▶ ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-14
(54)【発明の名称】ＣＤ４５を多量体化する結合分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231107BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231107BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231107BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231107BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20231107BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231107BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231107BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231107BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231107BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231107BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231107BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231107BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231107BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20231107BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12Q1/04
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 105
A61P37/02
A61P25/00
A61P17/00
A61P43/00 121
A61K35/12
A61P37/06
G01N33/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521770
(86)(22)【出願日】2021-10-14
(85)【翻訳文提出日】2023-04-10
(86)【国際出願番号】 EP2021078516
(87)【国際公開番号】W WO2022079199
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】2016386.1
(32)【優先日】2020-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2100737.2
(32)【優先日】2021-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514232085
【氏名又は名称】ユーシービー バイオファルマ エスアールエル
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラペッキ、スティーブン エドワード
(72)【発明者】
【氏名】アダムス、ラルフ
(72)【発明者】
【氏名】ハンフリーズ、デイビット ポール
(72)【発明者】
【氏名】フィニー、ヘレン マーガレット
(72)【発明者】
【氏名】ビッセル、ローズマリー フランセス
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B064
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA14
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QQ96
4B063QR48
4B063QS38
4B063QX01
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC06
4B064CC12
4B064CC24
4B064DA01
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB36
4C085BB44
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087CA04
4C087MA02
4C087NA05
4C087ZA02
4C087ZA89
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB27
4C087ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA45
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ４５を多量化して、著しいサイトカイン放出も誘導せずにＣＤ４５を発現する細胞の細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）を提供するものである。例えば、本発明は、ＣＤ４５に対する抗体を提供し、ここで、抗体は、ＣＤ４５の異なるエピトープにそれぞれ特異的な少なくとも２つの異なるパラトープを含む。抗体は、細胞の表面上のＣＤ４５を架橋するために使用されてもよい。抗体は、例えば、細胞移植の前に細胞を枯渇させることを含む様々な治療方法で使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つの異なるパラトープを含み、それぞれがＣＤ４５の異なるエピトープに特異的である抗体。
【請求項2】
抗体が、抗体の２つの異なるパラトープの各々がＣＤ４５の異なるエピトープに特異的であるバイパラトープ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＣＤ４５がヒトＣＤ４５である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
抗体が、ＣＤ４５を発現する細胞の細胞死を誘導することができ、好ましくは、抗体がサイトカインの放出を誘導しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
抗体がＦｃ領域を欠くか、又は１つ以上のＦｃエフェクター機能を除去するためにサイレンシングされ、及び／又は血清薬物動態を変更するために修飾されたＦｃ領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
ＢＹｂｅ抗体、ＴｒＹｂｅ抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、デュオボディ（ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ（例えば、ノブ・イン・ホール修飾、電荷‐電荷修飾及び／又はプロテインＡと結合する１つの重鎖の能力を変えるための修飾など、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成及び／又は精製ヘテロダイマーを促進するための修飾を有するＩｇＧ、又はＦＡＬＡ及びノブ・イン・ホール修飾を有するＩｇＧ４（Ｐ）抗体）から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
抗体が、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子（単数又は複数）。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体をコードする、又は請求項８に記載の核酸分子（単数又は複数）を含む、ベクター（単数又は複数）。
【請求項10】
（ａ）請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸分子（単数又は複数）、又は請求項９に記載のベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤
を含む、医薬組成物。
【請求項11】
治療の方法に使用するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
対象において疾患関連、ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療する方法に使用するための、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療する方法に使用するための、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法において使用するための医薬組成物であって、該方法が、細胞枯渇後に、対象に細胞を移植することをさらに含む、上記医薬組成物。
【請求項16】
対象において疾患を引き起こすＣＤ４５発現細胞を枯渇させる方法であって、請求項１０に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
【請求項17】
血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療するための、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療するための請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
細胞が枯渇した後に、対象に細胞を移植することをさらに含む、請求項１６、１７、及び１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
対象における疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷するための医薬の製造における、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、請求項８に記載の核酸分子（単数又は複数）、又は請求項９に記載のベクター（単数又は複数）の使用。
【請求項21】
医薬が血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療するためのものである、請求項２０に記載の使用。
【請求項22】
医薬が自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療するためのものである、請求項２０に記載の使用。
【請求項23】
医薬が、細胞殺傷後に細胞を対象に移植することをさらに含む方法において使用するためのものである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項24】
ＣＤ４５を発現している細胞の細胞死を誘導するために、ＣＤ４５を多量体化することができ、かつ有意なサイトカイン放出を誘導しない結合分子（単数又は複数）。
【請求項25】
結合分子（単数又は複数）が、ＣＤ４５と特異的に結合する抗体、又はＣＤ４５と特異的に結合する少なくとも２つの異なる抗体の混合物である、請求項２４に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項26】
抗体又は混合物の抗体が、以下のように修飾されているＦｃ領域を有する、請求項２５に記載の結合分子（単数又は複数）：（ａ）エフェクター最適化Ｆｃ領域であるようにする；
（ｂ）ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を増加させる（ノブ・イン・ホール修飾を有するなど）；
（ｃ）ホモダイマーよりヘテロダイマーの形成を促進する荷電残基を有する；
（ｄ）変化した血清薬物動態を有する、及び／又は
（ｅ）プロテインＡ結合を変化させる。
【請求項27】
抗体又は抗体の混合物中の抗体が、サイレンシングされたＦｃ領域を有する、請求項２５又は２６に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項28】
抗体又は抗体の混合物の抗体がＦｃ領域を欠いている、請求項２５に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項29】
抗体又は混合物の抗体が、ＢＹｂｅ抗体、ＴｒＹｂｅ抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、デュオボディ（ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ、又はノブ・イン・ホール修飾ＩｇＧから選択され、特に抗体（単数又は複数）がＩｇＧ４（Ｐ）ＦＡＬＡノブ・イン・ホール形式である、請求項２５に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項30】
請求項２４～２９のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）であって、（ａ）結合分子は、ＣＤ４５に対して異なる特異性を有する少なくとも２つの抗原結合部位を含む抗体であり；又は
（ｂ）結合分子が抗体の混合物であり、ここで、混合物中の抗体は、集合的に、ＣＤ４５に対して異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる抗原結合部位を含む、
上記結合分子（単数又は複数）。
【請求項31】
抗体の混合物である請求項３０に記載の結合分子（単数又は複数）であって、各抗体はＣＤ４５に対して単一の特異性を有するが、混合物はＣＤ４５に対して異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる抗体を含む、上記結合分子（単数又は複数）。
【請求項32】
抗体（単数又は複数）がキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項33】
抗体又は混合物の抗体が、血清アルブミンに特異的な抗原結合部位を含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）。
【請求項34】
請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）をコードする核酸分子（単数又は複数）。
【請求項35】
請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）をコードする、又は請求項３４に記載の核酸分子（単数又は複数）を含むベクター（単数又は複数）、例えば、ベクターがＬＮＰ－ｍＲＮＡである。
【請求項36】
以下を含む、医薬組成物：（ａ）請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子（単数又は複数）、請求項３４に記載の核酸分子（単数又は複数）、又は請求項３５に記載のベクター（単数又は複数）；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤。
【請求項37】
治療の方法に使用するための、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項38】
対象において疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷させる方法に使用するための、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項39】
血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療する方法に使用するための、請求項３７又は３８に記載の医薬組成物。
【請求項40】
自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療する方法に使用するための、請求項３７又は３８に記載の医薬組成物。
【請求項41】
前記方法が、細胞殺傷後に細胞を対象に移植することをさらに含む、請求項３７又は３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項42】
対象における疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法であって、請求項３６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
【請求項43】
血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療するための、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療するための請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
細胞を殺傷した後、対象に細胞を移植することをさらに含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
対象における疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷するための医薬の製造における、請求項２４～３３のいずれか一項による結合分子（単数又は複数）、請求項３４に記載の核酸分子（単数又は複数）、又は請求項３５に記載のベクター（単数又は複数）の使用。
【請求項47】
医薬が血液癌、例えば白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫を治療するためのものである、請求項４６に記載の使用。
【請求項48】
医薬が、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症又は強皮症を治療するためのものである、請求項４６に記載の使用。
【請求項49】
医薬が、細胞殺傷後に対象に細胞を移植することをさらに含む方法において使用するためのものである、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項50】
ＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）をスクリーニングする方法であって、以下を含む方法：（ａ）ＣＤ４５と結合することができる結合分子（単数又は複数）を、ＣＤ４５を発現する標的細胞と接触させること；及び
（ｂ）標的細胞が細胞死を起こすかどうかを決定すること。
【請求項51】
請求項５０に記載の方法であって、（ｃ）サイトカインが試験サンプル中に放出されるかどうかを決定すること、例えば、ＣＣＬ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、及びＭ－ＣＳＦの１つ以上のレベルを測定する、
ことをさらに含む、上記方法。
【請求項52】
請求項５０又は５１に記載の方法であって、ここで（ｉ）結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５を多量体化することができるものとして既に同定されている；又は
（ｉｉ）該方法が、例えば、ＣＤ４５を多量化する能力について、２つ以上の異なる結合分子の順列をスクリーニングすることにより、ＣＤ４５を多量体化する能力について、ＣＤ４５に特異的な結合分子を最初にスクリーニングすることを含む、上記方法。
【請求項53】
細胞、組織、又は器官の集団においてＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇又は殺傷する生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）方法であって、前記細胞組織又は器官を請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子と接触させることを含む、上記方法。
【請求項54】
対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子であって、前記方法が（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子と生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で接触させて、ＣＤ４５を発現する標的細胞を殺傷すること；及び
（ｂ）処理された細胞、組織、又は器官の集団を前記対象に移植すること
を含む、上記抗体又は結合分子。
【請求項55】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法であって（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子と接触させて、ＣＤ４５を発現する標的細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で殺傷すること；及び
（ｂ）処理された細胞、組織、又は臓器の集団を、そのような移植を必要とする対象に移植すること。
【請求項56】
（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項に記載の結合分子と接触させて、ＣＤ４５を発現する標的細胞を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で殺傷すること；及び（ｂ）処理された細胞、組織、又は臓器の集団を、そのような移植を必要とする対象に移植すること
を含む方法における、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防するための医薬の製造における使用のための、請求項１～７のいずれか一項による抗体又は請求項２４～３３のいずれか一項による結合分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ４５に特異的な結合分子、特に抗体に関するものである。この結合分子は、例えば、標的細胞を殺傷するために、特に細胞の移植の前に使用することができる。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ４５は、最初の、そして原型となる受容体型タンパク質チロシンホスファターゼであり、有核造血細胞に発現し、細胞応答の調節に中心的な役割を担っている。ＣＤ４５は、ＰＴＰＲＣ、Ｔ２００、Ｌｙ５、白血球共通抗原（ＬＣＡ）、Ｂ２２０としても知られている。ＣＤ４５は、Ｔ細胞及びＢ細胞において最も豊富な細胞表面タンパク質である。Ｂ及びＴ細胞の発生と活性化に必須である。ＣＤ４５変異細胞株、ＣＤ４５欠損マウス、ＣＤ４５欠損ヒトの研究により、ＣＤ４５がＴ及びＢ細胞の抗原受容体シグナル伝達とリンパ球の発生に不可欠な役割を果たすことが最初に示された。現在では、ＣＤ４５はインテグリン及びサイトカイン受容体から発せられるシグナルも調節することが知られている。抗原受容体のシグナル伝達における正の役割とは対照的に、ＣＤ４５は、例えばマクロファージにおけるインテグリン媒介シグナルの負のレギュレーターとして働く。ＣＤ４５はまた、造血及びインターフェロン依存性の抗ウイルス応答を制御する役割を果たすかもしれない。ＣＤ４５はまた、細胞の生存に役割を果たすことができる。
【0003】
ＣＤ４５は、約４００から５５０アミノ酸の高度で多様なグリコシル化された細胞外ドメインと、それに続く単一の膜貫通ドメイン、そして２つのタンデムに繰り返されるホスファターゼドメインを含む７０５アミノ酸の長い細胞内ドメインを含む。ＣＤ４５の発現制御と複数の代替スプライシングアイソフォーム（ＣＤ４５遺伝子からエクソン４，５及び６を交互にスプライシングし、Ａ、Ｂ及びＣと呼ぶ）の発現は、ホスファターゼ活性とシグナル伝達の差を決定的に制御している。ＣＤ４５は、外部刺激に対する感受性の相対的な閾値を制御することにより、細胞応答に影響を与える。この機能の乱れは、自己免疫、免疫不全、悪性腫瘍の原因となる可能性がある。
【0004】
ＣＤ４５の全てのアイソフォームはチロシンホスファターゼ活性を示し、それはホスファターゼドメインＤ１とＤ２の２つのタンデムリピートを含む分子の細胞質ドメインによって媒介され、それぞれが高度に保存されたＨＣ（Ｘ）５Ｒモチーフを含んでいる。ＣＤ４５のチロシンホスファターゼ活性はすべてＤ１ドメインから生じると考えられており、Ｄ２ドメインは制御に関与していると考えられる。ＣＤ４５チロシンホスファターゼの主要な標的の一つはＳｒｃファミリーキナーゼであり、これは細胞シグナル伝達におけるＣＤ４５の役割を反映している。ＣＤ４５のホスファターゼ活性が作用する場所によって、そのようなＳｒｃファミリーキナーゼの活性を活性化又は低下させる可能性がある。
ＣＤ４５の重要性を考えると、ＣＤ４５を標的とし、調節することができる薬剤が常に必要とされている。
ＣＤ４５の重要性を考えると、ＣＤ４５を標的とし、調節することができる薬剤が常に必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、特に、標的細胞上のＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる一方、著しいサイトカイン放出を誘導しない結合分子を提供するものである。この理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の結合分子は、既知の結合分子よりもＣＤ４５分子を架橋する能力が高く、したがって標的細胞の細胞死を誘導する能力が向上していると考えられる。したがって、本発明の結合分子は、特に対象における細胞移植の前に、標的細胞を殺傷するために使用することができる。いくつかの実施形態において、結合分子が提供される。他の実施形態では、少なくとも２つの異なる結合分子の混合物が提供される。
【0006】
本明細書で詳細に議論するように、本発明の結合分子は、様々な形式で提供される。一つの特に好ましい実施形態において、本発明の結合分子は、抗体である。さらなる特に好ましい実施形態では、本発明の少なくとも２つの異なる結合分子の混合物は、少なくとも２つの異なる抗体の混合物である。本発明の様々な実施形態において採用され得る抗体の形式は、本明細書において詳細に論じられる。一つの好ましい実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。一実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４抗体である。特に好ましい実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。
【0007】
好ましいＩｇＧ形式の例には、以下が含まれる。変化したヒンジを有するＩｇＧ（例えば、変化した長さ及び／又はジスルフィド結合）；変化した糖鎖を有するＩｇＧ；変化したＦｃＲｎ結合を有するＩｇＧ（例えば、血清半減期を減らすために、そのように結合が変化した）；ホモダイマー形成よりもヘテロダイマー形成を優先する重鎖修飾（例えば、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂｓ‐ｉｎ‐ｈｏｌｅｓ）及び／又は電荷修飾）を有するＩｇＧ；精製剤への結合を変える重鎖修飾を有するＩｇＧ（特に、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの精製を好む方法として、一方の重鎖がプロテインＡへの結合を変える修飾を有し、他方は有さない）；エフェクター機能を変えたＩｇＧ（例えば、ＦｃＧＲ結合及び／又はＣ１ｑ結合を変えた）；及び／又はエフェクター機能が低下／欠如したＩｇＧ。一つの特に好ましい実施形態において、このような形式は、ＩｇＧ抗体について採用される。別の特に好ましい実施形態では、本発明で採用される抗体は、ノブ・イン・ホール修飾を有するＩｇＧ４抗体である。さらに好ましい実施形態では、抗体は、ノブ・イン・ホール修飾及びＦＡＬＡ修飾を有するＩｇＧ４抗体である。一つの特に好ましい実施形態において、このようなＩｇＧ形式は、抗体がＣＤ４５に対して２つの異なる特異性を有する場合に採用されるであろう。
【0008】
本発明は、しかしＩｇＧ形式の抗体に限定されるものではなく、任意の適切な結合分子、特に本明細書に記載されたものが採用されてもよい。例えば、非ＩｇＧ抗体が採用されてもよい。ＴｒＹｂｅ及びＢＹｂｅ形式の抗体、特に本明細書に記載されるものが採用されてもよい。また、本明細書にも記載されているように、非抗体結合分子が採用されてもよい。
【0009】
従って、本発明は、以下を提供する。
・ 少なくとも２つの異なるパラトープを含み、それぞれがＣＤ４５の異なるエピトープに特異的である、抗体。
・ 本発明の抗体をコードする核酸分子（単数又は複数）。
・ 本発明の抗体をコードする、又は本発明の核酸分子（単数又は複数）を含むベクター（単数又は複数）。
・ ａ）本発明の抗体、本発明の核酸分子（単数又は複数）、又は本発明のベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
・ ＣＤ４５を多量体化し、著しいサイトカイン放出も誘導せずにＣＤ４５を発現する細胞の細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）。
・ 本発明の結合分子（単数又は複数）をコードする核酸分子（単数又は複数）。
・ 本発明の結合分子（単数又は複数）をコードする、又は本発明の核酸分子（単数又は複数）を含むベクター（単数又は複数）。
・ 少なくとも２つの異なるパラトープを含み、それぞれがＣＤ４５の異なるエピトープに特異的である、抗体。
・ 本発明の抗体をコードする核酸分子（単数又は複数）。
・ 本発明の抗体をコードする、又は本発明の核酸分子（単数又は複数）を含むベクター（単数又は複数）。
・ ａ）本発明の抗体、本発明の核酸分子（単数又は複数）、又は本発明のベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
・ ＣＤ４５を多量体化し、著しいサイトカイン放出も誘導せずにＣＤ４５を発現する細胞の細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）。
・ 本発明の結合分子（単数又は複数）をコードする核酸分子（単数又は複数）。
・ 本発明の結合分子（単数又は複数）をコードする、又は本発明の核酸分子（単数又は複数）を含むベクター（単数又は複数）。
【0010】
・ ａ）本発明の結合分子（単数又は複数）、本発明の核酸分子（単数又は複数）、又は本発明のベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、薬学的組成物。
・ 治療の方法において使用するための本発明の医薬組成物。
・ 対象において疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法における使用のための本発明の医薬組成物。
・ 対象において疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
・ 対象中の疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷するための医薬の製造における、本発明の結合分子（単数又は複数）、本発明の核酸分子（単数又は複数）、又は本発明のベクター（単数又は複数）の使用。
・ ＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）のスクリーニング方法であって、（ａ）ＣＤ４５と結合することができる結合分子（単数又は複数）をＣＤ４５を発現する標的細胞と接触させること、及び（ｂ）標的細胞が細胞死を起こしたかどうかを決定することを含む、上記方法。
・ 治療の方法において使用するための本発明の医薬組成物。
・ 対象において疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法における使用のための本発明の医薬組成物。
・ 対象において疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
・ 対象中の疾患関連ＣＤ４５発現細胞を殺傷するための医薬の製造における、本発明の結合分子（単数又は複数）、本発明の核酸分子（単数又は複数）、又は本発明のベクター（単数又は複数）の使用。
・ ＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）のスクリーニング方法であって、（ａ）ＣＤ４５と結合することができる結合分子（単数又は複数）をＣＤ４５を発現する標的細胞と接触させること、及び（ｂ）標的細胞が細胞死を起こしたかどうかを決定することを含む、上記方法。
【0011】
・ 細胞、組織、又は器官の集団においてＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇又は殺傷する生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）方法であって、前記細胞組織又は器官を本発明の結合分子又は本発明の抗体と接触させることを含む、上記方法。
・ 対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法において使用するための本発明の結合分子又は本発明の抗体であって、前記方法が、（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と生体外で接触させてＣＤ４５を発現している標的細胞を殺傷し、（ｂ）細胞、組織、又は器官の治療済み集団を前記対象へ移植することを含む、上記本発明の結合分子又は本発明の抗体。
・ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法であって、（ａ）細胞、組織、又は臓器の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と接触させて、ＣＤ４５を発現する標的細胞を生体外で殺傷すること；及び（ｂ）治療した細胞、組織、又は臓器の治療済み集団をそのような移植を必要としている対象へ移植することを含む、上記方法。
・ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防するための医薬の製造における本発明の結合分子又は本発明の抗体の使用であって、（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と接触させて、ＣＤ４５を発現している標的細胞を生体外で殺傷すること；及び（ｂ）細胞、組織、又は器官の治療済み集団をそのような移植を必要とする対象に移植すること、を含む方法における、上記使用。
・ 対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法において使用するための本発明の結合分子又は本発明の抗体であって、前記方法が、（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と生体外で接触させてＣＤ４５を発現している標的細胞を殺傷し、（ｂ）細胞、組織、又は器官の治療済み集団を前記対象へ移植することを含む、上記本発明の結合分子又は本発明の抗体。
・ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防する方法であって、（ａ）細胞、組織、又は臓器の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と接触させて、ＣＤ４５を発現する標的細胞を生体外で殺傷すること；及び（ｂ）治療した細胞、組織、又は臓器の治療済み集団をそのような移植を必要としている対象へ移植することを含む、上記方法。
・ 移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療又は予防するための医薬の製造における本発明の結合分子又は本発明の抗体の使用であって、（ａ）細胞、組織、又は器官の集団を本発明の結合分子又は本発明の抗体と接触させて、ＣＤ４５を発現している標的細胞を生体外で殺傷すること；及び（ｂ）細胞、組織、又は器官の治療済み集団をそのような移植を必要とする対象に移植すること、を含む方法における、上記使用。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＣＤ４５又は無関係な抗原に特異性を持つＦａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせでインキュベートした後の、（Ａ）リンパ球の細胞数、（Ｂ）アポトーシスを起こしたリンパ球の割合を示す棒グラフである。アポトーシスは、アネキシンＶの結合によって測定される。
【図2】ＣＤ４５又は無関係な抗原に対する特異性を有するＦａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙの組み合わせによるＣＤ４＋Ｔ細胞への効果の滴定を示すグラフ。値は、未処理細胞に対するＴ細胞数の減少％である。
【図3】（Ａ）ＣＤ４５、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙに特異性を持つＦａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ、又は（Ｂ）ＣＤ４５、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅに特異性を持つＢＹｂｅ（Ｆａｂ‐ｓｃＦｖ）によるＰＢＭＣ中のサブセット細胞への効果の滴定を示すグラフである。値は、未処理の細胞に対するサブセット細胞数の減少％である。
