▶ ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-09
(54)【発明の名称】修飾可溶性Ｔ細胞受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231101BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231101BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231101BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231101BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231101BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231101BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231101BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231101BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20231101BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231101BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20231101BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231101BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231101BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20231101BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12N1/00 A
C12N15/13
A61K38/02
A61K39/395 N
C12P21/08
C12P21/02 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526385
(86)(22)【出願日】2021-10-29
(85)【翻訳文提出日】2023-06-15
(86)【国際出願番号】 CN2021127290
(87)【国際公開番号】W WO2022089569
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】202011180613.X
(32)【優先日】2020-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518330176
【氏名又は名称】ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イン，ハンシャオ
(72)【発明者】
【氏名】シュ，マン
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，リーイン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ，ハンハン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，ジュアン
(72)【発明者】
【氏名】グ，ジジエ
(72)【発明者】
【氏名】ゴロロボブ，ゲンナジー
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジーシェン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE08
4B064CE20
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA02
4C084BA41
4C084CA53
4C084NA14
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA15
(57)【要約】
本発明では、（ｉ）抗体定常ドメインの全部または一部に融合したＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｉｉ）抗体定常ドメインの全部または一部に融合したＴＣＲβ鎖の全部または一部を含む、改変キメラ可溶性Ｔ細胞受容体（ＥＴＣＲ）を提供する。（ｉ）および（ｉｉ）は、設計したリンカー、ＴＣＲと抗体ドメインとの間の設計した結合インターフェース、およびそのＥＴＣＲを安定化するＴＣＲドメインにおける１つまたは複数の変異原をそれぞれ含む。ＥＴＣＲが、特異的ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を認識し、生物学的機能を示すことにより特徴づけられる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＴＣＲ Ｖα）とそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメイン（ＴＣＲ Ｖβ）とそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項2】
ａ）Ｃ１が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含み、ｂ）Ｃ２が、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、前記Ｃλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択され、前記Ｃκドメインは、Ｃκ１、Ｃκ２、Ｃκ３およびＣκ４からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項3】
ａ）Ｃ１が、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、前記Ｃλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択され、前記Ｃκドメインは、Ｃκ１、Ｃκ２、Ｃκ３およびＣκ４からなる群から選択され、ｂ）Ｃ２が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項4】
前記Ｃ１が、配列番号１１、１３、１５および１７のいずれか１つによる改変ＣＨ１を含み、ならびに／または前記Ｃ２が、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つによる改変Ｃλを含む、請求項２に記載のポリペプチド複合体。
【請求項5】
第１のＶαが、第１のコンジャンクションドメインを介してＣ１に動作可能に結合し、第１のＶβが、第２のコンジャンクションドメインを介してＣ２に動作可能に結合する、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項6】
前記Ｃ１が、改変ＣＨ１を含み、前記Ｃ２が、改変Ｃλを含み、前記第１のコンジャンクションドメインが、配列番号１９、２１および２３のいずれか１つを含み、ならびに／または前記第２のコンジャンクションドメインが、配列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５のいずれか１つを含み、好ましくは、前記第２のコンジャンクションドメインが、ＥＤＬＸＮＶＸＰを含み、前記Ｘが、任意のアミノ酸である、請求項５に記載のポリペプチド複合体。
【請求項7】
前記改変Ｃλが、配列番号１，３、５、７および９のいずれか１つの３０、３１および３３番目から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含む、請求項２または３に記載のポリペプチド複合体。
【請求項8】
前記ＴＣＲ Ｖβが、フレームワーク領域の１０、１３、１９、２４、４８、５４、７７、９０、９１、１２３および１２５番目（ＩＭＧＴナンバリング）から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含み、好ましくは、前記ＴＣＲ Ｖβが、１３番目の位置に少なくとも１つの変異を含むか、または９０および９１番目の位置に少なくとも２つの変異を含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体を含む第１の抗原結合部分、および第２の抗原結合部分を含む、多重特異性抗原結合複合体であって、前記第１の抗原結合部分が、第１の抗原特異性を有する、多重特異性抗原結合複合体。
【請求項10】
前記第２の抗原結合部分が、第１の抗原上の種々のエピトープに結合するか、または好ましくは、前記第１の抗原特異性とは異なる、第２の抗原特異性を有し、前記第１の抗原結合部分の第１のポリペプチドまたは前記第１の抗原結合部分の第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてコンジュゲートする、請求項９に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項11】
前記第１および前記第２の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に方向づけ、他方は、腫瘍関連抗原および／または腫瘍新生抗原に方向づける、請求項９に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項12】
前記第１の抗原結合部分が、ＴＣＲ ＶαおよびＴＣＲ Ｖβを含み、前記Ｖαが、配列番号３７、４１および４５から選択されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖβが、配列番号３９、４３および４７から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合部分が、配列番号４９から選択されるｓｃＦｖを含む、請求項９に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項13】
前記第１の抗原結合部分が、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）またはＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＧＰ１００ペプチド（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）に結合し、前記第２の抗原結合部分が、分化抗原群３（ＣＤ３）に結合する、請求項９に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項14】
前記第２の抗原結合部分が、可動性リンカーを介して共有結合的にコンジュゲートする重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの両方を含む１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項９に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、単離ベクター。
【請求項17】
請求項１５に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項１６に記載の単離ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項18】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体、または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を含む、コンジュゲート。
【請求項19】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を発現させる方法であって、前記ポリペプチド複合体が発現する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程を含む。
【請求項20】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項21】
それを必要とする対象における症状を治療する方法であって、治療有効量の請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項22】
前記第１の抗原および前記第２の抗原がともに調節される場合、前記症状を緩和、除去、治療または予防することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
疾患または症状の検出、診断、予後予測または治療のための、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項９～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を含む、キット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、改変キメラ可溶性Ｔ細胞受容体およびこの組成物、ならびに疾患の治療における療法に一般に関する。
本発明は、改変キメラ可溶性Ｔ細胞受容体およびこの組成物、ならびに疾患の治療における療法に一般に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
Ｔリンパ球は、主要組織適合分子（ＭＨＣ）と関連するペプチドとして提示される多種多様な外来抗原に対する応答を介して適応免疫において中心的役割を果たす。ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の特異的認識は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる、膜結合し多成分の細胞表面糖タンパク質により達成される。天然ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、αβおよびγδ型で存在し、これらは、構造的に類似するが、かなり異なる解剖学的位置と、おそらくは、機能とを有する。特には、αβ－ＴＣＲは、９５％を超えるあらゆるＴリンパ球に出現し、ほぼ無制限の多様なレパートリーで会合して、ヒトに外因性および内因性の両方の疾患からの防御を中枢的にもたらす。
Ｔリンパ球は、主要組織適合分子（ＭＨＣ）と関連するペプチドとして提示される多種多様な外来抗原に対する応答を介して適応免疫において中心的役割を果たす。ペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の特異的認識は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる、膜結合し多成分の細胞表面糖タンパク質により達成される。天然ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と結合する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、αβおよびγδ型で存在し、これらは、構造的に類似するが、かなり異なる解剖学的位置と、おそらくは、機能とを有する。特には、αβ－ＴＣＲは、９５％を超えるあらゆるＴリンパ球に出現し、ほぼ無制限の多様なレパートリーで会合して、ヒトに外因性および内因性の両方の疾患からの防御を中枢的にもたらす。
【0003】
抗体およびＴＣＲは、抗原を特異的に認識する、わずか２種類の分子であり、ＴＣＲは、ＭＨＣにより提示される特定のペプチド抗原に対する唯一の受容体であり、このＭＨＣでは、異質なペプチドが細胞における異常の唯一のサインとなることが多い。抗体と同様に、細胞内エピトープの治療標的を拡大するための薬物候補としての可溶性抗原特異的ＴＣＲおよびこの誘導体の開発への関心も持ち上がった。また、特異的ＴＣＲ：ｐＭＨＣ相互作用は、感染症、疾患マーカーおよび対応するｐＭＨＣ複合体を発現する特異的細胞を検出する強力な診断ツールとして利用することができる。しかし、抗体とは異なって、ＴＣＲは一般に、可溶性分子として発現する場合、非常に不安定であり、低発現収率、凝集およびミスフォールディングのような問題に直面することが多い。潜在的な説明として、大規模なグリコシル化、不安定な定常ドメインおよび非効率的鎖対形成が挙げられる。
【0004】
多くの論文では、それぞれのサブユニットを接続するヒンジ領域において天然ジスルフィド架橋を利用するＴＣＲヘテロ二量体の生成について記載された（Ｇａｒｂｏｃｚｉら、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ３８４巻（６６０５号）：１３４～１４１；Ｇａｒｂｏｃｚｉら、（１９９６）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ９１巻：１１４０８～１１４１２；Ｄａｖｏｄｅａｕら、（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８巻（２１号）：１５４５５～１５４６０；Ｇｏｌｄｅｎら、（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２０６巻：１６３～１６９）。しかし、このようなＴＣＲはＴＣＲ特異的抗体により認識され得るが、ミスフォールドした相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す天然リガンドを認識することは、いずれも示されていなかった。最近、国際公開第２００４／０７４３２２号では、その天然リガンドを認識することが可能であり、一定期間にわたって安定であるように正しくフォールドされ、合理的な量の生成が可能な、可溶性ＴＣＲについて記載されている。このＴＣＲは、定常ドメイン残基ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間の人工ジスルフィド結合により結合する、ＴＣＲβ鎖細胞外ドメインに二量体化するＴＣＲα鎖細胞外ドメインを含む。このような可溶性ＴＣＲ型式に基づいて、画期的な二重特異性ＴＣＲ薬物であるテベンタフスプ（Ｔｅｂｅｎｔａｆｕｓｐ）が開発され、転移性メラノーマを有する患者に対する利点を示した。同様に、米国特許出願公開第２０１８／０２１６８２号では、定常ドメイン残基（ＣαＲ５３、Ｐ８９、Ｙ１０ならびにＣβＳ５４、Ａ１９およびＥ２０）および定常ドメイン／可変ドメイン残基（Ｖα４６、４７（ＩＭＧＴナンバリング）およびＣβ６０、６１）間の別のいくつかの人工ジスルフィド結合も記載された。非常に最近では、Ｋａｒｅｎらは、可溶性ＴＣＲの計算支援的設計について記載した。Ｒｏｓｅｔｔａによる算出法および実験的スクリーニングの両方を使用して、彼らは、ＣαおよびＣβにおいて７つの変異を同定し、これらは、完全長ＴＣＲの会合および発現を著しく向上させた（Ｋａｒｅｎら、（２０２０）、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．、１１巻：２３３０）。特には、人工ジスルフィド結合または特に、定常ドメインにおいて、通常、高度にグリコシル化される変異原（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のいずれかによる天然ＴＣＲの修飾に基づいて設計された、このような可溶性ＴＣＲでは、薬物候補としての不特定の能力が潜在的に引き起こされ得る。このような欠点を回避するために、一部の場合では、このような可溶性ＴＣＲを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生成し、相対的に複雑な製造手順を生じるタンパク質リフォールディングプロセスにより会合させる。
【0005】
ＴＣＲの可変（Ｖ）および定常（Ｃ）ドメインと抗体との間の高度の配列同一性（３０％～７０％）は、抗体Ｆａｂ断片の重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖と同様に対形成するβシートサンドウィッチ構造にＴＣＲがフォールドされることを示唆する。ＴＣＲおよび抗体Ｆａｂの類似の全体構造およびヘテロ二量体結合を考慮して、可溶性ＴＣＲを得るための代替方法としてＴＣＲ抗体キメラタンパク質を生成する試みがなされている。これまでに記載のキメラＴＣＲ型式は、ａ）免疫グロブリン様会合物を生成するための結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメインへのＴＣＲの全部または一部の直接注入、およびｂ）ｆａｂ様会合物を生成するための追加の安定化ドメイン（例えば、Ｆｃ領域、ロイシンジッパー）を有するかまたは有しない抗体ｆａｂＣドメインへのＴＣＲ Ｖドメインの注入を主に含む（Ｊａｃｋら、（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１巻：１２６５４～１２６５８、Ｍａｒｋら、（１９８７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４巻：２９３６～２９４０、Ｇｒｅｇら、（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻（１３号）：７３１０～７３１６、Ｂｅｒｎａｒｄら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８巻：８０７７～８０８１、Ｊｏｎａｔｈａｎら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６巻（８号）：１３３３～１３４５、Ｊｏｎａｔｈａｎら、（１９９９）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２巻：１７５～１８４、ＡＵ７２９、４０６、ＵＳ６，９１１，２０４）。しかし、このようなキメラタンパク質の正しい機能は、わずかな場合において認められたが、発現レベルが極度に低いことが（３０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ）、このタンパク質製剤としてのさらなる適用の妨げとなった。実際、多くの差異が、ＴＣＲおよび抗体構造の注意深い調査により明らかとなり、これまでのＴＣＲ－抗体キメラの単純な注入の不満足な結果に対する説明がもたらされた。ＴＣＲは、すべてのβ鎖の一般的特徴であると思われるようにＣβドメインのループから突出しているため、Ｆａｂよりも中央を越えて広範にわたる（約５６Å対約４６Å）。また、ＴＣＲは、βシートがＣα／Ｃβインターフェースにさらに並行な角度で交差するため、Ｆａｂよりも非対称性かつ沈み込んでおり、Ｃα／Ｃβについて擬似２回対称位置の中心を外れておよそ５Å移動する。この非対称性は、Ｃβと比較した場合、より小さいサイズのＣαドメインにより強調される。したがって、野生型ＴＣＲおよび抗体の単純な注入の代わりに、構造的特徴に基づく包括的設計が、互換性を増強し、これにより安定かつ機能的キメラを生成するのに必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
可溶性ＴＣＲの重要性を考慮すると、天然の機能および大きな開発可能性を有するこのような分子を生成する代替方法を提供することが望ましい。本発明では、真核生物発現系において安定、可溶性かつ機能性のＴＣＲ（ＥＴＣＲ）およびＴＣＲ誘導体（二重特異性ＥＴＣＲ）を生成した。その上、本発明の二重特異性ＴＣＲを使用して、強力なｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性を観察した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の簡単な概要
一態様では、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体を本開示において提供する。特定の実施形態では、第１のＴＣＲは、第１の抗原特異性を有する。
一態様では、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体を本開示において提供する。特定の実施形態では、第１のＴＣＲは、第１の抗原特異性を有する。
【0008】
