特表2023-547086束状神経移植片、それを作製する方法、およびそれを使用した処置の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-09
(54)【発明の名称】束状神経移植片、それを作製する方法、およびそれを使用した処置の方法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/36 20060101AFI20231101BHJP
A61L 27/20 20060101ALI20231101BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20231101BHJP
A61L 27/14 20060101ALI20231101BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20231101BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20231101BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231101BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231101BHJP
【ＦＩ】
A61L27/36 100
A61L27/20
A61L27/24
A61L27/14
A61L27/22
A61K45/00
A61P25/20
A61P25/00
A61P29/00
A61P37/06
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524284
(86)(22)【出願日】2021-10-21
(85)【翻訳文提出日】2023-05-24
(86)【国際出願番号】 US2021055937
(87)【国際公開番号】W WO2022087192
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】63/104,437
(32)【優先日】2020-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/451,489
(32)【優先日】2021-10-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517415528
【氏名又は名称】アクソジェン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ファレリス、ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】タジダラン、カスラ
【テーマコード（参考）】
4C081
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C081AB18
4C081BA16
4C081BB08
4C081CD012
4C081CD022
4C081CD042
4C081CD092
4C081CD112
4C081CD122
4C081CD152
4C081DA04
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4C081DC03
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA65
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4C084NA05
4C084NA06
4C084ZA021
4C084ZA022
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4C084ZA202
4C084ZC611
4C084ZC612
4C084ZC751
4C084ZC752
(57)【要約】
本開示は、カスタマイズ可能な長さおよび直径の束状神経移植片、およびそれを調製する方法を提供する。移植片は、神経組織の神経束の周りのネイティブ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、および神経上膜鞘を消化することにより作製される。次いで、個々の束のうちの１本または複数本が、束状神経移植片を形成するために、エンチューブレーション材料にエンチューブレーションされてよく、コーティング材料に包埋されるか、もしくはそれでコーティングされてよく、またはその両方でよい。束状神経移植片は、カスタマイズ可能であり、かつ神経ギャップをブリッジするように設計され；束状神経移植片のモジュール性は、実質的に任意の長さの神経欠陥に連続性を取り戻すことを可能にし、かつ患者のレシピエント神経の直径にマッチすることを可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１本または複数本の神経束を備える束状神経移植片であって、神経上膜鞘およびネイティブ細胞外マトリックス材料を実質的に含まない、束状神経移植片。
【請求項2】
単一の神経束を備える、請求項１に記載の束状神経移植片。
【請求項3】
２本以上の神経束を備える、請求項１に記載の束状神経移植片。
【請求項4】
２本の神経束～２０本の神経束を備える、請求項３に記載の束状神経移植片。
【請求項5】
直径が互いに実質的に類似している神経束を備える、請求項３または４に記載の束状神経移植片。
【請求項6】
前記神経束のそれぞれの直径が、約５０μｍ～約１ｍｍの間である、請求項５に記載の束状神経移植片。
【請求項7】
約５０μｍ～約１ｍｍの間の直径を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項8】
長さが互いに実質的に類似している神経束を備える、請求項３～７のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項9】
約３ｍｍ～約２００ｍｍの間の長さを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項10】
前記１本または複数本の神経束が、生体適合性材料を含むエンチューブレーション材料によりエンチューブレーションされている、請求項１～９のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項11】
前記１本または複数本の神経束が、生体適合性材料を含むコーティング材料に包埋されているか、またはそれでコーティングされている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項12】
前記エンチューブレーション材料もしくは前記コーティング材料のうちの一方または両方の前記生体適合性材料が生分解性である、請求項１０または１１に記載の束状神経移植片。
【請求項13】
前記エンチューブレーション材料および前記コーティング材料のうちの一方または両方の前記生体適合性材料が、コラーゲン、キトサン、アルギネート、生分解性ポリマー、セルロース、フィブリノゲン、フィブリン、タンパク質ベースのポリマー、ゼラチン、多糖、ヒドロゲル、または非ネイティブ細胞外マトリックス材料のうちの１つまたは複数を含む細胞外マトリックス材料である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項14】
ゲル、コラーゲン、ゼラチン、多糖、ヒドロゲル、フィブリン、フィブリノゲン、アルギネート、または非ネイティブ細胞外マトリックス材料も、前記エンチューブレーション材料に取り囲まれている、請求項１０に記載の束状神経移植片。
【請求項15】
前記エンチューブレーション材料が継ぎ目を備え、前記継ぎ目が生体適合性接着剤またはシーラントによりシールされている、請求項１０に記載の束状神経移植片。
【請求項16】
前記１本または複数本の神経束が、ヒト、非ヒト動物、またはその両方からのものである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項17】
成長因子、細胞、混合細胞集団中の複数の細胞型を含む細胞のミックス、細胞成分、非ステロイド性抗炎症剤、または免疫抑制剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項18】
末梢神経移植片または脊髄神経移植片である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項19】
前記ネイティブ細胞外マトリックス材料の少なくとも約５０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または全部が除去されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項20】
前記神経上膜鞘の少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または全部が除去されている、請求項１～１９のいずれか１項に記載の束状神経移植片。
【請求項21】
束状神経移植片を調製する方法であって、１本または複数本の神経束を備え、かつネイティブ細胞外マトリックス材料および神経上膜鞘を備える少なくとも１つの神経組織を提供する工程と、
前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を分解する酵素で前記少なくとも１つの神経組織を処理する工程と、
前記処理された少なくとも１つの神経組織を洗浄して、前記酵素を実質的に除去および／または不活性化し、かつ前記ネイティブ細胞外マトリックス材料分解産生物および前記神経上膜鞘分解産生物を実質的に除去し、それによって、前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を実質的に含まない前記１本または複数本の神経束を産生する工程と、
前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を実質的に含まない前記１本または複数本の神経束のうちの少なくとも１本の神経束から束状神経移植片を形成する工程と
を備える、方法。
【請求項22】
