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▶ サニーベイ・バイオテック・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-10
(54)【発明の名称】ＨＥＲＶ－Ｋ抗体治療薬
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231102BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231102BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231102BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231102BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231102BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231102BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231102BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231102BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231102BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231102BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231102BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/08
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
A61K39/395 T
A61K47/68
A61P35/00
A61P35/02
G01N33/53 Y
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023518033
(86)(22)【出願日】2021-09-18
(85)【翻訳文提出日】2023-05-15
(86)【国際出願番号】 US2021071505
(87)【国際公開番号】W WO2022061368
(87)【国際公開日】2022-03-24
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523097086
【氏名又は名称】サニーベイ・バイオテック・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳｕｎｎｙＢａｙ ＢｉｏＴｅｃｈ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ワン－ヨハニング，フェン
(72)【発明者】
【氏名】ヨハニンング，ゲイリー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA45
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC27
4C076EE59
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB36
4C085BB50
4C085CC07
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、治療用ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体、ＣＡＲまたはＣＤ３およびＣＤＳに対する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、ＤＮＡコード化ＢｉＴＥ（ＤＢｉＴＥ）または抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなるその融合物を提供する。本発明はまた、免疫治療法において使用するためのペプチド、タンパク質、核酸および細胞に関する。特に、本発明は、ＭＨＣの分子に結合したがんペプチドまたは抗体および他の結合性分子の標的でもあり得るようなペプチドの免疫療法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト内因性レトロウイルス－Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）に結合する単離された抗体であって、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む単離された抗体。
【請求項2】
ヒト化またはヒトフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＨＥＲＶ－Ｋアンタゴニストである、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
腫瘍成長の低減において使用するための、請求項２に記載の抗体。
【請求項5】
肺、リンパ節または他の臓器への転移の低減において使用するための、請求項２に記載の抗体。
【請求項6】
請求項１に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項9】
哺乳動物においてがんを処置する方法であって、請求項２に記載の抗体の有効量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項10】
抗体が、リンカーを介して細胞傷害性薬物、アウリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体または誘導体にコンジュゲートされる、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
がんが、黒色腫、慢性リンパ性白血病、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、精巣がん、胃がん、腎臓がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
抗体が、全長抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
抗体が、ヒトモノクローナルＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
ＣＡＲ Ｔ、ＣＡＲ ＮＫまたはＢｉＴＥアッセイにおいて使用するためのヒト化抗体。
【請求項15】
アッセイが、ＣＡＲ Ｔ、ＣＡＲ ＮＫまたはＢｉＴＥを開発するために使用される、ＣＡＲ Ｔ、ＣＡＲ ＮＫまたはＢｉＴＥアッセイにおいて使用するためのヒト化抗体。
【請求項16】
本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体およびＡＤＣの標的として使用するための、ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現するがん細胞。
【請求項17】
細菌（ＨＵＭ１およびＨＵＭ２）または哺乳動物細胞から生成されたｈｕ６Ｈ５クローン（ＦＷＪ１およびＦＷＪ２）。
【請求項18】
Ｔ細胞ＣＤ３またはＣＤ８および腫瘍関連抗原ＨＥＲＶ－Ｋに対するヒト化ｓｃＦｖに対して向けられるＢｉＴＥであって、ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかおよびＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体を含む、ＢｉＴＥ。
【請求項19】
ヒト化または完全ヒトＨＥＲＶ－Ｋ ｓｃＦｖを有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターを発現するＴ細胞。
【請求項20】
組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成された抗原およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質を発現したがん細胞からの溶解物に結合可能なヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体。
【請求項21】
請求項１９に記載のヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲ。
【請求項22】
メモリーＢ細胞を有さないドナーのための、迅速拡大増殖およびＢ細胞活性化のための改善されたインビボ濃縮方法であって、（ａ）１、７および１４日目にサイトカインカクテルを用いてマウスを処置するステップ、および
（ｂ）１４および２１日目に抗原によってマウスを追加免疫するステップ
を含む、方法。
【請求項23】
抗原に結合し、がん細胞を死滅させることもできる抗体を産生する細胞。
【請求項24】
ＨＥＲＶ－Ｋの免疫チェックポイント阻害剤を用いて免疫抑制ドメイン（ＩＳＤ）を遮断する方法。
【請求項25】
ＨＥＲＶ－Ｋの免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＥＲＶ－ＫのＩＳＤを標的とするモノクローナル抗体および薬物からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項26】
チェックポイント遮断抗体処置有効性の増強において使用するための、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化および完全ヒト抗体。
【請求項27】
がん患者によって産生されたＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵタンパク質から生成される５種の多抗原ペプチド（ＭＡＰＳ）を用いて免疫化されたマウスから抗体を生成する方法。
【請求項28】
ＨＥＲＶ－Ｋ ＣＡＲ Ａ：ＶＨ－ＶＬｈｕ６Ｈ５－ＣＤ８－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は概して、がん抗原に関する。
【0002】
関連出願の参照
本特許事項は、２０２０年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０８０，００９号に関連し、その優先権を主張する。
本特許事項は、２０２０年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０８０，００９号に関連し、その優先権を主張する。
【背景技術】
【0003】
ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）は、ゲノム反復配列として周知であり、ゲノム中に多数のコピーを有し、その結果、ヒトゲノムのおよそ８％は、レトロウイルス起源のものである。以下の科学的参考文献１を参照されたい。ＨＥＲＶは、生殖系列細胞中にレトロウイルスＤＮＡを組み込んだ数千もの古代の組込み事象から生じた、２。通常、レトロウイルスは、突然変異の蓄積のために感染力を失っている。したがって、これらの遺伝子は、がんなどの病的状態の際を除いて、正常成体ヒト組織では主に、サイレントであり、発現しない。ほとんどの生物学的に活性なＨＥＲＶは、ＨＥＲＶ－Ｋファミリーのメンバーである。ＨＥＲＶ－Ｋは、複製能力のあるレトロウイルスに必要とされるすべての要素を発現可能な完全配列を有する（科学的参考文献３、４）が、正常細胞では依然としてサイレントのままであった。しかし、腫瘍においてなどの一部の状況において、発明者らは、いくつかの異なる種類の腫瘍において正常組織よりもかなり高いレベルで、ＨＥＲＶ－Ｋの発現が活性化され、そのエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質が検出され得ることを報告した。科学的参考文献５～２３を参照されたい。これは、腫瘍において発現され、正常組織には存在しないのでオフターゲット効果が最小となるために、優れた腫瘍関連抗原であり、がん免疫療法の理想的な標的である可能性があることを示す。
【0004】
がん治療薬の開発における重要な検討事項は、腫瘍関連抗原の発現プロファイルである。ＨＥＲＶ－Ｋは、生殖細胞腫瘍（科学的参考文献２４）、黒色腫（科学的参考文献２５）、乳がん細胞株（Ｔ４７Ｄ）（科学的参考文献２６～２８）、乳がん組織（科学的参考文献１５、２９）および卵巣がん（科学的参考文献１３）において転写的に活性である。発明者らは、がん細胞株および患者腫瘍におけるＨＥＲＶタンパク質および配列を具体的に同定した。発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍におけるＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。科学的参考文献１１、１２、１６、１７、２０、３０～３４を参照されたい。彼らはまた、乳がんにおけるＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ転写物の発現は、特に悪性度の高いサブタイプである基底乳がんと特異的に関連することも見出した、２０。
【0005】
いくつかの診断薬を患者選択のためのコンパニオン診断薬として使用できる。１つの戦略は、がん細胞上でのみ見出され、正常組織上では見出されない内因性ウイルス抗原を標的とする。ウイルスＲＮＡは、これらの腫瘍から放出され、ＨＥＲＶ－Ｋ ＲＮＡ（ｅｎｖまたはｇａｇ）と抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体の両方が、本発明者らのグループによって、がん患者の循環中に現れるとによって発見された。科学的参考文献３１～３３、３５を参照されたい。非ヒト起源のこれらのタンパク質は、がん療法の理想的な標的として、またＨＥＲＶ－Ｋを標的とする治療用抗体のコンパニオン診断薬として利用され得る。
【0006】
複数のがんの種類における免疫療法の著しく増大した数の臨床試験によって、乳がんの有効性の高い免疫療法の探索が促進された。乳がんの腫瘍微小環境の理解の改善は、合理的な、効率的な療法の設計にとって重大である。固形腫瘍に対する療法の成功を制限した１つの問題は、腫瘍細胞において高度に発現されるが、正常細胞では発現されない腫瘍抗原がないことである。
【0007】
本発明者らの以前の研究において、発明者らは、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質は、乳がん細胞の表面で一般に発現されることを示した、３０。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、いくつかの腫瘍においてＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞の浸潤を低下させ、３６、ＨＥＲＶ－Ｋ発現は、ＥＭＴを誘導し、細胞運動の増大につながると実証され、３７、その両方とも腫瘍播種に好都合である。科学的刊行物１０、３３、３７は、ＨＥＲＶ－Ｋの過剰発現が、がん発生につながり、がん進行に寄与するという強い証拠を提供する。ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（Ｋ－ＣＡＲ）は、抗ＨＥＲＶ－Ｋモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（６Ｈ５と呼ばれる）から生成され、Ｋ－ＣＡＲ療法の抗転移性腫瘍効果が乳がんおよび黒色腫において実証された。科学的参考文献３３、３５。重要なことに、Ｋ－ＣＡＲＴ細胞またはｓｈＲＮＡｅｎｖのいずれかを用いて処置されたがん細胞において、ＨＥＲＶ－ＫおよびＲａｓの発現の下方制御が示された。科学的参考文献１０、３３、３８を参照されたい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、血清および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）におけるチェックポイント分子レベルは、特に、高悪性度乳がん患者（浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）または浸潤性乳癌（ＩＭＣ）を有する患者）において、ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価と高度に相関することを見出した。乳がんにおけるＴＩＬの表現型的および機能的特徴は、ＨＥＲＶ－Ｋ状態と関連しており、チェックポイント阻害とＨＥＲＶ－Ｋ抗体療法の組合せは、より良好な死滅有効性をもたらす可能性がある。
【0009】
本発明は、治療用ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体またはＣＤ３およびＣＤ８に対する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、ＤＮＡコード化ＢｉＴＥ（ＤＢｉＴＥ）または抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなるその融合物を提供する。
【0010】
第１の実施形態では、本発明は、ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現するがん細胞を提供する。これらのがん細胞は、細胞あたりより多くの抗体が結合され得るので、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体およびＡＤＣの特に良好な標的および良好なモデルであり得る。
【0011】
第２の実施形態では、本発明は、細菌から生成した２つのヒト化抗体クローン（ＨＵＭ１およびＨＵＭ２）を、および哺乳動物細胞から生成したヒト化抗体（ｈｕ６Ｈ５）を提供する。両クローンは、組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成した抗原およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞からの溶解物に結合できる。哺乳動物細胞から生成したｈｕ６Ｈ５を、本発明者らの抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体の他の形態と比較した。ｈｕ６Ｈ５は、マウス抗体（ｍ６Ｈ５）、キメラ抗体（ｃＡｂ）またはヒト化抗体（ＨＵＭ１）と同様である、ＨＥＲＶ－Ｋ抗原に対する結合親和性を有する。ｈｕ６Ｈ５抗体は、がん細胞がアポトーシスを起こすように誘導し、がん細胞増殖を阻害し、ＨＥＲＶ－Ｋ抗原を発現するがん細胞を死滅させる。重要なことに、ｈｕ６Ｈ５抗体は、マウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片において腫瘍生存率を低減すると実証され、特に、肺およびリンパ節へのがん細胞転移を低減することができた。これらのヒト化抗体を用いて処置されたヒト乳がん腫瘍を有するマウスは、抗体処置を受けなかった対照マウスと比較してより長期の生存を有していた。
【0012】
第３の実施形態では、本発明は、がん細胞増殖、腫瘍成長ならびに肺およびリンパ節への転移を誘導できるがん遺伝子として、乳がん患者から生成されるＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ遺伝子を提供する。ＨＥＲＶ－Ｋを発現する細胞は、カスパーゼ３および９、ｐＲＢ、ＳＩＲＴ－１およびＣＩＤＥＡを含む腫瘍抑制と関連する遺伝子の発現の低減ならびにＲａｓ、ｐ－ＥＲＫ、Ｐ－Ｐ－３８およびベータカテニンを含む腫瘍形成と関連する遺伝子の発現の増大を示した。
【0013】
第４の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞ＣＤ３またはＣＤ８および腫瘍関連抗原ＨＥＲＶ－Ｋに対して向けられたＢｉＴＥを提供する。本発明者らは、ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかと、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体からなるようなＢｉＴＥ（ＶＬ－ＶＨ ６Ｈ５ｓｃＦｖ－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃ＋ＦＬＡＧ）または（ＶＬ－ＶＨ ｈｕ６Ｈ５ｓｃＦｖ－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはｈｕＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃ＋ＦＬＡＧ）を生成した。抗体によって認識されるペプチドであるＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３９）および抗体によって認識される短いペプチドであるＭｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号４０）。
【0014】
第５の実施形態では、本発明は、ヒト化または完全ヒトＨＥＲＶ－Ｋ ｓｃＦｖを有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターを発現するＴ細胞を提供する。
【0015】
【化1】
【0016】
これらのＴ細胞は、いくつかの異なるがんからの腫瘍細胞を効果的に溶解し、死滅させる。レンチウイルスベクターから発現されたヒト化Ｋ－ＣＡＲは、汎がんＣＡＲ－Ｔである。
【0017】
第６の実施形態では、本発明は、ヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体を提供する。この抗体は、組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞からの溶解物から生成された抗原に結合できる。このヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲを、レンチウイルスベクターにクローニングできる。この組換えベクターは、それだけには限らないが、Ｋ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびチェックポイント阻害剤、インターロイキン（ＩＬ）－１２およびＩＬ－１８などの炎症促進性サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルスおよびキナーゼ阻害剤を含む療法と組み合わせて使用できる。キナーゼ阻害剤には、それだけには限らないが、ｐ－ＲＳＫおよびｐ－ＥＲＫが含まれる。
【0018】
第７の実施形態では、本発明は、多くの場合には、血清腫瘍マーカーＣＫの染色と重複するＨＥＲＶ－Ｋ染色を提供する。ＨＥＲＶ－Ｋは、ＣＴＣマーカーならびにＨＥＲＶ－Ｋ抗体療法の標的であり得る。
【0019】
第８の実施形態では、本発明は、ＨＥＲＶ－Ｋを幹細胞マーカーとして提供する。ＨＥＲＶ－Ｋの標的化は、がん幹細胞の成長を減速するまたは妨げることによって腫瘍進行を遮断し得る。循環治療用抗体または他の療法を用いるＨＥＲＶ－Ｋの標的化はまた、ＣＴＣを死滅させ、これらの循環細胞の遠位部位への転移を妨げることができる。
【0020】
第９の実施形態では、本発明は、自然免疫応答（例えば、ポリＩ：Ｃ処置）またはＬＴＲ低メチル化（５－Ａｚａなどによる）によるＨＥＲＶ－Ｋの発現を誘導する薬剤を用いるＨＥＲＶ－Ｋの強制的な過剰発現が、がん細胞を、標的化免疫療法を含む標的化療法に対してより感受性にするであろう標的の産生を増大するように誘発することを提供する。
【0021】
第１０の実施形態では、本発明は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおけるインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）濃縮技術（ＩＶＥ：約２０倍増強）を改善し、迅速な拡大増殖およびＢ細胞活性化を可能にする。この改善された技術は、多数の抗原特異的形質芽細胞を産生し得る。より高い力価の抗体を有するがんを有するドナーについて、改善された技術は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの代わりにヒト化マウス（ＨＭ）またはヒト腫瘍マウス（ＨＴＭ）を用いるプロトコールを使用する。がんを有さない、およびメモリーＢ細胞を有さない正常なドナーについては、改善された技術は、改変を有するプロトコールを使用する：マウスをサイトカインカクテル（１、７および１４日目）を用いて処置し、１４および２１日目に抗原によってブーストする。血清をマウスから収集し、結合親和性をＥＬＩＳＡによって試験する。抗体力価の増大が検出された後、脾臓を回収し、分析し、ハイブリドーマを作製するために使用する。ＩＶＥプロトコールを使用してマウスにおいてより高い抗体力価が検出された。
【0022】
第１１の実施形態では、本発明は、抗体を産生するだけでなく、抗原に結合することもでき、がん細胞を死滅させる細胞を決定する方法を提供する。この方法は、ＣＤ４０－Ｂ細胞を効率的に刺激し、高純度（＞９０％）で多数に拡大増殖させ、その抗体の分泌を誘導できる。
【0023】
第１２の実施形態では、本発明は、処置されたＢ細胞のインキュベーション後の方法を提供する。ガラスカバースリップを洗浄し、蛍光抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてタグ付けし、単一Ｂ細胞による抗原特異的抗体の分泌に対応する別個のスポットを示すマイクロエングレービング技術を使用して読み取る。
【0024】
第１３の実施形態では、本発明は、マイクロウェルスラブ中のすべての細胞の結合動態および細胞対細胞相互作用を決定するためのプラットフォームの開発を提供する。
【0025】
第１４の実施形態では、本発明は、際立ったことに、乳がん患者の血漿において６つの循環免疫チェックポイントタンパク質の有意に増強された発現を提供する。本発明はまた、手術前に対して、手術後６ヶ月または１８ヶ月で免疫チェックポイントタンパク質レベルの著しい低下を提供する。重要なことに、可溶性免疫チェックポイントタンパク質分子レベルと、腫瘍におけるＨＥＲＶ－Ｋ発現によって誘導されるＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価の間の正の関連が結果として生じる。ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価は、乳がんにおいて免疫チェックポイントタンパク質レベルに影響を及ぼし得る。したがって、ＨＥＲＶ－Ｋの発現は、乳がん患者の免疫応答を制御できる。
【0026】
別の態様では、これらの知見はまとめて、ＨＥＲＶ－Ｋの免疫抑制ドメイン（ＩＳＤ）は、ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイントと類似の、がん細胞上のまだ認識されていない免疫チェックポイントであるということを示す。第１５の実施形態では、本発明は、それだけには限らないが、ＨＥＲＶ－ＫのＩＳＤを標的とするモノクローナル抗体および薬物を含むＨＥＲＶ－Ｋの免疫チェックポイント阻害剤を用いるＩＳＤの遮断は、がん免疫調節物質療法であり、これは、Ｔ細胞が作動し続け、がんに対する免疫応答の制限を解き、ならびに既存の応答を増強し、がん細胞の排出を促進することを可能にするであろうことを提供する。
【0027】
第１６の実施形態では、本発明は、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化および完全ヒト（ｈＴａｂ）抗体を提供する。これらの抗体は、チェックポイント遮断抗体処置有効性を増強する。有効な組合せがん療法には、それだけには限らないが、（ａ）ＨＥＲＶ－Ｋヒト化またはｈＴＡｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、（ｂ）Ｋ－ＣＡＲ、（ｃ）Ｋ－ＢｉＴＥ、（ｄ）ＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子発現をノックダウンするためのＨＥＲＶ－Ｋ ｓｈＲＮＡもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術、または（ｅ）全長および末端切断型ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖペプチドを含む防止的もしくは治療的ＨＥＲＶ－Ｋワクチンの組合せが含まれる。有効な組合せがん療法には、それだけには限らないが、（ａ）抗ＩＣＰ抗体、（ｂ）がん化学療法、（ｃ）５－アザシチジン、５－アザ－２’－デオキシシチジンもしくは他のエピジェネティックモジュレート剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴｉ）およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、（ｄ）ＥＭＴ阻害剤、（ｅ）細胞移動または浸潤の阻害剤、（ｆ）ＳもしくはＧ２期細胞周期停止の誘導、（ｇ）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲもしくはＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤、または（ｆ）ＨＩＦ１αへのシグナル伝達を含む因子と組み合わされた、全長および末端切断型ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖペプチドが含まれる。
【0028】
第１７の実施形態では、本発明は、薬物をがん細胞および腫瘍中に送達するＡＤＣのために使用できるＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化抗体を提供する。
【0029】
第１８の実施形態では、本発明は、腫瘍イメージングのために使用できるＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体を提供する。
【0030】
第１９の実施形態では、本発明は、ｈｕ６Ｈ５ ｓｃＦｖを使用する新規ＣＡＲを提供する。
【0031】
