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特表2023-547197ＴＬＲ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-09
(54)【発明の名称】ＴＬＲ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/688 20060101AFI20231101BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20231101BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20231101BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20231101BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20231101BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20231101BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20231101BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231101BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20231101BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20231101BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20231101BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231101BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231101BHJP
【ＦＩ】
A61K31/688
A61K9/127 ZNA
A61K47/28
A61K47/24
A61K47/26
A61K39/00 G
A61K39/39
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61P37/04
A61P31/22
A61K39/245
A61P37/08
A61P31/00
A61P37/02
A61P3/00
A61P7/00
A61P25/00
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525967
(86)(22)【出願日】2021-10-28
(85)【翻訳文提出日】2023-06-15
(86)【国際出願番号】 EP2021079918
(87)【国際公開番号】W WO2022090359
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】20306291.4
(32)【優先日】2020-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】592055820
【氏名又は名称】サノフィ・パスツール
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】マリー・ガリノ
(72)【発明者】
【氏名】ジーン・ヘンスラー
(72)【発明者】
【氏名】ファビエンヌ・ピラ
(72)【発明者】
【氏名】パトリック・シンティン
(72)【発明者】
【氏名】ソフィ・ルイス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076CC06
4C076CC07
4C076CC29
4C076CC35
4C076DD63
4C076DD69
4C076DD70
4C076FF11
4C076GG41
4C085AA03
4C085AA17
4C085AA38
4C085BA01
4C085BA78
4C085BB03
4C085EE01
4C085EE05
4C085EE06
4C085FF12
4C085FF17
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG08
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA34
4C086GA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086NA05
4C086NA10
4C086ZA01
4C086ZA51
4C086ZB07
4C086ZB09
4C086ZB13
4C086ZB26
4C086ZB31
4C086ZB33
4C086ZC21
4C086ZC41
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、サポニン、ステロール、リン脂質、および式（Ｉ）のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むリポソーム、リポソームを製造する方法、これらを含む組成物およびその使用、ならびにこのようなリポソームをアジュバントとして含む免疫原性組成物に関する。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、リポソーム、または第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せであって、
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、式（Ｉ）：
【化1】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であり、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であり、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であり、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
ｅ）
【化2】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または該化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約１：５０もしくは約１：２５～約１：３５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する、
リポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項2】
ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する、請求項１に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項3】
ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：【化3】
特に、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
【化4】
請求項１または２に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項4】
サポニンは、シャボンノキのサポニンであり、特に、キラヤの樹皮から抽出される、請求項１～３のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項5】
サポニンは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１、およびその組合せから選択され、好ましくはＱＳ－７またはＱＳ－２１である、請求項１～４のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項6】
ステロールは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、およびその混合物から選択され、特にコレステロールまたはその誘導体から選択され、特にコレステロールである、請求項１～５のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項7】
サポニンおよびステロールは、１：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、もしくは１：１０～１：５の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、または約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項8】
リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物から選択され、特にＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物から選択されるホスファチジルコリンである、請求項１～７のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ。
【請求項9】
リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約１：４００の範囲、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比で存在する、
方法。
【請求項10】
工程（ａ）の前に、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）は、溶媒注入法を使用することにより実行する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）は、以下の工程：（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
水混和性有機溶媒は、エタノール、イソプロパノール、もしくはその混合物から選択される、またはエタノールである、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
工程（ｂ）で得られるリポソームをろ過し、平均径が２００ｎｍ未満のリポソームを回収する工程（ｃ）をさらに含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか１項に記載の１つのリポソームもしくはリポソームの１つの組合せの少なくともいずれか、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソームを含む、アジュバント組成物。
【請求項16】
請求項１～８のいずれか１項に記載の１つのリポソームもしくはリポソームの１つの組合せの少なくともいずれか、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または請求項１５に記載のアジュバント組成物、および少なくとも１つの抗原を含む、免疫原性組成物。
【請求項17】
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの少なくとも１つの組合せのいずれかを含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物。
【請求項18】
前記ＣＭＶ ｇＢ抗原は、全長ＣＭＶ ｇＢ抗原、膜貫通ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての膜貫通ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、細胞内ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての細胞内ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方から実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原からなる群で選択され、特にｇＢｄＴＭである、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
前記ｇＨは、膜貫通ドメインの少なくとも一部もしくは実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失する、またはＣＭＶ ＵＬ７５遺伝子でコードした全長ｇＨポリペプチドの外部ドメインを含む、請求項１７または１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
ＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、ＣＭＶ抗原のみである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
ＴＬＲ４アゴニストは、請求項１～３のいずれか１項に記載のものである、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項22】
サポニンは、請求項４または５に記載のものである、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項23】
ステロールは、請求項６または７に記載のものである、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項24】
リン脂質は、請求項８に記載のものである、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項25】
ＣＭＶワクチンとして使用するための、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項26】
感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、稀な血液障害、稀な代謝性疾患、稀な神経疾患、および腫瘍またはがん疾患の予防および／または処置で使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法で得られるリポソーム、請求項１５に記載のアジュバント組成物、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ワクチン組成物においてアジュバントとして使用することができる新規なリポソーム製剤の分野に関する。リポソームを生成する方法および薬におけるその使用にも関する。
【0002】
本開示は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ｇＢ抗原、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、およびＴＬＲ－４アゴニスト含有アジュバントを含む免疫原性組成物にさらに関する。さらに、これは、反応原性が低いＣＭＶ抗原含有組成物に関する。ＣＭＶワクチンとして使用するための免疫原性組成物にさらに関する。
【背景技術】
【0003】
アジュバント製剤は、標的とする病原体に対する長期的な保護を与える目的で、免疫細胞への抗原提示を向上することにより、所与の抗原に対する免疫応答を向上させる助けとなるワクチン組成物において長年使用されている。アジュバントはまた、ワクチンの免疫応答の効果的なレベルを維持しながら、所与の抗原の必要とする量を低減するのに有用な適用を見出すことができる。抗原のこの節約は、必要とする抗原の利用可能な量を一定に保ちながら、ワクチンを製造する容積能力を高めるのに有用であり得る。この抗原の節約は、例えばパンデミックの状況で非常に有用であり得る。
【0004】
一部のアジュバントは、ある特定の抗原に特異的であり、他のアジュバントは、より広範囲の作用を有し、異なる化学的性質の抗原と組み合わせて異なる種類の疾患に対して効果的である。バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２プロファイルのアジュバントは、より広範囲の作用を有し得る。
【0005】
これらの最後の種類のアジュバントは、予め製造され、手元での抗原の広範囲な選択とのその組合せに対して製薬会社または医療従事者で直ちに利用可能であるという利点を有する。これらは、それを必要とする個体に直接投与することができる。この特質はまた、パンデミックの間に特に関心対象となり得る。
【0006】
当該技術分野で認識されるアジュバント系の中で、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅが販売するＡＳ０１アジュバントを挙げることができる。ＡＳ０１は、２つの免疫促進剤：ＴＬＲ４アゴニストである３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）およびサポニンＱＳ－２１を含有するリポソームベースのワクチンアジュバント系である。（特許文献１、特許文献２）。
【0007】
しかし、エタノールのような溶媒中のその溶解度が低いので、アジュバント系、特にリポソームアジュバント系におけるＭＰＬの存在により、その生産に使用することができる方法は制限され、産業的開発およびスケールアップに対して重大な障害となり得る。さらに、製剤において十分な免疫賦活またはアジュバント特性を得るのに必要なＭＰＬの量は比較的多く、その使用は相当に効果となる。これらの欠点は、必然的に、これらのアジュバントの製造をより複雑にし、その生産費用も上昇させる。
【0008】
他のＴＬＲ４アゴニストは、当該技術分野で知られており、その多くは、ワクチンアジュバントとして提案された（非特許文献１）。公知のＴＬＲ４アゴニストとして、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）のような天然リポ多糖類もしくはアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）（非特許文献２）のような合成ＴＬＲ４アゴニストのブプレノルフィン、オキシコドン、メサドン、フェンタニル、クルクミン、グリチルリチン、パクリタキセル、モルヒネ（非特許文献３）、ＧＬＡ－６０、ＥＲ１１２０２２、もしくはＯＮＯ－４００７（非特許文献３）、特許文献３に記載の化合物、またはＥ６０２０（非特許文献４）のようなオピオイドを挙げることができる。しかし、十分な免疫賦活またはアジュバント処理する応答を維持しながら、リポソームで、特に工業的な製造方法において容易に製剤化することができるＴＬＲ４アゴニストを同定することは困難である。
【0009】
ヒトまたは動物に使用することを意味するアジュバントを製剤化する場合の別の懸念事項は、製造工程のできるだけ多くを保健機関で一般に許容される生成物を使用して実施しなければならないことである。例えば、ある特定の溶媒は避けるべきであり、薬学的な観点からより良好に許容される他の溶媒は、好ましいはずである。
【0010】
ゆえに、市販されている製剤と同様に免疫応答の向上に関して少なくとも効果的であるアジュバント組成物のような新しい製剤に対する必要性が依然として存在する。
【0011】
良好な安全性プロファイルおよび反応原性効果がないまたは低減した反応原性効果を有するアジュバント組成物に対する必要性も依然として存在する。
【0012】
さらに、特に工業規模で製造するのが容易であり、生産費用が低い免疫賦活およびアジュバント製剤に対する必要性が存在する。工業規模で費用が安いＴＬＲ４アゴニストを含有するアジュバントベースのリポソームを製造することができる必要がある。大部分の保健当局で安全であるとみなされている、原材料を使用し、中間体を製造して、できるだけ薬学的に無害であるアジュバント製剤を提供する必要もある。
【0013】
抗原の節約のために使用することができるアジュバントを有する必要がある。
【0014】
最終的に、特に当該技術分野で公知のある特定のアジュバント製剤と比較して、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘発する製剤に対する必要性が依然として存在する。
【0015】
本開示は、これらおよび他の関連する利点を提供する。
【0016】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ヘルペスウイルス科に属する常在ウイルスである。本ウイルスは、テグメントに囲まれ、その表面に糖タンパク質のスパイクを担持する脂質二重層にエンベロープを有するカプシドに含有される線状二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）から構成される。この科の他のメンバーと同様に、ＨＣＭＶは、潜伏および再活性化の特質を有する。
【0017】
免疫担当宿主では、大部分のＨＣＭＶ感染は、疲労、不定愁訴、中程度の発熱、リンパ節症、肝腫大または肝酵素のわずかな増加のようなほとんど非特異的である症状を伴う、無症候または非常に軽度である。しかし、異好性抗体陰性単核球増加症は、先の健康な個体のおよそ１０％で観察される。対照的に、臨床徴候は、子宮で感染した新生児、およびＡＩＤＳにより免疫抑制された成人で、または実質臓器もしくは骨髄移植の文脈で、非常に重症であり得る。
【0018】
ＨＣＭＶ感染の有病率は、年齢と共に増加し、社会経済的要因により影響される。血清学的調査では、発展途上国および先進国の低い社会経済的な群においてより高い有病率が示されている。出産適齢期の女性に対して、ＨＣＭＶ血清陽性の女性の割合は、先進国の高所得および中程度の所得の群でおよそ５０％から、低所得者集団で８０％超までの範囲である。異なる欧州の国々で実施した調査では、幼児および青年期でのＨＣＭＶの血清学的有病率が、４０～５０％の範囲であるのに対して、より高齢の対象（４０歳以上）では、ＨＣＭＶの血清学的有病率が８０％より高いことが全体的に示された。
【0019】
ＨＣＭＶは、先進国では先天性感染症の最も一般的な原因である。先天性感染症とは、新生児の誕生前に母親から胎児に伝染した感染を指す。全体で、妊娠中の主要なＨＣＭＶ感染は、胎児に伝染のリスクの４０％に関連する。先天性ＨＣＭＶ感染の結果として、幼児が、精神遅滞、失明、および感音性難聴を含む障害で苦しむ可能性がある。先天的に感染した新生児の中で、５％～１０％は、小頭症、脈絡網膜炎、頭蓋内石灰化、肝脾腫大症、肝炎、黄疸、高直接ビリルビン血症、血小板減少症、点状出血、および貧血のような出生時に主要な徴候を有する。症候性の先天性ＨＣＭＶ疾患を有するこれらの新生児の中で、死亡率は、乳児期初期におよそ１０％であり、生存者の中で、５０～９０％は、精神遅滞、脳性麻痺、感音性聴力損失、または視力障害のような後遺症を有する。さらに、先天性ＨＣＭＶ感染症を有する多くの幼児は、出生時は無症候である。それにもかかわらず、追跡研究では、ウイルス学的スクリーニングにより新生児期にＨＣＭＶ血清陽性であり、出生時は無症候である幼児のおよそ１５％が、聴力損失または中枢神経系の異常のような後遺症を有することが示されている。全体として、欧米で毎年誕生するおよそ１７，０００名の幼児は、永続的な後遺症を有する。
【0020】
ＨＣＭＶはまた、臓器および骨髄移植のレシピエントならびにＡＩＤＳ患者において重要なウイルス病原体である。ＨＣＭＶ血清陰性の実質臓器移植のレシピエントにおけるＨＣＭＶ関連の罹患率は、６０％に達する。実質臓器移植では、本疾患は、血清陰性患者がＨＣＭＶ陽性のドナー由来の移植片を受け取る場合に最も重症となる。対照的に、骨髄または幹細胞移植では、本疾患は、ＨＣＭＶ感染の起源が内因性感染の再活性化であることを示す血清陰性ドナー由来の細胞を受け取るＨＣＭＶ血清陽性対象において最も重症となる。ＨＣＭＶは、同種移植のレシピエントのおよそ１５％で、肺炎、肝炎、胃腸疾患、骨髄抑制、および網膜炎を引き起こす。これらの直接的な終末器官の疾患に加えて、ＨＣＭＶは、移植片拒絶反応、促進したアテローム性動脈硬化症、および細菌または真菌感染をもたらし得る免疫抑制のような間接的な作用に関連している。
【0021】
妊娠中のＨＣＭＶ感染もしくは先天性ＨＣＭＶ感染、または臓器および骨髄移植のレシピエントならびにＡＩＤＳ患者において予防または処置するのに効果的な手段は、現在利用可能ではない。
【0022】
したがって、ＨＣＭＶワクチンの開発は、医学研究所のワクチン優先付けの報告において主要な公衆衛生の目的とみなされている（非特許文献５）。多くの候補のワクチンは、例えば特許文献４、特許文献５、または特許文献６に記載されているが、これまで認可されたものはない（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【0023】
ＭＦ５９アジュバントを含むサイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂワクチンは、移植レシピエントでの第２相無作為化プラセボ対照試験において有望な結果を示した（非特許文献９）。出産適齢期の女性での第２相プラセボ対照無作為化二重盲検では、プラセボと比較して、ＭＦ５９アジュバントを含む組換えＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質Ｂからなる同じワクチンが評価された。結果は、原発性ＨＣＭＶのＨＣＭＶ獲得を予防する際に５０％の効能を示した。しかし、免疫原性の結果は、ｇＢ／ＭＦ５９製剤により誘発される中和抗体（Ａｂ）のレベルが、第３の用量の投与の１か月後にピークのレベルとなり、次いで直ちに低下することを示した（非特許文献１０）。
【0024】
結果として、改善した効能を有するＣＭＶワクチン、特に中和抗体レベルを上昇させ、持続的な免疫応答を誘発することによる長期持続型の保護を誘発することができるワクチンを有する必要がある。
【0025】
広範な免疫応答を誘発することができるＣＭＶワクチンを有する必要もある。
【0026】
ＣＭＶを中和する保護レベルの抗体を誘発することができるアジュバント処理したＣＭＶワクチンを有する必要がある。
【0027】
個体においてＣＭＶを中和することができる長期持続型抗体を誘発することができるアジュバント処理したＣＭＶワクチンを有する必要がある。
【0028】
個別の健康に対するこれらの予想された有益な効果に加えて、ワクチンは、時に、一時的に、局所的に、または系統的に、反応原性効果を誘発する（非特許文献１１）。これらの効果は、ワクチンの注射に起因する免疫応答の身体的徴候を反映する。これらは、例えば、注射部位の疼痛もしくは硬結、発赤、腫脹、または全身症状、例えば発熱、筋痛症、もしくは頭痛であり得る。これらの反応原性効果は、ワクチンの使用および奨励に対する負の挙動、ならびにワクチンスケジュールへの低レベルの遵守を誘発することができる。個体が所与のワクチンの反応原性のものを有し得る知覚に関して、その個体がワクチン接種を拒絶する可能性がある。医療専門家でさえも、ワクチンを奨励するか否かを決定することができる。結果として、ワクチン接種への遵守の悪化または所与のワクチンへの個体の適用の悪化が起こり、これが、ワクチン接種から起こり得る全体的に有益な効果に、劇的に影響を及ぼし得る。
【0029】
アジュバントは、免疫応答を向上する、および／または抗原への応答（Ｔｈ１対Ｔｈ２）の種類を方向付ける免疫促進剤である。不都合な点では、アジュバントの種類および用量が、アジュバント処理していないワクチンと比較して、ワクチンの反応原性を高めることができることが認められている（非特許文献１１）。同じ抗原に対して、異なるアジュバントの使用は、異なるレベルの反応原性および異なる反応原性応答の種類を誘発することができる。例えば、異なる抗原で製剤化されたＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）、すなわちミョウバンまたはアジュバント系ＡＳ０１Ｂ、ＡＳ０１Ｅ、ＡＳ０３ＡもしくはＡＳ０４を報告する研究では、ＡＳ０１、特にＡＳ０１Ｂでの製剤化が、最も高い局所的および全身の反応原性を誘発していたことが示された（非特許文献１２）。ＡＳ０１は、様々な市販のワクチンの製剤に含まれ、アジュバントとしてＴＬＲ４アゴニスト３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含有する。
【0030】
他のＴＬＲ４アゴニストは、当該技術分野で知られており、その多くは、ワクチンアジュバントとして提案された（非特許文献１）。公知のＴＬＲ４アゴニストとして、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）のような天然リポ多糖類もしくはアミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）（非特許文献２）のような合成ＴＬＲ４アゴニストのブプレノルフィン、オキシコドン、メサドン、フェンタニル、クルクミン、グリチルリチン、パクリタキセル、モルヒネ（非特許文献３）、ＧＬＡ－６０、ＥＲ１１２０２２、もしくはＯＮＯ－４００７（非特許文献３）、特許文献３に記載の化合物、またはＥ６０２０（非特許文献４）のようなオピオイドを挙げることができる。
【0031】
ワクチンを製剤化するのに使用することができるが、低レベルの反応原性を誘発するアジュバントを含有するＴＬＲ４アゴニストを同定することは困難である。低レベルの反応原性を有するアジュバント処理したＣＭＶ－抗原を含有するワクチンを同定することはさらに困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0032】
【特許文献1】ＷＯ２００７／０６８９０７Ａ１
【特許文献2】ＥＰ０９５５０５９Ｂ１
【特許文献3】ＷＯ２０１９／１５７５０９
【特許文献4】ＷＯ２００９０／３７３５９Ａ１
【特許文献5】ＷＯ２０１７／０７０６１３Ａ１
【特許文献6】ＷＯ２０１９／０５２９７５
【非特許文献】
【0033】
【非特許文献1】Ｆｏｘら、Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０年；５３：３０３～２１頁
【非特許文献2】Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．２００６年；１２（５）：３１３～９頁
【非特許文献3】Ｐｅｒｉら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１４年；５７（９）：３６１２～３６２２頁
【非特許文献4】Ｉｓｈｉｚａｋａら、２００７年、Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒｕｇｓ
【非特許文献5】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＳ）Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｓｔｒａｔｔｏｎ ＫＲ、Ｄｕｒｃｈ ＪＳ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＲＳ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ：Ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｍａｋｉｎｇ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（ＵＳ）；２０００年
【非特許文献6】Ｐｌｏｔｋｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第６版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ編、２０１３年
【非特許文献7】Ｓｃｈｌｅｉｓｓら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ、１０３２～１０４１頁
【非特許文献8】Ｐｅｒｍａｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１８年３月１４日；９２（７）：ｅ０００３０－１８
【非特許文献9】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｌａｎｃｅｔ．２０１１年；３７７（９７７３）：１２５６～１２６３頁
【非特許文献10】Ｐａｓｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９年；３６０（１２）：１１９１～１１９９頁
【非特許文献11】Ｈｅｒｖｅら、ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１９年；４：３９
【非特許文献12】Ｌｅｒｏｕｘ－Ｒｏｅｌｓら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１６９：１６～２７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0034】
したがって、良好な免疫促進剤でありながら、対象においてワクチンに対して低いまたは中程度の反応原性も誘発するアジュバントを選択する必要がある。
【0035】
したがって、ＣＭＶ感染に対して効果的にアジュバント処理したワクチンを有する必要性に加えて、このワクチンが対象において低い反応原性を誘発する必要がある。
【0036】
レジメンスケジュールがどのようなものであってもその後の用量で低い反応原性を誘発する多用量のワクチンスケジュールで使用される、例えばＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバント処理したＣＭＶワクチンを有する必要がある。
【0037】
その後の用量投与の順守および許容に好都合である、例えばＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバント処理したＣＭＶワクチンを有する必要がある。
【0038】
第１の用量に続くその後の用量で、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン、好中球数、および／またはグロブリンのような炎症性血清バイオマーカーの小さい増加を誘発する複数回用量のワクチンスケジュールで使用される、例えばＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバント処理したＣＭＶワクチンを有する必要がある。
【0039】
本開示の目的は、これらの必要性の全てまたは一部を満足させることである。
【課題を解決するための手段】
【0040】
ＴＬＲ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用
本開示は、サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）、または
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せに関し、
本開示は、サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）、または
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せに関し、
【0041】
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、およびＹ２は、存在しない、酸素、ＮＨおよびＮ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））、ならびにＮ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【化1】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、およびＹ２は、存在しない、酸素、ＮＨおよびＮ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））、ならびにＮ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【0042】
ｅ）
（ここで、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ＭおよびＮは、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖を含む、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノ、およびアシルアミノからなる群から独立して選択される）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立し、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、１：１～約１：５０、または約１：２５～約１：３５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【化2】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立し、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、１：１～約１：５０、または約１：２５～約１：３５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【0043】
一実施形態では、本明細書に開示されるＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する。
【0044】
いくつかの実施形態では、第１の種類のリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、第２の種類のリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。
【0045】
本発明者らにより予想外に観察され、実施例で詳述される通り、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せのようなリポソームは、強力な免疫賦活作用、Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡応答を有し、ＣＭＶ抗原、Ｆｌｕ抗原、およびＲＳＶ抗原を含む数多くの抗原をアジュバント処理することが可能である。さらに、リポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せは、単純で効果的な方法によって製造することができるという利点を呈する。有利には、製造する方法は、リポソームを製造する工程で使用される有機溶媒としてエタノールのみの溶媒を使用することができる。さらに、リポソームまたは少なくとも２種類の本発明のリポソームの組合せは、少量のＴＬＲ４アゴニストを含有する一方、強力なアジュバント効果を誘発することができる。少量のＴＬＲ４アゴニストに関連する生産が容易であることは、生産の有利に低減した費用をもたらし、ワクチン生産で抗原を節約するのに有用な本明細書に開示されるアジュバントを作製する。さらに、ＡＳ０１Ｂのような類似のアジュバントと比較して、リポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せは、広範囲の抗原に対してよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２効果を含むアジュバント効果を呈し、ワクチン接種に対するより広いスペクトルの適用をアジュバントに与える。さらに、実施例に示す通り、サポニンとしてＱＳ７を含むリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せは、良好な安全性プロファイルおよび良好なアジュバント処理の効果を有利に呈する。
【0046】
さらに、本発明者らは、単一の種類のリポソームにおいてＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンを有することが必要ではないが、第１の種類のリポソームがサポニン、ステロール、およびリン脂質を含むが、ＴＬＲ４アゴニストを含まず、第２の種類のリポソームがステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むが、サポニンを含まない少なくとも２種類のリポソームの組合せが、ステロール、リン脂質、サポニン、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む単一の種類のリポソームとして類似のアジュバント処理の効果を誘発することができることを予想外に観察している。いくつかの実施形態では、第１の種類のリポソームは、任意のＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよく、第２の種類のリポソームは、任意のサポニンを有していなくてもよい。
【0047】
本明細書では、表現「リポソーム」とは、別段文脈で指示する場合を除いて、ステロール、リン脂質、サポニン、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む「単一の種類」のリポソーム、または（ｉ）サポニン、ステロール、およびリン脂質、もしくは（ｉｉ）ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストのいずれかを含む「第１および／または第２の種類」のリポソームのいずれか１つを互換的に指すことができる。「リポソームの種類」とは、ステロール、リン脂質、サポニン、またはＴＬＲ４アゴニストのような、その構成要素の性質および量により定義されるリポソームを指すことを意図する。
【0048】
本明細書では、第１および第２の種類のリポソームとは、本明細書に記載されるその組成が異なる第１および第２の種類のリポソームを指すことを意図する。
【0049】
別の実施形態では、好適なＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：
である。
【化3】
【0050】
別の実施形態では、好適なＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
のＥ６０２０である。
【化4】
【0051】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、サポニンとしてシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）のサポニンを含み得る。
【0052】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、サポニンとしてキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から抽出したサポニンを含み得る。
【0053】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、サポニンとしてＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、およびその組合せから選択されるサポニンを含み得る。
【0054】
別の実施形態では、サポニンは、ＱＳ２１またはＱＳ７であり得る。
【0055】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、サポニンとしてＱＳ２１を含み得る。
【0056】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、サポニンとしてＱＳ７を含み得る。
【0057】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、ステロールとして、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、およびその混合物から選択されるステロールを含み得る。
【0058】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームは、ステロールとして、コレステロールのようなコレステロールまたはその誘導体由来のステロールを含み得る。
【0059】
別の実施形態では、サポニンおよびステロールは、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームにおいて、１：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、もしくは１：１０～１：５の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、または約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で存在し得る。
【0060】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに好適なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物から選択することができる。
【0061】
別の実施形態では、リポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに好適なリン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物から選択されるホスファチジルコリンであり得る。例示的な一実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。
【0062】
別の実施形態では、本開示は、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約１：４００の範囲、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比で存在する、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される単一の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約１：４００の範囲、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比で存在する、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される単一の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0063】
一実施形態では、サポニンは、工程ｂ）の後、すなわち工程ｂ）で得られる懸濁液を含有するリポソームに添加される。
【0064】
別の実施形態では、本開示は、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0065】
一実施形態では、リポソームを製造するための本明細書に開示される方法は、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程を、上記の工程（ａ）の前にさらに含み得る。
【0066】
別の実施形態では、本開示は、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンが、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加される、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンが、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加される、方法を対象とする。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0067】
一実施形態では、本明細書に開示される方法の工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）は、溶媒注入法を使用することにより実行する。
【0068】
一実施形態では、工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）は、以下の工程：
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含む。
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含む。
【0069】
一実施形態では、水混和性有機溶媒は、エタノール、イソプロパノール、またはその混合物から選択される。一実施形態では、水混和性有機溶媒は、エタノールのみの溶媒である。
【0070】
一実施形態では、方法は、工程（ｂ）で得られるリポソームをろ過し、平均径が２００ｎｍ未満のリポソームを回収する工程（ｃ）をさらに含み得る。
【0071】
あるいは、一実施形態では、方法は、工程（ｂ）で得られるリポソームを例えば滅菌ろ過としてろ過し、ろ過したリポソームを回収する工程（ｃ）を含み得る。
【0072】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも２種類のリポソームの組合せを製造するための方法であって、第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含み、方法が、第１および第２のリポソームを混合する工程を少なくとも含む、方法を対象とする。
【0073】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される単一の種類のリポソームのような少なくとも１つのリポソーム、または本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームもしくは少なくとも１つのリポソームの組合せ、もしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む、アジュバント組成物を対象とする。
【0074】
別の実施形態では、本開示は、単一の種類のリポソームのような少なくとも１つのリポソーム、または本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームもしくは少なくとも１つのリポソームの組合せ、もしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む、免疫賦活剤を対象とする。
【0075】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームもしくは少なくとも１つのリポソームの組合せ、もしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に開示されるアジュバント組成物、および少なくとも１つの抗原を含む、ワクチン組成物のような免疫原性組成物を対象とする。
【0076】
別の実施形態では、免疫原性組成物は、細菌抗原、原虫抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および腫瘍抗原から選択される抗原を含み得る。
【0077】
別の実施形態では、本開示は、
－ 本明細書に開示されるリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも１つのリポソーム、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキット（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）を対象とする。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
－ 本明細書に開示されるリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも１つのリポソーム、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキット（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）を対象とする。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
【0078】
別の実施形態では、本開示は、
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
【0079】
別の実施形態では、本開示は、ワクチンのような免疫原性組成物を製造するための方法であって、少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または少なくとも１つの抗原を含む本明細書に開示されるアジュバント組成物を混合する工程を少なくとも含む、方法を対象とする。
【0080】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される方法によって得ることが可能な免疫原性組成物を対象とする。
【0081】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの抗原をアジュバント処理するための方法であって、前記少なくとも１つの抗原を、少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または少なくとも１つのリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に開示されるアジュバント組成物と組み合わせる工程を少なくとも含む、方法を対象とする。
【0082】
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫原性応答をアジュバント処理するための方法であって、前記個体に、少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または少なくとも１つのリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む前記少なくとも１つの抗原を投与する工程を含む、方法を対象とする。
【0083】
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を誘発するための方法であって、前記個体に、少なくとも１つのリポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または少なくとも１つのリポソーム、または本明細書に開示される方法で得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む前記少なくとも１つの抗原を投与する少なくとも１つの工程を含む、方法を対象とする。
【0084】
別の実施形態では、本発明に従う免疫応答を誘発する方法において、リポソーム（例えば、本明細書に開示される単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せ、またはアジュバント組成物および抗原は、同時に、別個に、または逐次的に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるリポソームの組合せの第１および第２の種類のリポソームは、同時に、別個に、または逐次的に投与することができる。
【0085】
別の実施形態では、免疫応答を誘発するための方法は、前記個体のサイトカインおよび／またはケモカイン応答を高める工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、免疫応答を誘発するための方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＫＣ、および／またはＴＮＦ－αから選択されるサイトカインおよび／またはケモカインの上昇を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を誘発するための方法は、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１７の上昇を含み得る。
【0086】
アジュバント処理したＣＭＶ抗原含有免疫原性組成物、およびその使用
本目的の１つによると、本開示は、以下：
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；
－ 以下：
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
－ 少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの少なくとも１つの組合せであって、第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、組合せのいずれか
を含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関する。
本目的の１つによると、本開示は、以下：
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；
－ 以下：
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
－ 少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの少なくとも１つの組合せであって、第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、組合せのいずれか
を含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関する。
【0087】
本目的の別の１つによると、本開示は、以下：
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ 以下：
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
－ 第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せのいずれか
を含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関し、
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ 以下：
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
－ 第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せのいずれか
を含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関し、
【0088】
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスが、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【化5】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【0089】
ｅ）
（ここで、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ＭおよびＮは、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖を含む、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノ、およびアシルアミノからなる群から独立して選択される）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【化6】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【0090】
アジュバントは、本明細書に記載される単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せからなる。
【0091】
いくつかの実施形態では、第１の種類のリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。いくつかの実施形態では、第２の種類のリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。
【0092】
例示的な一実施形態では、本開示で考えられるＣＭＶは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）である。ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、ＨＣＭＶに由来し得る。
【0093】
実施例の節で示す通り、ＨＣＭＶ抗原および本明細書に開示されるアジュバント（ＳＰＡ１４）を含有する本明細書に開示される免疫原性組成物が、他のＨＣＭＶを含有するアジュバント処理した免疫原性組成物と比較して、長期持続型中和抗体を誘起することができたことが予想外に観察された。
【0094】
さらに、本明細書に開示されるアジュバント処理した免疫原性組成物は、同じ抗原であるが、ベンチマークアジュバントとして使用されるＡＳ０１アジュバント系を含有する組成物より小さい、ＣＲＰ、好中球数またはグロブリンのような炎症性血清バイオマーカーで測定されるような反応原性効果を呈した（実施例４）。さらに、本明細書に開示される免疫原性組成物は、初回用量より第２の用量でさらに低い反応原性効果を示した。さらに、本明細書に開示される免疫原性組成物は、中和抗体の誘発に関してＡＳ０１アジュバント処理した組成物と同様に効果的であることを示した。
【0095】
本明細書で提示される結果では、本明細書に開示される免疫原性組成物が、免疫原性の有効性と低い反応原性とを組み合わせて、ＣＭＶ感染に対するワクチンとして有用であり得ることが示される。したがって、このような免疫原性組成物により、多回レジメンにおけるその後の用量投与の受容およびワクチンスケジュールの順守に対する患者の行動は好ましくなる。
【0096】
さらに、本発明者らは、第１の種類のリポソームがサポニン、ステロール、およびリン脂質を含むが、ＴＬＲ４アゴニストを含まず、第２の種類のリポソームがステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むが、サポニンを含まない少なくとも２種類のリポソームの組合せが、各々、ｇＢおよび五量体のようなｈＣＭＶ抗原を含むが、ステロール、リン脂質、サポニン、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、ならびにｈＣＭＶ抗原を含む単一の種類のリポソームと類似のアジュバント処理の効果を誘発することができたことを予想外に観察している。さらに、実施例に示す通り、サポニンとしてＱＳ７を含む、本明細書に開示されるリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せは、良好な安全性プロファイルおよびｈＣＭＶ抗原での良好なアジュバント処理の効果を有利に呈する。
【0097】
一実施形態によると、本明細書に開示される免疫原性組成物は、全長ＣＭＶ ｇＢ抗原、膜貫通ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての膜貫通ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、細胞内ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての細胞内ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方から実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原からなる群で選択されるＣＭＶ ｇＢ抗原を含み得る。
【0098】
例示的な一実施形態によると、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、ｇＢｄＴＭ抗原であり得る。
【0099】
例示的な別の実施形態によると、五量体複合抗原由来のＣＭＶ ｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの少なくとも一部または実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失し得る。
【0100】
例示的な別の実施形態によると、五量体複合抗原由来のＣＭＶ ｇＨ抗原は、ＣＭＶ ＵＬ７５遺伝子でコードした全長ｇＨポリペプチドの外部ドメインを含み得る。
【0101】
一実施形態によると、ＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、本明細書に開示される免疫原性組成物に存在するＣＭＶ抗原のみであり得る。
【0102】
一実施形態によると、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0103】
例示的な一実施形態によると、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：
であり得る。
【化7】
【0104】
例示的な別の実施形態によると、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
であり得る。
【化8】
【0105】
一実施形態によると、サポニンは、シャボンノキのサポニンであり得る。
【0106】
別の実施形態によると、サポニンは、キラヤの樹皮から抽出される。
【0107】
別の実施形態では、サポニンは、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、およびその組合せから選択することができる。サポニンは、ＱＳ７またはＱＳ２１であり得る。
【0108】
別の実施形態によると、サポニンは、ＱＳ２１であり得る。
【0109】
別の実施形態によると、サポニンは、ＱＳ７であり得る。
【0110】
一実施形態によると、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、およびその混合物から選択することができる。
【0111】
別の実施形態によると、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体から選択することができ、特にコレステロールである。
【0112】
一実施形態によると、サポニンおよびステロールは、１：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、もしくは１：１０～１：５の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、または約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で存在し得る。
【0113】
一実施形態によると、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物から選択することができる。
【0114】
別の実施形態によると、リン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物から選択されるホスファチジルコリンであり得る。
【0115】
一実施形態によると、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＨＣＭＶワクチンのようなＣＭＶワクチンとして使用することができる。
【0116】
一実施形態によると、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＣＭＶに対して中和抗体を誘発するための方法で使用することができ、前記方法は、対象に少なくとも第１および第２の用量の前記組成物を投与する工程を含み、少なくとも第１および第２の用量は、少なくとも１か月間隔をあけて投与され、第２の用量は、前記対象に第１の用量より低い反応原性を誘発し、前記反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）第１の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与されており、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）第２の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与されている前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定した量を前記第２の測定した量と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する。
【0117】
いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇は、反応原性組成物を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇がない場合は、反応原性組成物がないこと、または低減した反応原性組成物を示し得る。
【0118】
一実施形態によると、
－ 本明細書に開示されるアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットを開示する。
－ 本明細書に開示されるアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットを開示する。
【0119】
別の実施形態では、本開示は、
－ 本明細書に開示される単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも１つの単一の種類のリポソーム、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。
－ 本明細書に開示される単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される方法で得られる少なくとも１つの単一の種類のリポソーム、または本明細書に開示されるアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。
【0120】
一実施形態によると、
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを開示する。
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを開示する。
【0121】
一実施形態によると、対象においてＣＭＶに対して免疫応答を誘発するための方法であって、前記対象に本明細書に開示される少なくとも１つの免疫原性組成物を投与する少なくとも１つの工程を含む、方法を開示する。
【0122】
別の実施形態によると、本明細書に開示される方法は、前記対象に第１および第２の用量の前記組成物を少なくとも１か月間隔をあけて投与する工程を含み、第２の用量は、第１の用量より低い反応原性を誘発し、前記反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）第１の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与した後、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）第２の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与した後に前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定した量を、前記第２の測定した量と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する。
【0123】
いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇は、反応原性組成物を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇がない場合は、反応原性組成物がないこと、または低減した反応原性組成物を示し得る。
【図面の簡単な説明】
【0124】
【図1】ＵＶ ９６ウェルマイクロプレートにおける、エタノール濃度の増加（横軸）：０．５、１．０、２．０、および１０ｍｇ／ｍｌについて、エタノール中のＥ６０２０溶液（●）およびＭＰＬ溶液（◆）に対する相対的な比濁分析単位（ＲＮＵ）（縦軸）の変化。
【図2】横軸方向に左から右へ、投与の４８時間後の以下の条件：模擬条件（Ｍ－模擬）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来、カタログ番号Ｌ８６４３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、バーリントン、ＭＡ）および１０μｇ／ｍｌのＲ８４８（カタログ番号ＴＬＲＬ－Ｒ８４８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）の混合物の存在下、ＳＰＡ１４－８（１：４０、１：４００、１：４０００および１：４００００で希釈）の存在下、ＱＳ２１リポソーム（ＳＰＡ１４－０）（１：４０、１：４００、１：４０００および１：４００００で希釈）の存在下、およびＥ６０２０－Ｅｑ－１：４０の存在下で、ＭＩＭＩＣ（登録商標）ＰＴＥシステム（Ｍｏｄｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ－抹消組織等価）におけるフローサイトメトリーを介して測定した細胞生存率（％）（縦軸）。各ドナーに対する疑似条件は、１００％に正規化し、処置条件は、この値に対して計算した。バーは、幾何平均±９５％ＣＩを示す；ｎ＝８～２０名のドナー。
【図3】横軸方向に左から右へ、投与の４８時間後の以下の条件：模擬条件（Ｍ－模擬）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（緑膿菌由来、カタログ番号Ｌ８６４３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、バーリントン、ＭＡ）および１０μｇ／ｍｌのＲ８４８（カタログ番号ＴＬＲＬ－Ｒ８４８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）の混合物の存在下、ＳＰＡ１４－２０（１：２０、１：４０、１：８０および１：１６０で希釈）の存在下、ならびにＳＰＡ１４－８（１：２０、１：４０、１：８０および１：１６０で希釈）の存在下で、ＭＩＭＩＣ（登録商標）ＰＴＥシステムにおけるフローサイトメトリーを介して測定したＣＤ８６陽性ＡＰＣ（抗原提示細胞）の量（ＨＬＡ－ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋の％）（縦軸）。バーは、幾何平均±９５％ＣＩを示す；ｎ＝８～２０名のドナー。Ｔｕｋｅｙポスト検定を伴うＡＮＯＶＡ。模擬対ＳＰＡ１４－２０、１：２０：＊＊＊＊、模擬対ＳＰＡ１４－８、１：２０：＊＊＊＊、ＳＰＡ１４－２０対ＳＰＡ１４－８：ＮＳ（＊＊＊＊は、ｐ値＜０．０５を示す）。
【図4】免疫化したウサギ由来の血清でのＨＣＭＶ中和抗体の応答。Ｄ１５、Ｄ２４およびＤ３６で、補体不在下での上皮細胞ＭＲＣ－５上のμＰＲＮＴ５０（Ａ）、ならびにＤ２４およびＤ３６で、補体存在下での線維芽細胞ＡＲＰＥ－１９のμＰＲＮＴ５０（Ｂ）。ウサギは、ｇＢ＋五量体（●）、ｇＢ＋五量体＋ＳＰＡ１４（０μｇのＥ６０２０）（最も薄い色の▼）、ｇＢ＋五量体＋ＳＰＡ１４（１μｇのＥ６０２０）（２番目に薄い色の▼）、ｇＢ＋五量体＋ＳＰＡ１４（２μｇのＥ６０２０）（２番目に濃い色の▼）、ｇＢ＋五量体＋ＳＰＡ１４（５μｇのＥ６０２０）（最も濃い色の▼）、およびｇＢ＋五量体＋ＡＳ０１Ｂ（■）で２回（Ｄ０、Ｄ２１）免疫化した（実施例１および９を参照）。