【0013】
【図4】ドナーＨＴＡ＃０５１１１９‐０１からの全血中の（Ａ）リンパ球細胞及び（Ｂ）ＣＤ４＋細胞、並びにドナーＨＴＡ＃０５１１１９‐０２からの全血中の（Ｃ）リンパ球細胞及び（Ｄ）ＣＤ４＋細胞に対する効果の滴定を示すグラフである。ＣＤ４５に特異的なＦａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ（６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ）、抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）又は無関係な特異性を持つＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）のいずれかによって行われた。値は、未処理細胞に対する細胞数の減少％である。
【図5】抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）、無関係な特異性を有するＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）又はＰＢＳによる全血中の（Ａ）ＣＣＬ２、（Ｂ）ＧＭ‐ＣＳＦ、（Ｃ）ＩＬ‐ＲＡ、（Ｄ）ＩＬ‐６、（Ｅ）ＩＬ‐８、（Ｆ）ＩＬ‐１０、（Ｇ）ＩＬ‐１１又は（Ｈ）Ｍ‐ＣＳＦの誘導レベルを示した棒グラフである。
【図6】ＣＤ４５に特異的なＦａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ（６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ）、抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）、無関係な特異性を有するＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）、キャンパス又はＰＢＳによる全血中のＴ細胞レベルへの影響を示す棒グラフである。
【0014】
【図7】ＣＤ４５に特異的なＦａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ（６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ）、抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）、無関係な特異性を有するＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）、キャンパス又はＰＢＳによる全血中の（Ａ）ＩＦＮγ、（Ｂ）ＩＬ‐６、（Ｃ）ＴＮＦαの誘導レベルを示すグラフである。
【図8】ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３システムで撮影した、（Ａ）Ｍ１マクロファージ、（Ｂ）Ｍ２マクロファージの画像。
【図9】抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）、無関係な特異性を有するＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）、カンプトテシン、スタウロスポリン又はＰＢＳによる（Ａ）Ｍ１マクロファージ及び（Ｂ）Ｍ２マクロファージの生存率への影響を示す棒グラフである。値は生発光単位（Ｒａｗ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）である。
【0015】
【図10】抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）、無関係な特異性を有するＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）、カンプトテシン、又はＰＢＳによる（Ａ）Ｍ１マクロファージ及び（Ｂ）Ｍ２マクロファージのカスパーゼ３／７の誘導のレベルを示すグラフ。
【図11】（Ａ）ＣＤ４５ ＥＣＤ（Ｂ）４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び（Ｃ）ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物の質量測光シグナルを示すグラフ。数値は質量（ｋＤａ）に対する検出数である。ＣＤ４５ ＥＣＤの模式図はＰＤＢコード５ＦＭＶから作成した。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの模式図は、ＦａｂとｓｃＦｖの社内（インハウス）の結晶構造を連結して作成したモデルである。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ‐ＣＤ４５ ＥＣＤ複合体及び高次の多量体型の模式図はモデルである。モデルは説明のためのものであり、エピトープの特定の位置を示すことを意図していない。
【図12】抗体４１３３と６２９４のＶ領域、抗体４１３３と６２９４のヒト化グラフト、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ重鎖及び軽鎖、及びＣＤ４５細胞外ドメイン１‐４の配列。ＣＤ４５ ＥＣＤの予測されるＮ‐結合型グリコシル化部位に下線を引いてある。また、４１３３と６２９４のキメラ軽及び重ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ鎖の配列も示している。
【0016】
【図13】抗ＣＤ４５ ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ（（Ａ）＆（Ｃ））又は抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ（（Ｂ）＆（Ｄ））によるＰＢＭＣ中のリンパ球細胞及びＣＤ３４＋細胞への効果の滴定を示すグラフ。値は、（Ａ）＆（Ｂ）では未処理細胞に対する細胞数の減少％で、（Ｃ）＆（Ｄ）では実際の細胞数で示した。
【図14】ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅのモル比 １：１ 混合物（黒実線）の、分析用超遠心機で測定した沈降速度を示すグラフである。ＣＤ４５ ＥＣＤ（点）と４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ（ダッシュ）の沈降速度をグラフに重ねたものである。値は、沈降係数（１０－１３秒）に対する連続分布（フリンジ／Ｓ）である。ＣＤ４５ ＥＣＤの模式図はＰＤＢコード５ＦＭＶから作成した。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの模式図は、ＦａｂとｓｃＦｖの社内の結晶構造を連結して作成したモデルである。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ‐ＣＤ４５ ＥＣＤ複合体及び高次の多量体型の模式図はモデルである。モデルは説明のためのものであり、エピトープの特定の位置を示すことを意図していない。
【図15】抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４＿ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨ、抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ又は抗ＣＤ４５ ４１３３＿ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡのいずれかのＰＢＭＣ中のリンパ球細胞への効果の滴定を示すグラフ。値は、未処理細胞に対する細胞数の減少％として示されている。
【0017】
【図16】抗ＣＤ４５ ４１３３＿ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ、抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、又は抗ＣＤ４５ ４１３３＿ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡと抗ＣＤ４５ ６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙの組み合わせのＰＢＭＣ中のリンパ球細胞への効果の滴定を示すグラフ。値は、未処理細胞に対する細胞数の減少％で示した。
【図17】ＰＢＭＣ中のリンパ球細胞に対する抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅ又は抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡ ＫｉＨのいずれかの効果を滴定したものを示すグラフである。値は細胞数の減少％で示した。
【図18】細胞株（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（Ｂ）ＣＣＲＦ‐ＳＢ（Ｃ）ＭＣ１１６（Ｄ）Ｒａｊｉ ａｎｄ Ｒａｍｏｓ（Ｅ）ＳＵ‐ＤＨＬ‐４、ＳＵ‐ＤＨＬ‐５、ＳＵ‐ＤＨＬ‐８、ＮＵ‐ＤＵＬ‐１及びＯＣＩ‐Ｌｙ３（Ｆ）ＴＨＰ‐１（Ｇ）Ｄａｋｉｋｉに対する、抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅ（４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ）による効果の滴定を示すグラフである。値は細胞数の減少％である。
【0018】
【図19】細胞株（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（Ｂ）ＣＣＲＦ‐ＳＢ（Ｃ）ＭＣ１１６（Ｄ）Ｒａｊｉ（Ｅ）Ｒａｍｏｓ（Ｆ）ＳＵ‐ＤＨＬ‐４（Ｇ）ＳＵ‐ＤＨＬ‐５（Ｈ）ＳＵ‐ＤＨＬ‐８（Ｉ）ＮＵ‐ＤＵＬ‐１（Ｊ）ＯＣＩ‐Ｌｙ３（Ｋ）ＴＨＰ‐１（Ｌ）ＤａｋｉｋｉのＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ（無関係な特異性を有するＢＹｂｅ、希釈系列の最高濃度５００ｎＭのみを示す）、スタウロスポリン、カンプトテシン、リツキシマブ、キャンパス又は抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のいずれかによる細胞数の減少％を示す棒グラフである。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによるトップの細胞減少％もマークされている。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、サイトカイン放出を有意に誘導することなく標的細胞の細胞死を誘導するためにＣＤ４５を多量化することができる結合分子を提供するものである。特に好ましい実施形態では、結合分子は抗体である。結合分子及びその用途の詳細は、以下に提供される。
本発明は、とりわけ、サイトカイン放出を有意に誘導することなく標的細胞の細胞死を誘導するためにＣＤ４５を多量化することができる結合分子を提供するものである。特に好ましい実施形態では、結合分子は抗体である。結合分子及びその用途の詳細は、以下に提供される。
【0020】
ＣＤ４５分子
本発明の結合分子は、ＣＤ４５に特異的である。上記で説明したように、ＣＤ４５は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰは、細胞の成長、分化、有糸分裂周期、及び発癌性転換を含む様々な細胞プロセスを制御するシグナル伝達分子であることが知られている。ＣＤ４５は、細胞外ドメイン、１つの膜貫通セグメント、２つのタンデム細胞質内触媒ドメインを含むため、受容体型ＰＴＰに属する。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）といった様々なＣＤ４５のアイソフォームが存在する。ＣＤ４５のスプライスバリアントアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃは、多くの白血球サブセットで異なって発現している。ＣＤ４５の異なるアイソフォームが存在するにもかかわらず、これらのアイソフォームには共通の配列があり、１つの結合分子、特に１つの抗体によってすべてのアイソフォームが標的化されることを意味している。
本発明の結合分子は、ＣＤ４５に特異的である。上記で説明したように、ＣＤ４５は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰは、細胞の成長、分化、有糸分裂周期、及び発癌性転換を含む様々な細胞プロセスを制御するシグナル伝達分子であることが知られている。ＣＤ４５は、細胞外ドメイン、１つの膜貫通セグメント、２つのタンデム細胞質内触媒ドメインを含むため、受容体型ＰＴＰに属する。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）といった様々なＣＤ４５のアイソフォームが存在する。ＣＤ４５のスプライスバリアントアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃは、多くの白血球サブセットで異なって発現している。ＣＤ４５の異なるアイソフォームが存在するにもかかわらず、これらのアイソフォームには共通の配列があり、１つの結合分子、特に１つの抗体によってすべてのアイソフォームが標的化されることを意味している。
【0021】
ＣＤ４５の細胞内（ＣＯＯＨ末端）領域には２つのＰＴＰ触媒ドメインがあり、細胞外領域はエクソン４、５、６（それぞれＡ、Ｂ、Ｃと呼ぶ）の選択的スプライシングとグリコシル化のレベルの違いにより非常に多様である。検出されるＣＤ４５アイソフォームは、細胞型、成熟度、活性化状態に特異的である。一般に、タンパク質のロングフォーム（Ａ、Ｂ又はＣ）はナイーブ又は未活性化Ｂ細胞に発現し、ＣＤ４５（ＲＯ）の成熟又は切断形態が活性化又は成熟／記憶‐Ｂ細胞上に発現する。
【0022】
ＣＤ４５のヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０８５７５で入手可能であり、シグナルペプチドを欠いた、配列番号４１又は配列番号４１のアミノ酸２４～１３０４で本明細書に提供される。ヒトＣＤ４５の細胞外ドメイン１～４のアミノ酸配列は、配列番号１１３に提供される。ＣＤ４５のマウスバージョンは、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ０６８００に提供されている。本発明は、任意の種に由来するＣＤ４５の全ての形態に関連する。一つの実施形態では、ＣＤ４５は哺乳類ＣＤ４５である。特に好ましい一実施形態では、ＣＤ４５は、タンパク質のヒト形態、及びその天然バリアント及びアイソフォームを指す。一つの好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、所定の種によって発現されるＣＤ４５の全てのアイソフォームに結合することができる。例えば、結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５の全てのヒトアイソフォームと結合することができる。結合分子の混合物が、特に抗体の混合物が採用される一実施形態では、集合的に、それらは、ある種のＣＤ４５のアイソフォームの全て、特にＣＤ４５の全てのヒトアイソフォームに結合することができるかもしれない。代替の実施形態において、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５の特定のアイソフォームに対して特異的である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、齧歯類ＣＤ４５を結合することができ、例えば、齧歯類及びヒトＣＤ４５の双方を結合することができる。
【0023】
好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、対象によって発現されたＣＤ４５のアイソフォームの全てに結合することができる。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、対象によって発現されるＣＤ４５のアイソフォームの全てに特異的に結合することができるが、他のタンパク質には結合できない。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、対象によって発現されるＣＤ４５のアイソフォームの全てに共通するＣＤ４５の細胞外領域を認識する。一つの好ましい実施形態において、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、配列が配列番号１１３として提供されるＣＤ４５の細胞外ドメイン内の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する少なくとも２つの異なる特異性を含む。代替の実施形態では、本発明の結合分子（単数又は複数）、特に抗体（単数又は複数）は、ＣＤ４５の細胞内領域と結合する。
【0024】
結合分子
本発明は、結合分子、特にＣＤ４５に特異的な結合分子を提供する。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体である。代替的に、本発明の結合分子は抗体ではない。抗体について本明細書に記載されていることは、特に断らない限り、本発明の結合分子一般にも適用することができ、その逆もまた然りである。一実施形態では、抗体ではない本発明の結合分子は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールド又は骨格に基づく構造を有する分子の結合ドメインに使用される生体適合性フレームワーク構造を含んでいてもよい。本発明の代替結合分子の例には、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノステイン、チトクロームｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ‐Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくもの（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，４６３－４６９（構造生物学における現在の意見）参照）などが含まれる。本明細書で使用される「結合分子」という用語は、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ダーピン（Ｄａｒｐｉｎｓ）、フィロマー（Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎｓ）、マイクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）及びクニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎｓ）などの生体スキャフォールドに基づく結合分子も含んでいる。
本発明は、結合分子、特にＣＤ４５に特異的な結合分子を提供する。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、抗体である。代替的に、本発明の結合分子は抗体ではない。抗体について本明細書に記載されていることは、特に断らない限り、本発明の結合分子一般にも適用することができ、その逆もまた然りである。一実施形態では、抗体ではない本発明の結合分子は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールド又は骨格に基づく構造を有する分子の結合ドメインに使用される生体適合性フレームワーク構造を含んでいてもよい。本発明の代替結合分子の例には、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノステイン、チトクロームｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ‐Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくもの（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，４６３－４６９（構造生物学における現在の意見）参照）などが含まれる。本明細書で使用される「結合分子」という用語は、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ダーピン（Ｄａｒｐｉｎｓ）、フィロマー（Ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎｓ）、マイクロボディ（Ｍｉｃｒｏｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）及びクニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎｓ）などの生体スキャフォールドに基づく結合分子も含んでいる。
【0025】
ＣＤ４５と結合することができる小分子は、本発明の結合分子として使用することもできる。一実施形態では、採用され得る小分子は、例えば、ペプチド、環化ペプチド、及び大環状化合物を含む。例えば、ペプチド‐ｍＲＮＡライブラリーは、所望のペプチドを同定するために使用されてもよい。一実施形態では、そのような分子のライブラリーをｃＤＮＡ‐ペプチドに変換し、次にＣＤ４５と結合するのに必要な能力を有するペプチドを同定するためにスクリーニングし、次に所望の特性を有する選択したｃＤＮＡペプチドをＰＣＲに供してｃＤＮＡの配列、ひいてはペプチドを同定する。一実施形態では、Ｒａ ＰｈａｒｍａのＥｘｔｒｅｍｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（商標）プラットフォームが、このようなスクリーニングに採用され得る。別の実施形態では、スキャフォールドで修飾されたペプチドのライブラリーは、ＣＤ４５と結合する能力についてスクリーニングされてもよく、例えば、そのようなライブラリースクリーニングのためにＢｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのアプローチを用いることができる。
【0026】
本発明の結合分子は、ＣＤ４５に対して少なくとも１つの特異性を有するであろう。結合分子の「特異性」は、結合分子が結合する標的を示し、典型的には、本発明の文脈では、結合分子が標的のどこに結合するかも示す。したがって、例えば、ある結合分子の２つの特異性は、両方ともＣＤ４５に対して特異的であるが、ＣＤ４５自体の異なる部分に結合し、したがってＣＤ４５に対して異なる特異性を表すことができる。典型的には、結合分子の特定の部分（単数又は複数）がＣＤ４５と結合し、例えば、結合分子の結合部位がＣＤ４５と結合することになる。抗体の場合、抗原結合部位がＣＤ４５を結合し、特異性を付与することになる。一実施形態では、ＣＤ４５と結合する抗体の部分は、ＣＤ４５に特異的な抗体のパラトープと称される。ＣＤ４５の結合部分は、例えば、抗体のエピトープと呼ばれることがある。
【0027】
一実施形態では、本発明の結合分子はトランス結合を示し、すなわち、それは同時に複数のＣＤ４５の分子と結合する。このようなトランス結合は、典型的にはＣＤ４５の架橋をもたらし、それゆえ、本発明の特に好ましい実施形態を表す。一つの実施形態において、本発明の結合分子は、その結合部位でＣＤ４５の１つの分子だけを結合するように、ＣＤ４５のシス結合を示すことができる。このような実施形態では、ＣＤ４５の異なる分子に結合した結合分子を架橋するために、さらなる結合剤が使用されてもよい。
【0028】
本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、それゆえ、ＣＤ４５の異なる部分、特に異なるエピトープをそれぞれ結合する少なくとも２つの異なる特異性を含んでいてもよいという意味で、多特異的であってもよい。本発明の文脈における多特異性又は二重特異性結合分子は、したがって、必ずしも異なる分子への結合を必要としない：それは、同じ標的分子上、特にＣＤ４５上の異なる部位に結合する異なる結合部位を含む本発明の結合分子、特に本発明の抗体を包含している。以下でさらに議論するように、本発明の結合分子は、ＣＤ４５に対してだけでなく、ＣＤ４５以外の標的に対しても更なる特異性を含んでいてもよい。一つのさらなる実施形態では、さらなる特異性は、血清アルブミンに対するものである。
【0029】
好ましい実施形態において、本発明の結合分子は、ＣＤ４５に対する２つの異なる特異性を含んでいてもよい。好ましい一実施形態では、２つの異なる特異性は、重なり合わないＣＤ４５の部分を結合する。結合分子が抗体である１つの実施形態では、特異性がＣＤ４５の非同一エピトープを結合することであってもよい。一実施形態では、エピトープは重なってもよいが、非同一であってもよい。別の実施形態では、それらは全く重なっていないかもしれない。一実施形態では、２つの異なる特異性は、ＣＤ４５への結合について互いに競合しないものとして、又は互いに交差ブロックしないものとして、又は有意にそうしないものとして定義されてもよい。以下でさらに議論するように、ＣＤ４５に対する特異性が異なるかどうかを決定する１つの好ましい方法は、交差ブロックアッセイ又は競合アッセイを行うことである。結合分子は、好ましくは、互いに競合又は交差ブロッキングをしない。それらは典型的には、両方とも同時にＣＤ４５を結合することができるが、非同一のエピトープで結合することができるはずである。
【0030】
結合分子、特に抗体が有する結合部位の数は、その価数と呼ばれることがあり、各価数は結合部位を表し、抗体の場合は抗体の１つの抗原結合部位を表す。各価数は、同じ又は異なる特異性を表すことができ、例えば、二重特異性ＩｇＧ抗体は、２の価数及び２つの異なる特異性を有する。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有していてもよい。それは、例えば、ＣＤ４５に対して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なる特異性を有していてもよい。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５に対する２つ又は３つの異なる特異性、特にＣＤ４５に対する異なる特異性を付与する少なくとも２つの異なる抗原結合部位を含んでいてもよい。一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５に対する３つの異なる特異性を含む。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５に対する２つの異なる特異性を含む。一実施形態では、抗体は、少なくとも２つの異なるパラトープを含んでよく、ここで各パラトープは、ＣＤ４５の異なるエピトープに対して特異的である。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、２の価数を有し、ＣＤ４５に対する２つの異なる特異性を有する。別の実施形態では、それは３の価数を有し、それらの価数のうちの２つは、ＣＤ４５に対する異なる特異性に対応する。一実施形態では、他の価数は、血清アルブミンに対する特異性である。
【0031】
別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、分子の各結合部位がＣＤ４５に対して特異的である、３価の価数を有していてもよい。一つの好ましい実施形態では、３つの結合部位は全て、ＣＤ４５に対して異なる特異性を有することになる。したがって、１つの好ましい実施形態では、結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５に対して３つの異なる特異性を有していてもよい。そのような分子は、したがって、例えば、ＣＤ４５に対する３つの異なるパラトープを有していてもよい。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、結合分子、特に抗体は、多価であり、好ましくはＣＤ４５に対して多特異的である。したがって、ＣＤ４５に対して多特異的である結合分子も提供される。特に、それらは提供され、ＣＤ４５に対してマルチパラトピック（ｍｕｌｔｉ－ｐａｒａｔｏｐｉｃ）である。例えば、１つの実施形態において、結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５に対して３つ、４つ、又はそれ以上の異なる特異性を有し、特にそのような数のパラトープを有していてもよい。好ましい一実施形態では、それは、ＣＤ４５に対して２、３、又は４つの異なる特異性を有する。特に、それは、ＣＤ４５に対してそのような数の異なるパラトープを有していてもよい。一つの特に好ましい実施形態において、それは、ＣＤ４５に対する３つの異なる特異性を有し、好ましくは、それは、ＣＤ４５に対する３つの異なるパラトープを有する。別の好ましい実施形態では、ＣＤ４５に対してそのような数の特異性／パラトープを有するだけでなく、本発明の結合分子、特に抗体は、別の結合部位によって付与されたＣＤ４５ではない抗原に対する少なくとも１つの他の特異性も有する。例えば、結合分子はまた、ＣＤ４５を結合するものとは別の結合部位を通してアルブミンに結合することができるかもしれない。
【0032】
一つの特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子（単数又は複数）、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５と結合し、ＣＤ４５の多量体化をもたらすことができる。一つの実施形態において、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５の細胞外部分に結合して、ＣＤ４５の多量体化をもたらす。代替の実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５の細胞内部分に結合し得る。好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、ＣＤ４５の細胞内部分に結合して、ＣＤ４５の多量体化をもたらすことができる。
【0033】
本発明の結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５を多量化するために使用され得る。特に、それらは、標的細胞の表面上のＣＤ４５を多量化するために採用され得る。ＣＤ４５多量体は、特に、本発明の結合分子（単数又は複数）を介して連結された２つ以上のＣＤ４５分子の高次構造である。例えば、１つの実施形態において、ＣＤ４５の多量体は、少なくとも２つのＣＤ４５分子を含み得る。特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５の多量体は、少なくとも３つのＣＤ４５分子を含む。一実施形態では、ＣＤ４５の多量体は、本発明の結合分子によって一緒に結合された少なくとも３、４、５、６、７、又はそれ以上のＣＤ４５分子を含んでもよい。本明細書で議論するように、質量測定のような技術は、本発明の結合分子と複合体化したＣＤ４５の多量体を同定するために、したがってＣＤ４５の多量体を生成する本発明の結合分子（複数可）の能力を測定するために使用され得る。一実施形態において、本発明の結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５を架橋するために使用される。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（単数又は複数）は、標的細胞の表面上のＣＤ４５分子を架橋するために使用される。さらなる実施形態では、それらは、ＣＤ４５の内部部分に結合し、そのようにＣＤ４５を架橋し、好ましくはＣＤ４５の多量体を生成する。
【0034】
結合分子の混合物
別の実施形態では、単一の結合分子ではなく、少なくとも２つの異なる結合分子の混合物が提供され得る。例えば、一実施形態では、少なくとも２つの異なる結合分子の混合物が提供され、混合物中の個々の結合分子はＣＤ４５に対して１つの特異性のみを有するが、集合的に結合分子の混合物はＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有している。したがって、結合分子の混合物の使用は、ＣＤ４５の架橋を促進するさらなる方法である。結合分子の混合物、特に抗体の混合物であって、混合物の個々の結合分子がＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有する混合物もまた提供される。別の実施形態では、集合的にＣＤ４５に対して１つの特異性のみを有する結合分子の混合物が採用され得る。本発明の結合分子（単数及び複数）の両方は、他の治療剤とともに混合物として提供されてもよい。
結合分子への言及がなされる本明細書のあらゆる場所で、結合分子の混合物が、特に明記されない限り、代替的に採用され得る。例えば、本明細書において個々の抗体が言及されている箇所では、特に断らない限り、少なくとも２つの異なる抗体の混合物を代替的に採用することができる。その逆もまた然りである。
別の実施形態では、単一の結合分子ではなく、少なくとも２つの異なる結合分子の混合物が提供され得る。例えば、一実施形態では、少なくとも２つの異なる結合分子の混合物が提供され、混合物中の個々の結合分子はＣＤ４５に対して１つの特異性のみを有するが、集合的に結合分子の混合物はＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有している。したがって、結合分子の混合物の使用は、ＣＤ４５の架橋を促進するさらなる方法である。結合分子の混合物、特に抗体の混合物であって、混合物の個々の結合分子がＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有する混合物もまた提供される。別の実施形態では、集合的にＣＤ４５に対して１つの特異性のみを有する結合分子の混合物が採用され得る。本発明の結合分子（単数及び複数）の両方は、他の治療剤とともに混合物として提供されてもよい。
結合分子への言及がなされる本明細書のあらゆる場所で、結合分子の混合物が、特に明記されない限り、代替的に採用され得る。例えば、本明細書において個々の抗体が言及されている箇所では、特に断らない限り、少なくとも２つの異なる抗体の混合物を代替的に採用することができる。その逆もまた然りである。
【0035】
生体分子のスクリーニング
結合分子そのものと同様に、本発明は、本発明の結合分子を同定するための方法、及びかかる結合分子の有効性を決定するための方法も提供する。本明細書には、様々な機能的アッセイが開示されており、それらは、例えば、採用することができる。
例えば、本発明は、ＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ）ＣＤ４５と結合することができる結合分子（単数又は複数）を、ＣＤ４５を発現する標的細胞と接触させ；及び（ｂ）標的細胞が細胞死を起こすかどうかを決定することを含んでいる。一実施形態では、本方法は、（ｃ）試験サンプルにおいてサイトカインが放出されるかどうかを決定すること、例えば、ＣＣＬ２、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、及びＭ‐ＣＳＦの１つ又は複数のレベルが測定される場合、をさらに含む。一実施形態では、結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５を多量化することができるものとして既に同定されている。別の実施形態では、本方法は、例えば、ＣＤ４５を多量体化する能力について２つ以上の異なる結合分子の順列をスクリーニングすることにより、ＣＤ４５を多量体化する能力についてＣＤ４５に特異的な結合分子を最初にスクリーニングすることを含む。
結合分子そのものと同様に、本発明は、本発明の結合分子を同定するための方法、及びかかる結合分子の有効性を決定するための方法も提供する。本明細書には、様々な機能的アッセイが開示されており、それらは、例えば、採用することができる。
例えば、本発明は、ＣＤ４５を多量体化して細胞死を誘導することができる結合分子（単数又は複数）をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、（ａ）ＣＤ４５と結合することができる結合分子（単数又は複数）を、ＣＤ４５を発現する標的細胞と接触させ；及び（ｂ）標的細胞が細胞死を起こすかどうかを決定することを含んでいる。一実施形態では、本方法は、（ｃ）試験サンプルにおいてサイトカインが放出されるかどうかを決定すること、例えば、ＣＣＬ２、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、及びＭ‐ＣＳＦの１つ又は複数のレベルが測定される場合、をさらに含む。一実施形態では、結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５を多量化することができるものとして既に同定されている。別の実施形態では、本方法は、例えば、ＣＤ４５を多量体化する能力について２つ以上の異なる結合分子の順列をスクリーニングすることにより、ＣＤ４５を多量体化する能力についてＣＤ４５に特異的な結合分子を最初にスクリーニングすることを含む。
【0036】