第２０の実施形態では、本発明は、ＣＤ３およびＣＤ８ ＢｉＴＥを含むｈｕ６Ｈ５ ｓｃＦｖを使用する新規ＢＩＴＥを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【図4】図４では、アポトーシスアッセイを使用して、がん細胞に向けられたマウスおよびヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体の細胞毒性を決定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｐＬＶＸＫ（２３１Ｋ）（ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質を発現するｐＬＶＸベクターを用いて形質導入された乳がん細胞株）またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｐＬＶＸＣ（２３１Ｃ）（ｐＬＶＸ空ベクターを用いて形質導入された同一乳がん細胞株）を含むがん細胞を、ｍ６Ｈ５またはｈｕ６Ｈ５（１ｍｌあたり１または１０μｇ）のいずれかを用いて４時間または１６時間処置した。アネキシンＶおよび７ＡＡＤを使用して、アポトーシス細胞のパーセンテージを決定した。４時間の抗体処置後の結果がここで示されている。
【0036】
【図5】図５では、生／死細胞生存率アッセイを使用して、抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体処置後の細胞死の誘導を評価した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、２４ウェルプレートにおいて一晩播種した。細胞を種々の抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて処置し、細胞培養インキュベーター中３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、カルセインＡｍ（４μｌ／１０ｍｌ培地）およびＥｔｈ－Ｄ１（２０μｌ／１０ｍｌ培地）、ウェルあたり２００μｌを添加し、細胞を室温で３０分間インキュベートした。ＥｔｈＤ－１は、膜損傷を有する細胞に浸透し、死細胞において核酸に結合して、赤色蛍光を生成する。同時染色された生／死生存率アッセイを使用して、生細胞（緑色；カルセインＡｍ）および推定死細胞（赤色；ＥｔｈＤ－１）を同定した。ヒトＩｇＧまたはマウスＩｇＧを対照として使用した。赤色蛍光がない細胞が、対照ヒトまたはマウスＩｇＧを用いる処置後に観察された。しかし、赤色蛍光細胞がヒト化またはマウス６Ｈ５抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を用いて処置された細胞において観察された。
【0037】
【0038】
【0039】
【図8-1】図８では、２３１Ｋまたは２３１Ｃ細胞（皮下注射による２００万個）をマウスに接種した。次いで、マウスをｈｕ６Ｈ５抗体（ｎ＝３；４ｍｇ／ｋｇ、週に２回）を用いて処置した。腫瘍成長をモニタリングし、週に３回測定し、マウス生存を調べた。ｈｕ６Ｈ５を用いるマウスの処置は、対照抗体を用いるマウスの別のコホート（ｎ＝４）の処置よりも長い生存につながった。２３１Ｃ細胞を接種されたマウスにおいてよりも２３１Ｋ細胞を接種されたマウスにおいて、より短い生存が観察され、これは、乳がん細胞におけるＨＥＲＶ－Ｋの過剰発現が腫瘍関連生存を短縮することを示す。
【図8-2】同上。
【0040】
【図9-1】図９では、ｈｕ６Ｈ５および抗体処置なし群から得た組織を、Ｈ＆Ｅを用いて染色し、染色結果は、ここで、２Ｘ、４Ｘおよび１０Ｘで示されている。腫瘍生存率の低減が、抗体処置なし（６０％；Ｂ１４；図９Ａ）の同一細胞と比較して、ｈｕ６Ｈ５を用いて処置された２３１Ｃ細胞が接種されたマウス（２０％；Ｂ４）において実証された。また、腫瘍生存率の低減が、抗体処置なしの同一細胞と比較して、ｈｕ６Ｈ５を用いて処置された２３１Ｋ細胞を接種されたマウス（４５％；Ｂ１；図９Ｂ）において実証された（抗Ｋｉ６７および抗ＨＥＲＶ－Ｋ ｍＡｂ（６Ｈ５）を使用した（図９Ｃ）。腫瘍生存率の低減が、対照（６０％；上部のパネル）と比較して、ｈｕ６Ｈ５を用いて処置された２３１Ｃとともにインキュベートされたマウスにおいて（２０％；下部パネル）実証された。
【図9-2】同上。
【図9-3】同上。
【図9-4】同上。
【0041】
【図10-1】図１０では、肺およびリンパ節への転移が、２３１Ｋ細胞が接種されたマウスにおいて観察された。肺（図１０Ａおよび１０Ｂ）またはリンパ節（図１０Ｃ）への転移は、２３１Ｋ細胞を接種されたマウスにおいてのみ観察された。腫瘍生存率の低減および腫瘍壊死の増大が、２３１Ｋ細胞を接種され、ｈｕ６Ｈ５を用いて処置されたマウスの肺において検出された（図１０Ｂ）。２３１Ｋを接種されたマウスにおいてリンパ節の眼に見える拡大が見られたが、２３１Ｃ細胞を接種されたマウスでは見られなかった。腫瘍生存率の低減および腫瘍壊死の増大が、抗体を添加されなかった２３１Ｋ細胞（ＫＣＯＮ；上部のパネル）（Ｂ２６＞９５％）に対して、２３１Ｋ細胞を接種され、ｈｕ６Ｈ５（ＫＡＢ）を用いて処置されたマウスから得たリンパ節において検出された（図１０Ｃ；Ｂ１８；４０％、下部のパネル）。これらの結果は、ＨＥＲＶ－Ｋ発現が、腫瘍発生の、特に、遠位器官部位への転移の原因因子であることを示す。重要なことに、本発明者らのヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体は、腫瘍生存率を低減し、腫瘍壊死を増大し、肺およびリンパ節への転移を減少させることができる。
【図10-2】同上。
【図10-3】同上。
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【図15】図１５は、マイクロエングレービングプロセスを示す。図１５Ａでは、濃縮されたＢ細胞を腫瘍細胞と混合し、免疫アッセイのためにＨＥＲＶ－Ｋ抗原でコーティングされたガラススライドで覆われたウェル中で２時間～１６時間同時培養した（上部右）。抗体を産生し、腫瘍細胞を死滅させることができるＢ細胞は、ＲＴ－ＰＣＲのためにＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒによって回収可能であり（下部右）、抗体を生成するために再クローニングした（下部左）。図１５Ｂでは、腫瘍組織から生成されたマンモスフェア（７および１４日目）を標的細胞として使用した。抗体産生性Ｂ細胞を濃縮するために自己ＰＢＭＣをカクテルを用いて４日間刺激した。次いで、Ｂ細胞を腫瘍標的細胞と同時培養した。ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質でコーティングされたカバースライドを、同時培養された細胞とともにインキュベートした。同時染色された生／死生存率アッセイを使用して推定死細胞（赤色）を同定した。ＥｔｈＤ－１は、膜損傷を有する細胞に浸透し、死細胞において核酸に結合して、赤色蛍光を生成する。同一ウェルの同一位置におけるカバースライドでのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質に結合できる抗体を産生するＢ細胞を検出した（赤色四角）。図１５Ｃでは、ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒによってＨＥＲＶ－Ｋ＋（緑）およびＩｇＧ＋（赤）であったＢ細胞（赤色丸；左）を選びとった。細胞を選び取る前（上部右）および後（下部右）の細胞が示されている。
【0047】
【図16】図１６Ａ）では、ＨＥＲＶ－Ｋ膜貫通（ＴＭ）タンパク質（マウスＭ１～Ｍ４）またはＰＢＳ（Ｍ５～Ｍ６）を用いて免疫化したマウスにおいて、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、ＩＦＮ－γ分泌性脾臓細胞を検出した。図１６Ｂおよび図１６Ｃを参照されたい。ＥＬＩＳＡを使用して、マウスにおいて抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価を検出した。ＣｐＧ（図１６Ｂ）またはＣＤＮ（図１６Ｃ）状態に関わらず、ＫＳＵ Ｅｎｖタンパク質を用いて処置されたマウスにおいてより高い抗体力価が検出された。図１６Ｄでは、抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂを使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＴＭ１）またはＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＴＭ２）が接種されたＨＴＭモデルにおいて、およびＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵ Ｅｎｖタンパク質を用いて免疫化されたＨＭ（１－２）を用いてＥＬＩＳＡによって抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価を検出した。
【0048】
【図17】図１７では、ヒト－ＳＣＩＤキメラにおけるインビボＨＥＲＶ－Ｋ駆動形質芽細胞分化のスキームを示す。０日目に、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＨＥＲＶ－Ｋタンパク質（１００μｇ）と事前に混合した対象から得た５０００万個のＰＢＭＣを、ヒト化マウスに脾臓内注射する。サイトカインカクテル（ＢＡＦＦ：５０μｇ、ＩＬ－２：５０ｎｇ、ＩＬ－６：５０ｎｇおよびＩＬ－２１：５０ｎｇ）を、１、４および７日目に腹膜内に注射する。ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質（１００μｇ）を２日目に腹膜内にブーストする。ＩｇＧ＋、ＣＤ３８＋およびＨＥＲＶ－Ｋ＋を、その後の分析のためにフローサイトメトリーまたはマイクロエングレービングプラットフォームによって選別する。脾細胞の半量を使用して、ＭＦＰ－２融合パートナーとハイブリドーマを生成する。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ハイブリドーマクローンから抗ＺＩＫＶ Ｅｎｖ抗体を検出した。各ハイブリドーマクローンからの上清（１００μｌ）を添加し、１時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍ－ＨＲＰ抗体を添加し（１：４，０００希釈）、続いて、さらに１時間インキュベートした。いくつかのハイブリドーマクローンにおいて、ドナー３２２３３６から抗体の高力価が実証された。抗フラビウイルス４Ｇ２ ｍＡｂから得られた上清を、陽性対照（Ｄ１－４Ｇ２－４－１５；ＡＴＣＣ ＨＢ－１１２）として使用した。
【0049】
【図18】図１８Ａでは、ＴＮＢＣ ＰＤＸ細胞の接種後４週間で得られたｈｕＣＤ４５＋細胞において、およびＣＤ３４＋造血幹細胞を同時移植した、接種後７週間でのＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＨＴＭモデルにおいてＣＤ３３、ＣＤ３およびＣＤ１９＋細胞のパーセンテージを定量化した。図１８Ｂでは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の接種後７週間での脾臓細胞からのフローデータが示されている。図１８Ｃでは、免疫蛍光染色を使用して、ＨＴＭから得たＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍において抗ＨＥＲＶ－Ｋ ｍＡｂ ６Ｈ５（緑）を使用してＨＥＲＶ－Ｋの発現を検出した。Ｆ－アクチン（赤）を対照として使用した（２つの左のパネル）。腫瘍組織においてｈｕＣＤ３＋細胞（緑色）も検出された（２つの右のパネル）。図１８Ｄでは、抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂを使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＴＭ１）またはＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＨＴＭ２）を接種されたＨＴＭモデルにおいて、およびＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵ Ｅｎｖタンパク質を用いて免疫化されたＨＭ１およびＨＭ２を用いてＥＬＩＳＡによって抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価を検出した。
【0050】
【図19】図１９は、乳がん患者におけるＨＥＲＶ－Ｋ状態と関連するベースライン免疫状態を例示する：組み合わされたＨＥＲＶ－Ｋおよび免疫チェックポイントアッセイ。正常ドナーに対してＤＣＩＳおよび高悪性度乳がんを含む乳がん患者において、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって可溶性免疫チェックポイントタンパク質の発現を調べた。図１９Ａは、ＤＣＩＳ、高悪性度乳がん（ａＢＣ）および正常女性ドナーにおける６つのＩＣＰの発現の比較を示す。顕著な知見は、乳がん患者の血漿における６つの循環ＩＣＰの発現の有意な増強であった、図１９Ａ。図１９Ｂ（ａ～ｃ）：さらなる知見は、術前（時点１）に対する、術後６ヶ月（Ｂ；時点２）または１８ヶ月（示されていないデータ）での患者における免疫チェックポイントタンパク質レベルの著しい低下であった。重要なことに、腫瘍における可溶性ＩＣＰ分子レベルとＨＥＲＶ－Ｋ発現によって誘発されるＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価の間の正の関連が観察され（図１９Ｃ）、これは、ＨＥＲＶ－Ｋ抗体力価が、乳がんにおいてＩＣＰレベルに影響を及ぼすであろうということを示唆する。したがって、ＨＥＲＶ－Ｋの発現は、乳がん患者の免疫応答を制御できる。
【0051】
【図20-1】図２０Ａでは、免疫ブロットアッセイを使用して、ｒ－Ｇｅｌとの６Ｈ５コンジュゲーションを実証した。図２０Ｂでは、抗ＨＥＲＶ－Ｋ ６Ｈ５－ｒＧｅｌ ＡＤＣを使用してＨＥＲＶ－Ｋ陽性がん細胞において組換えゲロニン毒素（ｒ－Ｇｅｌ）のデリバリーが観察された。抗ＨＥＲＶ－Ｋ ６Ｈ５ ｍＡｂを使用してＤＯＶ１３卵巣がん細胞におけるＨＥＲＶ－Ｋの表面および細胞質発現を検出した。さらに、処置の４時間後に抗ｒＧｅｌ抗体を使用してＤＯＶ１３細胞においてｒ－Ｇｅｌ発現を検出した。図２０Ｃでは、内部移行の１時間後にＳＫＢｒ３、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞において、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質（６Ｈ５；赤）またはｒＧｅｌシグナル（緑）を検出した。黄色－橙色は、標的細胞質におけるＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質とｒＧｅｌ毒素の共局在を示す（右パネル）。対照ＩｇＧを用いて処置されたマウスと比較した、６Ｈ５（ｐ＝０．００５２）および６Ｈ５－ｒ－Ｇｅｌ（ｐ＜０．０００１）を用いて処置されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を接種されたマウスにおいて、抗腫瘍効果を比較した（図２０Ｄ）。
【図20-2】同上。
【0052】
【図21-1】図２１では、種々のＨＥＲＶ－Ｋ陽性乳がん細胞株においてインビトロおよびインビボで、金ナノ粒子（ＧＮＰ）のデリバリーが実証された。裸のＧＮＰ（図２１Ａ）または６Ｈ５－ＧＮＰ（図２１Ｂ）とともに２時間インキュベートした後にＴＥＭを使用して、ＧＮＰ（暗い点）がＭＤＡＭＢ２３１細胞においてインビトロで検出された。ＧＮＰは、銀増強アッセイを使用して、マウスの尾静脈における６Ｈ５－ＧＮＰまたは６Ｈ５ｓｃＦｖ－ＧＮＰを用いた静脈内注射の２４時間後にＭＤＡＭＢ２３１腫瘍（図２１Ｃ）またはＳＫＢｒ３腫瘍（図２１Ｄ）において検出された。（Ｅ／Ｆ）ＧＮＰ（白色矢印）は、６Ｈ５－ＧＮＰを用いた静脈内注射の２４時間後にＴＥＭによってマウスから単離された腫瘍のＭＤＡＭＢ２３１細胞において検出された。腫瘍細胞に隣接してＨＥＲＶウイルス粒子（緑色矢印）が観察された。
【図21-2】同上。
【0053】
【0054】
【発明を実施するための形態】
【0055】
有用性
本明細書は、ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を生成する方法を提供する。ｈｕ６Ｈ５の抗腫瘍効果が、インビトロおよびインビボで実証された。
本明細書は、ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を生成する方法を提供する。ｈｕ６Ｈ５の抗腫瘍効果が、インビトロおよびインビボで実証された。
【0056】
本発明は、がんを患っている患者を処置する方法を提供する。第２０の実施形態では、本発明は、がんを処置する方法であって、適宜、１つまたは複数の免疫チェックポイント遮断剤と組み合わされてもよい、治療用ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体またはＣＡＲ、ＢｉＴＥもしくはＡＤＣ、がんワクチンからなるその融合物を投与することを含む方法を提供する。これらの治療薬の各々は、免疫系を個々に標的とする。第２１の実施形態では、本発明の方法は、転移を阻害する。第２２の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍サイズを低減する。第２３の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍細胞の成長を阻害する。第２４の実施形態では、本発明の方法は、がんおよびがん転移を検出する。
【0057】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される一部の用語および語句の意味を以下に列挙する。別に記載しない限り、または文脈から暗示されている場合を除き、これらの用語および語句は、以下の意味を有する。これらの定義は、特定の実施形態の説明を補助するためであって、特許請求される本発明を制限するよう意図するものではない。別に定義されない限り、すべての技術用語および科学用語は、分子生物学の技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。用語の意味と、本明細書において提供される定義の間のいずれかの明らかな矛盾については、本明細書において提供される意味が優先されるべきである。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される一部の用語および語句の意味を以下に列挙する。別に記載しない限り、または文脈から暗示されている場合を除き、これらの用語および語句は、以下の意味を有する。これらの定義は、特定の実施形態の説明を補助するためであって、特許請求される本発明を制限するよう意図するものではない。別に定義されない限り、すべての技術用語および科学用語は、分子生物学の技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。用語の意味と、本明細書において提供される定義の間のいずれかの明らかな矛盾については、本明細書において提供される意味が優先されるべきである。
【0058】
「５－アザ」は、５－アザシチジンのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0059】
「６Ｈ５」は、本発明者らの研究室において開発されたマウス抗ＨＥＲＶ－Ｋモノクローナル抗体のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0060】
「約」は、分子生物学の技術分野の当業者によって理解され、使用される状況に応じてある程度変わる。使用される状況を考慮して分子生物学の技術分野の当業者にとって明確ではない用語の使用がある場合には、「約」は、値の最大プラスまたはマイナス１０％を意味する。
【0061】
「抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」は、永久または不安定リンカーのいずれかを用いて小分子抗がん薬または別の治療薬を抗体に付着することによって構築された高度に強力な生物学的薬物のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。抗体は、標的細胞上でのみ見出される特異的抗原を標的とする。
【0062】
「Ｂ７ファミリー」は、未定義の受容体を有する阻害性リガンドのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。Ｂ７ファミリーは、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４を包含し、両方とも腫瘍細胞および腫瘍浸潤性細胞で上方制御される。完全ｈＢ７－Ｈ３およびｈＢ７－Ｈ４配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ５ＺＰＲ３およびＡＡＺ１７４０６の下で見出すことができる。
【0063】
「ＢｉＴＥ」は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ＢｉＴＥは、１つは、Ｔ細胞上の細胞表面分子（例えば、ＣＤ３ε）を標的とし、もう一方は、悪性細胞の表面上の抗原を標的とする、２種の異なる抗体に由来する２つの連結されたｓｃＦｖを有する組換え二重特異性タンパク質を意味する。２つのｓｃＦｖは、短い可動性リンカーによって一緒に連結される。ｔｅｒｍ ＤＮＡコード化ＢｉＴＥ（ＤＢｉＴＥ）という用語は、インビボで発現され得る、任意のＢｉＴＥをコードするＤＮＡプラスミドを含む。
【0064】
「がん抗原」または「腫瘍抗原」は、（ｉ）腫瘍特異的抗原、（ｉｉ）腫瘍関連抗原、（ｉｉｉ）腫瘍特異的抗原を発現する細胞、（ｉｖ）腫瘍関連抗原を発現する細胞、（ｖ）腫瘍上の胚性抗原、（ｖｉ）自己腫瘍細胞、（ｖｉｉ）腫瘍特異的膜抗原、（ｖｉｉｉ）腫瘍関連膜抗原、（ｉｘ）増殖因子受容体、（ｘ）増殖因子リガンドおよび（ｘｉ）がんと関連する任意の他の種類の抗原または抗原提示細胞または材料のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0065】
「併用療法」は、組合せの有益な効果を提供するレジメンで逐次法での各薬剤または療法の投与、および実質的に同時法での、例えば、固定比のこれらの活性薬剤を有する単一カプセル剤での、もしくは各薬剤の複数の、別個のカプセルでのこれらの薬剤または療法の同時投与を包含する。併用療法はまた、個々のエレメントを別個の時間で、および／または異なる経路によって投与できるが、組み合わせて、併用療法の各薬剤もしくは腫瘍処置アプローチの同時作用または薬物動態および薬動力学効果によって有益な効果を提供するように作用する組合せを含む。
【0066】
「ＣＴＬ」は、細胞溶解性Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0067】
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６への結合によって免疫系を下方制御する。「ＣＴＬＡ－４」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）、ｈＣＴＬＡ－４のバリアント、アイソフォームおよび種相同体およびｈＣＴＬＡ－４との少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全ｈＣＴＬＡ－４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１６４１０の下で見出すことができる。
【0068】
指定されたポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」は、ポリペプチドの起源のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列またはその部分に対して本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、部分は、少なくとも１０～２０個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも２０～３０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも３０～５０個のアミノ酸からなるか、またはそうでなければ分子生物学の技術分野の当業者が配列中にその起源を有すると同定可能である。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して１つまたは複数の突然変異を有する場合がある、例えば、別のアミノ酸残基と置換された、または１つもしくは複数のアミノ酸残基挿入もしくは欠失を有する１つまたは複数のアミノ酸残基。ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含み得る。このようなバリアントは、出発分子と１００％未満の配列同一性または類似性を必ず有する。一部の実施形態では、ペプチドはヌクレオチド配列によってコードされる。本発明のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子療法、タンパク質発現および精製、突然変異導入、それを必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種、例えば、受動免疫のための抗体生成、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブ生成などを含むいくつかの適用にとって有用であり得る。
【0069】
「エフェクター細胞」は、免疫応答の認知および活性化局面とは対照的に免疫応答のエフェクター局面に関与する免疫細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。例示的免疫細胞には、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞およびＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞および好塩基球が含まれる。一部のエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現し、特異的免疫機能を実施する。
【0070】
「エピトープ」とは、抗体へ特異的結合可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面グループからなり、普通、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。立体配座および非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが、後者へのものは失われない点で区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）および結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合性ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基（言い換えれば、アミノ酸残基は、特異的抗原結合性ペプチドのフットプリント内にある）を含み得る。
【0071】
「ＦＡＣＳ」は、蛍光活性化セルソーターを指す。
【0072】
「ＨＥＲＶ」は、ヒト内因性レトロウイルスのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有し、「ＨＥＲＶ－Ｋ」は、内因性レトロウイルスのＨＥＲＶ－Ｋファミリーのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ヒト内因性レトロウイルス」（ＨＥＲＶ）は、すべての正常細胞のゲノム中に組み込まれたプロウイルスＤＮＡの形態で存在し、メンデル遺伝パターンによって伝達されるレトロウイルスである。「ＨＥＲＶ－Ｘ」（ここで、「Ｘ」は英語の文字である）は、ＨＥＲＶの他のファミリーのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「Ｅｎｖ」は、ウイルスエンベロープタンパク質のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ＫＳＵ」は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ表面融合タンパク質のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有し、「ＫＴＭ」は、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ膜貫通タンパク質のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ｅｎｖ」は、ウイルスエンベロープＲＮＡのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ｐＬＶＸＫは、ＨＥＲＶ－Ｋ発現ベクターのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＫまたは２３１－Ｋという用語は、 ｐＬＶＸＫで形質導入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を指す。ｐＬＶＸＣは、対照発現ベクターのみのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＣまたは２３１－Ｃという用語は、ｐＬＶＸＣで形質導入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を指す。ＨＥＲＶ－Ｋは、それだけには限らないが、黒色腫（Ｍｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｈ， ２００３； Ｂｕｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２０１０； Ｒｅｉｃｈｅ ｅｔ ａｈ、２０１０； Ｓｅｒａｆｉｎｏ ｅｔ ａｌ， ２００９）、乳がん（Ｐａｔｉｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ， １９９６； Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｓｅｉｆａｒｔｈ ｅｔ ａｌ， １９９５）、卵巣がん（Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、リンパ腫（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ－Ｇａｌｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， ２００８）および奇形がん腫（Ｂｉｅｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ； Ｌｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）を含む多数の腫瘍の種類で発現される。さらに、ＨＩＶによって感染したもの（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）を含む感染細胞も、ＨＥＲＶ－Ｋを発現する。これは、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とする１つのＣＡＲ設計を使用して、さまざまながんおよび感染症を処置できるという魅力的な機会を提供する。
