは有機ラジカルである。それぞれの一般構造Ｒ－ＳＯ２－Ｏ－およびＲ１－ＳＯ２－Ｏ－Ｒ２（Ｒ１、Ｒ２はいずれの場合も有機基である）を有するそれらの塩およびエステルは、スルホン酸塩として知られている。
【0004】
スルフィン酸のスルホン酸への変換は、例えば、過酸化物による酸化によって化学的に可能である（例えば、Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255-6259を参照）。スルフィン酸のスルホン酸への酵素的な酸化の可能性は、化学産業においては重要ではないものの、対応するスルフィン酸から天然に存在するスルホン酸を生成するためのバイオテクノロジープロセスにとっては興味深いものである。
【0005】
天然に存在するスルフィン酸の例としては、Ｌ－システインスルフィン酸およびヒポタウリンが挙げられる。天然に存在するスルホン酸の例としては、Ｌ－システイン酸およびタウリンが挙げられる。
【0006】
タウリン（２－アミノエタンスルホン酸、ＣＡＳ番号１０７－３５－７）は、アミノ酸システインおよびメチオニンの分解生成物として自然界に天然に存在するアミノスルホン酸である。タウリンは経済的に重要であり；例えば、エナジードリンクの成分であり、例えば、猫のためのペットフードにおいて、または魚の養殖においても用いられる（Salze and Davis, Aquaculture (2015) 437: 215-229）。しかしながら、タウリンには健康促進効果もあると考えられている（Ripps and Shen, Molecular Vision (2012) 18: 2673-2686）。
【0007】
現在、商業用のタウリンは化学的に製造されている。公知のプロセスの１つは、例えば、Changshu Yudong Chemical Factoryのプロセスであり、エチレンから始まり、エチレンイミンを介してタウリンに至る。化学的に製造される成分から離れた消費者主導の傾向により、タウリンの製造のためのバイオテクノロジープロセスがますます研究されている。
【0008】
自然界においては、タウリンはほとんど動物界にのみ存在し、植物、藻類または細菌に存在する例はわずかである。タウリンに至る様々な生合成経路が存在し（例えば、ＫＥＧＧ Ｐａｔｈｗａｙ Ｄａｔａｂａｓｅ：“Ｔａｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｙｐｏｔａｕｒｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”を参照）、とりわけ、Ｌ－システインから開始される。Ｌ－システインからタウリンに至る最も重要な合成工程は、式（１）～（５）に示される。
（１）Ｌ－システイン＋Ｏ２ → Ｌ－システインスルフィン酸
（２）Ｌ－システインスルフィン酸＋１／２Ｏ２ → Ｌ－システイン酸
（３）Ｌ－システインスルフィン酸 → ヒポタウリン＋ＣＯ２
（４）ヒポタウリン＋１／２Ｏ２ → タウリン
（５）Ｌ－システイン酸 → タウリン＋ＣＯ２
（１）Ｌ－システイン＋Ｏ２ → Ｌ－システインスルフィン酸
（２）Ｌ－システインスルフィン酸＋１／２Ｏ２ → Ｌ－システイン酸
（３）Ｌ－システインスルフィン酸 → ヒポタウリン＋ＣＯ２
（４）ヒポタウリン＋１／２Ｏ２ → タウリン
（５）Ｌ－システイン酸 → タウリン＋ＣＯ２
【0009】
（１）：第１の工程において、Ｌ－システインは酵素システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ、ＥＣ１．１３．１１．２０）によってＬ－システインスルフィン酸（３－スルフィノアラニン、ＣＡＳ番号２０７１２１－４８－０）に酸化される。
【0010】
（３）および（５）：システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ、ＥＣ４．１．１．２９）がＬ－システインスルフィン酸をヒポタウリン（２－アミノエタンスルフィン酸、ＣＡＳ番号３００－８４－５）に脱炭酸し、同様の反応によりＬ－システイン酸をタウリンに脱炭酸することができる。
【0011】
（２）および（４）：システインスルフィン酸のシステイン酸への酸化およびヒポタウリンのタウリンへの酸化は、まだ明確に解明されていない。
【0012】
タウリンを製造するための既知の生物工学的プロセスの欠点は、一般にヒポタウリンが主な生成物であることである。タウリンが生成物である場合、ヒポタウリンの酸化のための化学的プロセスを用いる必要がある。
【0013】
Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-1183には、コイ（シプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio））由来のＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子を異種発現する遺伝子操作された酵母株が記載されている。主な生成物はヒポタウリンであり、タウリンの割合はより小さかった。両方の生成物は細胞内に蓄積された。したがって、生成物の分析には細胞破砕が必要であった。細胞抽出物中のヒポタウリンは、Ｈ２Ｏ２で処理することにより、分析目的でタウリンに化学的に酸化され得る。さらなる使用のためにヒポタウリンを非化学的な工程でタウリンに変換する方法を詳述する工程は記載されていない。
【0014】
ＷＯ１７／２１３１４２Ａ１（味の素）には、本来システインを産生する株におけるシステインジオキシゲナーゼおよびＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼの異種発現によって得られるタウリン産生株が記載されている。主な生成物は、最大収量４５０μＭのヒポタウリンであり、その後のアルカリによる化学処理によってのみ、低収率でのみタウリンに変換することができた。
【0015】
ＵＳ２０１９－００６２７５７Ａ１（ＫｎｉｐＢｉｏ）には、タウリンまたはその前駆体物質の製造のための異種産生株が記載されており、開示された産生株は、ほとんど不均一な生成プロファイルを有し、ヒポタウリンの最高収率を達成する。さらに、達成された収量は非常に低く、最大で４１９ｎｇ／ｍｌのヒポタウリンであり、タウリンは検出不可能であった。
【0016】
収率が低いことに加えて、先行技術に開示されたタウリンを生産するための生物工学的なアプローチは、生成物の範囲が一貫していないという欠点があり、ヒポタウリンが主な生成物として生じ、タウリンは副生成物として生じるのみである。
【0017】
ヒポタウリンの酵素的な酸化へのアプローチは、Veeravalli et al. (2020), bioRxiv Preprint Server doi: https://doi.org/10.1101/750273に開示されている。彼らは、哺乳動物のフラビン依存性モノオキシゲナーゼ１（ＦＭＯ１）が、ヒポタウリンをタウリンに変換する酵素であると説明している。酸化は式（６）に従って進行する：
（６）ヒポタウリン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｏ２ → タウリン＋ＮＡＤ（Ｐ）＋Ｈ２Ｏ。
（６）ヒポタウリン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｏ２ → タウリン＋ＮＡＤ（Ｐ）＋Ｈ２Ｏ。
【0018】
式（６）に従ってヒポタウリンをタウリンに変換するための哺乳動物の酵素ＦＭＯ１が式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈの他のスルフィン酸の酸化にも適しているかどうかは不明である。
【0019】
ヒポタウリンの酸化のために、ＦＭＯ１は補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを化学量論量で用いる。これらの商業的に高価な補因子の使用は、技術的な使用を不経済なものとする。さらに、哺乳動物において同定されたＦＭＯ１については、工業生産に適した生産プロセスは知られていない。したがって、ＦＭＯ１酵素を用いた酵素的な酸化には経済的な根拠がない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
したがって、本発明の目的は、スルフィン酸をスルホン酸に、特にＬ－システインスルフィン酸をＬ－システイン酸に、およびヒポタウリンをタウリンに酸化するための経済的に有利な生物工学的な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0021】
式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸を、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される酵素によって、前記酵素の基質の存在下で、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３のスルホン酸に酵素的に酸化する方法によって、上記目的が達成された。好ましくは、本発明の方法は、スルフィン酸がアミノアルキルスルフィン酸であること、より好ましくは２－アミノアルキルスルフィン酸であることを特徴とする。好ましくは、本発明の方法は、スルホン酸がアミノアルキルスルホン酸であること、より好ましくは２－アミノアルキルスルホン酸であることを特徴とする。より好ましくは、スルフィン酸はアミノアルキルスルフィン酸であり、スルホン酸はアミノアルキルスルホン酸である。
【0022】
基Ｒは任意の基であり得、好ましくは水素、有機基、直鎖基、分岐鎖基、環式基、飽和基または不飽和基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、置換基を有していてもよく、有していなくてもよい。これは、基Ｒが置換されていてもよく、置換されていなくてもよいことを意味する。好ましい置換基は、－ＣＮ、－ＮＣＯ、－ＮＲ２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯＲ、－ハロゲン、－（メタ）アクリロイル、－エポキシ、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＮＲ２、－Ｏ－Ｒ、－ＣＯ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－ＯＣＯ－Ｒまたは－ＯＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＮＲ－、－Ｎ＝Ｒ、－Ｎ＝ＮＲまたは－Ｐ＝Ｒである。好ましくは、Ｃ１－Ｃ４アルキル、より好ましくはＣ１－Ｃ４アルキル、ビニル、具体的にはメチルまたはエチル、特にメチルを有する飽和基または不飽和基が用いられる。Ｒは、好ましくはＲ＝ＨまたはＲ＝ＣＯ２Ｈから選択され、すなわち、スルフィン酸はヒポタウリンまたはシステインスルフィン酸であることが好ましい。Ｒ＝Ｈであることが特に好ましい。
【0023】
したがって、本発明はまた、タウリンの生物工学的な製造におけるプロセス工程としての、Ｌ－システインスルフィン酸のＬ－システイン酸への酵素的な酸化、およびヒポタウリンのタウリンへの酵素的な酸化にも関する。
【0024】
Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される酵素の基質は、オキシダーゼによって酸化可能な物質を意味すると理解される。オキシダーゼは、式（７）に従ってその酸化し得る基質と反応する。
（７）基質＋Ｏ２ → 基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ２
（７）基質＋Ｏ２ → 基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ２
【0025】
Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼによって触媒される全体的な反応は、式（８）に従って行われる：
（８）基質＋Ｏ２＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈ →
基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈ →
基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ。
（８）基質＋Ｏ２＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈ →
基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈ →
基質（ｏｘ）＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ。
【0026】
適切なＨ２Ｏ２生成オキシダーゼは、「ＫＥＧＧ酵素」データベースにおいて「オキシダーゼ」という検索用語の下に、そこに列挙された酵素のサブセットとして見出すことができる。しかしながら、多数のＨ２Ｏ２生成オキシダーゼのうち、工業的に利用できる可能性があるのは、安価な基質を用いて、式（７）に従って基質の酸化によってＨ２Ｏ２を生成するオキシダーゼのみである。
【0027】
好ましい適切なＨ２Ｏ２生成オキシダーゼの例は、限定されないが、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．５）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１３）、第二級アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１８）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）、Ｌ－乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２）、アリールアルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．７）、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．９）、Ｌ－ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１１）、アルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．１）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．３またはＥＣ１．２．３．６）、シュウ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．４）、グリオキシル酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．５）、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２）、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３またはＥＣ１．４．３．１）、亜硫酸オキシダーゼ（ＥＣ１．８．３．１）およびチオールオキシダーゼ（ＥＣ１．８．３．２）である。
【0028】
特に好ましいＨ２Ｏ２生成オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．５）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１３）、第二級アルコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１８）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１０）およびＬ－乳酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２）である。
【0029】
したがって、好ましくは、本発明の方法は、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼと酸化可能なその基質との組み合わせが、グルコースオキシダーゼ／グルコース、アルコールオキシダーゼ／メタノール、アルコールオキシダーゼ／エタノール、第二級アルコールオキシダーゼ／イソプロパノールおよびＬ－乳酸オキシダーゼ／乳酸から選択されることを特徴とする。