一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なる特異性を含む生体分子を同定する方法を提供する。例えば、本方法は、ＣＤ４５に対する特異性の一対の順列のライブラリーをスクリーニングすることを含んでいてもよい。一実施形態では、一対の順列は、例えば質量測光によって、ＣＤ４５を多量化する能力についてスクリーニングされる。別の実施形態では、それらは、ＣＤ４５を発現する標的細胞の殺傷をもたらすそれらの能力についてスクリーニングされる。別の実施形態では、それらは、サイトカイン放出を誘発しない一方で、そのような標的細胞を殺傷する能力についてスクリーニングされる。様々な機能的アッセイ及びスクリーニング形式が本明細書に記載されており、それらのいずれもが使用され得る。一実施形態では、Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ形式は、一対の組合せをスクリーニングするために使用される。一実施形態では、一対の順列が評価される場合、スクリーニングはまた、ただ１つのそのような特異性を有する等価分子と比較することを含んでいてもよい。
【0037】
別の実施形態では、少なくとも２つの結合分子の望ましい混合物を同定するために、ＣＤ４５に特異的な異なる個々の結合分子の混合物の様々な順列が、所望の特性についてスクリーニングされ得る。一実施形態では、スクリーニングはまた、混合物の活性を個々の結合分子の活性と比較する。したがって、本発明は、ＣＤ４５を多量化することができるが、有意なレベルまでサイトカインを誘導しない本発明の結合分子の混合物を同定する方法であって、ＣＤ４５に特異的な個々の結合分子のパネルの様々な順列を含む混合物をスクリーニングし、所望の特性の最高レベルのものを与える混合物を同定することを含む、方法を提供する。例えば、アッセイは、最高レベルの多量体化を与える混合物を同定してもよいし、あるいは、ＣＤ４５を発現する標的細胞の最高レベルの細胞殺傷を与える混合物を同定してもよい。この方法は、サイトカインを放出することなく最高レベルの細胞殺傷を与える混合物を同定することを含み得る。
【0038】
抗体
特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５に対する抗体（単数又は複数）である。したがって、結合分子（単数又は複数）が言及される本明細書に概説される実施形態のいずれにおいても、好ましくは、抗体（単数又は複数）が採用される。用語「抗体」は、本明細書で議論される重鎖及び／又は軽鎖の様々な形式を含むものを含む、本明細書で開示される様々な抗体形式を含む。したがって、例えば、用語「抗体」は、本明細書で議論されるＦａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ、ＢＹｂｅ、ＴｒＹｂｅ、及びオンサイト多量体化ＩｇＧ抗体形式を特に含む。用語「抗体」はまた、抗体フラグメントを含み、好ましくは本明細書で言及されるものである。本明細書で論じるように、１つの特に好ましい抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ４である。
特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子（単数又は複数）は、ＣＤ４５に対する抗体（単数又は複数）である。したがって、結合分子（単数又は複数）が言及される本明細書に概説される実施形態のいずれにおいても、好ましくは、抗体（単数又は複数）が採用される。用語「抗体」は、本明細書で議論される重鎖及び／又は軽鎖の様々な形式を含むものを含む、本明細書で開示される様々な抗体形式を含む。したがって、例えば、用語「抗体」は、本明細書で議論されるＦａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ、ＢＹｂｅ、ＴｒＹｂｅ、及びオンサイト多量体化ＩｇＧ抗体形式を特に含む。用語「抗体」はまた、抗体フラグメントを含み、好ましくは本明細書で言及されるものである。本明細書で論じるように、１つの特に好ましい抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ４である。
【0039】
特に好ましい実施形態では、抗体の配列は、ホモダイマー形成よりもヘテロダイマー形成に有利なように、抗体が２種類の異なる重鎖を含み、それゆえ２種類の異なる特異性を有するようにする。あるいは、ホモダイマー抗体よりもヘテロダイマー抗体の精製を可能にするような修飾を有していてもよい。このような形式は、特に、所望の抗体が２つの異なる特異性を有するものであり、それゆえ、抗体が２つの異なる重鎖を有し、各特異性に対して１つであることが望まれる場合に使用され得る。
【0040】
上述したように、結合分子の特異性は、結合分子が結合する標的を示し、また標的のどこに結合するのかを示すことがある。したがって、抗体の場合、それは、抗体の抗原結合部位が結合する標的を示し、標的のどこに結合するかを示す。抗体の場合、抗体の抗原結合部位は、その抗体の特異性をもたらすと言える。２つの抗体がともにＣＤ４５に結合するが、その結合部位が同一ではない場合、ＣＤ４５に対する特異性が異なると言える。例えば、位置は重なっていても非同一であったり、全く重なっていなかったりする。抗体の「パラトープ」とは、抗体の抗原結合部位のうち、抗原を認識して結合する部分をいう。特に、パラトープは、抗原のエピトープを認識し結合する抗体の部分である。好ましい一実施形態では、２つの異なる特異性又はパラトープが言及される場合、それらは、それぞれがＣＤ４５の異なる部分と結合するという意味で異なるであろう。特に、各々がＣＤ４５の異なるエピトープと結合することになる。一実施形態において、ＣＤ４５の異なる特異性又はパラトープが言及される場合、それはＣＤ４５の異なる、特に非同一のエピトープが結合することを意味する場合がある。したがって、１つの好ましい実施形態では、結合したＣＤ４５のエピトープは非同一である。一実施形態では、異なる特異性がＣＤ４５のための異なるパラトープに対応することを表す。
【0041】
一実施形態では、本発明の抗体の特異性、特にパラトープは、それぞれ、ＣＤ４５の異なるエピトープに結合する。「異なるエピトープ」に結合することは、２つのエピトープが同一でないことを意味する。好ましい一実施形態では、認識された２つの異なるエピトープは、全く重ならない。例えば、好ましい実施形態では、認識されるエピトープは、ＣＤ４５の直鎖アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸によって分離されている。別の好ましい実施形態では、認識された２つのエピトープは、ＣＤ４５の直鎖配列において少なくとも５、１０、１５、２０、５０、１００又はそれ以上のアミノ酸によって分離されている。別の実施形態では、２つの異なるエピトープは、例えば、ＣＤ４５の直鎖配列において５個以下のアミノ酸によって、少量重なってもよい。別の実施形態では、エピトープは、４個以下のアミノ酸、例えば３個以下のアミノ酸、好ましくは２個以下のアミノ酸によって重なってもよい。別の好ましい実施形態では、エピトープは、ＣＤ４５の直鎖配列において、１つのみのアミノ酸によって重なるか、又は全く重ならないであろう。一実施形態では、エピトープが非直鎖状である場合、例えばそれらがコンフォメーションエピトープである場合、エピトープとして結合したＣＤ４５の部分に何らかの重複があるが、結合したＣＤ４５の二つの部分は同一ではないだろう。ある実施形態では、コンフォメーションエピトープは全く重ならないだろう。
【0042】
一実施形態では、結合分子、特に抗体に対する２つの特異性が異なるかどうかを決定することが望まれる場合、２つの特異性のそれぞれについて、想定される特異性の一方だけを有する結合分子が生成され、好ましくは、結合分子は同じ価数を有するが、存在する特異性においてのみ異なる場合に、結合分子は生成される。結合アッセイにおいて、それら２つの結合分子が競合又は交差ブロックする能力が決定される。特に、そのようなアッセイは、両方の結合分子がＣＤ４５と結合することができるが、ＣＤ４５に対する互いの結合を有意に減少させないかどうかを決定することになる。したがって、例えば、交差ブロック又は競合アッセイは、好ましい実施形態において、各結合分子のＣＤ４５への結合を個別に比較することができるが、両方の結合分子がＣＤ４５と一緒に混合された場合にも比較することができる。一実施形態では、所望の抗体は、他方の結合を減少させない。
【0043】
例えば、抗体の場合、同じ価数の抗体は、その抗体の（各々の）結合部位が特異性のうちの１つだけを付与するように生成される。このような各特異性の抗体が、互いに競合又は交差ブロックする能力が決定される。しかし、抗体は両方とも依然としてＣＤ４５と結合するはずである。好ましい実施形態では、各特異性の一価抗体、例えばｓｃＦｖ又はＦａｂが生成され、次に各特異性の抗体の交差ブロック又は競合する能力が測定されるであろう。別の方法では、各特異性のための二価の抗体が生成され、それぞれが他方を競合又は交差ブロックする能力が決定される。好ましい一実施形態では、比較に使用される抗体は、特異性を付与する領域の違いを除けば同一であり、例えば、異なる可変領域のみを有し、特にパラトープの点でのみ異なるだけである。例えば、２つの抗体は、パラトープのための異なる可変領域においてのみ異なっていてもよい。一実施形態では、そのような比較が行われる場合、交差ブロックは見られない。別の実施形態では、有意な交差ブロックは見られない。例えば、一方の抗体による他方の抗体による交差ブロックの量は、２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満であってよい。別の好ましい実施形態では、交差ブロックの程度は、５％未満であってもよい。別の実施形態では、交差ブロックの程度は１％未満となる。別の好ましい実施形態では、０％の交差ブロックが見られるであろう。これらのパーセンテージは、例えばＥＬＩＳＡにおいて、第１の抗体が第２の抗体のＣＤ４５への結合を減少させる程度を指す。
【0044】
一実施形態では、本発明の抗体におけるＣＤ４５に対する結合ドメインの親和性は、約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれ以上など、約１００ｎＭ又はそれ以上である。一実施形態では、結合親和性は、５０ｐＭ又はそれ以上である。一実施形態では、抗体の少なくとも１つのパラトープは、ＣＤ４５に対してそのような親和性を有する。別の実施形態では、抗体は、それぞれがＣＤ４５に対して異なる特異性を有する２つのパラトープを有し、ここで、パラトープのすべてが、個々にＣＤ４５に対してそのような親和性を有する。一実施形態では、それは、ＣＤ４５に対する抗体の全体的なアビディティ（親和性）である。一実施形態では、ＣＤ４５に対するパラトープの親和性は、１μΜ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満、又は０．１ｐＭ未満であってよい。いくつかの実施形態では、Ｋｄは、約０．１ｐＭ～約１μΜである。一実施形態では、本発明の抗体は、全体として、ＣＤ４５に対してそのレベルの親和性を有する。一実施形態では、本発明の結合分子は、ＣＤ４５に対してそのような親和性を示すことになる。別の実施形態では、特異性が言及されるところでは、そのような値を示すであろう。さらなる実施形態において、本発明の結合分子、又は結合分子の特異性は、そのような値を示すであろう。
【0045】
本発明の抗体が２つ以上の特異性を有する場合、一実施形態では、抗体は特定の特異性を有するように選択される。例えば、異なる特異性は、それぞれの結合部位がほぼ同様の親和性を有するように選択されてもよい。例えば、個々の特異性の結合親和力は、互いの１００倍以内、好ましくは５０倍以内、特に１０倍以内となるように選択されてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体の異なる特異性は、それらが異なる親和性を有するように選択されてもよい。例えば、一実施形態では、それらは互いに少なくとも１０倍異なっていてもよい。別の実施形態では、それらは互いに少なくとも５０倍異なっていてもよい。さらなる実施形態では、親和性は、互いに少なくとも１００倍異なっていてもよい。別の実施形態では、親和性は、少なくとも１０００倍異なっていてもよい。例えば、そのようなレベルの差は、ＫＤ値で見ることができる。
【0046】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は少なくとも２つの特異性、特にＣＤ４５の異なるエピトープに各々結合する少なくとも２つの異なるパラトープを有するので、それを可能にする任意の適切な抗体形式であってよい。好ましくは、どちらの抗体も他方の結合を著しくブロックする一方で、両者は依然として同時にＣＤ４５と結合することができるはずである。本発明の抗体がＣＤ４５に特異的な少なくとも２つの異なるパラトープを含む実施形態では、典型的には、バイパラトープ抗体（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の各パラトープはＣＤ４５と特異的に結合することができ、２つのパラトープはそれぞれＣＤ４５の異なるエピトープと特異的に結合することができるであろう。したがって、異なる特異性が存在しても、両者の同時結合は可能である。
【0047】
一実施形態では、抗原結合部位及び／又は抗体の各抗原結合部位に２つの可変領域がある場合、２つの可変領域は、ＣＤ４５に対する特異性を提供するために協働することがあり、例えば、それらはコグネイトペアであるか、ドメインが特定の抗原に特異的であるように十分な親和性を提供するように成熟させる。典型的には、それらは重鎖及び軽鎖可変領域ペア（ＶＨ／ＶＬペア）である。一実施形態では、本発明の抗体の２つの異なる抗原結合部位はそれぞれ、「共通」軽鎖とも呼ばれる同じ軽鎖を含むことになる。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ抗体形式であり、そのような共通の軽鎖を含む。一実施形態では、このようなアプローチは、ヘテロダイマー形成に有利な重鎖のノブ・アンド・ホール修飾と組み合わされてもよい。
【0048】
本発明の抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体、又はそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨなど）、ｓｃＦｖ、２価、３価又は４価抗体、Ｂｉｓ‐ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）、ｔｒｉａｂｏｄｙ（トリアボディ）、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ（テトラボディ）又は上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６‐１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ‐Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９‐２１７を参照されたい）。結合分子、特に抗体がある数の結合部位を有するが、言及されたフラグメント又は抗体形式のタイプがその数未満の結合部位を有する本発明の実施形態では、それはまだ全体の結合分子の一部を形成することができる。抗体フラグメントの作成及び製造方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５‐１８１を参照されたい）。本発明で使用するための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含んでもよいし、一重特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい）。
【0049】
本発明の抗体は、本明細書で議論されるいずれの形式であってもよい。一つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＢＹｂｅ、ＴｒＹｂｅ、又はＩｇＧ抗体形式である。そのような抗体形式は、抗体が治療的に採用される本発明の様々な実施形態において特に好ましい。
可能な抗体形式の例は、例えば、レビュー「Ｔｈｅ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ Ａｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（人工多価抗体の時代の到来），Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ ２０ Ｎｕｍｂｅｒ ５ Ｍａｒ ２０１５，ｐａｇｅ ５８８‐５９４，Ｄ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｎｏｖ ２０１１：１０；７９８，Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１０，Ｍａｙ ２０１０，３０１（参照することにより本明細書に取り込まれる）に開示されているように、当業者に既知である。一実施形態では、本発明の抗体は、以下の形式のいずれかを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
可能な抗体形式の例は、例えば、レビュー「Ｔｈｅ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ Ａｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（人工多価抗体の時代の到来），Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ ２０ Ｎｕｍｂｅｒ ５ Ｍａｒ ２０１５，ｐａｇｅ ５８８‐５９４，Ｄ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｎｏｖ ２０１１：１０；７９８，Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１０，Ｍａｙ ２０１０，３０１（参照することにより本明細書に取り込まれる）に開示されているように、当業者に既知である。一実施形態では、本発明の抗体は、以下の形式のいずれかを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
【0050】
・ タンデムｓｄＡｂ、タンデムｓｄＡｂ‐ｓｄＡｂ（３つのｓｄＡｂ）；
・（ｓｃＦｖ）２（タンデムｓｃＦｖとも呼ばれる）、ｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ）２；
・ ｄｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ；
・ ｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ；
・ ダート抗体、すなわち、ＶＨ１とＶＨ２のＣ末端がジスルフィド結合で結合したＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーとＶＨ１リンカーＶＬ２；
・ ＢｉＴＥ（登録商標）、ｄｓＢｉＴＥ、ｄｉｄｓＢｉＴＥ；
・ Ｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２５を参照）、ｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ；
・ ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ；
・ ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ；
・ ｔａｎｄａｂ（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２２を参照）；ｄｓｔａｎｄａｂ、ｄｉｄｓｔａｎｄａｂ、ｔｒｉｄｓｔａｎｄａｂ、ｔｅｔｒａｄｓｔａｎｄａｂ；
・ ＢｙＢｅ又はＴｒＹｂｅ形式の抗体
・ ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２２を参照）、ｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｄｉｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｒｉｄ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｅｔｒａｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２；
・ Ｐｅｎｔａｂｏｄｙ（ペンタボディ）（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２７を参照）；
・（ｓｃＦｖ）２（タンデムｓｃＦｖとも呼ばれる）、ｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ）２；
・ ｄｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ；
・ ｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ；
・ ダート抗体、すなわち、ＶＨ１とＶＨ２のＣ末端がジスルフィド結合で結合したＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーとＶＨ１リンカーＶＬ２；
・ ＢｉＴＥ（登録商標）、ｄｓＢｉＴＥ、ｄｉｄｓＢｉＴＥ；
・ Ｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２５を参照）、ｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙ；
・ ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ；
・ ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ；
・ ｔａｎｄａｂ（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２２を参照）；ｄｓｔａｎｄａｂ、ｄｉｄｓｔａｎｄａｂ、ｔｒｉｄｓｔａｎｄａｂ、ｔｅｔｒａｄｓｔａｎｄａｂ；
・ ＢｙＢｅ又はＴｒＹｂｅ形式の抗体
・ ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２２を参照）、ｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｄｉｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｒｉｄ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、ｔｅｔｒａｄｓ［ｓｃ（Ｆｖ）２］２；
・ Ｐｅｎｔａｂｏｄｙ（ペンタボディ）（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２７を参照）；
【0051】
・ Ｆａｂ‐ｓｃＦｖ（ｂｉｂｏｄｙともいう）、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ（又はＢＹｂｅ）、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ；
・ ｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｏｄｙ（ＦａｂｄｉｄｓｓｃＦｖ又はＴｒＹｂｅ又はＦａｂ‐（ｄｓｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）、Ｆａｂ’ｄｉｄｓｓｃＦｖ；
・ Ｆａｂｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’ｄａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ；
・ Ｆａｂ単一リンカーＦｖ（ＷＯ２０１４／０９６３９０に開示されているように、本明細書ではＦａｂｄｓＦｖとも呼ばれる）、Ｆａｂ’単一リンカーＦｖ（本明細書ではＦａｂ’ｄｓＦｖとも呼ばれる）；
・ ＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ ＦａｂｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ ＦｖＦａｂＦｖ、ＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ｄｓＦｖＦａｂＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ；
・ ＦａｂＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖｄｓＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖ；
・ ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、化学的に結合されたｄｉＦａｂ’を含む；
・（ＦａｂｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（ＦａｂｄｓｃＦｖ）２；
・（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２，（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ，（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ，（Ｆａｂ’ｄｓｃＦｖ）２；
・ ｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｏｄｙ（ＦａｂｄｉｄｓｓｃＦｖ又はＴｒＹｂｅ又はＦａｂ‐（ｄｓｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）、Ｆａｂ’ｄｉｄｓｓｃＦｖ；
・ Ｆａｂｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’ｄａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ；
・ Ｆａｂ単一リンカーＦｖ（ＷＯ２０１４／０９６３９０に開示されているように、本明細書ではＦａｂｄｓＦｖとも呼ばれる）、Ｆａｂ’単一リンカーＦｖ（本明細書ではＦａｂ’ｄｓＦｖとも呼ばれる）；
・ ＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ ＦａｂｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ；
・ ＦｖＦａｂＦｖ、ＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ｄｓＦｖＦａｂＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ；
・ ＦａｂＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖｄｓＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖ；
・ ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、化学的に結合されたｄｉＦａｂ’を含む；
・（ＦａｂｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（ＦａｂｄｓｃＦｖ）２；
・（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２，（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ，（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ，（Ｆａｂ’ｄｓｃＦｖ）２；
【0052】
・ ＶＨＨＣＫ（Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号６を参照）；
・ ｍｉｎｉｂｏｄｙ（ミニボディ）、ｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ；
・ ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ミニ抗体）（ＺＩＰ）［Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号７を参照］、ｄｓｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ＺＩＰ）及びｄｉｄｓｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ＺＩＰ）；
・ ｔｒｉｂｉ－ｍｉｎｉｂｏｄｙ［Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号１５を参照］ｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ；
・ ｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３；
・ タンデムｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｔｒｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｔｅｔｒａｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３；
・ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわちＵＳ８，４０９，５７７に記載されている結合ドメイン、リンカー‐ＣＨ２ＣＨ３結合ドメイン；
・ ＳＭＩＰ（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわち、（ｓｃＦｖ‐ＣＨ２ＣＨ３）２；
・ （ｄｓＦｖＣＨ２ＣＨ３）２、タンデムｓｃＦｖ‐Ｆｃ、タンデムｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖ‐Ｆｃ、タンデムｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃ；
・ ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｄｓｓｃＦｖ；
・ ｍｉｎｉｂｏｄｙ（ミニボディ）、ｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ；
・ ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ミニ抗体）（ＺＩＰ）［Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号７を参照］、ｄｓｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ＺＩＰ）及びｄｉｄｓｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ（ＺＩＰ）；
・ ｔｒｉｂｉ－ｍｉｎｉｂｏｄｙ［Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号１５を参照］ｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｒｉｂｉ‐ｍｉｎｉｂｏｄｙ；
・ ｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３；
・ タンデムｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｔｒｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｔｅｔｒａｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３；
・ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわちＵＳ８，４０９，５７７に記載されている結合ドメイン、リンカー‐ＣＨ２ＣＨ３結合ドメイン；
・ ＳＭＩＰ（Ｔｒｕｂｉｏｎ）すなわち、（ｓｃＦｖ‐ＣＨ２ＣＨ３）２；
・ （ｄｓＦｖＣＨ２ＣＨ３）２、タンデムｓｃＦｖ‐Ｆｃ、タンデムｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖ‐Ｆｃ、タンデムｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃ；
・ ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｄｓｓｃＦｖ；
【0053】
・ ｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｒｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐ＦＣ、ｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐ＦＣ、ｔｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｔｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ；
・ 二又は三機能性抗体、例えば、異なる重鎖可変領域と共通の軽鎖を有するもの、例えば、Ｍｅｒｕｓ二重特異性抗体形式（Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標））であって、固定配列の共通軽鎖及び異なる重鎖（異なるＣＤＲを含む）及び異なる重鎖の二量体化を促進するために設計されたＣＨ３ドメインを有するもの；。
・ Ｄｕｏｂｏｄｙ（デュオボディ）（すなわち、抗体の一方の全長鎖が抗体の他方の全長鎖に対して異なる特異性を有するもの）；
・ Ｆａｂアーム交換が二重特異性形式を作るために採用された完全長抗体；
・ 二又は三機能性抗体、ここで全長抗体は共通の重鎖と異なる軽鎖を有し、カッパ／ラムダ体又はκ／λ体とも呼ばれる、例えば、参照により本書に組み込まれるＷＯ２０１２／０２３０５３を参照。
・ 二又は三機能性抗体、例えば、異なる重鎖可変領域と共通の軽鎖を有するもの、例えば、Ｍｅｒｕｓ二重特異性抗体形式（Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標））であって、固定配列の共通軽鎖及び異なる重鎖（異なるＣＤＲを含む）及び異なる重鎖の二量体化を促進するために設計されたＣＨ３ドメインを有するもの；。
・ Ｄｕｏｂｏｄｙ（デュオボディ）（すなわち、抗体の一方の全長鎖が抗体の他方の全長鎖に対して異なる特異性を有するもの）；
・ Ｆａｂアーム交換が二重特異性形式を作るために採用された完全長抗体；
・ 二又は三機能性抗体、ここで全長抗体は共通の重鎖と異なる軽鎖を有し、カッパ／ラムダ体又はκ／λ体とも呼ばれる、例えば、参照により本書に組み込まれるＷＯ２０１２／０２３０５３を参照。
【0054】
・ 重鎖又は軽鎖のＣ末端から１、２、３又は４個のＩｇ‐ｓｃＦｖ、重鎖又は軽鎖のＮ末端から１、２、３又は４個のｓｃＦｖ‐Ｉｇ、重鎖又は軽鎖のＣ末端から１、２、３又は４個の単一リンカーＩｇ‐Ｆｖ、Ｉｇ‐ｄｓｓｃＦｖ（１、２、３又は４個のジスルフィド結合があるもの）、
・ 重鎖又は軽鎖のＮ末端から１、２、３又は４個のＩｇ‐ｄｓｓｃＦｖ（１、２、３又は４個のジスルフィド結合を有する）；
・ Ｉｇ単一リンカーＦｖ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６４４５０を参照）；
・ Ｉｇ‐ｄａｂ、ｄａｂ‐Ｉｇ、ｓｃＦｖ‐Ｉｇ、Ｖ‐Ｉｇ、Ｉｇ‐Ｖ；
・ ｓｃＦａｂＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂｄｓＦｖＦｃ（単一リンカー版ｓｃＦａｖＦｖ）、（ＦａｂＦｖＦｃ）２、（ＦａｂｄｓＦｖＦｃ）２、ｓｃＦａｂ’ＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂ’ｄｓＦｖＦｃ、（Ｆａｂ’ＦｖＦｃ）２、（Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｃ）２；及び
・ ＤＶＤＩｇ、これらは以下でより詳細に説明される。
・ 重鎖又は軽鎖のＮ末端から１、２、３又は４個のＩｇ‐ｄｓｓｃＦｖ（１、２、３又は４個のジスルフィド結合を有する）；
・ Ｉｇ単一リンカーＦｖ（ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６４４５０を参照）；
・ Ｉｇ‐ｄａｂ、ｄａｂ‐Ｉｇ、ｓｃＦｖ‐Ｉｇ、Ｖ‐Ｉｇ、Ｉｇ‐Ｖ；
・ ｓｃＦａｂＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂｄｓＦｖＦｃ（単一リンカー版ｓｃＦａｖＦｖ）、（ＦａｂＦｖＦｃ）２、（ＦａｂｄｓＦｖＦｃ）２、ｓｃＦａｂ’ＦｖＦｃ、ｓｃＦａｂ’ｄｓＦｖＦｃ、（Ｆａｂ’ＦｖＦｃ）２、（Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｃ）２；及び
・ ＤＶＤＩｇ、これらは以下でより詳細に説明される。
【0055】
