特表 2023-547239 ＡＣＥ２融合タンパク質及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-09

(54)【発明の名称】ＡＣＥ２融合タンパク質及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231101BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231101BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231101BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231101BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231101BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231101BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231101BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231101BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231101BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N9/50 ZNA

C12N15/57

C12N15/13

C12N15/12

C07K19/00

C07K16/00

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/15

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61P31/14

A61P9/12

A61P9/10

A61P13/12

A61P11/00

A61P43/00 105

A61P1/04

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 N

A61K39/395 S

A61K39/395 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526356

(86)(22)【出願日】2021-10-29

(85)【翻訳文提出日】2023-06-21

(86)【国際出願番号】 EP2021080130

(87)【国際公開番号】W WO2022090469

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】20204774.2

(32)【優先日】2020-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20210297.6

(32)【優先日】2020-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21164684.9

(32)【優先日】2021-03-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21170519.9

(32)【優先日】2021-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516338305

【氏名又は名称】フォーマイコン アーゲー

【氏名又は名称原語表記】ＦＯＲＭＹＣＯＮ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ライター、アルヴィン

(72)【発明者】

【氏名】ブロックマイヤー、カルステン

(72)【発明者】

【氏名】ヴォルシン、フロリアン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB36

4C085BB42

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045CA42

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＡＣＥ２とＩｇＧ Ｆｃとの融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質の医療用途、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のようなコロナウイルスによる感染の予防又は治療に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の断片又は前記断片のバリアントを備える第１の部分と、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質。

【請求項2】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

ヒトＡＣＥ２の前記断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

ヒトＡＣＥ２の前記断片が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＡＣＥ２の細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

配列番号２０又は２１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントである、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、配列番号９１又は９２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項６又は７に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

配列番号２２又は２３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項６から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、２７３位（番号付けは配列番号１を参照）に変異を備える、請求項６に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

２７３位の前記変異がＲ２７３Ａ変異である、請求項１０に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、配列番号２４又は２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項１０又は１１に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

配列番号３０又は３１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１４又は１５に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、配列番号３２又は３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項１７に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１７又は１８に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、２７３位に変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

２７３位の前記変異がＲ２７３Ａ変異である、請求項２０に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、配列番号３６又は３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項２０又は２１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

配列番号３８又は３９に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２０から２２に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

（ａ）ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントを備える第１の部分であって、前記ヒトＡＣＥ２が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントがＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、前記第１の部分と、（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分又はヒトＩｇＧの前記Ｆｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質。

【請求項25】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項２４に記載の融合タンパク質。

【請求項26】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。

【請求項27】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、配列番号３２又は３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項２６に記載の融合タンパク質。

【請求項28】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、２７３位に変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。

【請求項29】

２７３位の前記変異がＲ２７３Ａ変異である、請求項２８に記載の融合タンパク質。

【請求項30】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、配列番号３６又は３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項２８又は２９に記載の融合タンパク質。

【請求項31】

前記第２の部分が、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４の前記Ｆｃ部分のバリアントを備える、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項32】

前記第２の部分が、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項33】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項３２に記載の融合タンパク質。

【請求項34】

配列番号４０又は４１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項３２又は３３に記載の融合タンパク質。

【請求項35】

前記第２の部分が、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を備える、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項36】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

配列番号４２又は４３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項３５又は３６に記載の融合タンパク質。

【請求項38】

前記第２の部分が、配列番号４４に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項39】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項３８に記載の融合タンパク質。

【請求項40】

配列番号４５又は４６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項３８又は３９に記載の融合タンパク質。

【請求項41】

配列番号４７又は４８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６及び３１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項42】

配列番号４９又は５０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８、２９及び３１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項43】

配列番号５１又は５２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６、３１、３５及び３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

配列番号５３又は５４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８、２９、３５及び３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

配列番号５５又は５６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６、３１、３８及び３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項46】

配列番号５７又は５８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８、２９、３８及び３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項47】

前記第２の部分が、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアント、又は配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項48】

前記第２の部分が、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備え、前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項４７に記載の融合タンパク質。

【請求項49】

配列番号６１又は６２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２４、２５、４７及び４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項50】

配列番号６３又は６４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６、４７及び４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項51】

配列番号６５又は６６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８、２９、４７及び４８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項52】

前記第２の部分が、配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備え、前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項４７に記載の融合タンパク質。

【請求項53】

配列番号６７又は６８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２４、２５、４７及び５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

配列番号６９又は７０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２６、４７及び５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項55】

配列番号７１又は７２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項２８、２９、４７及び５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の断片又は前記断片のバリアントを備える第１の部分と、配列番号５９に記載の配列を有する、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアント、又は配列番号６０に記載の配列を有する、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質。

【請求項57】

前記第２の部分が、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備え、前記第１の部分及び前記第２の部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項５６に記載の融合タンパク質。

【請求項58】

前記第２の部分が、配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備え、前記第１の部分及び前記第２の部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される、請求項５６に記載の融合タンパク質。

【請求項59】

ヒトＡＣＥ２の前記断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項60】

ヒトＡＣＥ２の前記断片が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＡＣＥ２の細胞外ドメインである、請求項５６から５８に記載の融合タンパク質。

【請求項61】

配列番号７３又は７４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５６、５７、５９又は６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項62】

配列番号７５又は７６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５６又は５８から６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項63】

前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントが、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントである、請求項５６から６０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項64】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項６３に記載の融合タンパク質。

【請求項65】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、配列番号９１又は９２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項６３又は６４に記載の融合タンパク質。

【請求項66】

配列番号７７から８０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項67】

ヒトＡＣＥ２の前記酵素的に不活性なバリアントが、２７３位に変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、請求項６３に記載の融合タンパク質。

【請求項68】

２７３位の前記変異がＲ２７３Ａ変異である、請求項６７に記載の融合タンパク質。

【請求項69】

配列番号８１から８４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項６７又は６８に記載の融合タンパク質。

【請求項70】

（ａ）ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントを備える第１の部分であって、前記ヒトＡＣＥ２が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントがＲ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、前記第１の部分と、（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分又はヒトＩｇＧの前記Ｆｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質。

【請求項71】

ヒトＡＣＥ２の断片の前記バリアントが、配列番号２４又は２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項７０に記載の融合タンパク質。

【請求項72】

前記第２の部分が、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ部分を備える、請求項７０又は７１に記載の融合タンパク質。

【請求項73】

前記第２の部分が、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える、請求項７２に記載の融合タンパク質。

【請求項74】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結されている、請求項７３に記載の融合タンパク質。

【請求項75】

配列番号８５又は８６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項76】

前記第２の部分が、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を備える、請求項７２に記載の融合タンパク質。

【請求項77】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結されている、請求項７６に記載の融合タンパク質。

【請求項78】

配列番号８７又は８８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７６又は７７に記載の融合タンパク質。

【請求項79】

前記第２の部分が、配列番号４４に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える、請求項７２に記載の融合タンパク質。

【請求項80】

前記第１の部分及び前記第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結されている、請求項７９に記載の融合タンパク質。

【請求項81】

配列番号８９又は９０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項７９又は８０に記載の融合タンパク質。

【請求項82】

配列番号９３又は９４に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質。

【請求項83】

請求項１から８２のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子。

【請求項84】

請求項８３に記載の前記核酸分子を備える発現ベクター。

【請求項85】

請求項８３に記載の前記核酸分子又は請求項８４に記載の前記発現ベクターを備える宿主細胞。

【請求項86】

請求項８５に記載の前記宿主細胞を適切な培養培地中で培養することを備え、請求項１から８２のいずれか一項に記載の前記融合タンパク質を産生するための方法。

【請求項87】

医療用である、請求項１から８２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項88】

ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染の予防及び／又は治療における使用のための、請求項１から８２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項89】

ＡＣＥ２に結合する前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＮＬ６３からなる群（好適にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である）から選択される、請求項８８に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項90】

前記融合タンパク質が、抗ウイルス剤と組み合わせて投与されるものである、請求項８８又は８９に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項91】

前記抗ウイルス剤が、レムデシビル、アルビドールＨＣｌ、リトナビル、ロピナビル、ダルナビル、リバビリン、クロロキン及びその誘導体、ニタゾキサニド、カモスタットメシル酸塩、トシリズマブ、シルツキシマブ、サリルマブ及びバリシチニブリン酸塩からなる群から選択される、請求項９０に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項92】

前記融合タンパク質が抗体と組み合わせて投与されるものである、請求項８８又は８９に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項93】

前記抗体が、バムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、イムデビマブ、ソトロビマブ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９２に記載の使用のための融合タンパク質。

【請求項94】

高血圧症（高い血圧を含む）、鬱血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎機能障害、腎不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、急性腎障害、炎症性腸疾患及び多臓器障害の治療における使用のための、請求項１から８２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項95】

請求項１から８２のいずれか一項に記載の有効量の前記融合タンパク質及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を備える医薬組成物。

【請求項96】

抗ウイルス剤をさらに備える、請求項９５に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＡＣＥ２とＩｇＧ Ｆｃとの融合タンパク質、及びこれらの融合タンパク質の医療用途、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のようなコロナウイルスによる感染の予防又は治療に関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）は、中心に触媒亜鉛原子を有するレニン－アンジオテンシン系の重要な金属プロテアーゼである（非特許文献１）。全長ＡＣＥ２は、Ｎ末端細胞外ペプチダーゼドメイン、コレクトリン様ドメイン、一回膜貫通型ヘリックス及び短い細胞内セグメントからなる。これは、アンジオテンシンＩＩを切断してアンジオテンシン（１－７）を生成し、かつアンジオテンシンＩを切断してアンジオテンシン（１－９）を生成するように作用し、これは次に、他の酵素によって処理されアンジオテンシン（１－７）になる。ＡＣＥ２は、Ｒａｓ／ＭＡＳ系においてバランスを維持するように血圧を低下させるように作用し、ＡＣＥの活性に対抗する。従って、それは心血管疾患の治療のための有望な標的である。

【0003】

最近、ＡＣＥ２は、コロナウイルス、特に、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として多くの注目を集めている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年１２月に中国の武漢で最初に発見されたコロナウイルスであるが、世界中に急速に広がり、世界的なパンデミックを引き起こしている。２０２０年５月２２日に、ジョンズ・ホプキンズ大学は、世界中で５００万を超える感染を確認し、３３０，０００人を超える人の死を引き起こしたことを数えた。パンデミックは、多くの国において、非常に重要な経済的及び社会的効果を伴うロックダウンをもたらした。

【0004】

ＡＣＥ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶの受容体として（非特許文献２、非特許文献３）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として（非特許文献４）機能することが示された。さらに、呼吸細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入は、ＡＣＥ２及びセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２に依存する（非特許文献５）。

【0005】

細胞へのウイルス侵入に対するＡＣＥ２の重要な役割を考慮して、細胞へのＳＡＲＳ結合を遮断するために可溶性ＡＣＥ２を使用することが提案された（特許文献１、特許文献２）。同じアプローチはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の治療のためにも示唆された（非特許文献６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の治療におけるＡＣＥ２の可溶性形態を用いた臨床試験がＡｐｅｉｒｏｎ社（Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ Ｚｅｉｔｕｎｇ、２０２０年４月１０日）によって開始されており、一回目の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされた重度のＣｏｖｉｄ－１９を患う一人の患者が、可溶性ＡＣＥ２を用いた治療により早期に回復したことを示した（非特許文献７参照）。

【0006】

しかし、単離された受容体ドメインは、一般的に、低い安定性及び血漿半減期を特徴とする。ＡＣＥ２の可溶性形態については、１０時間の用量依存的終末相半減期が示された（非特許文献８）。これらの結果を考慮して、後の研究では、可溶性形態のＡＣＥ２を１日２回の注入として投与することが決定された（非特許文献９）。しかし、１日２回以上の投与は、患者及び医療従事者の両方にとって不便である。

【0007】

ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された酵素的に活性なＡＣＥ２又は酵素的に不活性なＡＣＥ２のいずれかの細胞外ドメインからなるＡＣＥ２の融合タンパク質を構築し、試験した。両方の構築物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方を強力に中和し、Ｓ（スパイク）タンパク質媒介性融合を阻害することが示された（非特許文献１０）。さらに、ＣＯＶＩＤＴＲＡＰ（商標）すなわちＳＴＩ－４３９８と呼ばれる融合タンパク質が、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社による臨床試験のために開発された（非特許文献１１参照）。非特許文献１２は、野生型ＡＣＥ２及びＡＣＥ２の触媒活性に影響を及ぼす９個のＡＣＥ２変異体と、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質を記載する。しかし、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと免疫細胞上のＦｃγ受容体との相互作用は、ウイルス感染を増強し得る（非特許文献１３、非特許文献１４）。

【0008】

非特許文献１５は触媒的不活性ＡＣＥ２の細胞外ドメインが免疫グロブリン重鎖のＦｃドメイン３に融合される「ＡＣＥ２マイクロボディ（ＡＣＥ２ ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ）」を開示する。

【0009】

非特許文献１６及びＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６３６９２は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＦｃドメインを有するＡＣＥ２融合タンパク質を記載する。

【0010】

欧州特許出願番号ＥＰ２１１８８８３２．６は、ＩｇＭ及びＩｇＧ２のＦｃドメインを有するＡＣＥ２融合タンパク質を開示する。

【0011】

特許文献３、特許文献４、特許文献５及び特許文献６もまた、ＡＣＥ２と各種免疫グロブリンのＦｃ部分との融合タンパク質を開示する。

【0012】

非特許文献１７は、ＡＣＥ２の細胞外ドメインとＩｇＧ１のＦｃ部分との融合タンパク質が、ウイルス複製の減少、体重減少、組織学的変化及び肺における炎症によって決定されるように、マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染から保護したことを記載する。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の受容体結合ドメインを標的とする抗体とは異なり、融合タンパク質による処置は、エスケープ変異体の発生を誘導しないことが示される。

