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特表2023-547656がんの腫瘍溶解性ウイルス免疫療法のための免疫チェックポイントを調節するＶＳＶ－ＮＤＶハイブリッドウイルス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-13
(54)【発明の名称】がんの腫瘍溶解性ウイルス免疫療法のための免疫チェックポイントを調節するＶＳＶ－ＮＤＶハイブリッドウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/47 20060101AFI20231106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231106BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231106BHJP
C12N 15/33 20060101ALI20231106BHJP
A61K 35/766 20150101ALI20231106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/47 ZNA
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N15/33
A61K35/766
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526528
(86)(22)【出願日】2021-10-29
(85)【翻訳文提出日】2023-06-12
(86)【国際出願番号】 EP2021080188
(87)【国際公開番号】W WO2022090500
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】20205209.8
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513302064
【氏名又は名称】クリニクム レヒツ デア イザール デア テクニシェン ウニフェルジテート ミュンヘン
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】アルトモンテ， イェニファー
(72)【発明者】
【氏名】クラベ， テレーザ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087MA16
4C087MA65
4C087NA05
4C087NA06
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。本発明はさらに、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸に関する。本発明はまた、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸を含むベクターに関する。さらに、本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む薬学的組成物に関する。本発明はさらに、医療における使用のための（例えば、がんの防止および／または処置における使用のための）ウイルス、核酸、ベクター、および薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化として、および／または腫瘍検出のために、ウイルス、核酸、ベクター、および薬学的組成物を使用することに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、前記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項2】
前記組換えウイルスは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４のＦｃドメイン、またはそのフラグメントをさらに含む、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項3】
前記Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、前記ｓＰＤ－１に融合される、請求項１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項4】
前記ｓＰＤ－１は、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）であり、好ましくは、そのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対して、それぞれ、前記リガンドに対する野生型ｓＰＤ－１の親和性より少なくとも２倍高い（例えば、４５倍高いおよび３０倍高い）親和性を有する、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に関して＜３．２μＭおよび／もしくはＰＤ－Ｌ２に関して＜０．１μＭのＫｄで親和性を有する、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項5】
前記ｓＰＤ－１は、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異を含む、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項6】
前記ｓＰＤ－１は、配列番号３の配列を有するＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項7】
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５の配列を有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である、および／またはプロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換、およびより好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
前記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する前記改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される、
前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項8】
前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸。
【請求項9】
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸であって、前記核酸は、好ましくは配列番号７の配列を有し、前記ｓＰＤ－１をコードする核酸に融合される、好ましくは、配列番号６の配列を有するＦｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸を含み、ここで好ましくはその融合生成物は、配列番号８の核酸配列を有する、請求項８に記載の核酸。
【請求項10】
請求項８または９に記載の核酸を含み、好ましくは配列番号９の配列を有するベクターであって、必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクター。
【請求項11】
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
請求項８～９のいずれかに記載の核酸または請求項１０に記載のベクター。
【請求項12】
薬学的組成物であって、（ｉ）請求項１～７のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸、または請求項１０～１１のいずれかに記載のベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物：
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞療法システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物。
【請求項13】
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のため
に製剤化されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
医療における使用のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項15】
がんの防止および／または処置、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択されるがんの防止および／または処置における使用のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項16】
遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。本発明はさらに、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸に関する。本発明はまた、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸を含むベクターに関する。さらに、本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む薬学的組成物に関する。
本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスに関する。本発明はさらに、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸に関する。本発明はまた、組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸を含むベクターに関する。さらに、本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
数十年もの集中的な研究にもかかわらず、がんは、全世界でおおきな健康上の懸念のままであり、疫学的にも経済的にも、社会的に重大な負荷を強いている。がん免疫療法は、上記治療の基礎として患者の免疫系を利用することによって、がんを処置するにあたって刺激的なパラダイムシフトとして腫瘍内科学の面を急速に変換しつつある。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は近年、がん免疫療法剤の刺激的な部分集合としてそれらの位置を獲得した。ＯＶは、直接的な腫瘍細胞の腫瘍溶解の開始、腫瘍微小環境の調節、および腫瘍細胞に対して指向される適応免疫応答を刺激する潜在的能力を通じて、新規な、マルチ機序アプローチを提供する。従って、ＯＶアプローチは、特に、他の免疫療法剤との合理的に設計された併用レジメンの文脈において、現在集中的に研究されている最中である。
数十年もの集中的な研究にもかかわらず、がんは、全世界でおおきな健康上の懸念のままであり、疫学的にも経済的にも、社会的に重大な負荷を強いている。がん免疫療法は、上記治療の基礎として患者の免疫系を利用することによって、がんを処置するにあたって刺激的なパラダイムシフトとして腫瘍内科学の面を急速に変換しつつある。腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は近年、がん免疫療法剤の刺激的な部分集合としてそれらの位置を獲得した。ＯＶは、直接的な腫瘍細胞の腫瘍溶解の開始、腫瘍微小環境の調節、および腫瘍細胞に対して指向される適応免疫応答を刺激する潜在的能力を通じて、新規な、マルチ機序アプローチを提供する。従って、ＯＶアプローチは、特に、他の免疫療法剤との合理的に設計された併用レジメンの文脈において、現在集中的に研究されている最中である。
【0003】
がん免疫療法は、患者の免疫系を調節して、侵襲している腫瘍細胞を認識および拒絶するという共通する目的を有する広い範囲のアプローチを包含する。ワクチン接種アプローチおよび養子免疫細胞療法（例えば、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ） Ｔ細胞）は、適切な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および標的とするべきネオアンチゲンの同定に依拠する。腫瘍内不均一性およびがん免疫編集のプロセスに起因して、１つの抗原を標的とするストラテジーは、その標的化された抗原を発現しない腫瘍細胞の選択を生じ得、治療を免れ得る。さらに、各腫瘍は、それ自体の別個の遺伝子シグネチャーを有することから、標的療法はしばしば、腫瘍生検物の高価かつ時間を浪費するスクリーニング、およびその後の個別化処置の作製を要求する。
【0004】
免疫チェックポイントは、Ｔ細胞活性化を抑制し、Ｔ細胞「疲弊」の状態を作り出すことによって、外来抗原に対する免疫炎症プロセスの一定の活性化を防止するように機能する代償的制御である。腫瘍細胞は、これらの免疫チェックポイントを利用して、免疫抑制的微少環境を作り出し、その中で腫瘍細胞は、免疫クリアランスから逃れ得、宿主を侵襲し続け得る。免疫チェックポイントは、がん免疫療法の有望な標的としてますます考慮されている。重要なチェックポイント分子に対する抗体を使用する妨害は、制限されたがん適応症のために市場に投入されているが、がん患者の小さな部分集合において、概して炎症性が高くかつ高い変異荷重を有する腫瘍において有効であるに過ぎないようである。さらに、全身適用のために必要とされるこれらの抗体の用量が高いことから、重篤な免疫関連毒性が生じ得る。
【0005】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍に対して指向される免疫応答を刺激しながら、直接的な腫瘍細胞溶解を引き起こすそれらの能力を通じて、がん治療に簡潔なマルチモードのアプローチを提供する。にもかかわらず、単剤療法としてのＯＶの潜在的能力は、抗ウイルス免疫応答の比較的迅速な発生、ならびに全身的な腫瘍クリアランスおよび再発からの保護を提供するためには不十分な養子免疫刺激によって制限されている。過去１０年間にわたって、増強されたＯＶ治療の開発において顕著な進展が起こり、いくつかのベクターは、臨床試験に入っている。現在までに、１つのＯＶが、臨床薬剤としての使用に関して、連邦医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医師会（ＥＭＡ）の承認を受けた。このウイルスは、組換え単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ－Ｉ）ベクターであり、現在は、切除不能な黒色腫であるただ１つの適応症に関してのみ承認されている。さらに、ＵＳ １０６０４５７４ Ｂ２は、治療用ポリペプチドの腫瘍溶解性ウイルス送達に関する。しかし、臨床試験結果は、免疫の能力がある宿主において大部分のＯＶ治療に対する不適切な腫瘍応答に起因して、しばしば失望するものである。
【0006】
本発明者らは、ハイブリッド腫瘍溶解性ウイルス技術（ＷＯ ２０１７／１９８７７９）（これは、各々の安全性の懸念を排除しながら、腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の有益な特徴と、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の有益な特徴とを併せ持つ）を以前に操作した。
【0007】
近年、ＯＶと免疫チェックポイント治療とを併用するストラテジーが出現している。その理論的根拠は、腫瘍内の局所的ウイルス感染が、「落ち着いた（ｃｏｌｄ）腫瘍微少環境を、高レベルのサイトカインおよび免疫細胞浸潤によって示される炎症を起こした「激しい（ｈｏｔ）」環境へと変換し得、それによって上記腫瘍を免疫チェックポイント妨害の効果に感作させ得ることである。腫瘍溶解性ウイルスでの腫瘍治療が、上記腫瘍内で、共阻害性Ｔ細胞レセプター、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＰＤ－１）のリガンドＰＤ－Ｌ１のアップレギュレーションをもたらし、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の妨害が、腫瘍溶解性免疫治療効果を増強することであると仮定されている。ｓＰＤ－１を発現する腫瘍溶解性粘液腫ウイルスを利用するストラテジーが発表されている［１］。
【0008】
しかし、ＯＶと免疫チェックポイント治療との併用の潜在的可能性を完全に利用するために、種々の障害に対処しなければならない。第１に、従来の免疫チェックポイント調節薬物が抗体からなり、これが全身にかつ高濃度で投与される必要があり、しばしば耐えられない副作用をもたらすことは、難題である。第２に、免疫療法剤の手が出ないほどに高いコストは、このクラスにおける２種の個々の薬物製品を併用することの実現性を実質的に制限する。第３に、相乗効果を最適化するために、強力な腫瘍減量効果と、免疫原性の細胞死および炎症とを併せ持つ効率的な腫瘍溶解性ウイルスを選択することは、難題である。
【0009】
従って、腫瘍溶解性ウイルス療法のための改善された手段および方法、ならびに改善された腫瘍溶解性ウイルスの必要性が当該分野に存在する。本発明の目的は、全身的な毒性がない状態で、最適なウイルス媒介性腫瘍溶解と強力な免疫媒介性効果とを併せ持つ優れたがん治療剤を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】米国特許第１０６０４５７４号明細書