【図5】マウスの血清において、Ｄ３５でのＳＰＡ１４＋０．１μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、ＡＳ０１Ｂ＋０．１μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、ＳＰＡ１４＋０．５μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、ＡＳ０１Ｂ＋０．５μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、０．１μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）単独、および０．５μｇのＨＡ Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）単独（横軸）の投与後の（左から右へ）、Ａ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）株に対してＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ（０．１および０．５μｇのＨＡ）で得られるＨＡＩ力価（縦軸）。
【図6】マウスの血清において、Ｄ３５でのＳＰＡ１４またはＡＳ０１ＢおよびＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ ０．５μｇのＨＡ単独（横軸）でアジュバント処理した製剤の投与後の（左から右へ）、ＨＫ／２０１４株、ミシガン／２０１５株、ブリスベン／０８株、シンガポール／２０１６株、およびコロラド／２０１７株に対してＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ ０．５μｇのＨＡで得られるＨＡＩ力価（縦軸）。
【図7】マウスの血清において、Ｄ３５でのＳＰＡ１４またはＡＳ０１ＢおよびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶ １μｇのＨＡ単独（横軸）でアジュバント処理した製剤の投与後の（左から右へ）、ミシガン／２０１５（Ｈ１Ｎ１）株およびブリスベン／０８株に対してＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶ １μｇのＨＡで得られるＨＡＩ力価（縦軸）。
【図8】Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）アジュバント処理した製剤での免疫に応答してＩＦＮγ、ＩＬ－５、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＫＣ、およびＩＬ－６分泌の増加。免疫の６時間後の免疫化したマウスの血清において、抗原なし（事前採血）、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）単独（Ｆｚｏｎｅ）、Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）単独（Ｆｂｌｏｋ）、ＳＰＡ１４単独、Ｆｚｏｎｅ＋ＳＰＡ１４、Ｆｂｌｏｋ＋ＳＰＡ１４、ＡＳ０１Ｂ、Ｆｚｏｎｅ＋ＡＳ０１Ｂ、およびＦｂｌｏｋ＋ＡＳ０１Ｂ（横軸）の存在下（左から右へ）、サイトカイン／ケモカインの量（ｐｇ／ｍＬ）（縦軸）。
【図9】ＥＬＩＳＰＯＴで測定したブースト免疫（３５日目）の２週間後、免疫化したマウスの脾細胞におけるＴｈ１（ＩＦＮγ）／Ｔｈ２（ＩＬ－５）サイトカイン分泌。Ｆｌｕｚｏｎｅ単独（○）、Ｆｌｕｚｏｎｅ＋ＳＰＡ１４（■）、Ｆｌｕｚｏｎｅ＋ＡＳ０１Ｂ（●）、Ｆｌｕｂｌｏｋ単独（Δ）、Ｆｌｕｂｌｏｋ＋ＳＰＡ１４（▼）およびＦｌｕｂｌｏｋ＋ＡＳ０１Ｂ（▲）（横軸）の投与後の（左から右へ）、Ｔｈ１／Ｔｈ２比（縦軸）。
【図10】ヒトＣＭＶウイルス株に対するアジュバント処理したｇＢおよび五量体の中和抗体の応答。Ｄ０およびＤ２１での、アジュバントを含まない、ＳＰＡ１４、またはＡＳ０１Ｂ（横軸）での８匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの筋肉内投与に続く、追加の補体を含まないＡＲＰＥ－１９上皮細胞株（Ａ）および追加の補体を含むＭＲＣ－５線維芽細胞株（Ｂ）で、Ｄ２０およびＤ３５で測定したヒトＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株の中和力価（ＰＲＮＴ５０）（縦軸）。マウスデータは、各群に対するスキャッタードプロットおよび中和力価の幾何平均（ＧＭＴ）として示される。Ｔｕｋｅｙ調節および一元ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）。
【図11-1】免疫化したマウス由来の脾臓細胞におけるｈＣＭＶｇＢならびにおよび五量体ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞。 Ｄ０およびＤ２１でのアジュバント処理しないｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体ワクチン、ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体、またはＡＳ０１Ｂアジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体でのＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＭ投与に続く、Ｄ３５で測定したｈＣＭＶ ｇＢ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡおよびＢ）ならびにｈＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞。（Ａ）１０６個の脾臓細胞あたりのｇＢ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞の頻度。（Ｂ）ｇＢに特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞の比。（Ｃ）１０６個の脾臓細胞あたりの五量体特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞の頻度。（Ｄ）五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞の比。バー＝幾何平均、スキャッタードドット＝個々のマウス応答、（Ａ）および（Ｃ）の点線＝レスポンダーのカットオフ、（Ｂ）および（Ｄ）の点線＝バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２比＝１。Ｔｕｋｅｙ調節および一元ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）。
【図12-1】免疫化したマウス由来の脾臓細胞でのＴ細胞応答の特徴付け。 Ｄ０およびＤ２１でのアジュバント処理しないｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体ワクチン、ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体、ならびにＡＳ０１Ｂアジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体でのＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＭ投与に続く、Ｄ３５で測定したｈＣＭＶ ｇＢ特異的ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞（ＡおよびＢ）ならびにｈＣＭＶ五量体特異的ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞。（Ａ）ｇＢ特異的ＩＦＮγ分泌性細胞の頻度（１０６個の脾臓細胞あたり）。（Ｂ）１０６個の脾臓細胞あたりのｇＢ特異的ＩＬ－５分泌性細胞の頻度。（Ｃ）ｇＢに特異的なＩＦＮγおよびＩＬ－５分泌性細胞の比。（Ｄ）１０６個の脾臓細胞あたりの五量体特異的ＩＦＮγ分泌性細胞の頻度。（Ｅ）１０６個の脾臓細胞あたりの五量体特異的ＩＬ－５分泌性細胞の頻度。（Ｆ）五量体に特異的なＩＦＮγおよびＩＬ－５分泌性細胞の比。バー＝幾何平均、スキャッタードドット＝個々のマウス応答、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｅ）の点線＝レスポンダーのカットオフ、（Ｃ）および（Ｆ）の点線＝バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２比＝１。Ｔｕｋｅｙ調節および一元ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０５）。
【図13】ＳＰＡ１４は、プレＦ－フェリチンをワクチン接種したＮＨＰ由来の血清におけるＦ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ応答を向上させる。個々のサルのデータは、各群に対して示す。点線＝定量化の限界。 ４匹の異なるマカク：マカク＃１（●）マカク＃２（■）マカク＃３（▲）およびマカク＃４（▼）（横軸）に対する、日数で、経時的なプレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４（左のグラフ）またはプレＦ－フェリチン単独（右のグラフ）の投与後のＦ特異的ＩｇＧ力価（血清）（縦軸）。
【図14】プレＦ－フェリチンに対するＲＳＶ－Ａ２中和抗体応答。０日目および２８日目にアジュバントを伴わない、またはＳＰＡ１４を伴う４匹のカニクイザル（マカク＃１（●）、マカク＃２（■）、マカク＃３（▲）およびマカク＃４（▼））の筋肉内ワクチン接種に続く、経時的に（日数で）（横軸）（Ａ）補体を含まない、および（Ｂ）補体を含むＲＳＶ－Ａ２中和力価（ＰＲＮＴ６０）（縦軸）。個々のサルのデータは、各群に対して示す。点線＝定量化の限界。（ＡＮＯＶＡ＊＊Ｐ値＜０．０１）。
【図15】プレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４は、ＮＨＰにおけるＲＳＶ Ｂ株に対する交差中和抗体を誘発する。アジュバントを伴わない、またはＳＰＡ１４を伴う４匹のカニクイザル（マカク＃１（●）、マカク＃２（■）、マカク＃３（▲）およびマカク＃４（▼））の筋肉内ワクチン接種に続く、経時的に（日数で）（横軸）補体を含まないＲＳＶ－Ａ２中和力価（ＰＲＮＴ６０）（縦軸）。個々のサルのデータは、各群に対して示す。点線＝定量化の限界。
【図16】免疫化したマカク由来のＰＢＭＣにおけるＦ特異的ＩｇＧ記憶Ｂ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ応答。０日目および２８日目に、プレＦ－ＮＰアジュバント処理した、またはＳＰＡ１４を伴わないカニクイザルのＩＭワクチン接種に続く、ベースライン、１１９日目、および１６１日目でのＦ特異的記憶Ｂ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ結果。（Ａ）Ｆ特異的記憶ＩｇＧ分泌性細胞／１０６個の細胞。（Ｂ）Ｆ特異的記憶ＩｇＧ分泌性細胞／総ＩｇＧ分泌性細胞の％。バー＝幾何平均；点線＝レスポンダーのカットオフ；ＡＮＯＶＡ＊＊Ｐ値＜０．０１）。
【図17】ワクチン接種に続くマカクにおける細胞免疫応答の特徴付け。免疫化したマカク由来のＰＢＭＣにおいてＤ７（用量１の７日後）およびＤ３５（用量２の７日後）での（Ａ）Ｆ特異的ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ応答および（Ｂ）Ｆ特異的ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔ応答。＊＊Ｐ値＜０．０１。バー＝幾何平均；点線＝レスポンダーのカットオフ。
【図18】生理食塩水緩衝液（△）で注射された、もしくは緩衝液（例えばＰＢＳ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １４０ｍＭ）中に２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＢ＋２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａを含む免疫原性組成物（－ －▼－ －）で免疫化した、またはＳＰＡ１４（▼）、ＡＦ０４（◆）、ＡＦ０３（●）、またはＡＳ０１Ｅ（□）で製剤化したマウスで得られる血清を含む、補体存在下での上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９で実行したマイクロプラーク減少中和試験（μＰＲＮＴ）の結果を表す（実施例１および２を参照）。動物に、０日目、２１日目、および２２１日目（７か月目）で免疫原性組成物を注射した。横軸方向は、血液サンプリングの日、すなわち１９日目（Ｄ１９）、１か月目（Ｍ１）、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、およびＭ８を与え、縦軸方向は、μＰＲＮＴ中和抗体力価（ｌｏｇ１０）を与える。
【図19】ｇＢおよび五量体に特異的な中和抗体力価。パネルＡ：補体不在下での上皮細胞ＭＲＣ－５上の中和抗体。パネルＢ：補体存在下での線維芽細胞株ＡＲＰＥ－１９上の中和抗体。中和抗体は、１か月目および８か月目で測定された（ＡＦ０３と比較して、＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００１）。血清は、ＳＰＡ１４、ＡＦ０４、ＡＦ０３またはＡＳ０１Ｅでアジュバント処理した緩衝液（例えばＰＢＳ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １４０ｍＭ）中に２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＢ＋２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａを含む免疫原性組成物で免疫化したマウスから得られた（実施例１および２を参照）。動物に、０日目、２１日目、および２２１日目（７か月目）に免疫原性組成物を注射した。
【図20】１か月目、７か月目、および８か月目にＥＬＩＳＰＯＴにより測定したＣＭＶ五量体刺激時のＩＦＮ－γ（パネルＡ）およびＩＬ－５（パネルＢ）分泌性細胞の頻度。血清は、ＳＰＡ１４、ＡＦ０４、ＡＦ０３またはＡＳ０１Ｅでアジュバント処理した緩衝液（例えばＰＢＳ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １４０ｍＭ）中に２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＢ＋２０μｇ／用量のＨＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａを含む免疫原性組成物で免疫化したマウスから得られた（実施例１および２を参照）。動物に、０日目、２１日目、および２２１日目（７か月目）で免疫原性組成物を注射した。
【図21】ヒツジの赤血球で、ＱＳ２１もしくはＱＳ７（０．８μＭ～１００μＭ）、または対照として使用されるクエン酸緩衝液の溶血効果を示す。
【図22】図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃおよび２２Ｄは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ））、ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０μｇ／ｍＬ））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００μｇ／ｍＬ）、ＱＳ７を含有するＳＰＡ１４様（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ）、（０：６００μｇ／ｍＬ）、または（０：１８００μｇ／ｍＬ）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００μｇ／ｍＬ）、（２０：６００μｇ／ｍＬ）、または（２０：１８００μｇ／ｍＬ））で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスにおけるｈＣＭＶｇＢおよび五量体のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃで誘発した応答を示す。
【図23】図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００））、ならびにＱＳ７を含有するＳＰＡ１４様製剤（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００）、（０：６００）、または（０：１８００）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００）、（２０：６００）、または（２０：１８００））で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスで誘発したＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ応答比を示す。
【図24】Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００））、ならびにＱＳ７を含有するＳＰＡ１４様製剤（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００）、（０：６００）、または（０：１８００）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００）、（２０：６００）、または（２０：１８００））で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスで誘発した血清中和力価応答を示す。
【図25】図２５Ａおよび２５Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００））、ならびにＱＳ７を含有するＳＰＡ１４様製剤（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム［要確認］）（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００）、（０：６００）、または（０：１８００）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００）、（２０：６００）、または（２０：１８００））で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスで誘発したＩＦＮ－γおよびＩＬ－５で分泌された応答比を示す。
【図26】図２６Ａおよび２６Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）（「ＳＰＡ１４ｈ２０」（２０：２００））、ならびにＳＰＡ１４で見出されるものと同じ用量で注射されたＱＳ２１およびＥ６０２０を含む「ＱＳ２１ ＬＩＰ」および「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」の組合せ（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」＋「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスにおけるｈＣＭＶｇＢおよび五量体のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃで誘発した応答を示す。
【図27】図２７Ａおよび２７Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）、ならびにＳＰＡ１４で見出されるものと同じ用量で注射されたＱＳ２１およびＥ６０２０を含む「ＱＳ２１ ＬＩＰ」および「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」の組合せ（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」＋「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスで誘発したＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ応答比を示す。
【図28】図２８Ａおよび２８Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）、ならびにＳＰＡ１４で見出されるものと同じ用量で注射されたＱＳ２１およびＥ６０２０を含む「ＱＳ２１ ＬＩＰ」および「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」の組合せ（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」＋「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスで誘発したＩＦＮ－γおよびＩＬ－５で分泌された応答比を示す。
【図29】図２９Ａおよび２９Ｂは、Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００））、ＱＳ２１なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０））、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）、ならびにＳＰＡ１４で見出されるものと同じ用量で注射されたＱＳ２１およびＥ６０２０を含む「ＱＳ２１ ＬＩＰ」および「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」の組合せ（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」＋「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）で製剤化したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）で免疫化したマウスから得られる血清を含む、補体不在下での上皮細胞株ＭＲＣ５（Ｂ）および補体存在下でのＡＲＰＥ－１９（Ａ）で実行したマイクロプラーク減少中和試験（μＰＲＮＴ）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0125】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、当該技術分野でのそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本明細書に開示される主題の生成物および方法を記載する際にさらなる指針を提供するために、下記または本開示の他の場所で議論される。
本明細書で使用される用語は、一般に、当該技術分野でのそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、本明細書に開示される主題の生成物および方法を記載する際にさらなる指針を提供するために、下記または本開示の他の場所で議論される。
【0126】
以下の定義は、本開示の文脈に適用する。
【0127】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段内容で明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。
【0128】
用語「約」または「およそ」とは、本明細書で使用される場合、当該技術分野における当業者に容易に知られているそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書で「約」の値またはパラメータへの参照は、値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。いくつかの実施形態では、用語「約」とは、所与の値の±１０％を指す。しかし、問題の値が、細分化されるとその同一性を失う分子または他の対象のような不可分の対象を指す場合には、「約」とは、不可分の対象の±１を指す。
【0129】
本明細書に記載される本開示の態様および実施形態が、態様および実施形態「を有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことは理解される。単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記述した要素（例えば主題の組成物または方法の工程）の包含を示すが、任意の他の要素の除外を示さないことは理解されよう。用語「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、任意の他の要素を除外して、記述した要素の包含を示す。用語「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、記述した要素、ならびに他の要素が本開示の基本的で新規な特質に具体的に影響を及ぼさない他の可能な要素の包含を示す。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または同等物を使用する本開示の異なる実施形態が、本用語が「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」と置き換えられる実施形態を網羅することは理解される。
【0130】
本明細書で使用される場合、抗原または抗原およびアジュバントの組合せについて使用される用語「免疫学的有効量」とは、対象に投与する場合、抗原に対して免疫応答を誘起するのに効果的である量を指すことを意図する。この量は、様々な要因、例えば対象の健康または身体的状態、年齢、抗体を生成する対象の免疫系の能力、所望する保護の度合い、抗原を含有する組成物の製剤化、医療状況に対する処置する医師の評価によって異なり得る。この量は、当業者に公知の日常的な方法で決定することができる。
【0131】
本明細書で使用される場合、免疫応答の誘起の文脈では、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」などは、統計的に有意な様式において、疾患もしくは障害、状態の症状を治癒、治療、緩和、軽減、変更、修復、寛解、改善、もしくは影響する、または症状、合併症の発症を予防もしくは遅延するあるいは障害のさらなる発症の停止もしくは阻害する目的で、本明細書に開示される組成物の投与または消費を指す。
【0132】
また、本明細書で使用される場合、本開示の文脈では、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などは、ＣＭＶ感染により媒介される病理学的プロセスからの軽減または緩和を指す。本開示の文脈では、本明細書に記載される他の状態のいずれかに関する限りにおいて、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などは、このような状態に関連する１つまたはそれ以上の症状を軽減または緩和することを指す。
【0133】
本明細書で使用される場合、疾患または障害に関する用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「の進行を遅延させる（ｄｅｌａｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ）」（およびその文法的な変形）は、例えば疾患を有する疑いのあるまたは疾患を発症するリスクがある個体における、疾患または障害の予防的処置に関する。予防は、限定されないが、疾患の発症もしくは進行を予防もしくは遅延すること、および／または所望のもしくは病理学的以下のレベルで疾患もしくは障害の１つまたはそれ以上の症状を維持することを含み得る。用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」は、事象発生の実現性または可能性の１００％の排除を必要としない。むしろ、事象発生の可能性が、本明細書に記載される組成物または方法の存在下で低減することを表す。
【0134】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」、「治療有効量」および「予防有効量」とは、考えられる疾患または障害の処置、予防、または管理において治療上の利点を提供する量を指す。治療に効果的である具体的な量は、通常の医療従事者により容易に決定することができ、考えられる疾患または障害の種類および段階、患者の病歴および年齢、ならびに他の治療剤の投与のような要因によって異なり得る。
【0135】
本明細書で使用される場合、用語「個体」または「対象」または「患者」は、互換的に使用され、哺乳動物を指すことを意図する。哺乳動物は、限定されないが、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒトおよびサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えばマウスおよびラット）を含む。例示的ないくつかの実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【0136】
本開示の文脈では、表現「中和抗体」は、当業者に公知の意味を有し、例えば宿主細胞へのウイルスの侵入を遮断する、または細胞から細胞へのウイルスの播種を遮断することによりその標的の病原体を直接中和する抗体を網羅することを意図する。中和抗体は、その病原性標的について免疫保護を対象に誘発することができる機能的抗体である。中和抗体レベルおよび／または中和抗体持続性の存在および／または増加および／または量を決定するのに利用可能な方法のいくつかの例示は、本開示の実験の部で提供される。
【0137】
本開示の文脈では、表現「薬学的に許容される担体」とは、本明細書に開示される免疫原性組成物の生理活性、すなわち反応原性効果の低い免疫応答を誘発するその能力を保持しながら、ヒトのような哺乳動物への投与に生理学的に許容される担体またはビヒクルを指す。
【0138】
用語「薬学的に許容される塩」は、このような化合物の例えば非毒性の酸付加塩との組合せに由来する本明細書に開示される化合物の付加塩を含む。
【0139】
用語「抗原」は、任意の分子、例えばペプチド、タンパク質、多糖または複合糖質を含み、免疫応答を誘起する、および／または免疫応答が配向される少なくとも１つのエピトープを含む。例えば、抗原は、場合により加工した後に免疫応答を誘発する分子であり、例えば抗原または抗原を発現する細胞に特異的である。加工した後、抗原は、ＭＨＣ分子で提示され、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する。ゆえに、抗原またはその断片は、Ｔ細胞受容体により認識すべきであり、適切な共刺激シグナルの存在下、抗原または断片を特異的に認識するＴ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローン増殖を誘発することができるべきであるが、これにより、抗原または抗原を発現する細胞に対する免疫応答をもたらされる。本開示によると、免疫応答に対する候補である任意の適切な抗原を想定することができる。抗原は、天然起源の抗原に相当し得る、または由来し得る。このような天然起源の抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、ならびに他の感染性物質および病原体に含まれ得るもしくは由来し得る、または抗原はまた、腫瘍抗原であり得る。前記抗原は、タンパク質もしくはペプチド抗原、多糖抗原、または複合糖質抗原であり得る。本明細書に好適な抗原は、本開示でさらに議論される。
【0140】
本開示およびワクチンの文脈内で、「反応原性」とは、ワクチン接種の直後に起こり、ワクチン接種に対する免疫応答の身体的徴候である症状のサブセットを指すことを意図する。これらの症状は、局所（注射部位）または全身症状であり得、局所症状としての疼痛、発赤、腫脹、注射部位の硬結、および全身症状としての発熱、筋痛症、頭痛、または発疹の少なくとも１つを含み得る。ワクチンまたは免疫原性組成物の反応原性はまた、グロブリン、ＣＲＰ、フィブリノゲン、または好中球数のようないくつかのバイオマーカーのレベルの測定、および測定したレベルの参照のレベルとの比較により決定することができる。本開示の文脈内で、「低い反応原性」または「低減した反応原性」は、同じ所与の治療指標で使用された同等の用量の第２の免疫原性もしくはワクチン組成物を受けたもしくは受けている同じまたは別の個体で誘起された反応原性応答のレベルより下位である第１の組成物の用量を受けた個体において所与の治療指標に対して使用した免疫原性またはワクチン組成物により誘起された反応原性応答のレベルを適格にするのに使用され、第２の免疫原性は、第１のものに対してその製剤と異なる。また、「低い反応原性」または「低減した反応原性」は、先と同一の用量の本組成物を受けているまたはその後の同一の用量の本組成物を受けた同じ個体で誘起された反応原性応答のレベルより下位である用量の本組成物を受けた個体において所与の治療指標に対して使用した免疫原性またはワクチン組成物により誘起された反応原性応答のレベルを適格にする。反応原性応答のレベルは、反応原性症状またはバイオマーカーとして通常みなされる少なくとも１つの症状または少なくとも１つのバイオマーカーの測定により決定することができる。反応原性のバイオマーカーは、血液または血清サンプルに投薬されたＣＲＰ、グロブリン、またはフィブリノゲンであり得る。
【0141】
用語「ステロール」または「ステロイドアルコール」とは、遊離であるまたはエステル化されるヒドロキシル部分を有するステランコアからなる脂質の群を指す。遊離ヒドロキシル部分を含むステロイドアルコールの例として、コレステロール、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール、およびエルゴステロールを引用することができる。ステロイドアルコールまたはステロールのエステルとは、ステロイドアルコールのヒドロキシル基とのカルボン酸のエステルを指す。好適なカルボン酸は、カルボキシル部分に対して、飽和または不飽和、直鎖または分岐鎖アルキル基をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ１～Ｃ２０アルキル基であり得る。他の実施形態では、カルボン酸は、脂肪酸であり得る。
【0142】
本開示内で、変化に関して使用される用語「著しく」とは、観察した変化が顕著である、および／または統計的な意味を有することを意味することを意図する。
【0143】
本開示内で、本開示の特徴と併用される用語「実質的に」とは、この特徴と全体ではないが大部分で類似する特徴に関する一連の実施形態を定義することを意図する。所与の特徴に関する一連の実施形態と所与の特徴との差は、一連の実施形態において、所与の特徴の性質および機能が具体的に影響を及ぼさない。
【0144】
本明細書で使用される場合、用語「免疫賦活」とは、投与される個体において免疫系の成分を活性化することにより、免疫応答を引き起こす、および／または向上させる能力を有する化合物または組成物を指す。
【0145】
本開示内で、用語「アジュバント」または「アジュバント効果」は、抗原含有ワクチン組成物に添加して、例えば抗原特異的免疫細胞に対する抗原提示を向上させ、標的とする病原体に対する長期的な保護を与える目的でこれらの細胞を活性化することにより、抗原に対する免疫応答を引き起こす、または向上させる助けとなる化合物または組成物を適格にするのに使用される。
【0146】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン」とは、病原性物質により引き起こされる病気から対象を保護または処置することを意図して、対象に投与して免疫応答を誘発する、病原性物質を対象とする免疫原性組成物を意味することを意図する。本明細書に開示されるワクチンは、初期の（および／または再発性の）感染を予防またはその発症の可能性を軽減することを意図して、感染前に対象に投与するために予防的（防御的）ワクチンとしての使用を意図している。先天性ＣＭＶ感染の場合、本明細書に開示される組成物は、母親から胎児または幼児への垂直ＣＭＶ伝染を予防またはその発症の可能性を軽減するために妊娠前の青年期の少女および妊娠適齢期の女性のための予防的ワクチンとして使用することを意図している。
【0147】
以下に記載する供給源、構成要素、および成分のリストは、その組合せおよび混合物も考慮され、本明細書の範囲内となるように列挙される。
【0148】
本明細書全体を通して与えられるあらゆる最大数値限定が、より小さいあらゆる数値限定を、このようなより小さい数値限定が明らかに本明細書に記載されたかのように含むことは理解すべきである。本明細書全体を通して与えられるあらゆる最小数値限定は、より大きいあらゆる数値限定を、このようなより大きい数値限定が明らかに本明細書に記載されたかのように含む。本明細書全体を通して与えられるあらゆる数値範囲は、このようなより大きな数値範囲内に含まれるより狭いあらゆる数値範囲を、このようなより狭い数値範囲が明らかに本明細書に記載されたかのように含む。
【0149】
例えば構成要素のリストのような項目の全てのリストは、マーカッシュ群として解釈することを意図し、解釈すべきである。ゆえに、全てのリストは、項目のリスト「ならびにその組合せおよび混合物」「からなる群から選択される」項目として読み取れ、解釈することができる。
【0150】
本明細書で参照されるのは、本開示で利用される様々な構成要素を含む成分に対する商標名であり得る。本発明者らは、任意の特定の商標名の材料により限定することを意図しない。商標名により参照されるものと同等の材料（例えば、異なる名称または参照番号での異なる供給源から得られるもの）は、本明細書での記載において置き換え、利用することができる。
【0151】
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト
本開示に好適なＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）アゴニストは、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
本開示に好適なＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）アゴニストは、式（Ｉ）：
【化9】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【0152】
ｅ）
（ここで、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ＭおよびＮは、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖を含む、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノ、およびアシルアミノからなる群から独立して選択される）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
の化合物または本化合物の薬学的に許容される塩である。
【化10】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
の化合物または本化合物の薬学的に許容される塩である。
【0153】
式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、これらの化合物の有機または無機塩基の塩であり得る。例えば、有機または無機塩基は、ナトリウム、カリウム、およびリチウムのようなアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛のような他の金属の水酸化物；非置換またはヒドロキシ置換したモノ、ジ、またはトリアルキルアミンのようなアンモニアおよび有機アミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ－メチル－Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ、ビスもしくはトリス（２－ヒドロキシアルキルアミン）、例えばモノ、ビスもしくはトリス（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、またはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジアルキル－Ｎ－（ヒドロキシアルキル）アミン、例えばＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミン、またはトリス（２－ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン；ならびに、アルギニンおよびリジンのようなアミノ酸からなる群に由来し得る。
【0154】
一実施形態では、本発明に好適なＴＬＲ４アゴニストは、上述した式（Ｉ）の化合物であり得、
－ Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）－または－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－であり、ｎは、１、２、３または４であり、
－ ａ、ｂ、ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して、１または２であり；
－ Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、ＮＨであり、
－ Ｗ１およびＷ２は、－Ｃ（Ｏ）－であり、
－ Ｒ２およびＲ５は、オキソで場合により置換されるＣ１０～Ｃ１５直鎖アルキル、ＮＨ－（Ｃ１０～Ｃ１５直鎖アルキル）、および
（式中、ＭおよびＮは、独立して、Ｃ２～Ｃ２０直鎖アルキルまたはアルケニルである）
からなる群から独立して選択され、
－ Ｒ３およびＲ６は、Ｃ５～Ｃ１０直鎖アルキルであり、
－ Ｒ４およびＲ７は、水素、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ８～Ｃ１２直鎖アルキル）、またはＣ（Ｏ）（Ｃ８～Ｃ１２直鎖アルケニル）からなる群から選択され、
－ Ｇ１およびＧ３は、酸素または－ＮＨ（ＣＯ）－であり、
－ Ｇ２およびＧ４は、酸素である。
－ Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）－または－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－であり、ｎは、１、２、３または４であり、
－ ａ、ｂ、ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して、１または２であり；
－ Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、ＮＨであり、
－ Ｗ１およびＷ２は、－Ｃ（Ｏ）－であり、
－ Ｒ２およびＲ５は、オキソで場合により置換されるＣ１０～Ｃ１５直鎖アルキル、ＮＨ－（Ｃ１０～Ｃ１５直鎖アルキル）、および
【化11】
からなる群から独立して選択され、
－ Ｒ３およびＲ６は、Ｃ５～Ｃ１０直鎖アルキルであり、
－ Ｒ４およびＲ７は、水素、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ８～Ｃ１２直鎖アルキル）、またはＣ（Ｏ）（Ｃ８～Ｃ１２直鎖アルケニル）からなる群から選択され、
－ Ｇ１およびＧ３は、酸素または－ＮＨ（ＣＯ）－であり、
－ Ｇ２およびＧ４は、酸素である。
【0155】
本開示の文脈では、下記の用語は、別段本明細書全体を通して記載されない限り、以下の定義を有する：
－ ハロゲン原子：フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子；
－ オキソ：「＝Ｏ」基；
－ ヒドロキシルまたはヒドロキシ基：ＯＨ基；
－ アルキル基：別段記述しない限り、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル」と記す）を含む直鎖または分岐鎖飽和炭水化物ベースの脂肪族基。例として、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、およびイソヘキシル基などを挙げることができる；
－ アルコキシ基：－Ｏ－アルキル基（アルキル基は先に定義される）。例として、限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、直鎖、第２級もしくは第３級のブトキシ、イソブトキシ、ペントキシ、またはヘキソキシ基などを挙げることができる；
－ アルキレン基：分岐鎖または直鎖のいずれかである二価の飽和炭水化物ラジカル。別段示されない限り、アルキレン基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレン」と記す）を含む。
－ アルキレンジオキシ基：－ＯＲＯ－基（Ｒは、本明細書に定義される通り、アルキレン基である）。
－ アシル基：炭素基に結合したカルボニル基。
－ アリール基：官能基、または芳香環、通常フェニルおよびナチフルのような芳香族炭水化物に由来する置換基；
－ アルケニル基：二重結合炭素に結合した水素原子が、アルケンの分子から除去される場合、形成される炭素原子への結合の開放点を含有する断片。別段示されない限り、アルケニル基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルケニル」と記す）を含む。
－ アシルオキシ基：カルボン酸に由来する、Ｒ－ＣＯＯ－。別段示されない限り、アシルオキシ基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アシルオキシ」と記す）を含む。
－ アルキルアミノ基：本明細書に定義される通り、アルキルおよびアミノ基の両方を含有；
－ アシルアミノ基：本明細書に定義される通り、アシルおよびアミノ基の両方を含有；
－ アミノ基：ＮＨ２基；
－ カルボニル基：（Ｃ＝Ｏ）基；
－ フルオロ基：－Ｆ；
－ チオール：Ｒ－ＳＨの形態の任意の有機硫黄化合物（Ｒは、本明細書に定義される通り、アルキルを表す）；
－ ニトロ基：－ＮＯ２；
－ スルホン：２つの炭素原子に結合したスルホニル官能基を含有。中心六価硫黄原子は、通常２つの別個の炭水化物置換基において、２つの炭素原子の各々に二重結合し、２つの炭素原子の各々に結合した一重結合を有する；
－ スルホキシド：通常２つの別個の炭水化物置換基において、２つの炭素原子に結合したスルフィニル（ＳＯ）官能基。
－ ハロゲン原子：フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子；
－ オキソ：「＝Ｏ」基；
－ ヒドロキシルまたはヒドロキシ基：ＯＨ基；
－ アルキル基：別段記述しない限り、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルキル」と記す）を含む直鎖または分岐鎖飽和炭水化物ベースの脂肪族基。例として、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、およびイソヘキシル基などを挙げることができる；
－ アルコキシ基：－Ｏ－アルキル基（アルキル基は先に定義される）。例として、限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、直鎖、第２級もしくは第３級のブトキシ、イソブトキシ、ペントキシ、またはヘキソキシ基などを挙げることができる；
－ アルキレン基：分岐鎖または直鎖のいずれかである二価の飽和炭水化物ラジカル。別段示されない限り、アルキレン基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルキレン」と記す）を含む。
－ アルキレンジオキシ基：－ＯＲＯ－基（Ｒは、本明細書に定義される通り、アルキレン基である）。
－ アシル基：炭素基に結合したカルボニル基。
－ アリール基：官能基、または芳香環、通常フェニルおよびナチフルのような芳香族炭水化物に由来する置換基；
－ アルケニル基：二重結合炭素に結合した水素原子が、アルケンの分子から除去される場合、形成される炭素原子への結合の開放点を含有する断片。別段示されない限り、アルケニル基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アルケニル」と記す）を含む。
－ アシルオキシ基：カルボン酸に由来する、Ｒ－ＣＯＯ－。別段示されない限り、アシルオキシ基は、１～６個の炭素原子（「（Ｃ１～Ｃ６）－アシルオキシ」と記す）を含む。
－ アルキルアミノ基：本明細書に定義される通り、アルキルおよびアミノ基の両方を含有；
－ アシルアミノ基：本明細書に定義される通り、アシルおよびアミノ基の両方を含有；
－ アミノ基：ＮＨ２基；
－ カルボニル基：（Ｃ＝Ｏ）基；
－ フルオロ基：－Ｆ；
－ チオール：Ｒ－ＳＨの形態の任意の有機硫黄化合物（Ｒは、本明細書に定義される通り、アルキルを表す）；
－ ニトロ基：－ＮＯ２；
－ スルホン：２つの炭素原子に結合したスルホニル官能基を含有。中心六価硫黄原子は、通常２つの別個の炭水化物置換基において、２つの炭素原子の各々に二重結合し、２つの炭素原子の各々に結合した一重結合を有する；
－ スルホキシド：通常２つの別個の炭水化物置換基において、２つの炭素原子に結合したスルフィニル（ＳＯ）官能基。
【0156】
一実施形態では、好適なＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：
の化合物であり得る。
【化12】
【0157】
一実施形態では、好適なＴＬＲ４アゴニストは、以下の式（ＩＩＩ）：
のＥ６０２０であり得る。
【化13】
【0158】
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の化合物は、強力なＴＬＲ－４受容体アゴニスト（Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００７年、６：７７３～８４頁）であるので、リポソームが細菌、ウイルス、真菌、もしくは寄生虫疾患に対するワクチンのような抗原、またはがんワクチンのような腫瘍抗原と共投与される場合、免疫アジュバントをもたらすのに有用な本開示のリポソームであり得る。
【0159】
好適なＴＬＲ４アゴニストは、ＷＯ２００７／００５５８３Ａ１で記載されるように得ることができる。
【0160】
Ｅ６０２０のＩＵＰＡＣ名は、（１Ｒ，６Ｒ，２２Ｒ，２７Ｒ）－１，２７－ジヘプチル－９，１９－ジオキシド－９，１４，１９，２９－テトラオキソ－６，２２－ビス［（３－オキソテトラデカノイル）アミノ］－４，８，１０，１８，２０，２４，２８－ヘプタオキサ－１３，１５－ジアザ－９，１９－ジホスファテトラコンタ－１－イルドデカン酸二ナトリウムである。そのＣＡＳ番号は、２８７１８０－６３－６である。
【0161】
本開示による好適なＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを呈する。
【0162】
好適なＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも３０ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0163】
好適なＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した約０．１～約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．２～約４５ｍｇ／ｍＬ、約１～約４０ｍｇ／ｍＬ、約２～約３５ｍｇ／ｍＬ、約６～約３０ｍｇ／ｍＬ、または約１０～約２５ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0164】
好適なＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定したおよそ少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ～約１２ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0165】
例示的な実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する。本明細書で提供される溶解度パラメータは、約２５℃、約１０１３ｈＰａの大気圧で測定した。
【0166】
溶解度は、溶媒、ここではエタノールに所与の温度および圧力で溶解することができる物質、ここではＴＬＲ４アゴニストの最大量を示す。特異的な溶媒における物質の溶解度の程度は、飽和濃度として測定されるが、より多くの溶質を添加することで、溶液の濃度は上昇せず、過剰量の溶質が沈殿し始める。
【0167】
エタノール中のＴＬＲ４アゴニストの溶解度は、当該技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。溶解度は、実験的に測定することができる。例えば、エタノール中の所与のＴＬＲ４アゴニスト、例えば本開示によって好適なＴＬＲ４アゴニストの溶媒度パラメータを決定するのに好適な方法は、実施例においてさらに下記に提供される比濁分析を実施することによる。エタノール中の所与のＴＬＲ４アゴニストの溶媒度パラメータを決定するための他の方法は、Ｖｅｓｅｌｉら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ．２０１９年１１月；４５（１１）：１７１７～１７２４頁）に記載される方法を含み得る。
【0168】
エタノールは、他の利用可能な有機溶媒または有機溶媒の混合物、例えばイソプロパノールまたはエタノール／イソプロパノールと対照的に、安全な化合物としてみなされ、医薬製品を製造する方法でのその使用は、通常、保健機関では挑戦していない。
【0169】
選択したＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度の具体的に提示された範囲により、これらの化合物は、溶媒注入法に基づくリポソーム製造方法で有利に実施される。このような方法は、工業規模でスケールアップすることができる利点を呈する。したがって、開示されるリポソームベースのアジュバントは、工業規模で容易で安価に生産することができる。
【0170】
好適なＴＬＲ４アゴニストは、タンパク質もしくはペプチド抗原と、多糖抗原と、および／または複合糖質抗原と組み合わせて使用して、ワクチン組成物のような免疫原性組成物を得ることができる。
【0171】
本明細書に開示されるＴＬＲ４アゴニストは、リポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第２の種類のリポソームにおいて、リポソームまたはリポソームの組合せに、サポニンおよびリン脂質のようなリポソームの他の成分またはリポソームの組合せの他の種類のリポソームの成分に関連して、個体に投与される場合の免疫賦活効果を与えるのに有効な量で使用することができる。ＴＬＲ－４アゴニストは、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第２の種類のリポソームのようなリポソームにおいて、リポソームまたはリポソームの組合せに、サポニンおよびリン脂質のようなリポソームの他の成分またはリポソームの組合せの他の種類のリポソームの成分に関連して、抗原に対するアジュバント効果を与えるのに有効な量で使用することができる。
【0172】
ＴＬＲ４アゴニストの量は、リポソームが含まれ得るワクチン組成物において重量／容積で、約０．５μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１５０μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ、例えば約２．５μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、例えば約４μｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌのＴＬＲ４アゴニストの範囲であり得る。
【0173】
一実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比でのサポニンを含む、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第２の種類のリポソームのようなリポソームに存在し得る。
【0174】
本明細書に開示されるリポソームと組み合わせて、異なる成分、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、サポニン、ステロールまたはステロールエステル、およびリン脂質の含有物は、リポソームの種類ごともしくはリポソームの組合せごと、またはリポソームを含む組成物ごとに表すことができる。いくつかの実施形態では、異なる成分、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、サポニン、ステロールまたはステロールエステル、およびリン脂質の含有物は、リポソームの組合せごと、またはリポソームを含む組成物ごとに表される。例えば、本明細書に開示されるリポソームと組み合わせて、ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンの量が、重量：重量比で表される場合、これは、第１の種類のリポソーム中のＴＬＲ－４アゴニストの量および第２の種類のリポソーム中のサポニンの量を指す。他の例として、本明細書に開示されるリポソームと組み合わせて、ＴＬＲ４アゴニスの量が、重量／容積で表される場合、これは、この組合せを含有する組成物の容積単位あたりのリポソームの組合せ中のＴＬＲ－４アゴニストの総量を指す。また例として、本明細書に開示されるリポソームと組み合わせて、ＴＬＲ４アゴニスト、例えばリン脂質の量が、重量：重量比で表される場合、これは、第１の種類のリポソーム中のＴＬＲ－４アゴニストの量ならびに第１および第２の種類のリポソーム中のリン脂質の総量を指す。
【0175】
一実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、約１：１～約１：５０、もしくは約１：２５～約１：３５の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比でのサポニンを含む、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第２の種類のリポソームのようなリポソームに存在し得る。
【0176】
ＴＬＲ４アゴニストは、約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比でのサポニンを含む、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第２の種類のリポソームのようなリポソームに存在し得る。
【0177】
実施例に示す通り、他のＴＬＲ４アゴニスト、例えばＭＰＬＡと比較して、本明細書に開示されるＴＬＲ４アゴニストは、免疫応答を誘起する効能の向上を提示するので、他のＴＬＲ４アゴニストと比較して、より少量で使用することができる。ゆえに、本明細書に開示されるＴＬＲ４アゴニストを含む材料を同じ絶対量で開始して、ＭＰＬＡより安価でより多くのアジュバント組成物を製造することが可能である。
【0178】
また、他のＴＬＲ４アゴニスト、例えば実施例に示すようなＭＰＬと比較して、本明細書に開示され、リポソームで製剤化されるＴＬＲ４アゴニストは、他のＴＬＲ４アゴニスト、または同じＴＬＲ４アゴニストだがリポソームで製剤化されていないものより良好な忍容性と低い反応原性を提示する。
【0179】
サポニン
本開示のリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１の種類のリポソームは、少なくとも１つのサポニンを含み得る。ＴＬＲ４アゴニストと組み合わせるようなサポニンの存在は、リポソームに対する免疫賦活効果を与える。
本開示のリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１の種類のリポソームは、少なくとも１つのサポニンを含み得る。ＴＬＲ４アゴニストと組み合わせるようなサポニンの存在は、リポソームに対する免疫賦活効果を与える。
【0180】
サポニンは、リポソームが細菌、ウイルス、真菌、もしくは寄生虫疾患に対するワクチンのような抗原、またはがんワクチンのような腫瘍抗原と共投与される場合、ＴＬＲ４アゴニストと組み合わせて免疫アジュバント効果を与えるのに有用なリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１の種類のリポソームであり得る。
【0181】
「サポニン」とは、ステロイドまたはトリテルペノイド構造のいずれかの疎水性領域と組み合わせた親水性領域（通常いくつかの糖鎖）からなる様々な植物種で豊富に見出される界面活性両親媒性グリコシドの群を指す。
【0182】
コレステロール、キラヤ属（Ｑｕｉｌｌａｊａ）のサポニンのようなサポニンの存在下で製剤化されない場合、望ましくない溶血効果を誘発し、水性相において不安定となり得ることは当該技術分野で知られている（Ｆｌｅｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９年；２４（１）：１７１；Ｗａｎｇら、ＡＣＳ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１９年；５（６）：９７４～９８１頁）。さらに、サポニンのアジュバント活性と溶血効果との相関関係が存在し得ることが認められている。コレステロールの存在下でのサポニンの製剤化は、同時にアジュバント処理の効果を維持しながら、溶血効果を有利に軽減する。溶血効果は、投与後、いくつかの有害反応に関連し得る。
【0183】
本開示において言及されるサポニンは、例えばＷａｎｇ Ｐ．ら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ、２０１３年１１月１５日；７８（２２）：１１５２５～１１５３４頁、Ｋｉｍ ＹＪら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、２００６年；１２８：１１９０６～１１９１５頁、またはＤｅｎｇ Ｋら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００８年；４７（３４）：６３９５～６３９８頁に記載されるような化学合成法により製造することができる。
【0184】
本開示に有用なサポニンは、シャボンノキのサポニンであり得る。「シャボンノキのサポニン」とは、本明細書で使用される場合、キラヤの樹木、例えばキラヤの樹木の樹皮に見出されるサポニンと構造的、機能的に同一であるが、別の植物源または合成手段のいずれかで得ることができるサポニンを指すことを意図する。合成手段は、化学的合成手段、または発酵槽で増殖させた組換え単離細胞での生産のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的生産手段、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで復元した人工細胞であり得る。培養細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた単離細胞、例えばキラヤの樹木で見出されるサポニンを生産するために、キラヤの樹木または別の植物のいずれかに由来するが修飾された植物細胞（組換え単離細胞）であり得る。
【0185】
一実施形態では、シャボンノキのサポニンは、キラヤから抽出することにより得ることができる。
【0186】
南アメリカの樹木であるキラヤの樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画は、当該技術分野で知られている。例えば、ＱＡ２１としても公知のＱＳ２１、キラヤの樹木由来のＨＰＬＣ精製分画、およびその生成方法は、ＵＳ５，０５７，５４０に（ＱＡ２１として）開示されており、キラヤ属のサポニンもまた、Ｓｃｏｔｔら、１９８５年、Ｉｎｔ Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．、７７、４０９頁によりアジュバントとして開示されている。
【0187】
植物から成分を抽出するための当業者に公知の任意の方法は、キラヤからサポニンを抽出するのに使用することができる。キラヤからサポニン抽出物を製造するための方法は、例えばＷＯ２０１９／１０６１９２Ａ１に記載されている。サポニンは、キラヤの樹皮由来のサポニン分画であるＱｕｉｌＡのさらなる分画化により得ることができる。
【0188】
サポニンは、混合物としてまたは精製した個別の成分として使用することができる。好適なサポニンは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、およびＱＳ－２１を含み、全てＱｕｉｌＡから分画される。
【0189】
いくつかの実施形態では、リポソームは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１、およびその組合せから選択されるサポニンを含み得る。
【0190】
一実施形態では、リポソームは、サポニンとして、ＱＳ２１またはＱＡ２１としても公知のＱＳ－２１を含み得る。
【0191】
一実施形態では、リポソームは、サポニンとしてＱＳ－７を含み得る。ＱＳ７は、ＱＳ２１の溶血効果よりはるかに小さい溶血効果を有する。実施例で示す通り、本開示のリポソームで製剤化する場合、ＱＳ７は、ＱＳ２１のアジュバント処理効果と同等に良好なアジュバント処理効果を誘発することができる。これは、個体への投与後の有害反応のリスクの可能性を高めることなく、アジュバント処理効果をさらに向上させるためのＱＳ７の量を、例えばＱＳ２１と比較して増加させるのに有利に実施することができる。
【0192】
他の好適なサポニンは、ナンバンカラスウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｓｐｒｅｎｇ）のサポニンである。「ナンバンカラスウリのサポニン」とは、本明細書で使用される場合、ナンバンカラスウリの果実に見出されるサポニンと構造的、機能的に同一であるが、別の植物源または上で開示される合成手段のいずれかで得られるサポニンを指すことを意図する。
【0193】
このようなサポニンは、Ｐ．Ｗａｎｇら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０２０年、６３、３２９０～３２９７頁）に記載されている。
【0194】
サポニンの量は、リポソーム（単一の種類または異なる種類のリポソームの組合せとして）が含まれ得るワクチン組成物における重量／容積での１μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌ、例えば２５μｇ／ｍｌ～７５０μｇ／ｍｌ、例えば５０μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌのサポニンの範囲であり得る。サポニンは、約１００μｇ／ｍｌの量でワクチン組成物に存在し得る。
【0195】
一実施形態では、サポニンは、ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で、ＴＬＲ４アゴニストを含むリポソームまたは本明細書に記載されるリポソームの組合せに存在し得る。
【0196】
サポニンは、約１０：１のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比でＴＬＲ４アゴニストを含む、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せのリポソームのようなリポソームに存在し得る。
【0197】
ＱＳ２１またはＱＳ７のようなサポニンは、約２０：２００、または約２０：６００、または約２０：１８００のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンのμｇ／ｍＬで表される量で、Ｅ６０２０のようなＴＬＲ４アゴニストを含む、単一の種類のリポソームのようなリポソームまたは本明細書に開示されるリポソームの組合せに存在し得る。
【0198】
サポニンＱＳ２１は、約２０：２００、または約２０：６００、または約２０：１８００、例えば約２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１のμｇ／ｍＬで表される量でＥ６０２０を含む、単一の種類のリポソームのようなリポソームまたは本明細書に開示される組合せに存在し得る。
【0199】
サポニンＱＳ７は、約２０：２００、または約２０：６００、または約２０：１８００、例えば約２０：６００のＥ６０２０：ＱＳ７のμｇ／ｍＬで表される量でＥ６０２０を含む、単一の種類のリポソームのようなリポソームまたは本明細書に開示される組合せに存在し得る。
【0200】
サポニンは、１：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、もしくは１：１０～１：５の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、または約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で、単一の種類のリポソームのようなリポソームまたは本明細書に開示される組合せに存在し得る。
【0201】
ステロール
単一の種類のリポソームおよび／または本明細書に開示される組合せの第１もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームは、ステロールまたはそのエステルを含み得る。ステロールまたはステロールのエステルの存在は、リポソームの構造安定性を改善することができる。
単一の種類のリポソームおよび／または本明細書に開示される組合せの第１もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームは、ステロールまたはそのエステルを含み得る。ステロールまたはステロールのエステルの存在は、リポソームの構造安定性を改善することができる。
【0202】
本明細書に有用なステロールは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、およびその混合物からなる群から選択することができる。
【0203】
ステロールのエステルとは、カルボン酸のステロイドアルコールのヒドロキシル基とのエステルを指す。好適なカルボン酸は、カルボキシル部分に対して、飽和または不飽和、直鎖または分岐鎖アルキル基をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルキル基は、Ｃ２～Ｃ１８、Ｃ４～Ｃ１６、Ｃ８～Ｃ１２の飽和または不飽和、直鎖または分岐鎖アルキル基のようなＣ１～Ｃ２０の飽和または不飽和、直鎖または分岐鎖アルキル基であり得る。他の実施形態では、カルボン酸は、脂肪酸であり得る。例えば、脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、マルガリン酸、オレイン酸、リノール酸、またはアラキジン酸であり得る。
【0204】
一実施形態では、ステロールのエステルは、コレステリルエステルであり得る。
【0205】
本明細書に有用なステロールのエステルは、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、およびステアリン酸コレステリル、ならびにその混合物からなる群から選択することができる。
【0206】
ステロールまたはそのエステルは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、およびステアリン酸コレステリル、ならびにその混合物から選択することができる。
【0207】
あるいは、有用なステロールは、酸化形コレステロールのようなコレステロール誘導体であり得る。
【0208】
好適な酸化形コレステロールは、２５－ヒドロキシコレステロール、２７－ヒドロキシコレステロール、２０α－ヒドロキシコレステロール、６－ケト－５α－ヒドロキシコレステロール、７－ケト－コレステロール、７β，２５－ヒドロキシコレステロール、および７β－ヒドロキシコレステロールであり得る。酸化形コレステロールは、２５－ヒドロキシコレステロールおよび２０α－ヒドロキシコレステロール、ならびにその混合物であり得、例えば、２０α－ヒドロキシコレステロールであり得る。
【0209】
一実施形態では、ステロールまたはそのエステルは、酸化形コレステロールのような、コレステロール、コレステリルエステル、またはコレステロール誘導体であり得る。一実施形態では、ステロールまたはステロイドアルコールは、コレステロールまたはコレステリルエステルであり得る。さらなる実施形態では、ステロールまたはステロイドアルコールは、コレステロールである。
【0210】
本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のステロールの含有物は、同一であり得るまたは異なり得る。いくつかの実施形態では、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のステロールの含有物は、同一であり得る。
【0211】
ステロールまたはそのエステルは、リポソームが含まれるワクチン組成物において、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲のモル量、約０．２ｍＭ～約７ｍＭの範囲のモル量、約０．５ｍＭ～約５ｍＭの範囲のモル量、または約０．８ｍＭ～約４ｍＭの範囲のモル量、または約１ｍＭ～約３ｍＭの範囲のモル量、または約１．２ｍＭ～約２ｍＭの範囲のモル量で存在し得る。例示的な一実施形態では、ステロールまたはそのエステルは、リポソームが含まれるワクチン組成物において、約１．３ｍＭのモル量で存在し得る。
【0212】
ステロールまたはそのエステルは、１：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、もしくは１：１０～１：５の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、または約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームにおいて存在し得る。
【0213】
リン脂質
単一の種類のリポソームならびに／または本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームは、少なくとも１つのリン脂質を含み得る。リン脂質の存在は、リポソームの構造安定性を改善することができる。
単一の種類のリポソームならびに／または本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームは、少なくとも１つのリン脂質を含み得る。リン脂質の存在は、リポソームの構造安定性を改善することができる。
【0214】
好適なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物からなる群から選択することができる。
【0215】
有用なホスファチジルコリンの例として、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物を挙げることができる。
【0216】