【0013】

従って、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の治療及び／又は予防に使用され得る薬剤が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】国際公開第２００５／０３２４８７号

【特許文献2】国際公開第２００６／１２２８１９号

【特許文献3】国際公開第２０２１／１７０１１３号

【特許文献4】国際公開第２０２１／１８３４０４号

【特許文献5】米国特許出願公開第２０２１／０２８４７１６号明細書

【特許文献6】国際公開第２０２１／１８９７７２号

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ｄｏｎｏｇｈｕｅ等（２００２年）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：ｅ１－ｅ９

【非特許文献2】Ｌｉ等（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ ４２６：４５０－４５４

【非特許文献3】Ｐｒａｋａｂａｒａｎ等（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１４：２３５－２４１

【非特許文献4】Ｙａｎ等（２０２０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７：１４４４－１４８５

【非特許文献5】Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（２０２０年）Ｃｅｌｌ １８１：１－１０

【非特許文献6】Ｋｒｕｓｅ（２０２０年）Ｆ１０００Ｒｅｓ．９：７２

【非特許文献7】Ｚｏｕｆａｌｙ等（２０２０年）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：１１５４－１１５８、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ２２１３－２６００（２０）３０４１８－５

【非特許文献8】Ｈａｓｃｈｋｅ等（２０１３年）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．５２：７８３－７９２

【非特許文献9】Ｋｈａｎ等（２０１７年）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ ２１：２３４

【非特許文献10】Ｌｅｉ等（２０２０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１：２０７０

【非特許文献11】ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｌｏｂｅｎｅｗｓｗｉｒｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／２０２０／０３／２０／２００３９５７／０／ｅｎ／ＳＯＲＲＥＮＴＯ－ＤＥＶＥＬＯＰＳ－ＳＴＩ－４３９８－ＣＯＶＩＤＴＲＡＰ－ＰＲＯＴＥＩＮ－ＦＯＲ－ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ－ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ－ＡＮＤ－ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ－ＯＦ－ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－ＣＯＲＯＮＡＶＩＲＵＳ－ＤＩＳＥＡＳＥ－ＣＯＶＩＤ－１９．ｈｔｍｌ

【非特許文献12】Ｌｉｕ等（２０２０年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６５：１６２６－１６３３、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０８．１３．２４８３５１ｖ１．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ

【非特許文献13】Ｐｅｒｌｍａｎ及びＤａｎｄｅｋａｒ（２００５年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１２）：９１７－９２７

【非特許文献14】Ｃｈｅｎ等（２０２０年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１－４

【非特許文献15】Ｔａｄａ等（２０２０年）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０９．１６．３００３１９ｖ１．ｆｕｌｌ

【非特許文献16】Ｓｖｉｌｅｎｏｖ等（２０２０年）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｓｑｕａｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｒｓ－４５９９４１／ｖ１

【非特許文献17】Ｚｈａｎｇ等（２０２１年）、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：６５

【発明の概要】

【0016】

本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の断片又は前記断片のバリアントを備える第１の部分と、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質を提供する。

【0017】

一実施形態では、第１の部分及び第２の部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0018】

ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよく、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＡＣＥ２の細胞外ドメインであってもよい。

【0019】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントである。

【0020】

ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異（番号付けは配列番号１を参照）、又は２７３位での変異、好適にはＲ２７３Ａ変異（番号付けは配列番号１を参照）を備えてもよい。

【0021】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントは、配列番号９１又は９２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0022】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントは、配列番号２４又は２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0023】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよい。

【0024】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、配列番号３２又は３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよい。

【0025】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、２７３位での変異、好適にはＲ２７３Ａ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、配列番号３６又は３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよい。

【0026】

本発明は、（ａ）ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントを備える第１の部分であって、前記ヒトＡＣＥ２が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントがＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、前記第１の部分と、（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分又はヒトＩｇＧの前記Ｆｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質をさらに提供する。

【0027】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0028】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、配列番号３２又は３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよい。

【0029】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、２７３位での変異、好適にはＲ２７３Ａ変異をさらに備える（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、配列番号３６又は３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよい。

【0030】

一実施形態では、第２の部分は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える。

【0031】

一実施形態では、第２の部分は、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備え、好適には、第１の部分及び第２の部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0032】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を備え、好適には、第１の部分及び第２の部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0033】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号４４に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備え、好適には、第１の部分及び第２の部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0034】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアント又は配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える。

【0035】

一実施形態では、第２の部分は、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備え、第１の部分及び第２の部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0036】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備え、第１の部分及び第２の部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0037】

本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の断片又は前記断片のバリアントを備える第１の部分と、配列番号５９に記載の配列を有する、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアント、又は配列番号６０に記載の配列を有する、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質をさらに提供する。

【0038】

第２の部分は、配列番号５９に記載の配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備え、第１の部分及び第２の部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結されてもよく、又は第２の部分は、配列番号６０に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備え、第１の部分及び第２の部分が、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結されてもよい。

【0039】

ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなってもよく、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＡＣＥ２の細胞外ドメインであってもよい。

【0040】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２断片のバリアントは、ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントである。

【0041】

ヒトＡＣＥ２の酵素的に不活性なバリアントは、Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異（番号付けは配列番号１を参照）又は２７３位での変異、好適にはＲ２７３Ａ変異（番号付けは配列番号１を参照）を備え得る。

【0042】

本発明は、（ａ）ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントを備える第１の部分であって、前記ヒトＡＣＥ２が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ヒトＡＣＥ２断片の前記バリアントがＲ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）、前記第１の部分と、（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分又はヒトＩｇＧの前記Ｆｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質をさらに提供する。

【0043】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２４又は２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0044】

第２の部分は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ部分を備えてもよい。

【0045】

一実施形態では、第２の部分は、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備え、好適には、第１の部分及び第２の部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0046】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を備え、好適には、第１の部分及び第２の部分は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって連結される。

【0047】

別の実施形態では、第２の部分は、配列番号４４に記載の配列を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える。

【0048】

本発明の融合タンパク質は、配列番号２０、２１、２２、２３、２６、２７、３０、３１、３４、３５、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９３及び９４に記載のアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。

【0049】

本発明はまた、前記融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子、前記核酸分子を備える発現ベクター、及び前記核酸分子又は前記発現ベクターを備える宿主細胞にも関する。

【0050】

さらに、本発明は、適切な培養培地中において前記宿主細胞を培養することを備える、前記融合タンパク質を産生するための方法に関する。

【0051】

本発明はまた、医療用の、特にＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染の予防及び／又は治療用の前記融合タンパク質にも関する。

【0052】

一実施形態では、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＮＬ－６３（好適にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である）からなる群から選択される。

【0053】

前記融合タンパク質は、レムデシビル、アルビドールＨＣｌ、リトナビル、ロピナビル、ダルナビル、リバビリン、クロロキン及びその誘導体、ニタゾキサニド、カモスタットメシル酸塩、トシリズマブ、シルツキシマブ、サリルマブ及びバリシチニブリン酸塩からなる群から選択され得る抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得る。

【0054】

前記融合タンパク質はまた、バムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブ、イムデビマブ、ソトロビマブ及びそれらの混合物からなる群から選択され得る抗体と組み合わせて投与され得る。

【0055】

本発明はまた、高血圧症（高い血圧を含む）、鬱血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎機能障害、腎不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、急性腎障害、炎症性腸疾患及び多臓器障害の治療用の前記融合タンパク質にも関する。

【0056】

本発明はまた、前記融合タンパク質及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を備える医薬組成物にも関する。医薬組成物は、抗ウイルス剤をさらに備え得る。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】勾配分光法（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）により測定される、プロテインＡクロマトグラフィ後の各種融合タンパク質のタンパク質収率。

【図2】分析用サイズ排除クロマトグラフィによる各種融合タンパク質の高分子量種の分析。

【図3】各種融合タンパク質のＯ－グリコシル化の分析。

【図4】競合ＥＬＩＳＡによって測定される、各種融合タンパク質によるＡＣＥ２へのＳ１結合の阻害。 ａ）ＩｇＧ４のＦｃ部分を有する構築物１～４ ｂ）ＩｇＧ１のＦｃ部分を有する構築物５～８

【図5】構築物１、３、５及び７によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株）の中和。

【図6】構築物１から８及び二つの参照タンパク質（Ｒｅｆ１、Ｒｅｆ２）の酵素活性の分析。 ａ）６つの個々の実験からの標準偏差を有する酵素活性の平均値。 ｂ）６つの個々の実験において得られた各構築物についての単一の値。

【図7】構築物１から８による各種コロナウイルスの中和。 ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｆｒａ－１（ＡＹ２９１３１５．１）株）の中和、３回の独立した実験からの平均ＩＣ５０値、エラーバーは９５％信頼区間を示す。 ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｍｕｎｉｃｈ－ＴＵＭ－１（ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿５８２１３４））の中和、３回の独立した実験からの平均ＩＣ５０値、エラーバーは９５％信頼区間を示す。 ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）の中和、３回の独立した実験からの平均ＩＣ５０値、エラーバーは９５％信頼区間を示す。

【図8】ＥＬＩＳＡの結合により測定される、配列番号６に記載の融合タンパク質のＡＣＥ２への結合。

【図9】各種ウイルス分離株（Ａ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍｕｎｉｃｈ－ＴＵＭ－１、Ｂ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇ、Ｃ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７、Ｄ：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．３５１）の配列番号６（構築物１、左側）及び配列番号８（構築物３、右側）に記載の融合タンパク質による中和。点線は、ＩＣ５０値の決定を示す。与えられたデータは、それぞれ３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。

【図10】分析用サイズ排除クロマトグラフィによる、異なる期間の保存後の各種融合タンパク質の高分子量種の分析。 ａ）構築物１から４（配列番号６から９に記載）の分析。 ｂ）構築物５から８（配列番号１０から１３に記載）の分析。

【発明を実施するための形態】

【0058】

以下に例示的に記載する本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）の非存在下において適切に実施され得る。

【0059】

本発明は、特定の実施形態に関して記載されるが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0060】

用語「備える」が本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、用語「からなる」は、用語「備える」の望ましい実施形態であることが考えられる。以下に、群が少なくとも特定の数の実施形態を備えることが定義される場合、これはまた、好適にはこれらの実施形態のみからなる群を開示することが理解されるべきである。

【0061】

本発明の目的のために、用語「得られる」は、用語「得ることができる」の望ましい実施形態であることが考えられる。以下に、例えば、細胞又は生物が特定の方法によって得ることができると定義される場合、これはまた、この方法によって得られる細胞又は生物を開示することは理解されるべきである。

【0062】

単数名詞を指すときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」又は「その」が使用される場合、これは、他に具体的に述べられない限り、その名詞の複数形を含む。

【0063】

上記のように、本発明は、ヒトＡＣＥ２の断片の特定のバリアントを備える第１の部分と、ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ１のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ又はＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質を提供する。本発明はまた、ヒトＡＣＥ２の特定の断片又は前記断片のバリアントを備える第１の部分と、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを備える第２の部分とを備える融合タンパク質を提供する。アミノ酸１８から７３２を備えるヒトＡＣＥ２の断片は、アミノ酸１８から７４０を備えるヒトＡＣＥ２の断片よりも高い収率及び低い量の高分子量種を提供し、並びにセリン７４０が欠損しているので非天然Ｏ－グリコシル化を提供しないことが示された。さらに、アミノ酸１８から７３２を備えるヒトＡＣＥ２の断片は、アミノ酸１８から７４０を備えるヒトＡＣＥ２の断片よりも高い保存後安定性を示した。それにもかかわらず、アミノ酸１８から７３２を備えるヒトＡＣＥ２の断片を有する融合タンパク質は、アミノ酸１８から７４０を備えるヒトＡＣＥ２の断片を有する融合タンパク質と同様の効率で各種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２バリアントを中和した。対照的に、ＡＣＥ２のアミノ酸１８から６１５のみを備える融合タンパク質は、ＡＣＥ２のアミノ酸１８から７４０を備える融合タンパク質よりも低い効率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染を遮断することが他者によって見出されている（Ｌｉ（２０２０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９４（２２）：ｅ０１２８３－２０）。文献（例えば、多田等（２０２０）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．０９．１６．３００３１９ｖ１．ｆｕｌｌ参照）を考慮すると、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を有する融合タンパク質は、Ｆｃ部分を有しない可溶性ＡＣＥ２二量体よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対して高い親和性を有すると想定される。Ｆｃ部分間のジスルフィド架橋は、融合タンパク質のそれらの標的（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質等）に対する結合を安定化させることも想定される。本発明の融合タンパク質はＦｃＲｎに結合することで、可溶性ＡＣＥ２二量体よりも半減期が長くなる。

【0064】

抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性貪食（ＡＤＰ）等のＦｃ媒介性抗体機能が、インフルエンザウイルス及び他のウイルス病原体から保護することが示された（Ｖａｎｄｅｒｖｅｎ及びＫｅｎｔ（２０２０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９８：２５３－２６３）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２処置に関連して、抗体カシリビマブ及びイムデビマブの混合物に関するＥＭＡ評価レポートは、これらの抗体がＡＤＣＣ及びＡＤＰを媒介することができることを論じている。さらに、抗体依存性増強の証拠は、いずれの処置動物においても観察されなかった。

【0065】

「融合タンパク質」は、自然には互いに連結していない少なくとも二つのポリペプチド部分により形成されるタンパク質である。二つのポリペプチド部分はペプチド結合によって連結され、任意で、リンカー分子が二つのポリペプチド部分の間に挿入される。二つのポリペプチド部分は、単一分子として転写及び翻訳される。融合タンパク質は、一般的に、両方のポリペプチド部分に由来する機能性を有する。本発明に関して、融合タンパク質は、ＡＣＥ２の結合特性、特にコロナウイルスなどのウイルスの結合、及びヒトＩｇＧのＦｃ部分によって付与される半減期及びＦｃ受容体結合の増加を保持する。

