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特表2023-547732遺伝子改変を検出するための標的化シークエンシング方法およびそのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-13
(54)【発明の名称】遺伝子改変を検出するための標的化シークエンシング方法およびそのキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20231106BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20231106BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20231106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231106BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231106BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231106BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231106BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20231106BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
A61P35/00
A61K31/713
A61K45/00
A61K48/00
G01N33/50 P
G01N33/48 R
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023527994
(86)(22)【出願日】2021-11-02
(85)【翻訳文提出日】2023-06-29
(86)【国際出願番号】 IB2021060130
(87)【国際公開番号】W WO2022097021
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】63/108,932
(32)【優先日】2020-11-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/153,956
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523165835
【氏名又は名称】エイシーティ・ジェノミックス（アイピー）リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＴ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （ＩＰ） Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ライ，イー－シュアン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ユー－リン
(72)【発明者】
【氏名】シュー，アン
(72)【発明者】
【氏名】リン，ペイ－イー
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ホア－チエン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，シュー－ジェン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA14
4B063QA01
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA05
4C084ZB261
4C084ZB262
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
(57)【要約】
本願は、遺伝子改変、例えば遺伝子融合を決定するための方法を提供する。本願はまたは遺伝子改変を決定するためのキットを提供する。本願は、対象が特定のがん種または遺伝子型についてリスクがあるかを決定し、および適切な処置を投与する事による対象を処置するための方法をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するための方法であって、（ａ）該生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程、
を含む、方法。
【請求項2】
ＲＴプライマーが少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有する直鎖構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＲＴプライマーが、ステムループ構造および少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有するオーバーハング構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ステムループ構造がヘアピンステムループ構造またはＹ字型ステムループ構造である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ステムループ構造がバーコード配列を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
ステムループ構造が少なくとも第２のユニバーサルプライマー配列の配列長である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステムループ構造のステムが８ｂｐの長さである、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
第１のアダプター配列または第２のアダプター配列の内の少なくとも１つがバーコード配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
標的ＤＮＡが少なくとも１００ｂｐの長さである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
標的ＤＮＡが１００ｂｐから４０００ｂｐの長さである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
標的ＤＮＡが１００ｂｐから５００ｂｐの長さである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
工程（ｃ）において、標的ＤＮＡが少なくとも２つの遺伝子特異的プライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲによって増幅される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
第１のＰＣＲ産物が、遺伝子特異的プライマーの３’または５’の方向に生成され、および分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
遺伝子特異的プライマーが、融合ジャンクション境界から少なくとも２５ｂｐの距離内で標的ＤＮＡにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
１つ以上の遺伝子特異的プライマーが、配列番号１１、１２、１４～３５、および任意のその相補配列からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
ユニバーサルプライマーが、配列番号１～１０、および任意のその相補配列からなる群より選択される、請求項１に記載の方法
【請求項18】
遺伝子改変が、ＡＢＬ１、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＲＶ７、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤ７４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＺＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＮＵＴＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＰＯ２、ＳＤＣ４、ＳＬＣ３４Ａ２およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群より選択される、既知の遺伝子の配列を含む遺伝子融合である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
生物学的試料が固形腫瘍に由来する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
生物学的試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
