知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2023-547692細胞製剤、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用、及び造血幹細胞を判定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-13
(54)【発明の名称】細胞製剤、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用、及び造血幹細胞を判定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20231106BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231106BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20231106BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20231106BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231106BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 D
G01N33/543 541A
G01N33/543 575
A61K35/28
A61P7/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023527448
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-06-21
(86)【国際出願番号】 CN2021121702
(87)【国際公開番号】W WO2022095642
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】202011208703.5
(32)【優先日】2020-11-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522242362
【氏名又は名称】▲広▼州▲輯▼因医▲療▼科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＥＤＩＧＥＮＥ （ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ） ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １０， Ｎｏ．６， Ｎａｎｊｉａｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｒｏａｄ， Ｚｈｕｊｉａｎｇ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｎｓｈａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１００００， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】方 日国
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ 奎▲瑩▼
(72)【発明者】
【氏名】李 超
(72)【発明者】
【氏名】袁 ▲鵬▼▲飛▼
【テーマコード（参考）】
2G045
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA36
2G045FB03
2G045FB12
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZA51
(57)【要約】
本発明は、細胞製剤、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用、及び造血幹細胞を判定するための方法を提供する。前記細胞製剤は、選別対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞である。本発明の前記タンパク質を用いて造血幹細胞を特徴付けることにより、目的細胞をインビトロでより正確に標識、評価することができるだけでなく、造血幹細胞移植を受けた後の造血系再構築能を長期的に維持する患者の能力を向上させ、より良い治療効果を達成することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上と、を含む使用。
【請求項2】
前記タンパク質は、（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅと、を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出することと、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出することと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出することと、
被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質陽性であるか否かを検出することと、を含み、
被検細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定する、造血幹細胞を判定するための方法。
【請求項4】
前記被検細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、造血幹細胞をスクリーニングする方法。
【請求項7】
前記分離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
選別対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を含む、細胞製剤。
【請求項10】
前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項９に記載の細胞製剤。
【請求項11】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項９又は１０に記載の細胞製剤。
【請求項12】
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、細胞製剤を調製する方法。
【請求項13】
前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
造血系再構築能を向上させるための薬物であって、請求項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を含む、薬物。
【請求項16】
被験者の造血系を再構築する方法であって、請求項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を被験者に投与することを含む、方法。
【請求項17】
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含む、造血幹細胞を検出するキット又は製品。
【請求項18】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項１７に記載のキット又は製品。
【請求項19】
前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項１７又は１８に記載のキット又は製品。
【請求項20】
前記化合物は抗体である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のキット又は製品。
【請求項21】
前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、請求項２０に記載のキット又は製品。
【請求項22】
前記抗体は磁気ビーズに付着される抗体である、請求項２０に記載のキット又は製品。
【請求項23】
選別又は富化対象の細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別又は富化するための化合物を含む、造血幹細胞を選別又は富化するキット又は製品。
【請求項24】
前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、請求項２３に記載のキット又は製品。
【請求項25】
前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、請求項２３又は２４に記載のキット又は製品。
【請求項26】
前記化合物は抗体である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載のキット又は製品。
【請求項27】
前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、請求項２６に記載のキット又は製品。
【請求項28】
前記抗体は磁気ビーズに付着される抗体である、請求項２６に記載のキット又は製品。
【請求項29】
スクリーニング対象培地を用いて造血幹細胞を培養した後、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性であることにより特徴付けられる造血幹細胞の割合の維持又は上昇下降を検出することを含む造血幹細胞用培地をスクリーニングする方法であって、上記のように特徴付けられた造血幹細胞の培養後の割合が維持又は上昇していると、スクリーニング対象培地は適切な造血幹細胞用培地であることを示す、方法。
【請求項30】
請求項２９に記載の方法によりスクリーニングされた造血幹細胞用培地。
【請求項31】
請求項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の有効量を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの技術分野に関し、特に、細胞製剤、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用、及び造血幹細胞を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
造血幹細胞（ＨＳＣｓ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は骨髄と血液に存在し自己複製能を有し、すべてのタイプの血液細胞に多方向に分化する幹細胞である。造血系において、造血幹細胞はすべての細胞の分化のもとであり、多能性及び自己複製能を有する。造血幹細胞には、長期（ＬＴ：Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ）と短期（ＳＴ：Ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ）の２種類があり、ＬＴ－ＨＳＣは数が少なく、主に静止状態を維持し、主に造血系の長期再構築能を担当する。ＳＴ－ＨＳＣは強い増殖能を持ち、さらに造血前駆細胞（ＨＰＣｓ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）に分化できる。これらの前駆細胞は造血系の系統分化能を部分的に保持し、さらに成熟したリンパ細胞、骨髄系細胞、赤血球などにコミットして分化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）することができる。
【0003】
最近４０年来、造血系に対する理解が深くなるに伴い、造血幹細胞はますます多く臨床に応用され、血液疾患や免疫不全症などに対して細胞治療と遺伝子治療を行っている。細胞由来により、ＨＳＣは臍帯血（ＣＢ：Ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、動員末梢血（ｍＰＢ：Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）、及び骨髄（ＢＭ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）ＨＳＣに分けられる。現在の造血幹細胞移植の適応症は以下を含む。