【0066】

用語「ヒトＡＣＥ２」は、ヒト対象由来のアンジオテンシン変換酵素２を示す。ヒトＡＣＥ２の全長配列は、８０５個のアミノ酸を有する。それは、シグナルペプチド、Ｎ末端細胞外ペプチダーゼドメイン、それに続くコレクトリン様ドメイン、一回膜貫通型ヘリックス及び短い細胞内セグメントを備える。ヒトＡＣＥ２の全長配列を配列番号１に示す。別段の指示がない限り、本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、配列番号１に記載のヒトＡＣＥ２の全長配列の番号付けを示す。ヒトＡＣＥ２の細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸１８から７４０からなり、配列番号３に示されている。

【0067】

用語「ヒトＡＣＥ２の断片」は、配列番号１に記載のヒトＡＣＥ２の全長配列と比較して一つ以上のアミノ酸を欠損するポリペプチドを示す。ヒトＡＣＥ２の断片は、少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に結合可能である。少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質へのヒトＡＣＥ２の断片の結合は、Ｓタンパク質を基質上に固定し、ヒトＡＣＥ２の断片に接触させ、Ｓタンパク質とヒトＡＣＥ２の断片との間の相互作用を検出するＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定され得る。代わりに、少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質へのヒトＡＣＥ２の断片の結合は、表面プラズモン共鳴により測定されてもよく、例えば、Ｓｈａｎｇ等（２０２０年）Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２１７９－ｙ、Ｗｒａｐｐ等（２０２０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６７（６４８３）：１２６０－１２６３、Ｌｅｉ等（２０２０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１（１）：２０７０において記載される。さらなる代わりとして、少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質へのヒトＡＣＥ２の断片の結合はバイオレイヤー干渉法により測定されてもよく、例えば、Ｓｅｙｄｏｕｘ等（２０２０）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０５．１２．０９１２９８において記載される。Ｓタンパク質への結合を測定するための適切な方法はまた、本明細書中の実施例の部分に記載される。

【0068】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸からなる。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸からなる。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸からなる。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸からなる。

【0069】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５、及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0070】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0071】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0072】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸からなり、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0073】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸からなる。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸からなる。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６０５まで、１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸からなる。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸からなる。

【0074】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まり、アミノ酸Ｇ７３２において終わる。この断片のＣ末端におけるアミノ酸グリシンは、二つのタンパク質部分の融合に有利に働く高い回転自由度を提供することで、融合タンパク質の安定性を増加する。さらに、驚くべきことに、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まり、アミノ酸Ｇ７３２において終わるアミノ酸配列を備えるＡＣＥ２断片の使用が、より長いＡＣＥ２断片よりも良好な収率並びに良好な安定性を提供することが見出された。さらに、それは非天然Ｏ－グリコシル化を欠き、より長いＡＣＥ２断片と同様の効率で各種ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２バリアントを中和する。これは、ＡＣＥ２の１８から６１５までのアミノ酸のみを備えるより短いＡＣＥ２断片が、ＡＣＥ２の１８から７４０までのアミノ酸を備えるより長いＡＣＥ２断片よりも低い効率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ２による感染を防止するという結果と対照的である。

【0075】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の完全な細胞外ドメインからなる。

【0076】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる。配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まり、アミノ酸Ｇ６０５において終わる。

【0077】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0078】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0079】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0080】

本発明に関して、用語「配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる／からなっているヒトＡＣＥ２の断片」は、断片が、配列表中の対応する配列によって定義される長さを正確に有し、いかなるアミノ酸の付加及び／又は欠損を備えないことを意味することが意図される。しかし、この用語は、定義された断片の配列内のアミノ酸置換（複数）の存在を除外しない。

【0081】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。

【0082】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５、及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0083】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｋ３１及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0084】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｅ３５及びＱ４２を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0085】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３６０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の３８０から７２３まで、４００から７２３まで、４２０から７２３まで、４４０から７２３まで、４６０から７２３まで、４８０から７２３まで又は５００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の５２０から７２３まで、５４０から７２３まで、５６０から７２３まで、５８０から７２３まで又は６００から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列内の６２０から７２３まで、６４０から７２３まで、６６０から７２３まで、６８０から７２３まで、７００から７２３まで又は７２０から７２３までの連続するアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｑ２４、Ｄ３０、Ｋ３１、Ｅ３５、Ｑ４２及びＫ３５３を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0086】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６０５まで、１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定される。

【0087】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定される。配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まり、アミノ酸Ｇ７３２において終わる。この断片のＣ末端におけるアミノ酸グリシンは、二つのタンパク質部分の融合に有利に働く高い回転自由度を提供することで、融合タンパク質の安定性を増加する。加えて、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まりアミノ酸Ｇ７３２において終わるアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定されるＡＣＥ２断片の使用は、より長いＡＣＥ２断片よりも良好な収率を提供する。

【0088】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するヒトＡＣＥ２の完全な細胞外ドメインを備え、又はそれによって同定される。

【0089】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定される。配列番号１４に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列中のアミノ酸Ｑ１８から始まり、アミノ酸Ｇ６０５において終わる。

【0090】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片はアミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0091】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0092】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０及びＮ３２２においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸残基Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６及びＮ６９０においてＮ－グリコシル化される（番号付けは配列番号１を参照）。

【0093】

用語「Ｎ－グリコシル化される」又は「Ｎ－グリコシル化」は、グリカン構造がタンパク質のアスパラギン残基のアミドの窒素原子に結合することを意味する。グリカンは、分岐した柔軟な糖鎖であり、タンパク質のアスパラギン残基に結合したグリカンの正確な構造は、糖タンパク質産生に使用される発現系に依存する。

【0094】

ヒトＡＣＥ２の断片の「バリアント」は、配列番号１に記載の野生型の全長ヒトＡＣＥ２のアミノ酸配列中の対応する配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる、又は少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個又は少なくとも１３個のアミノ酸が異なる、上記で定義されるような断片を示す。ヒトＡＣＥ２の断片の「バリアント」は、ヒトＡＣＥ２の断片の配列中に一つ以上のアミノ酸置換を備える。ヒトＡＣＥ２の断片の「バリアント」は、バリアントが由来する配列と比較して、いかなるアミノ酸の付加又は欠損を備えない。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２又は配列番号３に記載のヒトＡＣＥ２の断片のバリアントであり、配列番号２又は配列番号３に記載の配列と比較すると、いかなるアミノ酸の付加又は欠損を備えない、すなわち配列番号２又は配列番号３に記載の配列と同じ長さを有する。本発明の範囲内で、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に結合可能である。少なくとも一つのコロナウイルスのＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質へのヒトＡＣＥ２の断片のバリアントの結合は、ヒトＡＣＥ２の断片について上述したように測定され得る。

【0095】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と一個のアミノ酸だけ異なる。別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と二個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と三個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と四個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と五個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と六個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と七個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と八個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と九個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と十個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と十一個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と十二個のアミノ酸だけ異なる。さらに別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号１に記載の配列中の対応するアミノ酸配列と十三個のアミノ酸だけ異なる。

【0096】

ヒトＡＣＥ２の断片の一つのバリアントは、酵素的に不活性なバリアントであり得る。「ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアント」は、アンジオテンシンＩＩをＡｎｇ１－７に切断する能力を欠く。ヒトＡＣＥ２の酵素活性は、当業者に既知の方法によって測定され得る。ヒトＡＣＥ２の酵素活性を測定するための適切なキットは、例えばＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社又はＡｎａｓｐｅｃ社から市販されている。酵素的に不活性なＡＣＥ２バリアントを使用することによって、心血管系又は血圧の調節に対する効果のようなＡＣＥ２の酵素活性に関連する任意の副作用が排除される。さらに、ＲＡＳ－ＭＡＳの均衡を崩すリスクが低減される。

【0097】

ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、ＡＣＥ２の触媒中心内のアミノ酸の一つ以上の変異を備え得る。特に、ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、配列番号１に記載の配列の残基３７４での野生型ヒスチジンの変異及び／又は配列番号１に記載の配列の残基３７８での野生型ヒスチジンの変異を備える。野生型ヒスチジンは、ヒスチジン以外の任意のアミノ酸に変異されてもよく、特に、野生型ヒスチジンはアスパラギンに変異される。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0098】

別の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、以下のアミノ酸残基（残基３４５（野生型のヒスチジン）、２７３（野生型のアルギニン）、４０２（野生型のグルタミン酸）及び５０５（野生型のヒスチジン））のうちの一つ以上における変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、残基３４５におけるヒスチジンのアラニン又はロイシンへの変異、残基２７３におけるアルギニンのアラニン、グルタミン又はリシンへの変異、残基４０２におけるグルタミン酸のアラニンへの変異、及び／又は残基５０５におけるヒスチジンのアラニン又はロイシンへの変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。特定の実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片の酵素的に不活性なバリアントは、残基２７３におけるアルギニンのアラニンへの変異（Ｒ２７３Ａ変異とも呼ばれる）を備える。アルギニン２７３が基質結合に重要であり、その置換が酵素活性を消失させることが見出された（Ｇｕｙ等（２００５年）ＦＥＢＳ Ｊ．２７２（１４）：３５１２－３５２０）。

【0099】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0100】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号９１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0101】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号９２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0102】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0103】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を備える。

【0104】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0105】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0106】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から３８０まで、１８から４００まで、１８から４２０まで、１８から４４０まで、１８から４６０まで、１８から４８０まで又は１８から５００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から５２０まで、１８から５４０まで、１８から５６０まで、１８から５８０まで又は１８から６００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から６１５まで、１８から６２０まで、１８から６４０まで、１８から６６０まで、１８から６８０まで又は１８から７００までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。さらにより好適には、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１に記載の配列の１８から７１０まで、１８から７２０まで又は１８から７３０までのアミノ酸を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0107】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異を備える。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２４又は配列番号２５に記載の配列を備え、又はそれによって同定される。

【0108】

ヒトＡＣＥ２の断片の別のバリアントは、ＡＣＥ２の脱落を抑制するバリアントであり得る。ＡＣＥ２が、ＡＣＥ２細胞外ドメインの切断によってヒト気道上皮から脱落すること、及びＡＤＡＭ１７がＡＣＥ２切断を調節することが示された。さらに、ＡＣＥ２の細胞外ドメインに位置する全長ＡＣＥ２のロイシン５８４における点変異は、脱落を無効にした（Ｊｉａ等（２００９年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９７（１）：Ｌ８４－９６）。従って、一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、ロイシン５８４における変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。一実施形態では、ロイシン５８４における変異はＬ５８４Ａ変異である。

【0109】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｌ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0110】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｌ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0111】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｌ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0112】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｌ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0113】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0114】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0115】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0116】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0117】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0118】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、Ｒ２７３Ａ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0119】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0120】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0121】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0122】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＬ５８４Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0123】

ヒトＡＣＥ２の断片の別のバリアントは、プロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２によるＡＣＥ２の切断を抑制するバリアントであり得る。ＴＭＰＲＳＳ２によるＡＣＥ２タンパク質分解が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの侵入を増大させることが示された（Ｈｅｕｒｉｃｈ等（２０１４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（２）：１２９３－１３０７）。ＴＭＰＲＳＳ２はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞内への侵入において役割を果たす（Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（２０２０年）Ｃｅｌｌ １８１：１－１０）。ＴＭＰＲＳＳ２によるＡＣＥ２の切断を無効にするために、切断に必須のアミノ酸残基は変異され得る。ＡＣＥ２のアミノ酸６９７から７１６までに及ぶアミノ酸領域内のアルギニン残基及びリジン残基が、ＴＭＰＲＳＳ２によるＡＣＥ２切断に必須であることが示された（Ｈｅｕｒｉｃｈ等（２０１４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（２）：１２９３－１３０７）。従って、一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも二つ又は三つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも四つ又は五つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。最も好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、残基６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。これらの残基のいずれかにおける野生型アミノ酸残基は、任意の他のアミノ酸に変異されてもよく、特に、野生型アミノ酸残基は、アラニンに変異される。

【0124】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも二つ又は三つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。より好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも四つ又は五つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。最も好適には、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0125】

ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、残基６１９、６２１及び／又は６２５における変異をさらに備え得る（番号付けは配列番号１を参照）。特に、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ及び／又はＫ６２５Ａ）をさらに備え得る（番号付けは配列番号１を参照）。

【0126】

従って、一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0127】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、残基６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0128】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、残基６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0129】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0130】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0131】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0132】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0133】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、アミノ酸６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、残基６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0134】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、アミノ酸６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、残基６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0135】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0136】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0137】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0138】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0139】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、残基６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0140】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、残基６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0141】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0142】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0143】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0144】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0145】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、残基６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）のうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0146】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、アミノ酸６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６から選択される少なくとも一つの残基における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、残基６１９、６２１、６２５、６９７、７０２、７０５、７０８、７１０及び７１６における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａのうちの少なくとも一つを備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0147】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0148】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0149】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0150】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異並びに、以下の変異（Ｋ６１９Ａ、Ｒ６２１Ａ、Ｋ６２５Ａ、Ｒ６９７Ａ、Ｋ７０２Ａ、Ｒ７０５Ａ、Ｒ７０８Ａ、Ｒ７１０Ａ及びＲ７１６Ａ）を備える（番号付けは配列番号１に記載の配列を参照）。

【0151】

ヒトＡＣＥ２の断片の別のバリアントは、二つのＡＣＥ２分子間のジスルフィド架橋の形成のための追加のシステインを提供するバリアントであり得る。ジスルフィド架橋は、融合タンパク質の固有の安定性を増加させ、融合タンパク質のその標的への結合にも影響を及ぼし得る。追加のシステインは、配列番号１の番号付けにおけるセリン６４５のシステインによる置換によって提供され得る。

【0152】

従って、一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0153】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0154】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0155】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0156】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0157】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0158】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0159】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0160】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。

