(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-10
(54)【発明の名称】改良型抗原結合受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231102BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231102BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231102BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231102BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231102BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231102BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231102BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231102BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231102BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231102BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20231102BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20231102BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 105
A61K39/395 N
A61K48/00
C12N5/0783
C07K16/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526027
(86)(22)【出願日】2021-10-26
(85)【翻訳文提出日】2023-05-18
(86)【国際出願番号】 EP2021079595
(87)【国際公開番号】W WO2022090181
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】20204220.6
(32)【優先日】2020-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514099673
【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ダロフスキ， ダイアナ
(72)【発明者】
【氏名】ガイガー， マルティナ
(72)【発明者】
【氏名】クライン， クリスティアン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZB271
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087CA04
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、概して、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる活性化可能な抗原結合受容体に関するものである。本発明の抗原結合受容体は、１又は複数のプロテアーゼを介して活性化可能である。活性化後、本抗原結合受容体は、治療用抗体の変異型Ｆｃドメインと特異的に結合／相互作用することで、腫瘍細胞を標的とする。また、本発明は、本発明の抗原結合受容体及び／又は本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を発現する形質導入された免疫細胞にも関する。更に、変異型Ｆｃドメインを含む腫瘍標的抗体と組み合わせた、このような細胞及び／又は核酸分子を含むキットが提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとを含む抗原結合受容体であって、細胞外ドメインが、（ａ）Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、
（ｂ）プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び
（ｃ）抗原結合部分
を含み、
抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスクされており、マスキング部分と抗原結合部分はプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている、抗原結合受容体。
【請求項2】
マスキング部分が、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片、具体的にはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である、請求項１に記載の抗原結合受容体。
【請求項3】
マスキング部分が、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ４ドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗原結合受容体。
【請求項4】
マスキング部分が変異型Ｆｃドメイン又はその断片であり、特に、マスキング部分は、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいる、請求項２又は３に記載の抗原結合受容体。
【請求項5】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｆｃ受容体への結合を低下させ、且つ／又はエフェクター機能を低下させる、請求項４に記載の抗原結合受容体。
【請求項6】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある、請求項４又は５に記載の抗原結合受容体。
【請求項7】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項8】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びグリシン（Ｇ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む、請求項４から７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項9】
前記少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項４から８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項10】
抗原結合部分が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含んでいる、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項11】
抗原結合部分がｓｃＦｖである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項12】
マスキング部分がＣＨ２ドメインである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項13】
抗原結合部分が、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片に結合しない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項14】
プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項15】
プロテアーゼ認識配列が、（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）
から成る群より選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項16】
プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項17】
マスキング部分が、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項18】
抗原結合部分が、（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２又は配列番号４０のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに
（ｉｉ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項19】
抗原結合部分が、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項20】
抗原結合部分が、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項21】
細胞外ドメインが、配列番号８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項22】
細胞外ドメインが、配列番号４１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項23】
細胞外ドメインが、配列番号４４の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項24】
アンカー膜貫通ドメインが、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインから成る群より選択される膜貫通ドメイン又はその断片であり、特に、アンカー膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項25】
少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項26】
抗原結合受容体が共シグナル伝達ドメインを１つ含み、共シグナル伝達ドメインが、Ｎ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＣ末端に繋がれている、請求項２５に記載の抗原結合受容体。
【請求項27】
抗原結合受容体が、刺激性シグナル伝達ドメイン１つを更に含み、刺激性シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端で、共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に繋がれている、請求項２６に記載の抗原結合受容体。
【請求項28】
抗原結合部分が、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【請求項29】
配列番号１３６のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。
【請求項30】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項31】
請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド。
【請求項32】
請求項３０のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
【請求項33】
請求項３０に記載のポリヌクレオチド又は請求項３２に記載のベクターを含む、形質導入されたＴ細胞。
【請求項34】
請求項９から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞。
【請求項35】
（Ａ）請求項９から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞；及び（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
【請求項36】
（Ａ）請求項９から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド；及び（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
【請求項37】
医薬としての使用のための、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項38】
標的細胞抗原に、特にがん細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に、抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞が投与される、医薬としての使用のための、請求項９から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体又は請求項５２又は５３に記載の形質導入されたＴ細胞。
【請求項39】
疾患の治療における使用のため、特にがんの治療における使用のための、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項40】
対象における疾患を治療する方法であって、請求項９から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞を対象に投与することと、標的細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の治療的有効量を、形質導入されたＴ細胞の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与することとを含む、方法。
【請求項41】
医薬の製造のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体、請求項３０に記載のポリヌクレオチド又は請求項３３若しくは３４に記載の形質導入されたＴ細胞の使用。
【請求項42】
医薬ががんの治療のためのものである、請求項４１に記載の使用。
【請求項43】
前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、請求項４２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる活性化可能な抗原結合受容体に関するものである。本発明の抗原結合受容体は、１又は複数のプロテアーゼを介して活性化可能である。活性化後、本抗原結合受容体は、治療用抗体の変異型Ｆｃドメインと特異的に結合／相互作用することで、腫瘍細胞を標的とする。また、本発明は、本発明の抗原結合受容体及び／又は本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を発現する形質導入された免疫細胞にも関する。更に、変異型Ｆｃドメインを含む腫瘍標的抗体と組み合わせた、このような細胞及び／又は核酸分子を含むキットが提供される。
【背景技術】
【0002】
養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん特異的なＴ細胞を用いた強力な治療手法である（Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) 2015:62-68）。ＡＣＴは、天然に存在する腫瘍特異的な細胞、又はＴ細胞若しくはキメラ抗原受容体を用いた遺伝子工学によって特異的にされたＴ細胞を使用してもよい（Rosenberg and Restifo, Science 348(6230) 2015:62-68）。ＡＣＴにより、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫又はメラノーマなど、進行性疾患やその他の治療抵抗性疾患に罹患している患者においても、治療及び寛解導入に成功することが可能である（Dudley et al., J Clin Oncol 26(32) 2008: 5233-5239; Grupp et al., N Engl J Med 368 (16) 2013: 1509-1518; Kochenderfer et al., J Clin Oncol. 33(6) 2015:540-549）。
【0003】
しかし、ＡＣＴは、顕著な臨床有効性にもかかわらず、治療関連毒性によって制限される。ＡＣＴに使用される工学的に操作されたＴ細胞の特異性及びその結果として生じるｏｎ－ｔａｒｇｅｔ効果及びｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ効果は、主に抗原結合受容体に導入された腫瘍標的抗原結合部分によって駆動される（Hinrichs et al., Nat Biotechnol. 31(11) 2013, 999-1008）。腫瘍抗原の非排他的発現又は発現レベルの時間差は重篤な副作用を引き起こしたり、治療の許容できない毒性のためにＡＣＴの中止に至ることさえある。実際、ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＢＣＭＡのなどのいくつかの系統特異的抗原を除いて、上皮腫瘍抗原を標的とし、正常組織にも頻繁に発現してｏｎ－ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ毒性をもたらす従来のＣＡＲ－Ｔ細胞の進歩は、特に固形腫瘍では遅く、このことが、例えばＨＥＲ２を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の例で示されている（Morgan et al., Mol Ther 18(4) 1020:843-851）。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞をより腫瘍特異的にする方法は、治療上大きな可能性を持っている。
【0004】
更に、効率的な腫瘍細胞溶解のための腫瘍特異的Ｔ細胞の利用可能性は、工学的に操作されたＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの長期生存と増殖能力に依存している。一方、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存と増殖は、健康な組織の損傷につながり得る制御されていないＴ細胞応答の持続による望ましくない長期的影響をもたらすこともある（Grupp et al. 2013 N Engl J Med 368(16):1509-18, Maude et al. 2014 2014 N Engl J Med 371(16):1507-17）。
【0005】
重篤な治療関連毒性を抑制し、ＡＣＴの安全性を向上させるための手法の一つは、免疫シナプスにアダプター分子を導入することによってＴ細胞の活性化及び増殖を制限することである。このようなアダプター分子は、例えば最近報告された葉酸－ＦＩＴＣスイッチ（Kim et al. J Am Chem Soc 2015; 137:2832-2835）のような低分子バイモジュラースイッチを含む。更なる手法には、腫瘍細胞を標的にするために、Ｔ細胞の特異性を誘導するタグを含む人工改変抗体が含まれる（Ma et al. PNAS 2016; 113(4):E450-458, Cao et al. Angew Chem 2016; 128:1-6, Rogers et al. PNAS 2016; 113(4):E459-468, Tamada et al. Clin Cancer Res 2012; 18(23):6436-6445）。
【0006】
しかし、既存の手法にはいくつかの限界がある。分子スイッチに依存する免疫シナプスには、免疫応答を誘発したり非特異的なｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ効果をもたらす可能性のあるエレメントを追加的に導入する必要がある。一方、既存の治療用モノクローナル抗体にタグ構造を導入することで、これらのコンストラクトの有効性及び安全性プロファイルに影響を与える可能性がある。更に、タグを付加することにより、当該抗体の製造をより複雑にする追加の改変工程及び精製工程が必要となるうえに、追加の安全性試験も必要となる。
【0007】
既存の手法のもう一つの限界として、ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ効果の可能性が挙げられる。多くの適応症では、目的の抗原が健康な組織にも発現しているため、純粋な標的が見つからない。副作用を減らし、新薬の開発につながるような標的抗原の選択肢を増やすためには、がん特異的Ｔ細胞のみを局所的に活性化させることが望ましい。ＣＡＲ Ｔ細胞の選択性を高めて腫瘍内でのみ活性化するようにするために、例えば酸素感受性ＣＡＲなど、様々な手法が開発されてきた（Juillerat A et al. Sci Rep. 2017;7:39833. Published 2017 Jan 20. doi:10.1038/srep39833）。また、従来のＡＣＴの安全性向上を目指し、プロテアーゼ感受性リンカーを有するダイレクトＣＡＲ（direct CAR）も開発されている（Han X et al. Mol Ther. 2017;25(1):274-284. doi:10.1016/j.ymthe.2016.10.011）。しかし、このような活性化ＣＡＲは複雑であり、適切な免疫細胞での発現が制限される可能性がある。
【0008】
したがって、ＡＣＴの課題に対処するための改善された治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、特性が改良された抗原結合受容体を提供する。
【0010】
特に提供されるのは、細胞外ドメイン及びアンカー膜貫通ドメインを含む抗原結合受容体であって、ここで細胞外ドメインは、
（ａ）Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、
（ｂ）プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び
（ｃ）抗原結合部分
を含み、
該抗原結合部分は該マスキング部分に結合しており、該抗原結合部分はマスクされており、該マスキング部分と該抗原結合部分は該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている。
（ａ）Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、
（ｂ）プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び
（ｃ）抗原結合部分
を含み、
該抗原結合部分は該マスキング部分に結合しており、該抗原結合部分はマスクされており、該マスキング部分と該抗原結合部分は該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている。
【0011】
ある実施態様では、該マスキング部分は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片、具体的にはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である。
【0012】
ある実施態様では、該マスキング部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ４ドメインを含む。
【0013】
ある実施態様では、該マスキング部分は変異型Ｆｃドメイン又はその断片であり、特に、該マスキング部分は、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいる。
【0014】
ある実施態様において、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体への結合を低下させ、且つ／又はエフェクター機能を低下させる。
【0015】
ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある。
【0016】
ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む。
【0017】
ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びグリシン（Ｇ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む。
【0018】
ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0019】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含んでいる。
【0020】
ある実施態様では、該抗原結合部分はｓｃＦｖである。
【0021】
ある実施態様では、該マスキング部分はＣＨ２ドメインである。
【0022】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片に結合しない。
【0023】
ある実施態様では、該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む。
【0024】
ある実施態様では、プロテアーゼ認識配列は、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）
から成る群より選択される。
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）
から成る群より選択される。
【0025】
ある実施態様において、該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーは、プロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）を含む。
【0026】
ある実施態様では、該マスキング部分は、Ｃ末端で該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーのＮ末端に繋がれており、該プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーは、Ｃ末端で該抗原結合部分のＮ末端に繋がれている。
【0027】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、該アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれている。
【0028】
ある実施態様では、該抗原結合部分の該軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、該アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれており、且つ／又は、該重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、該軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端に繋がれている。
【0029】
ある実施態様において、該マスキング部分は、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0030】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２又は配列番号４０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに
（ｉｉ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２又は配列番号４０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに
（ｉｉ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む。
【0031】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0032】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0033】
ある実施態様では、該細胞外ドメインは、配列番号８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む。
【0034】
ある実施態様では、該細胞外ドメインは、配列番号４１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む。
【0035】
ある実施態様では、該細胞外ドメインは、配列番号４４の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む。
【0036】
ある実施態様では、該アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメイン又はその断片から成る群より選択される膜貫通ドメインであり、特に、該アンカー膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である。
【0037】
ある実施態様では、該アンカー膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインであり、特に、該アンカー膜貫通ドメインは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【0038】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む。
【0039】
ある実施態様において、該少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ３ｚの、ＦＣＧＲ３Ａの、及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択され、特に、該少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚ細胞内ドメイン又はその断片である。
【0040】
ある実施態様では、該少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片であり、特に、該少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【0041】
ある実施態様では、該少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ２７の、ＣＤ２８の、ＣＤ１３７の、ＯＸ４０の、ＩＣＯＳの、ＤＡＰ１０の、及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択される。
【0042】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、ＣＤ１３７共刺激性活性を保持するＣＤ１３７共刺激性シグナル伝達ドメイン又はその断片を含み、特に、該抗原結合受容体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【0043】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、ＣＤ２８共刺激性活性を保持するＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメイン又はその断片を含む。
【0044】
ある実施態様において、該抗原結合受容体は、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片を含む刺激性シグナル伝達ドメインを含み、且つ、該抗原結合受容体は、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【0045】
ある実施態様において、該刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【0046】
ある実施態様において、該抗原結合受容体は、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片を含む刺激性シグナル伝達ドメインを１つ含み、且つ、該抗原結合受容体は、ＣＤ１３７共刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ１３７の細胞内ドメイン又はその断片を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを１つ含む。
【0047】
ある実施態様において、該刺激性シグナル伝達ドメインは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、該共刺激性シグナル伝達ドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0048】
ある実施態様では、該抗原結合部分は、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、該アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれている。
【0049】
ある実施態様において、該ペプチドリンカーは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【0050】
ある実施態様では、該アンカー膜貫通ドメインは、任意選択でペプチドリンカーを介して、共シグナル伝達ドメイン又は刺激性シグナル伝達ドメインに繋がれている。
【0051】
ある実施態様では、該シグナル伝達ドメイン同士及び／又は共シグナル伝達ドメイン同士は、任意選択で少なくとも１つのペプチドリンカーを介して、繋がれている。
【0052】
ある実施態様では、該ＶＬドメインは、Ｃ末端で該アンカー膜貫通部のＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して、繋がれている。
【0053】
ある実施態様では、該ＶＨドメインは、Ｃ末端で該ＶＬドメインのＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して、繋がれている。
【0054】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は共シグナル伝達ドメインを１つ含み、該共シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端で、該アンカー膜貫通ドメインのＣ末端に繋がれている。
【0055】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、刺激性シグナル伝達ドメイン１つを更に含み、該刺激性シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端で、該共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に繋がれている。
【0056】
ある実施態様において、該抗原結合部分は、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0057】
ある実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体である。
【0058】
ある実施態様では、提供されるのは、本明細書で上述したような抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチドである。
【0059】
ある実施態様において、提供されるのは、本明細書で上述したような単離ポリヌクレオチドによってコードされた、ポリペプチドである。
【0060】
ある実施態様では、提供されるのは、本明細書で上述したようなポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターである。
【0061】
ある実施態様では、提供されるのは、本明細書で上述したようなポリヌクレオチド又はベクターを含む、形質導入されたＴ細胞である。
【0062】
ある実施態様では、提供されるのは、請求項９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞である。
【0063】
ある実施態様では、提供されるのは、キットであって、
（Ａ）請求項９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
（Ａ）請求項９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
【0064】
ある実施態様では、提供されるのは、キットであって、
（Ａ）請求項９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
（Ａ）請求項９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
【0065】
ある実施態様では、該Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
【0066】
ある実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される。
【0067】
ある実施態様では、医薬としての使用のための、本明細書で上述したようなキットが提供される。
【0068】
ある実施態様では、医薬としての使用のための、本明細書で上述したような抗原結合受容体又は形質導入されたＴ細胞が提供される、ここで、抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞は、標的細胞抗原に、特にがん細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与される。
【0069】
ある実施態様では、該使用は、疾患の治療、特にがんの治療における使用のためのものである。
【0070】
ある実施態様では、該治療は、抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞を、がん細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与することを含む。
【0071】
ある実施態様において、前記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。
【0072】
ある実施態様では、該がん細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される。
【0073】
ある実施態様では、該形質導入されたＴ細胞は、治療される対象から単離された細胞に由来する。
【0074】
ある実施態様では、形質導入されたＴ細胞は、治療される対象から単離された細胞に由来するものでない。
【0075】
更に提供されるのは、対象における疾患を治療する方法であって、本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞を対象に投与することと、形質導入されたＴ細胞の投与の前、投与と同時又は投与の後に、標的細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の治療的有効量を投与することとを含む方法である。
【0076】
ある実施態様では、該方法は、対象からＴ細胞を単離することと、単離Ｔ細胞に本明細書で上述したようなポリヌクレオチドを形質導入することによって形質導入されたＴ細胞を生成することを追加的に含む。
【0077】
ある実施態様では、該Ｔ細胞は、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターコンストラクト、又は非ウイルスベクターコンストラクトで形質導入される。
【0078】
ある実施態様では、該形質導入されたＴ細胞は、静脈内注入によって対象に投与される。
【0079】
ある実施態様では、該形質導入されたＴ細胞を、対象への投与の前に、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる。
【0080】
ある実施態様では、該形質導入されたＴ細胞を、対象への投与前に少なくとも１つのサイトカインと接触させ、好ましくはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及び／若しくはインターロイキン－２１又はそれらのバリアントと接触させる。
【0081】
ある実施態様では、上記疾患はがんである。
【0082】
ある実施態様において、該がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。
【0083】
更に提供されるのは、標的細胞の溶解を誘導する方法であって、標的細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の存在下で、標的細胞を、本明細書で上述したような抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と接触させることを含む方法である。
【0084】
ある実施態様では、上記標的細胞はがん細胞である。
【0085】
ある実施態様では、標的細胞は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される抗原を発現する。
【0086】
更に、医薬の製造のための、本明細書で上述したようなポリヌクレオチド又は形質導入されたＴ細胞が提供される。
【0087】
ある実施態様では、該医薬は、がんの治療のためのものである。
【0088】
ある実施態様において、前記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される。
【図面の簡単な説明】
【0089】
【図3A-C】結合部分として異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価である。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下での、又はＰ３２９Ｇ Ｆｃバリアントを含むが標的細胞がない抗体の存在下での、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均（technical average values from triplicates）であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図3D-F】結合部分として異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の非特異的シグナル伝達の評価である。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、異なるＦｃバリアントを有する抗体の存在下でのＣＤ３下流シグナル伝達の強度を定量化することにより評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4A-C】ＦｏｌＲ１に対する高（１６Ｄ５）、中（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせた、高（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１））標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下でＰ３２９Ｇバインダーの様々なヒト化バージョンを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4D-F】ＦｏｌＲ１に対する高（１６Ｄ５）、中（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせた、中（Ｓｋｏｖ３）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下でＰ３２９Ｇバインダーの様々なヒト化バージョンを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図4G-I】ＦｏｌＲ１に対する高（１６Ｄ５）、中（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）又は低（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）親和性を有する抗体と組み合わせた、低（ＨＴ２９）標的発現レベルを有するＦｏｌＲ１＋標的細胞の存在下でＰ３２９Ｇバインダーの様々なヒト化バージョンを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。活性化は、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、ＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化によって評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図5】結合部分として異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１標的ＩｇＧとＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋）標的細胞の存在下で、レポーター細胞の活性を評価した（図５Ａ）。抗体用量依存的活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用してＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化により評価し、曲線下面積を算出した（図５Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図6】結合部分として異なるヒト化バージョンのＰ３２９Ｇバインダーを用いた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ ＪｕｒｋａｔレポーターＴ細胞の活性化。抗ＨＥＲ２（ペルツズマブ）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１標的ＩｇＧとＨｅＬａ（ＨＥＲ２＋）標的細胞の存在下で、レポーター細胞の活性を評価した（図６Ａ）。抗体用量依存的活性化を、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイを使用してＣＤ３下流シグナル伝達の強度の定量化により評価し、曲線下面積を算出した（図６Ｂ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図7B】このマスクは、プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して抗Ｐ３２９Ｇ ｓｃＦｖに融合されている。リンカー切断後、抗Ｐ３２９Ｇバインダーは脱マスキングされ、例えば抗Ｐ３２９Ｇ抗体と結合することができる（図７Ｂ）。
【図8】マスクされた抗Ｐ３２９Ｇ結合部分を有する第二世代キメラ抗原結合受容体をコードするＤＮＡコンストラクトの模式図である。ＶＨｘＶＬ ｓｃＦｖ配向（図８Ａ）及びＶＬｘＶＨ（図８Ｂ）配向での図である。
【図9】マスクされた抗Ｐ３２９Ｇバインダーを結合部分として用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の活性化。抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１標的ＩｇＧとＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋）標的細胞の存在下で、レポーター細胞の活性を評価した（図９Ａ）。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図10A】マスクされた抗Ｐ３２９Ｇバインダーを結合部分として用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の用量依存的活性化。レポーター細胞の活性は、抗ＰＳＭＡ（Ｊ５９１）Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１標的ＩｇＧとＬｎＣＡＰ（ＰＳＭＡ＋）標的細胞の存在下（図１０Ａ）の存在下で評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【図10B】マスクされた抗Ｐ３２９Ｇバインダーを結合部分として用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーターＴ細胞の用量依存的活性化。レポーター細胞の活性は、抗ＥｐＣａｍ（３－１７Ｉ）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１標的ＩｇＧとＬｎＣＡＰ（ＥｐＣａｍ＋）標的細胞の存在下で評価された。描かれているのは技術的値のトリプリケートの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0090】