【0073】
「ＨＭ」は、ヒト化マウスのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有し、「ＨＴＭ」は、ヒト腫瘍マウスのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0074】
「ｈＴＡｂ」は、完全ヒト腫瘍抗体のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0075】
「ヒト内因性レトロウイルス－Ｋ」、「ＨＥＲＶ－Ｋ」、「ＨＥＲＶ」、「ヒト内因性レトロウイルス」、「内因性レトロウイルス」および「ＥＲＶ」は、細胞によって天然に発現される、または内因性レトロウイルスの遺伝子でトランスフェクトされた細胞で発現される内因性レトロウイルスの任意のバリアント、アイソフォームおよび種相同体を含む。
【0076】
「ＩＣＰ」は、免疫チェックポイントのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0077】
「ＩＨＣ」は、免疫組織化学のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0078】
「ＩＬＣ」は、浸潤性小葉癌のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ＤＣＩＳ」は、非浸潤性乳管がんのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ＩＤＣ」は、浸潤性乳管癌のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0079】
「免疫細胞」は、造血起源であり、免疫応答における役割を果たす細胞である。免疫細胞には、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞および骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球）が含まれる。
【0080】
「免疫チェックポイント遮断薬」は、１つまたは複数のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、干渉する、またはモジュレートする分子のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントと関連する阻害性シグナルを妨げる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、免疫チェックポイントと関連する阻害性シグナル伝達を撹乱する抗体またはその断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、阻害性シグナル伝達を撹乱する小分子である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、チェックポイント遮断薬タンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片または抗体模倣物、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６の間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント遮断薬は、ＬＡＧ３とそのリガンドの間またはＴＩＭ－３とそのリガンドの間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント遮断薬はまた、分子（またはそのバリアント）自体の可溶性形態の形態、例えば、可溶性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１融合物であり得る。
【0081】
「免疫チェックポイント」は、抗原のＴ細胞受容体認識の振幅および質を調節する同時刺激性および阻害性シグナルのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。一部の実施形態では、免疫チェックポイントは、阻害性シグナルである。一部の実施形態では、阻害性シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用である。一部の実施形態では、阻害性シグナルは、ＣＤ２８結合に置き換わる、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６の間の相互作用である。一部の実施形態では、阻害性シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子の間の相互作用である。一部の実施形態では、阻害性シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９の間の相互作用である。
【0082】
「インビボ」は、生存している生物において生じるプロセスのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「哺乳動物」または「対象」または「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトと非ヒトの両方を含み、それだけには限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマおよびブタを含む。
【0083】
「成長を阻害する」（例えば、腫瘍細胞などの細胞へ言及して）とは、ＨＥＲＶ－Ｋ特異的治療薬と接触した場合の、ＨＥＲＶ－Ｋ特異的治療薬と接触していない同一細胞の成長と比較した、細胞成長における任意の測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％の細胞培養物の成長の阻害を含むものとする。細胞成長のこのような減少は、抗ＨＥＲＶ－Ｋ剤によって個別に、または組合せ、例えば、アポトーシスのいずれかで発揮されるさまざまな機序によって生じ得る。
【0084】
「ＩＳＤ」は、免疫抑制ドメインのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0085】
「Ｋ－ＣＡＲ」または「ＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＣＡＲ」は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ遺伝子（表面または膜貫通）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝的コンストラクトのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。「ＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞」または「Ｋ－ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、Ｋ－ＣＡＲまたはＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＣＡＲレンチウイルスまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ発現系で形質導入されたＴ細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0086】
「ＫＤ」は、普通はｓｈＲＮＡによるノックダウンのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0087】
「連結された」、「融合された」または「融合」は、同義的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むいかなる手段によってであれ、２つまたはそれより多い要素または成分またはドメインを一緒に接合することを指す。化学的コンジュゲーション（例えば、ヘテロ二機能的架橋剤を使用する）の方法は、当技術分野で公知である。
【0088】
「リンカー」または「リンカードメイン」は、直線的な配列で２つまたはそれより多いドメイン（例えば、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化抗体およびＴ細胞タンパク質を標的とする抗体）を接続する配列のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。本明細書において開示される方法において使用するのに好適なコンストラクトは、１つまたは複数の「リンカードメイン」、例えば、ポリペプチドリンカーを使用できる。「ポリペプチドリンカー」は、直線的なポリペプチド鎖のアミノ酸配列で２つまたはそれより多いドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。このようなポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に可動性を提供できる。ポリペプチドリンカーは、１つまたは複数のＦｃドメインおよび／または薬物を接続する（例えば、遺伝子的に融合する）ために使用できる。
【0089】
「リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合によるリンパ球活性の阻害と関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を増強し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機能を阻害する。「ＬＡＧ３」は、本明細書で使用される場合、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３のバリアント、アイソフォームおよび種相同体および少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全ｈＬＡＧ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１８６２７の下で見出すことができる。
【0090】
「マンモスフェア」は、細胞の別個のクラスターを形成する非付着性非分化条件下で培養された乳房または乳腺細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0091】
「核酸」は、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。具体的に制限されない限り、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に断りのない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列ならびに明確に示された配列も暗黙に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成できる。Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９， ５０８１ （１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６０， ２６０５－２６０８ （１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ， ８， ９１－９８ （１９９４）を参照されたい。アルギニンおよびロイシンについては、第２の塩基での改変も保存的であり得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。
【0092】
「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0093】
「ＰＤＸ」は、患者由来の異種移植片のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ＰＤＸは通常、ヒトがんの免疫不全マウスモデル中にヒト腫瘍細胞または腫瘍組織を移植することによって生成される。
【0094】
２つまたはそれより多い核酸またはポリペプチド配列に関連して「同一性パーセント」とは、以下に記載される配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査によって測定されるような、最大対応のために比較され、アラインされた場合に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定のパーセンテージを有する２つまたはそれより多い配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得る、あるいは、比較されるべき２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のために、通常、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および参照配列がコンピュータ中にインプットされ、部分配列座標が指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムによって、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２， ４８２ （１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８， ４４３ （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ２４４４ （１９８８）の類似性の探索の方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、米国、ウィスコンシン州、マディソン中のＧＡＰ、ＢＥＳＨＥＲＶ－ＫＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＨＥＲＶ－ＫＡＳＴＡ）のコンピュータによって計算された実行によって、または目視検査によって実施できる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの一例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３－４１０ （１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターウェブサイトを介して公的に入手可能である。
【0095】
「薬学的に許容される」とは、一般に、合理的な利益／リスク比に釣り合った、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わない、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織、臓器および／または体液と接触した使用に適している化合物、材料および組成物および／または投与形を意味する。
【0096】
「プログラム死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）」は、ＰＤ－１への結合の際にＴ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドのうちの１つである（もう一方は、ＰＤ－Ｌ２である）。「ＰＤ－Ｌ１」は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１のバリアント、アイソフォームおよび種相同体およびｈＰＤ－Ｌ１との少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全ｈＰＤ－Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７の下で見出すことができる。
【0097】
「プログラム死－１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫阻害性受容体のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ＰＤ－１は、インビボでは以前に活性化されたＴ細胞で主に発現され、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合する。「ＰＤ－１」は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１のバリアント、アイソフォームおよび種相同体およびｈＰＤ－１との少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全ｈＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ５１７７３の下で見出すことができる。
【0098】
「組換え宿主細胞」（または簡単に「宿主細胞」）は、発現ベクターが導入された細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指す。突然変異または環境の影響のいずれかのために、一部の改変が後に続く世代において生じる場合があるので、このような後代は、実際、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される場合に、依然として「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞には、例えば、トランスフェクトーマ、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ／０細胞およびリンパ性細胞が含まれる。
【0099】
「ｓｃＦｖ」は、単鎖可変断片のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0100】
「ＳＵ」は、ＨＥＲＶ－Ｋ表面タンパク質のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0101】
「十分な量」または「に十分な量」とは、所望の効果をもたらすのに十分な量、例えば、腫瘍のサイズを低減するのに十分な量を意味する。
【0102】
２つまたはそれより多い個々の成分によってもたらされる効果に関して「相乗作用」または「相乗作用の」は、これらの成分によってもたらされた総効果が、組合せで利用された場合に、単独で作用する各成分の個々の作用の合計よりも大きい現象のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0103】
「Ｔ細胞膜タンパク質－３（ＴＩＭ３）」は、ＴＨ１細胞応答の阻害によるリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、ガレクチン９であり、がんの種々の種類において上方制御される。「ＴＩＭ３」は、本明細書で使用される場合、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３のバリアント、アイソフォームおよび種相同体および少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。完全ｈＴＩＭ３配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ８ＴＤＱｏの下で見出すことができる。
【0104】
「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。Ｔ細胞という用語は、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞およびＴＨ１７細胞を包含する。
【0105】
「治療上有効量」とは、疾患の症状を改善するのに有効である量である。治療上有効な量は、予防が考慮される療法であり得るので「予防上有効量」であり得る。
【0106】
「ＴＭ」は、ＨＥＲＶ－Ｋ膜貫通タンパク質のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0107】
「ＴＮＢＣ」は、トリプルネガティブ乳がんのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。
【0108】
「トランスジェニック非ヒト動物」は、１つまたは複数のヒト重および／または軽鎖導入遺伝子またはトランスクロモソーム（動物の天然ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた、または組み込まれていない）を含み、完全ヒト抗体を発現できるゲノムを有する非ヒト動物のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。例えば、トランスジェニックマウスは、ヒト軽鎖導入遺伝子と、ヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖トランスクロモソームのいずれかを有する場合があり、その結果、マウスは、ＨＥＲＶ－Ｋ抗原および／またはＨＥＲＶ－Ｋを発現する細胞で免疫化されると、ヒト抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を生成する。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えば、ＨｕＭＡｂマウスの場合のようにマウスの染色体ＤＮＡ中に組み込まれる場合がある、またはヒト重鎖導入遺伝子は、ＷＯ０２／４３４７８に記載されるようなトランスクロモソームＫＭマウスの場合のように染色体外で維持される場合がある。このようなトランスジェニックおよびトランスクロモソームマウス（まとめて、本明細書において「トランスジェニックマウス」と呼ばれる）は、Ｖ－Ｄ－Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを起こすことによって、所与の抗原に対してヒトｍＡｂの複数のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥなど）を生成できる。トランスジェニック非ヒト動物はまた、特定の抗原に対する抗体の生成のために、このような特定の抗体をコードする遺伝子を導入することによって、例えば、動物の乳において発現される遺伝子に作動可能に連結することによって使用できる。
【0109】
「処置」とは、症状または疾患状態を和らげる、寛解させる、停止する、または根絶する（治癒する）ことを目的とした本発明の治療上活性な化合物の有効量の投与を意味する。
【0110】
「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送可能な核酸分子のバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。ベクターの１つの種類として、「プラスミド」があり、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループのバイオテクノロジーの技術分野で認識される意味を有する。別の種類のベクターとして、ウイルスベクターがあり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲートされ得る。一部のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞中への導入の際に、他のベクター（非エピソーム哺乳動物ベクターなど）を宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、一部のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的な形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」という用語は同義的に使用される。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、発現ベクターのこのような他の形態、例えば、ウイルスベクター（複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど）を含むように意図される。
【0111】
過去１５年にわたって、がん治療用抗体、例えば、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、アービタックス（登録商標）（セツキシマブ）および他のものの開発によって、世界中で何万もの命が救われた。特に、トラスツズマブを使用するＨＥＲ２陽性転移性乳がんまたは卵巣がんの処置は、患者転帰を劇的に変更した４０。抗体治療薬は、小分子薬に対して別個の進歩、すなわち、（ｉ）定義された作用の機序、（ｉｉ）より高い特異性およびより少ないオフターゲット効果および（ｉｉｉ）予測可能な安全性および毒性学的プロファイルを提供する４１、４２。現在＞２００の抗体治療薬が、米国において臨床試験中である。抗Ｈｅｒ２および抗ＥＧＦＲモノクローナルを用いる広範な研究が証明するように、高親和性でその分子標的に結合するその能力に基づいて同定された数千のうち数個の抗体のみが、臨床上有効ながん細胞死滅に必要な特性を示す４１。治療用抗体の有効性は、標的細胞におけるアポトーシスの直接誘導によって、または抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のようなエフェクター媒介性機能を介して強力な腫瘍細胞毒性を誘発するその能力に主に起因する４１、４２。
【0112】
抗体単離のための主要な方法論は、（ｉ）ファージまたは微生物ディスプレイを使用する、免疫化動物からの、または合成ライブラリーからのライブラリーのインビトロスクリーニング４３～４５、および（ｉｉ）Ｂ細胞不死化またはクローニング後の抗体の単離４６～４８。これらの方法論は、以下の欠点のいずれかまたは両方を抱えており、単離できる独特の抗体の数を厳しく制限する：（ｉ）少数の高親和性抗体を単離するためでさえ広範なスクリーニングを必要とすることおよび（ｉｉ）ヒトに注射されたこれらの抗体に対する免疫応答。したがって、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のスクリーニング／単離のために使用される方法論に関わらず、発見から臨床までの移行速度は非効率的であり、骨の折れるものである４７、４９。
【0113】
治療用ｍＡｂの承認を加速した１つの進歩は、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト技術によるヒト化抗体の生成であった。科学的参考文献１０を参照されたい。ＣＤＲグラフトでは、非ヒト抗体ＣＤＲ配列は、標的特異性を維持するためにヒトフレームワーク配列に翻訳される。
【0114】
ヒト化抗体および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）医薬組成物
ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現するがん細胞は、細胞あたりより多くの抗体が結合される可能性があるので本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体およびＡＤＣの特に良好な標的であり得る。したがって、第２５の実施形態では、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを用いて処置されるべきがん患者は、その腫瘍細胞においてＨＥＲＶ－Ｋの過剰発現を有すると診断された患者、例えば、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がんまたは結腸直腸がん患者である。
ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現するがん細胞は、細胞あたりより多くの抗体が結合される可能性があるので本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体およびＡＤＣの特に良好な標的であり得る。したがって、第２５の実施形態では、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを用いて処置されるべきがん患者は、その腫瘍細胞においてＨＥＲＶ－Ｋの過剰発現を有すると診断された患者、例えば、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がんまたは結腸直腸がん患者である。
【0115】
抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの精製の際、それらを周知の医薬品担体または賦形剤を使用して医薬組成物に製剤化できる。
【0116】
医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９５）に開示されるものなどの従来技術に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤を用いて製剤化できる。
【0117】
薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の公知のアジュバントおよび賦形剤は、本発明のヒト化抗体またはＡＤＣおよび選択された投与様式に適していなくてはならない。医薬組成物の担体および他の成分の適合性は、抗原結合の際に選択された本発明の化合物または医薬組成物の所望の生物学的特性に対する著しい負の影響がないことに基づいて決定される（例えば、実質的未満の影響（１０％以下の相対阻害、５％以下の相対阻害など））。
【0118】
本発明の医薬組成物はまた、希釈剤、増量剤、塩、バッファー、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０またはＴｗｅｅｎ－８０）、安定化剤（例えば、糖またはタンパク質不含アミノ酸）、保存料、組織固定剤、可溶化剤および／または医薬組成物中に含めるのに好適な他の材料も含み得る。