（１）血液系悪性腫瘍、例えば、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄線維化及び骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性マクログロブリン血症、形質細胞白血病、形質芽球性リンパ腫、有毛細胞白血病、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍及びその他の血液系悪性腫瘍。
（２）血液系非悪性腫瘍、例えば、再生不良性貧血、ファンコニー貧血、地中海貧血、鎌状赤血球貧血症、骨髄線維化、重度の発作性夜間ヘモグロビン尿症、無巨核球性血小板減少症及びその他の血液系非悪性腫瘍。
（３）固形腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、精巣癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、生殖細胞腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、ウェルムス腫瘍、骨肉腫、髄芽細胞腫、悪性脳腫瘍及びその他の固形腫瘍。
（４）免疫系疾患、例えば、重症複合免疫不全症、重症自己免疫疾患、原発性中枢神経系リンパ腫、湿疹血小板減少合併免疫不全症候群、慢性肉芽腫、ＩＰＥＸ（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）症候群、ＡＬアミロイドーシス、ＰＯＥＭＳ症候群、血球貪食症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性筋炎と皮膚筋炎及びその他の自己免疫、免疫失調及び免疫不全疾患。
（５）他の遺伝疾患又は代謝系疾患、例えば、ムコ多糖症、先天性角化異常症、リソソーム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー及びその他の遺伝疾患又は代謝系疾患など。
（１）血液系悪性腫瘍、例えば、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄線維化及び骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性マクログロブリン血症、形質細胞白血病、形質芽球性リンパ腫、有毛細胞白血病、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍及びその他の血液系悪性腫瘍。
（２）血液系非悪性腫瘍、例えば、再生不良性貧血、ファンコニー貧血、地中海貧血、鎌状赤血球貧血症、骨髄線維化、重度の発作性夜間ヘモグロビン尿症、無巨核球性血小板減少症及びその他の血液系非悪性腫瘍。
（３）固形腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌、精巣癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、生殖細胞腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、ウェルムス腫瘍、骨肉腫、髄芽細胞腫、悪性脳腫瘍及びその他の固形腫瘍。
（４）免疫系疾患、例えば、重症複合免疫不全症、重症自己免疫疾患、原発性中枢神経系リンパ腫、湿疹血小板減少合併免疫不全症候群、慢性肉芽腫、ＩＰＥＸ（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）症候群、ＡＬアミロイドーシス、ＰＯＥＭＳ症候群、血球貪食症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性筋炎と皮膚筋炎及びその他の自己免疫、免疫失調及び免疫不全疾患。
（５）他の遺伝疾患又は代謝系疾患、例えば、ムコ多糖症、先天性角化異常症、リソソーム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー及びその他の遺伝疾患又は代謝系疾患など。
【0004】
倫理や研究モデルの制限により、ヒト造血幹細胞に対する理解は、マウスＨＳＣの機序を参考にした研究と、ヒトＨＳＣを免疫不全マウスモデルに移植した研究に限られている。しかし、マウスの発育機序はヒトとは多くの違いがある。そのため、ヒト成体造血幹細胞の表現型と機能に対する理解はまだ比較的に限定されており、今まではヒト成体造血幹細胞の真の免疫表現型を定義する最も権威ある研究はまだ１つもない。
【0005】
ＣＤ３４は未熟な造血細胞に広く発現しており、現在臨床で移植用にヒトＨＳＣの同定とスクリーニングに最も広く応用されている。しかし、ＣＤ３４陽性細胞は不均一性が存在し、ＨＳＣを含むだけでなく、巨核球－赤血球系前駆細胞（ＭＥＰ）、リンパ－骨髄系前駆細胞（ＬＭＰ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、多能性リンパ系前駆細胞（ＭＬＰ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球－単球前駆細胞（ＧＭＰ）、リンパ系共通前駆細胞（ＣＬＰ）などの特定の系統にしか分化できないＨＰＣｓを含んでいる。これらの造血幹細胞／前駆細胞には、表現型、幹細胞性、及び分化能に関して多くの類似点と相違点がある。その中で、生体内で長期自己更新を維持しつつ、すべての血液系の系統を再構築できるのは長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣｓ：Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ＨＳＣｓ）のみである。移植後の被験者の造血系の長期再構築能を維持し、より良く安全な治療効果を達成するために、表面マーカータンパク質でヒトＨＳＣｓを定義するためのより好適な方法が期待される。
【0006】
現在、いくつかの研究は異なる方法でヒトＨＳＣｓを定義できるマーカータンパク質を見つけた。例えば、最も典型的なＣＤ９０（Ｔｈｙ１）はヒト胎児の骨髄で最初に発見され、現在まで使用されている。ＨＳＣはＣＤ９０陽性とされているが、ＣＤ９０陰性の細胞には自己複製と多方向分化能を有するＨＳＣｓが含まれていることが報告されている。
【0007】
ＣＤ３８は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など、さまざまな免疫細胞の表面に発現する糖タンパク質である。非ＨＳＣｓに発現することが報告されているため、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－は複数の研究においてＨＳＣの定義に応用されている。しかし、本発明者ら及びその他のプロジェクトグループの研究により、ＨＳＣをインビトロ培養した後、ＣＤ３８の発現量は急激に減少し、そのため、ＣＤ３８はＨＳＣを確実に定義できる表面マーカータンパク質ではないことを発見した。
【0008】
その後、ある研究グループはＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ９０＋に加えて、ＣＤ４５ＲＡも同様にＨＳＣｓとＨＰＣｓを区別することができることを発見した。Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋は、ｍＰＢ又はＣＢ由来のいずれの細胞においても、より多くのヒトＨＳＣｓが濃縮されている。
【0009】
ＨＳＰＣｓにおける異なるアドヘシンをスクリーニングすることにより、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６：ｉｎｔｅｇｒｉｎα６）はＨＳＣｓの特異性マーカーとして使用できることが発見された。Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－細胞をさらにＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋とＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ－に分けて生体内機能の検証を行った結果、ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋はＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ－細胞よりも６倍以上高い移植効率を示し、ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋のみは連続移植中に長期造血再構築効果を示す。
【0010】
別の報告によると、ＣＤ１６６はマウスとヒトの両方のＨＳＣにおいて機能マーカータンパク質であることが明らかになった。ヒトＣＢ ＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓの多くはＣＤ１６６陽性であった。これに加えて、造血微小環境でＨＳＣに重要な影響を及ぼす骨芽細胞（ＯＢ：ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）もＣＤ１６６を発現している。Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞において、ＣＤ１６６＋亜集団はＣＤ１６６－亜集団より高い移植効率を示し、この移植上の優位性はＨＳＣとＯＢにおけるＣＤ１６６のアイソタイプの相互作用によって実現され得る。
【0011】
ＣＤ１０５（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）は内皮細胞のマーカータンパク質として広く認められているが、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓの３０～８０％にも高発現している。ＣＤ３４とともに造血細胞上でＴＧＦ－ｂｅｔａ１をポジティブレギュレーションし、細胞周期を抑制し、幹細胞／前駆細胞のより原始的な状態を維持する役割を果たしている。ＣＤ３４＋ＣＤ１０５＋は発育初期の、より幹細胞性のヒト造血幹細胞を標識した。
【0012】
別の研究では、ＣＤ３４とＣＤ４５ＲＡにＣＤ２０１（ＥＰＣＲ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を組み合わせて培養後のヒトＨＳＣを定義した。ＥＰＣＲ／ＰＡＲ１経路は一酸化窒素の産生制限やＣｄｃ４２活性の制御により、ＬＴ－ＨＳＣの骨髄中での残存を促進することが報告されている。また、マウス骨髄においてもＥＰＣＲはマウスＨＳＣを定義するために用いられる。
【0013】
さらに、同研究グループは、培養後のＣＢのＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＥＰＣＲ＋細胞には２つの機能性亜集団が存在しており、その中でＬＴ－ＨＳＣｓは主にＩｎｔｅｇｒｉｎ－ａ３（ＩＴＧＡ）＋亜集団に集中していることを見出した。ＩＴＧＡ３＋細胞はより強い多系統分化能を示し、免疫不全マウスモデルに連続移植すると、再構築能とＨＳＣの特異性遺伝子発現を示す。したがって、ＥＰＣＲ＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＩＴＧＡ３＋細胞はＨＳＣの真の定義に近いと考えられる。
【0014】
別の研究では、ヒト骨髄サンプルの遺伝子発現解析により、糖タンパク質（ＥＭＣＮ：ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ）がヒトＨＳＣのもう１つの潜在的マーカー分子として機能することを同定した。ヒトＨＳＣで高発現し、前駆細胞に分化する過程で発現量が低下する。これまでにも、ＥＭＣＮは、胚発生過程において、赤血球系前駆細胞では発現せず、マウスＨＳＣに特異的に発現することが明らかとなり、ＥＭＣＮがＨＳＣの潜在的表面マーカーとして機能し得ることが明らかとなった。
【0015】
単細胞シーケンシングの発展に伴い、いくつかの研究グループはヒトＨＳＰＣｓの各段階の幹細胞と前駆細胞をさらに亜集団化し、その遺伝子系統を解析した。研究により、ＣＤ１６４は造血系の最も早い系統に発現し、早期と末期の幹細胞／前駆細胞を明らかに区別できることを発見した。ＣＤ３４＋ＣＤ１６４ｈｉ亜集団はＣＤ３４＋ＣＤ１６４ｌｏｗ亜集団より強いクローン形成能、インビトロ分化能、増幅能及びインビボの全系統分化能がある。また、ＣＤ１６４はＬＴ－ＨＳＣを定義する従来のＣＤ９０＋やＣＤ３８－に比べて、より認識性が高い。
【0016】