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
【0091】
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【0092】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
【0093】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（「ＡＤＣＣ」）は、抗体でコートした標的細胞の免疫エフェクター細胞による溶解につながる免疫機構である。該標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介してＦｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、上で定義したＡＤＣＣの機構によって、該標的細胞を囲む培地中の所定の抗体濃度で、所定の時間内に溶解する該標的細胞の数の減少及び／又はＡＤＣＣの機構によって、所定の時間内に所定の数の標的細胞の溶解を達成するのに必要な、該標的細胞を囲む培地中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。このＡＤＣＣの低下は、（当業者に既知の）同じ標準的な製造、精製、製剤化及び保管方法を用いて、同じ種類の宿主細胞により産生された同じ抗体であるが工学操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。例えば、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換をＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、このようなアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
【0094】
薬剤、例えば薬学的組成物の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【0095】
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。特に断らない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。一般に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）によって表される。親和性は、本明細書に記載のものを含む当技術分野で一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示的方法を以下に記載する。
【0096】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされているアミノ酸と、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、Ｏ－ホスホセリンなど、後に修飾されるアミノ酸のことである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持ちながら、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。アミノ酸は、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字記号のいずれかで称される。
【0097】
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。最終構築物が所望の特徴（例えば、Ｆｃ受容体への結合の低下又は別のペプチドとの会合の増加）を有することを条件として、置換、欠失、挿入及び修飾のいかなる組み合わせも、最終構築物に到達するために行うことが可能である。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特にアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変化させるためには、非保存的アミノ酸置換、すなわち１つのアミノ酸を異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、又は２０種類の一般的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが含まれる（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝学的方法には、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。遺伝子工学以外の方法、例えば化学修飾によるアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用であり得ると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、様々な表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示され得る。
【0098】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例：二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
【0099】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例：ｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；シングルドメイン抗体（ｄＡｂｓ）； 及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
【0100】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域ともいう）によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0101】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例としては、免疫グロブリン及びその誘導体（例：断片）、並びに抗原結合受容体及びその誘導体が挙げられる。
【0102】
ここで使用される用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。ある実施態様では、抗原結合部分は、それが結合する実体（例えば、該抗原結合部分を含む抗原結合受容体を発現している細胞）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと誘導することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメイン（例：ｓｃＦｖ断片）を含む。特定の実施態様では、該抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、且つ当技術分野において既知である抗体定常領域を含み得る。有用な重鎖定常領域には、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかが含まれる。
【0103】
本発明の文脈において、用語「抗原結合受容体」は、アンカー膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む抗原結合分子をいう。抗原結合受容体は、異なる供給源からのポリペプチド部分から作ることができる。したがって、抗原結合受容体は、「融合タンパク質」及び／又は「キメラタンパク質」であると理解される場合もある。通常、融合タンパク質は、もともと別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子（好ましくはｃＤＮＡ）を結合して作られるタンパク質である。この融合遺伝子（又は融合ｃＤＮＡ）を翻訳すると、好ましくは、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドが得られる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究又は治療における使用のために、組換えＤＮＡ技術によって人工的に作られる。本発明の抗原結合受容体の更なる詳細は、本明細書において後述する。本発明の文脈において、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、それ自体が細胞内シグナル伝達ドメインに融合しているアンカー膜貫通ドメインにスペーサー配列によって融合された抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解される。
【0104】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用をもたらす抗原結合分子の部位、すなわち１又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、典型的には２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は、典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【0105】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体又は抗原結合受容体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0106】
本明細書で使用される場合、用語「抗原決定基」は「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の連続ストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体構造（conformational configuration）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、その他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離した状態で、且つ／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質は、霊長類（例：ヒト）及びげっ歯類（例：マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の天然型を指す。特定の実施態様では、該抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質に言及する場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の形態のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。
【0107】
本発明による「変異型Ｆｃドメインを含む抗体」、すなわち治療用抗体は、１、２、３又はそれ以上の結合ドメインを有してよく、単一特異性、二重特異性又は多重特異性であってもよい。該抗体は、単一種からの完全長であっても、キメラ化若しくはヒト化されていてもよい。２つを超える抗原結合ドメインを持つ抗体の場合、いくつかの結合ドメインが同じであったり、同じ特異性を持っていたりすることがある。
【0108】
本明細書で使用される「ＡＴＤ」という用語は、細胞の１又は複数の細胞膜に組み込むことができるポリペプチドストレッチを画定する「アンカー膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＭは細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、これらの細胞外及び／又は細胞内ポリペプチドドメインは、細胞膜に限局している。本発明の抗原結合受容体の場合、ＡＴＭは、本発明の抗原結合受容体の膜付着及び限局を付与する。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのＡＴＭと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む。また、ＡＴＭは細胞内シグナル伝達ドメインに融合している場合もある。
【0109】
「特異結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器で解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217229 (2002)）のいずれかによって測定することができる。ある実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【0110】
本明細書で採用する「ＣＤＲ」という用語は、「相補性決定領域」に関するものであり、当技術分野でよく知られているものである。ＣＤＲは、免疫グロブリン又は抗原結合受容体の一部であり、前記分子の特異性を決定し、特定のリガンドと接触させるものである。ＣＤＲは該分子の最も可変的な部分であり、このような分子の抗原結合多様性に寄与している。各Ｖドメインには、３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が存在する。ＣＤＲ－Ｈは可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－Ｌは可変軽鎖のＣＤＲ領域を表す。ＶＨは可変重鎖を意味し、ＶＬは可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) or “Chothia” (Nature 342 (1989), 877-883）に記載されているように決定することができる。
【0111】
「ＣＤ３ｚ」は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指し、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」や「ＣＤ２４７」としても知られる。
【0112】
「キメラ抗原受容体」又は「キメラ受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、スペーサー配列によって細胞内シグナル伝達ドメイン／共シグナル伝達ドメイン（例：ＣＤ３ｚ及びＣＤ２８の）に融合された、抗原結合部分の細胞外部分（例えば一本鎖抗体ドメイン）から構成された抗原結合受容体を指す。
【0113】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の主要なクラスにはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つがあり、これらのうちのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。特定の態様において、抗体は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を低下させるＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものであり、ＩｇＧ４抗体の安定性を向上させる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。
【0114】
本願で使用される「ヒト起源の定常領域」又は「ヒト定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を意味する。このような定常領域は、ヒト又はヒト化抗体において使用することができ、当技術分野において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている（また、例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788参照）。特に断らない限り、定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるように、ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【0115】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖の可変ドメインとＦａｂ軽鎖の可変ドメインが交換されている（すなわち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端の方向に）から構成されるペプチド鎖とを含む。明確にするために本明細書では、Ｆａｂ軽鎖の可変ドメインとＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖をクロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
【0116】
本明細書で使用される「ＣＳＤ」という用語は、共刺激性シグナル伝達ドメインを指す。
【0117】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、以下が含まれる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例：Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
【0118】
本明細書で使用される場合、「工学（的に）操作（する）、工学（的に）操作された（る））（“engineer, engineered, engineering”）」という用語は、天然に存在するポリペプチド又は組換えポリペプチド又はそれらの断片の、ペプチド骨格のいかなる操作又は翻訳後修飾をも含むと考えられる。工学的操作には、アミノ酸配列の改変、グリコシル化パターンの改変又は個々のアミノ酸の側鎖基の改変と、これらの手法の組み合わせとが含まれる。
【0119】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写される核酸配列とプロモーターを含む。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【0120】
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）とから成るタンパク質を指す。
【0121】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を包含する。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は多少変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１又は複数（特に１又は２）のアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により、宿主細胞によって産生される抗体は、完全長重鎖を含むことも、完全長重鎖の切断されたバリアント（本明細書では「切断されたバリアント重鎖」とも呼ぶ）を含むこともある。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に該当し得る。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）は、存在することもしないこともあり得る。Ｆｃドメイン（又は本明細書で定義されているＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを有しないものとして示される。本発明のある実施態様では、本明細書で定義されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本発明のある実施態様では、本明細書で定義されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本明細書に記載の薬学的組成物など、本発明の組成物は、本発明の抗原結合分子の集団を含んでいる。抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断されたバリアント重鎖を有する分子とを含み得る。抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子と切断されたバリアント重鎖を有する分子との混合物から構成されてもよく、抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、切断されたバリアント重鎖を有する。本発明のある実施態様では、本発明の抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗原結合分子を含んでいる。本発明のある実施態様では、本発明の抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫活性化Ｆｃドメイン結合分子を含んでいる。本発明のある実施態様では、このような組成物は、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子から構成される抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基 （Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）； 及び追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチドを有する、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含んでいる。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（別名ＥＵインデックス）に従う（上記も参照のこと）。本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
【0122】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。通常、可変ドメインのＦＲは４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４から成る。したがって、ＣＤＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の配列：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（ＣＤＲ－Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（ＣＤＲ－Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（ＣＤＲ－Ｌ３）－ＦＲ４に現れる。
【0123】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体又は本明細書で定義されているＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【0124】
「融合した」とは、成分同士（例：Ｆａｂと膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合により、直接的に又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して結合されていることを意味する。
【0125】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含める。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
【0126】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体のアミノ酸配列又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【0127】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬフレームワーク配列又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。ある態様では、ＶＬについて、該サブグループはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．前掲書にあるようなサブグループカッパＩである。ある態様では、ＶＨについて、該サブグループはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．前掲書にあるようなサブグループＩＩＩである。
【0128】
「ヒト化」抗体（例：ヒト化ｓｃＦｖ断片）とは、非ヒトＣＤＲのアミノ酸残基とヒトＦＲのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化した抗体を指す。
【0129】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、且つ抗原結合特異性を決定する抗体可変ドメインの各領域、例えば相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を指す。
【0130】
一般に、抗体は６つのＣＤＲ：ＶＨに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下のものが挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、９６～１０１（Ｈ３）にある超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）にあるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）にある抗原コンタクト（antigen contact）（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、９６～１０１（Ｈ３）にある超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）にあるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）にある抗原コンタクト（antigen contact）（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）。
【0131】
特に断りのない限り、ＣＤＲはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．前掲書に従って決定される。当業者であれば、ＣＤＲの割り当ては、Ｃｈｏｔｈｉａ前掲書、ＭｃＣａｌｌｕｍ前掲書又は他の科学的に認められた命名法に従って決定することもできることを理解するであろう。
【0132】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【0133】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例：ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例：ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例：マウス、ラット）が含まれる。特定に態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【0134】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例：イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定されるように、９５％超又は９９％超の純度に精製される。抗体純度の評価方法の総論については、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0135】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は可変軽ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちのいずれか１つに割り当てることができ、これらの種類のいくつかは、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）のサブタイプに更に分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちのいずれか１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合した２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとから実質的に成る。
【0136】
「単離核酸」分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子であるＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明のために単離されたものと見なされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又はその本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖型とマイナス鎖型及び二本鎖型を含む。本発明の単離ポリヌクレオチド又は核酸は、合成により製造されたそのような分子を更に含む。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。
【0137】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中５％までのヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、或いは参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置に、或いはこれら末端位置の間の任意の場所に、参照配列中の残基間で個別に散在して、又は参照配列内の１つ若しくは複数の連続したかたまりで散在して起こる可能性がある。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチド用の後述するものなどの既知のコンピュータプログラム（例えばＡＬＩＧＮ－２）を用いて慣例的に判定することができる。
【0138】
「単離された」ポリペプチド若しくはバリアント又はその誘導体とは、その自然の環境にないポリペプチドの意味である。特に精製は必要ではない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現した組換え生産ポリペプチド及びタンパクは、任意の適切な技術により分離、画分化又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明のために単離されたものと見なされる。
【0139】
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドとの会合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１サブユニット及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別個の修飾を含み、これらの修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、これらのＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それぞれ立体的に、静電気的に、それらの会合を有利にすることができる。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのサブユニットの各々に融合された更なる構成要素（例えば抗原結合部分）が同じではないという意味で非同一である可能性がある。いくつかの実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【0140】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち該集団を構成する個々の抗体が、あり得るバリアント抗体（これらは例えば天然に存在する変異を含んでいたりモノクローナル抗体調製物の生産中に生じ、通常少量存在する）を除き、同一であり且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって製造することができ、これらの方法及びモノクローナル抗体を製造するためのその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【0141】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的組成物中に存在してもよい。
【0142】
「天然抗体」は、天然に存在する、様々な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続いている。
【0143】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、アライメントのためにいかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大のアライメントを得るために必要なアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。或いは、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて、同一性パーセント値を生成することもできる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、利用者向け文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、そこで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録され、且つ国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
【0144】
本明細書では、特に断らない限り、アミノ酸配列の同一性パーセント値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較行列と共にバージョン３６．３．８ｃ以降のＦＡＳＴＡパッケージのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６に記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に入手可能である。或いは、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉからアクセスできる公開サーバーを使用し、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムとデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）で、ローカルではなくグローバルアライメントを実行して、配列を比較することも可能である。アミノ酸の同一性パーセントは、出力アライメントヘッダに示される。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチドが構成するプリン塩基とピリミジン塩基とを含む塩基の配列に関係するものであり、前記塩基は核酸分子の一次構造を表すものである。ここで、核酸分子という用語には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成型、及びこれらの分子を２種以上含む混合ポリマーが含まれる。また、核酸分子という用語には、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が含まれる。更に、本明細書に記載の核酸分子は、当業者には容易に理解されるように、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。
【0145】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【0146】
用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を何も含有しない調製物を指す。薬学的組成物は、１又は複数の薬学的に許容される担体を更に含む。
【0147】
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
【0148】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合（ペプチド結合としても知られる）により直線的に結合したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。
【0149】
用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸から成る鎖を指すのであって、該生成物の特定の長さのものを指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語の代わりに、又はこれらと互換的に、使用され得る。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されており、このような産物には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるものでも組換え技術により生産されるものでもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されたものであるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で製造することができる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上のアミノ酸から成るサイズのものである。ポリペプチドは、明確に定義された三次元構造を有する場合もあるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。明確に定義された三次元構造を有するポリペプチドは、「フォールディングされた」と言われ、明確に定義された三次元構造を有せずに多数の異なるコンフォメーションを採り得るポリペプチドは、「フォールディングされていない」と言われる。
【0150】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する１又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【0151】
本明細書で使用される「プロテアーゼ」又は「タンパク質分解酵素」は、リンカーを認識配列（認識部位ともいう）で切断し、標的細胞によって発現される任意のタンパク質分解酵素を指す。このようなプロテアーゼは、標的細胞によって分泌されても、標的細胞と会合したまま残っても（例えば標的細胞表面に）よい。プロテアーゼの例には、限定されないが、メタロプロテイナーゼ（例：マトリックスメタロプロテイナーゼ１－２８、Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）２、７－１２、１５、１７－２３、２８－３０及び３３）、セリンプロテアーゼ（例：ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ）、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ；並びにカテプシンファミリーのメンバーが含まれる。
【0152】
本発明の抗原結合受容体に関して本明細書において使用される「活性化可能」とは、抗原特異的活性化の能力が低下又は消失した抗原結合受容体を指す。この抗原特異的活性化能の低下は、受容体がその抗原に結合する能力を低下させるか又は消失させるマスキング部分（例：ＣＨ２ドメイン）に起因するものである。タンパク質切断によって（例：マスキング部分と抗原結合受容体を繋ぐリンカーのタンパク質切断によって）マスキング部分が解離すると、抗原への結合能が回復し、それによって抗原結合受容体が活性化される。
【0153】
本明細書で用いられる「可逆的に隠す」とは、抗原結合部分をその抗原（
例：変異したＦｃドメイン）から妨げるように、マスキング部分が抗原結合部分に結合することをいう。この隠すことは、マスキング部分（例：ＣＨ２ドメイン）
が、例えばプロテアーゼ切断によって抗原結合部分から外され、それによって抗原結合部分がその抗原に結合するために遊離することができるという点で、可逆的である。
例：変異したＦｃドメイン）から妨げるように、マスキング部分が抗原結合部分に結合することをいう。この隠すことは、マスキング部分（例：ＣＨ２ドメイン）
が、例えばプロテアーゼ切断によって抗原結合部分から外され、それによって抗原結合部分がその抗原に結合するために遊離することができるという点で、可逆的である。
【0154】
「結合の低下」、例えばＦｃ受容体への結合の低下は、例えばＳＰＲで測定される、それぞれの相互作用の親和性の低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性のゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）までの低下、すなわち相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合の増大」は、それぞれの相互作用の結合親和性の上昇を指す。
【0155】
用語「調節配列」とは、連結されるコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を指す。このような調節配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物において、調節配列にはプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターが通常含まれる。真核生物においては、調節配列にはプロモーター、ターミネーター、場合によってはエンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子が通常含まれる。「調節配列」という用語は、発現に必要な全ての構成要素を最低限含むことを意図しており、且つ追加の有利な構成要素も含み得る。
【0156】
本明細書において使用される用語「一本鎖」は、ペプチド結合により直線状に結合したアミノ酸単量体を含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一方は、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーにより繋がれて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。このような特定の実施態様では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に繋がれている。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ断片である。
【0157】
本明細書で使用される「ＳＳＤ」という用語は、「共刺激性シグナル伝達ドメイン」を指す。
【0158】
本明細書において用いられる場合、「治療（“treatment”）」（及び「治療する（“treat”又は“treating”）」など、その文法的変形）は、治療される個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程において実施され得る。治療の望ましい作用としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患進行の速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び緩解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0159】
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される１又は複数の細胞応答を指す。本発明の免疫活性化Ｆｃドメイン抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
【0160】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
【0161】
本明細書で使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原に特異的な１つ（且つ１つまで）の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示すものである。
【0162】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを備えている。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインで十分である。更に、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
【0163】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、自身が結合している別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、導入された宿主細胞のゲノムに組み入れたベクターだけでなく、自己複製核酸構造体としてのベクターも含む。ある種のベクターは、それが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」という。
【0164】
変異型Ｆｃドメインに特異結合できる、活性化可能な抗原結合受容体
本発明は、例えば標的細胞（例：がん細胞）を標的とする治療用抗体などの抗体の変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合受容体に関するものである。特に、本発明は、活性化可能な抗原結合受容体に関するものである好ましい態様において、本発明は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できる、活性化可能な抗原結合受容体に関する。
本発明は、例えば標的細胞（例：がん細胞）を標的とする治療用抗体などの抗体の変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合受容体に関するものである。特に、本発明は、活性化可能な抗原結合受容体に関するものである好ましい態様において、本発明は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できる、活性化可能な抗原結合受容体に関する。
【0165】
本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの抗原結合部分とマスキング部分とを含む細胞外ドメインを含む。該マスキング部分は、抗原結合部分を可逆的に隠す。好ましい実施態様では、該マスキング部分は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーを介して抗原結合部分に繋がれている。プロテアーゼがない場合、該マスキング部分は抗原結合部位がその標的抗原に結合するのを防げる（図７Ａ参照）。したがって、本発明の抗原結合受容体は、適切なプロテアーゼによって活性化可能である。
【0166】
適切なプロテアーゼが、例えば標的細胞の微小環境中に存在する（標的細胞は１又は複数の適切なプロテアーゼを分泌するか又は標的細胞の微小環境中の細胞が１又は複数の適切なプロテアーゼを分泌する）と、プロテアーゼ切断可能なリンカーが切断され、抗原結合受容体がアンマスクとなる（図７Ｂ参照）。
【0167】
