特表 2023-547045 ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２受容体結合ドメインと担体タンパク質との共有結合コンジュゲート並びにそれらを含有するワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-09

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２受容体結合ドメインと担体タンパク質との共有結合コンジュゲート並びにそれらを含有するワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/64 20170101AFI20231101BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231101BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20231101BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20231101BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20231101BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64 ZNA

A61K39/215

A61P37/04

A61P31/14

A61K39/39

C07K14/165

C07K14/195

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023521032

(86)(22)【出願日】2021-10-05

(85)【翻訳文提出日】2023-06-02

(86)【国際出願番号】 CU2021050009

(87)【国際公開番号】W WO2022073528

(87)【国際公開日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】CU-2020-0069

(32)【優先日】2020-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523057415

【氏名又は名称】インスティテュート フィンレイ デ バクナス

(71)【出願人】

【識別番号】509352381

【氏名又は名称】セントロ デ インミュノロヒア モレキュラル

(71)【出願人】

【識別番号】518390697

【氏名又は名称】ウニベルシダ デ ラ ハバナ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バルデス バルビン、ユーリー

(72)【発明者】

【氏名】サンタナ メデロス、ダリエリス

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデス カスティーリョ、ソンシレ

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア リベラ、ダグマー

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア リベラ、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア リカルド、マヌエル

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス ノダ、ローラ マルタ

(72)【発明者】

【氏名】ラミレス ゴンザレス、ウベル ヘスス

(72)【発明者】

【氏名】サンチェス ラミレス、ベリンダ

(72)【発明者】

【氏名】ボッギアノ アヨ、タミー

(72)【発明者】

【氏名】オヒト マガス、エドアルド

(72)【発明者】

【氏名】ベレス ベンコモ、ビンセント ギレルモ

(72)【発明者】

【氏名】オリバ、ヘルナンデス、レイナルド

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB15

4C076CC06

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC21

4C085DD59

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF02

4C085GG03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045CA11

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA31

4H045FA10

4H045GA10

(57)【要約】

本発明は、バイオテクノロジー、より具体的にはヒトの健康の分野に関する。この文書は、特に、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインのコンジュゲート、それらを得るために使用される方法、及びそれらを含有するワクチン組成物を記載する。本発明に記載されるワクチン組成物は、中和抗体の強い応答を誘導するので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防に有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と担体タンパク質とを含む、共有結合コンジュゲート。

【請求項2】

担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、及びジフテリアトキソイド変異体ＣＲＭ１９７を含む群から選択される、請求項１に記載の共有結合コンジュゲート。

【請求項3】

ＲＢＤ－担体タンパク質のモル比が、担体タンパク質あたり１～８のＲＢＤの範囲内である、請求項１又は２に記載の共有結合コンジュゲート。

【請求項4】

ＲＢＤが、配列番号１、２及び３を含む群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。

【請求項5】

配列番号１のＲＢＤがその二量体形態で使用される、請求項１から４のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。

【請求項6】

ＲＢＤが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌及び酵母を含む群から選択される宿主において産生される、請求項１から５のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。

【請求項7】

請求項１から５のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲートを含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導するために使用されるワクチン組成物。

【請求項8】

水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムを含む群から選択されるアジュバントも含む、請求項７に記載のワクチン組成物。

【請求項9】

コンジュゲートが、用量あたり１～３０μｇのＲＢＤの濃度範囲である、請求項７に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

アジュバントが、用量あたり２００～１５００μｇの濃度範囲である、請求項８に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

適切な医薬賦形剤も含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項12】

以下の段階Ａ）チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）基を導入するための担体タンパク質の官能基化、Ｂ）担体タンパク質のＲＢＤへの共有結合コンジュゲーション、及びＣ）精製からなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲートを調製するための手順。

【請求項13】

段階Ａの前にＲＢＤ二量体のインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元からなる追加の工程を含む、請求項１２に記載の手順。

【請求項14】

段階Ａの前にＲＢＤのＮ末端のチオール化からなる追加の工程を含む、請求項１２に記載の手順。

【請求項15】

配列番号１が使用される、請求項１３に記載の手順。

【請求項16】

配列番号１から３のいずれかが使用される、請求項１４に記載の手順。

【請求項17】

段階Ａで導入されるチオフィリック基が、マレイミド、ブロモアセチル、ビニルスルホン、アクリラート、アクリルアミド、アクリロニトリル、及びメタクリラートを含む群から選択される、請求項１２に記載の手順。

【請求項18】

請求項１２から１７のいずれか一項に記載の手順に従って得られるコンジュゲート。

【請求項19】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための、請求項７から１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。

【請求項20】

ワクチン組成物の二回投与後に中和抗体応答が必要とされる際に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための、請求項７から１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。

【請求項21】

１μｇ～３０μｇでの１用量～３用量のＲＢＤの筋肉内ワクチン接種スケジュールを適用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体応答を誘導するための、請求項７から１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー、より具体的にはヒトの健康の分野に関する。この文書は、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインと担体タンパク質との共有結合コンジュゲート、それらを得るために使用される方法、及びそれらを含有するワクチン組成物を記載する。

【背景技術】

【0002】

ＣＯＶＩＤ－１９は、病因不明の肺炎の重篤な症例が報告され始めた２０１９年１２月に中国の武漢で発見された非常に最近の疾患である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる疾患は、その急速な広がり、並びに５０％未満を占める症候性患者の場合には発熱、咳、鼻漏、喉の痛み及び呼吸困難などの症状の出現を特徴とする。この疾患に感染した残りの人々は無症候性であり、これはウイルスの拡散における重要な要因であり、その制御に関して疫学的課題を表している（www.who.int/emergencies /diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports. Consulted on 13 August 2020におけるＷＨＯコロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－２０１９）状況報告書）。

【0003】

ＭＥＲＳ及びＳＡＲＳとして知られるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同様の他のコロナウイルスは、過去数十年に同様の流行を既に引き起こしている。ＳＡＲＳはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とのより大きな相同性を示し、それらの間の主な類似性の１つは、両方のウイルスがＡＣＥ２タンパク質を受容体として使用してヒト細胞に浸透することである。したがって、ＳＡＲＳもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も、Ｓ１ウイルスタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）タンパク質との相互作用が、ヒトがウイルスに感染する決定的要因である。（Walls A et al (2020) Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.058）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤは、約１９５アミノ酸の断片（配列３３３～２５７）であり、それは、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含有し、ウイルスがＡＣＥ２受容体と相互作用する領域である。ＲＢＤは、システインＣｙｓ３３６－Ｃｙｓ３６１、Ｃｙｓ３７９－Ｃｙｓ４３２、Ｃｙｓ３９１－Ｃｙｓ５２５及びＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８の間に４つの分子内ジスルフィド架橋を含み、非常にコンパクトで安定した構造の作成に役立つ（Lan et al (2020), Nature Vol 581: 215-230）。

【0004】

ＲＢＤは小分子であり、その分子質量は、発現宿主及び組み込まれた炭水化物に応じて２５～２７ｋＤａの範囲であり、主にアスパラギンＮ３３１及びＮ３４３に結合している（Chen WH et al., 2017, Journal of Pharmaceutical Sciences 106: 1961-1970）。

【0005】

ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ワクチンのための戦略には、不活化ウイルス、アデノウイルスに組み込まれた又はメッセンジャーＲＮＡとしてウイルス遺伝物質を含有する遺伝子構築物、及び遺伝子改変宿主において発現されるウイルスタンパク質サブユニット又は断片に基づくワクチンが含まれる。この場合、好ましい分子は、スパイクタンパク質としても知られるＳタンパク質、又はその構造の断片、すなわちＲＢＤである。この戦略が使用中の多くのワクチンの戦略に近いので、それらの主な利点は、安全性であるが、それにもかかわらず、その主な課題は、ウイルス感染から保護するのに十分な免疫応答の達成である。

【0006】

現在（２０２０年９月２１日）までに、前臨床評価の対象となるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補ワクチンは１４９種類あり、３８種類が臨床試験中である。これら３８種のうち、ＲＢＤを特異的抗原とするワクチン候補が少なくとも１３種（５種は臨床試験中、８種は前臨床試験中）存在する（ＣＯＶＩＤ－１９候補ワクチンのＤＲＡＦＴランドスケープ－２０２０年９月２１日）。

【0007】

これらのワクチンは、用量あたり最大５０マイクログラムの高濃度でアルミナに吸収されたＲＢＤからなる（clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04466085?term=NCT04466085&draw=2&rank=1におけるワールド・ワイド・ウェブ、２０２０年８月１７日に参照）。他のワクチン候補は、バキュロウイルス及び昆虫細胞で発現され、精製され、水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用して製剤化されたアミノ酸残基３１９～５４５を含むＲＢＤタンパク質を使用する。（Yang J et al (2020) Nature Vol 586: 572-592）。その単量体形態のＲＢＤは、アルミナに吸収された動物実験でも使用されており、抗体依存性増強なしに中和抗体を誘導できることを実証している（Zang J. et al (2020) bioRxiv 2020.05.21.107565）。