【特許文献2】国際公開第２０１７／１９８７７９号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Bartee MY, Dunlap KM, Bartee E. Tumor-Localized Secretion of Soluble PD1 Enhances Oncolytic Virotherapy. Cancer Res. 2017;77(11):2952-63.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明の要旨
以下において、本発明の要素が記載される。これらの要素は、具体的実施形態とともに列挙されるが、それらが、さらなる実施形態を創作するために、任意の様式でかつ任意の数で組み合わされ得ることは、理解されるべきである。種々に記載される例および好ましい実施形態は、その明示的に記載される実施形態のみに本発明を限定すると解釈されるべきではない。この記載は、その明示的に記載される実施形態のうちの２もしくはこれより多くのものを組み合わせるか、またはその明示的に記載される実施形態のうちの１もしくはこれより多くのものを、任意の数の開示されるおよび／もしくは好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持および包含することが理解されるべきである。さらに、本出願における全ての記載される要素の任意の並べ替えおよび組み合わせは、文脈が別段示さなければ、本出願の記載によって開示されると見做されるべきである。
以下において、本発明の要素が記載される。これらの要素は、具体的実施形態とともに列挙されるが、それらが、さらなる実施形態を創作するために、任意の様式でかつ任意の数で組み合わされ得ることは、理解されるべきである。種々に記載される例および好ましい実施形態は、その明示的に記載される実施形態のみに本発明を限定すると解釈されるべきではない。この記載は、その明示的に記載される実施形態のうちの２もしくはこれより多くのものを組み合わせるか、またはその明示的に記載される実施形態のうちの１もしくはこれより多くのものを、任意の数の開示されるおよび／もしくは好ましい要素と組み合わせる実施形態を支持および包含することが理解されるべきである。さらに、本出願における全ての記載される要素の任意の並べ替えおよび組み合わせは、文脈が別段示さなければ、本出願の記載によって開示されると見做されるべきである。
【0013】
第１の局面において、本発明は、組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、上記ウイルスは、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、
ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、上記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含むウイルスに関する。
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、
ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、上記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含むウイルスに関する。
【0014】
１つの実施形態において、上記組換えウイルスは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４のＦｃドメイン、またはそのフラグメントをさらに含む。
【0015】
１つの実施形態において、上記Ｆｃドメインもしくはそのフラグメントは、上記ｓＰＤ－１に融合される。
【0016】
１つの実施形態において、上記ｓＰＤ－１は、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）であり、好ましくは、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対して、上記リガンドに対する野生型ｓＰＤ－１の親和性よりそれぞれ、少なくとも２倍高い（例えば、４５倍高いおよび３０倍高い）親和性を有する、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に関して＜３．２μＭおよび／もしくはＰＤ－Ｌ２に関して＜０．１μＭのＫｄで親和性を有する。
【0017】
１つの実施形態において、上記ｓＰＤ－１は、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異を含む。
【0018】
１つの実施形態において、上記ｓＰＤ－１は、配列番号２を有する配列を含むかまたはからなり、必要に応じて、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異さらに含む。
【0019】
１つの実施形態において、上記ｓＰＤ－１は、配列番号３の配列を有するＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである。
【0020】
１つの実施形態において、上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５の配列を有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である、および／または
プロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換を、より好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは
上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
上記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される。
プロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換を、より好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは
上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
上記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される。
【0021】
さらなる局面において、本発明は、上記に定義されるとおりの組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸に関する。
【0022】
１つの実施形態において、上記核酸は、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸であって、上記核酸は、好ましくは配列番号７の配列を有し、上記ｓＰＤ－１をコードする核酸に融合され、好ましくは配列番号６を有するＦｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸を含み、ここで好ましくはその融合生成物は、配列番号８の核酸配列を有する。
【0023】
この局面において、上記組換え腫瘍溶解性ウイルス、上記Ｆｃドメイン、上記フラグメント、および上記ｓＰＤ－１は、上記で定義されるとおりである。
【0024】
さらなる局面において、本発明は、上記で定義されるとおりの核酸を含み、好ましくは配列番号９の配列を有するベクターであって、
必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクターに関する。
必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクターに関する。
【0025】
さらなる局面において、本発明は、上記で定義されるとおりの核酸または上記で定義されるとおりのベクターであって、
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
核酸またはベクターに関する。
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
核酸またはベクターに関する。
【0026】
好ましい実施形態において、上記核酸（上記で定義されるとおり）または上記ベクター（上記で定義されるとおり）は、配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはからなる。
【0027】
さらなる局面において、本発明は、薬学的組成物であって、
（ｉ）上記で定義されるとおりの組換え腫瘍溶解性ウイルス、上記で定義されるとおりの核酸、または上記で定義されるとおりのベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞治療システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物に関する。
（ｉ）上記で定義されるとおりの組換え腫瘍溶解性ウイルス、上記で定義されるとおりの核酸、または上記で定義されるとおりのベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞治療システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物に関する。
【0028】
１つの実施形態において、上記で定義されるとおりの薬学的組成物は、
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または
皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のうちのいずれかため、
に製剤化されている
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または
皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のうちのいずれかため、
に製剤化されている
【0029】
さらなる局面において、本発明は、医療における使用のための、組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、核酸（上記で定義されるとおり）、ベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）に関する。
【0030】
さらなる局面において、本発明は、がんの防止および／または処置、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択されるがんの防止および／または処置における使用のための、組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、核酸（上記で定義されるとおり）、ベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）に関する。
【0031】
１つの実施形態において、上記使用のための組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、上記使用のための（上記で定義されるとおり）、上記使用のための核酸（上記で定義されるとおり）、上記使用のためのベクター（上記で定義されるとおり）、上記使用のための薬学的組成物（上記で定義されるとおり）は、以下のような他の療法：
細胞キャリアシステム、例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、例えば、腫瘍ワクチンもしくは免疫チェックポイントインヒビター、
養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞での）、ならびに／または
標準的な腫瘍療法、例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓形成、低分子インヒビター、
との組み合わせにおいて使用される。
細胞キャリアシステム、例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、例えば、腫瘍ワクチンもしくは免疫チェックポイントインヒビター、
養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞での）、ならびに／または
標準的な腫瘍療法、例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓形成、低分子インヒビター、
との組み合わせにおいて使用される。
【0032】
さらなる局面において、本発明は、癌の診断、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択される癌の診断における使用のための、組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、核酸（上記で定義されるとおり）、ベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）に関する。
【0033】
さらなる局面において、本発明は、遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化として、および／または腫瘍検出のための、組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、または核酸（上記で定義されるとおり）、またはベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）の使用に関する。１つの実施形態において、このような使用は、インビトロでの使用である。
【0034】
さらなる局面において、本発明は、がんの診断、防止および／または処置の方法であって、上記方法は、治療量の組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、または核酸（上記で定義されるとおり）、またはベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）を必要性のある被験体に投与する工程を包含する方法に関する。
【0035】
１つの実施形態において、上記投与する工程は、全身、静脈内、動脈内、腫瘍への注射を介するものである、および／または皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内および硝子体内の注射を介するものである。
【0036】
この局面において、上記がんおよび上記投与する工程は、上記で定義されるとおりである。
【0037】
さらなる局面において、本発明は、がんを診断、防止および／または処置するための医薬の製造のための、組換え腫瘍溶解性ウイルス（上記で定義されるとおり）、または核酸（上記で定義されるとおり）、またはベクター（上記で定義されるとおり）、または薬学的組成物（上記で定義されるとおり）の使用に関する。この局面において、上記がんならびに上記診断、防止および／または処置する工程は、上記で定義されるとおりである。
【発明を実施するための形態】
【0038】
詳細な説明
本発明の増強されたウイルスは、改変されたＶＳＶ－ＮＤＶであり、優れた安全性プロフィールを維持しながら、細胞－細胞融合反応の誘導によって生成される、従来の腫瘍溶解性ウイルスを超えるいくつかの有益な特徴、例えば、迅速かつ効率的な腫瘍細胞の腫瘍溶解を提供する。感染細胞が隣り合う腫瘍細胞と融合し、それによってそれら細胞を殺滅するのみならず、それらが患者の免疫系に、残りの感染していない腫瘍細胞に対して攻撃を加えさせ、炎症性の腫瘍微少環境を作り出す一連の事象をも引き起こす。ＶＳＶ－ＮＤＶは、全ての腫瘍細胞において十分に複製し得ることから、多数の腫瘍適応症において広範囲に及ぶ治療効果を有する。
本発明の増強されたウイルスは、改変されたＶＳＶ－ＮＤＶであり、優れた安全性プロフィールを維持しながら、細胞－細胞融合反応の誘導によって生成される、従来の腫瘍溶解性ウイルスを超えるいくつかの有益な特徴、例えば、迅速かつ効率的な腫瘍細胞の腫瘍溶解を提供する。感染細胞が隣り合う腫瘍細胞と融合し、それによってそれら細胞を殺滅するのみならず、それらが患者の免疫系に、残りの感染していない腫瘍細胞に対して攻撃を加えさせ、炎症性の腫瘍微少環境を作り出す一連の事象をも引き起こす。ＶＳＶ－ＮＤＶは、全ての腫瘍細胞において十分に複製し得ることから、多数の腫瘍適応症において広範囲に及ぶ治療効果を有する。
【0039】
本発明は、単一の治療剤内で有効な免疫チェックポイント遮断分子を有する強力な腫瘍溶解性ウイルスを提供する。本発明者らは、安全かつ免疫を刺激するｒＶＳＶ－ＮＤＶウイルスをベクターとして使用して、ヒトＰＤ－１のシグナル伝達ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを含む可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）分子を発現する。上記組換えベクターは、腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞において上記ベクターは複製し、ｓＰＤ－１の分泌を誘起する。次いで、ｓＰＤ－１は、そのリガンドである、周りの腫瘍細胞および免疫細胞（すなわち、樹状細胞）の表面上のＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合し、それによって、それらの阻害性リガンドへのＴ細胞結合に関して競合するデコイとして作用し、それによって、Ｔ細胞が、抗体の必要性なしに活性なままであることを可能にする（図１）。
【0040】