好ましい実施態様において、マスキング部分は、変異型Ｆｃドメイン又はその断片である。Ｆｃドメイン又はその断片に結合可能な抗原結合受容体は、抗原結合受容体を含む免疫細胞（Ｔ細胞など）を適切なＦｃドメインを含む治療用抗体を介し標的細胞に対して標的化するために使用することができる。治療用抗体が標的細胞に結合し、細胞表面に（活性化された）抗原結合受容体を含む免疫細胞が治療用抗体のＦｃドメインに結合すると、免疫細胞が活性化される（図７Ｂ参照）。
【0168】
好ましい実施態様では、治療用抗体のＦｃドメインは、（例えば、低下した１又は複数のエフェクター機能を有する）変異型Ｆｃドメインである。変異型Ｆｃドメインを有する治療用抗体は、Ｆｃドメインを変異させることにより、Ｆｃドメインの所望の機能（例：エフェクター機能）を治療における当該機能の最適レベルに応じて増大又低下させることができるため、抗体療法において有益である。
【0169】
本発明による改良型抗原結合受容体は、治療用抗体のこのような変異型Ｆｃドメインに特異結合できる。この概念によれば、治療用抗体の変異型Ｆｃドメインは、本発明による形質導入された細胞を治療用抗体の標的にするために使用される。本発明による改良型抗原結合受容体は活性化可能であり、治療のｏｎ－ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ活性が低減される。したがって、本発明は、例えばがんの改善された治療のための改良型抗原結合受容体を提供する。
【0170】
本発明は、抗原結合受容体の細胞外ドメインにプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーを介して標的（変異体）Ｆｃドメインを融合させることにより、抗原結合受容体が可逆的に隠されている（マスクされている）、（プロテアーゼ）活性化可能な抗原結合受容体を提供する。本発明の抗原結合受容体は、抗原結合部分が適切な変異型Ｆｃドメインに特異的に結合し、非変異型親（野生型Ｆｃドメイン）には結合しないため、天然に存在するＦｃドメインには結合しない。したがって、野生型Ｆｃドメインを含む抗体（例：ＩｇＧ抗体）は、本発明の抗原結合受容体によって認識されない。これは、例えば変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体に含まれるような標的変異型Ｆｃドメインのみが、本発明の活性化可能な抗原結合受容体によって、適切なプロテアーゼによる活性化後にのみ認識されるという利点を有している。
【0171】
本発明は更に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞などのＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞又はマクロファージの、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の、本明細書に記載の抗原結合受容体による形質導入とそれらの標的化された動員、例えば、変異型Ｆｃドメイン（例：ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメイン）を含む抗体分子（例：治療用抗体）による腫瘍への標的化に関する。ある実施態様では、本抗体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に特異結合できる。
【0172】
別記の実施例に示すように、概念実証として、マスキング部分（Ｐ３２９Ｇ変異を含むＣＨ２ドメイン）、抗原結合部分（Ｐ３２９Ｇ変異に特異的に結合できるｓｃＦｖ）を含み、本発明によるアンカー膜貫通ドメイン（ＣＤ８膜貫通ドメイン）を含む抗原結合受容体（配列番号１３８に示されるＤＮＡ配列によってコードされ、図７Ａに示されるような配列番号１３６）であって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む治療用抗体に特異結合できる抗原結合受容体が構築された。Ｆｃドメイン中のＰ３２９Ｇ変異を含む抗ＦｏｌＲ１抗体とＦｏｌＲ１陽性且つプロテアーゼ分泌性の腫瘍細胞との共培養により、ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ融合タンパク質（配列番号１３８に示すＤＮＡ配列によりコードされる配列番号１３６）を発現する形質導入されたＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞）が強く活性化された（例えば図９参照）。
【0173】
以下、本発明の概念とその構成要素について、更に詳しく説明する。
【0174】
本発明によれば、変異型Ｆｃドメイン（例：ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む）を含む腫瘍特異的抗体、すなわち治療用抗体と、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む／から成る抗原結合受容体を形質導入されたＴ細胞との対合の結果、Ｔ細特異的活性化とその後の腫瘍細胞の溶解が得られる。この手法は、変異型Ｆｃドメインを含む抗体の非存在下ではＴ細胞は不活性であるため、従来のＴ細胞ベースの手法に比べて安全性に大きな利点がある。
【0175】
しかし、多くの適応症では、（腫瘍）標的抗原は健康な組織にも発現しているため、純粋な腫瘍標的（抗原）が見つからない。本発明は、腫瘍組織中のプロテアーゼによって選択的に活性化される活性化可能抗原結合受容体を提供する。この手法は、副作用を軽減し、標的抗原の選択肢を増やす。
【0176】
本発明は、Ｔ細胞を誘導するものとして、ＩｇＧ型抗体を用いて腫瘍細胞をマーク又は標識する、汎用性の高い治療プラットフォームを提供する。本プラットフォームは、多様な（既存の又は新規に開発された）標的抗体の使用又は異なる抗原特異性を有するがＦｃドメインに同じ変異（例：Ｐ３２９Ｇ変異など）を持つ複数の抗体の共投与を可能にすることにより、柔軟性と個別性を備えたプラットフォームとなっている。Ｔ細胞活性化の程度は、共投与される治療用抗体の投与量を調整することによって、又は異なる抗体特異性又はフォーマットに切り替えることにより、更に調整することができる。本発明に従い形質導入されたＴ細胞は、変異型Ｆｃドメインを含む標的抗体の共投与がなくても不活性である。なぜなら、本明細書に記載のＦｃドメインに対する変異は、天然免疫グロブリン又は非変異型免疫グロブリンでは生じないからである。また、形質導入されたＴ細胞は、プロテアーゼが切断されて、マスキング部分が外れるまでは不活性である。したがって、本発明は、がん治療に適した標的抗原の空間を拡大する。
【0177】
したがって、本発明は、細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとを含む抗原結合受容体に関するものであり、ここで、細胞外ドメインは、Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び抗原結合部分を含み、抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスキングされており、マスキング部分と抗原結合部分はプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている。
【0178】
エフェクター機能は、本明細書で詳述するように、抗体ベースの腫瘍治療の深刻な副作用につながる可能性があるため、がん治療においてエフェクター機能が低下した治療用抗体を用いることが特に望ましい。エフェクター機能を低下させるＦｃドメインの変異は、当技術分野で知られており、本明細書にも記載されている。ある実施態様において、マスキング部分は、Ｆｃ受容体への結合及びエフェクター機能を低下させる、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0179】
本発明の文脈において、抗原結合受容体は、Ｔ細胞内又はＴ細胞上に天然には存在しない細胞外ドメインを含む。このように、抗原結合受容体は、本発明による抗原結合受容体を発現する細胞に対して目的に適った結合特異性を付与することができる。本発明の１又は複数の抗原結合受容体を形質導入した細胞（例：Ｔ細胞）は、変異型Ｆｃドメインに特異結合できるようになるが、非変異型親Ｆｃドメインには特異結合できるようにならない。特異性は、抗原結合受容体の細胞外ドメインの抗原結合部分とプロテアーゼ切断可能なリンカーのプロテアーゼ認識配列によってもたらされる。本発明の文脈において、本明細書で説明するように、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合部分は、変異型Ｆｃドメインと結合／相互作用するが、非変異型親Ｆｃドメインとは結合／相互作用しない。
【0180】
マスキング部分として機能するＦｃドメイン又はその断片
ある態様において、Ｆｃドメイン又はその断片によってマスクされている（活性化可能な）抗原結合受容体が提供される。本発明の抗原結合受容体は、抗原結合部分とマスキング部分とを含む。好ましい態様において、マスキング部分はＦｃドメイン又はその断片である。ある態様において、抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスクされている。好ましい態様では、抗原結合部分は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異型Ｆｃドメインであるマスキング部分に特異結合できる。ある態様では、抗原結合受容体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含まないＦｃドメインであるマスキング部分に結合することはない。
ある態様において、Ｆｃドメイン又はその断片によってマスクされている（活性化可能な）抗原結合受容体が提供される。本発明の抗原結合受容体は、抗原結合部分とマスキング部分とを含む。好ましい態様において、マスキング部分はＦｃドメイン又はその断片である。ある態様において、抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスクされている。好ましい態様では、抗原結合部分は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異型Ｆｃドメインであるマスキング部分に特異結合できる。ある態様では、抗原結合受容体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含まないＦｃドメインであるマスキング部分に結合することはない。
【0181】
該Ｆｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖から成る。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ２ ＩｇＧ重鎖定常ドメイン及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。該Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。本発明によるマスキング部分は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片（又はＣＨ２二量体などの二量体のその断片）の一方又は両方のサブユニットとすることができる。ある実施態様では、該マスキング部分はＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、該マスキング部分はＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、該マスキング部分はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【0182】
該Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期や好ましい組織－血液分配比などの好ましい薬物動態特性を抗体に付与する。しかしながら、同時に、該Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への望ましくない標的化をもたらす可能性がある。更に、Ｆｃ受容体のシグナル伝達経路の共活性化によりサイトカインが放出され、それにより全身投与時のサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用が生じる可能性がある。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的な破壊に起因して、抗体（例：Ｔ細胞活性化抗体）の効力を低下させることさえあり得る。
【0183】
したがって、好ましくは、例えば本発明の抗原結合受容体との組み合わせとして、本発明に従って使用される抗体は、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下は、抗体のＦｃを改変することによって達成される。本発明による抗原結合部分は、このような改変型Ｆｃドメインに特異的に結合する。
【0184】
本発明のある態様によれば、本発明の抗原結合受容体をマスクするＦｃドメイン又はその断片は、抗原結合受容体と組み合わせて使用される抗体のＦｃドメインの改変と一致するように改変／工学的に操作されている。但し、このマスキング部分の改変は、マスキング部分が治療用抗体のマスキング部分とＦｃドメインの両方に結合できる限り、治療用抗体のＦｃドメインの改変と同一である必要はない。概念実証として含まれる別記の実施例では、抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含むＣＨ２マスキングドメインに結合する。一致している治療用抗体はＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を有するが、該治療用抗体及び／又はマスキング部分は更なる変異を有していてもよい。
【0185】
この概念によれば、本発明の抗原結合受容体の抗原結合部分をマスクするためのマスキング部分として、改変／工学的操作型Ｆｃドメイン又はその断片が使用される。マスキング部分が抗原結合受容体から（例えば、腫瘍微小環境におけるプロテアーゼ切断によって）外されると、抗原結合部分は、抗原結合部分の結合のための適切な改変を含むＦｃドメインを含む抗体に結合することが可能である。
【0186】
したがって、ある実施態様において、本発明に従って使用される抗体のＦｃドメインは、改変されており且つ／又は工学的に操作されている。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈する。ある態様では、改変（変異）型Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、該Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。ある実施態様において、該Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。ある実施態様において、該Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。ある実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。ある実施態様では、該Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、該Ｆｃドメインが天然型ＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超、特に約８０％超、とりわけ約９０％超を示す場合に、達成される。
【0187】
特定の実施態様では、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能が非工学操作型Ｆｃドメインと比較して低下するように工学的に操作されている。
【0188】
特定の実施態様では、該Ｆｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸変異を含む。
【0189】
典型的には、同じ１又は複数のアミノ酸変異が、本発明の抗体のＦｃドメインの２つのサブユニットの各々（及び対応するマスキング部分の一方又は両方のサブユニット）に存在する。但し、本発明の抗原結合受容体の結合をマスクするには、Ｆｃドメイン又はその断片の一方のサブユニット（例：ＣＨ２ドメイン）で十分である（別記の実施例に示すとおり）。
【0190】
ある実施態様では、アミノ酸変異が、Ｆｃ受容体への抗体のＦｃドメインの結合親和性を低下させる。ある実施態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低下させる、１つより多いアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメイン又はその断片の結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又は更には少なくとも５０分の１低下させ得る。ある実施態様において、工学操作型Ｆｃドメインは、非工学操作型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して２０％未満、特に１０％未満、更に詳細には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の実施態様において、該Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、該Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの各受容体に対する結合が低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。ある実施態様では、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわちＦｃドメイン又はその断片の前記受容体への結合親和性の保存は、Ｆｃドメインが非工学操作型ＦｃドメインのＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を呈する場合に達成される。Ｆｃドメインは、そのような親和性の約８０％超、更には約９０％超を呈し得る。特定の実施態様では、本抗体のＦｃドメインは、非工学操作型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有するように工学的に操作されている。エフェクター機能の低下は、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の減少、標的結合抗体の架橋の減少、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１又は複数を含み得る。ある実施態様において、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。ある実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、非工学操作型Ｆｃドメインによって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【0191】
ある実施態様では、該マスキング部分は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片、具体的にはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である。ある実施態様では、該マスキング部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ４ドメインを含む。ある実施態様では、該マスキング部分は、天然型ＩｇＧ１又はＩｇＧ４と比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変を含んでいる。ある実施態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメイン又はその断片の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸改変は、アミノ酸置換である。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある。ある実施態様において、該マスキング部分は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、該マスキング部分は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、該マスキング部分は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような実施態様では、該マスキング部分は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ある実施態様では、該マスキング部分は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、該アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。ある実施態様において、該マスキング部分は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、この更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、該マスキング部分は、Ｐ３２９位、Ｌ２３４位及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様において、該マスキング部分は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。このような実施態様では、該マスキング部分は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片である。アミノ酸置換の上記「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。
【0192】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。したがって、いくつかの実施態様では、該マスキング部分はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である。ある実施態様において、該マスキング部分は、Ｓ２２８位のアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。Ｆｃ受容体へのその結合親和性及び／又はエフェクター機能を更に低下させるために、ある実施態様において、該マスキング部分は、Ｌ２３５位のアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、該マスキング部分は、Ｐ３２９位のアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。特定の実施態様において、該マスキング部分は、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２位のアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号（参照により全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【0193】
特定の実施態様において、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【0194】
特定の実施態様では、Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分のＮグリコシル化は排除されている。このような実施態様では、該マスキング部分はＮ２９７位にアミノ酸変異、特に、アスパラギンをアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）で置き換えるアミノ酸置換を含む。
【0195】
上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を伴うＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７３３２５８１号）など、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２以上に置換を有するＦｃ変異体を含む。
【0196】
ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0197】
変異体Ｆｃドメイン及びその断片は、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いるアミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【0198】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、Ｆｃ受容体は組換え発現により得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代替的に、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【0199】
Ｆｃドメイン又はその断片のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのその他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば動物モデル（Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)に開示されているものなど)において評価されてもよい。
【0200】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように工学的に操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。プロテアーゼ活性化可能Ｔ細胞活性化二重特異性分子がＣ１ｑに結合することができ、それゆえにＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実行されてもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。
【0201】
対応するマスキング部分と同様に（改変型）Ｆｃドメインに結合する適切な抗原結合部分は、本明細書で後述するように調製することができる。
【0202】
プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー
本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能なリンカーを含むものである。適切なプロテアーゼの非存在下では、マスキング部分（すなわちＦｃドメイン又はその断片）は、抗原結合部分をマスクする。すなわち、抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、それゆえに適切なＦｃドメイン又はその断片を含む抗体に結合することはできない。適切なプロテアーゼの存在下では、Ｆｃドメイン又はその断片と抗原結合部分を繋ぐプロテアーゼ切断可能なリンカーが切断され、マスキング部分が抗原結合受容体から外され／離される。切断後、抗原結合部分は、適切なＦｃドメインを含む（治療用）抗体と結合することができる。
本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断可能なリンカーを含むものである。適切なプロテアーゼの非存在下では、マスキング部分（すなわちＦｃドメイン又はその断片）は、抗原結合部分をマスクする。すなわち、抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、それゆえに適切なＦｃドメイン又はその断片を含む抗体に結合することはできない。適切なプロテアーゼの存在下では、Ｆｃドメイン又はその断片と抗原結合部分を繋ぐプロテアーゼ切断可能なリンカーが切断され、マスキング部分が抗原結合受容体から外され／離される。切断後、抗原結合部分は、適切なＦｃドメインを含む（治療用）抗体と結合することができる。
【0203】
したがって、ある実施態様では、（マスキング）Ｆｃドメイン又はその断片は、リンカーを介して抗原結合受容体に共有結合している。ある実施態様では、該リンカーはペプチドリンカーである。ある実施態様では、該リンカーはプロテアーゼ切断可能なリンカーである。
【0204】
ある実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３７、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７又は１６８に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む（プロテアーゼ認識部位を有する）リンカーを含む。好ましい実施態様において、該リンカーは、配列番号１３７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。ある実施態様において、該プロテアーゼ認識部位は、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４又は１５５のポリペプチド配列を含む。好ましい実施態様において、該プロテアーゼ認識部位は、配列番号１５５のポリペプチド配列を含む。
【0205】
ある実施態様において、プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１－２８、並びにＡ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＡＤＡＭ）２、７－１２、１５、１７－２３、２８－３０及び３３；セリンプロテアーゼ（例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ）；システインプロテアーゼ；アスパラギン酸プロテアーゼ；並びにカテプシンプロテアーゼから成る群より選択される。ある特定の実施態様では、プロテアーゼはＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。更なる特定の実施態様において、プロテアーゼはマトリプターゼである。
【0206】
抗原結合部分
（改変型／工学操作型）Ｆｃドメイン又はその断片に特異結合できる抗原結合部分は、例えば、適切な変異を含むＦｃドメイン又はその断片を有する、例えば哺乳類の免疫系の免疫化によって生成することができる。このような方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｂｕｒｎｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９５：１－１２（２００５）に記載されている。代替的には、本発明の抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８５０８（２０１６）に総説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌら、ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）、並びにＺｈａｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説があり、更には、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；並びにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に記載されている。ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換え、その後ＷｉｎｔｅｒらのＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように抗原結合ファージについてスクリーニングを行うことができる。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく高親和性抗原結合部分を提供する。或いは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらがＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載したように、免疫化せずに広範囲の抗原に対する抗原結合部分の単一の供給源を提供することができる。更に、ナイーブライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒがＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載したように、幹細胞から配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変なＣＤＲ３領域をコードする、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで配列変更を達成することによっても合成することが可能である。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載された特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号、第７９８５８４０号、第７７８５９０３号及び第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０２３７７６４号及び２００７／０２９２９３６号、並びに２００９／０００２３６０号がある。コンビナトリアルライブラリーを１又は複数の所望の活性を有する抗原結合部分についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法の更なる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体の提示及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えばＳｃｈｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５１７５（２０１５）、及びＺｈａｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３８４（２０１２）に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓら、ＰＮＡＳ ９４：４９３７４９４２（１９９７）に記載されている。
（改変型／工学操作型）Ｆｃドメイン又はその断片に特異結合できる抗原結合部分は、例えば、適切な変異を含むＦｃドメイン又はその断片を有する、例えば哺乳類の免疫系の免疫化によって生成することができる。このような方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｂｕｒｎｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９５：１－１２（２００５）に記載されている。代替的には、本発明の抗原結合部分は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８５０８（２０１６）に総説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗原結合部分の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌら、ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）、並びにＺｈａｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説があり、更には、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；並びにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）に記載されている。ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換え、その後ＷｉｎｔｅｒらのＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように抗原結合ファージについてスクリーニングを行うことができる。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく高親和性抗原結合部分を提供する。或いは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらがＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載したように、免疫化せずに広範囲の抗原に対する抗原結合部分の単一の供給源を提供することができる。更に、ナイーブライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍとＷｉｎｔｅｒがＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載したように、幹細胞から配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変なＣＤＲ３領域をコードする、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで配列変更を達成することによっても合成することが可能である。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載された特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号、第７９８５８４０号、第７７８５９０３号及び第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、２００７／０１１７１２６号、２００７／０２３７７６４号及び２００７／０２９２９３６号、並びに２００９／０００２３６０号がある。コンビナトリアルライブラリーを１又は複数の所望の活性を有する抗原結合部分についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法の更なる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体の提示及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えばＳｃｈｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５１７５（２０１５）、及びＺｈａｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３８４（２０１２）に総説されている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓら、ＰＮＡＳ ９４：４９３７４９４２（１９９７）に記載されている。
【0207】
概念実証として、本発明の例示的な実施態様において、アミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合受容体が提供される。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体への結合とそれに伴うエフェクター機能を低下させる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異型Ｆｃドメインは、非変異型Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でｃγ受容体に結合する。
【0208】
更なる実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0209】
ある実施態様では、抗原結合部分は、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる。ある実施態様において、該Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ある実施態様において、該ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。ある実施態様では、変異型Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して低下した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を呈する。ある実施態様において、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸変異を含む。
【0210】
好ましい実施態様では、変異型Ｆｃドメインは、Ｐ３２９Ｇ変異を含んでいる。したがって、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異型Ｆｃドメインは、非変異型Ｆｃドメインと比較して低下した又は消失した親和性でｃγ受容体に結合する。
【0211】
ある実施態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含んでいる。ある実施態様において、抗原結合受容体は、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインに特異結合できる。
【0212】
ある実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0213】
ある実施態様では、抗原結合部分は、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0214】
好ましい実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）又はＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0215】
ある特定の実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0216】
別の特定の実施態様では、抗原結合部分は、
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
（ａ）ＲＹＷＭＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＧ（配列番号４０）のＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）のＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
且つ、
（ｄ）ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）のＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号６）のＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0217】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0218】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0219】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0220】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【0221】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【0222】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0223】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0224】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。
【0225】
好ましい実施態様において、抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでいる。
【0226】
ある実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。好ましい実施態様では、抗原結合部分はｓｃＦｖである。
【0227】
ある実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、ＶＨドメインは、特にペプチドリンカーを介して、ＶＬドメインに繋がれている。ある実施態様では、ＶＬドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介して、ＶＨドメインのＮ末端に繋がれている。好ましい実施態様では、ＶＨドメインのＣ末端は、特にペプチドリンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に繋がれている。ある実施態様において、該ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）を含む。
【0228】
ある実施態様では、抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであるｓｃＦｖであり、前記可変ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向にａ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はｂ）ＶＬ－リンカー－ＶＨの構成のいずれかを有する。好ましい実施態様では、該ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの構成を有する。
【0229】
ある実施態様では、抗原結合部分は、配列番号１０、配列番号１２６及び配列番号１２８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0230】
ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【0231】
ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。
【0232】
ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、抗原結合部分は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。
【0233】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分、例えば本明細書に記載のｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ断片は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド橋を導入することによって更に安定化させることが可能である。したがって、ある実施態様において、本発明による抗原結合受容体に含まれるｓｃＦｖ断片（複数可）及び／又はｓｃＦａｂ断片（複数可）は、システイン残基（例：Ｋａｂａｔ番号付けによる、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介する鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化される。ある実施態様では、提供されるのは、アミノ酸のシステインでの少なくとも１つの置換（特に、Ｋａｂａｔ番号付けによる、可変重鎖の４４位及び／又は可変軽鎖の１００位における）を含む、上記のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列のいずれか１つである。
【0234】
アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）
本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、哺乳類プロテアーゼの切断部位を有しないことを特徴としてもよい。本発明の文脈において、プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解できるタンパク質分解酵素のことをいう。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、ＣＤ命名法で特に規定されているような、膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインが本発明の抗原結合受容体を生成するために使用され得る。