【0119】
本発明の医薬組成物中のヒト化抗体またはＡＤＣの実際の投与量レベルは、患者にとって毒性ではない、特定の患者、組成物および投与様式の所望の治療的応答を達成するのに有効であるヒト化抗体またはＡＤＣの量を得るために変わり得る。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、使用されている特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、処置の持続期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の病歴および医学の技術分野において周知の同様の因子を含むさまざまな薬物動態因子に応じて変わる。
【0120】
医薬組成物は、任意の好適な経路および様式によって投与され得る。本発明のヒト化抗体またはＡＤＣを投与する好適な経路は、当技術分野で周知であり、分子生物学の技術分野における当業者によって選択され得る。
【0121】
第２６の実施形態では、本発明の医薬組成物は、非経口的に投与される。
【0122】
「非経口投与」および「非経口的に投与された」という語句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、上皮、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【0123】
第２７の実施形態では、医薬組成物は、静脈内または皮下注射または注入によって投与される。
【0124】
薬学的に許容される担体は、本発明のヒト化抗体またはＡＤＣと生理学的に適合する、ありとあらゆる好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、抗酸化物質および吸収遅延剤などを含む。
【0125】
本発明の医薬組成物において使用できる好適な水性および非水性担体の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油およびゴマ油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントゴムおよび注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルおよび／または種々の緩衝液が挙げられる。他の担体は、医薬品の技術分野において周知である。
【0126】
薬学的に許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来媒体または薬剤が、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣと不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。
【0127】
例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用して、分散物の必要な粒子サイズの維持および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持できる。
【0128】
本発明の医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質、例えば、（１）水溶性抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性抗酸化物質、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなどおよび（３）金属キレート化剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸なども含み得る。
【0129】
本発明の医薬組成物はまた、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは塩化ナトリウムを含み得る。
【0130】
本発明の医薬組成物はまた、医薬組成物の有効期間または有効性を増強し得る、選択された投与経路にとって適当な１つまたは複数のアジュバント、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存料または緩衝液を含有し得る。本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、化合物を迅速な放出から保護するであろう担体を用いて調製できる、例えば、留置剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む徐放製剤。このような担体は、単独でまたはワックスまたは分子生物学の技術分野において周知の他の材料とともに、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を含み得る。このような製剤を調製する方法は、分子生物学の技術分野における当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ． （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８）を参照されたい。
【0131】
第２８の実施形態では、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化され得る。非経口投与のための薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
【0132】
注射のための医薬組成物は、通常、無菌であり、製造および保存の条件下で安定していなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬物濃度に好適な他の秩序の構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含有する水性または非水性溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングを使用して、分散物の必要な粒子サイズの維持および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持できる。多くの場合には、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによって引き起こされ得る。滅菌注射用溶液は、必要な量の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを、例えば、上記で列挙されるような成分の１つまたは組合せとともに適当な溶媒中に組み込むこと、それに続く滅菌微量濾過によって調製できる。一般に、分散物は、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを、基本分散媒および例えば、上記で列挙されたものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末のための、調製法の例として、事前に滅菌濾過されたその溶液から有効成分および任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結－乾燥（凍結乾燥）がある。
【0133】
滅菌注射用溶液は、必要な量の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを、上記で列挙されるような成分の１つまたは組合せとともに適当な溶媒中に組み込むこと、必要に応じて、それに続く滅菌微量濾過によって調製できる。一般に、分散物は、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末のための、調製法の例として、事前に滅菌濾過されたその溶液から抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣおよび任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および凍結－乾燥（凍結乾燥）がある。
【0134】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体もしくはＡＤＣまたは本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体もしくはＡＤＣの組合せを含有し得る。
【0135】
抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの効率的な投与量および投与計画は、処置されるべき疾患または状態に応じて変わり、分子生物学の技術分野の当業者によって決定できる。本発明の化合物の治療上有効な量の例示的な限定されない範囲は、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５～５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約４ｍｇ／ｋｇまたは約３ｍｇ／ｋｇまたは約２ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇである。本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの治療上有効な量の例示的な限定されない範囲は、特に、本明細書において開示されるような抗体０１１、０９８、１１４または１１１の、約０．０２～３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５～１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５～５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１～２ｍｇ／ｋｇである。
【0136】
分子生物学の技術分野における通常の技術を有する医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方できる。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで、医薬組成物において使用される抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を段階的に増大できる。本発明の組成物の好適な１日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である化合物の量となる。このような有効な用量は、一般に、上記の因子に応じて変わるであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であり得る、例えば、標的の部位の近位に投与され得る。必要に応じて、医薬組成物の有効な１日用量は、適宜、単位投与形で１日を通じて適当な間隔で別個に投与される２、３、４、５、６またはそれより多い部分用量として投与され得る。本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣにとって、単独で投与されることが可能であるが、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣを上記のような医薬組成物として投与することが好ましい。
【0137】
第２９の実施形態では、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、１０～１５００ｍｇ／ｍ２、例えば、３０～１５００ｍｇ／ｍ２または例えば、５０～１０００ｍｇ／ｍ２、または例えば、１０～５００ｍｇ／ｍ２、または例えば、１００～３００ｍｇ／ｍ２の毎週の投与量で注入によって投与され得る。このような投与は、例えば、１回～８回、例えば、３回～５回反復され得る。投与は、２時間～２４時間、例えば、２時間～１２時間の期間にわたる連続注入によって実施され得る。
【0138】
第３０の実施形態では、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、３０～１５００ｍｇ／ｍ２、例えば、５０～１０００ｍｇ／ｍ２または１００～３００ｍｇ／ｍ２の投与量で３週間毎の注入によって投与され得る。このような投与は、例えば、１回～８回、例えば、３回～５回反復され得る。投与は、２時間～２４時間、例えば、２時間～１２時間の一定期間にわたる連続注入によって実施され得る。
【0139】
第３１の実施形態では、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、毒性副作用を低減するために、長期間、例えば、２４時間より長い期間にわたる遅い連続に注入によって投与され得る。
【0140】
第３２の実施形態では、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、５０ｍｇ～２０００ｍｇ、例えば、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇまたは２０００ｍｇなどの毎週の投与量で最大１６回、例えば、４～１０回、例えば、４～６回投与され得る。投与は、２～２４時間、例えば、２～１２時間の期間にわたる連続注入によって実施され得る。このようなレジメンは、例えば、６ヶ月または１２ヶ月後に必要に応じて１回または複数回反復され得る。投与量は、例えば、生体試料を採取することおよび本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、投与の際の血液中の本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣの量を測定することによって決定または調整され得る。
【0141】
第３３の実施形態では、抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体またはＡＤＣは、維持療法、例えば、週に１回、６ヶ月以上の期間などによって投与され得る。
【0142】
第３４の実施形態では、ＡＤＣは、本発明のＡＤＣの１回の注入と、それに続く本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体、例えば、抗体６Ｈ５ｈｕｍの注入を含むレジメンによって投与され得る。
【0143】
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）
第３５の実施形態では、それを必要とする対象においてＨＥＲＶ－Ｋ陽性がんを処置する方法であって、対象に、２つの異なる抗原結合領域、ＣＤ３またはＣＤ８に対する結合特異性を有するものと、ＨＥＲＶ－Ｋに対する結合特異性を有するものとを含む二重特異性抗体の治療上有効な量を投与することを含む方法が本明細書において提供される。
第３５の実施形態では、それを必要とする対象においてＨＥＲＶ－Ｋ陽性がんを処置する方法であって、対象に、２つの異なる抗原結合領域、ＣＤ３またはＣＤ８に対する結合特異性を有するものと、ＨＥＲＶ－Ｋに対する結合特異性を有するものとを含む二重特異性抗体の治療上有効な量を投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【0144】
第３６の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化リガンドＣＤ３またはＣＤ８に結合する第２の単鎖ヒト可変領域と直列に、ＨＥＲＶ－Ｋに結合する第１の単鎖ヒト可変領域を含む二重特異性抗体に関する。第１および第２の単鎖ヒト可変領域は、アミノからカルボキシの順序にあり、リンカー配列が、前記セグメントの各々の間に介在し、スペーサーポリペプチドは、第１および第２の単鎖可変領域を連結する。
【0145】
本方法の第３７の実施形態では、投与することは、静脈内または腹腔内である。
【0146】
本方法の第３８の実施形態では、二重特異性結合分子は、前記投与ステップの際にＴ細胞に結合されない。
【0147】
本明細書において記載される方法の第３９の実施形態では、方法は、対象にＴ細胞を投与することをさらに含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、前記二重特異性結合分子と同一の分子に結合されない。
【0148】
第４０の実施形態では、治療上有効な量の二重特異性結合分子、薬学的に許容される担体およびＴ細胞を含む医薬組成物が本明細書において提供される。第４１の実施形態では、Ｔ細胞は、二重特異性結合分子に結合される。第４２の実施形態では、二重特異性結合分子へのＴ細胞の結合は、非共有結合的である。第４３の実施形態では、投与することは、ＨＥＲＶ－Ｋ陽性がんの処置のための対象へのＴ細胞注入と組み合わせて実施される。第４４の実施形態では、投与することは、Ｔ細胞注入を用いる患者の処置の後に実施される。第４５の実施形態では、Ｔ細胞は、それが投与される対象に対して自己である。第４６の実施形態では、Ｔ細胞は、それが投与される対象に対して同種異系である。第４７の実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【0149】
本明細書に記載される方法の第４８の実施形態では、対象はヒトである。
【0150】
本方法の第４９の実施形態では、二重特異性結合分子が、医薬組成物中に含有され、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0151】
二重特異性結合分子の第５０の実施形態では、二重特異性結合分子は、その可溶性または細胞結合型形態Ｆｃ受容体に結合しない。二重特異性結合分子の一部の実施形態では、重鎖は、Ｎ結合型グリコシル化部位を破壊するように突然変異された。二重特異性結合分子の第５１の実施形態では、重鎖は、Ｎ結合型グリコシル化部位であるアスパラギンをグリコシル化部位として機能しないアミノ酸と置き換えるアミノ酸置換を有する。二重特異性結合分子の第５２の実施形態では、重鎖は、Ｃ１ｑ結合部位を破壊するように突然変異された。第５３の実施形態では、二重特異性結合分子は、補体を活性化しない。
【0152】
二重特異性結合分子の第５４の実施形態では、ＨＥＲＶ－Ｋ陽性がんは、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、結腸直腸がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんまたはＨＥＲＶ－Ｋを発現する任意の他の新生物組織である。第５５の実施形態では、ＨＥＲＶ－Ｋ陽性がんは、原発腫瘍または転移性腫瘍、例えば、脳、骨または肺転移である。
【0153】
ＤＮＡコード化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＤＢｉＴＥ）
ｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む特定の抗体療法は、がん免疫療法の重要なツールである。ＢｉＴＥは、がんの免疫療法の展望を変化させる可能性を有する人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスである。ＢｉＴＥは、がん細胞に対する宿主の免疫系、より詳しくはＴ細胞の細胞傷害性活性を指示する。ＢｉＴＥは、２つの結合ドメインを有する。一方のドメインは、標的化される腫瘍（ＨＥＲＶ－Ｋを発現する細胞のような）に結合し、もう一方は、Ｔ細胞上の分子への直接的な結合によって免疫系に関与する。この二重結合性活性が、腫瘍で直接的にＴ細胞活性化を駆動し、その結果、死滅化機能および腫瘍破壊をもたらす。ＤＢｉＴＥは、二重特異性モノクローナル抗体の多数の利点を共有する。両者は、２つの抗体断片をコードする操作されたＤＮＡ配列から構成される。患者自身の細胞が、送達されたＤＢｉＴＥ配列によってコードされる機能的ＢｉＴＥＳを製造する工場からなる。耐性がんを処置するための多方面アプローチとして、ＢｉＴＥのデリバリーおよびＤＢｉＴＥの組合せが一度に投与されることを可能にすること。ＢｉＴＥ様分子の合成ＤＮＡ設計は、最適化合成プラスミドＤＮＡカセット中にそれらを操作することおよびコードすることを含む。次いで、ＤＢｉＴＥを筋肉中に局所注射し、筋肉細胞が遺伝子指令をタンパク質に変換し、分子をインビボで血流中に直接送り出して、腫瘍を探し、破壊することを可能にする。Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ４（８）， ｅ１２６０８６ （Ａｐｒｉｌ １８， ２０１９）を参照されたい。前臨床研究では、ＤＢｉＴＥは、従来のＢｉＴＥと比較して独特のプロファイルを実証し、生成と関連する技術的課題の一部を克服した。さらなる情報については、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１６／０５４１５３（Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）およびＷＯ２０１８／０４１８２７（ＰｓｉｏｘｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）も参照されたい。
ｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む特定の抗体療法は、がん免疫療法の重要なツールである。ＢｉＴＥは、がんの免疫療法の展望を変化させる可能性を有する人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスである。ＢｉＴＥは、がん細胞に対する宿主の免疫系、より詳しくはＴ細胞の細胞傷害性活性を指示する。ＢｉＴＥは、２つの結合ドメインを有する。一方のドメインは、標的化される腫瘍（ＨＥＲＶ－Ｋを発現する細胞のような）に結合し、もう一方は、Ｔ細胞上の分子への直接的な結合によって免疫系に関与する。この二重結合性活性が、腫瘍で直接的にＴ細胞活性化を駆動し、その結果、死滅化機能および腫瘍破壊をもたらす。ＤＢｉＴＥは、二重特異性モノクローナル抗体の多数の利点を共有する。両者は、２つの抗体断片をコードする操作されたＤＮＡ配列から構成される。患者自身の細胞が、送達されたＤＢｉＴＥ配列によってコードされる機能的ＢｉＴＥＳを製造する工場からなる。耐性がんを処置するための多方面アプローチとして、ＢｉＴＥのデリバリーおよびＤＢｉＴＥの組合せが一度に投与されることを可能にすること。ＢｉＴＥ様分子の合成ＤＮＡ設計は、最適化合成プラスミドＤＮＡカセット中にそれらを操作することおよびコードすることを含む。次いで、ＤＢｉＴＥを筋肉中に局所注射し、筋肉細胞が遺伝子指令をタンパク質に変換し、分子をインビボで血流中に直接送り出して、腫瘍を探し、破壊することを可能にする。Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ， ４（８）， ｅ１２６０８６ （Ａｐｒｉｌ １８， ２０１９）を参照されたい。前臨床研究では、ＤＢｉＴＥは、従来のＢｉＴＥと比較して独特のプロファイルを実証し、生成と関連する技術的課題の一部を克服した。さらなる情報については、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１６／０５４１５３（Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ）およびＷＯ２０１８／０４１８２７（ＰｓｉｏｘｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）も参照されたい。
【0154】
ＨＥＲＶ－Ｋ ＣＡＲ－Ｔ療法
標的抗原に特異的なＣＡＲの多数の製剤が開発されている。例えば、国際特許公開ＷＯ２０１４／１８６４６９（理事会、テキサスシステム大学）を参照されたい。本明細書は、例えば、微小残存病変（ＭＲＤ）を示す白血病患者を処置する目的で、インビボで長寿命の可能性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）媒介性Ｔ細胞を生成する方法を提供する。全体として、この方法は、可溶性分子、例えば、サイトカインを治療的可能性を増強するために細胞表面に融合させることができる方法を説明している。この方法の核心は、ＣＡＲＴ細胞を、以降ｍＩＬ１５と呼ばれるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のヒトサイトカイン変異タンパク質を用いて同時改変することに依存している。ｍＩＬ１５融合タンパク質は、可動性セリン－グリシンリンカーを介して全長ＩＬ１５受容体アルファに融合されたＩＬ－１５のコドン最適化ｃＤＮＡ配列から構成される。このＩＬ－１５変異タンパク質は、（ｉ）外因性可溶性サイトカイン投与が毒性につながったので、ｍＩＬ１５発現をＣＡＲ＋Ｔ細胞の表面に限定して、非標的インビボ環境へのサイトカインの核酸を制限し、それによって、その安全性プロファイルを潜在的に改善する、および（ｉｉ）ＩＬ－１５Ｒａとの関連でＩＬ－１５を提示して、生理学的に関連する定性的シグナル伝達を模倣する、ならびにより長いサイトカイン半減期のためのＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体の安定化および再利用のためにこのような様式で設計された。ｍＩＬ１５を発現するＴ細胞は、注入後のその生存にとって重要である、支持的サイトカインシグナル伝達を継続可能である。非ウイルスＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系遺伝子改変および臨床的に適用可能なプラットフォームでのその後の生体外拡大増殖によって生成されたｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、高い、低い腫瘍負荷を有する、または腫瘍負荷のないマウスモデルにおいて注入後の残留性が増強されたＴ細胞注入生成物をもたらした。さらに、ｍＩＬ１５ ＣＡＲ＋Ｔ細胞はまた、高および低腫瘍負荷モデルの両方において抗腫瘍効力の改善を実証した。レンチウイルスベクターにおいて、ｈｕ６Ｈ５ ｓｃＦｖを使用して、Ｋ－ＣＡＲを生成した。
標的抗原に特異的なＣＡＲの多数の製剤が開発されている。例えば、国際特許公開ＷＯ２０１４／１８６４６９（理事会、テキサスシステム大学）を参照されたい。本明細書は、例えば、微小残存病変（ＭＲＤ）を示す白血病患者を処置する目的で、インビボで長寿命の可能性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）媒介性Ｔ細胞を生成する方法を提供する。全体として、この方法は、可溶性分子、例えば、サイトカインを治療的可能性を増強するために細胞表面に融合させることができる方法を説明している。この方法の核心は、ＣＡＲＴ細胞を、以降ｍＩＬ１５と呼ばれるインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のヒトサイトカイン変異タンパク質を用いて同時改変することに依存している。ｍＩＬ１５融合タンパク質は、可動性セリン－グリシンリンカーを介して全長ＩＬ１５受容体アルファに融合されたＩＬ－１５のコドン最適化ｃＤＮＡ配列から構成される。このＩＬ－１５変異タンパク質は、（ｉ）外因性可溶性サイトカイン投与が毒性につながったので、ｍＩＬ１５発現をＣＡＲ＋Ｔ細胞の表面に限定して、非標的インビボ環境へのサイトカインの核酸を制限し、それによって、その安全性プロファイルを潜在的に改善する、および（ｉｉ）ＩＬ－１５Ｒａとの関連でＩＬ－１５を提示して、生理学的に関連する定性的シグナル伝達を模倣する、ならびにより長いサイトカイン半減期のためのＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体の安定化および再利用のためにこのような様式で設計された。ｍＩＬ１５を発現するＴ細胞は、注入後のその生存にとって重要である、支持的サイトカインシグナル伝達を継続可能である。非ウイルスＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ系遺伝子改変および臨床的に適用可能なプラットフォームでのその後の生体外拡大増殖によって生成されたｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、高い、低い腫瘍負荷を有する、または腫瘍負荷のないマウスモデルにおいて注入後の残留性が増強されたＴ細胞注入生成物をもたらした。さらに、ｍＩＬ１５ ＣＡＲ＋Ｔ細胞はまた、高および低腫瘍負荷モデルの両方において抗腫瘍効力の改善を実証した。レンチウイルスベクターにおいて、ｈｕ６Ｈ５ ｓｃＦｖを使用して、Ｋ－ＣＡＲを生成した。
【0155】
併用療法
本明細書の療法は、インサイツでＨＥＲＶ－Ｋ＋がん細胞の表面抗原へ抗体または断片が結合し、そこで免疫攻撃を刺激することに依存し、改変を用いずに使用できる。あるいは、前記の方法は、細胞傷害性薬剤が結合している抗体または結合断片を使用して実施できる。腫瘍細胞への細胞傷害性抗体または抗体結合断片の結合が、細胞の成長を阻害する、または細胞を死滅させる。
本明細書の療法は、インサイツでＨＥＲＶ－Ｋ＋がん細胞の表面抗原へ抗体または断片が結合し、そこで免疫攻撃を刺激することに依存し、改変を用いずに使用できる。あるいは、前記の方法は、細胞傷害性薬剤が結合している抗体または結合断片を使用して実施できる。腫瘍細胞への細胞傷害性抗体または抗体結合断片の結合が、細胞の成長を阻害する、または細胞を死滅させる。
【0156】
ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質に特異的な抗体を、他の発現されたＨＥＲＶ抗原とともに使用できる。これは、いくつかの異なるＨＥＲＶが発現される疾患の免疫療法および抗体処置にとって特に有用であり得る。例えば、前立腺におけるＨＥＲＶ－Ｅ、卵巣がんにおけるＥＲＶ３、ＨＥＲＶ－ＥおよびＨＥＲＶ－Ｋならびに他のがんにおけるＥＲＶ３、ＨＥＲＶ－ＨおよびＨＥＲＶ－Ｗ。
【0157】
共通ガンマ鎖受容体ファミリー（γＣ）中のサイトカインは、リンパ系機能、生存および増殖にとって重要であるＴ細胞の重要な共刺激分子である。ＩＬ－１５は、養子療法にとって望ましいいくつかの特質を有する。ＩＬ－１５は、長寿命メモリー細胞傷害性Ｔ細胞の生存を支持し、腫瘍常在性細胞の機能抑制の軽減を介して定着腫瘍の根絶を促進し、活性化誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）を阻害する恒常性サイトカインである。ＩＬ－１５は、組織に限定され、病的状態下でのみであり、血清中または全身で任意のレベルで観察される。周囲の環境中に分泌される他のγＣサイトカインとは異なり、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）の関連で産生細胞によってＴ細胞にトランス提示される。このサイトカインのＴ細胞および他の応答性細胞への独特のデリバリー機序は、（ｉ）高度に標的化され、局在化され、（ｉｉ）ＩＬ－１５の安定性および半減期を増大し、（ｉｉｉ）可溶性ＩＬ－１５によって達成されるものとは質的に異なるシグナル伝達をもたらす。