特定の実施形態では、Ｃ１およびＣ２は、ＩｇＧ１（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２２８、Ｚ１７３７０、ＡＬ１２２１２７、ＭＧ９２０２５２、ＭＧ９２０２５、ＭＧ９２０２４６、ＭＧ９２０２４７、ＭＧ９２０２４８、ＭＧ９２０２４９、ＭＧ９２０２５０、ＭＧ９２０２５１、ＭＧ９２０２５３）、ＩｇＧ２（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２３０、ＡＪ２５０１７０、ＡＦ４４９６１６、ＡＦ４４９６１８、ＡＦ９２８７４２、ＭＨ０２５８２８、ＭＨ０２５８２９、ＭＨ０２５８３０、ＭＨ０２５８３２、ＭＨ０２５８３３、ＭＨ０２５８３４、ＭＨ０２５８３５、ＭＨ０２５８３６）、ＩｇＧ３（ＩＭＧＴ受託番号：Ｘ０３６０４、Ｋ０１３１３、Ｘ１６１１０、Ｘ９９５４９、ＡＪ３９０２３６、ＡＪ３９０２３７、ＡＪ３９０２３８、ＡＪ３９０２４１、ＡＪ３９０２４２、ＡＬ１２２１２７、ＡＪ３９０２４７、ＡＪ３９０２５２、ＡＪ３９０２５４、ＡＪ３９０２６０、ＡＪ３９０２６２、ＡＪ３９０２７２、ＡＪ３９０２７６、ＭＧ９２０２５６、ＭＧ９２０２５５、ＭＧ９２０２５４、ＭＨ０２５８３７、ＭＧ９２０２５７、ＭＧ９２０２５８、ＭＧ９２０２５９、ＭＧ９２０２６０、ＭＧ７８６８１３、ＭＧ９２０２６１）、ＩｇＧ４（ＩＭＧＴ受託番号：Ｋ０１３１６、ＡＬ９２８７４２）、ＩｇＭ（ＩＭＧＴ受託番号：Ｘ１４９４０、Ｋ０１３０７、Ｘ５７３３１、ＡＣ２５４８２７）、ＩｇＡ１（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２２０、ＩＭＧＴ００００３５）、ＩｇＡ２（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２２１、Ｍ６０１９２、Ｓ７１０４３）、ＩｇＤ（ＩＭＧＴ受託番号：Ｋ０２８７５、Ｘ５７３３１）およびＩｇＥ（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２２２、Ｌ０００２２、ＩＭＧＴ００００２５、ＡＬ９２８７４２）からなる群から選択される抗体重鎖（ＣＨ１ドメイン）、またはＣλ１（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２５２、Ｘ５１７５５）、Ｃλ２（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２５３、Ｘ０６８７５、ＡＪ４９１３１７）、Ｃλ３（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２５４、Ｋ０１３２６、Ｘ０６８７６、Ｄ８７０１７）、Ｃλ６（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ０３０１１）、Ｃλ７（ＩＭＧＴ受託番号：Ｘ５１７５５、Ｍ６１７７１、Ｘ５１７５５、Ｍ６１７７１、ＫＭ４５５５５７）、Ｃκ１（ＩＭＧＴ受託番号：Ｊ００２４１）、Ｃκ２（ＩＭＧＴ受託番号：Ｍ１１７３６）、Ｃκ３（ＩＭＧＴ受託番号：Ｍ１１７３７）、Ｃκ４（ＩＭＧＴ受託番号：ＡＦ０１７７３２）およびＣκ５（ＩＭＧＴ受託番号：ＡＦ１１３８８７）からなる群から選択される軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含む。
【0009】
特定の実施形態では、Ｃ１は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、このＣλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択される。
【0010】
特定の実施形態では、Ｃ１は、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、このＣλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択され、Ｃ２は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含む。
【0011】
特定の実施形態では、ａ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ１ドメインを含み、ｂ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ１ドメインを含み、ｃ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ３（ＩｇＧ３）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ１ドメインを含み、ｄ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ１ドメインを含み、ｅ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ２ドメインを含み、ｆ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ２ドメインを含み、ｇ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ３（ＩｇＧ３）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ２ドメインを含み、ｈ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ２ドメインを含み、ｉ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ１ドメインを含み、ｊ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ３ドメインを含み、ｋ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ３（ＩｇＧ３）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ３ドメインを含み、ｌ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ３ドメインを含み、ｍ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ６ドメインを含み、ｎ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ６ドメインを含み、ｏ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ３（ＩｇＧ３）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ６ドメインを含み、ｐ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ６ドメインを含み、ｑ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ７ドメインを含み、ｒ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ７ドメインを含み、ｓ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ３（ＩｇＧ３）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ７ドメインを含み、ｔ）Ｃ１は、ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）由来の改変ＣＨ１ドメインを含み、Ｃ２は、ヒト免疫グロブリン由来の改変Ｃλ７ドメインを含む。
【0012】
特定の実施形態では、Ｃ１は、配列番号１１、１３、１５および１７のいずれか１つによる改変ＣＨ１を含み、ならびに／またはＣ２は、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つによる改変Ｃλを含む。
【0013】
特定の実施形態では、第１のＶαは、第１のコンジャンクションドメインを介してＣ１に動作可能に結合し、第１のＶβは、第２のコンジャンクションドメインを介してＣ２に動作可能に結合する。
【0014】
特定の実施形態では、Ｃ１は、改変ＣＨ１を含み、Ｃ２は、改変Ｃλを含み、ここで、第１のコンジャンクションドメインは、配列番号１９、２１および２３のいずれか１つを含み、ならびに／または第２のコンジャンクションドメインは、配列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５のいずれか１つを含み、好ましくは、第２のコンジャンクションドメインは、ＥＤＬＸＮＶＸＰを含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【0015】
特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｖβは、フレームワーク領域の１０、１３、１９、２４、４８、５４、７７、９０、９１、１２３および１２５番目（ＩＭＧＴナンバリング）から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含み、好ましくは、ＴＣＲ Ｖβは、１３番目の位置に少なくとも１つの変異を含むか、または９０および９１番目の位置に少なくとも２つの変異を含む。
【0016】
特定の実施形態では、ＣλまたはＣＨ１は、３０、３１および３３番目から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含む。
【0017】
別の態様では、前述のポリペプチド複合体を含む第１の抗原結合部分、および第２の抗原結合部分を含む、多重特異性抗原結合複合体であって、第１の抗原結合部分が、第１の抗原特異性を有する、多重特異性抗原結合複合体を最近の開示において提供している。
【0018】
特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、第１の抗原上の種々のエピトープに結合するか、または好ましくは、第１の抗原特異性とは異なる、第２の抗原特異性を有し、第１の抗原結合部分の第１のポリペプチドまたは第１の抗原結合部分の第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてコンジュゲートする。
【0019】
特定の実施形態では、第１の抗原特異性および第２の抗原特異性は、２つの異なる抗原に方向づけるか、または１つの抗原上の２つの異なるエピトープに方向づける。
【0020】
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合複合体は、第１の抗原結合部分および第２の抗原結合部分を含み、ここで、第１の抗原結合部分が、Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドを含み、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能である。第１のＴＣＲは、第１の抗原特異性を有する。
【0021】
特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、第１の抗原上の種々のエピトープに対する特異性を有する。
【0022】
特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、第１の抗原特異性とは異なる第２の抗原特異性を有し、第１の抗原結合部分の第１のポリペプチドまたは第１の抗原結合部分の第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてコンジュゲートする。
【0023】
特定の実施形態では、第１および第２の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に方向づけ、他方は、腫瘍関連抗原および／または腫瘍新生抗原に方向づける。
【0024】
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＴＣＲ ＶαおよびＴＣＲ Ｖβを含み、Ｖαは、配列番号３７、４１および４５から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｖβは、配列番号３９、４３および４７から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、第２の抗原結合部分は、配列番号４９から選択されるｓｃＦｖを含む。
【0025】
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）（配列番号３７～４０、４５～４８）に結合し、第２の抗原結合部分は、分化抗原群３（ＣＤ３）（配列番号４９～５０）に結合する。
【0026】
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＧＰ１００ペプチド（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）（配列番号４１～４４）に結合し、第２の抗原結合部分は、ＣＤ３（配列番号４９～５０）に結合する。
【0027】
特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、可動性リンカーを介して共有結合的にコンジュゲートする重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの両方を含む１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【0028】
別の態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体、または本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体をコードする、単離ポリヌクレオチドを本開示において提供する。
【0029】
一態様では、本明細書において提供するポリヌクレオチドを含む、単離ベクターを本開示において提供する。
【0030】
一態様では、本明細書において提供する単離ポリヌクレオチド、または本明細書において提供する単離ベクターを含む、宿主細胞を本開示において提供する。
【0031】
一態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体、または多重特異性抗原結合複合体を含む、コンジュゲートを本開示において提供する。
【0032】
一態様では、ポリペプチド複合体または多重特異性抗原結合複合体が発現する条件下で本明細書において提供する宿主細胞を培養する工程を含む、本明細書において提供するポリペプチド複合体または本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体を発現させる方法を本開示において提供する。
【0033】
一態様では、ａ）Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能であり、第１のＴＣＲが、第１の抗原特異性を有する、工程と、ｂ）宿主細胞がポリペプチド複合体を発現することが可能となる工程とを含む、本明細書において提供するポリペプチド複合体を生成する方法を本開示において提供する。
【0034】
一態様では、ａ）Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメインとそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能であり、第１のＴＣＲが、第１の抗原特異性を有し、第２の抗原結合部分が、第１の抗原特異性とは異なる第２の抗原特異性を有し、第１の抗原結合部分の第１のポリペプチドまたは第１の抗原結合部分の第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてコンジュゲートする、工程と、ｂ）宿主細胞が多重特異性抗原結合複合体を発現することが可能となる工程とを含む、本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体を生成する方法を本開示において提供する。
【0035】
特定の実施形態では、本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体を生成する方法は、ポリペプチド複合体を単離する工程をさらに含む。
【0036】
一態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体または本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体を含む組成物を本開示において提供する。
【0037】
一態様では、本明細書において提供するポリペプチド複合体または本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を本開示において提供する。
【0038】
一態様では、治療有効量の本明細書において提供するポリペプチド複合体または本明細書において提供する多重特異性抗原結合複合体を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象における症状または疾患、例えば、がんを治療する方法を本開示において提供する。特定の実施形態では、第１の抗原および第２の抗原がともに調節される場合、症状は、緩和、除去、治療または予防することができる。
【0039】
別の態様では、疾患または症状の検出、診断、予後予測または治療のための、本明細書において提供するポリペプチド複合体を含むキットを本開示において提供する。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】実施例１の工程１における抗体の定常領域における切断および変異アミノ酸位置を示す模式図である。
【図2】実施例１の工程２におけるスクリーニングにより得たファージディスプレイ可能キメラＴＣＲ中間体の呈示および結合活性アッセイ結果を示す図である。
【図3】ｄｓＴＣＲおよびｓｃＴＣＲを用いた実施例１の工程２におけるスクリーニングにより得たキメラＴＣＲ中間体の親和性比較の結果を示す図である。
【図4】実施例１の工程３におけるＶＴＣＲＣ ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＶＴＣＲＣκ、λリンカー間組入れ位置を示す模式図である。
【図5】実施例１の工程４におけるキメラＴＣＲファージリンカーの比較結果を示す図である。
【図6】実施例１工程５の１Ｇ４親和性成熟におけるクローニングしたファージのファージディスプレイおよび結合活性アッセイの結果を示す図である。
【図8】図８ａは、ＣＴＣＲのコンジャンクションドメイン構造を示す図である。黒色の矢は、構造から解析したコンジャンクションドメインの末端を示し、赤色の破線の矢は、コンジャンクションドメインとＦＧループとの間に形成された潜在的極性接点を示した。図８ｂは、ＥＴＣＲ（ＳＳＡＳ）のコンジャンクションドメイン構造を示す図である。黒色の矢は、ＣＴＣＲおよびＥＴＣＲの重複から解析したコンジャンクションドメインの末端を示した。
【図9】代表的ＣＴＣＲのモデル化構造を示す図である。可変ドメインおよび定常ドメイン結合インターフェースに含まれる残基は、灰色の網目に覆われている棒として示した。
【図10A】図１０Ａは、代表的ＣＴＣＲのＶβ－Ｃβ結合インターフェースの詳細な構造を示す図である。結合に含まれる残基は棒として示し、赤色の矢および黄色の破線は極性接点を示し、橙色の円は非極性接点を示した。
【図14】代表的ＥＴＣＲ１およびＣＴＣＲ１のＦＡＣＳ結果を示す図である。
【図15】試験した二重特異性ＥＴＣＲを示す略図である。抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端、抗体ＣλドメインのＣ末端、ＴＣＲ ＶαドメインのＮ末端、抗体ＣＨ１ドメインのＣ末端にそれぞれ挿入し、二重特異性ＥＴＣＲ１－Ｅ１．１、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．２、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．３およびＥＴＣＲ１－Ｅ１．４を生成した（図１５Ａ～Ｄ）。ＣＴＣＲでは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端に挿入し、ＣＴＣＲ１－Ｅ１．１を生成した（図１５Ｅ）。
【図16】二重特異性ＥＴＣＲ１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーン１～４：二重特異性ＥＴＣＲ１の上清、レーン５～８：対応する精製した二重特異性ＥＴＣＲ１。
【図18】７２ｈにおけるＡ３７５細胞に対するＴ細胞殺傷の再方向づけの用量依存的結果を示す図である。
【図19】ＥＴＣＲの型式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
詳細な説明
本発明を以下に詳細に記載するが、本発明では、それらは異なり得るため、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に制限されないことが理解されるべきである。本明細書において使用する用語法は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図せず、この本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるべきである。他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
本発明を以下に詳細に記載するが、本発明では、それらは異なり得るため、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に制限されないことが理解されるべきである。本明細書において使用する用語法は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図せず、この本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることも理解されるべきである。他に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【0042】
「単離」の用語は、本明細書において使用する場合、人工的手段により天然状態から得られる状態を指す。特定の「単離」物質または成分は、おそらくは、この天然環境が変化するか、物質が天然環境から単離されるか、またはこの両方のため、天然に存在し得る。例えば、特定の非単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の生動物体に天然に存在し、このような天然状態から単離された高純度の同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ぶ。「単離」の用語は、混合した人工または合成物質も単離物質の活性には影響しない他の不純物質も除外しない。
【0043】
「ベクター」の用語は、本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドを挿入可能な核酸媒体を指す。挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現がベクターによって可能となる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ぶ。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入またはトランスフェクションにより宿主細胞内で発現する遺伝物質エレメントを保有し得る。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、ファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージおよび動物ウイルスを含むが、これらに限定されない。ベクターとして使用可能な動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含むが、これらに限定されない。ベクターは、発現を調節するための複数のエレメントを含んでもよく、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない。加えて、ベクターは、複製起点を含み得る。
【0044】
「宿主細胞」の用語は、本明細書において使用する場合、タンパク質、タンパク質断片または目的のペプチドを生成するように改変可能な細胞系を指す。宿主細胞は、培養細胞、例えば、げっ歯類（ラット、マウス、モルモットまたはハムスター）に由来する哺乳動物培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、もしくはヒト組織に由来する哺乳動物培養細胞、またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞、ならびに遺伝子導入動物または培養組織に含まれる細胞を含むが、これらに限定されない。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代をも包含する。変異または環境的影響のいずれかが原因で継代において特定の修飾が生じ得るため、このような後代は、親細胞と同一ではない可能性を有するが、「宿主細胞」の用語の範囲内に、なお含む。
【0045】
「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」の用語は、本明細書において使用する場合、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度における変化の検出により、リアルタイムで生体分子特異的相互作用の解析が可能となる光学現象を指し、これを含む。さらなる記載については、実施例５ならびにＪｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１巻：１９～２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１巻：６２０～６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８巻：１２５～１３１；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８巻：２６８～２７７を参照されたい。