さらに、ＨＬＡ－ＤＲ、ｃ－Ｋｉｔ、Ｔｉｅ２、ＩＬ－３Ｒなどの表面タンパク質もＨＳＰＣｓで高発現していることが報告されているが、Ｌｉｎ－ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋細胞において乾細胞性のより良い亜集団を定義するためには使用できない。
【0017】
以上の研究は、異なる方法でヒトＨＳＣｓのマーカータンパク質を発見したが、ＨＳＣｓ免疫表現型の真の定義は依然として様々なであり、一致しておらず、これは造血幹細胞移植の臨床開発及びその治療効果と安全性の評価にも大きく影響した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
上記課題に対して、本発明は、ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上とを含むタンパク質によって造血幹細胞を特徴付ける方法を提供する。タンパク質を用いて造血幹細胞を特徴付けることにより、目的細胞をインビトロでより正確に標識、評価することができるだけでなく、造血幹細胞移植を受けた後の造血系再構築能を長期的に維持する患者の能力を向上させ、より良い治療効果を達成することもできる。
【0019】
上記タンパク質を用いて造血幹細胞を定義する意義は次のとおりである。
（１）インビトロでは、様々な由来のＨＳＣの細胞の純度と品質をより効果的に評価して制御することができる。
（２）ヒト体内で得られ得る造血幹細胞の数は限られており、臨床移植に要求される最低数量基準に達しないことが多いため、インビトロ増幅培養が必要となる。しかし、多くの培養系では乾細胞性が良好に維持されず、培養後のＨＳＣ割合が低下する。マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することにより、インビトロ培養系をより良く評価、最適化することができる。
（３）造血系全体を再構築する能力に基づいて、ＨＳＣは遺伝子編集による多種の血液及び免疫疾患の治療に用いられている。遺伝子修飾において、マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することで、標的とする目的細胞をより正確に特定し、標的を絞ってＨＳＣの遺伝子修飾を行うことができる。
（４）ＨＳＣマーカータンパク質は造血系の生理的発育を理解する上で極めて重要であるだけでなく、多くの難治性悪性血液腫瘍はＨＳＣで発癌するため、標的化と根治が困難である。マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することはこれらの腫瘍疾患の発症機序をよりよく理解し、治療標的を増加させることに役立つ。
（５）ＨＳＣマーカータンパク質については、ＨＳＣｓを富化（濃縮）するための抗体、検出ビーズ、検出キットなどの対応する検出製品を開発することができ、科学研究と臨床応用に有用なＨＳＣを多く提供することができる。
（１）インビトロでは、様々な由来のＨＳＣの細胞の純度と品質をより効果的に評価して制御することができる。
（２）ヒト体内で得られ得る造血幹細胞の数は限られており、臨床移植に要求される最低数量基準に達しないことが多いため、インビトロ増幅培養が必要となる。しかし、多くの培養系では乾細胞性が良好に維持されず、培養後のＨＳＣ割合が低下する。マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することにより、インビトロ培養系をより良く評価、最適化することができる。
（３）造血系全体を再構築する能力に基づいて、ＨＳＣは遺伝子編集による多種の血液及び免疫疾患の治療に用いられている。遺伝子修飾において、マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することで、標的とする目的細胞をより正確に特定し、標的を絞ってＨＳＣの遺伝子修飾を行うことができる。
（４）ＨＳＣマーカータンパク質は造血系の生理的発育を理解する上で極めて重要であるだけでなく、多くの難治性悪性血液腫瘍はＨＳＣで発癌するため、標的化と根治が困難である。マーカータンパク質によりＨＳＣをより正確に標識することはこれらの腫瘍疾患の発症機序をよりよく理解し、治療標的を増加させることに役立つ。
（５）ＨＳＣマーカータンパク質については、ＨＳＣｓを富化（濃縮）するための抗体、検出ビーズ、検出キットなどの対応する検出製品を開発することができ、科学研究と臨床応用に有用なＨＳＣを多く提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【0020】
したがって、本発明の具体的な技術的解決手段は以下のとおりである。
【0021】
１．造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用であって、
前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上と、を含む使用。
２．前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅと、を含む、項１に記載の使用。
３．造血幹細胞を判定するための方法であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かを検出するステップと、を含み、
被検細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定する、方法。
上記の検出ステップは、検出が必要な項目を説明することを意図しており、検出の実施の順序を限定することを意図していない。すなわち、本願の実施形態は、上記の検出ステップが順に行われる、順に行わない、及び同時に行われるようなすべての技術的形態を網羅している。
４．前記被検細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項３に記載の方法。
５．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項３又は４に記載の方法。
６．造血幹細胞をスクリーニングする方法であって、
単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む方法。
７．前記分離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項６に記載の方法。
８．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項６又は７に記載の方法。
９．選別対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を含む、細胞製剤。
１０．前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項９に記載の細胞製剤。
１１．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項９又は１０に記載の細胞製剤。
１２．細胞製剤を調製する方法であって、
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、方法。
１３．前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項１２に記載の方法。
１４．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項１２又は１３に記載の方法。
１５．造血系再構築能を向上させるための薬物であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を含む、薬物。
１６．被験者の造血系を再構築する方法であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を被験者に投与することを含む、方法。
１つの実施形態では、本願はまた、被験者の造血系を再構築するための薬物の製造における、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の使用にも関する。
１７．造血幹細胞を検出するキット又は製品であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含む、キット又は製品。
１８．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項１７に記載のキット又は製品。
１９．前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項１７又は１８に記載のキット又は製品。
２０．前記化合物は抗体である、項１７～１９のいずれか１項に記載のキット又は製品。
２１．前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、項２０に記載のキット又は製品。
２２．前記抗体は磁気ビーズに付着する抗体である、項２０に記載のキット又は製品。
２３．造血幹細胞を選別又は富化するキット又は製品であって、選別又は富化対象の細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別又は富化するための化合物を含む、キット又は製品。
２４．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項２３に記載のキット又は製品。
２５．前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項２３又は２４に記載のキット又は製品。
２６．前記化合物は抗体である、項２３～２５のいずれか１項に記載のキット又は製品。
２７．前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、項２６に記載のキット又は製品。
２８．前記抗体は磁気ビーズに付着する抗体である、項２６に記載のキット又は製品。
２９．スクリーニング対象培地を用いて造血幹細胞を培養した後、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質が陽性であることにより特徴付けられる造血幹細胞の割合の維持又は上昇下降を検出することを含む造血幹細胞用培地をスクリーニングする方法であって、
上記のように特徴付けられた造血幹細胞の培養後の割合が維持又は上昇していると、スクリーニング対象培地は適切な造血幹細胞用培地であることを示す、方法。
３０．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項２９に記載の方法
３１．項２９又は３０に記載の方法によりスクリーニングされた造血幹細胞用培地。
３２．被験者の疾患を治療する方法であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の有効量を被験者に投与することを含む、方法。
３３．前記疾患は、被験者の造血系を再構築するために造血幹細胞治療を必要とする疾患である、項３２に記載の方法。
３４．前記疾患は、悪性腫瘍、血液系疾患又は免疫系疾患である、項３３に記載の方法。
３５．前記疾患は、
（１）慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄線維化及び骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性マクログロブリン血症、形質細胞白血病、形質芽球性リンパ腫、有毛細胞白血病、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍及びその他の血液系悪性腫瘍。
（２）再生不良性貧血、ファンコニー貧血、地中海貧血、鎌状赤血球貧血症、骨髄線維化、重度の発作性夜間ヘモグロビン尿症、無巨核球性血小板減少症及びその他の血液系非悪性腫瘍。
（３）乳癌、卵巣癌、精巣癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、生殖細胞腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、ウェルムス腫瘍、骨肉腫、髄芽細胞腫、悪性脳腫瘍及びその他の固形腫瘍。
（４）重症複合免疫不全症、重症自己免疫疾患、原発性中枢神経系リンパ腫、湿疹血小板減少合併免疫不全症候群、慢性肉芽腫、ＩＰＥＸ（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）症候群、ＡＬアミロイドーシス、ＰＯＥＭＳ症候群、血球貪食症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性筋炎と皮膚筋炎及びその他の自己免疫、免疫失調及び免疫不全疾患。