【0158】
医薬組成物
本明細書はまた、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質に特異的に結合する療法を、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に含む医薬組成物を対象とする。このような医薬組成物は、非経口、局所、経口または局所（エアゾールまたは経皮など）またはそれらの任意の組合せを含む任意の好適な方法で投与できる。好適なレジメンはまた、静脈内ボーラス注射による最初の投与と、それに続く１つまたは複数の間隔での反復用量を含む。
本明細書はまた、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質に特異的に結合する療法を、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に含む医薬組成物を対象とする。このような医薬組成物は、非経口、局所、経口または局所（エアゾールまたは経皮など）またはそれらの任意の組合せを含む任意の好適な方法で投与できる。好適なレジメンはまた、静脈内ボーラス注射による最初の投与と、それに続く１つまたは複数の間隔での反復用量を含む。
【0159】
本開示の化合物の医薬組成物は、所望の程度の純度を有する化合物を含有するペプチドリガンドを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄ．， １９９０）と混合することによって保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。
【0160】
本明細書における組成物はまた、処置されている特定の適応症に対して必要に応じて１種よりも多い活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものも含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、成長阻害性薬剤および／または心臓保護薬を含み得る。このような分子は、意図される目的にとって有効である組合せで、量で適宜存在する。
【0161】
本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、決して、本発明の範囲または内容を制限するように意図するものではない。
【実施例】
【0162】
［実施例１］
【化2】
【0163】
ＶＨ
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡ（配列番号２）
ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡ（配列番号２）
【0164】
＞ＦＷＪ＿ＶＨ
ＱＶＫＬＱＱＳＧＰＤＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３）
ＱＶＫＬＱＱＳＧＰＤＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３）
【化3】
【表1】
【0165】
ＶＬ
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣ（配列番号４）
ＧＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣ（配列番号４）
【0166】
＞ＦＷＪ＿ＶＬ
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５）
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５）
【表2】
【化4】
【0167】
ヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体の設計
抗体番号付けスキームおよびＣＤＲ定義：抗体番号付けサーバーは、ＫａｂａｔＭａｎデータベースの一部であり（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／）、これを使用し、増強Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従ってこの研究のすべての抗体配列を番号付けした。このヒト化研究では、本発明者らは、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けを抗体配列の接触ＣＤＲ定義と組み合わせて、抗体軽鎖および重鎖のＣＤＲを以下の位置に配置した：Ｈ－ＣＤＲ１ ３０～３５、Ｈ－ＣＤＲ２ ４７～５８ Ｈ－ＣＤＲ３ ９３～１０１、Ｌ－ＣＤＲ１ ３０～３６、Ｌ－ＣＤＲ２ ４６～５５およびＬ－ＣＤＲ３ ８９～９６。
抗体番号付けスキームおよびＣＤＲ定義：抗体番号付けサーバーは、ＫａｂａｔＭａｎデータベースの一部であり（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／）、これを使用し、増強Ｃｈｏｔｈｉａスキームに従ってこの研究のすべての抗体配列を番号付けした。このヒト化研究では、本発明者らは、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けを抗体配列の接触ＣＤＲ定義と組み合わせて、抗体軽鎖および重鎖のＣＤＲを以下の位置に配置した：Ｈ－ＣＤＲ１ ３０～３５、Ｈ－ＣＤＲ２ ４７～５８ Ｈ－ＣＤＲ３ ９３～１０１、Ｌ－ＣＤＲ１ ３０～３６、Ｌ－ＣＤＲ２ ４６～５５およびＬ－ＣＤＲ３ ８９～９６。
【0168】
ヒト鋳型の選択：ヒト化ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、マウスＶＨおよびＶＬの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、選択されたヒトフレームワーク（ＦＲ）にグラフトし、所与の抗体のヒト化に対して最高のアミノ酸配列同一性を示した。マウスＦＷＪ抗体クローンの選択されたヒトＦＲとして、ヒト免疫グロブリン生殖系列配列を使用した（図１）。ヒトとマウスＦＷＪ ＶＨおよびＶＬの間でＦＲにおいて最高のアミノ酸配列類似性を示すヒト免疫グロブリン生殖系列配列を、Ｖ－ｑｕｅｓｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ）およびＩｇ－ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）を使用して独立に同定した。選択された重鎖ＶＨＩＩＩおよび軽ＫＩ鎖は保存された生殖系列に基づく。ＦＷＪのＣＤＲ残基をグラフトするために選択された生殖系列遺伝子の間でコンセンサスヒトＦＲを設計した。バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）残基および鎖パッキング残基（ｐａｃｋｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）として知られる位置にマウス残基を保存しながら、コンセンサスヒトＦＲとは異なっていたマウスＶＨおよびＶＬのＦＲ中のアミノ酸配列をヒト残基と置換した。
【0169】
＞ＨＵＭ１－ＦＷＪＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．７である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．７である。
【0170】
＞Ｈｕｍ２ ＦＷＪＶＨ ＶＨ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．５である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．５である。
【0171】
＞ＦＷＪ＿ＶＨ
ＱＶＫＬＱＱＳＧＰＤＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号８）。クエリー配列のＺ－スコアは、－１．７である。
ＱＶＫＬＱＱＳＧＰＤＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号８）。クエリー配列のＺ－スコアは、－１．７である。
【0172】
【表3】
【0173】
【表4】
【0174】
【表5】
【0175】
＞ＨＵＭ１ＦＷＪＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．１である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．１である。
【0176】
＞ＨＵＭ２ＦＷＪＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．０である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）。クエリー配列のＺ－スコアは、０．０である。
【0177】
＞ＦＷＪ＿ＶＬ
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１１）。クエリー配列のＺ－スコアは、－１．０である。
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＴＤＤＶＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１１）。クエリー配列のＺ－スコアは、－１．０である。
【0178】
ｓｃＦｖ遺伝子の最終ヒト化バージョン
ヒト化ｓｃＦｖ－１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）
ヒト化ｓｃＦｖ－１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）
【0179】
ヒト化ｓｃＦｖ－２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）
【0180】
ｓｃＦｖの構築およびヒトＫＶおよび２３１抗原に対する生物活性の試験。ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２抗体遺伝子の、可変の重鎖および軽鎖のクローンを増幅し、合成した。ｓｃＦｖをコードする遺伝子は、標準の２０個のアミノ酸のリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＧＧＧＡＲ（配列番号１４）を有するＶＨ－リンカー－ＶＬである。増幅された遺伝子を、ＢｓｓＨＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素を用いて消化し、周辺質タンパク質発現を制御するためのｐｅｌＢプロモーターを含有するｐＥＴベースのベクター（ＰＡＢ－ｍｙｃ）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）中に、金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのＣ末端の６×ヒスチジンタグとともに挿入し、ＤＨ５α細菌株中に形質転換した。形質転換されたクローンをアンピシリンブロスを有するＬＢ中で一晩増幅させた。プラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡシーケンシングのために送った。ｓｃＦｖプラスミドの正しい配列をＴ７シャトル細菌株中に形質転換し、形質転換された細菌を、周辺質コンパートメントにおける可溶性タンパク質生成のために使用した。
【0181】
ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２＿ｓｃＦｖ＿遺伝子および翻訳されたタンパク質配列：以下の図は、ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２＿ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖およびリンカーアームを描写する。ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２＿ｓｃＦｖ遺伝子の操作では、２つのエピトープタグをＣ末端上に操作した：１）ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるコードされたｓｃＦｖの精製を促進するための６つのｈｉｓタグ；および２）発現されたｓｃＦｖの迅速な免疫化学認識を促進するためのｍｙｃタグ。
【0182】
ｓｃＦｖ遺伝子の最終ヒト化バージョン
ヒト化ｓｃＦｖ－１ ＦＷＪ＿ｈｕｍｓｃＦｖ－１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５）
ヒト化ｓｃＦｖ－１ ＦＷＪ＿ｈｕｍｓｃＦｖ－１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＡＴＬＳＶＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５）
【0183】
【化5】
【化6】
【0184】
ヒト化ＦＷＪ＿ｈｕｍｓｃＦｖ－２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＶＮＰＮＳＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＲＤＫＳＩＳＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＫＧＮＹＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＨＧＴＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＦＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＩＹＹＣＱＱＳＮＥＤＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８）
【0185】
【化7】
【化8】
【0186】
細菌宿主におけるＳｃＦｖタンパク質の誘導：ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２ｓｃＦｖクローンをＴ７シャトル細菌株中に形質転換した。Ｔ７シャトル細胞を１．４Ｌの２ｘＹＴおよびアンピシリン培地中、３７℃で対数期（ｌｏｇ－ｐｈａｇｅ）（ＯＤ６００＝０．５）まで増殖させ、０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、３０℃でさらに１６時間増殖させた。誘導後、細菌を８０００ｇで１５分間４℃での遠心分離によって回収し、ペレットを－２０℃で少なくとも２時間保存した。凍結ペレットを短時間解凍し、４０ｍｌの溶解緩衝液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよびＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、マサチューセッツ州、ウォルサム）に懸濁した。溶解混合物を氷上で１時間インキュベートし、次いで、１０ｍＭのＭｇＣＬ２および１μｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩを添加し、混合物を２５℃で２０分間インキュベートした。最終溶解混合物を１２０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を収集した。この上清を周辺質抽出物と呼び、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーに使用した。
【0187】
ＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２＿ｓｃＦｖタンパク質を使用するウエスタンブロット解析：溶解物ＡｇおよびＫＳＵタンパク質をドットブロット解析における抗原標的として使用した。非還元条件のものとして２～５μｇのＡｇタンパク質および陰性対照として１μｇの精製タンパク質を、ニトロセルロースメンブレンン上にロードした。ＰＢＳ中、３％の脱脂乳を使用し、室温で３時間メンブレンをブロッキングした。その後、メンブレンをＦＷＪ＿１およびＦＷＪ＿２ ｓｃＦｖタンパク質の周辺質抽出物とともに４℃で一晩インキュベートした。メンブレンを、０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０緩衝液を有するリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。洗浄したメンブレンを、ｓｃＦｖ上のｃ－Ｍｙｃタグを認識するために抗ｃ ＭｙｃマウスＩｇＧとともに室温で１時間インキュベートして、ｓｃＦｖによって結合された抗原の位置を同定した。ＰＢＳＴで洗浄した後、メンブレンを、ＰＢＳで希釈した（１：３０００ ｖ／ｖ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰコンジュゲートとともに室温で１時間インキュベートし、ＴＭＢ基質の混合物を用いて特異的免疫反応のバンドを可視化した。
【0188】
本発明者らは、抗ＨＥＲＶ－Ｋ ｍＡｂ ６Ｈ５重鎖ＣＤＲ（Ｈ－ＣＤＲ１ ３０～３５、Ｈ－ＣＤＲ２ ４７～５８、Ｈ－ＣＤＲ３ ９３～１０１）および軽鎖ＣＤＲ（Ｌ－ＣＤＲ１ ３０～３６、Ｌ－ＣＤＲ２ ４６～５５およびＬ－ＣＤＲ３ ８９～９６）を同定し、それらを選択されたヒトフレームワーク（ＦＲ）上にグラフトし、最高のアミノ酸配列同一性を示し、所与の抗体のヒト化を最適化した。ヒトとマウスＶＨおよびＶＬの間でＦＲにおいて最高アミノ酸配列類似性を示すヒト免疫グロブリン生殖系列配列を、Ｖ－ｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ）およびＩｇ－ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ）サーバーから独立に同定した。バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）残基および鎖パッキング残基（ｐａｃｋｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）として知られる位置にマウス残基を保存しながら、コンセンサスヒトＦＲとは異なるマウスＶＨおよびＶＬのＦＲ中のアミノ酸配列を、ヒト残基と置換した。候補ヒト化抗体遺伝子のＶＨおよびＶＬ鎖のクローンを増幅し、合成した。ｓｃＦｖをコードし、標準の２０個のアミノ酸のリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＧＧＧＡＲを有するＶＨ－リンカー－ＶＬを含む遺伝子を、周辺質タンパク質発現を制御するためのｐｅｌＢプロモーターを含有するｐＥＴベースのベクター（ＰＡＢ－ｍｙｃ）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国、ウィスコンシン州、マディソン）中に、金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのＣ末端の６×ヒスチジンタグおよび発現されたｓｃＦｖの迅速な免疫化学認識を促進するためのｍｙｃタグとともに挿入した。ｓｃＦｖプラスミドの正しい配列を、周辺質コンパートメントにおける可溶性タンパク質生成のために使用した。２つのｈｕ６Ｈ５クローン（ＦＷＪ１およびＦＷＪ２）を選択し、抗原に対する結合親和性を決定した。両クローンとも、組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成された抗原およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞からの溶解物に結合できた。
【0189】
ヒトＩｇＧ１を有するＨｕＶＨまたはＨｕＶＬを、ｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にクローニングして、ＶＨ－ＣＨ（ヒトＩｇＧ１）またはＶＬ－ＣＬ（ヒトカッパ）を生成した。哺乳動物発現のためにプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。Ｈ鎖対Ｌ鎖プラスミドの比は、２：３とする。ウエスタンブロットを使用して、発現を決定し、還元条件下で４９／２３ｋＤａ（Ｈ鎖／Ｌ鎖）の予測されたＭＷが検出された（図１）。
【0190】
サイズおよび／または分子量によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分離をさらに使用して、タンパク質発現を決定した（図２）。最後に、エンドトキシンレベル＜１ＥＵ／ｍｇを有するヒト化６Ｈ５抗体（純度＞９５％）を使用して、インビトロおよびインビボで抗腫瘍効果を決定した。
【0191】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ｈｕ６Ｈ５対ｍ６Ｈ５の抗原結合感受性および特異性を比較した（図３）。これら２つのパラメータ間に有意差は検出されなかった。
【0192】
アポトーシスアッセイを使用して、がん細胞を死滅させることにおいてｈｕ６Ｈ５およびｍ６Ｈ５の有効性を比較した。それぞれの抗体（１ｍｌあたり１または１０μｇ）を使用して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を４時間および２４時間処置した（図４）。抗体なしまたはｍＩｇＧもしくはヒトＩｇＧを用いて処置した細胞を対照として使用した。結果は、ｈｕ６Ｈ５は、これらの乳がん細胞を死滅させることにおいてｍ６Ｈ５と同様の効果を有していることを示した。細胞死滅における有効性をさらに評価するために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を種々の抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて１６時間処置した。同時染色生／死生存率アッセイを使用して生細胞（緑色；カルセインＡｍ）および推定死細胞（赤色；ＥｔｈＤ－１）を同定し（図５）、結果は、ｈｕ６Ｈ５が乳がん細胞の死滅においてｍ６Ｈ５と同様である有効性を有することを示した。さらに、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して、ｈｕ６Ｈ５ががん細胞成長を阻害できることを確認した（図６）。ＡＤＣＣを使用して、ＢＣ細胞死滅の機序を決定し、本発明者らの結果は、抗体によって覆われた標的細胞を溶解する細胞傷害性分子のエフェクター細胞媒介性分泌を支持した（図７）。
【0193】
フローサイトメトリーを使用して、ｈｕ６Ｈ５がｐ－ＥＲＫ、ＲａｓおよびＳＩＲＴ－１の発現を下方制御できるか否かを決定した。２３１Ｃまたは２３１Ｋ細胞を、１ｍｌあたり１０μｇのｈｕ６Ｈ５を用いて１６時間処置した。許容下（ｕｎｄｅｒ ｐｅｒｍ）および非許容（ｎｏｎ－ｐｅｒｍ）の両細胞におけるＨＥＲＶ－Ｋ、ＳＩＲＴ－１（図８Ａ）、ｐ－ＥＲＫおよびＲａｓ（図８Ｂ）の発現。ｈｕ６Ｈ５を用いて処置された２３１Ｋまたは２３１Ｃにおいて、ＨＥＲＶ－Ｋ、ｐ－ＥＲＫ、ＲａｓおよびＳＩＲＴ－１の下方制御された発現が実証された。
【0194】
【化9】
【0195】
【化10】
【0196】
【化11】
【0197】
【化12】
【0198】
ｐＬＶＸＫは、ＨＥＲＶ－Ｋ発現ベクターであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＫは、ｐＬＶＸＫで形質導入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞である。同様に、ｐＬＶＸＣは、対照発現ベクターのみであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＫは、ｐＬＶＸＣで形質導入されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞である。ＮＳＧ雌マウス（８週齢）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＣ（２３１－Ｃ；皮下、２００万個の細胞）対ＭＤＡ＿ＭＢ－２３１ ｐＬＶＸＫ（２３１－Ｋ；皮下、２００万個の細胞）を接種した。６日目に、マウスをｈｕ６Ｈ５（４ｍｇ／ｋｇ腹腔内、週に２回、３週間）を用いて処置した。腫瘍成長をモニタリングし、隔日で測定した。種々の時間間隔で生存しているマウスのパーセンテージが図９Ａに示されている。２３１－Ｃおよび抗体を用いて処置された２３１－Ｋ細胞を有するマウスにおいて、より高い生存が実証された。各マウスから腫瘍および肺組織を収集した。２３１－Ｋ細胞を有する一部のマウスにおいてより大きなリンパ節が検出されたが、２３１－Ｃ細胞を有するマウスでは検出されなかった。
【0199】
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色をさらに使用して、腫瘍組織（図９）および他の器官に由来する組織（肺およびリンパ節；図１０）の形態学的特徴を評価した。Ｈ＆Ｅ染色によって腫瘍面積を測定することによって、病理学者によって腫瘍生存率および腫瘍壊死を定量化した。ヒト化抗体処置は、より小さい腫瘍体積、より少ない腫瘍限局性（ｆｏｃａｌｉｔｙ）および数、より少ない浸潤性境界ならびに有糸分裂活性の減少をもたらした。２３１－Ｃ細胞（図９Ｂ）を有するマウスにおいて、または抗体を用いて処置された２３１－Ｋ細胞（図１０Ｂ）において、腫瘍生存率のパーセンテージの低減が観察された。２３１Ｃ（図９Ｂ）またはｈｕ６Ｈ５を用いて処置された２３１Ｋ細胞（図９Ｃ）において、その対照と比較して腫瘍可変性の低減が実証された。抗Ｋｉ６７および抗ＨＥＲＶ－Ｋ ｍＡｂを使用した（図９Ｄ）。対照（６０％；上部パネル；図９Ｂ）と比較して、ｈｕ６Ｈ５を用いて処置されたマウス（２０％；下部パネル）において、腫瘍生存率の低減が実証された。抗体処置群は、外観においてより均一であり、より少ない多形核およびより小さい核小体を有し、腫瘍浸潤性リンパ球は数が有意に増大した。
【0200】
２３１－Ｋ細胞を有するマウスから得られた肺組織では、転移性腫瘍細胞も見出されたが、２３１－Ｃ細胞を有するマウスでは見出されなかった（図１０Ａ）。腫瘍生存率のパーセンテージの低減が、抗体を用いて処置されていないものと比較して抗体を用いて処置された２３１－Ｋを有するマウスの肺において観察された（図１０Ｂ）。転移性リンパ節が、２３１Ｋ細胞を接種されたマウスにおいてのみ検出された（図１０Ｃ）。２３１－Ｋ細胞を有するマウスのリンパ節において９５％より大きな腫瘍生存率が検出され（図１０Ｃ；＞９５％；上部パネル）、抗体を用いて処置されたマウスのリンパ節において（図１０Ｃ；４０％；下部パネル）、抗体を用いて処置されていないマウス（図１０Ｄ）と比較して、腫瘍生存率のパーセンテージの低減が観察された。腹水は、抗体処置を用いない２３１Ｋまたは２３１Ｃ腫瘍細胞を保持したマウスにおいて実証された。
【0201】
［実施例２］
ＨＥＲＶ－Ｋを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の有効性
ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかおよびＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体からなる、Ｔ細胞ＣＤ３またはＣＤ８および腫瘍関連抗原ＨＥＲＶ－Ｋに向けられたＢｉＴＥを生成した。このＢｉＴＥは、ＨＥＲＶ－Ｋエピトープが負荷された腫瘍組織適合性クラス（ＭＨＣ）分子を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞に対するインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮガンマ）細胞傷害性活性を誘発すると示され、ＢｉＴＥを用いる処置後にＩＦＮガンマ発現が２０～３０倍増大した（図１１）。
ＨＥＲＶ－Ｋを標的とする二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の有効性
ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかおよびＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体からなる、Ｔ細胞ＣＤ３またはＣＤ８および腫瘍関連抗原ＨＥＲＶ－Ｋに向けられたＢｉＴＥを生成した。このＢｉＴＥは、ＨＥＲＶ－Ｋエピトープが負荷された腫瘍組織適合性クラス（ＭＨＣ）分子を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞に対するインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮガンマ）細胞傷害性活性を誘発すると示され、ＢｉＴＥを用いる処置後にＩＦＮガンマ発現が２０～３０倍増大した（図１１）。
【0202】
ＢｉＴＥは、Ｔ細胞を腫瘍細胞にリダイレクトし、抗原提示細胞による内因性Ｔ細胞の拡大増殖を必要としない単鎖抗体コンストラクトとして構築された組換えタンパク質構築物である。科学的参考文献５０を参照されたい。ＢｉＴＥ分子は、患者に直接的に投与でき、ＢｉＴＥ媒介性Ｔ細胞活性化は、ＣＡＲがそうであるようにはＭＨＣクラスＩ分子の存在に依存しない。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としてＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖを標的化することの成功およびほぼすべての乳がん細胞株がＫｅｎｖタンパク質を発現することを考慮して、本発明者らは、ＫｅｎｖおよびＣＤ３（Ｋ３Ｂｉ）に特異的なＢｉＴＥは、Ｋ－ＣＡＲがそうであったように転移性疾患を有効に処置すると仮定する。本発明者らは、ＫｅｎｖおよびＣＤ３に対して二重特異性を有するＫ３Ｂｉを設計し、合成した。したがって、Ｔ細胞は、ＨＥＲＶ－Ｋ＋腫瘍細胞を標的とするように指示される。本発明者らは、Ｋ３ＢｉおよびＣＤ８ ＢｉＴＥ（Ｋ８Ｂｉ）を生成し、精製し、検証した。これは、ＣＡＲコンストラクトにおいても使用された（科学的参考文献３３）ｍＡｂ ６Ｈ５と、他のＢｉＴＥにおいてこれまでに使用されたヒトＣＤ３に対する抗体であるＯＫＴ３とを使用して行われ、ヒト化され、可動性リンカーならびに精製および染色のための２つのＣ末端エピトープタグ（ＭＹＣおよびＦＬＡＧ）と接続された。本発明者らの研究室においてＯＫＴ８ハイブリドーマ細胞から得られたＣＤ８単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を生成し、これを使用して、Ｋ８Ｂｉ（ＶＬ－ＶＨ６Ｈ５リンカーＶＨ－ＶＬＣＤ８－ＭＹＣおよびＦＬＡＧ）を生成した。Ｋ３ＢｉおよびＫ８Ｂｉを組換えタンパク質発現のためにｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰレンチまたはｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクター中にクローニングした。Ｋ３ＢｉまたはＫ８ＢｉのＴ細胞およびＨＥＲＶ－Ｋ＋乳がん細胞株に結合する能力をいくつかの免疫アッセイによって決定した。本発明者らは、ＢｉＴＥ濃度が増加すると、ＢｉＴＥに結合した標的細胞の数が増大することを見出した。