【0046】
「がん」の用語は、本明細書において使用する場合、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖または転移により媒介される固形腫瘍および非固形腫瘍、例えば、白血病のいずれか１つを指し、医学的症状を惹起する。
【0047】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｅｄ）」の用語は、症状を治療する状況で本明細書において使用する場合、ヒトまたは動物にかかわらず、一部の所望の治療作用、例えば、症状の増悪の阻害が達成される治療および療法に一般に関係し、増悪率の低下、増悪率の停止、症状の退縮、症状の改善および症状の治癒を含む。予防的手段（すなわち、予防法、防止策）としての治療をも含む。がんでは、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」は、腫瘍もしくは悪性細胞の成長、増殖もしくは転移の減衰もしくは遅延、またはこれらの一部の組合せを指し得る。腫瘍では、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、腫瘍の全部もしくは一部の除去、腫瘍の成長および転移の阻害もしくは遅延、腫瘍発症の予防もしくは遅延、またはこれらの一部の組合せを含む。
【0048】
「有効量」または「治療有効量」の用語は、本明細書において使用する場合、活性化合物もしくは物質、組成物の量、または活性化合物を含むための投与量に関係し、これは、所望の治療レジメンに従って投与する場合、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、一部の所望の治療作用をもたらすのに有効である。例えば、「有効量」は、標的抗原関連疾患または症状の治療と関連して使用する場合、この疾患または症状を治療するのに有効な量または濃度の抗体またはこの抗原結合部分を指す。
【0049】
「薬学的に許容される」の用語は、本明細書において使用する場合、媒体、希釈剤、賦形剤および／またはこの塩が、製剤中の他の成分と化学的および／または理学的に適合し、レシピエントと生理学的に適合することを意味する。
【0050】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」の用語は、対象および活性剤と薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、これは、当技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．ＧｅｎｎａｒｏＡＲ編、第１９版Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバントおよびイオン強度増強剤を含むが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、限定されないが、リン酸バッファーを含み、界面活性剤は、限定されないが、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０を含み、イオン強度増強剤は、限定されないが、塩化ナトリウムを含む。
【0051】
本明細書において使用する場合、「対象」の用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」の用語は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。他に述べる場合を除いて、「患者」または「対象」の用語は、互換的に使用される。
【0052】
次の実施例における実験方法は、他に特定しない限り、従来方法である。
【実施例】
【0053】
実施例１．ＴＣＲ可変ドメインの遺伝子を抗体の定常領域の遺伝子とライゲートし、ファージのｇＩＩＩ遺伝子とさらに会合させて、ファージの表面上に呈示され得るＴＣＲヘテロ二量体型式をスクリーニングする。
【0054】
工程１．２つの異なるＴＣＲ Ｖドメインの遺伝子：ＣＴＣＲ２およびＣＴＣＲ２を抗体定常領域の遺伝子とライゲートする
抗体の重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインまたは完全長のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび抗体の軽鎖定常領域Ｃκ、Ｃλを含む。特には、抗体定常ドメインにおける２つの追加の変異を設計、検査し、野生型と比較した。１）鎖間ジスルフィド結合変異：システインをセリンに（抗体の定常領域における鎖間ジスルフィド結合位置のＣをＳに変異させる場合、定常領域ＣＨ１は、κＧ１ｓ、κＧ１ｓ－逆と明示する）、２）Ｎグリコシル化変異：アスパラギンをグルタミンに。切断および変異位置は、図１に示す。ライゲーションにより、ＶＴＣＲＣＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＶＴＣＲＣκ、λ遺伝子産物（ＶＴＣＲは、ＶαおよびＶβを含む）が生じた。このような遺伝子産物をファージミドベクターｐｃｏｍ３ＸＸ－ＤＴに挿入し、ここでＶＴＣＲＣＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ ＶＴＣＲＣκ、λを、ｃ－Ｍｙｃ．６Ｈｉｓタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子とコンジュゲートさせ、ＶＴＣＲＣκ、λは、Ｆｌａｇタグを発現する。ファージは自己会合可能であるため、２つの発現したポリペプチドは、自然発生的に複合体形成し、機能性ヘテロ二量体としてファージ上に呈示される。対応するＣＴＣＲも同一のファージミドベクターに挿入し、ここでＶβＣβを、ｃ－Ｍｙｃ．６Ｈｉｓタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子とコンジュゲートさせ、ＶαＣαは、Ｆｌａｇタグを発現する。対応する１本鎖ＴＣＲは、Ｖα－（Ｇ４Ｓ）－Ｖβとして会合させ、６Ｈｉｓ．ｃ－Ｍｙｃタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子と融合したプラスミドベクターｐＦＬ２４９に挿入する。
抗体の重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインまたは完全長のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび抗体の軽鎖定常領域Ｃκ、Ｃλを含む。特には、抗体定常ドメインにおける２つの追加の変異を設計、検査し、野生型と比較した。１）鎖間ジスルフィド結合変異：システインをセリンに（抗体の定常領域における鎖間ジスルフィド結合位置のＣをＳに変異させる場合、定常領域ＣＨ１は、κＧ１ｓ、κＧ１ｓ－逆と明示する）、２）Ｎグリコシル化変異：アスパラギンをグルタミンに。切断および変異位置は、図１に示す。ライゲーションにより、ＶＴＣＲＣＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＶＴＣＲＣκ、λ遺伝子産物（ＶＴＣＲは、ＶαおよびＶβを含む）が生じた。このような遺伝子産物をファージミドベクターｐｃｏｍ３ＸＸ－ＤＴに挿入し、ここでＶＴＣＲＣＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ ＶＴＣＲＣκ、λを、ｃ－Ｍｙｃ．６Ｈｉｓタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子とコンジュゲートさせ、ＶＴＣＲＣκ、λは、Ｆｌａｇタグを発現する。ファージは自己会合可能であるため、２つの発現したポリペプチドは、自然発生的に複合体形成し、機能性ヘテロ二量体としてファージ上に呈示される。対応するＣＴＣＲも同一のファージミドベクターに挿入し、ここでＶβＣβを、ｃ－Ｍｙｃ．６Ｈｉｓタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子とコンジュゲートさせ、ＶαＣαは、Ｆｌａｇタグを発現する。対応する１本鎖ＴＣＲは、Ｖα－（Ｇ４Ｓ）－Ｖβとして会合させ、６Ｈｉｓ．ｃ－Ｍｙｃタグを発現するｇＩＩＩ遺伝子と融合したプラスミドベクターｐＦＬ２４９に挿入する。
【0055】
工程２．ファージ培養条件の最適化
種々のＴＣＲヘテロ二量体型式を呈示するファージをスクリーニングするために、クローンを２ＹＴ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１６ｇ／Ｌのトリプシン、５ｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含む、ｐＨ７．０）６００μｌに播種した。株を３７℃の振盪機においてＯＤ６００＝０．３～０．５に成長させ、７．５Ｅ９ｐｆｕのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、３７℃のインキュベーターにおいて４５分間さらにインキュベートした。細胞を４，０００ｇで１０分の遠心分離により沈殿させ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．０５のカナマイシン、５ｍＭのＭｇＳＯ４を含む２ＹＴ培地６００μｌに再懸濁して、２５℃の振盪機において３６時間培養した。ＴＣＲヘテロ二量体を呈示するファージ上清を、遠心分離により得ることができる。
種々のＴＣＲヘテロ二量体型式を呈示するファージをスクリーニングするために、クローンを２ＹＴ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１６ｇ／Ｌのトリプシン、５ｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含む、ｐＨ７．０）６００μｌに播種した。株を３７℃の振盪機においてＯＤ６００＝０．３～０．５に成長させ、７．５Ｅ９ｐｆｕのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、３７℃のインキュベーターにおいて４５分間さらにインキュベートした。細胞を４，０００ｇで１０分の遠心分離により沈殿させ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．０５のカナマイシン、５ｍＭのＭｇＳＯ４を含む２ＹＴ培地６００μｌに再懸濁して、２５℃の振盪機において３６時間培養した。ＴＣＲヘテロ二量体を呈示するファージ上清を、遠心分離により得ることができる。
【0056】
工程３．ファージＥＬＩＳＡによりＴＣＲヘテロ二量体のファージディスプレイおよび結合活性を検出する
ファージ上でのＴＣＲヘテロ二量体の呈示レベルをサンドウィッチＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡプレートは、抗Ｆｌａｇ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングしてＥＴＣＲまたはＣＴＣＲヘテロ二量体ファージを捕捉し、抗ｃ－ｍｙｃ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしてｓｃＴＣＲを捕捉した。ブロッキング溶液（３％のＢＳＡ）で１時間、プレートをブロッキングした。１：１で希釈したファージ上清を加え、室温で（２０～２５℃）２時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで、抗ファージＭ１３アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用して、ファージ表面上でのＴＣＲの呈示レベルを検出した。ファージ上でのＴＣＲヘテロ二量体の結合能をＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡプレートは、４μｇ／ｍｌのＳＡで一晩コーティングし、ブロッキング溶液（３％のＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。２μｇ／ｍｌのビオチン化ｐＭＨＣＩ単量体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで、１：１で希釈したファージ上清を加えてＲＴで１時間インキュベートし、次いで、抗ファージＭ１３アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用してＴＣＲ呈示ファージの結合活性を検出した。最終的に、６４種のＥＴＣＲ型式をスクリーニングし、６種の最適型式：λＧ１、λＧ１ｓ、κＧ１ｓ、λＧ１ｓ－逆、λＧ４ｓ－逆、λＡ１ｓ－逆が得られ、これらにより、図２に示すように、さらに良好な呈示レベルおよび結合能が明らかとなった。
ファージ上でのＴＣＲヘテロ二量体の呈示レベルをサンドウィッチＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡプレートは、抗Ｆｌａｇ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングしてＥＴＣＲまたはＣＴＣＲヘテロ二量体ファージを捕捉し、抗ｃ－ｍｙｃ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングしてｓｃＴＣＲを捕捉した。ブロッキング溶液（３％のＢＳＡ）で１時間、プレートをブロッキングした。１：１で希釈したファージ上清を加え、室温で（２０～２５℃）２時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで、抗ファージＭ１３アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用して、ファージ表面上でのＴＣＲの呈示レベルを検出した。ファージ上でのＴＣＲヘテロ二量体の結合能をＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡプレートは、４μｇ／ｍｌのＳＡで一晩コーティングし、ブロッキング溶液（３％のＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。２μｇ／ｍｌのビオチン化ｐＭＨＣＩ単量体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで、１：１で希釈したファージ上清を加えてＲＴで１時間インキュベートし、次いで、抗ファージＭ１３アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用してＴＣＲ呈示ファージの結合活性を検出した。最終的に、６４種のＥＴＣＲ型式をスクリーニングし、６種の最適型式：λＧ１、λＧ１ｓ、κＧ１ｓ、λＧ１ｓ－逆、λＧ４ｓ－逆、λＡ１ｓ－逆が得られ、これらにより、図２に示すように、さらに良好な呈示レベルおよび結合能が明らかとなった。
【0057】
図２Ａおよび図２Ｂは、異なるＴＣＲ型式におけるＴＣＲ１およびＴＣＲ２の呈示レベルをそれぞれ示す。４つのクローンをランダムに選択して、呈示された各ＴＣＲを試験した。結果は、すべてのＥＴＣＲ、ＣＴＣＲおよびｓｃＴＣＲがファージにより良好に呈示可能であることを示唆した。
【0058】
図２Ｃおよび図２Ｄは、異なるＴＣＲ型式におけるＴＣＲ１およびＴＣＲ２の結合能をそれぞれ示す。特異的ｐＭＨＣＩへの異なる結合が、異なるＴＣＲ型式により観察され、ここで、ｐＭＨＣＩへの非特異的結合は、観察されなかった。
【0059】
最適ＥＴＣＲ型式の呈示レベルおよび結合活性をさらに決定し、ファージ相対定量ＥＬＩＳＡによりＣＴＣＲおよびｓｃＴＣＲと比較した。初期ウェル内のファージの数は、１：３希釈で５Ｅ１０ｐｆｕであった。結果は、最適ＥＴＣＲ型式の呈示レベルが、ｓｃＴＣＲおよびｄｓＴＣＲよりも良好であることを示す。また、図３に示すように、発明者らのＴＣＲ λＧ４ｓ－逆の結合親和性は、ｄｓＴＣＲのそれよりも２～６倍良好である。ＥＴＣＲ型式をさらに最適化するために、その後、リンカードメインを設計した。
【0060】
工程４．キメラＴＣＲ構造のリンカー最適化
ＥＴＣＲの呈示レベルおよび結合活性を向上させるために、ＴＣＲ ＶαまたはＶβのＦＲ４部分を切断し、次いで、抗体の定常ドメインに直接接続した。結果は、ＴＣＲの安定性が影響し、結合活性が低下したことを示した。
ＥＴＣＲの呈示レベルおよび結合活性を向上させるために、ＴＣＲ ＶαまたはＶβのＦＲ４部分を切断し、次いで、抗体の定常ドメインに直接接続した。結果は、ＴＣＲの安定性が影響し、結合活性が低下したことを示した。
【0061】
その一方で、ＳＳ、ＳＳＡ、ＳＳＡＳ、ＳＳＡＳＳ、ＳＳＡＳＳＳを含む種々の長さのリンカーをＥＴＣＲ可変ドメインのＣ末端と抗体定常ドメインのＮ末端との間に挿入し、特定の位置は、図４に示す。４つのクローンをランダムに選択して、ファージの呈示レベルおよび結合活性を検出する。すべてのリンカーの中でも、ＳＳＡＳリンカーは、他のリンカーよりも優れた能力を示した（図５）。したがって、λＧ４ｓ－逆－ＳＳＡＳを、ＴＣＲ親和性成熟のための最終ＥＴＣＲ型式として選択した。
【0062】
工程５．ＴＣＲ親和性成熟ライブラリーの構築およびスクリーニング
天然ＴＣＲ １Ｇ４を、概念実証試験として親和性成熟のために選択した。１Ｇ４のＶαおよびＶβ遺伝子を合成し、λＧ４ｓ－逆－ＳＳＡＳ ＥＴＣＲ骨格を含む発明者らのファージミドベクターにクローニングし、１Ｇ４ ＥＴＣＲ（親和性成熟のための鋳型、野生型、ＷＴ）を得た。天然ＴＣＲの親和性は、ＥＬＩＳＡを使用しても結合シグナルが検出不可能であるほど極めて低い。その後、発明者らは、参考文献に従って１Ｇ４ ＥＴＣＲのＣＤＲ２およびＣＤＲ３上に部位特異的変異を作製し、図６に示すように、ＥＴＣＲヘテロ二量体型式を使用して、結合活性を検出し、ＴＣＲ親和性成熟の実現可能性を証明した。
天然ＴＣＲ １Ｇ４を、概念実証試験として親和性成熟のために選択した。１Ｇ４のＶαおよびＶβ遺伝子を合成し、λＧ４ｓ－逆－ＳＳＡＳ ＥＴＣＲ骨格を含む発明者らのファージミドベクターにクローニングし、１Ｇ４ ＥＴＣＲ（親和性成熟のための鋳型、野生型、ＷＴ）を得た。天然ＴＣＲの親和性は、ＥＬＩＳＡを使用しても結合シグナルが検出不可能であるほど極めて低い。その後、発明者らは、参考文献に従って１Ｇ４ ＥＴＣＲのＣＤＲ２およびＣＤＲ３上に部位特異的変異を作製し、図６に示すように、ＥＴＣＲヘテロ二量体型式を使用して、結合活性を検出し、ＴＣＲ親和性成熟の実現可能性を証明した。
【0063】
実施例２：ＴＣＲ可変ドメインを抗体定常ドメインと組み換えてＴＣＲ抗体キメラタンパク質（ＥＴＣＲ）を生成する
１．ＴＣＲ配列
ＣＴＣＲ１と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有するＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）特異的ＴＣＲ（配列番号３７～４０および６３～６６、Ｖαのアミノ酸配列は、配列番号３７として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号３９として示し、Ｃαのアミノ酸配列は、配列番号６３として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号６５として示す）、およびＣＴＣＲ２と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有するＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＧＰ１００（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）特異的ＴＣＲ（配列番号４１～４４および６３～６６、Ｖαのアミノ酸配列は、配列番号４１として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号４３として示し、Ｃαのアミノ酸配列は、配列番号６３として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号６５として示す）を選択して、概念実証試験を行った。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
１．ＴＣＲ配列
ＣＴＣＲ１と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有するＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）特異的ＴＣＲ（配列番号３７～４０および６３～６６、Ｖαのアミノ酸配列は、配列番号３７として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号３９として示し、Ｃαのアミノ酸配列は、配列番号６３として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号６５として示す）、およびＣＴＣＲ２と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有するＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＧＰ１００（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）特異的ＴＣＲ（配列番号４１～４４および６３～６６、Ｖαのアミノ酸配列は、配列番号４１として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号４３として示し、Ｃαのアミノ酸配列は、配列番号６３として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号６５として示す）を選択して、概念実証試験を行った。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
【0064】
ＣＴＣＲ３と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有する別のＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）特異的ＴＣＲ（配列番号４５～４８および６３～６６、Ｖαのアミノ酸配列は、配列番号４５として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号４７として示し、Ｃαのアミノ酸配列は、配列番号６３として示し、Ｖβのアミノ酸配列は、配列番号６５として示す）をも選択して、さらなる試験を行った。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
【0065】
配列番号３７、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＡＡ：
AQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYLGDSALVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDIRSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP
配列番号３８、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccct
配列番号３９、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
SAVISQKPSRDIKQRGTSLTIQCQVDKRLALMFWYRQQPGQSPTLIATAWTGGEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVGGSGAADTQYFGPGTRLTVL
配列番号４０、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
agcgccgtgatcagccagaagcctagcagagacatcaaacagaggggcacatctctgaccatccagtgccaagtggacaagagactcgctctgatgttctggtatagacagcagcccggacagtcccccacactgatcgccaccgcttggaccggcggagaagccacctacgagtccggcttcgtgatcgacaagttccccatctctagacccaatctgaccttttccacactgaccgtgtccaacatgagccccgaggactccagcatttatctgtgtagcgtgggaggcagcggagctgccgatacccagtacttcggccccggaaccagactgaccgtgctg
配列番号４１、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶαＡＡ：
AQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGSTPMQFGKGTRLSVIA
配列番号４２、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶαＤＮＡ：
gctcagcaaggcgaagaggatccccaagctctgagcattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgctcctacaagaccagcatcaacaacctccagtggtatagacagaacagcggcagaggactggtgcatctgattctgattagaagcaacgagagagagaagcactccggaaggctgagggtgacactggatacaagcaagaagagcagctctctgctgatcaccgcttccagagccgctgacaccgccagctacttctgcgccaccgacggcagcacccctatgcagttcggcaagggcacaagactcagcgtgatcgcc
配列番号４３、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶβＡＡ：
DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSWAQGDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSWGAPYEQYFGPGTRLTVT
配列番号４４、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶβＤＮＡ：
gacggcggcatcacccagtcccccaagtatctgtttagaaaggagggccagaatgtgacactgagctgcgagcagaatctgaaccacgacgccatgtactggtacagacaagaccccggccaaggactgaggctgatctattacagctgggcacaaggagacttccagaagggcgacatcgccgagggatacagcgtgtctagagagaagaaggagagctttcctctgaccgtgaccagcgcccagaagaatcccaccgccttctatctgtgtgccagcagctggggagctccctacgagcagtatttcggacccggcacaagactgaccgtgaca
配列番号４５、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＡＡ：
QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLITPWQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLLDGTYIPTFGRGTSLIVHP
配列番号４６、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
caagaagtgacacagatccctgccgctctgtctgtgcctgagggcgaaaacctggtgctgaactgcagcttcaccgacagcgccatctacaacctgcagtggttcagacaggaccccggcaagggactgacaagcctgctgctgattaccccttggcagagagagcagaccagcggcagactgaatgccagcctggataagtcctccggcagaagcaccctgtatatcgccgcttctcagcctggcgatagcgccacatatctgtgtgccgtcagacccctgctggacggcacatatatccccacctttggcagaggcaccagcctgatcgtgcaccct
配列番号４７、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVAIQTTDRGEVPNGYNVSRSTIEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYLGNTGELFFGEGSRLTVL
配列番号４８、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg
配列番号４９、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖＡＡ：
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号５０、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖＤＮＡ：
gccatccagatgacgcaaagtccatcaagtctgagcgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgcagagccagccaggacatcagaaattacctgaattggtaccagcagaagcctggcaaggctccaaagctcctcatatattatacatcgagattagaatctggtgttccaagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccctgaccatcagcagcctgcagcctgaggacttcgccacctactactgccagcagggcaataccctgccttggacatttggacagggtaccaaggtggaaattaaaggcggcggcggaagcggaggcggagggtcgggtggcggaggttcaggtggaggagggtctggtggaggctcagaggtacaacttgtggagtcaggcggtggactagtccaaccaggaggatctttacgcttatcttgtgccgccagcggctacagcttcaccggctacaccatgaattgggtgagacaggctcccggtaagggcctggagtgggtggccctgatcaatccttacaagggcgtgagcacctacaatcagaagttcaaggacagattcaccatcagcgtggacaagagcaagaataccgcctacctgcagatgaatagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagcggctactacggcgacagcgactggtactttgatgtttgggggcaaggtacacttgtcactgtaagctcc
配列番号５１、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿αＦＬ ＡＡ：
AQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYLGDSALVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDIRSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号５２、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿αＦＬ ＤＮＡ：
gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccctaacatccagaaccccgatcccgccgtgtaccagctgagggacagcaagtccagcgacaagtccgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgtcccagagcaaggatagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtcctcgacatgaggtccatggacttcaagagcaacagcgccgtggcttggagcaacaagagcgacttcgcttgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacacc
配列番号５３、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿βＦＬ ＡＡ：
SAVISQKPSRDIKQRGTSLTIQCQVDKRLALMFWYRQQPGQSPTLIATAWTGGEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVGGSGAADTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号５４、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿βＦＬ ＤＮＡ：
agcgccgtgatcagccagaagcctagcagagacatcaaacagaggggcacatctctgaccatccagtgccaagtggacaagagactcgctctgatgttctggtatagacagcagcccggacagtcccccacactgatcgccaccgcttggaccggcggagaagccacctacgagtccggcttcgtgatcgacaagttccccatctctagacccaatctgaccttttccacactgaccgtgtccaacatgagccccgaggactccagcatttatctgtgtagcgtgggaggcagcggagctgccgatacccagtacttcggccccggaaccagactgaccgtgctggaggatctgaagaacgtgtttccccccgaggtggccgtgtttgagcccagcgaggccgagattagccacacccagaaggccacactggtgtgtctggccaccggcttttaccccgaccacgtggaactgagctggtgggtgaacggcaaggaggtgcactccggcgtgtgtaccgatccccagcctctgaaggagcagcccgccctcaacgatagcagatacgctctgtcctccagactgagagtgagcgccacattctggcaagaccccagaaaccactttagatgccaagtgcagttctacggactgagcgaaaacgacgagtggacacaagatagagccaagcccgtgacccagatcgtgagcgccgaggcttggggcagagccgat
配列番号５５、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿αＦＬ ＡＡ：
AQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGSTPMQFGKGTRLSVIANIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号５６、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿αＦＬ ＤＮＡ：
gctcagcaaggcgaagaggatccccaagctctgagcattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgctcctacaagaccagcatcaacaacctccagtggtatagacagaacagcggcagaggactggtgcatctgattctgattagaagcaacgagagagagaagcactccggaaggctgagggtgacactggatacaagcaagaagagcagctctctgctgatcaccgcttccagagccgctgacaccgccagctacttctgcgccaccgacggcagcacccctatgcagttcggcaagggcacaagactcagcgtgatcgccaacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca
配列番号５７、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿βＦＬ ＡＡ：
DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSWAQGDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSWGAPYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号５８、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿βＦＬ ＤＮＡ：
gacggcggcatcacccagtcccccaagtatctgtttagaaaggagggccagaatgtgacactgagctgcgagcagaatctgaaccacgacgccatgtactggtacagacaagaccccggccaaggactgaggctgatctattacagctgggcAcaaggagacttccagaagggcgacatcgccgagggatacagcgtgtctagagagaagaaggagagctttcctctgaccgtgaccagcgcccagaagaatcccaccgccttctatctgtgtgccagcagctggggagctccctacgagcagtatttcggacccggcacaagactgaccgtgacagaggatctgaagaacgtcttccctcccgaggtggctgtgttcgagccctccgaggccgagatctcccacacccagaaggccaccctcgtgtgtctggctaccggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaagaggtgcatagcggcgtgtgtaccgacccccagcctctgaaagagcaacccgctctgaacgactccagatacgctctgtcctccagactgagggtctccgccacattttggcaagaccctagaaaccactttagatgtcaagtgcagttctacggactgagcgagaatgatgagtggacacaagacagagccaagcccgtgacacagattgtcagcgccgaggcttggggaagagctgat
配列番号５９、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＡＡ：
QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLITPWQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLLDGTYIPTFGRGTSLIVHP
配列番号６０、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
caagaagtgacacagatccctgccgctctgtctgtgcctgagggcgaaaacctggtgctgaactgcagcttcaccgacagcgccatctacaacctgcagtggttcagacaggaccccggcaagggactgacaagcctgctgctgattaccccttggcagagagagcagaccagcggcagactgaatgccagcctggataagtcctccggcagaagcaccctgtatatcgccgcttctcagcctggcgatagcgccacatatctgtgtgccgtcagacccctgctggacggcacatatatccccacctttggcagaggcaccagcctgatcgtgcaccct
配列番号６１、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVAIQTTDRGEVPNGYNVSRSTIEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYLGNTGELFFGEGSRLTVL
配列番号６２、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg
配列番号６３、ＣαＡＡ：
NIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号６４、ＣαＤＮＡ：
aacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca
配列番号６５、ＣβＡＡ：
EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号６６、ＣβＤＮＡ：
gaggatctgaagaacgtcttccctcccgaggtggctgtgttcgagccctccgaggccgagatctcccacacccagaaggccaccctcgtgtgtctggctaccggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaagaggtgcatagcggcgtgtgtaccgacccccagcctctgaaagagcaacccgctctgaacgactccagatacgctctgtcctccagactgagggtctccgccacattttggcaagaccctagaaaccactttagatgtcaagtgcagttctacggactgagcgagaatgatgagtggacacaagacagagccaagcccgtgacacagattgtcagcgccgaggcttggggaagagctgat
２．ＴＣＲ抗体キメラタンパク質（ＥＴＣＲ）の生成
ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２の定常ドメインＣαおよびＣβを、Ｆｃドメインと融合させたかまたは融合させないＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣλ／Ｃκにより置換して、さらなる解析のために多数のＥＴＣＲを生成した。
AQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYLGDSALVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDIRSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP
配列番号３８、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccct
配列番号３９、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
SAVISQKPSRDIKQRGTSLTIQCQVDKRLALMFWYRQQPGQSPTLIATAWTGGEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVGGSGAADTQYFGPGTRLTVL
配列番号４０、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
agcgccgtgatcagccagaagcctagcagagacatcaaacagaggggcacatctctgaccatccagtgccaagtggacaagagactcgctctgatgttctggtatagacagcagcccggacagtcccccacactgatcgccaccgcttggaccggcggagaagccacctacgagtccggcttcgtgatcgacaagttccccatctctagacccaatctgaccttttccacactgaccgtgtccaacatgagccccgaggactccagcatttatctgtgtagcgtgggaggcagcggagctgccgatacccagtacttcggccccggaaccagactgaccgtgctg
配列番号４１、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶαＡＡ：
AQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGSTPMQFGKGTRLSVIA
配列番号４２、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶαＤＮＡ：
gctcagcaaggcgaagaggatccccaagctctgagcattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgctcctacaagaccagcatcaacaacctccagtggtatagacagaacagcggcagaggactggtgcatctgattctgattagaagcaacgagagagagaagcactccggaaggctgagggtgacactggatacaagcaagaagagcagctctctgctgatcaccgcttccagagccgctgacaccgccagctacttctgcgccaccgacggcagcacccctatgcagttcggcaagggcacaagactcagcgtgatcgcc
配列番号４３、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶβＡＡ：
DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSWAQGDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSWGAPYEQYFGPGTRLTVT
配列番号４４、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿ＶβＤＮＡ：
gacggcggcatcacccagtcccccaagtatctgtttagaaaggagggccagaatgtgacactgagctgcgagcagaatctgaaccacgacgccatgtactggtacagacaagaccccggccaaggactgaggctgatctattacagctgggcacaaggagacttccagaagggcgacatcgccgagggatacagcgtgtctagagagaagaaggagagctttcctctgaccgtgaccagcgcccagaagaatcccaccgccttctatctgtgtgccagcagctggggagctccctacgagcagtatttcggacccggcacaagactgaccgtgaca
配列番号４５、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＡＡ：
QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLITPWQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLLDGTYIPTFGRGTSLIVHP
配列番号４６、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
caagaagtgacacagatccctgccgctctgtctgtgcctgagggcgaaaacctggtgctgaactgcagcttcaccgacagcgccatctacaacctgcagtggttcagacaggaccccggcaagggactgacaagcctgctgctgattaccccttggcagagagagcagaccagcggcagactgaatgccagcctggataagtcctccggcagaagcaccctgtatatcgccgcttctcagcctggcgatagcgccacatatctgtgtgccgtcagacccctgctggacggcacatatatccccacctttggcagaggcaccagcctgatcgtgcaccct
配列番号４７、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVAIQTTDRGEVPNGYNVSRSTIEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYLGNTGELFFGEGSRLTVL
配列番号４８、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg
配列番号４９、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖＡＡ：
AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
配列番号５０、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖＤＮＡ：