【0030】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼがアルコールオキシダーゼであり、存在する基質が第一級アルコール、より好ましくはメタノールであることを特徴とする。すなわち、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは、アルコールオキシダーゼと指定されるＫＥＧＧデータベースのクラスＥＣ１．１．３．１３の酵素である。
【0031】
アルコールは、一般式Ｒ－ＯＨの化合物であって、１つ以上のヒドロキシ基を有し、より重要度が高い他の官能基を含まない。アルコールは、ヒドロキシル基が結合している官能基の炭素原子上の炭素原子および水素原子の数によって区別される。第一級アルコールの場合、炭素原子に加えて、２個の水素原子が前記炭素原子に結合し、ＲＣＨ２ＯＨの一般式をとる。さらに、第一級アルコールは酸化によってアルデヒドに変換される。たとえば、エタノールは２個の水素原子を除去することにより、アルデヒドエタナールになる。
【0032】
好ましい第一級アルコールとしては、メタノールおよびエタノールが挙げられ、より好ましくは第一級アルコールはメタノールである。
【0033】
アルコール中のＲは、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であるが、アリール基、アシル基またはヘテロ原子ではない。
【0034】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、存在する基質がグルコースであることを特徴とする。すなわち、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼと指定されるＫＥＧＧデータベースのクラスＥＣ１．１．３．４の酵素である。
【0035】
このプロセスを工業的に実施するための前提条件は、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼおよび安価で酸化可能な基質を利用できることにある。
【0036】
Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは、例えば、関係するオキシダーゼを自然に生成する（同種生産）適切な産生株を培養することによって、または宿主生物における適切な組換え遺伝子構築物の発現の結果として（異種生産）、生産することができる。さらに、様々なＨ２Ｏ２生成オキシダーゼが市販されており、プロセスの経済性にプラスの影響を与える可能性がある。市販のオキシダーゼの例は、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来のアルコールオキシダーゼＡＯＸ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、または菌類アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のグルコースオキシダーゼＧＯＸ（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）である。市販のグルコースオキシダーゼの別の例は、例えば、製パン産業で用いられる商品名Ｇｌｕｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）として市販されている酵素である。Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは、発酵により産生されることが好ましい。
【0037】
さらに、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼの基質を安価に入手できることは、プロセスの経済的な実行可能性にとって重要である。ＡＯＸアルコールオキシダーゼの場合、基質は第一級アルコールであり、好ましくはメタノールまたはエタノールから選択される。ＡＯＸ酵素は、反応（９）に従って、メタノールからＨ２Ｏ２を生成する：
（９）メタノール＋Ｏ２ → ホルムアルデヒドおよびＨ２Ｏ２。
（９）メタノール＋Ｏ２ → ホルムアルデヒドおよびＨ２Ｏ２。
【0038】
グルコースオキシダーゼＧＯＸの場合、基質はＤ－グルコースである。ＧＯＸ酵素は、反応（１０）に従ってグルコースでＨ２Ｏ２を生成する：
（１０）Ｄ－グルコース＋Ｏ２ → Ｄ－グルコノ－１，５－ラクトン＋Ｈ２Ｏ２。
（１０）Ｄ－グルコース＋Ｏ２ → Ｄ－グルコノ－１，５－ラクトン＋Ｈ２Ｏ２。
【0039】
本発明の目的のために、プロセスは、１つ以上の連続する反応バッチにおいて、反応物（出発物質）が、反応条件によって決定される中間体を介して、所定の順序で生成物に変換される、多段階の連続する作業工程として定義される。
【0040】
本発明の目的のために、生物工学的なプロセスは、グルコースオキシダーゼを用いるヒポタウリンからのタウリンの生成等、化合物の生産のための工業的用途における酵素、細胞または生物全体の使用として定義される。生物工学的なプロセスとは対照的に、化学的プロセス工程を特徴とするプロセスが利用可能である。
【0041】
バッチまたは反応バッチは、定義された条件下で反応物が生成物に変換される、反応物（出発物質）、酵素、および任意に他の反応物の混合物として定義される。本発明のバッチまたは反応バッチは、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈの少なくとも１種のスルフィン酸、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼのクラスから選択される少なくとも１種の酵素、オキシダーゼによって酸化可能な基質、および大気中の酸素Ｏ２を含む。
【0042】
生体内変化は、酵素触媒下における反応物の生成物への変換として定義される。本発明の方法は生体内変化である。
【0043】
反応の収率は、単位体積あたりの生成物の絶対量（ｍＭまたはｇ／Ｌ）の体積収率として、またはパーセント収率とも呼ばれる、用いられる反応物の割合としての生成物の相対収率として（反応物および生成物の分子量を考慮する）表すことができる。本発明の文脈において、パーセントで表されるモル収率は、この反応において用いられる式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２のスルフィン酸および式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈの総モル量に対する、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼによって、その基質の存在下で、酵素的に酸化された後の式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸の総モル量を指す。
【0044】
発酵は、培地、温度、ｐＨ、酸素供給および培地混合について定義された条件下で産生微生物株を増殖させる培養細胞の生産のためのプロセス工程である。産生株の構成に応じて、発酵の目的は、プロセスにおいてさらに用いるために、タンパク質／酵素および／または代謝産物をそれぞれの場合において可能な限り最高の収量で生産することにある。
【0045】
酵素活性はＵ／ｍｌで表され、１Ｕ／ｍｌは、試験条件下における１ｍｌの試験バッチ中の１μｍｏｌの基質／分の変換として定義される。
【0046】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、ｃｄｓまたはコーディング配列と同義）は、開始コドンで始まり停止コドンで終わるＤＮＡまたはＲＮＡの領域を指し、タンパク質のアミノ酸配列をコードする。ＯＲＦは、コード領域または構造遺伝子とも呼ばれる。
【0047】
遺伝子または発現単位は、生物学的に活性なＲＮＡを産生するためのすべての基本情報を含むＤＮＡのセクションを指す。遺伝子には、転写によって一本鎖ＲＮＡコピーが産生されるＤＮＡのセクション、およびこのコピープロセスの調節に関与する発現シグナルが含まれる。発現シグナルは、例えば、少なくとも１つのプロモーター、転写開始点、翻訳開始点およびリボソーム結合部位を含む。ターミネータおよび１つ以上のオペレーターは、追加の可能な発現シグナルである。
【0048】
メッセンジャーＲＮＡとしても知られるｍＲＮＡは、タンパク質合成のための遺伝情報を運ぶ一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。ｍＲＮＡは、細胞内において特定のタンパク質の組み立て指示を提供する。ｍＲＮＡ分子は、タンパク質合成に必要なメッセージを遺伝情報（ＤＮＡ）からタンパク質合成を担うリボソームに伝える。細胞内において、ｍＲＮＡ分子は、遺伝子に対応するＤＮＡの一部の転写物として形成される。ＤＮＡに保存されている遺伝情報は、このプロセスによって変更されることはない。
【0049】
真核生物の遺伝子は、大部分はモザイク遺伝子として知られているものであり、原核生物の遺伝子とは異なり、イントロン（遺伝子内領域）として知られる非コード部分も含む。エクソン（発現領域）として知られるコード配列は、ＲＮＡに転写された後、リボソームによってタンパク質のアミノ酸配列に翻訳される真核生物遺伝子のＤＮＡの部分である。ＤＮＡからＲＮＡへの転写後、イントロンは一次転写産物からスプライシングされる。イントロンが除去されたタンパク質コードＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または「成熟」ｍＲＮＡと呼ばれる。これは、キャッピングおよびポリアデニル化等のさらなる修飾を受ける。次いで、成熟ｍＲＮＡのコード領域がタンパク質配列に翻訳される。エクソン／イントロン構造を含む真核生物の遺伝子を原核生物で発現させる場合、エクソン／イントロン構造のプロセシングが原核生物においては行われないため、成熟したｍＲＮＡのタンパク質配列またはコード領域をイントロンを含まないＤＮＡに逆翻訳する必要がある。本発明の文脈において、タンパク質配列またはｍＲＮＡに由来する遺伝子配列に言及する場合、意味されるのはまさにこの逆翻訳のプロセスである。配列の最適化、すなわち、対応する原核生物のコドン使用への適応（コドン最適化）は、ｍＲＮＡ配列のＤＮＡ配列への逆翻訳と同時に起こることが好ましい。
【0050】
オペロンは、複数の遺伝子が単一のプロモーターの制御下で転写されるが、それぞれが独自のリボソーム結合部位から翻訳される高レベルの発現単位として定義される。
【0051】
本発明の文脈において、遺伝子構築物は、少なくとも１つの遺伝子がさらなる遺伝要素（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、ターミネーター、選択マーカー、転写開始点）に連結された環状ＤＮＡ分子（プラスミド、ベクター）である。遺伝子構築物の遺伝要素は、細胞増殖中にその染色体外遺伝を引き起こし、遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する。
【0052】
本発明の実施例１および２に開示されるように、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは、その酸化可能な基質と組み合わせて、Ｌ－システインスルフィン酸およびヒポタウリン等のスルフィン酸を、それぞれ対応するスルホン酸であるＬ－システイン酸およびタウリンに酸化するのに適している。この観察は斬新で驚くべきものであった。従来技術によれば、大部分は分析スケールでのみ調査されているが（例えば、Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255-6259を参照）、Ｈ２Ｏ２は原理的にはスルフィン酸のスルホン酸への酸化に適している。しかしながら、定量的反応のために、Ｈ２Ｏ２は、式（８）に従って、少なくとも化学量論量で用いられなければならず、これは、比較的大量のスルホン酸の産生のために、対応する多量のＨ２Ｏ２が必要であることを意味する。したがって、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼは古くから知られていたが、比較的大量のスルフィン酸を酸化するのに、アルコールオキシダーゼ反応により生じるＨ２Ｏ２の量とグルコースオキシダーゼ反応により生じるＨ２Ｏ２の量とではどちらが十分であるかは当業者には予測できなかった。
【0053】
したがって、本発明の方法は、生物工学的方法であるだけでなく、工業規模で実施可能であり、コストを要する補因子を必要としないため経済的に好ましい方法であるという利点を有する。
【0054】
実施例３において初めて開示され、従来技術から予想されなかったように、驚くべきことに、グルコースオキシダーゼ／グルコースの使用により、例えばヒポタウリンのタウリンへのほぼ定量的な酸化が、化学合成に適した濃度、すなわち２０ｇ／Ｌで達成された。したがって、本発明は、化学合成工程を回避しながら、食品、動物飼料または医薬品分野において用いるためのタウリン等のスルホン酸の持続可能な生産に対するますます高まる需要に適したバイオテクノロジープロセスを提供する。
【0055】
好ましくは、本発明の方法は、スルフィン酸が２－アミノエタンスルフィン酸（ヒポタウリン）であり、形成されるスルホン酸が２－アミノエタンスルホン酸（タウリン）であることを特徴とする。
【0056】
スルフィン酸をスルホン酸に酸化するための本発明の酵素的な方法は、好ましくは１５℃～８０℃、より好ましくは２０℃～６０℃、特に好ましくは２５℃～５０℃の温度で行われる。
【0057】
本発明の方法を行うｐＨは、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼの酵素特性に依存する。実施例に記載されているように、アルコールオキシダーゼの反応はｐＨ７．５で行われ、グルコースオキシダーゼの反応はｐＨ５．５で行われた。反応を好適に行うｐＨ範囲はｐＨ３．０～ｐＨ８．５、より好ましくはｐＨ４．０～ｐＨ８．０、特に好ましくはｐＨ４．５～ｐＨ７．５である。
【0058】
本発明の方法は、例えば、インキュベーションシェーカー上で反応バッチを混合することによって生じる受動的な流入、または圧縮空気の移動によって生じるような能動的な流入によって、大気酸素を供給して行われる。
【0059】
温度、ｐＨおよび酸素流入等のパラメータと並んで、本発明の方法におけるＨ２Ｏ２生成オキシダーゼの用量は、反応の変換を決定し、反応が可能な限り低い用量のＨ２Ｏ２生成オキシダーゼで可能な限り短い時間で起こるように選択される。Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼの用量は、好ましくは１Ｕ／ｍｌ～２００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは２Ｕ／ｍｌ～１５０Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは４Ｕ／ｍｌ～１００Ｕ／ｍｌである。
【0060】
Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼによって酸化可能な基質は、好ましくは、本発明の方法において、スルフィン酸のモル含有量に対して少なくとも等モル量で用いられる（酸化可能な基質に対するスルフィン酸のモル比は、好ましくは少なくとも１：１である）。特に好ましくは、酸化可能な基質に対するスルフィン酸のモル比が少なくとも１：２であり、特に好ましくは少なくとも１：５である。
【0061】
反応時間は、Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼの用量に依存し、好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、特に好ましくは２４時間以下である。
【0062】
反応に用いる溶媒は水が好ましい。
【0063】
バッチ中のスルフィン酸の濃度は、好ましくは少なくとも１ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｇ／ｌ、特に好ましくは少なくとも２０ｇ／ｌである。
【0064】
本発明の生体内変化におけるスルフィン酸からスルホン酸へのモル変換は、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％である。
【0065】
スルフィン酸の酸化のための本発明の方法は、不連続式または連続式で行うことができる。不連続式操作（バッチ操作）においては、すべての反応物が反応の過程でバッチに添加され、バッチは反応が終了した後に後処理される。
【0066】