第２のＰＣＲ産物が次世代シークエンシングによって解析される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キット。
【請求項23】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キット。
【請求項24】
第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項25】
ステムループプライマーのステムが８ｂｐの長さである、請求項２２に記載のキット。
【請求項26】
オーバーハング構造が５～１０ヌクレオチドの長さを持つランダムヘキサマーである、請求項２２に記載のキット。
【請求項27】
キットがさらに少なくとも１つの標識ｄＮＴＰを含み、ここで該ｄＮＴＰがビオチン群、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、またはその他の分子で標識される、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項28】
対象を処置するための方法であって、（ａ）請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法を使用して、対象から得た生物学的試料から遺伝子改変を検出する事により、対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する工程；
（ｂ）（ｉ）特定の遺伝子改変型を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順の提供；
を対象に投与する事などにより、対象における特定のがん種を処置する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１１月３日に出願された米国仮出願第６３／１０８，９３２号および２０２１年２月２６日に出願された米国仮出願第６３／１５３，９５６号の優先権を主張するものである。各開示について、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
本願は、２０２０年１１月３日に出願された米国仮出願第６３／１０８，９３２号および２０２１年２月２６日に出願された米国仮出願第６３／１５３，９５６号の優先権を主張するものである。各開示について、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【0002】
分野
本願は、分子診断学、がん遺伝学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本願は遺伝子融合イベントを検出するための方法およびキットに関する。本願はまた、特定のがん種（ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅ）または遺伝子型のリスクを決定する工程および適切な処置を投与する工程によって、適切な処置を投与するための方法に関する。
本願は、分子診断学、がん遺伝学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本願は遺伝子融合イベントを検出するための方法およびキットに関する。本願はまた、特定のがん種（ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅ）または遺伝子型のリスクを決定する工程および適切な処置を投与する工程によって、適切な処置を投与するための方法に関する。
【0003】
電子的に提出された配列表の参照
本願は、ファイル名が「０６６９９７－１ＷＯ１Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」であり、２０２１年１０月１２日に作成され、サイズが７．１ｋｂである、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された当該配列表は本願明細書の一部であり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
本願は、ファイル名が「０６６９９７－１ＷＯ１Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」であり、２０２１年１０月１２日に作成され、サイズが７．１ｋｂである、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された当該配列表は本願明細書の一部であり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【背景技術】
【0004】
背景
遺伝子改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は正常なＤＮＡ配列における改変、例えば遺伝子融合、点変異、挿入、欠損、増幅および再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）などを総称する。ＤＮＡ配列が改変されると、機能不全または異常活性化したタンパク質が産生され、がんなどの疾患をもたらし得る。よって、遺伝子改変の検出は、疾患の監視を改善し、および続く処置を提供するために重要な工程である。
遺伝子改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は正常なＤＮＡ配列における改変、例えば遺伝子融合、点変異、挿入、欠損、増幅および再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）などを総称する。ＤＮＡ配列が改変されると、機能不全または異常活性化したタンパク質が産生され、がんなどの疾患をもたらし得る。よって、遺伝子改変の検出は、疾患の監視を改善し、および続く処置を提供するために重要な工程である。
【0005】
遺伝子融合は、腫瘍形成において重要な役割を果たす遺伝子改変の１つである。転座、間質性欠失または染色体逆位などの結果、本来は別々で機能的に異なる２つの遺伝子が融合し、様々な種類の遺伝子融合が生成され得る。遺伝子融合の主流な例の１つには、キナーゼ遺伝子が高発現のパートナー遺伝子と融合したものがあり、この融合遺伝子は潜在的に異常な活性を有する過剰量のタンパク質をもたらし得るため、腫瘍形成につながる。多くの遺伝子融合ががんにつながるため、融合遺伝子は薬剤開発の標的として使用され得る。したがって、これらの標的化療法が有益となり得る患者を特定するために、可能性のある全ての遺伝子融合を特定する事は重要である。
【0006】
現在、遺伝子融合を検出するための多くのプラットフォームは遺伝子融合の既知の配列に基づくものである。例えば、伝統的なＰＣＲでは、増幅過程のための標的特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを適切に設計するには既知の配列が必要とされる。しかし、可能性のある全ての遺伝子融合の多くは事前に特定されておらず、未知の配列を有するため、そのようなＰＣＲ技術を使用して可能性のある全ての遺伝子融合を検出する事は困難である。５’／３’ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）などの方法がこの困難の克服のために使用され得るが、融合遺伝子の低品質および少量の臨床試料では、依然としてこれらの方法に制限が生じる。
【0007】
標的化次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ベースのプラットフォームが臨床的実施において理想的であり、標的濃縮のためのハイブリッドキャプチャー（例えば、ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｎｅ９４，９７）法およびアンプリコンベースのアプローチ（例えば、Ａｒｃｈｅｒ ＦｕｓｉｏｎＰｌｅｘ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｐａｎｅｌ１２０，１２１）とは区別され得る。アンプリコンベースのアプローチでは、ライブラリー構築時に、標的配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために遺伝子特異的プライマーを使用することによって、ゲノムまたはトランスクリプトーム配列を標的とする。マルチプレックスＰＣＲでは、片方の末端における遺伝子特異的プライマーおよびもう一方の末端におけるユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ増幅によりユニバーサル配列が標的配列に付加される。ＲＮＡベースのＮＧＳ技術では、マルチプレックスアッセイにおいてユニバーサルプライマーおよび遺伝子特異的プライマーを使用する事によって、３’融合パートナーを検出する事ができるか（例えば、ＯｍｎｉＦｕｓｉｏｎ ＲＮＡ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ）、または、例えばＡｒｃｈｅｒ ＦｕｓｉｏｎＰｌｅｘ ＮＧＳ ａｓｓａｙなど、アダプター連結技術によって任意の既知のまたは未知の５’または３’融合パートナーを検出することができる。しかし、新規の融合、または新規の切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）を持つ既知の融合の検出性能は、ライブラリー調製技術、エキソンカバレッジおよび検出効率に影響される。