抗体を介する旧来の免疫チェックポイント妨害（ＩＣＢ）療法と比較すると、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス療法およびＩＣＢを１つの治療剤の中に併せ持ち、このことが、直接的な腫瘍溶解性効果を介して、微少環境内での免疫抑制を緩和しながら、腫瘍を同時に減量するように作用するという点で進歩性がある。さらに、このアプローチは、ウイルス複製および腫瘍部位での直接的なＰＤ－１の局所的放出を介して、治療剤の自己増幅を可能にし、これは、抗体アプローチと比較して大きな安全性の利点である。
【0041】
本発明は、第１に、上記ベクターが、酵素に融合性のＮＤＶ融合（Ｆ）タンパク質（例えば、ＮＤＶ／Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ））を含み、これが、強力な免疫原性細胞死および最適には、免疫チェックポイント妨害と相乗的に作用する；第２に、構築物中で使用されるｓＰＤ－１が、好ましくは、野生型ｓＰＤ－１と比較して増大した親和性を有する「高親和性」バージョンであるという利点を有する。このような高親和性バージョンは、例えば、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２［２］へのそれぞれ、４５倍および３０倍高い親和性結合を生じるために、アミノ酸１３２における１個のアラニンからロイシンへの置換（Ａ１３２Ｌ）の導入を介して生成されるか、または例えば、野生型よりＰＤ－Ｌ１に対して４０，０００倍高い親和性を有する、位置４１においてイソロイシンまたはバリンをコードする高親和性コンセンサス改変体である［３］。第３に、ＨＡ－ｓＰＤ－１は、増強された安定性のために、ヒトＩｇＧのＦｃドメインへと融合される。１つの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、フレームの中でｓＰＤ－１配列に直接続き、ここでｓＰＤ－１の停止コドンは、Ｆｃドメインを有するｓＰＤ－１－Ｆｃ融合タンパク質を生成するために除去される。１つの実施形態において、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）は、野生型ｓＰＤ－１と比較して、および／または野生型ＰＤ－１と比較して増大した親和性（例えば、それぞれのリガンドに対して親和性において２倍の増大）を有する。１つの実施形態において、ｓＰＤ－１の「高親和性」バージョンは、野生型ｓＰＤ－１の親和性の少なくとも２倍程度の高さである親和性（例えば、５倍高い親和性、１０倍高い親和性、３０倍高い親和性、または４５倍高い親和性）を有する。１つの実施形態において、野生型ヒトＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に関して、それぞれ、６．３６μＭおよび０．１９μＭのＫｄを有する。１つの実施形態において、ＨＡ－ｓＰＤ－１（高親和性ｓＰＤ－１）は、ＰＤ－Ｌ１に関しては＜３．２μＭおよびＰＤ－Ｌ２に関しては＜０．１μＭのＫｄを有する親和性、好ましくはＰＤ－Ｌ１に関しては＜０．５μＭおよびＰＤ－Ｌ２に関しては＜０．０１μＭ（例えば、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に関して、それぞれ、０．１４μＭおよび０．００６５μＭ）のＫｄを有する親和性を有する。
【0042】
野生型ｓＰＤ－１の、そのリガンドへの結合は、治療上有効なアプローチとしてその適用を支持するにはおそらく弱すぎる。本発明の利点は、本発明のベクターにおいて使用されるｓＰＤ－１高親和性バージョンが、がん処置においてより有効であり、従って、より高い効率を有することである。
【0043】
本発明のベクターは、抗体ベースのＩＣＢ療法を超えるいくつかの利点を提供する。例えば、それは、腫瘍部位において特異的にＰＤ－１の局所的放出を提供し、このことは、これらの抗体の全身送達に原因があるとされる重篤な副作用を回避する潜在的可能性を有する。本発明のベクターはまた、腫瘍減量を介する相乗効果的な作用機序、抗腫瘍免疫応答の誘導、および腫瘍微少環境内での免疫抑制の治療的調節を提供する。さらに、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１薬物製品は、潜在的には、ＰＤ－１抗体の価格の数分の一で生成され得、それは、別個のＰＤ－１抗体に追加してのＯＶの併用療法の投与より費用効果的である。さらに、本発明のベクターは、有利なことには、ヒト使用に関して安全である。
【0044】
本発明は、さらなる利点（例えば、ｓＰＤ－１を発現する腫瘍溶解性粘液腫ウイルスを超える利点）を有する。第１に、上記ｒＶＳＶ－ＮＤＶベクターは、最適な腫瘍溶解性ウイルスプラットフォームである。なぜならそれは、直接的な腫瘍溶解性効果およびより免疫原性の細胞死の誘導を介して腫瘍殺滅において極めて安全かつ高度に有効であり、アブスコパル効果をもたらすからである。これらの優れた治療効果は、ＮＤＶのエンベロープタンパク質（融合（Ｆ）およびヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質を含む）での、およびより具体的には、ウイルス構築物へと操作される改変された超融合性融合（Ｆ）タンパク質の使用を介するＶＳＶ糖タンパク質置換に原因があるとされる。１つの実施形態において、上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、例えば、配列番号２５の配列を有する、必要に応じてプロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換、より好ましくはＬ２８９Ａをさらに含むＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である。１つの実施形態において、ＮＤＶ融合（Ｆ）タンパク質のＬ２８９Ａ改変バージョン、すなわち、ＮＤＶ／Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）（例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質）を使用すると、増大した超融合性が提供される。これらの特性は、ＩＣＢとの併用に関して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶが理想的なＯＶベクターであることに関する基礎である。さらに、上記ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ベクターは、ｓＰＤ－１、好ましくはヒトｓＰＤ－１の高親和性バージョンを利用する。これは、ｓＰＤ－１とそのリガンドとのより強い相互作用、従って、治療効果のより高い潜在的可能性を提供する。最後に、高親和性ｓＰＤ－１は、ヒトＩｇＧのＦｃドメインと融合され、これは、インビボで改善された薬物動態プロフィールのためのより大きな安定性を可能にする。１つの実施形態において、本発明の核酸および／またはベクターは、配列番号９または１５を有するヌクレオチド配列を含み、ここで配列番号９および１５はともに、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡｓＰＤ１－Ｆｃをコードし、ここで配列番号９は、非コード領域をさらに含む。
【0045】
濃度、量、および他の数値データは、範囲形式において本明細書で表現または提示され得る。このような範囲形式は、便利さおよび簡潔さのために使用されるに過ぎないことが理解されるべきであり、従って、範囲の境界として明示的に記載される数値範囲を含むのみならず、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲の全てをも、各数値および部分範囲が明示的に記載されるかのうように含むと柔軟に解釈されるべきである。例証として、「２０～１００ヌクレオチド」という数値範囲は、２０～１００の明示的に記載される値を含むのみならず、その示される範囲内の個々の数値および部分範囲をも含むと解釈されるべきである。従って、この数値範囲に含まれるのは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、…９７、９８、１００のような個々の値、および２５～３５、２０～４０、２５～５０などのような部分範囲である。この同じ原理が、ただ１つの数値（例えば、「少なくとも２５ヌクレオチド」）を記載する範囲にも該当する。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載される特性に関係なく該当するはずである。
【0046】
用語「ＶＳＶ」とは、本明細書で使用される場合、ラブドウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に関する。ＶＳＶベクターは、それらの固有の腫瘍特異性および迅速な複製サイクルに起因して、高い腫瘍内力価およびその後の腫瘍細胞溶解を生じる非常に魅力的な腫瘍溶解性薬剤である。ＶＳＶのゲノムは、５種の主要タンパク質： 糖タンパク質（Ｇ）、ラージポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（Ｎ）をコードするネガティブセンスＲＮＡの単一分子である。ゲノム全体は、約１１，０００ヌクレオチドである。ＶＳＶ Ｇタンパク質は、ウイルス進入を可能にする。それは、宿主細胞上に存在するＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）またはＬＤＬＲファミリーメンバーへのウイルスの結合を媒介する。結合後に、ＶＳＶ－ＬＤＬＲ複合体は、迅速にエンドサイトーシスを受ける。それは、次いで、ウイルスエンベロープとエンドソーム膜との融合を媒介する。ＶＳＶは、部分的にクラスリン被覆された小胞を介して細胞に進入する；ウイルス含有小胞は、従来の小胞より多くのクラスリンおよびクラスリンアダプターを含む。ウイルス含有小胞は、それらの相互作用のためにアクチン機構の構成要素を増員し、従って、それ自体の取り込みを誘導する。複製は、細胞質において起こる。ＶＳＶ Ｌタンパク質は、ゲノムの半分によってコードされ、リンタンパク質と合わさって、ｍＲＮＡの複製を触媒する。ＶＳＶ Ｍタンパク質は、８３１ヌクレオチドの長さであり、２２９アミノ酸のタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡによってコードされる。その推定Ｍタンパク質配列は、膜会合を促進し得るいかなる長さの疎水性ドメインも非極性ドメインも含まない。上記タンパク質は、塩基性アミノ酸が豊富であり、高度の塩基性のアミノ末端ドメインを含む。用語「ｒＶＳＶ」は、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に関する。
【0047】
ＶＳＶインディアナ完全ゲノム 配列番号１７
ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４２８．１
ＶＳＶインディアナＧタンパク質 配列番号１８
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３６３３．１を参照のこと。
ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４２８．１
ＶＳＶインディアナＧタンパク質 配列番号１８
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３６３３．１を参照のこと。
【0048】
用語「ＮＤＶ」とは、本明細書で使用される場合、パラミクソウイルス科のトリウイルスであるニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に関する。この科のメンバーは、１本鎖の直線状ＲＮＡを有する。ゲノム全体は、約１６，０００ヌクレオチドである。上記ウイルスの複製は、宿主細胞の細胞質において起こる。それは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、健常細胞を無傷のままにしながら腫瘍細胞の中で複製し、溶解を引き起こすその生来の能力に起因して、腫瘍溶解性ウイルスとして開発されてきた。フェーズＩ～ＩＩ臨床試験は、療法に関連する最小限の毒性が存在することを示唆する。腫瘍溶解性薬剤としてのＮＤＶの主要な利益は、ウイルスエンベロープ（これは、ヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）タンパク質から構成される）が、標的細胞へのウイルス結合および融合を媒介するのみならず、感染細胞の、それらの隣り合う非感染細胞への融合をも引き起こし、ウイルスの拡がりおよび腫瘍細胞殺滅の強力な機序を提供することである。さらに、新たな証拠は、細胞－細胞融合によって引き起こされる合胞体形成は、マルチモードの細胞死応答を生じ、これは、強力な腫瘍破壊機序に関するウイルスの直接的な腫瘍溶解性効果と相乗的に作用し得ることを示す。
【0049】
ニューカッスル病ウイルスの２つのタンパク質が、エンベロープの中に挿入される。それらは、ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）および融合タンパク質（Ｆ）である。これら２つのタンパク質は、上記ウイルスの毒性および上記ウイルスが宿主細胞にどのように感染するかを決定するにあたって重要である。上記ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼタンパク質は、重要な２つの部分を有する： （１）ヘマグルチニン部分。これは、結合タンパク質であり、赤血球を含む宿主細胞の膜の外側にあるレセプターに結合する。（２）ノイラミニダーゼ部分は、宿主細胞の膜からウイルスを放出することを助ける酵素の活性部位である。この酵素の活性は、上記ウイルスが赤血球から溶離するためにかかる時間に影響する。
【0050】
融合タンパク質Ｆは、ウイルスエンベロープを、宿主細胞の膜に融合する。これは、ウイルスゲノムによる宿主細胞の透過を可能にする。融合が起こるには、天然の融合タンパク質の形状を変化させなければならない。この変化は、宿主細胞プロテアーゼが特異的切断部位において上記タンパク質を切断するときに起こる。これが起こった後に、融合タンパク質が活性化され、次いで、宿主細胞の膜に融合し得る。切断部位の周りのアミノ酸の配列は、タンパク質の切断を活性化し得るプロテアーゼの範囲を決定する。従って、この配列は、毒性を決定する。ＮＤＶ Ｆタンパク質は、細胞膜とのウイルスの融合および合胞体の形成を介して、細胞から細胞へとウイルスの拡がりを担う。Ｆタンパク質内の多塩基性の切断部位（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）の存在は、広い範囲のプロテアーゼによるタンパク質切断および活性化を可能にし、短潜伏期性ウイルス株における毒性の決定因子である。本発明者らは、Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質におけるアミノ酸２８９でのロイシンからアラニンへの１個のアミノ酸置換（Ｌ２８９Ａ）が、いかなるさらなる毒性もなしに、上記Ｆ３ａａ変異のみを有するウイルスより実質的に大きな（ｔａｎｔｉａｌｌｙ）合胞体形成および腫瘍壊死を生じることを以前に示した［４］。ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａ株の融合性および腫瘍溶解性の活性は、ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）を生成する残基２８９でのロイシンからアラニンへのＦタンパク質における点変異によってさらに増強され得る。同所性の免疫能のある肝臓腫瘍ラットモデルにおいて、肝動脈注入を介する変異ウイルスの投与は、顕著な合胞体形成および壊死を生じ、これは、元のｒＮＤＶ／Ｆ３ａａウイルスでの処置を超える有意な２０％生存長期化を説明した［４］。
【0051】
ＮＤＶ Ｈｉｔｃｈｎｅｒ Ｂ１完全ゲノム 配列番号２０
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３
ＮＤＶ ＨＮタンパク質 配列番号５および１９
核酸およびアミノ酸配列に関してはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２２７０を参照のこと。
ＮＤＶ Ｆタンパク質 配列番号２１および２２
核酸およびアミノ酸配列に関してはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２２７１を参照のこと。
ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質 配列番号２４および２５
Ｌ２８９Ａを有するＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質 配列番号２３および４
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３
ＮＤＶ ＨＮタンパク質 配列番号５および１９
核酸およびアミノ酸配列に関してはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２２７０を参照のこと。
ＮＤＶ Ｆタンパク質 配列番号２１および２２
核酸およびアミノ酸配列に関してはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２２７１を参照のこと。
ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質 配列番号２４および２５
Ｌ２８９Ａを有するＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質 配列番号２３および４