gccatccagatgacgcaaagtccatcaagtctgagcgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgcagagccagccaggacatcagaaattacctgaattggtaccagcagaagcctggcaaggctccaaagctcctcatatattatacatcgagattagaatctggtgttccaagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccctgaccatcagcagcctgcagcctgaggacttcgccacctactactgccagcagggcaataccctgccttggacatttggacagggtaccaaggtggaaattaaaggcggcggcggaagcggaggcggagggtcgggtggcggaggttcaggtggaggagggtctggtggaggctcagaggtacaacttgtggagtcaggcggtggactagtccaaccaggaggatctttacgcttatcttgtgccgccagcggctacagcttcaccggctacaccatgaattgggtgagacaggctcccggtaagggcctggagtgggtggccctgatcaatccttacaagggcgtgagcacctacaatcagaagttcaaggacagattcaccatcagcgtggacaagagcaagaataccgcctacctgcagatgaatagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagcggctactacggcgacagcgactggtactttgatgtttgggggcaaggtacacttgtcactgtaagctcc
配列番号５１、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿αＦＬ ＡＡ：
AQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYLGDSALVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDIRSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号５２、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿αＦＬ ＤＮＡ：
gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccctaacatccagaaccccgatcccgccgtgtaccagctgagggacagcaagtccagcgacaagtccgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgtcccagagcaaggatagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtcctcgacatgaggtccatggacttcaagagcaacagcgccgtggcttggagcaacaagagcgacttcgcttgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacacc
配列番号５３、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿βＦＬ ＡＡ：
SAVISQKPSRDIKQRGTSLTIQCQVDKRLALMFWYRQQPGQSPTLIATAWTGGEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVGGSGAADTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号５４、ＣＡｂ１－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿βＦＬ ＤＮＡ：
agcgccgtgatcagccagaagcctagcagagacatcaaacagaggggcacatctctgaccatccagtgccaagtggacaagagactcgctctgatgttctggtatagacagcagcccggacagtcccccacactgatcgccaccgcttggaccggcggagaagccacctacgagtccggcttcgtgatcgacaagttccccatctctagacccaatctgaccttttccacactgaccgtgtccaacatgagccccgaggactccagcatttatctgtgtagcgtgggaggcagcggagctgccgatacccagtacttcggccccggaaccagactgaccgtgctggaggatctgaagaacgtgtttccccccgaggtggccgtgtttgagcccagcgaggccgagattagccacacccagaaggccacactggtgtgtctggccaccggcttttaccccgaccacgtggaactgagctggtgggtgaacggcaaggaggtgcactccggcgtgtgtaccgatccccagcctctgaaggagcagcccgccctcaacgatagcagatacgctctgtcctccagactgagagtgagcgccacattctggcaagaccccagaaaccactttagatgccaagtgcagttctacggactgagcgaaaacgacgagtggacacaagatagagccaagcccgtgacccagatcgtgagcgccgaggcttggggcagagccgat
配列番号５５、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿αＦＬ ＡＡ：
AQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDGSTPMQFGKGTRLSVIANIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号５６、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿αＦＬ ＤＮＡ：
gctcagcaaggcgaagaggatccccaagctctgagcattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgctcctacaagaccagcatcaacaacctccagtggtatagacagaacagcggcagaggactggtgcatctgattctgattagaagcaacgagagagagaagcactccggaaggctgagggtgacactggatacaagcaagaagagcagctctctgctgatcaccgcttccagagccgctgacaccgccagctacttctgcgccaccgacggcagcacccctatgcagttcggcaagggcacaagactcagcgtgatcgccaacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca
配列番号５７、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿βＦＬ ＡＡ：
DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSWAQGDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSWGAPYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号５８、ＣＡｂ２－ＧＰ１００＿βＦＬ ＤＮＡ：
gacggcggcatcacccagtcccccaagtatctgtttagaaaggagggccagaatgtgacactgagctgcgagcagaatctgaaccacgacgccatgtactggtacagacaagaccccggccaaggactgaggctgatctattacagctgggcAcaaggagacttccagaagggcgacatcgccgagggatacagcgtgtctagagagaagaaggagagctttcctctgaccgtgaccagcgcccagaagaatcccaccgccttctatctgtgtgccagcagctggggagctccctacgagcagtatttcggacccggcacaagactgaccgtgacagaggatctgaagaacgtcttccctcccgaggtggctgtgttcgagccctccgaggccgagatctcccacacccagaaggccaccctcgtgtgtctggctaccggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaagaggtgcatagcggcgtgtgtaccgacccccagcctctgaaagagcaacccgctctgaacgactccagatacgctctgtcctccagactgagggtctccgccacattttggcaagaccctagaaaccactttagatgtcaagtgcagttctacggactgagcgagaatgatgagtggacacaagacagagccaagcccgtgacacagattgtcagcgccgaggcttggggaagagctgat
配列番号５９、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＡＡ：
QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLITPWQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPLLDGTYIPTFGRGTSLIVHP
配列番号６０、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶαＤＮＡ：
caagaagtgacacagatccctgccgctctgtctgtgcctgagggcgaaaacctggtgctgaactgcagcttcaccgacagcgccatctacaacctgcagtggttcagacaggaccccggcaagggactgacaagcctgctgctgattaccccttggcagagagagcagaccagcggcagactgaatgccagcctggataagtcctccggcagaagcaccctgtatatcgccgcttctcagcctggcgatagcgccacatatctgtgtgccgtcagacccctgctggacggcacatatatccccacctttggcagaggcaccagcctgatcgtgcaccct
配列番号６１、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＡＡ：
GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVAIQTTDRGEVPNGYNVSRSTIEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYLGNTGELFFGEGSRLTVL
配列番号６２、ＣＡｂ３－ＮＹ－ＥＳＯ－１＿ＶβＤＮＡ：
ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg
配列番号６３、ＣαＡＡ：
NIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT
配列番号６４、ＣαＤＮＡ：
aacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca
配列番号６５、ＣβＡＡ：
EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD
配列番号６６、ＣβＤＮＡ：
gaggatctgaagaacgtcttccctcccgaggtggctgtgttcgagccctccgaggccgagatctcccacacccagaaggccaccctcgtgtgtctggctaccggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaagaggtgcatagcggcgtgtgtaccgacccccagcctctgaaagagcaacccgctctgaacgactccagatacgctctgtcctccagactgagggtctccgccacattttggcaagaccctagaaaccactttagatgtcaagtgcagttctacggactgagcgagaatgatgagtggacacaagacagagccaagcccgtgacacagattgtcagcgccgaggcttggggaagagctgat
２．ＴＣＲ抗体キメラタンパク質（ＥＴＣＲ）の生成
ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２の定常ドメインＣαおよびＣβを、Ｆｃドメインと融合させたかまたは融合させないＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣλ／Ｃκにより置換して、さらなる解析のために多数のＥＴＣＲを生成した。
【0066】
配列番号１、改変Ｃλ１ＡＡ：
PTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号２、改変Ｃλ１ＤＮＡ：
cccacggtcactctgttcccgccctcctctgaggagctccaagccaacaaggccacactagtgtgtctgatcagtgacttctacccgggagctgtgacagtggcttggaaggcagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagacgaccaaaccctccaaacagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
配列番号３、改変Ｃλ２ＡＡ：
PTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号４、改変Ｃλ２ＤＮＡ：
ccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcttggaaagcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
配列番号５、改変Ｃλ３ＡＡ：
PSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号６、改変Ｃλ３ＤＮＡ：
ccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagttgcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggggtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacaaaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagttgcccctacggaatgttca
配列番号７、改変Ｃλ６ＡＡ：
PSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVKVAWKADGSPVNTGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPAECS
配列番号８、改変Ｃλ６ＤＮＡ：
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配列番号９、改変Ｃλ７ＡＡ：
PSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
配列番号１０、改変Ｃλ７ＤＮＡ：
ccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcgtaagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatggcagccccgtcaaggtgggagtggagaccaccaaaccctccaaacaaagcaacaacaagtatgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccgggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctgcagaatgctct
配列番号１１、改変ＩｇＧ１ＣＨ１ＡＡ：
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
配列番号１２、改変ＩｇＧ１ＣＨ１ＤＮＡ：
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配列番号１３、改変ＩｇＧ２ＣＨ１ＡＡ：
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配列番号１４、改変ＩｇＧ２ＣＨ１：
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配列番号１５、改変ＩｇＧ３ＣＨ１ＡＡ：
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配列番号１６、改変ＩｇＧ３ＣＨ１ＤＮＡ：
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配列番号１７、改変ＩｇＧ４ＣＨ１ＡＡ：
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配列番号１８、改変ＩｇＧ４ＣＨ１ＤＮＡ：
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３．材料および方法
３．１ 抗体およびＴＣＲ相同性のモデル化
抗体およびＴＣＲ構造モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用してアミノ酸配列に基づいて構築した。次いで、すべてのモデル化セグメントを会合させてαキメラ鎖およびβキメラ鎖構造モデルを構築した。全配列が最も類似するＴＣＲ構造の角度を採ることにより２つのモデル化鎖間の相対配向を予想した。すべての分子の可視化および解析作業は、ＰｙＭＯＬソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社）を使用して行った。
PTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号２、改変Ｃλ１ＤＮＡ：
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配列番号３、改変Ｃλ２ＡＡ：
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配列番号４、改変Ｃλ２ＤＮＡ：
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配列番号５、改変Ｃλ３ＡＡ：
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配列番号６、改変Ｃλ３ＤＮＡ：
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配列番号７、改変Ｃλ６ＡＡ：
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配列番号８、改変Ｃλ６ＤＮＡ：
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配列番号９、改変Ｃλ７ＡＡ：
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配列番号１０、改変Ｃλ７ＤＮＡ：
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配列番号１２、改変ＩｇＧ１ＣＨ１ＤＮＡ：
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配列番号１３、改変ＩｇＧ２ＣＨ１ＡＡ：
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配列番号１４、改変ＩｇＧ２ＣＨ１：
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配列番号１６、改変ＩｇＧ３ＣＨ１ＤＮＡ：
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配列番号１７、改変ＩｇＧ４ＣＨ１ＡＡ：
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配列番号１８、改変ＩｇＧ４ＣＨ１ＤＮＡ：
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３．材料および方法
３．１ 抗体およびＴＣＲ相同性のモデル化
抗体およびＴＣＲ構造モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用してアミノ酸配列に基づいて構築した。次いで、すべてのモデル化セグメントを会合させてαキメラ鎖およびβキメラ鎖構造モデルを構築した。全配列が最も類似するＴＣＲ構造の角度を採ることにより２つのモデル化鎖間の相対配向を予想した。すべての分子の可視化および解析作業は、ＰｙＭＯＬソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社）を使用して行った。
【0067】
３．２ ＤＮＡ操作
ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２遺伝子は、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．により合成された。ＣＨ１およびＣλ／Ｃκ遺伝子は、既存の社内ＤＮＡ鋳型からＰＣＲにより増幅した。Ｆｃドメインキメラと融合したＥＴＣＲ（ＩｇＧ様ＥＴＣＲ）では、軽鎖組換えの遺伝子産物は、ＣＭＶプロモーター、カッパシグナルペプチドおよびＷＰＲＥ制御因子を含む線状化ベクターに挿入し、一方、重鎖組換えの遺伝子産物は、ヒト対応定常領域ＣＨ２－ＣＨ３、ＣＭＶプロモーターおよびヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む線状化ベクターに挿入した。Ｆｃドメインキメラと融合していないＥＴＣＲ（Ｆａｂ様ＥＴＣＲ）では、軽鎖組換えおよび重鎖組換えのそれぞれをＣＭＶプロモーター、カッパシグナルペプチドおよびＷＰＲＥ制御因子を含む線状化ベクターにそれぞれ挿入した。プラスミドライゲーション、形質転換、ＤＮＡ調製は、標準的分子生物学プロトコールを使用して実施した。
ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２遺伝子は、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．により合成された。ＣＨ１およびＣλ／Ｃκ遺伝子は、既存の社内ＤＮＡ鋳型からＰＣＲにより増幅した。Ｆｃドメインキメラと融合したＥＴＣＲ（ＩｇＧ様ＥＴＣＲ）では、軽鎖組換えの遺伝子産物は、ＣＭＶプロモーター、カッパシグナルペプチドおよびＷＰＲＥ制御因子を含む線状化ベクターに挿入し、一方、重鎖組換えの遺伝子産物は、ヒト対応定常領域ＣＨ２－ＣＨ３、ＣＭＶプロモーターおよびヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む線状化ベクターに挿入した。Ｆｃドメインキメラと融合していないＥＴＣＲ（Ｆａｂ様ＥＴＣＲ）では、軽鎖組換えおよび重鎖組換えのそれぞれをＣＭＶプロモーター、カッパシグナルペプチドおよびＷＰＲＥ制御因子を含む線状化ベクターにそれぞれ挿入した。プラスミドライゲーション、形質転換、ＤＮＡ調製は、標準的分子生物学プロトコールを使用して実施した。
【0068】
３．３ タンパク質発現
重鎖および軽鎖の構築したベクターは、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に同時トランスフェクトした。同時トランスフェクションのための種々のベクターの比率は、予想したＥＴＣＲ構造ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにおいて示された初期発現結果に従って最適化した。トランスフェクション手順は、供給者により提供されたマニュアルに従った。簡潔には、プラスミド各２．５μｇおよび１３．６Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、５ｍｌ容量の２．９４×１０６個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後２０時間にエンハンサー１およびエンハンサー２を加えた。トランスフェクトした細胞は、オービタルシェーカー上で８％ＣＯ２、湿度８５％により３７℃で培養し、１２０ｒｐｍ（フラスコ）または２００ｒｐｍ（５０ｍｌチューブ）のいずれかで回転させた。トランスフェクション後５日に、上清を遠心分離により回収し、細胞断片を０．２２μｍの濾過により除去した。さらなる検査の前に、必要に応じて、処理した上清を濃縮する。
重鎖および軽鎖の構築したベクターは、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に同時トランスフェクトした。同時トランスフェクションのための種々のベクターの比率は、予想したＥＴＣＲ構造ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにおいて示された初期発現結果に従って最適化した。トランスフェクション手順は、供給者により提供されたマニュアルに従った。簡潔には、プラスミド各２．５μｇおよび１３．６Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、５ｍｌ容量の２．９４×１０６個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後２０時間にエンハンサー１およびエンハンサー２を加えた。トランスフェクトした細胞は、オービタルシェーカー上で８％ＣＯ２、湿度８５％により３７℃で培養し、１２０ｒｐｍ（フラスコ）または２００ｒｐｍ（５０ｍｌチューブ）のいずれかで回転させた。トランスフェクション後５日に、上清を遠心分離により回収し、細胞断片を０．２２μｍの濾過により除去した。さらなる検査の前に、必要に応じて、処理した上清を濃縮する。