一実施形態では、抗体形式は、当技術分野で既知のもの及び本明細書に記載のものを含み、例えば、抗体分子形式は、以下のものを含む又はからなる群から選択されるものの１つであるか、又はそれを含む：ｄｉａｂｏｄｙ、ＢＹｂｅ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ、ＴｒＹｂｅ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ‐ｓｃＦｖ、Ｆａｂ‐ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ‐（ｄｓｓｃＦｖ）２、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、タンデムｓｃＦｖ‐Ｆｃ、ｓｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、Ｉｇ‐ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ‐Ｉｇ、Ｖ‐Ｉｇ、Ｉｇ‐Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤＩｇ、これらは以下でより詳細に議論される。本発明で採用するためのさらに好ましい抗体形式は、二重特異性抗体である。
【0056】
一つの好ましい実施形態では、本発明の抗体分子は、Ｆｃドメインを含んでいない、すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含んでいない。例えば、分子は、タンデムｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖ ｄｉｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ（（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ、ｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｓｔｒｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｔｒｉｂｏｄｙ、Ｆａｂｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’ｄａｂ、Ｆａｂ’Ｆｖ、Ｆａｂ単一リンカーＦｖ（ＷＯ２０１４／０９６３９０に開示）、Ｆａｂ’単一リンカーＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖ、Ｆａｂ‐ｓｃＦｖ（ｂｉｂｏｄｙともいう）、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ、ＦａｂｄｉｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ’ｄｉｄｓｓｃＦｖ、ＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、ＦａｂｄｓｓｃＦｖｓ単一リンカーＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖ、ＦｖＦａｂＦｖ、ＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ｄｓＦｖＦａｂＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖ、ＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖ、ｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖ、ＦａｂＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ＦｖｄｓＦｖ、ＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖ、Ｆａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖ、ｄｉｓＦａｂ、化学的に結合したｄｉＦａｂ’を含むｄｉＦａｂ’、（ＦａｂｓｃＦｖ）２、（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖ、（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖ、（ＦａｂｄｓｃＦｖ）２、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、ｄｉｄｓｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３、タンデムｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｄｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、タンデムｔｒｉｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、及びタンデムｔｅｔｒａｄｓｓｃＦｖ‐ＣＨ３、を含む群から選択することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、ｄｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）であるか、又はｄｉａｂｏｄｙを含む。別の実施形態では、それは、デュオボディ（ｄｕｏｂｏｄｙ）であるか、又はデュオボディを含む。
【0057】
以下では、本発明の抗体として、又は抗体全体の一部として、本発明での使用に適した抗体形式についてさらに説明する。
本明細書で用いられる「単一ドメイン抗体」（本明細書ではｄａｂ及びｓｄＡｂとも呼ばれる）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントを指す。単一ドメイン抗体の例としては、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが挙げられる。
本明細書で採用されるタンデム‐ｓｄＡｂは、リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された２つのドメイン抗体を指し、特にドメイン抗体が異なる抗原に対する特異性を有する場合を指す。
本明細書で採用されるタンデム‐ｓｄＡｂ‐ｓｄＡｂは、２つのリンカー、例えばペプチドリンカーによって直列に接続された３つのドメイン抗体を指し、特にドメイン抗体が異なる抗原に対して特異性を有する場合を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖは、可変内ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。ｄｓＦｖは、より大きな分子の成分であってもよく、例えば、可変ドメインの１つが、例えばアミノ酸リンカーを介して別の抗体フラグメント／成分に連結されてもよい。
本明細書で用いられる「単一ドメイン抗体」（本明細書ではｄａｂ及びｓｄＡｂとも呼ばれる）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントを指す。単一ドメイン抗体の例としては、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが挙げられる。
本明細書で採用されるタンデム‐ｓｄＡｂは、リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された２つのドメイン抗体を指し、特にドメイン抗体が異なる抗原に対する特異性を有する場合を指す。
本明細書で採用されるタンデム‐ｓｄＡｂ‐ｓｄＡｂは、２つのリンカー、例えばペプチドリンカーによって直列に接続された３つのドメイン抗体を指し、特にドメイン抗体が異なる抗原に対して特異性を有する場合を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖは、可変内ジスルフィド結合を有するＦｖを指す。ｄｓＦｖは、より大きな分子の成分であってもよく、例えば、可変ドメインの１つが、例えばアミノ酸リンカーを介して別の抗体フラグメント／成分に連結されてもよい。
【0058】
本明細書で採用される（ｄｓＦｖ）２は、例えばペプチドリンカー又はジスルフィド結合（例えば２つのＶＨのＣ末端の間）を介して第２のｄｓＦｖ中のドメインに連結された１つのドメインを有するｄｓＦｖを指し、その形式は後述の（ｓｃＦｖ）２に類似するが、各ペアの可変領域は可変領域内ジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用される成分は、本発明の抗体のビルディングブロック又は部分を指し、特に成分がｓｃＦｖ、Ｆａｂ等の抗体フラグメントである場合、特に本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、本発明の抗体全体の一部として使用され得る。
本明細書で使用される単鎖Ｆｖ又は「ｓｃＦｖ」と略記されるものは、（例えばペプチドリンカーによって）連結されて単一のポリペプチド鎖を形成するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントを意味する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、この形式では省略される。
本明細書で採用される成分は、本発明の抗体のビルディングブロック又は部分を指し、特に成分がｓｃＦｖ、Ｆａｂ等の抗体フラグメントである場合、特に本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、本発明の抗体全体の一部として使用され得る。
本明細書で使用される単鎖Ｆｖ又は「ｓｃＦｖ」と略記されるものは、（例えばペプチドリンカーによって）連結されて単一のポリペプチド鎖を形成するＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントを意味する。重鎖及び軽鎖の定常領域は、この形式では省略される。
【0059】
本明細書で採用されるｄｓｓｃＦｖは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるタンデムｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｓｃＦｖ又は（ｓｃＦｖ）２）ともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して結合した２つのｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるタンデムｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｓｃＦｖｄｓｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結した２つのｓｃＦｖであって、そのうちの１つが可変領域内ジスルフィド結合を有するものを指す。
本明細書で採用されるタンデムｄｉｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｄｓｓｃＦｖともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖであって、各ｓｃＦｖが不変領域ジスルフィド結合を含んでいるものをいう。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖは、例えばペプチドリンカーによって、ジスルフィド結合を介して連結された２つの可変ドメインを含むＦｖドメインに連結され、ｄｓＦｖを形成するｓｃＦｖをいう。この形式では、ｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬは、ｄｓＦｖのＶＨ又はＶＬに連結されてもよい。
本明細書で採用されるタンデムｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｓｃＦｖ又は（ｓｃＦｖ）２）ともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して結合した２つのｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるタンデムｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｓｃＦｖｄｓｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖｓｃＦｖともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結した２つのｓｃＦｖであって、そのうちの１つが可変領域内ジスルフィド結合を有するものを指す。
本明細書で採用されるタンデムｄｉｄｓｓｃＦｖ（本明細書ではｄｉｄｓｓｃＦｖともいう）は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖであって、各ｓｃＦｖが不変領域ジスルフィド結合を含んでいるものをいう。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖは、例えばペプチドリンカーによって、ジスルフィド結合を介して連結された２つの可変ドメインを含むＦｖドメインに連結され、ｄｓＦｖを形成するｓｃＦｖをいう。この形式では、ｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬは、ｄｓＦｖのＶＨ又はＶＬに連結されてもよい。
【0060】
本明細書で採用されるｄｓｓｃＦｖ‐ｄｓＦｖは、２つの可変ドメインがジスルフィド結合を介して結合してｄｓＦｖを形成してなるたＦｖドメインに、ｄｓｓｃＦｖが例えばペプチドリンカーで結合しているものである。この形式では、ｄｓｓｃＦｖのＶＨ又はＶＬは、ｄｓＦｖのＶＨ又はＶＬに連結されていてもよい。
本明細書で採用されるＤｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）とは、２つのＦｖ対ＶＨ／ＶＬ及びさらなるＶＨ／ＶＬ対であって、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結し、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結するような２つのＦｖ間リンカーを有しているものをいう。
本明細書で採用されるｄｓＤｉａｂｏｄｙは、可変領域内ジスルフィド結合を含むｄｉａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓＤｉａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域の各対の間に１つのｄｓを含むｄｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＳｃ‐ｄｉａｂｏｄｙとは、分子が３つのリンカーを含み、例えばＶＨ１リンカーＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーＶＬ２のような２つの正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むｄｉａｂｏｄｙをいう。
本明細書で採用されるＤｉａｂｏｄｙ（ジアボディ）とは、２つのＦｖ対ＶＨ／ＶＬ及びさらなるＶＨ／ＶＬ対であって、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結し、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結するような２つのＦｖ間リンカーを有しているものをいう。
本明細書で採用されるｄｓＤｉａｂｏｄｙは、可変領域内ジスルフィド結合を含むｄｉａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓＤｉａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域の各対の間に１つのｄｓを含むｄｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＳｃ‐ｄｉａｂｏｄｙとは、分子が３つのリンカーを含み、例えばＶＨ１リンカーＶＬ１リンカーＶＨ２リンカーＶＬ２のような２つの正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むｄｉａｂｏｄｙをいう。
【0061】
本明細書で採用されるｄｓｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙとは、可変領域内ジスルフィド結合を持つｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙのことである。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙは、各対の可変領域間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＤａｒｔとは、ＶＬ１リンカーＶＨ２リンカー及びＶＨ１リンカーＶＬ２であって、ＶＨ１及びＶＨ２のＣ末端がジスルフィド結合によって結合しているものをいう。Ｐａｕｌ Ａ．Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ，２０１１；１１７（１７）：４５４２－４５５１。
本明細書で採用されるＢｉｔｅ（登録商標）は、以下の形式の２対の可変ドメインを含む分子を指す；ペア１からのドメイン（例えばＶＨ１）が、ペア２からのドメイン（例えばＶＨ２又はＶＬ２）にリンカーを介して接続され、前記第２のドメインがペア１からのさらなるドメイン（例えばＶＬ１）にリンカーで接続され、今度はペア２からの残りのドメイン（すなわちＶＬ２又はＶＨ２）に接続されたもの。
Ｄｉ－ｄｉａｂｏｄｙは、Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２５を参照されたい。
本明細書で採用されるＤｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙである。
本明細書で採用されるＤｉｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙは、各対の可変領域間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙである。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙは、各対の可変領域間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｓｃ‐ｄｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＤａｒｔとは、ＶＬ１リンカーＶＨ２リンカー及びＶＨ１リンカーＶＬ２であって、ＶＨ１及びＶＨ２のＣ末端がジスルフィド結合によって結合しているものをいう。Ｐａｕｌ Ａ．Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ，２０１１；１１７（１７）：４５４２－４５５１。
本明細書で採用されるＢｉｔｅ（登録商標）は、以下の形式の２対の可変ドメインを含む分子を指す；ペア１からのドメイン（例えばＶＨ１）が、ペア２からのドメイン（例えばＶＨ２又はＶＬ２）にリンカーを介して接続され、前記第２のドメインがペア１からのさらなるドメイン（例えばＶＬ１）にリンカーで接続され、今度はペア２からの残りのドメイン（すなわちＶＬ２又はＶＨ２）に接続されたもの。
Ｄｉ－ｄｉａｂｏｄｙは、Ｎｕｎｅｚ‐Ｐｒａｄｏら、特にその中の図１の分子番号２５を参照されたい。
本明細書で採用されるＤｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙである。
本明細書で採用されるＤｉｄｓｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙは、各対の可変領域間に可変領域内ジスルフィド結合を有するｄｉ‐ｄｉａｂｏｄｙである。
【0062】
本明細書で採用されるＴｒｉａｂｏｄｙ（トリアボディ）とは、３つのＦｖと３つのＦｖ間リンカーを含むｄｉａｂｏｄｙと同様の形式を指す。
本明細書で採用されるｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、可変ドメイン対の１つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｒｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むｔｒｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、３つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域の各対の間に１つのｄｓを含むｔｒｉａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｔｅｔｒａｂｏｄｙは、４つのＦｖと４つのＦｖ間リンカーを含むｄｉａｂｏｄｙと同様の形式を指す。
本明細書で採用されるｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、可変領域対のうちの１つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＴｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、３つの可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを指し、すなわち、３対の可変領域のそれぞれの間に１つのｄｓを含む。
本明細書で採用されるｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、可変ドメイン対の１つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｒｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むｔｒｉａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｔｒｉｄｓｔｒｉａｂｏｄｙは、３つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、可変領域の各対の間に１つのｄｓを含むｔｒｉａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｔｅｔｒａｂｏｄｙは、４つのＦｖと４つのＦｖ間リンカーを含むｄｉａｂｏｄｙと同様の形式を指す。
本明細書で採用されるｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、可変領域対のうちの１つの間に可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、２つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち、２つの可変ドメイン対のそれぞれの間に１つのｄｓを含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるＴｒｉｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、３つの可変領域内ジスルフィド結合を含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを指し、すなわち、３対の可変領域のそれぞれの間に１つのｄｓを含む。
【0063】
本明細書で採用されるＴｅｔｒａｄｓｔｅｔｒａｂｏｄｙは、４つの可変領域内ジスルフィド結合、すなわち各可変ドメイン間に１つのｄｓを含むｔｅｔｒａｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるＴｒｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）とは、軽鎖のＣ末端に第１のｓｃＦｖが付加され、重鎖のＣ末端に第２のｓｃＦｖが付加されたＦａｂフラグメントのことを指す。
本明細書で採用されるｄｓｔｒｉｂｏｄｙは、２つの位置のうちの１つにｄｓｓｃＦｖを含むｔｒｉｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｒｉｂｏｄｙ又はＴｒＹｂｅは、２つのｄｓｓｃＦｖを含むｔｒｉｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦａｂは、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦａｂ’は、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂ’を指す。
ｓｃＦａｂは、一本鎖のＦａｂフラグメントである。
ｓｃＦａｂ’は、一本鎖のＦａｂ’フラグメントである。
ｄｓｓｃＦａｂは一本鎖のｄｓＦａｂである。
ｄｓｓｃＦａｂ’は、一本鎖のｄｓＦａｂ’である。
本明細書で採用されるＦａｂｄａｂは、その重鎖又は軽鎖に、任意にリンカーを介してドメイン抗体が付加されたＦａｂフラグメントを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄａｂは、その重鎖又は軽鎖に、任意にリンカーを介してドメイン抗体が付加されたＦａｂ’フラグメントを指す。
本明細書で採用されるＴｒｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）とは、軽鎖のＣ末端に第１のｓｃＦｖが付加され、重鎖のＣ末端に第２のｓｃＦｖが付加されたＦａｂフラグメントのことを指す。
本明細書で採用されるｄｓｔｒｉｂｏｄｙは、２つの位置のうちの１つにｄｓｓｃＦｖを含むｔｒｉｂｏｄｙを意味する。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｔｒｉｂｏｄｙ又はＴｒＹｂｅは、２つのｄｓｓｃＦｖを含むｔｒｉｂｏｄｙを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦａｂは、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦａｂ’は、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂ’を指す。
ｓｃＦａｂは、一本鎖のＦａｂフラグメントである。
ｓｃＦａｂ’は、一本鎖のＦａｂ’フラグメントである。
ｄｓｓｃＦａｂは一本鎖のｄｓＦａｂである。
ｄｓｓｃＦａｂ’は、一本鎖のｄｓＦａｂ’である。
本明細書で採用されるＦａｂｄａｂは、その重鎖又は軽鎖に、任意にリンカーを介してドメイン抗体が付加されたＦａｂフラグメントを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄａｂは、その重鎖又は軽鎖に、任意にリンカーを介してドメイン抗体が付加されたＦａｂ’フラグメントを指す。
【0064】
本明細書で採用されるＦａｂＦｖは、以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬそれぞれのＣ末端に付加された追加の可変領域を有するＦａｂフラグメントを指す（例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２を参照のこと）。その形式は、例えばＷＯ２０１１／０６１４９２を参照して、そのＰＥＧ化バージョンとして提供されてもよい。
本明細書で採用されるＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ部分がＦａｂ’で置換されているＦａｂＦｖと同様である。その形式は、そのＰＥＧ化バージョンとして提供されてもよい。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が、付加されたＣ末端可変領域を安定化するＦａｂＦｖを指し、例えばＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい。その形式は、ＰＥＧ化されたバージョンとして提供されてもよい。
本明細書で採用されるＦａｂ単一リンカーＦｖ及びＦａｂ’単一リンカーは、例えばペプチドリンカーによって可変ドメインに連結されたＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを指し、前記可変ドメインは可変ドメイン内ジスルフィド結合を介して第２の可変ドメインに連結され、それによってｄｓＦｖを形成し、例えばＷＯ２０１４／０９６３９０を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂ‐ｓｃＦｖ（ｂｉｂｏｄｙとも呼ばれる）は、軽鎖又は重鎖のＣ‐末端に、任意にリンカーを介してｓｃＦｖが付加されたＦａｂ分子である。
本明細書で採用されるＦａｂ’‐ｓｃＦｖは、軽鎖又は重鎖のＣ末端に、任意にリンカーを介してｓｃＦｖが付加されたＦａｂ’分子である。
本明細書で採用されるＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ部分がＦａｂ’で置換されているＦａｂＦｖと同様である。その形式は、そのＰＥＧ化バージョンとして提供されてもよい。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が、付加されたＣ末端可変領域を安定化するＦａｂＦｖを指し、例えばＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい。その形式は、ＰＥＧ化されたバージョンとして提供されてもよい。
本明細書で採用されるＦａｂ単一リンカーＦｖ及びＦａｂ’単一リンカーは、例えばペプチドリンカーによって可変ドメインに連結されたＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを指し、前記可変ドメインは可変ドメイン内ジスルフィド結合を介して第２の可変ドメインに連結され、それによってｄｓＦｖを形成し、例えばＷＯ２０１４／０９６３９０を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂ‐ｓｃＦｖ（ｂｉｂｏｄｙとも呼ばれる）は、軽鎖又は重鎖のＣ‐末端に、任意にリンカーを介してｓｃＦｖが付加されたＦａｂ分子である。
本明細書で採用されるＦａｂ’‐ｓｃＦｖは、軽鎖又は重鎖のＣ末端に、任意にリンカーを介してｓｃＦｖが付加されたＦａｂ’分子である。
【0065】
本明細書で採用されるＦａｂｄｓｓｃＦｖ又はＢＹｂｅは、一本鎖Ｆｖの可変領域間にジスルフィド結合を有するＦａｂｓｃＦｖである。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖは、一本鎖Ｆｖの可変領域間にジスルフィド結合を有するＦａｂ’ｓｃＦｖである。
本明細書で採用されるＦａｂｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂである。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｄｓｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ‐ｄａｂは、ｄｓｓｃＦｖを一方の鎖のＣ末端に、ドメイン抗体を他方の鎖のＣ末端に付加したＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ＦｖのドメインがＦａｂの重鎖又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖが他のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドによって連結されているＦａｂ単一リンカーＦｖを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖは、一本鎖Ｆｖの可変領域間にジスルフィド結合を有するＦａｂ’ｓｃＦｖである。
本明細書で採用されるＦａｂｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂである。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓｃＦｖ‐ｄａｂは、一方の鎖のＣ末端にｄｓｓｃＦｖを、他方の鎖のＣ末端にドメイン抗体を付加したＦａｂを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ‐ｄａｂは、ｄｓｓｃＦｖを一方の鎖のＣ末端に、ドメイン抗体を他方の鎖のＣ末端に付加したＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ＦｖのドメインがＦａｂの重鎖又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖが他のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドによって連結されているＦａｂ単一リンカーＦｖを指す。
【0066】
本明細書で採用されるＦａｂｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖは、ｓｃＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂｓｃＦｖ単一リンカーＦｖを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖは、ＦｖのドメインがＦａｂの重鎖又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖが他のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドによって連結されているＦａｂ’単一リンカーＦｖを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ｓｃＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含んでいるＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖのことを指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に第１のＦｖのドメインが付加され、重鎖及び軽鎖のＣ末端に第２のＦｖのドメインが付加されたＦａｂを指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に第１のＦｖのドメインが付加され、重鎖及び軽鎖のＣ末端に第２のＦｖのドメインが付加されたＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合を含む）及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有するＦａｂを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖは、ＦｖのドメインがＦａｂの重鎖又は軽鎖に連結され、ｓｃＦｖが他のＦａｂ鎖に連結され、Ｆｖのドメインが可変領域内ジスルフィドによって連結されているＦａｂ’単一リンカーＦｖを指す。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓｓｃＦｖ単一リンカーＦｖとは、ｓｃＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含んでいるＦａｂ’ｓｃＦｖ単一リンカーＦｖのことを指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に第１のＦｖのドメインが付加され、重鎖及び軽鎖のＣ末端に第２のＦｖのドメインが付加されたＦａｂを指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に第１のＦｖのドメインが付加され、重鎖及び軽鎖のＣ末端に第２のＦｖのドメインが付加されたＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合を含む）及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有するＦａｂを指す。
【0067】