本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、哺乳類プロテアーゼの切断部位を有しないことを特徴としてもよい。本発明の文脈において、プロテアーゼとは、プロテアーゼの切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解できるタンパク質分解酵素のことをいう。プロテアーゼという用語には、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が含まれる。本発明の文脈において、ＣＤ命名法で特に規定されているような、膜貫通タンパク質の任意のアンカー膜貫通ドメインが本発明の抗原結合受容体を生成するために使用され得る。
【0235】
したがって、本発明の文脈において、アンカー膜貫通ドメインは、マウス（murine/mouse）の膜貫通ドメインの一部、又は、好ましくはヒトの膜貫通ドメインの一部を含んでいてもよい。このようなアンカー膜貫通ドメインの例としては、例えば、本明細書において配列番号１１に示すようなアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有する、ＣＤ８の膜貫通ドメインがある。本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体のアンカー膜貫通ドメインは、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列（配列番号２４に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含む／から成っていてもよい。
【0236】
別の実施態様において、本明細書で提供される抗原結合受容体は、配列番号６１に示すヒト完全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３～１７９、１５４～１７９、１５５～１７９、１５６～１７９、１５７～１７９、１５８～１７９、１５９～１７９、１６０～１７９、１６１～１７９、１６２～１７９、１６３～１７９、１６４～１７９、１６５～１７９、１６６～１７９、１６７～１７９、１６８～１７９、１６９～１７９、１７０～１７９、１７１～１７９、１７２～１７９、１７３～１７９、１７４～１７９、１７５～１７９、１７６～１７９、１７７～１７９又は１７８から１７９（配列番号６０に示されるｃＤＮＡによってコードされている）に位置するＣＤ２８の膜貫通ドメインを含んでいてもよい。
【0237】
或いは、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカー膜貫通ドメインとして、ＣＤ命名法で特に規定されているような膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質を使用することができる。
【0238】
いくつかの実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ＣＤ２７（配列番号５８によってコードされている配列番号５９）、ＣＤ１３７（配列番号６６によってコードされている配列番号６７）、ＯＸ４０（配列番号７０によってコードされている配列番号７１）、ＩＣＯＳ（配列番号７４によってコードされている配列番号７５）、ＤＡＰ１０（配列番号７８によってコードされている配列番号７９）、ＤＡＰ１２（配列番号８２によってコードされている配列番号８３）、ＣＤ３ｚ（配列番号８７によってコードされている配列番号８６）、ＦＣＧＲ３Ａ（配列番号９１によってコードされている配列番号９０）、ＮＫＧ２Ｄ（配列番号９５によってコードされている配列番号９４）、ＣＤ８（配列番号１２４によってコードされている配列番号１２３）から成る群のいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。
【0239】
ヒト配列は、例えば、アンカー膜貫通ドメイン（の一部）が細胞外空間からアクセス可能であり、したがって患者の免疫系にアクセス可能である可能性があるため、一般的な発明の場合には有益であるかもしれない。好ましい実施態様では、アンカー膜貫通ドメインはヒト配列を含んでいる。そのような実施態様では、アンカー膜貫通ドメインは、抗原結合受容体を当該膜に固定する能力を保持する、ヒトＣＤ２７（配列番号５６によってコードされている配列番号５７）、ヒトＣＤ１３７（配列番号６４によってコードされている配列番号６５）、ヒトＯＸ４０（配列番号６８によってコードされている配列番号６９）、ヒトＩＣＯＳ（配列番号７２によってコードされている配列番号７３）、ヒトＤＡＰ１０（配列番号７６によってコードされている配列番号７７）、ヒトＤＡＰ１２（配列番号８０によってコードされている配列番号８１）、ヒトＣＤ３ｚ（配列番号８５によってコードされている配列番号８４）、ヒトＦＣＧＲ３Ａ（配列番号８９によってコードされている配列番号８８）、ヒトＮＫＧ２Ｄ（配列番号９３によってコードされている配列番号９２）、ヒトＣＤ８（配列番号１２２によってコードされている配列番号１２１）から成る群のいずれか１つの膜貫通ドメイン又はその膜貫通部の断片を含む。
【0240】
刺激性シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）及び共刺激性シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）
好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞の活性化をもたらす刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいる。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又は
ヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２）であり；マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１）である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２）である、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１）であり；マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞の活性化をもたらす刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいる。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）又は
ヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０９６３（バージョン番号１７７、配列番号２）であり；マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２４１６１（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｄ３Ｇ３（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１４３、配列番号１）である）、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０８６３７（バージョン番号１７８、配列番号２）である、又はＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６７１８（バージョン番号１５１、配列番号１）であり；マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ５４７０９（バージョン番号１３２、配列番号２）である）の断片／ポリペプチド部分である刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。
【0241】
したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体に含まれる刺激性シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片／ポリペプチド部分であってもよい。マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）完全長ＣＤ３ｚ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８６（ＣＤ３ｚ）、９０（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９４（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（マウスは、配列番号８７（ＣＤ３ｚ）、９１（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９５（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。ヒト完全長ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示される（ヒトは配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によりコードされている）。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれていれば、刺激性ドメインとしてＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄの断片を含んでいてもよい。特に、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ又はＮＫＧ２Ｄのいずれの部分／断片も、少なくとも１つのシグナル伝達モチーフが含まれていれば、刺激性ドメインとして適している。しかし、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られるポリペプチドを含む。したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体は、本明細書において配列番号８４（ＣＤ３ｚ）、８８（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９２（ＮＫＧ２Ｄ）として示されるアミノ酸配列を含む（ヒトは配列番号８５（ＣＤ３ｚ）、８９（ＦＣＧＲ３Ａ）又は９３（ＮＫＧ２Ｄ）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。好ましい実施態様では、抗原結合受容体に含まれている１又は複数の刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列（配列番号２６に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含むか又はそれから成る。更なる実施態様では、抗原結合受容体は、配列番号１３に示すような配列、又は配列番号１３と比較して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の置換、欠失若しくは挿入を有する配列を含み、刺激性シグナル伝達活性を有することを特徴とする。刺激性シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書では以下及び実施例と図面に示されている。刺激性シグナル伝達活性は、例えば、サイトカイン放出の増強（ＥＬＩＳＡで測定）（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）、増殖活性の増強（細胞数の増加で測定）又は溶解活性の増強（ＬＤＨ放出アッセイで測定）によって決定することができる。
【0242】
更に、本明細書で提供される抗原結合受容体は、好ましくは、Ｔ細胞に更なる活性を提供する少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいる。本明細書で提供される抗原結合受容体は、マウス（murine/mouse）又はヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ１０７４７（バージョン番号１７３、配列番号１であり；マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ３１０４１（バージョン番号１３４、配列番号２）である）、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４５、配列番号１）であり；マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１３９、配列番号１）である）、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２３５１０（バージョン番号１３８、配列番号１）であり；マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４３４８８（バージョン番号１１９、配列番号１）である）、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９Ｙ６Ｗ８（配列番号１、バージョン番号１２６）であり；マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＷＶ４０（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９ＪＬ１７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１０２、配列番号２）である）、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２６８４２（バージョン番号１６０、配列番号２）であり；マウスＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ４１２７２（バージョン番号１３７、配列番号１）である）、４－１－ＢＢ（マウス４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ２０３３４（バージョン番号１４０、配列番号１）であり；ヒト４－１－ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ０７０１１（バージョン番号１４６、配列番号）である）、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＵＢＪ５（バージョン番号２５、配列番号２）であり；マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＱ９ＱＵＪ０（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１０１、配列番号１）である）又はＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ４３９１４（バージョン番号１４６、配列番号１）であり；マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＯ０５４８８５（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ９Ｒ１Ｅ７（引用可能なセカンダリアクセッション番号）、バージョン番号１２３、配列番号１）である）の断片／ポリペプチド部分である共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。本発明の特定の実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、本明細書に記載の１又は複数、すなわち１、２、３、４、５、６又は７つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。したがって、本発明の文脈において、本発明の抗原結合受容体は、第１の共刺激性シグナル伝達ドメインとして、マウス（ｍｕｒｉｎｅ／ｍｏｕｓｅ）ＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分、又は、好ましくはヒトＣＤ１３７の断片／ポリペプチド部分を含んでいてもよく、第２の共刺激性シグナル伝達ドメインは、マウス若しくは好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２又はそれらの断片から成る群より選択される。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源から得られる共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体に含まれている１又は複数の刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含んでいても、それから成っていてもよい。
【0243】
したがって、本明細書で提供される抗原結合受容体に任意選択で含まれる共刺激性シグナル伝達ドメインは、完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。マウス（murine/mouse）完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５９（ＣＤ３ｚ）、６３（ＣＤ２８）、６７（ＣＤ１３７）、７１（ＯＸ４０）、７５（ＩＣＯＳ）、７９（ＤＡＰ１０）又は８３（ＤＡＰ１２）として示される（マウスは、配列番号５８（ＣＤ２７）、６２（ＣＤ２８）、６６（ＣＤ１３７）、７０（ＯＸ４０）、７４（ＩＣＯＳ）、７８（ＤＡＰ１０）又は８２（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。しかし、本発明の文脈ではヒト配列が最も好ましいため、本明細書で提供される抗原結合受容体タンパク質に任意選択で含まれ得る共刺激性シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２の断片／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０又はＤＡＰ１２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号５７（ＣＤ２７）、６１（ＣＤ２８）、６５（ＣＤ１３７）、６９（ＯＸ４０）、７３（ＩＣＯＳ）、７７（ＤＡＰ１０）又は８１（ＤＡＰ１２）として示される（ヒトは配列番号５６（ＣＤ２７）、６０（ＣＤ２８）、６４（ＣＤ１３７）、６８（ＯＸ４０）、７２（ＩＣＯＳ）、７６（ＤＡＰ１０）又は８０（ＤＡＰ１２）に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）。
【0244】
好ましいある実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激性シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８又はその断片を含んでいる。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれていれば、共刺激性シグナル伝達ドメインとしてＣＤ２８の断片を含んでいてもよい。特に、ＣＤ２８のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれている限り、ＣＤ２８のいかなる部分／断片も本発明の抗原結合受容体に好適である。共刺激性シグナル伝達ドメインＰＹＡＰ（ＣＤ２８のＡＡ２０８から２１１）及びＹＭＮＭ（ＣＤ２８のＡＡ１９１から１９４）は、ＣＤ２８ポリペプチドの機能及び上に列挙した機能効果にとって有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は配列番号９６に示されており、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は配列番号９７に示されている。したがって、本発明の抗原結合受容体において、ＣＤ２８ポリペプチドは、好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号９６）及び／又はＰＹＡＰ（配列番号９７）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメイン由来の配列を含んでいる。他の実施態様では、本発明の抗原結合受容体において、これらのドメインの一方又は両方が、それぞれＦＭＮＭ（配列番号９８）及び／又はＡＹＡＡ（配列番号９９）に変異している。これらの変異のいずれも、抗原結合受容体を含む形質導入された細胞の、自身の増殖能力に影響を与えずにサイトカインを放出する能力を低下させ、且つ、有利には、形質導入された細胞の生存を延長させ、ひいてはその治療能力を高めるために使用することができる。すなわち、言い換えれば、このような非機能性変異は、好ましくは、本明細書で提供される抗原結合受容体がｉｎ ｖｉｖｏで形質導入された細胞の持続性を高めるものである。しかし、これらのシグナル伝達モチーフは、本明細書で提供される抗原結合受容体の細胞内ドメイン内のどの部位に存在してもよい。
【0245】
別の好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、共刺激性シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７又はその断片を含んでいる。本明細書で提供される抗原結合受容体は、ＣＤ１３７の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれていれば、共刺激性シグナル伝達ドメインとしてＣＤ１３７の断片を含んでいてもよい。特に、ＣＤ１３７のシグナル伝達モチーフの少なくとも１つが含まれている限り、ＣＤ１３７のいかなる部分／断片も本発明の抗原結合受容体に好適である。好ましい実施態様では、本発明の抗原結合受容体タンパク質に含まれているＣＤ１３７ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（配列番号２５に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を含むか又はそれから成る。
【0246】
共刺激性シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含む抗原結合受容体の具体的な構成は、本明細書では以下及び実施例と図面に示されている。共刺激性シグナル伝達活性は、例えば、サイトカイン放出の増強（ＥＬＩＳＡで測定）（ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）、増殖活性の増強（細胞数の増加で測定）又は溶解活性の増強（ＬＤＨ放出アッセイで測定）によって決定することができる。上述のように、本発明の実施態様において、抗原結合受容体の共刺激性シグナル伝達ドメインは、形質導入されたＴ細胞のような、本明細書に記載の形質導入された細胞のサイトカイン産生、増殖及び溶解活性であると定義されるヒトＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７遺伝子Ｔ細胞活性に由来してもよい。ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７活性は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ又はインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインのＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法による放出、例えばｋｉ６７測定により測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリー法による細胞の定量、又は標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定により評価される溶解活性（例えばThakur et al., Biosens Bioelectron. 35(1) (2012), 503-506; Krutzik et al., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens et al., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296; Ge et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 99(5) (2002), 2983-2988; Duewell et al., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, Erratum in: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161に記載されているように、例えばICELLligence機器を使用）によって測定することができる。
【0247】
更なるリンカー及びシグナルペプチド
更に、本明細書で提供される抗原結合受容体は、（プロテアーゼ切断可能なリンカーに加えて）少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含んでいてもよい。リンカーは通常、２０アミノ酸までの長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有していてもよい。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体は、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性シグナル伝達ドメイン間にリンカーを含んでいてもよい。更に、本明細書で提供される抗原結合受容体は、抗原結合部分に、特に抗原結合部分の免疫グロブリンドメイン間（例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間）にリンカーを含んでいてもよい。このようなリンカーは、抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性シグナル伝達ドメイン）が独立して折り畳まれ、期待通りに挙動する確率を高めるという利点を有する。したがって、本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び刺激性シグナル伝達ドメインは、一本鎖の多機能性ポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、一本鎖融合コンストラクトは、少なくとも１つの抗原結合部分を含む（１又は複数の）細胞外ドメイン、（１又は複数の）アンカー膜貫通ドメイン、（１又は複数の）共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は（１又は複数の）刺激性シグナル伝達ドメインを含む（１又は複数の）ポリペプチドから構成されてもよい。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン、及び刺激性シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の１又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって繋がれていてもよい。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列を含んでいても、それらから成っていてもよい。別の実施態様では、抗原結合部分とアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１９に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列を含んでいるか又はそれらから成る。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性ドメインは、ペプチドリンカーによって、又は代替的に、これらのドメインの直接融合によって、互いに繋がれていてもよい。
更に、本明細書で提供される抗原結合受容体は、（プロテアーゼ切断可能なリンカーに加えて）少なくとも１つのリンカー（又は「スペーサー」）を含んでいてもよい。リンカーは通常、２０アミノ酸までの長さを有するペプチドである。したがって、本発明の文脈において、該リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸の長さを有していてもよい。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体は、変異型Ｆｃドメインに特異結合できる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性シグナル伝達ドメイン間にリンカーを含んでいてもよい。更に、本明細書で提供される抗原結合受容体は、抗原結合部分に、特に抗原結合部分の免疫グロブリンドメイン間（例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間）にリンカーを含んでいてもよい。このようなリンカーは、抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性シグナル伝達ドメイン）が独立して折り畳まれ、期待通りに挙動する確率を高めるという利点を有する。したがって、本発明の文脈において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び刺激性シグナル伝達ドメインは、一本鎖の多機能性ポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、一本鎖融合コンストラクトは、少なくとも１つの抗原結合部分を含む（１又は複数の）細胞外ドメイン、（１又は複数の）アンカー膜貫通ドメイン、（１又は複数の）共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は（１又は複数の）刺激性シグナル伝達ドメインを含む（１又は複数の）ポリペプチドから構成されてもよい。したがって、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン、及び刺激性シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の１又は複数の同一又は異なるペプチドリンカーによって繋がれていてもよい。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１７に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列を含んでいても、それらから成っていてもよい。別の実施態様では、抗原結合部分とアンカー膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号１９に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列を含んでいるか又はそれらから成る。したがって、アンカー膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は刺激性ドメインは、ペプチドリンカーによって、又は代替的に、これらのドメインの直接融合によって、互いに繋がれていてもよい。
【0248】
本発明による好ましい実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、これは、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで繋げた融合タンパク質である。このリンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンを多く含んでおり、溶解度のためにセリン又はスレオニンを多く含んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に繋ぐことができ、その逆も同様である。好ましい実施態様では、該リンカーは、ＶＬドメインのＮ末端とＶＨドメインのＣ末端とを繋ぐ。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、該リンカーは、配列番号１６に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列を有していてもよく、ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。
【0249】
本発明によるいくつかの実施態様では、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドである一本鎖Ｆａｂ断片又はｓｃＦａｂであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次のいずれかの順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬを有しており；ここで前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸の、好ましくは３２から５０アミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合によって安定化されている。
【0250】
本明細書で提供される抗原結合受容体又はその一部は、シグナルペプチドを含んでいてもよい。このようなシグナルペプチドは、タンパク質をＴ細胞膜の表面に持ってくる。例えば、本明細書で提供される抗原結合受容体において、該シグナルペプチドは、配列番号１００に示されるようなアミノ及びアミノ酸配列（配列番号１０１に示されるＤＮＡ配列によってコードされている）を有していてもよい。
【0251】
変異型Ｆｃドメインに特異結合できる、活性化可能な抗原結合受容体
本明細書に記載の抗原結合受容体の構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化抗原結合受容体を生成することができる。
本明細書に記載の抗原結合受容体の構成要素は、様々な構成で互いに融合して、Ｔ細胞活性化抗原結合受容体を生成することができる。
【0252】
いくつかの実施態様では、抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインに繋がれている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）から構成される抗原結合部分とマスキング部分とを含む細胞外ドメインを含む。好ましい実施態様では、該ＶＨドメインは、Ｃ末端で該ＶＬドメインのＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して、融合している。他の実施態様では、該抗原結合受容体は、刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む。
【0253】
特定のそのような実施態様において、抗原結合受容体は、マスキング部分、ＶＨドメインとＶＬドメインから構成される抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、及び任意選択で、１又は複数のペプチドリンカーによって繋がれた刺激性シグナル伝達ドメインから本質的に成り、マスキング部分はＣ末端で抗原結合部分のＮ末端に融合しており、ＶＨドメインはＣ末端でＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインはＣ末端でアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインはＣ末端で刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【0254】
任意選択で、抗原結合受容体は、共刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む。このような特定のある実施態様において、抗原結合受容体は、Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、１又は複数のペプチドリンカーによって繋がれた刺激性シグナル伝達ドメインと共刺激性シグナル伝達ドメインから本質的に成り、マスキング部分はＣ末端でＶＨドメインのＮ末端に融合しており、ＶＨドメインはＣ末端でＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインはＣ末端でアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインはＣ末端で刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、刺激性シグナル伝達ドメインはＣ末端で共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【0255】
代替的な実施態様では、共刺激性シグナル伝達ドメインは、刺激性シグナル伝達ドメインの代わりにアンカー膜貫通ドメインに繋がれている。特定のそのような実施態様において、抗原結合受容体は、Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、１又は複数のペプチドリンカーによって繋がれた刺激性シグナル伝達ドメイン及び共刺激性シグナル伝達ドメインから本質的に成り、マスキング部分はＣ末端でＶＨドメインのＮ末端に融合しており、ＶＨドメインはＣ末端でＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインはＣ末端でアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインはＣ末端で共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、共刺激性シグナル伝達ドメインはＣ末端で刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【0256】
好ましい実施態様では、抗原結合受容体は、（改変型）ＣＨ２ドメインであるマスキング部分、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、アンカー膜貫通ドメイン、１又は複数のペプチドリンカーによって繋がれた共刺激性シグナル伝達ドメイン及び刺激性シグナル伝達ドメインから本質的に成る。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインはＣ末端でＶＨドメインのＮ末端に融合しており、ＶＨドメインはＣ末端でＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインはＣ末端でアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインはＣ末端で刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しており、刺激性シグナル伝達ドメインはＣ末端で共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端にＣ融合している。別の実施態様において、ＣＨ２ドメインはＣ末端でＶＨドメインのＮ末端に融合しており、ＶＨドメインはＣ末端でＶＬドメインのＮ末端に融合しており、ＶＬドメインはＣ末端でアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合しており、アンカー膜貫通ドメインはＣ末端で共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合しおり、共刺激性シグナル伝達ドメインはＣ末端で刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。
【0257】
マスキング部分、抗原結合部分、アンカー膜貫通ドメイン、並びに刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激性シグナル伝達ドメインは、１若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２～２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、又は直接、互いに融合していてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の数である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を繋ぐための好ましいペプチドリンカーは、配列番号１７によるＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。抗原結合部分とアンカー膜貫通部分を繋ぐための別の好ましいペプチドリンカーは、配列番号１９によるＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（ＣＤ８ストーク）である。可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を繋ぐのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１６によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
【0258】
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、抗原結合部分は、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に融合されている場合、追加のペプチドリンカーの有無に関わらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合されてもよい。
【0259】
本明細書に記載のとおり、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。標的細胞抗原に特異結合できる単一の抗原結合部分を有する抗原結合受容体は、特に抗原結合受容体の高発現が必要な場合に有用であり、好ましい。更に、このような場合には、適切な変異を含む単一のＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ４ドメインを含むマスキング部分が好ましい。複数の抗原結合部分及び／又は複数のＣＨドメインが存在すると、抗原結合受容体の発現効率が制限される場合がある。しかしながら、その他の場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分を含む抗原結合受容体を有することは、例えば標的部位への標的化を最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。更にこの他の場合、例えばマスキング効率を最適化するため、又はＣＨ二量体（例：ＣＨ２二量体）に（のみ）結合する抗原結合部分のマスキングを可能にするため、２つのＣＨドメイン（例：２つのＣＨ２ドメイン）を含むマスキング部分を有することが有利であろう。
【0260】
ある特定の実施態様では、マスキング部分と抗原結合部分は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている。ある実施態様では、マスキング部分は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片、具体的にはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である。ある実施態様では、マスキング部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ４ドメイン、好ましくはＣＨ２ドメインを含む。ある実施態様では、ＣＨ２ドメインは、天然型ＣＨ２ドメインと比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいる。ある実施態様において、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｆｃ受容体への結合を低下させ、且つ／又はエフェクター機能を低下させる。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む。ある実施態様では、該少なくとも１つのアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【0261】
ある特定の実施態様では、抗原結合受容体は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含む変異型Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合部分を１つ含む。
【0262】
ある実施態様では、変異型Ｆｃドメインに特異結合できるが、非変異型の親Ｆｃドメインに特異結合できない抗原結合部分がｓｃＦｖである。ある実施態様では、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含むマスキング部分はＣ末端でｓｃＦｖのＮ末端に融合しており、ｓｃＦｖ断片のＣ末端はアンカー膜貫通ドメインのＮ末端に、任意選択でペプチドリンカーを介して、融合されている。ある実施態様において、該ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１９）を含む。ある実施態様では、該アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインから成る群より選択される膜貫通ドメイン又はその断片である。好ましい実施態様において、該アンカー膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である。特定の実施態様において、該アンカー膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むか又はそれから成る。ある実施態様では、該抗原結合受容体は、共刺激性シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を更に含む。ある実施態様では、該抗原結合受容体の該アンカー膜貫通ドメインは、Ｃ末端で共刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。ある実施態様では、該共刺激性シグナル伝達ドメインは、上述のように、ＣＤ２７の、ＣＤ２８の、ＣＤ１３７の、ＯＸ４０の、ＩＣＯＳの、ＤＡＰ１０の、及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択される。好ましい実施態様において、該共刺激性シグナル伝達ドメインはＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片である。好ましいある実施態様では、該共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達を保持するＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片を含む。別の好ましい実施態様では、該共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７シグナル伝達を保持するＣＤ１３７の細胞内ドメイン又はその断片を含む。特定の実施態様において、該共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか又はそれから成る。ある実施態様では、該抗原結合受容体は、刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む。ある実施態様では、該抗原結合受容体の該共刺激性シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で該刺激性シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合している。ある実施態様では、該少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚの、ＦＣＧＲ３Ａの、及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択される。好ましい実施態様では、該共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚシグナル伝達を保持するＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片を含む。特定の実施態様において、該共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか又はそれから成る。