連続式操作においては、オキシダーゼ酵素は、まず、固定相の形態で、例えば膜反応器に充填されるか、または支持体上に固定化され、スルフィン酸、およびＨ２Ｏ２生成オキシダーゼによって酸化可能な基質を含む移動相としての基質が、上述した固定相との接触に供される。移動相と固定相との接触時間は、好ましくは、スルフィン酸が反応してスルホン酸生成物を形成することができるように設定される。
【0067】
不連続（バッチ）操作が好ましい。
【0068】
本発明の酵素的な酸化に由来するスルホン酸は、さらなる後処理工程なしでさらに直接用いられる得、または既知の方法によって濃縮または精製され得る。その場合の濃縮の程度は、その後の使用に依存する。
【0069】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、スルホン酸、より好ましくはタウリンが反応バッチから単離されることを特徴とする。
【0070】
スルホン酸、特にタウリンを単離する方法は、例えばアミノ酸の単離方法から当業者に知られている。例としては、濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、結晶化が挙げられる。
【0071】
本発明の方法は、対応するスルホン酸へのスルフィン酸の酵素的な酸化のための新規かつ予想外の経路を開示するものであり、Ｌ－システイン酸およびタウリンの生物工学的生産に特に適している。
【0072】
本発明の方法において、反応の進行は、開始時、反応中の様々な時間、および反応終了時にスルフィン酸（反応物）およびスルホン酸（生成物）の含有量を測定することによってモニターされる。溶液または細胞培養中の式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸の含有量、例えばヒポタウリンの含有量、または式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸の含有量、例えばタウリンの含有量は、以下のように決定することができる。
【0073】
反応開始時のスルフィン酸反応物の濃度が、少なくとも０．１ｇ／Ｌであり、ＨＰＬＣによって決定される、完全な変換を伴う反応終了時のスルホン酸生成物の等量に相当する場合、含有量はバッチのアリコートから直接定量化することができる。これは、ヒポタウリンおよびタウリンについて実施例１に記載されているように、バッチの１ｍｌのアリコートを取り、これを８０℃で５分間インキュベートし、次いで、例えば卓上遠心分離機で最大速度で５分間遠心分離することによってすべての固体成分を除去し、関連するスルフィン酸またはスルホン酸について較正されたＨＰＬＣによって上清を定量することによって行うことができる。反応開始時のスルフィン酸反応物の濃度が０．１ｇ／Ｌ未満である場合、例えば、サンプルを蒸発させ、適切な体積のＨ２Ｏ（例えば、１０倍の濃度に対応するサンプル体積の１０％）に再溶解することにより、スルフィン酸反応物およびスルホン酸生成物の両方の測定精度を高めるために、サンプルを予備濃縮することができる。
【0074】
スルフィン酸を含有する培養ブロスが本発明の方法において用いられる場合、そのまま定量に用いることができる。あるいは、例えば、遠心分離または濾過によって最初に培養ブロスから細胞を除去し、得られたスルフィン酸含有細胞培養の上清を本発明の方法で用いることも可能である。既知の方法によって細胞培養上清からスルフィン酸を単離し、精製されたスルフィン酸を本発明の方法で用いることも可能である。
【0075】
以下の生体内変化アッセイは、本発明の方法を実証し、変換を決定するために用いることができる。
【0076】
スルフィン酸含有溶液または培養物、例えばヒポタウリン含有培養ブロス、好ましくは発酵ブロス、または対応する細胞培養上清、またはヒポタウリン等の精製されたフィン酸または市販のスルフィン酸を用いて、生体内変化バッチが生成される。実験室規模での生体内変化バッチは、１０ｍｌのバッチ容量であり、少なくとも０．１ｇ／Ｌのスルフィン酸を含む（上述したように、培養液／培養ブロス／発酵ブロスから、遠心分離された培養上清から、または精製物質および定量化物として、またはその投与された市販品として）。バッチ容量は生産規模に応じて大きくなり得、例えば、分取規模では少なくとも１Ｌである。Ｈ２Ｏ２生成オキシダーゼ、好ましくはＡＯＸまたはＧＯＸ、および該オキシダーゼによって酸化可能な基質は、酵素活性の投与量が少なくとも１Ｕ／ｍｌとなるように添加される。ＡＯＸを用いる場合、少なくとも１％（ｖ／ｖ）のメタノール、すなわち反応バッチ１０ｍｌ当たり少なくとも０．１ｍｌをＡＯＸ酵素の基質として添加する。ＧＯＸ酵素の基質として、グルコースを少なくとも１０ｇ／Ｌの用量で反応バッチに添加する。生体内変化バッチには、例えば、いずれの場合も空気の導入を伴うインキュベーションシェーカーまたはスターラーによる混合を介して受動的に、または混合を伴うかまたは混合を伴わない圧縮空気または純粋な酸素の導入により能動的に大気中の酸素が供給される。ＡＯＸを用いる場合、反応のｐＨは７．５である。ＧＯＸを用いる場合、反応のｐＨは５．５である。バッチのｐＨは、例えば、ビュレットからの補正剤（アルカリまたは酸）を計量するｐＨ制御ユニットに接続されたｐＨ電極を備え付けることによって、一定に保つことができる（「ｐＨスタット」法）。反応温度は２５℃（ＡＯＸ）または３０℃（ＧＯＸ）である。反応の進行は、反応物であるヒポタウリンの消費および生成物であるタウリンの形成を通じてモニターすることができ、例えばＨＰＬＣによってヒポタウリンおよびタウリンを定量的に決定することが可能である。反応の終了時点は、反応の進行に応じて選択される。選択される反応の終了は、好ましくは式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸、例えばタウリンのモル収率が、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％の時である。次いで、反応バッチ中に形成された式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸は、さらなる使用のために利用可能である。
【0077】
スルフィン酸は、化学的または発酵的な生産に由来し得、本発明の方法で用いられるスルフィン酸は、発酵的生産に由来することが好ましい。より好ましくは、本発明の方法は、スルフィン酸がヒポタウリンであり、これが発酵的生産に由来することを特徴とする。本発明の方法において、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸、例えばヒポタウリンが発酵的生産に由来し、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸、例えばタウリンがそれから形成される場合、本発明によって式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸、例えばタウリンを生産するための生物工学的方法を提供することは大きな利益を有する。この方法には、化学反応的な反応工程は含まれない。
【0078】
式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸、例えばヒポタウリンの生産に適しているのは、細菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、藻類（例えば、クラミドモナス・レインハルドチイ（Chlamydomonas reinhardtii）、酵母（例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica））または菌類（例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））である。
【0079】
式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸がヒポタウリンである場合、ヒポタウリン生産に適した微生物株が用いられる。ヒポタウリン生産に適した微生物株は、ＫＥＧＧ経路データベース「タウリンおよびヒポタウリン代謝」で特定される代謝経路の１つに従って、ヒポタウリンに至る代謝経路を含むことを特徴とする。式（１）および（３）のヒポタウリンの生合成はＬ－システインから開始するので、システイン生産にも適した微生物株が好ましい。例えば、Wada and Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54に記載されているように、野生型の微生物におけるシステイン生産は厳密に調節されており、これは、先行技術において文書化されているように、調節されたシステイン生合成経路を有する微生物株が、商業的に実行可能な量のヒポタウリンの生産に適していないことを意味する。したがって、調節が解除されたシステイン生合成経路を有するヒポタウリン生産に適した微生物株が好ましい。
【0080】
調節が解除されたシステイン生合成経路を有し、したがってシステイン生産に適した微生物株は、以下の改変のうちの少なくとも１つを示すことを特徴とする：
ａ）微生物株は、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害が、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも２倍減少している３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）をコードする改変ｓｅｒＡ遺伝子の特徴を有し、ＳｅｒＡの酵素活性は、例えばMcKitrick and Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141: 235-245に記載されているように、例えばＳｅｒＡの基質である３－ホスホヒドロキシピルビン酸に依存するＮＡＤＨの酸化を介して測光的に決定され得る。
３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）の特に好ましい変異体において、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害は、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍減少している。
および／または
ｂ）微生物株は、システインによるフィードバック阻害が、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも２倍減少しているセリン－Ｏ－アセチル－トランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）をコードする改変ｃｙｓＥ遺伝子を含み（例えば、ＥＰ０８５８５１０Ｂ１またはNakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611に記載されているように）、ＣｙｓＥの酵素活性は、例えばNakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611)に記載されているように、例えばＬ－セリンと反応してＯ－アセチル－Ｌ－セリンをもたらす結果として生じる、ＣｙｓＥの基質であるアセチル－ＣｏＡの消費を介して測光的に決定され得る。セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）の特に好ましい変異体において、システインによるフィードバック阻害は、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍減少している。
および／または
ｃ）微生物株において、細胞外へのシステインの排出は、排出遺伝子の過剰発現の結果として、対応する野生型の細胞と比較して少なくとも２倍増大し、システインの排出は、例えばＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されているように、Gaitonde, Biochem. J (1967) 104: 627-633による細胞がシステイン含有量の測光的測定により決定され得る（システイン、シスチン、およびシステインとピルビン酸とから形成される付加物（Ｒ）－２－メチルチアゾリジン－２，４－ジカルボン酸を含む）。
排出遺伝子の過剰発現は、野生型の細胞と比較して、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも２０倍増大した細胞からのシステイン排出をもたらす。
排出遺伝子は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｙｄｅＤ（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１を参照）、ｙｆｉＫ（ＥＰ１３８２６８４Ｂ１を参照）、ｃｙｄＤＣ（ＷＯ２００４／１１３３７３Ａ１を参照）、ｂｃｒ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照）およびｅｍｒＡＢ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照）、または異なる微生物由来の対応する相同遺伝子に由来する。
ａ）微生物株は、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害が、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも２倍減少している３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）をコードする改変ｓｅｒＡ遺伝子の特徴を有し、ＳｅｒＡの酵素活性は、例えばMcKitrick and Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141: 235-245に記載されているように、例えばＳｅｒＡの基質である３－ホスホヒドロキシピルビン酸に依存するＮＡＤＨの酸化を介して測光的に決定され得る。
３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）の特に好ましい変異体において、Ｌ－セリンによるフィードバック阻害は、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍減少している。
および／または
ｂ）微生物株は、システインによるフィードバック阻害が、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも２倍減少しているセリン－Ｏ－アセチル－トランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）をコードする改変ｃｙｓＥ遺伝子を含み（例えば、ＥＰ０８５８５１０Ｂ１またはNakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611に記載されているように）、ＣｙｓＥの酵素活性は、例えばNakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611)に記載されているように、例えばＬ－セリンと反応してＯ－アセチル－Ｌ－セリンをもたらす結果として生じる、ＣｙｓＥの基質であるアセチル－ＣｏＡの消費を介して測光的に決定され得る。セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）の特に好ましい変異体において、システインによるフィードバック阻害は、対応する野生型の酵素と比較して少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、より好ましい実施形態においては少なくとも５０倍減少している。
および／または
ｃ）微生物株において、細胞外へのシステインの排出は、排出遺伝子の過剰発現の結果として、対応する野生型の細胞と比較して少なくとも２倍増大し、システインの排出は、例えばＥＰ０８８５９６２Ｂ１に記載されているように、Gaitonde, Biochem. J (1967) 104: 627-633による細胞がシステイン含有量の測光的測定により決定され得る（システイン、シスチン、およびシステインとピルビン酸とから形成される付加物（Ｒ）－２－メチルチアゾリジン－２，４－ジカルボン酸を含む）。
排出遺伝子の過剰発現は、野生型の細胞と比較して、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも２０倍増大した細胞からのシステイン排出をもたらす。