【0052】
上記で考察されるように、本発明は、組換え腫瘍溶解性ＶＳＶウイルスであって、ここで上記ＶＳＶの糖タンパク質が偽型化され、可溶性ＰＤ－１をさらに含む組換え腫瘍溶解性ＶＳＶウイルスを提供する。１つの実施形態において、「可溶性ＰＤ－１をさらに含む」ウイルスに言及する場合、これは、好ましくは、上記ウイルスの核酸、好ましくは上記ウイルスのゲノムが、上記可溶性ＰＤ－１をコードする状況をいうことが意味される；例えば、ＶＳＶおよび／またはＶＳＶ－ＮＤＶのウイルスゲノムは、可溶性ＰＤ－１をコードする。例えば、上記可溶性ＰＤ－１をコードする核酸は、ウイルスゲノム、例えば、ＶＳＶまたはＶＳＶ－ＮＤＶハイブリッドウイルスのゲノムへと、遺伝子改変によって組み込まれ得る。１つの実施形態において、このようなウイルスゲノムから、上記可溶性ＰＤ－１が、例えば、細胞（例えば、がん細胞）によって発現される。１つの実施形態において、可溶性ＰＤ－１をさらに含む上記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、上記可溶性ＰＤ－１をコードする核酸配列を含む。１つの実施形態において、上記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、上記組換え腫瘍溶解性ウイルスのウイルスゲノムの一部として、好ましくはＶＳＶのウイルスゲノムの一部として、可溶性ＰＤ－１をさらに含む。１つの実施形態において、可溶性ＰＤ－１は、組換えタンパク質として発現される。１つの実施形態において、上記組換え腫瘍溶解性ウイルスに感染したがん細胞のような細胞は、上記可溶性ＰＤ－１を発現する。１つの実施形態において、可溶性ＰＤ－１をさらに含む上記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、上記可溶性ＰＤ－１をコードする；好ましくは、上記ウイルスのゲノムにおいて上記可溶性ＰＤ－１をコードする組換え腫瘍溶解性ウイルスである。ウイルスの糖タンパク質を異種ウイルスの糖タンパク質と交換するという概念（「偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）」）は、以前に、ウイルス向性を変化させる効果的な手段として示されている。このアプローチを使用すると、ウイルス骨格は無傷で維持され、従って、感受性細胞におけるウイルス複製は、最小限にもたらされるはずである。
【0053】
１つの実施形態において、ＶＳＶのＧタンパク質は、改変された融合タンパク質、好ましくは位置Ｌ２８９においてアミノ酸置換（例えば、Ｌ２８９Ａ）、およびＮＤＶのＨＮタンパク質を有する改変された融合（Ｆ）タンパク質によって置き換えられる。１つの実施形態において、上記組換え腫瘍溶解性ウイルスはさらに、ＶＳＶの残存タンパク質、すなわち、ラージポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）および核タンパク質（Ｎ）を含む。例えば、ＶＳＶの内因性糖タンパク質は、全長ＶＳＶゲノムをコードするプラスミドから欠失され得る。上記ＮＤＶ糖タンパク質（改変された融合タンパク質（ＮＤＶ／Ｆ（Ｌ２８９Ａ））およびヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ／ＨＮ）を含む）は、ＶＳＶマトリクス（Ｍ）遺伝子とラージポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子との間に不連続転写ユニットとして挿入され得る（図２ＡおよびＷＯ ２０１７／１９８７７９を参照のこと）。１つの実施形態において、ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、Ｆ３ａａ改変Ｆタンパク質、必要に応じて、プロテアーゼ切断部位において、好ましくは位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換（例えば、Ｌ２８９Ａ）を含むＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である。
【0054】
本発明のベクター、好ましくは組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ）ベクターの一実施形態において、上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５のアミノ酸配列［＝Ｆ３ａａタンパク質のａａ配列］もしくは配列番号４のアミノ酸配列［＝Ｆ３ａａタンパク質／Ｌ２８９Ａのａａ配列］、または
配列番号２５もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列，
を含むかまたはからなる、ならびに／あるいは
ここで上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２４のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質のヌクレオチド配列］もしくは配列番号２３のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質／Ｌ２８９Ａのヌクレオチド配列］、または
配列番号２４もしくは２３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
によってコードされる。
配列番号２５もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列，
を含むかまたはからなる、ならびに／あるいは
ここで上記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２４のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質のヌクレオチド配列］もしくは配列番号２３のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質／Ｌ２８９Ａのヌクレオチド配列］、または
配列番号２４もしくは２３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
によってコードされる。
【0055】
本発明のベクター、好ましくはｒＶＳＶベクターの一実施形態において、ＮＤＶのＨＮタンパク質は、
配列番号５のアミノ酸配列、または
配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含むかもしくはからなる、ならびに／あるいは
上記ＮＤＶのＨＮタンパク質は、配列番号１９のヌクレオチド配列、または配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
配列番号５のアミノ酸配列、または
配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含むかもしくはからなる、ならびに／あるいは
上記ＮＤＶのＨＮタンパク質は、配列番号１９のヌクレオチド配列、または配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0056】
本発明は、本発明の腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸を含む。本発明は、本発明の核酸を含むベクターをさらに含む。
【0057】
１つの実施形態において、本発明のベクターは、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ、
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および
ワクチン接種用の（標的にされる腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；ならびに
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含む。
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ、
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および
ワクチン接種用の（標的にされる腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；ならびに
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含む。
【0058】
本発明は、医療における使用のための、上記組換え腫瘍溶解性ウイルス、本発明の核酸、本発明のベクター、および／または本発明の薬学的組成物を提供する。本発明は、がんの診断、防止および／または処置における使用のための、上記組換え腫瘍溶解性ウイルス、本発明の核酸、本発明のベクター、および／または本発明の薬学的組成物をさらに提供する。本発明はまた、腫瘍溶解性療法、特に、腫瘍溶解性ウイルス療法における使用のための、上記組換え腫瘍溶解性ウイルス、本発明の核酸、本発明のベクター、および／または本発明の薬学的組成物を提供する。用語「腫瘍溶解性ウイルス療法（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）」とは、本明細書で使用される場合、腫瘍溶解性ウイルス、これらをコードする核酸またはそれぞれのベクターを投与して、腫瘍退縮を誘導することによるがんの療法をいう。１つの実施形態において、上記組換え本発明の腫瘍溶解性ウイルス、本発明の核酸、本発明のベクター、および／または本発明の薬学的組成物は、以下のような他の療法：
細胞キャリアシステム、例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、例えば、腫瘍ワクチンもしくは免疫チェックポイントインヒビター、
養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞もしくは樹状細胞での）、ならびに／または
標準的な腫瘍療法、例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓形成、低分子インヒビター、
との組み合わせにおける使用のために提供される。
細胞キャリアシステム、例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、例えば、腫瘍ワクチンもしくは免疫チェックポイントインヒビター、
養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞もしくは樹状細胞での）、ならびに／または
標準的な腫瘍療法、例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓形成、低分子インヒビター、
との組み合わせにおける使用のために提供される。
【0059】
１つの実施形態において、必要性のある患者への組換え腫瘍溶解性ウイルス、核酸、ベクター、および／もしくは薬学的組成物の投与は、全身、静脈内、動脈内、腫瘍への注射を介するものである、ならびに／または皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、および硝子体内注射を介するものである。好ましい実施形態において、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む薬学的組成物は、投与、例えば、静脈内または腫瘍内投与のための液体組成物として製剤化される。このような組成物は、適切な間隔において（例えば、１～１５週間の期間にわたって１週間に１回）、必要性のある患者に投与される。
【0060】
本発明は、必要性のある被験体に、治療上有効な量の上記組換え腫瘍溶解性ウイルス、上記核酸または本発明のベクターまたは本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含する、がんの診断、防止および／または処置の方法をさらに提供する。本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルス、核酸またはベクターの治療上有効な量は、所望の治療結果、特に、腫瘍退縮を生じる量である。
【0061】
上記組換えウイルス、核酸、ベクターまたはそれらの薬学的組成物は、好ましくは、数日間から数週間までのような期間にわたって複数サイクルで投与される。１つの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、キャリアおよび／もしくは賦形剤（例えば、改善された安定性および腫瘍形質導入効率のための生理学的緩衝液、および／またはポリマーおよび／または脂質）を含む。
【0062】
本発明はまた、遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルス、核酸、ベクター、および／または薬学的組成物のインビトロおよび／またはエクスビボでの使用に関する。
【0063】
本発明のベクターは、ＶＳＶ Ｇ欠失ベクターへと挿入され、ＮＤＶ ＨＮ結合タンパク質と一緒に改変された高融合性Ｆタンパク質を含む。これらの２つの強力な腫瘍溶解性ベクターのハイブリッドを作製することによって、各ウイルスの役に立つ特徴が、各々の安全性の懸念を同時に排除しながら合わされる。得られるベクターは、ＶＳＶ骨格を有し、従って、野生型ＶＳＶの迅速な複製サイクルを維持する。さらに、ＮＤＶのＨＮおよび高融合性Ｆタンパク質の組み込みに起因して、上記組換えウイルスは、増強された合胞体形成を誘導し、上記ウイルスの効率的な腫瘍内での拡がりおよび強力な腫瘍細胞死滅機序および抗腫瘍免疫応答の誘導を可能にする。このストラテジーを使用すると、融合性ウイルスの利益は、ＮＤＶと関連した環境上の脅威なしに達成され得る。さらに、内因性ＶＳＶ糖タンパク質は欠失されていることから、上記ベクターと関連する神経毒性が存在しない。最後に、ＮＤＶは標的細胞にシアル酸残基（これは、腫瘍細胞上ではアップレギュレートされている）を介して結合することから、本発明は、偽型化ベクターで標的化しているさらなる形質導入腫瘍を達成する。具体的ウイルス改変は、ウイルスがより安全であることに加えて、ＶＳＶエンベロープタンパク質を、ＮＤＶのエンベロープタンパク質で置換することに起因して、非常に強力なウイルスを提供することを可能にする。ＮＤＶ Ｆタンパク質の変異したバージョンは、安全性に負の影響を与えることなしに、得られる組換えウイルスの効率をさらに改善するために導入されている。それに加えて、上記ベクターは、免疫チェックポイントの非常に効率的な阻害を可能にする非常に親和性のある（ａｆｆｉｎｅ）可溶性ＰＤ－１をさらに含む。
【0064】
糖タンパク質交換を有するベクターの利益は、三重である：
１． 内因性ＶＳＶ糖タンパク質と関連する神経向性は、ＶＳＶエンベロープの欠失および非神経向性のＮＤＶエンベロープタンパク質の導入によって避けられ得る；
２． 腫瘍細胞は、シアル酸残基（これは、ＮＤＶの天然のレセプターである）のアップレギュレーションを介して標的化され得る；および
３． ウイルスの拡がりおよび腫瘍細胞殺滅は、ＮＤＶ Ｆタンパク質の非常に融合性の変異バージョンの導入を介して顕著に増強され得る。
１． 内因性ＶＳＶ糖タンパク質と関連する神経向性は、ＶＳＶエンベロープの欠失および非神経向性のＮＤＶエンベロープタンパク質の導入によって避けられ得る；
２． 腫瘍細胞は、シアル酸残基（これは、ＮＤＶの天然のレセプターである）のアップレギュレーションを介して標的化され得る；および
３． ウイルスの拡がりおよび腫瘍細胞殺滅は、ＮＤＶ Ｆタンパク質の非常に融合性の変異バージョンの導入を介して顕著に増強され得る。
【0065】
本発明のウイルスは、他のベクターを超える改善された安全性および増強された効率を提供する。さらに、ｒＶＳＶ－ＮＤＶベクター骨格を使用することは、その高融合性の特徴、一般的な集団における既存の免疫の欠如、およびＶＳＶまたはＮＤＶと比較して減弱化が予測されないことに起因して、有利である。さらに、ｓＰＤ－１とＦｃとの融合の利点は、第１に、ｓＰＤ－１の安定性が増大されること、第２に、Ｆｃドメインが、複合体が免疫細胞上のＦｃレセプターと相互作用することを可能にし、これが免疫療法にさらに寄与することである。好ましくは、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、組換え腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。１つの実施形態において、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＷＯ ２０１７／１９８７７９において定義されるとおりであり、可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）、好ましくは高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）（例えば、配列番号３を有する高親和性ｓＰＤ－１改変体）をさらに含み、必要に応じてＦｃドメインをさらに含み、ここで上記選択肢的なＦｃドメインが好ましくは上記ｓＰＤ－１に融合される腫瘍溶解性ウイルスを含む。１つの実施形態において、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＷＯ ２０１７／１９８７７９において定義されるとおりであり、ｓＰＤ－１、好ましくは高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）（例えば、配列番号３を有する高親和性ｓＰＤ－１改変体）をさらに含み、上記ｓＰＤ－１に融合されるＦｃドメインをさらに含む腫瘍溶解性ウイルスを含む。１つの実施形態において、本発明のウイルスは、ＶＳＶのＮタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、およびＬタンパク質、ＮＤＶの改変されたＦタンパク質およびＨＮタンパク質、ならびにＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃ融合タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【0066】