前記方法が、前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を実質的に含まない前記１本または複数本の神経束を互いに分離する工程をさらに備え、前記束状神経移植片が、前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を実質的に含まない前記分離された１本または複数本の神経束から形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記束状神経移植片を形成する工程が、前記分離された１本または複数本の神経束のうちの前記少なくとも１本の神経束をエンチューブレーション材料でエンチューブレーションする工程を備える、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記束状神経移植片を形成する工程が、ゲル、接着剤、またはゲルおよび接着剤の両方を含むコーティング材料に前記少なくとも１本の神経束を包理する、またはそれで前記少なくとも１本の神経束をコーティングする工程を備える、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記束状神経移植片を形成する工程が、前記エンチューブレーション材料と前記少なくとも１本の神経束の間の空間、前記束状神経移植片を形成するために２本以上の神経束が使用されるケースにおいて２本以上の神経束の間の空間、またはその両方を、ゲル、コラーゲン、ゼラチン、多糖、ヒドロゲル、フィブリン、フィブリノゲン、アルギネート、セルロース、キトサン、または細胞外マトリックス材料のうちの１つまたは複数を含む生体適合性材料で少なくとも部分的に充填する工程を備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記束状神経移植片を形成する工程が、エンチューブレーション材料のシート上にコーティング材料を置く工程、および前記コーティングされたエンチューブレーション材料で前記少なくとも１本の神経束をエンチューブレーションする工程を備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
前記少なくとも１本の神経束が、ゲル、接着剤、もしくはゲルおよび接着剤を含むコーティング材料に包埋されるか、またはそれでコーティングされ、次いで、前記少なくとも１本の包埋またはコーティングされた神経束が、コラーゲン、キトサン、アルギネート、生分解性ポリマー、セルロース、フィブリノゲン、フィブリン、タンパク質ベースのポリマー、ゼラチン、多糖、および／もしくはヒドロゲルのうちの１つまたは複数を含む、細胞外マトリックス材料のうちの１つまたは複数を含むエンチューブレーション材料にエンチューブレーションされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項28】
前記エンチューブレーション材料および前記コーティング材料のうちの一方または両方の前記生体適合性材料が生分解性である、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記束状神経移植片が、単一の神経束を備える、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記束状神経移植片が、２本以上の神経束を備える、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記束状神経移植片が、２本の神経束～２０本の神経束を備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記束状神経移植片が、直径において互いに実質的に類似している神経束を備える、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項33】
前記神経束のそれぞれの直径が、約５０μｍ～約１ｍｍの間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記束状神経移植片が、約５０μｍ～約１ｍｍの間の直径を有する、請求項２１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記束状神経移植片が、長さが互いに実質的に類似している神経束を備える、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項36】
前記束状神経移植片が、約３ｍｍ～約２００ｍｍの間の長さを有する、請求項２１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記束状神経移植片を形成する工程が、前記ネイティブ細胞外マトリックス材料および前記神経上膜鞘を実質的に含まない前記２本以上の神経束の長さを修正して、実質的に同じ長さを有する工程を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項38】
前記少なくとも１つの神経組織が、ヒト動物、非ヒト動物、またはその両方からのものである、請求項２１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
成長因子、細胞、混合細胞集団中の複数の細胞型を含む細胞のミックス、細胞成分、非ステロイド性抗炎症剤、または免疫抑制剤のうちの１つまたは複数を前記束状神経移植片に導入する工程をさらに備える、請求項２１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記束状神経移植片が、末梢神経移植片または脊髄神経移植片である、請求項２１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記少なくとも１つの神経組織が、２つ以上の神経組織を含み、前記束状神経移植片が、前記２つ以上の神経組織からの神経束から形成される、請求項２１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記酵素が、ヒトコラゲナーゼ、非ヒト特異的コラゲナーゼ、または非特異的コラゲナーゼのうちの１種または複数種であり、任意選択で前記酵素が、コラゲナーゼタイプＩ、コラゲナーゼタイプＩＩＩ、コラゲナーゼタイプＩＶ、またはマトリックスメタロペプチダーゼである、請求項２１～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記神経組織を前記酵素で処理する工程が、約４℃～約３７℃の間の温度で実施される、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記神経組織を前記酵素で処理する工程が、約２時間～約２４時間の間の期間実施される、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記神経組織を前記酵素で処理する工程が、約３７℃の温度で約２時間～約４時間の期間実施される、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記神経組織を前記酵素で処理する工程が、約４℃の温度で約４時間～約２４時間の期間実施される、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記神経組織を前記酵素で処理する工程が、撹拌しながら実施される、請求項２１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記処理された神経組織を洗浄する工程が、撹拌しながら実施される、請求項２１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記処理された神経組織を洗浄する工程が、約４℃～約４０℃の間の温度で実施される、請求項２１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記処理された神経組織を洗浄する工程が、約１分～約６時間の範囲の期間実施される、請求項２１～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記処理された神経組織を洗浄する工程が、１回を超えて実施される、請求項２１～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記洗浄された神経組織を溶液中に懸濁させる工程と、前記懸濁された神経組織を前記溶液中でインキュベートする工程と
をさらに備える、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記洗浄された神経組織を前記溶液中に懸濁させる工程、前記懸濁された神経組織を前記溶液中でインキュベートする工程、またはその両方が、撹拌しながら実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記懸濁された神経組織が、約４℃～約３７℃の間の温度でインキュベートされる、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項55】
前記懸濁された神経組織が、約４５分～約２４時間の期間インキュベートされる、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記懸濁された神経組織が、約４℃の温度で約６時間～約２４時間の期間インキュベートされる、請求項５２～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記懸濁された神経組織が、約３７℃の温度で約４５分～約６０分の期間インキュベートされる、請求項５２～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記溶液が、少なくともアルファ－アンチトリプシンおよびアルファ－２－マクログロブリンを含むセリン成分を含む、請求項５３～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記溶液が、ウシ胎児血清、ヤギ胎児血清、ウマ胎児血清、およびウサギ胎児血清からなる群から選択される、請求項５２～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