排出遺伝子は、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｙｄｅＤ（ＥＰ０８８５９６２Ｂ１を参照）、ｙｆｉＫ（ＥＰ１３８２６８４Ｂ１を参照）、ｃｙｄＤＣ（ＷＯ２００４／１１３３７３Ａ１を参照）、ｂｃｒ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照）およびｅｍｒＡＢ（ＵＳ２００５－２２１４５３ＡＡを参照）、または異なる微生物由来の対応する相同遺伝子に由来する。
【0081】
ヒポタウリンの生産に適した微生物株は、先行技術に従って、好ましくは発酵によるヒポタウリンの生産に用いられる。ヒポタウリン含有培養ブロス、好ましくは発酵ブロスが形成される。副産物として存在する場合、ヒポタウリンおよびタウリンの含有量は、培養ブロスから定量化することができる。これは、少なくとも１．０／ｍｌの細胞密度ＯＤ６００／ｍｌを有する培養ブロスの１ｍｌアリコートを取り、これを８０℃で５分間インキュベートし、次いで、例えば卓上遠心分離機で５分間遠心分離することによってすべての固体成分を除去し、例えば実施例１においてヒポタウリンおよびタウリンについて記載したように、ヒポタウリンおよびタウリンについて較正されたＨＰＬＣによって上清を定量化することによって行うことができる。
【0082】
当業者は、同位体分析を用いて、方法においてスルフィン酸として用いることを望むヒポタウリン等の物質が化学的または発酵的な生産に由来するかどうかを決定することができる。区別することができる同位体分析法は、例えばSieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527に記載されており、例えば炭素または窒素の同位体比の決定に基づいており、生成物が化学的（石油ベース）または天然（植物ベース）のどちらの生産に由来するかによって異なる。実施例５に記載されるヒポタウリンの製造方法は、生産株の培養に用いられるグルコースが先行技術による植物ベースの生産に由来するため、天然（植物ベース）の生産方法と見なされる。
【0083】
相同な遺伝子、タンパク質または相同な配列は、該遺伝子のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列、ＤＮＡまたはタンパク質の部分が、少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一であることを意味すると理解されるべきである。
【0084】
ＤＮＡの同一性の程度は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/に見いだされ、ｂｌａｓｔｎアルゴリズムに基づく「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ」プログラムによって決定される。デフォルトのパラメータは、２つ以上のヌクレオチド配列のアラインメントについてのアルゴリズムパラメーターとして機能する。デフォルトの一般パラメータは：最大ターゲット配列＝１００；短いクエリ＝「短い入力配列のパラメータを自動的に調整する」；予想される閾値＝１０；ワードサイズ＝２８；短い入力配列のパラメータを自動的に調整する＝０である。対応するデフォルトのスコアリングパラメータは：マッチ／ミスマッチスコア＝１、－２；ギャップコスト＝線形である。
【0085】
タンパク質の配列は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/の「ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ」プログラムを用いて比較される。このプログラムは、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いている。デフォルトのパラメータは、２つ以上のタンパク質の配列のアラインメントについてのアルゴリズムパラメータとして機能する。デフォルトの一般パラメータは：最大ターゲット配列＝１００；短いクエリ＝「短い入力配列のパラメータを自動的に調整する」；予想される閾値＝１０；ワードサイズ＝３；短い入力配列のパラメータを自動的に調整する＝０である。デフォルトのスコアリングパラメータは：ギャップコスト＝存在：１１拡張：１；構成調整＝条件付き構成スコアマトリックス調整である。
【0086】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、スルフィン酸がヒポタウリンであること、およびこのヒポタウリンが細菌生産に由来すること、すなわち細菌生産株を用いて生産されたものであることを特徴とする。細菌生産株は、好ましくはエシェリヒア・コリ種の株である。
【0087】
好ましい細菌生産株は、システイン生産に適しているという特徴も有する。システイン生産に適した好ましい株は、実施例に開示されているＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ株およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ株である。本発明の実施例５に開示されるように、株Ｗ３１１０×ｐＣｙｓに由来する株Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよび株Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓに由来するＷ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓにおいてシステインジオキシゲナーゼをコードするＣＤＯ遺伝子およびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼをコードするＣＳＡＤ遺伝子の異種発現は、ヒポタウリンの産生とわずかなタウリンのみをもたらす。
【0088】
ｐｐｓＡ－ＭＨＩと呼ばれる微生物株は、Ｗｔ－ｐｐｓＡ遺伝子のコード配列を欠くこと、およびこれが配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号９のｐｐｓＡ－ＭＨＩｃｄｓによって置換されていることを特徴としている。
【0089】
ｐｐｓＡは、ＫＥＧＧデータベースにおいてＥＣ２．７．９．２と指定される酵素クラスの酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を指す。対応するタンパク質は、ＰｐｓＡまたはホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ＰＥＰシンターゼ）とも呼ばれ、またはホスホエノールピルビン酸－Ｈ２Ｏジキナーゼとも同義である。酵素クラスは、下記の式に従う可逆反応においてホスホエノールピルビン酸からピルビン酸を生成できると定義される。
（１１）ホスホエノールピルビン酸＋リン酸塩＋ＡＭＰ←→ピルビン酸＋Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ
（１１）ホスホエノールピルビン酸＋リン酸塩＋ＡＭＰ←→ピルビン酸＋Ｈ２Ｏ＋ＡＴＰ
【0090】
実施例６に開示されるように、このようなバッチからのヒポタウリンは、Ｄ－グルコースと共にグルコースオキシダーゼを用いることにより、未知の方法でタウリンに完全に変換することができる。したがって、本発明の方法は、ヒポタウリンの生合成生産とそのタウリンへの酵素的な酸化とを組み合わせることによって、タウリンの生物工学的生産を可能にする。
【0091】
方法の開発および単純化において、ヒポタウリン生産株においてＨ２Ｏ２生成オキシダーゼを発現させることも考えられる。適切なＨ２Ｏ２生成オキシダーゼの遺伝子は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）等のデータベースにおいて同定することができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産される異種グルコースオキシダーゼの例は、ペニシリウム・アマガサキエンセ（Penicillium amagasakiense）由来のＧＯＸ遺伝子である（Witt et al., App. Environ. Microbiol (1998) 64: 1405-1411）。
【0092】
タウリンを生産するための生物工学的方法が好ましく、この方法では、第１段階で、生産株を培養することによりヒポタウリンが生産され、第２段階で、形成されたヒポタウリンがさらに処理されることなく酵素的にタウリンに酸化され、グルコースオキシダーゼ／Ｄ－グルコースによるヒポタウリンのタウリンへの酵素的酸化が特に好ましい。本発明の実施例において、ヒポタウリンの生物工学的生産（実施例５）およびそのヒポタウリンのタウリンへの酵素的酸化（実施例６）が開示されている。
【0093】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、スルフィン酸がヒポタウリンであること、およびこのヒポタウリンが細菌産生に由来すること、すなわち調節が解除されたシステイン生合成経路を有する細菌生産株を用いて生産されることを特徴とする。調節が解除されたシステイン生合成経路を有する微生物株は、上述した定義の通りである。
【0094】
より好ましくは、システインが最初に生成され、これが式（１）に従って生産株に存在するＣＤＯ酵素を介してシステインスルフィン酸にさらに反応し（ＣＤＯ反応）、式（３）に従って生産株に同様に存在するＣＳＡＤ酵素を介してヒポタウリンに反応する（ＣＳＡＤ反応）。
【0095】
特に好ましくは、本方法は、スルフィン酸が、細菌生産株によって生産されるヒポタウリンであること、および生産株が株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣＹＳ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓまたは株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣＹＳ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株の１つであり、より好ましくは株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣＹＳ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓであることを特徴とする。
【0096】
したがって、本発明は、ヒポタウリンの生物工学的生産のための生産株も実証する。特に好ましい出発株は、システイン生産に適した株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓまたは株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓの１つである。本発明の実施例４に記載されるように、ベクターｐＣｙｓ（図１）は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号１のラタス・ノルベギカス（Rattus norvegicus）由来のシステインジオキシゲナーゼ（ＣＤｏｒｎ）の遺伝子、および配列番号４のアミノ酸配列を有する配列番号３のｎｔ１～ｎｔ１５０９のホモ・サピエンス（homo sapiens）由来のＬ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤｈｓ）で伸長される。これにより、ヒポタウリンの生産に適したベクターｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓがもたらされる（図２）。
【0097】
本発明において用いられるＣＤＯ遺伝子は、ラタス・ノルベギカス種に限定されるものではない。式（１）のｍＲＮＡ由来遺伝子産物（タンパク質）がＬ－システインをＬ－システインスルフィン酸に酸化するのに適した任意のＣＤＯ遺伝子が適している。そのようなタンパク質は、例えば、ＮＣＢＩデータベースにおいて、「ｐｒｏｔｅｉｎ」のサブデータベースで、検索用語を「システインジオキシゲナーゼ」として、ＣＤＯタンパク質を検索することにより見出すことができる。従来技術から公知であり、それらに限定されない他のＣＤＯタンパク質は、好ましくは、ホモ・サピエンス（ヒト）、シプリナス・カルピオ（Cyprinus carpio）（コイ）またはシネココッカス（Synechococcus）（藻類）に由来するＣＤＯタンパク質、またはそれらと７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質、より好ましくはそれらと８０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質であり、特に好ましくは、ＣＤＯタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２で特定される配列を有し、配列番号１で特定されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0098】
同様に、用いられるＣＳＡＤ遺伝子は、ホモ・サピエンス種に限定されるものではない。式（３）のｍＲＮＡ由来遺伝子産物（タンパク質）がＬ－システインスルフィン酸をヒポタウリンに脱炭酸するのに適した任意のＣＳＡＤ遺伝子が適している。そのようなタンパク質は、例えば、ＮＣＢＩデータベースにおいて、「ｐｒｏｔｅｉｎ」のサブデータベースで、検索用語を「システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ」として、ＣＳＡＤタンパク質を検索することにより見出すことができる。従来技術から公知であり、それらに限定されない他のＣＳＡＤタンパク質は、好ましくは、ラタス・ノルベギカス（ラット）、シプリナス・カルピオ（コイ）、シネココッカス（藻類）またはＥ．ｃｏｌｉ由来のＣＳＡＤタンパク質、またはそれらと７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質、より好ましくはそれらと８０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質であり、特に好ましくは、ＣＳＡＤタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４で特定される配列を有し、ｎｔ１－１５０９からの配列番号３で特定されるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0099】
ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子を含む遺伝子構築物、例えば、特に好ましくは構築物ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓは、例示目的で実施例４に詳述されているように、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて先行技術に従って生成することができる。
【0100】
これは、システインジオキシゲナーゼをコードするＣＤＯ遺伝子およびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼをコードするＣＳＡＤ遺伝子を、この目的に適したベクターにクローニングすることによって行われる。原則として、ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子を生産株で発現させることができる任意のベクターが適している。
【0101】
ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子を含む遺伝子構築物を生成するために、ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子は、それぞれが独自のプロモーターおよび任意にターミネーターを伴って別々の発現ユニットとしてベクターにクローニングされ得、または単一のプロモーターの制御下にあるオペロンとして任意の所望の配列にクローニングされ得る。また、それぞれ独自のリボソーム結合部位を有するＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子が、ベクターに既に存在する遺伝子の１つの後にクローニングされ、当該遺伝子のプロモーターの制御下で発現されるオペロン構造も可能である。さらに、ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子について、それら自身のプロモーター下、かつオペロンの形態での考えられる他のすべての発現の組み合わせが可能である。