【0008】
したがって、低品質および少量の臨床試料において、未知の配列の遺伝子融合を特定することができる正確かつ高感度な遺伝子融合検出法がアンメット・メディカル・ニーズとなっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示の概要
本願は、遺伝子改変を検出するための方法であって、
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程、
を含む、方法を提供する。
本願は、遺伝子改変を検出するための方法であって、
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程、
を含む、方法を提供する。
【0010】
上記によるところ、ＲＴプライマーが少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有する直鎖構造を含む。
【0011】
上記によるところ、ＲＴプライマーが、ステムループ構造および少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有するオーバーハング構造を含む。
【0012】
上記によるところ、ステムループ構造がヘアピンステムループ構造またはＹ字型ステムループ構造である。
【0013】
上記によるところ、ステムループ構造がバーコード配列を含む。
【0014】
上記によるところ、ステムループ構造が少なくとも第２のユニバーサルプライマー配列の配列長である。
【0015】
上記によるところ、第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである。
【0016】
上記によるところ、ステムループ構造のステムが８ｂｐの長さである。
【0017】
上記によるところ、第１のアダプター配列または第２のアダプター配列の内の少なくとも１つがバーコード配列を含む
【0018】
上記によるところ、標的ＤＮＡが少なくとも１００ｂｐの長さである。
【0019】
上記によるところ、標的ＤＮＡが１００ｂｐから４０００ｂｐの長さである。
【0020】
上記によるところ、標的ＤＮＡが１００ｂｐから５００ｂｐの長さである。
【0021】
上記によるところ、工程（ｃ）において、標的ＤＮＡが少なくとも２つの遺伝子特異的プライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲによって増幅される
【0022】
上記によるところ、第１のＰＣＲ産物が、遺伝子特異的プライマーの３’または５’の方向に生成され、および分離される。
【0023】
上記によるところ、遺伝子特異的プライマーが、融合ジャンクション境界から少なくとも２５ｂｐの距離内で標的ＤＮＡにハイブリダイズする。
【0024】
上記によるところ、１つ以上の遺伝子特異的プライマーが、配列番号１１、１２、１４～３５、および任意のその相補配列からなる群より選択される。
【0025】
上記によるところ、ユニバーサルプライマーが、配列番号１～１０、および任意のその相補配列からなる群より選択される。
【0026】
上記によるところ、遺伝子改変が、ＡＢＬ１、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＲＶ７、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤ７４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＺＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＮＵＴＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＰＯ２、ＳＤＣ４、ＳＬＣ３４Ａ２およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群より選択される、既知の遺伝子の配列を含む遺伝子融合である。
【0027】
上記によるところ、生物学的試料が固形腫瘍に由来する。
【0028】
上記によるところ、生物学的試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である。
【0029】
上記によるところ、第２のＰＣＲ産物が次世代シークエンシングによって解析される。
【0030】
１つの態様では、本願はまた、生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キットを提供する。
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キットを提供する。
【0031】
また、生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キットも提供される。
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キットも提供される。
【0032】
上記によるところ、第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである。
【0033】
上記によるところ、ステムループプライマーのステムが８ｂｐの長さである。
【0034】
上記によるところ、オーバーハング構造が５～１０ヌクレオチドの長さを持つランダムヘキサマーである。
【0035】
上記によるところ、キットがさらに少なくとも１つの標識ｄＮＴＰを含み、ここでｄＮＴＰがビオチン群、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ （ＤＩＧ））、またはその他の分子で標識される。
【0036】
別の態様では、本願はまた、対象を処置するための方法であって、
（ａ）対象から得た生物学的試料から本願の方法を使用して遺伝子改変を検出する事により、対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する工程；
（ｂ）（ｉ）特定の遺伝子改変型（ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順の提供；
を対象に投与する事などにより、対象における特定のがん種を処置する工程、
を含む、方法を提供する。
（ａ）対象から得た生物学的試料から本願の方法を使用して遺伝子改変を検出する事により、対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する工程；
（ｂ）（ｉ）特定の遺伝子改変型（ｇｅｎｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｔｙｐｅ）を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順の提供；
を対象に投与する事などにより、対象における特定のがん種を処置する工程、
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
図面の簡単な説明
１つ以上の実施形態が、限定ではなく一例として、添付の図面の図において例示され、ここで同じ参照番号の指定を有する要素は図面を通して同様の要素を表す。特に開示されない限り、図面は縮尺通りではない。
１つ以上の実施形態が、限定ではなく一例として、添付の図面の図において例示され、ここで同じ参照番号の指定を有する要素は図面を通して同様の要素を表す。特に開示されない限り、図面は縮尺通りではない。
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
図面は単に模式的なものであり、非限定的なものである。図面において、いくつかの要素の大きさは、例示の目的で誇張され、縮尺通りに描かれていない場合がある。寸法および相対的な寸法は、必ずしも本開示の実施に対する実際の縮小に対応しない。
【発明を実施するための形態】
【0044】
詳細な説明
本開示の実施形態の作成および使用は以下で詳細に議論される。しかし、実施形態は、多種多様な特定の文脈において具体化され得る多くの適用可能な発明概念を提供するものである事を理解されたい。議論される特定の実施形態は、当該実施形態を作成および使用する特定の方法の単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。
本開示の実施形態の作成および使用は以下で詳細に議論される。しかし、実施形態は、多種多様な特定の文脈において具体化され得る多くの適用可能な発明概念を提供するものである事を理解されたい。議論される特定の実施形態は、当該実施形態を作成および使用する特定の方法の単なる例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。
【0045】