（５）ムコ多糖症、先天性角化異常症、リソソーム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー及びその他の遺伝疾患又は代謝系疾患などを含む、項３４に記載の方法。
３６．本願は、上記疾患を治療する薬物の製造における、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の使用にも関する。
前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上と、を含む使用。
２．前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅと、を含む、項１に記載の使用。
３．造血幹細胞を判定するための方法であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かを検出するステップと、を含み、
被検細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定する、方法。
上記の検出ステップは、検出が必要な項目を説明することを意図しており、検出の実施の順序を限定することを意図していない。すなわち、本願の実施形態は、上記の検出ステップが順に行われる、順に行わない、及び同時に行われるようなすべての技術的形態を網羅している。
４．前記被検細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項３に記載の方法。
５．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項３又は４に記載の方法。
６．造血幹細胞をスクリーニングする方法であって、
単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む方法。
７．前記分離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項６に記載の方法。
８．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項６又は７に記載の方法。
９．選別対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を含む、細胞製剤。
１０．前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項９に記載の細胞製剤。
１１．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項９又は１０に記載の細胞製剤。
１２．細胞製剤を調製する方法であって、
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種，４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、方法。
１３．前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項１２に記載の方法。
１４．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項１２又は１３に記載の方法。
１５．造血系再構築能を向上させるための薬物であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を含む、薬物。
１６．被験者の造血系を再構築する方法であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤を被験者に投与することを含む、方法。
１つの実施形態では、本願はまた、被験者の造血系を再構築するための薬物の製造における、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の使用にも関する。
１７．造血幹細胞を検出するキット又は製品であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含む、キット又は製品。
１８．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項１７に記載のキット又は製品。
１９．前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項１７又は１８に記載のキット又は製品。
２０．前記化合物は抗体である、項１７～１９のいずれか１項に記載のキット又は製品。
２１．前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、項２０に記載のキット又は製品。
２２．前記抗体は磁気ビーズに付着する抗体である、項２０に記載のキット又は製品。
２３．造血幹細胞を選別又は富化するキット又は製品であって、選別又は富化対象の細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別又は富化するための化合物を含む、キット又は製品。
２４．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項２３に記載のキット又は製品。
２５．前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である、項２３又は２４に記載のキット又は製品。
２６．前記化合物は抗体である、項２３～２５のいずれか１項に記載のキット又は製品。
２７．前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体である、項２６に記載のキット又は製品。
２８．前記抗体は磁気ビーズに付着する抗体である、項２６に記載のキット又は製品。
２９．スクリーニング対象培地を用いて造血幹細胞を培養した後、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種又は４種以上のタンパク質が陽性であることにより特徴付けられる造血幹細胞の割合の維持又は上昇下降を検出することを含む造血幹細胞用培地をスクリーニングする方法であって、
上記のように特徴付けられた造血幹細胞の培養後の割合が維持又は上昇していると、スクリーニング対象培地は適切な造血幹細胞用培地であることを示す、方法。
３０．前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである、項２９に記載の方法
３１．項２９又は３０に記載の方法によりスクリーニングされた造血幹細胞用培地。
３２．被験者の疾患を治療する方法であって、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の有効量を被験者に投与することを含む、方法。
３３．前記疾患は、被験者の造血系を再構築するために造血幹細胞治療を必要とする疾患である、項３２に記載の方法。
３４．前記疾患は、悪性腫瘍、血液系疾患又は免疫系疾患である、項３３に記載の方法。
３５．前記疾患は、
（１）慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、急性前骨髄球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄線維化及び骨髄異形成症候群、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性マクログロブリン血症、形質細胞白血病、形質芽球性リンパ腫、有毛細胞白血病、全身性肥満細胞症、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍及びその他の血液系悪性腫瘍。
（２）再生不良性貧血、ファンコニー貧血、地中海貧血、鎌状赤血球貧血症、骨髄線維化、重度の発作性夜間ヘモグロビン尿症、無巨核球性血小板減少症及びその他の血液系非悪性腫瘍。
（３）乳癌、卵巣癌、精巣癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、小細胞肺癌、生殖細胞腫、ユーイング肉腫、軟組織肉腫、ウェルムス腫瘍、骨肉腫、髄芽細胞腫、悪性脳腫瘍及びその他の固形腫瘍。
（４）重症複合免疫不全症、重症自己免疫疾患、原発性中枢神経系リンパ腫、湿疹血小板減少合併免疫不全症候群、慢性肉芽腫、ＩＰＥＸ（免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）症候群、ＡＬアミロイドーシス、ＰＯＥＭＳ症候群、血球貪食症候群、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性筋炎と皮膚筋炎及びその他の自己免疫、免疫失調及び免疫不全疾患。
（５）ムコ多糖症、先天性角化異常症、リソソーム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー及びその他の遺伝疾患又は代謝系疾患などを含む、項３４に記載の方法。
３６．本願は、上記疾患を治療する薬物の製造における、項９～１１のいずれか１項に記載の細胞製剤、又は項１２～１４のいずれか１項に記載の方法により調製された細胞製剤の使用にも関する。
【発明の効果】
【0022】
本発明により提供されるタンパク質は、造血幹細胞を特徴付けるもので、目的細胞をインビトロでより正確に標識、評価することができるだけでなく、造血幹細胞移植を受けた後の患者の造血系再構築能を長期的に維持する能力を向上させ、より良い治療効果を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】実施例３における表面タンパク質発現検証のフローチャートである。
【図2】実施例３におけるフローサイトメトリーを用いた異なる表面タンパク質のＬＴ－ＨＳＣｓ及びＨＳＰＣｓにおける発現量の差を初期スクリーニングする概略図である。
【図3A】実施例３におけるフローサイトメトリーを用いたヒトＨＳＰＣｓ及びＬＴ－ＨＳＣｓにおけるＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）、ＣＤ４８及びＣＤ２００の発現の検出の概略図である。
【図3B】実施例３におけるフローサイトメトリーを用いたヒトＨＳＰＣｓ及びＬＴ－ＨＳＣｓにおけるＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）、ＣＤ４８及びＣＤ２００の発現の検出の概略図である。
【図3C】実施例３におけるフローサイトメトリーを用いたヒトＨＳＰＣｓ及びＬＴ－ＨＳＣｓにおけるＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）、ＣＤ４８及びＣＤ２００の発現の検出の概略図である。
【図4】実施例４におけるインビトロ培養又は未培養ＨＳＰＣｓに含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの差を比較した概略図である。
【図5】実施例４におけるさまざまな由来のＨＳＰＣｓでの表面マーカータンパク質の再スクリーニングの概略図である。
【図6】実施例４におけるＨＳＰＣｓの異なる亜集団を目的タンパク質で区分し、それに含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を解析した概略図である。
【図7】実施例４におけるＣＤ２００、ＣＤ６６ａ及びＣＤ６６ｅ亜集団に含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合の培養時間による変化を比較した概略図である。
【図8A】実施例５におけるＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞（ＣＤ６６ｅ ｈｉはＣＤ６６ｅが高発現していることを意味する）のフローサイトメトリーによるソーティング、及びソーティング後のフローサイトメーターによる細胞純度解析の概略図であり、ＡはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞のフローサイトメトリーによるソーティングの概略図であり、Ｂはフローサイトメトリーによるソーティング後の細胞純度の検出の概略図である。