【0102】
ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子が、調節が解除されたシステイン生合成を保証するベクター、例えばｐＣｙｓとは独立した別個の発現単位として別個のベクターにクローニングされること、またはＥ．ｃｏｌｉ等の宿主生物のゲノムに組み込まれることも考えられる。
【0103】
ＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子の発現の好ましい形態は、いずれについても独自のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を伴い、独自のプロモーターを有さない人工オペロンの形態である。
【0104】
特に好ましくは、ベクターは、ｐＣｙｓに存在するｓｅｒＡ３１７遺伝子の後にＣＤＯ遺伝子およびＣＳＡＤ遺伝子がクローニングされ、その結果、それらの発現が以下の発現ユニットの配列に従ってｓｅｒＡ３１７プロモーターの制御下で起こるｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓである：ｓｅｒＡプロモーター→（ｓｅｒＡ３１７－ｃｄｓ）→ＲＢＳ－（ＣＤＯｒｎ－ｃｄｓ）→ＲＢＳ－（ＣＳＡＤｈｓ－ｃｄｓ）－ｒｒｎＢターミネーター。発現ユニットが、ＣＳＡＤｃｄがＣＤＯｃｄの前に配置される構成であることも可能である。
【0105】
ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓは、３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ遺伝子）のフィードバック耐性バリアントｓｅｒＡ３１７、セリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ遺伝子）のフィードバック耐性バリアントＣｙｓＥＸ、およびシステイン排出タンパク質のｙｄｅＤ遺伝子の発現ユニットを含めることにより、システイン生合成の調節の解除を確実にするという追加の特徴を有する。本発明は、遺伝子ｓｅｒＡ３１７、ｃｙｓＥＸおよびｙｄｅＤの少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つが存在するベクターに関し、関係する遺伝子は任意の所望の選択および配列でベクター中に存在することが可能である。
【0106】
ＣＤＯおよびＣＳＡＤがベクターにクローン化されると、これは既知の方法で適切な宿主株に形質転換される。適切な宿主株は、組換えＤＮＡ技術にアクセス可能であり、かつ組換えタンパク質の発酵的生産に適している任意の微生物である。好ましい宿主株は、エシェリヒア・コリ種の株であり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０株またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ株である。特に好ましくはＷ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓまたはＷ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ等の形質転換から得られる株は、実施例５に記載されるように、ヒポタウリンの生産に適している。
【0107】
特に好ましくは株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓまたは株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓの１つを用いたヒポタウリンの生産は、振盪フラスコ中で培養するか（実施例５）、または生産規模で株を発酵させることによって達成することができる。
【0108】
本発明の方法において、形成されたヒポタウリンは、酵素的酸化によってタウリンに変換される。これは、ヒポタウリン含有細胞培養物を、その基質の存在下でＨ２Ｏ２生成オキシダーゼと共に、例えばグルコースの存在下でグルコースオキシダーゼと共にインキュベートすることによって行われる（実施例６参照）。
【0109】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、スルフィン酸がシステインスルフィン酸であり、形成されるスルホン酸がシステイン酸であることを特徴とする。
【0110】
好ましくは、本発明の方法は、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸のモル収率が、式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ２Ｈのスルフィン酸および式Ｈ２Ｎ－ＣＨ（Ｒ）－ＣＨ２－ＳＯ３Ｈのスルホン酸の用いられる添加モル濃度に基づいて、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％である。スルフィン酸の使用量は、好ましくは少なくとも１ｍＭ（１０９．２ｍｇ／Ｌ）、より好ましくは少なくとも１０ｍＭ（１．１ｇ／Ｌ）、特に好ましくは少なくとも１００ｍＭ（１０．９ｇ／Ｌ）である。
【0111】
モル収率の値を決定するために、酵素的酸化に用いられるスルフィン酸およびスルホン酸のモル含有量は、従来技術で知られているように、ＨＰＬＣによって反応の開始時点および終了時点に決定される。例えば、その決定は、ヒポタウリンの分子量１０９．２ｇ／ｍｏｌおよびタウリンの分子量１２５．２ｇ／ｍｏｌに基づいて、実施例１に記載されるように行うことができる。反応開始時点のスルフィン酸およびスルホン酸の全モル含有量に対する反応終了時点のバッチ中のスルホン酸のモル含有量は、スルホン酸のモル収率をパーセントで与える。
【図面の簡単な説明】
【0112】
【0113】
図中で用いられる略語：
ｂｌａ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）耐性遺伝子
ｋａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子
ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
ＰａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子のプロモーター
ＰａｒａＢ：ａｒａＢ遺伝子のプロモーター
Ｇａｍ：ラムダファージＧａｍ組換え遺伝子
Ｂｅｔ：ラムダファージＢｅｔ組換え遺伝子
Ｅｘｏ：ラムダファージＥｘｏ組換え遺伝子
ＯＲＩ１０１：温度感受性複製起点
ＲｅｐＡ：プラスミド複製タンパク質Ａの遺伝子
ｓａｃＢ：レバンスクラーゼ遺伝子
ｐｒ－ｆ：プライマーの結合部位ｆ（フォワード）
ｐｒ－ｒ：プライマーの結合部位ｒ（リバース）
ＯｒｉＣ：複製起点Ｃ
ＴｅｔＲ：テトラサイクリン耐性遺伝子
Ｐ１５ＡＯＲＩ：複製起点
ｓｅｒＡ３１７：ｓｅｒＡ（アミノ酸１～３１７をコードする３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）ｃｄｓ
ｃｙｓＥＸ：ｃｙｓＥ（セリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、フィードバック耐性）ｃｄｓ
ＯＲＦ３０６：ｙｄｅＤ（システイン排出遺伝子）ｃｄｓ
ＳｃａＩ：制限酵素ＳｃａＩの切断部位
ＰｐｕＭＩ：制限酵素ＰｐｕＭＩの切断部位
ＣＤＯｒｎ：ＣＤＯ（システインジオキシゲナーゼ）Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｃｄｓ
ＣＳＡＤｈｓ：ＣＳＡＤ（システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｃｄｓ
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
ｂｌａ：アンピシリン（β－ラクタマーゼ）耐性遺伝子
ｋａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子
ａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子（リプレッサー遺伝子）
ＰａｒａＣ：ａｒａＣ遺伝子のプロモーター
ＰａｒａＢ：ａｒａＢ遺伝子のプロモーター
Ｇａｍ：ラムダファージＧａｍ組換え遺伝子
Ｂｅｔ：ラムダファージＢｅｔ組換え遺伝子
Ｅｘｏ：ラムダファージＥｘｏ組換え遺伝子
ＯＲＩ１０１：温度感受性複製起点
ＲｅｐＡ：プラスミド複製タンパク質Ａの遺伝子
ｓａｃＢ：レバンスクラーゼ遺伝子
ｐｒ－ｆ：プライマーの結合部位ｆ（フォワード）
ｐｒ－ｒ：プライマーの結合部位ｒ（リバース）
ＯｒｉＣ：複製起点Ｃ
ＴｅｔＲ：テトラサイクリン耐性遺伝子
Ｐ１５ＡＯＲＩ：複製起点
ｓｅｒＡ３１７：ｓｅｒＡ（アミノ酸１～３１７をコードする３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）ｃｄｓ
ｃｙｓＥＸ：ｃｙｓＥ（セリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、フィードバック耐性）ｃｄｓ
ＯＲＦ３０６：ｙｄｅＤ（システイン排出遺伝子）ｃｄｓ
ＳｃａＩ：制限酵素ＳｃａＩの切断部位
ＰｐｕＭＩ：制限酵素ＰｐｕＭＩの切断部位
ＣＤＯｒｎ：ＣＤＯ（システインジオキシゲナーゼ）Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ｃｄｓ
ＣＳＡＤｈｓ：ＣＳＡＤ（システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ）Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｃｄｓ
ＲＢＳ：リボソーム結合部位
【0114】
以下の実施例は、本発明を限定することなくさらに説明するのに役立つ。
【実施例】
【0115】
実施例１：アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）によるヒポタウリンとシステインスルフィン酸の酸化
Ａ）ＡＯＸによるシステインスルフィン酸のシステイン酸への酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＡＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのＬ－システインスルフィン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム９．９ｍｌに溶解し、０．１ｍｌのメタノールを添加した（最終濃度１％ｖ／ｖ）。反応を開始するために、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム中のピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＡＯＸの市販の溶液３０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＡＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＡＯＸを含まない２番目のバッチ（比較バッチ）をｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム３０μｌで処理した。バッチを２５℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣで分析した。開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、ＡＯＸありのバッチおよびＡＯＸなしのバッチにおけるＬ－システインスルフィン酸およびＬ－システイン酸の含有量を表１にまとめる。
Ａ）ＡＯＸによるシステインスルフィン酸のシステイン酸への酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＡＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのＬ－システインスルフィン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム９．９ｍｌに溶解し、０．１ｍｌのメタノールを添加した（最終濃度１％ｖ／ｖ）。反応を開始するために、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム中のピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＡＯＸの市販の溶液３０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＡＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＡＯＸを含まない２番目のバッチ（比較バッチ）をｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム３０μｌで処理した。バッチを２５℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣで分析した。開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、ＡＯＸありのバッチおよびＡＯＸなしのバッチにおけるＬ－システインスルフィン酸およびＬ－システイン酸の含有量を表１にまとめる。
【0116】
【表1】
【0117】
Ｂ）ＡＯＸによるヒポタウリンのタウリンへの酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＡＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム９．９ｍｌに溶解し、０．１ｍｌのメタノールを添加した（最終濃度１％ｖ／ｖ）。反応を開始するために、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム中のピキア・パストリス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＡＯＸの市販の溶液３０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＡＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＡＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム３０μｌで処理した。バッチを２５℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣで分析した。開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）ありのバッチおよびアルコールオキシダーゼなしのバッチにおけるヒポタウリンおよびタウリンの含有量を表２にまとめる。
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＡＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム９．９ｍｌに溶解し、０．１ｍｌのメタノールを添加した（最終濃度１％ｖ／ｖ）。反応を開始するために、ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム中のピキア・パストリス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＡＯＸの市販の溶液３０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＡＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＡＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸ナトリウム３０μｌで処理した。バッチを２５℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣで分析した。開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）ありのバッチおよびアルコールオキシダーゼなしのバッチにおけるヒポタウリンおよびタウリンの含有量を表２にまとめる。