【0203】
本発明者らはまた、Ｋ３Ｂｉの、Ｔ細胞活性化、増殖、サイトカインの産生および標的腫瘍細胞の溶解を誘導する能力を調べた。科学的参考文献５１に記載されるように、健常な対照から得たバルクＰＢＭＣ（ウェルあたり５０，０００個）を、１０：１のエフェクター細胞：標的細胞比を達成するようにＫ３Ｂｉ（０、１、１０、１００および１，０００ｎｇ／ｍｌ）および腫瘍細胞（ウェルあたり５，０００個）と同時培養した。１つの結果が図１２に示されている。ＰＢＭＣ＋ＭＣＦ－７＋Ｋ３Ｂｉは、ＰＢＭＣ＋ＭＣＦ－７ Ｋ３Ｂｉなしと比較してがん細胞死滅の増大を示した（図１２Ｂ）。本発明者らが以前に行ったように、細胞生存率および細胞毒性の検出のためにＬＤＨ放出アッセイを使用した。科学的参考文献３３を参照されたい。ＥＬＩＳＡによってアッセイされたＩＦＮ－γ産生の増強（図１２Ｃ）が、Ｋ３Ｂｉを用いて処置されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８およびＭＣＦ－７細胞において観察された。未処置細胞、ＰＢＭＣのみまたはＢｉＴＥのみを対照として使用し、これらの対照群ではＩＦＮ－γ産生は観察されなかった。
【0204】
さらに、ＰＢＭＣおよびＣＤ３ ＨＥＲＶ－Ｋ ＢｉＴＥおよびＩＬ－２またはＣＤ８ ＨＥＲＶ－Ｋ ＢｉＴＥおよびＰＢＭＣおよびＩＬ－２を用いるＨＥＲＶ－Ｋ陽性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を有する免疫不全ＮＳＧマウスの処置は、腫瘍成長のより大きな減少をもたらした（図１３）。
【0205】
［実施例３］
ＣＡＲ－ＡおよびＣＡＲ－Ｂレンチウイルスベクターで形質導入された正常ドナーＰＢＭＣの染色結果
正常ドナーからのＰＢＭＣを、２つのＣＡＲ－ＴレンチウイルスベクターコンストラクトであるＫ－ＣＡＲ－Ａ（ＣＡＲ－Ａ）またはＫ－ＣＡＲ Ｂ（ＣＡＲ－Ｂ）で形質導入した。ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２ｇを有するｐＷＰＴ－ＧＦＰ。ＶＨ－ＶＬｈｕ６Ｈ５－ＣＤ８－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ形質導入プロセスの代替物、すなわち、レンチウイルス形質導入によってＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するためのプロトコールは以下のとおりである：
１．ＰＢＭＣ（２×１０７）を解凍し、プラスチック接着（３７℃、５％ ＣＯ２での１時間のインキュベーション）によって単球を枯渇させる。
２．１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で単球が枯渇したＰＢＭＣを培養する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを３：１のビーズ：細胞比で用い、４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて２４時間刺激する。
３．活性化されたＴ細胞を、ＣＡＲ－ＡまたはＣＡＲ－Ｂレンチウイルス粒子（対照としてＣＤ１９ ＣＡＲ）で形質導入する。
４．形質導入の２４時間後、Ｔ細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および２：１のａＡＰＣ／Ｔ細胞比でγ照射された（１００Ｇｙ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｋｅｎｖ（Ｋｅｎｖは、ＨＥＲＶ－Ｋのエンベロープタンパク質である）ａＡＰＣを含有する完全培地で培養して、ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を刺激する。対照ａＡＰＣとしてγ照射されたＫ５６２－ＣＤ１９を使用する。
５．５日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去する。２～３日毎にＣＡＲ－Ｔ細胞にＩＬ－２を含有する新鮮培地を補充する。
６．ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、増殖が対数期からの減少を示す場合にはさらなる実験を実施する。
ＣＡＲ－ＡおよびＣＡＲ－Ｂレンチウイルスベクターで形質導入された正常ドナーＰＢＭＣの染色結果
正常ドナーからのＰＢＭＣを、２つのＣＡＲ－ＴレンチウイルスベクターコンストラクトであるＫ－ＣＡＲ－Ａ（ＣＡＲ－Ａ）またはＫ－ＣＡＲ Ｂ（ＣＡＲ－Ｂ）で形質導入した。ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２ｇを有するｐＷＰＴ－ＧＦＰ。ＶＨ－ＶＬｈｕ６Ｈ５－ＣＤ８－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ形質導入プロセスの代替物、すなわち、レンチウイルス形質導入によってＨＥＲＶ－Ｋｅｎｖ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するためのプロトコールは以下のとおりである：
１．ＰＢＭＣ（２×１０７）を解凍し、プラスチック接着（３７℃、５％ ＣＯ２での１時間のインキュベーション）によって単球を枯渇させる。
２．１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で単球が枯渇したＰＢＭＣを培養する。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを３：１のビーズ：細胞比で用い、４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて２４時間刺激する。
３．活性化されたＴ細胞を、ＣＡＲ－ＡまたはＣＡＲ－Ｂレンチウイルス粒子（対照としてＣＤ１９ ＣＡＲ）で形質導入する。
４．形質導入の２４時間後、Ｔ細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および２：１のａＡＰＣ／Ｔ細胞比でγ照射された（１００Ｇｙ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｋｅｎｖ（Ｋｅｎｖは、ＨＥＲＶ－Ｋのエンベロープタンパク質である）ａＡＰＣを含有する完全培地で培養して、ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖を刺激する。対照ａＡＰＣとしてγ照射されたＫ５６２－ＣＤ１９を使用する。
５．５日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去する。２～３日毎にＣＡＲ－Ｔ細胞にＩＬ－２を含有する新鮮培地を補充する。
６．ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用して、増殖が対数期からの減少を示す場合にはさらなる実験を実施する。
【0206】
ＣＡＲ－ＡまたはＣＡＲ－Ｂが形質導入された細胞を、γ照射された（１００Ｇｙ）ＭＤＡ ＭＢ ２３１抗原提示細胞と同時培養した。可溶性ＩＬ－２サイトカイン（５０Ｕ／ｍｌ）を隔日で添加した。１４日目に、染色のために細胞を回収した。それらを、まず、１：１０００希釈のＢＶ４５０生および死染色を用いて４℃で２０分間染色した。２０分後、細胞を洗浄し、Ｋ１０－ＡＦ ４８８タンパク質（１μｇ／ｍｌ）、ＣＤ４ Ａｍｃｙａｎ、ＣＤ３ Ｐｅ ｃｙ７およびヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＡＦ ５９４抗体を用い、製造業者の推奨に従って４℃で３０分間染色し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を４％ ＰＦＡを用いて１５～３０分間固定し、洗浄し、その後、フローサイトメーターで分析した。試料は、それらはＧＦＰ＋ＣＡＲ－Ａ／ＣＡＲ－Ｂでトランスフェクトされたので、ＧＦＰに対して陽性であった。
【0207】
ＣＤ４＋細胞のパーセンテージを、ＢＶ４５０について陰性であり、それぞれの色について陽性である集団のゲーティングによって決定した。ＣＤ４陰性（ＣＤ８陽性細胞と呼ばれる）のパーセンテージを、ＢＶ４５０について陰性であり、ＣＤ４ Ａｍｃｙａｎ色について陰性である集団を選択することによってゲーティングした。結果は、Ｋ１０標識されたＡＦ４８８タンパク質で染色された、ＣＡＲ－Ａ／ＣＡＲ－Ｂで形質導入されたＣＤ４陽性ＰＢＭＣのパーセンテージが、Ｋ１０標識されたＡＦ４８８タンパク質で染色されたナイーブＴ細胞のパーセンテージよりも高いことを示す（図１４）。これは、ＣＡＲ－ＡまたはＣＡＲ－Ｂで形質導入されたＴ細胞がＨＥＲＶ－Ｋ１０タンパク質で染色されることを示す。
【0208】
ヒト化または完全ヒトＨＥＲＶ－Ｋ ｓｃＦｖを有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターを発現するＴ細胞は、いくつかの異なるがん由来の腫瘍細胞を効果的に溶解し、死滅させる。レンチウイルスベクターから発現されたヒト化Ｋ－ＣＡＲは、汎がんＣＡＲ－Ｔである。
【0209】
［実施例４］
ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ヒト化キメラ抗原受容体（Ｋ－ＣＡＲ）療法
本発明者らは、ヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体を生成し（実施例１）、これは、組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成された抗原（直前の実施例３）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞からの溶解物に結合できた。このヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲを、レンチウイルスベクター中にクローニングし、それだけには限らないが、Ｋ－ＣＡＲＴ細胞およびチェックポイント阻害剤、炎症促進性サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１２およびＩＬ－１８、腫瘍溶解性ウイルスならびにキナーゼ阻害剤（それだけには限らないが、ｐ－ＲＳＫ、ｐ－ＥＲＫを含む）を含む療法と組み合わせて使用する。
ＨＥＲＶ－Ｋ特異的ヒト化キメラ抗原受容体（Ｋ－ＣＡＲ）療法
本発明者らは、ヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体を生成し（実施例１）、これは、組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成された抗原（直前の実施例３）およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞からの溶解物に結合できた。このヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲを、レンチウイルスベクター中にクローニングし、それだけには限らないが、Ｋ－ＣＡＲＴ細胞およびチェックポイント阻害剤、炎症促進性サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１２およびＩＬ－１８、腫瘍溶解性ウイルスならびにキナーゼ阻害剤（それだけには限らないが、ｐ－ＲＳＫ、ｐ－ＥＲＫを含む）を含む療法と組み合わせて使用する。
【0210】
［実施例５］
強力な標的特異性および高い感受性を示す極めて稀なＢ細胞由来のヒト治療用抗体（ｈＴＡｂ）の同定
ヒト適応免疫系からの完全ヒト治療用抗体の生成：高親和性抗体の供給源として乳がん患者由来のＢ細胞を直接使用するために、本発明者らは、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ組換え融合タンパク質を用いて関節ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロットを実施し、本発明者らはこれを使用して、いくつかの異なる乳がん患者から抗ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ特異的応答を検出した。抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体のより高い力価を有する患者を、単一Ｂ細胞実験のために選択した。乳がん患者から得たＰＢＭＣをポリクローナルに活性化した：１）２週間の期間照射された３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌ線維芽細胞を使用して。この方法は、ＣＤ４０－Ｂ細胞を効率的に刺激し、高純度（＞９０％）で多数に拡大増殖させ、その抗体の分泌を誘導できる；および２）エキソビボで組換えヒトＩＬ－２１、ＩＬ－２、可溶性ＣＤ４０リガンドおよび抗ＡＰＯ１を用いて４日間。この第２の方法は、最小の培養時間を使用して最高パーセンテージのＢ細胞からの分泌を可能にできる。ＩＬ－２１は、抗体分泌細胞への分化を促進すると知られている。科学的参考文献５３、５４を参照されたい。インビトロでのＩＬ－２刺激は、誘導閾値に到達するために適当なＴ細胞の補助を必要とする、ヒト血漿細胞分化を引き起こすことができる。科学的参考文献５５を参照されたい。ｓＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の細胞表面で発現されるＣＤ４０と会合して、Ｔ細胞媒介性活性化を模倣する。科学的参考文献５６を参照されたい。活性化はまた、細胞死を誘導するので、抗ＡＰＯ１を使用して、Ｆａｓ誘導性アポトーシスからＢ細胞を救出する。科学的参考文献５７を参照されたい。細胞傷害性Ｂ細胞はほとんど検出されなかった。
強力な標的特異性および高い感受性を示す極めて稀なＢ細胞由来のヒト治療用抗体（ｈＴＡｂ）の同定
ヒト適応免疫系からの完全ヒト治療用抗体の生成：高親和性抗体の供給源として乳がん患者由来のＢ細胞を直接使用するために、本発明者らは、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ組換え融合タンパク質を用いて関節ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロットを実施し、本発明者らはこれを使用して、いくつかの異なる乳がん患者から抗ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ特異的応答を検出した。抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体のより高い力価を有する患者を、単一Ｂ細胞実験のために選択した。乳がん患者から得たＰＢＭＣをポリクローナルに活性化した：１）２週間の期間照射された３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌ線維芽細胞を使用して。この方法は、ＣＤ４０－Ｂ細胞を効率的に刺激し、高純度（＞９０％）で多数に拡大増殖させ、その抗体の分泌を誘導できる；および２）エキソビボで組換えヒトＩＬ－２１、ＩＬ－２、可溶性ＣＤ４０リガンドおよび抗ＡＰＯ１を用いて４日間。この第２の方法は、最小の培養時間を使用して最高パーセンテージのＢ細胞からの分泌を可能にできる。ＩＬ－２１は、抗体分泌細胞への分化を促進すると知られている。科学的参考文献５３、５４を参照されたい。インビトロでのＩＬ－２刺激は、誘導閾値に到達するために適当なＴ細胞の補助を必要とする、ヒト血漿細胞分化を引き起こすことができる。科学的参考文献５５を参照されたい。ｓＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の細胞表面で発現されるＣＤ４０と会合して、Ｔ細胞媒介性活性化を模倣する。科学的参考文献５６を参照されたい。活性化はまた、細胞死を誘導するので、抗ＡＰＯ１を使用して、Ｆａｓ誘導性アポトーシスからＢ細胞を救出する。科学的参考文献５７を参照されたい。細胞傷害性Ｂ細胞はほとんど検出されなかった。
【0211】
マイクロウェルスラブ中のすべての細胞の結合動態および細胞対細胞相互作用を決定するためのプラットフォームの開発。抗体産生性Ｂ細胞の単一細胞クローニングを経時的に可能にする、Ｂ細胞相互作用のスクリーニングおよびモニタリングを可能にするマイクロエングレービングプロセスの詳細が、図１５Ａに示されている。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でナノウェルのアレイを製作し、本発明者らの研究室で生成され、培養された患者乳房腫瘍組織由来のマンモスフェアから得た細胞（図１５Ｂ；左パネル）を、乳がん細胞死滅の有効性を決定するための標的として使用した。同一ドナーからのＢ細胞およびマンモスフェア細胞（１：１比）を、ナノウェルアレイにロードし（ウェルあたり１個の細胞）、細胞を重力によって沈降させた（図１５Ｂ中央パネル）。死腫瘍細胞（赤色）およびＢ細胞が同一ウェルにおいて示されている（図１５Ｂ）。このＢ細胞によって生成された抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体が、ガラスカバースライドの同一位置で検出された（右パネル、赤色の四角）。次いで、ＲＴ－ＰＣＲのために単一Ｂ細胞をＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒによって選び取った（図１５Ｃ）。本発明者らの結果は、ＨＥＲＶ－Ｋ特異的メモリーＢ細胞が抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体発現ならびにその自己マンモスフェア細胞に対する細胞毒性を示したことを示す。
【0212】
インビボ濃縮（ＩＶＥ）適応を使用する治療用抗体発見：本発明者らのプラットフォームによって、標的がん細胞に結合するだけでなく、細胞を死滅もさせることができる抗体の単離を可能にする。ｈＴＡｂを生成するために乳がん患者ドナーの代わりに、メモリーＢ細胞を有さない正常なドナーの使用が可能となる。Ｂ細胞は、生体外濃縮後でさえ極めて稀である処置のための治療用抗体を産生できるので、本発明者らは、極めて稀なｈＴＡｂを同定するために以下のプラットフォームを開発した：
【0213】
野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６週齢）の群（Ｎ＝１０／群）を、１日目に免疫化し、３週目および５週目に追加免疫する。ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、免疫化マウスから得られたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を決定する（図１６Ａ）。ＥＬＩＳＡアッセイ（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ）を使用して、免疫化マウス血清における抗ＨＥＲＶ－Ｋ ＩｇＧの力価を検出する。
【0214】
［実施例５．１］
多数の抗原特異的形質芽細胞が生成することを目的として、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいてインビボ濃縮技術（ＩＶＥ：約２０倍増強）を適応させ、迅速な拡大増殖およびＢ細胞活性化を可能にする。図１１Ａを参照されたい。このプラットフォームは、８日ほどの短い時間でＢ細胞から完全ヒト抗体を生成する。原理の証明として、本発明者らは、ＭＦＰ－２パートナー細胞との融合の８日目に脾細胞から生成されたハイブリドーマ細胞において完全ヒト抗ジカ抗体を生成するＩＶＥ技術を開発した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
多数の抗原特異的形質芽細胞が生成することを目的として、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいてインビボ濃縮技術（ＩＶＥ：約２０倍増強）を適応させ、迅速な拡大増殖およびＢ細胞活性化を可能にする。図１１Ａを参照されたい。このプラットフォームは、８日ほどの短い時間でＢ細胞から完全ヒト抗体を生成する。原理の証明として、本発明者らは、ＭＦＰ－２パートナー細胞との融合の８日目に脾細胞から生成されたハイブリドーマ細胞において完全ヒト抗ジカ抗体を生成するＩＶＥ技術を開発した（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
【0215】
最近、ヒト化マウス（ＨＭ）およびヒト腫瘍マウス（ＨＴＭ）を、ＨＭ生成のためのＣＤ３４＋細胞（１～２×１０５個／マウス）の静脈内注射およびＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵまたはＰＤ－Ｌ１組換え融合タンパク質を用いる免疫化によって成功裏に生成した。本発明者らはまた、ＣＤ３４＋造血幹細胞を、ＨＴＭ生成のために乳腺脂肪パッドに、５×１０４～３×１０６個の乳がん細胞トリプルネガティブ乳がん患者由来異種移植片（ＴＮＢＣ ＰＤＸ細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１またはＭＤＡ－ＭＢ－４６８ ＴＮＢＣ細胞）とともに同時移植した。ｈＣＤ１９またはｈＣＤ４５細胞のパーセンテージは、ＣＤ３４細胞を用いる接種後、より長い期間を経たマウスにおいてより高い（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。抗原に対する曝露は、腫瘍におけるＨＥＲＶ－Ｋ発現と関連しており、より高い抗体力価が検出された（ＨＴＭ ２：４０日対ＨＴＭ １：３０日；図１８Ｃおよび図１８Ｄ）。重要なことに、これは、乳がん細胞を接種されたマウスにおいてＨＴＭが抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を産生できることを示す。この知見は、完全ｈＴＡｂを生成するためにＨＭまたは／およびＨＴＭを使用することを探索するように、特に、抗原に対して以前に曝露したことのない正常ドナーを使用するように本発明者らを促した。Ｔ－、Ｂ－、およびＮＫ細胞活性を欠くＮＳＧマウスが、ＨＭを確立するための理想的な候補として企図される。初期研究において見られたものよりも、ヒトＣＤ４５＋細胞のより高い移植率を有する、何らかの著しい毒性を伴わないマウス（図１８Ｂ）を最近開発した。
【0216】
プロトコール１。より高い力価の抗体を有するがんを有するドナーについては、本発明者らは、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの代わりにＨＭを使用する図１７Ａにおけるようなプロトコールを使用する。乳がん患者から得たＰＢＭＣ（５０×１０６個）をＩＬ－２１、ＩＬ－２、可溶性ＣＤ４０リガンドおよび抗ＡＰＯ１によってポリクローナルに活性化し、抗原（ＨＥＲＶ－ＫまたはＰＤ－Ｌ１；１００μｇ）と事前に混合する。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して陰性選択によって上記のＰＢＭＣから単離したＢ細胞を、０日目にブスルファン、科学的参考文献６１を参照されたい、（Ｆｉｓｈｅｒ：３０ｍｇ／ｋｇ腹膜内）を用いて処置したマウスにおいてＣＤ３４細胞と同時注射する。マウスをサイトカインカクテル（１、４および７日目）を用いて処置し、２日目に抗原によって追加免疫する。このプロトコールは相対的に迅速に完了できる（８日）。
【0217】
プロトコール２。がんを有さず、メモリーＢ細胞を有さない正常ドナーについては、本発明者らは、改変を加えたプロトコール１を使用する：マウスをサイトカインカクテル（１、７および１４日目）を用いて処置し、１４日目および２１日目に抗原によって追加免疫する。マウスから血清を収集し、結合親和性をＥＬＩＳＡによって試験する。抗体力価の増大が検出された後、脾臓を回収し、分析し、ハイブリドーマを作製するために使用する。２週目にＩＶＥプロトコール２を使用してマウスにおいてより高い抗体力価が検出された。
【0218】
［実施例５．２］
ＩＶＥ後、脾臓の半分を回収し、フローサイトメトリー分析、マイクロエングレービングおよび他の分析のために使用する。Ｂ細胞表面および 細胞内マーカーおよびＣＦＳＥ標識のフローサイトメトリー分析（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥキット）を以下を使用して実施する：抗ＣＤ１９ ＰＥＣｙ５、抗ＣＤ２７アロフィコシアニン、抗ＣＤ３８ ＰＥＣｙ７、抗ＩｇＧ ＦＩＴＣまたはＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥＣｙ５、ＰＥＣｙ７、Ａｌｅｘａ ７００もしくはアロフィコシアニンにコンジュゲートされたマウスＩｇＧ１ｋの抗ＩｇＭ ＰＥアイソタイプコントロール（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）。負の磁気免疫親和性ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、脾臓由来の総ＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離し、組換えヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ；７５ｎｇ／ｍｌ；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ－１０（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ） （すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の存在下でＣｐＧ２００６（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｏｌｉｇｏｓ、Ｉｎｃ．）を用いて７２時間刺激する。本発明者らのマルチウェルマイクロエングレービングプラットフォーム（最大４００，０００ウェル：図１５）を、標的細胞としてのその自己腫瘍細胞またはＨＥＲＶ－Ｋ＋ＴＮＢＣ細胞とともに使用して、プロトコール１または２から直接得た腫瘍死滅性Ｂ細胞を決定する。図１５におけるように、抗体を産生するだけでなく、抗原に結合し、がん細胞を死滅させることができる細胞を決定する。
ＩＶＥ後、脾臓の半分を回収し、フローサイトメトリー分析、マイクロエングレービングおよび他の分析のために使用する。Ｂ細胞表面および 細胞内マーカーおよびＣＦＳＥ標識のフローサイトメトリー分析（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥキット）を以下を使用して実施する：抗ＣＤ１９ ＰＥＣｙ５、抗ＣＤ２７アロフィコシアニン、抗ＣＤ３８ ＰＥＣｙ７、抗ＩｇＧ ＦＩＴＣまたはＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥＣｙ５、ＰＥＣｙ７、Ａｌｅｘａ ７００もしくはアロフィコシアニンにコンジュゲートされたマウスＩｇＧ１ｋの抗ＩｇＭ ＰＥアイソタイプコントロール（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）。負の磁気免疫親和性ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、脾臓由来の総ＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離し、組換えヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ；７５ｎｇ／ｍｌ；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ＩＬ－２（２０ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ－１０（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ） （すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の存在下でＣｐＧ２００６（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｏｌｉｇｏｓ、Ｉｎｃ．）を用いて７２時間刺激する。本発明者らのマルチウェルマイクロエングレービングプラットフォーム（最大４００，０００ウェル：図１５）を、標的細胞としてのその自己腫瘍細胞またはＨＥＲＶ－Ｋ＋ＴＮＢＣ細胞とともに使用して、プロトコール１または２から直接得た腫瘍死滅性Ｂ細胞を決定する。図１５におけるように、抗体を産生するだけでなく、抗原に結合し、がん細胞を死滅させることができる細胞を決定する。
【0219】
［実施例５．３］