【0008】

前述の技術的解決策はいずれも本発明に及ばない。本発明の発明者らは、ＲＢＤ構造を利用して、担体タンパク質に共有結合的にコンジュゲートしたＲＢＤを得る。これらのコンジュゲートは、３３３～５２７配列（配列番号２）又はその伸長を含む任意の断片から得ることができる。

【0009】

驚くべきことに、これらのコンジュゲートに対して誘発される免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用するウイルス中和アッセイ及びＡＣＥ２受容体結合阻害アッセイで測定される、その動態及びウイルス中和能に関して、非コンジュゲート単量体ＲＢＤによって誘発されるものよりも強い。これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるパンデミックシナリオの中で極めて重要な特徴である。本発明に記載のワクチン組成物は、免疫後７日目に、ＩＦＮγの誘導を特徴とするＴｈ１パターンへの細胞応答の極性化を伴う抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体応答を誘発し、したがって、Ｔｈ２パターンを誘導するコロナウイルスワクチンについて報告された免疫病理学的効果は、この場合には予想されない。

【0010】

コロナウイルス感染後獲得免疫の１つの弱点は、それが長く持続しないことである。本発明に記載のワクチン組成物は、ＣＤ８^＋、ＣＤ４^＋及びＴ細胞メモリー応答、特にＲＢＤに特異的でＩＦＮγを産生するリンパ球を誘発する。

【0011】

本発明以前の技術的解決策又は科学的刊行物のいずれも、化学的方法によって得られた担体タンパク質に対するＲＢＤの共有結合コンジュゲートも、そのようなコンジュゲートに基づくワクチン組成物も記載していないことは、言及する価値がある。

【発明の概要】

【0012】

本発明の一実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及び担体タンパク質を含む共有結合コンジュゲートからなる。これらのコンジュゲートは、特に、ＲＢＤ－担体タンパク質比が、好ましくは１つの担体タンパク質あたり１～８のＲＢＤユニットのモル範囲内であるという事実を特徴とするが、１３のＲＢＤユニットまでのコンジュゲートも得ることができる。担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７を含む群から選択することができる。破傷風トキソイドとのコンジュゲーションによって達成される免疫効果は、他の担体タンパク質とのコンジュゲーションによっても生じる可能性があるので、本発明の効果は破傷風トキソイドの使用に限定されない。

【0013】

コンジュゲーションに使用されるＲＢＤ抗原は、以下のアミノ酸配列、すなわち３１９～５４１（配列番号１）、３３３～５２７（配列番号２）、３２８～５３３（配列番号３）のいずれかを有することができる。配列番号１は、特に二量体形態でも見出され得る。ＲＢＤ抗原は、哺乳動物細胞（好ましくは非ヒト）、昆虫細胞、細菌及び酵母を含む群から選択される宿主において産生することができる。

【0014】

本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と担体タンパク質とで構成される共有結合コンジュゲートを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する防御免疫応答を誘導するワクチン組成物を含む。これらのワクチン組成物はまた、とりわけ、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムなどの任意の無機塩を含む群から選択されるアジュバントを含むことができる。当該ワクチン組成物のコンジュゲートは、１用量あたり１～３０μｇのＲＢＤ濃度範囲を有し、アジュバントは、１用量あたり２００～１５００μｇの濃度範囲内である。これらの組成物はまた、適切な医薬賦形剤を含有する。

【0015】

本発明の別の実施形態は、以下の段階Ａ）チオフィリック基（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒｏｕｐ）を導入するための担体タンパク質の官能基化、Ｂ）担体タンパク質のＲＢＤへの共有結合コンジュゲーション、及びＣ）精製を含む共有結合コンジュゲートを得るための手順を含む。この手順はまた、段階Ａの前に、配列番号１がその二量体形態であるＲＢＤ二量体のインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元からなる工程を含むことができる（図１）。更に、手順は、段階Ａの前に、配列番号１～３が使用されるＲＢＤ Ｎ末端のチオール化の別の工程を含むことができる（図２）。手順の段階Ａで導入されるチオフィリック基は、マレイミド、ブロモアセチル、ビニルスルホン、アクリラート、アクリルアミド、アクリロニトリル、及びメタクリラートを含む群から選択される。

【0016】

本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための上述のワクチン組成物の使用に関する。特に、中和抗体の応答が必要な場合の本明細書に記載のワクチン組成物の使用を含む。

【0017】

最後に、本発明の別の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する早期ＩｇＧ抗体応答を誘導するための上述のワクチン組成物の使用において、１～３０μｇのＲＢＤ範囲で、１～３回の注射に及ぶ筋肉内ワクチン接種スケジュールを適用することからなる。

【0018】

本発明はここで、第１の態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）及び担体タンパク質を含む共有結合コンジュゲートを提供する。

【0019】

本発明の共有結合コンジュゲートの好ましい実施形態では、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、及びジフテリアトキソイド変異体ＣＲＭ１９７を含む群から選択される（図３及び図４）。

【0020】

本発明の共有結合コンジュゲートの好ましい実施形態では、ＲＢＤ－担体タンパク質のモル比は、担体タンパク質あたり１～８のＲＢＤの範囲内である（図５）。

【0021】

本発明の共有結合コンジュゲートの好ましい実施形態では、ＲＢＤは、配列番号１、２及び３を含む群から選択される。

【0022】

本発明の共有結合コンジュゲートの好ましい実施形態では、配列番号１のＲＢＤがその二量体形態で使用される。

【0023】

本発明の共有結合コンジュゲートの好ましい実施形態では、ＲＢＤは、哺乳動物細胞（好ましくは非ヒト）、昆虫細胞、細菌及び酵母を含むか又はそれらからなる群から選択される宿主中で産生される。

【0024】

別の態様では、本発明は、上記の本発明の共有結合コンジュゲートを含むワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘導するために使用される。

【0025】

本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムを含むか又はそれらからなる群から選択されるアジュバントを更に含む。

【0026】

本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態では、コンジュゲートは、用量あたり１～３０μｇのＲＢＤの濃度範囲である。

【0027】

本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、用量あたり２００～１５００μｇの濃度範囲である。

【0028】

本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態では、ワクチン組成物は、適切な医薬賦形剤を更に含む。

【0029】

別の態様では、本発明は、上記の本発明の共有結合コンジュゲートを調製するための方法であって、担体タンパク質及びＲＢＤを提供する工程であって、ＲＢＤが単量体又は二量体の形態であってもよい工程と、チオフィリック基を導入することによって担体タンパク質を官能基化する工程と、担体タンパク質をＲＢＤに共有結合的にコンジュゲートする工程と、得られたコンジュゲートを精製する工程とを含む方法を提供する。

【0030】

ＲＢＤ二量体が使用される本発明の共有結合コンジュゲートを調製するための方法の好ましい実施形態では、本方法は、ＲＢＤ二量体の還元の更なる工程を、好ましくは担体タンパク質へのそのコンジュゲーションの前にインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、好ましくはチオフィリック基を導入することによる担体タンパク質の官能基化の前に含む。

【0031】

本発明の共有結合コンジュゲートを調製するための方法の好ましい実施形態では、配列番号１～３のいずれかのＲＢＤを使用することができ、最も好ましくは、配列番号１がＲＢＤとして使用される。

【0032】

本発明の共有結合コンジュゲートを調製するための方法の好ましい実施形態では、導入されるチオフィリック基は、マレイミド、ブロモアセチル、ビニルスルホン、アクリラート、アクリルアミド、アクリロニトリル及びメタクリラートを含むか又はそれらからなる群から選択される。

【0033】

別の態様では、本発明は、上記の本発明の共有結合コンジュゲートを調製するための方法によって得られるコンジュゲートを提供する。

【0034】

別の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染の予防、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によって引き起こされる疾患の予防のための本発明のワクチン組成物の使用を提供する。

【0035】

別の態様では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防する方法であって、治療有効量の上記の本発明のワクチン組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。

【0036】

好ましくは、本発明による感染を予防する使用又は疾患を予防する方法では、使用又は方法は、ワクチン組成物の２回の用量又はワクチン接種を受けた後の中和抗体応答を必要とする対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからの疾患を予防するためのものである。

【0037】

本発明による感染又は疾患を予防する使用及び方法の好ましい実施形態では、使用又は方法は、１～３用量の筋肉内ワクチン接種スケジュールを適用することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体応答を誘導することである。好ましくは、本発明によるスケジュール化されたワクチン接種用量では、用量中のＲＢＤの量は１～３０μｇである。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】チオフィリックマレイミド基で活性化された破傷風トキソイド（ＴＴ）へのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の部位選択的コンジュゲーションのスキームを示す図である。コンジュゲーションは、受容体結合モチーフ（赤色で表される）から空間的に離れているＣｙｓ５３８の遊離チオールで起こるため、ＲＢＤの抗原性に影響を及ぼさない。