【0161】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0162】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0163】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0164】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｓ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0165】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0166】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0167】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0168】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0169】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0170】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0171】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0172】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＳ６４５Ｃ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0173】

ヒトＡＣＥ２の断片の別のバリアントは、二量化を抑制するバリアントであり得る。従って、一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、アミノ酸Ｑ１３９における変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片のバリアントは、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0174】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0175】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0176】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0177】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0178】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0179】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0180】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0181】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0182】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0183】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0184】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列からなり、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0185】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列からなり、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0186】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質からなり、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0187】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0188】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0189】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0190】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0191】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0192】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0193】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0194】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0195】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号２に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0196】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号３に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0197】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｑ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0198】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0199】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｈ３７４Ｎ変異、Ｈ３７８Ｎ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0200】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0201】

一実施形態では、ヒトＡＣＥ２の断片は、配列番号１４に記載の配列を備え、又はそれによって同定され、Ｒ２７３Ａ変異、Ｌ５８４Ａ変異及びＱ１３９Ａ変異を備える（番号付けは配列番号１を参照）。

【0202】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２の部分は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分を備える。ヒトＩｇＧのＦｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ部分であり得る。

【0203】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２の部分は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を備える。ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分は、共に連結されてＦｃ部分を形成するヒトＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを備える。全長ヒトＩｇＧ４抗体では、Ｆｃ部分はヒンジ領域を介してＦａｂ断片に結合される。Ｆａｂ断片は、重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを備える。好適には、本発明の融合タンパク質において使用されるヒトＩｇＧ４のＦｃ部分は、配列番号５に記載の配列を有する。

【0204】

抗体のＩｇＧ４サブクラスは、Ｆｃγ受容体に対して部分的な親和性しか有さず、補体を活性化しないので（Ｍｕｈａｍｍｅｄ（２０２０年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１６（１）：１７３参照）、それは、抗体のＩｇＧ１サブクラスと同程度まで免疫系を活性化しない。その結果、サイトカインの発現はより低い程度に刺激され、サイトカインストームのリスクが低減される。抗体のＩｇＧ４サブクラスは、ＦｃＲｎに結合可能である。

【0205】

「ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアント」は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して、一つ以上のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を示す。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して、１個から１２個、１個から１１個、１個から１０個、１個から９個、１個から８個、１個から７個、１個から６個、１個から５個、１個から４個、１個から３個、１個又は２個のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して、エフェクター機能の低下をもたらす。一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して、半減期の増加をもたらす。一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較してエフェクター機能の低下をもたらし、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分と比較して半減期の増加をもたらす。

【0206】

一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１６に記載のＩｇＧ１の野生型Ｆｃ部分を産生しない。一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、変化したＩｇＧ４のＦｃ部分に野生型ＩｇＧ１のエフェクター機能を付与しない。

【0207】

好適には、エフェクター機能の低下は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下を備える。より好適には、ＣＤＣは、配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４の野生型Ｆｃ部分のＣＤＣと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍低下している。ＣＤＣを測定及び定量する方法は、当業者に既知である。一般に、ＣＤＣは、抗原結合部分に融合されたＦｃ部分を適切な標的細胞及び補体と共にインキュベートし、標的細胞の細胞死を検出することによって測定することができる。補体の動員は、ＥＬＩＳＡプレートを使用するＣ１ｑ結合アッセイにより分析することができる（例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ等（２０１６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２９（１０）：４５７－４６６参照）。

【0208】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５に記載の配列のＦ３、Ｌ４、Ｇ６、Ｐ７、Ｆ１２、Ｖ３３、Ｎ６６及びＰ９８から選択されるアミノ酸残基において少なくとも一つのアミノ酸置換を備える。これらのアミノ酸残基は、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸残基Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｆ２４３、Ｖ２６４、Ｎ２９７及びＰ３２９に対応する。これらの残基におけるアミノ酸置換が、エフェクター機能の低下をもたらすことが示された（国際公開第９４／２８０２７号、国際公開第９４／２９３５１号、国際公開第９５／２６４０３号、国際公開第２０１１／０６６５０１号、国際公開第２０１１／１４９９９９号、国際公開第２０１２／１３０８３１号、Ｗａｎｇ等（２０１８年）ＰｒｏｔｅｉｎＣｅｌｌ．９（１）：６３－７３）。

【0209】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ／Ａに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ４Ｅ／Ａを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0210】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｆ３Ａ及びＬ４Ａを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0211】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ及びＰ２３８Ｓに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｆ３Ａ、Ｌ４Ｅ、Ｇ６Ａ及びＰ７Ｓを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0212】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｆ２４３Ａ及びＶ２６４Ａに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｆ１２Ａ及びＶ３３Ａを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0213】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ４Ｅ及びＰ９８Ｇを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0214】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｎ２９７Ａ／Ｑ／Ｇに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｎ６６Ａ／Ｑ／Ｇを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0215】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のＴ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｅ２５８、Ｋ２８８、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｑ３１１、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５から選択されるアミノ酸残基において少なくとも一つのアミノ酸置換を備える。これらのアミノ酸残基は配列番号５に記載の配列のアミノ酸残基Ｔ１９、Ｍ２１、Ｓ２３、Ｔ２５、Ｅ２７、Ｋ５７、Ｔ７６、Ｖ７７、Ｑ８０、Ｖ１９６、Ｍ１９７、Ｈ２０２、Ｎ２０３及びＨ２０４に対応する。これらのアミノ酸置換はＦｃ含有タンパク質の半減期の増加をもたらすことが示された（国際公開第００／４２０７２号、国際公開第０２／０６０９１９号、国際公開第２００４／０３５７５２号、国際公開第２００６／０５３３０１号、国際公開第２００９／０５８４９２号、国際公開第２００９／０８６３２０号、米国特許出願公開第２０１０／０２０４４５４号、英国特許出願公開第２０１３／０２８７８号、国際公開第２０１３／１６３６３０号、米国特許出願公開第２０１９／００１０２４３号）。抗体又はＦｃ融合タンパク質の半減期は、抗体又はＦｃ融合タンパク質の投与後の異なる時点における血清中の抗体又はＦｃ融合タンパク質の濃度を測定し、そこから半減期を計算することにより測定することができる。

【0216】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｍ２１Ｙ、Ｓ２３Ｔ及びＴ２５Ｅを備える。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0217】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｔ２５６Ｄ及びＴ３０７Ｑに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｔ２５Ｄ及びＴ７６Ｑを備える。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する。このバリアントは、増加した半減期及びＦｃＲｎへの増強された結合を有する（Ｍａｃｋｎｅｓｓ等（２０１９年）ＭＡＢＳ １１（７）：１２７６－１２８８）。

【0218】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｔ２５０Ｑ／Ｅ及びＭ４２８Ｌ／Ｆに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｔ１９Ｑ／Ｅ及びＭ１９７Ｌ／Ｆを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0219】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｎ４３４Ｓ及びＶ３０８Ｗ／Ｙ／Ｆに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｎ２０３Ｓ及びＶ７７Ｗ／Ｙ／Ｆを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0220】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｌに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｍ２１Ｙ及びＭ１９７Ｌを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0221】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｓに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｔ７６Ｑ及びＮ２０３Ｓを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0222】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｍ４２８Ｌ及びＶ３０８Ｆに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｍ１９７Ｌ及びＶ７７Ｆを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0223】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｑ３１１Ｖ及びＮ４３４Ｓに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｑ８０Ｖ及びＮ２０３Ｓを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0224】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｈ２０２Ｋ及びＮ２０３Ｆを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0225】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｅ２５８Ｆ及びＶ４２７Ｔに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｅ２７Ｆ及びＶ１９６Ｔを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0226】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｋ２８８Ｅ及びＨ４３５Ｋに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｋ５７Ｅ及びＨ２０４Ｋを備える。このバリアントは増加した半減期を有する。

【0227】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｒ４０９Ｋに対応する配列番号５に記載の配列中のアミノ酸置換Ｒ１７８Ｋを備える。このバリアントはヒトＩｇＧ４の酸性誘導性凝集を防止する（Ｎａｍｉｓａｋｉ等（２０２０年）ＰｌｏＳ ＯＮＥ １５（３）：ｅ０２２９０２７参照）。

【0228】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５に記載の配列中の３７位、４３位、６５位、９６位、９９位、１００位、１２４位、１２５位、１２７位、１８７位及び２１４位のうちの一つ以上におけるアミノ酸置換を備えない。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、アミノ酸置換Ｑ３７Ｈ、Ｑ４３Ｋ、Ｆ６５Ｙ、Ｇ９６Ａ、Ｓ９９Ａ、Ｓ１００Ｐ、Ｑ１２４Ｒ、Ｅ１２５Ｄ、Ｍ１２７Ｌ、Ｒ１７８Ｋ、Ｅ１８７Ｑ及びＬ２１４Ｐのうちの一つ以上を備えない。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５に記載の配列中の３７位、４３位、６５位、９６位、９９位、１００位、１２４位、１２５位、１２７位、１８７位及び２１４位のうちのいずれかにおけるいかなるアミノ酸置換も備えない。一実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントは、アミノ酸置換Ｑ３７Ｈ、Ｑ４３Ｋ、Ｆ６５Ｙ、Ｇ９６Ａ、Ｓ９９Ａ、Ｓ１００Ｐ、Ｑ１２４Ｒ、Ｅ１２５Ｄ、Ｍ１２７Ｌ、Ｒ１７８Ｋ、Ｅ１８７Ｑ及びＬ２１４Ｐのうちのいずれも備えない。

【0229】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２の部分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分又はそのバリアントを備える。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、共に連結されてＦｃ部分を形成するヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを備える。全長ヒトＩｇＧ１抗体では、Ｆｃ部分はヒンジ領域を介してＦａｂ断片に結合される。Ｆａｂ断片は、重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを備える。好適には、本発明の融合タンパク質において使用されるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、配列番号１６に記載の配列を有する。

【0230】

「ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアント」は、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃ部分と比較して、一つ以上のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を示す。一実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃ部分と比較して、エフェクター機能の低下をもたらす。

【0231】

好適には、エフェクター機能の低下は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下を備える。より好適には、ＣＤＣは、配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃ部分のＣＤＣと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍低下している。ＣＤＣを測定及び定量する方法は、当業者に既知であり、上述されている。

【0232】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、配列番号１６に記載の配列のＬ３、Ｌ４及びＰ９８から選択されるアミノ酸残基において少なくとも一つのアミノ酸置換を備える。これらのアミノ酸残基は、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９に対応する。

【0233】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ／Ａに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ４Ｅ／Ａを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0234】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ３Ａ及びＬ４Ａを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0235】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ３Ａ、Ｌ４Ａ、Ｐ９８Ｇを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0236】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｌ４Ａ及びＰ９８Ｇを備える。このバリアントは、低下したエフェクター機能、特に低下したＣＤＣを有する。

【0237】

一実施態様では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｍ２１Ｙ、Ｓ２３Ｔ及びＴ２５Ｅを備える。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する。このバリアントは、増加した半減期及びＦｃＲｎへの増強された結合を有する。

【0238】

一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、全長ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列中のアミノ酸置換Ｔ２５６Ｄ及びＴ３０７Ｑに対応する配列番号１６に記載の配列中のアミノ酸置換Ｔ２５Ｄ及びＴ７６Ｑを備える。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有する。このバリアントは、増加した半減期及びＦｃＲｎへの増強された結合を有する（Ｍａｃｋｎｅｓｓ等（２０１９年）ＭＡＢＳ １１（７）：１２７６－１２８８）。

【0239】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２の部分は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分のバリアントを備え、同じ第１の部分及び野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える第２の部分を備える融合タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が低下している。ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、同じ第１の部分及び配列番号１６に記載の野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える第２の部分を備える融合タンパク質の結合と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍又は少なくとも１０倍まで低下する。

【0240】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第２の部分は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分のバリアントを備え、同じ第１の部分及び野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える第２の部分を備える融合タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は低下し、ＦｃＲｎへの結合は本質的に同じである。用語「ＦｃＲｎへの結合は本質的に同じ」は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分又はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃ部分のバリアントを備える融合タンパク質のＦｃＲｎへの結合が、同じ第１の部分及び配列番号１６に記載の野生型ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える第２の部分を備える融合タンパク質の結合と、２０％以下又は１５％以下、好適には１０％以下又は５％以下、より好適には３％以下又は２％以下、最も好適には１％以下だけ異なることを意味する。

【0241】

融合タンパク質のＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃＲｎへの結合は、本明細書中の例に記載されるような表面プラズモン共鳴によって測定され得る。

【0242】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質の第１及び第２の部分は、連結配列によって連結される。連結配列は、それ自体では機能を有さず、融合タンパク質の折り畳みに影響を及ぼさない短いアミノ酸配列である。一実施形態では、連結配列は、８個から２０個のアミノ酸、好適には１０個から１８個のアミノ酸、より好適には１１個から１７個のアミノ酸又は１２個から１６個のアミノ酸、最も好適には１３個のアミノ酸を備える。

【0243】

一実施形態では、連結配列は、グリシン及びセリンから選択される小さなアミノ酸からなる。連結配列の概要は、Ｃｈｅｎ等（２０１３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９において提供される。

【0244】

一実施形態では、融合タンパク質の第２の部分がヒトＩｇＧ４のＦｃ部分又はそのバリアントである場合、連結配列はヒトＩｇＧ４のヒンジ領域からなる。一実施形態では、連結配列は、配列番号４に記載の配列からなる。配列番号４に記載の配列では、（全長ＩｇＧ４のセリン２２８に対応する）ＩｇＧ４の野生型ヒンジ領域の残基１０におけるセリンがプロリンに置換されており、半分子ＩｇＧの交換の低下をもたらしている。ＩｇＧ４抗体は、Ｆａｂアームの交換を受けることができ、二つの異なるＦａｂアームの組み合わせをもたらし、新たな二重特異性抗体分子を作製することが知られている（例えば、Ａａｌｂｅｒｓｅ等（２００９年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ３９（４）：４６９－４７７参照）。このＦａｂアームの交換は、ＩｇＧ４のヒンジ領域に位置する、Ｆｃ領域のセリン２２８のプロリンへの変異によって防止され得る（Ｓ２２８Ｐ、Ｓｉｌｖａ等（２０１５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０：５４６２－５４６９参照）。さらに、短いリンカー配列の使用は、融合タンパク質の安定性を増加させ、融合タンパク質のプロテアーゼへの接近を低下させる。