【0263】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、レポータータンパク質に、特にＧＦＰ又はその改良型アナログに、融合している。ある実施態様では、該抗原結合受容体は、Ｃ末端でｅＧＦＰ（改良型緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様において、該ペプチドリンカーは、配列番号１８によるＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。
【0264】
特定の実施態様では、該抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメインと、改変型ＣＨ２ドメインであるマスキング部分を含む細胞外ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含み、該少なくとも１つの抗原結合部分は、変異型ＣＨ２ドメインに特異結合できるが非変異型の親ＣＨ２ドメインには特異結合できないｓｃＦｖであり、ここで変異型ＣＨ２ドメインはＰ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けに従う）を含む。このＰ３２９Ｇ変異は、Ｆｃγ受容体との結合を低下させる。ある実施態様では、本発明の抗原結合受容体は、アンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）、共刺激性シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）及び刺激性シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）を含む。そのような実施態様では、該抗原結合受容体は、ＣＨ２－ｓｃＦｖ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤの構成を有する。別の実施態様では、該抗原結合受容体は、ＣＨ２－ｓｃＦｖ－ＡＴＤ－ＳＳＤ－ＣＳＤの構成を有する。好ましい実施態様では、該抗原結合受容体は、ＣＨ２－ＶＨ－ＶＬ－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤの構成を有する。より具体的なそのような実施態様では、抗原結合受容体は、ＣＨ２－プロリンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＡＴＤ－ＣＳＤ－ＳＳＤの構成を有し、ここで「プロリンカー」はプロテアーゼ切断可能なリンカーである。
【0265】
特定の実施態様では、該抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できるｓｃＦｖであり、ここで該抗原結合部分は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、配列番号６から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
【0266】
別の特定の実施態様では、該抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できるｓｃＦｖであり、ここで該抗原結合部分は、配列番号１、配列番号４０及び配列番号３から成る群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５、配列番号６から成る群より選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含んでいる。
【0267】
好ましい実施態様では、該抗原結合部分は、Ｐ３２９Ｇ変異を含む変異型Ｆｃドメインに特異結合できるｓｃＦｖであり、ここで、該抗原結合部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ Ｈ）１アミノ酸配列ＲＹＷＭＮ（配列番号１）、ＣＤＲ Ｈ２アミノ酸配列ＥＩＴＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＧ（配列番号２）、ＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列ＰＹＤＹＧＡＷＦＡＳ（配列番号３）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ Ｌ）１アミノ酸配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号４）、ＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号５）及びＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号６）を含んでいる。
【0268】
ある実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に以下のものを含んでいる抗原結合受容体を提供する：
（ｉ）マスキング部分、特に配列番号１３０の変異型ＣＨ２、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、任意選択で配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ ３を含むもの、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖ）軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、任意選択で配列番号４の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ ２、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ ３を含むもの、
（ｖｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉｉｉ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｉｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激性シグナル伝達ドメイン。
（ｉ）マスキング部分、特に配列番号１３０の変異型ＣＨ２、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、任意選択で配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ ３を含むもの、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖ）軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、任意選択で配列番号４の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ ２、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ ３を含むもの、
（ｖｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｖｉｉｉ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｉｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激性シグナル伝達ドメイン。
【0269】
ある実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に以下のものを含んでいる抗原結合受容体を提供する：
（ｉ）マスキング部分、特に配列番号１３０の変異型ＣＨ２、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｖ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ ２、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉｉ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｖｉｉ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激性シグナル伝達ドメイン。
（ｉ）マスキング部分、特に配列番号１３０の変異型ＣＨ２、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉｉ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｖ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ ２、配列番号３の重鎖ＣＤＲ ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖｉ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ １、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ ２、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉｉ）アンカー膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアンカー膜貫通ドメイン、
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２の共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｖｉｉ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３の刺激性シグナル伝達ドメイン。
【0270】
ある実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に以下のものを含んでいる抗原結合受容体を提供する：
（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるマスキング部分、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）好ましくはＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である膜貫通ドメイン、
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激性シグナル伝達ドメイン。
（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるマスキング部分、
（ｉｉ）プロテアーゼ切断可能なリンカーであって、特に以下の（ａ）～（ｏ）から成る群より選択されるもの：
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）好ましくはＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）、
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー、
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー、
（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である膜貫通ドメイン、
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激性シグナル伝達ドメイン、並びに
（ｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激性シグナル伝達ドメイン。
【0271】
ある実施態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで順番に以下のものを含んでいる抗原結合受容体を提供する：
（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるマスキング部分；
（ｉｉ）配列番号１５５のプロテアーゼ切断可能なリンカー；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー；
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー；
（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である膜貫通ドメイン；
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激性シグナル伝達ドメイン；並びに
（ｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激性シグナル伝達ドメイン。
（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるマスキング部分；
（ｉｉ）配列番号１５５のプロテアーゼ切断可能なリンカー；
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；
（ｉｖ）ペプチドリンカー、特に配列番号１６のペプチドリンカー；
（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
（ｖｉｉ）ペプチドリンカー、特に配列番号１９のペプチドリンカー；
（ｖｉｉｉ）膜貫通ドメイン、特に配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である膜貫通ドメイン；
（ｉｘ）共刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である共刺激性シグナル伝達ドメイン；並びに
（ｘ）刺激性シグナル伝達ドメイン、特に配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である刺激性シグナル伝達ドメイン。
【0272】
ある実施態様において、提供されるのは、配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体である。ある実施態様において、提供されるのは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体である。
【0273】
ある実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む抗原結合受容体である。ある実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体である。
【0274】
ある実施態様では、該抗原結合受容体は、レポータータンパク質に、特にＧＦＰ又はその改良型アナログに、融合している。ある実施態様では、該抗原結合受容体は、Ｃ末端でｅＧＦＰ（改良型緑色蛍光タンパク質）のＮ末端に、任意選択で本明細書に記載のペプチドリンカーを介して、融合している。好ましい実施態様において、該ペプチドリンカーは、配列番号１８によるＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）である。
【0275】
本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入された細胞
本発明の更なる態様は、本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞である。本明細書に記載の抗原結合受容体とは、天然にはＴ細胞内及び／又はＴ細胞表面上には含まれず、正常な（非形質導入）Ｔ細胞内又は表面上で（内因的に）発現しない分子をいう。このように、Ｔ細胞内及び／又は表面上の本発明の抗原結合受容体は、Ｔ細胞に人工的に導入される。本発明の文脈において、前記Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のように治療対象から単離／取得されてもよい。したがって、人工的に導入され、その後、前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される本明細書に記載の抗原結合受容体は、（Ｉｇ由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインに（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）アクセス可能な１又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含んでいる。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、本明細書で後述されるような（レトロウイルス、レンチウイルス又は非ウイルスの）形質導入の後に、前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本発明によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のＦｃドメインに特定の変異を含む（治療用）抗体によって、標的細胞の存在下で活性化され得る。
本発明の更なる態様は、本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞である。本明細書に記載の抗原結合受容体とは、天然にはＴ細胞内及び／又はＴ細胞表面上には含まれず、正常な（非形質導入）Ｔ細胞内又は表面上で（内因的に）発現しない分子をいう。このように、Ｔ細胞内及び／又は表面上の本発明の抗原結合受容体は、Ｔ細胞に人工的に導入される。本発明の文脈において、前記Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に記載のように治療対象から単離／取得されてもよい。したがって、人工的に導入され、その後、前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される本明細書に記載の抗原結合受容体は、（Ｉｇ由来）免疫グロブリン、好ましくは抗体、特に抗体のＦｃドメインに（ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで）アクセス可能な１又は複数の抗原結合部分を含むドメインを含んでいる。本発明の文脈において、これらの人工的に導入された分子は、本明細書で後述されるような（レトロウイルス、レンチウイルス又は非ウイルスの）形質導入の後に、前記Ｔ細胞内及び／又は表面上に提示される。したがって、形質導入後、本発明によるＴ細胞は、免疫グロブリン、好ましくは本明細書に記載のＦｃドメインに特定の変異を含む（治療用）抗体によって、標的細胞の存在下で活性化され得る。
【0276】
また、本発明は、本発明の抗原結合受容体をコードする１又は複数の核酸分子によってコードされている抗原結合受容体を発現する、形質導入されたＴ細胞に関する。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子、又は本発明の抗原結合受容体を発現する本発明のベクターを含んでいてもよい。
【0277】
本発明の文脈において、用語「形質導入されたＴ細胞」とは、遺伝子改変型Ｔ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）をいう。本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、本発明のベクターを含んでいてもよい。好ましくは、本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子及び／又は本発明のベクターを含む。本発明の形質導入されたＴ細胞は、外来ＤＮＡ（すなわち、Ｔ細胞に導入された核酸分子）を一過性に又は安定的に発現するＴ細胞とすることができる。特に、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子は、レトロウイルス又はレンチウイルス形質導入を用いることにより、Ｔ細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。ｍＲＮＡトランスフェクションを用いることにより、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を一過性に発現させることができる。好ましくは、本明細書で提供される形質導入されたＴ細胞は、ウイルスベクター（例：レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を介してＴ細胞に核酸分子を導入することによって遺伝子改変されたものである。したがって、該抗原結合受容体の発現は恒常的であってもよく、該抗原結合受容体の細胞外ドメインは細胞表面で検出可能であってもよい。抗原結合受容体のこの細胞外ドメインは、本明細書に記載の、抗原結合受容体の完全な細胞外ドメインだけでなく、その一部も含んでよい。抗原結合受容体における抗原結合部分の大きさは、必要最小限の大きさである。
【0278】
この発現はまた、抗原結合受容体が誘導性又は抑制性プロモーターの制御下でＴ細胞に導入される場合、条件的又は誘導性である場合がある。このような誘導性又は抑制性プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターとトランス活性化因子タンパク質ＡｌｃＲとを含む転写系を挙げることができる。ａｌｃＡプロモーターに結合した目的の遺伝子の発現を制御するために、異なるアルコール系の農業用製剤が使用される。更に、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリン存在下で遺伝子発現系を活性化するか又は抑制するかのいずれかの機能を有し得る。これらの系のエレメントとしては、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びＴｅｔＲと単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化配列との融合体であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）などがある。更に、ステロイド応答性プロモーター、金属制御性プロモーター、病原性関連（ＰＲ）タンパク質関連プロモーターを使用することができる。
【0279】
この発現は、使用する系によって、恒常的又は構成的であり得る。本発明の抗原結合受容体は、本明細書で提供される形質導入Ｔ細胞の表面に発現させることができる。抗原結合受容体の細胞外部分（すなわち抗原結合受容体の細胞外ドメイン）は細胞表面で検出可能であり得るが、一方、細胞内部分（すなわち共刺激性シグナル伝達ドメイン（１又は複数）及び刺激性シグナル伝達ドメイン）は細胞表面で検出不可能である。抗原結合受容体の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を用いることによって、又は細胞外ドメインが結合できる変異型Ｆｃドメインによって実施することが可能である。これらの抗体又はＦｃドメインを用いて、フローサイトメトリー又は顕微鏡で細胞外ドメインを検出することができる。
【0280】
他の細胞も、本発明の抗原結合受容体で形質導入することにより、標的細胞に向かわせることができる。これらの更なる細胞には、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、自然リンパ球系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞又は好中球が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、前記免疫細胞はリンパ球であろう。白血球の表面上の本発明の抗原結合受容体がトリガーとなり、その細胞が由来する系統に関係なく変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体と併わせて、標的細胞に対して細胞傷害性が付与される。細胞傷害性は、抗原結合受容体として選択された刺激性シグナル伝達ドメイン又は共刺激性シグナル伝達ドメインに関係なく起こり、追加のサイトカインの外因性供給には依存しない。したがって、本発明の形質導入された細胞は、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ミエロイド細胞又は間葉系幹細胞であってもよい。好ましくは、本明細書で提供される形質導入された細胞はＴ細胞（例：自己Ｔ細胞）であり、より好ましくは、形質導入された細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。更に、本発明の文脈において、形質導入された細胞は自己Ｔ細胞である。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、好ましくは自己ＣＤ８＋Ｔ細胞である。対象から分離した自己細胞（例：Ｔ細胞）の使用に加えて、本発明は、同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明の文脈において、形質導入された細胞は、同種異系ＣＤ８＋ Ｔ細胞などの同種異系細胞であってもよい同種異系という用語は、例えば本明細書に記載の抗原結合受容体発現型の形質導入された細胞によって治療される個体／対象とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する非血縁ドナー個体／対象に由来する細胞を意味する。自己細胞とは、本明細書に記載の形質導入された細胞で治療される対象から上記のように単離／取得された細胞をいう。
【0281】
本発明の形質導入された細胞には、更なる核酸分子を、例えばサイトカインをコードする核酸分子を共形質導入してもよい。
【0282】
本発明はまた、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の製造方法であって、Ｔ細胞に本発明のベクターを形質導入する工程と、前記形質導入された細胞の中又は上での抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で前記形質導入されたＴ細胞を培養する工程と、前記形質導入されたＴ細胞を回収する工程とを含む方法に関する。
【0283】
本発明の文脈において、本発明の形質導入された細胞は、好ましくは、対象（好ましくはヒト患者）から細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）を単離することによって製造される。患者から又はドナーから細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞）を単離／取得する方法は当技術分野において周知であり、患者から又はドナーからの本細胞（例えばＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の文脈では、例えば細胞は採血又は骨髄の除去により単離されてもよい。患者の試料として細胞を単離／取得した後、該細胞（例：Ｔ細胞）を該試料の他の成分から分離する。試料から細胞（例：Ｔ細胞）を分離するいくつかの方法が知られており、限定されないが、例えば、患者又はドナーの末梢血試料から細胞を得るための白血球搬出法、ＦＡＣＳ細胞選別装置を用いることにより細胞を単離／取得する方法などが挙げられる。単離／取得された細胞Ｔ細胞は、その後、例えば、抗ＣＤ３抗体を用いることにより、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いることにより、且つ／又は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を用いることにより培養され、増やされる（例えば、Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342又はDudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239参照）。
【0284】
その後の工程では、細胞（例：Ｔ細胞）は、当技術分野で既知の方法によって人工的／遺伝子的に改変／形質導入される（例えば、Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386を参照）。細胞（例：細胞）に形質導入する方法は当技術分野で知られており、限定されないが、核酸又は組換え核酸を形質導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法又はリポソーム法などが挙げられる。導入する核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えばリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１６６８０２７）を用いることにより、従来通りに高効率で形質導入することができる。ベクターを用いる場合、ベクターがプラスミドベクター（すなわち、ウイルスベクターでないベクター）であれば、上記核酸と同じように形質導入することができる。本発明の文脈において、細胞（例：Ｔ細胞）に形質導入する方法には、レトロウイルス又はレンチウイルスのＴ細胞導入、非ウイルスベクター（例：スリーピングビューティーミニサークルベクター）及びｍＲＮＡトランスフェクションが含まれる。「ｍＲＮＡトランスフェクション」とは、トランスフェクトされる細胞において、本発明の抗原結合受容体のような目的のタンパク質を一過性に発現させる、当業者によく知られた方法をいう。端的に言えば、エレクトロポレーション（例えばＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄなど）を用いて、本発明の抗原結合受容体をコードするｍＲＮＡで細胞をエレクトロポレーションし、その後、上記のような標準細胞（例：Ｔ細胞）培養プロトコルによって培養してもよい（Zhao et al., Mol Ther. 13(1) (2006), 151-159参照）。本発明の形質導入された細胞は、レンチウイルス又は最も好ましくはレトロウイルスの形質導入により作製することができる。
【0285】
この文脈では、細胞に形質導入するための適切なレトロウイルスベクターが当技術分野で知られており、例えば、ＳＡＭＥＮ ＣＭＶ／ＳＲａ（Clay et al., J. Immunol.163 (1999), 507-513）、ＬＺＲＳ－ｉｄ３－ＩＨＲＥＳ（Heemskerkら, J. Exp.Med.186 (1997）, 1597-1602Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602）、ＦｅＬＶ（Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820）、ＳＡＸ（Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567）、ｐＤＯＬ（Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388）、Ｎ２（Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477）、ＬＮＬ６（Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341）、ｐＺｉｐＮＥＯ（Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638）、ＬＡＳＮ（Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129）、ｐＧ１ＸｓＮａ（Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036）、ＬＣＮＸ（Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997）、ＳＦＧ（Gallardo et al., Blood 90 (1997）、及びＬＸＳＮ（Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048）、ＳＦＧ（Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957）、ＨＭＢ－Ｈｂ－Ｈｕ（Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600）、ｐＭＶ７（Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66）、ｐＳＴＩＴＣＨ（Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203）、ｐＬＺＲ（Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132）、ｐＢＡＧ（Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982）、ｒＫａｔ．４３．２６７ｂｎ（Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151）、ｐＬＧＳＮ（Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＭＰ７１（Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168）、ｐＧＣＳＡＭ（Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295）、ｐＭＳＧＶ（Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423）又はｐＭＸ（de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136）である。本発明の文脈において、細胞（例：Ｔ細胞）に形質導入するための好適なレンチウイルスベクターは、例えば、ＰＬ－ＳＩＮレンチウイルスベクター（Hotta et al, Nat Methods.6(5) (2009), 370-376）、ｐ１５６ＲＲＬ－ｓｉｎＰＰＴ－ＣＭＶ－ＧＦＰ－ＰＲＥ／ＮｈｅＩ（Campeau et al., PLoS One 4(8) (2009), e6529）、ｐＣＭＶＲ８．７４（Addgene カタログ番号22036）、ＦＵＧＷ（Lois et al,Science 295(5556) (2002), 868-872）、ｐＬＶＸ－ＥＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅ カタログ番号６４３６８）、ｐＬＶＥ（Brunger et al,Proc Natl Acad Sci U S A 111(9) (2014), E798-806）、ｐＣＤＨ１－ＭＣＳ１－ＥＦ１（Hu et al., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770）、ｐＳＬＩＫ（Wang et al., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356）、ｐＬＪＭ１（Solomon et al., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30）、ｐＬＸ３０２（Kang et al., Sci Signal.6(287) (2013), rs13）、ｐＨＲ－ＩＧ（Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab.33(12) (2013),1875-85）、ｐＲＲＬＳＩＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ カタログ番号６２０５３）、ｐＬＳ（Miyoshi et al., J Virol.72(10) (1998), 8150-8157）、ｐＬＬ３．７（Lazebnik et al., J Biol Chem.283(7) (2008), 11078-82）、ＦＲＩＧ（Raissi et al., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32）、ｐＷＰＴ（Ritz-Laser et al., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821）、ｐＢＯＢ（Marr et al., J Mol Neurosci.22(1-2) (2004), 5-11）又はｐＬＥＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ カタログ番号２７９７６）である。
【0286】
本発明の形質導入された細胞は、好ましくは、自然環境の外で、制御された条件下で育てられる。特に、「培養する（こと）」という用語は、多細胞真核生物（好ましくはヒト患者）由来の細胞（例：本発明の形質導入された細胞）がｉｎ ｖｉｔｒｏで育てられることを意味する。細胞を培養することは、元の組織源から分離された細胞を維持する検査手技である。ここで、本発明の形質導入された細胞は、その中又は上での本発明の抗原結合受容体の発現を可能にする条件下で培養されたものである。この発現又は導入遺伝子（すなわち、本発明の抗原結合受容体のもの）を可能にする条件は、当技術分野において一般に知られており、例えば、アゴニスト抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、並びにサイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）など）の添加が含まれる。培養した形質導入された細胞（例：ＣＤ８＋ Ｔ）に本発明の抗原結合受容体を発現させた後、該形質導入された細胞は培養液から（すなわち培地から）回収される（すなわち再抽出される）。
【0287】
したがって、本発明の方法により得られる本発明の核酸分子によってコードされている抗原結合受容体を発現する、形質導入された細胞、好ましくはＴ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔも、本発明により包含される。
【0288】
核酸分子
本発明の更なる態様は、１又は複数の本発明の抗原結合受容体をコードする核酸又はベクターである。本発明の抗原結合受容体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号１３８に示される。本発明の核酸分子は、調節配列の制御下に置かれていてもよい。例えば、本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が用いられ得る。本発明の文脈において、核酸分子は、恒常的又は誘導的プロモーターの制御下で発現される。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＵＢＣプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＰＧＫ（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＥＦ１Ａプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＳＶ４０プロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＴＲＥプロモーター（Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)）又はＮａｎｏｇプロモーター（Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24）がある。したがって、本発明は、本発明に記載の１又は複数の核酸分子を含む１又は複数のベクターに関するものでもある。ここでのベクターという用語は、それが導入された細胞内で自律的に複製することができる環状又は直鎖状の核酸分子を指す。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者には知られているが、その選択肢は所望の機能によって異なり、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、その他遺伝子工学で一般的に用いられているベクターが含まれる。当業者によく知られている方法を用いて、種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載の技術を参照されたい。或いは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためのリポソームに再構成することができる。詳細は後述するが、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが使用された。特定のポリペプチドの発現が必要な場合、適切な配列を発現ベクターに導入することができる。代表的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８、及びｐＧＢＴ９がある。代表的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
本発明の更なる態様は、１又は複数の本発明の抗原結合受容体をコードする核酸又はベクターである。本発明の抗原結合受容体をコードする例示的な核酸分子は、配列番号１３８に示される。本発明の核酸分子は、調節配列の制御下に置かれていてもよい。例えば、本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にするプロモーター、転写エンハンサー及び／又は配列が用いられ得る。本発明の文脈において、核酸分子は、恒常的又は誘導的プロモーターの制御下で発現される。好適なプロモーターには、例えば、ＣＭＶプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＵＢＣプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＰＧＫ（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＥＦ１Ａプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＡＧＧプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＳＶ４０プロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Qin et al., PLoS One 5(5) (2010), e10611）、ＴＲＥプロモーター（Qin et al., PLoS One. 5(5) (2010), e10611）、Ｏｃｔ３／４プロモーター（Chang et al., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)）又はＮａｎｏｇプロモーター（Wu et al., Cell Res. 15(5) (2005), 317-24）がある。したがって、本発明は、本発明に記載の１又は複数の核酸分子を含む１又は複数のベクターに関するものでもある。ここでのベクターという用語は、それが導入された細胞内で自律的に複製することができる環状又は直鎖状の核酸分子を指す。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者には知られているが、その選択肢は所望の機能によって異なり、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、その他遺伝子工学で一般的に用いられているベクターが含まれる。当業者によく知られている方法を用いて、種々のプラスミド及びベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）に記載の技術を参照されたい。或いは、本発明のポリヌクレオチド及びベクターは、標的細胞への送達のためのリポソームに再構成することができる。詳細は後述するが、個々のＤＮＡ配列を単離するためにクローニングベクターが使用された。特定のポリペプチドの発現が必要な場合、適切な配列を発現ベクターに導入することができる。代表的なクローニングベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８、及びｐＧＢＴ９がある。代表的な発現ベクターとしては、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが挙げられる。
【0289】
本発明はまた、本明細書で定義される抗原結合受容体をコードする１又は複数の核酸分子に作動可能に結合した調節配列である前記１又は複数の核酸分子を含むベクターに関する。本発明の文脈において、該ベクターは多シストロン性とすることができる。このような調節配列（制御エレメント）は当業者に知られており、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、１又は複数のベクターに挿入物を導入するための翻訳及び挿入部位を含むことができる。本発明の文脈において、前記１又は複数の核酸分子は、真核生物細胞又は原核細胞内での発現を可能にする前記発現制御配列に作動可能に結合している。前記１又は複数のベクターが、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする１又は複数の核酸分子を含む１又は複数の発現ベクターであることが想定される。作動可能に結合したとは、そのように記載された構成要素が意図された方法で機能するのを可能する関係にあるような並置を意味する。コード配列に作動可能に結合した制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。制御配列がプロモーターの場合、好ましくは二本鎖核酸が用いられることは、当業者にとって自明である。
【0290】
本発明の文脈において、言及した１又は複数のベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができ、選択された細胞におけるコード配列の発現をもたらすコンストラクトである。１又は複数の発現ベクターは、例えば、１又は複数のクローニングベクター、１又は複数のバイナリーベクター、或いは１又は複数の組込みベクターとすることができる。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。原核生物及び／又は真核細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者によく知られている。調節エレメントは、真核細胞の場合、転写の開始を確実にするプロモーターを通常含み、更に任意選択で転写の終了と転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。原核生物宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの候補は、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含み、真核生物宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター又は哺乳動物細胞及びその他の動物細胞のＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー若しくはグロビンイントロンである。
【0291】
これらの調節エレメントは、転写の開始を担うエレメントの他に、ポリヌクレオチドの下流にＳＶ４０ポリＡ部位又はｔｋポリＡ部位などの転写終結シグナルも含んでいてもよい。更に、使用される発現系によっては、ポリペプチドを細胞区画に誘導する、又は培地に分泌することができるシグナルペプチドをコードするリーダー配列が言及した核酸配列のコード配列に付加されてもよく、該配列は当技術分野でよく知られている。例えば、別添の実施例も参照されたい。