【図2】チオフィリックマレイミド基で活性化された破傷風トキソイド（ＴＴ）へのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のＮ末端選択的コンジュゲーションのスキームを示す図である。ＲＢＤのＮ末端チオール化は、Ｎ末端アミノ基を選択的に修飾する新規な（社内で開発された）チオアセチル－ピリジノカルボアルデヒド試薬を用いて行われる。Ｎ末端残基は、受容体結合モチーフ（赤色で表される）から空間的に離れているため、ＲＢＤの抗原性に影響を及ぼさない。

【図3】Ａ）破傷風トキソイド、Ｂ）ジフテリアトキソイド又はＣ）交差反応性材料１９７（ＣＲＭ１９７）を担体タンパク質として使用した、Ｃｙｓ５３８でコンジュゲートしたＲＢＤ（３１９～５４１）に基づくＲＢＤコンジュゲートの図である。

【図4】Ａ）破傷風トキソイド、Ｂ）ジフテリアトキソイド又はＣ）交差反応性材料１９７（ＣＲＭ１９７）を担体タンパク質として使用した、Ｎ末端でコンジュゲートしたＲＢＤ（３２８～５３３）に基づくＲＢＤコンジュゲートの図である。

【図5】破傷風トキソイド１ユニットあたり平均２、４及び６ユニットのＲＢＤを有するＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートを表す図である。平均８、１０又は１３ユニットのＲＢＤユニットを有するコンジュゲートも得た。

【図6】ＲＢＤ単量体に対するＲＢＤの二量体（配列番号１）の減少を示し、ＲＢＤ単量体の参照プロファイルと比較したＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５クロマトグラムを示す図である。

【図7】ＲＢＤの天然型及びＲＢＤ二量体（配列番号１）の還元に由来するＲＢＤの１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。Ｒ：試料を還元試料緩衝液中でインキュベートした後、ゲルにアプライした。ＮＲ：試料を非還元試料緩衝液中にアプライした。

【図8】天然単量体及び二量体の抗原性と比較した、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるＲＢＤ二量体（配列番号１）の還元によって得られた単量体の抗原性を示す図である。

【図9】破傷風トキソイドのクロマトグラムと比較した、精製ＲＢＤ－ＴＴ２及び３コンジュゲート（例２）のＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００クロマトグラムを示す図である。

【図10】ＥＬＩＳＡ（Ａ）及び抗ＲＢＤポリクローナル抗体を使用したドットブロット（Ｂ）によって分析した、ＡＣＥ－２受容体によるＲＢＤ（３１９～５４１）－ＴＴコンジュゲートの認識を示す図である。

【図11】Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化された又は製剤化されていないＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートを０日目及び１４日目にワクチン接種した後に誘導された抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体の動態を、Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化されたＲＢＤと比較して示す図である。アステリスクは、各時点での群間の有意差（ｐ≦０．０５）を示す。

【図12】Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化された又は製剤化されていないＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートを０日目及び１４日目にワクチン接種した後に誘導された抗ＴＴ ＩｇＧ抗体の動態を示す図である。

【図13】Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化された又は製剤化されていないＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートのワクチン組成物を０日目及び１４日目に免疫したマウスにおいて、２８日目に誘導された抗体の希釈物を用いてＥＬＩＳＡで測定されたＲＢＤ－ＡＣＥ２結合の阻害を、Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化されたＲＢＤと比較して示す図である。

【図14】Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化された又は製剤化されていない２用量のＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートで免疫されたマウスからの２８日目の血清の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を、Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化されたＲＢＤと比較して示す図である。アステリスクは有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図15】定量的ＥＬＩＳＡによって決定される、Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化されたＲＢＤ－ＴＴ又はプラセボ（Ａｌ（ＯＨ）_３）で免疫されたマウスの脾臓細胞におけるＩＦＮγ、ＩＬ４及びＩＬ１７Ａの産生を示す図である。アステリスクは、テューキー検定による有意差（ｐ＜０．０５）を示す。

【図16】Ａｌ（ＯＨ）_３中に製剤化された２用量のＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートで免疫したマウスにおいて誘導された記憶細胞応答を示す図である。（Ａ）ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋＋Ｔリンパ球、（Ｂ）ＩＦＮγ産生ＣＤ８ Ｔリンパ球、（Ｃ）ＣＤ４^＋ＣＤ４４^＋＋メモリーＴリンパ球、及び（Ｄ）ＩＦＮγ産生ＣＤ４ Ｔリンパ球。ＲＢＤ／ＲＢＤ：２用量（Ｔ０、Ｔ１４）のＲＢＤ－ＴＴを受け、抽出されたリンパ球をインビトロでＲＢＤで刺激した群。アルミニウム／ＲＢＤ：２用量（Ｔ０、Ｔ１４）のアルミニウムを受け、抽出されたリンパ球をインビトロでＲＢＤで刺激した群。

【図17】ＲＢＤ単量体のＮ末端残基（配列番号３）の選択的チオール化を示し、ＲＢＤ単量体の参照プロファイルと比較したＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５クロマトグラムを示す図である。

【図18】（Ａ）Ｎ末端残基でチオール化されたＲＢＤ単量体（配列番号３）のコンジュゲーション（上のパネル）、ＲＢＤ－ＴＴ４の１６時間反応混合物（中央のパネル）、及びＲＢＤ－ＴＴ４精製コンジュゲート（下のパネル）を示すＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラムを示す図である。（Ｂ）破傷風トキソイドと比較したＲＢＤ－ＴＴ４精製コンジュゲートのＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００クロマトグラムを示す図である。

【図19】（Ａ）ＥＬＩＳＡ試験によって、及び（Ｂ）ドットブロットによって試験された抗ＲＢＤポリクローナル抗体によって分析された、ＡＣＥ－２受容体によるＲＢＤ（３２８～５３３）－ＴＴコンジュゲートの認識を示す図である。

【図20】第ＩＩ相臨床試験（１９～８０歳）及び第Ｉ／ＩＩ相臨床試験（３～１８歳）におけるコンジュゲートワクチンの０日目及び２８日目の免疫後１４日目（Ｔ４２）に誘導された抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体を示す図である。ＰＣＰ：小児回復者からの血清のパネル。

【図21】ワクチン接種対象又はワクチン未接種対象の唾液試料からの抗ＲＢＤ ＩｇＧを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語は、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性症例の検査は、必要に応じて核酸配列決定による確認を伴うリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＲＴ－ＰＣＲ）などのＮＡＡＴによるウイルスＲＮＡ配列の検出に基づくことができる。これまでに標的とされたウイルス遺伝子には、Ｎ、Ｅ、Ｓ及びＲｄＲＰ遺伝子が含まれる。「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症」及び「ＣＯＶＩＤ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされるウイルス感染症に関する。一般的なＣＯＶＩＤ－１９症状としては、発熱、咳、及び息切れが挙げられる。筋肉痛、痰の産生及び喉の痛みはあまり一般的ではない。症例の大部分は軽度の症状をもたらすが、一部は重度の肺炎及び多臓器不全に進行する。感染は、典型的には、咳中に産生される呼吸液滴を介してある人から別の人に広がる。また、汚染された表面に触れた後に、顔に触れることから感染が広がる可能性がある。

【0040】

本明細書で使用される「受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）」という用語は、コロナウイルスのコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を指し、対象の細胞上の受容体へのウイルス付着、及びその後の細胞への侵入に関与するコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の一部への言及を含む。細胞受容体は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体であってもよい。好ましくは、ＲＢＤは、配列番号１～３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。ＲＢＤの定義の範囲内で、配列番号１～３のアミノ酸配列の抗原性部分であるＲＢＤも想定される。本明細書に記載のＲＢＤは、配列番号１～３のアミノ酸配列又はその抗原性部分から１～１００個、好ましくは１～５０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失されているという点で改変することができ、好ましくは、当該改変ＲＢＤは、本明細書に記載のコンジュゲートで対象を免疫した際に誘発される免疫応答の産物、好ましくは抗体に結合し、当該コンジュゲートのＲＢＤは、配列番号１～３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。したがって、ＲＢＤという用語は、配列番号１～３と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有し、本明細書に記載のコンジュゲートで対象を免疫した際に誘発される免疫応答の産物、好ましくは抗体に結合する配列への言及を含み、当該コンジュゲートのＲＢＤは、配列番号１～３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。

【0041】

本発明の様々な態様では、「コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）」という用語は、完全なコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質のＲＢＤ部分のみのことを指す。

【0042】

「スパイク（Ｓ）タンパク質」という用語又は「スパイク（Ｓ）糖タンパク質」という同等の用語は、Ｓ１サブユニット（Ｎ末端頭部）及びＳ２サブユニット（Ｃ末端柄）からなるコロナウイルスＳタンパク質を指す。Ｓ１サブユニットは、Ｎ末端Ｓ１Ａドメイン（ウイルス付着因子であるシアル酸を含む）及びＳＡＲＳ ＡＣＥ２受容体に結合するＣ末端受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介したウイルスの付着及び侵入を媒介する。Ｓ２サブユニットはより保存されており、融合ペプチド（ＦＰ）及び２つの７アミノ酸繰り返しＨＲ１及びＨＲ２を介した宿主細胞へのウイルス融合を媒介する。ヒトＡＣＥ２及びＣＬＥＣ４Ｍ／ＤＣ－ＳＩＧＮＲ受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質ＲＢＤの結合は、宿主細胞のエンドソームへのウイルスの内在化をもたらす。