本明細書で採用されるＦｖＦａｂｄｓＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に第１のＦｖのドメインが付加され、重鎖及び軽鎖のＣ末端に第２のＦｖのドメインが付加され、第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含むＦａｂを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含む）、及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有するＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメインと重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有し、第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含んでいるＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合を含む）及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメイン（第２のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合も含む）を有するＦａｂを指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含む）、及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有するＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメインと重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメインを有し、第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含んでいるＦａｂ’を指す。
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂｄｓＦｖは、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合を含む）及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメイン（第２のＦｖは可変領域内ジスルフィド結合も含む）を有するＦａｂを指す。
【0068】
本明細書で採用されるｄｓＦｖＦａｂ’ｄｓＦｖは、Ｆａｂ’の重鎖及び軽鎖のＮ末端に付加された第１のＦｖのドメイン（第１のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合を含む）、及び重鎖及び軽鎖のＣ末端に付加された第２のＦｖのドメイン（第２のＦｖが可変領域内ジスルフィド結合も含む）を有するＦａｂ’を意味する。
本明細書で採用されるＦａｂＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し、例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂ’ＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し、例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し（例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい）、Ｃ末端に直接付着した第１のＦｖ対が可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し（例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい）、ここで、Ｃ末端に直接付着した第１のＦｖペアは、可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し、例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂ’ＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し、例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し（例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい）、Ｃ末端に直接付着した第１のＦｖ対が可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓＦｖＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し（例えばＷＯ２０１１／０８６０９１を参照されたい）、ここで、Ｃ末端に直接付着した第１のＦｖペアは、可変領域内のジスルフィド結合を含む。
【0069】
本明細書で採用されるＦａｂＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し、分子の「Ｃ」末端の第２のＦｖ対は、可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂ’ＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に２対のＦｖが直列に付加されたＦａｂ’フラグメントを指し、分子の「Ｃ」末端における第２のＦｖ対は、可変領域内ジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し、第１及び第２のＦｖ対は可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し、ここで、第１及び第２のＦｖは可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＤｉＦａｂは、それらの重鎖のＣ末端を介して連結された２つのＦａｂ分子を意味する。
本明細書で採用されるＤｉＦａｂ’は、そのヒンジ領域において１つ以上のジスルフィド結合を介して連結された２つのＦａｂ’分子を意味する。
ＤｉＦａｂ及びＤｉＦａｂ’分子には、その化学的共役形態が含まれる。
本明細書で採用されるＦａｂ’ＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に２対のＦｖが直列に付加されたＦａｂ’フラグメントを指し、分子の「Ｃ」末端における第２のＦｖ対は、可変領域内ジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂｄｓＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂフラグメントを指し、第１及び第２のＦｖ対は可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＦａｂ’ｄｓＦｖｄｓＦｖは、重鎖及び軽鎖のＣ末端に直列に付加された２対のＦｖを有するＦａｂ’フラグメントを指し、ここで、第１及び第２のＦｖは可変領域内のジスルフィド結合を含む。
本明細書で採用されるＤｉＦａｂは、それらの重鎖のＣ末端を介して連結された２つのＦａｂ分子を意味する。
本明細書で採用されるＤｉＦａｂ’は、そのヒンジ領域において１つ以上のジスルフィド結合を介して連結された２つのＦａｂ’分子を意味する。
ＤｉＦａｂ及びＤｉＦａｂ’分子には、その化学的共役形態が含まれる。
【0070】
本明細書で採用される（ＦａｂｓｃＦｖ）２は、２つのｓｃＦｖが付加されたｄｉＦａｂ分子を指し、例えば、重鎖又は軽鎖、例えば、重鎖のＣ‐末端に付加されている。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２は、２つのｓｃＦｖがそれに付加されたｄｉＦａｂ’分子を指し、例えば、重鎖又は軽鎖、例えば、重鎖のＣ‐末端に付加されている。
本明細書で採用される（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｓｃＦｖ及びｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ（例えば重鎖Ｃ‐末端のそれぞれから１つずつ付加されたもの）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ’（例えば、重鎖Ｃ末端のそれぞれから１つずつ付加されたもの）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｄｓｓｃＦｖ及びｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ（例えば、重鎖Ｃ‐末端から）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｄｓｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ’（例えば重鎖Ｃ‐末端から）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’ｓｃＦｖ）２は、２つのｓｃＦｖがそれに付加されたｄｉＦａｂ’分子を指し、例えば、重鎖又は軽鎖、例えば、重鎖のＣ‐末端に付加されている。
本明細書で採用される（Ｆａｂ）２ｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｓｃＦｖ及びｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ（例えば重鎖Ｃ‐末端のそれぞれから１つずつ付加されたもの）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’）２ｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ’（例えば、重鎖Ｃ末端のそれぞれから１つずつ付加されたもの）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｄｓｓｃＦｖ及びｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ（例えば、重鎖Ｃ‐末端から）を指す。
本明細書で採用される（Ｆａｂ’）２ｄｓｓｃＦｖｄｓＦｖは、ｄｓｓｃＦｖとｄｓＦｖが付加されたｄｉＦａｂ’（例えば重鎖Ｃ‐末端から）を指す。
【0071】
本明細書で採用されるＭｉｎｉｂｏｄｙ（ミニボディ）は、（ＶＬ／ＶＨ‐ＣＨ３）２を指す。
本明細書で採用されるｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙは、１つのＶＬ／ＶＨが可変領域内ジスルフィド結合を含む、（ＶＬ／ＶＨ‐ＣＨ３）２を指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙは、（ｄｓＦｖ‐ＣＨ３）２を指す。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、一定領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加されるｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、ＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｄｓｓｃＦｖと、例えばヒンジを介して、定常領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）２の第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して定常領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）２のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるタンデムｓｃＦｖ‐Ｆｃは、２つのタンデムｓｃＦｖを指し、ここで各々は、分子が４つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、一定領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ‐末端に直列に付加される。
本明細書で採用されるｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙは、１つのＶＬ／ＶＨが可変領域内ジスルフィド結合を含む、（ＶＬ／ＶＨ‐ＣＨ３）２を指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｍｉｎｉｂｏｄｙは、（ｄｓＦｖ‐ＣＨ３）２を指す。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、一定領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加されるｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、ＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｄｓｓｃＦｖと、例えばヒンジを介して、定常領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）２の第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるｄｉｄｓｓｃＦｖ‐Ｆｃは、分子が２つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して定常領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）２のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されたｓｃＦｖを指す。
本明細書で採用されるタンデムｓｃＦｖ‐Ｆｃは、２つのタンデムｓｃＦｖを指し、ここで各々は、分子が４つの結合ドメインを有するように、例えばヒンジを介して、一定領域フラグメント‐（ＣＨ２ＣＨ３）のＣＨ２ドメインのＮ‐末端に直列に付加される。
【0072】
本明細書で採用されるＳｃｄｉａｂｏｄｙ‐Ｆｃは、２つのｓｃｄｉａｂｏｄｙであり、各々が、例えばヒンジを介して、定常領域フラグメント‐ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されている。
本明細書で採用されるＳｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖは、４つのｓｃＦｖを指し、ここで、それぞれの１つは、‐ＣＨ２ＣＨ３フラグメントの重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端及びＣ末端に付加されている。
本明細書で採用されるｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３は、それぞれが、例えばヒンジを介してＣＨ３ドメインに連結された２つのｓｃｄｉａｂｏｄｙ分子を指す。
「カッパ／ラムダ体」又は「κ／λ体」は、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する通常のＩｇＧの形式であり、２つの軽鎖は互いに異なり、一方はラムダ軽鎖（ＶＬ‐ＣＬ）、他方はカッパ軽鎖（ＶＫ‐ＣＫ）である。重鎖は、ＷＯ２０１２／０２３０５３に記載されているように、ＣＤＲにおいても同一である。
本明細書で採用されるＩｇＧ‐ｓｃＦｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端にｓｃＦｖを有する全長抗体である。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐ＩｇＧは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ‐末端にｓｃＦｖを有する全長抗体である。
本明細書で採用されるＳｃＦｖ‐Ｆｃ‐ｓｃＦｖは、４つのｓｃＦｖを指し、ここで、それぞれの１つは、‐ＣＨ２ＣＨ３フラグメントの重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端及びＣ末端に付加されている。
本明細書で採用されるｓｃｄｉａｂｏｄｙ‐ＣＨ３は、それぞれが、例えばヒンジを介してＣＨ３ドメインに連結された２つのｓｃｄｉａｂｏｄｙ分子を指す。
「カッパ／ラムダ体」又は「κ／λ体」は、２つの重鎖と２つの軽鎖を有する通常のＩｇＧの形式であり、２つの軽鎖は互いに異なり、一方はラムダ軽鎖（ＶＬ‐ＣＬ）、他方はカッパ軽鎖（ＶＫ‐ＣＫ）である。重鎖は、ＷＯ２０１２／０２３０５３に記載されているように、ＣＤＲにおいても同一である。
本明細書で採用されるＩｇＧ‐ｓｃＦｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端にｓｃＦｖを有する全長抗体である。
本明細書で採用されるｓｃＦｖ‐ＩｇＧは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ‐末端にｓｃＦｖを有する全長抗体である。
【0073】
本明細書で採用されるＶ‐ＩｇＧは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ末端に可変ドメインを有する全長抗体である。
本明細書で採用されるＩｇＧ‐Ｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端に可変ドメインを有する全長抗体である。
ＤＶＤ‐Ｉｇ（デュアルＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、各重鎖及び各軽鎖のＮ末端に１つずつ、さらに４つの可変ドメインを有する完全長抗体である。
本明細書で採用されるｄｕｏｂｏｄｙ（デュオボディ）又は「Ｆａｂ‐アーム交換」は、２つの異なるモノクローナル抗体の定常ドメイン（通常ＣＨ３）において、一致し相補的に設計されたアミノ酸変化が、混合時にヘテロダイマーの形成につながる二重特異性ＩｇＧ形式抗体である。第一抗体からの重：軽鎖ペアは、残基エンジニアリングの結果として、第二抗体の重：軽鎖ペアと結合することが好ましい。例えば、ＷＯ２００８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７を参照されたい。
本明細書で採用されるＩｇＧ‐Ｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端に可変ドメインを有する全長抗体である。
ＤＶＤ‐Ｉｇ（デュアルＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、各重鎖及び各軽鎖のＮ末端に１つずつ、さらに４つの可変ドメインを有する完全長抗体である。
本明細書で採用されるｄｕｏｂｏｄｙ（デュオボディ）又は「Ｆａｂ‐アーム交換」は、２つの異なるモノクローナル抗体の定常ドメイン（通常ＣＨ３）において、一致し相補的に設計されたアミノ酸変化が、混合時にヘテロダイマーの形成につながる二重特異性ＩｇＧ形式抗体である。第一抗体からの重：軽鎖ペアは、残基エンジニアリングの結果として、第二抗体の重：軽鎖ペアと結合することが好ましい。例えば、ＷＯ２００８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７を参照されたい。
【0074】
本発明の抗体は、抗体フラグメントであってもよく、したがって、本明細書における抗体への言及は、抗体フラグメントも含む。一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なるパラトープを含む、本明細書に開示された抗体フラグメントのいずれかであってもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４５に対する単一の抗原結合部位のみを含むが、本発明の結合分子の一部、又は本明細書で論じるような抗体の混合物の１つとして採用される、本明細書で論じる抗体フラグメントを含むものであってもよい。別の実施形態では、一価の抗体フラグメントは、本発明において、好ましくは本明細書に規定されるような抗体混合物において採用され得る。本明細書で採用される「結合フラグメント」とは、標的ペプチド又は抗原に特異的であるとフラグメントを特徴付けるのに十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができるフラグメントを指す。
【0075】
本明細書で使用する「Ｆａｂフラグメント」という用語は、軽鎖のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）、並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む軽鎖フラグメントを含む抗体フラグメントを意味する。用語「Ｆｖ」は、２つの可変ドメイン、例えば、コグネイトペア又は親和性成熟可変ドメイン、すなわちＶＨ及びＶＬペアのような共働可変ドメインを指す。一実施形態では、そのようなフラグメントは、本発明の抗体分子として使用される。本明細書で採用される共働可変ドメインは、Ｆｖ（ＶＨ／ＶＬペア）を当該抗原に対して特異的にするために、互いに補完し合う及び／又は両方が抗原結合に貢献する可変ドメインである。
【0076】
本発明の抗体は、特に本明細書で議論されるＦａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ、ＢｙＢｅ、ＴｒＹｂｅ、及びＩｇＧ形式を含む、本明細書で議論される抗体形式のいずれかを含んでいてもよい。ＢＹｂｅ、ＴｒＹｂｅ、及びＩｇＧ形式の抗体は、治療において特に有用である。本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖可変領域と、任意にリンカー又は抗体の異なる部分を一緒に接合する他の実体とを含む形式を含んでいてもよい。このような抗体は、分子とも呼ばれることがある。一つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ形式である。別の特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＢＹｂｅ形式である。別の特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＴｒＹｂｅ形式である。
【0077】
また、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭクラスの抗体であってもよい。
本明細書で採用される標的分子、特にＣＤ４５に対する特異性（又は特異的）の程度とは、相互作用におけるパートナー又はその関連部分が、非パートナーと比較して、互いを認識するだけ、又は互いに有意に高い親和性を有することをいう。例えばバックグラウンドレベルの結合又は別の無関係なタンパク質（例えば、鶏卵白リゾチームなど）に対してよりも、例えば少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍又は少なくとも１，０００，０００倍高い親和性である。一実施形態では、そのような特異性の程度は、ＣＤ４５に対するものである。別の実施形態では、そのような特異性は、ＣＤ４５に対してだけでなく、ＣＤ４５の他のエピトープと比較して、抗体の抗原結合部位、特にパラトープによって結合されるＣＤ４５の特定のエピトープに対してでもある。
本明細書で採用される標的分子、特にＣＤ４５に対する特異性（又は特異的）の程度とは、相互作用におけるパートナー又はその関連部分が、非パートナーと比較して、互いを認識するだけ、又は互いに有意に高い親和性を有することをいう。例えばバックグラウンドレベルの結合又は別の無関係なタンパク質（例えば、鶏卵白リゾチームなど）に対してよりも、例えば少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍又は少なくとも１，０００，０００倍高い親和性である。一実施形態では、そのような特異性の程度は、ＣＤ４５に対するものである。別の実施形態では、そのような特異性は、ＣＤ４５に対してだけでなく、ＣＤ４５の他のエピトープと比較して、抗体の抗原結合部位、特にパラトープによって結合されるＣＤ４５の特定のエピトープに対してでもある。
【0078】
本明細書で採用される「結合部位」とは、標的抗原を結合することができる結合領域、典型的にはポリペプチドを指し、例えば、その部位を抗原に対して特異的であると特徴付けるのに十分な親和性を有している。好ましい実施形態では、結合部位は、ＣＤ４５を結合する。一実施形態では、結合部位は、少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば可変ドメイン又はその誘導体のペア、例えば可変ドメイン又はその誘導体のコグネイトペアを含む。典型的には、これはＶＨ／ＶＬペアである。
任意の適切な抗原結合部位が、本発明の抗体において使用され得る。一実施形態では、結合部位、特にパラトープは、少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば可変ドメイン又はその誘導体のペア、例えば可変ドメイン又はその誘導体のコグネイトペアを含む。典型的には、これはＶＨ／ＶＬペアである。
任意の適切な抗原結合部位が、本発明の抗体において使用され得る。一実施形態では、結合部位、特にパラトープは、少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば可変ドメイン又はその誘導体のペア、例えば可変ドメイン又はその誘導体のコグネイトペアを含む。典型的には、これはＶＨ／ＶＬペアである。
【0079】
可変領域（本明細書では可変ドメインとも呼ばれる）は、一般に、３つのＣＤＲ及び適当なフレームワークを含む。一実施形態では、抗原結合部位は、２つの可変領域、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、これらの要素は共に、ＣＤ４５に対する抗体又は結合フラグメントの結合相互作用の特異性、特に結合部位がＣＤ４５上のどこに結合するかという点での特異性に寄与する。一実施形態では、本発明の抗体分子の抗原結合部位に採用される可変ドメインは、コグネイトペアである。本明細書で採用される「コグネイトペア」は、予め形成されたカップルとして宿主から単離された可変ドメイン（又はそのヒト化バージョン等のその誘導体）の重鎖及び軽鎖のペアを指す。この定義には、宿主からの元のペアが保持されない、ライブラリーから単離された可変ドメインは含まれない。コグネイトペアは、宿主においてしばしば親和性成熟され、したがって、ファージライブラリーなどのライブラリーから選択された可変ドメイン対の組み合わせよりも、それらが特異的である抗原に対して高い親和性を有する場合があるので有利であると考えられる。別の実施形態では、本発明の抗体の結合部位における重鎖及び軽鎖は、コグネイトペアでなくてもよい。一実施形態では、例えば共通の軽鎖が使用される場合、軽鎖は重鎖可変領域の少なくとも１つと同族（コグネイト）ではないが、それでも機能的な抗原結合部位を形成することが可能である。
【0080】
誘導体、修飾（改変）体、及びヒト化
本明細書で採用される「誘導体」とは、例えば、望ましくない特性を除去するなどして特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１、２、３、４又は５個のアミノ酸が置換又は欠失され、しかし特徴付ける特性は保持されることを意味する。修飾の例としては、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、又は溶媒にさらされたリジンを除去するものがある。これらの修飾は、関連するアミノ酸残基を保存的なアミノ酸置換で置き換えることによって達成することができる。
本明細書で採用される「誘導体」とは、例えば、望ましくない特性を除去するなどして特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１、２、３、４又は５個のアミノ酸が置換又は欠失され、しかし特徴付ける特性は保持されることを意味する。修飾の例としては、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、又は溶媒にさらされたリジンを除去するものがある。これらの修飾は、関連するアミノ酸残基を保存的なアミノ酸置換で置き換えることによって達成することができる。
【0081】
ＣＤＲにおける他の修飾は、例えば、１つ以上のシステインを例えばセリン残基で置換することを含むことができる。Ａｓｎは脱アミノ化の基質となりうるが、この傾向はＡｓｎ及び／又は隣接するアミノ酸を保存的置換などの代替アミノ酸で置換することにより低減することが可能である。ＣＤＲのアミノ酸Ａｓｐは異性化される可能性がある。後者は、Ａｓｐ及び／又は隣接するアミノ酸を代替アミノ酸、例えば保存的置換で置き換えることによって最小化することができる。
【0082】
一実施形態では、例えば本発明の抗体分子における抗原結合部位における可変領域（単数又は複数）は、ヒト化されている。可変領域のヒト化されたものは、本明細書の文脈では、その誘導体でもある。ヒト化は、非ヒトフレームワークをヒトフレームワークに置換すること、及び任意に１つ又は複数の残基を「ドナー残基」に逆変異することを含み得る。本明細書で採用されるドナー残基とは、宿主から単離された元の可変領域に見出される残基を指し、特にヒトフレームワーク中の所定のアミノ酸をドナーフレームワーク中の対応する位置のアミノ酸に置き換えることである。一実施形態では、本明細書に開示される任意の非ヒト可変領域はまた、ヒト化形態で本発明の抗体分子に存在することができる。一実施形態では、本明細書に開示されているようなＣＤＲは、ヒト可変領域フレームワーク中に存在する。別の実施形態では、フレームワークドナー残基もまた、ＣＤＲと同様に移植されてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、完全ヒト可変領域を含んでいる。別の実施形態では、本発明の抗体は、完全にヒトである。
【0083】
抗体定常領域及びＦｃ領域の機能
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含んでいない。 一つの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に以下に記載されるように修飾されたＦｃドメインを含む。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含むが、Ｆｃドメインの配列は、１つ又は複数のＦｃエフェクター機能を除去するために修飾されている。別の実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、本明細書で議論されるもののいずれかなど、抗体の特定の特性を最適化するために修飾されている。
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含んでいない。 一つの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に以下に記載されるように修飾されたＦｃドメインを含む。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含むが、Ｆｃドメインの配列は、１つ又は複数のＦｃエフェクター機能を除去するために修飾されている。別の実施形態では、本発明の抗体のＦｃ領域は、本明細書で議論されるもののいずれかなど、抗体の特定の特性を最適化するために修飾されている。
【0084】
一実施形態では、本発明の抗体は、「サイレンス化された」（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）Ｆｃ領域を含む。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、正常なＦｃ領域に関連するエフェクター機能（単数又は複数）を表示しない。
本明細書で採用されるＦｃドメインは、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、一般に‐（ＣＨ２ＣＨ３）２を指す。
一実施形態では、本発明の抗体は、‐ＣＨ２ＣＨ３フラグメントを含んでいない。
本明細書で採用されるＦｃドメインは、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、一般に‐（ＣＨ２ＣＨ３）２を指す。
一実施形態では、本発明の抗体は、‐ＣＨ２ＣＨ３フラグメントを含んでいない。
【0085】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＨ２ドメインを含んでいない。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨ３ドメインを含んでいない。
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターと結合しない。
一実施形態では、本発明の抗体は、補体と結合しない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、第１補体因子であるＣ１ｑ又はＣ１と結合しない。一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ｆｃ領域を欠いているため、それらの因子と結合しない。別の実施形態では、本発明の抗体は、定常領域においてその能力を妨げる修飾を有するため、それらの因子に結合しない。代替の実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲと結合しないが、補体と結合する。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲと結合しないが、Ｃ１ｑ及び／又はＣ１と結合する。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨ３ドメインを含んでいない。
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターと結合しない。
一実施形態では、本発明の抗体は、補体と結合しない。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、第１補体因子であるＣ１ｑ又はＣ１と結合しない。一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ｆｃ領域を欠いているため、それらの因子と結合しない。別の実施形態では、本発明の抗体は、定常領域においてその能力を妨げる修飾を有するため、それらの因子に結合しない。代替の実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲと結合しないが、補体と結合する。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃγＲと結合しないが、Ｃ１ｑ及び／又はＣ１と結合する。
【0086】
一実施形態では、本発明の抗体は、通常のＦｃ領域が放出を誘発するであろう１つ以上のサイトカインの放出を誘発しないという意味において、活性Ｆｃ領域を含んでいない。例えば、本発明の抗体のＦｃ領域は、Ｆｃレセプターに結合したときにサイトカインの放出を誘発しないか、又は有意にはそうしないかもしれない。
一実施形態において、一般に本発明の結合分子は、結合分子の血清半減期を変更する修飾を含んでいてもよい。したがって、別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の半減期を変化させるＦｃ領域修飾（複数可）を有する。そのような修飾は、Ｆｃ機能を変化させるものと同様に存在してもよい。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、抗体の血清半減期を変化させる修飾（複数可）を有する。特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、そのような修飾を欠く抗体と比較して、抗体の血清半減期を減少させる修飾（複数可）を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、そのような修飾を欠く抗体と比較して、Ｆｃ領域のサイレンシング及び抗体の血清半減期の減少の両方を集合的に行う修飾（複数可）を含む。
一実施形態において、一般に本発明の結合分子は、結合分子の血清半減期を変更する修飾を含んでいてもよい。したがって、別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体の半減期を変化させるＦｃ領域修飾（複数可）を有する。そのような修飾は、Ｆｃ機能を変化させるものと同様に存在してもよい。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、抗体の血清半減期を変化させる修飾（複数可）を有する。特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、そのような修飾を欠く抗体と比較して、抗体の血清半減期を減少させる修飾（複数可）を有する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、そのような修飾を欠く抗体と比較して、Ｆｃ領域のサイレンシング及び抗体の血清半減期の減少の両方を集合的に行う修飾（複数可）を含む。
【0087】