次いで、本発明者らは、長期間の抗体利用可能性を確実にするヒトハイブリドーマ細胞を開発する。完全ヒトハイブリドーマを開発するために、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）－ＨＹ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，）をそのプロトコールに従って使用し、脾臓の残りの半分とともに、ＭＦＰ－２細胞をハイブリドーマを生成するためのパートナーとして使用する。ヒトリンパ球をＭＦＰ－２細胞と融合するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用し、ハイブリドーマ細胞のクローニングおよび選択のためには、このキット中のメチルセルロースベースの半固形培地を使用する。選択後に増殖するクローンをピペットで９６ウェルプレート中に入れ、ＥＬＩＳＡによってＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質に対する反応性についてスクリーニングする。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のヒトＩｇＧ抗体アイソタイピングキットを使用して陽性クローンのアイソタイプを決定する。次いで、クローンを血清不含培地条件に適応させ、拡大増殖する。ハイブリドーマ上清を回収し、ヒト抗体のアイソタイプに応じてＨｉ－ＴｒａｐプロテインＡまたはプロテインＧカラムを使用して抗体を精製する。プロテインＡカラムは、アイソタイプ－ＩｇＧ１、２および４の抗体に対して高親和性を有し、アイソタイプＩｇＭの抗体に対して可変結合を有すると知られており、プロテインＧカラムは、アイソタイプ－ＩｇＧ１、２、３および４の抗体に対して高結合を示すが、ＩｇＭ抗体には結合しないと知られている。
次いで、本発明者らは、長期間の抗体利用可能性を確実にするヒトハイブリドーマ細胞を開発する。完全ヒトハイブリドーマを開発するために、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）－ＨＹ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，）をそのプロトコールに従って使用し、脾臓の残りの半分とともに、ＭＦＰ－２細胞をハイブリドーマを生成するためのパートナーとして使用する。ヒトリンパ球をＭＦＰ－２細胞と融合するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用し、ハイブリドーマ細胞のクローニングおよび選択のためには、このキット中のメチルセルロースベースの半固形培地を使用する。選択後に増殖するクローンをピペットで９６ウェルプレート中に入れ、ＥＬＩＳＡによってＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質に対する反応性についてスクリーニングする。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のヒトＩｇＧ抗体アイソタイピングキットを使用して陽性クローンのアイソタイプを決定する。次いで、クローンを血清不含培地条件に適応させ、拡大増殖する。ハイブリドーマ上清を回収し、ヒト抗体のアイソタイプに応じてＨｉ－ＴｒａｐプロテインＡまたはプロテインＧカラムを使用して抗体を精製する。プロテインＡカラムは、アイソタイプ－ＩｇＧ１、２および４の抗体に対して高親和性を有し、アイソタイプＩｇＭの抗体に対して可変結合を有すると知られており、プロテインＧカラムは、アイソタイプ－ＩｇＧ１、２、３および４の抗体に対して高結合を示すが、ＩｇＭ抗体には結合しないと知られている。
【0220】
［実施例５．４］
本発明者らは、本発明者らが日常的に本発明者らの研究室において行うように、インビトロで上記のプロトコールから得られた候補Ｂ細胞の、細胞成長、増殖およびアポトーシスに対する効果を含む抗腫瘍有効性を評価する。乳がん細胞株および原発腫瘍細胞を使用して、免疫不全マウスモデルにおいてｈＴＡｂの有効性を評価するためのインビボ研究も行って、有効性を評価し、対応する未関与の対照乳房細胞と比較する。
本発明者らは、本発明者らが日常的に本発明者らの研究室において行うように、インビトロで上記のプロトコールから得られた候補Ｂ細胞の、細胞成長、増殖およびアポトーシスに対する効果を含む抗腫瘍有効性を評価する。乳がん細胞株および原発腫瘍細胞を使用して、免疫不全マウスモデルにおいてｈＴＡｂの有効性を評価するためのインビボ研究も行って、有効性を評価し、対応する未関与の対照乳房細胞と比較する。
【0221】
［実施例６］
併用療法
本発明者らの乳がんデータは、ＨＥＲＶ－Ｋを含む併用療法アプローチの可能性を強力に支持する。したがって、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化および完全ヒト抗体は、チェックポイント遮断抗体治療有効性を増強する。有効な併用がん療法は、それだけには限らないが、（ａ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｈＴＡｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、（ｂ）Ｋ－ＣＡＲ、（ｃ）Ｋ－ＢｉＴＥ、（ｄ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｓｈＲＮＡまたはＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子発現をノックダウンするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術、（ｅ）または全長および末端切断型ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖペプチドを含む予防的もしくは治療的ＨＥＲＶ－Ｋワクチンならびに（ａ）抗ＩＣＰ抗体（図１９）、（ｂ）がん化学療法、（ｃ）５－アザシチジン、５－アザ－２’－デオキシシチジンまたは他のエピジェネティックモジュレート剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴｉ）およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、（ｄ）ＥＭＴ阻害剤、（ｅ）細胞移動もしくは浸潤の阻害剤、（ｆ）ＳもしくはＧ２期細胞周期停止の誘導、（ｇ）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲもしくはＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤または（ｈ）ＨＩＦ１αへのシグナル伝達の組合せを含む。
併用療法
本発明者らの乳がんデータは、ＨＥＲＶ－Ｋを含む併用療法アプローチの可能性を強力に支持する。したがって、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化および完全ヒト抗体は、チェックポイント遮断抗体治療有効性を増強する。有効な併用がん療法は、それだけには限らないが、（ａ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｈＴＡｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ）、（ｂ）Ｋ－ＣＡＲ、（ｃ）Ｋ－ＢｉＴＥ、（ｄ）ＨＥＲＶ－Ｋ ｓｈＲＮＡまたはＨＥＲＶ－Ｋ遺伝子発現をノックダウンするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術、（ｅ）または全長および末端切断型ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖペプチドを含む予防的もしくは治療的ＨＥＲＶ－Ｋワクチンならびに（ａ）抗ＩＣＰ抗体（図１９）、（ｂ）がん化学療法、（ｃ）５－アザシチジン、５－アザ－２’－デオキシシチジンまたは他のエピジェネティックモジュレート剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴｉ）およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、（ｄ）ＥＭＴ阻害剤、（ｅ）細胞移動もしくは浸潤の阻害剤、（ｆ）ＳもしくはＧ２期細胞周期停止の誘導、（ｇ）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲもしくはＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤または（ｈ）ＨＩＦ１αへのシグナル伝達の組合せを含む。
【0222】
［実施例７］
【化13】
【0223】
【化14】
【0224】
【化15】
【0225】
【化16】
【0226】
【化17】
【0227】
【化18】
【0228】
【化19】
【0229】
【化20】
【0230】
【化21】
【0231】
ＩｇＧドメインの順序：
ＶＬ－ＶＨ６Ｈ５－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃタグ＋ＦＬＡＧまたはＶＬ－ＶＨｈｕ６Ｈ５－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはｈｕＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃタグ＋ＦＬＡＧ
ＶＬ－ＶＨ６Ｈ５－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃタグ＋ＦＬＡＧまたはＶＬ－ＶＨｈｕ６Ｈ５－－－ＶＨ－ＶＬｈｕＣＤ３またはｈｕＣＤ８＋ｃ－ｍｙｃタグ＋ＦＬＡＧ
【0232】
【化22】
【0233】
【化23】
【0234】
マウスを５種のＭａｐｓを用いて免疫化し、血清を収集し、種々のＨＥＲＶ融合タンパク質を使用し、ＥＬＩＳＡによって試験した（図２３）。ＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵタンパク質のみが陽性であった。５種のＭａｐｓを用いて免疫化したマウスからハイブリドーマ細胞を生成し、以下の配列を有するｓｃＦｖを選択した。
【0235】
【化24】
【0236】
［実施例８］
がん細胞および腫瘍中に薬物を送達するためのＡＤＣに使用できるＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化抗体
組換えゲロニン（ｒ－Ｇｅｌ）毒素を６Ｈ５（図２０Ａ）とコンジュゲートした。ｒ－Ｇｅｌを、抗ｒ－Ｇｅｌ抗体を使用して１時間の内部移行後にＯＶＣＡＲ３（図２０Ｂ）、ＳＫＢｒ３、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図２０Ｃ）において検出した。さらに、金ナノ粒子（ＧＮＰ）を、裸のＧＮＰ（図２１Ａ）または６Ｈ５－ＧＮＰ（図２１Ｂ）とともの２時間のインキュベーション後に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって検出した。ＧＮＰを、６Ｈ５－ＧＮＰ（図２１Ｃ、２１Ｅおよび２１Ｆ）または６Ｈ５ｓｃＦＶ－ＧＮＰ（図２１Ｄ）を用いた静脈内注射の２４時間後にマウスから単離したＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図２１Ｃ、２１Ｅおよび２１Ｆ）またはＳＫＢｒ３（図２１Ｄ）の腫瘍において銀増強アッセイを使用して検出した。ＧＮＰは、高周波磁場に配置された場合に、標的化された腫瘍細胞を死滅させる熱を生成する
がん細胞および腫瘍中に薬物を送達するためのＡＤＣに使用できるＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化抗体
組換えゲロニン（ｒ－Ｇｅｌ）毒素を６Ｈ５（図２０Ａ）とコンジュゲートした。ｒ－Ｇｅｌを、抗ｒ－Ｇｅｌ抗体を使用して１時間の内部移行後にＯＶＣＡＲ３（図２０Ｂ）、ＳＫＢｒ３、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図２０Ｃ）において検出した。さらに、金ナノ粒子（ＧＮＰ）を、裸のＧＮＰ（図２１Ａ）または６Ｈ５－ＧＮＰ（図２１Ｂ）とともの２時間のインキュベーション後に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって検出した。ＧＮＰを、６Ｈ５－ＧＮＰ（図２１Ｃ、２１Ｅおよび２１Ｆ）または６Ｈ５ｓｃＦＶ－ＧＮＰ（図２１Ｄ）を用いた静脈内注射の２４時間後にマウスから単離したＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図２１Ｃ、２１Ｅおよび２１Ｆ）またはＳＫＢｒ３（図２１Ｄ）の腫瘍において銀増強アッセイを使用して検出した。ＧＮＰは、高周波磁場に配置された場合に、標的化された腫瘍細胞を死滅させる熱を生成する
【0237】
［実施例９］
マウスの腫瘍結節における抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体のインビボイメージング
Ｎｕａｎｃｅシステムを使用するインビボイメージングによって、抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート６Ｈ５－Ａｌｅｘａ６４７（赤色）を用いる静脈内注射の２４時間後のマウスからの腫瘍結節において６Ｈ５のより高い密度が検出された（図２２）。
マウスの腫瘍結節における抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体のインビボイメージング
Ｎｕａｎｃｅシステムを使用するインビボイメージングによって、抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート６Ｈ５－Ａｌｅｘａ６４７（赤色）を用いる静脈内注射の２４時間後のマウスからの腫瘍結節において６Ｈ５のより高い密度が検出された（図２２）。
【0238】
実施形態のリスト
ＨＥＲＶ－Ｋ抗体治療薬の特定の組成物および方法。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義されるべきである。生物医学の技術分野の当業者は、開示の文脈および精神と一致する可能な限り広い方法で、すべての特許請求の範囲の用語を解釈するであろう。本明細書における詳細な説明は、例示的であり、限定的または網羅的なものではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に制限されず、実際には変わる場合がある。明細書または特許請求の範囲が順序付けられたステップまたは機能を列挙する場合には、代替実施形態が異なる順序で、または実質的に同時にその機能を発揮する可能性がある。生物医学の技術分野の当業者が認識するように、すでに記載されたものに加えて、他の等価物および改変が、本明細書に記載される発明の概念から逸脱することなくあり得る。
ＨＥＲＶ－Ｋ抗体治療薬の特定の組成物および方法。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義されるべきである。生物医学の技術分野の当業者は、開示の文脈および精神と一致する可能な限り広い方法で、すべての特許請求の範囲の用語を解釈するであろう。本明細書における詳細な説明は、例示的であり、限定的または網羅的なものではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に制限されず、実際には変わる場合がある。明細書または特許請求の範囲が順序付けられたステップまたは機能を列挙する場合には、代替実施形態が異なる順序で、または実質的に同時にその機能を発揮する可能性がある。生物医学の技術分野の当業者が認識するように、すでに記載されたものに加えて、他の等価物および改変が、本明細書に記載される発明の概念から逸脱することなくあり得る。
【0239】
本明細書を通じて引用されるすべての特許および刊行物は、参照により本開示に組み込まれ、本明細書に記載される技術を用いて使用される材料および方法を説明する。特許および刊行物は、単に本明細書の出願日の前のその開示のために提供される。特許および刊行物の開示および刊行日に関するすべての記述は、本発明者らの情報および信念による。本発明者らは、これらの文書の内容または日付の正確性について認めていない。本明細書において提供される日付と実際の刊行日の間に矛盾がある場合には、実際の刊行日が優先されるべきである。本発明者らは、先行発明または別の理由のためにこのような開示に先行する場合がある。前の特許または刊行物の科学的または技術的教示と本明細書の間に矛盾がある場合には、本明細書およびこれらの特許請求の範囲の教示が優先される。
【0240】
本明細書が値の範囲を提供する場合には、その範囲の上限と下限の間に介在する値は各々、別に指示されない限り値の範囲内にある。
【0241】
本明細書において提供される実施形態の中には以下がある：
【0242】
１．ヒト内因性レトロウイルス－Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）に結合する単離された抗体であって、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む単離された抗体。ヒト化抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体は、腫瘍成長を低減できる、特に、肺、リンパ節および他の臓器への転移を低減できる。
【0243】
２．ヒト化またはヒトフレームワーク領域を含む、実施形態１に従う抗体。
【0244】
３．ＨＥＲＶ－Ｋアンタゴニストである、実施形態１に従う抗体。
【0245】
４．実施形態１のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【0246】
５．実施形態４の核酸を含む発現ベクター。
【0247】
６．実施形態５の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【0248】
７．ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはそれらの組合せを含む抗体を生成する方法であって、実施形態１の宿主細胞を、宿主細胞がＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはそれらの組合せを含む抗体を発現するような条件下で成長させること、およびＨＣＶＲ、ＬＣＶＲまたはそれらの組合せを含む抗体を単離することを含む、方法。
【0249】
１０．哺乳動物においてがんを処置する方法であって、実施形態１に従う抗体の有効量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0250】
１１．がんを処置する方法であって、それを必要とする個体に、有効量の、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を含むＡＤＣを投与することを含み、ＶＨ領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＶＬ領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、抗体は、リンカーを介して細胞傷害性薬物、アウリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体または誘導体にコンジュゲートされる、方法。
【0251】
１２．ＡＤＣが、１つまたは複数の追加の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態１１の方法。
【0252】
１３．１つまたは複数の追加の治療薬が化学療法薬を含む、実施形態１１の方法。
【0253】
１４．がんが、黒色腫、慢性リンパ性白血病、乳がん、膵臓がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、精巣がん、胃がん、腎臓がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がんおよび非小細胞肺がんからなる群から選択される、実施形態１１の方法。
【0254】
ＣＡＲ Ｔ、ＣＡＲ ＮＫおよびＢｉＴＥ研究のために開発されたヒト化抗体。
【0255】
１５．抗体が全長抗体である、実施形態１１の方法。
【0256】
１６．抗体が、ヒトモノクローナルＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、実施形態１１の方法。
【0257】
１７．アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、実施形態１１の方法。
【0258】
１８．アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、実施形態１１の方法。
【0259】
１９．細胞傷害性薬物がエムタンシン（ＤＭ１）である、実施形態１１の方法。
【0260】
２０．細胞傷害性薬物がオザガマイシン（ｏｚａｇａｍｉｃｉｎ）（カリケアマイシン）である、実施形態１１の方法。
【0261】
２１．細胞傷害性薬物がデルクステカン（ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）（ＤＸｄ）である、実施形態１１の方法。
【0262】
２２．細胞傷害性薬物がゴビテカン（ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）（ＳＮ－３８）である、実施形態１１の方法。
【0263】
２３．細胞傷害性薬物がマホドチン（ＭＭＡＦ）である、実施形態１１の方法。
【0264】
２４．細胞傷害性薬物がデュオカルマジン（デュオカルマイシン）である、実施形態１１の方法。
【0265】
２５．細胞傷害性薬物がＢＡＴ８００１（マイタンシノイド）ソラブタンシン（ＤＭ４）である実施形態１１の方法。
【0266】
２６．細胞傷害性薬物がテシリン（ＰＢＤ）である、実施形態１１の方法。
【0267】
２７．リンカーが、抗体の部分還元によって得られた抗体のスルフィドリル残基と結合している、実施形態１１の方法。
【0268】
２８．リンカー－アウリスタチンがｖｃＭＭＡＦまたはｖｃＭＭＡＥである、実施形態１１の方法。
【0269】
２９．早期検出、転移または実質的に本明細書に記載されるようなＨＥＲＶ－Ｋおよび免疫チェックポイントバイオマーカー。
【0270】
３０．実質的に本明細書に記載されるような、抗体ベースの治療薬。
【0271】
３２．本発明の抗ＨＥＲＶ－Ｋヒト化抗体およびＡＤＣの標的としての、ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現するがん細胞。
【0272】
３３．細菌（ＨＵＭ１およびＨＵＭ２）または哺乳動物細胞から生成されたｈｕ６Ｈ５クローン（ＦＷＪ１およびＦＷＪ２）。
【0273】
３４．Ｔ細胞ＣＤ３またはＣＤ８および腫瘍関連抗原ＨＥＲＶ－Ｋに対するヒト化ｓｃＦｖに対して向けられるＢｉＴＥであって、ＣＤ３またはＣＤ８のいずれかおよびＨＥＲＶ－Ｋを標的とする抗体を含む、ＢｉＴＥ。
【0274】
３５．ヒト化または完全ヒトＨＥＲＶ－Ｋ ｓｃＦｖを有するレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターを発現するＴ細胞。
【0275】
３６．組換えＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ表面融合タンパク質（ＫＳＵ）から生成された抗原およびＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質を発現したがん細胞からの溶解物に結合可能なヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体。
【0276】
３７．実施形態２８のヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲ。
【0277】
３８．レンチウイルスベクター中にクローニングされる、実施形態２８のヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲ。
【0278】
３９．併用療法において使用するための、レンチウイルスベクター中にクローニングされる、実施形態２８のヒト化ｓｃＦｖから生成されたＣＡＲ。
【0279】
４４．メモリーＢ細胞を有さないドナーのための、迅速拡大増殖およびＢ細胞活性化のための改善されたインビボ濃縮方法であって、１、７および１４日目にサイトカインカクテルを用いてマウスを処置するステップおよび１４および２１日目に抗原によってマウスを追加免疫するステップを含む、方法。
【0280】
４５．抗体を産生するだけでなく、抗体は、抗原に結合し、がん細胞を死滅させることができ、抗原を発現する細胞が、抗体によって死滅させられ得る、細胞。
【0281】
４７．乳がん患者の血漿中の６種の循環免疫チェックポイントタンパク質の有意に増強された発現。
【0282】
５０．ＨＥＲＶ－Ｋの免疫チェックポイント阻害剤を用いて免疫抑制ドメイン（ＩＳＤ）を遮断する方法。
【0283】
５１．ＨＥＲＶ－Ｋの免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＥＲＶ－ＫのＩＳＤを標的とするモノクローナル抗体および薬物からなる群から選択される、実施形態４２の方法。
【0284】
５２．チェックポイント遮断抗体治療有効性の増強において使用するための、ＨＥＲＶ－Ｋを標的とするヒト化および完全ヒト抗体。
【0285】
５３．がん患者によって産生されたＨＥＲＶ－Ｋ ＳＵタンパク質から生成される５種の多抗原ペプチド（ＭＡＰＳ）を用いて免疫化されたマウスから新規抗体を生成する方法。
【0286】
５４．ＨＥＲＶ－Ｋ ＣＡＲ Ａ：ＶＨ－ＶＬｈｕ６Ｈ５－ＣＤ８－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータを生成する方法。
【0287】
参考文献
分子生物学の技術分野の当業者は、本発明を作製および使用した際の予測可能な結果のガイダンスとして以下の特許、特許出願および科学的参考文献を使用できる：
分子生物学の技術分野の当業者は、本発明を作製および使用した際の予測可能な結果のガイダンスとして以下の特許、特許出願および科学的参考文献を使用できる：
【0288】
特許参考文献：
米国特許第９，２４３，０５５号（Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ）。この特許は、がん診断薬および療法を開示し、特許請求する。ＨＥＲＶ－Ｋ＋がんを検出、予防および処置するための方法および組成物が提供される。１つの方法は、対象に、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質結合抗体のがん細胞増殖遮断または低減量を投与することによってがん細胞増殖を妨げるまたは阻害するためである。
米国特許第９，２４３，０５５号（Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ）。この特許は、がん診断薬および療法を開示し、特許請求する。ＨＥＲＶ－Ｋ＋がんを検出、予防および処置するための方法および組成物が提供される。１つの方法は、対象に、ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖタンパク質結合抗体のがん細胞増殖遮断または低減量を投与することによってがん細胞増殖を妨げるまたは阻害するためである。
【0289】
国際特許公開ＷＯ２０１４／１８６４６９（理事会、テキサスシステム大学）。この特許公開は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変Ｔ細胞を使用する免疫療法のための方法および組成物に関する。ＣＡＲを発現するＴ細胞が、最小の生体外拡大増殖を必要とする、またはがん処置のために患者に直接投与できる、ＣＡＲを発現する細胞の集団を生成するために、トランスポゾンベースの組込みシステムと併用したエレクトロポレーションを使用して生成される。
【0290】
科学的参考文献：
１．Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｌｉｎｔｏｎ ＬＭ， Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１；４０９： ８６０－９２１．ＨＥＲＶは、ゲノム中に多数のコピーを有するゲノム反復配列として周知であり、その結果、ヒトゲノムのおよそ８％が、レトロウイルス起源のものである。
１．Ｌａｎｄｅｒ ＥＳ， Ｌｉｎｔｏｎ ＬＭ， Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１；４０９： ８６０－９２１．ＨＥＲＶは、ゲノム中に多数のコピーを有するゲノム反復配列として周知であり、その結果、ヒトゲノムのおよそ８％が、レトロウイルス起源のものである。
【0291】
２．Ｈｕｇｈｅｓ ＪＦ， Ｃｏｆｆｉｎ ＪＭ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｉｍａｔｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ２００１；２９： ４８７－４８９．ＨＥＲＶは、生殖系列細胞中にレトロウイルスＤＮＡを組み込んだ数千もの古代の組込み事象から生じた。
【0292】
３．Ｌａｒｓｓｏｎ Ｅ， Ｋａｔｏ Ｎ， Ｃｏｈｅｎ Ｍ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９；１４８： １１５－１３２．ほとんどの生物学的に活性なＨＥＲＶは、ＨＥＲＶ－Ｋファミリーのメンバーである。ＨＥＲＶ－Ｋは、複製能力のあるレトロウイルスに必要とされるすべての要素を発現可能な完全配列を有する。
【0293】
４．Ｏｎｏ Ｍ， Ｙａｓｕｎａｇａ Ｔ， Ｍｉｙａｔａ Ｔ， Ｕｓｈｉｋｕｂｏ Ｈ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９８６；６０： ５８９－５９８．ほとんどの生物学的に活性なＨＥＲＶは、ＨＥＲＶ－Ｋファミリーのメンバーである。ＨＥＲＶ－Ｋは、複製能力のあるレトロウイルスに必要とされるすべての要素を発現可能な完全配列を有する。
【0294】
５．Ｋｒａｕｓ Ｂ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｋ， Ｂｕｃｈｎｅｒ ＳＭ， ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｋ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８： ｅ７２７５６．
【0295】
６．Ｄｅｎｎｅ Ｍ， Ｓａｕｔｅｒ Ｍ， Ａｒｍｂｒｕｅｓｔｅｒ Ｖ， Ｌｉｃｈｔ ＪＤ， Ｒｏｅｍｅｒ Ｋ， Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｌａｎｔｚｓｃｈ Ｎ． Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｐ９ ａｎｄ ｒｅｃ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００７；８１： ５６０７－５６１６．
【0296】