【0043】

本明細書で使用される「担体タンパク質」という用語は、タンパク質、オリゴ糖又は多糖などの抗原が結合し得る免疫原性タンパク質を指す。担体に結合すると、結合した分子はより免疫原性になってもよい。担体への分子の共有結合は、免疫原性及びＴ細胞依存性を増強させる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」としても知られる、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を指すために本明細書で使用される。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、そのサイズ又は機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関して使用されることが多く、「ペプチド」という用語は、小さなポリペプチドに関して使用されることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複する。本発明の文脈において、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は完全に交換可能である。

【0045】

本発明の（ＲＢＤ）抗原を含むタンパク質は、本明細書に例示及び記載される正確な配列とは異なり得ることを理解されたい。したがって、本発明は、配列が本発明の方法に従って機能する限り、示される配列に対する欠失、付加及び置換が企図される。これに関して、特に好ましい置換は、一般に、本質的に保存的であり、すなわちアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は一般に４つのファミリー（１）酸性のアスパラギン酸及びグルタミン酸、（２）塩基性のリジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、（４）非荷電極性のグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることがある。イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの単独置換、又はその逆；グルタミン酸によるアスパラギン酸の単独置換、又はその逆；セリンによるトレオニンの単独置換、又はその逆；又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないことが合理的に予測可能である。したがって、例示及び記載された配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない軽微なアミノ酸置換を有するタンパク質は、本発明の範囲内である。少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のＲＢＤタンパク質の全長にわたる配列同一性は、配列番号１～３のＲＢＤタンパク質の機能的変異体であると考えられ、本発明の態様で使用することができる。「配列同一性％」という用語は、本明細書では、最大のパーセント配列同一性を達成するために、配列をアライメントさせ、必要に応じてギャップを導入した後の、目的の核酸又はアミノ酸配列中のそれぞれヌクレオチド、アミノ酸と同一である、核酸配列中のヌクレオチド、又はアミノ酸配列中のアミノ酸のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で公知である。配列同一性は、目的のアミノ酸配列の実質的に全長にわたって、好ましくは全長（完全長）にわたって計算される。当業者は、１つのアミノ酸配列中の連続するアミノ酸残基が別のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸残基と比較されることを理解する。

【0046】

本明細書で使用される「破傷風トキソイド」という用語は、公知の破傷風トキソイドペプチドを指し、ペプチドは破傷風毒素の残基８３０～８４４のエピトープを表す。この配列は、複数のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子に結合することが示されており、一般的に免疫原性であると記載されている。アミノ酸配列はＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬである。

【0047】

本明細書で使用される「ジフテリアトキソイド」という用語は、ジスルフィド架橋によって連結された２つのサブユニットからなる５３５アミノ酸の単一ポリペプチド鎖である、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される不活性化外毒素を指す。ジフテリアトキソイドは、世界的に標準的な様式で製造されており、米国では、生産及び試験手順は連邦規則集に規定されている。

【0048】

本明細書で使用される「ジフテリアトキソイド変異体ＣＲＭ１９７」という用語は、多糖類及びハプテンの担体タンパク質として定期的に使用されてそれらを免疫原性にする、ジフテリア毒素の非毒性変異体を指す。野生型ジフテリアトキソイド配列における単一のＧ→Ａ転移は、グルタミン酸によるグリシン－５２の置換をもたらす（Ｇｉａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９８４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１０）：４０６３－４０６９）。

【0049】

本明細書で使用される「共有結合」という用語は、２つの原子が１つ又は複数の電子対を共有して、それらを一緒に保持する化学結合を指す。

【0050】

本明細書で使用される「共有結合コンジュゲート」という用語は、抗原ポリペプチドが担体タンパク質に共有結合している化合物を指す。

【0051】

本明細書で使用される「共有結合的にコンジュゲートする」という用語は、化学反応によってコンジュゲートを調製する工程を指す。

【0052】

本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、活性免疫を生成するために、ほとんどの場合アジュバントと共に体内に投与される、通常は改変型生（ｍｏｄｉｆｉｅｄ－ｌｉｖｅ）（弱毒化）若しくは不活化感染因子、又は感染因子の一部からなる抗原性部分の組成物への言及を含む。本発明は、薬学的に許容される担体中に上記のコンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。そのような担体は、水性液体又はエアロゾル組成物であってもよい。

【0053】

本明細書で使用される「用量」という用語は、特定の時間に投与されるか又は投与されることが推奨される本発明のコンジュゲート又は組成物の量又は測定量を指す。

【0054】

本明細書で使用される「アジュバント」という用語は、製剤中の特定のワクチン抗原と組み合わせて使用される場合、得られる免疫応答を増強又はそうでなければ変更若しくは修飾する１つ又は複数の化合物への言及を含む。好ましくは、アジュバントは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム（アルミニウム塩）である。

【0055】

本明細書で使用される「医薬賦形剤」という用語は、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤、保存剤などの材料を指す。ワクチン賦形剤は、例えば、欧州薬局方及び米国薬局方９ＣＦＲなどの政府規制、及びThe Handbook of Pharmaceutical Excipients (R. Rowe et al., Pharmaceutical press 2012, ISBN 08571 10276)、Remington: the science and practice of pharmacy (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)などのハンドブックに記載されている。

【0056】

本明細書で使用される「インサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元」という用語は、本明細書に記載のＲＢＤの二量体から単量体への変換を指す。二量体の還元は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して行うことが好ましい。好ましくは、還元はインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）であり、これは、二量体がＴＣＥＰと混合され、その後、中間精製工程なしで担体タンパク質と混合されることを意味する。

【0057】

本明細書で使用される「チオール化」という用語は、ＲＢＤのＮ末端又はＮ末端残基へのスルフヒドリル（ＳＨ）基の導入を指す。チオール化は、ＲＢＤを過剰の２－チオアセチル－ピリジン－２－カルボキシアルデヒドと反応させ、続いてヒドロキシルアミンで処理することによって達成することができる。

【0058】

本明細書で使用される「官能基化」という用語は、担体タンパク質中の１つ又は複数のチオフィリック基の導入を指す。チオフィリック基としては、マレイミド、ブロモアセチル、ビニルスルホン、アクリラート、アクリルアミド、アクリロニトリル及びメタクリラートを挙げることができる。当業者は、タンパク質中の１つ又は複数のチオフィリック基を導入するための方法について熟知している。官能基化は、例えば、担体タンパク質を適切な緩衝液中でマレイミド－プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって達成することができる。

【0059】

本発明の態様では、次いで、チオール化ＲＢＤを、チオフィリック基により官能基化された担体タンパク質と反応させて、本発明のコンジュゲートを形成させる。反応化学量論に応じて、得られるコンジュゲートは、担体タンパク質のユニット当たり１～８のＲＢＤユニットを含有する。本発明について記載されるコンジュゲーション手順は、化学選択的及び残基特異的である。本発明による共有結合コンジュゲートは、好ましくは、ＲＢＤと担体タンパク質とがペプチド結合を介して結合している融合タンパク質ではない。

【0060】

本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の部位でのコンジュゲートの少なくとも部分的な送達をもたらす方法又は経路により、本明細書に開示される化合物又は組成物を対象に配置することを指す。本明細書中に開示される化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。好ましくは、投与は注射、好ましくは筋肉内注射によるものである。

【0061】

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。通常、非ヒト動物は、脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯類、家畜又は狩猟動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカック、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯動物としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。動物としては、数例を挙げると、アルマジロ、ヘッジホッグ、及びラクダも挙げられる。家畜及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えばマス、ナマズ及びサケが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、又はブタであってもよいが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、所与の状態の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、好ましくはヒトである。対象は、男性又は女性であってもよい。対象は、治療を必要とする状態に罹患しているか又はその状態を有していると、以前に診断されているか又は特定されており、場合により、既に治療を受けている対象であってもよい。或いは、対象は、状態を有すると以前に診断されていない対象であってもよい。例えば、対象は、１つ若しくは複数の危険因子を示す対象、又は危険因子を示さない対象であってもよい。

【0062】

特定の症状に対する治療を「必要とする対象」は、その症状を有する対象、その症状を有すると診断された対象、又はその症状を発症するリスクがある対象であってもよい。

【0063】

本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染の予防」という用語及び本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染によって引き起こされる疾患を予防する」という用語は、ＣＯＶＩＤ－１９疾患、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス若しくはその変異体によって引き起こされる疾患を予防又は治療することを指す。