本発明の抗体分子の抗体定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。好ましい実施形態において、抗体は、Ｆｃを欠くもの、又はＦｃ領域の１つ以上のエフェクター機能を欠くもの、好ましくはそれらの全てを欠くものである。本発明の他の実施形態では、抗体のＦｃ領域のエフェクター機能（複数可）は、依然として存在してもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト定常領域、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインを含んでいてもよい。特に、抗体分子が抗体エフェクター機能が必要とされる治療用途に意図される場合、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用され得る。あるいは、抗体分子が治療目的を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされない場合には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプが使用され得る。特に好ましいＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４である。抗体がエフェクター機能を持たないように、好ましい実施形態において定常領域が修飾されていてもよい。したがって、これらの定常領域ドメインの配列バリアントもまた使用され得ることが理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０：１０５‐１０８に記載されているように、２４１位のセリンがプロリンに変更されているＩｇＧ４分子が使用されてもよい。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は、変異Ｓ２４１Ｐを含んでもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を欠いていてもよい。
【0088】
本発明の抗体は、一実施形態において、サイレンス化されたＦｃ領域を有していてもよい。本明細書で使用される用語「サイレント」、「サイレンス化された」、又は「サイレンシング」は、本明細書に記載の修飾Ｆｃ領域を有する抗体であって、非修飾Ｆｃ領域を含む同一の抗体のＦｃｇＲへの結合と比較してＦｃγ受容体（ＦｃｇＲ）への結合が減少した抗体を指す（例えば、以下の通り：例えばＢＬＩによって測定される、ＦｃｇＲへの結合の、非修飾Ｆｃ領域を含む同一の抗体のＦｃｇＲへの結合に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の減少）。いくつかの実施形態では、Ｆｃサイレンス化抗体は、ＦｃｇＲへの検出可能な結合を有さない。修飾されたＦｃ領域を有する抗体のＦｃｇＲへの結合は、当該技術分野において既知の様々な技術を用いて測定することができる。例えば、限定されるものではないが、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；ＫｉｎＥｘＡ、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３７３：５２‐６０，２００８；又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、又は表面プラズモン共鳴測定法又は他の機構の動力学ベースの測定法（例えば。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析又はＯｃｔｅｔ（商標）解析（ｆｏｒｔｅＢＩＯ））、及び間接結合アッセイ、競合結合アッセイ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過）などの他の方法である。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＦｃｇＲへの結合を低減又は除去するが、依然として補体の活性化を可能にするように修飾されていてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、サイトカイン放出を活性化しないが、依然として補体を活性化することができるように、修飾されたＦｃ領域を有していてもよい。
【0089】
一実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖は、κ又はλのいずれかのＣＬドメインを含む。一実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖は、κ又はλのいずれかのＣＬドメインを含む。
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、抑制ＦｃγＲＩＩｂ受容体、補体の第１成分（Ｃ１ｑ）に異なるアフィニティーで結合し、非常に異なったエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．２００９．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．（ヒトＦｃγ受容体及びその多型バリアントのヒトＩｇＧサブクラスに対する特異性及び親和性。）Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６‐２５）、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２‐９０も参照されたい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターに結合しない。本発明の別の実施形態では、抗体は、１種類以上のＦｃレセプターに結合する。
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、抑制ＦｃγＲＩＩｂ受容体、補体の第１成分（Ｃ１ｑ）に異なるアフィニティーで結合し、非常に異なったエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．２００９．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．（ヒトＦｃγ受容体及びその多型バリアントのヒトＩｇＧサブクラスに対する特異性及び親和性。）Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６‐２５）、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２‐９０も参照されたい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターに結合しない。本発明の別の実施形態では、抗体は、１種類以上のＦｃレセプターに結合する。
【0090】
ＩｇＧとＦｃγＲｓあるいはＣ１ｑとの結合は、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインに位置する残基によって決まる。ＣＨ２ドメインの２つの領域はＦｃγＲｓ及びＣ１ｑの結合に重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４においてユニークな配列を持っている。２３３‐２３６位のＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位のＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に減少させることが示されている（Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．、１９９９，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．（Ｆｃガンマ受容体Ｉ結合及び単球トリガー活性を欠く組換えヒトＩｇＧ分子。）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３‐２４及びＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩ， Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩ， Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ， ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒ（ＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ、ＦｃガンマＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位の高解像度マッピング及びＦｃガンマＲへの結合を改善したＩｇＧ１バリアントのデザイン）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１‐６０４）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が補体の活性化を著しく減少させることを示した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．、２０００．Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ１ｑ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｒｉｔｕｘａｎ、ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ａ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｆｃ．（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するキメラ抗体であるリツキサン上のＣ１ｑ結合部位のマッピング）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８‐８４）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインの変異は、ＦｃγＲＩ、及びＣ１ｑへの結合を減少させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ，１９９５．Ｅｘ ｖｉｖｏ ｃｏａｔｉｎｇ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｒｉｎｅ ＣＴＬＡ４／Ｆｃ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｒａｆｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．（マウスＣＴＬＡ４／Ｆｃによる膵島細胞同種移植片のｅｘ ｖｉｖｏコーティングは、移植片寛容を促進する。）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５‐７４）。
【0091】
一実施形態では、採用されるＦｃ領域は変異されており、特に本明細書に記載される変異がされている。一実施形態では、変異は、結合及び／又はエフェクター機能を除去することである。一つの好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターと結合しないように変異されている。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含まないので、そのためにＦｃエフェクター活性を示さない。一実施形態では、Ｆｃ変異は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合を除去又は増強する変異、エフェクター機能を増加又は除去する変異、抗体の半減期を増加又は減少させる変異及びこれらの組み合わせを含む群から選択される。好ましい実施形態では、修飾は、Ｆｃ受容体への結合を除去又は減少させる。別の好ましい実施形態では、修飾は、Ｆｃエフェクター機能を除去又は低減させる。別の好ましい実施形態では、修飾は、血清半減期を減少させる。別の好ましい実施形態では、抗体の定常領域は、Ｆｃ受容体結合、及びＦｃエフェクター機能を低減又は除去するとともに、血清半減期を短縮する修飾（単数又は複数）を含む。一実施形態では、修飾の影響に言及する場合、それは、等価な抗体であるが修飾を欠いているものとの比較によって実証され得る。
【0092】
本発明の別の実施形態では、抗体は、プロテインＡと結合する能力を修飾する、特にプロテインＡ結合を除去する重鎖修飾を有していてもよい。本明細書で議論するように、このようなアプローチは、二重特異性抗体の精製を促進するために好ましく使用され得る。しかしながら、他の実施形態では、本発明の任意の抗体は、それがＦｃ領域を有する場合、プロテインＡ結合を変更するために修飾されてもよい。例えば、両方の重鎖が修飾を含んでいてもよい。あるいは、両方の重鎖が修飾を欠いていてもよい。しかし、好ましい実施形態では、一方が修飾を有し、他方が有しない。
【0093】
ｐＨ７．４ではなくｐＨ６．０でＦｃＲｎに選択的に結合するいくつかの抗体は、様々な動物モデルにおいてより高い半減期を示す。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間の界面に位置するいくつかの変異、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ＰＲ．ｅｔ ａｌ．２００４．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇｅｒ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．（霊長類におけるより長い血清半減期を有する工学的ヒトＩｇＧ抗体。）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３‐６）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅｖｅｌｓ．（免疫グロブリンＧのＦｃ領域を工学的に修飾してｉｎ ｖｉｖｏ抗体レベルを調節すること。）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３‐８）は、ＦｃＲｎへの結合親和性及びＩｇＧ１のインビボでの半減期を増加させることが示されている。したがって、Ｍ２５２／Ｓ２５４／Ｔ２５６＋Ｈ４４／Ｎ４３４に血清半減期を変化させる修飾が存在してもよく、特にＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆが存在する可能性がある。ただし、ＦｃＲｎ結合の増加と半減期の増加には必ずしも直接的な関係があるわけではない（Ｄａｔｔａ‐Ｍａｎｎａｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧ１ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍａｔｅｓ．（新生児Ｆｃレセプターへの結合特性が異なるヒト化ＩｇＧ１バリアント：マウス及び霊長類における薬物動態との関係） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５：８６‐９４）。一実施形態では、半減期を増加させることが望まれる。別の実施形態では、実際には、抗体の血清半減期を減少させることが望まれる場合があるので、血清半減期を減少させる修飾が存在する場合がある。
【0094】
ＩｇＧ４サブクラスはＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の減少を示し、他のＩｇＧサブクラスの抗体は一般に強い結合を示す。これらの他のＩｇＧサブタイプにおける減少したレセプター結合は、Ｐｒｏ２３８、Ａｐｓ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２７０（Ｆｃ炭水化物の損失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５を含む群から選択される１又は複数のアミノ酸の変更、例えば置換によって生じ得る。一実施形態では、本発明による分子は、ＩｇＧサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３のＦｃを有し、Ｆｃは、以下の１つ、２つ又はすべての位置Ｓ２２８、Ｌ２３４及び／又はＤ２６５において変異している。一実施形態では、Ｆｃ領域における変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ及びそれらの組み合わせから独立して選択される。
【0095】
一実施形態では、本発明の抗体は、抗体がサイトカイン放出をもたらすかどうかに影響する修飾を含んでいてもよい。特に、Ｌ２３４Ｆ及びＫ２７４Ｑの修飾は、抗体がサイトカイン放出をもたらす能力を低下させることが示されている。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体は、サイトカイン放出を変化させるＬ２３４及び／又はＫ２７４における修飾、特にＬ２３４Ｆ及びＫ２７４Ｑの修飾を含んでいてもよい。さらに、Ｌ２３４残基は血小板活性化に影響を及ぼす可能性があり、その残基は追加的又は代替的に修飾されてもよい。本発明の一実施形態では、例えば、血小板結合を変化させるＬ２３４修飾、特にＬ２３４Ｆ修飾が導入されてもよい。Ｐ３３１はまた、Ｃ１ｑ結合において役割を果たすことが示されているので、１つの実施形態では、補体活性化を保持するためにＰ３３１は修飾されなくてもよい。別の実施形態では、補体活性化を減少又は除去するために修飾されてもよい；例えば、重鎖はＰ３３１Ｓ修飾を含んでいてもよい。別の実施形態では、補体結合を減少又は除去するＰ３２９修飾が存在し、特にＰ３２９Ａ修飾が存在する。別の実施形態では、抗体は、位置Ｐ３２９、Ｐ３３１、Ｋ３３２及び／又はＤ２６５における１つ又は複数の修飾を含んでいてもよい。好ましい一実施形態では、抗体は、補体結合に影響を与え、特にＣ１ｑ結合を減少させるために、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３３１Ｓ、Ｋ３３２Ａ、及びＤ２６５Ａでの修飾を含んでいてもよい。
【0096】
Ｆｃ領域のエフェクター機能を減少させるか、又は増加させるかのいずれかが所望され得る。好ましい一実施形態では、そのようなエフェクター機能を減少させることが所望される。別のものでは、それを最適化することが望まれる。細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体では、エフェクター機能を奪うことが典型的に要求される。他の例では、特に細胞を枯渇させることが目的である場合、Ｆｃエフェクター機能が除去されているか、又は可能な限り低いレベルまで低減されていることが望まれる場合がある。例えば、特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４５を発現する標的細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導することができるが、Ｆｃエフェクター機能を示さない。したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、活性Ｆｃ領域を欠く。例えば、抗体は物理的にＦｃ領域を有していなくてもよいし、抗体はＦｃ領域を不活性化する修飾を含んでいてもよい。後者は、例えば、Ｆｃサイレンシングと称され得る。一実施形態では、Ｆｃサイレンシングは、本発明の抗体が、修飾されていないＦｃ領域を有する抗体であれば通常放出を誘発するであろう１つ又は複数のサイトカインの放出をもたらす能力が低い、又はもたらさないことを意味し得る。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、細胞死（好ましくはアポトーシス）を刺激することができるが、Ｆｃ機能を示さない。Ｆｃ機能のさらなる例には、マスト細胞の脱顆粒の刺激が含まれ、再びその機能は、本発明の抗体において低減又は欠如され得る。Ｆｃ機能の低減の程度は、例えば、少なくとも６５％であってもよく、例えば、少なくとも７５％であってもよい。一実施形態では、減少は、少なくとも８０％である。別の実施形態では、減少は、少なくとも９０％である。減少は、例えば、少なくとも９５％であってよい。好ましい一実施形態では、減少は、少なくとも９９％である。別の実施形態では、減少は１００％であってよく、このような例では、Ｆｃ機能が完全に除去されることを意味する。
【0097】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに多数の変異が作られ、ＡＤＣＣとＣＤＣへの影響がｉｎ ｖｉｔｒｏでテストされている（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．、２００１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．（補体をリクルートする活性を高めた工学的抗体。）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（４）：２５７１‐５）。注目すべきは、３３３位におけるアラニン置換が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させることが報告されていることである。したがって、一実施形態では、３３３位における修飾が存在してもよく、特に補体をリクルートする能力を変化させるものが存在してもよい。Ｌａｚａｒらは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が高く、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が低い三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）が、ＡＤＣＣの向上をもたらすことを記載した（Ｌａｚａｒ ＧＡ．ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、Ｓ２３９／Ｉ３３２／Ａ３３０における修飾が存在し、特にＦｃ受容体に対する親和性を変化させるもの、特にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌが存在する可能性がある。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．（エフェクター機能を強化した人工抗体Ｆｃバリアント。）ＰＮＡＳ １０３（１１）：４００５‐４０１０）。同じ変異を使用して、ＡＤＣＣが増加した抗体を生成した（Ｒｙａｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｂ‐ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ．（悪性形質細胞上のＢ細胞成熟抗原の抗体ターゲティング）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、６：３００９‐３０１８）。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、マクロファージによる標的細胞の強化された貪食を媒介するＦｃγＲＩＩＩａ親和性及びＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を改善したわずかに異なる三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．（ＦｃγＲＩＩａへの抗体結合の最適化により腫瘍細胞のマクロファージの貪食を増強する。）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７‐２７）。一実施形態では、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ修飾は、したがって、存在し得る。
【0098】
ＩｇＧ４抗体はエフェクター機能を持たないため、受容体ブロックに適したＩｇＧサブクラスである。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂ‐アーム交換と呼ばれる動的なプロセスで半分子交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間で起こり得る。一つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｓ２２８での修飾、特にＳ２２８Ｐを有する。Ｓ２２８Ｐ変異は、この組換えプロセスを防ぐことが示されており、より予測不可能な治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にする（Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＩｇＧ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎｇａｇｅ ｉｎ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｎ ｖｉｖｏ．（治療用ＩｇＧ４抗体はｉｎ ｖｉｖｏで内因性ヒトＩｇＧ４とＦａｂ‐アーム交換を行う。）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７‐７１）。この技術は、二重特異性抗体分子を作成するために採用され得る。本明細書に記載される修飾は、好ましい実施形態において、ＩｇＧ４の文脈で採用され得る。
【0099】
ＷＯ２００８／１４５１４２は、本発明で採用され得る修飾、特にＩｇＧ４アイソタイプ抗体に対する修飾の例を開示している。
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、４０９位のＡｒｇ残基、４０５位のＰｈｅ残基及び／又は３７０位のＬｙｓ残基の置換を有するヒトＩｇＧ４定常領域を含むことができる。例えば、１つの好ましい実施形態において、抗体の重鎖は、４０９位における修飾、特にその位置におけるＬｙｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入から選択される１つを含む。一実施形態では、修飾は、４０９位におけるＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入である。別の実施形態では、修飾は、４０９位におけるＬｙｓ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入であってよい。一実施形態では、抗体は、ヒンジ領域においてＣｙｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｒｏ‐Ｃｙｓを含んでいない。一実施形態では、抗体は、インビボでＦａｂアーム交換を誘導する能力の低下を示す。一実施形態では、抗体のヒンジ領域は、ＣＸＰＣ又はＣＰＸＣ配列（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、特定の抗体クラス、抗体アイソタイプ、又は抗体アロタイプが特定の特性を示す能力を採用することができる。このような天然の多様性は、特定の特性を付与するために使用されてもよい。例えば、ＩｇＧ１はＲ４０９を有するのに対し、ＩｇＧ４は重鎖の４０９位にＫ４０９を有するが、これは抗体の能力に自然に影響すると考えられる。様々な天然に存在する配列変異の総説は、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２００９）ｍＡｂｓ、１（４）：３３２‐３３８に記載されており、これは、特にそこで議論された配列変異に関連して、その全体が参照により組み込まれる。
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、４０９位のＡｒｇ残基、４０５位のＰｈｅ残基及び／又は３７０位のＬｙｓ残基の置換を有するヒトＩｇＧ４定常領域を含むことができる。例えば、１つの好ましい実施形態において、抗体の重鎖は、４０９位における修飾、特にその位置におけるＬｙｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入から選択される１つを含む。一実施形態では、修飾は、４０９位におけるＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入である。別の実施形態では、修飾は、４０９位におけるＬｙｓ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕ残基の導入であってよい。一実施形態では、抗体は、ヒンジ領域においてＣｙｓ‐Ｐｒｏ‐Ｐｒｏ‐Ｃｙｓを含んでいない。一実施形態では、抗体は、インビボでＦａｂアーム交換を誘導する能力の低下を示す。一実施形態では、抗体のヒンジ領域は、ＣＸＰＣ又はＣＰＸＣ配列（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、特定の抗体クラス、抗体アイソタイプ、又は抗体アロタイプが特定の特性を示す能力を採用することができる。このような天然の多様性は、特定の特性を付与するために使用されてもよい。例えば、ＩｇＧ１はＲ４０９を有するのに対し、ＩｇＧ４は重鎖の４０９位にＫ４０９を有するが、これは抗体の能力に自然に影響すると考えられる。様々な天然に存在する配列変異の総説は、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２００９）ｍＡｂｓ、１（４）：３３２‐３３８に記載されており、これは、特にそこで議論された配列変異に関連して、その全体が参照により組み込まれる。
【0100】
また、当業者であれば、抗体は様々な翻訳後修飾を受ける可能性があることも理解されよう。これらの修飾の種類及び程度は、しばしば、抗体を発現させるために使用される宿主細胞株及び培養条件に依存する。このような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションが含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の損失である（Ｈａｒｒｉｓ、ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９‐１３４、１９９５に記載されているように）。従って、抗体重鎖のＣ末端リジンは存在しない場合がある。
【0101】
一実施形態では、本発明の抗体は、例えば、低下したＦｃ機能、特にほぼＦｃ‐ヌル表現型をもたらすために、アグリコシルＩｇＧであってもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｎ２９７での修飾、特にＮ２９７Ａを有する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４３及び／又はＦ２４４における修飾、特に、抗体がアグリコシルＩｇＧであることを意味するものを有する。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４３Ａ及び／又はＦ２４４Ａ重鎖修飾を含んでいてもよい。別の実施形態では、Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６２及びＶ２６４の１つ以上が修飾されてもよく、特にグリコシル化に影響を与えるアミノ酸に修飾されてもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆ２４１Ａ、Ｆ２４３Ａ、Ｖ２６２Ｅ及びＶ２６４Ｅに修飾を有していてもよい。そのような修飾は、Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２０１３）１３５（２６）：９７２３‐９７３２に記載されており、特にそこで議論された修飾に関連して、その全体が参照により組み込まれ、そのような修飾は、例えば、Ｆｃ受容体結合を調節する方法を提供する。抗体のグリコシル化に影響を与える修飾が存在してもよい。さらに、本発明の抗体は、糖鎖工学のさらなるアプローチとして、グリコシル化に影響を与える細胞型において産生されてもよい。一実施形態では、本発明の抗体のフコシル化、シアリル化、ガラクトシル化、及び／又はマンノシル化は、配列修飾によって、及び／又は抗体を産生するために用いられる細胞の種類を介して、変更されてもよい。
一実施形態では、本発明の抗体は、２９７位及び／又は２９９位に修飾を有する。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、その重鎖におけるＮ２９７Ａ修飾、好ましくはＮ２９７Ｑ又は２９９位のＳｅｒ若しくはＴｈｒの他の残基への変異を含む。一実施形態では、それはそれらの修飾の両方を有する。
一実施形態では、本発明の抗体は、２９７位及び／又は２９９位に修飾を有する。例えば、一実施形態では、本発明の抗体は、その重鎖におけるＮ２９７Ａ修飾、好ましくはＮ２９７Ｑ又は２９９位のＳｅｒ若しくはＴｈｒの他の残基への変異を含む。一実施形態では、それはそれらの修飾の両方を有する。
【0102】
一実施形態では、本発明の抗体は、不要な種よりも本発明の抗体の形成に有利な修飾を有していてもよい。例えば、一実施形態では、本発明の抗体の生成は、２つの異なる抗原部位、特に２つの異なるパラトープが、異なるユニット上にあり、関連付けられることを含む場合がある。したがって、パラトープの一方のみを含むホモダイマーを優先して、両方のパラトープを含むヘテロダイマーを形成することが望ましい場合がある。ヘテロダイマー形成に有利なアプローチの例は、２つの同じ重鎖が会合するよりもむしろ、２つの異なる重鎖に有利な重鎖修飾を採用することである。一実施形態では、結合パートナーの１つ（又は少なくとも１つ）はホモダイマーを形成することができない、例えば結合パートナーのアミノ酸配列は、ホモダイマーの形成を除去又は最小化するように変異している。このような修飾の例としては、いわゆる「ノブ‐イントゥ‐ホール」（“ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ”）修飾が挙げられる。可能なノブ‐イントゥ‐ホール修飾は、例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６（７）６７７‐６８１及びＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８（１‐２）．７‐１５に記載されており、これらは両方とも、特にそこで議論されたノブ‐イントゥ‐ホール修飾に関連して、参照により組み込まれる。電荷修飾は、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を有利にするために代替的又は追加的に採用されてもよく、例えば、そのような修飾は重鎖に存在してもよい。別の実施形態では、電荷修飾は、特定の軽鎖と特定の重鎖とのペアをもたらすために使用される。
【0103】
一実施形態では、ヘテロダイマー形成を有利にするためのそのようなアプローチは、共通の軽鎖アプローチと組み合わせて使用される。別の実施形態では、ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を有利にするのではなく、例えばクロマトグラフィーによって、ヘテロダイマーをホモダイマーからより容易に分離できることを意味する修飾が存在することがある。ここでも、そのようなアプローチは、いくつかの実施形態において、一般的な軽鎖のアプローチで採用され得る。別の実施形態では、ＣＤ４５に対する特定のパラトープを有する抗体の部分は、抗体の異なるパラトープを含む抗体の部分とのみ会合することが可能である。
【0104】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモダイマーを形成することができず、例えば、結合パートナーの１つはペプチドであり、他の結合パートナーは前記ペプチドに特異的なＶＨＨである。一実施形態では、本発明の分子に採用されるｓｃＦｖは、ホモダイマーを形成することができない。
本明細書で採用されるホモダイマーを形成することができないとは、ホモダイマーを形成する傾向が低い又はゼロであることを意味する。本明細書で採用される低いとは、５％以下、例えば、４、３、２、１、０．５％以下の凝集体を意味する。
本明細書で採用されるホモダイマーを形成することができないとは、ホモダイマーを形成する傾向が低い又はゼロであることを意味する。本明細書で採用される低いとは、５％以下、例えば、４、３、２、１、０．５％以下の凝集体を意味する。
【0105】
別の実施形態では、本発明の抗体は、修飾されたヒンジ領域及び／又はＣＨ１領域を有していてもよい。あるいは、採用されるアイソタイプは、特定のヒンジ領域を有するものとして選択されてもよい。Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２７（１）に記載されているように。１３８‐１４８、ＩｇＧ２ ＣＨ１及びヒンジ領域は、特に重鎖と軽鎖の間のジスルフィド橋に関連して、特定の特性を付与する。ヒンジ領域の柔軟性を有利にする修飾、又は柔軟性を低下させる修飾の使用も、例えば、本発明の抗体において採用され得る。ヒンジ領域の柔軟性を変化させるアプローチは、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０：４２０６に開示されている。Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ（２０１５）及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ（２０１９）は、特に、議論された修飾に関連して、その全体が参照により組み込まれる。一実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、ＩｇＧ２ ＣＨ１及び／又はヒンジ領域を有し、別の実施形態では、両方の重鎖がそうである。一実施形態では、採用される抗体は、ｈ２抗体である。特に好ましい実施形態では、採用される抗体は、ヒンジ又はＣＨ１修飾を有するＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体、特に修飾ヒンジ領域を有するもの、例えばジスルフィド結合形成を変更するように操作されたものであってもよい。別の実施形態では、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体が採用され、それらのアイソタイプのヒンジ領域は、ＩｇＧ３アイソタイプ抗体よりも柔軟性を示さないからである。一実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体は、ＣＤ３２架橋をもたらすことができる可能性がある形態で採用される。