有用なホスファチジルエタノールアミンの例として、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＰＯＰＥ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＳＯＰＥ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルエタノールアミン）、およびその混合物を挙げることができる。
【0217】
有用なホスファチジン酸の例として、ＤＳＰＡ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸）、ＤＰＰＡ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸）、ＤＭＰＡ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸）、ＰＯＰＡ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸）、ＤＯＰＡ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジン酸）、ＳＯＰＡ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジン酸）、およびその混合物を挙げることができる。これらホスファチジン酸の薬学的に許容される塩もまた有用であり得る。
【0218】
有用なホスファチジルグリセロールの例として、ＤＳＰＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール）、ＤＭＰＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール）、ＰＯＰＧ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルグリセロール）、ＳＯＰＧ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルグリセロール）、およびその混合物を挙げることができる。
【0219】
有用なホスファチジルセリンの例として、ＤＳＰＳ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン）、ＤＰＰＳ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン）、ＤＭＰＳ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン）、ＰＯＰＳ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン）、ＤＯＰＳ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルセリン）、ＳＯＰＳ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルセリン）、およびその混合物を挙げることができる。
【0220】
有用なホスファチジルイノシトールの例として、ＤＳＰＩ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルイノシトール）、ＤＰＰＩ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルイノシトール）、ＤＭＰＩ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルイノシトール）、ＰＯＰＩ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルイノシトール）、ＤＯＰＩ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルイノシトール）、ＳＯＰＩ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルイノシトール）、およびその混合物を挙げることができる。
【0221】
リン脂質は、ホスファチジルコリン、例えばＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ；ＳＯＰＣ、およびホスファチジルエタノールアミン、例えばＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＯＰＥ、ＳＯＰＥ；ならびにその混合物からなる群から選択することができる。
【0222】
一実施形態では、好適なリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、およびＤＯＰＥであり得、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ、およびその混合物であり得る。
【0223】
本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のリン脂質の含有物は、同一であり得るまたは異なり得る。いくつかの実施形態では、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のリン脂質の含有物は、同一であり得る。
【0224】
リン脂質は、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのようなリポソームが含まれるワクチン組成物において、約０．１ｍＭ～約２０ｍＭの範囲のモル量、約０．２ｍＭ～約１５ｍＭの範囲のモル量、約０．５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲のモル量、約０．８ｍＭ～約７ｍＭの範囲のモル量、約１ｍＭ～約５ｍＭの範囲のモル量、または約１．２ｍＭ～約２．５ｍＭの範囲のモル量で存在し得る。例示的な一実施形態では、リン脂質は、リポソームが含まれるワクチン組成物において、約１．２５ｍＭのモル量で存在し得る。
【0225】
リン脂質は、１：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８の、または約１：２０のサポニン：リン脂質の重量：重量比で、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのようなリポソームに存在し得る。
【0226】
リン脂質は、１００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１の、約１：２の、または約１：４のステロール：リン脂質の重量：重量比で、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される組合せの第１および／もしくは第２の種類のリポソームのような本開示のリポソームに存在し得る。
【0227】
抗原
一実施形態によると、本開示のリポソームは、野生型もしくは組換え抗原、またはその断片もしくはサブユニットをアジュバント処理するのに使用することができる。前記抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類、および／または複合糖質であり得る。
一実施形態によると、本開示のリポソームは、野生型もしくは組換え抗原、またはその断片もしくはサブユニットをアジュバント処理するのに使用することができる。前記抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類、および／または複合糖質であり得る。
【0228】
少なくとも２つのリポソームの組合せが実現される実施形態では、抗原は、本明細書に開示される組合せの第１および／または第２の種類のリポソームに存在し得る。
【0229】
本開示のリポソーム／抗原含有組成物は、それらの原子価で異なり得る。原子価は、組成物中の抗原性成分の数、すなわち異なる抗原の数を指す。いくつかの実施形態では、組成物は一価である。これらはまた、二価、三価、または多価の組成物のような２個以上の原子価を含む組成物であり得る。多価組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の抗原または抗原部分（例えば抗原性ペプチドなど）を含み得る。
【0230】
本開示のリポソーム／抗原含有組成物は、ワクチン組成物のような免疫原性組成物として使用して、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および寄生虫のような感染性物質との接触による感染を保護、処置、または治癒することができる。リポソーム／抗原含有組成物を使用して、がん疾患を保護、処置、または治癒することができる。
【0231】
一実施形態によると、本明細書に好適な抗原は、細菌抗原、原虫抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、または腫瘍抗原からなる群から選択することができる。
【0232】
細菌抗原
細菌抗原は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌に由来し得る。細菌抗原は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルケルラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルケルラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルケルラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルケルラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カムピュロバクテル・ジェユニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミュディア・ツラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミュドピラ・プシツタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロスツリディウム・ディフフィキレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、コリュネバクテリウム・ディプテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコククス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコククス・ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエルラ・プネウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネルラ・プネウモピラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア・モノキュトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、モラクセルラ・カタルラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の種、緑膿菌、リクケトシア・リクケトシイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネルラ・チャピムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セルラティア・マルケスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲルラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲルラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタピュロコククス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタピュロコククス・サプロピュティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコククス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコククス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、またはペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）から得ることができる。
細菌抗原は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌に由来し得る。細菌抗原は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルケルラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルケルラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルケルラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルケルラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カムピュロバクテル・ジェユニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミュディア・ツラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミュドピラ・プシツタキ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロスツリディウム・ディフフィキレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、コリュネバクテリウム・ディプテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコククス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコククス・ファエキウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、病原性大腸菌、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の種、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエルラ・プネウモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネルラ・プネウモピラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インテルロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア・モノキュトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、モラクセルラ・カタルラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の種、緑膿菌、リクケトシア・リクケトシイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネルラ・チャピムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セルラティア・マルケスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シゲルラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲルラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタピュロコククス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタピュロコククス・サプロピュティクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコククス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコククス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、またはペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）から得ることができる。
【0233】
ウイルス抗原
ウイルス抗原は、アデノウイルス；単純ヘルペス１型；単純ヘルペス２型；脳炎ウイルス、パピローマウィルス、水痘帯状疱疹ウイルス；エプスタイン－バーウイルス；ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ヒトヘルペスウイルス８型；ヒトパピローマウィルス；ＢＫウイルス；ＪＣウイルス；天然痘；ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス；ヒトボカウイルス；パルボウイルスＢ１９；ヒトアストロウイルス；ノーウォークウイルス；コクサッキーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；ポリオウイルス；ライノウイルス；重症急性呼吸器症候群ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；黄熱ウイルス；デング熱ウイルス；西ナイルウイルス；風疹ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザウイルスＡ型もしくはＢ型；グアナリトウイルス；フニンウイルス；ラッサウイルス；マチュポウイルス；サビアウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルス；エボラウイルス；マールブルグウイルス；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）；ヒトメタニューモウイルス；ヘンドラウイルス；ニパウイルス；狂犬病ウイルス；Ｄ型肝炎；ロタウイルス；オルビウイルス；コルティウイルス；ハンタウイルス、中東呼吸器コロナウイルス；ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス；チクングニアウイルス；ジカウイルス；パラインフルエンザウイルス；ヒトエンテロウイルス；ハンタウイルス；日本脳炎ウイルス；小水疱性発疹ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｘａｎｔｈｅｒｎａｖｉｒｕｓ）；東部ウマ脳炎（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｏｒ）；またはバンナウイルスから得ることができる。
ウイルス抗原は、アデノウイルス；単純ヘルペス１型；単純ヘルペス２型；脳炎ウイルス、パピローマウィルス、水痘帯状疱疹ウイルス；エプスタイン－バーウイルス；ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；ヒトヘルペスウイルス８型；ヒトパピローマウィルス；ＢＫウイルス；ＪＣウイルス；天然痘；ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス；ヒトボカウイルス；パルボウイルスＢ１９；ヒトアストロウイルス；ノーウォークウイルス；コクサッキーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；ポリオウイルス；ライノウイルス；重症急性呼吸器症候群ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；黄熱ウイルス；デング熱ウイルス；西ナイルウイルス；風疹ウイルス；Ｅ型肝炎ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；インフルエンザウイルスＡ型もしくはＢ型；グアナリトウイルス；フニンウイルス；ラッサウイルス；マチュポウイルス；サビアウイルス；クリミアコンゴ出血熱ウイルス；エボラウイルス；マールブルグウイルス；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）；ヒトメタニューモウイルス；ヘンドラウイルス；ニパウイルス；狂犬病ウイルス；Ｄ型肝炎；ロタウイルス；オルビウイルス；コルティウイルス；ハンタウイルス、中東呼吸器コロナウイルス；ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス；チクングニアウイルス；ジカウイルス；パラインフルエンザウイルス；ヒトエンテロウイルス；ハンタウイルス；日本脳炎ウイルス；小水疱性発疹ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｘａｎｔｈｅｒｎａｖｉｒｕｓ）；東部ウマ脳炎（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｏｒ）；またはバンナウイルスから得ることができる。
【0234】
一実施形態では、抗原は、インフルエンザＡもしくはインフルエンザＢのウイルスの株、またはその組合せに由来する。インフルエンザＡまたはインフルエンザＢの株は、トリ、ブタ、ウマ、イヌ、ヒト、または非ヒト霊長類に関連し得る。
【0235】
核酸は、赤血球凝集素タンパク質またはその断片をコードすることができる。赤血球凝集素タンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、またはその断片であり得る。赤血球凝集素タンパク質は、ヘッドドメイン（ＨＡ１）を含んでも含まなくてもよい。あるいは、赤血球凝集素タンパク質は、細胞質ドメインを含んでも含まなくてもよい。
【0236】
ある特定の実施形態では、赤血球凝集素タンパク質は、切断型赤血球凝集素タンパク質である。切断型赤血球凝集素タンパク質は、膜貫通ドメインの一部を含み得る。
【0237】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、およびＨ１０Ｎ８ウイルス、またはＢ株ウイルスからなる群から選択することができる。
【0238】
別の実施形態では、抗原は、ＣＭＶに由来し得る。抗原は、ＨＣＭＶに由来し得る。抗原は、五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）およびｇＢの組合せであり得る。別の実施形態では、抗原は、ＣＭＶに由来しない。抗原は、ＨＣＭＶに由来しない。抗原は、五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）およびｇＢの組合せではない。
【0239】
別の実施形態では、抗原は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１ウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、またはＭＥＲＳ－Ｃｏｖウイルスのようなコロナウイルスに由来する。
【0240】
別の実施形態では、抗原は、ＲＳＶに由来し得る。抗原は、プレＦ－フェリチンであり得る。好適な前融合ＲＳＶ Ｆ抗原は、ＷＯ２０１４／１６０４６３Ａ１またはＷＯ２０１９／１９５３１６Ａ１に開示されている。
【0241】
一実施形態では、本明細書に好適な抗原は、五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）およびｇＢの組合せのようなヒトＣＭＶ由来の抗原、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、およびインフルエンザＢ株のようなヒトインフルエンザ株由来の抗原、フェリチン部分に融合した（プレＦ）または融合していないその前融合立体配座（プレＦ－フェリチン）におけるＦ抗原のようなＲＳＶ由来の抗原であり得る。
【0242】
ＣＭＶ抗原
本開示による免疫原性組成物で使用することができるＣＭＶ抗原は、ＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原であり得る。
本開示による免疫原性組成物で使用することができるＣＭＶ抗原は、ＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原であり得る。
【0243】
例示的な一実施形態では、ＣＭＶ抗原は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に由来するので、ＨＣＭＶ抗原であり得る。
【0244】
ＣＭＶ ｇＢ抗原
本開示によるＣＭＶ ｇＢ抗原は、中和抗体を誘発する全長ｇＢポリペプチドまたはｇＢ由来のポリペプチドであり得る。ｇＢ由来のポリペプチドは、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換のようないくつかの修飾をもたらし、ＣＭＶに対して中和抗体を依然として誘発する全長ｇＢから得られるポリペプチドである。ｇＢ由来のポリペプチドの例として、例えばフリン部位において、切断型ｇＢ抗原および／またはいくつかのアミノ酸置換を含有する突然変異したｇＢ抗原を挙げることができる。切断型ｇＢとは、本明細書に開示される場合、膜貫通領域のような、１つまたは複数の領域またはドメインが、全てまたは一部で欠失しているｇＢを指す。
本開示によるＣＭＶ ｇＢ抗原は、中和抗体を誘発する全長ｇＢポリペプチドまたはｇＢ由来のポリペプチドであり得る。ｇＢ由来のポリペプチドは、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換のようないくつかの修飾をもたらし、ＣＭＶに対して中和抗体を依然として誘発する全長ｇＢから得られるポリペプチドである。ｇＢ由来のポリペプチドの例として、例えばフリン部位において、切断型ｇＢ抗原および／またはいくつかのアミノ酸置換を含有する突然変異したｇＢ抗原を挙げることができる。切断型ｇＢとは、本明細書に開示される場合、膜貫通領域のような、１つまたは複数の領域またはドメインが、全てまたは一部で欠失しているｇＢを指す。
【0245】
ｇＢポリペプチドは、ＣＭＶゲノムのＵＬ５５遺伝子によりコードされる。ｇＢ（またはｇｐ１３０）の天然形態のサイズは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のサイズに依存し、考えられる株によって異なり得る。例えば、２７１７ｂｐ長であるＡＤ１６９株のＯＲＦは、９０６個のアミノ酸の全長ｇＢをコードし、Ｔｏｗｎｅ株のＯＲＦは、９０７個のアミノ酸の天然ｇＢをコードする。これら２つの株のタンパク質配列は、ＵＳ２００２／０１０２５６２に記載され、その全体を参照によって組み入れる。ｇＢの天然形態は、アミノ酸２６～７０６または７０７にわたる細胞外ドメインまたは外部ドメインが続く、２２～２５アミノ酸長であり得、膜近位領域（アミノ酸７０７または７０８～７５０）および膜貫通ドメイン（アミノ酸７５０または７５１～７７２）が続き、次いでアミノ酸７７２または７７３～９０６または９０７にわたる細胞内ドメインで終結している、残基アルギニン４５９（またはＴｏｗｎｅ株の４６０、番号付けは株によって異なり得る）とセリン４６０（またはＴｏｗｎｅ株の４６１、番号付けは株によって異なり得る）との間の切断をもたらす内部タンパク質分解性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断部位（フリン部位、ＲＴＲＲ、ＡＤ１６９株の残基４５６～４５９、またはＴｏｗｎｅ株のＲＴＫＲ）を含有する、アミノ酸のシグナル配列を含有する（Ｓｈａｒｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１３年；４３５（２）：２３９～２４９頁およびＢｕｒｋｅら、ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎ．２０１５年；１１（１０）：ｅ１００５２２７）。一旦プロセシングされると、全長ｇＢは、感染した細胞で起こる翻訳後機構の結果としてアミノ酸のシグナル配列から欠失する。本開示の目的のための全長ｇＢ抗原の例は、ＣＭＶ株であるＴｏｗｎｅおよびＡＤ１６９の全長ｇＢの両方、ならびに他の同等の株を包含する。中和抗体を含むいくつかの抗原ドメイン（ＡＤ）は、ｇＢポリペプチド配列に記載されている。抗原ドメインの例として、アミノ酸残基４６１から６８０に伸びるドメインを挙げることができる。このドメインは、２つの連続しないドメイン、残基４６１から６１９に伸びる第１のドメインおよび残基６２０から６８０に伸びる第２のドメインに細分化することができる（ＵＳ５，５４７，８３４）。同定した他の抗原ドメインとして、アミノ酸残基５６０～６４０（Ｓｃｈｏｐｐｅｌ Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６年、２１６：１３３～４５頁）に位置する抗原ドメイン１（ＡＤ－１）、またはアミノ酸残基６５～８４（Ａｘｅｌｓｓｏｎ Ｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７、２６：４１～６頁）もしくはアミノ酸残基２７～８４（Ｂｕｒｋｅ ＨＧら、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１５年、１１（１０）：ｅ１００５２２７）に位置する抗原ドメイン２（ＡＤ－２）を引用することができる。その結果、その配列に上で引用した抗原ドメインの１つまたはいくつかに相同である配列を含むポリペプチドもまた、本開示の目的に好適であり得る。用語「に相同である配列」とは、ＴｏｗｎｅまたはＡＤ１６９株に由来する天然ｇＢとみなされる抗原ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性があるアミノ酸配列を意味することを意図する（ＵＳ２００２／０１０２５６２に記載）。典型的には、配列相同性は、少なくとも９０％の配列同一性に基づき、さらにより具体的には、配列相同性は、完全（１００％の配列同一性）である。
【0246】
本明細書で使用される場合、第２の配列と少なくともｘ％の同一性を有する第１の配列は、ｘ％が、第２のアミノ酸配列の総長に対して、両方の配列がグローバルアライメントを介して最適に並べられている場合、第２の配列のそれらの一致するアミノ酸と同一である第１の配列におけるアミノ酸の数を表すことを意味する。両方の配列は、ｘが最大である場合、最適に並べられている。アライメントおよび同一性の百分率の決定は、グローバルアライメントアルゴリズム、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、４８、４４３～４５３頁（１９７０）に記載のＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して、例えば、ポリペプチド配列比較に対する以下のパラメータ：比較マトリクス：ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９、１０９１５～１０９１９頁（１９９２）由来のＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップペナルティ：８、およびギャップ長ペナルティ：２；ならびにポリヌクレオチド配列比較に対する以下のパラメータ：比較マトリクス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０、およびギャップ長ペナルティ：３で、手動または自動的に実行することができる。
【0247】
上記のパラメータで使用することができるプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ＷＩ製の「ギャップ」プログラムとして公的に利用可能である。前述のパラメータは、ペプチド比較（エンドギャップに対するペナルティなしで）および核酸比較に対するそれぞれのデフォルトのパラメータである。
【0248】
本開示の目的に有用なｇＢ由来のポリペプチドの中で、ＵＳ５，５４７，８３４に記載されるｇｐ５５を挙げることができる。これは、内部タンパク質分解性切断部位でｇＢの切断に由来し；そのアミノ酸配列は、セリン残基４６１からＣ末端に伸びる配列に対応する。膜貫通配列の全てまたは一部および細胞内Ｃ末端ドメインの全てまたは一部から欠失したｇｐ５５のような、ｇｐ５５の切断型もまた使用することができる。このようなｇＢ切断型抗原の例は、残基４６１～６４６の範囲のｇＢまたは細胞内Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部の欠失したｇｐ５５のアミノ酸配列に相同である配列を有するペプチド、例えば残基４６１～６８０の範囲のｇＢのアミノ酸配列に相同である配列を有するペプチドであり得る。ｇｐ５５のこのような切断型もまた、ＵＳ５，５４７，８３４に記載され、その全体を参照によって組み入れる。
【0249】
内部タンパク質分解性切断部位で１つまたはいくつかのアミノ酸置換を担持し得る全長ｇＢの突然変異型も使用し、後者を効果的でないようにすることができる。例示的な実施形態として、アミノ酸置換は、ｇｐ１３０の配列の残基４５７～４６０、例えばアルギニン４６０および／またはリジン４５９および／またはアルギニン４５７に位置することができる。全長ｇＢのこのような突然変異型は、中和抗体に対する標的である全てのドメインを含む全体の細胞外ドメインを担持し得る。このような突然変異型は、組換えタンパク質として生産される場合の宿主におけるその分泌およびその容易な下流の精製を可能にするために、膜貫通配列の全てもしくは一部（ａａ７５２から７７３に伸びる）および／または細胞内Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部（ａａ７７４から９０７に伸びる）から二次的に切断される。このようなｇＢ誘導体は、中和抗体を標的とする実質的に全てのドメインが保存されている限り、有用である。
【0250】
例示的な一実施形態では、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、全長ＣＭＶ ｇＢ抗原、膜貫通ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての膜貫通ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、細胞内ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての細胞内ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方から実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原からなる群で選択することができる。
【0251】
別の実施形態では、先行するものと組み合わせてまたは組み合わせないで、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、内部タンパク質分解性切断部位におけるアミノ酸置換のような１つまたはいくつかの突然変異を含み得る。
【0252】
表現「全ての細胞内ドメインから実質的に欠失している」または「全ての膜貫通ドメインから実質的に欠失している」とは、前記ドメインのアミノ酸配列の少なくとも８０％が欠失していることを意味する。したがって、所与のドメインの全てから実質的に欠失した切断型ｇＢ抗原は、前記ドメイン、例えば細胞内ドメインの配列の長さの０％～約２０％、例えば約５％～約１０％を含み得る。
【0253】
本明細書で開示される通り、「ドメインの少なくとも一部の欠失した」とは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％であるが、８０％未満のドメインの欠失したことを意味する。したがって、所与のドメインの少なくとも一部から欠失した切断型ｇＢ抗原は、前記ドメイン、例えば膜貫通ドメインの配列の長さのおよそ約２０％～約９５％、例えば約３０％～約９０％、例えば約４０％～約６０％、または例えば５０％を含み得る。
【0254】
一実施形態では、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、ｇＢポリペプチド、すなわち近位膜ドメインを含む可能性のある全ての膜貫通配列から、および全ての細胞内Ｃ末端ドメインから欠失した全長ｇＢの外部ドメインからなる。「外部ドメイン」は、膜を超えて細胞外間隙に伸びる膜貫通アンカータンパク質の一部である。例えば、ＡＤ１６９株由来の全長ｇＢポリペプチドの外部ドメインは、アミノ酸２６からアミノ酸７０７にわたっている。
【0255】
本明細書に開示されるＣＭＶ ｇＢ抗原はまた、他の突然変異および／または欠失および／または付加を含有し得る。例えば、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、ＥＰ２６２７３５２に記載される細胞外ドメインに位置する融合ループ１（ＦＬ１）ドメインおよび融合ループ２（ＦＬ２）ドメインの少なくとも１つにおいて少なくとも１つのアミノ酸欠失または置換を含有し得る。あるいは、または加えて、ＥＰ２６２７３５２に記載されるリーダー配列の少なくとも一部の欠失を含有し得る。本明細書に開示されるＣＭＶ ｇＢ抗原はまた、ＷＯ２０１６／０９２４６０に記載される疎水性表面１（アミノ酸残基１５４～１６０および２３６～２４３からなるドメイン）内のグリコシル化部位を導入する突然変異を含み得る。このようなグリコシル化部位は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ／Ｃモチーフを含むＮ－グリコシル化部位であり得、Ｘは、任意のアミノ酸残基（通常プロリンではない）であり得る。ＣＭＶ ｇＢ抗原は、グリコシル化部位を導入する突然変異を含み得る。このような実施形態では、グリコシル化部位は、ＷＯ２０１６／０９２４６０に記載される通り、（１）疎水性表面２（アミノ酸残基１４５～１６７および２３０～２５２からなるドメイン）内で；または（２）融合ループ１（ＦＬ１）（アミノ酸残基１５５～１５７からなるドメイン）および／もしくは融合ループ２（ＦＬ２）（アミノ酸残基２４０～２４２）から２０オングストローム以内である残基であり得る。
【0256】
別の実施形態では、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、ＷＯ２０１６／０９２４６０に記載される通り、Ｃ末端で少なくとも１２の残基長であり得る異種配列を含み得る。このような実施形態では、ｇＢタンパク質は、異種配列が外部ドメインのＣ末端で融合し得る融合タンパク質であり得る。
【0257】
ＣＭＶ ｇＢは、関連するウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ｇＢおよびエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ｇＢにおけるｇＢタンパク質の３Ｄ結晶学的構造に基づいてホモ三量体として組み立てると推測され、これらは、ホモ三量体である（Ｈｅｌｄｗｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、３１３：２１７～２２０頁；Ｂａｃｋｏｖｉｃら、ＰＮＡＳ、２００９年、１０６（８）：２８８０～２８８５頁）。本明細書に開示されるＣＭＶ ｇＢ抗原は、三量体形態、および／または六量体形態（三量体形態の二量体）、および／または十二量体形態（六量体の二量体）であり得る。例えば、本明細書に開示される免疫原性組成物のＣＭＶ ｇＢ抗原は、単量体形態では実質的にあり得ない。表現「単量体形態では実質的にない」とは、ＣＭＶ ｇＢ抗原の２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満が単量体形態であり得ることを意味する。
【0258】
一実施形態によると、ｇＢ抗原は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。例えば、前記ｇＢ抗原は、配列番号１：
ＳＴＲＧＴＳＡＴＨＳＨＨＳＳＨＴＴＳＡＡＨＳＲＳＧＳＶＳＱＲＶＴＳＳＱＴＶＳＨＧＶＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＨＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＳＨＳＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＡＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＭＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＶＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＤＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＳＡＬＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＴＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＬＴＨＮＴＴＱＴＳＴＤＧＮＮＡＴＨＬＳＮＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＲＬＣＭＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＮＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＶＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ
と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＳＴＲＧＴＳＡＴＨＳＨＨＳＳＨＴＴＳＡＡＨＳＲＳＧＳＶＳＱＲＶＴＳＳＱＴＶＳＨＧＶＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＨＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＳＨＳＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＡＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＭＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＶＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＤＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＳＡＬＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＴＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＬＴＨＮＴＴＱＴＳＴＤＧＮＮＡＴＨＬＳＮＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＲＬＣＭＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＮＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＶＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ
と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0259】
例示的な一実施形態では、ｇＢ抗原は、配列番号１と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0260】
本開示に好適なＣＭＶ ｇＢ抗原は、Ｃ末端ドメインの全てもしくは一部および／または膜貫通配列の全てもしくは一部を除去し、切断部位が効果的ではない全長ｇＢから得られる切断型ｇＢポリペプチドであり得る。このようなｇＢの例示的な切断形態は、ｇＢｄＴＭを呼ばれる、ＵＳ６，１００，０６４に記載されるものであり得、その全体を参照によって組み入れる。ＵＳ６，１００，０６４において、ｇＢのシグナル配列は、２４アミノ酸長であると仮定した。実際に、シグナル配列は、２５アミノ酸長である。したがって、ＵＳ６，１００，０６４で示されたｇＢのアミノ酸の番号付けは、１だけシフトすべきである。これを考慮すると、ＵＳ６，１００，０６４に記載されるｇＢｄＴＭは、細胞外ドメインが細胞質ドメインに直接接続するように、切断部位での３つの突然変異：アルギニン４３２はトレオニンで置換され、リジン４３４はグルタミンで置換され、アルギニン４３５はトレオニンで置換される（番号変更した位置を考慮し、シグナル配列を計数しない）；ならびに、アミノ酸残基バリン６７６とアルギニン７５１との間の膜貫通領域における欠失（番号変更した位置を考慮する）を有する。このようなｇＢ抗原は、分泌型でこの生成物を発現する組換え細胞で生産される場合、より容易に精製される。得られる形態は、ｇＢ Ｔｏｗｎｅ株に由来する場合、そのシグナル配列およびその膜貫通領域の欠失した８０６アミノ酸長のポリペプチドである。例示的な一実施形態では、ｇＢ抗原は、本明細書に開示される通り、ｇＢｄＴＭであり得る。
【0261】
本明細書に記載されるＣＭＶ ｇＢ抗原は、当業者に周知の任意の方法によって製造することができる。このような方法は、固相（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５（１４）、２１４９～２１５４頁（１９６３））または液相での従来の化学合成法、構成型アミノ酸もしくはその誘導体からの酵素的合成法（Ｋ．Ｍｏｒｉｈａｒａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５（６）、１６４～１７０頁（１９８７））、無細胞タンパク質合成法（Ｋａｔｚｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（３）、１５０～１５６頁（２００５））、ならびに組換え技術による生物学的生産法を含み得る。
【0262】
例えば、ＣＭＶ ｇＢ抗原は、組換え宿主細胞での生物学的生産方法を使用して得ることができる。このような方法では、本明細書に記載されるＣＭＶ ｇＢ抗原をコードする核酸を含有する発現カセットは宿主細胞に移されるが、これは、対応するタンパク質の発現を可能にする条件下で培養される。次いで、これにより生成されるタンパク質を回収し、精製することができる。タンパク質を精製するための方法は、当業者に周知されている。得られる組換えタンパク質は、分画化、クロマトグラフィー法、特異的なモノまたはポリクローナル抗体を使用する免疫親和法などのような、個別にまたは組み合わせて使用した方法により、溶解物および細胞抽出物または培養媒体の上清から精製することができる。一実施形態では、得られる組換えタンパク質は、培養媒体の上清から精製することができる。ＣＭＶ ｇＢ抗原は、通常、組換えＤＮＡ技術により得られ、当業者に周知の方法によって精製される。ＵＳ６，１００，０６４およびＵＳ２００２／０１０２５６２に記載される方法は、その全体を参照によって組み入れるが、例えば使用することができる。
【0263】
例えば、本明細書に開示されるＣＭＶ ｇＢ抗原は、組換え糖タンパク質であり得るが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養において生成することができる。ＣＭＶのＴｏｗｎｅ株由来のｇＢ遺伝子は、ＵＳ６，１００，０６４に記載される細胞培養における分泌を促進するために、突然変異を起こして、切断部位および分子の膜貫通部を取り除くことができる。分泌分子は、１９個の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を保持する８０６個のアミノ酸のペプチドであり得、ｇＢｄＴｍとも呼ばれる。精製方法は、親和性およびイオン交換クロマトグラフィーの工程に関与し得る。
【0264】
ＣＭＶ ｇＢ抗原は、免疫学的に活性な量、すなわち対象のレシピエントにおいて免疫応答を誘発するのに好適な量で組成物中に存在し得る。本開示に好適なｇＢ抗原の免疫学的に活性な量の例として、約１μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌ、または約２０μｇ／ｍｌ～約３５０μｇ／ｍｌ、または約４０μｇ／ｍｌ～約３００μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌ～約２８０μｇ／ｍｌ、または約８０μｇ／ｍｌ～約２４０μｇ／ｍｌの範囲の量を引用することができる。
【0265】
ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原
本明細書に開示される免疫原性組成物の別の抗原は、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原である。
本明細書に開示される免疫原性組成物の別の抗原は、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原である。
【0266】
このような五量体複合体は、５つの成分の中でジスルフィド結合および非共有結合の相互作用を通して組み立てられて、立体配座エピトープを提示することができる機能的複合体を形成する（Ｃｉｆｅｒｒｉら、ＰＮＡＳ、２０１５年、１１２（６）：１７６７～１７７２頁；Ｗｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０１４年、３２（３０）：３７９６～３８０４頁）。
【0267】
本開示に好適な五量体複合体は、容易に記載され、当業者に知られている。例えば、このような五量体複合体は、Ｒｙｃｋｍａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００８年１月、６０～７０頁）および特許出願ＷＯ２０１４／００５９５９またはＷＯ２０１９／０５２９７５に記載される。
【0268】
ｇＨ抗原
ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体は、修飾されたＣＭＶ ｇＨポリペプチドを含み得る。修飾されたＣＭＶ ｇＨポリペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインの少なくとも一部から欠失し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたｇＨポリペプチドは、ＴＭドメインの一部を保持するが、脂質二重層にタンパク質をとどめるのに十分ではない。例示的な一実施形態では、ｇＨポリペプチドは、実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失し得る。例示的な別の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、ＴＭドメインの全てから欠失し得る。
ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体は、修飾されたＣＭＶ ｇＨポリペプチドを含み得る。修飾されたＣＭＶ ｇＨポリペプチドは、膜貫通（ＴＭ）ドメインの少なくとも一部から欠失し得る。いくつかの実施形態では、修飾されたｇＨポリペプチドは、ＴＭドメインの一部を保持するが、脂質二重層にタンパク質をとどめるのに十分ではない。例示的な一実施形態では、ｇＨポリペプチドは、実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失し得る。例示的な別の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、ＴＭドメインの全てから欠失し得る。
【0269】
一実施形態では、ＣＭＶ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）ポリペプチドは、ｇＨ ＴＭドメインの最大で１０個のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸）を含有し得る。別の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、ｇＨ ＴＭドメインの１０個以下のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸）を含有し得る。
【0270】
一実施形態では、ｇＨ抗原は、膜貫通ドメインの少なくとも一部または実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失し得る。
【0271】
本発明の文脈では、「ドメインの少なくとも一部の欠失した」とは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％であるが、８０％未満のドメインの欠失したことを意味する。したがって、所与のドメインの少なくとも一部から欠失した切断型ｇＨ抗原は、前記ドメイン、例えば膜貫通ドメインの配列の長さのおよそ約２０％～約９５％、例えば約３０％～約９０％、例えば約４０％～約６０％、または例えば５０％を含み得る。
【0272】
表現「実質的に全ての細胞内ドメインから欠失している」または「実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失している」とは、対応するドメインのアミノ酸配列の少なくとも８０％が欠失していることを意味する。したがって、所与のドメインの全てから実質的に欠失した切断型ｇＨ抗原は、ドメイン、例えば膜貫通ドメインの配列の長さの０％～約２０％、例えば約５％～約１０％を含み得る。
【0273】
あるいは、またはＴＭドメインの少なくとも一部、実質的に全て、もしくは全てから欠失していることに加えて、ｇＨポリペプチドは、ＣＭＶ ｇＨの細胞内ドメインの一部、実質的に全て、または全てから欠失し得る。
【0274】
一実施形態では、ｇＨ抗原は、ＣＭＶ ｇＨの細胞内ドメインの一部から欠失し得る。別の実施形態では、ｇＨ抗原は、実質的に全ての細胞内ドメインから欠失し得る。別の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、全ての細胞内ドメインから欠失し得る。
【0275】
一実施形態では、ｇＨポリペプチドは、全てのＴＭドメインおよび全ての細胞内ドメインから欠失し得る。
【0276】
一実施形態では、ｇＨ抗原は、ＣＭＶ ＵＬ７５遺伝子でコードした全長ｇＨポリペプチドの外部ドメインを含む、またはからなる。
【0277】
ＵＬ７５遺伝子でコードしたｇＨ抗原は、感染性に不可欠であり、アルファ、ベータおよびガンマヘルペスウイルスのメンバー間で保存されている、ビリオン糖タンパク質である。これは、ｇＬとの安定な複合体を形成し、この複合体の形成により、ｇＨの細胞表面の発現は促進される。ＨＳＶ－２およびＥＢＶ ｇＨ／ｇＬ複合体の結晶構造に基づいて、ｇＬユニットおよびｇＨのＮ末端残基は、構造の一端（「頭部」）で球状ドメインを形成するが、これは、ｇＢとの相互作用および膜融合の活性化に関係している。ウイルス膜（「尾部」）に近位のｇＨのＣ末端ドメインもまた、膜融合に関係している。
【0278】
一実施形態では、本明細書に記載される五量体複合体におけるｇＨポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。別の実施形態では、ｇＨ抗原は、配列番号２：
ＲＹＧＡＥＡＶＳＥＰＬＤＫＡＦＨＬＬＬＮＴＹＧＲＰＩＲＦＬＲＥＮＴＴＱＣＴＹＮＮＳＬＲＮＳＴＶＶＲＥＮＡＩＳＦＮＦＦＱＳＹＮＱＹＹＶＦＨＭＰＲＣＬＦＡＧＰＬＡＥＱＦＬＮＱＶＤＬＴＥＴＬＥＲＹＱＱＲＬＮＴＹＡＬＶＳＫＤＬＡＳＹＲＳＦＳＱＱＬＫＡＱＤＳＬＧＥＱＰＴＴＶＰＰＰＩＤＬＳＩＰＨＶＷＭＰＰＱＴＴＰＨＧＷＴＥＳＨＴＴＳＧＬＨＲＰＨＦＮＱＴＣＩＬＦＤＧＨＤＬＬＦＳＴＶＴＰＣＬＨＱＧＦＹＬＩＤＥＬＲＹＶＫＩＴＬＴＥＤＦＦＶＶＴＶＳＩＤＤＤＴＰＭＬＬＩＦＧＨＬＰＲＶＬＦＫＡＰＹＱＲＤＮＦＩＬＲＱＴＥＫＨＥＬＬＶＬＶＫＫＤＱＬＮＲＨＳＹＬＫＤＰＤＦＬＤＡＡＬＤＦＮＹＬＤＬＳＡＬＬＲＮＳＦＨＲＹＡＶＤＶＬＫＳＧＲＣＱＭＬＤＲＲＴＶＥＭＡＦＡＹＡＬＡＬＦＡＡＡＲＱＥＥＡＧＡＱＶＳＶＰＲＡＬＤＲＱＡＡＬＬＱＩＱＥＦＭＩＴＣＬＳＱＴＰＰＲＴＴＬＬＬＹＰＴＡＶＤＬＡＫＲＡＬＷＴＰＮＱＩＴＤＩＴＳＬＶＲＬＶＹＩＬＳＫＱＮＱＱＨＬＩＰＱＷＡＬＲＱＩＡＤＦＡＬＫＬＨＫＴＨＬＡＳＦＬＳＡＦＡＲＱＥＬＹＬＭＧＳＬＶＨＳＭＬＶＨＴＴＥＲＲＥＩＦＩＶＥＴＧＬＣＳＬＡＥＬＳＨＦＴＱＬＬＡＨＰＨＨＥＹＬＳＤＬＹＴＰＣＳＳＳＧＲＲＤＨＳＬＥＲＬＴＲＬＦＰＤＡＴＶＰＡＴＶＰＡＡＬＳＩＬＳＴＭＱＰＳＴＬＥＴＦＰＤＬＦＣＬＰＬＧＥＳＦＳＡＬＴＶＳＥＨＶＳＹＶＶＴＮＱＹＬＩＫＧＩＳＹＰＶＳＴＴＶＶＧＱＳＬＩＩＴＱＴＤＳＱＴＫＣＥＬＴＲＮＭＨＴＴＨＳＩＴＡＡＬＮＩＳＬＥＮＣＡＦＣＱＳＡＬＬＥＹＤＤＴＱＧＶＩＮＩＭＹＭＨＤＳＤＤＶＬＦＡＬＤＰＹＮＥＶＶＶＳＳＰＲＴＨＹＬＭＬＬＫＮＧＴＶＬＥＶＴＤＶＶＶＤＡＴＤＳＲ
と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
ＲＹＧＡＥＡＶＳＥＰＬＤＫＡＦＨＬＬＬＮＴＹＧＲＰＩＲＦＬＲＥＮＴＴＱＣＴＹＮＮＳＬＲＮＳＴＶＶＲＥＮＡＩＳＦＮＦＦＱＳＹＮＱＹＹＶＦＨＭＰＲＣＬＦＡＧＰＬＡＥＱＦＬＮＱＶＤＬＴＥＴＬＥＲＹＱＱＲＬＮＴＹＡＬＶＳＫＤＬＡＳＹＲＳＦＳＱＱＬＫＡＱＤＳＬＧＥＱＰＴＴＶＰＰＰＩＤＬＳＩＰＨＶＷＭＰＰＱＴＴＰＨＧＷＴＥＳＨＴＴＳＧＬＨＲＰＨＦＮＱＴＣＩＬＦＤＧＨＤＬＬＦＳＴＶＴＰＣＬＨＱＧＦＹＬＩＤＥＬＲＹＶＫＩＴＬＴＥＤＦＦＶＶＴＶＳＩＤＤＤＴＰＭＬＬＩＦＧＨＬＰＲＶＬＦＫＡＰＹＱＲＤＮＦＩＬＲＱＴＥＫＨＥＬＬＶＬＶＫＫＤＱＬＮＲＨＳＹＬＫＤＰＤＦＬＤＡＡＬＤＦＮＹＬＤＬＳＡＬＬＲＮＳＦＨＲＹＡＶＤＶＬＫＳＧＲＣＱＭＬＤＲＲＴＶＥＭＡＦＡＹＡＬＡＬＦＡＡＡＲＱＥＥＡＧＡＱＶＳＶＰＲＡＬＤＲＱＡＡＬＬＱＩＱＥＦＭＩＴＣＬＳＱＴＰＰＲＴＴＬＬＬＹＰＴＡＶＤＬＡＫＲＡＬＷＴＰＮＱＩＴＤＩＴＳＬＶＲＬＶＹＩＬＳＫＱＮＱＱＨＬＩＰＱＷＡＬＲＱＩＡＤＦＡＬＫＬＨＫＴＨＬＡＳＦＬＳＡＦＡＲＱＥＬＹＬＭＧＳＬＶＨＳＭＬＶＨＴＴＥＲＲＥＩＦＩＶＥＴＧＬＣＳＬＡＥＬＳＨＦＴＱＬＬＡＨＰＨＨＥＹＬＳＤＬＹＴＰＣＳＳＳＧＲＲＤＨＳＬＥＲＬＴＲＬＦＰＤＡＴＶＰＡＴＶＰＡＡＬＳＩＬＳＴＭＱＰＳＴＬＥＴＦＰＤＬＦＣＬＰＬＧＥＳＦＳＡＬＴＶＳＥＨＶＳＹＶＶＴＮＱＹＬＩＫＧＩＳＹＰＶＳＴＴＶＶＧＱＳＬＩＩＴＱＴＤＳＱＴＫＣＥＬＴＲＮＭＨＴＴＨＳＩＴＡＡＬＮＩＳＬＥＮＣＡＦＣＱＳＡＬＬＥＹＤＤＴＱＧＶＩＮＩＭＹＭＨＤＳＤＤＶＬＦＡＬＤＰＹＮＥＶＶＶＳＳＰＲＴＨＹＬＭＬＬＫＮＧＴＶＬＥＶＴＤＶＶＶＤＡＴＤＳＲ
と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0279】
別の実施形態では、ｇＨポリペプチドは、配列番号２と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0280】
ｇＬ抗原
ＣＭＶ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）は、ＵＬ１１５遺伝子でコードした。ｇＬ抗原は、ウイルス複製に不可欠であると考えられ、ｇＬの全ての公知の機能的特性は、ｇＨとのその二量化に直接関連する。ｇＬ／ｇＨ複合体は、宿主細胞へのウイルスの侵入をもたらすウイルスおよび原形質膜の融合に必要である。
ＣＭＶ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）は、ＵＬ１１５遺伝子でコードした。ｇＬ抗原は、ウイルス複製に不可欠であると考えられ、ｇＬの全ての公知の機能的特性は、ｇＨとのその二量化に直接関連する。ｇＬ／ｇＨ複合体は、宿主細胞へのウイルスの侵入をもたらすウイルスおよび原形質膜の融合に必要である。
【0281】
一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体のｇＬポリペプチドは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。別の実施形態では、ｇＬ抗原は、配列番号３と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、からなる。
【0282】
例示的な一実施形態では、ｇＬポリペプチドは、配列番号３：
ＡＡＶＳＶＡＰＴＡＡＥＫＶＰＡＥＣＰＥＬＴＲＲＣＬＬＧＥＶＦＱＧＤＫＹＥＳＷＬＲＰＬＶＮＶＴＧＲＤＧＰＬＳＱＬＩＲＹＲＰＶＴＰＥＡＡＮＳＶＬＬＤＥＡＦＬＤＴＬＡＬＬＹＮＮＰＤＱＬＲＡＬＬＴＬＬＳＳＤＴＡＰＲＷＭＴＶＭＲＧＹＳＥＣＧＤＧＳＰＡＶＹＴＣＶＤＤＬＣＲＧＹＤＬＴＲＬＳＹＥＲＳＩＦＴＥＨＶＬＧＦＥＬＶＰＰＳＬＦＮＶＶＶＡＩＲＮＥＡＴＲＴＮＲＡＶＲＬＰＶＳＴＡＡＡＰＥＧＩＴＬＦＹＧＬＹＮＡＶＫＥＦＣＬＲＨＱＬＤＰＰＬＬＲＨＬＤＫＹＹＡＧＬＰＰＥＬＫＱＴＲＶＮＬＰＡＨＳＲＹＧＰＱＡＶＤＡＲ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
ＡＡＶＳＶＡＰＴＡＡＥＫＶＰＡＥＣＰＥＬＴＲＲＣＬＬＧＥＶＦＱＧＤＫＹＥＳＷＬＲＰＬＶＮＶＴＧＲＤＧＰＬＳＱＬＩＲＹＲＰＶＴＰＥＡＡＮＳＶＬＬＤＥＡＦＬＤＴＬＡＬＬＹＮＮＰＤＱＬＲＡＬＬＴＬＬＳＳＤＴＡＰＲＷＭＴＶＭＲＧＹＳＥＣＧＤＧＳＰＡＶＹＴＣＶＤＤＬＣＲＧＹＤＬＴＲＬＳＹＥＲＳＩＦＴＥＨＶＬＧＦＥＬＶＰＰＳＬＦＮＶＶＶＡＩＲＮＥＡＴＲＴＮＲＡＶＲＬＰＶＳＴＡＡＡＰＥＧＩＴＬＦＹＧＬＹＮＡＶＫＥＦＣＬＲＨＱＬＤＰＰＬＬＲＨＬＤＫＹＹＡＧＬＰＰＥＬＫＱＴＲＶＮＬＰＡＨＳＲＹＧＰＱＡＶＤＡＲ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0283】
ＵＬ１２８抗原
一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体におけるＵＬ１２８ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。一実施形態では、ＵＬ１２８抗原は、配列番号４と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体におけるＵＬ１２８ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。一実施形態では、ＵＬ１２８抗原は、配列番号４と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0284】
例示的な一実施形態では、ＵＬ１２８ポリペプチドは、配列番号４：
ＥＥＣＣＥＦＩＮＶＮＨＰＰＥＲＣＹＤＦＫＭＣＮＲＦＴＶＡＬＲＣＰＤＧＥＶＣＹＳＰＥＫＴＡＥＩＲＧＩＶＴＴＭＴＨＳＬＴＲＱＶＶＨＮＫＬＴＳＣＮＹＮＰＬＹＬＥＡＤＧＲＩＲＣＧＫＶＮＤＫＡＱＹＬＬＧＡＡＧＳＶＰＹＲＷＩＮＬＥＹＤＫＩＴＲＩＶＧＬＤＱＹＬＥＳＶＫＫＨＫＲＬＤＶＣＲＡＫＭＧＹＭＬＱ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
ＥＥＣＣＥＦＩＮＶＮＨＰＰＥＲＣＹＤＦＫＭＣＮＲＦＴＶＡＬＲＣＰＤＧＥＶＣＹＳＰＥＫＴＡＥＩＲＧＩＶＴＴＭＴＨＳＬＴＲＱＶＶＨＮＫＬＴＳＣＮＹＮＰＬＹＬＥＡＤＧＲＩＲＣＧＫＶＮＤＫＡＱＹＬＬＧＡＡＧＳＶＰＹＲＷＩＮＬＥＹＤＫＩＴＲＩＶＧＬＤＱＹＬＥＳＶＫＫＨＫＲＬＤＶＣＲＡＫＭＧＹＭＬＱ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0285】
ＵＬ１３０抗原
ＵＬ１３０は、ＵＬ１３１Ａ－１２８遺伝子座の中心で最大の（２１４個のコドン）遺伝子である。遺伝子の概念翻訳により、推定ケモカインドメイン（アミノ酸４６～１２０）内の２つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ８５およびＡｓｎ１１８）、ならびに唯一のＣ末端領域の末端に近い追加のグリコシル化部位（Ａｓｎ２０１）を含有する親水性タンパク質に先行する長い（２５個のアミノ酸の）Ｎ末端シグナル配列が予測される。ＵＬ１３０は、ＴＭドメインを有していないことが予測される。
ＵＬ１３０は、ＵＬ１３１Ａ－１２８遺伝子座の中心で最大の（２１４個のコドン）遺伝子である。遺伝子の概念翻訳により、推定ケモカインドメイン（アミノ酸４６～１２０）内の２つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ８５およびＡｓｎ１１８）、ならびに唯一のＣ末端領域の末端に近い追加のグリコシル化部位（Ａｓｎ２０１）を含有する親水性タンパク質に先行する長い（２５個のアミノ酸の）Ｎ末端シグナル配列が予測される。ＵＬ１３０は、ＴＭドメインを有していないことが予測される。
【0286】
感染した細胞から非効率的に分泌されるが、ゴルジ成熟した形態としてビリオンエンベロープに組み入れられるルミナール糖タンパク質であることが報告されている（Ｐａｔｒｏｎｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７９（２００５）：８３６１～８３７３頁）。
【0287】
一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体におけるＵＬ１３０ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。一実施形態では、ＵＬ１３０抗原は、配列番号５と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0288】
例示的な一実施形態では、ＵＬ１３０ポリペプチドは、配列番号５：
ＳＰＷＳＴＬＴＡＮＱＮＰＳＰＬＷＳＫＬＴＹＳＫＰＨＤＡＡＴＦＹＣＰＦＩＹＰＳＰＰＲＳＰＬＱＦＳＧＦＱＲＶＬＴＧＰＥＣＲＮＥＴＬＹＬＬＹＮＲＥＧＱＴＬＶＥＲＳＳＴＷＶＫＫＶＩＷＹＬＳＧＲＮＱＴＩＬＱＲＭＰＲＴＡＳＫＰＳＤＧＮＶＱＩＳＶＥＤＡＫＩＦＧＡＨＭＶＰＫＱＴＫＬＬＲＦＶＶＮＤＧＴＲＹＱＭＣＶＭＫＬＥＳＷＡＨＶＦＲＤＹＳＶＳＦＱＶＲＬＴＦＴＥＡＮＮＱＴＹＴＦＣＴＨＰＮＬＩＶ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
ＳＰＷＳＴＬＴＡＮＱＮＰＳＰＬＷＳＫＬＴＹＳＫＰＨＤＡＡＴＦＹＣＰＦＩＹＰＳＰＰＲＳＰＬＱＦＳＧＦＱＲＶＬＴＧＰＥＣＲＮＥＴＬＹＬＬＹＮＲＥＧＱＴＬＶＥＲＳＳＴＷＶＫＫＶＩＷＹＬＳＧＲＮＱＴＩＬＱＲＭＰＲＴＡＳＫＰＳＤＧＮＶＱＩＳＶＥＤＡＫＩＦＧＡＨＭＶＰＫＱＴＫＬＬＲＦＶＶＮＤＧＴＲＹＱＭＣＶＭＫＬＥＳＷＡＨＶＦＲＤＹＳＶＳＦＱＶＲＬＴＦＴＥＡＮＮＱＴＹＴＦＣＴＨＰＮＬＩＶ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0289】
ＵＬ１３１Ａ抗原
ＵＬ１３１Ａとも呼ばれるＵＬ１３１の機能は、内皮細胞だけではなく上皮細胞においてもＣＭＶ複製に必要である。一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体におけるＵＬ１３１Ａポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。一実施形態では、ＵＬ１３１Ａ抗原は、配列番号６と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
ＵＬ１３１Ａとも呼ばれるＵＬ１３１の機能は、内皮細胞だけではなく上皮細胞においてもＣＭＶ複製に必要である。一実施形態によると、本明細書に記載される五量体複合体におけるＵＬ１３１Ａポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。一実施形態では、ＵＬ１３１Ａ抗原は、配列番号６と少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0290】
例示的な一実施形態では、ＵＬ１３１ポリペプチドは、配列番号６：
ＱＣＱＲＥＴＡＥＫＮＤＹＹＲＶＰＨＹＷＤＡＣＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴＬＮＹＨＹＤＡＳＨＧＬＤＮＦＤＶＬＫＲＩＮＶＴＥＶＳＬＬＩＳＤＦＲＲＱＮＲＲＧＧＴＮＫＲＴＴＦＮＡＡＧＳＬＡＰＨＡＲＳＬＥＦＳＶＲＬＦＡＮ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。配列番号２～６は、ＢＥ／２８／２０１１株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＰ７４５６６９）に由来する。
ＱＣＱＲＥＴＡＥＫＮＤＹＹＲＶＰＨＹＷＤＡＣＳＲＡＬＰＤＱＴＲＹＫＹＶＥＱＬＶＤＬＴＬＮＹＨＹＤＡＳＨＧＬＤＮＦＤＶＬＫＲＩＮＶＴＥＶＳＬＬＩＳＤＦＲＲＱＮＲＲＧＧＴＮＫＲＴＴＦＮＡＡＧＳＬＡＰＨＡＲＳＬＥＦＳＶＲＬＦＡＮ
と１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはからなる。配列番号２～６は、ＢＥ／２８／２０１１株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＰ７４５６６９）に由来する。
【0291】
五量体複合抗原
本明細書に開示される免疫原性組成物の五量体複合抗原では、ｇＨ、ｇＬ、およびＵＬ１２８は、ジスルフィド結合を通して結合することができるが、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａは、非共有結合の相互作用により五量体複合体に組み入れることができる。例えば、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合の相互作用により五量体複合体に組み入れることができる。さらに、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合の相互作用により連結することができる。
本明細書に開示される免疫原性組成物の五量体複合抗原では、ｇＨ、ｇＬ、およびＵＬ１２８は、ジスルフィド結合を通して結合することができるが、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａは、非共有結合の相互作用により五量体複合体に組み入れることができる。例えば、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合の相互作用により五量体複合体に組み入れることができる。さらに、ＵＬ１３０タンパク質および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質は、非共有結合の相互作用により連結することができる。
【0292】
五量体複合体に対する一連の立体配座エピトープは知られている。例えば、Ｍａｃａｇｎｏら（Ｍａｃａｇｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８４（２０１０）：１００５～１３頁）は、内皮、上皮、および骨髄細胞のＣＭＶ感染を中和したヒトモノクローナル抗体のパネルを単離した。一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物の五量体複合抗原は、Ｍａｃａｇｎｏら（２０１０）により同定した立体配座エピトープの１つまたはそれ以上を提示することができる。
【0293】
五量体複合抗原の各タンパク質は、これらの突然変異が抗原としてタンパク質の使用に有害ではない限り、挿入、欠失、および置換のような突然変異を含有し得る。加えて、このような突然変異は、本発明によって五量体複合体を形成するタンパク質の能力を防止してはならない。本明細書に開示されるように五量体複合体を形成する能力は、タンパク質精製を実施し、非還元ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を解析することにより試験することができる。タンパク質が複合体の一部を形成する場合、これらは全て、天然ＰＡＧＥゲル上の単結合に存在し、および／またはサイズ排除クロマトグラムでの単一のピークに存在し得る。
【0294】
前記五量体複合体の発現は、当業者に公知の方法によって実現することができる。例えば、Ｈｏｆｍａｎｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年）に記載される方法が挙げられる。本開示の文脈での使用に好適な発現系は、当業者に周知されており、多くは、Ｄｏｙｌｅ（Ｄｏｙｌｅ編、Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ編、２００８年）に詳述されている。一般に、必要とする宿主でポリペプチドを生産する核酸分子を維持、増殖、および発現するのに好適である任意の系またはベクターを使用することができる。適切なヌクレオチド配列は、様々な周知される日常的な技術のいずれか、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第３編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年）に記載されるものにより発現系に挿入することができる。一般に、コードした遺伝子は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列が形質転換宿主細胞にＲＮＡへの転写されるように、プロモーターおよび場合によりオペレーターのような制御要素の制御下に配置することができる。好適な発現系の例は、例えば、染色体、エピソーム、およびウイルス由来の系を含み、例えば、以下に由来するベクター：細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスボゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えば特許出願ＷＯ２０１５／１７０２８７に記載されるバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス、またはその組合せ、例えばコスミドおよびファージミドを含むプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものを含む。ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドに含有し、発現することができるものより大きい断片のＤＮＡを送達するのに利用することができる。
【0295】
ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の５つの異なる組換えタンパク質を同時に等モルの方法で発現するために、いくつかの可能性がある。第１の可能性（１）は、同じまたは類似の調節要素（プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナル、終結シグナル．．．）の制御下、５つ全てのＯＲＦを含有する単一のベクター、および場合により、細胞株選択の選択系を構築することができる。ベクターは、５つの発現カセット（例えば、Ａｌｂｅｒｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５年、１２５（４）：１６０３～１６１９頁；もしくはＣｈｅｓｈｅｎｋｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００１年、８（１１）：８４６～８５４頁に記載の通り）を含有し得る、または５つの成分（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１）は、単一のＯＲＦにおいて、適したポリタンパク質の成熟を引き起こす要素で、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ－Ｗｏｒｋｍａｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１２、２０１２（２）：１９９～２０４頁に記載される自己切断が可能な配列）の５つのタンパク質に融合することができる。第２の場合、等モル濃度が保証されており、全ての切断が正確に起こると仮定される。ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体を発現する別の可能性（２）は、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合体抗原の１つの成分を各々発現する５つのベクター、および場合により、細胞株選択の選択系を構築することであり得る。５つのベクターは、標的細胞株で同時にトランスフェクトし得る。可能性（１）と可能性（２）との間の任意の中間系はまた、必要とするベクターの数を最小にし、各ベクターを妥当なサイズ（例えば１２ｋｂ未満）に維持するように設計される。