【図8B】実施例５におけるＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞（ＣＤ６６ｅ ｈｉはＣＤ６６ｅが高発現していることを意味する）のフローサイトメトリーによるソーティング、及びソーティング後のフローサイトメーターによる細胞純度解析の概略図であり、ＡはＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞のフローサイトメトリーによるソーティングの概略図であり、Ｂはフローサイトメトリーによるソーティング後の細胞純度の検出の概略図である。
【図9】実施例５におけるｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの３種類の細胞のＨＳＣ関連遺伝子発現量の検出の概略図である。
【図10】実施例６におけるマウスへの細胞移植後の４週目、１２週目、１６週目に末梢血への細胞移植効率を検出した統計図である。
【図11】実施例６において、２つの細胞群における再構築能を有するＨＳＣを限界希釈法により計算した概略図である。
【図12】実施例６における移植後１６週目の骨髄及び脾臓への移植の概略図である。
【図13】実施例７におけるマウスの末梢血、骨髄、脾臓への移植の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、図面に記載された実施形態を参照して本発明について詳細に説明し、ここで、すべての図面における同じ数字は、同じ構成を表す。本発明の具体的な実施例が図面に示されているが、本発明は、本明細書に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な形態で実施され得ることが理解されるべきである。むしろ、これらの実施例は、本発明をより完全に理解することを可能にし、かつ、本発明の範囲を当業者に完全に伝えることを可能にするために提供される。
【0025】
なお、明細書及び特許請求の範囲では、特定の構成要素を称するためにいくつかの用語が使用されている。当業者は、同じ構成要素を異なる名詞で呼ぶことがあることを理解する。本明細書及び特許請求の範囲では、名詞の差異を、構成要素を区分する方式とするのではなく、構成要素の機能上の差異を区分の基準とする。明細書及び特許請求の範囲を通じて言及されている「含む」又は「備える」は開放的な用語であるため、「含むが、限定されない」と解釈すべきである。本明細書の以下の記載は、本発明を実施するための好ましい実施形態であるが、この記載は本発明の範囲を限定するためのものではなく、本明細書の一般的な原則を目的とするものである。本発明の特許範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されるものに準ずるものとする。
【0026】
本発明は、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用であって、該タンパク質はＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種又は２種以上を含む、使用を提供する。
【0027】
いくつかの実施形態では、本発明は、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質は、（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、（２）ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、４種または４種以上と、を含む使用に関する。
【0028】
ＣＤ４８は免疫グロブリンファミリーのＣＤ２サブファミリータンパク質の一種である。ＣＤ４８は膜貫通タンパク質ではないが、ＧＰＩを介して細胞膜にアンカーされることができ、そのＣ末端ドメインが切断されて可溶性タンパク質になり得る。ＣＤ４８は多種の免疫細胞及び内皮細胞などに発現し、ＮＫ細胞上の２Ｂ４受容体と高親和性で連結し、ＣＤ２と低親和性で連結する。ＣＤ４８は活性化リンパ球間の相互作用を促進し、Ｔ細胞の活性化に関与する可能性がある。
【0029】
ＣＥＡファミリーは２つのサブファミリーとしてＣＥＡ細胞接着因子及び妊娠特異的多糖類を含み、１９番染色体の長腕にある。ＣＥＡＣＡＭタンパク質は、細胞膜にアンカー可能であり、Ｉｇドメインに３４個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含むことを特徴とし、１２個のメンバータンパク質（ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ２１）を含む。
【0030】
ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）はＣＥＡＣＡＭファミリーの中で最も広く分布するメンバーであり、分泌型と膜貫通型の２種類の形態を含み、その機能は主にＮ末端ドメインに依存して実現される。ＣＤ６６ａは最初に胆汁糖タンパク質として肝臓胆管に発見された。その後の研究により、リンパ細胞、上皮細胞、内皮細胞などにも発現していることが報告された。細胞間コヘシンとして、ホモフィリック又はヘテロフィリックな結合を通じて細胞機能の調節を実現し、細胞分化、組織構造形成、血管新生、アポトーシス、腫瘍抑制、代謝、自然免疫と獲得免疫に関与する。
【0031】
ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６）はＣＥＡファミリーに属し、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介して細胞膜に結合する。生理的な環境では、ＣＤ６６ｃは一連の上皮細胞、好中球及び単球細胞に顕著に高発現している。また、ＣＤ６６ｃは悪性腫瘍に対する血清検出にも一般的に用いられている。
【0032】
ＣＤ６６ｄ（ＣＥＡＣＡＭ３）はＣＥＡファミリーのメンバーであり、ヒト染色体１９ｑ１３．２に位置する。多種の細菌性病原体はこのタンパク質を介して宿主細胞に結合及び侵入する。そのため、ＣＤ６６ｄはヒト自然免疫の病原体感染抵抗の制御において重要な役割を果たしている。
【0033】
ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）はＣＥＡファミリーのメンバーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を介して細胞膜に結合する。ＣＤ６６ｅの発現はヒト胚胎及び胎児発育の初期段階（９～１４週）から始まり、しかも特定の細胞で発現を終身維持する。成人組織では、ＣＤ６６ｅは腸管、胃、舌、食道、子宮頸部、汗腺、前立腺のいずれにも発現している。ＣＤ６６ｅも同様に腫瘍識別マーカーとしてよく用いられているが、その機序や機能は不明である。
【0034】
ＣＤ２００分子はＩ－型膜糖タンパク質であり、分子質量が（４１～４７）ｋＤａであり、典型的なＶ／Ｃ２構造を有し、細胞外シグナルペプチド、ジヒドロキシ脱水素酵素領域、Ｖ領域、Ｃ２領域、膜貫通領域、及び細胞内領域から構成され、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ＣＤ２００は、ヒトでは染色体３ｑ１２－ｑ１３に位置し、６つのエクソンと５つのイントロンから構成され、転写後のｍＲＮＡは全長２．１４ｋｂで、２６９個のアミノ酸のポリペプチド鎖をコードすることができ、マウスでは１６番染色体Ｂ５領域に位置し、全長２．２０ｋｂで、２７８個のアミノ酸のポリペプチド鎖をコードすることができる。
【0035】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0036】
本発明は、造血幹細胞を判定するための方法であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞が、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質が陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、前記タンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定するステップと、を含む方法を提供する。
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞が、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質が陽性であるか否かを検出するステップと、
被検細胞がＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、前記タンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定するステップと、を含む方法を提供する。
【0037】
上記の検出ステップは、検出が必要な項目を説明することを意図しており、検出の実施順序を限定するものではない。
【0038】
本発明では、被検細胞の由来は限定されず、例えば臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であってもよい。
【0039】
前記被検細胞とは、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来の造血幹細胞を選別して得られる細胞をいう。
【0040】
本発明では、その操作方法は限定されず、特異的抗体を用いた染色後のフローサイトメトリーによるソーティング、磁気ビーズソーティングなど、当業者に周知の方法に基づいて選別することができる。
【0041】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0042】
本発明は、上記タンパク質を用いて造血幹細胞を特徴付けることにより、目的細胞をインビトロでより正確に標識、評価することができるだけでなく、造血幹細胞移植を受けた後の造血系再構築能を長期的に維持する患者の能力を向上させ、より良い治療効果を達成することができる。
【0043】
本発明は、造血幹細胞をスクリーニングする方法であって、
単離対象細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。
単離対象細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。
【0044】
前記造血幹細胞とは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質が陽性である造血幹細胞をいう。
【0045】
本発明では、上記のスクリーニング方法は限定されず、必要に応じて当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、フローサイトメトリーによるソーティング法、磁気ビーズソーティング法などを用いてスクリーニングすることができる。
【0046】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である。
【0047】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0048】
本発明は、単離対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を含む細胞製剤を提供する。
【0049】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である。
【0050】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0051】
本発明は、細胞製剤を調製する方法であって、
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である細胞製剤をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である細胞製剤をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。
【0052】
前記細胞製剤とは、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質が陽性である造血幹細胞をいう。
【0053】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である。
【0054】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0055】