用語「Ｆｃドメイン（Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）」とは、本明細書で使用される場合、細胞表面レセプター（例えば、Ｆｃレセプターおよび補体系のいくつかのタンパク質）と相互作用する抗体のテール領域である抗体のフラグメント結晶化可能領域をいう。１つの実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２－Ｆｃドメイン、ＩｇＧ３－Ｆｃドメイン、およびＩｇＧ４－Ｆｃドメインのうちのいずれかである。１つの実施形態において、「Ｆｃドメイン」および／または「Ｆｃドメインもしくはそのフラグメント」に言及する場合、その用語はまた、Ｆｃドメインの生物学的に機能的なフラグメント（例えば、ＦｃドメインのＣＨ３フラグメント）を含む。すなわち、その用語は、Ｆｃドメイン全体およびそのフラグメント（例えば、ＣＨ３フラグメント）を含む。Ｆｃドメインのフラグメントは、代表的には、Ｆｃドメインの生物学的に機能的なフラグメントである。すなわち、そのフラグメントは、細胞表面レセプターと相互作用する能力（例えば、Ｆｃレセプター）、および／または補体系の構成要素と相互作用する能力（例えば、ＣＨ３フラグメント）を有する。
【0067】
１つの実施形態において、本発明の組換えウイルスでの感染に対する患者の応答は、高度に炎症した腫瘍微少環境を誘導し、それによって、上記腫瘍を免疫チェックポイント阻害に感作させる。１つの実施形態において、用語「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、交換可能に使用され、好ましくは、哺乳動物患者、より好ましくはヒト患者に関する。
【0068】
１つの実施形態において、用語「可溶性ＰＤ－１（ｓｏｌｕｂｌｅ ＰＤ－１）」とは、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＰＤ－１）の可溶性形態に関する。ＰＤ－１は、免疫チェックポイント、すなわち、免疫系をダウンレギュレートすることによって免疫系の応答を調節し、Ｔ細胞炎症活性を抑制することによって自己寛容性を促進することにおいて役割を有するタンパク質である。ＰＤ－１は、２つのリガンド、すなわち、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を有し、これらは、Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－１は、代表的には、配列番号１に示されるとおりの配列を有する。ＰＤ－１は、細胞表面上にあるタンパク質であり、可溶性ＰＤ－１は、細胞から分泌され得るその可溶性形態である。可溶性ＰＤ－１は、代表的には、配列番号２に示されるとおりの配列を有する。１つの実施形態において、可溶性ＰＤ－１は、配列番号３の配列を有する高親和性ｓＰＤ－１である。１つの実施形態において、本発明のウイルスおよび／または本発明の薬学的組成物は、配列番号１～３のうちのいずれかを有する、好ましくは配列番号３を有するアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％またはこれより大きい（例えば、９９％）の配列同一性を有するｓＰＤ－１を含む。１つの実施形態において、本発明のウイルス、本発明の核酸、本発明のベクター、および／または本発明の薬学的組成物は、配列番号１～３のうちのいずれかを有する、好ましくは配列番号３を有するアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、配列番号６の配列を有する核酸）と少なくとも６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％またはこれより大きい（例えば、９９％）配列同一性を有するｓＰＤ－１を含む。遺伝コードのコドン縮重に起因して、核酸に言及する場合、同じアミノ酸配列をコードするが、代替のコドンを含む代替の核酸配列がまた、包含される。
【0069】
用語「融合される（ｆｕｓｅｄ）」および／または「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、ｓＰＤ－１およびＦｃの文脈において本明細書で使用される場合、別個のタンパク質を通常はコードする２またはこれより多くの遺伝子の結合を通じて作製されるタンパク質（例えば、ｓＰＤ－１およびＦｃ）の融合に関する。このような融合遺伝子（例えば、ｓＰＤ－１－Ｆｃ）の翻訳は、元のタンパク質の各々から得られる機能的特性を有する１つまたは多数のポリペプチドを生じる。タンパク質の融合は、代表的には、第１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に由来する停止コドンを除去し、次いで、第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列を、当業者に公知の方法（例えば、ライゲーションまたはオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ））を通じてインフレームで付加することを含む。その得られたＤＮＡ配列は、次いで、単一のタンパク質として細胞によって発現される。そのタンパク質は、両方の元のタンパク質の全配列、またはいずれかのタンパク質のみを含むように操作され得る。必要に応じて、リンカーが、融合タンパク質の構成要素間に含められ得る。１つの実施形態において、用語「融合生成物（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、２またはこれより多くの遺伝子を融合することによって作製される生成物（例えば、Ｆｃドメインをコードする、好ましくは配列番号７の配列を有する核酸を含む遺伝子、およびｓＰＤ－１をコードする、好ましくは配列番号６の配列を有する核酸を含む遺伝子を含む融合遺伝子、ならびに／あるいはこのような融合した遺伝子によってコードされる生成物）に関する。１つの実施形態において、ＨＡ－ｓＰＤ－１およびＦｃの例示的な融合生成物は、配列番号８の核酸配列および／または配列番号１３のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、ｓＰＤ－１（例えば、ＨＡ－ｓＰＤ－１）に融合され、これは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸およびｓＰＤ－１（例えば、ＨＡ－ｓＰＤ－１）をコードする核酸が使用されることを意味する。１つの実施形態において、ＮＤＶの融合（Ｆ）タンパク質の文脈において使用される場合、用語「融合タンパク質」は、一緒に結合されている２またはこれより多くのタンパク質に関連するのではなく、むしろ、その用語は、ウイルスエンベロープと細胞レセプターの融合を誘導するタンパク質に関する。
【0070】
用語「高親和性」とは、本明細書で使用される場合、改変されたタンパク質（例えば、ＨＡ－ｓＰＤ－１）のその結合パートナー（例えば、ＰＤ－Ｌ１）に対する、それぞれの野生型タンパク質（例えば、ｓＰＤ－１）のそれぞれの結合パートナーに対する親和性と比較して増大した親和性に関連する。１つの実施形態において、ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）の「高親和性」バージョンは、野生型ｓＰＤ－１と比較して、そのリガンドに対して増大した親和性（例えば、２倍増大した親和性）を有する。このような高親和性バージョンは、例えば、そのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２それぞれに結合するより高い親和性（例えば、４５倍および３０倍高い親和性）を生じるｓＰＤ－１のアミノ酸１３２での１個のアラニンからロイシンへの置換（Ａ１３２Ｌ）の同意入を介して生成されるか、または例えば、野生型ｓＰＤ－１と比較して、より高い親和性（例えば、ＰＤ－Ｌ１に対する４０，０００倍高い親和性）を生じる、位置４１においてイソロイシンまたはバリンをコードする高親和性コンセンサス改変体である。１つの実施形態において、高親和性ｓＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に関しては＜３．２μＭおよびＰＤ－Ｌ２に関しては＜０．１μＭのＫｄを有する。１つの実施形態において、変異は、好ましくは点変異である。
【0071】
配列番号１は、ヒトＰＤ－１のアミノ酸配列を表す。
配列番号２は、ヒトＰＤ－１（可溶性）のアミノ酸配列を表す。
配列番号３は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである例示的な高親和性ＰＤ－１（可溶性）のアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、アミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ－ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）のアミノ酸配列を表す。
配列番号５は、ＮＤＶのＨＮタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである例示的な高親和性ＰＤ－１（可溶性）をコードする核酸配列を表す。
配列番号７は、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ；ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒンジ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの核酸配列を表す。
配列番号８は、例示的な高親和性可溶性ＰＤ－１－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合遺伝子の核酸配列を表す。
配列番号９は、構築物ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを含む本発明の例示的なベクターの核酸配列を表す。
配列番号１０は、Ｎタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１は、Ｐタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２は、Ｍタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１４は、Ｌタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１５は、構築物ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃの核酸配列を表す。
配列番号１６は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１の全核酸配列を表し、ここで上記ｓＰＤ－１は、高親和性改変がない通常のｓＰＤ－１であり、ここで上記配列は、Ｆｃコード配列を含まない。
配列番号１７は、ＶＳＶインディアナの完全ゲノムを表す。
配列番号１８は、ＶＳＶインディアナＧタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１９は、ＮＤＶ ＨＮタンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２０は、ＮＤＶ Ｈｉｔｃｈｎｅｒ Ｂ１の完全ゲノムを表す。
配列番号２１は、ＮＤＶ Ｆ（改変されていない）タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２２は、ＮＤＶ Ｆ（改変されていない）タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号２３は、Ｌ２８９Ａを有するＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２４は、ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２５は、ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号２６は、ヒト可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）の核酸配列を表す。
配列番号２は、ヒトＰＤ－１（可溶性）のアミノ酸配列を表す。
配列番号３は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである例示的な高親和性ＰＤ－１（可溶性）のアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、アミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ－ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）のアミノ酸配列を表す。
配列番号５は、ＮＤＶのＨＮタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである例示的な高親和性ＰＤ－１（可溶性）をコードする核酸配列を表す。
配列番号７は、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ；ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒンジ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの核酸配列を表す。
配列番号８は、例示的な高親和性可溶性ＰＤ－１－ＩｇＧ１－Ｆｃ融合遺伝子の核酸配列を表す。
配列番号９は、構築物ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを含む本発明の例示的なベクターの核酸配列を表す。
配列番号１０は、Ｎタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１１は、Ｐタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１２は、Ｍタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１３は、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１４は、Ｌタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１５は、構築物ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃの核酸配列を表す。
配列番号１６は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１の全核酸配列を表し、ここで上記ｓＰＤ－１は、高親和性改変がない通常のｓＰＤ－１であり、ここで上記配列は、Ｆｃコード配列を含まない。
配列番号１７は、ＶＳＶインディアナの完全ゲノムを表す。
配列番号１８は、ＶＳＶインディアナＧタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号１９は、ＮＤＶ ＨＮタンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２０は、ＮＤＶ Ｈｉｔｃｈｎｅｒ Ｂ１の完全ゲノムを表す。
配列番号２１は、ＮＤＶ Ｆ（改変されていない）タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２２は、ＮＤＶ Ｆ（改変されていない）タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号２３は、Ｌ２８９Ａを有するＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２４は、ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質の核酸配列を表す。
配列番号２５は、ＮＤＶ Ｆ３ａａ－改変された融合タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号２６は、ヒト可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）の核酸配列を表す。
【図面の簡単な説明】
【0072】
本発明はここで、以下の図面を参照することによってさらに記載される。
【0073】
以下の図面の説明において言及される全ての方法は、実施例中に詳細に記載されるとおりに行われた。
【0074】
【0075】