【0296】
好適な発現系は、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；酵母発現ベクターで形質添加した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、特許出願ＷＯ２０１５／１７０２８７に記載されるようなバキュロウイルス）に感染もしくはトランスフェクトした昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系のような微生物を含む。無細胞翻訳系もまた、タンパク質を生成するのに利用することができる。
【0297】
好適な植物細胞の遺伝子発現系の例は、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号、およびＺｅｎｋ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１年、３０（１２）：３８６１～３８６３頁に記載されるものを含み得る。例えば、プロトプラストを単離し、培養して、再生した植物全体を得ることができる全ての植物を使用して、導入した遺伝子を含有する植物全体を回収するようにする。実際に、全ての植物は、培養した細胞または組織から再生され、限定されないが、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マメ、ならびに野菜の全ての主要な種を含む。
【0298】
ＨＥＫ２９３細胞は、リン酸カルシウムおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を含む様々な技術によるトランスフェクト能（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）が高いので、本明細書に開示される五量体複合体のＣＭＶタンパク質の一過性発現に好適であり得る。ＨＥＫ２９３の有用な細胞株は、２９３－６ＥのようなＥＢＶのＥＢＮＡ１を発現するものであり得る（Ｌｏｉｇｎｏｎら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年；８：６５頁）。形質転換したＨＥＫ２９３細胞は、高レベルのタンパク質を増殖媒体に分泌するので、増殖媒体から直接このようなタンパク質複合体を精製することを可能にすることを示している。
【0299】
ＣＨＯ細胞は、ＣＭＶタンパク質の工業生産、例えば本発明による免疫原性組成物のＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原部分の工業生産に好適な哺乳動物の宿主であり得る。トランスフェクトは、リン酸カルシウムを使用することを含む当該技術分野で周知の一連の方法、電気穿孔法、またはカチオン性脂質を材料と混合することにより実行して、細胞膜と融合し、そのカーゴを内部に沈着するリポソームを生産することができる。
【0300】
細胞上清または封入体から組換えタンパク質を精製するための方法は、当該技術分野で周知されている。例示的な一実施形態では、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。
【0301】
ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、免疫学的に活性な量、すなわち対象のレシピエントにおいて免疫応答を誘発するのに好適な量で組成物中に存在し得る。本開示に好適なｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の免疫学的に活性な量の例として、約１μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌ～約４００μｇ／ｍｌ、または約２０μｇ／ｍｌ～約３５０μｇ／ｍｌ、または約４０μｇ／ｍｌ～約３００μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌ～約２８０μｇ／ｍｌ、または約８０μｇ／ｍｌ～約２４０μｇ／ｍｌの範囲の量を引用することができる。
【0302】
一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、任意の完全ＣＭＶウイルスを含まない。
【0303】
一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、本明細書に記載されるＣＭＶ抗原であるさらなる抗原を含み得る。本明細書に開示される組成物に添加することができるさらなる抗原の例として、百日咳菌、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、破傷風菌、結核菌、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、炭疽菌、コレラ菌、チフス菌、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、肺炎レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、らい菌、ペスト菌、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウィルス、エボラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、リッサウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルス由来の抗原を引用することができる。例示的な一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、組成物の唯一のＣＭＶ抗原としてＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含み得る。
【0304】
例示的な一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、組成物の唯一のＣＭＶ抗原としてＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含み得る。
【0305】
真菌抗原
真菌抗原は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、プネウモキュスティス・ジロウェキイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、コクキディオイデス・イムミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）／ポサダシイ（ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、カンディア・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フィロバシディエルラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ））、微胞子虫目（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）（例えば、エンケパリトゾオン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エンテロキュトゾオン・ビエネウシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ））、またはケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（例えば、ムコル・キルキネルロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリュザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リクテイミア・コリュムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ））から得ることができる。
真菌抗原は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、プネウモキュスティス・ジロウェキイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、コクキディオイデス・イムミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）／ポサダシイ（ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、カンディア・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、フィロバシディエルラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ））、微胞子虫目（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）（例えば、エンケパリトゾオン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、エンテロキュトゾオン・ビエネウシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ））、またはケカビ亜門（Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）（例えば、ムコル・キルキネルロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、リゾプス・オリュザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リクテイミア・コリュムビフェラ（Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ））から得ることができる。
【0306】
原虫抗原
原虫抗原は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ギアルディア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、ツリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、Ｔ．クルジ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、トキソプラスマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモジウム属の種、またはバベシア・ミクロティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）から得ることができる。
原虫抗原は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ギアルディア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、ツリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、Ｔ．クルジ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、トキソプラスマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、プラスモジウム属の種、またはバベシア・ミクロティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）から得ることができる。
【0307】
寄生虫抗原
寄生虫抗原は、アカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、アニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ、ツツガムシ、ラセンウジバエ（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、赤痢アメーバ、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、ギアルディア・ラムブリア、鉤虫、リーシュマニア、イヌシタムシ（Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｅｒｒａｔａ）、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、ダニ、条虫、トキソプラスマ・ゴンジイ、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、鞭虫、またはウケレリア・バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）から得ることができる。
寄生虫抗原は、アカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、アニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ、ツツガムシ、ラセンウジバエ（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、赤痢アメーバ、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、ギアルディア・ラムブリア、鉤虫、リーシュマニア、イヌシタムシ（Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｅｒｒａｔａ）、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、ダニ、条虫、トキソプラスマ・ゴンジイ、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、鞭虫、またはウケレリア・バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）から得ることができる。
【0308】
腫瘍抗原
一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわちがん細胞で発現したタンパク質またはペプチドのようながん細胞の構成要素であり得る。用語「腫瘍抗原」は、組織および／もしくは臓器の限定数、または特定の発生段階で特異的に発現した正常条件下であり、１つまたはそれ以上の腫瘍またはがん組織で発現または異常発現しているタンパク質に関する。腫瘍抗原は、例えば、細胞種類に特異的な分化抗原のような分化抗原、すなわちある特定の分化段階でのある特定の細胞腫および生殖系列に特異的な抗原で特異的に発現した正常条件下であるタンパク質を含む。例えば、腫瘍抗原は、発現しているがん細胞で提示される。
一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわちがん細胞で発現したタンパク質またはペプチドのようながん細胞の構成要素であり得る。用語「腫瘍抗原」は、組織および／もしくは臓器の限定数、または特定の発生段階で特異的に発現した正常条件下であり、１つまたはそれ以上の腫瘍またはがん組織で発現または異常発現しているタンパク質に関する。腫瘍抗原は、例えば、細胞種類に特異的な分化抗原のような分化抗原、すなわちある特定の分化段階でのある特定の細胞腫および生殖系列に特異的な抗原で特異的に発現した正常条件下であるタンパク質を含む。例えば、腫瘍抗原は、発現しているがん細胞で提示される。
【0309】
例えば、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、１－フェトプロテイン、イソフェリチン、および胎児性スルホ糖タンパク質（ｆｅｔａｌ ｓｕｌｐｈｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｃｃ２－Ｈ－鉄タンパク質、ならびにγ－フェトプロテインを含む。
【0310】
本発明で有用であり得る腫瘍抗原の他の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばクローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐｌ ＯＯ、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、例えばＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メラン－Ａ、ＭＣ１ Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ ９０ｍｉｎｏｒＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ ｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶｒＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬｌ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／１ＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴ、例えばＷＴ－１である。
【0311】
リポソームおよびそれを製造するための方法
本開示はまた、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、方法に関する。このような方法は、本明細書に開示される単一の種類のリポソームを得ることを可能にする。
本開示はまた、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、方法に関する。このような方法は、本明細書に開示される単一の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0312】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第２の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような実施形態では、方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような実施形態では、方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0313】
一実施形態では、リポソームを製造するための本明細書に開示される方法は、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程を、工程（ａ）の前に含み得る。
【0314】
本開示はまた、本明細書に開示されるリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ１）２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程、
（ａ２）水混和性有機溶媒において、工程（ａ１）で選択されたＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ２）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ２）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法に関する。
（ａ１）２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程、
（ａ２）水混和性有機溶媒において、工程（ａ１）で選択されたＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ２）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ２）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法に関する。
【0315】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第２の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ１）２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程、
（ａ２）水混和性有機溶媒において、工程（ａ１）で選択されたＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、ならびに、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ１）２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程、
（ａ２）水混和性有機溶媒において、工程（ａ１）で選択されたＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、ならびに、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0316】
一実施形態では、リポソームを製造するための本明細書に開示される方法は、約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度パラメータを決定する工程を、工程（ａ１）の前に含み得る。
【0317】
本開示は、本明細書に開示されるリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ１）約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度パラメータを決定する工程；
（ａ２）工程（ａ１）で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬの溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程；
（ａ３）水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
ここで、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストであり、ならびに
（ｂ）工程（ａ３）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ３）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法にさらに関する。
（ａ１）約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度パラメータを決定する工程；
（ａ２）工程（ａ１）で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬの溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程；
（ａ３）水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
ここで、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストであり、ならびに
（ｂ）工程（ａ３）で得られる溶液をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ３）、工程（ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法にさらに関する。
【0318】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第２の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ１）約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度パラメータを決定する工程；
（ａ２）工程（ａ１）で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬの溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程；
（ａ３）水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程
ここで、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストであり、ならびに
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ１）約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのエタノール中の溶解度パラメータを決定する工程；
（ａ２）工程（ａ１）で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬの溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程；
（ａ３）水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程
ここで、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストであり、ならびに
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0319】
本明細書に開示される方法によってリポソームを製造するのに好適であるＴＬＲ４アゴニスト、サポニン、ステロール、およびリン脂質は上述している。このような化合物を混合し得る量および比もまた上述している。
【0320】
選択したＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0321】
選択したＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも３０ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0322】
選択したＴＬＲ４アゴニストは、約０．１～約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．２～約４５ｍｇ／ｍＬ、約１～約４０ｍｇ／ｍＬ、約２～約３５ｍｇ／ｍＬ、約６～約３０ｍｇ／ｍＬ、または約１０～約２５ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0323】
選択したＴＬＲ４アゴニストは、およそ少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ～約１２ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍｌ、およそ少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍｌの範囲のエタノール中の溶解度パラメータを有し得る。
【0324】
一実施形態では、選択したＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する。
【0325】
溶解度パラメータは、約２５℃の温度、約１０１３ｈＰａの大気圧で測定される。溶解度パラメータは、比濁分析で測定することができる。
【0326】
式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストのような分子の溶解度パラメータを決定する方法は、当業者に周知されている。このような方法の例は、前記分子の異なる濃度でエタノールにおいて分子の比濁分析測定を実施することを含む。例えば、比濁分析は、エタノール中のブランクを伴うＵＶ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ＵＶ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ９６ Ｒｅｆ ８４０４）で試験される異なる濃度の分子を含む、０．２００ｍｌの各溶液で、ＢＭＧ－Ｌａｂｔｅｃｈ Ｎｅｐｈｅｌｏｓｔａｒで実施することができる。各溶液のＲＮＵ（相対的な比濁分析単位）は記録される。分子の溶媒度パラメータを決定する他の方法は、Ｖｅｓｅｌｉら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ．２０１９年１１月；４５（１１）：１７１７～１７２４頁）に記載される方法を含み得る。
【0327】
リポソームにおいて工程（ａ）で得られる溶液を加工するための方法は、当該技術分野で知られている（Ｗａｇｎｅｒ Ａら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１年；５９１３２５）。例示的な実施形態として、「薄膜法」または「溶媒注入法」が挙げられる。
【0328】
「薄膜法」は、例えばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＲＲＣ Ｎｅｗ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ編、１９９０年に詳述されるが、工程（ａ）によって、適切な有機溶媒または有機溶媒混合物中の脂質化合物、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、リン脂質、および場合によりサポニンの溶液を得ることからなる。本方法は、例えばＷＯ２００７／０６８９０７ Ａ１においてリポソームの製造で使用される。
【0329】
好適な有機溶媒または溶媒混合物は、クロロホルム、ジクロロメタン、クロロホルム／エタノール、ジクロロメタン／エタノール、イソプロパノール、イソプロパノール／エタノール、クロロホルム／メタノール、ジクロロメタン／メタノール、イソプロパノール、またはイソプロパノール／メタノールであり得る。
【0330】
次いで、得られる溶媒は、乾燥して有機溶媒に蒸発させて、薄い脂質膜または脂質ケーキとして脂質性の乾燥分を得る。蒸発は、ガラス容器の壁の換気フードまたは回転蒸発により乾燥した窒素またはアルゴン流を使用して行うことができる。
【0331】
次いで、得られる脂質性の乾燥分は、適切な水性媒体または水性緩衝液において再懸濁化により水和させる。水和時間は、脂質種および構造でわずかに異なり得る。好適な水性媒体または緩衝液は、リポソームを得るために、ｐＨ６．１でのＰＢＳまたはｐＨ６．３でのクエン酸緩衝液であり得る。
【0332】
本明細書に開示される方法において、サポニンが工程（ａ）で添加されないが、工程（ｂ）で添加される場合、薄膜法では水和工程に使用される水性媒体または水性緩衝液での添加および可溶化により、乾燥した脂質分の水和の工程で添加することができる。あるいは、工程ｂ）の後にサポニンの溶液として工程（ｂ）で得られるリポソームの懸濁液に添加することができる。
【0333】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第１の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加される、
方法を対象とする。このような実施形態では、工程ａ）は、水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニストを可溶化する工程を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程ｂ）、または工程（ｂ）の後のいずれかで添加される、
方法を対象とする。このような実施形態では、工程ａ）は、水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニストを可溶化する工程を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0334】
次いで、得られるリポソームまたはリポソーム懸濁液は、０．２μｍの細孔サイズの膜を通したろ過による滅菌を可能にするためにリポソームの直径を低減するように、超音波処理、微小流動化、または排出での処置によりサイジングを行う。
【0335】
薄膜法は、多くの場合、通常操作することが困難である塩素化有機溶媒を使用する。さらに、薄膜法は、ガラス容器の壁に薄い脂質膜を得るための脂質乾燥する工程に依存する。この工程は、工業レベルでのようなスケールアップに対する多くの困難を有する。そのため、他の方法は、リポソームを製造する場合により有利であることが分かる。
【0336】
「溶媒注入法」は、例えばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＲＲＣ Ｎｅｗ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ編、１９９０年に詳述されるが、水混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒混合物への選択した比で、脂質化合物、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、リン脂質、および場合によりサポニンの溶液を得ることからなる。
【0337】
好適な水混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒混合物は、エタノール、イソプロパノール、またはイソプロパノール／エタノールであり得る。例示的な一実施形態では、好適な水混和性有機溶媒は、エタノールであり得る。エタノールは、他の利用可能な溶媒または溶媒の混合物、例えばイソプロパノールと対照的に、保健機関により医薬製品の製造する方法で使用される最も安全な化合物の１つとしてみなされる。
【0338】
溶媒注入法は、エタノールのような適切な水混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒混合物において脂質化合物を可溶化する工程を課す。本明細書に開示されるリポソームを製造する方法の使用は、水混和性有機溶媒において溶解度の特異的な閾値を有する特異的なＴＬＲ４アゴニストを選択することにより可能になる。一実施形態では、選択したＴＬＲ４アゴニストは、本明細書に開示される通り、エタノール中の溶解度の特異的な閾値を有する。
【0339】
溶媒注入法は、例えば薄膜法のような他の可能なリポソームを製造する方法と比較して、工業レベルでスケールアップが容易であるという利点を有する。
【0340】
一実施形態では、工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程（ｂ）は、溶媒注入法を使用して実施する。
【0341】
別の実施形態では、工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程（ｂ）は、以下の工程：
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程
を含む。
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程
を含む。
【0342】
次いで、工程（ａ）で得られる溶液は、過剰な水性媒体または水性緩衝液に注入または希釈される。好適な緩衝液は、ｐＨ６．１でのＰＢＳ、ｐＨ６．３でのクエン酸緩衝液であり得る。次いで、溶媒は、透析または透析ろ過により排除される。希釈は、Ｗａｇｎｅｒら、Ｊ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．２００６年；１６（３）：３１１～９頁もしくはＷａｇｎｅｒら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１年；２０１１：５９１３２５に記載されるＴコネクタまたはクロスフロー注入デバイスを使用する、または微小流動化デバイスを使用することにより混合するクロスフローで実施することができる。好適な微小流動化デバイスは、Ｐｒｅｃｉｓｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、バンクーバー、カナダ製のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌＲであり得る。溶媒注入法を使用することにより、０．２μｍの細孔サイズの膜でのろ過による滅菌に適合する小さいリポソームは、プロセスパラメータ（容積および溶媒／緩衝液の比、混合速度など）の適切な選択により直接得ることができる。
【0343】
一実施形態では、注入の工程は、希釈工程、シリンジでの注入、またはクロスフロー注入システムにより実行することができる。
【0344】
別の実施形態では、工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程（ｂ）は、以下の工程：
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
をさらに含み得る。
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
をさらに含み得る。
【0345】
水混和性有機溶媒を除去するために、透析、透析ろ過、またはタンジェンシャルフローろ過が行われる。
【0346】
別の実施形態では、工程（ａ）で得られる溶液をリポソームに加工する工程（ｂ）は、以下の工程：
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含み得る。
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含み得る。
【0347】
一実施形態では、リポソームを製造するための方法は、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含み得、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ１）、工程（ｂ２）、または工程（ｂ２）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含み得、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ１）、工程（ｂ２）、または工程（ｂ２）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する。
【0348】
工程（ｂ１）で添加する場合、サポニンは、水性緩衝液で可溶化される。
【0349】
工程（ｂ２）で添加する場合、サポニンは、リポソームを含有する懸濁液を透析するために使用する水性緩衝液で可溶化して、水混和性有機溶媒を除去する。
【0350】
工程（ｂ２）の後に添加する場合、サポニンは、水性緩衝液で可溶化され、次いで工程（ｂ２）の後に得られるリポソームの懸濁液と混合する。
【0351】
サポニンがステロールに対して高い親和性を提示する場合、例えばＱＳ２１およびコレステロールを使用する場合、サポニンは、予め形成したステロール含有リポソームに後添加によりリポソーム内に組み込むことができる。この場合、ステロール含有リポソームは、上述のように製造され、サポニンは、サポニン溶液（水またはＰＢＳ ｐＨ６．１もしくはシトレートｐＨ６．３のような酸性緩衝液中）のステロール含有リポソームの懸濁液との簡単な混合により組み込まれる。
【0352】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第１の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ１）、工程（ｂ２）、または工程（ｂ２）の後のいずれかで添加される、
方法を対象とする。このような実施形態では、工程ａ）は、水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニストを可溶化する工程を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、ステロールおよびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ１）、工程（ｂ２）、または工程（ｂ２）の後のいずれかで添加される、
方法を対象とする。このような実施形態では、工程ａ）は、水混和性有機溶媒において、ＴＬＲ４アゴニストを可溶化する工程を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、ＴＬＲ４アゴニストを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第１の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0353】
別の実施形態では、本開示は、リポソーム、例えば第２の種類のリポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような実施形態では、方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を少なくとも含む、方法を対象とする。このような実施形態では、方法は、工程（ａ）および／または（ｂ）でサポニンの追加を含まない。このような実施形態では、得られるリポソームは、サポニンを有していなくてもよい。このような方法は、本明細書に開示される第２の種類のリポソームを得ることを可能にする。
【0354】
本明細書に開示される方法の工程（ａ）は、上述のような工程（ａ１）および（ａ２）または（ａ１）、（ａ２）および（ａ３）に分けることができる。
【0355】
本開示のリポソームは、機器の推奨される取扱説明書にしたがってＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；マルバーン、ＵＫ）を使用する動的光散乱法により測定する場合、平均径がおよそ１００ｎｍの小型単層小胞および小型多層小胞の混合物である。
【0356】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも２種類のリポソームの組合せを製造するための方法であって、第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含み、方法が、第１および第２のリポソームを混合する工程を少なくとも含む、方法を対象とする。
【0357】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるリポソームを製造するための方法は、工程（ｂ）で得られるリポソームをろ過し、平均径が２００ｎｍ未満のリポソームを回収する工程（ｃ）をさらに含む。例示的な一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームは、約８０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲または約１２０ｎｍ～約１８０ｎｍの範囲である平均径を有し得る。
【0358】
少なくとも２種類のリポソームの組合せの場合、ろ過の工程は、少なくとも２種類のリポソームを混合する工程の前および／または後にリポソームで行うことができる。
【0359】
別の実施形態では、工程（ｃ）は、平均径が１７５ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、または約１００ｎｍのリポソームを回収する工程を含む。そのため、工程（ｂ）で得られるリポソームをろ過する工程（ｃ）は、０．２２μｍの細孔サイズの膜で実施することができる。
【0360】
例示的な一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームを製造するための方法は、工程（ｂ）で得られるリポソームを滅菌フィルターでろ過する工程（ｃ）をさらに含む。滅菌フィルターは、０．２２μｍの細孔サイズの膜を有し得る。このような実施形態では、本方法は、０．２２μｍの細孔サイズの膜での滅菌ろ過に適合する平均径のリポソームを回収する工程を含む。
【0361】
電子顕微鏡検査で解析する場合、本明細書に開示されるように得られるリポソームの懸濁液は、単層リポソームの混合物、ならびにいくつかの多層および多胞体性リポソームを含む。
【0362】
本明細書に開示される、または本明細書の方法により得られるリポソームは、抗原とさらに組み合わせることができる。少なくとも２種類のリポソームの組合せでは、第１もしくは第２または両方の種類のリポソームは、少なくとも１つの抗原を含有し得る。第１および第２の種類のリポソームは、同じまたは異なる抗原を含有し得る。
【0363】
したがって、本明細書に開示される方法は、工程ｂ）の後または工程ｃ）の後に得られるリポソームを少なくとも１つの抗原と混合するさらなる工程を含み得る。好適な抗原は、上で開示される通りである。混合することは、少なくとも１つの抗原をリポソームの懸濁液に添加することにより行われる。混合する前の各抗原およびリポソームの懸濁液の容積および濃度は、各成分、例えば抗原、ＴＬＲ－４アゴニスト、ＱＳ２１またはＱＳ７、コレステロール（など）、およびリン脂質の所望の濃度を最終組成物で得られるように調節する。
【0364】
あるいは、抗原は、開示される方法の工程ａ）またはｂ）の１つで添加することができるが、ただし抗原の性質および機能は変更しない。
【0365】
抗原は、液体、半液体、例えばゲル、または固体、例えば粉末の形態で提供され得る。例示的な一実施形態では、抗原は、溶液のような液体の形態でリポソームに添加される。
【0366】
方法は、本分野で通常実施されるような精製、ろ過、および／または滅菌の工程をさらに含み得る。得られる組成物は、さらなる保存および使用のためにバイアルまたはシリンジで包装される。
【0367】
本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、異なる成分、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、サポニン、ステロールまたはステロールエステル、およびリン脂質の含有物は、リポソームの種類ごともしくはリポソームの組合せごと、またはリポソームを含む組成物ごとに表すことができる。いくつかの実施形態では、異なる成分、すなわちＴＬＲ４アゴニスト、サポニン、ステロールまたはステロールエステル、およびリン脂質の含有物は、リポソームの組合せごと、またはリポソームを含む組成物ごとに表される。例えば、本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、所望の成分の量が重量／容積で表される場合、これは、この組合せを含有する組成物の容積単位あたりのリポソームの組合せ中の本成分の総量を指す。他の例として、本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、所望の成分の量が重量：重量比で表される場合、これは、第１および第２の種類のリポソーム中の各成分の量を指す。
【0368】
本明細書に開示されるリポソームの組合せでは、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のステロールおよびリン脂質の含有物は、同一であり得るまたは異なり得る。いくつかの実施形態では、異なる種類のリポソーム、例えば第１および第２の種類のリポソーム中のステロールリン脂質の含有物は、同一であり得る。
【0369】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバント、すなわち単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：２．５～約１：９０の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、約１：３～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のステロール：リン脂質の重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：２．５～約１：９０の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、約１：３～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のステロール：リン脂質の重量：重量比
を含み得る。
【0370】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバント、すなわち単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：２．５～約１：９０の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、約１：３～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲の重量：重量比、ＴＬＲ４アゴニスト：サポニン、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のサポニン：リン脂質の重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：２．５～約１：９０の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、約１：３～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲の重量：重量比、ＴＬＲ４アゴニスト：サポニン、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のサポニン：リン脂質の重量：重量比
を含み得る。
【0371】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ２１の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ２１：コレステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のコレステロール：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ２１の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ２１：コレステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のコレステロール：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
【0372】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ２１の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ２１：コレステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のＱＳ２１：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：４０の範囲、または約１：５～約１：２５の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ２１の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ２１：コレステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のＱＳ２１：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
【0373】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：９０の範囲、または約１：５～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ７の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ７：コレステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のコレステロール：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：９０の範囲、または約１：５～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ７の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ７：コレステロールの重量：重量比、
－ １００：１～１：２００の範囲、５０：１～１：１００の範囲、１０：１～２０：１の範囲、約１：１、約１：２、または約１：４のコレステロール：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
【0374】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：９０の範囲、または約１：５～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ７の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ７：コレステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のＱＳ７：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
－ 約１：１～約１：５００の範囲、約１：１～約１：４００、約１：２～約１：２００の範囲、約１：２．５～約１：１００の範囲、約１：３～約１：９０の範囲、または約１：５～約１：３０の範囲、または約１：５～約１：１０の範囲のＥ６０２０：ＱＳ７の重量：重量比、
－ １：１００～１：１の範囲、１：５０～１：２の範囲、または１：１０～１：５の範囲、約１：２、または約１：５のＱＳ７：コレステロールの重量：重量比、
－ １：４００～１：４の範囲、１：２００～１：８の範囲、１：１００～１：１０の範囲、１：５０～１：１０の範囲、約１：８、または約１：２０のＱＳ７：ＤＯＰＣの重量：重量比
を含み得る。
【0375】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００１ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲である、約２：０．５：０．０５：Ｘｍｇ／ｍｌ～約８：１．５：１．８：Ｘｍｇ／ｍｌの範囲の重量：重量比で、本明細書に開示されるリン脂質／ステロールまたはそのエステル／サポニン／ＴＬＲ－４アゴニストを含み得る。
【0376】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００１ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲である、約２：０．５：０．０５：Ｘｍｇ／ｍｌ～約８：１．５：０．８：Ｘｍｇ／ｍｌの範囲の重量：重量比で、本明細書に開示されるリン脂質／ステロールまたはそのエステル／サポニン／ＴＬＲ－４アゴニストを含み得る。
【0377】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：０．２：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、本明細書に開示されるリン脂質／ステロールまたはそのエステル／サポニン／ＴＬＲ－４アゴニストを含み得る。
【0378】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：０．６：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、本明細書に開示されるリン脂質／ステロールまたはそのエステル／サポニン／ＴＬＲ－４アゴニストを含み得る。
【0379】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００１ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲である、約２：０．５：０．０５：Ｘｍｇ／ｍｌ～約８：１．５：０．８：Ｘｍｇ／ｍｌの範囲の重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０を含み得る。
【0380】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：０．２：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０を含み得る。
【0381】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００１ｍｇ／ｍｌ～０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲である、約２：０．５：０．０５：Ｘｍｇ／ｍｌ～約８：１．５：１．８：Ｘｍｇ／ｍｌの範囲の重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0382】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：０．２：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0383】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：０．６：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0384】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、Ｘが０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、または０．０２ｍｇ／ｍｌである、４：１：１．８：Ｘｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0385】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、４：１：０．２：０．０２０ｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０を含み得る。
【0386】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、４：１：０．２：０．０２０ｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0387】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、４：１：０．６：０．０２０ｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0388】
一実施形態では、本明細書に開示されるリポソームアジュバントは、４：１：１．８：０．０２０ｍｇ／ｍｌの重量：重量比で、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ７／Ｅ６０２０を含み得る。
【0389】
特に、上で提供される実施形態のリポソームアジュバントで使用することができる抗原は、ＣＭＶ抗原である。
【0390】
これらの実施形態で提供される比は、リポソームが、他の公知のリポソームより少ないＴＬＲ４アゴニストを同時に必要とすることで生産費用を低減しながら、低い反応原性を有し、所与の抗原に対して高く持続的なレベルの中和抗体を誘発することが可能である点で特に有益であり得る。
【0391】
リポソームを含む組成物
いくつかの実施形態によると、本開示は、リポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む組成物、またはリポソームを含む組成物に関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに本明細書に開示される、または本明細書に開示される方法により得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む。
いくつかの実施形態によると、本開示は、リポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む組成物、またはリポソームを含む組成物に関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに本明細書に開示される、または本明細書に開示される方法により得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む。
【0392】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのリポソーム、例えば本明細書に開示される通り、単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せを含むアジュバント組成物に関する。
【0393】
前記アジュバント組成物は、アジュバント特性を有する当該技術分野で知られている他の成分をさらに含み得る。
【0394】
一実施形態では、本開示は、少なくとも１つのリポソーム、例えば本明細書に記載される単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの少なくとも１つの組合せを含む免疫賦活剤に関する。本明細書に記載されるリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せはまた、免疫賦活剤として単独で使用することができる。
【0395】
一実施形態では、本明細書に記載されるリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む組成物は、リポソームを懸濁する緩衝溶液をさらに含み得る。本明細書に好適な緩衝溶液は、水性緩衝化溶液、例えば酸性緩衝液、例えばクエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液、コハク酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはリン酸緩衝液を含む。例えば、水性緩衝液は、クエン酸緩衝化溶液もしくは酢酸緩衝化溶液、またはヒスチジン緩衝液であり得る。
【0396】
緩衝溶液は、安定化剤をさらに含み得る。好適な安定化剤は、炭水化物、界面活性剤、ポリマー、例えばポリビニルアルコール、アミノ酸、シクロデキストリン、および尿素のような分子量が小さい添加剤を含む。
【0397】
本明細書に記載されるリポソーム、例えば単一の種類のリポソームまたは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む組成物は、凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、リポソームを凍結し、圧力を低下させ、次いで昇華により氷を除去することを含む低温脱水プロセスである。リポソームに好適であり、これらの分解を避ける凍結乾燥の方法は、当業者に周知されている。凍結乾燥した組成物は、リポソームの貯蔵寿命を延長する利点を呈する。
【0398】
本明細書に開示される組成物は、滅菌することができる。リポソームに好適であり、これらの分解を避ける滅菌の方法は、当業者に周知されている。滅菌した組成物は、個体への投与に特に有利である。
【0399】
免疫原性組成物
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、もしくは本明細書に記載されるリポソームを含む組成物、または上述したアジュバント組成物、および少なくとも１つの抗原を含む、ワクチン組成物のような免疫原性組成物に関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに本明細書に開示される、または本明細書に開示される方法により得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、もしくは本明細書に記載されるリポソームを含む組成物、または上述したアジュバント組成物、および少なくとも１つの抗原を含む、ワクチン組成物のような免疫原性組成物に関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに本明細書に開示される、または本明細書に開示される方法により得られる少なくとも２種類のリポソームの組合せを含む。
【0400】
ワクチン組成物は、所与の抗原に対する防御免疫応答を誘起するのに使用される組成物である。ワクチンは、予防ツールとして通常使用されるが、ある特定の場合、処置としても使用することができる。
【0401】
ワクチン組成物のような免疫原性組成物における本明細書に開示されるリポソームの存在は、組成物において抗原により誘起される免疫応答を高めることによりアジュバントとして作用する。
【0402】
ワクチン組成物のような免疫原性組成物で使用することができる好適な抗原は、上述している。一実施形態では、抗原は、細菌抗原、原虫抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および腫瘍抗原から選択することができる。
【0403】
本開示のある特定の態様は、本明細書に開示されるｇＢ抗原、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、ならびに本明細書に記載されるサポニン、ステロール、リン脂質、および式（Ｉ）のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソームを含むアジュバントを含む、免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＭＶ感染を予防および／または処置するのに有用であり得る。
【0404】
一態様では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、サブユニットの免疫原性組成物、例えばサブユニットのワクチン組成物である。
【0405】
本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、エアゾール剤、液剤、懸濁剤、または乳剤のような固体、半固体、液体形態における製造物に製剤化することができる。このような組成物を投与する典型的な経路は、限定されないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、バッカル、鼻腔内を含む。用語、非経口は、本明細書で使用する場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内の注射または注入技術を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物は、経皮、皮下、皮内、または筋肉内の経路で投与することができる。本開示の組成物は、例えば、筋肉内、皮内、または皮下注射のような非経口送達を介する送達用に製剤化された組成物を含む、送達の様式に基づいて製剤化される。
【0406】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、粘膜投与（例えば鼻腔内もしくは舌下）、非経口投与（例えば筋肉内、皮下、経皮、もしくは皮内経路）、または経口投与のような任意の好適な経路を介して投与することができる。当業者が理解する通り、免疫原性組成物は、意図する投与経路に適合するように好適に製剤化することができる。一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、筋肉内経路、または皮内経路、または皮下経路を介して投与するように製剤化することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、筋肉内経路を介して投与するように製剤化することができる。
【0407】
本明細書に開示される組成物は、対象への組成物の投与の際、含有される有効成分が生体で利用可能となるように製剤化される。
【0408】
このような剤形を製造する実際の方法は、当業者に知られている、または明らかになり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい。
【0409】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、任意の薬学的に許容される担体と製剤化することができる。組成物は、少なくとも１つの賦形剤または担体を含有し得る。例示的な１つの薬学的に許容されるビヒクルは、生理食塩水緩衝液である。他の生理学的に許容されるビヒクルは、当業者に知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに記載されている。本明細書に記載されている免疫原性組成物は、ｐＨ調節および緩衝化剤、等張化剤、湿潤化剤などのような適切な生理的条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ－アルギニンヒドロクロレート、サッカロース、Ｄ－トレハロース脱水物、ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、および／または尿素を場合により含有し得る。加えて、ワクチン組成物は、例えば賦形剤、結合剤、安定剤、および保存剤を含む薬学的に許容される添加物質を場合により含み得る。
【0410】
一実施形態では、組成物は、液体の形態、例えば液剤、乳剤、または懸濁剤であり得る。液体は、注射による送達用であり得る。注射で投与することを意図する組成物は、界面活性剤、保存剤、湿潤化剤、分散化剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤の少なくとも１つを含有し得、等張剤を含み得る。本明細書に開示される液体組成物は、滅菌賦形剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、例えば生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えば溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成のモノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸またはリン酸、および張性調節用薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース；凍結保護剤として作用する薬剤、例えばスクロースまたはトレハロースの少なくとも１つを含み得る。
【0411】
本明細書に開示される免疫原性組成物のｐＨは、約５．５～約８、例えば約６．５～約７．５の範囲であり得る、または約７であり得る。安定的なｐＨは、緩衝液を使用することで維持することができる。可能な使用できる緩衝液として、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を引用することができる。本明細書に開示される免疫原性組成物は、一般に緩衝剤を含み得る。免疫原性組成物は、ヒトのような哺乳動物に関して等張であり得る。免疫原性組成物はまた、ＮａＣｌのような１つまたはいくつかの付加塩を含み得る。
【0412】
非経口製造物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに包含することができる。注射用組成物は、例えば滅菌である。
【0413】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、従来の滅菌技術、例えばＵＶもしくはガンマ線照射で滅菌することができる、または滅菌ろ過することができる。本明細書に開示される液体の免疫原性組成物の滅菌ろ過から得られる組成物は、液体形態で包装し、保存し得る、または凍結乾燥し得る。凍結乾燥した組成物は、投与前に滅菌の水性担体で復元することができる。
【0414】
本明細書に開示される組成物は、薬学分野で周知の方法論で製造することができる。例えば、注射で投与することを意図する組成物は、リポソーム、本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に開示されるリポソームを含む組成物を、溶液を形成するように滅菌した蒸留水または他の担体と組み合わせることにより製造することができる。界面活性剤は、均質な溶液または懸濁液の形成を促進するために添加することができる。
【0415】
本明細書に開示される組成物は、治療有効量で投与されるが、この量は、利用する具体的な治療剤の活性；治療剤の代謝安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；投与の様式および時間；排出率；薬物併用；特異的な障害または状態の重症度；ならびに対象が経験している療法を含む様々な要因によって異なり得る。
【0416】
一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、凍結乾燥した組成物、またはＷＯ２００９／１０９５５０に記載される粒状にする方法を介して得られるマイクロペレットのような乾燥形態で包装し、保存し得る。一実施形態では、組成物の異なる成分、例えばｇＢ抗原、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、およびアジュバントは全て、同じマイクロペレットに存在し得る。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物の成分、例えばｇＢ抗原、ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、およびアジュバントｇＢ抗原は、各々別個のマイクロペレット、すなわち１つのマイクロペレットあたり１つの成分であり得る。このような実施形態では、異なる成分を別個に含有する異なるマイクロペレットは、対象に投与する前に混合することができる。一実施形態では、これらは、液体担体に復元する前に混合することができる。別の実施形態では、これらは、１容積の液体担体を添加することにより液体担体に復元するときに混合することができる。別の実施形態では、第１に、これらは、異なる容積の液体担体に各々別個に添加し、次いで、第２に、異なる溶液の液体担体は、共に混合して、対象に投与される最終的な液体組成物を得ることができる。
【0417】
乾燥組成物は、マンニトール、スクロース、またはドデシルマルトシド、ならびにその混合物、例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などのような安定剤を含み得る。
【0418】