７．Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓ， Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ Ｎ， Ｍｏｒａｔｏｒｉｏ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｎｐ９ ｇｅｎｅ ｉｓ ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ Ｒｅｐ． ２０１４；３： ７０－７２．
【0297】
８．Ｌｉ Ｍ ＲＲ， Ｙｉｎ Ｂ， Ｌｉ Ｊ， Ｃｈｉｖｕｋｕｌａ Ｒ， Ｌｉｎ Ｋ， Ｌｕ Ｙ， Ｓｈｅｎ Ｊ， Ｃｈａｎｇ ＤＺ， Ｌｉ Ｄ， Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ＧＬ， Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ． Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｋ （ＨＥＲＶ－Ｋ） ｖｉｒａｌ ｅｎｖ ＲＮＡ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１７；印刷中．
【0298】
９．Ｆｅｎｇ Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ＪＬ， Ｇａｒｙ Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ， Ｍｉｎｇ Ｌｉ， Ｒａｇｈｕ Ｃｈｉｖｕｋｕｌａ， Ｇｕｏｑｉｎｇ Ｗｕ． Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲＶ－Ｋ， ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７；７７： Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｒ ＬＢ－２２１．
【0299】
１０．Ｚｈｏｕ Ｆ， Ｌｉ Ｍ， Ｗｅｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１６；７： ８４０９３－８４１１７．
【0300】
１１．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｒａｄｖａｎｙｉ Ｌ， Ｒｙｃａｊ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８；６８： ５８６９－５８７７．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0301】
１２．Ｚｈａｏ Ｊ， Ｒｙｃａｊ Ｋ， Ｇｅｎｇ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ Ｋ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇｅｎｅｓ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１１；２： ９１４－９２２．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0302】
１３．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｒｙｃａｊ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００７；１２０： ８１－９０．
【0303】
１４．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｌｉ Ｍ， Ｅｓｔｅｖａ ＦＪ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｋ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｓ ｓｅｒｕｍ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１４；１３４： ５８７－５９５．
【0304】
１５．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｆｒｏｓｔ ＡＲ， Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ＧＬ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｋ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；７： １５５３－１５６０．
【0305】
１６．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｆｒｏｓｔ ＡＲ， Ｊｉａｎ Ｂ， Ｅｐｐ Ｌ， Ｌｕ ＤＷ， Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ＧＬ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ２００３；２２： １５２８－１５３５．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0306】
１７．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｆｒｏｓｔ ＡＲ， Ｊｉａｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ． ２００３；９８： １８７－１９７．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0307】
１８．Ｗａｌｌａｃｅ ＴＡ， Ｄｏｗｎｅｙ ＲＦ， Ｓｅｕｆｅｒｔ ＣＪ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｖａｔｅｄ ＨＥＲＶ－Ｋ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＰＢＭＣ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｏｌｄｅｒ ｍｅｎ ａｎｄ ｓｍｏｋｅｒｓ． Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． ２０１４；３５： ２０７４－２０８３．
【0308】
１９．Ｄｏｗｎｅｙ ＲＦ， Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＦＪ， Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ａｍｂｓ Ｓ， Ｇｉｌｅｓ ＦＪ， Ｇｌｙｎｎ ＳＡ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ： Ｉｎｎｏｃｅｎｔ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｏｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｃｏｍｐｌｉｃｅ？ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１５；１３７： １２４９－１２５７．
【0309】
２０．Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ ＧＬ， Ｍａｌｏｕｆ ＧＧ， Ｚｈｅｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｋ ｉｓ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１７；７： ４１９６０．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。彼らはまた、乳がんにおけるＨＥＲＶ－Ｋ ｅｎｖ転写物の発現は、特に悪性度の高いサブタイプである基底乳がんと特異的に関連することも見出した。
【0310】
２１．Ｓｅｒａｆｉｎｏ Ａ， Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉ Ｅ， Ｐｉｅｒｉｍａｒｃｈｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ （ＨＥＲＶ－Ｋ） ｉｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００９；３１５： ８４９－８６２．
【0311】
２２．Ｏｒｉｃｃｈｉｏ Ｅ， Ｓｃｉａｍａｎｎａ Ｉ， Ｂｅｒａｌｄｉ Ｒ， Ｔｏｌｓｔｏｎｏｇ ＧＶ， Ｓｃｈｕｍａｎｎ ＧＧ， Ｓｐａｄａｆｏｒａ Ｃ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ＬＩＮＥ－１ ａｎｄ ＨＥＲＶ－Ｋ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． ２００７；２６： ４２２６－４２３３．
【0312】
２３．Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏ Ｍ， Ｉｄｕｍａ Ｐ， Ｋａｒａｃｈａｌｉｏｕ Ｎ， Ｓａｎｔａｒｐｉａ Ｍ， Ｂｌａｎｃｏ Ｊ， Ｒｏｓｅｌｌ Ｒ． Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． ２０１６；１３： ４８３－４８８．
【0313】
２４．Ｋｌｅｉｍａｎ Ａ， Ｓｅｎｙｕｔａ Ｎ， Ｔｒｙａｋｉｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． ＨＥＲＶ－Ｋ（ＨＭＬ－２） ＧＡＧ／ＥＮＶ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００４；１１０： ４５９－４６１．
【0314】
２５．Ｂｕｓｃｈｅｒ Ｋ， Ｔｒｅｆｚｅｒ Ｕ， Ｈｏｆｍａｎｎ Ｍ， Ｓｔｅｒｒｙ Ｗ， Ｋｕｒｔｈ Ｒ， Ｄｅｎｎｅｒ Ｊ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；６５： ４１７２－４１８０．
【0315】
２６．Ｓｅｉｆａｒｔｈ Ｗ， Ｓｋｌａｄｎｙ Ｈ， Ｋｒｉｅｇ－Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｆ， Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ａ， Ｈｅｈｌｍａｎｎ Ｒ， Ｌｅｉｂ－Ｍｏｓｃｈ Ｃ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ４７－Ｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｙｐｅ Ｂ－ ａｎｄ Ｃ－ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９９５；６９： ６４０８－６４１６．
【0316】
２７．Ｅｔｋｉｎｄ ＰＲ， Ｌｕｍｂ Ｋ， Ｄｕ Ｊ， Ｒａｃｅｖｓｋｉｓ Ｊ． Ｔｙｐｅ １ ＨＥＲＶ－Ｋ ｇｅｎｏｍｅ ｉｓ ｓｐｌｉｃｅｄ ｉｎｔｏ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ４７Ｄ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９７；２３４： ３０４－３０８．
【0317】
２８．Ｏｎｏ Ｍ， Ｋａｗａｋａｍｉ Ｍ， Ｕｓｈｉｋｕｂｏ Ｈ． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｆｅｍａｌｅ ｓｔｅｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｔ４７Ｄ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ． １９８７；６１： ２０５９－２０６２．
【0318】
２９．Ｅｊｔｈａｄｉ ＨＤ， Ｍａｒｔｉｎ ＪＨ， Ｊｕｎｙｉｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｔｅｃｔｓ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｋ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ２００５；１５０： １７７－１８４．
【0319】
３０．Ｗａｎｇ－Ｊｏｈａｎｎｉｎｇ Ｆ， Ｒｙｃａｊ Ｋ， Ｐｌｕｍｍｅｒ ＪＢ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－Ｋ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２０１２；１０４： １８９－２１０．発明者らは、ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖタンパク質は、乳がん細胞の表面で一般に発現されることを示した。発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。３０～３４。
【0320】
３１．Ｌｉ Ｍ， Ｒａｄｖａｎｙｉ Ｌ， Ｙｉｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ Ｋ （ＨＥＲＶ－Ｋ） Ｖｉｒａｌ ｅｎｖ ＲＮＡ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７；２３： ５８９２－５９１１．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0321】
３２．Ｒｙｃａｊ Ｋ， Ｐｌｕｍｍｅｒ ＪＢ， Ｙｉｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｋ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１５；２１： ４７１－４８３．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0322】
３３．Ｚｈｏｕ Ｆ， Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ Ｊ， Ｗｅｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＨＥＲＶ－Ｋ ｉｎｈｉｂｉｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ． Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２０１５；４： ｅ１０４７５８２．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0323】
３４．Ｚｈｏｕ Ｆ， Ｌｉ Ｍ， Ｗｅｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲＶ－Ｋ Ｅｎｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１６．
【0324】
３５．Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ Ｊ， Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ＢＡ， Ｍｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ＨＥＲＶ－Ｋ， ａｎ Ａｎｃｉｅｎｔ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｏｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１５；２１： ３２４１－３２５１．発明者らは、乳房、肺、前立腺、卵巣、結腸、膵臓および他の固形腫瘍においてＨＥＲＶ、特に、ＨＥＲＶ－Ｋ配列の発現を観察した。
【0325】
３６．Ｃｈａｅ ＹＫ， Ｃｈａｎｇ Ｓ， Ｋｏ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ （ＥＭＴ） ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ （ＮＳＣＬＣ）． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１８；８： ２９１８．
【0326】
３７．Ｌｅｍａｉｔｒｅ Ｃ， Ｔｓａｎｇ Ｊ， Ｂｉｒｅａｕ Ｃ， Ｈｅｉｄｍａｎｎ Ｔ， Ｄｅｗａｎｎｉｅｕｘ Ｍ． Ａ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｃａｎ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＥＲＫ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ２０１７；１３： ｅ１００６４５１．
【0327】
３８．Ｌｉ Ｍ， Ｒａｄｖａｎｙｉ ＬＧ， Ｙｉｎ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｋ （ＨＥＲＶ－Ｋ） ｖｉｒａｌ ｅｎｖ ＲＮＡ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１７．
【0328】
３９．Ｈｅｌｓｅｎ ＣＷ， Ｈａｍｍｉｌｌ ＪＡ， Ｌａｕ ＶＷＣ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＴＡＣ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏ－ｏｐｔｓ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１８；９： ３０４９．
【0329】
４０．Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ＨＪ， Ｗｉｎｅｒ ＥＰ． Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ： Ｔ ｓｔａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ， ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ， ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００９；２７： ５６７１－５６７３．
【0330】
４１．Ｎａｔｓｕｍｅ Ａ， Ｎｉｗａ Ｒ， Ｓａｔｏｈ Ｍ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ＡＤＣＣ ａｎｄ ＣＤＣ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ． ２００９；３： ７－１６．
【0331】
４２．Ｓｐｅｃｔｏｒ ＮＬ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ＫＬ． Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｂｅｈｉｎｄ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００９；２７： ５８３８－５８４７．
【0332】
４３．Ｆｅｌｄｈａｕｓ ＭＪ， Ｓｉｅｇｅｌ ＲＷ， Ｏｐｒｅｓｋｏ ＬＫ， ｅｔ ａｌ． Ｆｌｏｗ－ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３；２１： １６３－１７０．
【0333】
４４．Ｍａｚｏｒ Ｙ， Ｖａｎ Ｂｌａｒｃｏｍ Ｔ， Ｍａｂｒｙ Ｒ， Ｉｖｅｒｓｏｎ ＢＬ， Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ， ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７；２５： ５６３－５６５．
【0334】
４５．Ｚｈｏｕ Ｙ， Ｚｏｕ Ｈ， Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｍａｒｋｓ ＪＤ． Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｙｅａｓｔ－ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１０；４０４： ８８－９９．
【0335】
４６．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ， Ｃｏｒｔｉ Ｄ， Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ． Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７；１８： ５２３－５２８．
【0336】
４７．Ｓｍｉｔｈ Ｋ， Ｇａｒｍａｎ Ｌ， Ｗｒａｍｍｅｒｔ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ａ ｖａｃｃｉｎａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２００９；４： ３７２－３８４．
【0337】
４８．Ｓｃｈｅｉｄ ＪＦ， Ｍｏｕｑｕｅｔ Ｈ， Ｆｅｌｄｈａｈｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒｏａｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＨＩＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００９；４５８： ６３６－６４０．
【0338】
４９．Ｍｅｉｊｅｒ ＰＪ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＰＳ， Ｈａａｈｒ Ｈａｎｓｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒｉｎｇ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００６；３５８： ７６４－７７２．
【0339】
５０．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ， Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ． ２０１５．
【0340】
５１．Ｚｈａｎｇ Ｐ， Ｓｈｉ Ｂ， Ｇａｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｉｍｉｔｅｄ ｇａｌｅｃｔｉｎ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０１４；６３： １２１－１３２．
【0341】
５２．Ｓｅｉｔｚ Ｓ， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＣＫ， Ｍａｌｏｔｋａ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ ａｎｄ ｂｅｔａ－ｃｈａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００６；１０３： １２０５７－１２０６２．
【0342】
５３．Ｅｔｔｉｎｇｅｒ Ｒ， Ｓｉｍｓ ＧＰ， Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ－２１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００５；１７５： ７８６７－７８７９．
【0343】
５４．Ｇｏｏｄ ＫＬ， Ｂｒｙａｎｔ ＶＬ， Ｔａｎｇｙｅ ＳＧ． Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＬ－２１． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６；１７７： ５２３６－５２４７．
【0344】
５５．Ｈｉｐｐ Ｎ， Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ Ｈ， Ｐａｓｔｏｒｅｔ Ｃ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ－２ ｉｍｐｒｉｎｔｓ ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＲＫ／ＥＬＫ１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＢＡＣＨ２ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１７；８： １４４３．
【0345】
５６．Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ， Ｂｅｎｓｏｎ ＭＪ， ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ＶＣ， Ｗａｓｉｕｋ Ａ， Ｇｕｏ Ｙ， Ｎｏｅｌｌｅ ＲＪ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２００９；２２９： １５２－１７２．
【0346】
５７．Ｋｏｎｃｚ Ｇ， Ｈｕｅｂｅｒ ＡＯ． Ｔｈｅ Ｆａｓ／ＣＤ９５ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ Ｃｅｌｌｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１２；３： ２０７．
【0347】
５９．Ｓｏｎｇ ＹＣ， Ｌｉｕ ＳＪ． Ａ ＴＬＲ９ ａｇｏｎｉｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｖｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１５；５： １２５７８．
【0348】
６０．Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ ＫＢ， Ｓｔｒｉｓｓｅｌ ＰＬ， Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｃａｕｓｅｓ ａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ｖｉａ ｄｓＲＮＡ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１５；１６２： ９７４－９８６．
【0349】
６１．Ｃｈｏｉ Ｂ， Ｃｈｕｎ Ｅ， Ｋｉｍ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒｇａｍｍａ（ｎｕｌｌ） （ＮＳＧ） ｍｉｃｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｂｙ ｂｕｓｕｌｆａｎ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１１；３１： ２５３－２６４．
【0350】
６２．Ｍｏｒｏｚｏｖ ＶＡ， Ｄａｏ Ｔｈｉ ＶＬ， Ｄｅｎｎｅｒ Ｊ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－－Ｋ （ＨＥＲＶ－Ｋ） ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８： ｅ７０３９９．
【0351】
６３．Ｌｉｕ Ｈ， Ｍｏｙｎｉｈａｎ ＫＤ， Ｚｈｅｎｇ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｌｙｍｐｈ－ｎｏｄｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１４；５０７： ５１９－５２２．
【0352】
６４．Ｋｏｎｔｓｅｋｏｖａ Ｅ， Ｚｉｌｋａ Ｎ， Ｋｏｖａｃｅｃｈ Ｂ， Ｎｏｖａｋ Ｐ， Ｎｏｖａｋ Ｍ． Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｍａｎ ｔａｕ ｖａｃｃｉｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔａｕ－ｔａｕ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔａｕ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． ２０１４；６： ４４．
【0353】
６５．Ｎｏｖａｋ Ｐ， Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｒ， Ｋｏｎｔｓｅｋｏｖａ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｕ ｖａｃｃｉｎｅ ＡＡＤｖａｃ１ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ， ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ， ｐｈａｓｅ １ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１７；１６： １２３－１３４．
【0354】
６６．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ－ＭｃＣａｒｔｈｙ ＬＲ， ＭｃＣａｒｔｈｙ ＫＲ， Ｒａａｂｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｉｎｃｔ ｖｉｒｕｓ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ． ２０１８；１４： ｅ１００７１２３．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23】
【配列表】
【国際調査報告】