【図2】図２は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ骨格（Ａ）および本発明のｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１構築物（Ｂ）を示す。Ａ）ＮＤＶの糖タンパク質を発現する組換え偽型化ＶＳＶ構築物（ＷＯ ２０１７／１９８７７９ Ａ１も参照のこと）。ＶＳＶの内因性糖タンパク質を、全長ＶＳＶゲノムをコードするプラスミドから欠失させた。ＮＤＶ糖タンパク質（改変された融合タンパク質（ＮＤＶ／Ｆ（Ｌ２８９Ａ））およびヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ／ＨＮ）を含む）を、ＶＳＶマトリクス（Ｍ）遺伝子とラージポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子との間に不連続転写ユニットとして挿入した。それぞれの偽型化ＶＳＶベクターを、確立された逆遺伝学システムを使用してレスキューした。Ｂ）本発明の構築物は、ヒトＩｇＧのＦｃドメインと融合された可溶性ヒトＰＤ－１遺伝子、好ましくは高親和性可溶性ヒトＰＤ－１遺伝子（ＨＡ－ｓＰＤ－１）を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインと融合された高親和性の可溶性ヒトＰＤ－１遺伝子（ＨＡ－ｓＰＤ－１）を、ＮＤＶ結合タンパク質（ＨＮ）とＶＳＶラージポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子との間のさらなる転写ユニットとしてクローニングした。その得られたウイルスゲノムを示す。
【0076】
【0077】
【0078】
【図5】図５は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃが、同系のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞を有する免疫能のあるマウスにおいて腫瘍増殖の遅れを引き起こすことを示す。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２．４×１０５ Ｂ１６－ＯＶＡ細胞を側腹部において皮下移植した。腫瘍移植後７日目、１０日目、および１３日目に、ＰＢＳまたは１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰもしくはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを、５０μｌ容積において腫瘍へと注射した。腫瘍サイズを毎日モニターし、式： ４／３×ＰＩ（）×（（Ｌ＋Ｗ）／４）３を使用して腫瘍容積を計算した。各処置の個々の腫瘍増殖曲線を示す。各曲線は、個々のマウスを表す。
【0079】
【図6】図６は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃの腫瘍内注射が、Ｂ１６－ＯＶＡを有するマウスの生存を顕著に長期化させることを示す。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２．４×１０５ Ｂ１６－ＯＶＡ細胞を側腹部において皮下移植した。腫瘍移植後７日目、１０日目、および１３日目に、ＰＢＳまたは１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰもしくはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを、５０μｌ容積において腫瘍へと注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍直径が１．５ｃｍに達したときにまたは皮膚が腫瘍増殖に起因して裂けた場合に、安楽死させた。処置後の生存時間を、カプラン－マイアー生存曲線としてプロットし、統計的有意性を、ログランク検定によって決定した。ＰＢＳに対するｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃのｐ値は＜０．０５。
【0080】
【0081】
【図8】図８は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体が、Ｂ１６黒色腫細胞において、コントロールｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰと比較して、類似の増殖動態および細胞傷害性効果を有することを示す。マウスＢ１６黒色腫細胞に、インビトロで、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰ、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１－Ｆｃ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、０．０１のＭＯＩで感染させた。上のパネル： 代表的顕微鏡写真を、感染後２４時間および４８時間において２００×倍率で得た。感染していないＢ１６細胞をコントロールとして供した。左下： 細胞傷害性を、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ（ＬＤＨ， Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して感染後の種々の時点で定量した。二連の実験の平均＋平均の標準誤差を示す。右下： 感染後の複数の時点で採取した上清のアリコートを、ウイルス増殖動態の分析のためにＴＣＩＤ５０分析に供した。三連で行った実験の平均＋平均の標準誤差を示す。
【0082】
【図9】図９は、組換えｓＰＤ１発現ＶＳＶ－ＮＤＶベクターがヒトＰＤ１を生成および分泌することを示す。Ｂ１６マウス黒色腫細胞に、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰまたは可溶性ヒトＰＤ１を発現するＶＳＶ－ＮＤＶの改変体（ＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１－Ｆｃ、またはＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ）を０．０１のＭＯＩで感染させたか、あるいはモック感染させた。左： 細胞溶解物および上清のアリコートを、感染後の種々の時点で集め、ヒトＰＤ１またはＧＡＰＤＨのためにウェスタンブロット分析に供した。右： 上清のアリコートを、２４時間で集め、放出されたヒトＰＤ１の定量のためにＥＬＩＳＡアッセイに供した。平均＋平均の標準誤差を示す。
【0083】
【図10A-10B】図１０は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃでの免疫能のある腫瘍を有するマウスの処置が、ＶＳＶ－ＮＤＶコントロールと比較して、腫瘍増殖の改善された制御および腫瘍特異的Ｔ細胞の富化を引き起こすことを示す。Ａ） 雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、対側の側腹部において同系Ｂ１６黒色腫細胞を皮下移植した。ＰＢＳ、１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、右側腹部の腫瘍へと注射した一方で、左側腹部の腫瘍は処置しないままであった。腫瘍容積を毎日モニターし、１５日目に血液を集めた。Ｂ）循環しているＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、血液から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色するためにＯＶＡ特異的テトラマーを使用するフローサイトメトリーによって定量した。個々のデータ点、平均、および平均の標準誤差を示す。Ｃ）腫瘍容積は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶおよびＰＢＳ群と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ群において有意に減少した。
【図10C-1】図１０は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃでの免疫能のある腫瘍を有するマウスの処置が、ＶＳＶ－ＮＤＶコントロールと比較して、腫瘍増殖の改善された制御および腫瘍特異的Ｔ細胞の富化を引き起こすことを示す。Ａ） 雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、対側の側腹部において同系Ｂ１６黒色腫細胞を皮下移植した。ＰＢＳ、１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、右側腹部の腫瘍へと注射した一方で、左側腹部の腫瘍は処置しないままであった。腫瘍容積を毎日モニターし、１５日目に血液を集めた。Ｂ）循環しているＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、血液から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色するためにＯＶＡ特異的テトラマーを使用するフローサイトメトリーによって定量した。個々のデータ点、平均、および平均の標準誤差を示す。Ｃ）腫瘍容積は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶおよびＰＢＳ群と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ群において有意に減少した。
【図10C-2】図１０は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃでの免疫能のある腫瘍を有するマウスの処置が、ＶＳＶ－ＮＤＶコントロールと比較して、腫瘍増殖の改善された制御および腫瘍特異的Ｔ細胞の富化を引き起こすことを示す。Ａ） 雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、対側の側腹部において同系Ｂ１６黒色腫細胞を皮下移植した。ＰＢＳ、１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、右側腹部の腫瘍へと注射した一方で、左側腹部の腫瘍は処置しないままであった。腫瘍容積を毎日モニターし、１５日目に血液を集めた。Ｂ）循環しているＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、血液から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色するためにＯＶＡ特異的テトラマーを使用するフローサイトメトリーによって定量した。個々のデータ点、平均、および平均の標準誤差を示す。Ｃ）腫瘍容積は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶおよびＰＢＳ群と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ群において有意に減少した。
【図10C-3】図１０は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃでの免疫能のある腫瘍を有するマウスの処置が、ＶＳＶ－ＮＤＶコントロールと比較して、腫瘍増殖の改善された制御および腫瘍特異的Ｔ細胞の富化を引き起こすことを示す。Ａ） 雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、対側の側腹部において同系Ｂ１６黒色腫細胞を皮下移植した。ＰＢＳ、１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、右側腹部の腫瘍へと注射した一方で、左側腹部の腫瘍は処置しないままであった。腫瘍容積を毎日モニターし、１５日目に血液を集めた。Ｂ）循環しているＯＶＡ特異的Ｔ細胞を、血液から得た末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を染色するためにＯＶＡ特異的テトラマーを使用するフローサイトメトリーによって定量した。個々のデータ点、平均、および平均の標準誤差を示す。Ｃ）腫瘍容積は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶおよびＰＢＳ群と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ群において有意に減少した。
【0084】
以下において、実施例が言及される。実施例は、例証のために示され、本発明を限定するために示されるのではない。
【実施例】
【0085】
実施例１： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ウイルスの調製
ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ウイルスを操作するために、ＰＤ－１のシグナル伝達ドメインおよび細胞外ドメインを、先ず、ＲＴ－ＰＣＲによってヒトＰＢＭＣから増幅した。その生成したＲＴ－ＰＣＲ生成物を、オーバーラッピングＰＣＲのラウンドのためにテンプレートとして供して、高親和性のためにＡ１３２Ｌ変異を導入し、これによって、変異した塩基対を含む２つのオーバーラッピングＰＣＲフラグメントが生成された。これらのフラグメントをアニールし、最終伸長工程に供して、全長ＨＡ－ｓＰＤ－１遺伝子を生成した。ＨＡ－ｓＰＤ－１フラグメントを、ＨＡ ｓＰＤ－１とヒトＦｃフラグメントとの融合遺伝子を作製するために、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ１へとクローニングした。ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃ構築物をｒＶＳＶ－ＮＤＶへと挿入するために、適切な制限部位を、正方向および逆方向オリゴヌクレオチドを使用して導入し、ＰＣＲによって増幅した。最後に、挿入物を、ＮＤＶ－ＨＮ遺伝子とＶＳＶ－Ｌ遺伝子との間のマルチクローニング部位を介してさらなる転写ユニットとして全長ＶＳＶ－ＮＤＶゲノムへとライゲーションした。そのウイルス構築物を、図２Ｂに示す。その相当する感染性組換えウイルスを、逆遺伝学の確立された方法を使用してレスキューした。
ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ウイルスを操作するために、ＰＤ－１のシグナル伝達ドメインおよび細胞外ドメインを、先ず、ＲＴ－ＰＣＲによってヒトＰＢＭＣから増幅した。その生成したＲＴ－ＰＣＲ生成物を、オーバーラッピングＰＣＲのラウンドのためにテンプレートとして供して、高親和性のためにＡ１３２Ｌ変異を導入し、これによって、変異した塩基対を含む２つのオーバーラッピングＰＣＲフラグメントが生成された。これらのフラグメントをアニールし、最終伸長工程に供して、全長ＨＡ－ｓＰＤ－１遺伝子を生成した。ＨＡ－ｓＰＤ－１フラグメントを、ＨＡ ｓＰＤ－１とヒトＦｃフラグメントとの融合遺伝子を作製するために、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ１へとクローニングした。ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃ構築物をｒＶＳＶ－ＮＤＶへと挿入するために、適切な制限部位を、正方向および逆方向オリゴヌクレオチドを使用して導入し、ＰＣＲによって増幅した。最後に、挿入物を、ＮＤＶ－ＨＮ遺伝子とＶＳＶ－Ｌ遺伝子との間のマルチクローニング部位を介してさらなる転写ユニットとして全長ＶＳＶ－ＮＤＶゲノムへとライゲーションした。そのウイルス構築物を、図２Ｂに示す。その相当する感染性組換えウイルスを、逆遺伝学の確立された方法を使用してレスキューした。
【0086】
実施例２： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ウイルスの特徴付け
上記組換えＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃウイルスの特徴付けを、マウス黒色腫細胞株Ｂ１６－ＯＶＡにおいて行った。上記ウイルスの増殖動態を親ｒＶＳＶ－ＮＤＶウイルスと比較したところ、わずかな減弱が導入遺伝子の発現に原因があることが明らかにされ、複製のピークは、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染後約４８時間に達した（図３）。これらの知見と一致して、同じ細胞における細胞傷害性アッセイは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃでの感染による腫瘍細胞殺滅のわずかな遅れ、しかし、感染後７２時間程度での細胞単層のほぼ完全な殺滅を明らかにした（図４）。よって、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃウイルスは、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃなしのウイルスと比較して、感染後７２時間後に増強した効率を提供する。
上記組換えＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃウイルスの特徴付けを、マウス黒色腫細胞株Ｂ１６－ＯＶＡにおいて行った。上記ウイルスの増殖動態を親ｒＶＳＶ－ＮＤＶウイルスと比較したところ、わずかな減弱が導入遺伝子の発現に原因があることが明らかにされ、複製のピークは、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染後約４８時間に達した（図３）。これらの知見と一致して、同じ細胞における細胞傷害性アッセイは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃでの感染による腫瘍細胞殺滅のわずかな遅れ、しかし、感染後７２時間程度での細胞単層のほぼ完全な殺滅を明らかにした（図４）。よって、ＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃウイルスは、ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃなしのウイルスと比較して、感染後７２時間後に増強した効率を提供する。