【0064】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」又は「改善」という用語は、治療的処置を指し、目的は、疾患又は障害、例えば癌又は炎症に関連する状態の進行又は重症度を逆転、緩和、改善、阻害、減速又は停止することである。「治療すること」という用語は、状態、疾患又は障害の少なくとも１つの有害作用又は症状を軽減又は緩和することを含む。１つ又は複数の症状又は臨床マーカーが低下している場合、治療は一般に「有効」である。或いは、疾患の進行が軽減又は停止する場合、治療は「有効」である。すなわち、「治療」には、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療がない場合に予想されるものと比較して、症状の進行又は悪化の停止又は少なくとも遅延も含まれる。有益な又は所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であろうと検出不能であろうと、１つ又は複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の引き延ばし又は遅延、疾患状態の改善又は緩和、寛解（部分的であろうと全体的であろうと）、及び／又は死亡率の低下が挙げられる。疾患の「治療」という用語はまた、疾患の症状又は副作用からの軽減を提供すること（緩和治療を含む）を含む。

【0065】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、疾患又は障害の少なくとも１つ又は複数の症状を緩和するのに必要なワクチン抗原の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な量の薬理学的組成物に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、一般的な対象に投与された場合に特定の効果をもたらすのに十分なワクチン抗原の量を指す。本明細書で使用される有効量はまた、様々な状況において、疾患の症状の発症を遅延させる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、限定されないが、疾患の症状又はその重症度の進行を遅らせること）、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは一般に実用的ではない。しかしながら、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、ルーチンの実験のみを使用して当業者によって決定することができる。有効量は、好ましくは、対象において中和抗体応答を引き起こす。

【0066】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、所望の障害又は状態を治療、改善、抑制、阻害又は予防するための、又は検出可能な治療効果又は予防効果を示すための治療剤の量を指す。対象に必要な正確な有効量は、対象のサイズ及び健康状態、状態の性質及び程度、並びに投与のために選択される治療薬又は治療薬の組み合わせに依存する。所与の状況に対する治療有効量は、ルーチンの実験によって決定することができる。

【0067】

「中和抗体応答」という用語は、外来タンパク質、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに結合し、その活性を低下又は減少させる、対象における抗体の産生を指す。外来タンパク質の活性は、例えば、中和抗体応答の非存在下又は誘発前の外来タンパク質の活性と比較して、検出可能な量、例えば１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％（すなわち、完全に不活性化されている）低下させることができる。外来タンパク質の活性は、当該分野で公知の任意の方法によって決定することができる外来タンパク質に依存する。

【0068】

本明細書で使用される「ワクチン接種」という用語は、疾患からの保護をもたらすために、レシピエントの免疫系によって中和抗体応答を誘導するワクチンの投与を指す。

【0069】

「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書で使用される。

【0070】

ＲＢＤ抗原の取得方法
ＲＢＤタンパク質のコード配列を合成し、適切な発現ベクター、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングする。選択されるＲＢＤアミノ酸配列は、配列番号１～３又はその伸長である。標的タンパク質を含有する構築物は、バイオテクノロジーで従来使用されている宿主の１つ、すなわち哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３）、昆虫細胞、細菌及び酵母、好ましくはＣＨＯ細胞で発現することができる。

【0071】

発現した標的タンパク質を遠心分離及び濾過によって回収し、アフィニティーカラム、好ましくはＮｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー精製、好ましくはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００で精製する。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＳＥＣ及びＭＳなどの適切な方法を使用して分析し、他の分子特性の中でも、分子サイズ、純度、同一性及びアミノ酸配列を決定する。

【0072】

担体タンパク質への共有結合コンジュゲートを得るために、本発明者らは、１９５アミノ酸（配列Ｔｈｒ３３３～Ｐｒｏ５２７、配列番号２）を含有する球状タンパク質であるＲＢＤの構造を利用する。当該配列は、システイン（Ｃｙｓ３３６－Ｃｙｓ３６１、Ｃｙｓ３７９－Ｃｙｓ４３２、Ｃｙｓ３９１－Ｃｙｓ５２５及びＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８）の間に４つの分子内ジスルフィド架橋を含み、非常にコンパクトで安定した構造を作り出す。この配列は、この分子について記載される４つの免疫優性エピトープ並びに受容体結合モチーフを含有するので、ＲＢＤのコンジュゲーションに使用される生物学的に関連する構造を構成する。これらのコンジュゲートは、３３３～５２７配列又はその伸長を含む任意の断片から得ることができる。

【0073】

更に、ＲＢＤを作成するために使用される遺伝子構築は、３３３～３００アミノ酸のいずれかのＮ末端、又は５２７～５６０アミノ酸領域のＣ末端のいずれかにおいて、３３３～５２７配列の末端の一方又は両方に伸長を含むことができる。遺伝子構築自体によって、特に、活性であると考えられる天然アミノ酸の１つ、例えばシステイン５３８を含むように配列を伸長することによって、生物学的に関連する構造に影響を与えることなく末端の一方を活性化することが可能である。別の解決策は、末端の一方に活性官能基を導入することからなり、この例は、Ｎ末端アミノ酸、例えば３２８～５３３ ＲＢＤ配列（配列番号３）のアルギニン３２８のチオール基官能基化である。

【0074】

配列番号１の標的タンパク質のアミノ酸配列は、４つの分子内ジスルフィド架橋（Ｃｙｓ３３６－Ｃｙｓ３６１、Ｃｙｓ３７９－Ｃｙｓ４３２、Ｃｙｓ３９１－Ｃｙｓ５２５及びＣｙｓ４８０－Ｃｙｓ４８８）に関与する８個を含む９個のシステインを含み、非常にコンパクトで安定な構造をもたらす。ＲＢＤの精製中及び空気の存在下（穏やかな酸化条件）で、配列番号１のＲＢＤは、２つのＲＢＤ分子の位置５３８の２つの遊離システインの間にジスルフィド架橋を形成することによって二量体化することができる。それにもかかわらず、ＲＢＤが不活性ガス（すなわち、窒素又はアルゴン）の雰囲気中に維持されている場合、システイン５３８は反応せず、ＲＢＤはその単量体形態のままであり、したがって、ＲＢＤはチオフィリック基との化学反応に関与することができる。

【0075】

担体タンパク質へのＲＢＤの共有結合コンジュゲートを得るための方法
担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、及びジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７、又はヒトで使用するためのワクチンにおいて同じ機能を果たす任意の他のタンパク質を含む群から選択することができる。これらの担体タンパク質を得て特性決定する方法は、利用可能な文献に見出すことができる。

【0076】

本発明について記載されるコンジュゲーション手順は、化学選択的及び残基特異的である。当該手順は３つの段階に分けられる。第１段階（Ａ）は、担体タンパク質を官能基化して、チオフィリック基、好ましくはマレイミドを導入することからなるが、既知のチオフィリック基、すなわちブロモアセチル、ビニルスルホン、アクリラート、アクリルアミド、アクリロニトリル及びメタクリラートのいずれを使用してもよい。官能基化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のマレイミド－プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを、適切な緩衝液中でタンパク質に対して１００～２００のモル比で使用することによって達成することができる。官能基化タンパク質は、精製中のタンパク質に適合するＭＷＣＯ値を有する膜を使用した透析濾過によって精製され、官能基化の程度は、改変Ｅｌｌｍａｎ手順を使用して決定される。

【0077】

段階（Ｂ）は、ＲＢＤと官能基化担体タンパク質との共有結合コンジュゲーションを包含し、これらは適切な緩衝液中で０．２～９．４のＲＢＤ：担体タンパク質（ｗ：ｗ）の質量比で反応混合物に添加され、混合物は、不活性ガス雰囲気中、５±３℃で４～１８時間穏やかに撹拌される。残りのチオフィリック基は、シスタミンの右部分を添加することによってブロックされる。

【0078】

段階（Ｃ）は、担体タンパク質に適合するＭＷＣＯ値を有する膜を使用した透析濾過によって達成することができる、得られたコンジュゲートの精製からなる。

【0079】

コンジュゲーションは、その単量体及び二量体の両方の形態の配列番号１のＲＢＤを使用することによって達成することができる。段階（Ａ）の前に、ＲＢＤ二量体中の分子間ジスルフィド架橋の還元を含む別の段階を導入し、この段階は、ジスルフィド結合の還元剤、好ましくはジチオスレイトール（ＤＤＴ）又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して穏やかな還元条件下、１２５μＭ～４２０μＭの範囲の濃度で、５～２０分間及び０～２３℃の範囲の温度で達成される。これらの条件は、特に、上記の他の４つの分子内ジスルフィド架橋に影響を及ぼすことなく、この架橋を選択的に切断する。単量体への二量体の還元はＨＰＳＥＣによって検証することができ、４つの分子内ジスルフィド架橋の保存性及び抗原性はそれぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び間接ＥＬＩＳＡ試験によって確認される。

【0080】

本発明の別の実施形態は、段階Ａの前にＲＢＤのＮ末端残基をチオール化するための別の工程を含む。この手順は、過剰の２－チオアセチル－ピリジン－２－カルボキシアルデヒド（ＲＢＤに対して２０～５０当量）と２３～３７℃で１２～４８時間反応させ、続いて洗浄し、過剰のヒドロキシルアミンを用いて周囲温度で１～５時間処理することを伴う。