インキュベーション後に前記溶液を除去する工程および前記神経組織を緩衝化溶液で洗浄する工程をさらに備える、請求項５２～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記緩衝化溶液が、約７．４のｐＨを有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記神経組織が、前記緩衝化溶液で約３７℃の温度で少なくとも４５分の期間洗浄される、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項63】
前記神経組織が、前記緩衝化溶液で約４℃の温度で少なくとも１時間の期間洗浄される、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項64】
前記神経組織を前記緩衝化溶液で洗浄する工程が、撹拌しながら実施される、請求項６０～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記ネイティブ細胞外マトリックス材料の少なくとも約５０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または全部が除去されている、請求項２１～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記神経上膜鞘の少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または全部が除去されている、請求項２１～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
請求項１～２０のいずれか１項に記載の神経移植片を患者に植え込む工程を備える、処置の方法。
【請求項68】
請求項２１～６６のいずれか１項に記載の方法により作製された前記神経移植片を患者に植え込む工程を備える、処置の方法。
【請求項69】
前記患者が、ヒトまたは非ヒト動物である、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項70】
鎮痛療法、非ステロイド性抗炎症薬、成長因子、または免疫抑制剤で前記患者を処置する工程をさらに備える、請求項６７～６９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は一般に、神経生物学および医学の分野に関する。より詳細には、本開示は、束状神経移植片、そのような神経移植片を作製する方法、およびそのような神経移植片を使用して神経欠損を処置する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
神経損傷は、神経障害性疼痛を含む様々なタイプの慢性疼痛を引き起こす可能性がある。末梢神経損傷は、様々な事故による外傷によって引き起こされる一般的な臨床課題であり、急増している。末梢神経損傷はしばしば、完全麻痺、麻痺、および対応する身体部分の自律制御の喪失につながる。神経損傷の外科的修復は、現在、そのような損傷の一般的な処置であるが、転帰は理想的ではない。したがって、神経損傷後の軸索再生および標的臓器の神経支配を改善する新しい戦略が必要とされている。
【0003】
末梢神経系のニューロンは、中枢神経系のニューロンよりも高い内因性の再生能を有すると理解されており、かつ適した環境条件下で軸索を再生することができる。しかし、末梢神経再生過程は複雑であり、かつ神経再生に関与する微小環境など、複数の因子により制御される。それでもなお、自家神経移植術は、末梢神経欠陥を修復するためのゴールドスタンダードとして受け入れられてきた。
【0004】
多くの臨床状況において、横切された神経の直接端々接合による末梢神経のテンションフリー再建を可能にするのに十分な神経組織は存在しない。これらのケースにおいて、異なる源の神経移植片を使用して、神経ギャップをブリッジすることができる。神経自家移植片は典型的には第２の手術部位を要し、それは、追加の手術時間、永久的な瘢痕、およびドナー神経の領域における感覚喪失を必然的に伴い、結果として持続性術後疼痛を生じ得る。神経自家移植片の代替は、加工された神経同種移植片または加工された神経異種移植片の使用であり、その両方が、神経再生のための生物学的基質を提供し、かつ神経自家移植片のように、免疫抑制なしに使用することができる。それでもなお、現在利用可能な商業的移植片技術は、任意の特定の外科的必要に適正な「フィットマッチ」ではないことがあるという点で限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
神経移植片、特に任意の特定の患者の必要に適切な長さおよび直径サイズの神経移植片の品質、および利用可能性は依然として課題である。実際、現在利用可能な商業的神経移植片は、長さおよび直径に関して限定されたサイズのものであり、それは、すべての患者の必要を満たさないことがある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示によれば、１本または複数本の神経束を備える束状神経移植片であって、神経上膜鞘（ｅｐｉｎｅｕｒｉａｌ ｓｈｅａｔｈ）およびネイティブ細胞外マトリックス材料を実質的に含まない、束状神経移植片が提供される。
【0007】
加えて、本開示によれば、束状神経移植片を調製する方法であって、１本または複数本の神経束を備え、かつネイティブ細胞外マトリックス材料および神経上膜鞘を備える少なくとも１つの神経組織を提供する工程と、ネイティブ細胞外マトリックス材料および神経上膜鞘を分解する酵素で少なくとも１つの神経組織を処理する工程と、処理された少なくとも１つの神経組織を洗浄して、酵素を実質的に除去および／または不活性化し、かつネイティブ細胞外マトリックス材料分解産生物および神経上膜鞘分解産生物を実質的に除去し、それによって、ネイティブ細胞外マトリックス材料および神経上膜鞘を実質的に含まない１本または複数本の神経束を産生する工程と、ネイティブ細胞外マトリックス材料および神経上膜鞘を実質的に含まない１本または複数本の神経束のうちの少なくとも１本の神経束から束状神経移植片を形成する工程とを備える、方法が提供される。
【0008】
当業者であれば、本明細書に開示される神経移植片、神経移植片を調製する方法、および神経移植片を使用した処置の方法は、ヒトおよび他の脊椎動物の外科的介入において使用されてよく、実験室研究、比較、およびアッセイにおいても使用されることを理解するであろう。
【0009】
当業者であれば、具体的に例証されるもの以外の出発材料、生物学的材料、生体適合性材料、成分、成長因子、薬剤、酵素、および溶液、療法、薬物、ならびに調製および処置の方法を過度の実験に頼ることなく本開示の実行において利用することができることも理解するであろう。任意のそのような材料および方法のすべての当技術分野で公知の機能的均等物が本開示に含まれることが意図される。
【0010】
束状神経移植片を使用した処置を準備および提供するための本明細書に記載される方法論は、さもなければその神経の使用がそれらの直径または不十分な束数に基づいて拒否された可能性がある低収量ドナーの使用をよりよく可能にし得る。例えば、本開示は、所望の長さおよび直径の束状神経移植片を作り出すために、１つを超える収集された神経から単離された束を組み合わせることを提供する。したがって、開示される方法は、例えば、使用可能なドナー神経の収量を改善し得、かつ移植プロセスをより効率的かつ経済的にし得る。
【0011】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および例は、本開示の例証的な実施形態を示す一方、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、例示のためにのみ与えられていると理解されるべきである。特定の化合物がある一般式に帰するという理由だけで、それが別の一般式にも属することができないことを意味しないことに留意されたい。
【0012】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により特に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。用語「およそ」および「約」は、言及された数または値とほぼ同じであることを表す。本明細書において使用されるとき、用語「およそ」および「約」は一般に、指定された量または値の±５％を包含すると理解されるべきである。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを表すことが明示的に示されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、たとえ代替物のみならびに「および／または」を表すという定義を本開示が支持していても、「および／または」を意味するために使用される。本明細書において使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。本出願全体を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために利用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【0013】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも単に例証的かつ説明的であり、特許請求される通り、特徴を限定するものではない。本明細書において使用されるとき、用語「を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む」、「を有する」、またはそれらの他の変形は、非排他的な包含を網羅することが意図され、したがって、要素のリストを構成するプロセス、方法、物品、もしくは装置は、それらの要素のみを含むのではなく、明示的にリストされていない、またはそのようなプロセス、方法、物品、もしくは装置に固有の他の要素も含んでよい。追加的に、用語「例証的な」は、「理想的な」よりもむしろ「例」の意味で本明細書において使用される。加えて、値の範囲の記載において使用される用語「間」は、本明細書に記載される最小値および最大値を含むことが意図される。
【0014】
採用された用語および表現は、限定の用語としてではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、図示および記載された特徴またはその一部の任意の均等物を除外する意図はないが、特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。