【0069】
３．４ ＥＬＩＳＡによるＥＴＣＲ濃度の測定
ＩｇＧ様ＥＴＣＲでは、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングバッファー（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＣ抗体でコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、深型ウェル洗浄機（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ４０５）を使用してＰＢＳＴ洗浄バッファーによりプレートを１回洗浄した。次いで、プレートを１％のカゼインでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌの陽性対照（存在する場合）、陰性対照（存在する場合）および希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ラムダ抗体または抗カッパ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えて、１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）１００μｌを加えて、プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＶ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
ＩｇＧ様ＥＴＣＲでは、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングバッファー（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中１μｇ／ｍｌの抗ヒトＦＣ抗体でコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、深型ウェル洗浄機（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ４０５）を使用してＰＢＳＴ洗浄バッファーによりプレートを１回洗浄した。次いで、プレートを１％のカゼインでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌの陽性対照（存在する場合）、陰性対照（存在する場合）および希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ラムダ抗体または抗カッパ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えて、１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）１００μｌを加えて、プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＶ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【0070】
Ｆａｂ様ＥＴＣＲでは、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングバッファー（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中０．５μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体でコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、深型ウェル洗浄機（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ４０５）を使用してＰＢＳＴ洗浄バッファーによりプレートを１回洗浄した。次いで、プレートを１％のカゼインでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌの陽性対照（存在する場合）、陰性対照（存在する場合）および希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ラムダ抗体または抗カッパ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えて、１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）１００μｌを加えて、プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＶ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【0071】
３．５ ＥＬＩＳＡによる標的結合の測定
ＥＬＩＳＡプレートをコーティングバッファー（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、深型ウェル洗浄機（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ４０５）を使用してＰＢＳＴ洗浄バッファーによりプレートを１回洗浄した。次いで、プレートを１％のカゼインでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、２．５μｇ／ｍｌの抗原ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＧＰ１００（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）（ｐＨＬＡ、Ｋａｃｔｕｓ ｂｉｏ社により提供）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、陽性対照（存在する場合）、陰性対照（存在する場合）および希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ｃｍｙｃ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えて、１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）１００μｌを加えて、プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＶ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
ＥＬＩＳＡプレートをコーティングバッファー（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）中２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングした。４℃で一晩のインキュベーション後、深型ウェル洗浄機（ＢｉｏｔｅｋＥＬｘ４０５）を使用してＰＢＳＴ洗浄バッファーによりプレートを１回洗浄した。次いで、プレートを１％のカゼインでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、２．５μｇ／ｍｌの抗原ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＧＰ１００（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）（ｐＨＬＡ、Ｋａｃｔｕｓ ｂｉｏ社により提供）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、陽性対照（存在する場合）、陰性対照（存在する場合）および希釈した試料を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄して、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ｃｍｙｃ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで６回洗浄し、ＴＭＢ１００μｌを加えて、１０分間インキュベートし、次いで、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、１００μｌ／ウェル）１００μｌを加えて、プレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＶ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【0072】
４．結果
ＴＣＲが天然の膜タンパク質であるため、これらの可溶性型式への転移により、好ましい薬物様特性が常に生じるとは限らない。しかし、数十年前に報告されているように、人工ジスルフィド結合ＣαＳ４８－ＣβＴ５７を天然ＴＣＲ非共有結合Ｃα－Ｃβに導入することにより、可溶性ＴＣＲ型式の安定な増強が生じた（図７Ａ、米国特許第７６６６６０４号Ｂ２）。天然ＴＣＲとは対照的に、天然ジスルフィド結合は、抗体定常ドメインに存在した（図７Ｂ）。これは、キメラの安定性に寄与し得る。
ＴＣＲが天然の膜タンパク質であるため、これらの可溶性型式への転移により、好ましい薬物様特性が常に生じるとは限らない。しかし、数十年前に報告されているように、人工ジスルフィド結合ＣαＳ４８－ＣβＴ５７を天然ＴＣＲ非共有結合Ｃα－Ｃβに導入することにより、可溶性ＴＣＲ型式の安定な増強が生じた（図７Ａ、米国特許第７６６６６０４号Ｂ２）。天然ＴＣＲとは対照的に、天然ジスルフィド結合は、抗体定常ドメインに存在した（図７Ｂ）。これは、キメラの安定性に寄与し得る。
【0073】
発明者らは第１に、ＣαおよびＣβを置換するＣＨ１およびＣλ／Ｃκの能力を評価した。ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２可変ドメインのいずれかを、ＩｇＧ抗体由来の定常ドメインと組み換え、Ｆｃドメインに融合させて、ＩｇＧ様ＥＴＣＲを生成した。このようなＥＴＣＲの発現および結合を、ＥＬＩＳＡによりさらに決定した。表１および表２では、ＩｇＧ様ＥＴＣＲの構築、発現および結合結果を列挙し、回収した上清は、１０倍濃縮してＥＬＩＳＡ解析を行った。概して、構築物のほとんどが良好に発現したが、結合シグナルは相対的に低く、キメラＩｇＧ様ＥＴＣＲのＥＴＣＲ部分が、正しくフォールドまたは会合していない可能性を示す。キメラＴＣＲの能力がさらに増強されることが予想されるＦｃドメインによって、ＥＴＣＲ部分を安定化することが不可能であるように思われる。それにもかかわらず、結果を解析することにより、発明者らは、「逆」融合パターンが、「正」融合パターンよりも良好であり、ほとんどすべての検査試料では、ＣＨ１と融合したＶαおよびＣＬと融合したＶβによって、他よりも良好な結合能が生じることを見出した。
【0074】
【表1】
【0075】
【表2】
【0076】
さらに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ由来のさらなる定常ドメインも、ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２可変ドメインと組み換えて、大規模なスクリーニングのためにＦａｂ様ＥＴＣＲを生成した（これまでの結果に基づいて、さらなるスクリーニングおよび改変において、Ｆｃドメインは、ＥＴＣＲと融合させない）。このようなＥＴＣＲの発現および結合を、ＥＬＩＳＡによりさらに決定した。表３および表４では、Ｆａｂ様ＥＴＣＲの構築、発現および結合結果を列挙し、回収した上清は、１０倍濃縮してＥＬＩＳＡ解析を行った。概して、ＴＣＲ可変ドメインをＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ由来の定常ドメインと融合させた場合、低い発現レベルならびに結合能が観察された。
【0077】
このような結果に基づいて、さらなる改変では、「逆」パターンで融合したＩｇＧ ＣＨ１およびＣλ／Ｃκを含む定常ドメインを有するＦａｂ様ＥＴＣＲに焦点を当てる。
【0078】
【表3】
【0079】
【表4】
【0080】
実施例３：ＥＴＣＲのコンジャンクションドメインの設計および改変
一般には、ＴＣＲおよび抗体の両方における可変ドメインと定常ドメインとの間のコンジャンクションドメインは、これらの安定化および機能のために重要である。しかし、ＩｇＧおよびＴＣＲのリンカーは、いくらか異なる。したがって、種々の型および長さを有するリンカーは、各鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間に挿入した。種々のＥＴＣＲを生成して、これらの発現レベルおよび結合能について検査した。
一般には、ＴＣＲおよび抗体の両方における可変ドメインと定常ドメインとの間のコンジャンクションドメインは、これらの安定化および機能のために重要である。しかし、ＩｇＧおよびＴＣＲのリンカーは、いくらか異なる。したがって、種々の型および長さを有するリンカーは、各鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間に挿入した。種々のＥＴＣＲを生成して、これらの発現レベルおよび結合能について検査した。
【0081】
結果
第一に、種々の長さのセリンおよびアラニンを含む従来の可動性リンカーを、ＴＣＲ可変ドメインと抗体定常ドメインとの間にリンカーとして挿入した（ＴＣＲ Ｖα－ＣＨ１の融合は、配列番号１９～２４およびＴＣＲ Ｖβ－Ｃλ／Ｃκの融合は、配列番号２５～３０）。
第一に、種々の長さのセリンおよびアラニンを含む従来の可動性リンカーを、ＴＣＲ可変ドメインと抗体定常ドメインとの間にリンカーとして挿入した（ＴＣＲ Ｖα－ＣＨ１の融合は、配列番号１９～２４およびＴＣＲ Ｖβ－Ｃλ／Ｃκの融合は、配列番号２５～３０）。
【0082】
表５では、可変および定常ドメイン間に可動性リンカーを挿入したＦａｂ様ＥＴＣＲの例となる構築、発現および結合結果を列挙し、回収した上清は、１０倍濃縮してＥＬＩＳＡ解析を行った。ＳＳＡＳをリンカーとして含むコンジャンクションドメイン（α鎖は、配列番号１９およびβ鎖は、配列番号２５）は、検査したすべてのキメラ会合物において最高の発現レベルおよび結合シグナルを示し（表５）、これにより、わずかな可動性がドメイン間に導入されたが、可変ドメインおよび定常ドメインの立体障害は除去されず、本来のＴＣＲ機能は、完全には回復しなかったことを示す。
【0083】
配列番号１９、コンジャンクションドメイン１ＡＡ：ＳＳＡＳ
配列番号２０、コンジャンクションドメイン１ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａ
配列番号２１、コンジャンクションドメイン２ＡＡ：ＳＳＡＳＳ
配列番号２２、コンジャンクションドメイン２ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇ
配列番号２３、コンジャンクションドメイン３ＡＡ：ＳＳＡＳＳＳ
配列番号２４、コンジャンクションドメイン３ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃａ
配列番号２５、コンジャンクションドメイン４ＡＡ：ＳＳＡＳＫＡＡ
配列番号２６、コンジャンクションドメイン４ＤＮＡ：ａｇｔｔｃｇｇｃｃｔｃａａａｇｇｃｔｇｃｃ
配列番号２７、コンジャンクションドメイン５ＡＡ：ＳＳＡＳＳＫＡＡ
配列番号２８、コンジャンクションドメイン５ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇａａｇｇｃｔｇｃｃ
配列番号２９、コンジャンクションドメイン６ＡＡ：ＳＳＡＳＳＳＫＡＡ
配列番号３０、コンジャンクションドメイン６ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃａａａｇｇｃｔｇｃｃ
配列番号２０、コンジャンクションドメイン１ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａ
配列番号２１、コンジャンクションドメイン２ＡＡ：ＳＳＡＳＳ
配列番号２２、コンジャンクションドメイン２ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇ
配列番号２３、コンジャンクションドメイン３ＡＡ：ＳＳＡＳＳＳ
配列番号２４、コンジャンクションドメイン３ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃａ
配列番号２５、コンジャンクションドメイン４ＡＡ：ＳＳＡＳＫＡＡ
配列番号２６、コンジャンクションドメイン４ＤＮＡ：ａｇｔｔｃｇｇｃｃｔｃａａａｇｇｃｔｇｃｃ
配列番号２７、コンジャンクションドメイン５ＡＡ：ＳＳＡＳＳＫＡＡ
配列番号２８、コンジャンクションドメイン５ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇａａｇｇｃｔｇｃｃ
配列番号２９、コンジャンクションドメイン６ＡＡ：ＳＳＡＳＳＳＫＡＡ
配列番号３０、コンジャンクションドメイン６ＤＮＡ：ｔｃｇｔｃｇｇｃｔｔｃａｔｃｇｔｃａａａｇｇｃｔｇｃｃ
【0084】
【表5】
【0085】
次いで、発明者らは、構造アラインメントに基づいて、抗体およびＴＣＲの配列を注意深くアラインメントし、生殖系列配列において定義されたコンジャンクションが、ドメインと常に一致するとは限らないことを見出した。発明者らは、抗体およびＴＣＲコンジャンクションの重複構造上でのオーバーラップの仕方を確認し、ＴＣＲコンジャンクションから抗体定常ドメインのＮ末端（図８、黒色の矢として指示）を使用して潜在的置換を推定した。特には、抗体のそれとのＴＣＲ定常ドメインの構造のアラインメントによって、ＴＣＲベータ鎖のＦＧおよびＤＥループが、抗体定常ドメインの対応する領域よりも著しく長く、ＴＣＲコンジャンクションドメインとの強力な相互作用を形成していることが明らかとなった（図８Ａ、赤色の矢として指示）。本発明のキメラＥＴＣＲにおいて長いＦＧおよびＤＥループが存在しないため、不飽和の荷電アミノ酸を有すると思われる本来のＴＣＲコンジャンクションドメインにおける鍵となる位置は、合理的に変異させて安定性を増強させる必要を有する。
【0086】
このような概念に基づき、λＧ４－逆定常ドメインを例となる骨格として使用して、β鎖の２つのコンジャンクションドメイン（Ｌ１およびＬ２）（ＴＣＲ ＶβドメインとＣλとの間）を第一に設計して検査した（配列番号３３～３６、Ｌ１のアミノ酸配列は、配列番号３３として示し、Ｌ２のアミノ酸配列は、配列番号３５として示し、α鎖のコンジャンクションドメインは、やはり可動性リンカーであり、可動性リンカーのアミノ酸配列は、配列番号１９に示す）。表６では、可変および定常ドメイン間に設計したリンカーを挿入したＦａｂ様ＥＴＣＲの例となる構築、発現および結合結果を列挙し、回収した上清は、１０倍濃縮してＥＬＩＳＡ解析を行った。設計したリンカーを挿入したβ鎖のクローンでは、ＣＴＣＲ１およびＣＴＣＲ２可変ドメインの両方を使用するλＧ４－逆骨格と比較して、発現は同等に維持されたが、良好な結合シグナルを示し、β鎖における設計したリンカーＬ１およびＬ２の、コンジャンクションドメインとしての使用により、さらに良好な構造的互換が可能となり、さらなる天然ＴＣＲ様の会合が生じることを示した。したがって、可動性リンカーおよび設計したリンカーをα鎖およびβ鎖にそれぞれ挿入したλＧ４－逆を、さらなる改変のための例となる骨格として使用した。
【0087】
配列番号３１、コンジャンクションドメイン７ＡＡ：ＥＤＬＮＫＶＦＰ
配列番号３２、コンジャンクションドメイン７ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇａａｃａａｇｇｔｇｔｔｃｃｃａ
配列番号３３、コンジャンクションドメイン９ＡＡ：ＥＤＬＳＮＶＳＰ
配列番号３４、コンジャンクションドメイン９ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇｔｃｃａａｔｇｔｃａｇｔｃｃｃ
配列番号３５、コンジャンクションドメイン８ＡＡ：ＥＤＬＫＮＶＦＰ
配列番号３６、コンジャンクションドメイン８ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇａａａａａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａ
配列番号３２、コンジャンクションドメイン７ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇａａｃａａｇｇｔｇｔｔｃｃｃａ
配列番号３３、コンジャンクションドメイン９ＡＡ：ＥＤＬＳＮＶＳＰ
配列番号３４、コンジャンクションドメイン９ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇｔｃｃａａｔｇｔｃａｇｔｃｃｃ
配列番号３５、コンジャンクションドメイン８ＡＡ：ＥＤＬＫＮＶＦＰ
配列番号３６、コンジャンクションドメイン８ＤＮＡ：ｇａｇｇａｃｃｔｇａａａａａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａ
【0088】
【表6】
【0089】
実施例４：ＥＴＣＲのＶβ－ＣＬ結合インターフェースの設計および改変
天然ＴＣＲ構造を注意深く解析することにより、発明者らは、天然ＴＣＲの可変ドメインおよび定常ドメインの結合が通常、３つの別々の領域Ｖα－Ｃα、Ｖβ－ＣβおよびＶα－Ｃβ（図９）によりもたらされることを見出した。それらの中でも、Ｖβ－Ｃβにおける最も大型の結合領域は、高度に組織化されていて、いくつかのＨ結合および塩橋ならびに疎水性コアからなることが見出され、非常に強力な結合親和性を示した（図１０Ａ、極性接点は、赤色の矢および黄色の破線により示し、非極性接点は、橙色の円により示す）。次いで、発明者らは、キメラＥＴＣＲ構造を天然ＴＣＲに重ね、天然ＴＣＲの高度に組織化された相互作用が、Ｃβを抗体定常ドメインＣλに置換することにより完全に破壊されていることをさらに認めた（図１０Ｂ）。重複モデルを解析することにより、ＶβとＣλとの間の結合に寄与し得る、Ｃλにおける鍵となる位置を決定し、変異原をさらに設計して検査した。例となる設計および変異を以下に列挙する。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
天然ＴＣＲ構造を注意深く解析することにより、発明者らは、天然ＴＣＲの可変ドメインおよび定常ドメインの結合が通常、３つの別々の領域Ｖα－Ｃα、Ｖβ－ＣβおよびＶα－Ｃβ（図９）によりもたらされることを見出した。それらの中でも、Ｖβ－Ｃβにおける最も大型の結合領域は、高度に組織化されていて、いくつかのＨ結合および塩橋ならびに疎水性コアからなることが見出され、非常に強力な結合親和性を示した（図１０Ａ、極性接点は、赤色の矢および黄色の破線により示し、非極性接点は、橙色の円により示す）。次いで、発明者らは、キメラＥＴＣＲ構造を天然ＴＣＲに重ね、天然ＴＣＲの高度に組織化された相互作用が、Ｃβを抗体定常ドメインＣλに置換することにより完全に破壊されていることをさらに認めた（図１０Ｂ）。重複モデルを解析することにより、ＶβとＣλとの間の結合に寄与し得る、Ｃλにおける鍵となる位置を決定し、変異原をさらに設計して検査した。例となる設計および変異を以下に列挙する。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
【0090】
【表7】
【0091】
材料および方法
タンパク質精製
６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｅｘｃｅｌクロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をカラムに備えたＡＫＴＡｐｕｒｅＭ２５により精製した。洗浄バッファーＡ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２。洗浄バッファーＢ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．２。精製プロセスは、概して次のように記載する。カラムを洗浄バッファーＡにより１ｍｌ／分で平衡化する。試料を、試料入口を使用して１ｍｌ／分で適用する。カラムを洗浄バッファーＡにより１ｍｌ／分で洗浄する。カラムを２％、４％、１０％、１００％の洗浄バッファーＢで洗浄する。洗浄プロセス中に画分を１．０ｍｌ／バイアルで採取する。
タンパク質精製