【0081】

反応化学量論に応じて、得られるコンジュゲートは、担体タンパク質のユニット当たり１～８のＲＢＤユニットを含有する。

【0082】

ワクチン組成物及び投与経路
受容体結合ドメインと担体タンパク質との共有結合コンジュゲートに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、１～３０μｇ、好ましくは５～２５μｇの範囲のＲＢＤ用量で、筋肉内又は皮下経路を介して投与される。これらのワクチン組成物は、２００～１５００μｇ、好ましくは５００～１０００μｇの範囲の用量で、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない任意の無機塩をアジュバントとして含有することができる。ワクチン組成物は、ｐＨを調節することができる適切な医薬賦形剤、例えば３．０～７．０ｍＭの範囲の濃度のリン酸緩衝液、５０～１５０ｍＭの範囲の濃度の塩化ナトリウムとしての等張溶液、並びに保存剤、例えばチオメルサール、フェノール、２－フェノキシエタノール、メチルパラヒドロキシベンゾアート、ホルムアルデヒド、ｍ－クレゾール、又は他のメチル及びプロピル－パラベン、好ましくはチオメルサールを含む。

【0083】

これらのワクチン組成物製剤は、好ましくは１～３用量、好ましくは７～２８日ごと、より好ましくは１４～２８日ごと、より好ましくは２１～２８日ごとのスケジュールに従って投与される。好ましくは、連続投与の間に少なくとも１～３週間の間隔、好ましくは少なくとも２週間の間隔がある。投与のための単回用量は、好ましくは１～３０μｇの量のＲＢＤを含む。注射フラスコなどの容器は、複数の対象のワクチン接種のための複数回用量を含むことができる。各用量は、好ましくは約０．０５～約１ｍＬ、好ましくは各用量は約０．３～０．５ｍＬ、最も好ましくは約０．３ｍＬである。投与量は、濃縮形態又は凍結乾燥形態で容器に含まれてもよく、投与前に適切な注射液で希釈又は再構成されてもよい。

【0084】

投与は、好ましくは筋肉内である。投与は、好ましくは血管内、皮下又は皮内ではない。本発明で提案されるワクチン組成物は、アジュバント化非コンジュゲート化ＲＢＤを含有するワクチン組成物と比較して、その優位性を示し、パンデミックの現在の状況下で重要なこれらのワクチン組成物のいくつかの特徴、すなわち誘発される応答の迅速性、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和剤及びＲＢＤ－ＡＣＥ２受容体相互作用の遮断薬として作用する高レベルの抗体力価が存在する。これらの組成物は、Ｔｈ１パターン免疫応答、並びにＲＢＤに特異的なＣＤ８^＋、ＣＤ４^＋及びＴ細胞の記憶応答、特にＩＦＮγを産生する細胞の記憶応答を誘発する。

【0085】

更なる利点
本発明で提案されるワクチン組成物は、小児集団における臨床試験で優れた結果を示している。

【0086】

更に、本発明で提案されるワクチン組成物は、ワクチン接種されたヒトにおける粘膜ＩｇＧ応答を実証している。これの重要性は、そのような誘導された粘膜応答が、ウイルスの伝染並びにその感染力を減少させたことである。本発明者は、これが現在入手可能なＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの中で独特の新しい特性であると考える。

【0087】

完全なスパイクタンパク質ワクチンが心筋炎及び心膜炎のような重要な有害事象を示すので、完全なスパイクタンパク質ワクチンの一部として現在提案されているＲＢＤ構造は重要な利点を有すると考えられる。これらの副作用は、スパイクタンパク質のカルボキシル領域に関連している。この領域は、現在提案されているＲＢＤ－担体タンパク質コンジュゲートワクチンには存在しない。完全なスパイクタンパク質ワクチンの言及された副作用が小児集団において特に劇的であるので、現在提案されているワクチン組成物は、小児使用に非常に適していることは注目に値する。

【0088】

最初の結果は、免疫抑制の対象及び免疫減弱状態の対象の免疫応答が非常に有益であり、他のワクチンよりも良好であることを示している。

【0089】

本発明者らは、不活化ウイルスワクチン又はアデノウイルスベクターワクチンについて報告されるような他の有害事象を同定しておらず、免疫応答又は中和抗体応答の評価は不活化ウイルスワクチンよりも高い。

【実施例】

【0090】

例１ Ｃｙｓ５３８で二量体化したＲＢＤからのＲＢＤ（３１９～５４１）単量体の調製。
ＲＢＤ二量体（３１９～５４１）をＰＢＳ緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡに溶解して、最終タンパク質濃度を５～１０ｍｇ／ｍＬにした。ＴＣＥＰを１２５μＭ～４２０μＭの最終濃度まで添加した。周囲温度で中程度に撹拌しながらアルゴン雰囲気中で反応を１０分間維持した。

【0091】

単量体形態への変換及びその分子の完全性を、それぞれＨＰＳＥＣ及びポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検証した。図６は、還元から得られた単量体が天然単量体と同じ分子分布を有することを示すＨＰＳＥＣプロファイルを示している。図７（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、還元によって再生されたＲＢＤ単量体（ライン３）が、天然ＲＢＤ単量体（ライン２、天然の立体配座）と同じ泳動パターンを有することを示し、これは、より遅い泳動を示す、分子間架橋及び分子内架橋を還元するための徹底的な条件に供された対照試料（ライン４）とは対照的である。

【0092】

還元によって得られた単量体の抗原性を、ＣＯＶＩＤ－１９ヒト回復期血清を用いた間接ＥＬＩＳＡによって分析した。図８は、還元によって再生されたＲＢＤが天然のＲＢＤと同様に認識されたが、徹底的な条件下で還元され、分子間及び分子内ジスルフィド架橋を破壊したＲＢＤ単量体（合計、Ｃ－）は、血清によって認識されないことを証明している。

【0093】

例２ ＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートの調製
担体タンパク質の官能基化：ＤＳＭＯ中のマレイミド－プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（７５ｍｇ／ｍＬ）と反応させたＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）中の破傷風トキソイド担体タンパク質（５ｍｇ／ｍＬ）を反応混合物中にゆっくり滴下した。反応物を周囲温度で１時間維持した。ＰＢＳ緩衝液（３５ｍＭ、ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄することによる透析濾過によって、官能基化破傷風トキソイドを精製した。官能基化の程度を改変Ｅｌｌｍａｎ手順によって決定した。

【0094】

コンジュゲーション：官能基化破傷風トキソイドを、０．２対０．４のＲＢＤ／ＴＴモル比で、単量体形態のＲＢＤの溶液又は単量体にインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元されたＲＢＤの溶液に添加した。反応物をアルゴン雰囲気下、５±３℃で４～１８時間穏やかに撹拌しながら保持した。残りのマレイミド基をブロックするために、システアミン塩酸塩を最大１５７μＭの濃度で添加し、撹拌を３０分間維持した。

【0095】

精製：ＰＢＳ（６ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄しながら、１００ｋＤａのＭＷＣＯ値を有する膜を使用した透析濾過によって精製を達成した。

【0096】

ＲＢＤ／ＴＴ比は、ドットブロットデンシトメトリー及び比色法の組み合わせによって決定した。非コンジュゲート化ＲＢＤの含有量及び分子サイズ分布をＨＰＳＥＣによって決定した。動的光散乱（ＤＬＳ）によって分子サイズ及び多分散指数を決定した。表１は、コンジュゲートのモル比が１．８～６．３ｍｏｌ ＲＢＤ／ｍｏｌ ＴＴの範囲であり、一方、非結合ＲＢＤの含有量が１５％未満であることを示している。分子サイズ分布定数（Ｋｄ）は、破傷風トキソイドと比較して、コンジュゲートの分子サイズの増加を実証している（Ｋｄ＝０．３１）。また、より多くのＲＢＤモルが担体タンパク質に取り込まれるにつれて、コンジュゲート集団の相対サイズが増加したことも示されている（表１及び図９）。

【表1】

^＊ＲＢＤ二量体のインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元によって再生された単量体

【0097】

例３ ＡＣＥ２受容体及び特異的抗体によるＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートの認識の実証。
ＡＣＥ２受容体によるＲＢＤ－破傷風トキソイドコンジュゲート（ＲＢＤ－ＴＴ）の認識を、組換えＡＣＥ２受容体でプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡ試験によって分析した。試料（ＲＢＤ－ＴＴのバッチ１及び２、陽性対照としてのＲＢＤ二量体、及び陰性対照としてのｈＰＤＬＨｙｓ）を異なる濃度（０．００１、０．００４、０．０１９、０．０７８、０．３１２５、１．２５及び５μｇ／ｍｌ）で添加した。インキュベーション後、ＲＢＤ特異的ウサギポリクローナル血清を添加し、続いてペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧを添加した。対応する基質によって反応を明らかにし、４０５ｎｍで読み取った。