【0015】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、かつ本開示のある特定の態様をさらに明示するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される例証的な実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、よりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
本開示の神経移植片は、様々な操作的必要にマッチする多種多様な長さおよび直径で調製することができる。したがって、本開示は、より成功した神経再生およびよりよい患者転帰を提供することができる。例証的な神経移植片、それらの調製のための関連する方法、および神経移植片を使用した処置の関連する方法が、以下で詳細に記載される。
【0018】
本開示の一部の実施形態によれば、神経移植片を調製する工程は、１本または複数本の神経束を有する神経組織を提供する工程を含む。
図１～４は、束状神経移植片１１４を調製するために使用される神経組織１００の一例を例示する。図１～４に示された特定の特徴は、単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。図１は、神経束１０２、ネイティブ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料１０４、および神経上膜鞘１０６を含む神経組織１００の断面図を示す。神経組織１００は、１本の神経束を含んでよく、または図１に示されるように１本を超える神経束１０２を含んでよい。本開示における使用に適した神経組織１００は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物など、動物から得られてよい。１つを超える神経組織１００が、本明細書に記載される方法において使用されてよく、１つを超えるタイプの神経組織１００、例えば、ヒト神経組織および非ヒト神経組織、または異なる非ヒト哺乳動物からの非ヒト神経組織からの神経束１０２が、束状神経移植片１１４の調製において組み合わせられてよい。図４に示された束状神経移植片１１４は、ヒト、非ヒト動物、または他の脊椎動物から単離された神経組織１００から調製されてよい。出発神経材料は、身体内の任意の適した神経組織から入手されてよい。出発神経材料は、末梢神経組織または脊髄神経組織を含んでよく、かつ究極的に、末梢または脊髄神経移植のための神経移植片を形成するために使用されてよい。
図１～４は、束状神経移植片１１４を調製するために使用される神経組織１００の一例を例示する。図１～４に示された特定の特徴は、単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。図１は、神経束１０２、ネイティブ細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料１０４、および神経上膜鞘１０６を含む神経組織１００の断面図を示す。神経組織１００は、１本の神経束を含んでよく、または図１に示されるように１本を超える神経束１０２を含んでよい。本開示における使用に適した神経組織１００は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物など、動物から得られてよい。１つを超える神経組織１００が、本明細書に記載される方法において使用されてよく、１つを超えるタイプの神経組織１００、例えば、ヒト神経組織および非ヒト神経組織、または異なる非ヒト哺乳動物からの非ヒト神経組織からの神経束１０２が、束状神経移植片１１４の調製において組み合わせられてよい。図４に示された束状神経移植片１１４は、ヒト、非ヒト動物、または他の脊椎動物から単離された神経組織１００から調製されてよい。出発神経材料は、身体内の任意の適した神経組織から入手されてよい。出発神経材料は、末梢神経組織または脊髄神経組織を含んでよく、かつ究極的に、末梢または脊髄神経移植のための神経移植片を形成するために使用されてよい。
【0019】
本開示による束状神経移植片（例示された束状神経移植片１１４を含む）は、束状神経移植片で処置される患者に対して同種または異種でよい。図１～４の例において、束状神経移植片１１４は、神経組織１００の三次元微細構造のスキャフォールドを備え、かつそれに固有のタンパク質成分を含んでよい。本明細書において同じく企図されるのは、患者への植え込み前および／または後に神経組織（神経組織１００など）および／または神経組織から調製された束状神経移植片（例えば、神経組織１００から調製された束状神経移植片１１４）に対して実施される１種または複数種の免疫抑制技法を含む方法である。例えば、供与された神経組織が、束を束状神経移植片に取り込む前に細胞成分および／もしくは残屑を選択的に除去するように加工されてよく、かつ／または神経組織が、本明細書に記載される方法による処理の前に細胞成分および／もしくは残屑を選択的に除去するように加工されてよい。
【0020】
本明細書の方法による例証的な束状神経移植片１１４の調製は、ネイティブＥＣＭ材料１０４および神経上膜鞘１０６を少なくとも部分的または完全に分解する１種または複数種の酵素で神経組織１００を処理する工程を含んでよい。酵素は、例えば、コラゲナーゼタイプＩＶ、他のタイプのコラゲナーゼ（ＩまたはＩＩＩ、最高濃度１ｍｇ／ｍＬ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）もしくは生理食塩水などの水性ベースの溶液中最高濃度１：２０のマトリックスメタロペプチダーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ７またはＭＭＰ１２）を含んでよい。
【0021】
神経組織（例えば、神経組織１００）を酵素で処理する工程は、約４℃～約１５℃の間、約１０℃～約２０℃の間、または約２０℃～約３０℃の間など、約４℃～約３７℃の間の温度で実施されてよい。加えて、神経組織１００を酵素で処理する工程は、約２時間～約５時間の間、約８時間～約１２時間の間、約１６時間～約２４時間の間、または約６時間～約１２時間の間など、約２時間～約２４時間の間の期間実施されてよい。少なくとも１つの例において、神経組織１００を酵素で処理する工程は、約３５℃～約４０℃の温度で約２時間～約６時間の間の期間、とりわけ、約３７℃の温度で約２時間～約４時間の間の期間実施されてよい。少なくとも１つの例において、神経組織１００を酵素で処理する工程は、約４℃～約６℃の温度で約４時間～２４時間の間の期間実施されてよい。神経組織１００を酵素で処理する工程は、撹拌しながら実施されてよい。
【0022】
次いで、処理された神経組織から残っているすべての残っている酵素および／または残屑を除去するために、個々の神経束（例えば、神経束１０２）を含む処理された神経組織を洗浄することができる。すなわち、方法は、酵素、残留するネイティブＥＣＭ材料、または神経上膜鞘分解産生物を除去するために、処理された神経組織を洗浄する工程を含んでもよい。一部の態様において、処理された神経組織を洗浄する工程は、ｐＨを平衡させることにより酵素を不活性化してよい。洗浄工程を実施することにより酵素が完全または少なくとも部分的に除去および／または不活性化されてよい。処理された神経組織を洗浄する工程は、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、セリン含有血清、またはそれらの組合せなどの溶液を使用して実施されてよい。処理された神経組織を洗浄する工程は、撹拌しながら実施されてよい。加えて、処理された神経組織を洗浄する工程は、約４℃～約４０℃の間の温度で実施されてよい。さらに、処理された神経組織を洗浄する工程は、約１分～約４時間の間の期間実施されてよい。その上さらに、処理された神経組織を洗浄する工程は、１回を超えて、例えば、２回、３回、もしくは４回またはそれ以上実施されてよい。ネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を除去し、それによって、ネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を含まないか、またはネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘が実質的にない１本または複数本の神経束を産生するために、処理された神経組織が十分に洗浄されてよい。本明細書において使用されるとき、語句「ネイティブＥＣＭ材料を実質的に含まない」は、ネイティブＥＣＭ材料のすべて、または少なくとも５０％が除去されていることを意味する。ある特定の実施形態において、ネイティブＥＣＭ材料を実質的に含まない１本または複数本の神経束は、ネイティブＥＣＭ材料の少なくとも約８５％または少なくとも約９５％が除去されている。他の実施形態において、ネイティブＥＣＭ材料を実質的に含まない１本または複数本の神経束は、ネイティブＥＣＭ材料の少なくとも約９９％または全部が除去されている。加えて、神経上膜鞘を実質的に含まない神経束のうちの１本または複数本は、神経上膜鞘の少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または全部が除去されている。
【0023】
追加的または代替的に、方法は、処理および洗浄された神経組織を溶液中に懸濁させる工程およびインキュベートする工程を含んでもよい。インキュベーションは、約４℃～約１５℃の間、約１０℃～約２０℃の間、または約２０℃～約３０℃の間など、約４℃～約３７℃の間の温度で実施されてよい。インキュベーションは、約１時間～約２時間の間、約３時間～約８時間の間、約６時間～約１２時間の間、または約１２時間～約２４時間の間など、約４５分～約２４時間の期間実施されてよい。例えば、インキュベーションは、約４℃の温度で６時間～約２４時間の期間でよい。別の例において、インキュベーションは、約３７℃の温度で約４５分～６０分の期間でよい。一部の態様において、インキュベーションは、３７℃で約３時間～約５時間の期間、例えば３７℃で約４時間でよい。持続時間および温度の例証的な範囲が本明細書にリストされるが、一般に、インキュベーション温度が低下するにつれて、インキュベーションの持続時間は増加し得る。神経組織を懸濁させる工程、神経組織をインキュベートする工程、またはその両方が、撹拌しながら実施されてもよい。懸濁およびインキュベーションのために使用される溶液は、少なくともアルファ－アンチトリプシンおよびアルファ－２－マクログロブリンを含むセリン成分を含んでよい。溶液はセリン含有血清でよい。例えば、溶液は、ウシ胎児血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ニワトリ血清、またはウサギ血清を含んでよい。