一実施形態では、アジュバントおよび本明細書に開示される免疫原性組成物の抗原は、単一の組成物において共にブレンドすることができる。このような実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＭＶ ｇＢ抗原、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、およびアジュバントのすぐ使用される混合物として製造することができる。
【0419】
一実施形態では、アジュバントおよび抗原は、少なくとも２つの異なる組成物において製造することができる。次いで、異なる組成物は、患者に投与する直前に、即時的な手法で共にブレンドすることができる。別の実施形態では、異なる組成物は、別個に投与する、すなわち同時に（実際にはたった数秒または数分間、例えば５分未満あける）だが、少なくとも２つの異なる投与部位、例えば少なくとも２つの異なる注射部位を介して投与することができる。別の実施形態では、異なる組成物は、逐次的に、すなわち少なくとも２つの異なる時点、例えば少なくとも５分間あけて、または最大で数時間もしくは１もしくは２日あけて、投与することができる。このような実施形態では、異なる組成物は、同じ投与部位、例えば同じ注射部位に、または異なる投与部位、例えば異なる注射部位に投与することができる。
【0420】
例示的な一実施形態では、免疫原性組成物は、患者への投与の直前に即時的に製造することができる。このような実施形態では、本明細書に開示される組成物の異なる成分は、パーツのキットとして別個に提供することができる。本明細書に開示されるパーツのキットは、別個の容器にそれぞれ含まれ、容易に混合される、免疫原性組成物の異なる成分を含み得る。
【0421】
一実施形態では、本開示は、
－ 本明細書に開示されるリポソームまたはアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
－ 本明細書に開示されるリポソームまたはアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
【0422】
別の実施形態では、本開示は、
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
【0423】
一実施形態では、アジュバントおよび抗原の少なくとも１つは、乾燥形態であり得る。
【0424】
別の実施形態では、アジュバントおよび抗原の全ては、別個の容器において乾燥形態であり得る。このような実施形態では、パーツのキットは、使用前に組成物の異なる成分を液体形態に復元するために液体の薬学的な担体を含む容器をさらに含み得る。
【0425】
本明細書に開示されるパーツのキットに使用される容器は、バイアルのような別個の容器であり得る。いくつかの構成では、全ての成分は、使用する時間までは別個に保持される。次いで、バイアルの含有物は、例えば１つのバイアルの含有物を除去し、これを他のバイアルに添加することにより、または全てのバイアルの含有物を別個に除去し、これらを新しい容器で混合することにより混合することができる。
【0426】
一実施形態では、本明細書に開示されるパーツのキットは、
－ 本明細書に開示されるアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含み得る。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
－ 本明細書に開示されるアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含み得る。このような実施形態では、リポソームは、単一の種類のリポソームであり得る。アジュバント組成物は、単一の種類のリポソームまたは少なくとも２種類のリポソームの組合せを含み得る。
【0427】
別の実施形態では、本開示は、
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
－ サポニン、ステロール、およびリン脂質を含む第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、
－ ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む第２の種類のリポソームを含む、第２の容器、ならびに
－ 本明細書に開示される少なくとも１つのｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットを対象とする。
【0428】
一実施形態では、ＣＭＶ抗原、すなわちｇＢ抗原およびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、別個の容器で提供することができる。このような実施形態では、パーツのキットは、少なくとも３つ、４つ、またはそれ以上の容器を含み得る。
【0429】
一実施形態では、アジュバント、ならびにＣＭＶ抗原、すなわちｇＢ抗原およびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の少なくとも１つは、乾燥形態であり得る。
【0430】
別の実施形態では、アジュバント、ならびにＣＭＶ抗原、すなわちｇＢ抗原およびｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原の全ては、別個の容器、例えば２つまたは３つの容器において乾燥形態であり得る。このような実施形態では、パーツのキットは、使用前に組成物の異なる成分を液体形態に復元するために液体の薬学的な担体を含む容器をさらに含み得る。
【0431】
本明細書に開示されるパーツのキットに使用される容器は、バイアルのような別個の容器であり得る。いくつかの構成では、全ての成分は、使用する時間までは別個に保持される。例えば、ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、同じ容器であり得、アジュバントは、別の容器にあり得る。次いで、バイアルの含有物は、例えば１つのバイアルの含有物を除去し、他のバイアルに添加することにより、または全てのバイアルの含有物を別個に除去し、新しい容器においてこれらを混合することにより混合することができる。
【0432】
一実施形態では、少なくとも１つの容器は、シリンジであり得、他の容器は、バイアルであり得る。シリンジは、混合するためにその含有物を別の容器に挿入するために（例えばニードルで）使用することができ、次いで混合物は、シリンジに没入することができる。次いで、シリンジの混合した含有物は、典型的に新しい滅菌ニードルを通して患者に投与することができる。
【0433】
別の実施形態では、キットの容器は、多チャンバーシリンジのような、単一のシリンジの別個の隣接した連通するチャンバーであり得る。このような実施形態では、各々チャンバーは、アジュバントチャンバーと連通し、連通は使用するまで閉じたままである。連通は、異なる成分の混合を可能にする、チャンバー間の密封を破壊するシリンジのプランジャーの作動により開くことができる。このような実施形態では、少なくとも１つのチャンバーは、液体組成物を含有する。他のチャンバーは、凍結乾燥した生成物またはマイクロペレットのような液体形態または乾燥形態のいずれかの成分を含有し得る。
【0434】
例示的な一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、抗原およびアジュバントのすぐ使用される混合物として単一のバイアルまたは単一のシリンジで包装され得る。
【0435】
例示的な一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＣＭＶ ｇＢ抗原、ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原、およびアジュバントのすぐ使用される混合物として単一のバイアルまたは単一のシリンジで包装され得る。
【0436】
使用、使用方法、および処置方法
本開示は、本明細書に記載されるリポソーム、アジュバント組成物、免疫賦活剤、および免疫原性組成物の使用にさらに関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソーム、例えば単一の種類のリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに少なくとも２種類のリポソームの組合せおよび本明細書に開示されるように得られるリポソームの組合せを含む。
本開示は、本明細書に記載されるリポソーム、アジュバント組成物、免疫賦活剤、および免疫原性組成物の使用にさらに関する。本節において言及されるリポソームは、上述したリポソーム、例えば単一の種類のリポソームおよび上述したリポソームを製造する方法により得られるリポソーム、ならびに少なくとも２種類のリポソームの組合せおよび本明細書に開示されるように得られるリポソームの組合せを含む。
【0437】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの抗原をアジュバント処理するための方法であって、少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に記載されるアジュバント組成物を、少なくとも１つの抗原と組み合わせる工程を少なくとも含む、方法に関する。
【0438】
さらなる実施形態では、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫原性応答をアジュバント処理するための方法であって、前記個体に、少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に記載されるアジュバント組成物を前記抗原と投与する工程を含む、方法に関する。
【0439】
別の実施形態では、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を誘発するための方法であって、前記個体に、少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、または本明細書に記載されるアジュバント組成物を前記抗原と投与する少なくとも１つの工程を含む、方法に関する。
【0440】
好適な抗原は、上述している。
【0441】
本明細書に開示される方法では、リポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、またはアジュバント組成物、および抗原は、同時に、別個に、または逐次的に投与される。
【0442】
一実施形態では、本明細書に包含される方法は、それを必要とする個体のサイトカインおよび／またはケモカイン応答を高める工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインおよび／またはケモカイン応答は、それを必要とする個体のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＫＣ、および／またはＴＮＦ－αの応答を含む。別の実施形態では、本明細書に包含される方法は、それを必要とする個体に対してバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を与えるＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１７の応答を高める工程を含む。別の実施形態では、本明細書に包含される方法は、それを必要とする個体のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＦＮγの応答を高める工程を含む。「サイトカインおよび／またはケモカイン応答を高める工程」とは、個体のサイトカインおよび／またはケモカイン応答が、抗原を単独でまたはリポソームもしくはアジュバント組成物を含まずに投与する場合の個体のサイトカインおよび／またはケモカイン応答と比較した場合より高くなることを意味する。
【0443】
一実施形態では、本明細書に開示される免疫原性組成物は、本明細書に開示される少なくとも１つのアジュバントおよび少なくとも１つの抗原を含むが、前記組成物を受ける患者において前記抗原に対して免疫応答を誘起するための方法で使用するためであり、前記免疫応答は、バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答である。
【0444】
Ｔｈ１免疫応答は、実質的に、細胞媒介性免疫応答である。ＩＦＮ－γは、Ｔｈ１免疫応答のバイオマーカーとして使用することができる。Ｔｈ２免疫応答は、実質的に、体液媒介性免疫応答である。ＩＬ－５は、Ｔｈ２免疫応答のバイオマーカーであり得る。
【0445】
バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答は、１００万個の細胞あたりのＩＦＮγ分泌性細胞の数の１００万個の細胞あたりのＩＬ－５分泌性細胞の数に対する比のｌｏｇ１０が、約１～約１５、好ましくは約２～約１０、約３～約８の範囲であり、約５である、免疫応答であり得る。ＩＦＮγおよびＩＬ－５分泌性細胞は、実施例の節に詳述されるＥＬＩＳＰＯＴで測定することができる。
【0446】
ＩＬ－５またはＩＮＦγの分泌は、本明細書に開示される免疫組成物を受けている個体から得られる、脾臓細胞のような免疫細胞で測定することができる。
【0447】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、それを必要とする個体において疾患を予防および／または処置する方法であって、有効量の少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、少なくとも１つのアジュバント組成物、少なくとも１つの免疫賦活剤、または本明細書に記載される少なくとも１つの免疫原性組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法に関する。例えば、リポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、アジュバント組成物、免疫賦活剤、または本明細書に開示される免疫原性組成物は、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、稀な血液障害、稀な代謝性疾患、稀な神経疾患、および腫瘍またはがん疾患を予防および／または処置するための治療方法で使用することができる。
【0448】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、稀な血液障害、稀な代謝性疾患、稀な神経疾患、および腫瘍またはがん疾患を予防および／または処置するための医薬の製造のための、少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、少なくとも１つのアジュバント組成物、少なくとも１つの免疫賦活剤、または本明細書に開示される少なくとも１つの免疫原性組成物の使用に関する。例えば、本開示に関係し得る疾患は、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、真菌または寄生虫感染性疾患のような感染性疾患であり得る。本開示にさらに関する疾患は、がんまたは腫瘍疾患であり得る。
【0449】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、稀な血液障害、稀な代謝性疾患、稀な神経疾患、および腫瘍またはがん疾患の予防および／または処置での使用のための、少なくとも１つのリポソーム、例えば単一の種類のリポソームもしくは本明細書に開示される少なくとも２種類のリポソームの組合せ、少なくとも１つのアジュバント組成物、少なくとも１つの免疫賦活剤、または本明細書に開示される少なくとも１つの免疫原性組成物に関する。
【0450】
ウイルス感染性疾患は、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染、伝染性単核球増加症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次ＨＳＶ－１感染（例えば、小児の歯肉口内炎、成人の扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎）、潜在性ＨＳＶ－１感染（例えば、口唇ヘルペスおよび単純疱疹）、一次ＨＳＶ－２感染、潜在性ＨＳＶ－２感染、無菌性髄膜炎、伝染性単核球増加症、巨細胞封入体病、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性体腔性リンパ腫、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、ライ症候群、麻疹、感染後性脳脊髄炎、ムンプス、過形成上皮病変（例えば、尋常性、扁平、足底、および肛門性器疣贅、喉頭乳糖種、疣贅状表皮発育異常症）、子宮頚癌、扁平上皮細胞癌、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、細気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重度の細気管支炎、風疹、先天性風疹、水痘、Ｃｏｖｉｄ－１９、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、ならびに帯状疱疹であり得る。
【0451】
一実施形態では、疾患は、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、またはＣｏｖｉｄ－１９であり、例えばインフルエンザである。
【0452】
一実施形態では、疾患は、サイトメガロウイルス感染ではない。
【0453】
細菌感染性疾患は、例えば膿瘍、放線菌症、急性前立腺炎、エロモナス・ハイドロフィラ、一年生ライグラス中毒、炭疽、細菌性紫斑病、菌血症、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性腟症、細菌関連の皮膚状態、バルトネラ症、ＢＣＧ腫瘍、ボトリオミセス症、ボツリヌス中毒、ブラジル紫斑熱、ブローディー膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂窩織炎、クラミジア感染、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多発性骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、歯周歯内病変、ウシ伝染性胸膜肺炎、ジフテリア、ジフテリア口内炎、エールリヒア症、丹毒、喉頭蓋炎、丹毒、フィッツ・ヒュー・カーチス症候群、ノミ媒介斑点熱、腐蹄症（感染性蹄葉炎）、ガレー氏硬化性骨髄炎、淋疾、鼠径部肉芽腫、ヒト顆粒球アナプラズマ症、ヒト単球性エールリヒア症、百日咳、膿痂疹、後期先天性梅毒性眼病、レジオネラ症、レミエール症候群、ライ病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラレ（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ－ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＭＡＩ）、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、壊疽性口内炎（ｎｏｍａ）（水癌または壊疽性口内炎（ｇａｎｇｒｅｎｏｕｓ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ））、臍炎、眼窩蜂窩織炎、骨髄炎、脾摘後重症感染症（ＯＰＳＩ）、ヒツジブルセラ症、パスツレラ症、眼窩周囲蜂窩織炎、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Ｑ熱、回帰熱（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｆｅｖｅｒ、ｔｙｐｈｉｎｉａ）、リウマチ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染、赤痢菌感染症、南部ダニ紅斑病、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、レンサ球菌性咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒素性ショック症候群（ＴＳＳ）、トラコーマ、塹壕熱、熱帯性潰瘍、結核、野兎病、腸チフス熱、チフス、尿生殖器結核、尿路感染症、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染、ウォーターハウス・フリデリクセン症候群、仮性結核（エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））疾患、およびエルシニア症であり得る。
【0454】
寄生虫感染性疾患は、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症（カラアザール）、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎、およびバベシア症であり得る。
【0455】
真菌感染性疾患は、アスペルギルス症、分芽菌症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、および足白癬であり得る。さらに、免疫不全を有する人は、コウジカビ属、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、およびニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）のような真菌属による疾患に感受性がある。他の真菌、いわゆる皮膚糸状真菌および好ケラチン性真菌は、眼、爪、毛髪、とりわけ皮膚を攻撃し、様々な状態を引き起こすが、これは足部白癬のような白癬が一般的である。真菌胞子もまた、アレルギーの主要な原因であり、異なる分類群由来の広範囲の真菌は、一部の人間でアレルギー反応を喚起し得る。
【0456】
がんもしくは腫瘍疾患は、がんであり得る、または腫瘍疾患は、例えば、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、腎癌、消化器腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱がん、直腸腫瘍、胃がん、食道がん、膵がん、肝がん、乳房癌（＝乳がん）、子宮がん、子宮頚部がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、肝細胞癌、様々なウイルス誘発性腫瘍、例えば乳頭腫ウイルス誘発性癌（例えば子宮頚部癌＝子宮頚部がん）、アデノ癌、ヘルペスウイルス誘発性腫瘍（例えばバーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘発性Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘発性腫瘍（肝細胞性癌）、ＨＴＬＶ－１およびＨＴＬＶ－２誘発性リンパ腫、聴神経腫、肺癌（＝肺がん＝気管支癌）、小細胞肺癌、咽頭がん、肛門癌、神経膠芽細胞腫、直腸癌、星細胞腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽細胞腫、膣がん、膵がん、精巣がん、ホジキン症候群、髄膜種、シュネーベルガー病、下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、有棘細胞腫、バーキットリンパ腫、喉頭がん、腎がん、胸腺腫、体部癌、骨がん、非ホジキンリンパ腫、尿道がん、ＣＵＰ症候群、頭部／頚部腫瘍、乏突起神経膠腫、外陰部がん、腸がん、結腸癌、食道癌（＝食道がん）、疣贅併発、小腸の腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣癌、生殖器腫瘍、卵巣がん（＝卵巣癌）、膵癌（＝膵がん）、子宮内膜癌、肝転移、陰茎がん、舌がん、胆嚢がん、白血病、形質細胞腫、眼瞼腫瘍、前立腺がん（＝前立腺腫瘍）から選択される。
【0457】
本開示が治療的介入として有用であり得る疾患は、ＳＭＮ１関連の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；嚢胞性線維症（ＣＦ）；シスチン尿を含むＳＬＣ３Ａ１関連障害；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症；Ｘ連鎖副腎脳白質ジストロフィーおよび副腎脊髄神経症；フリードライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッハー病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連の結節性硬化症；サンフィリッポＢ症候群（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）；ＣＴＮＳ関連シスチン蓄積症；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘに関連する振戦／運動失調症候群および脆弱Ｘ早期卵巣機能不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダーウィリ症候群；遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病Ｃ１型；若年型神経細胞内セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年型バッテン病、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ病、ヤンスキー－ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ－１およびＴＰＰ１欠乏症を含む神経セロイドリポフスチン症関連疾患；中枢神経系ミエリン形成不全／白質消失を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４およびＥＩＦ２Ｂ５関連の小児期運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連の発作性運動失調症２型；古典的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連の重度新生児脳症およびＰＰＭ－Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連の非定型レット症候群；ケネディー病（ＳＢＭＡ）；Ｎｏｔｃｈ－３関連の皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連の発作性障害；Ａｌｐｅｒｓ－Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ症候群、ＰＯＬＧ関連の感覚失調性ニューロパチー、構音障害、および眼筋麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺を含むポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ファブリー病；ならびに、ウィルソン病のような疾患を含む。
【0458】
一実施形態によると、本開示の組成物は、組成物に存在するＣＭＶ抗原に対して免疫応答を誘発するのに十分な投与量で投与される。ＣＭＶ抗原およびアジュバントは、免疫学的に活性な量で投与される。
【0459】
通常、ヒト対象に対して、投与される免疫原性またはワクチン組成物の用量は、０．２～１ｍＬの範囲、例えば０．４～０．８ｍＬの容積を有し得る。例示的な一実施形態では、用量は、０．５ｍＬであり得る。
【0460】
免疫原性またはワクチン組成物は、単一の組成物として、または少なくとも２つの容器を含み、第１の容器が液体製剤として製剤化したＣＭＶ抗原、例えばＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含有し、第２の容器が液体製剤としてアジュバント組成物を含有する、パーツのキットとして提供することができるが、両容器の含有物は、使用前に容積対容積で混合することができる。
【0461】
いくつかの実施形態では、パーツのキットは、少なくとも３つの容器を含み得、第１の容器は、液体製剤として製剤化したＣＭＶ抗原、例えばＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含有し、第２の容器は、液体製剤として本明細書に開示される第１の種類のリポソームを含有し、第３の容器は、液体製剤として本明細書に開示される第２の種類のリポソームを含有するが、３つの容器の含有物は、使用前に容積対容積で混合することができる。
【0462】
対象に投与されるＣＭＶ抗原およびアジュバントの量は、対象の年齢、体格、体重、性別、症状、または状態、ならびに投与経路などのような当業者に周知の様々な要因によって異なり得る。例えば、用量は、体重または体表面積によって計算することができる。
【0463】
別の実施形態によると、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＨＣＭＶワクチンのようなＣＭＶワクチンとして使用することができる。
【0464】
本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物は、免疫原性またはワクチン組成物を投与するのに通常使用される任意の経路で投与される。予想される免疫応答の誘発をもたらすレジメンを使用する。通常、免疫化のスケジュールは、いくつかの投与を含み得る。投与される免疫原性組成物の量は、所望の免疫応答が生じるのに十分であり、当業者により決定することができる。
【0465】
別の実施形態によると、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＨＣＭＶのようなＣＭＶに対する中和抗体を誘発するための医薬としての方法で使用することができる。誘発した中和抗体は、ＨＣＭＶのようなＣＭＶを中和することができる。ＣＭＶの中和は、ＣＭＶ疾患もしくは感染を予防する、またはＣＭＶ疾患もしくは感染の発症のリスクを低減する、またはＣＭＶ疾患の症状を軽減することができる。本明細書に開示される方法は、対象に少なくとも第１および第２の用量の前記組成物を投与する工程を含み得、少なくとも第１および第２の用量は、少なくとも１週間あけて、例えば少なくとも１または２か月あけて投与される。本明細書に開示される方法では、第２の用量は、対象に第１の用量より低い反応原性を誘発し、反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）前記バイオマーカーの第１の測定値を得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与しており、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）前記バイオマーカーの第２の測定値を得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与している前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定値を、前記第２の測定値と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する。
【0466】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、第３の用量の投与を含み得る。第３の用量は、第１の用量から少なくとも４、５、６または７か月あけて投与される。一実施形態では、第３の用量は、第１の用量から６か月あけて投与される。
【0467】
一実施形態では、開示される方法は、第１の用量、および第１の用量から１または２か月あけた第２の用量の投与を含み得る。別の実施形態では、開示される方法は、第１の用量、第１の用量から１または２か月あけた第２の用量、および第１の用量から６か月あけた第３の用量の投与を含み得る。
【0468】
別の実施形態によると、本開示は、対象においてＨＣＭＶのようなＣＭＶに対する免疫応答を誘発するための医薬としての方法に関する。誘発した免疫応答は、ＣＭＶ疾患もしくは感染を予防する、またはＣＭＶ疾患もしくは感染の発症のリスクを低減する、またはＣＭＶ疾患もしくは感染の症状を軽減することができる。本明細書に開示される方法は、対象に本明細書に開示される少なくとも１つの免疫原性またはワクチン組成物を投与する少なくとも１つの工程を含み得る。
【0469】
予防すべきである、または発症の可能性を低減すべきであるＣＭＶ感染または疾患は、出産適齢期の女性におけるＣＭＶ感染、妊娠中のＣＭＶ感染、幼児における先天性ＣＭＶ感染、または実質臓器移植もしくは骨髄移植のような臓器移植を行う対象におけるＣＭＶ感染であり得る。
【0470】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される組成物を受ける対象において、ＨＣＭＶ疾患または感染のようなＣＭＶ疾患または感染を予防するためである。
【0471】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、前記対象に少なくとも第１および第２の用量の前記組成物を、少なくとも１週間、例えば少なくとも１または２か月間隔をあけて投与する工程を含み、第２の用量は、第１の用量より低い反応原性を誘発し、反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）第１の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与しており、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）第２の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与している前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定した量を、前記第２の測定した量と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する。
【0472】
いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇は、反応原性組成物を示し得る。
【0473】
いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇がない場合は、反応原性組成物がないこと、または低減した反応原性組成物を示し得る。
【0474】
ワクチン組成物のような本明細書に開示される免疫原性組成物は、このような組成物を投与する対象において中和抗体レベルおよび／または中和抗体持続性を高めることができる。
【0475】
一実施形態では、本開示は、対象においてＣＭＶ感染または疾患を予防する、またはその発症の可能性を低減するための方法に関する。このような方法は、本明細書に開示される通り、免疫学的有効量の免疫原性組成物またはワクチン組成物を投与する工程を含み得る。
【0476】
本発明の免疫原性組成物、例えばワクチン組成物は、少なくとも第１および第２の用量の組成物の投与を含む投与スケジュールで対象に投与される。投与スケジュールは、対象に時間的に連続して投与する２または３用量を含み得る。２つの連続した用量間の時間は、１～２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月、またはそれ以上の範囲であり得る。
【0477】
第１および第２の用量は、少なくとも約１か月、例えば約２か月、約３か月、約４か月、約５、約６、約７、または約８か月で分けることができる。例示的な実施形態では、第１および第２の用量は、少なくとも約１か月、２か月、または約３か月、または約４か月で分けることができる。例示的な一実施形態では、第１および第２の用量は、１か月あける。
【0478】
一実施形態では、第２の用量は、さらなるその後の用量、例えば少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも４つのその後の用量が続く。その後の各用量を分ける時間の間隔は、第１および第２の用量を分ける期間と同一であり得る。別の実施形態では、その後の用量を分ける期間は異なり得る。一実施形態では、その後の用量を分ける各期間は互いに異なり得る。その後の用量を互いから分ける期間は、約１～約８か月、約２～約４か月の範囲であり得る、または約３か月であり得る。一実施形態では、第１の用量および第３の用量を分ける期間は、約４～約８か月、例えば約６か月であり得る。
【0479】
例示的な実施形態では、本明細書に開示される免疫原性またはワクチン組成物は、２または３用量で投与される。組成物が３用量で投与される一実施形態では、第１の用量および第３の用量は、約４～約８か月あけて、例えば約６か月あけて投与される。例えば、組成物は、第１、第２、および第３の用量で投与される。このような実施形態では、第２の用量は、第１の用量の約１～約３か月後、例えば第１の用量の約１か月後または１か月半後に投与され、第３の用量は、第１の用量の約４～８か月後、例えば約６か月後に投与される。
【0480】
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、単回用量で投与される。
【0481】
本発明によるワクチンは、２用量で投与される。好ましくは、第１の用量および第２の用量は、およそ約１、２、３、６、８、または９か月あけて投与される。例示的な一実施形態では、第１および第２の用量は、２か月あけて投与される。
【0482】
本明細書に開示される免疫原性組成物は、それを必要とする任意の対象に投与される。このような組成物に関する対象の例として、幼児、小児、十代、青年、成人、または高齢者を挙げることができる。一実施形態では、対象は、新生児または出産適齢期の女性であり得る。別の実施形態では、対象は、実質臓器、骨髄移植、または幹細胞移植のような臓器移植を行う対象であり得る。例示的な一実施形態では、対象は、出産適齢期の女性（１６～４５歳）または青年期の少女（１１～１５歳）であり得る。
【0483】
本明細書に開示される組成物は、単独で、または他の免疫原性もしくはワクチン組成物に付随して投与することができる。このような組成物は、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、結核菌、プラスモジウム属の種、炭疽菌、コレラ菌、チフス菌、ボレリア属の種、肺炎レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、クロストリジウム属の種、らい菌、ペスト菌、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウィルス、エボラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、リッサウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスを対象とし得る。
【0484】
別段示されない限り、または矛盾もしくは不一致が起こることが当業者に明らかでない限り、本開示が、列挙した請求項の少なくとも１つからの少なくとも１つの限定、要素、条項、記述用語などが、同じ基本的な請求項（または関連として任意の他の請求項）による別の請求項に導入される、全ての変形例、組合せ、および置換を包含することは理解すべきである。要素が、リストなどとして、例えばマーカッシュ群または類似のフォーマットで表される場合、要素の各部分群もまた開示され、任意の要素を群から取り除くことができることは理解すべきである。全体的に、本開示または本開示の態様が、含まれる特定の要素、特徴などを指す場合、これらはまた、このような要素、特徴などからなる、または本質的になる実施形態を包含することは理解すべきである。単純化する目的で、これらの実施形態は、あらゆる場合で、本明細書で非常に多くの単語において具体的に記載していない。本開示の任意の実施形態または態様が、具体的な排除が本明細書に記載されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲から明示的に排除することができることも理解すべきである。本開示の背景を記載し、その実施に関するさらなる詳細をもたらすための本明細書に参照される出版物および他の標準材料は、参照により本明細書に組み入れる。
【0485】
本明細書に開示される配列は、参照として機能する。同じ配列はまた、特許の主題を目的に、標準要件によってフォーマットされる配列表に示す。標準的な配列表と何らかの配列の不一致がある場合、本明細書に記載される配列を基準とする。
【0486】
本開示に限定されないが、本開示の実施形態の数値は、例示の目的のために下に記載される。
【0487】
本発明の実施形態は、以下の項目にさらに詳述する。
【0488】
第１の項目によると、本開示は、サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含むリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）、または
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せ
に関し、
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せ
に関し、
【0489】
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１は、
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【化14】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、または（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルまたはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖または分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、またはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、または４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルまたはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、またはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、またはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル）；ならびに
【0490】
ｅ）
（ここで、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ＭおよびＮは、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖を含む、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノ、およびアシルアミノからなる群から独立して選択される）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり；
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【化15】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソまたはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、またはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり；
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【0491】
第２の項目によると、本開示は、項目１に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する。
【0492】
第３の項目によると、本開示は、項目１または２に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：
である。
【化16】
【0493】
第４の項目によると、本開示は、項目１～３のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
のＥ６０２０である。
【化17】
【0494】
第５の項目によると、本開示は、項目１～４のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、サポニンは、シャボンノキのサポニンである。
【0495】
第６の項目によると、本開示は、項目１～５のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、サポニンは、キラヤの樹皮から抽出される。
【0496】
第７の項目によると、本開示は、項目１～６のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、サポニンは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１、およびその組合せから選択される。いくつかの実施形態では、サポニンは、ＱＳ２１またはＱＳ７である。
【0497】
第８の項目によると、本開示は、項目１～７のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、およびその混合物から選択される。
【0498】
第９の項目によると、本開示は、項目１～８のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体から選択され、特にコレステロールである。
【0499】
第１０の項目によると、本開示は、項目１～９のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、サポニンおよびステロールは、１：１００～１：１の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で存在する。
【0500】
第１１の項目によると、本開示は、項目１～１０のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物から選択される。
【0501】
第１２の項目によると、本開示は、項目１～１１のいずれか１項に記載のリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）または少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソームに関し、リン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物から選択されるホスファチジルコリンである。
【0502】
第１３の項目によると、本開示は、リポソームを製造するための方法であって、以下の工程：
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法に関する。
（ａ）水混和性有機溶媒において、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニスト、ステロール、およびリン脂質を可溶化する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程
を少なくとも含み、
サポニンは、工程（ａ）、工程（ｂ）、または工程ｂ）の後のいずれかで添加され、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：１～約４００：１の範囲、約２：１～約２００：１の範囲、約２．５：１～約１００：１の範囲、約３：１～約４０：１の範囲、または約５：１～約２５：１の範囲のサポニン：ＴＬＲ４アゴニストの重量：重量比で存在する、
方法に関する。
【0503】
第１４の項目によると、本開示は、工程（ａ）の前に、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する式（Ｉ）のＴＬＲ４アゴニストを選択する工程を含む、項目１３に記載の方法に関する。
【0504】
第１５の項目によると、本開示は、工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）が、溶媒注入法を使用することにより実行する、項目１３または１４に記載の方法に関する。
【0505】
第１６の項目によると、本開示は、工程（ａ）で得られる混合物をリポソームに加工する工程（ｂ）が、以下の工程：
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含む、項目１３～１５のいずれか１項に記載の方法に関する。
（ｂ１）工程（ａ）で得られる溶液を水性緩衝液に注入および／または希釈する工程、ならびに
（ｂ２）水混和性有機溶媒を除去する工程
を含む、項目１３～１５のいずれか１項に記載の方法に関する。
【0506】
第１７の項目によると、本開示は、水混和性有機溶媒が、エタノール、イソプロパノール、もしくはその混合物から選択される、またはエタノールである、項目１３～１６のいずれか１項に記載の方法に関する。
【0507】
第１８の項目によると、本開示は、工程（ｂ）で得られるリポソームをろ過し、平均径が２００ｎｍ未満のリポソームを回収する工程（ｃ）をさらに含む、項目１３～１７のいずれか１項に記載の方法に関する。
【0508】
第１９の項目によると、本開示は、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソームもしくはリポソームの組合せ、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソームを含む、アジュバント組成物に関する。
【0509】
第２０の項目によると、本開示は、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソームを含む、免疫賦活剤に関する。
【0510】
第２１の項目によると、本開示は、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物、および少なくとも１つの抗原を含む、免疫原性組成物に関する。
【0511】
第２２の項目によると、本開示は、項目２１に記載の免疫原性組成物に関し、抗原は、細菌抗原、原虫抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および腫瘍抗原から選択される。
【0512】
第２３の項目によると、本開示は、
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載の１つのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載の１つのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物を含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。
【0513】
いくつかの実施形態では、本開示は、
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第２の種類のリポソームを含む第２の組成物を含む、第２の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットに関する。
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第２の種類のリポソームを含む第２の組成物を含む、第２の容器、および
－ 少なくとも１つの抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットに関する。
【0514】
第２４の項目によると、本開示は、免疫原性組成物を製造するための方法であって、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物を、少なくとも１つの抗原と混合する工程を少なくとも含む、方法に関する。
【0515】
第２５の項目によると、本開示は、少なくとも１つの抗原をアジュバント処理するための方法であって、前記少なくとも１つの抗原を、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物と合わせる工程を少なくとも含む、方法に関する。
【0516】
第２６の項目によると、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫原性応答をアジュバント処理するための方法であって、前記個体に、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物を含む前記少なくとも１つの抗原を投与する工程を含む、方法に関する。
【0517】
第２７の項目によると、本開示は、それを必要とする個体において少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を誘発するための方法であって、前記個体に、項目１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのリポソーム（例えば、単一の種類のリポソーム）もしくは少なくとも２種類のリポソームの組合せのリポソーム、または項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法により得られる少なくとも１つのリポソーム、または項目１９に記載のアジュバント組成物を含む前記少なくとも１つの抗原を投与する少なくとも１つの工程を含む、方法に関する。
【0518】
第２８の項目によると、本開示は、リポソームまたはアジュバント組成物および抗原が、同時に、別個に、または逐次的に投与される、項目２６または２７に記載の方法に関する。
【0519】
第２９の項目によると、本開示は、前記個体のサイトカインおよび／ケモカイン応答を高める工程をさらに含む、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法に関する。
【0520】
第３０の項目によると、本開示は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＫＣ、およびまたはＴＮＦ－αから選択されるサイトカインおよび／またはケモカインの上昇を含む、項目２９に記載の方法に関する。
【0521】
第３１の項目によると、本開示は、以下：
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの少なくとも１つの組合せを含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関する。
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または第１の種類のリポソームが、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームが、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの少なくとも１つの組合せを含む、１つのアジュバント
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関する。
【0522】
第３２の項目によると、本開示は、以下：
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せ
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関し、
－ １つのＣＭＶ ｇＢ抗原；
－ １つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原；ならびに
－ サポニン、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む少なくとも１つのリポソーム、または
第１の種類のリポソームは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を含み、第２の種類のリポソームは、ステロール、リン脂質、およびＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含む、少なくとも２種類のリポソームを含むリポソームの組合せ
を少なくとも含む、免疫原性組成物に関し、
【0523】
Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、
［式中、Ｒ１は、
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、もしくは（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、もしくは－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルもしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、もしくはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、もしくは４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、もしくは４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルケニルもしくはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル）；ならびに
【化18】
ａ）Ｃ（Ｏ）；
ｂ）Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）であって、前記Ｃ１～Ｃ１４アルキルが、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、Ｃ１～Ｃ５アルキレンジオキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、もしくは（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールで場合により置換され、前記（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アリールの前記アリール部分が、Ｃ１～Ｃ５アルコキシ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）アミノ、（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ（Ｃ１～Ｃ５アルコキシ）、Ｏ（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、もしくは－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）アミノ－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５アルキル）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ５）アルキルで場合により置換される、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）－Ｃ（Ｏ）；
ｃ）ヒドロキシルもしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ１５の直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル；および
ｄ）－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－であって、前記アリーレンが、ヒドロキシル、ハロゲン、ニトロ、もしくはアミノで場合により置換される、－Ｃ（Ｏ）－（Ｃ６～Ｃ１２アリーレン）－Ｃ（Ｏ）－
からなる群から選択され；
ａおよびｂは、独立して０、１、２、３、もしくは４であり；
ｄ、ｄ’、ｄ”、ｅ、ｅ’およびｅ”は、独立して０、１、２、３、もしくは４であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１およびＹ２は、存在しない、酸素、－ＮＨ－および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－、ならびに－Ｎ（Ｃ１～Ｃ４アルキル）－からなる群から独立して選択され；
Ｗ１およびＷ２は、カルボニル、メチレン、スルホン、およびスルホキシドからなる群から独立して選択され；
Ｒ２およびＲ５は、
ａ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル；
ｂ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルケニルもしくはジアルケニル；
ｃ）オキソ、ヒドロキシル、もしくはアルコキシで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ；
ｄ）－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル）であって、前記アルキル基が、オキソ、ヒドロキシ、もしくはアルコキシで場合により置換される、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル）；ならびに
【0524】
ｅ）
（ここで、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ＭおよびＮは、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖を含む、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アシルオキシ、アルキルアミノ、およびアシルアミノからなる群から独立して選択される）
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソもしくはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、もしくはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、もしくはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【化19】
からなる群から独立して選択され；
Ｒ３およびＲ６は、オキソもしくはフルオロで場合により置換される、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルケニルからなる群から独立して選択され；
Ｒ４およびＲ７は、Ｃ（Ｏ）－（Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルケニル）、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ、およびＣ２～Ｃ２０の直鎖もしくは分岐鎖アルケニルからなる群から独立して選択され；前記アルキル、アルケニル、もしくはアルコキシ基は、ヒドロキシル、フルオロ、もしくはＣ１～Ｃ５アルコキシで独立して、場合により置換することができ；
Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４は、酸素、メチレン、アミノ、チオール、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、および－Ｎ（Ｃ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ４アルキル））－からなる群から独立して選択され；
またはＧ２Ｒ４またはＧ４Ｒ７は、水素原子またはヒドロキシルと一緒にあり得る］
または本化合物の薬学的に許容される塩であり、
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンは、約１：５０～約１：１もしくは約１：３５～約１：２５の範囲であるＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量：重量比、または約１：１０のＴＬＲ４アゴニスト：サポニンの重量比で存在する。
【0525】
第３３の項目によると、前記ＣＭＶ ｇＢ抗原は、全長ＣＭＶ ｇＢ抗原、膜貫通ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての膜貫通ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、細胞内ドメインの少なくとも一部から欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、全ての細胞内ドメインから実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方から実質的に欠失している切断型ＣＭＶ ｇＢ抗原からなる群で選択される、項目３１または３２に記載の免疫原性組成物。
【0526】
第３４の項目によると、前記ＣＭＶ ｇＢ抗原は、ｇＢｄＴｍである、項目３１～３３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0527】
第３５の項目によると、前記ｇＨは、膜貫通ドメインの少なくとも一部もしくは実質的に全ての膜貫通ドメインから欠失する、項目３１～３４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0528】
第３６の項目によると、前記ｇＨは、ＣＭＶ ＵＬ７５遺伝子でコードした全長ｇＨポリペプチドの外部ドメインを含む、項目３１～３５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0529】
第３７の項目によると、ＣＭＶ ｇＢ抗原およびＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原は、ＣＭＶ抗原のみである、項目３１～３６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0530】
第３８の項目によると、ＴＬＲ４アゴニストは、２５℃で測定した少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのエタノール中の溶解度パラメータを有する、項目３１～３７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0531】
第３９の項目によると、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩ）：
である、項目３１～３８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【化20】
【0532】
第４０の項目によると、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＩＩ）：
のＥ６０２０である、項目３１～３９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【化21】
【0533】
第４１の項目によると、サポニンは、シャボンノキのサポニンである、項目３１～４０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0534】
第４２の項目によると、サポニンは、キラヤの樹皮から抽出される、項目３１～４１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0535】
第４３の項目によると、サポニンは、ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１、およびその組合せから選択される、項目３１～４２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。いくつかの実施形態では、サポニンは、ＱＳ２１またはＱＳ７である。
【0536】
第４４の項目によると、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体、エルゴステロール、デスモステロール（３β－ヒドロキシ－５，２４－コレスタジエン）、スチグマステロール（スチグマスタ－５，２２－ジエン－３－オール）、ラノステロール（８，２４－ラノスタジエン－３ｂ－オール）、７－デヒドロコレステロール（Δ５，７－コレステロール）、ジヒドロラノステロール（２４，２５－ジヒドロラノステロール）、ジモステロール（５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール）、ラトステロール（５α－コレスト－７－エン－３β－オール）、ジオスゲニン（（３β，２５Ｒ）－スピロスト－５－エン－３－オール）、シトステロール（２２，２３－ジヒドロスチグマステロール）、シトスタノール、カンペステロール（カンペスト－５－エン－３β－オール）、カンペスタノール（５ａ－カンペスタン－３ｂ－オール）、２４－メチレンコレステロール（５，２４（２８）－コレスタジエン－２４－メチレン－３β－オール）、マルガリン酸コレステリル（コレスト－５－エン－３β－イルヘプタデカノエート）、オレイン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、およびその混合物から選択される、項目３１～４３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0537】
第４５の項目によると、ステロールは、コレステロールまたはその誘導体から選択され、特にコレステロールである、項目３１～４４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0538】
第４６の項目によると、サポニンおよびステロールは、１：１００～１：１の範囲のサポニン：ステロールの重量：重量比、約１：２のサポニン：ステロールの重量：重量比で、または約１：５のサポニン：ステロールの重量：重量比で存在する、項目３１～４５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0539】
第４７の項目によると、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、およびその混合物から選択される、項目３１～４６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0540】
第４８の項目によると、リン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、およびその混合物から選択されるホスファチジルコリンである、項目３１～４７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【0541】
第４９の項目によると、本開示は、ＣＭＶワクチンとして使用するための、項目３１～４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物に関する。
【0542】
第５０の項目によると、本開示は、ＣＭＶに対して中和抗体を誘発するための方法で使用するための、項目３１～４９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物に関し、前記方法は、対象に少なくとも第１および第２の用量の前記組成物を投与する工程を含み、少なくとも第１および第２の用量は、少なくとも１か月間隔をあけて投与され、第２の用量は、前記対象に第１の用量より低い反応原性を誘発し、前記反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）第１の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与されており、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）第２の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与されている前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定した量を、前記第２の測定した量と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇は、反応原性組成物を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇がない場合は、反応原性組成物がないこと、または低減した反応原性組成物を示し得る。
【0543】
第５１の項目によると、本開示は、
－ 項目３１および３８～４８のいずれか１項に記載のアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 項目３２～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。
－ 項目３１および３８～４８のいずれか１項に記載のアジュバントを含む第１の組成物を含む、第１の容器、ならびに
－ 項目３２～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第２の組成物を含む、第２の容器
を含む、パーツのキットに関する。
【0544】
いくつかの実施形態では、本開示は、
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第２の種類のリポソームを含む第２の組成物を含む、第２の容器、および
－ 項目３２～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットに関する。
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第１の種類のリポソームを含む第１の組成物を含む、第１の容器、および
－ 項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームの組合せの少なくとも第２の種類のリポソームを含む第２の組成物を含む、第２の容器、および
－ 項目３２～３７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＣＭＶ ｇＢ抗原および少なくとも１つのＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１五量体複合抗原を含む第３の組成物を含む、第３の容器
を含む、パーツのキットに関する。
【0545】
第５２の項目によると、本開示は、対象においてＣＭＶに対して免疫応答を誘発するための方法であって、前記対象に項目３１～４８のいずれか１項に記載の少なくとも１つの免疫原性組成物を投与する少なくとも１つの工程を含む、方法に関する。
【0546】
第５３の項目によると、前記対象に少なくとも第１および第２の用量の前記組成物を少なくとも１か月間隔をあけて投与し、第２の用量は、第１の用量より低い反応原性を誘発し、前記反応原性は、（ａ）ＣＲＰ、グロブリンおよびフィブリノゲンから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを、（ｉ）第１の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第１の用量の前記組成物で投与した後、前記第２の用量の前記組成物で投与する前に前記対象から採取した第１の血液サンプルにおいて、および（ｉｉ）第２の測定した量の前記バイオマーカーを得るために、前記第２の用量の前記組成物で投与した後に前記対象から採取した第２の血液サンプルにおいて、投薬する工程、ならびに（ｂ）前記第１の測定した量を、前記第２の測定した量と比較する工程を少なくとも含む方法で測定し、前記比較は、前記投与した組成物で誘起される反応原性に関する情報を提供する、項目５２に記載の方法。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇は、反応原性組成物を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の測定と比較した第２の測定での少なくともバイオマーカーの測定した量の上昇がない場合は、反応原性組成物がないこと、または低減した反応原性組成物を示し得る。