本発明は、造血系再構築能を向上させるための薬物であって、上記の細胞製剤又は上記の方法により調製された得られた細胞製剤を含む、薬物を提供する。
【0056】
本発明は、造血幹細胞を選別する方法であって、
ＣＤ３４抗体、ＣＤ９０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上であるタンパク質の抗体とを用いて、単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、前記タンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別することを含む、方法を提供する。
ＣＤ３４抗体、ＣＤ９０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上であるタンパク質の抗体とを用いて、単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、前記タンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別することを含む、方法を提供する。
【0057】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来である。
【0058】
本発明の好ましい特定の実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである。
【0059】
本願はまた、被験者の造血系を再構築する方法であって、上記細胞製剤又は上記方法により調製された細胞製剤を被験者に投与することを含む方法に関する。
【0060】
本願はまた、造血幹細胞を検出するキット又は製品であって、
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、及び被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含む、キット又は製品に関する。
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、及び被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含む、キット又は製品に関する。
【0061】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅである。本願では、前記単離対象細胞は特に限定されず、臍帯血、動員末梢血、骨髄、又は培養細胞に由来するものであってもよい。本発明では、上記の検出方法は限定されず、特異的抗体による検出、フローサイトメトリー検出など、当業者に周知の方法に基づいて検出することができる。
【0062】
本願はまた、造血幹細胞を選別又は富化するキット又は製品であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別又は富化するために使用される、キット又は製品に関する。
【0063】
本願では、選別又は富化対象の細胞は特に限定されず、臍帯血、動員末梢血、骨髄、又は培養細胞に由来するものであってもよい。本発明では、上記の選別方法は限定されず、例えば特異的抗体による選別、例えばフローサイトメトリーや磁気ビーズソーティングなど、当業者に周知の方法に基づいて選別することができる。
【0064】
本願はまた、スクリーニング対象培地を用いて造血幹細胞を培養した後、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性であることによって特徴付けられる造血幹細胞の割合の維持又は上昇下降を検出することを含む、造血幹細胞用培地をスクリーニングする方法であって、上記のように特徴付けられた造血幹細胞の培養後の割合が維持又は上昇していると、スクリーニング対象培地は適切な造血幹細胞用培地であることを示す、方法に関する。本願はまた、該方法によりスクリーニングされた造血幹細胞用培地に関する。
【0065】
本願はまた、被験者の疾患を治療する方法であって、上記細胞製剤又は上記方法によって調製された細胞製剤の有効量を被験者に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、前記疾患は、被験者の造血系を再構築するために造血幹細胞を投与することを必要とする疾患である。
実施例
実施例
【0066】
本発明は、試験に使用される材料及び試験方法の一般的及び／又は具体的な説明をしており、以下の実施例では、特に断らない限り、％はｗｔ％、すなわち重量パーセントを表す。使用した試薬又は器具は、製造メーカーが明記されていない場合、いずれも市場で購入することができる通常の試薬製品である。
【0067】
実施例１ 造血幹細胞の単離
使用したヒト造血幹細胞は主に臍帯血由来である。臍帯血サンプルを病院から回収した後、室温で０．５～１時間放置して温度を回復し、血液サンプルを血液バッグから５０ｍｌ遠心管に移し、軽く均一に混合した。ピペット銃を用いてそれぞれサンプル１００μｌを、白血球計数及びフローサイトメトリーによるＣＤ３４陽性割合の検出に用いた。残りの血液サンプルを１％ＨＡＳ含有生理食塩水により１：１で希釈し、ピペットで軽く均一に混合した。混合液を別の５０ｍｌ遠心管に入れて、適量のリンパ球単離液を管底まで添加し、３加速０減速で４００ｇ、３０分間遠心分離した。遠心分離後に遠心管をゆっくりと取り出し、液面を水平に維持した。ピペッターを用いて白膜層細胞を慎重に吸引し、別の遠心管に移し、１％ＨＡＳの生理食塩水で細胞を洗浄し、９加速５減速で５００ｇ、１０分間遠心分離した。
使用したヒト造血幹細胞は主に臍帯血由来である。臍帯血サンプルを病院から回収した後、室温で０．５～１時間放置して温度を回復し、血液サンプルを血液バッグから５０ｍｌ遠心管に移し、軽く均一に混合した。ピペット銃を用いてそれぞれサンプル１００μｌを、白血球計数及びフローサイトメトリーによるＣＤ３４陽性割合の検出に用いた。残りの血液サンプルを１％ＨＡＳ含有生理食塩水により１：１で希釈し、ピペットで軽く均一に混合した。混合液を別の５０ｍｌ遠心管に入れて、適量のリンパ球単離液を管底まで添加し、３加速０減速で４００ｇ、３０分間遠心分離した。遠心分離後に遠心管をゆっくりと取り出し、液面を水平に維持した。ピペッターを用いて白膜層細胞を慎重に吸引し、別の遠心管に移し、１％ＨＡＳの生理食塩水で細胞を洗浄し、９加速５減速で５００ｇ、１０分間遠心分離した。
【0068】
遠心分離後に細胞を再懸濁させ、ＣＤ３４陽性細胞の選別を行った（ＣＤ３４＋細胞磁気ビーズ選別キット、ミルテニーバイオテク社、１３０－０４６－７０３）。まず、１×１０６総細胞ごとに、ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １００μｌとＣＤ３４－Ｂｅａｄｓ １００μｌを加えて４℃に置き、３０分間インキュベートした。インキュベート後に１％ＨＡＳの生理食塩水４０ｍｌで洗浄し、４００ｇ、８分間遠心分離し、３ｍｌあたり１×１０９細胞を再懸濁させた。
【0069】
ＣＤ３４＋細胞選別カラムをＭＡＣＳ磁気分離ラックに置き、選別カラムの上に４０μｍ細胞篩を置き、選別カラムの下に１５ｍｌ遠心管を置いた。ろ過篩を１％ＨＡＳの生理食塩水３ｍｌで濡らして洗浄し、細胞懸濁液を加え、滴下完了後、１％ＨＡＳの生理食塩水３ｍｌで３回洗浄した。吸着カラムについて磁場を除去し、１％ＨＡＳの生理食塩水を加えて細胞を遠心管に捕集し、これを１回繰り返した。細胞を均一に混合して計数し、培養又は凍結保存を行った。細胞の一部を採取してフローサイトアッセイを行い、ＣＤ３４の発現を検出し、その純度を確認した。
【0070】
実施例２ 造血幹細胞の培養
まず、造血幹細胞の完全培地を調製し、その成分と使用量を以下に示す。
まず、造血幹細胞の完全培地を調製し、その成分と使用量を以下に示す。
【0071】
【表1】
【0072】
実施例１の計数結果によれば、２４ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ５×１０４ＣＤ３４＋細胞を加え、完全培地１ｍｌで細胞を培養した。３日間培養した後、採取した細胞をフローサイトアッセイに用いた。
【0073】
実施例３ 表面タンパク質発現の初期スクリーニング
本検出にはヒト表面タンパク質検出パネル（ＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅ－Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番５６０７４７）を用いた。この検出パネルには、それぞれ９６ウェルプレートの各ウェルに２４２個のヒト表面マーカータンパク質と９個のアイソタイプ対照抗体が被覆されていた。
本検出にはヒト表面タンパク質検出パネル（ＢＤ Ｌｙｏｐｌａｔｅ－Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐａｎｅｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番５６０７４７）を用いた。この検出パネルには、それぞれ９６ウェルプレートの各ウェルに２４２個のヒト表面マーカータンパク質と９個のアイソタイプ対照抗体が被覆されていた。
【0074】
フローサイトメトリー染色液としてＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ ＥＤＴＡを調製した。新鮮／培養ヒトＨＳＣｓをフローサイトメトリー染色液で再懸濁させ、それぞれ１ウェルあたり５００００細胞／５０μｌで検出パネルに加え、４℃で３０分間染色した後、１ウェルあたりフローサイトメトリー染色液１００μｌを加え、４００ｇで遠心分離して除去した。パネル中の一次抗体のタイプがマウス抗体又はラット抗体であることから、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｉｇ又はｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｔ Ｉｇ（使用濃度はいずれも１：２００倍希釈）を用いて４℃で光を避けて３０分間染色し、１ウェルあたりフローサイトメトリー染色液１００μｌを加え、洗浄して２回遠心分離した。
【0075】
その後、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番：３４３５２８）とＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ品番：３２８１０８）を用いて、細胞１００μｌあたりの使用濃度５μｌで、４℃で光を避けて１５分間染色した。１ウェル当たりフローサイトメトリー染色液１００μｌを加え、４００ｇで遠心分離して上澄みを除去した。フローサイトメトリー染色液１００μｌを用いて細胞を再懸濁させ、ハイスループットフローサイトメーターで検出した（ＢＤ ＬＳＲｐｏｒｔｅｓｓａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）。
【0076】
その流れを図１に示す。
表面タンパク質発現の初期スクリーニング結果を図２に示す。
フローサイトメトリー法を用いたヒトＨＳＰＣｓ及びＬＴ－ＨＳＣｓにおけるＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）、ＣＤ４８及びＣＤ２００の発現の概略図を図３Ａから図３Ｃに示す。
表面タンパク質発現の初期スクリーニング結果を図２に示す。
フローサイトメトリー法を用いたヒトＨＳＰＣｓ及びＬＴ－ＨＳＣｓにおけるＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）、ＣＤ４８及びＣＤ２００の発現の概略図を図３Ａから図３Ｃに示す。
【0077】
図２より、ＬＴ－ＨＳＣｓ（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）におけるＣＤ４８、ＣＤ２００、及びＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）の発現量がＨＳＰＣｓ（ＣＤ３４＋）よりも有意に高く、かつ、他の測定されたタンパク質よりも著しく差があることが明らかになり、ＣＤ４８、ＣＤ２００、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、及びＣＤ６６ｅがＬＴ－ＨＳＣｓの新規表面マーカータンパク質として期待されることが示唆された。
【0078】