【0245】

一実施形態では、融合タンパク質の第２の部分がヒトＩｇＧ１のＦｃ部分又はそのバリアントである場合、連結配列はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域からなる。一実施形態では、連結配列は、配列番号１５に記載の配列からなる。

【0246】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列、及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0247】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号２１に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列、及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0248】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号２２に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0249】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号２３に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0250】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号２６に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0251】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号２７に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0252】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号３０に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0253】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号３１に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0254】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号３４に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0255】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号３５に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0256】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号３８に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0257】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号３９に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0258】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号４０に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0259】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号４１に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0260】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号４２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0261】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号４３に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0262】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号４５に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0263】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号４６に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0264】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号４７に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0265】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号４８に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0266】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号４９に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0267】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号５０に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0268】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号５１に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0269】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号５２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0270】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号５３に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0271】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号５４に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0272】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号５５に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0273】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号５６に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0274】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号５７に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0275】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号５８に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0276】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号６１に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0277】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号６２に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0278】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号６３に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0279】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号６４に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0280】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号６５に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0281】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号６６に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0282】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号６７に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0283】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号６８に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0284】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号６９に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0285】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号７０に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0286】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号７１に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0287】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｓ６４５Ｃ変異及びＲ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号７２に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0288】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号７３に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0289】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号７４に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0290】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号７５に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0291】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号７６に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0292】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号７７に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0293】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号７８に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0294】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号７９に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0295】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｈ３７４Ｎ変異及びＨ３７８Ｎ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号８０に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0296】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号８１に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0297】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号８２に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号５９に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0298】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号８３に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0299】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号８４に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号６０に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0300】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号８５に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0301】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号８６に記載のアミノ酸配列、配列番号１５に記載の連結配列及び配列番号１６に記載のヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を有する。

【0302】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号８７に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0303】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号８８に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号５に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分を有する。

【0304】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号８９に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0305】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｒ２７３Ａ変異を有する（番号付けは配列番号１を参照）ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号９０に記載のアミノ酸配列、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0306】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号２）のアミノ酸１８から７３２を備える配列番号９３に記載のアミノ酸配列（番号付けは配列番号１を参照）、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0307】

特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒトＡＣＥ２（配列番号３）のアミノ酸１８から７４０を備える配列番号９４に記載のアミノ酸配列（番号付けは配列番号１を参照）、配列番号４に記載の連結配列及び配列番号４４に記載のヒトＩｇＧ４のＦｃ部分のバリアントを有する。

【0308】

本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子にも関する。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列が既知であるときに核酸分子を構築する方法を知っている。特に、核酸分子の構築は、三文字の遺伝コードを使用してタンパク質のアミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳し、任意で、核酸分子を使用してタンパク質が発現される宿主細胞のコドンの使用を考慮することを含む。

【0309】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を備える核酸分子は、単離された核酸分子である。用語「単離された核酸分子」は、それが産生された環境において通常関連している少なくとも一つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子を示す。好適には、単離された核酸は、産生環境に関連する全ての成分と関連していない。

【0310】

本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を増殖可能である核酸分子を示す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及びそのベクターが導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、そのベクターが動作可能に連結されている核酸の発現を誘導可能である。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

【0311】

発現ベクターは、適切なプロモーター及びポリアデニル化シグナルのような核酸の発現のための要素を含有する。さらに、発現ベクターは、一般に、発現ベクターを含有しない細胞から発現ベクターを含有する細胞の区別を可能にするために、適切なプロモーターの制御下にある選択マーカー遺伝子を含有する。本発明の融合タンパク質のようなリコンビナントタンパク質を発現させるために適した発現ベクターを構築するために必要な要素及び方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ等（１９９９年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７：１８３－２０２及びＫａｕｆｍａｎ（２０００年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５１－１６１において記載される。

【0312】

発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換する、すなわち遺伝的に改変するために使用される。

【0313】

当業者は、発現ベクターを哺乳類細胞に導入するための方法を認識している。これらの方法は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＰＥＩｍａｘ）、２９３－Ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍａｘのような市販のトランスフェクションキットの使用を含む。さらなる適切な方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション及びＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションを含む。トランスフェクション後、細胞は、発現ベクター（複数）によってコードされる選択マーカー（複数）に基づく適切な薬剤を用いた処置により選択され、リコンビナント核酸分子を含有する安定したトランスフェクト細胞を同定する。

【0314】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、同義的に使用され、外因性の核酸又は発現ベクターが導入されている細胞及びそのような細胞の子孫を示す。宿主細胞は、初代形質転換細胞及び継代数に関係なくそれから由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。

【0315】

本発明の融合タンパク質は、好適には哺乳類宿主細胞において産生される。本発明の融合タンパク質を発現するための適切な哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ陰性ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、サル腎臓ＣＶ１、ヒト胎児腎臓株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３ Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞及びＦＳ４細胞を含む。より好適には、宿主細胞は齧歯類に由来する。最も好適には、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

【0316】

本発明の融合タンパク質を産生するために、宿主細胞は、適切な培養培地において培養される。

【0317】

用語「培地」、「細胞培養培地」及び「培養培地」は、本明細書において同義的に使用され、哺乳類細胞を成長させるために必要とされる栄養素を含有する溶液を示す。一般的に、細胞培養培地は、最小限の成長及び／又は生存のために細胞によって必要とされる必須及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、及び微量元素を提供する。細胞培養培地はまた、成長因子を備え得る。好適には、培地は、全てのその成分及びそれらの濃度が既知であるという点において化学的に定義される。また好適には、培地は無血清かつ無加水分解物であり、いかなる動物由来の成分も含有しない。より好適な実施形態では、培地は無血清かつ無加水分解物であり、いかなる動物由来の成分又はインスリンも含有しない。

【0318】

一実施形態では、本発明の方法に使用される培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｏｌＣＨＯ Ｐ Ｐｏｗｄｅｒ Ｂａｓｅ ＣＤ、ＡｃｔｉＰｒｏ（両方ＧＥから入手）、ＰｏｗｅｒＣＨＯ－２、ＰｒｏＣＨＯ－５（両方Ｌｏｎｚａから入手）又はＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａから入手）のような市販の培地である。

【0319】

哺乳類細胞を培養するために、バッチ培養、灌流培養、連続培養及び流加培養を含む様々な戦略が利用可能である。好適には、流加培養プロセスが使用される。流加培養では、培養プロセスは、特定の量の基礎培地で開始され、一つ以上の栄養素を備える一つ以上のフィード培地が、培養プロセスの後の時点（複数）において供給され、産物が細胞培養液から除去されない間の栄養素の枯渇を防止する。従って、用語「フィーディング」は、少なくとも一つの成分が既存の細胞培養物に添加されることを意味する。

【0320】

用語「基礎培地」は、細胞培養プロセスの始めから使用される培地を示すことが意図される。哺乳類細胞を基礎培地に植え付け、フィーディングが開始されるまで一定期間この培地において成長させる。基礎培地は、上述の培養培地の定義を満たす。市販の培地が使用される場合、さらなる成分が基礎培地に添加され得る。

【0321】

フィード培地は、細胞を一定期間基礎培地において培養した後に細胞培養物に添加される。フィード培地は、栄養枯渇を防止する役割を果たし、従って、基礎培地と同じ組成を有しなくてもよい。特に、一つ以上の栄養素の濃度は、基礎培地中よりもフィード培地中において高くてもよい。一実施形態では、フィード培地は、基礎培地と同じ組成を有する。別の実施形態では、フィード培地は、基礎培地と別の組成を有する。フィード培地は、連続的に、又は規定の時点においてボーラス投与として添加され得る。

【0322】

適切なフィード培地は当業者に既知であり、ＰｏｌＣＨＯ Ｆｅｅｄ－Ａ Ｐｏｗｄｅｒ Ｂａｓｅ ＣＤ、ＰｏｌＣＨＯ Ｆｅｅｄ－Ｂ Ｐｏｗｄｅｒ Ｂａｓｅ ＣＤ、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及びＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂ（全てＧＥから入手）、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ３ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）及びＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ ｆｅｅｄ １（Ｓｉｇｍａから入手）を含む。

【0323】

宿主細胞の培養は、一定温度、例えば３７℃±０．２℃の温度において実行され得る。代わりに、培養温度は第１の温度から第２の温度まで低下されてもよく、すなわち、温度は能動的に下方調節される。従って、第２の温度は、第１の温度よりも低い。第１の温度は、３７℃±０．２℃であってもよい。第２の温度は、３０℃から３６℃までの範囲であってもよい。

【0324】

本発明の融合タンパク質が、適切な培養培地における宿主細胞の培養により産生された後、融合タンパク質は、細胞培養物から回収される。哺乳類細胞から発現されたＦｃ融合タンパク質は、一般的に、培養プロセスの間に細胞培養液中に分泌されるので、培養プロセスの終了時の産生物回収は、融合タンパク質を備える細胞培養液を細胞から分離することによって行われる。細胞分離法は、細胞破壊を最小限にして、細胞破片の増加並びにプロテアーゼ及び融合タンパク質産物の質に影響を及ぼし得る他の分子の放出を避けるために穏やかであるべきである。通常、融合タンパク質を備える細胞培養液の回収は、遠心分離及び／又は濾過を必要とし、それによって融合タンパク質は、上清及び濾液中にそれぞれ存在する。拡張ベッド吸着クロマトグラフィは、遠心分離／濾過法を避けるための代替法である。

【0325】

融合タンパク質を備える細胞培養液を回収した後、融合タンパク質は細胞培養液から精製されなければならない。Ｆｃ融合タンパク質の精製は、通常、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、特にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィのようなクロマトグラフィステップを含み得る一連の標準的な技術によって達成される。さらに、精製プロセスは、一つ以上の限外濾過、ナノ濾過又は透析濾過並びに接線流濾過及び／又はクロスフロー濾過ステップを備え得る。

【0326】

融合タンパク質を精製した後、それは医薬組成物を調製するために使用され得る。医薬組成物は、疾患又は病気を治療又は予防するために患者に送達されることが意図される組成物である。活性薬剤、すなわち本発明の融合タンパク質に加えて、医薬組成物は、一般的に、少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤を含有する。薬学的に許容される賦形剤は、融合タンパク質の生理的活性を妨害せず、医薬組成物を安定化させ、及び／又は医薬組成物の溶解度を増強し、又は粘性を低下させる物質である。リコンビナントタンパク質のための一般的な薬学的に許容される賦形剤は、緩衝剤、塩、糖又は糖アルコール、アミノ酸及び界面活性剤を含む。

【0327】

医薬組成物は、治療有効量の本発明の融合タンパク質を備える。用語「治療有効量」は、特定の障害、病気又は疾患を処置する（例えば、その症状の一つ以上を改善する、緩和する、軽減する、及び／又は遅延させる）のに十分な本発明の融合タンパク質の量を示す。コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染に関して、治療有効量の本発明の融合タンパク質は、咳、息切れ、呼吸困難、発熱、寒気、疲労感、筋肉痛、咽頭痛、頭痛、胸痛、並びに嗅覚及び／又は味覚の喪失から選択される一つ以上の症状を改善、緩和、軽減、及び／又は遅延させる。治療有効量は、一回以上の投与において投与され得る。

【0328】

本発明の融合タンパク質は、医療用であり、すなわち、疾患を予防及び／又は治療するために使用されることが意図される。

【0329】

本明細書で使用される「治療」又は「治療している」は、有益な又は所望の結果（臨床的結果を含む）を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果は、限定されないが、以下（疾患に起因する一つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防又は遅延）、疾患の拡大の予防又は遅延、疾患の再発の予防又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患の（部分的又は全体の）寛解の提供、疾患の治療に必要な一つ以上の他の薬剤の用量の減少、及び／又は生存の延長）の一つ以上を含む。本発明の使用は、治療のこれらの態様の内のいずれか一つ以上を考慮する。

【0330】

用語「予防する」、及び「予防された」、「予防している」等のような類似の用語は、疾患又は病気の再発の可能性を予防、抑制、又は低減するためのアプローチを示す。それはまた、疾患又は病気の再発を遅延させること、又は疾患又は病気の症状の再発を遅延させることを示す。本明細書で使用されるように、「予防」及び類似の用語はまた、疾患又は病気の再発の前に、疾患又は病気の強度、効果、症状及び／又は負荷を低下させることを含む。

【0331】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を予防及び／又は治療するために使用される。コロナウイルスは、プラスセンスの一本鎖ＲＮＡゲノム及び二十面体タンパク質シェルを有するエンベロープウイルスである。Ｓ１及びＳ２サブユニットからなるスパイクタンパク質は、エンベロープから突出し、ＡＣＥ２に結合することによる標的細胞との相互作用を媒介するホモ三量体を形成する。コロナウイルスはしばしば、ヒト及び他の哺乳類並びに鳥類種において呼吸器疾患を引き起こす。ヒトでは、七つのコロナウイルス株（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が知られている。最初の四つのコロナウイルス株（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）は、軽い症状のみを引き起こすが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染は、重度の、生命を脅かす可能性のある疾患をもたらし得る。