別の実施形態では、抗体は、ＣＤ４５分子の架橋をもたらすために立体的に最良の能力を示す。
別の実施形態では、抗体は、ＣＤ４５分子の架橋をもたらすために立体的に最良の能力を示す。
【0106】
二重特異性抗体
一つの好ましい実施形態において、結合分子、特に本発明の抗体は、二重特異性である。したがって、好ましい実施形態では、二重特異性抗体が本発明で採用され、特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５に対する２つの異なる特異性を有する二重特異性抗体が採用される。特異性の異なる重鎖と軽鎖を一緒に発現させた場合に、単特異性抗体よりも二重特異性抗体の形成、又は精製を有利に行うための様々な二特異性抗体形式が利用でき、これらは本発明において採用することが可能である。
一つの好ましい実施形態において、結合分子、特に本発明の抗体は、二重特異性である。したがって、好ましい実施形態では、二重特異性抗体が本発明で採用され、特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５に対する２つの異なる特異性を有する二重特異性抗体が採用される。特異性の異なる重鎖と軽鎖を一緒に発現させた場合に、単特異性抗体よりも二重特異性抗体の形成、又は精製を有利に行うための様々な二特異性抗体形式が利用でき、これらは本発明において採用することが可能である。
【0107】
例えば、片方又は両方の特異性において、ホモダイマー形成よりもヘテロダイマー形成に有利な形状又は電荷修飾が重鎖に存在してもよい。このような修飾の例としては、異なる特異性のための２つの異なる重鎖が相互作用しやすく、したがってヘテロダイマーの形成に有利であることを意味するノブ・イン・ホール重鎖の修飾が挙げられる。鎖交換ドメイン（Ｓｔｒａｎｄ‐ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ）（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）のアプローチもヘテロダイマーの形成を促進するために使用され得る。
【0108】
重鎖の修飾は、一方の重鎖が他方の重鎖と比較して結合剤に対して異なる親和性を有するように採用することもできる。例えば、２つの異なる重鎖は、プロテインＡに対して異なる親和性を有していてもよい。ある実施形態では、一方の重鎖は、プロテインＡ結合を除去する修飾を有するか、又はプロテインＡと結合しないアイソタイプであり、他方の重鎖は依然としてプロテインＡと結合する。このようなアプローチは、形成されるヘテロダイマーの割合を変えない一方で、プロテインＡ親和性に基づくホモダイマー抗体のいずれかからヘテロダイマー抗体を精製することを可能にしている。本発明の抗体は、プロテインＡ結合に影響を与える重鎖の一方の９５位及び９６位に修飾を有していてもよい。採用され得るそのような修飾の例には、一方の重鎖についてＨ９５Ｒ修飾を採用すること、又はＩＭＧＴエクソン番号付けシステムにおいてＨ９５Ｒ及びＹ９６Ｆ修飾を共に採用することが含まれる。それらの修飾は、ＥＵ番号付けシステムにおけるＨ４３５Ｒ修飾及びＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ修飾である。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｄ１６、Ｌ１８、Ｎ４４、Ｋ５２、Ｖ５７及びＶ８２における修飾も有し得る。一実施形態では、そのような修飾は、ＩＭＧＴ番号付けシステムにおけるＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ及びＶ８２Ｉ修飾の１つ以上と同様に、重鎖に存在する。一実施形態では、このような修飾は、ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である場合に採用される。特に好ましい実施形態では、それらは、両方の重鎖がＩｇＧ４アイソタイプである２つの重鎖のうちの１つについて採用される。プロテインＡ結合に影響を与えるそのような修飾のアプローチは、例えば、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されており、これは、特に、プロテインＡ結合に関連するその開示する修飾に関連して、その全体が参照により組み込まれる。
【0109】
さらなる実施形態において、採用される重鎖のアイソタイプは、プロテインＡを結合する能力に基づいて選択され得る。例えば、ヒトでは、野生型のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４はすべてプロテインＡと結合するが、野生型のヒトＩｇＧ３はプロテインＡと結合しない。特に好ましい実施形態では、両方の重鎖がＩｇＧ４であるが、一方はプロテインＡ結合を減少又は除去するための修飾（複数可）を有している。つまり、抗体のヘテロダイマー形態は、プロテインＡ親和性に基づいて、より容易に不要なホモダイマー形態から分離することができるであろう。
【0110】
一実施形態では、ヘテロダイマー形成を促進する修飾は、ヘテロダイマーの精製を可能にする修飾と組み合わされてもよい。一実施形態では、修飾は、位置Ｆ４０５及びＫ４０９であってよい。例えば、ヘテロダイマー形成を有利にするために２つの重鎖に導入され得る修飾のペアの１つの例は、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒである。それらの修飾は、それ自体で採用されてもよいし、ヘテロダイマーの優先的な精製を可能にする重鎖の修飾と組み合わせて採用されてもよい。一実施形態では、一方の重鎖は４０５位、４０９位、４３５位、及び４３６位で修飾を有し、他方の重鎖は４０９位で修飾を有する。一実施形態では、一方の重鎖はＦ４０５Ｌ修飾を有し、他方はＫ４０９Ｒ、Ｈ４３５Ｒ、及びＹ４３６Ｆ修飾を有する。別の実施形態では、一方の重鎖がＦ４０５Ｌ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ修飾を有し、他方の重鎖がＫ４０９Ｒ修飾を有する。そのようなアプローチの例は、Ｓｔｅｉｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１２，３に記載されており、特に記載された二重特異性抗体形式及び重鎖修飾に関連して、その全体が参照により組み込まれる。別の実施形態では、軽鎖に関係するアプローチが採用されてもよく、特に、上述した重鎖のためのアプローチに加えて、軽鎖のためのアプローチが採用されてもよい。例えば、１つの軽鎖について、ペアリングすることが望まれる軽鎖及び重鎖の部分を互いに入れ替えて、その軽鎖重ペアの形成を有利にし、一方、他の特異性の重鎖及び軽鎖は修飾されないようにすることができる。一実施形態では、したがって、Ｒｏｃｈｅ Ｃｒｏｓｓ‐Ｍａｂのアプローチが適用される。別の実施形態では、共通の軽鎖が採用され、同じ軽鎖が両方の特異性に対して採用される。様々な二重特異性抗体形式は、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７：９５‐１０６に概説されており、特にその文献の図１に示されるものなど、本発明において採用され得る。Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）は、特にその文献の図１に示される抗体形式の種類を含め、参照により組み込まれる。
【0111】
抗体の生成及びスクリーニング
一実施形態では、本発明の抗体又はその抗体／フラグメント成分は、標的抗原又は抗原、特にＣＤ４５に対する改善された親和性を提供するように処理される。そのようなバリアントは、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４、３９２‐４０３、１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９‐７８３，１９９２）、大腸菌の変異体株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２５０，３５９‐３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８、７２４‐７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６、７７‐８８、１９９６）及び性的ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８‐２９１，１９９８）などの多くの親和性成熟プロトコルにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ（（前掲））は、これらの親和性成熟の方法について論じている。本発明で使用するための結合ドメインは、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって生成することができ、例えばＣＤＲは、市販の抗体を含む非ヒト抗体から採取してヒトフレームワークにグラフト化することができ、あるいは代わりにキメラ抗体を非ヒト可変領域及びヒト定常領域等を使用して調製することができる。
一実施形態では、本発明の抗体又はその抗体／フラグメント成分は、標的抗原又は抗原、特にＣＤ４５に対する改善された親和性を提供するように処理される。そのようなバリアントは、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４、３９２‐４０３、１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９‐７８３，１９９２）、大腸菌の変異体株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２５０，３５９‐３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８、７２４‐７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６、７７‐８８、１９９６）及び性的ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８‐２９１，１９９８）などの多くの親和性成熟プロトコルにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ（（前掲））は、これらの親和性成熟の方法について論じている。本発明で使用するための結合ドメインは、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって生成することができ、例えばＣＤＲは、市販の抗体を含む非ヒト抗体から採取してヒトフレームワークにグラフト化することができ、あるいは代わりにキメラ抗体を非ヒト可変領域及びヒト定常領域等を使用して調製することができる。
【0112】
ＣＤ４５抗体の例は当技術分野で知られており、そのような抗体からのパラトープは、ＣＤ４５に対して複数の特異性を有する本発明の抗体において採用されてもよく、又は本明細書に記載の方法を使用して適合性についてスクリーニングされ、その後、必要に応じて修飾され、本明細書に記載の方法を使用して、例えばヒト化されてもよい。治療用抗ＣＤ４５抗体は、当技術分野で記載されており、例えばＵＳ２０１１／００７６２７０に開示されている抗ＣＤ４５抗体が挙げられる。ＣＤ４５抗体の例としては、ラットモノクローナルＹＴＨ５４、ＹＴＨ２５．４、Ｍｉｌｔｅｎｙｉクローン５Ｂ１及びクローン３０Ｆ１１からのマウスモノクローナル、ラットモノクローナルＹＡＭＬ５６８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのマウスモノクローナルクローン２Ｄ１カタログ番号３４７４６０、Ｎｏｖｕｓからのマウスモノクローナル抗体５Ｄ３Ａ３カタログ番号ＮＢＰ２‐３７２９３、マウスモノクローナルＨＩ３０カタログ番号ＮＢＰ１‐７９１２７、マウスモノクローナル４Ａ８Ａ４Ｃ７Ａ２カタログ番号ＮＢＰ１‐４７４２８、マウスモノクローナル２Ｂ１１カタログ番号ＮＢＰ２‐３２９３４、ラットモノクローナルＹＴＨ２４．５カタログ番号ＮＢ１００‐６３８２８、ウサギモノクローナルＹ３２１カタログ番号ＮＢ１１０‐５５７０１、マウスモノクローナルＰＤ７／２６／１６カタログ番号ＮＢ１２０‐８７５、Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚからのクローンＢ８由来マウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ‐２８３６９、クローンＦ１０‐８９‐４由来のマウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ‐５２４９０、クローンＨ‐２３０由来のウサギモノクローナルカタログ番号ｓｃ‐２５５９０、クローンＮ‐１９由来のヤギモノクローナルカタログ番号ｓｃ‐１１２３、クローンＯＸ１由来のマウスモノクローナルカタログ番号ｓｃ‐５３０４５、ラットモノクローナル（Ｔ２９／３３）カタログ番号ｓｃ‐１８９０１、ラットモノクローナル（ＹＡＭＬ ５０１．４）カタログ番号：Ｎｏ．ｓｃ６５３４４、ラットモノクローナル（ＹＴＨ８０．１０３）カタログ番号ｓｃ‐５９０７１、マウスモノクローナル（３５１Ｃ５）カタログ番号ｓｃ‐５３２０１、マウスモノクローナル（３５‐Ｚ６）カタログ番号ｓｃ‐１１７８、マウスモノクローナル（１５８‐４Ｄ３）カタログ番号ｓｃ‐５２３８６、ＣＤ４５ＲＯに対するマウスモノクローナル（ＵＣＨ‐Ｌ１）カタログ番号ｓｃ‐１１８３、ＣＤ４５ＲＯに対するマウスモノクローナル（２Ｑ１３９２）カタログ番号ｓｃ‐７０７１２が挙げられる。ＣＤ４５抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／０２６２１０、ＷＯ０２／０７２８３２及びＷＯ２００３／０４８３２７にも開示されている。このような市販の抗体は、治療用抗体の発見において有用なツールであり得る。一つの特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体であるか、又はヒト化されたものである。したがって、市販の抗体は、１つの実施形態においてヒト化されていてもよい。本出願はしかし、特定の好ましい抗体の例、及びさらなる抗体を同定するための方法を定めている。
【0113】
当業者は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて、本発明の抗体で使用するための抗体を生成することができる。例えば宿主を免疫するために使用するための、又はファージディスプレイのようなパニングにおいて使用するための、抗体を生成する際に使用するための抗原ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子工学的宿主細胞から当技術分野で周知のプロセスによって調製してもよいし、天然の生物源から回収してもよい。本願において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、特に指定しない限り、互換的に使用される。抗原ポリペプチドは、ある実施態様では、例えばアフィニティタグ等に融合された融合タンパク質等のより大きなタンパク質の一部であってもよい。一実施形態では、宿主は、例えばその表面にＣＤ４５を発現している、ＣＤ４５でトランスフェクトされた細胞で免疫されてもよい。
【0114】
抗原ポリペプチドに対して生成された抗体は、動物の免疫化が必要な場合、動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することにより、よく知られた日常的なプロトコル（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照）を用いて得ることができる。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタのような多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、一般に、マウス、ウサギ、ブタ、ラットが最も適している。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５‐４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ １９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７‐９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，１９８５）など当業者に知られている任意の方法により準備することができる。
【0115】
また、抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ １９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３‐７８４８ｌ；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載の方法によって特定の抗体の産生のために選択された単一リンパ球から生成した免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし発現させることにより、単一リンパ球抗体法を使用して生成することもできる。本発明で使用するための抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１‐５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７‐１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２‐９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９‐１８）、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１‐２８０）及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；５，９６９，１０８、及びＷＯ２００１１／３０３０５によって開示されるものを含む。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤ４５に特異的な少なくとも２つの異なるパラトープを有し、ＣＤ４５の１つのパラトープを認識する抗体を最初に作製し、次に、例えば、それらの抗体の２つを使用して、ＣＤ４５の少なくとも２つの異なるパラトープに結合できる本発明の抗体を生成することがありえる。例えば、ＣＤ４５に対する複数の抗体を、本明細書で議論される方法を用いて作成し、次いで、結合親和性などの望ましい特性についてスクリーニングすることであってよい。その後、最良の候補を使用して、本発明の抗体を生成してもよい。
【0116】
一例として、本発明の抗体は完全ヒトであり、特に１つ以上の可変領域が完全ヒトである。完全ヒト分子とは、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト由来であるか、又はヒト由来の配列と実質的に同一であるものをいい、必ずしも同じ抗体からのものである必要はない。完全ヒト抗体の例としては、例えば、上記のファージディスプレイ法によって産生された抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域及び任意に定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されたマウスによって産生された抗体、例えば、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４及びＥＰ０４６３１５１に一般用語で記載されているような抗体などが挙げられる。モノパラトープ抗体は、まず、ＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なるパラトープを含む本発明の抗体を生成するために、引き起こされ、次に使用されてもよい。
【0117】
一例において、本発明による抗体の抗原結合部位、特に可変領域は、ヒト化されている。本明細書で採用されるヒト化（ＣＤＲグラフト化抗体を含む）とは、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する分子を意味する（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。ＣＤＲ全体ではなく、ＣＤＲの特異性決定残基を移植することだけが必要な場合があることが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５～３４を参照）。しかし、好ましい実施形態では、ＣＤＲ全体（単数又は複数）が移植される。ヒト化抗体は、任意で、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ以上のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）からの１又は複数のＣＤＲ（必要に応じて、１又は複数の修飾ＣＤＲを含む）を含む抗体分子を意味する。レビューについては、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５‐５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態では、ＣＤＲ全体が移されるのではなく、本明細書に記載のＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ又は複数のみがヒト抗体フレームワークに移植される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５‐３４を参照のこと）。一実施形態では、本明細書で上述したＣＤＲのうちの１つ以上からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移植される。別の実施形態では、本明細書に記載されたＣＤＲの各々からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移植される。
【0118】
ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフト化される場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列が使用され得る。好適には、本発明によるヒト化抗体は、本明細書に提供されるＣＤＲの１つ以上と同様に、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメインを有する。本発明で使用できるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ （前掲））。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。あるいは、ヒト生殖細胞系列の配列も使用できる。これらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ‐ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐで利用可能である。
【0119】
本発明のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同一の抗体に由来する必要はなく、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含むものであってもよい。フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列である必要はない。例えば、珍しい残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプに対してより頻繁に出現する残基に変更することができる。あるいは、アクセプターフレームワーク領域の選択された残基は、ドナー抗体の同じ位置に見られる残基に対応するように変更してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ １９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３‐３２４を参照のこと）。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限度にとどめるべきである。変更する必要がある可能性のあるアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。フレームワークの誘導体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸が、例えばドナー残基で代替アミノ酸に置換されていてもよい。ドナー残基は、ドナー抗体、すなわちＣＤＲが元々由来する抗体からの残基であり、特にドナー配列からの対応する位置の残基が採用される。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワークに由来する適当な残基（アクセプター残基）で置換されてもよい。
【0120】
抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って従来の方式で番号付けされている。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ、ＵＳＡ（以下「Ｋａｂａｔら（前掲）」）に記載されている。この番号付けシステムは、特に示されない限り、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔ残基の呼称は、アミノ酸残基の直鎖状番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の直鎖アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれであっても、構造的成分の短縮、又は挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない又は追加のアミノ酸を含む場合がある。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列中の相同性のある残基と「標準」Ｋａｂａｔ番号の配列とのアラインメントによって、所定の抗体について決定することができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、残基３１‐３５（ＣＤＲ‐Ｈ１）、残基５０‐６５（ＣＤＲ‐Ｈ２）及び残基９５‐１０２（ＣＤＲ‐Ｈ３）に位置している。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６、９０１‐９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ‐Ｈ１に相当するループは、残基２６から残基３２まで延びている。したがって、本明細書で採用される「ＣＤＲ‐Ｈ１」は、他に示されない限り、Ｋａｂａｔ番号付けシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジカルループ定義の組み合わせによって記述されるように、残基２６から３５を指すことが意図される。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、残基２４～３４（ＣＤＲ‐Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ‐Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ‐Ｌ３）に配置される。
【0121】
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される抗体配列、特に本明細書に開示されるヒト化された配列に及ぶ。
一例では、結合ドメインはヒト化されている。
一例では、本明細書で提供される１つ又は複数のＣＤＲは、システイン残基又はアスパラギン酸（Ｄ）異性化部位又はアスパラギン（Ｎ）脱アミド化部位などの望ましくない残基又は部位を除去するように修飾されてもよい。一例では、アスパラギン残基（Ｎ）及び／又は隣接する残基を任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって、アスパラギン脱アミド化部位を１つ又は複数のＣＤＲから除去することができる。一例では、ＮＧ又はＮＳのようなアスパラギン脱アミド化部位は、例えばＮＡ又はＮＴに変異させてもよい。
一例では、結合ドメインはヒト化されている。
一例では、本明細書で提供される１つ又は複数のＣＤＲは、システイン残基又はアスパラギン酸（Ｄ）異性化部位又はアスパラギン（Ｎ）脱アミド化部位などの望ましくない残基又は部位を除去するように修飾されてもよい。一例では、アスパラギン残基（Ｎ）及び／又は隣接する残基を任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって、アスパラギン脱アミド化部位を１つ又は複数のＣＤＲから除去することができる。一例では、ＮＧ又はＮＳのようなアスパラギン脱アミド化部位は、例えばＮＡ又はＮＴに変異させてもよい。
【0122】
一例として、アスパラギン酸残基（Ｄ）及び／又は隣接する残基を任意の他の適切なアミノ酸に変異させることにより、アスパラギン酸異性化部位を１つ又は複数のＣＤＲから除去することができる。一例として、ＤＧ又はＤＳのようなアスパラギン酸異性化部位は、例えばＥＧ、ＤＡ又はＤＴに変異させてもよい。
例えば、ＣＤＲのいずれか１つにおける１つ以上のシステイン残基は、セリンなどの他のアミノ酸で置換されてもよい。
一例では、ＮＬＳのようなＮ‐グリコシル化部位は、アスパラギン残基（Ｎ）を、例えばＳＬＳ又はＱＬＳのような任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって除去されてもよい。一例では、ＮＬＳのようなＮ‐グリコシル化部位は、セリン残基（Ｓ）を、スレオニン（Ｔ）は別として、任意の他の残基に変異させることによって除去することができる。
当業者は、ＣＤＲのバリアント又はヒト化配列を、本明細書に記載されるような任意の適切なアッセイで試験し、活性が維持されることを確認することが可能である。
例えば、ＣＤＲのいずれか１つにおける１つ以上のシステイン残基は、セリンなどの他のアミノ酸で置換されてもよい。
一例では、ＮＬＳのようなＮ‐グリコシル化部位は、アスパラギン残基（Ｎ）を、例えばＳＬＳ又はＱＬＳのような任意の他の適切なアミノ酸に変異させることによって除去されてもよい。一例では、ＮＬＳのようなＮ‐グリコシル化部位は、セリン残基（Ｓ）を、スレオニン（Ｔ）は別として、任意の他の残基に変異させることによって除去することができる。
当業者は、ＣＤＲのバリアント又はヒト化配列を、本明細書に記載されるような任意の適切なアッセイで試験し、活性が維持されることを確認することが可能である。
【0123】
抗原への特異的結合は、例えばＥＬＩＳＡやＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴法などの任意の適切なアッセイを用いて試験することができ、そこで抗原（ＣＤ４５）への結合が測定されうる。そのようなアッセイは、単離された天然若しくは組換えＣＤ４５又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用してもよい。一例では、結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって、組換えＣＤ４５（配列番号４１又は配列番号４１のアミノ酸２３～１３０４）を使用して測定される。あるいは、タンパク質は、ＨＥＫ細胞などの細胞上に発現させ、フローサイトメトリーに基づく親和性決定を採用して親和性を測定してもよい。一実施形態では、１つの抗原結合部位、特にパラトープの特性をそれ自体で決定することが望まれる場合、そのパラトープのみを有する抗体が生成される。例えば、２つの異なる特異性を有する本発明の抗体と同じ形式の抗体が生成されるが、ＣＤ４５に対する特異性のうちの１つだけが存在する。一実施形態では、例えば、各パラトープの親和性を決定できるように、又はパラトープが互いに対して交差ブロッキングを示すかどうかを決定するために、少なくとも２つのパラトープを有する本発明の抗体からＣＤ４５に対する各パラトープに対する抗体を生成してもよい。一実施形態では、ＣＤ４５の細胞外領域と結合する能力が、例えば配列番号１１３のタンパク質を用いて測定される。一実施形態では、ＳｃＦｖのような一価の抗体が、比較を行うために生成される。
【0124】
本発明による抗体分子のパラトープの結合を交差ブロックするパラトープを含む抗体は、例えば、本発明の抗体において、ＣＤ４５との結合に同様に有用であり、したがって、同様に有用な抗体である可能性がある。したがって、そのような交差ブロッキング又は競合アッセイを採用することは、本発明の抗体を同定及び生成する有用な方法となり得る。一実施形態では、本発明の抗体からの個々のパラトープは、両方の抗原結合部位がそのパラトープを含む二価の抗体を生成するために使用され、その二価の抗体は次に交差ブロッキングアッセイで使用され得る。
【0125】
別の実施形態では、本明細書に開示された抗体の１つのパラトープの少なくとも１つを交差ブロックすることができる抗体が、本発明の抗体分子の生成に採用され得る。一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に規定されるパラトープの１つ、又はそれと交差ブロック若しくは競合することができる１つを含んでいてもよい。したがって、本発明はまた、抗原ＣＤ４５に特異的な結合ドメインを含む抗体分子を提供し、ここで、ＣＤ４５のための結合ドメインは、本明細書で上述した抗体分子のいずれか１つのＣＤ４５に特異的なパラトープの少なくとも１つのＣＤ４５への結合を交差ブロックし、及び／又はそれらのパラトープのいずれか１つによってＣＤ４５との結合から交差ブロックされる。全体として、典型的にはしかし、ＣＤ４５に対して異なるパラトープを有する本発明の抗体におけるＣＤ４５に対して特異的な異なるパラトープは、ＣＤ４５への結合について互いに交差ブロックしないか、又は競合しないか、又は著しくそうはしない。例えば、３０％未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満の交差ブロックが見られるであろう。一実施形態では、５％未満、特に１％未満の交差ブロックが見られるであろう。一実施形態では、交差ブロックパラトープは、例えば、交差ブロックする既存のパラトープを置き換えるために、本発明の抗体において採用されるべきＣＤ４５に特異的なさらなるパラトープを特定するための方法として望まれる。別の実施形態では、交差ブロッキング抗体は、本明細書に上述した抗体のＣＤ４５に特異的なパラトープによって結合されるエピトープと境界を接し、及び／又は重なり合うエピトープに結合する。別の実施形態では、交差ブロック中和抗体は、本明細書において上に記載される抗体のＣＤ４５に対するパラトープによって結合されるエピトープと境界を接し、及び／又は重なりあうエピトープに結合する。本発明の抗体のＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なるパラトープは、ＣＤ４５の異なるエピトープに結合し、したがって互いの結合を交差ブロックしないことを確認するために、交差ブロックアッセイも採用され得る。一実施形態では、ＣＤ４５に対するパラトープのうちの１つだけを各々含む２つの抗体を作製し、それぞれが他方を交差ブロックする能力を測定することができる。ＣＤ４５に対する抗体及び／又は特異性は、典型的には、他と交差ブロックしたり競合したりすべきではないが、それらは両方とも同時にＣＤ４５と依然として結合できるはずである。
【0126】
交差ブロッキング抗体は、当該技術分野における任意の適切な方法、例えば、交差ブロッキング抗体の抗原（ＣＤ４５）への結合が本発明の抗体の結合を阻止する、又はその逆の、競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することによって同定することが可能である。このような交差ブロッキングアッセイは、単離された天然若しくは組換えＣＤ４５、又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用することができる。一例では、結合及び交差ブロックは、組換えＣＤ４５（配列番号４１）を用いて測定され、例えば、それらの抗体のいずれかによる交差ブロックは、８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、特に９５％以上によるものである。一実施形態では、交差ブロックアッセイは、本発明の抗体からＣＤ４５に特異的なパラトープのうちの１つだけを有する抗体を用いて実施されてもよい。