様々な出版物、論文、特許および特許出願が、背景において、および本明細書を通して引用または記載され、これらの参考文献の各々についてここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、物品などの議論は、本願の文脈を提供する事を目的として本明細書中に含まれる。このような議論は、これらの事項のいずれかまたは全てが、開示または請求されるいずれかの発明に関する先行技術の一部を形成する事を認めるものではない。
【0046】
別段の規定が無い限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は本開示が属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈によって明らかに指示されない限り、複数の参照を含む。
【0047】
本開示において、遺伝子改変は遺伝子融合、点変異、挿入、欠失、増幅および再構成を含む。
【0048】
用語「遺伝子融合」または「融合遺伝子」とは、以前は独立していた２つの遺伝子またはその一部から形成されるハイブリッド遺伝子、またはその少なくとも２つの独立したエキソンから形成される特定の遺伝子を含む遺伝子改変を指す。本開示では、ＭＥＴエキソン１４スキッピングは１つの融合型（ｆｕｓｉｏｎ ｔｙｐｅ）とみなされる。例えば、ＭＥＴ遺伝子融合は、ＭＥＴ遺伝子のすくなくとも一部と高発現パートナー遺伝子との間の融合である。ＭＥＴ遺伝子融合はまた、ＭＥＴ遺伝子のエキソン１３とエキソン１５との間の融合（ＭＥＴエキソン１４スキッピング）をもたらす異常なスプライシングによって引き起こされる。融合遺伝子は、転座、間質性欠失または染色体逆位などの遺伝子改変の結果、染色体上の第１の遺伝子または第１の遺伝子の一部が、同じか異なる染色体上の第２の遺伝子または第２の遺伝子の一部と融合することで形成される。「遺伝子融合」は「遺伝子転座」または「遺伝子再構成」とも称される。例えば、ＮＴＲＫ遺伝子またはその一部が遺伝子融合の一部である場合、そのような遺伝子融合は「ＮＴＲＫ遺伝子融合」または「ＮＴＲＫ融合」と呼ばれる。
【0049】
融合遺伝子の５’末端の遺伝子を融合遺伝子の「５’遺伝子」、および融合遺伝子の３’末端の遺伝子を融合遺伝子の「３’遺伝子」と呼ぶ。融合遺伝子は、遺伝子が融合する部位である「融合遺伝子切断点」を有する。本明細書で使用する場合、「融合遺伝子切断点」は「切断点」と互換的に使用される。融合遺伝子切断点は、５’遺伝子由来の配列および３’遺伝子由来の配列を包含する融合ジャンクション配列によって規定される融合遺伝子のある領域に位置する。異なる融合遺伝子切断点は異なる「融合型」をもたらし得る。融合切断点は融合遺伝子内の任意の位置に生じ得るため、２つの特定の遺伝子間の融合は複数の異なる融合遺伝子をもたらし得る。例えば第１の遺伝子の第１エキソンと第２の遺伝子の第２エキソンとの間の融合は１つの融合型であり、一方で該第１の遺伝子の第３エキソンと該第２の遺伝子の第１エキソンとの間の融合は別の融合型である。
【0050】
遺伝子融合は、ＤＮＡ中、または当該ＤＮＡのＲＮＡ転写物中の融合ジャンクションを同定する事によって検出され得る。本明細書で使用される場合、「融合型」とは融合遺伝子のＲＮＡ転写物中に存在する固有の融合ジャンクション配列を指す。言い換えると、２つの特定の遺伝子からの複数の融合遺伝子は、複数の融合遺伝子がそのＤＮＡ配列中に異なる融合ジャンクション配列を有する場合であっても、そのＲＮＡ転写物中に同じ融合ジャンクションを含む場合には、それらは同じ融合型とみなされる。複数の融合遺伝子は、２つの特定の遺伝子間の融合が同じイントロン領域の異なる部位で生じる場合には、同じ融合型であり得る。例えば、遺伝子Ａのエキソン３と遺伝子Ｂのエキソン５との間の融合は、遺伝子Ａのエキソン３およびエキソン４の間のエキソン３から延長したイントロンの小さい部分および遺伝子Ｂのエキソン４およびエキソン５の間のエキソン５から延長した大きい部分を含むＤＮＡ融合領域を有し得る。あるいは、このような融合は、遺伝子Ａのエキソン３およびエキソン４の間のエキソン３から延長したイントロンの大きい部分および遺伝子Ｂのエキソン４およびエキソン５の間のエキソン５から延長した小さい部分を含むＤＮＡ融合領域を有し得る。これら２つの融合遺伝子から生成されるＲＮＡ転写物は同じ融合ジャンクション配列を有するため、これら２つの融合は、異なるＤＮＡ融合ジャンクションを有するにも関わらず同じ「融合型」とみなされる。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「逆転写プライマー」または「ＲＴプライマー」とはユニバーサルプライマー配列および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドの直鎖、または少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドのオーバーハング構造を持つステムループを含むＤＮＡプライマーを指す。ＲＴプライマーはＲＮＡ配列の３’末端に結合し、逆転写を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作成する。
【0052】
本明細書で使用される場合、用語「鋳型切り替えオリゴ」または「ＴＳオリゴ」または「ＴＳＯ」とは、５’末端から３’末端向かって、ユニバーサルプライマー配列および合成ＤＮＡの３’末端の非鋳型ヌクレオチド（ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡ鋳型を使用して逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する際に、ＲＮＡ鋳型の５’末端に到達すると、逆転写酵素の末端転移酵素活性によって、新しく合成されたｃＤＮＡの３’末端に数個の追加的な非鋳型ヌクレオチド（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を用いた場合はほとんどがデオキシシチジン）が追加される。これらの非鋳型ヌクレオチドはＴＳオリゴのアンカー部位として機能する。ＴＳオリゴと非鋳型ヌクレオチドとの塩基対形成によって逆転写酵素は鋳型鎖をＲＮＡからＴＳオリゴへと「切り替え」、ＴＳオリゴの５’末端まで複製を続ける。そうすることにより、得られたｃＤＮＡは、転写物の完全な５’末端を含み、および選択したユニバーサルプライマー配列が逆転写産物に付加される。ＴＳオリゴは、米国特許出願公開第２０２１／０１８００５１号（「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳ ＴＯ ＡＭＰＬＩＦＹ ＳＨＯＲＴ ＲＮＡ ＴＡＲＧＥＴＳ」）に記載されるように合成されてよく、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子特異的プライマー」とは、目的の遺伝子の標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するように設計されたＤＮＡプライマーを指す。本願のいくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーは融合遺伝子のＤＮＡ断片に特異的に結合する。
【0054】
本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサルプライマー」とは、ユニバーサルプライマーのヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡを増幅するように設計されたＤＮＡプライマーを指す。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」、「第１のアダプター」、「第２のアダプター」、「第３のアダプター」および「第４のアダプター」とは、配列ライブラリーを作成するための品種タグ（ｖａｒｉｅｔａｌ ｔａｇ）、バーコードをｃＤＮＡに付加するように設計されたＤＮＡアダプター、またはシークエンサーによる認識のためのプラットフォーム特異的配列を含むＤＮＡアダプターを指す。
【0056】
本明細書に記載される各遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）に掲載される「遺伝子名（ｇｅｎｅ ｎａｍｅ）（またはｓｙｍｂｏｌ）」に対応する。したがって、遺伝子の配列または遺伝子名の同義語を特定するためにＮＣＢＩ遺伝子データベースを使用し得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、本願の方法に関する用語「投与」とは、本明細書に記載される症候群、障害または疾患（例えば、がん）を治療的または予防的に予防、処置または改善するための方法を意味する。このような方法は、有効量の治療剤を治療過程の異なる時点で、または組み合わせの形態で同時に投与する事を含む。本願の方法は、すべての既知の治療的処置レジメンを包含するものとして理解されるものである。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、研究者、獣医、医学博士またはその他の臨床医が求める、組織系、動物またはヒトにおける生物学的または薬学的な応答を誘導する活性化合物または治療剤の量を意味し、それには処置されるべき症候群、障害もしくは疾患、または処置されるべき症候群、障害もしくは疾患の症状の予防、処置または改善も含む。
【0059】