６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｅｘｃｅｌクロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をカラムに備えたＡＫＴＡｐｕｒｅＭ２５により精製した。洗浄バッファーＡ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２。洗浄バッファーＢ：５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．２。精製プロセスは、概して次のように記載する。カラムを洗浄バッファーＡにより１ｍｌ／分で平衡化する。試料を、試料入口を使用して１ｍｌ／分で適用する。カラムを洗浄バッファーＡにより１ｍｌ／分で洗浄する。カラムを２％、４％、１０％、１００％の洗浄バッファーＢで洗浄する。洗浄プロセス中に画分を１．０ｍｌ／バイアルで採取する。
【0092】
精製前タンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５／２００ｉｎｃｒｅａｓｅクロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）をカラムに備えたＡＫＴＡｐｕｒｅＭ２５により、さらに精製することができる。洗浄バッファー：１３７ｍＭのリン酸ナトリウム、２．６８ｍＭのＮａＣｌ、１．７６ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４。精製プロセスは、概して次のように記載する。タンパク質を適切な充填容量に限外濾過して濃縮する。カラムを蒸留水で洗浄する。カラムを洗浄バッファーで平衡化する。試料をカラム上に適用する。０．５ｍｌ／分で流出物中に物質が出現しなくなるまでカラムを洗浄バッファーで溶出する。精製したタンパク質は、後の使用のために－８０℃で保存する。
【0093】
精製タンパク質の定量
Ａ２８０を使用して、精製タンパク質の予備的特性決定を行った。２８０ｎｍにおけるタンパク質溶液の吸収値をＮａｎｏｄｒｏｐ２０００により、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２をブランクバッファーとして使用して測定した。タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２８０／消衰係数。
Ａ２８０を使用して、精製タンパク質の予備的特性決定を行った。２８０ｎｍにおけるタンパク質溶液の吸収値をＮａｎｏｄｒｏｐ２０００により、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２をブランクバッファーとして使用して測定した。タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ２８０／消衰係数。
【0094】
また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを特性決定に使用した。ランニング電圧は、３５分間２００Ｖで一定とし、電気泳動後にクーマシーブルーを使用して染色した。
【0095】
試料の純度は、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィーを使用して最終的に決定した。ＴＳＫ ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣシステムを使用した。洗浄バッファー：５０ｍＭのリン酸ナトリウム。簡潔なプロセスは、概して次のように記載する。カラムを５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化する。試料をカラム上に適用し、２８０ｎｍのＵＶ吸光度を監視した。純度は、クロマトグラムを統合することにより推定した。
【0096】
結果
可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３３）をα鎖およびβ鎖にそれぞれ挿入したλＧ４－逆を、さらなる改変のための例となる骨格として使用した。構造解析に基づいて、抗体ＣλにおけるＧ３０、Ａ３１およびＴ３３を含む鍵となる位置を同定してＧ３０Ｄ、Ａ３１ＨおよびＴ３３Ｅにそれぞれ変異させ、ＴＣＲ様相互作用を生成可能とした。
可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３３）をα鎖およびβ鎖にそれぞれ挿入したλＧ４－逆を、さらなる改変のための例となる骨格として使用した。構造解析に基づいて、抗体ＣλにおけるＧ３０、Ａ３１およびＴ３３を含む鍵となる位置を同定してＧ３０Ｄ、Ａ３１ＨおよびＴ３３Ｅにそれぞれ変異させ、ＴＣＲ様相互作用を生成可能とした。
【0097】
単一の変異だけでなく組合せ的変異を生成、発現、精製および特性決定した。図１１Ａは、例となる変異原の上清の電気泳動結果を示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって明瞭なバンドを見ることができ、このような変異によりキメラＥＴＣＲ１の発現が著しく増強されたことを示唆した。また、さらなる結合ＥＬＩＳＡ検査によって天然ＴＣＲ ＣＴＣＲ１に匹敵する結合能が明らかとなり（図１１Ｂ、異なる検出タグによって僅差が生じ得る）、Ｇ３０Ｄ－Ｖβ１２３Ｒ、Ａ３１Ｈ－Ｖβ１２５ＴおよびＴ３３Ｅ－Ｖβ１０Ｒの間で合理的変異原を介して再構築された相互作用により、全ＥＴＣＲ１構造が強力に安定化されることを示唆した。このような変異によりＥＴＣＲ１は良好に発現および機能したが、同一の変異原を有するＥＴＣＲ２では、可変性が観察された。
【0098】
β鎖の互換性をさらに向上させるために、ＥＴＣＲ１およびＥＴＣＲ２の両結合インターフェースを再び重ねて注意深く解析した。構造解析により、Ｖ－Ｃ結合インターフェースに位置するＴＣＲ可変ドメインのフレームワーク１領域（ＦＲ１）が、ＥＴＣＲ１とＥＴＣＲ２とでは著しく異なることが明らかとなり、上述の可変性に対する（図１２Ａ、この差異は赤色の矢により示す）説明がもたらされた。可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３３）をα鎖およびβ鎖型式に挿入したλＧ４－逆ならびにｂＭ１設計に基づいて、ＣＴＣＲ２ＦＲ１の構造解析に従って選択された位置を、ＥＴＣＲ１ＦＲ１の対応するアミノ酸に個別に置換してＥＴＣＲ２の互換性をさらに向上させ、結果として、ＥＴＣＲ２可変βドメイン（Ｖβ）のＲ１３の１つの位置を同定した。図１２Ｂでは、Ｒ１３変異原の上清の例となる電気泳動結果を示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって明瞭なバンドを見ることができ、ＦＲ１変異体によって、キメラＥＴＣＲ２の発現がｂＭ１と比較して著しく増強されることを示唆した。また、さらなるＱ－ＥＬＩＳＡ検査によって、Ｒ１３Ｋ／Ｔ変異を有するＥＴＣＲ２－ｂＭ１の発現レベルの向上が、親ＥＴＣＲ２－ｂＭ１と比較して明らかとなり（９５７／７５５ｎＭ対２０８ｎＭ）、ＶβにおけるＲ１３変異とともにＣλにおける変異とにより、全ＥＴＣＲ２構造が強力に安定化されることを示唆した。
【0099】
実施例５：ＥＴＣＲのＳＰＲ解析
次いで、ＥＴＣＲの詳細な結合能を、ＳＰＲ技術を使用して決定した。
次いで、ＥＴＣＲの詳細な結合能を、ＳＰＲ技術を使用して決定した。
【0100】
方法
ＥＴＣＲおよびＭＨＣ－ペプチド（ｐＭＨＣ）抗原の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（またはＢｉｏｃｏｒｅ８Ｋ）を使用して検出した。一般的プロセスは、次のように記載する。ｐＭＨＣ抗原をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ社）上に固定化した。段階濃度の解析物およびランニングバッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を１２０秒の結合相および２４００秒の解離相の間、流量３０μＬ／分でチップに整然と注射した。各サイクル後、センサーチップ表面を１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）により完全に再生した。捕捉リガンドを有しない表面チャネルＦｃ１を、参照サブトラクションのための対照表面として使用した。各相互作用の最終データは、参照Ｆｃ１およびバッファーチャネルデータから差し引いた。分子量５０．５ｋＤａを使用して解析物のモル濃度を算出し、実験データをＢｉａｃｏｒｅ８Ｋによる評価によって適合させた。
ＥＴＣＲおよびＭＨＣ－ペプチド（ｐＭＨＣ）抗原の結合親和性をＢｉａｃｏｒｅＴ２００（またはＢｉｏｃｏｒｅ８Ｋ）を使用して検出した。一般的プロセスは、次のように記載する。ｐＭＨＣ抗原をＣＭ５センサーチップ（ＧＥ社）上に固定化した。段階濃度の解析物およびランニングバッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を１２０秒の結合相および２４００秒の解離相の間、流量３０μＬ／分でチップに整然と注射した。各サイクル後、センサーチップ表面を１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）により完全に再生した。捕捉リガンドを有しない表面チャネルＦｃ１を、参照サブトラクションのための対照表面として使用した。各相互作用の最終データは、参照Ｆｃ１およびバッファーチャネルデータから差し引いた。分子量５０．５ｋＤａを使用して解析物のモル濃度を算出し、実験データをＢｉａｃｏｒｅ８Ｋによる評価によって適合させた。
【0101】
結果
図１３では、ＥＴＣＲおよびＣＴＣＲのセンサーグラムを示し、概して、このセンサーグラムにより、非常に類似する結合特性が観察された。詳細には、表１３および表８～９では、例となるＥＴＣＲ１およびＥＴＣＲ２のＳＰＲ結果を列挙した。キメラＥＴＣＲおよびＣＴＣＲは、定性的に類似の結合能を有した。特には、ＥＴＣＲは、ＣＴＣＲよりもさらに良好なＫｏｎを示し、これは、ＣＴＣＲと比較して安定で互換性の抗体定常ドメインから利益を得得るものである。
図１３では、ＥＴＣＲおよびＣＴＣＲのセンサーグラムを示し、概して、このセンサーグラムにより、非常に類似する結合特性が観察された。詳細には、表１３および表８～９では、例となるＥＴＣＲ１およびＥＴＣＲ２のＳＰＲ結果を列挙した。キメラＥＴＣＲおよびＣＴＣＲは、定性的に類似の結合能を有した。特には、ＥＴＣＲは、ＣＴＣＲよりもさらに良好なＫｏｎを示し、これは、ＣＴＣＲと比較して安定で互換性の抗体定常ドメインから利益を得得るものである。
【0102】
【表8】
【0103】
【表9】
【0104】
実施例６：ＥＴＣＲのＦＡＣＳ解析
次いで、ＥＴＣＲの結合能を腫瘍細胞株に対してＦＡＣＳ技術を使用して評価した。
次いで、ＥＴＣＲの結合能を腫瘍細胞株に対してＦＡＣＳ技術を使用して評価した。
【0105】
方法
設計したＥＴＣＲの結合能を、Ａ３７５腫瘍細胞株を使用して評価した（Ａ３７５は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１およびＮＹ－ＥＳＯ－１二重陽性細胞株である）。細胞株を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地中に維持した。
設計したＥＴＣＲの結合能を、Ａ３７５腫瘍細胞株を使用して評価した（Ａ３７５は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１およびＮＹ－ＥＳＯ－１二重陽性細胞株である）。細胞株を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地中に維持した。
【0106】
１ウェルあたり１０５個の細胞の一定分量を採取し、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄した後、９６ウェルの丸底プレート内の段階希釈したＥＴＣＲにより４℃で１時間インキュベートした。１％のＢＳＡで３回洗浄後、プレートをＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトｃ－ｍｙｃ抗体により４℃で３０分間さらにインキュベートした。プレートを再び３回洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによりＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して解析し、関連する蛍光強度を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して定量した。４パラメーター非線形回帰分析を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）によりＥＣ５０値を得た。
【0107】
結果
図１４では、例となるＥＴＣＲ１のＦＡＣＳ結果を示す。キメラＥＴＣＲ１－ｂＭ１およびＣＴＣＲ１は、定性的に類似の結合特性を有した。それにもかかわらず、ＥＴＣＲ１－ｂＭ２は、ＣＴＣＲ１およびＥＴＣＲ１－ｂＭ１よりも著しく良好な結合特性を有し、これは、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲでは示されなかった。発明者らは、Ｇ３０Ｄ－Ｖβ１２３Ｒ、Ａ３１Ｈ－Ｖβ１２５ＴおよびＴ３３Ｅ－Ｖβ１０Ｒの包括的相互作用の微妙な構造的差異が、Ｔ３３Ｅ－Ｖβ１０Ｒの単一相互作用と比較して、低抗原密度（Ａ３７５細胞１細胞あたり抗原１０～５０コピー）の条件下で際立ち得ると仮定する。
図１４では、例となるＥＴＣＲ１のＦＡＣＳ結果を示す。キメラＥＴＣＲ１－ｂＭ１およびＣＴＣＲ１は、定性的に類似の結合特性を有した。それにもかかわらず、ＥＴＣＲ１－ｂＭ２は、ＣＴＣＲ１およびＥＴＣＲ１－ｂＭ１よりも著しく良好な結合特性を有し、これは、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲでは示されなかった。発明者らは、Ｇ３０Ｄ－Ｖβ１２３Ｒ、Ａ３１Ｈ－Ｖβ１２５ＴおよびＴ３３Ｅ－Ｖβ１０Ｒの包括的相互作用の微妙な構造的差異が、Ｔ３３Ｅ－Ｖβ１０Ｒの単一相互作用と比較して、低抗原密度（Ａ３７５細胞１細胞あたり抗原１０～５０コピー）の条件下で際立ち得ると仮定する。
【0108】
実施例７：ＥＴＣＲのＶβフレームワークドメインの設計および改変
本発明のキメラ型式の互換性をさらに検査するために、発明者らは、本発明の改変抗体定常ドメインおよびＴＣＲ可変ドメインのＦＲ１に導入した変異を、異なるＴＣＲ生殖系列に融合させたが、これまでに１Ｇ４として報告された一生殖系列対に関しては、安定なＥＴＣＲを生成することができなかった。発明者らは、定常ドメインならびに結合インターフェースを除いて、ＴＣＲの可変ドメインも、ＥＴＣＲの安定性に対する影響を有し得ると仮定する。したがって、次いで、さらに良好な安定性のために、ＶβのＦＲ領域を包括的に設計した。
本発明のキメラ型式の互換性をさらに検査するために、発明者らは、本発明の改変抗体定常ドメインおよびＴＣＲ可変ドメインのＦＲ１に導入した変異を、異なるＴＣＲ生殖系列に融合させたが、これまでに１Ｇ４として報告された一生殖系列対に関しては、安定なＥＴＣＲを生成することができなかった。発明者らは、定常ドメインならびに結合インターフェースを除いて、ＴＣＲの可変ドメインも、ＥＴＣＲの安定性に対する影響を有し得ると仮定する。したがって、次いで、さらに良好な安定性のために、ＶβのＦＲ領域を包括的に設計した。
【0109】
ＴＣＲ配列
ＣＴＣＲ３と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有する別のＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）特異的ＴＣＲ（配列番号４５～４８）を選択して試験を行った。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
ＣＴＣＲ３と名付けられた、ＣαＳ４８－ＣβＴ５７間に非天然ジスルフィド結合を有する別のＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）特異的ＴＣＲ（配列番号４５～４８）を選択して試験を行った。ＩＭＧＴナンバリング規定を、すべてのＴＣＲ可変ドメインに使用した。
【0110】
材料および方法
抗体およびＴＣＲ相同性モデル化
抗体およびＴＣＲ構造モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用してアミノ酸配列に基づいて構築した。次いで、すべてのモデル化セグメントを組み合わせてαキメラ鎖およびβキメラ鎖構造モデルを構築した。全配列が最も類似するＴＣＲ構造の角度を採ることにより２つのモデル化鎖間の相対配向を予想した。すべての分子の可視化および解析作業は、ＰｙＭＯＬソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社）を使用して行った。
抗体およびＴＣＲ相同性モデル化
抗体およびＴＣＲ構造モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲを使用してアミノ酸配列に基づいて構築した。次いで、すべてのモデル化セグメントを組み合わせてαキメラ鎖およびβキメラ鎖構造モデルを構築した。全配列が最も類似するＴＣＲ構造の角度を採ることにより２つのモデル化鎖間の相対配向を予想した。すべての分子の可視化および解析作業は、ＰｙＭＯＬソフトウェア（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社）を使用して行った。
【0111】
結果
第一に、ＣＴＣＲ３の可変ドメインを増幅して、ｂＭ２設計を含む改変抗体定常ドメインに融合させた（可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３５）をα鎖およびβ鎖に挿入したλＧ４－逆）。しかし、生じたＥＴＣＲ－ｂＭ２は、およそ５０ｎＭしか発現せず、精製不可能であった。ＴＣＲのＶβドメインのさらなる安定化によって、哺乳動物細胞において可溶性ＴＣＲを発現させる場合のＴＣＲ発現、安定性および会合に利益をもたらすかどうかを調べるために、発明者らは、分子モデル化シミュレーションを使用して、Ｖβドメインが安定化する変異を同定した。発明者らは、ＶβドメインのＦＲ領域のすべての残基の位置にわたってスキャンし、ＦｏｌｄＸを使用して、すべての潜在的点変異（システインを除く）をモデル化し、このような変異のエネルギーを算出した。このようなエネルギーデータを解析して順位付けすることにより、理論上１５００種の変異から１８０種の変異を、さらなる実験的確認のために選択した。最終的には、それぞれに発現レベルを著しく向上させることが可能な変異、Ｍ１９Ｙ（ｂＭ４１）、Ａ２４Ｋ（ｂＭ４２）、Ａ２４Ｒ（ｂＭ４３）、Ｍ４８Ｆ（ｂＭ３９）、Ｈ５４Ｙ（ｂＭ４４）、Ｈ５４Ｗ（ｂＭ４５）、Ｈ５４Ａ（ｂＭ４０）、Ｎ７７Ｅ（ｂＭ４６）、Ｒ９０Ｔ（ｂＭ３７）、Ｒ９０Ｖ（ｂＭ４７）、Ｌ９１Ｉ（ｂＭ３８）が確認された。次いで、安定化する変異を、２～４つの変異を内包する種々のバリアントに組み合わせた。すべての組合せの中でも、Ｒ９０Ｔ－Ｌ９１Ｉ（ｂＭ３７－ｂＭ３８）では、発現レベルが最も高くなり、１６１２ｎＭに達した。表１０では、例となるＥＴＣＲ３のＳＰＲ結果を列挙した。キメラＥＴＣＲおよびＣＴＣＲは、定性的に類似の結合能を有し、ＴＣＲ可変ドメインにおける変異もＥＴＣＲの安定化に寄与することを示した。
第一に、ＣＴＣＲ３の可変ドメインを増幅して、ｂＭ２設計を含む改変抗体定常ドメインに融合させた（可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３５）をα鎖およびβ鎖に挿入したλＧ４－逆）。しかし、生じたＥＴＣＲ－ｂＭ２は、およそ５０ｎＭしか発現せず、精製不可能であった。ＴＣＲのＶβドメインのさらなる安定化によって、哺乳動物細胞において可溶性ＴＣＲを発現させる場合のＴＣＲ発現、安定性および会合に利益をもたらすかどうかを調べるために、発明者らは、分子モデル化シミュレーションを使用して、Ｖβドメインが安定化する変異を同定した。発明者らは、ＶβドメインのＦＲ領域のすべての残基の位置にわたってスキャンし、ＦｏｌｄＸを使用して、すべての潜在的点変異（システインを除く）をモデル化し、このような変異のエネルギーを算出した。このようなエネルギーデータを解析して順位付けすることにより、理論上１５００種の変異から１８０種の変異を、さらなる実験的確認のために選択した。最終的には、それぞれに発現レベルを著しく向上させることが可能な変異、Ｍ１９Ｙ（ｂＭ４１）、Ａ２４Ｋ（ｂＭ４２）、Ａ２４Ｒ（ｂＭ４３）、Ｍ４８Ｆ（ｂＭ３９）、Ｈ５４Ｙ（ｂＭ４４）、Ｈ５４Ｗ（ｂＭ４５）、Ｈ５４Ａ（ｂＭ４０）、Ｎ７７Ｅ（ｂＭ４６）、Ｒ９０Ｔ（ｂＭ３７）、Ｒ９０Ｖ（ｂＭ４７）、Ｌ９１Ｉ（ｂＭ３８）が確認された。次いで、安定化する変異を、２～４つの変異を内包する種々のバリアントに組み合わせた。すべての組合せの中でも、Ｒ９０Ｔ－Ｌ９１Ｉ（ｂＭ３７－ｂＭ３８）では、発現レベルが最も高くなり、１６１２ｎＭに達した。表１０では、例となるＥＴＣＲ３のＳＰＲ結果を列挙した。キメラＥＴＣＲおよびＣＴＣＲは、定性的に類似の結合能を有し、ＴＣＲ可変ドメインにおける変異もＥＴＣＲの安定化に寄与することを示した。
【0112】
【表10】
【0113】
実施例８：二重特異性ＥＴＣＲの設計および改変
安定に発現するＥＴＣＲを良好に生成し、キメラ型式が天然リガンドに結合可能であることを確認した後、発明者らは続けて、二重特異性型式を構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能を検査した。可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３３）をα鎖およびβ鎖にそれぞれ挿入したλＧ４－逆ならびにｂＭ１設計をＥＴＣＲ１型式として使用した。
安定に発現するＥＴＣＲを良好に生成し、キメラ型式が天然リガンドに結合可能であることを確認した後、発明者らは続けて、二重特異性型式を構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能を検査した。可動性リンカーＳＳＡＳ（配列番号１９）および設計したリンカーＬ１（配列番号３３）をα鎖およびβ鎖にそれぞれ挿入したλＧ４－逆ならびにｂＭ１設計をＥＴＣＲ１型式として使用した。
【0114】
方法
ＤＮＡ操作およびプラスミド構築
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体（配列番号４９～５０）遺伝子は、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．により合成された。抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端、抗体ＣλドメインのＣ末端、ＴＣＲ ＶαドメインのＮ末端、抗体ＣＨ１ドメインのＣ末端にそれぞれ挿入し、二重特異性ＥＴＣＲ１－Ｅ１．１、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．２、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．３およびＥＴＣＲ１－Ｅ１．４を生成した（図１５Ａ～Ｄ）。ＣＴＣＲでは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端に挿入し、ＣＴＣＲ１－Ｅ１．１を生成した（図１５Ｅ、報告された型式）。プラスミドライゲーション、形質転換、ＤＮＡ調製は、標準的分子生物学プロトコールを使用して実施した。
ＤＮＡ操作およびプラスミド構築
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体（配列番号４９～５０）遺伝子は、ＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ．により合成された。抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端、抗体ＣλドメインのＣ末端、ＴＣＲ ＶαドメインのＮ末端、抗体ＣＨ１ドメインのＣ末端にそれぞれ挿入し、二重特異性ＥＴＣＲ１－Ｅ１．１、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．２、ＥＴＣＲ１－Ｅ１．３およびＥＴＣＲ１－Ｅ１．４を生成した（図１５Ａ～Ｄ）。ＣＴＣＲでは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖの遺伝子産物を増幅してＴＣＲ ＶβドメインのＮ末端に挿入し、ＣＴＣＲ１－Ｅ１．１を生成した（図１５Ｅ、報告された型式）。プラスミドライゲーション、形質転換、ＤＮＡ調製は、標準的分子生物学プロトコールを使用して実施した。
【0115】
タンパク質の発現、精製および他の特性決定方法は、上述の説明に従った。
結果
すべての抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体（配列番号５０）ＥＴＣＲ融合物は、Ｅｘｐｉ２９３細胞において良好に発現し、精製された。図１６は、上清中および精製後の生成した二重特異性ＥＴＣＲタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを示す。非還元ゲル中の正しい分子量、すなわち、およそ７８Ｋｄのバンドは、すべて明瞭に観察された。精製した試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣによってさらに調査すると、この純度は９９％超を達成した。データは、ＥＴＣＲ二重特異性タンパク質が良好に発現し、会合することを示した。