【0024】
追加的または代替的に、方法は、洗浄された神経組織を懸濁させる工程において使用された溶液を除去するために、懸濁およびインキュベートされた神経組織を緩衝化溶液で洗浄する工程を含んでもよい。緩衝化溶液は、例えば、約７．２、約７．４、または約７．６など、約６．８～約７．８の間のｐＨを有してよい。少なくとも１つの例において、懸濁された神経組織は、緩衝化溶液で約３７℃の温度で約４５分～約５５分の期間洗浄されてよい。少なくとも１つの例において、懸濁された神経組織は、緩衝化溶液で約４℃の温度で約１時間～約６時間の期間洗浄されてよい。加えて、懸濁された神経組織を緩衝化溶液で洗浄する工程は、撹拌しながら実施されてよい。緩衝化溶液は、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水または他の適した緩衝液を含んでよい。
【0025】
次いで、処理および洗浄された神経組織の神経束は、互いに分離することができ、それによって、分離された神経束を産生する。図２は、神経組織１００に由来する５本の分離された神経束１０８（すなわち、図１に示された６本の神経束１０２のうちの５本に対応する図２の５本の分離された神経束１０８）を示す。次いで、任意の数の分離された神経束を実質的に整列させ（任意選択で、神経組織の１つまたは複数の他のサンプルから得られる１本または複数本の神経束と組み合わせて－神経組織のそれらのサンプルが、異なる源から得られる場合を含む）、ネイティブＥＣＭ材料および／もしくは神経上膜鞘を伴わないか、またはそれを実質的に含まない１本または複数本の神経束を含む束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）を調製するために包むか、または巻くことにより非端側面をエンチューブレーションすることができる。図３は、図３に示された神経組織１００に由来する５本の分離された神経束１０８、および異なる神経組織に由来する２本の追加の分離された神経束１０８を含む７本の分離された神経束１０８を示す。すなわち、図３および図４を参照して、束状神経移植片１１４は、少なくとも１本の分離された神経束（例えば、複数本の分離された神経束１０８）、および神経束１０８を取り囲む生体適合性材料を含むエンチューブレーション材料１１０から形成されてよい。束状神経移植片１１４を形成するために使用されるすべての神経束１０８が同じ神経組織からでよく、または神経束１０８のうちの１本または複数本が、他の神経組織から得られた１本または複数本の他の束と組み合わせられてよい。そのような他の神経束は、上記と同じように処理および洗浄された神経組織から得られてよい。
【0026】
本開示による束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）を調製するために使用される個々の束は、神経組織（例えば、神経組織１００）を処理する工程において使用される加工方法、ならびにその後の洗浄およびインキュベーションにより実質的に改変および破損されない。酵素は、神経束を実質的に破損することなく、神経組織のネイティブＥＣＭ材料（例えば、神経組織１００のネイティブＥＣＭ材料１０４）および神経上膜鞘（例えば、神経上膜鞘１０６）を実質的に消化する。神経束を改変または破損することなくネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を消化するのに適切な酵素は、上述のもの、例えば、特異的および非特異的コラゲナーゼまたはコラーゲン特異的酵素または化学薬品を含む。例えば、ネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を除去するためにコラゲナーゼタイプＩＶが使用されてよい。神経束を改変または破損しない酵素は、束および各束を取り囲む神経周膜を実質的にインタクトかつ神経束の取扱いに十分な品質のまま残す酵素である。加えて、実質的にインタクトかつ神経束の取扱いに十分な品質のままでありながら、各束を取り囲む神経周膜が神経組織の加工中に影響されてよい。本明細書において使用されるとき、用語「実質的にインタクトかつ取扱いに十分な品質の」は、以下のうちの１つまたは複数を意味する：神経束は、神経束が分裂することなく、マニピュレートされる能力、例えば、ピンセットなどのツールを使用してピックアップされる能力を有する、神経束は、ネイティブ神経組織中の神経束（例えば、神経組織１００中の神経束１０２）と類似の形態および形状を維持し得る、神経束は、流動性のない固体状態のままである、または神経束の物理的特性、例えば、引張強度および弾性率などは、ネイティブ神経組織中の神経束（例えば、神経組織１００の神経束１０２）のものと類似であり得る。図５は、本明細書の方法による１種または複数種の酵素での処理前のネイティブＥＣＭ材料１０４に取り囲まれているラミニン染色された神経束１０２を示す。図６は、処理後の同じラミニン染色された神経束１０２を示し、ここで、ネイティブＥＣＭ材料１０４および神経上膜鞘１０６が除去されている一方、神経束１０２はインタクトなままであった。以下の実施例１は、本開示による、神経組織１００などの神経組織を処理および洗浄する方法を記載する。
【0027】
一部の実施形態によれば、加工され、分離された神経束は、生体適合性材料であるエンチューブレーション材料で包まれることによるものを含め、整列（１本を超える束が使用される場合）およびエンチューブレーションされる。エンチューブレーション材料は、その形状を維持しながら、マニピュレートされる能力、例えば、ピンセットなどのツールでピックアップされる能力を有する十分な強度の任意の材料でよく、かつ例えば、シート、鞘、チューブ、ゲル、または接着剤でよい。エンチューブレーション材料は、ネイティブ神経（例えば、神経組織１００）の形状を代表する形状で束を一緒に保持することができる任意の材料でよい。加えて、エンチューブレーション材料は、神経終末または別の材料に対するエンチューブレーション材料の結合のためのその内部を通る縫合糸の挿入に耐える能力を有する十分な強度の任意の材料または材料の組合せで形成されてよい。図３は、図３に示されるようなシートの形態の例証的なエンチューブレーション材料１１０を例示する。代替的に、神経束（例えば、神経束１０８）は、生体適合性材料を含むチューブで束の非端側面を取り囲むことによりエンチューブレーションされてよい。エンチューブレーション材料は、様々な材料または材料の組合せを含んでよく、それらは天然または合成材料でよい。本明細書の束状神経移植片を形成するエンチューブレーション材料としての使用に適した例証的な生体適合性材料は、これらに限定されないが、インタクトなＥＣＭ、コラーゲン（これらに限定されないが、単離タイプ－Ｉコラーゲン、またはタイプＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＩＶを含む追加のタイプのコラーゲンを含む）、合成生分解性材料（ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ－Ｌ－乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のようなポリエステルなど）、多糖（例えば、キトサン、アルギネート、セルロースを含む）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリマー（例えば、タンパク質ベースのポリマーを含む）、フィブリノゲン、フィブリン、ゼラチン、およびヒドロゲルを含む。エンチューブレーション材料として使用される生体適合性材料は生分解性でよい。適した生体適合性材料のさらなる詳細は、以下にリストされる。エンチューブレーション材料のシートは、患者の必要に合わせてカスタマイズされた構造および寸法を含む所望通りの構造および寸法の１本または複数本の個々の神経束を取り巻き、かつ含むように配置されてよい。いくつかの例において、束状神経移植片を調製するために生体適合性接着剤またはシーラントが使用されてよい。例えば、エンチューブレーション材料が、クロージャー（例えば、チューブに巻かれたシート）を必要とする１つまたは複数の継ぎ目を備える場合、継ぎ目が、生体適合性接着剤またはシーラントの使用を通じて閉じられてよい（例えば、シートの縁部が、一緒に連結およびシールされてよい）。本開示による継ぎ目を閉じるために使用されてよい接着剤またはシーラントの例は、これらに限定されないが、ＰＥＧ、フィブリン糊、単離タイプ－Ｉコラーゲン（またはタイプＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、およびＩＶを含む追加のタイプのコラーゲン）、および光硬化接着剤を含む生物学的に入手された材料または合成材料を含むが、これらに限定されない。シーラントまたは接着剤は、末梢神経組織のような類似の機械的性質および弾性モジュールを保証することができる。
【0028】
代替的に、または加えて、少なくとも１本の神経束（例えば、神経束１０８）をエンチューブレーションし、束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）を調製する工程は、生体適合性材料または生体適合性材料の組合せであるコーティング材料に神経束を包理する、またはそれで神経束をコーティングする工程を含んでよい。コーティング材料は、例えば、ゲル形態でよく、または接着剤、もしくはゲルおよび接着剤の両方を含んでよい。コーティング材料として使用される生体適合性材料は、神経束がエンチューブレーション材料に包まれ、かつコーティング材料で包埋またはコーティングされるケースにおいて、エンチューブレーション材料としての使用のための上記の生体適合性材料と同じでも、異なっていてもよい。例えば、エンチューブレーション材料上で神経束を整列させた後、整列された神経束は、コーティング材料に包埋され、次いで、エンチューブレーション材料に包まれてよい。代替的に、例えば、神経束は、エンチューブレーション材料上で整列され、エンチューブレーション材料に包まれる前に、コーティング材料で包埋またはコーティングされてよい。そして、コーティング工程の別の代替として、エンチューブレーション材料上で神経束を整列させ、神経束をエンチューブレーション材料に包む前に、エンチューブレーション材料にコーティング材料が厚く塗られてよい（すなわち、コーティング材料（例えば、図３および図４に示されたコーティング材料１１２）がエンチューブレーション材料上に広げられる）。