本開示では、遺伝子改変を検出するための方法が提供される。方法は、以下の工程を含む：
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程。
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは生物学的試料から調製される。生物学的試料は、動物またはヒト対象から得られる任意の試料であり得る。生物学的試料の例は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片、血液、血漿または細胞を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料はがん患者に由来する。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、または骨髄腫に由来する。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、内分泌腺がん、食道がん、女性生殖器がん、頭頸部がん、肝胆道系がん、腎臓がん、肺がん、間葉系細胞新生物、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、外分泌膵臓腫瘍および尿路系がんの患者に由来する。
【0061】
生物学試料からの全ＲＮＡの調製は、当分野において知られる様々な方法によって行われ得る。１つの典型的な手順は、フェノール／クロロホルムなどの有機溶媒を用いたＲＮＡ抽出および遠心分離による沈殿である。ＲＮＡ単離または精製のためのキットも市販されている。ＲＮＡが得られたら、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰを含むｄＮＴＰ）と共に逆転写酵素を用い、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを生成する。この過程は逆転写と呼ばれる。逆転写はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ （Ｃａｔ Ｎｏ：１１７５４０５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実行され得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、本方法は、その配列が既知である遺伝的な遺伝子改変を検出し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、その配列の少なくとも一方の末端が既知である遺伝子改変を検出し得る。いくつかの実施形態では、本方法は既知の融合遺伝子を検出し得る。いくつかの実施形態では、本方法は既知の遺伝子が未知の遺伝子と融合した遺伝子融合を検出し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、５’パートナーが既知であり、３’パートナーが未知である遺伝子融合を検出する。いくつかの実施形態では、本方法は、同じ既知のパートナーが複数の異なる未知のパートナーと融合した一連の遺伝子融合を検出する。いくつかの実施形態では、本方法は、複数の異なる既知のパートナーが複数の異なる未知のパートナーと融合した複数の遺伝子融合を検出し得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、本方法の工程（ｄ）において第２のＰＣＲ産物は、陰イオン交換体精製または磁気ビーズベース核酸精製などの固相核酸抽出によって単離され得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列または第２のアダプター配列の少なくとも１つはバーコード配列を含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは少なくとも１００ｂｐの長さである。
【0066】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは１００ｂｐ～４０００ｂｐの長さである。
【0067】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは１００ｂｐ～５００ｂｐの長さである。
【0068】
いくつかの実施形態では、開示される方法は、工程（ｃ）において、少なくとも２つの遺伝子特異的プライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲによって標的ＤＮＡを増幅する工程をさらに含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、第１のＰＣＲ産物は、遺伝子特異的プライマーの３’または５’の方向に生成され、および分離される。
【0070】
いくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーは、融合ジャンクション境界から少なくとも２５ｂｐの距離内で標的ＤＮＡにハイブリダイズする。
【0071】
いくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーは、配列番号１１、１２、１４～３５、および任意のその相補配列からなる群より選択される。
【0072】
いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、配列番号１～１０、および任意のその相補配列からなる群より選択される。
【0073】
他の実施形態では、遺伝子改変は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＲＶ７、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤ７４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＺＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＮＵＴＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＰＯ２、ＳＤＣ４、ＳＬＣ３４Ａ２およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群より選択される既知の遺伝子の配列を含む遺伝子融合である
【0074】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変の存在は第２のＰＣＲ産物のシークエンシングから特定される。いくつかの実施形態では、第２のＰＣＲ産物のシークエンシングは、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング、またはパイロシークエンシングによって実行され得る。いくつかの実施形態では、第２のＰＣＲ産物からのシークエンシング結果は、遺伝子改変を同定するための配列アライメントによってさらに実行される。いくつかの実施形態では、配列アライメントは第１または第２のアライメントを必要とし得る。第１または第２のアライメントは、例えばＢｌａｓｔｎ、ＢＬＡＴ、ＢＷＮ、ＢｒｅａｋＤａｎｃｅｒ、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ （ＢＷＡ）、ＢＷＡ－ＭＥＭ、ＢＷＡ－ＳＷ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｓｔａｍｐｙ、Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ （ＴＭＡＰ）、またはＴｏｐＨａｔなどのいくつかのアライメントアルゴリズムまたはソフトウェアのうちの１つを使用して行われ得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、本方法は、標的ＤＮＡのユニバーサルプライマー伸長を行うためにＲＴプライマーおよび鋳型切り替えオリゴを使用する。いくつかの実施形態では、鋳型切り替えオリゴは任意の遺伝子改変配列の５’末端に結合し、およびＲＴプライマーはその３’末端に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＴプライマーはステムループ構造および少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有するオーバーハング構造を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列の少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドへの連結（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｏｎ）を含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造はヘアピンステムループ構造またはＹ字型ステムループ構造である。いくつかの実施形態では、オーバーハング配列はランダムヘキサマーであり、５～１０個の連続した核酸のランダムな配列である。いくつかの実施形態では、ステムループ構造はバーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は少なくとも第２のユニバーサルプライマー配列の配列長である。いくつかの実施形態では、ＲＴプライマーは３０ｂｐ未満の長さである第２のユニバーサルプライマーを含む。いくつかの実施形態では、ステムループプライマーのステムは８ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、ステムループ構造は、ユニバーサルプライマー配列、「ＧＰＳ」バーコード配列、およびサンプルバーコード配列を含む（図２）。