【0547】
第５４の項目によると、本開示は、感染性疾患、アレルギー、自己免疫疾患、稀な血液障害、稀な代謝性疾患、稀な神経疾患、および腫瘍またはがん疾患の予防および／または処置で使用するための、項目１～１２のいずれか１項に記載のリポソームまたはリポソームの組合せ、項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法で得られるリポソーム、項目２０の記載の免疫賦活剤、項目１９に記載のアジュバント組成物、項目２１に記載の免疫原性組成物、または項目３１～４７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物に関する。
【実施例1】
【0548】
リポソームの製造方法
Ｉ．材料および方法
リポソームを、以下の通り、溶媒、例えばエタノール注入法によって製造した。
Ｉ．材料および方法
リポソームを、以下の通り、溶媒、例えばエタノール注入法によって製造した。
【0549】
Ｅ６０２０のエタノール中の溶液を、２ｍｇ／ｍｌで、２．０ｍｇのＥ６０２０粉末を０．９９８ｍｌのエタノールに溶解することにより製造した。
【0550】
４倍濃縮したエタノール溶液を、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、および０．２００ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０で、０．８５０ｍｌのエタノール中、４０ｍｇのＤＯＰＣおよび１０ｍｇのコレステロールに溶解し、０．１００ｍｌの先に製造したＥ６０２０溶液をエタノールに添加することにより、製造した。
【0551】
溶液を、生成物を完全に溶解し、無色の溶液を得るまで、室温（ＲＴ）で撹拌した。
【0552】
７ｍｌのＬｙｏガラス製バイアルにおいて、３．０ｍＬのＣＢＳ（クエン酸緩衝溶液）ｐＨ６．３（シトレート１０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ｐＨ６．３）を、室温で、１０００ｒｐｍで撹拌した。１．０ｍｌの脂質溶液を、０．１ｍｌ／分で、２２ｇａのニードルおよびシリンジポンプを伴うハミルトンシリンジを使用してゆっくり添加して、リポソームを形成した。リポソームを、ＣＢＳ ｐＨ６．３に対して３回（半日後、一晩目、一日後）に（１００００ＭＣＷＯ透析カセットで）透析した。
【0553】
リポソーム懸濁液を、直径３３ｍｍのＭｉｌｌｅｘフィルターＰＶＤＦ０．２２μｍで滅菌ろ過し、窒素下の＋４℃で保存した。
【0554】
リポソーム成分濃縮液を、透析の希釈倍率によって推定した。１．６の透析希釈倍率に対して、リポソーム成分濃縮液は、６．２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１．５６ｍｇ／ｍｌのコレステロール、および０．０３１ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０であった。
【0555】
フローフード下、３．０ｍｇのＱＳ２１を、３．０ｍＬのＣＢＳ ｐＨ６．３に再懸濁化して１．０ｍｇ／ｍｌでＱＳ２１の溶液を得、直径２５ｍｍのＰａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ ０．２μｍで滅菌ろ過した。
【0556】
滅菌条件において、ＳＰＡ１４（リポソーム懸濁液）を、ＣＢＳ ｐＨ６．３における１．０ｍｇ／ｍｌでの１．５６３ｍｌのＱＳ２１の溶液を、５．０００ｍｌの先のリポソーム懸濁液および１．２５０ｍｌのＣＢＳ ｐＨ６．３に添加することにより製剤化した。混合物を、ボルテックスを使用して１０秒間撹拌し、４ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１ｍｇ／ｍｌのコレステロール、０．０２０ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０、および０．２００ｍｇ／ｍｌのＱＳ２１の最終的なＳＰＡ１４滅菌懸濁液に対して窒素下の＋４℃で保存した。
【0557】
抗原と混合するために、ＳＰＡ１４アジュバントを穏やかに５回上下に返して、２回濃縮した抗原と混合する前に生成物を均質化した。次いで、免疫原性組成物（アジュバントＳＰＡ１４＋抗原）を、さらに使用するまで、適切な温度（２～８℃）で保存した。
【0558】
抗原は、２×Ｃ濃縮で製造する必要があった（例えば、５０μｌでの注入下での５μｇの用量の抗原に対して（Ｃ＝１００μｇ／ｍｌ）、抗原を２００μｇ／ｍｌで製造した）。
【0559】
抗原との混合を容積／容積で行い、得られる混合物を穏やかに５回上下に返した。
【0560】
混合物を、注射直前または注射の最大で３時間前に製造した。この後者の場合、これらは、注射まで２～８℃に設置する必要があった。
【0561】
比較アジュバントＡＳ０１Ｂは、Ｓｈｉｎｇｒｉｘの市販のワクチンのアジュバントバイアルからサンプリングした。
【0562】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＩＭＩＣシステムの研究全体におけるいわゆる「ビヒクル」または「ＱＳ２１リポソーム」（実施例３を参照）を、脂質エタノール溶液においてＥ６０２０を含まずにＳＰＡ１４について記載したように製造した。
【実施例2】
【0563】
Ｅ６０２０のアルコール溶解度
Ｉ．材料および方法
Ｅ６０２０（Ｅ６０２０ Ｅｉｓａｉ）およびＭＰＬ粉末（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５製、Ｓｉｇｍａ Ｌ６８９５）を、無水エタノール（ＥｔＯＨ）（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）において０．５、１．０、２．０および１０ｍｇ／ｍｌで可溶化した。
Ｉ．材料および方法
Ｅ６０２０（Ｅ６０２０ Ｅｉｓａｉ）およびＭＰＬ粉末（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５製、Ｓｉｇｍａ Ｌ６８９５）を、無水エタノール（ＥｔＯＨ）（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）において０．５、１．０、２．０および１０ｍｇ／ｍｌで可溶化した。
【0564】
１ｍｌの各溶液を、室温（約２５℃）で３時間混合した。
【0565】
Ｅ６０２０溶液は透明であったが、ＭＰＬ溶液は乳白色であり、乳白色は濃度に応じて増した。不溶性を示す乳白色が出現し、増大した後に、比濁分析を行った。
【0566】
比濁分析は、無水エタノールブランクを含むＵＶ ９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ ＵＶ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ ９６ Ｒｅｆ ８４０４）で、０．２００ｍｌのサンプルと共にＢＭＧ－Ｌａｂｔｅｃｈ Ｎｅｐｈｅｌｏｓｔａｒで実施した。
【0567】
各溶液のＲＮＵ（相対的な比濁分析単位）を記録し、グラフにプロットした。
【0568】
ＩＩ．結果
Ｅ６０２０エタノール溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで完全に透明だった一方、ＭＰＬエタノール溶液は、試験した最低濃度でさえ乳白色であり、乳白色はＭＰＬ濃度に応じて増した。（図１）。
Ｅ６０２０エタノール溶液は、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで完全に透明だった一方、ＭＰＬエタノール溶液は、試験した最低濃度でさえ乳白色であり、乳白色はＭＰＬ濃度に応じて増した。（図１）。
【0569】
データが示す通り、Ｅ６０２０のような本開示に好適なＴＬＲ４アゴニストは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有した。溶解度のこのような度合いは、ＴＬＲ４アゴニストをリポソームの製造のためのエタノール注入法での使用に有利とする。
【0570】
ＭＰＬのエタノールにおける非常に低い溶解度は、このようなリポソーム製造法に適合できないようにする。
【実施例3】
【0571】
Ｅ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームの免疫賦活効果
本実施例では、ＳＰＡ１４の生来の免疫プロファイルを、ＭＩＭＩＣシステムの生来のアームを使用して評価した。ＭＩＭＩＣシステム（ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ヒト免疫系を模倣する人工的なシステムである。このモジュールは、抹消組織等価（ＰＴＥ）構築物と呼ぶが、ＴＬＲアゴニストおよびワクチンを試験するのに予め使用していた三次元組織工学的内皮細胞／コラーゲン基質培養系である（Ｍａ Ｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０年、１３０：３７４～８７頁）。ＰＴＥモジュールへのＴＬＲアゴニストの適用により、多重ビーズ系アレイで評価することができるサイトカインおよびケモカイン生成を誘発するだけでなく、フローサイトメトリー解析で試験することができる樹状細胞（ＤＣ）分化および成熟も促進する（Ｄｒａｋｅら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、１：２８～４０頁；Ｈｉｇｂｅｅら、Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ、２００９年、３７ 補遺１：１９～２７頁）。この解析のために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、およびサイトカイン／ケモカインプロファイルを、未処置のまま、または様々な用量のＳＰＡ１４もしくはＱＳ２１リポソームで処置した培養で評価した。
本実施例では、ＳＰＡ１４の生来の免疫プロファイルを、ＭＩＭＩＣシステムの生来のアームを使用して評価した。ＭＩＭＩＣシステム（ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、ヒト免疫系を模倣する人工的なシステムである。このモジュールは、抹消組織等価（ＰＴＥ）構築物と呼ぶが、ＴＬＲアゴニストおよびワクチンを試験するのに予め使用していた三次元組織工学的内皮細胞／コラーゲン基質培養系である（Ｍａ Ｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０年、１３０：３７４～８７頁）。ＰＴＥモジュールへのＴＬＲアゴニストの適用により、多重ビーズ系アレイで評価することができるサイトカインおよびケモカイン生成を誘発するだけでなく、フローサイトメトリー解析で試験することができる樹状細胞（ＤＣ）分化および成熟も促進する（Ｄｒａｋｅら、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、１：２８～４０頁；Ｈｉｇｂｅｅら、Ａｌｔｅｒｎ Ｌａｂ Ａｎｉｍ、２００９年、３７ 補遺１：１９～２７頁）。この解析のために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、およびサイトカイン／ケモカインプロファイルを、未処置のまま、または様々な用量のＳＰＡ１４もしくはＱＳ２１リポソームで処置した培養で評価した。
【0572】
Ｉ．材料および方法
１．リポソームの製造
ＳＰＡ１４およびＱＳ２１リポソームを、実施例１に記載されるプロトコルによって製造した。
ＳＰＡ１４－２０：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１：０．０１ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
ＳＰＡ１４－８：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１：０．００４ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
ＱＳ２１リポソーム（ＳＰＡ１４－０）：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
１．リポソームの製造
ＳＰＡ１４およびＱＳ２１リポソームを、実施例１に記載されるプロトコルによって製造した。
ＳＰＡ１４－２０：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１：０．０１ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
ＳＰＡ１４－８：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１：０．００４ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
ＱＳ２１リポソーム（ＳＰＡ１４－０）：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／（ＰＢＳでの二分の一希釈後に２：０．５：０．１ｍｇ／ｍｌ）からなるリポソーム製剤。
【0573】
本研究は、ＳＰＡ１４のヒト免疫細胞を刺激する能力を主に評価したが、ＳＰＡ１４中のＥ６０２０の２つの濃度、すなわち８および２０μｇ／ｍＬを試験するために設計し、全ての他のＳＰＡ１４成分を一定に保った。
【0574】
次に、試験項目を、１０倍用量曲線において１：４０～１：４０００、または２倍用量曲線において１：２０～１：１６０で希釈した。ＳＰＡ１４で誘発した生来の免疫シグネチャーに対するＱＳ２１リポソームの寄与を理解するために、ＱＳ２１リポソーム（任意のＴＬＲアゴニストを差し引く）はまた、上述した同じ用量スキームを使用するアッセイで試験した。
【0575】
Ｅ６０２０（ＥＩＳＡＩ）（Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００７年、６：７７３～８４頁；ＷＯ２００７００５５８３Ａ１）、ＳＰＡ１４におけるＴＬＲ－４アゴニストもまた、各用量範囲の最高濃度でアッセイに単独で投薬した。
【0576】
２．ＰＢＭＣの製造
アフェレーシス血液生成物を、ＯｎｅＢｌｏｏｄ（Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ）血液銀行でドナーから収集した。試験プロトコルおよびドナープログラムは、Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｉｎｃ．（コロンビア、ＭＤ）が審査し、承認された。収集の時点で、健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離で濃縮し、Ｍａ Ｙ．ら（Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３０：３７４～８７頁、２０１０年）が教示するＤＭＳＯ含有凍結培地で低温保存した。
アフェレーシス血液生成物を、ＯｎｅＢｌｏｏｄ（Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ）血液銀行でドナーから収集した。試験プロトコルおよびドナープログラムは、Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｉｎｃ．（コロンビア、ＭＤ）が審査し、承認された。収集の時点で、健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離で濃縮し、Ｍａ Ｙ．ら（Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３０：３７４～８７頁、２０１０年）が教示するＤＭＳＯ含有凍結培地で低温保存した。
【0577】
３．ＭＩＭＩＣ（登録商標）ＰＴＥアッセイ
ＭＩＭＩＣ（登録商標）ＰＴＥ構築物は、上述したＭａ Ｙ．らが教示する方法を使用するロボットラインで組み立てられた。
ＭＩＭＩＣ（登録商標）ＰＴＥ構築物は、上述したＭａ Ｙ．らが教示する方法を使用するロボットラインで組み立てられた。
【0578】
簡潔には、内皮細胞を、コラーゲン基質（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ、サンディエゴ、ＣＡ）上で集密まで増殖した。その後、凍結したストックから製造したドナーＰＢＭＣを、アッセイウェルに適用した。９０分間インキュベートした後、非遊走細胞を洗浄することにより除去し、試験項目を、上述した通り、異なる濃度で培養に添加した。
【0579】
１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（緑膿菌由来、カタログ番号Ｌ８６４３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、バーリントン、ＭＡ）および１０μｇ／ｍＬのＲ８４８（カタログ番号ＴＬＲＬ－Ｒ８４８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）の混合物を、これらのアッセイ（Ｌ＋Ｒ）の陽性対照として使用した。Ａｇ／模擬（Ｍ－模擬）を含まない、陰性アッセイ対照は、追加した任意の処置を伴わない培養培地に設定した。
【0580】
培養上清を、処置の４８時間後に採取し、多重アッセイによりサイトカイン／ケモカインを、ＥＬＩＳＡによりＰＧＥ２分泌を解析した。同時点で採取した細胞を、フローサイトメトリーを使用して細胞生存率およびＡＰＣ活性化について表現型を決定した。
【0581】
４．サイトカイン／ケモカイン解析
ＭＩＭＩＣ（登録商標）培養上清を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）ヒト１２－プレックスマルチサイトカイン決定システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して解析した。キットは、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦαを含む。分析物濃度を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘマネージャソフトウェアを使用して関連する標準曲線に基づいて計算した（Ｌｕｎａら、ＰｌｏＳ ｏｎｅ、第１３巻、６ ｅ０１９７４７８．２０１８年６月６日、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９７４７８）。
ＭＩＭＩＣ（登録商標）培養上清を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）ヒト１２－プレックスマルチサイトカイン決定システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して解析した。キットは、ＩＦＮ－α２、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦαを含む。分析物濃度を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘマネージャソフトウェアを使用して関連する標準曲線に基づいて計算した（Ｌｕｎａら、ＰｌｏＳ ｏｎｅ、第１３巻、６ ｅ０１９７４７８．２０１８年６月６日、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９７４７８）。
【0582】
試験実施承認基準（ｒｕｎ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ）に対して、各分析物に対する定量化の下限（ＬＬＯＱ）および定量化の上限（ＵＬＯＱ）は、標準値の５パラメータロジスティック（５ＰＬ）の曲線当てはめに対して、各点の回収パーセント（観察／予想×１００）に基づいて確立した。８０％～１２０％の回収百分率が許容されるとみなされたので、この範囲に含まれる値は、標準曲線の下限および上限を定義する。生データファイルは、ビーズ数に関して検討し；データ点は、１領域あたり最小の３５個のビーズを計数した場合に有効であるとみなした。
【0583】
５．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーの染色および獲得を、上述したＬｕｎａらが教示するように実施した。
フローサイトメトリーの染色および獲得を、上述したＬｕｎａらが教示するように実施した。
【0584】
簡潔には、ＭＩＭＩＣ ＰＴＥ由来細胞を、ＰＢＳで洗浄し、氷上で２０分間、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）で標識した。洗浄し、ＩｇＧ－Ｆｃブロック（正常マウス血清；カタログ番号０１５－０００－１２０、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を実施した後、細胞を、非骨髄系統細胞および免疫リガンド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）に特異的である、蛍光色素標識ｍＡｂｓのカクテル、例えば抗ＣＤ１４、抗ＨＬＡ－ＤＲ、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ１９でインキュベートした。その後、細胞を、緩衝化媒体で洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで取得した。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、アシュランド、ＯＲ）を使用して実施した。フローゲーティングのために、最初に二重項を生細胞集団から排除し、次いでリンパ球（ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋）細胞を、ダンプチャネルアプローチを使用する解析から除去した。次に、ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞を、ＣＤ１１ｃ＋単球性ＤＣおよびＣＤ１２３＋ｐＤＣにゲーティングした。その後、各ＤＣ亜集団を、ＨＬＡ－ＤＲの発現および個々の活性化マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ８６、ＣＤ８３）に対して解析した。
【0585】
６．データ解析およびグラフ作成
データを、統計解析およびグラフ作成のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）にエクスポートした。サイトカインデータは、エクセルのデータベースにエクスポートした。範囲外より高い（＞ＯＯＲ）値（ＵＬＯＱより高い値）は、データ表から除去した。範囲外より低い（＜ＯＯＲ）値は、ＬＬＯＱの１／２を表す値と置き換えた。異なる試験項目は、Ｔｕｋｅｙポスト検定の調節を伴う一元ＡＮＯＶＡ検定を介して比較した。「ｐ」値、ｐ＜０．０５は、著しいとみなされた。
データを、統計解析およびグラフ作成のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）にエクスポートした。サイトカインデータは、エクセルのデータベースにエクスポートした。範囲外より高い（＞ＯＯＲ）値（ＵＬＯＱより高い値）は、データ表から除去した。範囲外より低い（＜ＯＯＲ）値は、ＬＬＯＱの１／２を表す値と置き換えた。異なる試験項目は、Ｔｕｋｅｙポスト検定の調節を伴う一元ＡＮＯＶＡ検定を介して比較した。「ｐ」値、ｐ＜０．０５は、著しいとみなされた。
【0586】
ＩＩ．結果
１．ＳＰＡ１４は最小の免疫毒性である
細胞生存率の評価は、細胞の亜集団において化合物の潜在的な免疫細胞傷害作用を確立するのに重要であった。本研究でこの解析を実施するために、４８時間処置したＭＩＭＩＣ－ＰＴＥ（登録商標）培養由来の細胞を採取し、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色で識別し、フローサイトメトリーを介して細胞生存率を解析した。
１．ＳＰＡ１４は最小の免疫毒性である
細胞生存率の評価は、細胞の亜集団において化合物の潜在的な免疫細胞傷害作用を確立するのに重要であった。本研究でこの解析を実施するために、４８時間処置したＭＩＭＩＣ－ＰＴＥ（登録商標）培養由来の細胞を採取し、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ染色で識別し、フローサイトメトリーを介して細胞生存率を解析した。
【0587】
模擬条件に基づいて１００％の生存率に正規化した各処置条件を示す図２で分かる通り、ＳＰＡ１４－８およびＳＰＡ１４－０（ＱＳ２１リポソーム）は、試験した全ての用量で細胞生存率に最小限で匹敵する影響を有した。興味深いことに、単独で試験した場合、Ｅ６０２０は、ＳＰＡ１４の１：４０希釈に同等の用量で、細胞生存率の４０～５０％の低下を引き起こした。この観察により、リポソーム製剤がＥ６０２０の免疫細胞傷害作用を調整することができることが示された。
【0588】
ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８アゴニストの組合せ（ＬＰＳ＋Ｒ８４８：Ｌ＋Ｒ）が、４８時間の後処置でＰＴＥ細胞生存率においておよそ８０％の低下を誘発したという観察を予想し、アッセイが予想したように動作していたことを実証した。
【0589】
２．ＳＰＡ１４はＡＰＣ活性化／成熟を誘発
ＡＰＣ（抗原提示細胞）は、ＢおよびＴリンパ球を係合し、活性化するその能力を通して適応免疫を導くことができる生来の免疫の主要な要素を表した。ＴＬＲ４アゴニストの主要な機能的特徴は、これらが、ＡＰＣ成熟を引き起こすことであり、これは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、およびＣＤ８０／８６のような表面マーカーの発現の変化、ならびに様々なサイトカインおよびケモカインの変化した発現を含む複雑なプロセスであった。ＭＩＭＩＣ ＰＴＥモジュールでは、ＣＤ１１ｃ＋（ｍＤＣ）亜集団の活性化状態を、採取した細胞の表面上の共刺激マーカーの解析を通し、未処置および処置した培養から得られる上清で評価した可溶性サイトカインの生産を介して測定した。注目すべきは、他のＤＣ亜集団がＭＩＭＩＣ ＰＴＥ構築物で生成されたが、この解析は、様々なＴＬＲアゴニストに応答し、主要な循環ＡＰＣ亜集団の１つをｉｎ ｖｉｖｏで構成するので従来のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣに焦点を当てた（Ｃｏｌｌｉｎら、Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、１４０：２２～３０頁）。
ＡＰＣ（抗原提示細胞）は、ＢおよびＴリンパ球を係合し、活性化するその能力を通して適応免疫を導くことができる生来の免疫の主要な要素を表した。ＴＬＲ４アゴニストの主要な機能的特徴は、これらが、ＡＰＣ成熟を引き起こすことであり、これは、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１４、およびＣＤ８０／８６のような表面マーカーの発現の変化、ならびに様々なサイトカインおよびケモカインの変化した発現を含む複雑なプロセスであった。ＭＩＭＩＣ ＰＴＥモジュールでは、ＣＤ１１ｃ＋（ｍＤＣ）亜集団の活性化状態を、採取した細胞の表面上の共刺激マーカーの解析を通し、未処置および処置した培養から得られる上清で評価した可溶性サイトカインの生産を介して測定した。注目すべきは、他のＤＣ亜集団がＭＩＭＩＣ ＰＴＥ構築物で生成されたが、この解析は、様々なＴＬＲアゴニストに応答し、主要な循環ＡＰＣ亜集団の１つをｉｎ ｖｉｖｏで構成するので従来のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣに焦点を当てた（Ｃｏｌｌｉｎら、Ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、１４０：２２～３０頁）。
【0590】
本発明者らは、アジュバント処理の有無で、ＰＴＥ由来のＡＰＣの表面上の成熟および活性化マーカーの発現を評価した。本研究に特に関心対象となるのは、ＡＰＣ成熟および活性化に対する重要なリガンドとして記載され、未処理のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を駆動するのに重要であることから、共刺激マーカーＣＤ８６（Ｂ７－２）およびＣＤ８３であった（図３参照）。
【0591】
ＳＰＡ１４は、用量依存性の様式でＣＤ８６陽性ＰＴＥ由来ＡＰＣの増加を引き起こすことができた。ＣＤ８３は、類似した発現パターンにしたがった（データは示さず）。
【0592】
３．ＳＰＡ１４はＰＴＥアッセイにおいて免疫刺激性サイトカインの分泌を誘発
未処置および処置したＭＩＭＩＣ ＰＴＥ培養由来の培養上清を、４８時間後に採取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカスタム１２－プレックスアレイを使用してサイトカイン／ケモカイン分泌を解析した。生来の免疫活性に重要であり、免疫細胞傷害も駆動することができるので、以下の生来のケモカイン／サイトカイン：ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０を評価した。
未処置および処置したＭＩＭＩＣ ＰＴＥ培養由来の培養上清を、４８時間後に採取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカスタム１２－プレックスアレイを使用してサイトカイン／ケモカイン分泌を解析した。生来の免疫活性に重要であり、免疫細胞傷害も駆動することができるので、以下の生来のケモカイン／サイトカイン：ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１βおよびＩＰ－１０を評価した。
【0593】
試験した最大用量（１：２０希釈）から得られる結果は、以下の表１に報告する。
【0594】
【表1】
【実施例4】
【0595】
ウサギに投与したＣＭＶ抗原でのＥ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームのアジュバント処理効果
ウサギにおけるＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂの免疫原性評価
本研究の目的は、３週間の間隔をあけた２回の筋肉内注射に続いて、ニュージーランドホワイトウサギにおいて、アジュバントとしてＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂのいずれかを含有するＣＭＶ抗原含有ワクチン組成物で誘発した免疫応答を調査することであった。
ウサギにおけるＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂの免疫原性評価
本研究の目的は、３週間の間隔をあけた２回の筋肉内注射に続いて、ニュージーランドホワイトウサギにおいて、アジュバントとしてＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂのいずれかを含有するＣＭＶ抗原含有ワクチン組成物で誘発した免疫応答を調査することであった。
【0596】
Ｉ．材料および方法
ＣＭＶのＣＭＶ ｇＢ＋ＣＭＶ五量体（五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）抗原を、緩衝液（例えばＰＢＳ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １４０ｍＭ）で濃縮した抗原を希釈することにより製造して、８０μｇ／ｍＬのｇＢ＋８０μｇ／ｍＬの五量体で２倍濃縮した溶液を得、単独で（４０μｇ／ｍＬのｇＢ＋４０μｇ／ｍＬの五量体でＰＢＳでの二分の一希釈）またはＥ６０２０－ＱＳ２１リポソーム、ＳＰＡ１４アジュバントと組み合わせて（容積／容積での混合物）使用した。５００μＬの抗原／アジュバント混合物を、以下の濃度：１用量当たり２０μｇのｇＢ＋２０μｇの五量体で、ＩＭ経路を介して投与した。
ＣＭＶのＣＭＶ ｇＢ＋ＣＭＶ五量体（五量体（ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１）抗原を、緩衝液（例えばＰＢＳ ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １４０ｍＭ）で濃縮した抗原を希釈することにより製造して、８０μｇ／ｍＬのｇＢ＋８０μｇ／ｍＬの五量体で２倍濃縮した溶液を得、単独で（４０μｇ／ｍＬのｇＢ＋４０μｇ／ｍＬの五量体でＰＢＳでの二分の一希釈）またはＥ６０２０－ＱＳ２１リポソーム、ＳＰＡ１４アジュバントと組み合わせて（容積／容積での混合物）使用した。５００μＬの抗原／アジュバント混合物を、以下の濃度：１用量当たり２０μｇのｇＢ＋２０μｇの五量体で、ＩＭ経路を介して投与した。
【0597】
ＨＣＭＶ五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１を、５つのプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株で得たが、各プラスミドは、ＨＣＭＶ五量体を構成する５つのタンパク質の１つをコードする配列を含んだ。配列は、ＢＥ／２８／２０１１株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＰ７４５６６９）に由来した。ｇＨ配列は、組換え五量体の分泌に対して膜貫通ドメインを伴わなかった。五量体複合体の発現の例は、Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年、第１１２巻、第１２号、２５０５～２５１５頁に与えられた。ｇＢｄＴＭは、ＵＳ６，１００，０６４に記載されるように得たが、８０６アミノ酸長のポリペプチドであった。
【0598】
ＡＳ０１Ｂは、それぞれ２：０．５：０．１：０．１ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／ＭＰＬで、商用のワクチンＳｈｉｎｇｒｉｘから得た。２倍濃縮していないので、濃縮した抗原と混合して、１用量当たり２０μｇのｇＢ＋２０μｇの五量体を含有する５５０μｌの注射の容積に達した。
【0599】
ＳＰＡ１４は、それぞれ４：１：０．２：Ｘｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０で、実施例１に記載されるように、または実施例１０に記載されるように製造した。４つの異なる濃度Ｘ：０ｍｇ／ｍｌ、０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、および０．０２ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０を使用して、以下の表２に記載されるＥ６０２０の用量を得た（抗原および注射した５００μｌでのｖ／ｖ希釈）。
【0600】
５６匹の１２～１４週齢の雌のニュージーランドホワイトウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｆｒａｎｃｅ－ＥＳＤ）に、３週間あけて、ＣＭＶ－ｇＢおよび五量体（Ｐｅｎｔ）抗原の異なるアジュバント製剤の２回の筋肉内（ＩＭ、０．５ｍＬまたは０．５５ｍＬ）注射を投与した。ウサギは、各々８匹のウサギを含有する、６つの異なるアジュバント製剤群に割り当てた。各ウサギは、腰部の異なる２部位に、１日目および２２日目に２回のＩＭ注射を受けたが、各部位には１回注射した。対照群１のウサギは、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を与えた。群２および３の処置したウサギは、それぞれ、緩衝液中の抗原、およびＡＳ０１Ｂ対照アジュバント中の抗原を与えた。群４～７の処置したウサギは、それぞれ、０、１、２、および５μｇの用量でＥ６０２０を含有するＳＰＡ１４アジュバント中の抗原を与えた。
【0601】
【表2】
【0602】
血清中和（Ｓｅｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）アッセイ
簡潔には、２．５×１０４個のＭＲＣ５線維芽細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。Ｄ０に、血清を５６℃で３０分間、加熱不活化した。血清サンプルを、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５年８月；７９（１６）：１０３３０～８頁に記載）とインキュベートした。次いで、血清／ウイルス混合物を、ＭＲＣ５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃で、ＭＲＣ５細胞に対しては３日間、ＡＲＰＥ細胞に対しては４日間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターでインキュベートした。
簡潔には、２．５×１０４個のＭＲＣ５線維芽細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。Ｄ０に、血清を５６℃で３０分間、加熱不活化した。血清サンプルを、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５年８月；７９（１６）：１０３３０～８頁に記載）とインキュベートした。次いで、血清／ウイルス混合物を、ＭＲＣ５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃で、ＭＲＣ５細胞に対しては３日間、ＡＲＰＥ細胞に対しては４日間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターでインキュベートした。
【0603】
次いで、培養上清を除去し、細胞を、室温で１時間、ＰＢＳ中の１００μｌの１％ホルモルで固定した。次いで、プレートを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーでの解析の前に、ＰＢＳで洗浄し、室温で空気乾燥して、各ウェルで感染した細胞を計数した。
【0604】
対照として、細胞対照（ウイルスなし）の２つのウェルおよび４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍＬを含有するウイルス希釈の半分を感染させた細胞を含む６つのウェルは、各プレートに存在した。これら６つのウェルの平均は、特異的シグナル値の５０％として決定した、血清中和の閾値を定義した。中和エンドポイント力価は、計算した特異的シグナル値の５０％未満に低下した最後の希釈の逆数として定義した。中和力価（μＰＲＮＴ５０）は、各個体の血清に対して、感染した細胞の５０％の低下を誘発した最後の希釈、すなわち計算した特異的シグナル値の５０％より少なく感染した細胞を誘発した最後の希釈として定義した。幾何平均の中和抗体力価は、各群に対して計算した。
【0605】
ＩＩ．結果
機能的体液性応答
血清におけるＨＣＭＶｇＢ＋ＨＣＭＶ五量体＋ＳＰＡ１４で誘発した中和抗体力価
１、１５、２４、および３６日目に全ての動物から収集した個々の血清サンプルは、その中和活性に対して試験した。ベビーウサギ補体不在下での上皮細胞へのＨＣＭＶの侵入を阻害する中和抗体力価およびベビーウサギ補体存在下での線維芽細胞へのＨＣＭＶの侵入を阻害する中和抗体力価は、それぞれＣＭＶ五量体およびＣＭＶ－ｇＢに特異的な機能的抗体に焦点を当てるために、以下に示した。
機能的体液性応答
血清におけるＨＣＭＶｇＢ＋ＨＣＭＶ五量体＋ＳＰＡ１４で誘発した中和抗体力価
１、１５、２４、および３６日目に全ての動物から収集した個々の血清サンプルは、その中和活性に対して試験した。ベビーウサギ補体不在下での上皮細胞へのＨＣＭＶの侵入を阻害する中和抗体力価およびベビーウサギ補体存在下での線維芽細胞へのＨＣＭＶの侵入を阻害する中和抗体力価は、それぞれＣＭＶ五量体およびＣＭＶ－ｇＢに特異的な機能的抗体に焦点を当てるために、以下に示した。
【0606】
１５日目ならびに２４日目で、全てのアジュバント処理群は、機能的抗体応答を生じた（図４Ａおよび４Ｂ）。著しく高いアジュバント効果を、アジュバント未処理群と比較して少なくとも９倍高いＧＭＴを伴う全てのアジュバント処理群で観察した（全てのｐ値＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ調節）。
【0607】
２４日目に、第２のワクチン投与の後、早期に、どの製剤かにかかわらず、１５日目に得たものと比較して上皮細胞の中和抗体力価のわずかだが著しい増加を観察した（全てのｐ値≦０．０２８）。同様に、全てのアジュバント処理群では、補体存在下で線維芽細胞に２．１～２．５のｌｏｇ１０μＰＲＮＴ５０の範囲の平均中和抗体力価を伴う機能的抗体応答が生じた（図４Ｂ）。中和抗体応答の上昇では、どの血清中和アッセイを使用しても、全てのワクチン製剤に対して２４日目と比較して、少なくとも１５倍の上昇を３６日目にさらに確認した。
【0608】
ＳＰＡ１４製剤のＥ６０２０用量範囲に関して、Ｅ６０２０投与量の著しい影響は、中和抗体応答で観察されなかった。ＳＰＡ１４リポソームに１、２または５μｇのＥ６０２０を添加することで、Ｅ６０２０を含まないＳＰＡ１４リポソームと比較して最大で２倍高い中和抗体力価を誘発したが、これらの差のいずれも統計的には有意ではなかった（全てのｐ値＞０．０６）。ＳＰＡ１４製剤のＡＳ０１Ｂベンチマークとの比較に関して、ＳＰＡ１４アジュバント処理群に対する補体を含むおよび含まない上皮細胞で測定した中和抗体力価は、どのＳＰＡ１４に含有したＥ６０２０投与量か、どの時点かにかかわらず、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理群で測定したものと著しく異なることはなかった（全てのｐ値＞０．０５、片側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。線維芽細胞で（２４日目に補体と共に）測定したＧＭＴに対して、ＳＰＡ１４＋０μｇのＥ６０２０およびＳＰＡ１４＋１μｇのＥ６０２０を投与した群で得られる中和抗体力価は、どのＳＰＡ１４に含有したＥ６０２０投与量か、どの時点かにかかわらず、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理群で測定したものよりそれぞれ２．３および２倍、著しく劣っていた（ｐ値≦０．０２、片側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）（全てのｐ値＞０．０５、片側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。線維芽細胞で（２４日目に補体と共に）測定したＧＭＴに対して、ＳＰＡ１４＋０μｇのＥ６０２０およびＳＰＡ１４＋１μｇのＥ６０２０を投与した群で得られる中和抗体力価は、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理群で測定したものよりそれぞれ２．３および２倍、著しく劣っていた（ｐ値≦０．０２、片側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）。次いで、ＳＰＡ１４でより高いＥ６０２０投与量、すなわち２および５μｇでは、著しい差は観察されなかった（ｐ値＞０．１８）。
【0609】
全体としてみると、これらの結果は、ＳＰＡ１４が、アジュバント中に存在するＥ６０２０の量にかかわらず、免疫化したウサギ由来の血清でのＨＣＭＶ中和抗体応答を向上させることを示す傾向にあった。さらに、ＳＰＡ１４アジュバント処理群で補体を含む線維芽細胞で測定した中和抗体力価は、Ｅ６０２０含量がＡＳ０１Ｂで使用されるＭＰＬの濃度未満のままである少なくとも２μｇ／用量であった場合、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理群で測定したものと著しく異なることはなかった。
【0610】
ＱＳ２１と共にリポソーム中のアジュバントを製剤化するＥ６０２０の使用により、ＭＰＬＡの使用と比較して２５分の１の化合物しか必要としないので、それ自体特に有利であることが明らかになった。これは、費用および潜在的な反応原性に関して有利となる。
【0611】
【実施例5】
【0612】
マウスに投与したＣＭＶ抗原でのＥ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームのアジュバント処理効果
Ｉ．材料および方法
本マウス研究では、７週齢の未処理の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの群は、０、２１、および２２１日目（７か月目）にＩＭ経路を介して、ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および１μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）またはＡＳ０１Ｅ（商用のワクチンＳｈｉｎｇｒｉｘから得られる実施例３に記載されるＡＳ０１Ｂの２倍希釈）アジュバントで製剤化した、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（各２μｇ／用量）の３回のＩＭ免疫化を受けた。血液サンプルを、血清中和抗体応答をモニタリングするために１、２、３、４、５、６、７、および８か月目に収集した（血清中和アッセイは、実施例４に記載の通りであった）。加えて、１、７、および８か月目に、血液および脾臓を、１群当たり１０匹のマウスから収集して、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）の頻度、ならびにＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌をモニタリングした。
Ｉ．材料および方法
本マウス研究では、７週齢の未処理の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの群は、０、２１、および２２１日目（７か月目）にＩＭ経路を介して、ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および１μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）またはＡＳ０１Ｅ（商用のワクチンＳｈｉｎｇｒｉｘから得られる実施例３に記載されるＡＳ０１Ｂの２倍希釈）アジュバントで製剤化した、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（各２μｇ／用量）の３回のＩＭ免疫化を受けた。血液サンプルを、血清中和抗体応答をモニタリングするために１、２、３、４、５、６、７、および８か月目に収集した（血清中和アッセイは、実施例４に記載の通りであった）。加えて、１、７、および８か月目に、血液および脾臓を、１群当たり１０匹のマウスから収集して、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）の頻度、ならびにＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌をモニタリングした。
【0613】
ＩＩ．結果
最大で７か月目（後期のブースターの前）に、アジュバント効果では、全ての試験した製剤に対してＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的免疫応答が実証された。
最大で７か月目（後期のブースターの前）に、アジュバント効果では、全ての試験した製剤に対してＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的免疫応答が実証された。
【0614】
ＳＰＡ１４対ＡＳ０１Ｅの結果は、以下の表３に示した。
【0615】
全ての時点およびパラメータに対して、抗体応答、例えば中和抗体、ならびにＢ記憶分泌性細胞の頻度は、ＡＳ０１Ｅアジュバント対照で得られたが、ＳＰＡ１４で得られる応答と類似した、またはこの応答より低い（著しく異なることはない）傾向があった。ＳＰＡ１４とＡＳ０１Ｅとの間のいくらかの差は、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルを誘発するＳＰＡ１４をもたらすＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインプロファイルに関して観察された。
【0616】
【表3】
【0617】
結論として、マウスモデルにおいて最大で８か月目に行った解析では、ＳＰＡ１４が、ＣＭＶ抗原に対する免疫応答を向上させるのにＡＳ０１と同様に少なくとも効果的であったことを結論付けることができた。
【実施例6】
【0618】
マウスに投与したＦＬＵ抗原でのＥ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームのアジュバント処理効果
ＳＰＡ１４と余剰時間で（ｅｘｔｒａｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）混合した季節性の四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）との免疫原性研究を実施して、未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバントの利点を試験した。
ＳＰＡ１４と余剰時間で（ｅｘｔｒａｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）混合した季節性の四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）との免疫原性研究を実施して、未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアジュバントの利点を試験した。
【0619】
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのアジュバントＡＳ０１Ｂを、本研究のコンパレーター対照として使用した。Ａ／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア系統）、およびＢ／プーケット／３０７３／２０１３（山形系統）株を含有する北半球２０１７～２０１８の季節性ＱＩＶのＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）の商用のロットを使用した。
【0620】
抗原およびアジュバントバッチを、以下の表４および５に示すように製造した。
【0621】
本研究の目的は、マウスモデルにおいてＳＰＡ１４アジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ワクチン（＋／－ＳＰＡ１４）の免疫原性を評価することであった。ここで、未処理のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＳＰＡ１４アジュバント処理した季節性の四価インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）の免疫原性を評価した。
【0622】
Ｉ．材料および方法
マウスの群（ｎ＝８）を、ＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂアジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶで免疫化し、血球凝集抑制（ＨＡＩまたはＨＩ）応答、生来の応答、およびＴｈ１／Ｔｈ２比に対して試験した。アジュバントを、市販の製剤と混合した。抗原、ＴＬＲ４アゴニスト、およびＱＳ２１の最終量は、以下の表４および５に示した。
マウスの群（ｎ＝８）を、ＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂアジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶで免疫化し、血球凝集抑制（ＨＡＩまたはＨＩ）応答、生来の応答、およびＴｈ１／Ｔｈ２比に対して試験した。アジュバントを、市販の製剤と混合した。抗原、ＴＬＲ４アゴニスト、およびＱＳ２１の最終量は、以下の表４および５に示した。
【0623】
試験は、Ｄ０に６～８週齢で、最小で２０ｇの体重の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスで実施した。動物は、２８ｇのニードル、０．５ｍＬのシリンジ（ＢＤ＃３２９４６１）を使用して、右大腿部の筋肉に筋肉内経路を介して免疫化した。５０μＬの試験した組成物をマウスごとに注射した。
【0624】
【表4】
【0625】
【表5】
【0626】
生物学的サンプリング
２１日目、試験した組成物の用量２を投与する前に、７５μＬの血液を下顎の出血を介して収集した。終末部血液を３５日目に心臓穿刺によりゲルチューブに収集した。その後、室温で少なくとも３０分間インキュベートした後、２３℃で５分間、１００００ｇで遠心分離した。上清をマイクロバイアルに等分し、－２０℃の冷凍庫で保存した。
２１日目、試験した組成物の用量２を投与する前に、７５μＬの血液を下顎の出血を介して収集した。終末部血液を３５日目に心臓穿刺によりゲルチューブに収集した。その後、室温で少なくとも３０分間インキュベートした後、２３℃で５分間、１００００ｇで遠心分離した。上清をマイクロバイアルに等分し、－２０℃の冷凍庫で保存した。
【0627】
赤血球凝集素阻害アッセイ：
血清を、ＲＤＥ（ＲＤＥ（ＩＩ）「Ｓｅｉｋｅｎ」（受容体破壊酵素）、カタログＵＣＣ－３４０－１２２、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で１：５希釈し、終夜（１８～２０時間）、３７℃の水浴に設置した。血清を５６℃で４０分間、加熱不活化した。ＰＢＳとさらに１：２希釈を実施し、１：１０の最終血清希釈を得た。シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）を、０．７５％ＴＲＢＣをＰＢＳ／０．７５％ＢＳＡに混合することにより製造した。抗原を、４血球凝集単位（ＨＡＵ）を２５μｌに含有するようにＰＢＳ／０．７５％ＢＳＡに希釈して、以下を確認した。９６ウェルプレートの３列を５０μｌのＰＢＳで充填した。２列の第１のウェルは、さらなる５０μｌのウイルスで充填し、２倍希釈において最終ウェルに滴定した。５０マイクロリットル（５０μｌ）のＴＲＢＣを添加し、プレートを振とうし、ＨＡＵを室温で１時間インキュベートした後に読み出した。
血清を、ＲＤＥ（ＲＤＥ（ＩＩ）「Ｓｅｉｋｅｎ」（受容体破壊酵素）、カタログＵＣＣ－３４０－１２２、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で１：５希釈し、終夜（１８～２０時間）、３７℃の水浴に設置した。血清を５６℃で４０分間、加熱不活化した。ＰＢＳとさらに１：２希釈を実施し、１：１０の最終血清希釈を得た。シチメンチョウ赤血球（ＴＲＢＣ）を、０．７５％ＴＲＢＣをＰＢＳ／０．７５％ＢＳＡに混合することにより製造した。抗原を、４血球凝集単位（ＨＡＵ）を２５μｌに含有するようにＰＢＳ／０．７５％ＢＳＡに希釈して、以下を確認した。９６ウェルプレートの３列を５０μｌのＰＢＳで充填した。２列の第１のウェルは、さらなる５０μｌのウイルスで充填し、２倍希釈において最終ウェルに滴定した。５０マイクロリットル（５０μｌ）のＴＲＢＣを添加し、プレートを振とうし、ＨＡＵを室温で１時間インキュベートした後に読み出した。
【0628】
９６ウェルＶ底アッセイプレートの各ウェルを２５μｌのＰＢＳで充填した。血清を、最上列に加え、２倍希釈でカラムを希釈した。各サンプルを二重に試験した。第２から最終カラムは、陽性対照の血清を含有し、最終カラムは、陰性対照（ＰＢＳ）およびウイルス逆滴定を含有した。２５μＬのウイルスを、最終カラムを除いて各ウェルに添加した。プレートを振とうし、室温で１時間インキュベートした。次いで、５０μＬのＴＲＢＣを各ウェルに添加した後、１時間インキュベートし、その後血球凝集パターンを、わずかな角度でプレートを滴定することにより読み出した。
【0629】
本研究に対して、Ａ／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／ブリスベン／６０／２００８を含む同種ウイルスパネル、ならびにＡ／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６およびＢ／コロラド／０６／２０１７株を含む同種ウイルスパネルは、卵で増殖した。
【0630】
Ｌｕｍｉｎｅｘベースのアッセイによる１８－プレックスサイトカイン／ケモカイン評価
免疫化後のマウスで誘発したサイトカインプロファイルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキット：マウス高感度Ｔ細胞磁性ビーズパネル（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＨＳＴＣＭＡＧ－７０ＫＰＭＸ）を使用して、血清サイトカイン／ケモカインレベルの定量化により評価した。以下のサイトカイン／ケモカイン：ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＫＣ／ＣＸＣＬ１、ＬＩＸ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－２、およびＴＮＦ－αを定量化した。
免疫化後のマウスで誘発したサイトカインプロファイルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキット：マウス高感度Ｔ細胞磁性ビーズパネル（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＭＨＳＴＣＭＡＧ－７０ＫＰＭＸ）を使用して、血清サイトカイン／ケモカインレベルの定量化により評価した。以下のサイトカイン／ケモカイン：ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＫＣ／ＣＸＣＬ１、ＬＩＸ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－２、およびＴＮＦ－αを定量化した。
【0631】
マウス高感度Ｔ細胞磁性ビーズパネルアッセイキットのアッセイプロトコルは、以下の通りであった。バイオセーフティキャビネットの中で、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を、キットに設けられた９６ウェルプレートに分配した。プレートを設けられたプレートシーラーキットで被覆し、室温で１０分間、５００ｒｐｍ～８００ｒｐｍでの水平軌道プレート振とう機に設置した。洗浄緩衝液をデカントし、あらゆる残留液を吸収紙にタッピングした。２５μＬの血清マトリクスを、基準および対照のウェルに添加し；２５μＬのアッセイ緩衝液をサンプルウェルの各々に添加した。２５μＬの血清を各プレートの指定したウェルに添加した。
【0632】
サンプルを二重に評価した。５０μＬの基準および品質対照を適切なウェルに添加し、５０μＬの血清マトリクスをブランク（ＢＬ）のために使用した。予備混合した１８－プレックスのビーズを、プレートに添加する前に１分間ボルテックスした。ビーズを、１ウェル当たり２５μＬのビーズを追加する前にピペットで上下に混合した。プレートを粘着型アルミニウムプレートシーラーで密封し、２～８℃で終夜、５００ｒｐｍ～８００ｒｐｍでの水平軌道プレート振とう機でインキュベートした。
【0633】
次の日、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｗａｓｈ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏを作動させ、プライミングした。主な機能は、洗浄ステーションチャネルを洗浄緩衝液で充填し、使用の前にあらゆる気泡を除去した。検出抗体およびストレプトアビジン－フィコエリスリンを、試薬が周囲温度に達するように、使用の３０分前に２～８℃で保存から除去した。プレートを、「Ｍａｇ ３×」洗浄プログラムを使用して３回洗浄した。２５μＬの検出抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを粘着型アルミニウムプレートシーラーで被覆し、室温で１時間、５００ｒｐｍ～８００ｒｐｍでの水平軌道プレート振とう機でインキュベートした。
【0634】
Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘプレートリーダーシステムを、この検出抗体をインキュベートする間に較正した。公知の分析物の低濃度および高濃度のビーズセットを含む較正キットを使用して、機械が正確に作動し、較正キットとして定義されるセットパラメータ内で読み出していたことを測定した。インキュベートした後、２５μＬのストレプトアビジン－フィコエリスリンを各ウェル（洗浄なし）に添加した。プレートを粘着型アルミニウムプレートシーラーで密封し、室温で３０分間、５００ｒｐｍ～８００ｒｐｍでの水平軌道プレート振とう機でインキュベートした。プレートを、「Ｍａｇ ３ｘ」洗浄プログラムを使用して３回洗浄した。
【0635】
１５０μＬのシース流体を全てのウェルに添加した。プレートを粘着型アルミニウムプレートシーラーで被覆し、２～８℃で少なくとも５分間、５００ｒｐｍ～８００ｒｐｍでの水平軌道プレート振とう機で振とうして、ビーズの懸濁を確実にすることが可能である。プレートを読み出すためのプロトコルは、Ｂｉｏｐｌｅｘマネージャーソフトウェアプロトコルにおいてサンプル、基準、および対照に対する希釈倍率でサンプルプレートマップを含んだ設定であった。サンプルの希釈倍率を、サンプルをアッセイ緩衝液で１：２に希釈するように、２に設定した。基準および対照の希釈も設定した。プレートを低いＰＭＴ ＲＰ１セッティングで、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ２００プレートリーダーまたはＣＳ １０００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み出した。
【0636】
ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＬ－５およびＩＮＦ－γサイトカイン評価
抗マウスＩＦＮ－γ（カタログ番号３３２１－３－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）およびＩＬ－５ ｍＡｂｓ（カタログ番号３３９１－３－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）を、滅菌ＰＢＳ ｐＨ７．４（カタログ番号１００１００２３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔ ＰＶＤＦ膜プレート（カタログ番号ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４℃で終夜、１００μＬ／ウェルのこれらの希釈したｍＡｂｓとコーティングした。
抗マウスＩＦＮ－γ（カタログ番号３３２１－３－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）およびＩＬ－５ ｍＡｂｓ（カタログ番号３３９１－３－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）を、滅菌ＰＢＳ ｐＨ７．４（カタログ番号１００１００２３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔ ＰＶＤＦ膜プレート（カタログ番号ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４℃で終夜、１００μＬ／ウェルのこれらの希釈したｍＡｂｓとコーティングした。
【0637】
各マウスの脾臓を、１０ｍｌの氷冷完全培地に採取し、均質化するためにＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（カタログ番号１３０－０９６－３３４、ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に移した。チューブを１，２００ｒｐｍで６分間、遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを４ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（カタログ番号Ａ１０４９２－０１、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、室温（ＲＴ）で３分間インキュベートして、赤血球を溶解した。細胞懸濁液を、４０μｍの細胞ストレーナー（カタログ番号３５２３４０、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用してろ過し、１，２００ｒｐｍで６分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１０ｍＬの完全培地で再懸濁した。
【0638】
再懸濁した細胞を、Ｇｕａｖａ溶液（カタログ番号４０００－００４１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）で１：２０に希釈した。細胞数および生存率を、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ細胞カウンターを使用して決定し、細胞濃度は、１×１０７個の細胞／ｍＬ（５×１０５個の細胞／５０μＬ／ウェル）に調節した。
【0639】
コーティング抗体溶液を除去し、プレートを２００μＬ／ウェルの滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、２００μｌ／ウェルのブロッキング溶液（完全培地）をＲＴで２時間、プレートに添加した。
【0640】
刺激剤、組換えＡ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）タンパク質、またはペプチドプール（特異的刺激）、およびＣｏｎ Ａ（陽性対照）を含む溶液を、最終濃度の２倍に完全培地で希釈した。組換えタンパク質の最終濃度は５μｇ／ｍＬであった。ペプチドプールは１２２個のペプチドを含有した。各ペプチドの長さは、１１個のアミノ酸が重複した１５個のアミノ酸であった。各ペプチドの最終濃度は２μｇ／ｍＬであった。Ｃｏｎ Ａの濃度は２．５μｇ／ｍｌであった。完全培地は陰性対照として使用した。ブロッキング溶液で２時間インキュベートした後、プレートを空にし、５０μＬの希釈した刺激剤と、続く５０μＬの細胞懸濁液を添加し、プレートの側面を穏やかにタッピングすることにより混合した。次いで、プレートを、５％ＣＯ２を供給した３７℃で２０時間インキュベートした。
【0641】
細胞をプレートから除去し、２００μＬ／ウェルの水を添加し、プレートをＲＴで３分間インキュベートしてプレートに付着した細胞を溶解した。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳで５回洗浄し、完全培地で希釈した１００μＬ／ウェルの１μｇ／ｍＬのビオチン化抗マウスＩＦＮ－γ（カタログ番号３３２１－６－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）またはＩＬ－５ ｍＡｂｓ（カタログ番号３３９１－６－１０００、ＭＡＢＴＥＣＨ）を添加した。プレートをＲＴで２時間インキュベートし、次いで２００μｌ／ウェルのＰＢＳで５回洗浄した。１００μｌ／ウェルの１：１０００希釈したアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（カタログ番号７１００－０４、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を、プレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液（カタログ番号Ｐ１３４０４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、発色現象するために添加した。プレートをＲＴで暗室において、３０分間またはスポットが生じるまでインキュベートした。プレートを水で５回すすぎ、ＲＴで２４時間、暗室において空気乾燥した。スポットを計数し、ＣＴＬ－Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ７．０．２３．２ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＤＣ＼ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ７、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）およびソフトウェア（ＣＴＬ Ｓｗｉｔｃｈｂｏａｒｄ２．７．２）を使用して解析した。１００万個当たりのスポット形成細胞の数を報告した。
【0642】
データ解析
ＨＡＩ力価に対して：
この目的は、１３６個のマウス血清（１３６個の血清×３つのウイルス株；１３６個の血清×２つのウイルス株）に対して、同種（ミシガン／２０１５、香港／２０１４、ブリスベン／２００８）および異種（シンガポール／２０１６、コロラド／２０１７）インフルエンザ株に対するＨＡＩ力価を決定することであった。Ｄ３５時点で得られた個々の動物血清は、全ての処置群に対するＨＡＩに対して試験した。ＨＡＩ力価をｌｏｇ２変換し、群による計算手段に対する記述分析を、同種（ミシガン／２０１５、香港／２０１４、ブリスベン／２００８）ならびに異種（Ａ／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６およびＢ／コロラド／０６／２０１７）インフルエンザ株に対して実施した。検出限界未満の値（＜１０）は、ｌｏｇ２変換する前に限界の半分の値で置き換えた。
ＨＡＩ力価に対して：
この目的は、１３６個のマウス血清（１３６個の血清×３つのウイルス株；１３６個の血清×２つのウイルス株）に対して、同種（ミシガン／２０１５、香港／２０１４、ブリスベン／２００８）および異種（シンガポール／２０１６、コロラド／２０１７）インフルエンザ株に対するＨＡＩ力価を決定することであった。Ｄ３５時点で得られた個々の動物血清は、全ての処置群に対するＨＡＩに対して試験した。ＨＡＩ力価をｌｏｇ２変換し、群による計算手段に対する記述分析を、同種（ミシガン／２０１５、香港／２０１４、ブリスベン／２００８）ならびに異種（Ａ／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６およびＢ／コロラド／０６／２０１７）インフルエンザ株に対して実施した。検出限界未満の値（＜１０）は、ｌｏｇ２変換する前に限界の半分の値で置き換えた。
【0643】
サイトカイン評価に対して：
９つの群（８匹の動物／群）は、マウス高感度Ｔ細胞磁性ビーズパネルキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で試験した。このキットは１８個の分析物を評価した。事前採血群は、限定した数の動物から免疫化の４日前に収集した。したがって、一対の事前採血および免疫化の６時間後のサンプルは存在しない。事前採血サンプルは、解析に関して別個の群として処置した。
９つの群（８匹の動物／群）は、マウス高感度Ｔ細胞磁性ビーズパネルキット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で試験した。このキットは１８個の分析物を評価した。事前採血群は、限定した数の動物から免疫化の４日前に収集した。したがって、一対の事前採血および免疫化の６時間後のサンプルは存在しない。事前採血サンプルは、解析に関して別個の群として処置した。
【0644】
サンプル、対照、および基準に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｌｕｍｉｎｅｘ２００プレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）またはＣＳ １０００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。データは、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘマネージャソフトウェアを使用して解析した。品質対照に対する承認基準は、高低両方の品質対照に対する計算した濃度が、製造者が設定したロット特異的な濃度範囲内にあることであった。対照値が範囲内であった場合、対照は合格し、アッセイ結果は認められた。５パラメータロジスティック回帰曲線を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘマネージャソフトウェアを使用してプロットした。各サンプルに特異的なサイトカイン濃度を、標準曲線から補間し、ｐｇ／ｍｌで報告した。各サイトカインに対してアッセイキットパラメータ／製造者が設定した定量化の限界（ＬＯＱ）未満であった、または「ＯＯＲ≦範囲外より低い」であったといういずれの結果も、解析に対するアッセイのＬＯＱ値によって変化した。
【0645】
ＩＩ．結果
ＳＰＡ１４では、機能的ＨＡアッセイでモニタリングした通り、抗原特異的抗体の高い力価を誘発することにより免疫原性を向上させることが見出された。同種ＨＩ力価の上昇は、全てのアジュバント処理したワクチン群で顕著であった。
ＳＰＡ１４では、機能的ＨＡアッセイでモニタリングした通り、抗原特異的抗体の高い力価を誘発することにより免疫原性を向上させることが見出された。同種ＨＩ力価の上昇は、全てのアジュバント処理したワクチン群で顕著であった。
【0646】
ＳＰＡ１４はまた、本研究で試験したＨ３およびＢ異種ウイルスに対するＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ワクチン接種群において異種ＨＡＩ力価を向上させた。ＳＰＡ１４は、Ｔｈ１応答へと応答をシフトした。加えて、２つのアジュバントは、アジュバント処理していない製剤と比較して、ＩＦＮγ、ＩＬ－５、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＫＣ、およびＩＬ－６の分析物での測定可能な上昇をもたらした。ＳＰＡ１４の実施は、ＡＳ０１Ｂに匹敵した。
【0647】
ＳＰＡ１４アジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ワクチンを伴う免疫原性
ＳＰＡ１４アジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶ（＋／－ＳＰＡ１４）の同種および異種免疫応答を誘発する能力を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。その目的のために、８匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの２５個の群を、商用のＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）季節性インフルエンザワクチンでのＩＭ経路により、３週間あけて（Ｄ０およびＤ２１に）２回免疫化した。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ワクチンに対して０．１μｇおよび０．５μｇのＨＡならびにＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ワクチンに対して０．１μｇおよび１．０μｇのＨＡの用量は、ＳＰＡ１４アジュバントの免疫原性を評価するために選択した。