【0118】
【表2】
【0119】
Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システイン酸、ヒポタウリンおよびタウリンのＨＰＬＣ分析：
実施例において定量分析した化合物の定量には、Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システイン酸、ヒポタウリンおよびタウリンについてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用い；較正に用いた参照物質はすべて市販されているものである（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から公知であるように、同じ製造者からのｏ－フタルジアルデヒドによるプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のためのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システイン酸、ヒポタウリンおよびタウリンのＯＰＡ誘導体化生成物を検出するために、ＨＰＬＣシステムに蛍光検出器を備え付けた。検出器を、３３０ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長に設定した。また、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製の長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラムを、カラムオーブン内で４０℃で熱的に平衡化して用いた。
溶離液Ａ：ｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸ナトリウム
溶離液Ｂ：メタノール
実施例において定量分析した化合物の定量には、Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システイン酸、ヒポタウリンおよびタウリンについてそれぞれ較正したＨＰＬＣ法を用い；較正に用いた参照物質はすべて市販されているものである（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。アミノ酸の分析から公知であるように、同じ製造者からのｏ－フタルジアルデヒドによるプレカラム誘導体化（ＯＰＡ誘導体化）のためのユニットを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステムを用いた。Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システイン酸、ヒポタウリンおよびタウリンのＯＰＡ誘導体化生成物を検出するために、ＨＰＬＣシステムに蛍光検出器を備え付けた。検出器を、３３０ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長に設定した。また、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製の長さ１００ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒径２．６μｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ（商標）ａＱカラムを、カラムオーブン内で４０℃で熱的に平衡化して用いた。
溶離液Ａ：ｐＨ６．０の２５ｍＭリン酸ナトリウム
溶離液Ｂ：メタノール
【0120】
分離はグラジエントモードで行った：０．５ｍｌ／分の流速で、０～２５分間で１０％溶離液Ｂから６０％溶離液Ｂへ、続いて２分間で６０％溶離液Ｂから１００％溶離液Ｂへ、続いてさらに２分間で１００％溶離液Ｂまで。Ｌ－システイン酸の保持時間：３．２分。Ｌ－システインスルフィン酸の保持時間：４．１分。タウリンの保持時間：１４．８分。ヒポタウリンの保持時間：１５．７分。
【0121】
実施例２：グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）によるヒポタウリンおよびシステインスルフィン酸の酸化
Ａ）ＧＯＸによるシステインスルフィン酸のシステイン酸への酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＧＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのＬ－システインスルフィン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム９．５ｍｌに溶解し、同じ緩衝液中の２００ｇ／Ｌグルコース溶液０．５ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＧＯＸの市販の溶液５０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＧＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム５０μｌで処理した。バッチを３０℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清を上述したようにＨＰＬＣにより分析した。
Ａ）ＧＯＸによるシステインスルフィン酸のシステイン酸への酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＧＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのＬ－システインスルフィン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム９．５ｍｌに溶解し、同じ緩衝液中の２００ｇ／Ｌグルコース溶液０．５ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＧＯＸの市販の溶液５０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＧＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム５０μｌで処理した。バッチを３０℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清を上述したようにＨＰＬＣにより分析した。
【0122】
開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、ＧＯＸありのバッチおよびＧＯＸなしのバッチにおけるＬ－システインスルフィン酸およびＬ－システイン酸の含有量を表３にまとめる。
【0123】
【表3】
【0124】
Ｂ）ＧＯＸによるヒポタウリンのタウリンへの酸化：
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＧＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム９．５ｍｌに溶解し、同じ緩衝液中の２００ｇ／Ｌグルコース溶液０．５ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５溶液の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＧＯＸの市販の溶液５０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＧＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム５０μｌで処理した。バッチを３０℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清を上述したようにＨＰＬＣにより分析した。
この反応は、２つの並行するバッチ、すなわちＧＯＸありおよびなしで調査された。１２ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２つの１００ｍｌコニカルフラスコのそれぞれに秤量し；これをｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム９．５ｍｌに溶解し、同じ緩衝液中の２００ｇ／Ｌグルコース溶液０．５ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５溶液の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）由来のＧＯＸの市販の溶液５０μｌを１つのバッチに入れた。製造者の情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。ＧＯＸを含まないバッチ（比較バッチ）をｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム５０μｌで処理した。バッチを３０℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始時および反応開始から５時間後に、各バッチから１ｍｌを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清を上述したようにＨＰＬＣにより分析した。
【0125】
開始時（０時間）および５時間の反応時間後の、ＧＯＸありのバッチおよびＧＯＸなしのバッチにおけるヒポタウリンおよびタウリンの含有量を表４にまとめる。
【0126】
【表4】
【0127】
実施例３：ＧＯＸによるヒポタウリンのタウリンへの予備的酸化
この反応は、２つの並行するバッチで、すなわち異なる用量の酵素ＧＯＸで調査され、酸化されるヒポタウリン基質の濃度は、それぞれの場合で２０ｇ／Ｌであった。
この反応は、２つの並行するバッチで、すなわち異なる用量の酵素ＧＯＸで調査され、酸化されるヒポタウリン基質の濃度は、それぞれの場合で２０ｇ／Ｌであった。
【0128】
バッチ１では、２００ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００ｍｌの三角フラスコに秤量し、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム６．９５ｍｌに溶解し、同じバッファー中の２００ｇ／Ｌのグルコース溶液３ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー由来のＧＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の市販の溶液５０μｌを添加した。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５Ｕ／ｍｌであった。
【0129】
バッチ２では、２００ｍｇのヒポタウリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００ｍｌの三角フラスコに秤量し、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム６．５ｍｌに溶解し、同じバッファー中の２００ｇ／Ｌグルコース溶液３ｍｌを添加した。反応を開始するために、ｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー由来のＧＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の市販の溶液５００μｌを添加した。製造者の酵素活性に関する情報によると、バッチ中のＧＯＸ活性は５０Ｕ／ｍｌであった。
【0130】
バッチ１および２を、３０℃および１４０ｒｐｍで振盪した（Ｉｎｆｏｒｓインキュベーターシェーカー）。反応開始から３時間、６時間および２４時間後に、各バッチの１ｍｌアリコートを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清を上述したようにＨＰＬＣにより分析した。時間経過に伴う反応の経過を表５にまとめる。
【0131】
【表5】
【0132】
実施例４：ヒポタウリン生産株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓの作製
システインジオキシゲナーゼＣＤＯｒｎ：
ＣＤＯｒｎ：ラタス・ノルベギカス由来のシステインジオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、配列ＩＤ：ＡＡＨ７０５０９．１としてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに開示されている。アミノ酸配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化されたＤＮＡ配列を導き出し（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）、それを合成的に生成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。ＣＤＯｒｎと命名されたこのＤＮＡ配列は、配列番号１に開示され、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
システインジオキシゲナーゼＣＤＯｒｎ：
ＣＤＯｒｎ：ラタス・ノルベギカス由来のシステインジオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、配列ＩＤ：ＡＡＨ７０５０９．１としてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに開示されている。アミノ酸配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化されたＤＮＡ配列を導き出し（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）、それを合成的に生成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。ＣＤＯｒｎと命名されたこのＤＮＡ配列は、配列番号１に開示され、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【0133】
システインスルフィン酸デカルボキシラーゼＣＳＡＤｈｓ：
ホモ・サピエンス由来のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤｈｓ）のアミノ酸配列は、配列ＩＤ：ＸＰ＿０１６８６１７８６．１としてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに開示されている。アミノ酸配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化されたＤＮＡ配列を導き出した（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）。ＣＳＡＤｈｓと命名されたこのＤＮＡ配列は、配列番号３のｎｔ１～１５０９に開示され、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢターミネーターのＤＮＡ配列（配列番号：３のｎｔ１５１０～１８４２）をｎｔ１５０９に結合させた。ｒｒｎＢターミネーターのＤＮＡ配列は、Orosz et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201: 653-659に開示されている。ＣＳＡＤｈｓ ｃｄｓおよびｒｒｎＢターミネーターからなる配列番号３に開示されるＤＮＡは、合成的に生成され（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢと命名された。