【0332】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３はＡＣＥ２に結合し、この結合を使用して標的細胞に侵入することが示されている（Ｌｉ等（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ ４２６（６９６５）：４５０－４、Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（２０２０年）Ｃｅｌｌ １８１：１－１０、Ｈｏｆｍａｎｎ等（２００５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０２（２２）：７９８８－９３）。従って、本発明の融合タンパク質は、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＨＣｏＶ－ＮＬ６３による感染を治療及び／又は予防するために使用され得る。ＡＣＥ２に結合する更なるコロナウイルスは、ＡＣＥ２を発現する細胞にコロナウイルススパイクタンパク質及びレポータータンパク質を発現するシュードタイプＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）を一時的又は構成的に植え付け、植え付け期間後にレポータータンパク質の活性を検出することにより同定され得る（Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（２０２０年）Ｃｅｌｌ １８１：１－１０のプロトコル参照）。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶではない。

【0333】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はアミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ及び／又はアミノ酸置換Ｎ４３９Ｋを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントは、Ｋｏｒｂｅｒ等（２０２０等）Ｃｅｌｌ １８２（４）：８１２－８２７に記載され、アミノ酸置換Ｎ４３９Ｋは、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１１．０４．３５５８４２において利用可能であるＴｈｏｍｓｏｎ等（２０２１年）Ｃｅｌｌ １８４（５）：１１７１，１１８７．ｅ２０において記載される。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇは武漢参考株における位置２３，４０３においてＡからＧへのヌクレオチド変異により引き起こされる。バリアントにおけるアミノ酸の番号付けは、配列番号１８に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質における番号付けを示す。従って、配列番号１８に記載のスパイクタンパク質を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、任意のバリアントが由来する野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることが定義される。

【0334】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ及び少なくとも一つの追加のアミノ酸置換を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ及びＤ１１１８Ｈを備え、アミノ酸６９、７０及び１４５の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ及びＭ１２２９Ｉを備え、アミノ酸６９及び７０の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ及びＬ４５２Ｒを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｅ４８４Ｋ及びＶ１１７６Ｆを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ及びＶ１１７６Ｆを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡ７０１Ｖを備え、アミノ酸２４２、２４３及び２４４の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡ７０１Ｖを備え、アミノ酸２４２、２４３及び２４４の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｄ６１４Ｇ、Ｄ８０Ａ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡ７０１Ｖを備え、アミノ酸２４２、２４３及び２４４の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｅ４８４Ｑ及びＬ４５２Ｒを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｅ４８４Ｋ及びＤ６１４Ｇを備え、アミノ酸１４５及び１４６の欠損を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。

【0335】

バリアントにおけるアミノ酸の番号付けは、配列番号１８に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質における番号付けを示す。バリアントを定義付けることの目的として、配列番号１８に記載のアミノ酸配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の野生型配列であると見なされる。

【0336】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインにおいて一つ以上のアミノ酸置換を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインは配列番号１８のアミノ酸３３１から５２４までを備える（Ｔａｉ等（２０２０年）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：６１３－６２０参照）。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｎ５０１Ｙを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｅ４８４Ｋを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、アミノ酸置換Ｋ４１７Ｔ／Ｎを備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。

【0337】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質はＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、配列番号１８に記載の野生型スパイクタンパク質を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して、ＡＣＥ２に対してより高い結合親和性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントの親和性は、例えば、シュードウイルスアッセイを用いて測定され得る。シュードウイルスアッセイは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのバリアントのＳタンパク質によりシュードタイプ化され、ルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子を含有するレンチウイルスを使用する。そのようなレンチウイルスは、例えば、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。シュードタイプレンチウイルスをＡＣＥ２発現細胞と共にインキュベートし、ウイルスを細胞に侵入させ、レポーター遺伝子を発現させる。バリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質によりシュードタイプ化されたレンチウイルスからのレポーター遺伝子の発現が、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質によりシュードタイプ化されたレンチウイルスからのレポーター遺伝子の発現よりも高い場合、バリアントは、ＡＣＥ２に対してより高い結合親和性を有する。本発明の文脈において、本発明の融合タンパク質は、バリアントＢ．１．１．７のようなＡＣＥ２に対してより高い結合親和性を有するバリアントに対してより高い親和性を有することが見出された。

【0338】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスによる感染を治療及び／又は予防するために使用され、ＡＣＥ２に結合するコロナウイルスは、配列番号１８に記載の野生型スパイクタンパク質を備えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して、より高い感染性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。ウイルス感染性は、一人の接触感染者から疾患に感染する人の平均数である基本再生産数Ｒ０を使用して測定され得る。

【0339】

投与経路は、既知の許容された方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路による注射又は注入に従う。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は鼻腔内、例えば、鼻スプレー、鼻軟膏又は点鼻薬によって投与されるものである。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、局所投与又は吸入によって投与される。好適には、本発明の融合タンパク質は静脈内注射又は注入によって投与される。

【0340】

本発明の医薬組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動し得る。適切な投与量又は投与経路の決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。動物実験は、ヒト治療に対する有効用量の決定のための信頼できる指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｙａｃｏｂｉ等，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２－４６によって規定された原理に従って実行され得る。

【0341】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重から４ｍｇ／ｋｇ体重の投与量、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．２ｍｇ／ｋｇ体重、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、０．４ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、０．６ｍｇ／ｋｇ体重、０．７ｍｇ／ｋｇ体重、０．８ｍｇ／ｋｇ体重、０．９ｍｇ／ｋｇ体重、１．０ｍｇ／ｋｇ体重、１．１ｍｇ／ｋｇ体重、１．２ｍｇ／ｋｇ体重、１．３ｍｇ／ｋｇ体重、１．４ｍｇ／ｋｇ体重、１．５ｍｇ／ｋｇ体重、１．６ｍｇ／ｋｇ体重、１．７ｍｇ／ｋｇ体重、１．８ｍｇ／ｋｇ体重、１．９ｍｇ／ｋｇ体重、２．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．１ｍｇ／ｋｇ体重、２．２ｍｇ／ｋｇ体重、２．３ｍｇ／ｋｇ体重、２．４ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重、２．６ｍｇ／ｋｇ体重、２．７ｍｇ／ｋｇ体重、２．８ｍｇ／ｋｇ体重、２．９ｍｇ／ｋｇ体重、３．０ｍｇ／ｋｇ体重、３．１ｍｇ／ｋｇ体重、３．２ｍｇ／ｋｇ体重、３．３ｍｇ／ｋｇ体重、３．４ｍｇ／ｋｇ体重、３．５ｍｇ／ｋｇ体重、３．６ｍｇ／ｋｇ体重、３．７ｍｇ／ｋｇ体重、３．８ｍｇ／ｋｇ体重、３．９ｍｇ／ｋｇ体重又は４．０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において静脈内投与される。

【0342】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１０ｍｇ／ｋｇ体重から１５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ体重、１５ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重、２５ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、３５ｍｇ／ｋｇ体重、４０ｍｇ／ｋｇ体重、４５ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、５５ｍｇ／ｋｇ体重、６０ｍｇ／ｋｇ体重、６５ｍｇ／ｋｇ体重、７０ｍｇ／ｋｇ体重、７５ｍｇ／ｋｇ体重、８０ｍｇ／ｋｇ体重、８５ｍｇ／ｋｇ体重、９０ｍｇ／ｋｇ体重、９５ｍｇ／ｋｇ体重、１００ｍｇ／ｋｇ体重、１０５ｍｇ／ｋｇ体重、１１０ｍｇ／ｋｇ体重、１１５ｍｇ／ｋｇ体重、１２０ｍｇ／ｋｇ体重、１２５ｍｇ／ｋｇ体重、１３０ｍｇ／ｋｇ体重、１３５ｍｇ／ｋｇ体重、１４０ｍｇ／ｋｇ体重、１４５ｍｇ／ｋｇ体重又は１５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において静脈内投与される。

【0343】

融合タンパク質は、１日１回、１日２回、１日３回、１日おき、１週間に１回又は２週間に１回投与され得る。

【0344】

融合タンパク質は、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間の期間にわたって投与され得る。

【0345】

本発明の融合タンパク質を投与することによって、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染が治療される、すなわち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の症状の少なくとも一つが軽減又は消失する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の症状は、咳、息切れ、呼吸困難、発熱、寒気、疲労、筋肉痛、咽頭痛、頭痛、胸痛、並びに嗅覚及び／又は味覚の喪失を含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の投与によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染によって引き起こされる発熱が軽減される。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による重度の感染過程を経験するリスクを低減する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、対象が多臓器不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）又は肺炎を経験するリスクを低減する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の長期的影響、例えば肺損傷、神経障害、皮膚障害及び心血管疾患を経験するリスクを低減する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、血液中のサイトカインＩＬ６及び／又はＩＬ８の濃度を低下させる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、血液中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子の濃度を低下させる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、抗ウイルス抗体の産生を刺激する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質の対象への投与は、抗ウイルスＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を刺激する。

【0346】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による重症感染症に罹患している対象に投与される。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し、人工呼吸を必要とする対象に投与される。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し、体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）を必要とする対象に投与される。

【0347】

本発明の融合タンパク質を投与することにより、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染が予防される、すなわち、処置された対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の症状を発症しない。

【0348】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象に接触している対象に投与される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象に接触している対象は、スマートフォンにインストールされた「コロナ警告アプリ」の使用により同定され得る。

【0349】

一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、上述の対象の咽喉又は鼻スワブを用いた試験が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していることを示すが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染のいかなる症状も発症していない対象に投与される。

【0350】

ＡＣＥ２、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合するコロナウイルスによる感染の治療又は予防では、本発明の融合タンパク質は、既知の抗ウイルス剤と組み合わせられ得る。抗ウイルス剤は、ウイルス感染を治療するために使用される薬剤であり、特異的抗ウイルス剤及び広域スペクトルウイルス剤の両方を含む。適切な抗ウイルス剤は、ヌクレオシド類似体、ウイルスプロテアーゼの阻害剤、ウイルスポリメラーゼの阻害剤、細胞内へのウイルス侵入の遮断薬、ヤヌスキナーゼ阻害剤に限定されず、炎症メディエータの阻害剤も含む。

【0351】

特定の実施形態では、抗ウイルス剤は、レムデシビル、アルビドールＨＣｌ、リトナビル、ロピナビル、ダルナビル、リバビリン、クロロキン及びヒドロキシクロロキンのようなその誘導体、ニタゾキサニド、カモスタットメシル酸塩、抗ＩＬ ６及び抗ＩＬ ６受容体抗体（例えば、トシリズマブ、シルツキシマブ及びサリルマブ）及びバリシチニブリン酸塩からなる群から選択される。

【0352】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の治療又は予防において、本発明の融合タンパク質は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体と組み合わせられ得る。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２モノクローナル抗体は、限定されないが、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙによって開発されたバムラニビマブ（ＬＹ－ＣｏＶ５５５ ２０、ＬＹ３８１９２５３）、エテセビマブ（ＬＹ－３８３２４７９、ＬＹ－ＣＯＶ０１６、ＪＳ－０１６、ＮＰ－００５）、ＲＥＧＮ１０９３３（カシリビマブ）及びＲＥＧＮ１０９８７（イムデビマブ）の混合物であり、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎによって開発されたＲＥＧＮ－ＣＯＶ２、Ｖｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって開発されたソトロビマブ（ＶＩＲ－７８３１、ＧＳＫ４１８２１３６）、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎによって開発されたＣＴ－Ｐ５９、抗体ＡＺＤ８８９５及びＡＺＤ１０６１の組合せであり、Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａによって開発されたＡＺＤ ７４４２、Ｊｕｎｓｈｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたＪＳ０１６、Ｔｙｃｈａｎ Ｐｔｅ Ｌｔｄによって開発されたＴＹ０２７、Ｂｒｉｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたＢＲＩＩ－９６及びＢＲＩＩ－９８、Ｓｉｎｏｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｔｄによって開発されたＳＣＴＡ０１、Ｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓによって開発されたＡＤＭ０３８２０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍなどによって開発されたＢＩ７６７５５１及びＣｏｒａｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたＣＯＲ－１０１を含む。

【0353】

コロナウイルスに結合する機能は別として、ＡＣＥ２はまた、高血圧症（高い血圧を含む）、鬱血性心不全、慢性心不全、急性心不全、収縮性心不全、心筋梗塞、動脈硬化、腎機能障害、腎不全、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症、腎線維症、慢性腎不全、急性腎不全、急性腎障害、炎症性腸疾患及び多臓器障害にも関与している。従って、本発明の融合タンパク質は、これらの障害及び疾患の治療にも使用され得る。

【0354】

本発明は、図面及び前述の説明において詳細に図示及び記載されているが、そのような図示及び説明は、具体的又は例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。本発明は、開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他の変形が、図面、開示、及び従属項の検討から、請求された発明を実施する当業者によって理解されかつ行われ得る。

【0355】

詳細な説明は、実際はただの例示であり、用途及び使用を限定する意図はない。以下の実施例は本発明をさらに説明するが、本発明の範囲をそれに限定するものではない。様々な変更及び修正が、本発明の説明に基づいて当業者によって行われることが可能であり、そのような変更及び修正は本発明にも含まれる。

【0356】

「実施例」
Ａ．材料及び方法
１．融合タンパク質の構築
本発明の四つの融合タンパク質を構築した。さらに、ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分の代わりにヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を備える４つの融合タンパク質を、比較例として構築した。以下の表１は、融合タンパク質の部分を示す。

【表1】

【0357】

構築物をコードする核酸配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を使用して発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ８６０－２０）のバリアントに挿入した。配列番号１７に記載のアルブミンシグナル配列を構築物のＮ末端に結合させた。次に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから利用可能）を使用して２９３細胞を一過性にトランスフェクトするために発現ベクターを使用した。６日目に、サンプルを細胞生存率及び細胞密度について分析し、上清を二段階遠心分離によって回収し、滅菌濾過した。物質をプールし、その半分を精製まで－８０℃で保存した。残りの半分をプロテインＡ精製に用いた。さらに、少量のサンプル（０．５ｍＬまで）をプールから取り出し、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって発現を測定した。