【0098】

図１０Ａは、２つのコンジュゲートバッチが、ＲＢＤ二量体（陽性対照）と同様にＡＣＥ２受容体によって認識されることを示している。したがって、インサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）還元及びコンジュゲーションは、ＡＣＥ２受容体によるＲＢＤの認識に関与するＲＢＤエピトープに影響を及ぼさないことが証明されている。

【0099】

抗ＲＢＤ特異的ポリクローナルＩｇＧ血清を使用したドットブロットにより、ＲＢＤ－ＴＴの抗原性を確認した。図１０Ｂは、コンジュゲートが、試験された全ての希釈において抗ＲＢＤ特異的抗体によって強く認識される一方で、１：８０希釈でアプライされた破傷風トキソイド（ＴＴ）は認識されないことを示している。したがって、コンジュゲーションは抗体によるＲＢＤの認識に影響を及ぼさないことが実証される。

【0100】

例４ ＲＢＤ（３１９～５４１）－ＴＴコンジュゲートは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて強い抗体応答を誘導する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０及び１４日目に、０．１ｍＬの以下の製剤のうちの１つで筋肉内に免疫した。
－第１群：１μｇのＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴ。
－第２群：５００μｇのＡｌ（ＯＨ）_３に吸収された１μｇのＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴ。
－第３群：３μｇのＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴ。
－第４群：５００μｇのＡｌ（ＯＨ）_３に吸収された３μｇのＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴ。
－第５群：５００μｇのＡｌ（ＯＨ）_３に吸収された３μｇのＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴ。
－第６群：プラセボ。ＰＢＳ及び５００μｇのＡｌ（ＯＨ）_３。
第６群は陰性対照製剤である。

【0101】

血液を７、１４、２１及び２８日目に抽出した。動物血清を間接ＥＬＩＳＡによって分析して、抗ＲＢＤ抗体価を決定した。９６ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを炭酸－重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の５０μＬのＲＢＤ（３μｇ／ｍＬ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄液で３回洗浄した。その後、コーティングされていない部位を１００μＬの５％スキムミルクを用いて３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを記載のように再び洗浄した後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡに１：３で希釈した血清（５０μＬ／ウェル）の段階希釈液を添加し、一般に１：５０希釈から開始した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、再び洗浄した。次に、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの希釈液５０μＬをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ（１：５０００）中に添加し、１時間インキュベートした。最後に１回洗浄した後、ペルオキシダーゼ酵素基質溶液（５０μＬ／ウェル）をアプライした。次いで、これを暗所で２０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止させた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ ＥＬＩＳＡリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＩｇＧ力価は、１：５０希釈で免疫前血清の平均吸光度（Ｔ０）の値の４倍に達する血清希釈の逆数として定義した。結果の分析及び提示のために、各動物についての力価のＬｏｇ１０を計算した。応答動物を定義するために、１：５０超の血清希釈に対応する、１．７０超のｌｏｇ力価をカットオフ値とした。力価がアッセイ検出限界より低い動物については、２５の力価及び１．４のｌｏｇ１０を設定した。

【0102】

図１１は、Ａｌ（ＯＨ）_３でアジュバントした３μｇのＲＢＤ－ＴＴによる免疫によって誘導されたＩｇＧ応答が、Ａｌ（ＯＨ）_３でアジュバントした同じ用量の非コンジュゲート化ＲＢＤによって誘導されたものよりも有意に強い（ｐ＜０．０５）初期抗体応答（免疫後７日目及び１４日目）を誘発することを示している。この特性は、ＲＢＤと担体タンパク質とのコンジュゲーションに起因する。Ａｌ（ＯＨ）_３でアジュバントした１μｇのＲＢＤ－ＴＴが、３μｇの非コンジュゲート化ＲＢＤによって誘導されるものと同様の抗体動態を誘導することも示されており、コンジュゲーションが抗原に対する応答を増強することを実証している。

【0103】

アジュバント化コンジュゲートは、同じ用量の非アジュバント化製剤と比較して、抗ＲＢＤ抗体レベルを増加させることも分かる。

【0104】

例５ ＲＢＤ（３１９～５４１）－ＴＴコンジュゲートによって誘導される抗破傷風トキソイド抗体価
例４に記載の手順に従って、免疫後７、１４、２１及び２８日目にマウスから抽出した血清を使用して、抗ＴＴ抗体の誘導を評価した。９６ウェルのＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２．５μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬの破傷風トキソイドでコーティングし、湿潤チャンバー中４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄した。血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ中、様々な希釈で添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、再び洗浄した。次に、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの希釈液１００μＬをリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＢＳＡ（１：１００００）中に３７℃で１時間添加した。最後の洗浄の後、１００μＬ／ウェルのペルオキシダーゼ酵素基質溶液をアプライし、暗所で２５分間インキュベートし、２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４（５０μＬ／ウェル）で反応を停止させた。Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ ＥＬＩＳＡリーダ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で吸光度を４５０ｎｍで読み取った。力価は、吸光度値をＩＵ／ｍｌ（国際単位／ミリリットル）に変換することによって決定し、４パラメータログロジスティック関数を使用して、標準の段階希釈に基づいて基準曲線を作成した。

【0105】

図１２は、Ａｌ（ＯＨ）_３でアジュバントしたコンジュゲートを含有する製剤が、非アジュバント化製剤によって誘発されたものよりも有意に強い（ｐ＜０．０５）抗ＴＴ ＩｇＧ応答を誘発したことを示している。

【0106】

例６ ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用阻害アッセイによって評価した、ＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートによって誘導される抗ＲＢＤ抗体の機能的活性。
例４に記載の手順に従って、免疫後２８日目にマウスから抽出した血清をＥＬＩＳＡ試験で分析して、ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用の阻害を決定した。別のＥＬＩＳＡ試験を行って、抗ＲＢＤ抗体によって誘導されるＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用の阻害を分析した。ＲＢＤ－ＡＣＥ２相互作用の阻害率を決定するために、マウスＡＣＥ２－Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）でコーティングしたプレートをブロッキングし、次いで、様々な実験用製剤で免疫したマウスからの血清と共に３７℃で１時間インキュベートしたヒトＲＢＤ－Ｆｃを、１：２５～１：１００００の範囲の希釈で添加した。認識の検出のために、ＳＳＴＦ－Ｔ緩衝液、０．２％ミルクで希釈した抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）－アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用した。最後に１回洗浄した後、ｐＮＰＰ（１ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）をジエタノールアミン緩衝液中にアプライした。プレートを暗所で２０分間インキュベートし、３Ｍ ＮａＯＨ（５０μＬ／ウェル）で反応を停止させた。吸光度を４０５ｎｍで読み取った。阻害率を以下の式（１－Ａｂｓ４０５ｎｍヒトＲＢＤ－Ｆｃ＋マウス血清／Ａｂｓ４０５ｎｍヒトＲＢＤ－Ｆｃ）^＊１００によって計算した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して非線形回帰によって最大阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。図１３は、本発明の製剤で免疫したマウス由来の血清の阻害能を示す。アジュバント化ＲＢＤ－ＴＴ製剤によって誘導される抗体は、非アジュバント化製剤によって誘導される抗体よりも大きい阻害能を有する。更に、アジュバント化コンジュゲートの阻害能（ＩＣ５０）は、非コンジュゲート化製剤（ＲＢＤ ３μｇ／Ａｌ（ＯＨ）_３）の阻害能の２倍（ＲＢＤ－ＴＴ １μｇ／Ａｌ（ＯＨ）_３）及び６．５倍（ＲＢＤ－ＴＴ ３μｇ／Ａｌ（ＯＨ）_３）であり、これは、ＲＢＤコンジュゲーションが低用量でさえ抗体の機能性を増強することを実証している。

【0107】

例７ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能によって評価した、ＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートの製剤によって誘導される抗ＲＢＤ抗体の機能的活性。
１回目の投与後２８日目にＲＢＤ－ＴＴ ３μｇ／Ａｌ（ＯＨ）_３及びＲＢＤ ３μｇ／Ａｌ（ＯＨ）_３で免疫したマウスからの血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和能（例４）を、ニュートラルレッドを使用する比色アッセイによって試験した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、２％ウシ胎児血清、２５ｍＭ／ｍＬ Ｌ－グルタミン、２μｇ／ｍＬ重炭酸塩、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢを添加したＭＥＭ中でインキュベートした。上清をプレートから除去し、０．０２％ニュートラルレッドを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２を添加した（１００μｌ／ウェル）。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。溶液を捨て、細胞単層を滅菌ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。溶解溶液（無水エタノール：超純水：氷酢酸、５０：４９：１）を添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを周囲温度で１５分間インキュベートし、分光光度計で５４０ｎｍで測定した。中和力価は、カットオフ値より高い光学濃度値を有する最も高い血清希釈であった。カットオフ値は、細胞対照に対応するウェルの光学密度の平均を２で割ったものであった。

【0108】

図１４は、ＲＢＤ－ＴＴコンジュゲートによって誘導された中和抗体価が、非コンジュゲート化ＲＢＤによって誘導された中和抗体価よりも有意に高い（ｐ＜０．０１）ことを示しており、誘導された抗体の機能性を増強するので、ＲＢＤコンジュゲーションの優位性を実証している。