ＳＰＡ１４アジュバント処理したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶ（＋／－ＳＰＡ１４）の同種および異種免疫応答を誘発する能力を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。その目的のために、８匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの２５個の群を、商用のＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）季節性インフルエンザワクチンでのＩＭ経路により、３週間あけて（Ｄ０およびＤ２１に）２回免疫化した。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ワクチンに対して０．１μｇおよび０．５μｇのＨＡならびにＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ワクチンに対して０．１μｇおよび１．０μｇのＨＡの用量は、ＳＰＡ１４アジュバントの免疫原性を評価するために選択した。
【0648】
対照群は、Ｈ３Ａ／香港／４８０１／２０１４株由来の０．５μｇ投与量の組換えＨＡ（ｒＨＡ）を受けた（ｎ＝８匹のマウス）。免疫化の３５日後の動物で誘起した血清学的抗体応答は、インフルエンザ株の同種パネル［Ａ株：Ａ／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ株：Ｂ／ブリスベン／６０／２００８（ビクトリア系統）］ならびに異種パネル（Ａ／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６およびＢ／コロラド／０６／２０１７）に対してニワトリ赤血球（ＲＢＣ）で実施したＨＡＩアッセイで測定した。
【0649】
図５の結果では、Ａ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）株に対するＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ（０．１μｇのＨＡ（図５のＦＺ ０．１）および０．５μｇのＨＡ（図５のＦＺ ０．５））で得られる予備的なＨＡＩ力価が図示された。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ（０．１および０．５μｇのＨＡ）の両方の用量で、アジュバントＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂは、抗原単独と比較した場合、ＨＡＩ力価を向上させた。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶで得られるこれらの結果に基づいて、本発明者らは、同種および異種インフルエンザ株の拡大パネルに対するその後の試験に対してより高用量の０．５μｇのＨＡを選んだ。
【0650】
Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶ（０．５μｇのＨＡ）（図６のＦＺ ０．５）に対して図６で図示した結果では、アジュバントＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂの両方が、３つの同種株に対して単独での抗原と比較した場合、ＨＡＩ力価を向上させたことが示された。ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂアジュバントはまた、異種株（シンガポール／２０１６およびコロラド）と交差反応することが可能なＨＡＩ力価も向上させた。Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）ＱＩＶで得られる結果では、ＳＰＡ１４がＡＳ０１Ｂと同様に実施したことが示された。
【0651】
Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）ＱＩＶ（１μｇのＨＡ）（図７のＦＢ １）に対して図７で図示した結果では、アジュバントＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂの両方が、Ａ／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）およびブリスベン株に対して単独での抗原と比較した場合、ＨＡＩ力価を向上させたことが示された。
【0652】
予想した通り、抗体応答は、異種株に対して単独でのＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂアジュバントで誘発されなかった。
【0653】
ＳＰＡ１４アジュバント処理したワクチンに対する生来のサイトカイン応答
免疫化の６時間後の免疫化した動物の血清で評価した図８におけるサイトカイン／ケモカインプロファイリングでは、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）（図８のＦｚｏｎ）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）（図８のＦｂｌｏｋ）アジュバント処理した製剤での免疫化に応答してＩＦＮγ、ＩＬ－５、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＫＣ、およびＩＬ－６分泌の測定可能な上昇が実証された。アジュバント処理していない製剤での免疫化により、事前採血と類似したプロファイルが得られた。ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂアジュバントは、Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）と使用した場合、サイトカイン応答の類似した上昇を誘発した。類似したまたは明らかに高い応答は、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）を含むＡＳ０１ＢおよびＳＰＡ１４で観察された。
免疫化の６時間後の免疫化した動物の血清で評価した図８におけるサイトカイン／ケモカインプロファイリングでは、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）（図８のＦｚｏｎ）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）（図８のＦｂｌｏｋ）アジュバント処理した製剤での免疫化に応答してＩＦＮγ、ＩＬ－５、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＫＣ、およびＩＬ－６分泌の測定可能な上昇が実証された。アジュバント処理していない製剤での免疫化により、事前採血と類似したプロファイルが得られた。ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂアジュバントは、Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）と使用した場合、サイトカイン応答の類似した上昇を誘発した。類似したまたは明らかに高い応答は、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）を含むＡＳ０１ＢおよびＳＰＡ１４で観察された。
【0654】
ＳＰＡ１４アジュバント処理したワクチンに対する適用性細胞応答
Ｔｈ１（ＩＦＮｇ）／Ｔｈ２（ＩＬ－５）サイトカイン分泌は、ブースト免疫（３５日目）の２週間後、免疫化したマウスの脾細胞で評価した。ＥＬＩＳｐｏｔで測定する通り、マウスを単独で免疫化したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）またはＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）では、低いＴｈ１／Ｔｈ２比が実証されたが、ＳＰＡ１４の追加は、抗原単独の群と比較してＴｈ１／Ｔｈ２比を著しく高めた。ＡＳ０１Ｂアジュバントは、ＳＰＡ１４群と比較してＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン応答比を著しく高めた（図９）。ＡＳ０１Ｂと比較して、ＳＰＡ１４は、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン分極化を誘発した。
Ｔｈ１（ＩＦＮｇ）／Ｔｈ２（ＩＬ－５）サイトカイン分泌は、ブースト免疫（３５日目）の２週間後、免疫化したマウスの脾細胞で評価した。ＥＬＩＳｐｏｔで測定する通り、マウスを単独で免疫化したＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）またはＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）では、低いＴｈ１／Ｔｈ２比が実証されたが、ＳＰＡ１４の追加は、抗原単独の群と比較してＴｈ１／Ｔｈ２比を著しく高めた。ＡＳ０１Ｂアジュバントは、ＳＰＡ１４群と比較してＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン応答比を著しく高めた（図９）。ＡＳ０１Ｂと比較して、ＳＰＡ１４は、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン分極化を誘発した。
【実施例7】
【0655】
マウスに投与したヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）抗原でのＥ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームのアジュバント処理効果およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）のアジュバントＡＳ０１Ｂで引き起こされる免疫応答プロファイルとの比較
ＳＰＡ１４と即時的に混合したヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）由来の組換えタンパク質を使用する免疫原性研究を実施して、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント製剤の利点を試験した。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのアジュバントＡＳ０１Ｂ（ＧＳＫ ＡＳ０１Ｂ）を使用して、同じ研究でＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂで誘起した免疫応答のプロファイルを比較した。ｈＣＭＶ由来のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１タンパク質を含有する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および五量体を抗原として使用した。
ＳＰＡ１４と即時的に混合したヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）由来の組換えタンパク質を使用する免疫原性研究を実施して、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるアジュバント製剤の利点を試験した。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのアジュバントＡＳ０１Ｂ（ＧＳＫ ＡＳ０１Ｂ）を使用して、同じ研究でＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂで誘起した免疫応答のプロファイルを比較した。ｈＣＭＶ由来のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１タンパク質を含有する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および五量体を抗原として使用した。
【0656】
本研究の目的は、ＳＰＡ１４アジュバント処理したｇＢおよび五量体ワクチン（＋／－ＳＰＡ１４）で誘起した抗体およびエフェクター細胞免疫応答を評価し、未処理のＣ５７Ｂｌ／６マウスでの同じプロトコルデザインおよび実験条件下で、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理したｇＢおよび五量体ワクチンで得られるものと比較することであった。
【0657】
マウスの群（ｎ＝８）を、Ｄ０およびＤ２１に、ＳＰＡ１４アジュバント処理したまたはＡＳ０１Ｂアジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体で免疫化し、上皮ＡＲＰ－１９および線維芽細胞ＭＲＣ－５細胞株、ｇＢおよび五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）、ならびにｇＢおよび五量体に特異的なＴヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）で血清中和ウイルス活性（ＳＮ）に対して試験した。
【0658】
血液および脾臓細胞サンプルを、Ｄ２０でのプライミングの３週間後、および免疫読出し解析に対してＤ３５でのブーストの２週間後に採取した。
【0659】
Ｉ．材料および方法
動物の情報
６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ、Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｍａｉｎ ｓｕｒ ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランスにより提供され、ＡＡＡＬＡＣ認可条件にしたがってＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ施設（Ｍａｒｃｙ Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に収容した。本研究は、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒの倫理委員会（Ｍａｒｃｙ Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）が審査した。全ての実験は、２０１３年の２月７日のフランス官報で出版されたＥｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ２０１０／６３／ＵＥにしたがって行った。
動物の情報
６～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ、Ｓａｉｎｔ Ｇｅｒｍａｉｎ ｓｕｒ ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランスにより提供され、ＡＡＡＬＡＣ認可条件にしたがってＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ施設（Ｍａｒｃｙ Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に収容した。本研究は、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒの倫理委員会（Ｍａｒｃｙ Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）が審査した。全ての実験は、２０１３年の２月７日のフランス官報で出版されたＥｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ２０１０／６３／ＵＥにしたがって行った。
【0660】
Ｄ０に最小で２０ｇの体重の動物は、Ｄ０にプライミングし、２８ｇのニードル、０．５ｍＬのシリンジ（ＢＤ＃３２９４６１）を使用してＤ２１に筋肉内経路投与（ＩＭ）を介して右大腿部の筋肉にブーストした。５０μＬの試験した組成物を、１注射当たりマウスごとに投与した。
【0661】
中間の血液サンプリングを、各マウスに対してＤ２０に実施し、血液および脾臓サンプルを、各マウスからＤ３５でのブースト後に採取した。
【0662】
アジュバント製剤、抗原、およびワクチン組成物を、以下の表６に示すように製造した。
【0663】
【表6】
【0664】
生物学的サンプリングおよび分析試験
血清製造に対する血液サンプリング
中間の血液サンプル（およそ２００μＬ）を、イソフルレンでわずかに麻酔したマウスの下顎の静脈からＤ２０でのプライミング後に収集した。Ｄ３５に血液サンプルを、深麻酔下に心臓穿刺（およそ１ｍＬ）で収集した。血液サンプルを、凝固活性化因子およびセパレーターのゲル（ＢＤ、メラン、フランス）を含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブに収集した。５±３℃に終夜とどめた後、チューブを２０分間、２６００ｇで遠心分離して、細胞から血清を分離した。血清を１００μＬのアリコートにおけるディープウェルプレートに移し、５６℃で３０分間、加熱不活化した。サンプルを、ＥＬＩＳＡおよび中和アッセイで使用するまで－２０℃で保存した。
血清製造に対する血液サンプリング
中間の血液サンプル（およそ２００μＬ）を、イソフルレンでわずかに麻酔したマウスの下顎の静脈からＤ２０でのプライミング後に収集した。Ｄ３５に血液サンプルを、深麻酔下に心臓穿刺（およそ１ｍＬ）で収集した。血液サンプルを、凝固活性化因子およびセパレーターのゲル（ＢＤ、メラン、フランス）を含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブに収集した。５±３℃に終夜とどめた後、チューブを２０分間、２６００ｇで遠心分離して、細胞から血清を分離した。血清を１００μＬのアリコートにおけるディープウェルプレートに移し、５６℃で３０分間、加熱不活化した。サンプルを、ＥＬＩＳＡおよび中和アッセイで使用するまで－２０℃で保存した。
【0665】
脾臓細胞単離に対する脾臓サンプリング
Ｂ細胞およびＴ細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイに対して、免疫化した各マウス由来の脾臓を、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）を含有する滅菌チューブに収集した。できるだけ早く、脾臓を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｙｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して機械的に分離し、４℃で１０分間、５００ｇで５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブにおいて遠心分離し、上清を廃棄した。１つのマウス脾臓に対応する各細胞ペレットを、１ｍＬの赤血球溶解緩衝液（Ｒ７７５７ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で再懸濁し、１分間穏やかに混合した。溶解反応を氷で停止し、次いで２０ｍＬの冷却したＲＰＭＩ緩衝液をペレットごとに添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブを７分間、５００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。脾臓細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ完全緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用する前に細胞係数のために製造した。
Ｂ細胞およびＴ細胞のＥＬＩＳｐｏｔアッセイに対して、免疫化した各マウス由来の脾臓を、ＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所培地）を含有する滅菌チューブに収集した。できるだけ早く、脾臓を、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｙｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して機械的に分離し、４℃で１０分間、５００ｇで５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブにおいて遠心分離し、上清を廃棄した。１つのマウス脾臓に対応する各細胞ペレットを、１ｍＬの赤血球溶解緩衝液（Ｒ７７５７ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で再懸濁し、１分間穏やかに混合した。溶解反応を氷で停止し、次いで２０ｍＬの冷却したＲＰＭＩ緩衝液をペレットごとに添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブを７分間、５００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。脾臓細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ完全緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで使用する前に細胞係数のために製造した。
【0666】
ＡＲＰＥ－１９上皮細胞株でのｈＣＭＶ中和抗体の検出のためのｈＣＭＶプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ５０）
免疫化したマウス由来の血清中の中和抗体は、プラーク減少血清中和試験を使用して滴定した。アッセイは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のヒトの上皮および線維芽細胞に感染する能力に基づいた。簡潔には、２．５×１０４個の上皮ＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。その使用の前に、各免疫化したマウスからＤ２０およびＤ３５に収集した血清サンプルは、最初に５６℃で３０分間、加熱不活化し、－２０℃で保存した。中和アッセイのＤ日目、加熱不活化した血清を、室温（２０～２５℃）でゆっくり解凍し、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（力価５．６３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ）とインキュベートした。異なる希釈の血清／ウイルス混合物を、ＡＲＰＥ－１９細胞培養に最終的に移し、３７℃で４日間、５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｄ４に、培養上清を除去し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、２０～２５℃で１時間、ＰＢＳ中の１００μＬ／ウェルの１％ホルモルで固定した。プレートを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーでの解析の前に、ＰＢＳ １×で３回洗浄し、２０～２５℃で空気乾燥した。感染した蛍光細胞は、各ウェルで列挙した。対照として、細胞を、ウイルスを含まない培養培地で二重にインキュベートのみを行った。プレート当たり６つのウェルでの感染の対照として、細胞を、４．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬでウイルス希釈の初期の半分の濃度で感染させた。感染した細胞を含まない２つのウェルの平均は、血清中和の閾値を定義した。二分の一のウイルス用量に感染した細胞を含有する６つのウェルにおける蛍光の平均値は、感染の特異的シグナルの５０％を定義した。各血清に対して、中和エンドポイント力価は、計算した特異的シグナル値（μＰＲＮＴ５０）の５０％未満に低下した最後の希釈の逆数、すなわち計算した特異的シグナル値の５０％より少なく感染した細胞を誘発した最後の希釈として定義した。各サンプルに対して、力価は、４パラメータロジスティック曲線を使用して決定した。幾何平均の中和抗体力価は、各群に対して計算した。
免疫化したマウス由来の血清中の中和抗体は、プラーク減少血清中和試験を使用して滴定した。アッセイは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のヒトの上皮および線維芽細胞に感染する能力に基づいた。簡潔には、２．５×１０４個の上皮ＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。その使用の前に、各免疫化したマウスからＤ２０およびＤ３５に収集した血清サンプルは、最初に５６℃で３０分間、加熱不活化し、－２０℃で保存した。中和アッセイのＤ日目、加熱不活化した血清を、室温（２０～２５℃）でゆっくり解凍し、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（力価５．６３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ）とインキュベートした。異なる希釈の血清／ウイルス混合物を、ＡＲＰＥ－１９細胞培養に最終的に移し、３７℃で４日間、５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｄ４に、培養上清を除去し、ＡＲＰＥ－１９細胞を、２０～２５℃で１時間、ＰＢＳ中の１００μＬ／ウェルの１％ホルモルで固定した。プレートを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーでの解析の前に、ＰＢＳ １×で３回洗浄し、２０～２５℃で空気乾燥した。感染した蛍光細胞は、各ウェルで列挙した。対照として、細胞を、ウイルスを含まない培養培地で二重にインキュベートのみを行った。プレート当たり６つのウェルでの感染の対照として、細胞を、４．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬでウイルス希釈の初期の半分の濃度で感染させた。感染した細胞を含まない２つのウェルの平均は、血清中和の閾値を定義した。二分の一のウイルス用量に感染した細胞を含有する６つのウェルにおける蛍光の平均値は、感染の特異的シグナルの５０％を定義した。各血清に対して、中和エンドポイント力価は、計算した特異的シグナル値（μＰＲＮＴ５０）の５０％未満に低下した最後の希釈の逆数、すなわち計算した特異的シグナル値の５０％より少なく感染した細胞を誘発した最後の希釈として定義した。各サンプルに対して、力価は、４パラメータロジスティック曲線を使用して決定した。幾何平均の中和抗体力価は、各群に対して計算した。
【0667】
類似したプロトコルは、線維芽細胞ＭＲＣ－５細胞株でのＰＲＮＴ５０アッセイで使用した。簡潔には、２．５×１０４個のＭＲＣ－５細胞を、マイクロ中和アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。加熱不活化した血清を、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、１０％のベビーウサギ補体存在下、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍＬのＢＡＤｒＵＬ１３１Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（力価５．６３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｍｌ）とインキュベートした。次いで、異なる希釈の血清／ウイルス混合物を、ＭＲＣ－５細胞培養に移し、３７℃で３日間、５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｄ３に、培養上清を除去し、ＭＲＣ－５細胞を、室温で１時間、ＰＢＳ中の１００μｌ／ウェルの１％ホルモルで固定した。中和抗体力価（μＰＲＮＴ５０）を、ＡＲＰＥ－１９細胞株に対して上で先に記載したように決定した。
【0668】
注：ＡＲＰＥ－１９細胞株でのプラーク減少中和アッセイは、抗原ｇＢおよび五量体の両方で誘起した中和抗体活性を反映した一方、ＭＲＣ－５細胞株でのプラーク減少中和アッセイは、むしろｇＢで誘起した中和抗体活性を反映した。
【0669】
ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）アッセイを、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ）に特異的な個々の抗体を分泌するＢ細胞（ＡＳＣ）を検出し、数え上げるのに使用し、抗原特異性に関係なくＡＳＣを分泌する総ＩｇＧと比較した。
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）アッセイを、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ）に特異的な個々の抗体を分泌するＢ細胞（ＡＳＣ）を検出し、数え上げるのに使用し、抗原特異性に関係なくＡＳＣを分泌する総ＩｇＧと比較した。
【0670】
蛍光性の低いＰＶＤＦ膜を備えた蛍光ＳＰＯＴプレートを、１分間、３５％エタノールで予め湿潤させ、滅菌水、次いでＰＢＳ １×で洗浄し、５±３℃で終夜、１０μｇ／ｍＬのｈＣＭＶ ｇＢもしくは１０μｇ／ｍＬのｈＣＭＶ五量体、または捕捉ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬのＫＤＬ）の混合物のいずれかでコーティングした。
【0671】
９６ウェルのＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）の膜を、最初に室温で２５μＬの３５％エタノールで予め湿潤させ、処置の１分後に除去した。２００μＬ／ウェルのＰＢＳ １×で洗浄した後、マクロプレートを、ｈＣＭＶｇＢ抗原もしくはｈＣＭＶ五量体（１０μｇ／ｍｌ）、または無関係のマウスＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＫＰＬ）のいずれかでコーティングした。プレートをＰＢＳで洗浄し、３７℃で２時間、完全培地ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳで遮断した。ＰＢＳで洗浄した後、免疫化したマウス由来の５×１０５個の新たに単離した脾臓細胞を、ウェルごとにプレーティングし、３７℃で５時間、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。ＰＢＳ １×Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％で３回洗浄し、ＰＢＳ １×で６回洗浄した後、プレートを３７℃で２時間、１００μＬ／ウェルの抗マウスＩｇＧ１ ＰＥ（４μｇ／ｍＬ）、抗マウスＩｇＧ２ｃ ＦＩＴＣ（２μｇ／ｍＬ）、または抗マウス総ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）検出ｍＡｂでインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、蛍光スポットを、自動化スポットリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。
【0672】
ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体特異的ＩＦＮγおよびＩＬ－５分泌性Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ
蛍光ＳＰＯＴアッセイを、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－５サイトカインのいずれかを分泌する個々の細胞の検出および数え上げに使用した。簡潔には、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）９６ウェルＩＰＦＬプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２０～２５℃で１分間、２５μＬの３５％エタノールで予め湿潤させ、滅菌水で洗浄し、ＰＢＳ １×で２回洗浄した。次いで、プレートを５±３℃で終夜、それぞれ１／１００および１／５０で希釈したラット抗マウスＩＦＮ－γまたはラット抗マウスＩＬ－５ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のウェル当たり１００μＬでコーティングした。ウェル当たり２００μＬの滅菌ＰＢＳ １×で３回プレート洗浄した後、飽和の工程を、３７℃で２時間、２００μＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌを含有するロズウェルパーク記念研究所培地）で実施した。プレート洗浄した後、５×１０５個の新たに単離した脾臓細胞をウェルごとに添加し、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）の存在下、陽性対照としてｈＣＭＶ ｇＢ抗原（０．１μｇ／ｍＬ）、ｈＣＭＶ五量体抗原（０．１μｇ／ｍＬ）、またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、２．５μｇ／ｍＬ）で終夜インキュベートした。
蛍光ＳＰＯＴアッセイを、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－５サイトカインのいずれかを分泌する個々の細胞の検出および数え上げに使用した。簡潔には、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）９６ウェルＩＰＦＬプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２０～２５℃で１分間、２５μＬの３５％エタノールで予め湿潤させ、滅菌水で洗浄し、ＰＢＳ １×で２回洗浄した。次いで、プレートを５±３℃で終夜、それぞれ１／１００および１／５０で希釈したラット抗マウスＩＦＮ－γまたはラット抗マウスＩＬ－５ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のウェル当たり１００μＬでコーティングした。ウェル当たり２００μＬの滅菌ＰＢＳ １×で３回プレート洗浄した後、飽和の工程を、３７℃で２時間、２００μＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌを含有するロズウェルパーク記念研究所培地）で実施した。プレート洗浄した後、５×１０５個の新たに単離した脾臓細胞をウェルごとに添加し、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）の存在下、陽性対照としてｈＣＭＶ ｇＢ抗原（０．１μｇ／ｍＬ）、ｈＣＭＶ五量体抗原（０．１μｇ／ｍＬ）、またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、２．５μｇ／ｍＬ）で終夜インキュベートした。
【0673】
ＰＢＳ １×ＢＳＡ０．１％（ウェル当たり２００μＬ）で６回洗浄した後、ＰＢＳ １×ＢＳＡ０．１％での１μｇ／ｍＬの濃度で使用したビオチン化抗マウスＩＦＮ－γまたは抗マウスＩＬ５抗体を添加し（ウェル当たり１００μＬ）、２０～２５℃で２時間、暗室でインキュベートした。ＰＢＳ １×ＢＳＡ０．１％で３回洗浄した後、ＰＢＳ １×ＢＳＡ０．１％中の１００μＬのストレプトアビジンＰＥ（１μｇ／ｍＬ）をウェルごとに添加し、２０～２５℃で１時間、暗室でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡでさらに６回洗浄した。最終的に、プレートの背部を取り外し、ウェル下部を滅菌水で迅速にすすいだ。プレートを空気乾燥し、読み出すまで暗室で保存した。ＩＦＮγまたはＩＬ－５の単一のプロデューサー細胞に対応する各スポットを、Ｃｙ３およびＦＩＴＣ蛍光に対するフィルターを備えた蛍光プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。結果は、１０６個の脾臓細胞当たりのＩＦＮ－γまたはＩＬ－５分泌性細胞の数として表した。
【0674】
ＩＩ．結果
ＡＳ０１Ｂと類似したｈＣＭＶ中和抗体力価を誘起したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質で製剤化したＳＰＡ１４
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質の血清中和応答を誘発する能力は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群を、０日目（Ｄ０）およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇの各組換えタンパク質、ｈＣＭＶ ｇＢ、および五量体で２回免疫化した。タンパク質を、アジュバントなしに投与した、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化したが、その組成は、実施例３に記載されている。
ＡＳ０１Ｂと類似したｈＣＭＶ中和抗体力価を誘起したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質で製剤化したＳＰＡ１４
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質の血清中和応答を誘発する能力は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群を、０日目（Ｄ０）およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇの各組換えタンパク質、ｈＣＭＶ ｇＢ、および五量体で２回免疫化した。タンパク質を、アジュバントなしに投与した、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化したが、その組成は、実施例３に記載されている。
【0675】
ＡＳ０１Ｂは、ベンチマークアジュバントとして使用した。第１の注射（Ｄ２０）の２０日後、および第２の注射（Ｄ３５）の１４日後に免疫化した動物で誘起した中和抗体応答を、ヒトＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株のヒトの線維芽細胞および上皮細胞の両方に感染する能力に基づいて、それぞれ補体を伴うまたは伴わずに、プラーク減少中和アッセイを使用して測定した。
【0676】
図１０Ａおよび１０Ｂの結果では、アジュバントなしのｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質が、線維芽細胞（ＭＲＣ－５）または上皮（ＡＲＰＥ－１９）細胞株の両方で測定した、プライミング後およびブースト後のＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス血清中和抗体（ＳＮ Ａｂ）を誘発しない、または低レベルで誘発することが示された。
【0677】
著しいアジュバント効果は、ＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス中和抗体でのＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂで測定し、両細胞株においてアジュバント未処理群のｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体と比較して、ブースト後で主に観察された（ｐ値＜０．０００１）。
【0678】
さらに、著しいブースト効果は、Ｄ２０からＤ３５まで中和抗体力価のおよそ２Ｌｏｇの増加を伴うＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂでのアジュバント処理群で測定した（ｐ＜０．０００１）。
【0679】
補体なしのＡＲＰＥ－１９上皮細胞株（図１０Ａ）では、ｇＢおよび五量体の両方で誘発した中和抗体の代表値、中和力価の幾何平均（ＧＭＴ）は、ＳＰＡ１４で３．７５Ｌｏｇ１０に、ＡＳ０１Ｂで３．９８Ｌｏｇ１０に達したが、１．８２Ｌｏｇ１０のＧＭＴは、アジュバント未処理群で決定した。類似した結果は、ｇＢで主に誘発した中和抗体力価を反映する、補体存在下のＭＲＣ－５線維芽細胞株（図１０Ｂ）で得られ、中和Ａｂ力価の幾何平均（ＧＭＴ）は、ＳＰＡ１４で３．８４Ｌｏｇ１０、ＡＳ０１Ｂで４．０５Ｌｏｇ１０と観察されたが、１．３Ｌｏｇ１０のＧＭＴは、アジュバント未処理群で観察された。
【0680】
差なし（ｎｓ）は、プライミング後Ｄ２１およびブースト後Ｄ３５に、ＳＰＡ１４で製剤化したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体、ならびにＡＳ０１Ｂで製剤化したｇＢおよび五量体で誘発した中和抗体力価で測定された。
【0681】
ｇＢおよび五量体タンパク質で製剤化したＳＰＡ１４は、アジュバント未処理群と比較してＤ３５にｇＢおよび五量体特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）を引き起こした
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質の両ｈＣＭＶ抗原に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）を誘発する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群をＤ０およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇの各組換えタンパク質、ｈＣＭＶ ｇＢ、および五量体で２回免疫化した。組換えタンパク質を、アジュバントなしで、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化して投与した。ｇＢまたは五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）は、免疫化したマウスからＤ３５に収集した脾臓細胞で、蛍光ＳＰＯＴで評価した（図１１Ａ～Ｄ）。
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質の両ｈＣＭＶ抗原に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）を誘発する能力を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群をＤ０およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇの各組換えタンパク質、ｈＣＭＶ ｇＢ、および五量体で２回免疫化した。組換えタンパク質を、アジュバントなしで、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化して投与した。ｇＢまたは五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞（ＡＳＣ）は、免疫化したマウスからＤ３５に収集した脾臓細胞で、蛍光ＳＰＯＴで評価した（図１１Ａ～Ｄ）。
【0682】
ＳＰＡ１４は、アジュバント未処理群と比較して、ｇＢおよび五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ ＡＳＣの著しく高い頻度を誘発した（ｐ＜０．００１）。
【0683】
実際に、ＳＰＡ１４アジュバント処理群で測定した具体的なＡＳＣの数は、ｇＢに特異的なＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞に対して４２個のスポット／１０６個の細胞およびＩｇＧ１分泌性Ｂ細胞に対して８３個のスポット／１０６個の細胞、五量体に特異的なＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞に対して２５個のスポット／１０６個の細胞およびＩｇＧ１分泌性Ｂ細胞に対して１０５個のスポット／１０６個の細胞の幾何平均値で中程度であった。
【0684】
同様に、ＡＳ０１Ｂは、ｇＢおよび五量体に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ－ＡＳＣ数の中程度の頻度を誘発したが、これらの細胞頻度は、アジュバント未処理群で測定したものより著しく高かった（ｐ＜０．００１）。
【0685】
興味深いことに、データはまた、ＡＳ０１Ｂが、ＳＰＡ１４と比較して抗ｇＢ ＩｇＧ２ｃ－ＡＳＣ（ｐ＝０．００５）および抗五量体ＩｇＧ２ｃ－ＡＳＣ（ｐ＝０．００２）の頻度を著しく向上させ、ｇＢ（ｐ＝０．０２４）および五量体（ｐ＝０．０１１）に対して著しく高いＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１分泌性Ｂ細胞比をもたらすことを示した。
【0686】
結論として、ＳＰＡ１４は、よりＴｈ１で歪んだ抗体応答を著しく誘発したＡＳ０１Ｂよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答をもたらした。
【0687】
ｇＢおよび五量体タンパク質で製剤化したＳＰＡ１４は、アジュバント未処理群と比較して、Ｄ３５にｇＢに特異的な低いＩＦＮ－γ分泌性細胞だが、五量体に特異的な高いＩＦＮ－γ分泌性細胞を誘起した
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質のｇＢおよび五量体に特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞を誘発する能力は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群を、０日目（Ｄ０）およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇのｇＢおよび五量体で２回免疫化した。組換えタンパク質を、アジュバントなしで、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化して投与した。
ＳＰＡ１４アジュバント処理したｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体タンパク質のｇＢおよび五量体に特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞を誘発する能力は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。その目的のために、８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つの群を、０日目（Ｄ０）およびＤ２１と３週間あけて、ＩＭ経路により、２μｇのｇＢおよび五量体で２回免疫化した。組換えタンパク質を、アジュバントなしで、またはＳＰＡ１４もしくはＡＳ０１Ｂのいずれかで製剤化して投与した。
【0688】
ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞は、免疫化したマウスからＤ３５に収集した新たな脾臓細胞の蛍光ＳＰＯＴで評価した（図１２）。
【0689】
アジュバント処理しないｇＢおよび五量体で免疫化したマウスでは、ｇＢに特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞ならびに五量体に特異的なＩＦＮ－γ分泌性細胞は検出しなかった。非アジュバント群では、少ないが測定可能な五量体に特異的なＩＬ－５分泌性細胞数を検出した（１０６個の脾臓細胞当たり５４個のスポット）。
【0690】
図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃに記載のｇＢでのｅｘ ｖｉｖｏの脾臓細胞の刺激に関するデータでは、ＳＰＡ１４が、アジュバント未処理群と比較して著しく高いＩＦＮ－γ分泌性細胞の頻度を誘発した（ｐ＝０．００３）が、ＳＰＡ１４の著しいアジュバント効果が、ＩＬ－５分泌性細胞数で測定されなかったことが示された。さらに、ＩＦＮ－γ分泌性細胞の頻度の増加は、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞の比に影響を及ぼさなかった（ｐ＝０．０７４；ｎｓ）が、１を超える比は、歪んだＴｈ１応答の代表的なものであった（データは示さず）。
【0691】
図１２Ｄ、１２Ｅ、および１２Ｆに記載の五量体でのｅｘ ｖｉｖｏの脾臓細胞の刺激に関するデータでは、ＳＰＡ１４が、１０６個の脾臓細胞当たり９個のスポットのＧＭ値のアジュバント未処理群と比較して、１０６個の脾臓細胞当たり３２１個のスポットのＧＭ値で、著しく高いＩＦＮ－γ分泌性細胞数を誘発した（ｐ＜０．００１）ことが示された。ＳＰＡ１４の著しいアジュバント効果は、五量体に特異的なＩＬ－５分泌性細胞数で測定されなかった。これらの結果は、アジュバント未処理群と比較してＳＰＡ１４を含む五量体を対象とする、りＴｈ１で歪んだ免疫応答を反映する、アジュバント未処理群と比較してＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞比の著しい増加に相関した（ｐ＜０．００１）（ＳＰＡ１４対アジュバント未処理の比データは示さず）。
【0692】
図１２における結果では、ＡＳ０１Ｂが、Ｄ３５にアジュバント未処理群と比較してｇＢおよび五量体の両方に特異的な著しく高いＩＦＮ－γ分泌性細胞数を誘発した（ｐ≦０．００１）ことが示された。ＡＳ０１Ｂの著しいアジュバント効果は、ｇＢに特異的なＩＬ－５分泌性細胞数で測定されなかったが、ＡＳ０１Ｂは、１０６個の細胞当たり５４個のスポットのＧＭ値を提示するアジュバント未処理群と比較して、１０６個の細胞当たり１１個のスポットのＧＭ値で五量体に特異的なＩＬ－５分泌性細胞数の著しい減少を誘発した（ｐ＜０．００１）。
【0693】
これらをまとめると、データでは、アジュバント処理しないｇＢおよび五量体と比較してＡＳ０１Ｂを含むｈＣＭＶ抗原を対象とする、よりＴｈ１で歪んだ免疫応答を反映する、アジュバント未処理群と比較してｇＢまたは五量体のいずれかに特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞比の著しい増加が実証された（ｐ＜０．００１）（ＡＳ０１Ｂ対アジュバント未処理群の比データは示さず）。
【0694】
２つのアジュバント処理群の比較では、ＳＰＡ１４が、ＡＳ０１Ｂと比較してｇＢに特異的な著しく低いＩＦＮ－γ分泌性細胞数を誘起した（ｐ＝０．００１）が、類似した数の五量体に特異的なＩＦＮ－γ分泌性細胞を誘発したことが示された。ＳＰＡ１４で観察される通り、ＡＳ０１Ｂは、ｇＢに特異的な特異的ＩＬ－５分泌性細胞を誘発しなかったが、興味深いことに、ＳＰＡ１４は、ＡＳ０１Ｂより著しく高い五量体に特異的なＩＬ－５分泌性細胞を引き起こした（ｐ＝０．０２）。
【0695】
これらをまとめると、データでは、ＳＰＡ１４がＡＳ０１Ｂよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘起したことが示された。
【0696】
ＩＩＩ．結論
Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体で製剤化したＳＰＡ１４は、高い体液性および細胞免疫応答を誘起した。ＳＰＡ１４は、ＡＳ０１Ｂで誘発したものと類似した上皮細胞（補体なし）および線維芽細胞（補体あり）の両方、両ｈＣＭＶ抗原に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性エフェクター細胞、ｇＢに特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞、ならびに主に五量体に特異的なＩＦＮ－γ分泌性細胞でのｈＣＭＶに対して高い血清中和抗体力価を誘起した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体で製剤化したＳＰＡ１４は、高い体液性および細胞免疫応答を誘起した。ＳＰＡ１４は、ＡＳ０１Ｂで誘発したものと類似した上皮細胞（補体なし）および線維芽細胞（補体あり）の両方、両ｈＣＭＶ抗原に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ分泌性エフェクター細胞、ｇＢに特異的なＩＦＮ－γおよびＩＬ－５分泌性細胞、ならびに主に五量体に特異的なＩＦＮ－γ分泌性細胞でのｈＣＭＶに対して高い血清中和抗体力価を誘起した。
【0697】
結果では、ＳＰＡ１４がｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体に対する混合したＴｈ１／Ｔｈ２免疫プロファイルを誘起したが、ＡＳ０１Ｂがより高い特異的ＩｇＧ２ｃ分泌性Ｂ細胞およびＩＦＮ－γ分泌性Ｔ細胞の頻度を誘起する、よりＴｈ１で歪んだ免疫応答を引き起こすことが実証された。
【実施例8】
【0698】
カニクイザルに投与したＲＳＶプレＦ－フェリチン抗原でのＥ６０２０－ＱＳ２１含有リポソームのアジュバント処理効果
本研究は、未処理のカニクイザルモデルにおいて、アジュバント処理したＲＳＶプレＦ－フェリチン対アジュバント処理していないＲＳＶプレＦ－フェリチンワクチンの免疫原性を評価した。プレＦ－フェリチンは、ＣＨＯ細胞で生成され、前融合立体配座で遮断され、自己集合性ヘリコバクター・ピロリフェリチン部分に融合したＲＳＶ－Ｆ糖タンパク質からなる組換えタンパク質抗原の粒子である（Ｓｗａｎｓｏｎら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０年；５（４７））。１つのアジュバントは、ＳＰＡ１４（リポソーム＋ＱＳ２１＋Ｅ６０２０）で試験した。
本研究は、未処理のカニクイザルモデルにおいて、アジュバント処理したＲＳＶプレＦ－フェリチン対アジュバント処理していないＲＳＶプレＦ－フェリチンワクチンの免疫原性を評価した。プレＦ－フェリチンは、ＣＨＯ細胞で生成され、前融合立体配座で遮断され、自己集合性ヘリコバクター・ピロリフェリチン部分に融合したＲＳＶ－Ｆ糖タンパク質からなる組換えタンパク質抗原の粒子である（Ｓｗａｎｓｏｎら、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０年；５（４７））。１つのアジュバントは、ＳＰＡ１４（リポソーム＋ＱＳ２１＋Ｅ６０２０）で試験した。
【0699】
８匹のカニクイザル（４匹の雄および４匹の雌）を使用し、４匹の動物（２匹の雄および２匹の雌）の２つの群に割り当てた。
【0700】
０日目および２８日目に、トータルで２つのＲＳＶワクチン候補を、三角筋での筋肉内注射を通して評価した（動物群当たり１つの製剤）。サンプルを、５か月にわたる免疫化前後の異なる時点で採取した（血清およびＰＢＭＣ）。
【0701】
ＳＰＡ１４アジュバント処理したプレＦ－フェリチンのみが、４９日目（用量２の３週間後）にピークとなるＲＳＶ－Ａ２中和抗体を誘発した。重要なことに、アジュバント処理したＲＳＶプレＦ－フェリチン製剤は、ＲＳＶ－Ｂ株（ＡＴＣＣ １８５３７）に対して交差中和抗体を誘発した。雌雄間で差は観察されなかった。血清の中和抗体応答は、用量２の後の５か月間を通して検出可能なままであり、応答寿命を示した。
【0702】
ＳＰＡ１４アジュバント処理したプレＦ－フェリチンはまた、Ｆ特異的記憶ＩｇＧ分泌性細胞を誘発することを示した。
【0703】
高レベルのＲＳＶ Ｆ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ／ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔ応答は、アジュバント未処理群と比較してＳＰＡ１４アジュバント処理した製剤で著しく誘発し、ＴＨ１型応答を示した。
【0704】
Ｉ．材料および方法
動物の情報
２４～３０か月のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｎｏｖｅｐｒｉｍ）を、Ｃｙｎｂｉｏｓｅ、ＳＡ（Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に収容した。本研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｂｏｄｙ ｏｆ Ｃｙｎｂｉｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＶｅｔＡｇｒｏ－Ｓｕｐ（１ ａｖｅｎｕｅ Ｂｏｕｒｇｅｌａｔ，６９２８０ Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）が審査し、番号１６３３－Ｖ３（ＭＥＳＲ番号：２０１６０７１５１７２１２８１５）で承認された。全ての実験は、２０１３年の２月７日のフランス官報で出版されたＥｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ２０１０／６３／ＵＥにしたがって行った。
動物の情報
２４～３０か月のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｎｏｖｅｐｒｉｍ）を、Ｃｙｎｂｉｏｓｅ、ＳＡ（Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）に収容した。本研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｂｏｄｙ ｏｆ Ｃｙｎｂｉｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＶｅｔＡｇｒｏ－Ｓｕｐ（１ ａｖｅｎｕｅ Ｂｏｕｒｇｅｌａｔ，６９２８０ Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）が審査し、番号１６３３－Ｖ３（ＭＥＳＲ番号：２０１６０７１５１７２１２８１５）で承認された。全ての実験は、２０１３年の２月７日のフランス官報で出版されたＥｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ２０１０／６３／ＵＥにしたがって行った。
【0705】
試験した組成物および投与量は、以下の表７に示した。
【0706】
【表7】
【0707】
生物学的サンプリングおよび分析試験
血清製造のための血液サンプリング
血清製造のための血液サンプルを、意識のある動物の大腿静脈から静脈穿刺により収集した。動物当たりおよそ４ｍＬを、以下の通り：Ｄ１２（ベースライン）、Ｄ１３、Ｄ２８（用量２の前）、Ｄ４９、Ｄ６３、Ｄ９１、Ｄ１１９、Ｄ１４９、およびＤ１６３に、凝固活性化因子およびセパレーターのゲル（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（商標）ＩＩ Ａｄｖａｎｃｅ、ｒｅｆ：３６７９５５、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むチューブにサンプリングした。
血清製造のための血液サンプリング
血清製造のための血液サンプルを、意識のある動物の大腿静脈から静脈穿刺により収集した。動物当たりおよそ４ｍＬを、以下の通り：Ｄ１２（ベースライン）、Ｄ１３、Ｄ２８（用量２の前）、Ｄ４９、Ｄ６３、Ｄ９１、Ｄ１１９、Ｄ１４９、およびＤ１６３に、凝固活性化因子およびセパレーターのゲル（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（商標）ＩＩ Ａｄｖａｎｃｅ、ｒｅｆ：３６７９５５、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むチューブにサンプリングした。
【0708】
＋２℃～＋８℃の範囲の温度で血液サンプルを終夜保存した後、血清を＋４℃で２０分間、２０００×ｇでの遠心分離により抽出した。血清の少なくとも４つの３００μＬのアリコートを、各動物から製造し、２型の層流キャビネット下のクライオチューブに調整した。
【0709】
抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）単離のための血液サンプリング
ＰＢＭＣ単離のための血液サンプルを、大腿静脈から静脈穿刺により収集した。動物当たりおよそ１２ｍＬを、６ｍＬのナトリウム－ヘパリンチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）、ｒｅｆ：３６７８７６、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にサンプリングした。
ＰＢＭＣ単離のための血液サンプルを、大腿静脈から静脈穿刺により収集した。動物当たりおよそ１２ｍＬを、６ｍＬのナトリウム－ヘパリンチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）、ｒｅｆ：３６７８７６、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にサンプリングした。
【0710】
この操作を、以下の通り：Ｄ１２（ベースライン）、Ｄ７、Ｄ３５、Ｄ１１９、およびＤ１６１に、意識のある動物に実施した。
【0711】
全身性ＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＲＳＶ－Ｆ特異的抗体力価を、手動でのＥＬＩＳＡで試験した。簡潔には、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ、Ｎｕｎｃ）を、重炭酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログＣ３０４１－１００ＣＡＰ）中の１μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ１１０４９－Ｖ０８Ｂ）でコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートし、次いで１時間、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％－ミルク５％で遮断した。血清を、コーティングしたプレートでＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％－ミルク５％で連続希釈した。３７℃での１時間３０分のインキュベートの後、洗浄プレート（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％を含む）を、３７℃で１時間３０分間、１：１００００希釈したヤギ抗サルＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログＡＡＩ４２Ｐ）でインキュベートした。プレートを洗浄し、ＲＴで３０分間、暗室で、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｔｅｂｕ－ｂｉｏ、カタログＴＭＢ １００－１０００）でインキュベートした。比色分析反応を、ウェル当たり１００μＬのＨＣｌ １Ｍ（ＶＷＲ Ｐｒｏｌａｂｏ、カタログ３００２４２９０）で停止し、Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０および６５０ｎｍで測定した。
ＲＳＶ－Ｆ特異的抗体力価を、手動でのＥＬＩＳＡで試験した。簡潔には、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ、Ｎｕｎｃ）を、重炭酸塩緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログＣ３０４１－１００ＣＡＰ）中の１μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ１１０４９－Ｖ０８Ｂ）でコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートし、次いで１時間、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％－ミルク５％で遮断した。血清を、コーティングしたプレートでＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％－ミルク５％で連続希釈した。３７℃での１時間３０分のインキュベートの後、洗浄プレート（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％を含む）を、３７℃で１時間３０分間、１：１００００希釈したヤギ抗サルＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログＡＡＩ４２Ｐ）でインキュベートした。プレートを洗浄し、ＲＴで３０分間、暗室で、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｔｅｂｕ－ｂｉｏ、カタログＴＭＢ １００－１０００）でインキュベートした。比色分析反応を、ウェル当たり１００μＬのＨＣｌ １Ｍ（ＶＷＲ Ｐｒｏｌａｂｏ、カタログ３００２４２９０）で停止し、Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０および６５０ｎｍで測定した。
【0712】
ＲＳＶ中和抗体（ＲＳＶ－Ａ２およびＲＳＶ－Ｂ株）の検出のためのＲＳＶプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ６０）
ベロ細胞を、２４ウェルプレートでの感染の１日前に５００μＬで、７０，０００個の細胞／ウェルで播種した。感染の日に、血清サンプルを、最初に５６℃で３０分間不活化し、次いでＤＭＥＭ－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２％ＦＢＳ＋１％ＰＳ培地で４倍希釈し、最終的に３７℃での１時間のインキュベート時間に対してモルモット補体（１０％）を伴いまたは伴わずに同容積のウイルス（７０ＰＦＵ／ウェル）と混合した。
ベロ細胞を、２４ウェルプレートでの感染の１日前に５００μＬで、７０，０００個の細胞／ウェルで播種した。感染の日に、血清サンプルを、最初に５６℃で３０分間不活化し、次いでＤＭＥＭ－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２％ＦＢＳ＋１％ＰＳ培地で４倍希釈し、最終的に３７℃での１時間のインキュベート時間に対してモルモット補体（１０％）を伴いまたは伴わずに同容積のウイルス（７０ＰＦＵ／ウェル）と混合した。
【0713】
ベロ細胞の上清を除去し、１００μＬのＤＭＥＭ－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２％ＦＢＳ＋１％ＰＳ、および１００μＬ／ウェルの血清／ウイルス混合物で置き換えた。３７℃での１．５時間のインキュベート時間の後、メチルセルロースオーバーレイ（ＤＭＥＭ－２％ＦＢＳ－１％ＰＳ中に０．７５％）をウェルに添加した。プレートを３７℃で５日間、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0714】
インキュベート時間に続いて、プレートを４℃で１時間、無水メタノール（－２０℃）で固定した。
【0715】
洗浄プレートを室温で１時間、ＰＢＳ－ミルク５％で遮断し、次いで免疫染色を実施した：
－ ＲＳＶ－Ａ２株に対して、室温で少なくとも２時間、１：２０００で希釈したポリクローナル抗ＲＳＶ－ＨＲＰ抗体（ａｂｃａｍ、カタログ２０６８６）。
－ ＲＳＶ－Ｂ株に対して、室温で１時間、１：２０００で希釈したモノクローナル抗ＲＳＶ融合タンパク質抗体（ａｂｃａｍ、カタログ２４０１１）、および洗浄後に室温で１時間、１：２０００で希釈した抗マウスＨＲＰ（ａｂｃａｍ、カタログａｂ６７８９）。
－ ＲＳＶ－Ａ２株に対して、室温で少なくとも２時間、１：２０００で希釈したポリクローナル抗ＲＳＶ－ＨＲＰ抗体（ａｂｃａｍ、カタログ２０６８６）。
－ ＲＳＶ－Ｂ株に対して、室温で１時間、１：２０００で希釈したモノクローナル抗ＲＳＶ融合タンパク質抗体（ａｂｃａｍ、カタログ２４０１１）、および洗浄後に室温で１時間、１：２０００で希釈した抗マウスＨＲＰ（ａｂｃａｍ、カタログａｂ６７８９）。
【0716】
洗浄後、プレートを室温で数分間、振とうしながらＴｒｕｅ Ｂｌｕｅ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ、カタログ５５１０－００３０）でインキュベートした。プラークを視認した場合、反応を水で洗浄することで停止した。プラークをマルチモーダルリーダー（Ｖｉｒｕｓｃｏｐｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で検出および計数し、中和抗体力価を６０％低下のエンドポイントで決定した。
【0717】
Ｆ特異的ＩｇＧ記憶Ｂ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ
Ｆ特異的Ｂ細胞記憶応答を、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）に分化する静止記憶Ｂ細胞を誘発するＰＢＭＣポリクローナル刺激（ＩＬ－２＋Ｒ８４８）の５日後に評価した。次いで、ＡＳＣ頻度を、Ｆ（ＳｉｎｏＢｉｏ ｒｅｆ＃１１４９＿Ｖ０８Ｂ）特異的応答を測定するように適合したＭａｂｔｅｃｈ製のヒトＩｇＧ蛍光ＳＰＯＴキット（製品コード番号ＦＳ＿０５Ｒ２４Ｇ－１０）で測定した。
Ｆ特異的Ｂ細胞記憶応答を、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）に分化する静止記憶Ｂ細胞を誘発するＰＢＭＣポリクローナル刺激（ＩＬ－２＋Ｒ８４８）の５日後に評価した。次いで、ＡＳＣ頻度を、Ｆ（ＳｉｎｏＢｉｏ ｒｅｆ＃１１４９＿Ｖ０８Ｂ）特異的応答を測定するように適合したＭａｂｔｅｃｈ製のヒトＩｇＧ蛍光ＳＰＯＴキット（製品コード番号ＦＳ＿０５Ｒ２４Ｇ－１０）で測定した。
【0718】
簡潔には、ＰＢＭＣを、Ｒ８４８（１μｇ／ｍｌ）および組換えヒトＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した完全培地（１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するロズウェルパーク記念研究所培地）で培養した。培養の５日後、細胞を除去し、洗浄し、下に記載されるように蛍光ＳＰＯＴアッセイで使用した。
【0719】
蛍光性の低いＰＶＤＦ膜を備えた蛍光ＳＰＯＴプレートを、１分間、３５％エタノールで予め湿潤させ、滅菌水、次いでＰＢＳで洗浄し、５±３℃で終夜、Ｆ抗原（ＳｉｎｏＢｉｏ、１１０４９－Ｖ０８Ｂ）または捕捉ｍＡｂｓの混合物（ＭＴ９１／１４５およびＭＴ５７）のいずれかでコーティングした。プレートを、ＰＢＳで洗浄し、３７℃で１時間、完全培地で遮断した。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＭＣをプレーティングし、３７℃で５時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで６回洗浄した後、プレートを３７℃で２時間、抗ヒトＩｇＧ－５５０（ＭＴ７８／１４５）検出ｍＡｂでインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、蛍光スポットを、スポットリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。
【0720】
ＲＳＶ Ｆ特異的ＩＦＮγ／ＩＬ－２蛍光ＳＰＯＴ
蛍光ＳＰＯＴアッセイを、Ｍａｂｔｅｃｈ製のサルＩＦＮγ／ＩＬ－２蛍光ＳＰＯＴキット（製品番号５２１２２－１０）を使用して実施して、片方または両方のサイトカインを分泌する細胞を検出し、数え上げる。簡潔には、最初に、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）９６ウェルＩＰＦＬプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、室温で１分間、２５μＬの３５％エタノールで１ｍｎに対して予め湿潤させ、滅菌水で、次いでＰＢＳで２回洗浄し、５±３℃で終夜、１００μＬのそれぞれ抗サルＩＦＮγおよび抗ＩＬ－２で精製したクローンＭＴ１２６ＬおよびＭＴ２Ａ９１の混合物でコーティングした。ウェルを、ウェル当たり２００μＬの滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、続いて３７℃で２時間、２００μＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌを含有するロズウェルパーク記念研究所培地）で飽和させた。完全培地を排除した後、０．２ １０６ ＰＢＭＣを、共刺激因子として抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（０．１μｇ／ｍＬ）と共に各ウェルに添加し、２μｇ／ｍＬの予備混合したペプチド、またはＲＳＶ Ｆタンパク質のプール、２μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃１１０４９１００＿Ｖ０８Ｂ）、または陽性対照（抗ＣＤ３）と終夜インキュベートした。ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡで６回洗浄した後、１００μＬのＦＩＴＣ結合した抗ＩＦＮγ（７－Ｂ６－１－ＦＳクローン）およびビオチン化抗ＩＬ－２（ＭＴ８Ｇ１０クローン）の混合物を、室温で２時間、暗室で添加した。ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡで３回洗浄した後、１００μＬの抗ＦＩＴＣ ＡｂおよびＳＡ－５５０ストレプトアビジンの混合物を、各ウェルに添加し、室温で１時間、暗室でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡでさらに６回洗浄した。最終的に、プレートの背部を取り外し、ウェルの下部を水で迅速にすすいだ。プレートを空気乾燥し、読み出すまで暗室で保存した。ＩＦＮγまたは／およびＩＬ－２の単一または二重のプロデューサー細胞に対応する各スポットを、Ｃｙ３およびＦＩＴＣ蛍光に対するフィルターを備えた蛍光プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。