【0076】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは少なくとも１つの標識ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰを用いて合成される。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの合成のための非標識ｄＮＴＰと標識ｄＮＴＰの比率は、４：１から７：１の範囲である。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰはビオチンまたは他の官能基で標識される。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰはリンカーを介してビオチンまたは他の官能基で標識される。いくつかの実施形態では、リンカーはｄＮＴＰのＤＮＡ水素結合を形成できない部位に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは炭素鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは１６炭素鎖（１６Ｃ）である。いくつかの実施形態では、標識ｄＮＴＰはビオチン－１６Ｃ－ｄＣＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ビオチンまたは他の官能基で標識したｄＮＴＰは、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）または他のビーズに結合する事ができる。いくつかの実施形態では、ビオチンまたは他の官能基で標識した標的ＤＮＡは、ストレプトアビジン結合磁気ビーズまたは他のビーズに結合する事ができる。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジン結合磁気ビーズまたは他のビーズは磁場により引き付けられ得る。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識され得る。いくつかの実施形態では、ＤＩＧで標識されたｄＮＴＰは、一般に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）または蛍光色素とコンジュゲートした抗ＤＩＧ抗体に結合し得る。いくつかの実施形態では、ＤＩＧで標識した標的ＤＮＡは、一般にＨＲＰ、ＡＰまたは蛍光色素とコンジュゲートした抗ＤＩＧ抗体に結合し得る。
【0077】
本明細書で使用される場合、「分子」とは、ビオチン、他の官能基またはＤＩＧなどのｄＮＴＰまたは標的ＤＮＡに標識できる物質を指す。「ベイト（ｂａｉｔ）」とは、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ、他のビーズまたは抗ＤＩＧ抗体などの、標的ＤＮＡを補足するために分子と結合することができる別の物質を指す。
【0078】
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは分子的に特異的な結合によって単離され得る。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは以下の工程により単離され得る：（１）分子で標識した標的ＤＮＡをベイトに結合する工程；（２）標的ＤＮＡに結合したベイトを補足する工程；（３）標的ＤＮＡ以外のいずれの試薬も洗い流す工程。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは以下の工程により単離され得る：（１）ビオチンまたは他の官能基で標識された標的ＤＮＡをストレプトアビジン結合磁気ビーズまたは他のビーズに結合する工程；（２）標的ＤＮＡに結合したストレプトアビジン結合磁気ビーズまたは他のビーズを補足するために磁場を供する工程；（３）第１鎖ＤＮＡ以外の全ての試薬を洗い流す工程。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは以下の工程により単離され得る：（１）抗ＤＩＧ抗体を固相上に修飾する工程；ＤＩＧで標識した標的ＤＮＡを固相上の抗ＤＩＧ抗体に結合する工程；（３）第１鎖ＤＮＡ以外の全ての試薬を洗い流す工程。
【0079】
本開示では、遺伝子改変を検出するためのキットが提供される。ある実施形態では、キットは、以下を含む：
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを持つ鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第２のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第２のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを持つ鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第２のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第２のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。
【0080】
他の実施形態では、キットは以下を含む：
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。
（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。
【0081】
対象が特定のがん種のリスクを有するか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する方法もまた提供され、方法は、以下の工程によって遺伝子改変を検出する工程を含む：
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程。
（ａ）生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程であって、好ましくは第２のＰＣＲ産物は、少なくとも１つのアダプター配列を利用したシークエンシング解析によって解析される、工程。
【0082】
本開示では、対象を処置するための方法であって、以下の工程を含む方法もまた提供される：
（ａ）対象から得た生物学的試料から本明細書に記載の方法を使用して遺伝子改変を検出する事により、対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する工程；および
（ｂ）（ｉ）特定の遺伝子改変型を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順の提供；
を対象に投与する事などにより、対象における特定のがん種を処置する工程。
（ａ）対象から得た生物学的試料から本明細書に記載の方法を使用して遺伝子改変を検出する事により、対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定する工程；および
（ｂ）（ｉ）特定の遺伝子改変型を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；
（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順の提供；
を対象に投与する事などにより、対象における特定のがん種を処置する工程。
【0083】
ある実施形態では、対象における特定のがん種を処置する工程は、遺伝子改変の検出に応じて以前に投与された治療剤を継続することを含む。他の実施形態では、対象における特定のがん種を処置する工程は、以前に投与された治療剤を中止し、および遺伝子改変の検出に応じて異なる治療剤を投与する事を含む。
【0084】
本開示は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これらの実施例は限定ではなく実証の目的で提供される。
【実施例】
【0085】
実施例１
【0086】
ＰＣＲおよび鋳型切り替え技術を用いた標的化ＲＮＡシークエンシングによる遺伝子融合の検出
【0087】