【0358】

２．タンパク質精製
一過性物質の精製を、プロテインＡカラムクロマトグラフィ、続いて分取ＳＥＣにより実行した。プロテインＡ精製のために、サンプルを装填した後、カラムを洗浄し、４０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ＝３．０）を使用してＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を溶出した。溶出後、まず１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝９．０）を用いてサンプルをｐＨ＝７．５に中和し、続いて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌを用いて１：１に希釈し、スピンフィルタを用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．５）、１５０ＮａＣｌを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いてさらに精製した。メインピークをプールし、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、滅菌フィルターに通し、さらなる使用まで４℃で保存した。

【0359】

３．勾配分光法（ｓｌｏｐｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によるタンパク質濃度（Ａ２８０）の測定
各種ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の精製物質を勾配分光法により分析し、タンパク質含有量を測定した。緩衝剤の干渉がないことを確認し、可変の光路長を使用することによって、精製プロセス中のサンプルの前希釈を前提条件とすることなく正確にタンパク質濃度を測定した。

【0360】

４．分析用サイズ排除クロマトグラフィによる高分子量種の測定
各種精製タンパク質構築物を、分析用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により分析した。簡潔に、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、２００Å（２０ｎｍ）、１．７μｍ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ｂｉｏ ＵＰＬＣシステムでサンプルを分析した。検出は２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度に基づいた。２０μｇのサンプルを装填し、移動相は２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなり、タンパク質を０．３ｍＬ／分の流速において均一濃度で溶出した。

【0361】

５．安定性試験
８個全ての精製されたＦｃ融合タンパク質について、安定性試験は、密閉バイアルにおいて１ｍｇ／ｍＬの濃度の７４０μＬ（３００μＬバックアップ）アリコートを用いて実行した。各Ｆｃ融合タンパク質の一つのバイアルを最初に３７℃で３週間インキュベートした。続いて、Ｆｃ融合タンパク質ごとに２番目のバイアルを加えてインキュベートした。加えて、さらに２週間後、Ｆｃ融合タンパク質ごとに３番目のバイアルを加えてインキュベートした。インキュベートをさらに１週間続けて、１番目の組のバイアルを６週間、２番目の組のバイアルを３週間及び３番目の組のバイアルを１週間インキュベートした。最後に、安定性試験の最後の週に並行して、４番目の組のバイアルに、－８０℃で３回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクルを行った。６週間、３週間及び１週間の試験間隔の全てのサンプルを、Ｆ／Ｔサンプルと一緒に、上述した方法を用いて分析用ＳＥＣで分析した。Ｔ＝０については、精製後の試験からのデータを用いた。

【0362】

６．ＰｅｐｍａｐによるＯ－グリコシル化の測定
精製されたＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質を、ＵＰＬＣ－ＲＰ／ＭＳを使用するペプチドマッピングによって分析した。タンパク質を塩酸グアニジン中で変性させ、次に、ＤＴＴを用いて４℃で１時間還元し、室温、暗所において３０分間、ヨードアセトアミドを用いてアルキル化した。サンプルに対してトリプシン及びＬｙｓ－Ｃ酵素の混合によるタンパク質分解消化を４時間行った。タンパク質分解ペプチドを、Ｃ１８逆相ＵＰＬＣ（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×３００ｍｍ、３００Å（３０ｎｍ）、１．７μｍ）カラム上で、移動相としてＭｉｌｌｉ－Ｑ中０．１％ギ酸及びアセトニトリルを用いて、初期保持時間４．５分で６０分のペプチドマッピンググラジエントにおいて分離した。糖ペプチドのカバレッジを改善するために、２つの異なる衝突エネルギーを適用した（１５から３０ｅＶまでの低衝突エネルギー及び６０から１００ｅＶまでの高衝突エネルギー）。ペプチドの検出は、２１４ｎｍのＵＶによって、及びＷａｔｅｒｓ製のＸｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏＦ質量分析計を用いた質量分析によって行った。分析をＭＳ^Ｅモードで実行して、ＭＳによる質量検証（ｍａｓｓ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に加えて断片化（ＭＳ／ＭＳ）によるペプチド検証（ｐｅｐｔｉｄｅ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を得た。デコンボリューションのためのＷａｔｅｒｓ ＭａｘＥｎｔ３を含む、Ｗａｔｅｒｓ ＵＮＩＦＩ １．９ソフトウェアを使用して、ＭＳ^Ｅスペクトルを処理した。Ｇｌｕ１－フィブリノペプチドＢを、別の参照プローブを用いて実行中に注入し、ロックマス補正のために使用した。デコンボリュートされた質量を、前駆体イオン質量に対して１０ｐｐｍのイオン許容差、及び断片イオン質量に対して２０ｐｐｍのイオン許容差を有する理論的配列（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に一致させた。グリコシル化ペプチドの同定のために、Ｃ－、Ｎ－及びＯ－グリカンの限定されたライブラリーを検索に含めた。作業の信頼性を高めるために、グリコシル化ペプチドの断片スペクトルをマーカーイオン（例えば、ｍ／ｚ ２９２及び２０４）の存在について調べた。加えて、シーケンスカバレッジマップについては、３つの断片イオンを有しないペプチドを除外した。

【0363】

７．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への融合タンパク質の結合の測定
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型）のスパイクタンパク質を用いた表面プラズモン共鳴。

【0364】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への融合タンパク質の結合を、市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ニューアーク、米国）を用いて表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により分析した。

【0365】

材料
ｈｉｓタグ及びＡｖｉＴａｇを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤは、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＳＰＤ－Ｃ８２Ｅ９、ロット番号ＢＶ３５４１ｂ－２０４３Ｆ１－ＲＤ）からである。タンパク質を製造業者の推奨に従って再構成し、等分し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで－８０℃で保存した。未使用のアリコートを各測定に使用した。

【0366】

ランニングバッファは、１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ）をＭｉｌｌｉＱ水で１：１０に希釈して調製した１×ＨＢＳ－ＥＰ＋であった。希釈した緩衝液を０．１μｍフィルターで濾過した。

【0367】

Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキット（Ｃｙｔｉｖａ）及びＢｉａｃｏｒｅ Ｘ－１００システムを測定に使用した。

【0368】

方法
ＡＣＥ２－Ｆｃｓを１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を用いて２００ｎＭに希釈した。濃度は、Ａ_{２８０、０．１％}の１．８４を使用して、１０ｍｍ石英キュベット中でＵＶ分光法によって確認した。２００ｎＭ ＡＣＥ２－Ｆｃを１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて４０、８、１．６及び０．３２ｎＭに希釈した。解凍したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤドメインを１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて１：１００に希釈して２μｇ／ｍＬの濃度にした。

【0369】

シングルサイクルキネティック法を使用した。流量は３０μＬ／分であった。各測定の前に、再生溶液（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の３回の注入を用いてチップを調整した。ＡｖｉＴａｇ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の固定化時間は３０秒であった。リガンド固定化後、各種濃度のＡＣＥ２－Ｆｃ（０．３２、１．６、８、４０及び２００ｎＭ）を、低い方から高い方へと開始するシングルサイクルキネティックモードにおいて、固定化リガンド上に注入した。ベースラインは、緩衝液注入のみによる２つのサイクルから得た。

【0370】

Ｋ_Ｄを生じる１：１結合モデルを用いて、データをＢｉａｃｏｒｅソフトウェアにおいて評価した。

【0371】

ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタバリアントのスパイクタンパク質との表面プラズモン共鳴。

【0372】

ＡＣＥ２－Ｆｃ構築物を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を用いて１ｎＭに希釈した。解凍したＳＡＲＳ ＣＯＶ－２スパイク三量体バリアント（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手、カタログ番号ＳＰＮ－Ｃ８２Ｅ７）を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を用いて２００ｎＭに前希釈し、続いて１×ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を用いて２０．００ｎＭ、６．６７ｎＭ、２．２２ｎＭ、０．７４ｎＭ及び０．２５ｎＭの最終アッセイ濃度に希釈した。実験の前に、Ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＮＨＳ／ＥＤＣ）を用いて１０００ＲＵの捕捉レベルまで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体によってチップを固定化した。各実験の前に、チップを調整するために、リガンドＡＣＥ２－ＦＣ構築物及び分析物スパイク三量体を用いて６回の開始サイクルを行った。各サンプル注入の前に、その後のブランク減算のためにブランク緩衝液サンプルを注入した。分析にはシングルサイクル法を用いた。流速を２０μＬ／ｍｉｎに設定し、ランニングバッファとして１×ＨＢＳ－ＥＰ＋を使用した。ＡＣＥ２－Ｆｃ構築物についての固定化時間は８０秒であったが、サンプル接触時間は会合時間については６００秒、解離時間については９００秒であった。スパイク三量体サンプルを、シングルサイクル動態アッセイにおいて、固定化されたＡＣＥ２－Ｆｃ構築物上に注入し、三重測定において低サンプル濃度から高サンプル濃度へと開始した。各サンプルサイクルの後、チップ表面をＭｇＣｌ_２の３Ｍ溶液で再生した。動態値は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアによるセンサーグラムの二重参照（リファレンスフローセル及びブランク緩衝液を参照）動態スクリーニングによって得た。各サンプルサイクルのベースラインプロット及び捕捉レベルプロットを、アッセイ検証のために生成した。

【0373】

ｃ）ＥＬＩＳＡ１

【0374】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への融合タンパク質の結合を定量化するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮＡＨＣＯ_３、７．７ｍＭ ＮａＮ_３、ｐＨ９．６）中の市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ニューアーク、米国）０．２μｇ／ウェルを用いてコーティングした。ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄した。ウェルを３００μｌのブロッキング緩衝液（洗浄緩衝液中２％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を用いて３７℃で９０分間ブロッキングした後、ウェルあたり３００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄した。次に、１００μｌの連続希釈した融合タンパク質を各ウェルに添加し、ウェルを３７℃で１時間インキュベートした。融合タンパク質をサンプル希釈緩衝液（洗浄緩衝液中０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）において希釈した。インキュベーション後、ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄した。次に、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃ抗体（洗浄緩衝液中０．５％ＢＳＡ（ｐＨ７．４）において希釈）を各ウェルに添加し、ウェルを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄した後、１０ｍｌ基質溶液Ａ（５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４×１２Ｈ_２Ｏ、２５ｍＭクエン酸、ｐＨ５．５）中２００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（８μｌ Ｈ_２Ｏ_２及び１００μｌ １０ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢを添加し、ウェルを暗所において３７℃で２０分間インキュベートした。５０μｌの１Ｍ硫酸を各ウェルに添加することによって反応を停止させた。プレートをＥＬＩＳＡリーダーにおいてＯＤ４５０ｎｍで読み取った。

【0375】

ＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質の結合の阻害を、製造者の指示に従って、適合された中和手順を用いてＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１阻害剤スクリーニングアッセイキット（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号＃７９９４５）を使用することにより試験した。簡潔に、ビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質（２５ｎＭ）を、９６ウェル中和プレート中においてＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の連続希釈物と共にゆっくり振盪しながら室温で１時間インキュベートした（＝中和混合物）。

【0376】

ＡＣＥ２タンパク質を、１μｇ／ｍＬの濃度でニッケルコーティング９６ウェルプレートに付着させ、ゆっくり振盪しながら室温で１時間インキュベートした。未結合ＡＣＥ２を洗浄ステップにより除去した。続いて、中和混合物をＡＣＥ２コーティングプレートに移し、プレートをゆっくり振盪しながら室温で１時間インキュベートした。１０分間のブロッキングステップの後、プレートをストレプトアビジン－ＨＲＰと共にゆっくり振盪しながら室温で１時間インキュベートした。洗浄及び１０分間のブロッキングの後、ＨＲＰ基質を添加し、プレートを化学発光リーダーで分析した。

【0377】

ｄ）ＥＬＩＳＡ２

【0378】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への融合タンパク質の結合を定量化するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）を、コーティング緩衝液（ＰＢＳ）中１００μＬ／ウェルを使用して、１．０μｇ／ｍＬの市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＰＮ－Ｃ５２Ｈ９、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてコーティングした。ウェルを４℃で一晩インキュベートした。翌日、コーティングを除去し、ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ＝７．５）を用いてウェルを３回洗浄した。１５０ｒｐｍで振盪しながら、２００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡを加えた洗浄緩衝液）を用いて室温で１時間ウェルをブロッキングした。その後、ブロッキング緩衝液を除去し、１００μｌの連続希釈した融合タンパク質を各ウェルに添加し、ウェルを室温で１時間、１５０ｒｐｍでインキュベートした。融合タンパク質をサンプル希釈緩衝液（洗浄緩衝液中１％ＢＳＡ）において希釈した。インキュベーション後、ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液を用いてウェルを３回洗浄した。次に、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ４Ｆｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、９２００－０５、ブロッキング緩衝液中１：４０００希釈）を各ウェルに添加し、ウェルを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル当たり３００μｌの洗浄緩衝液を用いてウェルを３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＢ０２）を添加し、ウェルを室温で２分間インキュベートした。ウェル当たり１００μｌの１Ｍ ＨＣｌを用いて反応を停止させ、遮光条件下において振盪しながら室温で３０秒間インキュベートした。暗所において室温で１５分間さらにインキュベートした後、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ、ＢｉｏＴｅｋ）においてＯＤ６５５を参照してＯＤ４５０ｎｍで読み取った。濃度（μｇ／ｍＬ）を、４パラメータロジスティック曲線フィットモデルを使用してＯＤ４５０（バックグラウンド減算後）に対してプロットした。

【0379】

８．融合タンパク質の存在下におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株による感染の分析。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の分析を、融合タンパク質の非存在下又は存在下においてＶｅｒｏ細胞を用いて行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を、イムノプラークの数を測定することにより検出した。