蛍光ＳＰＯＴアッセイを、Ｍａｂｔｅｃｈ製のサルＩＦＮγ／ＩＬ－２蛍光ＳＰＯＴキット（製品番号５２１２２－１０）を使用して実施して、片方または両方のサイトカインを分泌する細胞を検出し、数え上げる。簡潔には、最初に、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（商標）９６ウェルＩＰＦＬプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、室温で１分間、２５μＬの３５％エタノールで１ｍｎに対して予め湿潤させ、滅菌水で、次いでＰＢＳで２回洗浄し、５±３℃で終夜、１００μＬのそれぞれ抗サルＩＦＮγおよび抗ＩＬ－２で精製したクローンＭＴ１２６ＬおよびＭＴ２Ａ９１の混合物でコーティングした。ウェルを、ウェル当たり２００μＬの滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、続いて３７℃で２時間、２００μＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌを含有するロズウェルパーク記念研究所培地）で飽和させた。完全培地を排除した後、０．２ １０６ ＰＢＭＣを、共刺激因子として抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（０．１μｇ／ｍＬ）と共に各ウェルに添加し、２μｇ／ｍＬの予備混合したペプチド、またはＲＳＶ Ｆタンパク質のプール、２μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＃１１０４９１００＿Ｖ０８Ｂ）、または陽性対照（抗ＣＤ３）と終夜インキュベートした。ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡで６回洗浄した後、１００μＬのＦＩＴＣ結合した抗ＩＦＮγ（７－Ｂ６－１－ＦＳクローン）およびビオチン化抗ＩＬ－２（ＭＴ８Ｇ１０クローン）の混合物を、室温で２時間、暗室で添加した。ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡで３回洗浄した後、１００μＬの抗ＦＩＴＣ ＡｂおよびＳＡ－５５０ストレプトアビジンの混合物を、各ウェルに添加し、室温で１時間、暗室でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ ０．２５％ＢＳＡでさらに６回洗浄した。最終的に、プレートの背部を取り外し、ウェルの下部を水で迅速にすすいだ。プレートを空気乾燥し、読み出すまで暗室で保存した。ＩＦＮγまたは／およびＩＬ－２の単一または二重のプロデューサー細胞に対応する各スポットを、Ｃｙ３およびＦＩＴＣ蛍光に対するフィルターを備えた蛍光プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。
【0721】
ＩＩ．結果
全身体液性応答
血清においてプレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４で誘発した向上したＦ特異的ＩｇＧ力価
本研究は、研究開始（Ｄ０）およびＤ２８での免疫化を伴う、血清未処理のカニクイザルにおけるＲＳＶプレＦ－フェリチン（アジュバント未処理群）対ＲＳＶプレＦ＋ＳＰＡ１４ワクチン接種（アジュバント処理群）の反復用量に対する免疫学的応答の時間経過を評価するために設計した。
全身体液性応答
血清においてプレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４で誘発した向上したＦ特異的ＩｇＧ力価
本研究は、研究開始（Ｄ０）およびＤ２８での免疫化を伴う、血清未処理のカニクイザルにおけるＲＳＶプレＦ－フェリチン（アジュバント未処理群）対ＲＳＶプレＦ＋ＳＰＡ１４ワクチン接種（アジュバント処理群）の反復用量に対する免疫学的応答の時間経過を評価するために設計した。
【0722】
Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のＦ抗原を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。ＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧ力価は、免疫化の後の全ての時点でアジュバント未処理群に対してＳＰＡ１４群で著しく大きかった（図１３）。Ｆ特異的ＩｇＧ力価は、アジュバント未処理群よりおよそ２００倍大きい、ＳＰＡ１４群内でＤ４９（用量２の３週間後）にピークとなった（２００００対１００の幾何平均）。
【0723】
研究を通して、ＳＰＡ１４群は、アジュバント未処理群より大きいＦ特異的ＩｇＧ力価が持続した。レスポンダーは、２０のアッセイＬＯＤ（検出限界）より４倍以上増加した動物として定義した（投与後レベル≧８０）。この基準を適用して、ＳＰＡ１４群は、Ｄ１３までに１００％の応答率に達し、Ｆ特異的ＩｇＧ力価は、研究の終了時（Ｄ１６１＝用量２の５か月後）に１００％のレスポンダーで長期的に持続した。アジュバント未処理群は、Ｄ４９（用量２の３週間後）まで、およびＤ１６１で５０％応答率の最大値に達した。
【0724】
ＲＳＶプレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４で誘発したＲＳＶ－Ａ２中和抗体
血清ウイルス中和抗体は、ヒトにおいてＲＳＶ疾患からの保護に相関した。
血清ウイルス中和抗体は、ヒトにおいてＲＳＶ疾患からの保護に相関した。
【0725】
Ｆ特異的ＩｇＧ力価と異なり、ＲＳＶ－Ａ２ウイルス中和抗体（補体依存性および補体非依存性）は、ＳＰＡ１４アジュバント処理した製剤でのみ誘発した（図１４）。
【0726】
ＲＳＶ Ｆ特異的ＩｇＧ応答に類似して、ＲＳＶ－Ａ２ウイルス中和抗体は、Ｄ４９（用量２の３週間後）にピークとなった。
【0727】
ＳＰＡ１４でアジュバント処理した群は、アジュバント未処理群より著しく高い中和力価を有した（ｐ＜０．０１）。
【0728】
レスポンダーは、２０のアッセイＬＯＤより４倍以上増加した動物として定義した（投与後レベル≧８０）。この基準を適用して、ＳＰＡ１４群は、補体存在下でＤ２８までに７５％の応答率（４匹の動物のうち３匹）に達し、Ｄ４９までに１００％に達した。対照的に、アジュバント未処理群は、いずれのレスポンダーも示さなかった（図１４Ｂ）。
【0729】
補体不在下で、ＳＰＡ１４は、Ｄ４９に１００％のレスポンダー率に達した（図１４Ａ）。
【0730】
研究の終了時（Ｄ１６１＝用量２の５か月後）、ＳＰＡ１４群は、依然として１００％のレスポンダー（補体を含んでも含まなくても）を有した。
【0731】
プレＦ－フェリチン＋ＳＰＡ１４は、ＮＨＰにおいてＲＳＶ Ｂ株に対する交差中和抗体を誘発（ＡＴＣＣ１８５３７）
ＲＳＶ ＡおよびＢ株の多数のバリアントはヒト集団を循環しているので、効果的なＲＳＶワクチンが交差中和抗体を誘発する必要がある。ゆえに、免疫血清のＲＳＶ－Ｂ株（ＡＴＣＣ１８５３７）を交差中和する能力を評価した。
ＲＳＶ ＡおよびＢ株の多数のバリアントはヒト集団を循環しているので、効果的なＲＳＶワクチンが交差中和抗体を誘発する必要がある。ゆえに、免疫血清のＲＳＶ－Ｂ株（ＡＴＣＣ１８５３７）を交差中和する能力を評価した。
【0732】
レスポンダー基準（＞８０）を適用して、アジュバント処理していない製剤は、ＲＳＶ－Ｂ株に対して４９日目に２５％のレスポンダー（１／４のＮＨＰ）しか誘発しなかったが、ＳＰＡ１４アジュバント処理したプレＦ－フェリチンは、アジュバント未処理群より高い交差中和力価を誘起するアジュバント処理群で、Ｄ４９に１００％のＮＨＰで交差中和力価を誘発することができた（図１５）。
【0733】
これらをまとめると、これらの結果では、アジュバント処理したＲＳＶ プレＦ－フェリチンワクチンが、アジュバント処理していないＲＳＶプレＦ－フェリチンワクチンと比較してより大きなレベルの交差中和ＲＳＶ抗体を誘発することが示された。
【0734】
【0735】
ＳＰＡ１４は、Ｄ１１９およびＤ１６１で検出可能なＦ特異的ＩｇＧ循環記憶Ｂ細胞を誘発した。記憶応答は低かったが、測定可能であった（１００未満のスポット／１０６個の細胞または０．０１％～０．１％の総ＩｇＧ分泌性細胞）。ＳＰＡ１４は、アジュバント未処理群と比較して著しく高い記憶ＩｇＧ分泌性細胞を誘発した（Ｐ値＜０．０１）。
【0736】
Ｆ特異的ＩＦＮγおよびＩＬ－２ Ｔ細胞ＥＬＩＳｐｏｔ
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、必須のヘルパー機能を発揮し、Ｂ細胞の活性化および分化に重要である。インターフェロン（ＩＦＮ）－γおよびインターロイキン（ＩＬ）－２は、Ｔｈ１免疫応答を解析するのに選択された。ＳＰＡ１４ワクチン接種したサルは、第１および第２の注射の１週間後のＩＦＮγおよびＩＬ－２ＥＬＩＳｐｏｔアッセイからの結果が示す通り、アジュバント未処理群と比較して強力なＦに対する細胞免疫応答を生じた（Ｐ値＜０．０１）（図１７）。３５日目に、ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）は、１００万個のＰＢＭＣ当たり１００～５００個の範囲であり（図１７Ａ）、ＩＬ－２ ＳＦＣは、１００万個のＰＢＭＣ当たり２００～１０００個の範囲である（図１７Ｂ）。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、必須のヘルパー機能を発揮し、Ｂ細胞の活性化および分化に重要である。インターフェロン（ＩＦＮ）－γおよびインターロイキン（ＩＬ）－２は、Ｔｈ１免疫応答を解析するのに選択された。ＳＰＡ１４ワクチン接種したサルは、第１および第２の注射の１週間後のＩＦＮγおよびＩＬ－２ＥＬＩＳｐｏｔアッセイからの結果が示す通り、アジュバント未処理群と比較して強力なＦに対する細胞免疫応答を生じた（Ｐ値＜０．０１）（図１７）。３５日目に、ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）は、１００万個のＰＢＭＣ当たり１００～５００個の範囲であり（図１７Ａ）、ＩＬ－２ ＳＦＣは、１００万個のＰＢＭＣ当たり２００～１０００個の範囲である（図１７Ｂ）。
【0737】
ＩＩＩ．結論
本研究では、アジュバント処理したプレＦ－フェリチンのみが、４９日目（用量２の３週間後）にピークとなり、少なくとも６か月持続するＲＳＶ－Ａ２中和抗体を誘発した。ＳＰＡ１４は、著しく高い中和力価を誘発した。重要なことに、アジュバント処理したＲＳＶプレＦ－フェリチン製剤は、ＲＳＶ－Ｂ株（ＡＴＣＣ １８５３７）に対して交差中和抗体を誘発した。
本研究では、アジュバント処理したプレＦ－フェリチンのみが、４９日目（用量２の３週間後）にピークとなり、少なくとも６か月持続するＲＳＶ－Ａ２中和抗体を誘発した。ＳＰＡ１４は、著しく高い中和力価を誘発した。重要なことに、アジュバント処理したＲＳＶプレＦ－フェリチン製剤は、ＲＳＶ－Ｂ株（ＡＴＣＣ １８５３７）に対して交差中和抗体を誘発した。
【0738】
ＳＰＡ１４は、循環中和抗体（構造記憶）が保護を与えるのに十分に高くない場合、ＲＳＶ感染の後に中和抗体の生成を再活性化することに大きな関心を呼ぶ、Ｆ特異的記憶ＩｇＧ分泌性細胞（反応記憶）を誘発した。
【0739】
著しく高いレベルのＲＳＶ Ｆ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ／ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔ応答（Ｔｈ１）は、抗原単独の群と比較してＳＰＡ１４アジュバント処理した製剤で誘発した。
【0740】
ＰＢＭＣ上清でサイトカインを測定することにより、ＳＰＡ１４は、ＩＦＮγ分泌性細胞（Ｔｈ１）を生成した。
【実施例9】
【0741】
ＣＭＶ抗原およびワクチン組成物の製造
実施例４、１０および１１でのＣＭＶ抗原およびワクチン組成物の製造
材料
以下の実施例で使用される抗原およびアジュバントは、表８に記載される。
実施例４、１０および１１でのＣＭＶ抗原およびワクチン組成物の製造
材料
以下の実施例で使用される抗原およびアジュバントは、表８に記載される。
【0742】
【表8】
【0743】
製造方法
抗原およびアジュバント製剤を、表８に示す、または以下に開示されるように製造した。
抗原およびアジュバント製剤を、表８に示す、または以下に開示されるように製造した。
【0744】
ＡＳ０１ＥおよびＡＳ０１Ｂを除いて、アジュバントの原液を、容積で抗原容積と混合し、次いで必要な用量：５０または５００μＬ（マウスまたはウサギに対して）を投与した。
【0745】
ＡＳ０１Ｂは、Ｓｈｉｎｇｒｉｘ（登録商標）から得られ、より濃縮した抗原と使用して、初期濃度を維持した。
【0746】
ＡＳ０１Ｅは、抗原との容積：容積の混合物（他のアジュバントに対して）から得られた。
【0747】
ＨＣＭＶ五量体
ＨＣＭＶ五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１を、５つのプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株で得たが、各プラスミドは、ＨＣＭＶ五量体を構成する５つのタンパク質の１つをコードする配列を含んだ。配列は、ＢＥ／２８／２０１１株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＰ７４５６６９）に由来した。ｇＨ配列は、組換え五量体の分泌に対して膜貫通ドメインを伴わなかった。五量体複合体の発現の例は、Ｈｏｆｍａｎｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年、第１１２巻、第１２号、２５０５～２５１５頁）に与えられた。
ＨＣＭＶ五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１を、５つのプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株で得たが、各プラスミドは、ＨＣＭＶ五量体を構成する５つのタンパク質の１つをコードする配列を含んだ。配列は、ＢＥ／２８／２０１１株（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＰ７４５６６９）に由来した。ｇＨ配列は、組換え五量体の分泌に対して膜貫通ドメインを伴わなかった。五量体複合体の発現の例は、Ｈｏｆｍａｎｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年、第１１２巻、第１２号、２５０５～２５１５頁）に与えられた。
【0748】
ＳＰＡ１４
例えば、２０μｇ／ｍｌでＥ６０２０を含むＳＰＡ１４の原液を、以下のように製造した。
例えば、２０μｇ／ｍｌでＥ６０２０を含むＳＰＡ１４の原液を、以下のように製造した。
【0749】
リポソームを、以下の通り、溶媒、例えばエタノール注入法によって製造した。
【0750】
エタノール中のＥ６０２０の溶液を、２ｍｇ／ｍｌで、２．０ｍｇのＥ６０２０粉末を０．９９８ｍｌのエタノールに溶解することにより製造した。
【0751】
４倍濃縮したエタノール溶液を、４０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１０ｍｇ／ｍｌのコレステロール、および０．２００ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０で、０．８５０ｍｌのエタノール、４０ｍｇのＤＯＰＣ、および１０ｍｇのコレステロール、ならびに０．１００ｍｌの先に製造したＥ６０２０溶液をエタノールに溶解することにより、製造した。溶液を、生成物を完全に溶解し、無色の溶液が得られるまで、室温（ＲＴ）で撹拌した。
【0752】
７ｍｌのＬｙｏガラス製バイアルにおいて、３．０ｍＬのＣＢＳ（クエン酸緩衝溶液）ｐＨ６．３（シトレート１０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ｐＨ６．３）を、室温で、１０００ｒｐｍで撹拌した。１．０ｍｌの脂質溶液を、０．１ｍｌ／分で、２２ｇａのニードルおよびシリンジポンプを伴うハミルトンシリンジを使用してゆっくり添加して、リポソームを形成した。リポソームを、ＣＢＳ ｐＨ６．３に対して３回（半日後、一晩目、一日後）に（１００００ ＭＣＷＯ透析カセットで）透析した。
【0753】
リポソーム懸濁液を、直径３３ｍｍのＭｉｌｌｅｘフィルターＰＶＤＦ０．２２μｍで滅菌ろ過し、窒素下の＋４℃で保存した。
【0754】
リポソーム成分濃縮液を、透析の希釈倍率によって推定した。１．６の透析希釈倍率に対して、リポソーム成分濃縮液は、６．２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１．５６ｍｇ／ｍｌのコレステロール、および０．０３１ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０であった。
【0755】
フローフード下、３．０ｍｇのＱＳ２１を、３．０ｍＬのＣＢＳ ｐＨ６．３に再懸濁して１．０ｍｇ／ｍｌでＱＳ２１の溶液を得、直径２５ｍｍのＰａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ ０．２μｍで滅菌ろ過した。
【0756】
滅菌条件において、ＳＰＡ１４（リポソーム懸濁液）を、ＣＢＳ ｐＨ６．３における１．０ｍｇ／ｍｌでの１．５６３ｍｌのＱＳ２１の溶液を、５．０００ｍｌの先のリポソーム懸濁液および１．２５０ｍｌのＣＢＳ ｐＨ６．３に添加することにより製剤化した。混合物を、ボルテックスを使用して１０秒間撹拌し、４ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ、１ｍｇ／ｍｌのコレステロール、０．０２０ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０、および０．２００ｍｇ／ｍｌのＱＳ２１の最終的なＳＰＡ１４滅菌懸濁液に対して窒素下の＋４℃で保存した。
【0757】
抗原と混合するために、ＳＰＡ１４アジュバントを穏やかに５回上下に返して、２回濃縮した抗原と混合する前に生成物を均質化した。次いで、免疫原性組成物を、さらに使用するまで、適切な温度（２～８℃）で保存した。
【0758】
抗原との混合を容積／容積で行い、得られる混合物を穏やかに５回上下に返した。混合物を、注射直前または注射の最大で３時間前に製造した。この後者の場合、これらは、注射まで２～８℃に設置する必要があった。
【0759】
実施例１０に対して、ＳＰＡ１４原液を、上述の通りだが、４：１：０．２：０．０４ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ：コレステロール：ＱＳ２１：Ｅ６０２０の最終比で製造した。
【0760】
実施例４および１１に対して、ＳＰＡ１４原液を、それぞれ４：１：０．２：Ｘｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＱＳ２１／Ｅ６０２０で上述の通りに製造した。４つの異なる濃度Ｘ：０ｍｇ／ｍｌ、０．００４ｍｇ／ｍｌ、０．００８ｍｇ／ｍｌ、および０．０２ｍｇ／ｍｌのＥ６０２０を使用して、実施例９の表８に記載されるＥ６０２０の用量を得た（抗原および注射した５００μｌでのｖ／ｖ希釈）。
【実施例10】
【0761】
異なるアジュバントの評価
異なるアジュバントの評価
アジュバントＡＦ０４、ＳＰＡ１４、およびＡＳ０１Ｅは、ＡＦ０３と比較した（ＡＦ０３はスクアレン乳剤アジュバントであり、一次ＨＣＭＶのＨＣＭＶ獲得を予防するが、中和抗体のレベルを迅速に低下させる５０％の効能を示した、ｇＢ抗原での臨床試験に使用したＭＦ５９（ＷＯ２００７／００５５８３参照）と同様である）。
異なるアジュバントの評価
アジュバントＡＦ０４、ＳＰＡ１４、およびＡＳ０１Ｅは、ＡＦ０３と比較した（ＡＦ０３はスクアレン乳剤アジュバントであり、一次ＨＣＭＶのＨＣＭＶ獲得を予防するが、中和抗体のレベルを迅速に低下させる５０％の効能を示した、ｇＢ抗原での臨床試験に使用したＭＦ５９（ＷＯ２００７／００５５８３参照）と同様である）。
【0762】
材料および方法
本マウス研究では、３７週齢の未処理の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの群は、０、２１、および２２１日目（７か月目）にＩＭ経路を介して、ＡＦ０３（１．２５ｍｇのスクアレン／用量）、ＡＦ０４（１μｇ／用量のＥ６０２０を含有するＡＦ０３スクアレンベースの乳剤）、ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および１μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）、またはＡＳ０１Ｅ（商用のワクチンＳｈｉｎｇｒｉｘから得られるＡＳ０１Ｂの二分の一希釈）アジュバントで製剤化した、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（各２μｇ／用量－用量：５０μＬ）の３回の筋肉内（ＩＭ）免疫化を受けた。血液サンプルを、血清中和抗体応答をモニタリングするために１、２、３、４、５、６、７、および８か月目に収集した。約１ｍＬの血液を、凝固活性化因子および血清セパレーター（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ ｒｅｆ ３６７７８３）を含有するバイアルに収集した。＋４℃での一晩の後、血液を２０分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を収集し、解析まで－２０℃で保存した。加えて、１、７、および８か月目に、血液および脾臓を、１群当たり１０匹のマウスから収集して、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）頻度、ならびにＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌をモニタリングした。
本マウス研究では、３７週齢の未処理の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの群は、０、２１、および２２１日目（７か月目）にＩＭ経路を介して、ＡＦ０３（１．２５ｍｇのスクアレン／用量）、ＡＦ０４（１μｇ／用量のＥ６０２０を含有するＡＦ０３スクアレンベースの乳剤）、ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および１μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム）、またはＡＳ０１Ｅ（商用のワクチンＳｈｉｎｇｒｉｘから得られるＡＳ０１Ｂの二分の一希釈）アジュバントで製剤化した、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（各２μｇ／用量－用量：５０μＬ）の３回の筋肉内（ＩＭ）免疫化を受けた。血液サンプルを、血清中和抗体応答をモニタリングするために１、２、３、４、５、６、７、および８か月目に収集した。約１ｍＬの血液を、凝固活性化因子および血清セパレーター（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ ｒｅｆ ３６７７８３）を含有するバイアルに収集した。＋４℃での一晩の後、血液を２０分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、血清を収集し、解析まで－２０℃で保存した。加えて、１、７、および８か月目に、血液および脾臓を、１群当たり１０匹のマウスから収集して、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）頻度、ならびにＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌をモニタリングした。
【0763】
細胞応答アッセイに対して、脾臓を滅菌条件において収集し、脾細胞を、脾臓サンプリングの後できるだけ早く単離した。
【0764】
血清中和アッセイ
簡潔には、２．５×１０４個のＭＲＣ－５線維芽細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。Ｄ０に、血清を５６℃で３０分間、加熱不活化した。血清サンプルを、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５年８月；７９（１６）：１０３３０～８頁に記載）とインキュベートした。次いで、血清／ウイルス混合物を、ＭＲＣ５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃で、ＭＲＣ５細胞に対しては３日間、ＡＲＰＥ細胞に対しては４日間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターでインキュベートした。
簡潔には、２．５×１０４個のＭＲＣ－５線維芽細胞またはＡＲＰＥ－１９細胞を、マイクロ中和（ＭＮ）アッセイの前日に９６ウェルダークプレートに分配した。Ｄ０に、血清を５６℃で３０分間、加熱不活化した。血清サンプルを、９６ディープウェルプレートで１／１０から１／１０２４０に開始する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １％ＦＢＳでの２倍連続希釈し、３７℃で６０分間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターで、４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌのＢＡＤｒＵＬ１３１－Ｙ４ ＣＭＶウイルス株（Ｗａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００５年８月；７９（１６）：１０３３０～８頁に記載）とインキュベートした。次いで、血清／ウイルス混合物を、ＭＲＣ５またはＡＲＰＥ－１９細胞に移し、３７℃で、ＭＲＣ５細胞に対しては３日間、ＡＲＰＥ細胞に対しては４日間、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターでインキュベートした。
【0765】
次いで、培養上清を除去し、細胞を室温で１時間、ＰＢＳ中の１００μｌの１％ホルモルで固定した。次いで、プレートを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ蛍光プレートリーダーでの解析の前に、ＰＢＳで洗浄し、室温で空気乾燥して、各ウェルで感染した細胞を計数した。
【0766】
対照として、細胞対照（ウイルスなし）の２つのウェルおよび４．２ｌｏｇＦＦＵ／ｍｌを含有するウイルス希釈の半分を感染させた細胞を含む６つのウェルは、各プレートに存在した。これら６つのウェルの平均は、特異的シグナル値の５０％として決定した、血清中和の閾値を定義した。中和エンドポイント力価は、計算した特異的シグナル値の５０％未満に低下した最後の希釈の逆数として定義した。中和力価（μＰＲＮＴ５０）は、各対象の血清に対して、感染した細胞の５０％の低下を誘発した最後の希釈、すなわち計算した特異的シグナル値の５０％より少なく感染した細胞を誘発した最後の希釈として定義した。幾何平均の中和抗体力価は、各群に対して計算した。
【0767】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＭＶ－ｇＢ抗原またはＣＭＶ五量体抗原を対象とした血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体は、以下の手順にしたがってロボットＥＬＩＳＡアッセイで滴定した。
ＣＭＶ－ｇＢ抗原またはＣＭＶ五量体抗原を対象とした血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体は、以下の手順にしたがってロボットＥＬＩＳＡアッセイで滴定した。
【0768】
Ｄｙｎｅｘ ９６ウェルマイクロプレートを、４℃で終夜、０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ）において１μｇ／ウェルのＣＭＶ－ｇＢまたはＣＭＶ五量体でコーティングした。次いで、プレートを、３７℃で少なくとも１時間、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ－ミルク（ＰＢＳ ｐＨ７．１、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％（ｗ／ｖ）粉末スキムミルク（ＤＩＦＣＯ））で遮断した。次の全てのインキュベートは、１００μＬの最終容積で実行し、続いてＰＢＳ ｐＨ７．１、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。血清サンプルの２倍連続希釈を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ－ミルク（１／１０００または１／１００００から開始）で実施し、ウェルに添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。洗浄した後、１／２０００で、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ－ミルクで希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃペルオキシダーゼ結合抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をウェルに添加し、プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。プレートをさらに洗浄し、２０℃で３０分間、１００μＬ／ウェルのすぐ使用できるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（ＴＥＢＵ）と暗室でインキュベートした。反応を１００μＬ／ウェルのＨＣｌ １Ｍ（Ｐｒｏｌａｂｏ）で停止した。
【0769】
光学密度（ＯＤ）を、プレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍ～６５０ｎｍで測定した。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ抗体力価を、滴定曲線から０．２～３．０のＯＤ値範囲に対してＣｏｄＵｎｉｔソフトウェアを使用して計算した（参照マウス高度免疫血清は各プレートに置く）。この参照のＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ力価は、任意のＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表すが、１．０のＯＤを与える希釈の逆数のｌｏｇ１０に相当した。抗体検出の閾値は、１０ＥＬＩＳＡ単位（１．０ｌｏｇ１０）であった。全ての最終力価は、ｌｏｇ１０（Ｌｏｇ）で表した。
【0770】
ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比は、個々の算術値を使用して計算し、個々のＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比の幾何平均は、各群に対して計算した。
【0771】
蛍光ＳＰＯＴ
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）を、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５サイトカインを分泌する個々の細胞の検出および数え上げに使用した。
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）を、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－５サイトカインを分泌する個々の細胞の検出および数え上げに使用した。
【0772】
９６ウェルのＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）の膜を、３５％エタノールで予め湿潤させ、次いでＰＢＳ １×で２回洗浄した。次いで、マイクロプレートを、それぞれ１／１００および１／５０で希釈したラット抗マウスＩＦＮ－γまたはラット抗マウスＩＬ－５抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。
【0773】
Ｄ１に、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで３７℃で少なくとも２時間、ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳで遮断した。プレート洗浄した後、５×１０５個の新たに単離した脾細胞／ウェルを、マウスＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）の存在下、陽性対照としてＣＭＶ－ｇＢ抗原（０．１μｇ／ｍｌ）、ＣＭＶ五量体（０．１μｇ／ｍｌ）、またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、２．５μｇ／ｍＬ）で終夜インキュベートした。
【0774】
Ｄ２にプレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄する工程の後、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗マウスＩＦＮ－γまたは抗マウスＩＬ５抗体を、室温で２時間、暗室でＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％に１μｇ／ｍＬで添加した。プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％（２００μＬ／ウェル）で再び３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％中に１μｇ／ｍＬでの１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン－ＰＥを室温で１時間、暗室でインキュベートした。
【0775】
プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％（２００μＬ／ウェル）でさらに６回洗浄した。プレートを、読み出すまで５℃±３℃の暗室で保存した。
【0776】
ＩＦＮ－γまたはＩＬ５分泌性細胞（ＩＦＮ－γ ＳＣまたはＩＬ５ ＳＣ）に相当する各スポットは、自動蛍光ＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。結果は、１０６個の脾細胞当たりのＩＦＮ－γまたはＩＬ－５分泌性細胞の数として表した。
【0777】
ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ｃ蛍光ＳＰＯＴアッセイ
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）を、抗原特異性に関係なく抗体を分泌する個々のＢ細胞の検出および数え上げに使用した（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃまたは総ＩｇＧ）。
蛍光結合免疫スポット（蛍光ＳＰＯＴ）を、抗原特異性に関係なく抗体を分泌する個々のＢ細胞の検出および数え上げに使用した（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃまたは総ＩｇＧ）。
【0778】
９６ウェルのＩＰＦＬ底マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）の膜を、３５％エタノールで予め湿潤させ、次いでＰＢＳ １×で２回洗浄した。次いで、マイクロプレートを、それぞれ１／６８、１／１００および１／１００で希釈したＣＭＶ－ｇＢ抗原（１０μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｏｆｉ）、ＣＭＶ五量体（１０μｇ／ｍｌ、ＮＡＣ）、または総ＩｇＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＫＰＬ）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。
【0779】
Ｄ１に、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで３７℃で少なくとも２時間、ＲＰＭＩ １０％ＦＢＳで遮断した。
【0780】
プレートを洗浄した後、ＣＭＶ－ｇＢ抗原またはＣＭＶ五量体に対して５×１０５個の新たに単離した脾細胞／ウェルおよび総ＩｇＧ抗体に対して２．５×１０５個の新たに単離した脾細胞／ウェルを５時間インキュベートした。
【0781】
５時間後、プレートをＰＢＳ １×で３回洗浄し、４℃で一晩保存した。
【0782】
Ｄ２に、プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％（２００μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄する工程の後、１００μＬ／ウェルの抗マウスＩｇＧ１ ＰＥまたは抗マウスＩｇＧ２ｃ ＦＩＴＣまたは抗マウス総ＩｇＧ抗体を、室温で２時間、暗室でＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％にそれぞれ４、２または０．５μｇ／ｍＬで添加した。プレートをＰＢＳ １×－ＢＳＡ０．１％（２００μＬ／ウェル）で再び６回洗浄した。プレートを、読み出すまで５℃±３℃の暗室で保存した。
【0783】
抗体分泌性細胞（ＡＳＣ）（ＩｇＧ１ ＡＳＣ、ＩｇＧ２ｃ ＡＳＣ、または総ＩｇＧ ＡＣＳ）に相当する各スポットは、自動蛍光ＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で数え上げた。結果は、１０６個の脾細胞当たりの抗体分泌性細胞の数として表した。
【0784】
統計解析
全ての解析は、ＳＡＳ ｖ９．２（登録商標）（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケーリー、ＮＣ）で実施した。固定因子として群を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）１要因モデルまたは固定因子として群および時間を伴うＡＮＯＶＡ２因子を実施した。長手方向の解析に対して、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）は、分類変数として群および連続変数として時間を伴って実施した。ＡＦ０３と比較するために、Ｄｕｎｎｅｔｔ調節を使用した。
全ての解析は、ＳＡＳ ｖ９．２（登録商標）（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケーリー、ＮＣ）で実施した。固定因子として群を伴う分散分析（ＡＮＯＶＡ）１要因モデルまたは固定因子として群および時間を伴うＡＮＯＶＡ２因子を実施した。長手方向の解析に対して、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）は、分類変数として群および連続変数として時間を伴って実施した。ＡＦ０３と比較するために、Ｄｕｎｎｅｔｔ調節を使用した。
【0785】
結果
図１８に示す通り、アジュバント効果では、どの時点かにかかわらず、全ての試験した製剤に対してＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的免疫応答が実証された。ＳＰＡ１４は、ＡＦ０３と比較して、統計的に有意に高く（３倍以上）、より持続的な中和抗体力価を誘起した（優越性の検定、両側Ｄｕｎｎｅｔ調節、全てのｐ値＜０．０５）。また、ＳＰＡ１４は、ＡＦ０４より高い中和抗体応答を誘起した。ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅは、類似した振幅で中和抗体応答を誘起した。
図１８に示す通り、アジュバント効果では、どの時点かにかかわらず、全ての試験した製剤に対してＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的免疫応答が実証された。ＳＰＡ１４は、ＡＦ０３と比較して、統計的に有意に高く（３倍以上）、より持続的な中和抗体力価を誘起した（優越性の検定、両側Ｄｕｎｎｅｔ調節、全てのｐ値＜０．０５）。また、ＳＰＡ１４は、ＡＦ０４より高い中和抗体応答を誘起した。ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅは、類似した振幅で中和抗体応答を誘起した。
【0786】
図１９Ａおよび１９Ｂに示す通り、１か月目（第２の用量の１５日後）および８か月目（最終用量の２８日後）での解析は、初期の時点でＳＰＡ１４、ＡＳ０１Ｅ、ＡＦ０３およびＡＦ０４で観察された免疫プロファイル、ならびにＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅアジュバントのより高くより持続的な中和抗体力価を誘発する能力を確認した（図１９Ａおよび１９Ｂ、全てのｐ値＜０．０５）。
【0787】
さらに、ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅは、ＡＦ０３より高いＩｇＧ２ｃ Ｂ記憶細胞の頻度ならびによりＴｈ１で指向した細胞応答を誘発した。免疫応答のプロファイルに関して、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃ比は、ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅを受けた群に対するＴｈ１プロファイルを示し、Ｔｈ２プロファイルは、高いＩｇＧ１力価を誘起するＡＦ０３で観察された。これは、１か月目に細胞応答解析で確認した。ＡＦ０３と比較してＳＰＡ１４およびＡＳ０１ＥのＴｈ１で歪んだプロファイルでは、ＣＭＶ ｇＢまたはＣＭＶ五量体のいずれかの刺激の際の、ＩＬ－５の減少およびＩＦＮ－γ生成の増加が示された。解析では、７か月目および８か月目に、初期の時点でＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅで観察された免疫プロファイル、ならびにこれらのアジュバントのＡＦ０３よりＴｈ１で指向した細胞応答を誘発する能力を確認した（図２０Ａ～Ｂ）。さらに、形質芽球およびＢ記憶細胞中のＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１ ＡＳＣ比は、Ｔｈ１の指向に関連して、ＡＦ０３よりＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅで高かった。ＳＰＡ１４に対して３５日目に測定したこの早期の記憶Ｂ細胞応答は、７か月目に確認した（検出したＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体に特異的な０．６％から最大で１％のＩｇＧ２ｃ－ＡＳＣ記憶Ｂ細胞）。これらのＩｇＧ２ｃ ＡＳＣの頻度は、ＡＦ０３より著しく高かった（全てのｐ値＜０．００１）。さらに、ＳＰＡ１４がＡＳ０１Ｅよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘起したことを観察した。図２０に示す通り、特に８か月目に、ＳＰＡ１４は、ＡＳ０１Ｅより小さいＩＦＮ－γ分泌性細胞の増加（２．６分の１、有意ではない）、およびより小さいＩＬ－５分泌性細胞の減少（２．９倍高い、ｐ値＜０．００１）を誘発し、ＡＳ０１Ｅと比較して小さくよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２比をもたらした。
【0788】
マウスモデルにおいて最大８か月目に行った解析は、ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅが、予想した基準（ｉ）ＡＦ０３より高い中和抗体力価、（ｉｉ）より小さいＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｃのサブクラス比およびより高いＩＦＮγ／ＩＬ－５比で判明した、ＡＦ０３と比較してＴｈ１に偏ったプロファイル、ならびに（ｉｉｉ）ＡＦ０３と比較してより持続的な中和抗体応答および記憶Ｂ細胞のより高い頻度を満たすことができ、ＣＭＶワクチン候補を向上させるのに好適なアジュバントであり得ると結論付けることを可能にした。
【0789】
ＳＰＡ１４をＡＦ０４と比較する場合、ＡＦ０４が、ＡＦ０３とＳＰＡ１４との間に中間応答を誘起したことを観察した。乳剤（ＡＦ０４）またはリポソーム（ＳＰＡ１４）のいずれかで評価した同じＴＬＲ４アゴニスト濃度に対して、ＡＦ０４は、１か月目および８か月目でＡＦ０３より高い中和抗体を誘発することができた（図１８）が、中和力価のこの上昇は、ＳＰＡ１４で得られるものより低かった。同様に、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルに対して、ＡＦ０４は、ＡＦ０３と比較して、ＩＦＮ－γを上昇させ、ＩＬ－５を減少させることができたが、これらの変化は、ＳＰＡ１４製剤で向上し、より顕著であった。
【0790】
結論
結論として、ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅは、ｇＢおよび五量体の両方に特異的な最も高い中和抗体力価、ならびにｇＢおよび五量体に対する最も高い長く持続する免疫応答を誘発するアジュバントであった。両方のアジュバントは、Ｔｈ１プロファイルの免疫応答を誘発した。ＳＰＡ１４は、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘発した。
結論として、ＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｅは、ｇＢおよび五量体の両方に特異的な最も高い中和抗体力価、ならびにｇＢおよび五量体に対する最も高い長く持続する免疫応答を誘発するアジュバントであった。両方のアジュバントは、Ｔｈ１プロファイルの免疫応答を誘発した。ＳＰＡ１４は、よりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２応答を誘発した。
【実施例11】
【0791】
ＳＰＡ１４でアジュバント処理した組成物の反応原性
ＳＰＡ１４でアジュバント処理した組成物の反応原性
本研究の目的は、３週間の間隔をあけた２回の筋肉内注射に続いて、実施例４の同じニュージーランドホワイトウサギの群において、アジュバントとしてＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂのいずれかを含有するＣＭＶ抗原含有ワクチン組成物の潜在的な免疫原性を調査すること、ならびに２週間の観察期間の間の発症の遅延および／または任意の局所反応の可逆性を評価することであった。
ＳＰＡ１４でアジュバント処理した組成物の反応原性
本研究の目的は、３週間の間隔をあけた２回の筋肉内注射に続いて、実施例４の同じニュージーランドホワイトウサギの群において、アジュバントとしてＳＰＡ１４またはＡＳ０１Ｂのいずれかを含有するＣＭＶ抗原含有ワクチン組成物の潜在的な免疫原性を調査すること、ならびに２週間の観察期間の間の発症の遅延および／または任意の局所反応の可逆性を評価することであった。
【0792】
ＣＭＶ抗原を含有するＳＰＡ１４およびＡＳ０１Ｂアジュバント処理した免疫原性組成物は、実施例４に記載した通りであった。
【0793】
材料および方法
動物および研究デザイン
動物および研究デザインは、実施例４のものであった。
動物および研究デザイン
動物および研究デザインは、実施例４のものであった。
【0794】
血液サンプルの採取
血液サンプルを、研究を開始する前、次いで２、３、７、２３、２４、および３６日目に収集した。フィブリノゲン解析に対して、血液サンプルを、酢酸三ナトリウムを含有するバイアルに採取し、好中球数に対して、血液サンプルをＥＤＴＡ－Ｋ２を含有するチューブに採取した。
血液サンプルを、研究を開始する前、次いで２、３、７、２３、２４、および３６日目に収集した。フィブリノゲン解析に対して、血液サンプルを、酢酸三ナトリウムを含有するバイアルに採取し、好中球数に対して、血液サンプルをＥＤＴＡ－Ｋ２を含有するチューブに採取した。
【0795】
好中球数
好中球数を、製造者の奨励にしたがってＡＤＶＩＡ（１２０または２１２０、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して決定した。
好中球数を、製造者の奨励にしたがってＡＤＶＩＡ（１２０または２１２０、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して決定した。
【0796】
フィブリノゲン
フィブリノゲンパラメータを、製造者の奨励にしたがってＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｓｔａｇｏ）システムを使用して決定した。
フィブリノゲンパラメータを、製造者の奨励にしたがってＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｓｔａｇｏ）システムを使用して決定した。
【0797】
グロブリン
グロブリンパラメータを、製造者の奨励にしたがってＡＵ６８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）システムを使用して決定した。
グロブリンパラメータを、製造者の奨励にしたがってＡＵ６８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）システムを使用して決定した。
【0798】
Ｃ反応性タンパク質
ＣＲＰは、ＥＬＩＳＡ（ＣＲＰ－１０ Ｌｉｆｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して決定した。サンプルは、以下の通り製造した：サンプルを約４℃で１０分間、１８００Ｇで遠心分離した。次いで、血清を氷上で収集した。ＥＬＩＳＡキットを製造者の奨励にしたがって使用した。
ＣＲＰは、ＥＬＩＳＡ（ＣＲＰ－１０ Ｌｉｆｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して決定した。サンプルは、以下の通り製造した：サンプルを約４℃で１０分間、１８００Ｇで遠心分離した。次いで、血清を氷上で収集した。ＥＬＩＳＡキットを製造者の奨励にしたがって使用した。
【0799】
結果
ＡＳ０１ＢまたはＳＰＡ１４のいずれかでアジュバント処理したＣＭＶ抗原 ｇＢ＋五量体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）を含む免疫原性組成物の、３週間間隔をあけたＮＺＷウサギへの２回の筋肉内投与は、あらゆる全身毒性も誘発しなかった。
ＡＳ０１ＢまたはＳＰＡ１４のいずれかでアジュバント処理したＣＭＶ抗原 ｇＢ＋五量体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）を含む免疫原性組成物の、３週間間隔をあけたＮＺＷウサギへの２回の筋肉内投与は、あらゆる全身毒性も誘発しなかった。
【0800】
ＳＰＡ１４を受けた動物と比較してＡＳ０１Ｂアジュバント処理した組成物を受けた動物において、わずかな上昇を、好中球数およびフィブリノゲンレベルで観察し、ならびにグロブリンおよびＣＲＰレベルの上昇を観察した。
【0801】
【表9】
【0802】
第１の注射の後、ＡＳ０１Ｂ（群３）は、抗原単独と比較して好中球数の上昇を誘発した（２倍超）。上昇がＳＰＡ１４でも観察されたが、これは中程度にとどまり、５μｇのＥ６０２０でのみＡＳ０１Ｂと同様に強力であった。
【0803】
ＡＳ０１Ｂは、免疫原性組成物の第２の注射の後にも上昇を誘発したが、ＳＰＡ１４製剤では観察されなかった、または非常に中程度のみで長期的に持続しなかった（５μｇ／ｍｌのＥ６０２０でのＳＰＡ１４）。
【0804】
【表10】
【0805】
第１および第２の注射の４８時間後、ＡＳ０１Ｂは、抗原単独と比較して最大８８％のフィブリノゲンレベルの上昇を誘発した。ここでもまた、ＳＰＡ１４が第１の注射の４８時間後にフィブリノゲンの上昇を誘発した場合、フィブリノゲンレベルは、第２の注射の後より小さい程度まで上昇した（ＡＳ０１Ｂで誘発した上昇と比較して）。
【0806】
【表11】
【0807】
ＡＳ０１Ｂは、抗原単独と比較して、特に第２の注射の後にＳＰＡ１４アジュバント処理した組成物で観察したものよりわずかに高い、グロブリンレベルの上昇を誘発した。
【0808】
【表12】
【0809】
ＡＳ０１Ｂは、ＳＰＡ１４アジュバント処理した製剤で観察されたものより高いＣＲＰレベルの増加を誘発した。さらに、増加は、ＳＰＡ１４で観察されたものより長く、最大４８時間持続した。特に、第２の注射の４８時間後、ＡＳ０１Ｂは、５μｇ／ｍｌのＥ６０２０を含むＳＰＡ１４で誘発したＣＲＰレベルの２倍であるＣＲＰレベルを誘発した。ＣＲＰは、周知の反応原性バイオマーカーである。
【0810】
結論
ＡＳ０１ＢまたはＳＰＡ１４（０～５μｇのＥ６０２０を含有）でアジュバント処理したＣＭＶ－ｇＢ＋五量体の、３週間間隔をあけたＮＺＷウサギへの２回のＩＭ投与は、良好に許容され、いずれの全身毒性も誘発しなかった。局所反応のみ、全ての処置群において浮腫が主に判明した注射部位（ＩＳ）で注目されたが、有害とみなさなかった。わずかで可逆的な好中球数およびフィブリノゲンレベルの上昇は、アジュバント処理した処置群に匹敵することが観察されたが、これらの上昇は、ＡＳ０１ＢよりＳＰＡ１４で程度が小さかった。グロブリンおよびＣＲＰレベルの上昇もまた、全てのアジュバント処理した処置群において、ＡＳ０１Ｂより、ＳＰＡ１４製剤では、より低く、反応原性バイオマーカーＣＲＰに対して、基底レベルへの回復がより速いことで注目された。これらの変化は、ＡＳ０１Ｂと比較して、ＳＰＡ１４製剤でより低い反応原性プロファイルを示唆した。
ＡＳ０１ＢまたはＳＰＡ１４（０～５μｇのＥ６０２０を含有）でアジュバント処理したＣＭＶ－ｇＢ＋五量体の、３週間間隔をあけたＮＺＷウサギへの２回のＩＭ投与は、良好に許容され、いずれの全身毒性も誘発しなかった。局所反応のみ、全ての処置群において浮腫が主に判明した注射部位（ＩＳ）で注目されたが、有害とみなさなかった。わずかで可逆的な好中球数およびフィブリノゲンレベルの上昇は、アジュバント処理した処置群に匹敵することが観察されたが、これらの上昇は、ＡＳ０１ＢよりＳＰＡ１４で程度が小さかった。グロブリンおよびＣＲＰレベルの上昇もまた、全てのアジュバント処理した処置群において、ＡＳ０１Ｂより、ＳＰＡ１４製剤では、より低く、反応原性バイオマーカーＣＲＰに対して、基底レベルへの回復がより速いことで注目された。これらの変化は、ＡＳ０１Ｂと比較して、ＳＰＡ１４製剤でより低い反応原性プロファイルを示唆した。
【0811】
実施例４、１０および１１の総合的な結論
上記の実施例４、１０および１１に示す通り、ＣＭＶ抗原を含有する免疫原性組成物は、ｇＢおよび五量体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）抗原で例示され、ＳＰＡ１４アジュバントでアジュバント処理されるが、ＡＦ０４のようなＴＬＲ４アゴニストを含有する他のアジュバントと比較してより高い長期持続型血清中和抗体を誘発することが分かった。ＳＰＡ１４で誘起した免疫応答は、ＡＳ０１Ｂで誘起した免疫応答に匹敵した。
上記の実施例４、１０および１１に示す通り、ＣＭＶ抗原を含有する免疫原性組成物は、ｇＢおよび五量体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）抗原で例示され、ＳＰＡ１４アジュバントでアジュバント処理されるが、ＡＦ０４のようなＴＬＲ４アゴニストを含有する他のアジュバントと比較してより高い長期持続型血清中和抗体を誘発することが分かった。ＳＰＡ１４で誘起した免疫応答は、ＡＳ０１Ｂで誘起した免疫応答に匹敵した。
【0812】
Ｔｈ１で指向した応答を誘発するが、ＳＰＡ１４でアジュバント処理した免疫原性組成物で誘起した免疫応答は、ＡＳ０１Ｂと比較してよりバランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２プロファイルを呈した。
【0813】
最終的に、ＣＲＰ、フィブリノゲン、またはグロブリン応答に示す通り、ＳＰＡ１４でアジュバント処理したＣＭＶ免疫原性組成物は、ＡＳ０１Ｂアジュバント処理した免疫原性組成物と比較してより低い反応原性プロファイルを呈した。
【0814】
ｇＢおよび五量体（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）抗原のようなＣＭＶ抗原を含有し、ＳＰＡ１４でアジュバント処理した免疫原性組成物は、熟練者または意図したレシピエントのいずれかによるＣＭＶワクチン接種プログラムへの良好な遵守を確実にする、誘起した免疫応答に関して優れたプロファイルおよび低い反応原性を呈した。
【実施例12】
【0815】
ＳＰＡ１４様製剤でのＱＳ２１およびＱＳ７サポニン
ＳＰＡ１４製剤でのＱＳ２１対ＱＳ７の比較
本研究の目的は、サポニンとしてＱＳ２１またはＱＳ７のいずれかを含有するＳＰＡ１４製剤の溶血活性およびアジュバント処理効果を比較することであった。
ＳＰＡ１４製剤でのＱＳ２１対ＱＳ７の比較
本研究の目的は、サポニンとしてＱＳ２１またはＱＳ７のいずれかを含有するＳＰＡ１４製剤の溶血活性およびアジュバント処理効果を比較することであった。
【0816】
材料および方法
リポソームの製造
リポソームは、実施例１および４に記載される通り、ｈＣＭＶ抗原ｇＢおよび五量体で製造した。
リポソームの製造
リポソームは、実施例１および４に記載される通り、ｈＣＭＶ抗原ｇＢおよび五量体で製造した。
【0817】
溶血アッセイ
使用前に、赤血球（ヒツジ赤血球１０％、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ｒｅｆ Ｒ４０５－００５０、ロットＢＰ３０２０２（＋４℃で保存））を、冷たいＰＢＳで洗浄した。５ｍＬのヒツジ赤血球は、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、７ｍＬの冷たいＰＢＳを添加した。細胞を４℃で１０分間、７００ｇで遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを１２ｍＬの冷たいＰＢＳに懸濁した。次いで、細胞懸濁液を４℃で１０分間、７００ｇで遠心分離した。細胞の懸濁化および遠心分離の工程を２回繰り返した。最終的に、細胞を、５ｍＬの最終容積ですぐ使用できるＰＢＳに懸濁した。
使用前に、赤血球（ヒツジ赤血球１０％、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ｒｅｆ Ｒ４０５－００５０、ロットＢＰ３０２０２（＋４℃で保存））を、冷たいＰＢＳで洗浄した。５ｍＬのヒツジ赤血球は、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、７ｍＬの冷たいＰＢＳを添加した。細胞を４℃で１０分間、７００ｇで遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを１２ｍＬの冷たいＰＢＳに懸濁した。次いで、細胞懸濁液を４℃で１０分間、７００ｇで遠心分離した。細胞の懸濁化および遠心分離の工程を２回繰り返した。最終的に、細胞を、５ｍＬの最終容積ですぐ使用できるＰＢＳに懸濁した。
【0818】
丸底Ｐ９６プレートにおいて、ウェル当たり１００μＬのＰＢＳを添加した。次いで、ウェル当たり１００μＬのサポニンＱＳ２１またはＱＳ７溶液を、２倍連続希釈（１．６μＭから２００μＭへ）でクエン酸緩衝液（シトレート１０ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ｐＨ６．３）に添加した。クエン酸緩衝液を単独で対照溶液として使用した。
【0819】
２５μＬ／ウェルの１０％赤血球溶液を添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで室温で５分間、７００ｇで遠心分離した。ウェル当たり８０μＬの上清を収集し、分光光度計の読出し（ＯＤ ５４０ｎｍ）のために平底プレートに移した。細胞溶血の百分率を、式：１００×［（サンプル吸光度－陰性対照吸光度）÷（陽性対照吸光度－陰性対照吸光度）］にしたがって、μＭで試験した各サポニン濃度に対して計算した。
【0820】
統計解析は、Ｔｕｋｅｙ調節および一元ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０５で実行した。
【0821】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫応答研究
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの９つの群（ｎ＝８）は、以下で製剤化した、２μｇのＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）を含有する５０μＬの最終注射容積で大腿四頭筋への２回のＩＭ免疫化（プライミングおよびブースト：Ｄ０およびＤ２０）を受けた：
－ Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ））、
－ ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０ μｇ／ｍｌ））、
－ ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００μｇ／ｍＬ））
－ ＱＳ７（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ）」、（０：６００μｇ／ｍＬ）、または（０：１８００μｇ／ｍＬ）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００μｇ／ｍＬ）、（２０：６００μｇ／ｍＬ）、または（２０：１８００μｇ／ｍＬ））を含有するＳＰＡ１４様製剤。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの９つの群（ｎ＝８）は、以下で製剤化した、２μｇのＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）を含有する５０μＬの最終注射容積で大腿四頭筋への２回のＩＭ免疫化（プライミングおよびブースト：Ｄ０およびＤ２０）を受けた：
－ Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（５μｇ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ））、
－ ＱＳ２１またはＱＳ７なしにＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」（２０：０ μｇ／ｍｌ））、
－ ＳＰＡ１４（５μｇのＱＳ２１および０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＳＰＡ１４」（２０：２００μｇ／ｍＬ））
－ ＱＳ７（５、１５または４５μｇのＱＳ７および０または０．５μｇのＥ６０２０／用量を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ７ ＬＩＰ」（０：２００μｇ／ｍＬ）」、（０：６００μｇ／ｍＬ）、または（０：１８００μｇ／ｍＬ）、「ＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］」（２０：２００μｇ／ｍＬ）、（２０：６００μｇ／ｍＬ）、または（２０：１８００μｇ／ｍＬ））を含有するＳＰＡ１４様製剤。
【0822】
【表13-1】
【表13-2】
【0823】
血液サンプルおよび脾臓細胞を、血清中和抗体応答、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、ならびに実施例７に記載の方法によるＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌を測定するためにＤ３５に収集した。
【0824】
結果
溶血アッセイ
図２１に示す通り、ＱＳ２１は、２５μＭ～１００μＭで１００％の赤血球溶血を誘起し、４．２μＭで５０％の赤血球（ＥＣ５０）の溶血を誘発するのに効果的な濃度を提示したが、類似した濃度で、ＱＳ７では溶血活性を検出しなかった。
溶血アッセイ
図２１に示す通り、ＱＳ２１は、２５μＭ～１００μＭで１００％の赤血球溶血を誘起し、４．２μＭで５０％の赤血球（ＥＣ５０）の溶血を誘発するのに効果的な濃度を提示したが、類似した濃度で、ＱＳ７では溶血活性を検出しなかった。
【0825】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫応答研究
観察したアジュバントの効能効果は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対してＱＳ７ ＬＩＰ（０：２００）よりＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）で高かった。しかし、図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃおよび２２Ｄに示す通り、ＳＰＡ１４様製剤（２０：２００；６００または１８００のＥ６２０２０：ＱＳ７）に製剤化したＱＳ７は、ＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）と比較して類似したＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答を誘発した。
観察したアジュバントの効能効果は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対してＱＳ７ ＬＩＰ（０：２００）よりＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）で高かった。しかし、図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃおよび２２Ｄに示す通り、ＳＰＡ１４様製剤（２０：２００；６００または１８００のＥ６２０２０：ＱＳ７）に製剤化したＱＳ７は、ＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）と比較して類似したＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答を誘発した。
【0826】
図２３Ａおよび２３Ｂに示す通り、ＱＳ２１またはＱＳ７を含有するＳＰＡ１４製剤は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に匹敵するＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１比を誘発した。さらに、図２４に示す通り、ＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）および２０：２００、６００または１８００のＥ６０２０：ＱＳ７を伴うＬＩＰ［ＱＳ７＋Ｅ６０２０ ２０］は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対して類似した中和抗体力価を誘発した。
【0827】
ＬＩＰ［Ｅ６０２０＋ＱＳ７］で誘発した分泌したサイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ－５のレベルが、全ての試験した濃度でＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６２０２０：ＱＳ２１）で誘発したレベルよりわずかに低いが、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－５の比は、図２５Ａおよび２５Ｂに示す通り、ＳＰＡ１４（Ｅ６０２０：ＱＳ２１）と異なる試験した濃度のＬＩＰ［Ｅ６０２０＋ＱＳ７］との間で類似した。
【0828】
キラヤ属のサポニンで誘発したアジュバント処理する応答は、その毒性の原因でもあるそのアシル基に相関することが知られている（Ｆｌｅｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９年；２４（１）：１７１頁）。ＱＳ７は、ＱＳ２１と比較して短いアシル鎖を有し、毒性も低かった（Ｗａｎｇら、ＡＣＳ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１９年；５（６）：９７４～９８１頁）。ここでの結果では、ＱＳ７が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのその溶血活性に基づいて良好な安全性プロファイルを有することが確認された。さらに、意外にも、ＳＰＡ１４様製剤で製剤化した場合、ＱＳ２１を含有するＳＰＡ１４製剤に匹敵するアジュバント処理効果を誘発することができた。したがって、これらの結果では、ＱＳ７が、良好で安全なアジュバント処理効果を誘発するのにＳＰＡ１４製剤でのサポニンとして有利に使用することができることが示された。
【実施例13】
【0829】
合わせたＱＳ２１リポソームおよびＥ６０２０リポソーム対ＳＰＡ１４製剤
ＱＳ２１またはＥ６０２０を含有する合わせたリポソーム対ＳＰＡ１４製剤の比較
本研究の目的は、マウスモデルにおいてｈＣＭＶ抗原により誘発された免疫応答での、ＱＳ２１またはＥ６０２０を含有するリポソームとＱＳ２１およびＥ６０２０を含有するＳＰＡ１４製剤との組合せのアジュバント処理効果を比較することであった。
ＱＳ２１またはＥ６０２０を含有する合わせたリポソーム対ＳＰＡ１４製剤の比較
本研究の目的は、マウスモデルにおいてｈＣＭＶ抗原により誘発された免疫応答での、ＱＳ２１またはＥ６０２０を含有するリポソームとＱＳ２１およびＥ６０２０を含有するＳＰＡ１４製剤との組合せのアジュバント処理効果を比較することであった。
【0830】
材料および方法
リポソームの製造
リポソームは、実施例１および４に記載する通り、ｈＣＭＶ抗原ｇＢおよび五量体で製造した。
リポソームの製造
リポソームは、実施例１および４に記載する通り、ｈＣＭＶ抗原ｇＢおよび五量体で製造した。
【0831】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫応答研究
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの５つの群（ｎ＝８）は、以下で製剤化した、２μｇのＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）を含有する５０μＬの最終注射容積で大腿四頭筋への２回のＩＭ免疫化（プライミング－ブースト：Ｄ０およびＤ２０）を受けた：
－ Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」）、
－ ＱＳ２１なしにＥ６０２０（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）、
－ ＳＰＡ１４（２００μｇ／ｍｌのＱＳ２１および２０μｇ／ｍｌのＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ））。
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの５つの群（ｎ＝８）は、以下で製剤化した、２μｇのＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体（２μｇの各々／用量）を含有する５０μＬの最終注射容積で大腿四頭筋への２回のＩＭ免疫化（プライミング－ブースト：Ｄ０およびＤ２０）を受けた：
－ Ｅ６０２０なしにＱＳ２１（２００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「ＱＳ２１ ＬＩＰ」）、
－ ＱＳ２１なしにＥ６０２０（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ）（「Ｅ６０２０ ＬＩＰ」）、
－ ＳＰＡ１４（２００μｇ／ｍｌのＱＳ２１および２０μｇ／ｍｌのＥ６０２０を含有するＤＯＰＣ－Ｃｈｏｌリポソーム（４０００：１０００μｇ／ｍｌ））。
【0832】
１つの群のマウスは、アジュバントを含まない（アジュバントなし）抗原を受け、１つの群のマウスは、ＱＳ２１ ＬＩＰおよびＥ６０２０ ＬＩＰの組合せを受けた。投与した抗原の量は、各群で同一であった。
【0833】
血液サンプルおよび脾臓細胞を、ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ五量体特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス、ＩＬ－５およびＩＦＮ－γ分泌、ならびに実施例７に示した中和抗体を測定するためにＤ３５に収集した。
【0834】
統計解析は、Ｔｕｋｅｙ調節および一元ＡＮＯＶＡ：ｐ＜０．０５で実行した。
【0835】
結果
図２６Ａおよび２６Ｂに示す通り、ＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）で観察されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対してＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）で観察されたアジュバントの効能効果より低かった。しかし、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）は、ＳＰＡ１４と類似したＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答を誘発した。
図２６Ａおよび２６Ｂに示す通り、ＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）で観察されたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答は、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対してＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）で観察されたアジュバントの効能効果より低かった。しかし、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）は、ＳＰＡ１４と類似したＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ応答を誘発した。
【0836】
図２７Ａおよび２７Ｂに示す通り、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ１比は、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰおよびＥ６０２０ ＬＩＰ、ならびにＳＰＡ１４製剤の間で類似した。
【0837】
ＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）で観察されたサイトカインＩＦＮ－γ／ＩＬ－５の分泌レベルは、ｈＣＭＶ ｇＢおよび五量体抗原に対してＳＰＡ１４（２０：２００のＥ６０２０：ＱＳ２１）で観察されたＩＦＮ－γ／ＩＬ－５の分泌レベルより低かった。一方、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）は、ＳＰＡ１４と類似したレベルのサイトカインＩＦＮ－γ／ＩＬ－５を誘発した。図２８Ａおよび２８Ｂに示す通り、分泌したサイトカインＩＦＮ－γ／ＩＬ－５の比は、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰおよびＥ６０２０ ＬＩＰ、ならびにＳＰＡ１４製剤の間で類似した。
【0838】
図２９Ａおよび２９Ｂに示す通り、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）は、線維芽細胞（ＭＲＣ－５）または上皮（ＡＲＰＥ－１９）細胞株の両方で測定したＳＰＡ１４と類似したプライミング後（Ｄ２０）およびブースト後（Ｄ３５）の血清中和抗体を誘発した。著しいアジュバント効果は、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰ（０：２００）またはＥ６０２０ ＬＩＰ（２０：０）で測定された。
【0839】
結論として、合わせたリポソームＱＳ２１ ＬＩＰおよびＥ６０２０ ＬＩＰは、ＳＰＡ１４製剤、すなわちＥ６０２０およびＱＳ２１のようなサポニンを同時に含有するリポソームと得られる効果と類似したアジュバント処理効果を誘発することができた。
【0840】
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【図1】
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【図29】
【配列表】
【国際調査報告】