ホモ・サピエンス由来のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤｈｓ）のアミノ酸配列は、配列ＩＤ：ＸＰ＿０１６８６１７８６．１としてＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに開示されている。アミノ酸配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化されたＤＮＡ配列を導き出した（公開されているＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧＥＮＥｉｕｓソフトウェア）。ＣＳＡＤｈｓと命名されたこのＤＮＡ配列は、配列番号３のｎｔ１～１５０９に開示され、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｒｎＢターミネーターのＤＮＡ配列（配列番号：３のｎｔ１５１０～１８４２）をｎｔ１５０９に結合させた。ｒｒｎＢターミネーターのＤＮＡ配列は、Orosz et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201: 653-659に開示されている。ＣＳＡＤｈｓ ｃｄｓおよびｒｒｎＢターミネーターからなる配列番号３に開示されるＤＮＡは、合成的に生成され（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢと命名された。
【0134】
ベクターｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓの作製：
－ベクターｐＣｙｓ（図１）は、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に開示されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の誘導体であるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７を指す。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６には、複製起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子（親ベクターｐＡＣＹＣ１８４）だけでなく、システインによるフィードバック阻害が低減したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥＸ対立遺伝子、および排出遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）も含まれており、その発現は構成的ＧＡＰＤＨプロモーターによって制御される。
－ベクターｐＣｙｓ（図１）は、ＥＰ０８８５９６２Ｂ１に開示されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６の誘導体であるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７を指す。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６には、複製起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子（親ベクターｐＡＣＹＣ１８４）だけでなく、システインによるフィードバック阻害が低減したセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥＸ対立遺伝子、および排出遺伝子ｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）も含まれており、その発現は構成的ＧＡＰＤＨプロモーターによって制御される。
【0135】
ｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６－ｓｅｒＡ３１７を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＳｅｒＡタンパク質のＮ末端の３１７アミノ酸をコードし、Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184（その中では「ＮＳＤ：３１７」と呼ばれる）に開示されているｓｅｒＡ３１７遺伝子断片が、ｐＡＣＹＣ１８４－ｃｙｓＥＸ－ＧＡＰＤＨ－ＯＲＦ３０６のｙｄｅＤ（ＯＲＦ３０６）排出遺伝子の後にクローニングされた。ＳｅｒＡ３１７は、３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのセリンフィードバック耐性バリアントをコードする。ｓｅｒＡ３１７の発現は、ｓｅｒＡプロモーターによって調節される。
【0136】
調節が解除された生合成の結果として、ｐＣｙｓで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、誘導産物であるシステインスルフィン酸とヒポタウリンの開始産物であるシステインを生産する。
【0137】
－ベクターｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ（図２）：
ｐＣｙｓをＳｃａＩおよびＰｐｕＭＩにより切断した。それによって得られた６．１ｋｂのベクター断片を、分取アガロースゲル電気泳動（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。
ｐＣｙｓをＳｃａＩおよびＰｐｕＭＩにより切断した。それによって得られた６．１ｋｂのベクター断片を、分取アガロースゲル電気泳動（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。
【0138】
ＣＤＯｒｎ ＤＮＡを、プライマーｃｄｏｒｎ－１ｆ（配列番号５）およびｃｓａｄｈｓ－２ｒ（配列番号：６）を用いて、ＰＣＲ（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））によって配列番号１の合成ＤＮＡ（ＣＤＯｒｎ）から増幅し、０．６ｋｂの断片として単離した。
【0139】
プライマーｃｄｏｒｎ－１ｆは、５’末端から始まり、ＳｃａＩ消化により得られた６．１ｋｂのｐＣｙｓ ＳｃａＩ／ＰｐｕＭＩベクター断片（配列番号５のｎｔ１～２８）の３’末端と重複する２８ｎｔ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）（配列番号５のｎｔ３１～３６）、およびＣＤＯｒｎ ｃｄｓの最初の２２ｎｔ（配列番号５のｎｔ４４～６５）を含んでいた。
【0140】
プライマーｃｓａｄｈｓ－２ｒは、５’末端から始まり、ＣＳＡＤｈｓ ｃｄｓの開始点と重複する２２ｎｔ（配列番号：６のｎｔ１～２２）、その後にリボソーム結合部位（配列番号６のｎｔ３０～３５）およびＣＤＯｒｎ ｃｄｓの最後の２０ｎｔ（配列番号６のｎｔ３８～５７）を逆相補体形態で含んでいた。
【0141】
－ＤＮＡ断片を、ＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢＤＮＡ：プライマーｃｓａｄｈｓ－３ｆ（配列番号７）およびｇｌｆ－２ｒ（配列番号８）を用いて、ＰＣＲ（「Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ」ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））によって配列番号３（ＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢ）の合成ＤＮＡから増幅し、１．８ｋｂの断片として単離した。
【0142】
プライマーｃｓａｄｈｓ－３ｆは、５’末端から始まり、ＣＤＯｒｎ ｃｄｓの３’末端と重複する２０ｎｔ（配列番号７のｎｔ１～２０）、リボソーム結合部位（配列番号７のｎｔ２３～２８）、およびＣＳＡＤｈｓ ｃｄｓの最初の２２ｎｔ（配列番号７のｎｔ３６～５７）を含んでいた。
【0143】
プライマーｇｌｆ－２ｒは、５’末端から始まり、ＰｐｕＭＩ消化により得られた６．１ｋｂのｐＣｙｓ ＳｃａＩ／ＰｐｕＭＩベクター断片（配列番号８のｎｔ１～３３）の５’末端と重複する３３ｎｔ、その後にｒｒｎＢターミネーターの最後の２２ｎｔ（配列番号８のｎｔ３４～５５）を逆相補体形態で含んでいた。
【0144】
－ベクターｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ：６．１ｋｂのｐＣｙｓ ＳｃａＩ／ＰｐｕＭＩベクター断片、０．６ｋｂのＣＤＯｒｎのＰＣＲ産物（ＣＤＯｒｎ ＤＮＡ）、および１．８ｋｂのＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢのＰＣＲ産物（ＣＳＡＤｈｓ－ｒｒｎＢＤＮＡ）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）クローニングキット（ＮＥＢ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造元の指示に従ってライゲーションした。
【0145】
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ（登録商標）１０－ベータ細胞（ＮＥＢ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をライゲーション混合物で形質転換した。形質転換からのクローンをＬＢｔｅｔで選択した。ＬＢｔｅｔには、１０ｇ／Ｌのトリプトン（Ｇｉｂｃｏ（商標））、５ｇ／Ｌの酵母抽出物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌの寒天、および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれていた。形質転換からの単一クローンを、ＬＢｔｅｔ液体培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン）で培養し、培養物中の細胞ペレットからベクターを単離することによって分析した。正しい８．５ｋｂベクターは、ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓと命名された（図２）。
【0146】
－Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株：
用いた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］から株番号ＤＳＭ５９１１として市販されている）であった。
用いた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］から株番号ＤＳＭ５９１１として市販されている）であった。
【0147】
－Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ株：
用いた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩであった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩは、配列番号１０のタンパク質配列を有するタンパク質をコードする変異ｐｐｓＡ遺伝子ｐｐｓＡ－ＭＨＩ（配列番号９）およびＰＥＰシンターゼ（ＫＥＧＧデータベースにおいてＥＣ２．７．９．２で指定される酵素クラス）の酵素活性を特徴とする。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩは、当業者に公知の遺伝子改変のためのラムダ－レッド組換えおよびカウンターセレクションスクリーニングの組み合わせを用いることによって生産された（例えば、ee for example Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０のｐｐｓＡＷＴ遺伝子をｐｐｓＡ－ＭＨＩと置換するために、以下の手順を行った。
１）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０をプラスミドｐＫＤ４６（図３、アクセス番号ＡＹ０４８７４６．１として「ＧｅｎＢａｎｋ」遺伝子データベースに開示される）で形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６株を単離した（アンピシリン選択）。
２）プラスミドｐＫａｎ－ｓａｃＢ（図４）から、３．２ｋｂのＫａｎ－ｓａｃＢカセットを、プライマーｐｐｓ－９ｆ（配列番号１１、図４において「ｐｒ－ｆ」と指定された部位に結合する）、およびｐｐｓ－１０ｒ（配列番号１２、図４において「ｐｒ－ｒ」と指定された部位に結合する）を用いたＰＣＲによって単離した。プラスミドｐＫａｎ－ｓａｃＢには、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子および酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の両方の発現カセットが含まれていた。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）は、アクセス番号ＳＨ０２＿０３４００としてＮＣＢＩデータベースに開示されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｓａｃＢ遺伝子は、アクセス番号９３６４１３としてＮＣＢＩデータベースに開示されている。
プライマーｐｐｓ－９ｆは、ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の最初の３０ｎｔ（配列番号９のｎｔ１～３０と同一）、およびそれに接続された、図４において「ｐｒ－ｆ」と指定された部位の２０ｎｔを含む。プライマーｐｐｓ－１０ｒは、ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の最後の３０ｎｔ（配列番号９のｎｔ２３５０～２３７９と同一）、およびそれに接続された、図４において「ｐｒ－ｒ」と指定された部位の２０ｎｔを逆補体形態で含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６を３．２ｋｂのＫａｎ－ｓａｃＢカセットで形質転換し、カナマイシン耐性クローンを単離した。
４）得られたクローンをＬＢＳＣプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７％のスクロース、１．５％の寒天、および１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に播種した。組み込まれたｓａｃＢ遺伝子を有するクローンは、スクロースから有毒なレバンを生成し、これにより成長阻害（スクロース感受性）がもたらされた。カナマイシン耐性でスクロース感受性のクローンを選択し、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ：：Ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６と命名した。
５）Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ：：Ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６をｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子のＤＮＡ（配列番号９、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから合成的に生成）で形質転換し、クローンをカナマイシンを含まないＬＢＳプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、７％のスクロース、１．５％の寒天）で選抜した。活性なｓａｃＢ遺伝子を含まなくなったクローンのみがＬＢＳプレートで増殖することができた。これらのクローンをＬＢｋａｎプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％の寒天、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に播種し、活性なＫａｎ遺伝子をも含んでおらず、その増殖がカナマイシンの存在下で阻害されるクローンを選抜した。
６）スクロース存在下で正の増殖を示し、カナマイシン存在下で負の増殖を示すクローンを選抜し、ＰＣＲにより株のゲノムＤＮＡからｐｐｓＡＭＨＩ遺伝子を単離し、ＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により、配列番号９に開示されるＤＮＡ配列を有するｐｐｓＡＭＨＩ遺伝子が組み込まれており、配列番号１０からの配列に対応するタンパク質をコードしていることを確認した。４２℃でのインキュベーションによるプラスミドｐＫＤ４６の除去後、この株を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩと命名した。