任意の未知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、特に標的可能な配列に接する、遺伝子融合などの遺伝子改変を含むＤＮＡまたはＲＮＡを、特に低品質および少量の試料から取得するための方法が開発された。ＲＮＡ配列を最初の鋳型として使用して遺伝子融合を検出するための例示的な方法の全体の工程を図１に示す。未知の配列を取得するために、プライマー（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＩＤＴ）、Ｉｎｃ．から入手）を使用して標的ＲＮＡ断片に結合させ、および逆転写により標的ＤＮＡを作成し、続いてユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行い、最終的に未知の配列を含むＰＣＲ産物を取得し、サンガー法により配列決定する。
【0088】
実験工程１では、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）由来のＲＮＡ試料を６５°Ｃで５分間変性させ、氷上で冷却し、そして第１鎖ｃＤＮＡ合成のために、プライマーの５’末端にユニバーサル配列Ａを含む逆転写（ＲＴ）ランダムプライマーと反応させた。Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ （ｆｒｏｍ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）中の逆転写酵素が、ＲＮＡ鋳型の５’末端に到達した後に、合成されたＤＮＡの３’末端に数個の非鋳型ヌクレオチドを付加した。この非鋳型ヌクレオチドは鋳型切り替え（ＴＳ）オリゴのアンカー部位として機能した。
【0089】
実験工程２では、ユニバーサルプライマーＢを含む鋳型切り替えオリゴ（ＴＳＯ）を調製した。ＴＳオリゴと非鋳型ヌクレオチドの塩基対形成により、逆転写酵素は鋳型鎖をＲＮＡからＴＳオリゴへと切り替え、ｃＤＮＡの伸長をＴＳオリゴの５’末端まで続ける事で合成されたｃＤＮＡの３’末端にユニバーサル配列Ｂを付加した。ＲＴクリーンアップ反応および合成されたｃＤＮＡのＲＴ後の精製を市販のキットを使用して、製造元のプロトコルしたがって行った（ＯｍｎｉＦｕｓｉｏｎ（商標） ＲＮＡ）。
【0090】
実験工程３では、２つのプライマープールを使用して標的ｃＤＮＡの濃縮を行った。プライマープール１およびプール２は、未知の５’融合パートナーおよび未知の３’融合パートナーをそれぞれ検出するために使用した。未知の５’融合パートナーの検出のために、リード１配列に連結したフォワードユニバーサルプライマーＢおよびリード２配列に連結したリバース３’遺伝子特異的プライマーを使用したマルチプレックスＰＣＲ（ｍＰＣＲ）を行った。未知の３’融合パートナーの検出のために、リード２配列に連結したリバースユニバーサルプライマーＡおよびリード１配列に連結したフォワード５’遺伝子特異的プライマーを使用したマルチプレックスＰＣＲを行った。標的の濃縮後、ｍＰＣＲ後精製、消化反応および消化後精製を、市販のキットを使用して、製造元のプロトコルしたがって行った（ＯｍｎｉＦｕｓｉｏｎ（商標） ＲＮＡ）。
【0091】
実験工程４では、工程３からの精製ＤＮＡの両端のアダプター配列（リード１およびリード２）を、第２のＰＣＲ増幅（インデックス化目的）のために、固有のｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を持つ特異的プライマーとの塩基対形成のためのアニーリング部位として使用した。そして第２のＰＣＲ産物はサンガーシークエンシングまたは次世代シークエンシング（例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａまたはｉｏｎ ｔｏｒｒｅｎｔ）による融合イベントの検出のために調製された。
【0092】
図１は本方法の全体の過程を示す。２段階（ｔｗｏ－ｓｔｅｐ）ＰＣＲ法により、パートナー遺伝子が未知であるかまたはパネルに含まれていない場合に、遺伝子融合イベントを検出するために、存在する潜在的な遺伝子融合の標的産物を首尾よく濃縮する事ができる。
【0093】
ユニバーサルプライマーは表１に示すプライマーのいずれでもよく、ここで各ユニバーサルプライマーはユニバーサルフォワードプライマーまたはユニバーサルリバースプライマーのいずれかとして使用され得る。
【表1】
【0094】
実施例２
【0095】
異なるＲＴプライマーでのＰＣＲ産物サイズの比較
【0096】
新規の融合転写物を検出するための本明細書に記載の設計に基づき、遺伝子特異的プライマーは２つの別個のプライマープール、すなわち、１つは５’融合遺伝子の検出用、もう１つは３’融合遺伝子の検出用に分けられる。図２は本願の方法において使用し得るプライマーの設計を示す。
【0097】
異なる逆転写（ＲＴ）関連プライマーによる、逆転写効率および特異性への影響を試験するために、ユニバーサルプライマー配列を含む３種類のＲＴプライマーを使用して、ＰＢＭＣ ＲＮＡ混合物を鋳型として使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを構築した。評価したＲＴプライマーは、５’末端にユニバーサルプライマータグを持つ直鎖形態のランダムヘキサマープライマー、ループ領域にのみ位置するユニバーサルプライマータグを持つステムループ形態のランダムヘキサマーベースプライマー、およびループ領域およびステム領域の両方に位置するユニバーサルプライマータグを持つステムループ形態のランダムヘキサマーベースプライマーを含む（図３）。
【0098】
図４ａ、４ｂ、５ａおよび５ｂは、異なるＲＴ関連プライマーを使用した際の、異なるサイズのＰＣＲ産物の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の値を示す。結果は３種類のＲＴプライマーの全てでさらなるＰＣＲ増幅手順のためのｃＤＮＡ産物を首尾よく合成できた（図４ａおよび４ｂ）。設計した直鎖ランダムヘキサマープライマーと、設計したステムループプライマー間の特異性および性能は異なっており、必要性に基づいて、ライブラリー構築システムにおいて適当なＲＴプライマーをＲＴ変換オリゴマーとして選択し得る。
【0099】
実施例３
【0100】
潜在的なＭＥＴ遺伝子改変の決定
【0101】
ＭＥＴエキソン１４スキッピング変異核酸を標的とする３’または５’遺伝子特異的プライマー（表２に示す）を、ＭＥＴ遺伝子のＲＮＡ転写物における既知の融合ジャンクション配列のヌクレオチド配列（表３に示す）に基づいて設計した。この３’または５’遺伝子特異的プライマーを使用して、本願の方法により、既知の融合ジャンクションおよびその他の融合型を包含する遺伝子融合イベントを検出した。表３における配列の最初の２０塩基対および最後の２０塩基対はそれぞれ５’パートナー（ＭＥＴ遺伝子のエキソン１３）および３’パートナー（ＭＥＴ遺伝子のエキソン１５）に由来する。その他の３’または５’遺伝子特異的プライマー配列が、本願の方法を使用してＭＥＴ遺伝子融合イベントを検出するために使用され得る。
【表2】
【表3】
【0102】
実施例４
【0103】
潜在的なＮＴＲＫ遺伝子改変の決定
【0104】
表４は、様々なＮＴＲＫ融合型および本願の方法において使用し得るいくつかの３’または５’遺伝子特異的プライマーを示す。ＮＴＲＫエキソン変異核酸を標的とする３’または５’遺伝子特異的プライマーを、ＮＴＲＫ遺伝子融合のＲＮＡ転写物における融合領域のヌクレオチド配列に基づいて設計した。プライマーは、本願の方法により遺伝子融合イベントを検出するために使用される。その他の３’または５’遺伝子特異的プライマー配列もまた、本願の方法を使用してＮＴＲＫ遺伝子融合イベントを検出するために使用され得る。
【表4】
【0105】
実施例５
【0106】
潜在的なＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子改変の決定
【0107】
ＥＧＦＲエキソン変異核酸を標的とする３’または５’遺伝子特異的プライマー（表５に示す）を、ＥＧＦＲ－ＥＧＦＲ融合遺伝子のＲＮＡ転写物における融合領域のヌクレオチド配列（表６に示す）に基づいて設計した。３’または５’遺伝子特異的プライマーは、本願の方法により遺伝子融合イベントを検出するために使用される。その他の３’または５’遺伝子特異的プライマー配列もまた、本願の方法を使用してＥＧＦＲ遺伝子融合イベントを検出するために使用され得る。
【表5】
【表6】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するための方法であって、（ａ）該生物学的試料から得た標的ＲＮＡ、鋳型切り替えオリゴ、逆転写酵素、および逆転写（ＲＴ）プライマーを混合物中に混合する工程であって、ここで該鋳型切り替えオリゴは第１のユニバーサルプライマー配列を含む、および該ＲＴプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含む、工程；
（ｂ）逆転写が起こり該標的ＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡがもたらされる条件下に該混合物を供する工程；
（ｃ）プライマーの第１の対を用いて標的ＤＮＡを増幅し、第１のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第１の対は遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを含み、ここで遺伝子特異的プライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および厳しい条件下で標的遺伝子にハイブリダイズする３’末端配列を含み、ここでユニバーサルプライマーは５’末端の第１または第２のアダプター配列および第１または第２のユニバーサルプライマー配列を含む３’末端配列を含む、およびここで第１および第２のアダプター配列は互いに異なる、工程；