【0292】
１又は複数のリーダー配列は、翻訳配列、開始配列及び終結配列と適切な位相で組み合わされ、好ましくは、翻訳されたタンパク質又はその一部の細胞周辺腔又は細胞外培地への分泌を誘導することができるリーダー配列である。任意選択で、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化又は精製の簡略化を付与するＮ末端識別ペプチドを含む抗原結合受容体をコードすることができる；前掲書参照。この文脈において、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏ（Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの当業者に既知のものである。
【0293】
本発明の文脈において、発現制御配列は、真核細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができるベクター中の真核性プロモーター系に存在するが、原核細胞用の制御配列を使用することもできる。ベクターが適切な細胞に組み込まれると、その細胞は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で、所望のように維持される。追加の調節エレメントには、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。有利には、本発明の上記ベクターは、選択可能及び／又はスコア化可能なマーカーを含んでいる。形質転換細胞や例えば植物組織及び植物の選択に有用な選択可能なマーカー遺伝子は当業者によく知られており、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒの選択の基礎である抗代謝物耐性（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149）、アミノグリコシド系のネオマイシン、カナマイシン、パロマイシンに耐性を与えるｎｐｔ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995）、及びハイグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Marsh, Gene 32 (1984), 481-4855）を含む。更なる選択可能な遺伝子、すなわち、トリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース－６－リン酸イソメラーゼ（国際公開第９４／２０６２７号）、及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）又はブラストサイジンＳに対する耐性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreu）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338）が報告されている。
【0294】
有用なスコア化可能なマーカーも当業者に知られており、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes, FEBS Lett.389 (1996), 44-47）又はβ－グルクロニダーゼ（Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907）をコードする遺伝子である。本実施態様は、特に、言及したベクターを含む細胞、組織、生物体の簡便かつ迅速なスクリーニングに有用である。
【0295】
上記のように、例えば、養子Ｔ細胞療法だけでなく遺伝子治療目的のために、言及した１又は複数の核酸分子を単独で又は１若しくは複数のベクターの一部として使用して、細胞内で本発明の抗原結合受容体を発現させることができる。本明細書に記載の抗原結合受容体のいずれかをコードする１若しくは複数のＤＮＡ配列を含む核酸分子又は１若しくは複数のベクターを細胞に導入し、ひいてはそれが目的のポリペプチドを産生する。遺伝子治療は、ｅｘ ｖｉｖｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法による細胞への治療用遺伝子の導入に基づいており、遺伝子導入の最も重要な応用の一つである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法又は遺伝子送達系に適したベクター、方法又は遺伝子送達系は文献に記載されており、当業者に知られている。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），５３４－５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１－９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２），８０８－８１３；Ｖｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ ３８９（１９９４），２３９；Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６），３７０－３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７－１０８６；Ｏｎｏｄｅｒａ，Ｂｌｏｏｄ ９１（１９９８），３０－３６；Ｖｅｒｍａ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（１９９８），６９２－６９９；Ｎａｂｅｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１（１９９７），２８９－２９２；Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（１９９８），２２４３－５１；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６），７１４－７１６；国際公開第９４／２９４６９号；国際公開第９７／００９５７号；米国特許第５５８０８５９号；米国特許第５５８９４６６号；又はＳｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６），６３５－６４０を参照されたい。言及した１又は複数の核酸分子及びベクターは、細胞内への直接導入用に設計されてもよいし、リポソーム又はウイルスベクター（例：アデノウイルス、レトロウイルス）を介する導入用に設計されてもよい。本発明の文脈において、前記細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、γδＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞などのＴ細胞であり、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0296】
以上により、本発明は、本明細書に記載の抗原結合受容体のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含むベクター、特に遺伝子工学において従来から用いられているプラスミド、コスミド、バクテリオファージを得る方法に関する。本発明の文脈において、前記ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入ベクター若しくは標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターが、言及したポリヌクレオチド又はベクターの標的細胞集団への送達のために使用され得る。
【0297】
当業者に周知の方法を用いて１又は複数の組換えベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ ｃｉｔ．），Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９，ｌｏｃ ｃｉｔ．）又は他の標準的な教科書に記載の技術を参照されたい。或いは、言及した核酸分子及びベクターは、標的細胞への送達のためのリポソームに再構成することができる。本発明の核酸分子を含むベクターを周知の方法によって宿主細胞内に導入することができるが、但しそれは細胞宿主の種類によって異なる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるが、その他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが利用され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ前掲書を参照されたい。言及したベクターは、特に、ｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ又はｐＥＦ－ｎｅｏであってもよい。ベクターｐＥＦ－ＤＨＦＲ、ｐＥＦ－ＡＤＡ及びｐＥＦ－ｎｅｏは、当技術分野において、例えばＭａｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５），７０２１－７０２５及びＲａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５０（２００１），１４１－１５０に記載されている。
【0298】
本発明は、本明細書に記載のベクターを形質導入されたＴ細胞も提供する。前記Ｔ細胞は、上述したベクターの少なくとも１つ又は上述した核酸分子の少なくとも１つをＴ細胞又はその前駆細胞に導入することによって製造することができる。Ｔ細胞における前記少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、変異型Ｆｃドメインに特異結合することができる抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む上記の抗原結合受容体をコードする遺伝子の発現を媒介するものである。本発明のベクターは多シストロン性とすることができる。
【0299】
Ｔ細胞又はその前駆細胞に導入される記載の１又は複数の核酸分子又ベクターは、細胞のゲノムに統合されてもよいし、染色体外に維持されてもよい。
【0300】
標的細胞抗原
上述のように、変異型Ｆｃドメイン、特にアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメインを含む本明細書の抗体の（Ｉｇ由来の）１又は複数のドメインは、標的細胞表面分子、例えば腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対して特異性を有する抗原相互作用部位を含む。本発明の文脈において、そのような抗体は、本発明の抗原結合受容体を含む本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞を標的細胞（例：腫瘍細胞）と物理的に接触させ、該形質導入されたＴ細胞は活性化される。本発明の形質導入されたＴ細胞の活性化は、本明細書に記載のとおり、標的細胞の溶解を優先的にもたらす。
上述のように、変異型Ｆｃドメイン、特にアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメインを含む本明細書の抗体の（Ｉｇ由来の）１又は複数のドメインは、標的細胞表面分子、例えば腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に対して特異性を有する抗原相互作用部位を含む。本発明の文脈において、そのような抗体は、本発明の抗原結合受容体を含む本明細書に記載の形質導入されたＴ細胞を標的細胞（例：腫瘍細胞）と物理的に接触させ、該形質導入されたＴ細胞は活性化される。本発明の形質導入されたＴ細胞の活性化は、本明細書に記載のとおり、標的細胞の溶解を優先的にもたらす。
【0301】
標的（例：腫瘍）細胞の表面に天然に存在する標的細胞抗原（例：腫瘍マーカー）の例を以下に示すが、これらに限定されるものではない：ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチド。
【0302】
したがって、本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体はアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇ（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメイン、すなわち、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子３）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２Ｆｌｔ３、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、Ａ３３抗原、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、及び／又はヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドから成る群より選択される腫瘍細胞の表面に天然に存在する抗原／マーカーに特異結合できる治療用抗体に結合する。
【0303】
Ａ３３抗原、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、がん抗原１２－５（ＣＡ－１２－５）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ－ＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）、ＨＥＲ－１（ヒト上皮増殖因子１）、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子２）、ＨＥＲ－３（ヒト上皮増殖因子３）、ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＭＳＬＮ（メソテリン）、ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＭＵＣ－１（ムチン１）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ｐ９５（ｐ９５ＨＥＲ２）、トランスフェリン受容体、ＴＮＣ（テネイシン）、ヒト栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の（ヒト）メンバーの配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースで入手でき、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／？ｑｕｅｒｙ＝ｒｅｖｉｅｗｅｄ％３Ａｙｅｓから取得することが可能である。これらの（タンパク質）配列は、アノテーション付きの改変配列にも関連している。また、本発明は、本明細書で提供される短い配列の相同配列、また遺伝的対立遺伝子バリアントなどが使用される技術及び方法も提供する。好ましくは、本明細書中の短い配列の該バリアントなどが用いられる。好ましくは、該バリアントは遺伝子バリアントである。当業者は、これらのデータバンクエントリーの中から、これらの（タンパク質）配列の適切なコード化領域を容易に推測することができ、また、これらのデータバンクのエントリーはゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡ／ｃＤＮＡも含んでいる場合がある。（ヒト）ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１２８８４（エントリーバージョン１６８、配列バージョン５）から取得することができる；（ヒト）ＣＥＡ（がん胎児性抗原）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０６７３１（エントリーバージョン１７１、配列バージョン３）から取得することができる；（ヒト）ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１６４２２（エントリーバージョン１１７、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＭＳＬＮ（メソテリン）の１又は複数の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１３４２１（バージョン番号１３２；配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３）の１又は複数の配列は、バージョン番号１６５及び配列バージョン２のＳｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ３６８８８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ１３４１４（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン番号１１８；配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）の１又は複数の配列は、バージョン番号１５３及び配列バージョン３のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１５３２８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ５３ＥＷ２（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）栄養膜細胞表面抗原２（Ｔｒｏｐ－２）の１又は複数の配列は、バージョン番号１７２及び配列バージョン３のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０９７５８（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ１５６５８（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）の１又は複数の配列は、バージョン番号１３４及び配列バージョン１のＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｏ４３６５３（引用可能なプライマリアクセッション番号）又はＱ６ＵＷ９２（セカンダリアクセッション番号）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－１（上皮増殖因子受容体）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ００５３３（エントリーバージョン１７７、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－２（受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ０４６２６（エントリーバージョン１６１、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＨＥＲ－３（受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－３）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２１８６０（エントリーバージョン１４０、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ２０（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１１８３６（エントリーバージョン１１７、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ２２（Ｂリンパ球抗原ＣＤ２２）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０２７３（エントリーバージョン１３５、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＣＤ３３（Ｂリンパ球抗原ＣＤ３３）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２０１３８（エントリーバージョン１２９、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＣＡ－１２－５（ムチン１６）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ８ＷＸＩ７（エントリーバージョン６６、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＨＬＡ－ＤＲの１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ２９９００（エントリーバージョン５９、配列バージョン１）から取得することができる；ヒト）ＭＵＣ－１（ムチン－１）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ１５９４１（エントリーバージョン１３５、配列バージョン３）から取得することができる；（ヒト）Ａ３３（細胞表面Ａ３３抗原）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９９７９５（エントリーバージョン１０４、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）ＰＳＭＡ（グルタメートカルボキシペプチダーゼ２）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ０４６０９（エントリーバージョン１３３、配列バージョン１）から取得することができる；（ヒト）トランスフェリン受容体の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＵＰ５２（エントリーバージョン９９、配列バージョン１）及びＰ０２７８６（エントリーバージョン１５２、配列バージョン２）から取得することができる；（ヒト）ＴＮＣ（テネイシン）の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＰ２４８２１（エントリーバージョン１４１、配列バージョン３）から取得することができる；或いは（ヒト）ＣＡ－ＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）の１又は複数の配列は、Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ１６７９０（エントリーバージョン１１５、配列バージョン２）から取得することができる。
【0304】
好ましい実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される。
【0305】
上記のいずれかの標的細胞抗原に特異結合できる抗体は、哺乳類の免疫系を免疫する方法及び／又は組換えライブラリーを用いるファージディスプレイなど、当技術分野で周知の方法を用いて製造することができる。
【0306】
本発明に従って使用される抗体は、Ｐ３２９Ｇ変異（ＥＵ番号付けによる）を含むＦｃドメインを含んでいる。Ｐ３２９Ｇ変異は、Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させ、結合及び／又はエフェクター機能に影響を与える更なるＦｃ変異と組み合わせて使用され得る。したがって、更なる実施態様では、本発明の抗体の変異型Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して低下した、Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を呈する。このような実施態様において、変異型Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃ変異型ドメインを含む抗体）は、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈する。ある実施態様では、変異型Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃ変異型ドメインを含む抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、該Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。ある実施態様において、該Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。ある実施態様において、該Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。ある実施態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。ある実施態様では、該変異型Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に変化した、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ある実施態様において、変異型Ｆｃドメインを含む抗体は、非工学操作型Ｆｃドメインを含む抗体と比較して２０％未満、特に１０％未満、更に詳細には５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の実施態様において、該Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、該Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、該Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの各受容体への結合が低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。
【0307】
特定の実施態様では、本抗体のＦｃドメインは、非工学操作型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有するように変異している。エフェクター機能の低下は、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の減少、標的結合抗体の架橋の減少、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１又は複数を含み得る。ある実施態様において、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。ある実施態様において、ＡＤＣＣの低下は、非工学操作型Ｆｃドメイン（又は非工学操作型Ｆｃドメインを含む抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【0308】
ある実施態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む。更なる特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４位及び／又はＬ２３５位にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。より具体的な実施態様において、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。更に好ましい実施態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。このような実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。
【0309】
特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位にアミノ酸変異、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）でアスパラギンを置き換えるアミノ酸変異を含む。
【0310】
上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を伴うＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１又は複数の変異を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの変異を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７３３２５８１号）など、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び２９７のうちの２以上に変異を有するＦｃ変異体を含む。
【0311】
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いるアミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含み得る。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【0312】
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、Ｆｃ受容体は組換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【0313】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのその他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば動物モデル（Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)に開示されているものなど）において評価されてもよい。
【0314】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように工学操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本抗体がＣ１ｑに結合することができ、それゆえにＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実行されてもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004）を参照）。
【0315】
キット
本発明の更なる態様は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸及び／又は細胞、好ましくは本発明の抗原結合受容体での形質導入のためのＴ細胞／本発明の抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞、及び任意選択で、変異型Ｆｃドメインを含む１又は複数の抗体を含むキットであり、ここで抗原結合受容体は変異型Ｆｃドメインに特異結合できる。
本発明の更なる態様は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸及び／又は細胞、好ましくは本発明の抗原結合受容体での形質導入のためのＴ細胞／本発明の抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞、及び任意選択で、変異型Ｆｃドメインを含む１又は複数の抗体を含むキットであり、ここで抗原結合受容体は変異型Ｆｃドメインに特異結合できる。
【0316】
したがって、提供されるのは、キットであって、
（Ａ）本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入された細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
（Ａ）本発明の抗原結合受容体を発現することができる形質導入された細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
【0317】
更に提供されるのは、キットであって、
（Ａ）本発明の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド及び／又はベクター；並びに
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
（Ａ）本発明の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド及び／又はベクター；並びに
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキットである。
【0318】
本発明のキットは、形質導入されたＴ細胞、単離ポリヌクレオチド及び／又はベクター、並びにＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む１又は複数の抗体を含んでいてもよい。特定の実施態様では、本抗体は、治療用抗体、例えば、本明細書に記載の腫瘍特異的抗体である。腫瘍特異的抗原は、当技術分野で知られており、本明細書で上に記載されている。本発明の文脈において、本抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。本発明によるキットは、形質導入されたＴ細胞又は形質導入されたＴ細胞を生成するためのポリヌクレオチド／ベクターを含んでいる。この文脈では、該形質導入されたＴ細胞は、所定の腫瘍に特異的ではないが、変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体の使用によって任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。ここで提供されるのは、ＥＵ番号付け（例えば配列番号１０２～１１５）によるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の例であるが、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含むいかなる抗体も本発明に従って使用することができ、ここで提供されるキットに含まれる。
【0319】
特定の実施態様では、変異型Ｆｃ領域を含む抗体は、ＣＤ２０に特異的に結合することができ、配列番号１０２の重鎖配列及び配列番号１０３の軽鎖配列を含む。ある実施態様では、変異型Ｆｃ領域を含む抗体は、ＦＡＰに特異結合でき、配列番号１０４の重鎖配列及び配列番号１０５の軽鎖配列を含む。ある実施態様では、変異型Ｆｃ領域を含む抗体は、ＣＥＡに特異結合でき、配列番号１０６の重鎖配列及び配列番号１０７の軽鎖配列、配列番号１０８の重鎖配列及び配列番号１０９の軽鎖配列、配列番号１１０の重鎖配列及び配列番号１１１の軽鎖配列、又は配列番号１１２の重鎖配列及び配列番号１１３の軽鎖配列を含む。更なる実施態様では、変異型Ｆｃ領域を含む抗体はテネイシン（ＴＮＣ）に特異結合でき、配列番号１１４の重鎖配列及び配列番号１１５の軽鎖配列を含む。
【0320】
本発明のある実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１０２の重鎖及び配列番号１０３の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）。本キットは、ＣＤ２０陽性がんの治療に使用することができる。
【0321】
本発明の別の実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」）を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１０４の重鎖及び配列番号１０５の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。本キットは、ＦＡＰ陽性がんの治療に使用することができる。
【0322】
本発明の別の実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１０６の重鎖及び配列番号１０７の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。或いは、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１０８の重鎖及び配列番号１０９の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。本キットは、ＦＡＰ陽性がんの治療に使用することができる。或いは、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１１０の重鎖及び配列番号１１１の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。別の実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１１２の重鎖及び配列番号１１３の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。これらのキットは、ＣＥＡ陽性がんの治療に使用することができる。
【0323】
本発明の別の実施態様において、提供されるのは、配列番号１３６のアミノ酸配列（「ＣＨ２（Ｐ３２９Ｇ）－ＶＨ３ＶＬ１－ＣＤ８ＡＴＤ－ＣＤ１３７ＣＳＤ－ＣＤ３ｚＳＳＤ」を発現できる形質導入されたＴ細胞を含むキットであり、又は代替的に、該キットは、配列番号１１４の重鎖及び配列番号１１５の軽鎖を含む抗体と組み合わされた、配列番号１３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む（例えば、該キットは、配列番号１３８の配列を含むポリヌクレオチドを含む）キットである。本キットは、ＴＮＣ陽性がんの治療に使用することができる。
【0324】
更に、本発明のキットの部品は、バイアル又はボトルに個別包装されていても、容器又はマルチコンテナユニットにまとめて包装されていてもよい。更に、本発明のキットは、患者細胞、好ましくは本明細書に記載のＴ細胞を本発明の１又は複数の抗原結合受容体で形質導入し、ＧＭＰ（欧州委員会がｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｅｕｄｒａｌｅｘ／ｉｎｄｅｘ＿ｅｎ．ｈｔｍに掲載している優良製造所基準）条件下でインキュベートすることができる細胞培養バッグ（クローズド）システム（(closed) bag cell incubation system）を含んでもよい。更に、本発明のキットは、単離した／入手した患者Ｔ細胞を本発明の抗原結合レセプターで形質導入し、ＧＭＰ下でインキュベートすることができる細胞培養バッグ（クローズド）システムを含んでいる。更に、本発明の文脈において、本キットは、本明細書に記載の１又は複数の抗原結合受容体をコードするベクターを含んでいてもよい。本発明のキットは、特に、本発明の方法を実施するために有利に使用することができ、本明細書で言及する様々な用途、例えば、研究ツール又は医療ツールとして採用することができる。本キットの製造は、好ましくは、当業者に既知の標準的な手順に従う。
【0325】
この文脈において、患者由来の細胞、好ましくはＴ細胞は、上記のようなキットを用いて、本明細書に記載の変異型Ｆｃドメインに特異結合できる本発明の抗原結合受容体で形質導入され得る。変異型Ｆｃドメインに特異結合できる抗原結合部分を含む細胞外ドメインは、Ｔ細胞内又はＴ細胞上では天然には存在しない。したがって、本発明のキットで形質導入された患者由来細胞は、抗体、例えば治療用抗体の変異型Ｆｃドメインに特異結合する能力を獲得し、変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体との相互作用を介して標的細胞の排除／溶解を誘導することができるようになり、治療用抗体は腫瘍細胞の表面上に天然に存在する（内因的に発現する）腫瘍特異的抗原に結合できる。本明細書に記載の抗原結合受容体の細胞外ドメインの結合は、そのＴ細胞を活性化し、変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体を介して腫瘍細胞と物理的に接触させる。非形質導入Ｔ細胞又は内因性Ｔ細胞（例：ＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、変異型Ｆｃドメインを含む治療用抗体の変異型Ｆｃドメインに結合することができない。変異型Ｆｃドメインに特異結合できる細胞外ドメインを含む抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞は、本明細書に記載のＦｃドメインの変異を含まない治療用抗体の影響を受けない状態である。したがって、本発明抗原結合受容体分子を発現するＴ細胞は、本明細書に記載のＦｃドメインの変異を含む抗体の存在下で、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞を溶解する能力を有する。対応する標的細胞は、本明細書に記載の治療用抗体の少なくとも１つ、好ましくは２つの結合ドメインによって認識される表面分子、すなわち腫瘍細胞の表面上に天然に存在する腫瘍特異的抗原を発現する細胞を含む。このような表面分子は、本明細書において以下のように特徴づけられる。
【0326】
標的細胞の溶解は、当技術分野で既知の方法によって検出することができる。したがって、このような方法は、特に生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを含む。このような生理学的アッセイは、例えば細胞膜の完全性の喪失による細胞死をモニターすることができる（例えば、ＦＡＣＳベースのヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出定（photometric enzyme release）アッセイ（ＬＤＨ）、放射性５１Ｃｒ放出（radiometric 51Cr release）アッセイ、蛍光定量ユーロピウム放出（fluorometric Europium release）アッセイ及びカルセインＡＭ放出アッセイ）。更なるアッセイは、例えば、測光ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ－１及びアラマーブルーアッセイ、放射性３Ｈ－Ｔｈｄ取り込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、及びミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイによる細胞生存能力のモニターを含む。更に、アポトーシスは、例えば、ＦＡＣＳベースのホスファチジルセリン露出アッセイ、ＥＬＩＳＡベースのＴＵＮＥＬ試験、カスパーゼ活性アッセイ（測光、蛍光測定又はＥＬＩＳＡベース）によって、又は変化した細胞形態（収縮、膜小疱形成）を分析することによってモニターすることができる。
【0327】
治療用途及び治療の方法
本明細書で提供される分子又はコンストラクト（例：抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞及びキット）は、特にがんの治療のために医療現場で特に有用である。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞上の標的抗原に結合し且つ変異型Ｆｃドメイン（すなわち、ＥＵ番号付けによるＰ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメイン）を含む治療用抗体と併せて、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞で治療することができる。したがって、特定の実施態様において、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又はキットは、がん、特に上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんの治療において使用される。
本明細書で提供される分子又はコンストラクト（例：抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞及びキット）は、特にがんの治療のために医療現場で特に有用である。例えば、腫瘍は、腫瘍細胞上の標的抗原に結合し且つ変異型Ｆｃドメイン（すなわち、ＥＵ番号付けによるＰ３２９Ｇ変異を含むＦｃドメイン）を含む治療用抗体と併せて、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞で治療することができる。したがって、特定の実施態様において、抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又はキットは、がん、特に上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんの治療において使用される。
【0328】
該治療の腫瘍特異性は、標的細胞抗原に結合する治療用抗体によってもたらされ、該抗体は、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。この文脈では、該形質導入されたＴ細胞は、所定の腫瘍に特異的ではないが、本発明に従って使用される治療用抗体の特異性に応じて任意の腫瘍を標的とすることができるため、ユニバーサルＴ細胞である。
【0329】
上記がんは、上皮、内皮又は中皮由来のがん／癌であっても、血液のがんであってもよい。ある実施態様において、上記がん／癌は、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸管がん、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣がん、白血病、リンパ性白血病、上咽頭癌、結腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、皮膚がん（メラノーマ）、尿生殖器管のがん、例えば精巣がん、卵巣がん、内皮がん、子宮頸がん、及び腎臓がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、及び甲状腺のがん、又は血液腫瘍、神経膠腫、肉腫若しくは骨肉腫などの他の腫瘍性疾患から成る群より選択される。
【0330】
例えば、腫瘍性疾患及び／又はリンパ腫は、これらの１又は複数の医療適応症を対象とする特定のコンストラクトで治療することができる。例えば、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異抗原としての）（ヒト）ＥｐＣＡＭに対して向けられる抗体で治療することができる。
【0331】
胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、ＨＥＲ１、好ましくはヒトＨＥＲ１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。更に、胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＭＣＳＰ、好ましくはヒトＭＣＳＰに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＦＯＬＲ１、好ましくはヒトＦＯＬＲ１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、Ｔｒｏｐ－２、好ましくはヒトＴｒｏｐ－２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＰＳＣＡ、好ましくはヒトＰＳＣＡに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、好ましくはヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽細胞腫、及び／又は口腔がんは、ＭＳＬＮ、好ましくはヒトＭＳＬＮに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃がん、乳がん、及び／又は子宮頸がんは、ＨＥＲ２、好ましくはヒトＨＥＲ２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃がん及び／又は肺がんは、ＨＥＲ３、好ましくはヒトＨＥＲ３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。Ｂ細胞リンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫は、ＣＤ２２、好ましくはヒトＣＤ２２に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。骨髄性白血病は、ＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。卵巣がん、肺がん、乳がん、及び／又は胃腸がんは、ＣＡ１２－５、好ましくはヒトＣＡ１２－５に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、白血病、及び／又は上咽頭癌は、ＨＬＡ－ＤＲ、好ましくはヒトＨＬＡ－ＤＲに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、及び／又は膵臓がんは、ＭＵＣ－１、好ましくはヒトＭＵＣ－１に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。結腸がんは、Ａ３３、好ましくはヒトＡ３３に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。前立腺がんは、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。胃腸がん、膵臓がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、及び／又は口腔がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。膵臓がん、肺がん、及び／又は乳がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒト受容体に対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。腎臓がんは、ＣＡ－ＩＸ、好ましくはヒトＣＡ－ＩＸに対して向けられる治療用抗体の投与前、投与と同時又は投与後に投与される本発明の形質導入されたＴ細胞で治療することができる。
【0332】
また、本発明は、疾患、例えば上皮、内皮若しくは中皮由来のがん及び／又は血液のがんなどの悪性疾患の治療方法に関するものでもある。本発明の文脈において、前記対象はヒトである。
【0333】
本発明の文脈において、疾患の治療のための特定の方法は、
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；及び
（ｃ）前記形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；及び
（ｃ）前記形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程
を含む。
【0334】
本発明の文脈において、前記形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び／又は１若しくは複数の治療用抗体は、静脈内注入によって前記対象に共投与される。
【0335】
更に、本発明の文脈において、本発明は、以下の工程を含む疾患の治療方法を提供する：
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；
（ｃ）任意選択で、前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体を共形質導入する工程；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって該Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させる工程；及び
（ｅ）該形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程。
（ａ）対象からＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する工程；
（ｂ）前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程；
（ｃ）任意選択で、前記単離されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体を共形質導入する工程；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって該Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させる工程；及び
（ｅ）該形質導入されたＴ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞を前記対象に投与する工程。
【0336】
上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン２及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などの（刺激性）サイトカインの存在下で実施することも可能である。本発明の文脈において、上述の工程（ｄ）（抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体によるＴＩＬなどのＴ細胞の増殖工程を指す）は、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン７（ＩＬ－７）及び／又はインターロイキン２１（ＩＬ－２１）の存在下でも実施することができる。
【0337】
本発明の治療方法は、更に、本発明に従って使用される抗体の投与を含む。前記抗体は、該形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与することができる。本発明の文脈において、該形質導入されたＴ細胞の投与は、静脈内注入によって行われるであろう。本発明の文脈において、その形質導入されたＴ細胞は、治療対象から単離／取得される。
【0338】
本発明は更に、他の化合物、例えば、免疫エフェクター細胞、細胞増殖又は細胞刺激のための活性化シグナルを提供することができる分子との共投与プロトコルを想定している。前記分子は、例えば、Ｔ細胞の更なる一次活性化シグナル（例えば、更なる共刺激性分子：Ｂ７ファミリーの分子、Ｏｘ４０Ｌ、４．１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ－１）、又は更なるサイトカインインターロイキン（例：ＩＬ－２）であってもよい。
【0339】
また、上記のような本発明の組成物は、任意選択で検出のための手段及び方法を更に含む、診断用組成物であってもよい。
【0340】
組成物
更に、本発明は、１若しくは複数の変異型Ｆｃドメインを有する１若しくは複数の抗体分子、並びに／又は本発明の抗原結合受容体を含む１若しくは複数の形質導入されたＴ細胞、並びに／又は本発明による抗原結合受容体をコードする１若しくは複数の核酸分子及び１若しくは複数のベクターを含む組成物（医薬）を提供する。更に、本発明は、１又は複数の前記組成物を含むキットを提供する。本発明の文脈では、該組成物は、担体、安定剤及び／又は賦形剤である適切な製剤を任意選択で更に含む薬学的組成物である。したがって、本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞及び／又は前記形質導入されたＴ細胞を含む組成物と組み合わせて投与される、本明細書で定義されている変異型Ｆｃドメインを含む抗体分子を含む薬学的組成物（医薬）が提供され、ここで、前記抗体分子は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。
更に、本発明は、１若しくは複数の変異型Ｆｃドメインを有する１若しくは複数の抗体分子、並びに／又は本発明の抗原結合受容体を含む１若しくは複数の形質導入されたＴ細胞、並びに／又は本発明による抗原結合受容体をコードする１若しくは複数の核酸分子及び１若しくは複数のベクターを含む組成物（医薬）を提供する。更に、本発明は、１又は複数の前記組成物を含むキットを提供する。本発明の文脈では、該組成物は、担体、安定剤及び／又は賦形剤である適切な製剤を任意選択で更に含む薬学的組成物である。したがって、本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞及び／又は前記形質導入されたＴ細胞を含む組成物と組み合わせて投与される、本明細書で定義されている変異型Ｆｃドメインを含む抗体分子を含む薬学的組成物（医薬）が提供され、ここで、前記抗体分子は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に投与される。
【0341】
用語「組み合わせて」の使用は、治療レジメンの構成要素が対象に投与される順序を制限するものではない。したがって、本明細書に記載の薬学的組成物／医薬は、本発明の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に、本明細書で定義されているような抗体の投与を包含する。本明細書で使用される「組み合わせて」はまた、上で定義したような抗体と、本明細書で定義されているような抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞の投与のタイミングを制限するものではない。したがって、これら２つの構成要素が同時に／共に投与されない場合、これらの投与は、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間若しくは７２時間、又は当業者によって且つ／若しくは本明細書に記載のように容易に決定される任意の適切な時間、間隔が空いてもよい。
【0342】
本発明の文脈では、「組み合わせて」という用語はまた、本明細書で定義した抗体と、本発明による抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞が、対象への投与前に一緒にプレインキュベートされるという状態も包含する。したがって、これら２つの構成要素を、投与前に、例えば、１分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分若しくは１時間、又は当業者が容易に決定できる任意の適切な時間、プレインキュベートしてもよい。別の好ましい実施態様において、本発明は、本明細書で定義した抗体と、本明細書で定義した抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞とが、同時に／共に投与される治療レジメンに関する。本発明の文脈において、本明細書で定義した抗体は、抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞の投与前に投与されてもよい。
【0343】
更に、本明細書で使用される「組み合わせて」は、開示の治療レジメンを、本明細書で定義した抗体及び本発明の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の連続した順序での投与（すなわち、これら２つの構成要素の一方の投与に続いて（一定の時間間隔で）、間にいかなる他の治療プロトコルの投与及び／又は実施なしで、他方を投与する）に限定しない。したがって、本治療レジメンは、本明細書で定義した抗体分子と、本発明による抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の別々の投与をも包含し、これらの投与は、疾患又はその症状の治療又は予防に必要且つ／又は適した１又は複数の治療プロトコルによって切り離されている。このような介在する治療プロトコルの例としては、鎮痛剤の投与、化学療法剤の投与、疾患又はその症状の外科的処置などが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に開示される治療レジメンは、本明細書で定義した抗体と本明細書で定義した抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞（好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）とを、疾患又はその症状の治療又は予防に適した１つ又は複数の治療プロトコルと一緒に、本明細書に記載のように又は当技術分野で知られているように投与することを含む。
【0344】
特に、前記１又は複数の薬学的組成物／医薬は、点滴又は注射を介して患者に投与されることが想定される。本発明の文脈において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入されたＴ細胞は、点滴又は注射を介して患者に投与されることになる。好適な組成物／医薬の投与は、異なる方法、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与によって行われ得る。
【0345】
本発明の薬学的組成物／医薬は、薬学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。好適な薬学的担体の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などがある。このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投与レジメンは、主治医と臨床的要因によって決定される。医術においてよく知られているように、患者１名に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身状態、並びに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。通常、本薬学的組成物の定期投与としてのレジメンは、１日当たり１μｇ～５ｇ単位の範囲であることが望ましい。しかし、持続的注入のより好ましい投与量は、１時間あたり体重１ｋｇあたり０．０１μｇ～２ｍｇ、好ましくは０．０１μｇ～１ｍｇ、より好ましくは０．０１μｇ～１００μｇ、更に好ましくは０．０１μｇ～５０μｇ、最も好ましくは０．０１μｇｇ～１０μｇ単位の範囲であろう。特に好ましい投与量は、本明細書に後述される。定期的な評価により、進捗をモニターすることができる。投与量は様々だが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投与量は、ＤＮＡ分子のおよそ１０６から１０１２コピーである。
【0346】
本発明の該組成物は局所投与でも全身投与でもよい。通常、投与は非経口（例：静脈内）であり、形質導入されたＴ細胞を、例えばカテーテルで、標的部位に直接、動脈内の部位に投与することもできる。非経口投与のための調製物には、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性の溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。水性の担体としては、生理食塩水及び緩衝培地など、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、補液，及び栄養補給剤、電解質補給剤（例えばブドウ糖リンゲル液ベースのもの）などが挙げられる。防腐剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在してよい。更に、本発明の薬学的組成物は、例えば、血清アルブミン又は免疫グロブリン（好ましくはヒト由来のもの）のような、タンパク質性の担体を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、（本発明に記載の）タンパク質性の抗体コンストラクト若しくはそれをコードする核酸分子若しくはベクター、及び／又は細胞に加えて、薬学的組成物の使用目的に応じて更なる生物学的に活性な薬剤を含むことが想定される。このような薬剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞分裂停止剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）として作用する薬物、高尿酸血症（ｈｙｐｅｒｕｒｉｋｅｍｉａ）を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例：コルチコステロイド）、循環器系に作用する薬物、及び／又は当技術分野で知られているＴ細胞共刺激性分子又はサイトカインなどの薬剤であってもよい。
【0347】
例示的な実施態様
１．細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとを含む抗原結合受容体であって、細胞外ドメインが、
（ａ）Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、
（ｂ）プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び
（ｃ）抗原結合部分
を含み、
抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスクされており、マスキング部分と抗原結合部分はプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている、抗原結合受容体。
１．細胞外ドメインとアンカー膜貫通ドメインとを含む抗原結合受容体であって、細胞外ドメインが、
（ａ）Ｆｃドメイン又はその断片であるマスキング部分、
（ｂ）プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカー、及び
（ｃ）抗原結合部分
を含み、
抗原結合部分はマスキング部分に結合しており、抗原結合部分はマスクされており、マスキング部分と抗原結合部分はプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって繋がれている、抗原結合受容体。
【0348】
２．マスキング部分が、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片、具体的にはＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である、実施態様１に記載の抗原結合受容体。
【0349】
３．マスキング部分が、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＣＨ４ドメインを含む、実施態様１又は２に記載の抗原結合受容体。
【0350】
４．マスキング部分が変異型Ｆｃドメイン又はその断片であり、特に、マスキング部分は、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでいる、実施態様２又は３に記載の抗原結合受容体。
【0351】
５．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｆｃ受容体への結合を低下させ、且つ／又はエフェクター機能を低下させる、実施態様４に記載の抗原結合受容体。
【0352】
６．少なくとも１つのアミノ酸置換が、２３３、２３４、２３５、２３８、２５３、２６５、２６９、２７０、２９７、３１０、３３１、３２７、３２９及び４３５（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から成るリストから選択される位置にある、実施態様４又は５に記載の抗原結合受容体。
【0353】
７．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｐ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）に置換を含む、実施態様４から６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0354】
８．少なくとも１つのアミノ酸置換が、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）から成るリストから選択されるアミノ酸によるＰ３２９位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）の置換を含む、実施態様４から７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0355】
９．少なくとも１つのアミノ酸置換がアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、実施態様４から８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0356】
１０．抗原結合部分が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含んでいる、実施態様１から９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0357】
１１．抗原結合部分がｓｃＦｖである、実施態様１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0358】
１２．マスキング部分がＣＨ２ドメインである、実施態様１から１１のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0359】
１３．抗原結合部分が、非変異型Ｆｃドメイン又はその断片に結合しない、実施態様１から１１のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0360】
１４．プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーが少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、実施態様１から１３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0361】
１５．プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）
から成る群より選択される、実施態様１から１４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４１）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号１４２）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号１４４）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号１４５）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号１４６）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号１４７）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号１４８）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１４９）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１５０）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１５１）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１５２）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１５３）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１５４）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）
から成る群より選択される、実施態様１から１４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0362】
１６．プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーがプロテアーゼ認識配列ＰＭＡＫＫ（配列番号１５５）を含む、実施態様１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0363】
１７．マスキング部分が、Ｃ末端でプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーのＮ末端に繋がれており、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーは、Ｃ末端で抗原結合部分のＮ末端に繋がれている、実施態様１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0364】
１８．抗原結合部分が、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれている、実施態様１から１７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0365】
１９．抗原結合部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれており、且つ／又は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端に繋がれている、実施態様１から１７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0366】
２０．マスキング部分が、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１から１９のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0367】
２１．抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２又は配列番号４０のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに
（ｉｉ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、実施態様１から２０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
（ｉ）配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２又は配列番号４０のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、並びに
（ｉｉ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、実施態様１から２０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0368】
２２．抗原結合部分が、配列番号８、配列番号４１及び配列番号４４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、実施態様１から２１のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0369】
２３．抗原結合部分が、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、実施態様１から２２のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0370】
２４．細胞外ドメインが、配列番号８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、実施態様１から２３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0371】
２５．細胞外ドメインが、配列番号４１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、実施態様１から２３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0372】
２６．細胞外ドメインが、配列番号４４の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と配列番号９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分を含む、実施態様１から２３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0373】
２７．アンカー膜貫通ドメインが、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０若しくはＤＡＰ１２膜貫通ドメインから成る群より選択される膜貫通ドメイン又はその断片であり、特に、アンカー膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメイン又はその断片である、実施態様１から２６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0374】
２８．アンカー膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインであり、特に、アンカー膜貫通ドメインは配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施態様１から２７のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0375】
２９．少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメイン及び／又は少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインを更に含む、実施態様１から２８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0376】
３０．少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインが、刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ３ｚの、ＦＣＧＲ３Ａの、及びＮＫＧ２Ｄの細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択され、特に、少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚ細胞内ドメイン又はその断片である、実施態様２９に記載の抗原結合受容体。
【0377】
３１．少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインが、刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片であり、特に、少なくとも１つの刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施態様２９又は３０に記載の抗原結合受容体。
【0378】
３２．少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達ドメインが、共刺激性シグナル伝達活性を保持する、ＣＤ２７の、ＣＤ２８の、ＣＤ１３７の、ＯＸ４０の、ＩＣＯＳの、ＤＡＰ１０の、及びＤＡＰ１２の細胞内ドメイン又はそれらの断片から成る群より個別に選択される、実施態様２９又は３０に記載の抗原結合受容体。
【0379】
３３．ＣＤ１３７共刺激性活性を保持するＣＤ１３７共刺激性シグナル伝達ドメイン又はその断片を含む抗原結合受容体であって、特に、配列番号１２のアミノ酸配列を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、実施態様２９から３２のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0380】
３４．抗原結合受容体は、ＣＤ２８共刺激性活性を保持するＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメイン又はその断片を含む、実施態様２９から３３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0381】
３５．抗原結合受容体が、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片を含む刺激性シグナル伝達ドメインを含み、且つ、抗原結合受容体は、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ２８の細胞内ドメイン又はその断片を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、実施態様１から３４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0382】
３６．刺激性シグナル伝達ドメインが配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施態様３５に記載の抗原結合受容体。
【0383】
３７．抗原結合受容体が、ＣＤ３ｚ刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ３ｚの細胞内ドメイン又はその断片を含む刺激性シグナル伝達ドメインを１つ含み、且つ、抗原結合受容体は、ＣＤ１３７共刺激性シグナル伝達活性を保持するＣＤ１３７の細胞内ドメイン又はその断片を含む共刺激性シグナル伝達ドメインを１つ含む、実施態様１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0384】
３８．刺激性シグナル伝達ドメインが配列番号１３のアミノ酸配列を含み、共刺激性シグナル伝達ドメインが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施態様３７に記載の抗原結合受容体。
【0385】
３９．抗原結合部分が、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、アンカー膜貫通ドメインのＮ末端に繋がれている、実施態様１から３８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0386】
４０．ペプチドリンカーが配列番号１９のアミノ酸配列を含む、実施態様３９に記載の抗原結合受容体。
【0387】
４１．アンカー膜貫通ドメインが、任意選択でペプチドリンカーを介して、共シグナル伝達ドメイン又は刺激性シグナル伝達ドメインに繋がれている、実施態様２９から４０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0388】
４２．シグナル伝達ドメイン同士及び／又は共シグナル伝達ドメイン同士が、任意選択で少なくとも１つのペプチドリンカーを介して、繋がれている、実施態様２９から４１のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0389】
４３．ＶＬドメインが、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、アンカー膜貫通部のＮ末端に繋がれている、実施態様１０から４２のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0390】
４４．ＶＨドメインが、Ｃ末端で、任意選択でペプチドリンカーを介して、ＶＬドメインのＮ末端に繋がれている、実施態様１０から４３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0391】
４５．抗原結合受容体が共シグナル伝達ドメインを１つ含み、共シグナル伝達ドメインが、Ｎ末端で、アンカー膜貫通ドメインのＣ末端に繋がれている、実施態様２９から４４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0392】
４６．抗原結合受容体が、刺激性シグナル伝達ドメイン１つを更に含み、刺激性シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端で、共刺激性シグナル伝達ドメインのＣ末端に繋がれている、実施態様４５に記載の抗原結合受容体。
【0393】
４７．抗原結合部分が、配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１から４６のいずれか一項に記載の抗原結合受容体。
【0394】
４８．配列番号１３６のアミノ酸配列を含む抗原結合受容体。
【0395】
４９．実施態様１から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【0396】
５０．実施態様４９に記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド。
【0397】
５１．実施態様４９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
【0398】
５２．実施態様４９に記載のポリヌクレオチド又は実施態様５１に記載のベクターを含む、形質導入されたＴ細胞。
【0399】
５３．実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞。
【0400】
５４．キットであって、
（Ａ）実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
（Ａ）実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる、形質導入されたＴ細胞；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
【0401】
５５．キットであって
（Ａ）実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
（Ａ）実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体をコードする単離ポリヌクレオチド；及び
（Ｂ）標的細胞抗原に結合する抗体であって、ＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体
を含むキット。
【0402】
５６．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、実施態様５４又は５５に記載のキット。
【0403】
５７．標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される、実施態様５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
【0404】
５８．医薬としての使用のための、実施態様５４から５７のいずれか一項に記載のキット。
【0405】
５９．抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞が、標的細胞抗原に、特にがん細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与される、医薬としての使用のための、実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体又は実施態様５２又は５３に記載の形質導入されたＴ細胞。
【0406】
６０．疾患の治療における使用のため、特にがんの治療における使用のための、実施態様５４から５８のいずれか一項に記載のキット。
【0407】
６１．治療が、抗原結合受容体を発現する形質導入されたＴ細胞を、がん細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の投与の前、それと同時又はその後に投与することを含む、がんの治療における使用のための実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体又は実施態様５２若しくは５３に記載の形質導入されたＴ細胞。
【0408】
６２．前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、実施態様５２又は５３に記載の抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又は使用のためのキット。
【0409】
６３．がん細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される、実施態様６１又は６２に記載の抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又は使用のためのキット。
【0410】
６４．形質導入されたＴ細胞が、治療される対象から単離された細胞に由来する、実施態様６１から６３のいずれか一項に記載の抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又は使用のためのキット。
【0411】
６５．形質導入されたＴ細胞が、治療される対象から単離された細胞に由来しない、実施態様６１から６４のいずれか一項に記載の抗原結合受容体、形質導入されたＴ細胞又は使用のためのキット。
【0412】
６６．対象における疾患を治療する方法であって、実施態様９から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞を対象に投与することと、標的細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の治療的有効量を、形質導入されたＴ細胞の投与の前、投与と同時又は投与の後に投与することとを含む方法。
【0413】
６７．対象からＴ細胞を単離することと、該単離Ｔ細胞に実施態様４９に記載のポリヌクレオチド又は実施態様５１に記載のベクターを形質導入することによって形質導入されたＴ細胞を生成することを追加的に含む、実施態様６６に記載の方法。
【0414】
６８．Ｔ細胞が、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターコンストラクト、又は非ウイルスベクターコンストラクトで形質導入される、実施態様６７に記載の方法。
【0415】
６９．形質導入されたＴ細胞が、静脈内注入によって対象に投与される、実施態様６６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【0416】
７０．形質導入されたＴ細胞を、対象への投与の前に、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させる、実施態様６６から６９のいずれか一項に記載の方法。
【0417】
７１．形質導入されたＴ細胞を、対象への投与前に少なくとも１つのサイトカインと接触させ、好ましくはインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及び／若しくはインターロイキン－２１又はこれらのバリアントと接触させる、実施態様６６から７０のいずれか一項に記載の方法。
【0418】
７２．疾患ががんである、実施態様６６から７１のいずれか一項に記載の方法。
【0419】
７３．がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、実施態様７２に記載の方法。
【0420】
７４．標的細胞の溶解を誘導する方法であって、標的細胞抗原に結合し且つＥＵ番号付けによるアミノ酸変異Ｐ３２９Ｇを含むＦｃドメインを含む抗体の存在下で、標的細胞を、実施態様９から５０のいずれか一項に記載の抗原結合受容体を発現することができる形質導入されたＴ細胞と接触させることを含む、方法。
【0421】
７５．標的細胞ががん細胞である、実施態様７４に記載の方法。
【0422】
７６．標的細胞は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＤ２０、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）及びテネイシン（ＴＮＣ）から成る群より選択される抗原を発現する、実施態様７４又は７５に記載の方法。
【0423】
７７．医薬の製造のための、実施態様１から４８のいずれか一項に記載の抗原結合受容体、実施態様４９に記載のポリヌクレオチド又は実施態様５２若しくは５３に記載の形質導入されたＴ細胞の使用。
【0424】
７８．医薬ががんの治療のためのものである、実施態様７７の使用。
【0425】
７９．前記がんが、上皮、内皮又は中皮由来のがん及び血液のがんから選択される、実施態様７８に記載の使用。
【0426】
８０．上に記載された発明。
【0427】
これら及びその他の実施態様は、本発明の説明及び実施例によって開示され、包含される。本発明に従って採用される抗体、方法、使用及び化合物のいずれか１つに関する更なる文献は、例えば電子機器を使用して公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌから、例えばインターネット上で公開されている公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。更なるデータベース及びアドレス、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／などが当業者に知られており、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍからアクセス可能である。
【0428】
例示的な配列
【0429】
【0430】
【0431】
【0432】
【0433】
【0434】
【0435】
【0436】
【0437】
【0438】
【0439】
【0440】
【0441】
【0442】
【実施例】
【0443】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【0444】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に記載されている。
標準的な方法を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に記載されている。
【0445】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【0446】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ、レーゲンズブルク）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を使用して設計された。
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ、レーゲンズブルク）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を使用して設計された。
【0447】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を、予熱したＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製、カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。発現ベクターをＣＤ ＣＨＯ培地中で混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号２３９６６－１）を加え、その溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍｌ）を、ベクター／ＰＥＩ溶液と混合してフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気で振盪インキュベーター中３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、補充液（総量の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（W. Zhou and A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9; 2014）。トランスフェクションの翌日、補充液（Ｆｅｅｄ、総量の１２％）を添加した。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を、予熱したＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製、カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。発現ベクターをＣＤ ＣＨＯ培地中で混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号２３９６６－１）を加え、その溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍｌ）を、ベクター／ＰＥＩ溶液と混合してフラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気で振盪インキュベーター中３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、補充液（総量の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（W. Zhou and A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI: 10.1007/978-3-642-54050-9; 2014）。トランスフェクションの翌日、補充液（Ｆｅｅｄ、総量の１２％）を添加した。７日後、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、以下に示す標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【0448】
ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＩｇＧ様タンパク質の製造
代替的には、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。作製にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
代替的には、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。作製にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
【0449】
ＩｇＧ様タンパク質の精製
標準的なプロトコルを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。端的に言えば、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって、細胞培養上清から精製した。ｐＨ３．０で溶出した後、直ちに試料のｐＨを中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
標準的なプロトコルを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。端的に言えば、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって、細胞培養上清から精製した。ｐＨ３．０で溶出した後、直ちに試料のｐＨを中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
【0450】
ＩｇＧ様タンパク質の分析
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３によるアミノ酸配列に基づき計算した質量消散係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（パーキンエルマー）（パーキンエルマー）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含量の測定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーで実施した。
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３によるアミノ酸配列に基づき計算した質量消散係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（パーキンエルマー）（パーキンエルマー）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含量の測定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーで実施した。
【0451】
レンチウイルス上清の調製とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞への形質導入
リポフェクタミンＬＴＸＴＭベースのトランスフェクションを、約８０％コンフルエントのＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）と、ＣＡＲをコードするトランスファーベクターと、パッケージングベクターｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ及びｐｓＰＡＸ２とを２：２：１のモル比で使用して実施した（Giry-Laterriere M, et al Methods Mol Biol. 2011;737:183-209, Myburgh R, et al Mol Ther Nucleic Acids. 20144）。６６時間後、上清を回収し、３５０×ｇで５分間遠心分離した後、０．４５μｍのポリエーテルスルホンフィルターで濾過し、ウイルス粒子を採取及び精製した。ウイルス粒子は、そのまま使用するか、又は濃縮して（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｔａｋａｒａ）、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞のスピンフェクション（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１、９００×ｇ、２時間、３１℃）に使用した。
リポフェクタミンＬＴＸＴＭベースのトランスフェクションを、約８０％コンフルエントのＨｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１６）と、ＣＡＲをコードするトランスファーベクターと、パッケージングベクターｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ及びｐｓＰＡＸ２とを２：２：１のモル比で使用して実施した（Giry-Laterriere M, et al Methods Mol Biol. 2011;737:183-209, Myburgh R, et al Mol Ther Nucleic Acids. 20144）。６６時間後、上清を回収し、３５０×ｇで５分間遠心分離した後、０．４５μｍのポリエーテルスルホンフィルターで濾過し、ウイルス粒子を採取及び精製した。ウイルス粒子は、そのまま使用するか、又は濃縮して（Ｌｅｎｔｉ－ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｔａｋａｒａ）、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞のスピンフェクション（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１、９００×ｇ、２時間、３１℃）に使用した。
【0452】
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイは、ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のＴ細胞活性化を測定するものである。この不死化Ｔ細胞株は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように遺伝子操作されている。更に、該細胞株は、ＣＤ３ｚシグナル伝達メインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを発現する。ＣＡＲと固定化されたアダプター分子（腫瘍抗原結合アダプター分子など）との結合により、ＣＡＲの架橋が起こり、Ｔ細胞活性化とルシフェラーゼの発現に至る。基質の添加後、ＮＦＡＴ活性の細胞内変化を相対光単位として測定することができる（Darowski et al. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 32, Issue 5, May 2019,207-218頁, ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｚ０２７）。概して、このアッセイは３８４プレート（ファルコン ＃３５３９６３ 白、透明底）で行われた。標的細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞）とエフェクター細胞を１：５の比率（標的細胞２０００個、エフェクター細胞１００００個）で１０μｌずつ、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に３連で播種した。増殖培地で更に、目的の抗体の段階希釈液を、アッセイプレートで最終濃度が６７ｎＭから０．００００６７ｎＭ、最終体積が１ウェルあたり合計３０μｌとなるように調製した。３８４ウェルプレートを３００ｇ、室温で１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で、湿度雰囲気中インキュベートした。７時間のインキュベーション後、最終体積の２０％のＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｅ６１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを３５０×ｇで１分間遠心分離した。その後、Ｔｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダーを用いて、秒／ウェルあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）を直ちに測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン７を用いて、濃度反応曲線をフィッティングさせ、ＥＣ５０値を算出した。ｐ値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７に記載されているＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅスタイルを使用した。＊はＰ≦０，０３３；＊＊はＰ≦０，００２；＊＊＊はＰ≦０，００１を意味する。
Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイは、ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）のＴ細胞活性化を測定するものである。この不死化Ｔ細胞株は、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するように遺伝子操作されている。更に、該細胞株は、ＣＤ３ｚシグナル伝達メインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを発現する。ＣＡＲと固定化されたアダプター分子（腫瘍抗原結合アダプター分子など）との結合により、ＣＡＲの架橋が起こり、Ｔ細胞活性化とルシフェラーゼの発現に至る。基質の添加後、ＮＦＡＴ活性の細胞内変化を相対光単位として測定することができる（Darowski et al. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 32, Issue 5, May 2019,207-218頁, ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｚ０２７）。概して、このアッセイは３８４プレート（ファルコン ＃３５３９６３ 白、透明底）で行われた。標的細胞（ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞）とエフェクター細胞を１：５の比率（標的細胞２０００個、エフェクター細胞１００００個）で１０μｌずつ、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（増殖培地）に３連で播種した。増殖培地で更に、目的の抗体の段階希釈液を、アッセイプレートで最終濃度が６７ｎＭから０．００００６７ｎＭ、最終体積が１ウェルあたり合計３０μｌとなるように調製した。３８４ウェルプレートを３００ｇ、室温で１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で、湿度雰囲気中インキュベートした。７時間のインキュベーション後、最終体積の２０％のＯＮＥ－ＧｌｏＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｅ６１２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを３５０×ｇで１分間遠心分離した。その後、Ｔｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダーを用いて、秒／ウェルあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）を直ちに測定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン７を用いて、濃度反応曲線をフィッティングさせ、ＥＣ５０値を算出した。ｐ値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７に記載されているＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅスタイルを使用した。＊はＰ≦０，０３３；＊＊はＰ≦０，００２；＊＊＊はＰ≦０，００１を意味する。
【0453】
実施例１
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体の作製及び特性評価
親抗Ｐ３２９Ｇ抗体及びヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体をＨＥＫ細胞内に作製し、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。全ての抗体は、高品質で精製された（表２）。
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体の作製及び特性評価
親抗Ｐ３２９Ｇ抗体及びヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗体をＨＥＫ細胞内に作製し、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。全ての抗体は、高品質で精製された（表２）。
【0454】
【0455】
抗Ｐ３２９Ｇバインダー Ｍ－１．７．２４の親型及び６種類のヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
器具類：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００
チップ：ＣＭ５（＃７７２）
Ｆｃ１～４：抗ヒトＦａｂ特異的（ＧＥヘルスケア ２８－９５８３－２５）
捕捉：５０ｎＭ ＩｇＧ、６０秒
アナライト：ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）（Ｐ１ＡＤ９０００－００４）
ランニングバッファー：ＨＢＳ－ＥＰ
Ｔ°：２５℃
希釈：ＨＢＳ－ＥＰで２倍希釈 ０．５９～３７．５ｎＭ
フロー：３０μｌ／分
会合：２４０秒
解離：８００秒
再生：１０ｍＭ グリシン ｐＨ２．１ ２ｘ６０秒
器具類：Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００
チップ：ＣＭ５（＃７７２）
Ｆｃ１～４：抗ヒトＦａｂ特異的（ＧＥヘルスケア ２８－９５８３－２５）
捕捉：５０ｎＭ ＩｇＧ、６０秒
アナライト：ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）（Ｐ１ＡＤ９０００－００４）
ランニングバッファー：ＨＢＳ－ＥＰ
Ｔ°：２５℃
希釈：ＨＢＳ－ＥＰで２倍希釈 ０．５９～３７．５ｎＭ
フロー：３０μｌ／分
会合：２４０秒
解離：８００秒
再生：１０ｍＭ グリシン ｐＨ２．１ ２ｘ６０秒
【0456】
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニングバッファーとして（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥヘルスケア））を使用して実施された。抗ヒトＦａｂ特異抗体（ＧＥヘルスケア ２８－９５８３－２５）は、ＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）上にアミンカップリングにより直接固定化された。ＩｇＧを、５０ｎＭで６０秒間捕捉した。ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）の２倍希釈系列を、３０μｌ／分で２４０秒間リガンド上を通過させ、会合相を記録した。解離相を、８００秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へと切り替えることによってトリガーした。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１の６０秒の注入を２回行うことにより、各サイクル後に再生された。バルク屈折率差を、参照フローセル１で得られた応答を差し引くことによって補正した。親和定数を、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥヘルスケア）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングによって速度定数から導出した。測定は、独立した希釈系列でトリプリケートで行われた。
【0457】
以下の試料について、ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）との結合を解析した（表３）。
【0458】
【0459】
ヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）は、ヒトＩｇＧ１のプラスミン消化と、続いてＰｒｏｔｅｉｎＡによるアフィニティー精製及びサイズ排除クロマトグラフィーによって調製された。
【0460】
抗Ｐ３２９Ｇバインダー Ｍ－１．７．２４の親型及び６種類のヒト化バリアントのヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合
解離相を１本の曲線に当てはめ、オフレートを特徴づけるのに役立てた。結合と捕捉反応レベルの比率を算出した。（表４）
解離相を１本の曲線に当てはめ、オフレートを特徴づけるのに役立てた。結合と捕捉反応レベルの比率を算出した。（表４）
【0461】
【0462】
抗Ｐ３２９Ｇ結合剤Ｍ－１．７．２４の親型及び３種類のヒト化変異体のヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）に対する親和性
親と同様の結合パターンを持つ３種類のヒト化バリアントを、より詳細に評価した。１：１のラングミュア結合の速度定数を表５にまとめた。
親と同様の結合パターンを持つ３種類のヒト化バリアントを、より詳細に評価した。１：１のラングミュア結合の速度定数を表５にまとめた。
【0463】
【0464】
結論
６種類のヒト化バリアントを作製した。そのうちの３種類（ＶＨ４ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３）が、親Ｍ－１．７．２４と比較して低下したヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合を示した。他の３種類のヒト化バリアント（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、親バインダーと非常に似た結合反応速度を示し、ヒト化によって親和性が失われることはなかった。
６種類のヒト化バリアントを作製した。そのうちの３種類（ＶＨ４ＶＬ１、ＶＨ１ＶＬ２、ＶＨ１ＶＬ３）が、親Ｍ－１．７．２４と比較して低下したヒトＦｃ（Ｐ３２９Ｇ）への結合を示した。他の３種類のヒト化バリアント（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、親バインダーと非常に似た結合反応速度を示し、ヒト化によって親和性が失われることはなかった。
【0465】
実施例２
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の調製
ヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントの機能性を評価するために、Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ変異に特異的なバインダーをコードする重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の異なる可変ドメインＤＮＡ配列を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合部分としてクローニングし、第二世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインとして使用した。
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の調製
ヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントの機能性を評価するために、Ｐ３２９Ｇ Ｆｃ変異に特異的なバインダーをコードする重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の異なる可変ドメインＤＮＡ配列を一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）結合部分としてクローニングし、第二世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインとして使用した。
【0466】
Ｐ３２９Ｇバインダーの異なるヒト化バリアントは、Ｉｇ重鎖可変メインドメイン（ＶＬ）とＩｇ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでいる。ＶＨとＶＬは（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して繋がれている。ｓｃＦｖ抗原結合ドメインは、細胞内共刺激性シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）ＣＤ１３７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１ＡＡ ２１４－２５５）に融合しており、ひいては刺激性シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）ＣＤ３ζ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２０９６３ ＡＡ ５２－１６４）に融合しているアンカー膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）ＣＤ８ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１７３２［１８３－２０３］）に融合した。抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲのｓｃＦｖは、ＶＨｘＶＬ（図１Ａ）又はＶＬｘＶＨ（図１Ｂ）の２つの異なる配向で構築された。例示的な発現コンストラクト（ＧＦＰレポーターを含む）の図形表現を、ＶＨＶＬ構成については図１Ｃに、ＶＬＶＨ構成については図１Ｄに示す。
【0467】
実施例３
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞における抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）細胞へウイルス形質導入した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞における抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の発現
異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体をＪｕｒｋａｔ（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）細胞へウイルス形質導入した。
【0468】
抗Ｐ３２９Ｇ抗原結受容体の発現をフローサイトメトリーで評価した。異なるヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体を使用したＪｕｒｋａｔ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄後、９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり５０．０００細胞で播種した。ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む異なる濃度（５００ｎＭ～０ｎＭ １：５の段階希釈）の抗体を用いて暗所冷蔵庫（４～８℃）内で４５分間染色した後、試料をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、１０％０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８及び０．５ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含有するＰＢＳ））で３回洗浄した。その後、試料を２．５μｇ／ｍＬポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的且つＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ （ａｂ’）２ヤギ断片抗体で３０分間、暗所冷蔵庫内で染色し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＢＤ）で分析した。更に、抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体は、細胞内ＧＦＰレポーターを含んでいた（図１Ｃ参照）。
【0469】
Ｐ３２９Ｇバインダーのヒト化型（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）と比較して、オリジナルの非ヒト化バインダーは細胞表面で弱いＣＡＲ標識化を示すが（図２Ａ）、ＧＦＰ発現量は同等である。興味深いことに、ＶＬ１ＶＨ１コンストラクト（図１Ｄ参照）は細胞表面で高いＧＦＰ発現量を示すが、弱いＣＡＲ標識化も示し、これはバインダーの好ましくないコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）であることを示している。
【0470】
全体として、予想外に、ＶＨ３ＶＬ１バージョンは、最も高いＧＦＰ発現とＣＡＲ表面発現を示す。更に、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の試験された全てのコンストラクト（ＶＨ１ＶＬ１、ＶＨ２ＶＬ１、ＶＨ３ＶＬ１）は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に形質導入すると、元の非ヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体、更には興味深いことにＶＬＶＨコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）のコンストラクト（ＶＬ１ＶＨ３）と比較して、増強されたＧＦＰシグナルを示す。
【0471】
結論として、ＶＨＶＬコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）は、抗原結合受容体の発現レベル及び細胞表面への正確な標的化に有利であると思われる。
【0472】
更に、ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の選択性、特異性及び安全性を特徴づけるために、様々な試験を実施した。
【0473】
実施例４
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的抗体の存在下での特異的なＴ細胞活性化
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアントの非特異的結合を除外するために、これらのバリアントを含む抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＣＤ２０陽性ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞及び様々なＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、ＬＡＬＡ変異、Ｄ２４６Ａ変異又はそれらの組み合わせ）を有する抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）抗体の存在下で評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）を用いて、非特異結合の可能性を評価した。抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）では、非特異的抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化は検出できなかった。
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的抗体の存在下での特異的なＴ細胞活性化
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアントの非特異的結合を除外するために、これらのバリアントを含む抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞の活性化を、ＣＤ２０陽性ＷＳＵＤＬＣＬ２標的細胞及び様々なＦｃバリアント（Ｆｃ野生型、Ｆｃ Ｐ３２９Ｇ変異、ＬＡＬＡ変異、Ｄ２４６Ａ変異又はそれらの組み合わせ）を有する抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）抗体の存在下で評価した。ＣＡＲ－Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施し、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）又は非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）を用いて、非特異結合の可能性を評価した。抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）野生型ＩｇＧ１（図３Ａ）、抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｄ）、非特異的ＤＰ－４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｅ）では、非特異的抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化は検出できなかった。
【0474】
抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図３Ｂ）及び抗ＣＤ２０（ＧＡ１０１）Ｄ２４６Ａ Ｐ３２９Ｇ ＩｇＧ１（図３Ｆ）の存在下で、特異的な抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ活性化が検出された。評価されたＥＣ５０は、全てのヒト化抗Ｐ３２９Ｇバリアント間で同等であり、元のバインダーのＥＣ５０と異なることはなかった。
【0475】
興味深いことに、ＶＨＶＬコンフォメーションのｓｃＦｖバインダーを含む抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨコンフォメーションのヒト化バインダーと比べて、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の強い活性化をもたらす。より高いプラトー（例えば図３Ｆ参照）は、発現レベルの向上及び／又は抗原結合受容体による細胞表面への輸送の促進により、より強い活性化がもたらされたためと考えられる。更に、このコンフォメーションはＰ３２９Ｇ変異との結合に影響を与え得る。
【0476】
Ｔ細胞のトニックシグナル伝達又は非特異的な活性化をもたらす抗原結合ドメインクラスター化のリスクを調べるため、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施したが、使用する初期抗体濃度を上げ、１００ｎＭのＧＡ１０１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１で段階希釈を開始し、更に標的細胞は播種しなかった。
【0477】
図３Ｃに描かれているように、試験した全てのヒト化Ｐ３２９Ｇバリアントで活性化が検出されなかったことは、標的細胞の非存在下で検出可能な受容体クラスタリング又は非特異的な活性化を示している。
【0478】
実施例５
様々なレベルの抗原を発現する標的細胞に対するＴ細胞活性化により評価した、様々なヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体バリアントの感度
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の感度と選択性を更に特徴づけるために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施した。
様々なレベルの抗原を発現する標的細胞に対するＴ細胞活性化により評価した、様々なヒト化Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体バリアントの感度
ヒト化抗Ｐ３２９Ｇ抗原結合受容体の感度と選択性を更に特徴づけるために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施した。
【0479】
様々なヒト化抗Ｐ３２９Ｇ－ｓｃＦｖバリアント抗原結合受容体を発現するＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、高（ＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１）、中（Ｓｋｏｖ３）、低（ＨＴ２９）ＦｏｌＲ１陽性標的細胞を識別する能力について評価した。Ｊｕｒｋａｔ－Ｒｅｐｏｒｔｅｒ細胞株において、抗Ｐ３２９Ｇ結合体の様々なバリアントをｓｃＦｖ抗原認識足場として、ＦｏｌＲ１に対して高親和性（１６Ｄ５）（図４Ａ、Ｄ、Ｇ）、中親和性（１６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ）（図４Ｂ、Ｅ、Ｈ）又は低親和性（１６Ｄ５ Ｇ４９Ｓ／Ｋ５３Ａ）（図４Ｃ、Ｆ、Ｉ）を呈する抗体と組み合わせて使用した。高抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ａ）、中抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｂ）及び低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｃ）と組み合わせた高発現標的細胞であるＨｅＬａ－ＦｏｌＲ１は、用量依存的活性化を示した。高抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｄ）、中抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｅ）、低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｆ）と組み合わせた中発現標的細胞であるＳｋｏｖ３は、用量依存的活性化を示した。様々な親和性バインダー抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５（図４Ｇ）、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｗ９６Ｙ（図４Ｈ）又は低親和性アダプター－ＩｇＧ抗ＦｏｌＲ１ Ｇ４９Ｓ Ｋ５３Ａ（図４Ｉ）と組み合わせた低発現標的細胞であるＨＴ２９については、シグナルは全く検出されなかった。更に、興味深いことに、ＶＨＶＬフォーマットの抗原結合受容体は、元の非ヒト化バインダー及びＶＬＶＨフォーマットのヒト化バインダーと比較して強いＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の活性化をもたらす。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１ ｓｃＦｖバインダーは、全てのコンストラクトの中で最も高いシグナル強度をもたらす（図４Ａ－Ｆ）。
【0480】
更に、抗ＦｏｌＲ１ １６Ｄ５ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図５）又は抗ＨＥＲ２ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図６）のいずれかと組み合わせて用いたＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋及びＨＥＲ２＋）細胞について、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。いずれも、ＶＬＶＨ配向よりもＶＨＶＬ配向の方が優れているという知見を確かめるものである。ヒト化バリアントＶＨ３ＶＬ１が、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ Ｔ細胞の最も強い活性化をもたらす。
【0481】
実施例６
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的抗体と腫瘍細胞分泌性プロテアーゼの存在下でのマスクされたＣＡＲ Ｔ細胞の活性化
マスクされたＰ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的活性化を試験するために、プロテアーゼを分泌する腫瘍細胞の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。本アッセイは上記のように実施され、それによってＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋）標的細胞と抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１は最終体積３５μｌで濃度６０ｎＭか６ｎＭのいずれかで使用された。コントロールとして、非特異的ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を使用した。エフェクター細胞として、切断可能なリンカー又は非切断性リンカーを持つマスクされた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲを使用した。ポジティブコントロールとして、１：８０に希釈したマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ製ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５０）を添加した（図９）。切断可能なリンカーを持つマスクされた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞が共培養で活性化を示すがこれは、ＨｅＬａ細胞がプロテアーゼを分泌し、プロテアーゼが該リンカーを切断することでＣＡＲのマスクが外れ、ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されることを示している。マスクが非切断性リンカーで結合されている抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲは活性化を示さず、このことは、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ結合部位を適切にカバーしていることを示す。更に、非特異的抗ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１はＣＡＲの活性化を示さず、このことは、特異的活性化は標的抗体の存在下でのみであることを示す（図９）。
ＦｃドメインにＰ３２９Ｇ変異を含む標的抗体と腫瘍細胞分泌性プロテアーゼの存在下でのマスクされたＣＡＲ Ｔ細胞の活性化
マスクされたＰ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的活性化を試験するために、プロテアーゼを分泌する腫瘍細胞の存在下でＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを実施した。本アッセイは上記のように実施され、それによってＨｅＬａ（ＦｏｌＲ１＋）標的細胞と抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）ＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１は最終体積３５μｌで濃度６０ｎＭか６ｎＭのいずれかで使用された。コントロールとして、非特異的ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を使用した。エフェクター細胞として、切断可能なリンカー又は非切断性リンカーを持つマスクされた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲを使用した。ポジティブコントロールとして、１：８０に希釈したマトリプターゼ（Ｅｎｚｏ製ＡＬＸ－２０１－２４６－Ｕ２５０）を添加した（図９）。切断可能なリンカーを持つマスクされた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞が共培養で活性化を示すがこれは、ＨｅＬａ細胞がプロテアーゼを分泌し、プロテアーゼが該リンカーを切断することでＣＡＲのマスクが外れ、ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されることを示している。マスクが非切断性リンカーで結合されている抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲは活性化を示さず、このことは、抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ結合部位を適切にカバーしていることを示す。更に、非特異的抗ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１はＣＡＲの活性化を示さず、このことは、特異的活性化は標的抗体の存在下でのみであることを示す（図９）。
【0482】
図１０Ａ及びＢでは、ＬｎＣＡＰ（ＰＳＭＡ＋、ＥｐＣＡＭ＋）標的細胞を抗ＰＳＭＡ（図１０Ａ）又は抗ＥｐＣａｍ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１（図１０Ｂ）と組み合わせてエフェクター対標的細胞比１：１で使用した場合の、ｃａｒ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化を示している。非切断性マスクを持つエフェクター細胞は、マスクされた抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を示さなかった。抗ＥｐＣＡＭ抗体と組み合わせた切断可能なマスクを持つエフェクター細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞の用量依存的活性化を示した（図１０Ｂ）。マスクした抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲを更にプロテアーゼで処理した場合、抗ＰＳＭＡ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ １又は抗ＥｐＣＡＭ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を用いたときに用量依存活性化が見られた（図１０Ａ及びＢ）。
【0483】
実施例７
乳腺腫瘍患者由来異種移植片試料におけるマスクされたＣＡＲ Ｔ細胞の活性化について
がん患者由来異種移植片ＨＥＲ２＋ ＥＲ－異種移植片モデルＢＣ＿００４細胞（ＰＤＸ）（ＯｎｃｏＴｅｓｔ、ドイツ、フライブルク）について、ＨＥＲ２及びＦｏｌＲ１の発現を解析した。フローサイトメトリー解析を上記のように実施した。そこで、抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１及びＨｅｒ２（ペルツズマブ）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を用いて、腫瘍細胞上に発現した標的に結合させた（ｂｉｎ）。非標的結合コントロールとして、ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を使用した。上記のように細胞を洗浄した後、蛍光標識した二次抗体を用いて標的結合抗体を検出した。フローサイトメトリー解析は、細胞表面にＨＥＲ２及びＦｏｌＲ１の発現を確認した（図１１Ａ）。それらのＰＤＸ細胞を標的細胞として使用して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施した。該アッセイは９６ウェルプレートでＥ：Ｔ比１０：１で実施した。抗体として抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を用い、切断可能なマスクを持つ抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されることにより、非切断性マスクは活性化を防ぐことができることが示された（図１１Ｂ）。
乳腺腫瘍患者由来異種移植片試料におけるマスクされたＣＡＲ Ｔ細胞の活性化について
がん患者由来異種移植片ＨＥＲ２＋ ＥＲ－異種移植片モデルＢＣ＿００４細胞（ＰＤＸ）（ＯｎｃｏＴｅｓｔ、ドイツ、フライブルク）について、ＨＥＲ２及びＦｏｌＲ１の発現を解析した。フローサイトメトリー解析を上記のように実施した。そこで、抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１及びＨｅｒ２（ペルツズマブ）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を用いて、腫瘍細胞上に発現した標的に結合させた（ｂｉｎ）。非標的結合コントロールとして、ＤＰ４７ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を使用した。上記のように細胞を洗浄した後、蛍光標識した二次抗体を用いて標的結合抗体を検出した。フローサイトメトリー解析は、細胞表面にＨＥＲ２及びＦｏｌＲ１の発現を確認した（図１１Ａ）。それらのＰＤＸ細胞を標的細胞として使用して、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化アッセイを上記のように実施した。該アッセイは９６ウェルプレートでＥ：Ｔ比１０：１で実施した。抗体として抗ＦｏｌＲ１（１６Ｄ５）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１を用い、切断可能なマスクを持つ抗Ｐ３２９Ｇ ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されることにより、非切断性マスクは活性化を防ぐことができることが示された（図１１Ｂ）。
【図1A-B】
【図1C-D】
【図2】
【図3A-C】
【図3D-F】
【図4A-C】
【図4D-F】
【図4G-I】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】