【0109】

例８ ＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートによって誘導されるＩＦＮγによって決定されるＴｈ１細胞性免疫応答。
例４に記載の手順に従って免疫したマウスにおいて、免疫後２１日目に血清を抽出し、細胞性免疫応答を評価した。Ａｌ（ＯＨ）_３中１μｇのＲＢＤ－ＴＴ又はプラセボＡｌ（ＯＨ）_３のいずれかで免疫したマウスからの脾細胞を単離し、インビトロでＲＢＤ（５μｇ／ｍＬ）で再刺激して、定量的ＥＬＩＳＡによって決定した。アプライした濃度は１×１０^６細胞／ｍＬであった。刺激の７２時間後に培養上清中のＩＬ４、ＩＬ１７Ａ及びＩＦＮγを測定した。

【0110】

図１５は、１μｇのＲＢＤ－ＴＴ／Ａｌ（ＯＨ）_３による免疫がＩＦＮγを誘導することを示し、Ｔ細胞応答のＴｈ１分極を実証している。ＩＬ４及びＩＬ１７Ａは検出されず、これはコンジュゲートがＴｈ２又はＴｈ１７パターン応答に分極しないことを証明している。

【0111】

例９ ＲＢＤ（３１９～５４１）－破傷風トキソイドコンジュゲートによって誘導される、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質に特異的なメモリーＴ細胞応答。
例４に記載の手順に従って免疫したマウスにおいて、免疫後２１日目にメモリーＴ細胞応答を評価した。Ａｌ（ＯＨ）_３で製剤化された１μｇのＲＢＤ－ＴＴ又はプラセボＡｌ（ＯＨ）_３のいずれかで免疫したマウスからの脾細胞を単離し、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸塩、５０μＭ β－メルカプトエタノール、及び２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２中で７２時間培養した。細胞を活性化するために、５μｇ／ｍｌ ＲＢＤを添加した。サイトカインの分泌をブロックするために、ブレフェルジンＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を染色の４～６時間前に添加した。細胞をＰＢＳ １Ｘで洗浄し、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４４及び抗ＣＤ２２０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて４℃で３０分間染色した。細胞を固定し、透過処理して、抗ＩＦＮγ及び抗ＩＬ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）による細胞内染色を促進した。細胞計測データをＧａｌｌｉｏｓフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で取得し、結果をソフトウェアＫａｌｕｚａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって処理した。

【0112】

図１６は、１μｇのＲＢＤ－ＴＴ／Ａｌ（ＯＨ）_３による免疫が、表現型ＣＤ４４^＋＋を有するＲＢＤ特異的ＣＤ４^＋（Ｃ）及びＣＤ８^＋（Ａ）メモリーＴ細胞を生成することを示している。免疫はまた、ＩＦＮγを産生するＣＤ８（Ｂ）及びＣＤ４（Ｄ）メモリーＴ細胞を増加させた。

【0113】

例１０ Ｎ末端がチオール化されたＲＢＤ（３２８～５３３）の調製
５～１０ｍＬのＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中、２０～２００μＭの最終濃度のＲＢＤ（３２８～５３３）を、２－チオアセチル－ピリジン－２－カルボキシアルデヒドで処理（最終濃度１～１０ｍＭ）した。反応混合物を２３～３７℃の温度で１２～４８時間の範囲の時間撹拌した。ＰＢＳ（３５ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄することにより、透析濾過によって精製を達成した。官能基化ＲＢＤ（３２８～５３３）を２０～２００μＭまで濃縮し、ヒドロキシルアミン塩酸塩で４０ｍＭの最終濃度まで処理した。反応混合物を窒素雰囲気下、周囲温度で１～５時間撹拌し、Ｅｌｌｍａｎ手順によって９０％超の変換度を決定した。

【0114】

質量分析によって決定されたＮ末端残基の変換レベルは８０％より高かった。ＨＰＳＥＣ分析は、反応中に凝集が起こらず、チオール化ＲＢＤがその分子サイズ分布を保存したことを証明した（図１７）。

【0115】

例１１ Ｎ末端チオール化ＲＢＤ（３２８～５３３）のＲＢＤ（３２８～５３３）破傷風トキソイドコンジュゲートへの変換。
例２に記載の手順に従って、チオール化ＲＢＤ（３２８～５３３）を破傷風トキソイドにコンジュゲートさせる。

【0116】

図１８Ａは、ＲＢＤ、１６時間のコンジュゲーション後の反応混合物及び精製コンジュゲートについてのＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５クロマトグラムを示す。精製コンジュゲートは、ＲＢＤ－ＴＴモル比が１．９であり、非結合ＲＢＤ含有量が１５％未満である。ＨＰＳＥＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００クロマトグラム（図１８Ｂ）は、担体タンパク質（Ｋｄ＝０．３１）と比較した、コンジュゲート（Ｋｄ＝０．２７）の分子サイズの増加を示している。

【0117】

例２に記載の手順に従って、配列番号１及び配列番号３から得られたコンジュゲートは、同様の物理化学的特性を有する。

【0118】

例１２ ＡＣＥ２受容体及び特異的ＲＢＤ抗体によるＲＢＤ（３２８～５３３）－破傷風トキソイドコンジュゲートの認識の保存。
ＡＣＥ２受容体及び特異的抗ＲＢＤ抗体によるＲＢＤ－破傷風トキソイドコンジュゲートの認識を、例３に記載したように評価した。

【0119】

図１９Ａは、ＲＢＤ－破傷風トキソイドコンジュゲートがＡＣＥ２受容体によって認識されると共に、ＲＢＤ陽性対照（破傷風トキソイドの非存在下でのＲＢＤ）でも認識されることを示している。したがって、ＲＢＤのＮ末端残基のチオール化もコンジュゲーションプロセスも、ＡＣＥ２受容体によるＲＢＤの認識に関与するＲＢＤエピトープに影響を及ぼさないことが証明される。

【0120】

抗ＲＢＤ特異的ポリクローナルＩｇＧ血清を使用したドットブロットにより、コンジュゲートの抗原性を確認した。図１９Ｂは、コンジュゲートが、試験された全ての希釈において抗ＲＢＤ特異的抗体によって強く認識される一方で、１：８０希釈での破傷風トキソイド（ＴＴ）は認識されないことを示している。したがって、コンジュゲーションは抗体によるＲＢＤの認識に影響を及ぼさないことが実証される。

【0121】

例１３ ＲＢＤ（３１９～５４１）－ＴＴコンジュゲートは、ヒト、特に小児集団において強い抗体応答を誘発する。
アルミニウムにＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴを含むワクチン製剤を、２用量（Ｔ０、Ｔ２８日）スケジュールで臨床試験で評価した。成人（第ＩＩ相１９～８０歳）及び小児集団（第Ｉ／ＩＩ相３～１８歳）における臨床試験の手順は、https://rpcec.sld.cu/trials/RPCEC00000347-En , https://rpcec.sld.cu/trials/RPCEC00000374-Enに記載されている。

【0122】

図２０は、両臨床試験における２回目の投与の１４日後の血清中の特異的抗ＲＢＤ ＩｇＧの結果を示す。全ての年齢群で高レベルの抗体が上昇し、成人集団（１９～８０歳）で７４％の抗体陽転があった。注目すべきことに、小児は、１２～１８歳及び３～１１歳の群でそれぞれ抗体陽転が９２．８％及び９９．３％に達した。更に、両小児群の中央値である５０．３（１２～１８歳で１５．９；６２．０）及び９９．８（３～１１歳で３９．１；２１６．８）は、ＣＯＶＩＤ－１９回復期小児で作成された血清パネルの中央値である８．７（３．４；１５．７）よりも優れていた。

【0123】

例１４ ＲＢＤ（３１９～５４１）－ＴＴコンジュゲートはヒトにおいて特異的粘膜ＩｇＧを誘導する
アルミニウム中のＲＢＤ－（３１９～５４１）－ＴＴの製剤の２用量（Ｔ０、２８日）及びアルミニウム中の二量体ＲＢＤのブースター用量（Ｔ５６）で免疫した対象からの唾液を、以下のｈｔｔｐｓ：／／ｒｐｃｅｃ．ｓｌｄ．ｃｕ／ｔｒｉａｌｓ／ＲＰＣＥＣ０００００３６０－Ｅｎに記載されるように、「社内の」ＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。コーティングとしてのＲＢＤ（５μｇ／ｍＬ）及びブロッキングとしての３％ＰＢＳ－ＢＳＡ。唾液試料を複製によって純粋であると評価した。インキュベーション工程の後、適切な緩衝液中のペルオキシダーゼ抗ＩｇＧヒトコンジュゲート（シグマＡ６０２９、１：２５００）を添加した。ＯＰＤ基質を添加することによって、最終的な蛍光定量反応を誘導した。結果を吸光度値で表した。

【0124】

図１６は、免疫された対象が唾液中で特異的抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答を誘発したことを示している。

【配列表フリーテキスト】

【0125】

配列表１ ＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列表２ ＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列表３ ＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】