用いた株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩであった。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩは、配列番号１０のタンパク質配列を有するタンパク質をコードする変異ｐｐｓＡ遺伝子ｐｐｓＡ－ＭＨＩ（配列番号９）およびＰＥＰシンターゼ（ＫＥＧＧデータベースにおいてＥＣ２．７．９．２で指定される酵素クラス）の酵素活性を特徴とする。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩは、当業者に公知の遺伝子改変のためのラムダ－レッド組換えおよびカウンターセレクションスクリーニングの組み合わせを用いることによって生産された（例えば、ee for example Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245）。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０のｐｐｓＡＷＴ遺伝子をｐｐｓＡ－ＭＨＩと置換するために、以下の手順を行った。
１）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０をプラスミドｐＫＤ４６（図３、アクセス番号ＡＹ０４８７４６．１として「ＧｅｎＢａｎｋ」遺伝子データベースに開示される）で形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６株を単離した（アンピシリン選択）。
２）プラスミドｐＫａｎ－ｓａｃＢ（図４）から、３．２ｋｂのＫａｎ－ｓａｃＢカセットを、プライマーｐｐｓ－９ｆ（配列番号１１、図４において「ｐｒ－ｆ」と指定された部位に結合する）、およびｐｐｓ－１０ｒ（配列番号１２、図４において「ｐｒ－ｒ」と指定された部位に結合する）を用いたＰＣＲによって単離した。プラスミドｐＫａｎ－ｓａｃＢには、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子および酵素レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の両方の発現カセットが含まれていた。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）は、アクセス番号ＳＨ０２＿０３４００としてＮＣＢＩデータベースに開示されている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｓａｃＢ遺伝子は、アクセス番号９３６４１３としてＮＣＢＩデータベースに開示されている。
プライマーｐｐｓ－９ｆは、ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の最初の３０ｎｔ（配列番号９のｎｔ１～３０と同一）、およびそれに接続された、図４において「ｐｒ－ｆ」と指定された部位の２０ｎｔを含む。プライマーｐｐｓ－１０ｒは、ｐｐｓＡ ＷＴ遺伝子の最後の３０ｎｔ（配列番号９のｎｔ２３５０～２３７９と同一）、およびそれに接続された、図４において「ｐｒ－ｒ」と指定された部位の２０ｎｔを逆補体形態で含む。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＫＤ４６を３．２ｋｂのＫａｎ－ｓａｃＢカセットで形質転換し、カナマイシン耐性クローンを単離した。
４）得られたクローンをＬＢＳＣプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７％のスクロース、１．５％の寒天、および１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に播種した。組み込まれたｓａｃＢ遺伝子を有するクローンは、スクロースから有毒なレバンを生成し、これにより成長阻害（スクロース感受性）がもたらされた。カナマイシン耐性でスクロース感受性のクローンを選択し、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ：：Ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６と命名した。
５）Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ：：Ｋａｎ－ｓａｃＢ×ｐＫＤ４６をｐｐｓＡ－ＭＨＩ遺伝子のＤＮＡ（配列番号９、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから合成的に生成）で形質転換し、クローンをカナマイシンを含まないＬＢＳプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキス、７％のスクロース、１．５％の寒天）で選抜した。活性なｓａｃＢ遺伝子を含まなくなったクローンのみがＬＢＳプレートで増殖することができた。これらのクローンをＬＢｋａｎプレート（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．５％の寒天、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシン）に播種し、活性なＫａｎ遺伝子をも含んでおらず、その増殖がカナマイシンの存在下で阻害されるクローンを選抜した。
６）スクロース存在下で正の増殖を示し、カナマイシン存在下で負の増殖を示すクローンを選抜し、ＰＣＲにより株のゲノムＤＮＡからｐｐｓＡＭＨＩ遺伝子を単離し、ＤＮＡシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により、配列番号９に開示されるＤＮＡ配列を有するｐｐｓＡＭＨＩ遺伝子が組み込まれており、配列番号１０からの配列に対応するタンパク質をコードしていることを確認した。４２℃でのインキュベーションによるプラスミドｐＫＤ４６の除去後、この株を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩと命名した。
【0148】
－生産株：ベクターｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓのプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０株およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ株に形質転換した。比較のために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩをベクターｐＣｙｓで形質転換した。ＬＢｔｅｔで形質転換体を選抜した。それぞれの場合について１つのクローンを単離した。株を、それぞれＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓと命名し、同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓと命名した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓを、ヒポタウリンの生産のための生産株として用いた。
【0149】
実施例５：振盪フラスコにおけるヒポタウリンの生産
ＬＢｔｅｔ液体培地における前培養物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓから作製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した）。
ＬＢｔｅｔ液体培地における前培養物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓから作製した（３７℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した）。
【0150】
本培養物：０．５ｍｌｎ前培養物を、１５ｇ／Ｌのグルコース、２ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＬ－イソロイシン、０．１ｇ／ＬのＤ，Ｌ－メチオニン、０．１ｇ／ＬのＬ－スレオニン、５ｍｇ／ＬのビタミンＢ、および１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む３０ｍｌのＳＭ１－Ａｃ培地を入れた３００ｍｌのコニカルフラスコ（バッフル付き）に入れた。
【0151】
ＳＭ１－Ａｃ培地の組成：１２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＮＨ４アセテート、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、０．１ｇ／ＬのＮａＣｌ；１ｍｌ／Ｌの微量元素溶液。
【0152】
微量元素溶液の組成：０．１５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．７ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。
【0153】
本培養物を、インキュベーターシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で、３０℃、１４０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２４時間後、１ｍｌのサンプルを採取し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＧｅｎｅｓｙｓ（商標） １０Ｓ ＵＶ／可視分光光度計を用いて、細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ（６００ｎｍで測光的に測定した本培養物の光学密度）を測定し、ヒポタウリンおよびタウリンの量をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣにより測定された培養上清中のヒポタウリンの含有量は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓについて１５７．３ｍｇ／Ｌ（培養物の細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ：５．３／ｍｌ）であった。培養上清中のタウリンの含有量は５２．８ｍｇ／Ｌであった。
【0154】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ（培養物の細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ：７．１／ｍｌ）について、ＨＰＬＣにより測定された培養上清中のヒポタウリンの含有量は１０５９．２ｍｇ／Ｌであり、タウリンの含有量は３０４．１ｍｇ／Ｌであった。
【0155】
２種の比較株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０ｘｐＣｙｓ（培養物の細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ：６．１／ｍＬ）およびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩｘｐＣｙｓ（培養物の細胞密度ＯＤ６００／ｍｌ：７．５／ｍｌ）については、ヒポタウリンもタウリンも検出できなかった。
【0156】
実施例６：振盪フラスコ培養からタウリンへのヒポタウリンの酸化
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ（実施例５）の振盪フラスコ培養物からの各バッチ１０ｍｌを、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０Ｒ）、それぞれの上清９．４ｍｌを１００ｍｌコニカルフラスコに移し、０．７ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した。これに、Ｈ２Ｏ中のグルコースの２００ｇ／Ｌ溶液０．５ｍｌ（混合物中の最終濃度１０ｇ／Ｌ）、およびｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー由来のＧＯＸの１Ｕ／μｌストック溶液１００μｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（最終濃度１０Ｕ／ｍｌ）を添加し、バッチ（容量１０ｍｌ）をインキュベーターシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で３０℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーションの開始時および開始から２時間後に、各バッチの１ｍｌアリコートを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣにより分析した。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ（実施例５）の振盪フラスコ培養物からの各バッチ１０ｍｌを、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０Ｒ）、それぞれの上清９．４ｍｌを１００ｍｌコニカルフラスコに移し、０．７ＭのＮａＯＨでｐＨ５．５に調整した。これに、Ｈ２Ｏ中のグルコースの２００ｇ／Ｌ溶液０．５ｍｌ（混合物中の最終濃度１０ｇ／Ｌ）、およびｐＨ５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中のアスペルギルス・ニガー由来のＧＯＸの１Ｕ／μｌストック溶液１００μｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（最終濃度１０Ｕ／ｍｌ）を添加し、バッチ（容量１０ｍｌ）をインキュベーターシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ）中で３０℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーションの開始時および開始から２時間後に、各バッチの１ｍｌアリコートを採取し、８０℃で５分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｈｅｒａｅｕｓ（商標）Ｆｒｅｓｃｏ（商標）２１遠心分離機）、上清をＨＰＬＣにより分析した。
【0157】
表６にまとめられているように、振盪フラスコ培養物（実施例５）中に存在するヒポタウリン－Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株では１５７．３ｍｇ／Ｌ、Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓでは１０５９．２ｍｇ／Ｌ－は完全に消費され、それぞれ２１２．８ｍｇ／Ｌおよび１３５５．６ｍｇ／Ｌの濃度のタウリンが形成された。モル収率は、分子量の相違を考慮して決定された（ヒポタウリンは１０９．２ｇ／ｍｏｌ、タウリンは１２５．２ｇ／ｍｏｌ）。表６に示すように、Ｗ３１１０×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株の場合、反応開始時のヒポタウリン（１．４ｍＭ）およびタウリン（０．４ｍＭ）を合わせた含有量は１．８ｍＭであった。反応開始から２時間後、タウリン含有量は１．７ｍＭであり、ヒポタウリンは検出されなくなった。ヒポタウリン／タウリン生成物混合物の酵素的酸化からの、すなわち、振盪フラスコ培養からのヒポタウリンおよびタウリンの総入力（１．４＋０．４＝１．８ｍＭ）に基づくタウリンのモル収率は、９４．４％であった。Ｗ３１１０－ｐｐｓＡ－ＭＨＩ×ｐＣｙｓ－ＣＤＯｒｎ－ＣＳＡＤｈｓ株の場合、反応開始時のヒポタウリン（９．７ｍＭ）およびタウリン（２．４ｍＭ）を合わせた含有量は１２．１ｍＭであった。反応開始から２時間後、タウリン含有量は１０．８ｍＭであり、ヒポタウリンは検出されなくなった。ヒポタウリン／タウリン生成物混合物の酵素的酸化からの、すなわち、振盪フラスコ培養からのヒポタウリンおよびタウリンの総入力（９．７＋２．４＝１２．１ｍＭ）に基づくタウリンのモル収率は、８９．３％であった。
【0158】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】