【0029】
さらに、代替的に、または加えて、神経束を包埋またはコーティングし、束状神経移植片を調製する工程は、神経束の間の空間を、ゲル、コラーゲン、ゼラチン、多糖、ヒドロゲル、フィブリン、フィブリノゲン、アルギネート、セルロース、キトサン、または細胞外マトリックス材料のうちの１つまたは複数を含む生体適合性材料または生体適合性材料の組合せを含む充填材料で少なくとも部分的または完全に充填する工程を含んでよい。充填材料として使用される生体適合性材料は、エンチューブレーション材料として使用される生体適合性材料と同じでも、異なっていてもよく、神経束をコーティングする工程に加えて充填工程が実施されるケースにおいて、コーティング材料として使用される生体適合性材料と同じでも、異なっていてもよい。例えば、充填材料の層が、神経束とエンチューブレーション材料の間の空間、および／または神経束の間の空間を充填してよい。すなわち、束状神経移植片を調製する方法は、例えば、エンチューブレーション材料上で神経束を整列させ、整列された神経束をエンチューブレーション材料に包んだ後、エンチューブレーションされた神経束の間のエンチューブレーション材料内の空間に充填材料を、例えば、注入により、加えることを含んでよい。
【0030】
本明細書の方法は、所望の長さ、周囲長、および断面寸法（円柱状の神経移植片のケースにおける直径などの幅）を有する所望の寸法の神経移植片を産生するために使用することができる。そのために、束状神経移植片を調製するために使用される個々の神経束の数は、所望の幅（または直径）の神経移植片を達成するのに適切な任意の数の神経束を含んでよく、例えば、２本以上の束を含んでよい。すなわち、一部の実施形態において、束状神経移植片は、単一の神経束を含み、そして、他の実施形態において、束状神経移植片は、１本を超える神経束１０８を含む。例えば、束状神経移植片は、少なくとも２本、少なくとも３本、少なくとも４本、少なくとも５本、少なくとも８本、少なくとも１０本、少なくとも１２本、または少なくとも１６本の神経束など、複数本の束を備えてよい。いくつかの例において、神経移植片は、神経束のサイズ、束状神経移植片が使用される予定の患者の身体内の位置、および束状神経移植片が結合されることになる神経の性質に依存して、２～２０本の神経束、５～１５本の神経束、１４～１８本の神経束、またはさらに２０本を超える神経束を備える。
【0031】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、患者の外科的必要に適した寸法を有してよく、束状神経移植片を形成するために使用される神経束の数は、その使用位置および患者内の外科的部位の明細により決定されるときを含め、少なくとも部分的には、１本または複数本の神経束の寸法および束状神経移植片の所望の寸法に基づいて決定されてよい。本開示の一部の態様によれば、束状神経移植片は、直径が互いに実質的に類似している神経束を含んでよく、代替的に束状神経移植片は、互いに実質的に非類似の直径の２本以上の個々の神経束を備えてよく、さらに、束状神経移植片は、そのいくつかが互いに実質的に類似の直径を有し、その他が互いに実質的に非類似の直径を有する個々の神経束を備えてよい。各神経束（例えば、各神経束１０８）の直径は、約５０μｍ～約１ｍｍの間、約５０μｍ～約５ｍｍの間、例えば、約１００μｍ～約５００μｍの間、約２５０μｍ～約７５０μｍの間、約６００μｍ～約９００μｍの間、約７５０μｍ～約１ｍｍの間、または約７５０μｍ～約５ｍｍの間でよい。
【0032】
束状神経移植片のサイズは、レシピエント神経の束部分および／または全直径にマッチするように選択される。したがって、神経移植片を形成するために使用される束の数およびサイズは、束状神経移植片の全体のサイズをレシピエント神経の束の数および／またはサイズにマッチするように選択することができる。束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、約５０μｍ～約１０ｍｍの間、例えば、約１００μｍ～約５００μｍの間、約２５０μｍ～約７５０μｍの間、約６００μｍ～約９００μｍの間、または約７５０μｍ～約５ｍｍの間の直径を有してよい。個々の束は、約１０μｍの最小直径を有してよい。束状神経移植片の任意の単一の所望の直径について、１本の束または１本を超える束から束状神経移植片を調製することが可能であり得る。束状神経移植片が１本を超える神経束で形成されるケースにおいて、束状神経移植片を形成するために使用される神経束は、直径が実質的に類似してよい。本明細書において使用されるとき、「直径が実質的に類似」は、神経束が、互いに±２０％以内の直径を有することを意味する。代替的に、束状神経移植片を形成するために使用される神経束は、互いに異なっていてもよい。そして、上で述べたように、使用される束の数は、神経束のサイズ、ならびに束状神経移植片が使用される予定の患者の身体内の位置、および束状神経移植片が結合されることになる神経の性質に依存し得る。
【0033】
本明細書において束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）を形成する方法は、複数本の神経束（例えば、神経束１０８）の長さを修正して、例えば、互いに実質的に同じ長さの複数本の神経束を提供する工程を含んでよい。例えば、神経束は、例えば、上記のように、エンチューブレーションする工程、包埋もしくはコーティングする工程、および／または充填する工程のうちの１つまたは複数を含んでよい上記の方法のいずれかにより調製される束状神経移植片へと神経束を組み合わせる前、間、または後に、任意の適切な技法によりトリミングまたは切断されてよい。一部の態様において、軸索エスケープ（ａｘｏｎａｌ ｅｓｃａｐｅ）または神経腫の形成を最もよく防止するために、各神経束は、神経移植片の一端から他端まで連続すべきである。束状神経移植片は、約５ｍｍ～約１００ｍｍの間、約２０ｍｍ～約５０ｍｍの間、約４５ｍｍ～約７５ｍｍの間、または約１５ｍｍ～約４０ｍｍの間など、約３ｍｍ～約２００ｍｍの間の長さを有するように形成されてよい。さらに、例えば、束状神経移植片は、約１００ｍｍ３～約２５，０００ｍｍ３、約５００ｍｍ３～約１０，０００ｍｍ３、約１，０００ｍｍ３～約５，０００ｍｍ３、約５００ｍｍ３～約２，０００ｍｍ３、約１００ｍｍ３～約５０００ｍｍ３、または約７，５００ｍｍ３～約１５，０００ｍｍ３など、約５ｍｍ３～約５５，０００ｍｍ３の範囲の全体積を定義してよい。
【0034】
本明細書に記載される束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、神経成長因子、細胞、混合細胞集団中の複数の細胞型を含む細胞のミックス、細胞成分、非ステロイド性抗炎症剤、または免疫抑制剤のうちの１つまたは複数を含んでもよく、それらのいずれかが、束状神経移植片の形成においていつでも含まれてよく、かつ／またはその形成後に束状神経移植片に加えられてよい。加えて、その全体が本願明細書に援用される米国仮特許出願第６３／０７１，６３５号に記載された免疫抑制技法およびイムノフィリック剤（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｇｅｎｔ）が、本開示の束状神経移植片における再生活性および免疫抑制活性のために使用されてよい。
【0035】
本明細書に記載される方法にしたがって調製される束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、患者を処置する方法において、例えば、神経ギャップにわたる軸索再生を支持するために末梢神経の不連続性を再建するために、使用されてよい。患者は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマなど）であり得る。例えば、本明細書の方法による処置において使用される束状神経移植片は、外科的手順を通じて移植されてよい。例証的な手順において、外科医または他の医学的専門家が、関心部位の患者の組織を調べ、必要であれば瘢痕組織を切除し得る。損傷した神経の近位および遠位セグメントが、例えば、視覚的および触覚的サインにより、健常組織まで郭清され得る。さらに、外科医は、適切な長さおよび直径の束状神経移植片を選択するために、神経ギャップを定義する神経の終末間の距離および破損した神経の直径を測定することができる。次いで、本開示にしたがって調製された束状神経移植片が患者に植え込まれ得る。外科医は、縫合糸を使用して、神経ギャップを定義する神経の終末に束状神経移植片を接続することができる。任意選択で、患者を処置する工程は、鎮痛療法および／または非ステロイド性抗炎症薬、成長因子、もしくは免疫抑制剤の投与を含んでもよい。そのような薬剤は、上述のように、束状神経移植片に導入されてよく、かつ／または別個に患者に投与されてよい。イブプロフェンのような非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの非ステロイド性抗炎症剤は、疼痛を軽減し、発熱を低減し、血餅を防止し、かつ比較的より高い用量で、炎症を低減することができる。そのようなＮＳＡＩＤは、両方のシクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ－１およびＣＯＸ ２）の活性を阻害することに非選択的であり得、またはＣＯＸ－２選択的であり、ＣＯＸ－２の活性を阻害するために使用され得る。免疫抑制剤は、植え込まれた束状神経移植片に対する望まれない免疫応答を防止するのに役立ち得る。本開示に有用な免疫抑制剤は、これらに限定されないが、ステロイド（これらに限定されないが、テストステロンおよびエストロゲンを含む）、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬物、および他の免疫抑制薬を含んでよい。ＦＫ５０６などのイムノフィリンリガンドは、独立した作用機序を通じて神経再生を改善する一方で、免疫抑制的性質を提供する。