【0087】
実施例３： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ－１ウイルスのインビボでの抗がん効果
インビボでの有効性を決定するために、実験を、皮下Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を側腹部に有する免疫能のあるＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行った。腫瘍移植後７日目、１０日目および１３日目に、ＰＢＳまたは１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰまたはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを、５０μｌ容積において腫瘍へと注射した。腫瘍を毎日測定し、腫瘍容積を、以下の式： Ｖ＝４／３＊ＰＩ（）＊（（Ｌ＋Ｗ）／４）３を使用して計算した。データは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰで処置したそれらマウスにおける腫瘍増殖の顕著な遅れを明らかにし、これは、ＰＢＳと比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを受容するマウスにおいてさらにより顕著であった（図５）。
インビボでの有効性を決定するために、実験を、皮下Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を側腹部に有する免疫能のあるＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行った。腫瘍移植後７日目、１０日目および１３日目に、ＰＢＳまたは１０７ ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰまたはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを、５０μｌ容積において腫瘍へと注射した。腫瘍を毎日測定し、腫瘍容積を、以下の式： Ｖ＝４／３＊ＰＩ（）＊（（Ｌ＋Ｗ）／４）３を使用して計算した。データは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰで処置したそれらマウスにおける腫瘍増殖の顕著な遅れを明らかにし、これは、ＰＢＳと比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃを受容するマウスにおいてさらにより顕著であった（図５）。
【0088】
実施例４： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃで処置したマウスの生存の増大
生存試験において、マウスを、腫瘍が直径１．５ｃｍに達したときまたは腫瘍増殖によって皮膚が裂けた場合に、人道的なエンドポイントにおいて安楽死させた。第１の処置用量に関する生存時間をプロットしたところ、ＰＢＳと比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃで処置したマウスの顕著な生存長期化が明らかになり、メジアン生存時間は、それぞれ、１４日に対して２６日であった（図６）。薄い灰色の線は、ＰＢＳでの処置後の生存時間を表す；中間の灰色は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰ処置のものを表す；黒は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃ処置のものを表す。データは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃでの処置が、腫瘍増殖の実質的な遅れを生じ、緩衝液または親ｒＶＳＶ－ＮＤＶウイルスでの処置と比較して、生存の長期化を生じたことを示す。
生存試験において、マウスを、腫瘍が直径１．５ｃｍに達したときまたは腫瘍増殖によって皮膚が裂けた場合に、人道的なエンドポイントにおいて安楽死させた。第１の処置用量に関する生存時間をプロットしたところ、ＰＢＳと比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃで処置したマウスの顕著な生存長期化が明らかになり、メジアン生存時間は、それぞれ、１４日に対して２６日であった（図６）。薄い灰色の線は、ＰＢＳでの処置後の生存時間を表す；中間の灰色は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰ処置のものを表す；黒は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃ処置のものを表す。データは、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ－１－Ｆｃでの処置が、腫瘍増殖の実質的な遅れを生じ、緩衝液または親ｒＶＳＶ－ＮＤＶウイルスでの処置と比較して、生存の長期化を生じたことを示す。
【0089】
実施例５： 可溶性ＰＤ１（ｓＰＤ１）をコードする組換えＶＳＶ－ＮＤＶベクター
ヒトＦｃフラグメントあり（ｓＰＤ１－Ｆｃ）またはなし（ｓＰＤ１）、および高親和性変異（ＨＡ－ｓＰＤ１）ありまたはなしのいずれかで、可溶性ＰＤ１をコードするＶＳＶ－ＮＤＶ組換えベクターのパネルを操作し、確立された逆遺伝学システムによってレスキューした（図７）。これらのｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体は、コントロールｒＶＳＶ－ＮＤＶベクターとの比較においてインビトロで完全に特徴づけられており、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃベクターを、マウス黒色腫の免疫能のあるモデルにおいてインビトロでのさらなる特徴付けのために選択した。
ヒトＦｃフラグメントあり（ｓＰＤ１－Ｆｃ）またはなし（ｓＰＤ１）、および高親和性変異（ＨＡ－ｓＰＤ１）ありまたはなしのいずれかで、可溶性ＰＤ１をコードするＶＳＶ－ＮＤＶ組換えベクターのパネルを操作し、確立された逆遺伝学システムによってレスキューした（図７）。これらのｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体は、コントロールｒＶＳＶ－ＮＤＶベクターとの比較においてインビトロで完全に特徴づけられており、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃベクターを、マウス黒色腫の免疫能のあるモデルにおいてインビトロでのさらなる特徴付けのために選択した。
【0090】
実施例６： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体は、Ｂ１６マウス黒色腫細胞において十分に複製し、細胞傷害性を引き起こす
ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体のパネルをインビトロで特徴づけるために、Ｂ１６マウス黒色腫細胞株を、代表として選択した。Ｂ１６細胞に、種々のｓＰＤ１改変体またはＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰコントロールウイルスを０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。細胞を、細胞傷害性効果を可視化するために、感染後の種々の時点で顕微鏡検査した。さらに、上清のサンプルを、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイによる細胞生存性の分析および組織培養物感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイによるウイルス複製の定量のために集めた。これらのデータは、ｓＰＤ１改変体の間での、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶとの比較において、ウイルス複製または腫瘍細胞殺滅動態の実質的変化を明らかにしなかった（図８）。
ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体のパネルをインビトロで特徴づけるために、Ｂ１６マウス黒色腫細胞株を、代表として選択した。Ｂ１６細胞に、種々のｓＰＤ１改変体またはＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰコントロールウイルスを０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。細胞を、細胞傷害性効果を可視化するために、感染後の種々の時点で顕微鏡検査した。さらに、上清のサンプルを、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイによる細胞生存性の分析および組織培養物感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）アッセイによるウイルス複製の定量のために集めた。これらのデータは、ｓＰＤ１改変体の間での、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶとの比較において、ウイルス複製または腫瘍細胞殺滅動態の実質的変化を明らかにしなかった（図８）。
【0091】
実施例７： ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ｓＰＤ１改変体は、可溶性ヒトＰＤ１をインビトロで生成および放出する
上記組換え構築物が可溶性ヒトＰＤ１を生成および放出することを確認するために、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを行った。Ｂ１６細胞に、ｓＰＤ１発現ＶＳＶ－ＮＤＶ構築物またはコントロールＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰを０．０１のＭＯＩで感染させたか、または感染させないままにし、溶解物および上清を感染後の種々の時点で集め、ｓＰＤ１のためにウェスタンブロット分析に供した。さらに、ＧＡＰＤＨを分析して、タンパク質装填のためのコントロールにした。予測されるように、ｓＰＤ１ウイルス感染サンプルは、予測されるサイズのバンドを生成した一方で、ｓＰＤ１－Ｆｃ融合タンパク質を発現するウイルスは、ｓＰＤ１およびＦｃフラグメントの付加的サイズに相当するサイズにおいて実質的なシフトを有した（図９，左パネル）。２４時間で集めた上清のさらなるサンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイに供して、上清に分泌されるＰＤ１の量を定量した。予測されるように、ｓＰＤ１を発現するＶＳＶ－ＮＤＶに感染した細胞からのサンプルのみが、ＰＤ１の検出可能なレベルを生成した一方で、Ｆｃフラグメントと融合したｓＰＤ１（ｓＰＤ１－Ｆｃ）を発現するものは、Ｆｃフラグメントなしのものよりさらに高いレベルを有した。これは、Ｆｃフラグメントの存在が、細胞外ｓＰＤ１を安定化するという仮説を裏付ける（図９， 右パネル）。
上記組換え構築物が可溶性ヒトＰＤ１を生成および放出することを確認するために、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを行った。Ｂ１６細胞に、ｓＰＤ１発現ＶＳＶ－ＮＤＶ構築物またはコントロールＶＳＶ－ＮＤＶ－ＧＦＰを０．０１のＭＯＩで感染させたか、または感染させないままにし、溶解物および上清を感染後の種々の時点で集め、ｓＰＤ１のためにウェスタンブロット分析に供した。さらに、ＧＡＰＤＨを分析して、タンパク質装填のためのコントロールにした。予測されるように、ｓＰＤ１ウイルス感染サンプルは、予測されるサイズのバンドを生成した一方で、ｓＰＤ１－Ｆｃ融合タンパク質を発現するウイルスは、ｓＰＤ１およびＦｃフラグメントの付加的サイズに相当するサイズにおいて実質的なシフトを有した（図９，左パネル）。２４時間で集めた上清のさらなるサンプルを、ＥＬＩＳＡアッセイに供して、上清に分泌されるＰＤ１の量を定量した。予測されるように、ｓＰＤ１を発現するＶＳＶ－ＮＤＶに感染した細胞からのサンプルのみが、ＰＤ１の検出可能なレベルを生成した一方で、Ｆｃフラグメントと融合したｓＰＤ１（ｓＰＤ１－Ｆｃ）を発現するものは、Ｆｃフラグメントなしのものよりさらに高いレベルを有した。これは、Ｆｃフラグメントの存在が、細胞外ｓＰＤ１を安定化するという仮説を裏付ける（図９， 右パネル）。
【0092】
実施例８： 同系マウス黒色腫のインビボｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ処置が、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の増強および腫瘍増殖の遅れを生じる
ｓＰＤ１のＶＳＶ－ＮＤＶ媒介性発現のインビボ分析のために、本発明者らは、ＨＡ変異を介する高親和性結合およびｓＰＤ１とＦｃフラグメントとの融合によって与えられる血中での安定性という潜在的な利益に起因して、ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ改変体に焦点を当てた。本発明者らは、Ｂ１６黒色腫の皮下モデルを利用した。ここで腫瘍は、対側の側腹部に移植され、ＰＢＳ、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、１０７ ＴＣＩＤ５０の用量において、腫瘍移植後の７日目、１０日目、および１３日目に、右側腹部にある病変へと腫瘍内に注射した（図１０Ａ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、１５日目に集めた血液から単離し、Ｂ１６細胞によって発現されるモデル抗原（オボアルブミン）に対して特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析に供した。ＶＳＶ－ＮＤＶ処置は、ＰＢＳと比較して、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞において統計的に有意な増大を生じたが、この効果は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃで処置したマウスにおいてさらになお増大した（図１０Ｂ）。さらに、注射したおよび対側の注射していない病変の両方における腫瘍増殖の分析は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ処置またはＰＢＳ処置と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ処置動物における増殖の遅れを明らかにした（図１０Ｃ）。これらの結果は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃが、Ｔ細胞活性化の増強を可能にし、免疫媒介性アブスコパル効果をもたらすことを示す。
ｓＰＤ１のＶＳＶ－ＮＤＶ媒介性発現のインビボ分析のために、本発明者らは、ＨＡ変異を介する高親和性結合およびｓＰＤ１とＦｃフラグメントとの融合によって与えられる血中での安定性という潜在的な利益に起因して、ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ改変体に焦点を当てた。本発明者らは、Ｂ１６黒色腫の皮下モデルを利用した。ここで腫瘍は、対側の側腹部に移植され、ＰＢＳ、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ、またはｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃを、１０７ ＴＣＩＤ５０の用量において、腫瘍移植後の７日目、１０日目、および１３日目に、右側腹部にある病変へと腫瘍内に注射した（図１０Ａ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、１５日目に集めた血液から単離し、Ｂ１６細胞によって発現されるモデル抗原（オボアルブミン）に対して特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析に供した。ＶＳＶ－ＮＤＶ処置は、ＰＢＳと比較して、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞において統計的に有意な増大を生じたが、この効果は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃで処置したマウスにおいてさらになお増大した（図１０Ｂ）。さらに、注射したおよび対側の注射していない病変の両方における腫瘍増殖の分析は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ処置またはＰＢＳ処置と比較して、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃ処置動物における増殖の遅れを明らかにした（図１０Ｃ）。これらの結果は、ｒＶＳＶ－ＮＤＶ－ＨＡ－ｓＰＤ１－Ｆｃが、Ｔ細胞活性化の増強を可能にし、免疫媒介性アブスコパル効果をもたらすことを示す。
【0093】
参考文献
[1] Bartee MY, Dunlap KM, Bartee E. Tumor-Localized Secretion of Soluble PD1 Enhances Oncolytic Virotherapy. Cancer Res. 2017;77(11):2952-63.