図３Ａから図３Ｃから明らかに、ＬＴ－ＨＳＣｓ（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋）では、ＣＤ４８、ＣＤ２００、及びＣＤ６６（ａ、ｃ、ｄ、ｅ）の発現量がＨＳＰＣｓ（ＣＤ３４＋）よりも有意に高く、ＣＤ４８、ＣＤ２００、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、及びＣＤ６６ｅがＬＴ－ＨＳＣｓの新規表面マーカータンパク質として期待された。
【0079】
実施例４ 表面タンパク質発現の検証
ヒトＨＳＣｓ表面タンパク質の初期スクリーニング抗体に対して、それぞれ凍結保存又は単離したばかりの臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓ及び３日培養後の対応する細胞でそれぞれ再スクリーニングによる同定をさらに行った。以下の候補マーカータンパク質の抗体（表２）をそれぞれ細胞表現型同定用抗体（表３）と組み合わせて、１０００００細胞／１００μ１の条件で細胞を蛍光抗体で染色した。４℃で光を避けて１５分間染色した後、１ウェルあたり７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番：４２０４０４）２μｌを加え、さらに４℃で光を避けて５分間染色し、細胞の生存率を同定した。染色後に１本あたりフローサイトメトリー染色液１ｍｌを加えて洗浄し、４００ｇ、５分間遠心分離した後、フローサイトメトリー染色液１００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメータに注入して蛍光発現（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を検出し、陽性細胞割合と平均蛍光強度（ＭＦＩ）で各表面タンパク質の発現をそれぞれ示した。
ヒトＨＳＣｓ表面タンパク質の初期スクリーニング抗体に対して、それぞれ凍結保存又は単離したばかりの臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓ及び３日培養後の対応する細胞でそれぞれ再スクリーニングによる同定をさらに行った。以下の候補マーカータンパク質の抗体（表２）をそれぞれ細胞表現型同定用抗体（表３）と組み合わせて、１０００００細胞／１００μ１の条件で細胞を蛍光抗体で染色した。４℃で光を避けて１５分間染色した後、１ウェルあたり７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番：４２０４０４）２μｌを加え、さらに４℃で光を避けて５分間染色し、細胞の生存率を同定した。染色後に１本あたりフローサイトメトリー染色液１ｍｌを加えて洗浄し、４００ｇ、５分間遠心分離した後、フローサイトメトリー染色液１００μｌで細胞を再懸濁させ、フローサイトメータに注入して蛍光発現（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ）を検出し、陽性細胞割合と平均蛍光強度（ＭＦＩ）で各表面タンパク質の発現をそれぞれ示した。
【0080】
【表2】
【0081】
【表3】
【0082】
なお、図４は、インビトロ培養及び未培養ヒト造血幹細胞／前駆細胞に含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの差の概略図である。
図５は、さまざまな由来のＨＳＰＣｓでの表面マーカータンパク質の再スクリーニングの概略図である。
図６は、ＨＳＰＣｓの異なる亜集団を目的タンパク質で区分し、それに含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を解析した概略図である。
図７は、ＣＤ２００、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ６６ａ亜集団に含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合の培養時間による変化を比較した概略図である。
図５は、さまざまな由来のＨＳＰＣｓでの表面マーカータンパク質の再スクリーニングの概略図である。
図６は、ＨＳＰＣｓの異なる亜集団を目的タンパク質で区分し、それに含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合を解析した概略図である。
図７は、ＣＤ２００、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ６６ａ亜集団に含まれるＬＴ－ＨＳＣｓの割合の培養時間による変化を比較した概略図である。
【0083】
図４より、ＨＳＰＣｓはインビトロ培養系では成長を維持しているが、乾細胞性をうまく維持できず、このため、３日培養後にはＬＴ－ＨＳＣｓの割合が低下していることが分かった。
図５より、凍結保存及び新鮮由来の臍帯血細胞をインビトロで３日間培養する前後では、目的タンパク質の発現が変化しており、ＬＴ－ＨＳＣｓでのＣＤ６６ｅとＣＤ６６ａの割合はインビトロ培養に伴って低下し、ＬＴ－ＨＳＣｓの低下傾向と類似しており、ＣＤ２００についても、非常にわずかな低下が見られたことを見出した。
図６より、凍結保存及び新鮮由来の臍帯血細胞では、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００の発現量が高い亜集団ほど、多くのＬＴ－ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）が富化されていることが分かった。
図７より、インビトロ培養されていないＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓには１０～２５％のＬＴ－ＨＳＣｓが含まれ、ＣＤ３４＋ＣＤ２００＋とＣＤ３４＋ＣＤ６６ａ＋細胞には、ＬＴ－ＨＳＣｓの割合は似ているか、やや上昇していることがわかった。一方、ＣＤ３４＋ＣＤ６６ｅ＋には、ＬＴ－ＨＳＣｓの割合は明らかに高く、新鮮臍帯血細胞には４０％よりも大きいこともある。
図５より、凍結保存及び新鮮由来の臍帯血細胞をインビトロで３日間培養する前後では、目的タンパク質の発現が変化しており、ＬＴ－ＨＳＣｓでのＣＤ６６ｅとＣＤ６６ａの割合はインビトロ培養に伴って低下し、ＬＴ－ＨＳＣｓの低下傾向と類似しており、ＣＤ２００についても、非常にわずかな低下が見られたことを見出した。
図６より、凍結保存及び新鮮由来の臍帯血細胞では、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００の発現量が高い亜集団ほど、多くのＬＴ－ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－）が富化されていることが分かった。
図７より、インビトロ培養されていないＣＤ３４＋ＨＳＰＣｓには１０～２５％のＬＴ－ＨＳＣｓが含まれ、ＣＤ３４＋ＣＤ２００＋とＣＤ３４＋ＣＤ６６ａ＋細胞には、ＬＴ－ＨＳＣｓの割合は似ているか、やや上昇していることがわかった。一方、ＣＤ３４＋ＣＤ６６ｅ＋には、ＬＴ－ＨＳＣｓの割合は明らかに高く、新鮮臍帯血細胞には４０％よりも大きいこともある。
【0084】
実施例５ ＨＳＣ関連遺伝子発現の検証
まず、フローサイトメトリーによる細胞選別により特定の細胞亜集団を得た。臍帯血ＣＤ３４＋細胞に蛍光抗体染色（表４）を行い、４℃で光を避けて１５分間染色した後、１ウェルあたり７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番：４２０４０４）２μｌを加え、さらに４℃で光を避けて５分間染色し、細胞の生存率を同定した。染色後、１本あたりフローサイトメトリー染色液１ｍｌを加えて洗浄し、４００ｇ、５分間遠心分離した後、フローサイトメトリー染色液１００μｌで細胞を再懸濁させ、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－とＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの２群の細胞（ＣＤ６６ｅ ｈｉはＣＤ６６ｅ高発現細胞を指す）をフローサイトメーター（ＢＤ、Ａｒｉａ ＩＩＩ）で選別した。
まず、フローサイトメトリーによる細胞選別により特定の細胞亜集団を得た。臍帯血ＣＤ３４＋細胞に蛍光抗体染色（表４）を行い、４℃で光を避けて１５分間染色した後、１ウェルあたり７ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番：４２０４０４）２μｌを加え、さらに４℃で光を避けて５分間染色し、細胞の生存率を同定した。染色後、１本あたりフローサイトメトリー染色液１ｍｌを加えて洗浄し、４００ｇ、５分間遠心分離した後、フローサイトメトリー染色液１００μｌで細胞を再懸濁させ、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－とＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの２群の細胞（ＣＤ６６ｅ ｈｉはＣＤ６６ｅ高発現細胞を指す）をフローサイトメーター（ＢＤ、Ａｒｉａ ＩＩＩ）で選別した。
【0085】
次に、選別された細胞をフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ）で細胞表現型純度の同定を行った。
得られた細胞をＲＮＡ抽出した後、ｃＤＮＡに逆転写し（ＴｒａｎｓＧｅｎ社製のワンステップ用ｃＤＮＡ逆転写キット、ＡＴ３１１－０３）、表５の反応系（表５）と反応手順（表６）に従ってｑＲＴ－ＰＣＴ反応（Ｒｏｃｈｅ ６４０２７１２００１）を行い、その結果について、ＧＡＰＤＨを参考遺伝子とし、各遺伝子の発現状況を２＾－△△ＣＴで示した。
得られた細胞をＲＮＡ抽出した後、ｃＤＮＡに逆転写し（ＴｒａｎｓＧｅｎ社製のワンステップ用ｃＤＮＡ逆転写キット、ＡＴ３１１－０３）、表５の反応系（表５）と反応手順（表６）に従ってｑＲＴ－ＰＣＴ反応（Ｒｏｃｈｅ ６４０２７１２００１）を行い、その結果について、ＧＡＰＤＨを参考遺伝子とし、各遺伝子の発現状況を２＾－△△ＣＴで示した。
【0086】
【表4】
【0087】
【表5】
【0088】
【表6】
【0089】
図８Ａ、図８Ｂは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞のフローサイトメトリーによるソーティング及びソーティング後のフローサイトメーターによる細胞純度の概略図である。
図９は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの３種類の細胞のＨＳＣ関連遺伝子発現量の検出の概略図である。
図９は、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの３種類の細胞のＨＳＣ関連遺伝子発現量の検出の概略図である。
【0090】
図８Ａ、図８Ｂより、フローサイトメトリーによるソーティングによりＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉの純度は９７．５％に達することが分かった。
図９より、検出したＨＳＣ関連遺伝子はいずれもＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞で最も発現量が高く、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉがより多くのＨＳＣを富化していることが分かった。
図９より、検出したＨＳＣ関連遺伝子はいずれもＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉ細胞で最も発現量が高く、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ ｈｉがより多くのＨＳＣを富化していることが分かった。
【0091】
実施例６