【0036】
上記のように、本明細書に記載される束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、１本または複数本の神経束（例えば、神経束１０８）を１種または複数種の生体適合性材料、ならびに他の任意選択の補足的な材料と組み合わせることにより形成されてよい。特に、神経束は、束状神経移植片を形成するために、エンチューブレーション材料（例えば、図３および図４に示されたエンチューブレーション材料１１０）にエンチューブレーションされてよく（例えば、包まれるか、または取り囲まれてよく）、コーティング材料（例えば、図３および図４に示されたコーティング材料１１２）に包埋されるか、もしくはそれでコーティングされてよく、かつ／または充填材料に取り囲まれてよく、ここで、エンチューブレーション材料、コーティング材料、および／または充填材料は、生分解性である生体適合性材料を含む１種または複数種の生体適合性材料を含む。以下にリストされる生体適合性材料は、束の間の空間を充填するために使用されてよい。生体適合性材料は、最終的なコンストラクト（すなわち、最終的な束状神経移植片）内に束を包埋するために使用されてよい。一部の態様において、生体適合性材料は、最終産生物の外部層をコーティングするために使用されてよい。以下でより詳細に記載されるように、任意選択でヒドロゲルの形態の、非ネイティブＥＣＭ材料、コラーゲン、キトサン、アルギネート、生分解性ポリマー、セルロース、フィブリノゲン、フィブリン、タンパク質ベースのポリマー、ゼラチン、多糖（キトサン、アルギネート、またはセルロース以外）のうちの１つもしくは複数を含む様々な材料が、１本もしくは複数本の神経束をエンチューブレーションおよび／または包埋もしくはコーティングする、かつ／あるいは１本もしくは複数本の神経束の周りの空間を充填する目的で使用されてよい。リストされるＥＣＭ材料およびタンパク質は、束状神経移植片内の神経束の安定化を可能にし、かつ植え込まれた組織内の軟部組織浸潤を防止するのに役立つ一般的な生体適合性タンパク質と見なされる。
【0037】
上で述べたように、エンチューブレーション材料および／またはコーティング材料は、非ネイティブＥＣＭ材料、すなわち、ネイティブＥＣＭ材料のある部分および神経上膜鞘が除去された後に加えられるＥＣＭ材料を含んでよい。非ネイティブＥＣＭ材料は、異なるタイプの組織または異なる種から入手されてよい。加えて、非ネイティブＥＣＭ材料は、これらに限定されないが、ラミニン（例えば、ラミニンアルファ－２、ラミニンアルファ－４、ラミニンアルファ－５、ラミニンベータ－１、ラミニンベータ－２、ラミニンガンマ－１）、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩＶアルファ－１（ＩＶ）鎖、コラーゲンＩＶアルファ－１／５（ＩＶ）鎖、コラーゲンアルファＩＶ－２鎖、コラーゲンアルファＩＶ－３鎖、コラーゲンＩアルファ－１鎖、コラーゲンアルファ－２（Ｉ）鎖、コラーゲンアルファ－３（ＶＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＶＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＸＶＩＩＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＩＩＩ）鎖、コラーゲンアルファ－３（Ｖ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＸＩ）鎖、コラーゲンアルファ－２（ＶＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＶＩＩＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（Ｖ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＩＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＩＶ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＩＩ）鎖）、フィブロネクチン（例えば、フィブロネクチン１（タイプ－ＩＩＩ ４、７ドメイン））、アスポリン、パールカン、ナイドジェン（例えば、ナイドジェン－１、ナイドジェン－２）、ルミカン、デルマトポンチン、ケラチン、タイプＩＩ細胞骨格１、フィブリリン－１、デコリン、ビトロネクチン、ミエリンタンパク質Ｐ０、ミエリンＰ２タンパク質、アスポリン、プロラルギン、バイグリカン、ペリオスチン、およびアルファ－クリスタリンＢ鎖を含んでよいタンパク質を含む。これらのうち、少なくとも以下のタンパク質は、神経移植片の再生能力に寄与すると考えられる：ラミニンアルファ－２、ラミニンアルファ－４、ラミニンアルファ－５、ラミニンベータ－１、ラミニンベータ－２、ラミニンガンマ－１、コラーゲンｉｖアルファ－１（ＩＶ）鎖、コラーゲンＩＶアルファ－１／５（ＩＶ）鎖、コラーゲンアルファＩＶ－２鎖、コラーゲンアルファＩＶ－３鎖、フィブロネクチン１（タイプ－ｉｉｉ ４、７ドメイン）、パールカン、ナイドジェン－１、およびナイドジェン－２。非ネイティブＥＣＭ材料は、１本または複数本の神経束が得られる神経組織中にその加工の前に存在したネイティブＥＣＭ材料のタイプのうちの１つまたは複数を含んでよい。
【0038】
エンチューブレーション材料および／またはコーティング材料である生体適合性材料は、１つまたは複数のタイプのコラーゲンを追加的または代替的に含んでよい。コラーゲンは、例えば、薄いシートで形成されたスキャフォールドの形態でよい。コラーゲンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび／またはＶなどの他のタイプのコラーゲンも組成物に含まれてよいが、コラーゲンＩが特に企図される。線維性（タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ）、非線維性、ＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維結合性コラーゲン）（タイプＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＩＸ、ＸＸＩ）、短鎖（タイプＶＩＩＩ、Ｘ）、基底膜（タイプＩＶ）、マルチプレキシン（断続を有する複数の三重らせんドメイン）（タイプＸＶ、ＸＶＩＩＩ）、ＭＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する膜結合性コラーゲン）（タイプＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ）、またはその他（タイプＶＩ、ＶＩＩ）のコラーゲンとしてグループ化される他のタイプのコラーゲンが含まれてよい。一般に、コラーゲンＩおよびコラーゲンＩＩＩがネイティブＥＣＭ材料を含むとき、これらのタイプのコラーゲンが好ましいであろう。これらのコラーゲンは、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、またはヒト源に由来してよく、かつシリコーン、グリコサミノグリカン、線維芽細胞、および／または成長因子と組み合わせて使用されてよい。
【0039】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、生体適合性材料として１種または複数種の多糖を追加的または代替的に含んでよい。任意のタイプの生体適合性、生分解性多糖が使用されてよい。そのような多糖は、これらに限定されないが、キトサン、アルギネート、またはセルロースを含んでよい。セルロースは、任意の１つまたは複数のタイプのセルロースＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶを含んでよい。
【0040】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、１種または複数種の生分解性ポリマーなどの１種または複数種の生体適合性ポリマーを含んでよい。追加的または代替的に、束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、１種または複数種のタンパク質ベースのポリマーを含んでよい。いくつかの例において、束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、その分子量に依存して、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでよい。
【0041】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、フィブリン（第Ｉａ因子とも呼ばれる）および／またはフィブリノゲンを追加的または代替的に含んでよい。フィブリンまたはフィブリノゲンは、一般に束および束状神経移植片の安定化を促進し得る。
【0042】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、ゼラチンを追加的または代替的に含んでよく、それはコラーゲンに由来する。ゼラチンは、加水分解コラーゲン、コラーゲン加水分解物、ゼラチン加水分解物、および／または加水分解ゼラチンと表されることもある。ゼラチンは、一般に束および束状神経移植片の安定化を促進し得る。
【0043】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）はヒドロゲルを含んでよい。ヒドロゲルは、これらに限定されない、セルロース、セルロースの任意の誘導体、もしくはヒアルロン酸のいずれか１つまたは組合せからなってよい。ヒドロゲルは、それの機械的性質を調整するために架橋されてもよい。ヒドロゲルは、天然源または合成源を有してよい。
【0044】