[2] Lazar-Molnar E, Scandiuzzi L, Basu I, Quinn T, Sylvestre E, Palmieri E, et al. Structure-guided development of a high-affinity human Programmed Cell Death-1: Implications for tumor immunotherapy. EBioMedicine. 2017;17:30-44.
[3] Maute RL, Gordon SR, Mayer AT, McCracken MN, Natarajan A, et al. PD-1 variants for immunotherapy and PET imaging. PNAS. Nov 2015, 112 (47) E6506-E6514; DOI: 10.1073/pnas.1519623112.
[4] Altomonte, J., S. Marozin, et al. (2010). "Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma." Mol Ther 18(2): 275-284.
[5] Malini Guha, The Pharmaceutical Journal (2014).
[1] Bartee MY, Dunlap KM, Bartee E. Tumor-Localized Secretion of Soluble PD1 Enhances Oncolytic Virotherapy. Cancer Res. 2017;77(11):2952-63.
[2] Lazar-Molnar E, Scandiuzzi L, Basu I, Quinn T, Sylvestre E, Palmieri E, et al. Structure-guided development of a high-affinity human Programmed Cell Death-1: Implications for tumor immunotherapy. EBioMedicine. 2017;17:30-44.
[3] Maute RL, Gordon SR, Mayer AT, McCracken MN, Natarajan A, et al. PD-1 variants for immunotherapy and PET imaging. PNAS. Nov 2015, 112 (47) E6506-E6514; DOI: 10.1073/pnas.1519623112.
[4] Altomonte, J., S. Marozin, et al. (2010). "Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma." Mol Ther 18(2): 275-284.
[5] Malini Guha, The Pharmaceutical Journal (2014).
【0094】
本明細書、特許請求の範囲、および／または添付の図面に開示される本発明の特徴は、別個に、およびこれらの任意の組み合わせの両方において、それらの種々の形態において本発明を実現するために必須であり得る。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-10B】
【図10C-1】
【図10C-2】
【図10C-3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、前記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項2】
前記組換えウイルスは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４のＦｃドメイン、またはそのフラグメントをさらに含む、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項3】
前記Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、前記ｓＰＤ－１に融合される、請求項１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項4】
前記ｓＰＤ－１は、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）であり、好ましくは、そのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対して、それぞれ、前記リガンドに対する野生型ｓＰＤ－１の親和性より少なくとも２倍高い（例えば、４５倍高いおよび３０倍高い）親和性を有する、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に関して＜３．２μＭおよび／もしくはＰＤ－Ｌ２に関して＜０．１μＭのＫｄで親和性を有する、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項5】
前記ｓＰＤ－１は、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異を含む、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項6】
前記ｓＰＤ－１は、配列番号３の配列を有するＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである、前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項7】
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５の配列を有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である、および／またはプロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換、およびより好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
前記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する前記改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される、
前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項8】
前述の請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸。
【請求項9】
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸であって、前記核酸は、好ましくは配列番号７の配列を有し、前記ｓＰＤ－１をコードする核酸に融合される、好ましくは、配列番号６の配列を有するＦｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸を含み、ここで好ましくはその融合生成物は、配列番号８の核酸配列を有する、請求項８に記載の核酸。
【請求項10】
請求項８または９に記載の核酸を含み、好ましくは配列番号９の配列を有するベクターであって、必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクター。
【請求項11】
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
請求項８～９のいずれかに記載の核酸または請求項１０に記載のベクター。
【請求項12】
薬学的組成物であって、（ｉ）請求項１～７のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸、または請求項１０～１１のいずれかに記載のベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物：
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞療法システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物。
【請求項13】
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のため
に製剤化されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
医療における使用のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸を含む組成物、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクターを含む組成物、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項15】
がんの防止および／または処置、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択されるがんの防止および／または処置における使用のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸を含む組成物、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクターを含む組成物、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項16】
遺伝子送達ツールとしての使用のための、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化のための、および／または腫瘍検出のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、請求項８～９および１１のいずれかに記載の核酸を含む組成物、請求項１０～１１のいずれかに記載のベクターを含む組成物、または請求項１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物の使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0094】
本明細書、特許請求の範囲、および／または添付の図面に開示される本発明の特徴は、
別個に、およびこれらの任意の組み合わせの両方において、それらの種々の形態において本発明を実現するために必須であり得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスは、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、前記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目２）
前記組換えウイルスは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４のＦｃドメイン、またはそのフラグメントをさらに含む、項目１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目３）
前記Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、前記ｓＰＤ－１に融合される、項目１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目４）
前記ｓＰＤ－１は、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）であり、好ましくは、そのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対して、それぞれ、前記リガンドに対する野生型ｓＰＤ－１の親和性より少なくとも２倍高い（例えば、４５倍高いおよび３０倍高い）親和性を有する、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に関して＜３．２μＭおよび／もしくはＰＤ－Ｌ２に関して＜０．１μＭのＫ ｄ で親和性を有する、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目５）
前記ｓＰＤ－１は、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異を含む、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目６）
前記ｓＰＤ－１は、配列番号３の配列を有するＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目７）
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５の配列を有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である、および／またはプロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換、およびより好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
前記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する前記改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される、
前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目８）
前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸。
（項目９）
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸であって、前記核酸は、好ましくは配列番号７の配列を有し、前記ｓＰＤ－１をコードする核酸に融合される、好ましくは、配列番号６の配列を有するＦｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸を含み、ここで好ましくはその融合生成物は、配列番号８の核酸配列を有する、項目８に記載の核酸。
（項目１０）
項目８または９に記載の核酸を含み、好ましくは配列番号９の配列を有するベクターであって、
必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクター。
（項目１１）
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
項目８～９のいずれかに記載の核酸または項目１０に記載のベクター。
（項目１２）
薬学的組成物であって、
（ｉ）項目１～７のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、または項目１０～１１のいずれかに記載のベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物：
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞療法システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物。
（項目１３）
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または
皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のため
に製剤化されている、項目１２に記載の薬学的組成物。
（項目１４）
医療における使用のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目１５）
がんの防止および／または処置、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択されるがんの防止および／または処置における使用のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目１６）
遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物の使用。
別個に、およびこれらの任意の組み合わせの両方において、それらの種々の形態において本発明を実現するために必須であり得る。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
組換え腫瘍溶解性ウイルスであって、前記ウイルスは、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、
を含み、ここでＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は欠失され、前記ウイルスは、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）および
ＮＤＶのヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、
を含み、
可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）
をさらに含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目２）
前記組換えウイルスは、Ｆｃドメインまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４のＦｃドメイン、またはそのフラグメントをさらに含む、項目１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目３）
前記Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、前記ｓＰＤ－１に融合される、項目１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目４）
前記ｓＰＤ－１は、高親和性ｓＰＤ－１（ＨＡ－ｓＰＤ－１）であり、好ましくは、そのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対して、それぞれ、前記リガンドに対する野生型ｓＰＤ－１の親和性より少なくとも２倍高い（例えば、４５倍高いおよび３０倍高い）親和性を有する、ならびに／またはＰＤ－Ｌ１に関して＜３．２μＭおよび／もしくはＰＤ－Ｌ２に関して＜０．１μＭのＫ ｄ で親和性を有する、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目５）
前記ｓＰＤ－１は、配列番号２の１３２および４１から選択される位置における変異、好ましくはＡ１３２Ｌ、Ｌ４１Ｉ、およびＬ４１Ｖから選択される変異を含む、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目６）
前記ｓＰＤ－１は、配列番号３の配列を有するＨＡ－ｓＰＤ－１－Ａ１３２Ｌである、前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目７）
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号２５の配列を有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である、および／またはプロテアーゼ切断部位において、好ましくは配列番号２５の位置Ｌ２８９において少なくとも１個のアミノ酸置換、およびより好ましくはＬ２８９Ａを含む；ならびに／あるいは
前記ＮＤＶの改変された融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号４を有するアミノ酸置換Ｌ２８９Ａを有するＦ３ａａ改変Ｆタンパク質である；ならびに／あるいは
前記ＶＳＶのＧタンパク質は、配列番号４の配列を有する前記改変された融合タンパク質および配列番号５の配列を有するＮＤＶのＨＮタンパク質によって置換される、
前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
（項目８）
前述の項目のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスをコードする核酸。
（項目９）
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸であって、前記核酸は、好ましくは配列番号７の配列を有し、前記ｓＰＤ－１をコードする核酸に融合される、好ましくは、配列番号６の配列を有するＦｃドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸を含み、ここで好ましくはその融合生成物は、配列番号８の核酸配列を有する、項目８に記載の核酸。
（項目１０）
項目８または９に記載の核酸を含み、好ましくは配列番号９の配列を有するベクターであって、
必要に応じて、
－ 以下のうちのいずれかのようなレポーター遺伝子
ＨＳＶ１－ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチンレセプター２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、およびチロシナーゼ；
－ 以下のうちのいずれかのような腫瘍細胞および／もしくは腫瘍組織に送達されるべき遺伝子
免疫刺激遺伝子（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、ＩＬ－１２、もしくはＩＬ－１５；
免疫チェックポイント阻害抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、またはＢ７－Ｈ３）；および／または
ワクチン接種用の（標的にされる前記腫瘍に特異的な）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）；あるいは
－ これらの組み合わせ、
のうちのいずれかをさらに含むベクター。
（項目１１）
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列、または
配列番号９もしくは１５のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかもしくはからなるか、または
配列番号１６のヌクレオチド配列、または
配列番号１６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含むかもしくはからなる、
項目８～９のいずれかに記載の核酸または項目１０に記載のベクター。
（項目１２）
薬学的組成物であって、
（ｉ）項目１～７のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、または項目１０～１１のいずれかに記載のベクター；および
（ｉｉ）必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、以下のようなさらなる薬物：
化学療法剤、
放射性治療剤、
腫瘍ワクチン、
免疫チェックポイントインヒビター（例えば、抗ＣＴＬＡ４）、
養子細胞療法システム（例えば、Ｔ細胞または樹状細胞）、
細胞キャリアシステム、
低分子インヒビター、
塞栓因子、
遮蔽ポリマー、
を含む、薬学的組成物。
（項目１３）
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、および動脈内投与のうちのいずれかのため、ならびに／または
皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、脳内、脳室内、もしくは硝子体内注射のため
に製剤化されている、項目１２に記載の薬学的組成物。
（項目１４）
医療における使用のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目１５）
がんの防止および／または処置、例えば、肝細胞癌、膵臓がん、および黒色腫から選択されるがんの防止および／または処置における使用のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目１６）
遺伝子送達ツール、ウイルス生体分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための、項目１～７のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、項目８～９および１１のいずれかに記載の核酸、項目１０～１１のいずれかに記載のベクター、または項目１２～１３のいずれかに記載の薬学的組成物の使用。
【国際調査報告】