結果
すべての抗ＣＤ３ｓｃＦｖ抗体（配列番号５０）ＥＴＣＲ融合物は、Ｅｘｐｉ２９３細胞において良好に発現し、精製された。図１６は、上清中および精製後の生成した二重特異性ＥＴＣＲタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを示す。非還元ゲル中の正しい分子量、すなわち、およそ７８Ｋｄのバンドは、すべて明瞭に観察された。精製した試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣによってさらに調査すると、この純度は９９％超を達成した。データは、ＥＴＣＲ二重特異性タンパク質が良好に発現し、会合することを示した。
【0116】
次いで、すべての二重特異性ＥＴＣＲの結合特性をＳＰＲにより検査した。表１１では、例となる二重特異性ＥＴＣＲ１のＳＰＲ結果を示す。異なる位置における抗ＣＤ３ｓｃＦｖの融合は、二重特異性ＥＴＣＲ１の結合親和性に著しくは影響せず、二重特異性ＣＴＣＲ１と比較して良好なＫｏｎによってわずかに良好な類似の結合特性が、再び観察された。それにもかかわらず、抗ＣＤ３ｓｃＦｖの結合特性に関しては、可変の結果が観察された。抗ＣＤ３ｓｃＦｖがＴＣＲ ＶαおよびＶβドメインのＮ末端にコンジュゲートするＥＴＣＲ１－Ｅ１．１およびＥＴＣＲ－Ｅ１．３の結合親和性は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖが抗体ＣＨ１およびＣλドメインのＣ末端にコンジュゲートするＥＴＣＲ－Ｅ１．２およびＥＴＣＲ－Ｅ１．４よりもほぼ１０倍高く、抗体定常ドメインの立体障害がＴＣＲ可変ドメインよりも強力であると思われることを示した。
【0117】
【表11】
【0118】
実施例９：二重特異性ＥＴＣＲのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ２細胞殺傷アッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、特定のペプチドを充填した抗原提示細胞Ｔ２のＴ細胞関与による殺傷における、設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。Ｔ２細胞は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１陽性であり、特には、抗原プロセシング（ＴＡＰ）に関与するペプチド輸送体が欠損しており、このため、内因性（プロセシングした）ペプチドを、小胞体であるゴルジ体に充填するＭＨＣの部位に正しく転位置させることができない。したがって、ペプチドをパルス適用したＴ２細胞を使用して、非競合的環境下で目的の外因性抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を監視することができる。腫瘍細胞株と比較して、特定のペプチドを充填したＴ２細胞により、高い抗原密度が正常にもたらされ、良好な殺傷特性が生じた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、特定のペプチドを充填した抗原提示細胞Ｔ２のＴ細胞関与による殺傷における、設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。Ｔ２細胞は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１陽性であり、特には、抗原プロセシング（ＴＡＰ）に関与するペプチド輸送体が欠損しており、このため、内因性（プロセシングした）ペプチドを、小胞体であるゴルジ体に充填するＭＨＣの部位に正しく転位置させることができない。したがって、ペプチドをパルス適用したＴ２細胞を使用して、非競合的環境下で目的の外因性抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を監視することができる。腫瘍細胞株と比較して、特定のペプチドを充填したＴ２細胞により、高い抗原密度が正常にもたらされ、良好な殺傷特性が生じた。
【0119】
方法
健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７－１４４０－０３）による密度遠心分離によって、ヘパリン処理した静脈血から新鮮に単離した。１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液、１ｍｌあたり５０単位のヒトＩＬ－２リガンドタンパク質および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中での６日間の培養後、ＰＢＭＣにＥａｓｙＳｅｐカラムを通過させてＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した。負の選択カラムのＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。
健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７－１４４０－０３）による密度遠心分離によって、ヘパリン処理した静脈血から新鮮に単離した。１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液、１ｍｌあたり５０単位のヒトＩＬ－２リガンドタンパク質および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中での６日間の培養後、ＰＢＭＣにＥａｓｙＳｅｐカラムを通過させてＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した。負の選択カラムのＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。
【0120】
Ｔ２細胞（１７４ ９ＣＥＭ．Ｔ２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２（商標））をＡＴＣＣから入手し、２０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ培地中に３７℃、５％ＣＯ２で維持した。使用前に、計数して１×１０６／ｍｌまで培地中に再懸濁し、ペプチドを２０μｇ／ｍｌのペプチド濃度で３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて９０分間パルス適用した。次いで、パルス適用したＴ２細胞を、ＤＰＢＳ中２０ｎＭのＦａｒ－Ｒｅｄで３０分間標識し、次いで２回洗浄して、設計した細胞密度に再懸濁した。
【0121】
次いで、細胞および二重特異性ＥＴＣＲを混合し、設計した時間インキュベートした。解析では、ＰＩ（ＰＢＳ中１：５００希釈）１００μｌを各ウェルに加え、ＦＡＣＳを実行した。
【0122】
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、特定のペプチドを充填した抗原提示細胞Ｔ２のＴ細胞関与による殺傷における、設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。無関係なペプチドならびに無関係なＥＴＣＲ２を充填したＴ２細胞を、陰性対照として使用した。図１７は、１８ｈおよび２４ｈにおける例となる二重特異性ＥＴＣＲの用量依存的細胞殺傷機能を示す。いずれの陰性対照を使用しても、非特異的殺傷は観察されなかった。その上、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１（２．３ｐＭ）は、ＥＴＣＲ－Ｅ１．３（３９ｐＭ）よりもおよそ２０倍強力であり（表１２）、ＴＣＲのＶαの代わりにＶβドメインのＮ末端にコンジュゲートした抗ＣＤ３ｓｃＦｖにより、最良の殺傷機能の再方向づけが生じることを示した（いずれの抗体定常ドメインのＣ末端にコンジュゲートした抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する二重特異性ＥＴＣＲを使用しても、同一条件下において殺傷作用は観察されなかった、データ非提示）。特には、同一の抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよびコンジュゲーション位置を使用すると、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１は（２．３ｐＭ）、ＣＴＣＲ１－Ｅ１．１よりも（２５ｐＭ）１０倍著しく強力な殺傷を示し、改変抗体定常ドメインならびにＴＣＲ可変ドメインによって、キメラＥＴＣＲの全体的安定性が、ＣＴＣＲよりも良好であることを示唆した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、特定のペプチドを充填した抗原提示細胞Ｔ２のＴ細胞関与による殺傷における、設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。無関係なペプチドならびに無関係なＥＴＣＲ２を充填したＴ２細胞を、陰性対照として使用した。図１７は、１８ｈおよび２４ｈにおける例となる二重特異性ＥＴＣＲの用量依存的細胞殺傷機能を示す。いずれの陰性対照を使用しても、非特異的殺傷は観察されなかった。その上、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１（２．３ｐＭ）は、ＥＴＣＲ－Ｅ１．３（３９ｐＭ）よりもおよそ２０倍強力であり（表１２）、ＴＣＲのＶαの代わりにＶβドメインのＮ末端にコンジュゲートした抗ＣＤ３ｓｃＦｖにより、最良の殺傷機能の再方向づけが生じることを示した（いずれの抗体定常ドメインのＣ末端にコンジュゲートした抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する二重特異性ＥＴＣＲを使用しても、同一条件下において殺傷作用は観察されなかった、データ非提示）。特には、同一の抗ＣＤ３ｓｃＦｖおよびコンジュゲーション位置を使用すると、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１は（２．３ｐＭ）、ＣＴＣＲ１－Ｅ１．１よりも（２５ｐＭ）１０倍著しく強力な殺傷を示し、改変抗体定常ドメインならびにＴＣＲ可変ドメインによって、キメラＥＴＣＲの全体的安定性が、ＣＴＣＲよりも良好であることを示唆した。
【0123】
【表12】
【0124】
実施例１０：二重特異性ＥＴＣＲのｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞株殺傷アッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイも実施して、腫瘍細胞株Ａ３７５のＴ細胞関与による殺傷における設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。Ａ３７５腫瘍細胞は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１およびＮＹ－ＥＳＯ－１二重陽性であって１細胞あたり１０～５０コピーの抗原密度を有し、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的二重特異性ＴＣＲの殺傷を検査するのに適する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイも実施して、腫瘍細胞株Ａ３７５のＴ細胞関与による殺傷における設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。Ａ３７５腫瘍細胞は、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１およびＮＹ－ＥＳＯ－１二重陽性であって１細胞あたり１０～５０コピーの抗原密度を有し、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的二重特異性ＴＣＲの殺傷を検査するのに適する。
【0125】
方法
ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のための方法を実施例９に記載する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離のための方法を実施例９に記載する。
【0126】
Ａ３７５細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１９（商標））から入手し、１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中に維持した。殺傷アッセイでは、５０μｌ／ウェルの希釈した二重特異性ＥＴＣＲを黒色の９６ウェル平底プレートに加えた。５０μｌ／ウェルの単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０４／ウェルのＡ３７５細胞に対する指示比率で加え、設計した時間インキュベートした。解析では、プレートをＤＰＢＳで１回洗浄し、解剖の可変性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５５Ｂ）により検出した。
【0127】
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、腫瘍細胞株Ａ３７５のＴ細胞関与による殺傷における設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。無関係なＥＴＣＲ２を陰性対照として使用した。図１８は、例となるＥＴＣＲの用量依存的細胞殺傷機能を示す。いずれの陰性対照を使用しても、非特異的殺傷は観察されなかった。概して、Ｔ２細胞株と比較したＡ３７５腫瘍細胞株の抗原密度の急激な低下により、すべての二重特異性ＥＴＣＲの殺傷能力は低下し、特に、ＥＴＣＲ－Ｅ１．３の殺傷機能は、ほぼ完全に失われた。さらに、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１（３．６ｎＭ）は、ＣＴＣＲ－Ｅ１．１（２６４ｎＭ）よりも著しく７０倍強力な殺傷を示した（表１３）。このようなデータはやはり、キメラＥＴＣＲの全体的安定性が、改変抗体定常ドメインおよびＴＣＲ可変ドメインによって、ＣＴＣＲよりも良好となることを示唆し、このような利点は、実際の腫瘍微小環境において頻繁に出現する低抗原密度条件下で拡大する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能アッセイを実施して、腫瘍細胞株Ａ３７５のＴ細胞関与による殺傷における設計した二重特異性ＥＴＣＲの活性を確認した。無関係なＥＴＣＲ２を陰性対照として使用した。図１８は、例となるＥＴＣＲの用量依存的細胞殺傷機能を示す。いずれの陰性対照を使用しても、非特異的殺傷は観察されなかった。概して、Ｔ２細胞株と比較したＡ３７５腫瘍細胞株の抗原密度の急激な低下により、すべての二重特異性ＥＴＣＲの殺傷能力は低下し、特に、ＥＴＣＲ－Ｅ１．３の殺傷機能は、ほぼ完全に失われた。さらに、ＥＴＣＲ－Ｅ１．１（３．６ｎＭ）は、ＣＴＣＲ－Ｅ１．１（２６４ｎＭ）よりも著しく７０倍強力な殺傷を示した（表１３）。このようなデータはやはり、キメラＥＴＣＲの全体的安定性が、改変抗体定常ドメインおよびＴＣＲ可変ドメインによって、ＣＴＣＲよりも良好となることを示唆し、このような利点は、実際の腫瘍微小環境において頻繁に出現する低抗原密度条件下で拡大する。
【0128】
【表13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲα鎖可変ドメイン（ＴＣＲ Ｖα）とそれに動作可能に結合する第１の抗体定常ドメイン（Ｃ１）とを含む第１のポリペプチド、およびＮ末端からＣ末端に、第１のＴＣＲの第１のＴＣＲβ鎖可変ドメイン（ＴＣＲ Ｖβ）とそれに動作可能に結合する第２の抗体定常ドメイン（Ｃ２）とを含む第２のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、Ｃ１およびＣ２が、その天然の鎖間結合および相互作用を介して二量体を形成することが可能である、ポリペプチド複合体。
【請求項2】
ａ）Ｃ１が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含み、ｂ）Ｃ２が、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、前記Ｃλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択され、前記Ｃκドメインは、Ｃκ１、Ｃκ２、Ｃκ３およびＣκ４からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項3】
ａ）Ｃ１が、ヒト免疫グロブリン由来の改変λまたはκ軽鎖定常ドメイン（ＣλドメインまたはＣκドメイン）を含み、前記Ｃλドメインは、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、Ｃλ６およびＣλ７からなる群から選択され、前記Ｃκドメインは、Ｃκ１、Ｃκ２、Ｃκ３およびＣκ４からなる群から選択され、ｂ）Ｃ２が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される改変ＣＨ１ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド複合体。
【請求項4】
前記Ｃ１が、配列番号１１、１３、１５および１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む改変ＣＨ１を含み、ならびに／または前記Ｃ２が、配列番号１、３、５、７および９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む改変Ｃλを含む、請求項２に記載のポリペプチド複合体。
【請求項5】
第１のＴＣＲ Ｖαが、第１のコンジャンクションドメインを介してＣ１に動作可能に結合し、第１のＴＣＲ Ｖβが、第２のコンジャンクションドメインを介してＣ２に動作可能に結合する、請求項２～４のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項6】
前記Ｃ１が、改変ＣＨ１を含み、前記Ｃ２が、改変Ｃλを含み、前記第１のコンジャンクションドメインが、配列番号１９、２１および２３のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記第２のコンジャンクションドメインが、配列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第２のコンジャンクションドメインが、ＥＤＬＸＮＶＸＰを含み、ここにおいて前記Ｘが、任意のアミノ酸である、請求項５に記載のポリペプチド複合体。
【請求項7】
前記改変Ｃλが、配列番号１，３、５、７および９のいずれか１つの３０、３１および３３番目から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含む、請求項２または３に記載のポリペプチド複合体。
【請求項8】
前記改変Ｃλが、３０番目の位置のアミノ酸Ｄ、３１番目の位置のアミノ酸Ｈ、および３３番目の位置のアミノ酸Ｅの１つ以上を含む、請求項７に記載のポリペプチド複合体。
【請求項9】
前記ＴＣＲ Ｖβが、フレームワーク領域の１０、１３、１９、２４、４８、５４、７７、９０、９１、１２３および１２５番目（ＩＭＧＴナンバリング）から選択される１つまたは複数の位置に変異原を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項10】
前記ＴＣＲ Ｖβが、１０番目の位置のアミノ酸Ｒ、１３番目の位置のアミノ酸Ｋ、１３番目の位置のアミノ酸Ｔ、１９番目の位置のアミノ酸Ｙ、２４番目の位置のアミノ酸Ｋ、２４番目の位置のアミノ酸Ｒ、４８番目の位置のアミノ酸Ｆ、５４番目の位置のアミノ酸Ｙ、５４番目の位置のアミノ酸Ｗ、５４番目の位置のアミノ酸Ａ、７７番目の位置のアミノ酸Ｅ、９０番目の位置のアミノ酸Ｔ、９０番目の位置のアミノ酸Ｖ、９１番目の位置のアミノ酸Ｉ、１２３番目のアミノ酸Ｒ、および１２５番目の位置のアミノ酸Ｔの１つ以上を含む、請求項９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項11】
前記ＴＣＲ Ｖβが、１３番目の位置に少なくとも１つの変異を含むか、または９０および９１番目の位置に少なくとも２つの変異を含む、請求項９または１０に記載のポリペプチド複合体。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体を含む第１の抗原結合部分、および第２の抗原結合部分を含む、多重特異性抗原結合複合体であって、前記第１の抗原結合部分が、第１の抗原特異性を有する、多重特異性抗原結合複合体。
【請求項13】
前記第２の抗原結合部分が、第１の抗原上の種々のエピトープに結合するか、または好ましくは、前記第１の抗原特異性とは異なる、第２の抗原特異性を有し、前記第１の抗原結合部分の第１のポリペプチドまたは前記第１の抗原結合部分の第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてコンジュゲートする、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項14】
前記第１および前記第２の抗原特異性の一方は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子に方向づけ、他方は、腫瘍関連抗原および／または腫瘍新生抗原に方向づける、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項15】
前記第１の抗原結合部分が、ＴＣＲ ＶαおよびＴＣＲ Ｖβを含み、前記Ｖαが、配列番号３７、４１および４５から選択されるアミノ酸配列を含み、前記Ｖβが、配列番号３９、４３および４７から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合部分が、配列番号４９から選択されるｓｃＦｖを含む、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項16】
前記第１の抗原結合部分が、ＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）またはＨＬＡ＊Ａ＊０２：０１－ＧＰ１００ペプチド（ＹＬＥＰＧＰＶＴＶ）に結合し、前記第２の抗原結合部分が、分化抗原群３（ＣＤ３）に結合する、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項17】
前記第２の抗原結合部分が、可動性リンカーを介して共有結合的にコンジュゲートする重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの両方を含む１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１２に記載の多重特異性抗原結合複合体。
【請求項18】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体、または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項19】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、単離ベクター。
【請求項20】
請求項１８に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の単離ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項21】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体、または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を含む、コンジュゲート。
【請求項22】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を発現させる方法であって、前記ポリペプチド複合体が発現する条件下で請求項２０に記載の宿主細胞を培養する工程を含む。
【請求項23】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項24】
それを必要とする対象における症状の治療のための請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体であって、任意に、前記第１の抗原および前記第２の抗原がともに調節される場合、前記症状を緩和、除去、治療または予防することができる、ポリペプチド複合体または多重特異性抗原結合複合体。
【請求項25】
前記症状ががんである、請求項２４に記載のポリペプチド複合体または多重特異性抗原結合複合体。
【請求項26】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド複合体または請求項１２～１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合複合体を含む、キット。
【国際調査報告】