（ｄ）プライマーの第２の対を用いて第１のＰＣＲ産物を増幅し、第２のＰＣＲ産物を得る工程であって、ここでプライマーの第２の対の各々は５’末端の第３または第４のアダプター配列、およびそれぞれ第１または第２のアダプター配列にハイブリダイズする３’末端配列を含み、およびここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、工程；ならびに
（ｅ）第２のＰＣＲ産物を解析し、遺伝子改変の存在を検出する工程、
を含む、方法。
【請求項2】
ＲＴプライマーが少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有する直鎖構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＲＴプライマーが、ステムループ構造および少なくとも５つのランダムヌクレオチドを有するオーバーハング構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ステムループ構造がヘアピンステムループ構造またはＹ字型ステムループ構造である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ステムループ構造がバーコード配列を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
ステムループ構造が少なくとも第２のユニバーサルプライマー配列の配列長である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステムループ構造のステムが８ｂｐの長さである、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
第１のアダプター配列または第２のアダプター配列の内の少なくとも１つがバーコード配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
標的ＤＮＡが少なくとも１００ｂｐの長さである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
標的ＤＮＡが１００ｂｐから４０００ｂｐの長さである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
標的ＤＮＡが１００ｂｐから５００ｂｐの長さである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
工程（ｃ）において、標的ＤＮＡが少なくとも２つの遺伝子特異的プライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲによって増幅される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
第１のＰＣＲ産物が、遺伝子特異的プライマーの３’または５’の方向に生成され、および分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
遺伝子特異的プライマーが、融合ジャンクション境界から少なくとも２５ｂｐの距離内で標的ＤＮＡにハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
１つ以上の遺伝子特異的プライマーが、配列番号１１、１２、１４～３５、および任意のその相補配列からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
ユニバーサルプライマーが、配列番号１～１０、および任意のその相補配列からなる群より選択される、請求項１に記載の方法
【請求項18】
遺伝子改変が、ＡＢＬ１、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＲＶ７、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＤ７４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＺＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＮＵＴＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＰＯ２、ＳＤＣ４、ＳＬＣ３４Ａ２およびＴＭＰＲＳＳ２からなる群より選択される、既知の遺伝子の配列を含む遺伝子融合である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
生物学的試料が固形腫瘍に由来する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
生物学的試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
第２のＰＣＲ産物が次世代シークエンシングによって解析される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）ステムループ構造および少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドであるオーバーハング構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キット。
【請求項23】
生物学的試料中の遺伝子改変を検出するためのキットであって、（ａ）第１のユニバーサルプライマーを含む鋳型切り替えオリゴ；
（ｂ）少なくとも５つのランダムテールヌクレオチドである直鎖構造を含む逆転写（ＲＴ）プライマーであって、第２のユニバーサルプライマーを含む、ＲＴプライマー；
（ｃ）第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含む１つ以上の遺伝子特異的プライマー、および第１または第２のアダプター配列をそれぞれ含むユニバーサルプライマーであって、ここで遺伝子特異的プライマーの第１のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第２のアダプター配列とは異なる、または遺伝子特異的プライマーの第２のアダプター配列はユニバーサルプライマーの第１のアダプター配列とは異なる、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルプライマー；
（ｄ）第１および第２のアダプターにそれぞれ相補的なプライマー対であって、ここで該プライマー対の各プライマーは、第３または第４のアダプター配列をそれぞれ含み、ここで第３および第４のアダプター配列は互いに異なる、プライマー対；
（ｅ）逆転写酵素；
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ；ならびに
（ｇ）デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、
を含む、キット。
【請求項24】
第２のユニバーサルプライマーが３０ｂｐ未満の長さである、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項25】
ステムループプライマーのステムが８ｂｐの長さである、請求項２２に記載のキット。
【請求項26】
オーバーハング構造が５～１０ヌクレオチドの長さを持つランダムヘキサマーである、請求項２２に記載のキット。
【請求項27】
キットがさらに少なくとも１つの標識ｄＮＴＰを含み、ここで該ｄＮＴＰがビオチン群、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、またはその他の分子で標識される、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項28】
（ｉ）特定の遺伝子改変型を標的とする治療有効量のｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質の治療有効量の阻害剤；
（ｉｉｉ）特定の遺伝子改変型によってコードされる融合タンパク質を阻害する、治療有効量の剤：
（ｉｖ）遺伝子改変型に従って、サイトカイン、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、化学療法剤、放射線療法剤および抗がん免疫毒素からなる群より選択される治療有効量の抗がん剤；または
（ｖ）対象の細胞内における標的化ゲノム編集手順を提供するための剤、
を含む、対象におけるがんを処置するための医薬組成物であって、
ここで対象は、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法を使用して、該対象から得た生物学的試料から遺伝子改変を検出する事により、該対象が特定のがん種のリスクが増加しているか、または特定の遺伝子型に伴う特定のがん種のリスクを有するかを決定される、医薬組成物。
【国際調査報告】