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は追加的または代替的に、７Ｓ（３種のタンパク質－α－ＮＧＦ、β－ＮＧＦ、およびγ－ＮＧＦ（２：１：２比）の１３０ｋＤａ複合体（ｐｒｏＮＧＦ（ＮＧＦ前駆体）））と表現されることがある神経成長因子（ＮＧＦ）を含んでよく、または以下のタイプのうちの１つでよい：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４、ならびにＮＴ４、ＮＴ５、ＮＴＦ４、およびＮＴ－４／５としても知られる）、内因性ステロイドであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、および／またはその硫酸エステル、すなわちＤＨＥＡ硫酸（ＤＨＥＡ－Ｓ）。神経成長因子は、それらの軸索を再生するニューロンの数を増加させることができ、それは、運動および感覚回復ならびに標的筋の神経支配を向上させ得る。
【0045】
テストステロンおよび／またはエストロゲンなどのステロイドが束状神経移植片１１４において使用されてもよい。
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、細胞、混合細胞集団中の複数の細胞型を含む細胞のミックス、および／または細胞成分を追加的または代替的に含んでよい。細胞および混合細胞集団中の細胞のミックスの細胞型は、これらに限定されないが、シュワン細胞、マクロファージ、脂肪細胞、シュワン細胞からのエキソソーム、および述べられた細胞型を含む。細胞の源は、ヒト由来であり得、または幹細胞から分化され得、または人工多能性幹細胞から分化転換され得る。加えられる細胞は、サイトカインおよび他の因子の源であり得、それは、神経再生を改善し得る。
束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、細胞、混合細胞集団中の複数の細胞型を含む細胞のミックス、および／または細胞成分を追加的または代替的に含んでよい。細胞および混合細胞集団中の細胞のミックスの細胞型は、これらに限定されないが、シュワン細胞、マクロファージ、脂肪細胞、シュワン細胞からのエキソソーム、および述べられた細胞型を含む。細胞の源は、ヒト由来であり得、または幹細胞から分化され得、または人工多能性幹細胞から分化転換され得る。加えられる細胞は、サイトカインおよび他の因子の源であり得、それは、神経再生を改善し得る。
【0046】
上記のように、束状神経移植片（例えば、束状神経移植片１１４）は、緩衝溶液中で、かつ／または緩衝溶液と共に処分、保管、および／または調製され得る。保管に関して、束状神経移植片は、保管容器内に置かれてよく、次いで、保管容器は、約－８０℃から室温（約２０℃～約２２℃）までの範囲の温度で維持される。保管容器は、瞬間冷凍、および数週間、数カ月間、または数年間の－８０℃以下での維持に適用可能であり得る。保管容器はまた、実質的に気密であり得、かつ不活性ガスでバックフィルされ得る。いくつかの例において、組織は、本明細書に開示されるように（例えば、酵素、または消化溶液、および緩衝溶液を含んでよい、セリン含有血清を含む１種または複数種の洗浄液で、および任意選択で、緩衝溶液を含む追加の洗浄液で）処理され、次いで、医学的手順における使用前の保管のために、緩衝溶液、例えば、約７．２～約７．６の範囲内のｐＨ、例えば、約７．４のｐＨなど、約７．３～約７．５のｐＨを有する緩衝化生理食塩水溶液に移される。本明細書の方法にしたがって調製された移植片の保管に適した例証的な緩衝溶液は、これらに限定されないが、ＰＢＳ、生理食塩水陰極液、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、カコジル酸緩衝液、セーレンセンのリン酸緩衝液、リン酸－クエン酸緩衝液、およびバルビタール緩衝液を含む。
【0047】
（実施例）
本開示は、以下の非限定的な例によりさらに理解され得る。例は、上記の開示の実施形態を例示することが意図され、その範囲を狭めるものと解釈されるべきではない。当業者であれば、本開示の実施形態が実行され得る多くの他の様式を例が示唆することを容易に認識するであろう。本開示の範囲内に留まりながら多数の変形および修正が加えられ得ることが理解されるべきである。
本開示は、以下の非限定的な例によりさらに理解され得る。例は、上記の開示の実施形態を例示することが意図され、その範囲を狭めるものと解釈されるべきではない。当業者であれば、本開示の実施形態が実行され得る多くの他の様式を例が示唆することを容易に認識するであろう。本開示の範囲内に留まりながら多数の変形および修正が加えられ得ることが理解されるべきである。
【0048】
（実施例１）
以下のように束状神経移植片の調製前に神経組織を処理して、ネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を除去する。以下の工程を層流フード内で無菌条件下実施した。まず、１００μｌのコラーゲンタイプＩＶ特異的消化酵素（例えば、０．８ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ）溶液を１．５ｍｌ遠心分離管に移した。神経組織セグメント（約３ｍｍ長）および１００μｌ（ピペット設定）の対応する酵素溶液を、３７℃で２時間～４時間のインキュベーションのために１．５ｍｌ遠心分離管に入れた。セグメントを物理的に破損しないように細心の注意を払って、球タイプホールピペットを使用して消化酵素溶液を吸引した。次いで、洗浄間の反転により穏やかに混合しながらセグメントを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄液を上記のようにホールピペットで除去した。セグメントを破損しないことを保証しながら各洗浄間でできるだけ多くの流体を除去した。試験セグメントと球ホールピペットチップの間の接触を避けた。
以下のように束状神経移植片の調製前に神経組織を処理して、ネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を除去する。以下の工程を層流フード内で無菌条件下実施した。まず、１００μｌのコラーゲンタイプＩＶ特異的消化酵素（例えば、０．８ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ）溶液を１．５ｍｌ遠心分離管に移した。神経組織セグメント（約３ｍｍ長）および１００μｌ（ピペット設定）の対応する酵素溶液を、３７℃で２時間～４時間のインキュベーションのために１．５ｍｌ遠心分離管に入れた。セグメントを物理的に破損しないように細心の注意を払って、球タイプホールピペットを使用して消化酵素溶液を吸引した。次いで、洗浄間の反転により穏やかに混合しながらセグメントを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄液を上記のようにホールピペットで除去した。セグメントを破損しないことを保証しながら各洗浄間でできるだけ多くの流体を除去した。試験セグメントと球ホールピペットチップの間の接触を避けた。
【0049】
次に、吸引されたＰＢＳを、例えば、５００μｌのウシ胎児血清（ＦＢＳ）で置き換え、その後、３７℃で４５分間～５５分間のインキュベーションが続いた。次いで、セグメントを破損しないことを保証しながら培地を１．５ｍｌ遠心分離管から吸引した。これらの工程、すなわち、吸引された培地をＦＢＳで置き換える工程、３７℃で４５分～５５分インキュベートする工程、ならびにインキュベーターから取り出して培地を吸引する工程を２回繰り返した。培地を１．５ｍｌ遠心分離管から吸引し、１ｍｌのＰＢＳで置き換えた。次いで、解剖顕微鏡を使用して、ペア精密外科用ピンセット（例えば、５番ジュエラーピンセット）を使用して、各セグメントの消化された組織の残りの部分から、視覚的に分離された束を裂いた。１丁のマイクロシザーを使用して、消化された組織から束を注意深く郭清した。
【0050】
（実施例２）
動物またはヒト源から得られる神経組織を、例えば神経組織のネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を消化するためにコラゲナーゼタイプＩＶ酵素を使用して、実施例１の手順にしたがって調製した。そのような加工に供されない神経組織を対照として使用した。対照神経組織および処理された神経組織をパラフィンにそれぞれ包埋した。８ミクロンの厚さを有する神経サンプルの断面を得た。次いで、切片をラミニンについて染色して、神経束を識別した。組織学的青味試薬を使用して、ネイティブＥＣＭ材料の存在を識別した。図５に示されるように、対照神経組織が神経束の周りにネイティブＥＣＭ材料を含んでいたのに対し、図６に示されるように、処理された神経組織は、神経束の周りにネイティブＥＣＭ材料をほとんどまたは全く有していなかった。
動物またはヒト源から得られる神経組織を、例えば神経組織のネイティブＥＣＭ材料および神経上膜鞘を消化するためにコラゲナーゼタイプＩＶ酵素を使用して、実施例１の手順にしたがって調製した。そのような加工に供されない神経組織を対照として使用した。対照神経組織および処理された神経組織をパラフィンにそれぞれ包埋した。８ミクロンの厚さを有する神経サンプルの断面を得た。次いで、切片をラミニンについて染色して、神経束を識別した。組織学的青味試薬を使用して、ネイティブＥＣＭ材料の存在を識別した。図５に示されるように、対照神経組織が神経束の周りにネイティブＥＣＭ材料を含んでいたのに対し、図６に示されるように、処理された神経組織は、神経束の周りにネイティブＥＣＭ材料をほとんどまたは全く有していなかった。
【0051】
好ましい実施形態、例証的な実施形態、および任意選択の特徴を参照して本開示を行ってきたが、本明細書に開示される概念の修正および変形が当業者により用いられ得ること、ならびにそのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲により定義されるような本開示の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。本明細書において提供される具体的な実施形態および例は、本開示の有用な実施形態の例であり、限定するものではなく、単なる例示である。本開示は、本明細書に記載のデバイス、デバイス構成要素、方法、および工程の多くの変形を使用して行われてよいことが当業者には明らかになるであろう。当業者によって認識されるであろうように、本方法に有用な方法およびデバイスは、多くの様々な任意選択の構成および加工要素および工程を含むことができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】