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを蘇生させ、造血幹細胞の完全培地で一晩培養した後に細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６６ｅの蛍光抗体で染色した後、フローサイトメーターを用いて２群の細胞：ＣＤ６６ｅ＋群：ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋とＣＤ６６ｅ－群：ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－を選別した。２群の細胞をそれぞれ１．０Ｇｙ放射したＮＰＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ－／－）免疫不全マウスに、マウス１匹あたり３００、１０００又は３０００個の細胞で移植し、群あたりマウス８匹にした。移植後４週目、１２週目、１６週目にマウス末梢血への細胞移植効率を検出し、１６週目にマウス骨髄及び脾臓への移植効率も検出した。移植効率＝ｈＣＤ４５＋割合／（ｈＣＤ４５＋割合＋ｍＣＤ４５＋割合）×１００％であり、限界希釈法は、ＥＬＤＡオンラインツールhttp://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/を用いて、各細胞亜集団に含まれる再構築能を有するＨＳＣの割合を算出することである。
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを蘇生させ、造血幹細胞の完全培地で一晩培養した後に細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６６ｅの蛍光抗体で染色した後、フローサイトメーターを用いて２群の細胞：ＣＤ６６ｅ＋群：ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋とＣＤ６６ｅ－群：ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－を選別した。２群の細胞をそれぞれ１．０Ｇｙ放射したＮＰＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ－／－）免疫不全マウスに、マウス１匹あたり３００、１０００又は３０００個の細胞で移植し、群あたりマウス８匹にした。移植後４週目、１２週目、１６週目にマウス末梢血への細胞移植効率を検出し、１６週目にマウス骨髄及び脾臓への移植効率も検出した。移植効率＝ｈＣＤ４５＋割合／（ｈＣＤ４５＋割合＋ｍＣＤ４５＋割合）×１００％であり、限界希釈法は、ＥＬＤＡオンラインツールhttp://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/を用いて、各細胞亜集団に含まれる再構築能を有するＨＳＣの割合を算出することである。
【0092】
図１０は、マウスへ細胞移植後に４週目、１２週目、１６週目に末梢血への細胞移植効率を検出した統計図である。
図１１は、２つの細胞群における再構築能を有するＨＳＣを限界希釈法により計算した概略図である。
図１２は、移植後１６週目の骨髄及び脾臓への移植の概略図である。
図１１は、２つの細胞群における再構築能を有するＨＳＣを限界希釈法により計算した概略図である。
図１２は、移植後１６週目の骨髄及び脾臓への移植の概略図である。
【0093】
図１０の結果より、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋細胞の移植効率はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞より有意に高く、移植効率は移植細胞数の増加に伴い向上した。
図１１の結果より、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞よりも６０倍高い１／５２９個の再構築能を有するＨＳＣを含むことが限界希釈法により算出された。
図１２の結果により、移植後１６週目の骨髄及び脾臓においても、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋の移植効率はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞よりはるかに高かった。
図１１の結果より、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞よりも６０倍高い１／５２９個の再構築能を有するＨＳＣを含むことが限界希釈法により算出された。
図１２の結果により、移植後１６週目の骨髄及び脾臓においても、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋の移植効率はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞よりはるかに高かった。
【0094】
実施例７
実施例６において移植１６週後のマウス骨髄を採取し、１．０Ｇｙ放射したＮＰＧ免疫不全マウスに二次移植した。移植後１６週目にマウスの骨髄、末梢血、脾臓への移植状況を検出した。ここで、移植効率＝ｈＣＤ４５＋割合／（ｈＣＤ４５＋割合＋ｍＣＤ４５＋割合）×１００％であった。
実施例６において移植１６週後のマウス骨髄を採取し、１．０Ｇｙ放射したＮＰＧ免疫不全マウスに二次移植した。移植後１６週目にマウスの骨髄、末梢血、脾臓への移植状況を検出した。ここで、移植効率＝ｈＣＤ４５＋割合／（ｈＣＤ４５＋割合＋ｍＣＤ４５＋割合）×１００％であった。
【0095】
図１３は、マウス末梢血、骨髄、及び脾臓への二次移植１６週目の移植の概略図である。
【0096】
図１３の結果により、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ＋細胞は二次移植後に長期造血系再構築機能を示し、しかも、移植効率はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６６ｅ－細胞より有意に高かった。
【0097】
以上の通り、本発明では、上記のタンパク質、特にＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ａ及びＣＤ２００はすべて造血幹細胞例えばＬＴ－ＨＳＣｓを特徴付けることが期待でき、さらに、ＣＤ６６ｅはヒトＬＴ－ＨＳＣｓの新規表面マーカータンパク質として有用であることを見出した。
【0098】
上記は、本発明のより好適な実施例に過ぎず、本発明を他の形態で限定するものではなく、当業者であれば、上記で開示された技術的内容を変更又は変形して同等変化の等価実施例にすることができる。ただし、本発明の技術的解決手段の内容から逸脱することなく、本発明の技術的本質に基づいて上記の実施例に対して行われたいかなる簡単な修正、均等な変化及び変形は、本発明の技術策の保護範囲に属する。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質は、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上と、を含み、
好ましくは、
（１）ＣＤ３４、ＣＤ９０及びＣＤ４５ＲＡと、
（２）ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅと、
を含む、使用。
【請求項2】
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否かを検出することと、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否かを検出することと、
被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否かを検出することと、
被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質に陽性であるか否かを検出することと、を含み、
被検細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性であり、かつ、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質陽性である場合、造血幹細胞であると判定し、
好ましくは、前記被検細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、
造血幹細胞を判定するための方法。
【請求項3】
単離対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含み、
好ましくは、前記単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、
造血幹細胞をスクリーニングする方法。
【請求項4】
選別対象細胞から選別されたＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を含み、
好ましくは、前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくは、ＣＤ６６ｅである、
細胞製剤。
【請求項5】
選別対象細胞からＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種又は２種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞をスクリーニングすることを含み、
好ましくは、前記選別対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及び／又はＣＤ２００、好ましくはＣＤ６６ｅである、
細胞製剤を調製する方法。
【請求項6】
造血系再構築能を向上させるための薬物であって、請求項４に記載の細胞製剤、又は請求項５に記載の方法により調製された細胞製剤を含む、薬物。
【請求項7】
被験者の造血系を再構築する方法であって、請求項４に記載の細胞製剤、又は請求項５に記載の方法により調製された細胞製剤を被験者に投与することを含む、方法。
【請求項8】
被検細胞がＣＤ３４陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ９０陽性であるか否か、被検細胞がＣＤ４５ＲＡ陰性であるか否か、被検細胞がＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質に陽性であるか否かの各々を検出するための化合物を含み、
好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅであり、
更に好ましくは、単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記化合物は抗体である、
造血幹細胞を検出するキット又は製品。
【請求項9】
前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体であり、好ましくは、前記抗体は磁気ビーズに付着される抗体である、請求項８に記載のキット又は製品。
【請求項10】
選別又は富化対象の細胞から、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性である造血幹細胞を選別又は富化するための化合物を含み、
好ましくは、前記タンパク質は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００のうちの１種、２種又は３種、好ましくはＣＤ６６ｅであり、
更に好ましくは、単離対象細胞は、臍帯血、動員末梢血、又は骨髄由来であり、
更に好ましくは、前記化合物は抗体である、
造血幹細胞を選別又は富化するキット又は製品。
【請求項11】
前記抗体は、化学的に標識された抗体、例えば、発光性化合物で標識された抗体、例えば、蛍光で標識された抗体であり、好ましくは、前記抗体は磁気ビーズに付着される抗体である、請求項１０に記載のキット又は製品。
【請求項12】
スクリーニング対象培地を用いて造血幹細胞を培養した後、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－と、ＣＤ４８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ及びＣＤ２００から選択される１種、２種、３種、又は４種以上のタンパク質とが陽性であることにより特徴付けられる造血幹細胞の割合の維持又は上昇下降を検出することを含む造血幹細胞用培地をスクリーニングする方法であって、上記のように特徴付けられた造血幹細胞の培養後の割合が維持又は上昇していると、スクリーニング対象培地は適切な造血幹細胞用培地であることを示す、方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法によりスクリーニングされた造血幹細胞用培地。
【請求項14】
請求項４に記載の細胞製剤、又は請求項５に記載の方法により調製された細胞製剤を被験者の疾患を治療するための使用。
【国際調査報告】