【0380】

ＶｅｒｏＥ６細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質サンプルの６個の２倍連続希釈物を９６ウェルトランスファープレート（複数）中に調製した。Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ウイルスを、およそ１００プラーク形成単位［ＰＦＵ］／ウェルの標的作用濃度において希釈物に連続的に添加し、３７℃で６０分から９０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、ＶｅｒｏＥ６細胞を有するアッセイプレートに中和混合物を移し、続いて３７℃かつ５％ＣＯ２においてインキュベートした。６０分から９０分のインキュベーション期間後、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）オーバーレイ培地をウェルに添加し、プレートをさらに２４時間インキュベートした。次に、細胞を固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ Ｓタンパク質に対して特異的な抗体ペアを使用して染色した。ＴｒｕｅＢｌｕｅＴＭ基質を用いてイムノプラークを可視化し、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ）を用いて計数した。イムノプラーク数をＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に出力し、血清サンプルの中和力価を、その特定のサンプルに対する５０％中和力価（ＩＤ５０）に対応する希釈の逆数として計算した。

【0381】

９．ＡＣＥ２活性アッセイ
ＡｂｃａｍのＡＣＥ２活性アッセイキット（ａｂ２７３２９７）を使用して、構築物の酵素活性を測定した。アッセイは、製造業者のマニュアルに従って行った。２つの市販のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（カタログ番号Ｚ０３４８４－１）及びＡｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＡＣ２－Ｈ５２５７）を参照タンパク質（Ｒｅｆ１及びＲｅｆ２）として使用した。このアッセイは、合成ペプチジル－ＭＣＡ誘導体の切断に基づく。この基質は、活性ＡＣＥ２によって切断され、ペプチジル－ＭＣＡと比較して４２０ｎｍ（３２０ｎｍで励起）で増加した蛍光強度を有する遊離ＭＣＡフルオロフォアを放出する。ＡＣＥ２からの切断により放出されたＭＣＡの量を、蛍光強度の増加の傾き及び既知のＭＣＡ濃度を用いた検量線から計算した。

【0382】

１０．ウイルス中和アッセイ

【0383】

ウイルス株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｍｕｎｉｃｈ－ＴＵＭ－１（ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿５８２１３４）を、ミュンヘン（２０２０年１月）のＣＯＶＩＤ－１９陽性患者の鼻咽頭スワブから単離し、ＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）中のＶｅｒｏＥ６細胞で成長及び増殖させた。

【0384】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇを、ドイツ、ミュンヘン（２０２０年４月）の患者材料から単離し、Ｃａｃｏ－２細胞で成長させ、ＶｅｒｏＥ６細胞で増殖させた。

【0385】

フランクフルト由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｆｒａ－１（ＡＹ２９１３１５．１）を、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン）（全てＧｉｂｃｏ）中のＶｅｒｏＥ６細胞で成長させ、増殖させた。

【0386】

ウイルス中和アッセイ、続いてインセルＥＬＩＳＡ
ＶｅｒｏＥ６細胞を、５％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、１．６Ｅ０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃かつ５％ＣＯ_２において一晩インキュベートした。ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質の連続希釈物を未使用培地中においてウイルスと混合し、３７℃で１時間プレインキュベートした。中和したウイルス溶液を用いてＶｅｒｏＥ６細胞を３７℃で１時間、０．３のＭＯＩにおいて感染させた。次に、中和混合物を除去し、培養培地を添加し、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。モック細胞は、培養培地と共にインキュベートした非感染ＶｅｒｏＥ６細胞を示す。２４時間後、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＣｈｅｍＣｒｕｚ）を用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳを用いた洗浄ステップに続いて、固定したＶｅｒｏＥ６細胞をＰＢＳ中の０．５％サポニン（Ｒｏｔｈ）を用いて室温で１０分間透過処置をした。次に、透過処置溶液を除去し、細胞をＰＢＳ中の０．１％サポニン及び１０％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）の混合物を用いて室温で１時間穏やかに振盪しながらブロッキングした。続いて、ＶｅｒｏＥ６細胞を、１％ＦＣＳを加えたＰＢＳ中の抗ｄｓＲＮＡ Ｊ２抗体（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１：５００希釈物を用いて、振盪しながら４℃で一晩インキュベートし、続いて洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｒｏｔｈ）を加えた１×ＰＢＳ）を用いて４回の洗浄ステップを行った。次に、プレートを、１％ＦＣＳを加えたＰＢＳ中のヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ－ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：２０００希釈物を用いてインキュベートし、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。４回の洗浄ステップの後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェルに添加し、暗所において１０分間インキュベートした。２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４（Ｒｏｔｈ）の添加によって呈色反応を停止させた後、４５０ｎｍ及び５６０ｎｍでのＴｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００プロプレートリーダーでの比色検出を行った。非感染ＶｅｒｏＥ６細胞により得られた値に対して正規化した後、光学密度を中和パーセント値に変換し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を計算した（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）。

【0387】

１１．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた、Ｆｃ受容体に対するＡＣＥ２融合タンパク質の結合親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００をＦｃ受容体結合試験に使用した。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａ実験のために、１．５ｎＭの濃度を有するＨｉｓタグ付きＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａを、ＣＭ５チップ上の共有結合的に固定化された抗ｈｉｓタグ抗体上に５μＬ／分の流速で９０秒間溶液を注入することによって捕捉した。ランニングバッファはＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ７．４）（Ｃｙｔｉｖａ）であった。５つの異なる濃度のＡＣＥ２－Ｆｃ構築物をシングルサイクルキネティックモードにおいて注入した（ＦｃγＲＩを用いた実験については３．７から３００ｎＭ及びＦｃγＲＩＩＩａについては２５から２０００ｎＭ）。ＦｃγＲＩ結合データを不均一リガンドモデルに当てはめ、第１の結合定数を報告した。ＦｃγＲＩＩＩａ結合データを二状態反応モデルに当てはめ、結合定数を導出した。ＦｃＲｎ実験のために、ＦｃＲｎをＣＭ５チップ上に約５０ＲＵ（レスポンスユニット）まで共有結合的に固定化した。サンプル緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ６．０）（Ｃｙｔｉｖａ）であった。ＡＣＥ２－Ｆｃ構築物を、シングルサイクルキネティックモードにおいて、２０５から８０００ｎＭの５つの異なる濃度において注入した。ＦｃＲｎ結合を、定常状態親和性フィットを用いて評価した。

【0388】

１２．細胞生存率アッセイによるウイルス中和の測定

【0389】

ウイルス株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｍｕｎｉｃｈ－ＴＵＭ－１（ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿５８２１３４）を、ミュンヘン（２０２０年１月）のＣＯＶＩＤ－１９陽性患者の鼻咽頭スワブから単離し、ＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）中のＶｅｒｏＥ６細胞で成長及び増殖させた。

【0390】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇを、ドイツ、ミュンヘン（２０２０年４月）の患者材料から単離し、Ｃａｃｏ－２細胞で成長させ、ＶｅｒｏＥ６細胞で増殖させた。

【0391】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｕｎｄｅｓｗｅｈｒ（ＧＩＳＡＩＤ：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿７５５６３９）のＤｒ．Ｂｕｇｅｒｔから入手し、ＶｅｒｏＥ６細胞で増殖させた。

【0392】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．３５１を、ＬＧＬ（オーバーシュライスハイム、ドイツ）から入手した。これはドイツの患者から単離され、これをＣａｃｏ－２細胞で成長させ、ＶｅｒｏＥ６細胞で増殖させた。バリアントの同一性を配列決定により確認した。

【0393】

感染の２４時間前に、ヒトアンジオテンシン変換酵素２受容体、ＡＣＥ２（Ａ５４９－ｈＡＣＥ２）を過剰発現するように設計されたヒト肺上皮Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ－ＣＣＬ－１８５）を、２％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン及び１％ＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中において、透明底を備える９６ウェル白色ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ウェル当たり１５，０００細胞で播種した。

【0394】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｍｕｎｉｃｈ－ＴＵＭ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＤ６１４Ｇ、Ｂ１．１．７及びＢ．１．３５１を、ＶｅｒｏＥ６細胞で成長させた。このために、感染の一日前に１５×１０^６個のＶｅｒｏＥ６細胞を各Ｔ１５０フラスコに播種した。感染は、３７℃、５％ＣＯ_２において０．０１のＭＯＩでウイルスを添加することによって行った。ウイルスの添加一時間後、培地を、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン及び１％ＮＥＡＡ、２００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ－グルタミン及び１％ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭに交換した。

【0395】

感染を、ウイルス誘導性細胞傷害性の発光測定読み出しを使用して測定した。簡単に説明すると、感染７２時間後、細胞を製造業者の指示に従って処置した。１５μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、米国）を各ウェルに添加し、暗所、室温で１０分間インキュベートし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して発光を記録した（積分時間０．５秒、フィルター無し）。細胞の生存率及び各ウイルス分離株への対応する感染力価は、感染細胞を未処置の対照細胞（１００％に設定）に正規化させることにより計算した。構築物の連続希釈を実行し、指定された量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床分離株のウイルスストックを用いて混合すると、８０％の細胞毒性をもたらした。１時間のプレインキュベーション後、構築物及びそれぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株の混合物をＡ５４９－ｈＡＣＥ２細胞に添加した。感染の７２時間後、ウイルス誘導性細胞傷害性を上述のように測定した。

【0396】

１３．プラークアッセイによるウイルス力価（ｖｉｒｕｓ ｔｉｔｅｒ）の測定
ウイルス力価を、いくつかの修正を加えてＢａｅｒ等（２０１４年）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，ｅ５２０６５に記載のように測定した。簡潔に、ＨｅｐＧ２又はＶｅｒｏＥ６細胞を、５％ ＦＣＳ、１％ Ｐ／Ｓ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１％ ＭＥＭ－ＮＥＡＡ、１％ ピルビン酸ナトリウム（全てＧｉｂｃｏ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に５Ｅ０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートにおいて播種し、３７℃かつ５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。細胞を、細胞培養培地中のウイルスサンプルの連続希釈物を用いて３７℃で一時間感染させた。上清を捨てた後、最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で希釈した１ｍＬの５％カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）をウェルごとに添加し、明らかなプラークが出現するまでプレートを３７℃でインキュベートした。上清を除去した後、細胞を室温で３０分間、１０％パラホルムアルデヒド（ＣｈｅｍＣｒｕｚ）を用いて固定した。次に、ＰＢＳによる洗浄ステップを実施し、続いて１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、２０％メタノール及び水で希釈）を添加した。室温で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳを用いて溶液を洗い流し、プレートを乾燥させた。サンプルのウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を、希釈についてのプラークの平均数及び総希釈倍率の逆数を計数することによって測定した。

【0397】

Ｂ．結果
図１は、アミノ酸１８から７３２を備える短いＡＣＥ２断片を有する融合タンパク質（構築物１、３、５及び７）が、ＡＣＥ２のアミノ酸１８から７４０を備える融合タンパク質（構築物２、４、６及び８）と比較してより高い収率を得られたことを示す。

【0398】

さらに、アミノ酸１８から７３２を備える短いＡＣＥ２断片を有する融合タンパク質（構築物１、３、５及び７）は、ＡＣＥ２のアミノ酸１８から７４０を備える融合タンパク質（構築物２、４、６及び８）よりも、タンパク質凝集体を示す高分子量種のパーセンテージが低かった（図２参照）。同じことを３週間又は６週間の保存後に観察した（図１０参照）。

【0399】

表面プラズモン共鳴において、全ての構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対して同等の結合を示した（表２参照）。

【表2】

【0400】

同等の結果が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のデルタバリアントのスパイクタンパク質で得られた（表３参照）。

【表3】

【0401】

図３では、構築物１、３、５及び７は本質的にＯ－グリコシル化を有さないが、一方、構築物２、４、６及び８が様々な量の単一及び二重Ｏ－グリカンを有することを示す。

【0402】

図４は、全ての構築物１から８が、ＥＬＩＳＡ１によって測定されるように、ＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質の結合を阻害したことを示す。

【0403】

構築物１、３、５及び７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株によるＶｅｒｏＥ６細胞の感染をほぼ完全に阻害した（図５参照）。全ての構築物は、０．５ｎＭの範囲のＩＣ５０値を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／２０２０株を中和した。

【0404】

構築物１、２、５及び６は、３０分間のインキュベーション後に同量の合成ペプチジル－ＭＣＡ誘導体を切断するが、活性ＡＣＥ２部位に変異を有する構築物は、酵素活性を完全に喪失した（図６ａ及び図６ｂ参照）。

【0405】

全ての構築物１から８は、１５０ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶを中和し（図７ａ参照）、１０ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和し（図７ｂ参照）、１ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄ６１４Ｇを中和した（図７ｃ参照）。

【0406】

ＡＣＥ２－ＩｇＧ４－Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１対応タンパク質と比較して、ＦｃγＲＩに対してわずかに低い親和性を示した（表４参照）。ＡＣＥ２－ＩｇＧ４－ＦｃはＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示さなかったが、これはＡＣＥ２－ＩｇＧ１－Ｆｃ分子と対照的である（表４参照）。４つ全ての構築物は、ＦｃＲｎに対して同様の親和性を有した（表４参照）。

【表4】

【0407】

構築物１は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に、ＥＬＩＳＡ２によって測定される２５．９ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値で結合する（図８参照）。

【0408】

図９は、配列番号６及び８に記載のＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質（構築物１及び３）が、試験したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての臨床分離株を中和することを示す。より低いＩＣ５０（５０％阻害濃度）値によって証明されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの感染性がより高いほど、融合タンパク質はそれをより良好に中和する。特に、融合タンパク質は、スパイクタンパク質のＮ末端ドメインに対するほとんどのモノクローナル抗体及び受容体結合モチーフに対するモノクローナル抗体による中和への抵抗を示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＢ．１．１．７及びＢ．１．３５１に対して最も効果的である（Ｗａｎｇ等（２０２１年）Ｎａｔｕｒｅ）。さらに、Ｂ．１．３５１バリアントは、ワクチン接種された個体からの回復期血漿及び血清による中和からの回避を示す。

【0409】

各種構築物及び臨床分離株についてのＩＣ５０値を表５に示す。

【表5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】