【0127】
同一性と類似性の程度は容易に計算できる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｉｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３‐４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６‐２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１‐１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９‐３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９‐６５６，）。
【0128】
本発明はまた、本明細書に開示された新規ポリペプチド配列、及びそれに対して少なくとも８０％類似又は同一、例えば８５％以上、そのような９０％以上、特に９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の類似性又は同一性を有する配列にも及ぶものである。一実施形態では、配列は、本明細書で提供される特定の配列の少なくとも１つに対して少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。「同一性」は、本明細書で使用される場合、整列した配列の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で使用する「類似性」は、整列した配列中の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンに置換されていてもよい。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸には、以下が含まれるが、これらに限定されるものではない：
‐ フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
‐ リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
‐ アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
‐ アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
‐ システインとメチオニン（硫黄を含む側鎖を持つアミノ酸）。
‐ フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
‐ リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
‐ アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
‐ アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
‐ システインとメチオニン（硫黄を含む側鎖を持つアミノ酸）。
【0129】
同一性と類似性の程度は容易に計算できる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｉｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１，ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３‐４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆ Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６‐２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１‐１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９‐３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆ Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９‐６５６，）。
【0130】
本発明のこの態様は、ヒト化バージョン及び修飾バージョンを含むこれらの抗ＣＤ４５抗体のバリアントにも及ぶことが理解され、本明細書に記載されるように、１つ以上の異性化、脱アミド化、グリコシル化部位又はシステイン残基を取り除くためにＣＤＲにおいてアミノ酸が変異されたものが含まれる。一実施形態では、ＣＤ４５に対するパラトープの一方又は両方は、既に知られている抗体由来であってもよいが、バイパラトピック抗体形式で採用されたことはない。
【0131】
ＦＡＬＡ及びノブ・イン・ホール修飾を有する好ましい抗体
本発明の１つの特に好ましい実施形態では、採用される抗体は、ＦＡＬＡ修飾を有する重鎖を含んでいる。特に、ＦＡＬＡ修飾は、Ｆｃレセプター結合を変化させる。さらなる好ましい実施形態では、抗体は、抗体のヒンジ領域における修飾、特に２２８位、好ましくは２２８Ｐにおける修飾を含む。一実施形態では、抗体は、２２８位、２３４位、及び２３５位での修飾を含む重鎖を有する。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ ＦＡＬＡ修飾を含むであろう。本発明の特に好ましい実施形態において、提供される抗体は、ＩｇＧ４（Ｐ）アイソタイプ抗体であり、そのような修飾を含むであろう。
本発明の１つの特に好ましい実施形態では、採用される抗体は、ＦＡＬＡ修飾を有する重鎖を含んでいる。特に、ＦＡＬＡ修飾は、Ｆｃレセプター結合を変化させる。さらなる好ましい実施形態では、抗体は、抗体のヒンジ領域における修飾、特に２２８位、好ましくは２２８Ｐにおける修飾を含む。一実施形態では、抗体は、２２８位、２３４位、及び２３５位での修飾を含む重鎖を有する。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ ＦＡＬＡ修飾を含むであろう。本発明の特に好ましい実施形態において、提供される抗体は、ＩｇＧ４（Ｐ）アイソタイプ抗体であり、そのような修飾を含むであろう。
【0132】
別の特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、いわゆる「ノブ・イン・ホール」修飾を含むであろう。一実施形態では、抗体の一方の重鎖はＴ３５５で、他方はＴ３６６、３６８、４０７で修飾を含み、特に、２つの同一の重鎖がペアになるのではなく、それらが優先的にペアになることを意味する２つの異なる重鎖における相補的な形状を作る。特に、一方の特異性のための重鎖はＴ３５５Ｗ「ノブ」修飾を有し、他方はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ「ホール」修飾を有することができる。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体であり、そのような修飾を有する。
【0133】
本発明の別の特に好ましい実施形態では、ＦＡＬＡ、ヒンジ、及び「ノブ・イン・ホール」修飾が組み合わされる。好ましい実施形態では、それらは、ＩｇＧ４アイソタイプ抗体の文脈で組み合わされる。一実施形態では、抗体の１つの重鎖は、２２８位、２３４位、２３５位、及び３５５位に修飾を有する。別の実施形態では、１つの重鎖は、２２８、２３４、２３５、３６６、３６８、及び４０７位で修飾を含む。例えば、一実施形態では、一方の重鎖はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３５５Ｗ修飾（そのためＦＡＬＡと「ノブ」修飾の両方）を有し、好ましくは他方はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ修飾（そのためＦＡＬＡと「ホール」修飾の両方）を有している。
【0134】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＦＡＬＡ ＩｇＧ４（Ｐ）抗体である。さらなる特に好ましい実施形態では、ＦＡＬＡノブ・イン・ホールＩｇＧ４（Ｐ）抗体である。
別の実施形態では、上記の形式は、本明細書で議論される他の形式／修飾と組み合わされてもよい。例えば、それらはまた、９５位及び９６位におけるプロテインＡ結合を除去するために本明細書で議論される修飾を含んでもよい。さらなる実施形態において、それらは、共通の軽鎖を含んでもよく、また、同様にプロテインＡ結合修飾を含んでもよい。
別の実施形態では、上記の形式は、本明細書で議論される他の形式／修飾と組み合わされてもよい。例えば、それらはまた、９５位及び９６位におけるプロテインＡ結合を除去するために本明細書で議論される修飾を含んでもよい。さらなる実施形態において、それらは、共通の軽鎖を含んでもよく、また、同様にプロテインＡ結合修飾を含んでもよい。
【0135】
ＢＹｂｅ及びＴｒＹｂｅを含むさらに好ましい抗体形式
一態様において、以下を含む、又は以下からなる抗体分子が提供される：
ａ）式（ＶＩＩ）のポリペプチド鎖：
ｂ）式（ＶＩＩＩ）のポリペプチド鎖：
ここで
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表す；
Ｗは、結合又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表し、ただし、ｐ又はｑが０の場合、それらも０となる；
Ｚは、結合又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表す；
Ｖ１は、ｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表す；
ＶＬは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表す；
ＣＬは、定常領域からのドメイン、例えば、Ｃｋａｐｐａのような軽鎖定常領域ドメインを表す；
Ｖ２は、ｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表す；
ｐは０又は１である；
ｑは０又は１である；そして
ｐが１のときｑは０又は１であり、ｑが１のときｐは０又は１である、すなわち、ｐ及びｑは両方とも０を表さない；
ここで、抗体の抗原結合部位の少なくとも２つは、ＣＤ４５に対して異なるパラトープであり、それぞれがＣＤ４５に対して異なるエピトープを認識する。
一態様において、以下を含む、又は以下からなる抗体分子が提供される：
ａ）式（ＶＩＩ）のポリペプチド鎖：
【化1】
ｂ）式（ＶＩＩＩ）のポリペプチド鎖：
【化2】
ここで
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表す；
Ｗは、結合又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表し、ただし、ｐ又はｑが０の場合、それらも０となる；
Ｚは、結合又はリンカー、例えばアミノ酸リンカーを表す；
Ｖ１は、ｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表す；
ＶＬは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表す；
ＣＬは、定常領域からのドメイン、例えば、Ｃｋａｐｐａのような軽鎖定常領域ドメインを表す；
Ｖ２は、ｄａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖを表す；
ｐは０又は１である；
ｑは０又は１である；そして
ｐが１のときｑは０又は１であり、ｑが１のときｐは０又は１である、すなわち、ｐ及びｑは両方とも０を表さない；
ここで、抗体の抗原結合部位の少なくとも２つは、ＣＤ４５に対して異なるパラトープであり、それぞれがＣＤ４５に対して異なるエピトープを認識する。
【0136】
一例では、ＣＤ４５に特異的な結合ドメインは、Ｖ１、Ｖ２又はＶＨ／ＶＬのうちの少なくとも２つから選択される。
一実施形態では、ｑは０であり、ｐは１である。
一実施形態では、ｑは１であり、ｐは１である。
一実施形態では、Ｖ１はｄａｂであり、Ｖ２はｄａｂであり、これらは一緒に、コグネイトＶＨ／ＶＬペアなどの可変領域の共働ペアの単一の結合ドメインを形成し、これらは任意にジスルフィド結合によって連結されている。
一実施形態では、ｑは０であり、ｐは１である。
一実施形態では、ｑは１であり、ｐは１である。
一実施形態では、Ｖ１はｄａｂであり、Ｖ２はｄａｂであり、これらは一緒に、コグネイトＶＨ／ＶＬペアなどの可変領域の共働ペアの単一の結合ドメインを形成し、これらは任意にジスルフィド結合によって連結されている。
【0137】
一実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ２は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は一緒になって（例えば、結合ドメインとして）、ＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬはＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ２は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は一緒になって（例えば、１つの結合ドメインとして）、ＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬは、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的であり、Ｖ２はＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬはＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ２は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は一緒になって（例えば、結合ドメインとして）、ＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬはＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ２は、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は一緒になって（例えば、１つの結合ドメインとして）、ＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬは、ＣＤ４５に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１はＣＤ４５に特異的であり、Ｖ２はＣＤ４５に特異的であり、ＶＨ及びＶＬはＣＤ４５に特異的である。
【0138】
上記コンストラクトにおけるＶ１、Ｖ２、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ結合ドメインを表し、本明細書に提供される配列のいずれかを組み込んでいてもよい。
Ｗ及びＺは、任意の適切なリンカーを表してもよく、例えば、Ｗ及びＺは、独立してＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６７）又はＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）であってもよい。
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２がｄａｂ、ｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ間のジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４とＶＬ１００の間で形成される。
Ｗ及びＺは、任意の適切なリンカーを表してもよく、例えば、Ｗ及びＺは、独立してＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６７）又はＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１１４）であってもよい。
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２がｄａｂ、ｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ間のジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４とＶＬ１００の間で形成される。
【0139】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＢＹｂｅ抗体形式である。ＢＹｂｅ形式の抗体は、例えばＷＯ２０１３／０６８５７１、Ｄａｖｅ ｅｔ ａｌ，（２０１６）Ｍａｂｓ，８（７）：１３１９‐１３３５に記載されているように、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖにのみ連結したＦａｂを含む。したがって、例えば、上に与えられた式における１つの好ましい実施形態では、（Ｖ１）ｐ及び（Ｖ２）ｑのうちの１つはＳｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖとなり、他は何もないため、ＢＹｂｅ形式の抗体はＦａｂと１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖのみを含むことになる。（Ｖ１）ｐ及び（Ｖ２）ｑのいずれかがゼロの場合、対応するＷ又はＺもゼロとなり、他方は結合又はリンカーとなる。好ましくは、ＢＹｂｅ形式抗体は、Ｆａｂ及びｄｓｓｃＦｖを含む。このようなＢＹｂｅ形式抗体において、２つの抗原結合部位は、好ましくは、ＣＤ４５に対して両方特異的であることができ、この２つは、ＣＤ４５の異なるエピトープに対する２つの異なるパラトープに対応する。
【0140】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体はＴｒＹｂｅ形式である。ＴｒＹｂｅ形式は、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同じ又は異なる標的（例えば、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは治療標的に結合し、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは例えばアルブミンに結合して半減期を増加する）に結合している。そのような抗体フラグメントは、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／１９７７７２に記載されており、その全体は、特に抗体フラグメントの構造及び議論に関して、参照により本明細書に組み入れられる。上に与えられた式に関して、ＴｒＹｂｅ抗体については、ｐ及びｑは共に１であり、Ｖ１及びＶ２は、ＳｃＦｖ及びｄｓｓｃＦｖから独立して選択されるであろう。好ましい実施形態において、Ｖ１及びＶ２は、両方ともＳｃＦｖによってなる。別の実施形態では、Ｖ１及びＶ２は、両方ともｄｓｓｃＦｖであろう。別の実施形態では、Ｖ１及びＶ２のうちの１つはＳｃＦｖであり、他の１つはｄｓｓｃＦｖであろう。ＴｒＹｂｅの抗原結合部位の少なくとも２つは、ＣＤ４５に特異的であり、抗体は、ＣＤ４５の異なるエピトープにそれぞれ特異的な２つの異なるパラトープを含むであろう。特に好ましい一実施形態では、第３の抗原結合部位はアルブミンに特異的であり、特にＶ１及びＶ２のうちの１つはアルブミンに特異的であろう。例えば、ＶＨ／ＶＬはＣＤ４５に（例えばＣＤ４５の第１のエピトープに）特異的であってもよく、Ｖ１及びＶ２の一方はＣＤ４５に（例えばＣＤ４５の第２のエピトープに）特異的であってもよく、Ｖ１及びＶ２の他方はアルブミンに特異的であってもよい。
【0141】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、アルブミンに特異的な少なくとも１つのパラトープを含むであろう。一実施形態では、抗体は、ＣＤ４５の異なるエピトープに特異的な２つのパラトープ、及びアルブミンに特異的な第３のパラトープも含むＴＲＹｂｅ形式抗体であろう。アルブミンを結合するために使用され得るアルブミン結合抗体配列の例には、ＷＯ２０１７／１９１０６２に開示されたものが含まれ、特にアルブミン結合配列に関する限り、その全体が参照により組み込まれる。したがって、本発明の抗体は、ＷＯ２０１７１９１０６２のアルブミン特異的抗体のうちの１つからのパラトープを含んでいてもよい。
【0142】
代替の実施形態では、上述したような抗体は、少なくとも２つの異なるものではなく、ＣＤ４５に対して１つのみの特異性を有する。例えば、抗体の抗原結合部位の１つは、ＣＤ４５に対して特異的であってもよい。別の実施形態では、抗原結合部位のうちの２つはＣＤ４５に対して特異的であるが、同じ特異性を有する。さらなる実施形態では、上記で定めた抗体の３つの抗原結合部位は全て、ＣＤ４５に対して同じ特異性を有する。別の実施形態では、抗原結合部位のうちの２つはＣＤ４５に対して同じ特異性を有し、３つ目は血清アルブミンに対して特異的である。好ましい実施形態において、このような抗体は、本発明の抗体の混合物において使用される。
【0143】
ジスルフィド結合
本発明の抗体中の１つ以上の可変領域のペアがＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合を含む場合、これは以下に列挙する残基の２つの間など、任意の適切な位置であってもよい（文脈が他に示す場合を除いて、以下のリストではＫａｂａｔ番号付けが採用されている）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及する場合、関連する文献は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。
本発明の抗体中の１つ以上の可変領域のペアがＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合を含む場合、これは以下に列挙する残基の２つの間など、任意の適切な位置であってもよい（文脈が他に示す場合を除いて、以下のリストではＫａｂａｔ番号付けが採用されている）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及する場合、関連する文献は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。
【0144】
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２が、上述の式におけるｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、ＶＩ及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ間のジスルフィド結合は、以下に示す残基のうちの２つの間にある（文脈が他に示す場合を除いて、以下のリストにおいてＫａｂａｔ番号付けが採用されている）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及する場合、関連する文献は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。
【0145】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、以下を含む群から選択される位置にある：
・ ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６、７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ５４５１‐５４５９ Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）；又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６９ Ｎｏ．２８ ｐｐ．１８３２７‐１８３３１ Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）；又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１０ ｎｏ．１２ ｐｐ．１４５３‐１４５９ Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５‐８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
・ ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５‐１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
・ ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２‐１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照されたい；
・ ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ ｐｐ．７５３８‐７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５‐４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）、及び
・ ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５‐１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
及び、分子内に位置する可変領域ペアにおけるそれに対応する位置。
・ ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６、７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ５４５１‐５４５９ Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）；又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６９ Ｎｏ．２８ ｐｐ．１８３２７‐１８３３１ Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）；又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１０ ｎｏ．１２ ｐｐ．１４５３‐１４５９ Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５‐８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
・ ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５‐１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
・ ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２‐１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照されたい；
・ ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１‐７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照されたい；
・ ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ ｐｐ．７５３８‐７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５‐４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）、及び
・ ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５‐１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照されたい；
及び、分子内に位置する可変領域ペアにおけるそれに対応する位置。
【0146】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４とＶＬ１００との間に形成される。
上記のアミノ酸ペアは、ジスルフィド結合が形成され得るようなシステインによる置換に資する位置にある。システインは、既知の技術によって、これらの所望の位置に設計することができる。したがって、１つの実施形態において、本開示による設計されたシステインは、所定のアミノ酸位置における天然に存在する残基がシステイン残基で置換されているところを意味する。
上記のアミノ酸ペアは、ジスルフィド結合が形成され得るようなシステインによる置換に資する位置にある。システインは、既知の技術によって、これらの所望の位置に設計することができる。したがって、１つの実施形態において、本開示による設計されたシステインは、所定のアミノ酸位置における天然に存在する残基がシステイン残基で置換されているところを意味する。
【0147】
設計されたシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法には、ＰＣＲ伸長オーバーラップ変異生成、部位特異的突然変異誘発又はカセット式変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３参照）などがあるが、これらに制限されない。部位特異的変異誘発キットは市販されており、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ‐Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）がある。カセット式変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｈ，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５‐３２３ に基づいて行うことができる。あるいは、変異体は、オーバーラップするオリゴヌクレオチドのアニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅及びクローニングによる全遺伝子合成によって作製することができる。
【0148】
ＷＯ２０１５／１９７７７２は、ＢＹｂｅ及びＴｒＹｂｅ形式の抗体に関連して、ジスルフィドブリッジの好ましい位置を詳細に記載している。ＷＯ２０１５／１９７７７２は、特にジスルフィドブリッジの位置に関連して、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書で論じるように、抗体のヒンジ領域における残基の能力を変更することは、ＣＤ４５への結合に影響を与える１つの潜在的な方法であり、本発明において採用され得る。
本明細書で論じるように、抗体のヒンジ領域における残基の能力を変更することは、ＣＤ４５への結合に影響を与える１つの潜在的な方法であり、本発明において採用され得る。
【0149】
リンカー
ある文脈におけるリンカーに関する本明細書の教示は、リンカーが採用される異なる文脈におけるリンカー、例えば本発明の任意の結合分子、特に抗体、特にそれぞれが異なる抗原結合部位を有する実体を連結することを含むものに、同様に適用することができる。一実施形態では、リンカーは、本発明の結合分子、特に抗体の構成部分を一緒に結合するために採用され得る。例えば、一実施形態では、結合分子、特に抗体の構成部分を、ヘテロダイマーテザーの一部分に結合するためにリンカーが使用されてもよく、例えばＦａｂ又はＳｃＦｖがリンカーを介してヘテロダイマーテザーの２つのユニットのうちの１つに結合されてもよい。
一実施形態では、本発明の分子に採用されるリンカーは、例えば配列番号１４９～２１４に示される配列から選択される、長さ５０残基以下のアミノ酸リンカーである。
ある文脈におけるリンカーに関する本明細書の教示は、リンカーが採用される異なる文脈におけるリンカー、例えば本発明の任意の結合分子、特に抗体、特にそれぞれが異なる抗原結合部位を有する実体を連結することを含むものに、同様に適用することができる。一実施形態では、リンカーは、本発明の結合分子、特に抗体の構成部分を一緒に結合するために採用され得る。例えば、一実施形態では、結合分子、特に抗体の構成部分を、ヘテロダイマーテザーの一部分に結合するためにリンカーが使用されてもよく、例えばＦａｂ又はＳｃＦｖがリンカーを介してヘテロダイマーテザーの２つのユニットのうちの１つに結合されてもよい。
一実施形態では、本発明の分子に採用されるリンカーは、例えば配列番号１４９～２１４に示される配列から選択される、長さ５０残基以下のアミノ酸リンカーである。
【0150】
【表1】
【0151】
【表2-1】
【表2-2】
【0152】
（Ｓ）は、配列番号１６０から１６４において任意である。
リジッドリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号９２）、ＰＰＰＰ（配列番号９３）及びＰＰＰが含まれる。
他のリンカーを表３に示す。
リジッドリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号９２）、ＰＰＰＰ（配列番号９３）及びＰＰＰが含まれる。
他のリンカーを表３に示す。
【0153】
【表3】
【0154】
テザー形式の結合分子及び抗体
一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、ヘテロダイマーテザーによって一緒にされた２つの部分を含むことができる。例えば、本発明の抗体は、各々がＣＤ４５に対する異なるパラトープを有する異なる抗体フラグメントを含み、さらにそれが抗体の他の半分と一緒に全体の抗体分子を形成することを可能にするテザー領域を有する２つの部分を含んでもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ抗体形式（Ｆａｂ‐Ｋｄ‐Ｆａｂ形式とも称される）である。Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ抗体形式は、ＣＤ４５に対する異なるパラトープの順列を迅速にスクリーニングすることができるため、スクリーニングに特に有用である。
一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、ヘテロダイマーテザーによって一緒にされた２つの部分を含むことができる。例えば、本発明の抗体は、各々がＣＤ４５に対する異なるパラトープを有する異なる抗体フラグメントを含み、さらにそれが抗体の他の半分と一緒に全体の抗体分子を形成することを可能にするテザー領域を有する２つの部分を含んでもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ抗体形式（Ｆａｂ‐Ｋｄ‐Ｆａｂ形式とも称される）である。Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ抗体形式は、ＣＤ４５に対する異なるパラトープの順列を迅速にスクリーニングすることができるため、スクリーニングに特に有用である。
【0155】
したがって、１つの実施形態において、本発明による抗体分子は、式Ａ‐Ｘ：Ｙ‐Ｂを有するＣＤ４５の異なるエピトープに特異的な少なくとも２つの異なるパラトープを含む抗体であり、
Ａ‐Ｘは、第１の融合タンパク質である；
Ｙ‐Ｂは、第二の融合タンパク質である；
Ｘ：Ｙはヘテロダイマーテザーである；
：は、ＸとＹとの間の結合相互作用である；
Ａは、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントから選択される抗体の第１のタンパク質成分である；
Ｂは、Ｆａｂ又はＦａｂ’から選択される抗体の第２のタンパク質成分である；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合フラグメントから独立に選択される結合ペアの第１の結合パートナーであり；そして
Ｙは、抗原、抗体又はその結合フラグメントから独立して選択される結合ペアの第２の結合パートナーである；
ただし、Ｘが抗原であるとき、ＹはＸで表される抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントであり、Ｙが抗原であるとき、ＸはＹで表される抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントである。
Ａ‐Ｘは、第１の融合タンパク質である；
Ｙ‐Ｂは、第二の融合タンパク質である；
Ｘ：Ｙはヘテロダイマーテザーである；
：は、ＸとＹとの間の結合相互作用である；
Ａは、Ｆａｂ又はＦａｂ’フラグメントから選択される抗体の第１のタンパク質成分である；
Ｂは、Ｆａｂ又はＦａｂ’から選択される抗体の第２のタンパク質成分である；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合フラグメントから独立に選択される結合ペアの第１の結合パートナーであり；そして
Ｙは、抗原、抗体又はその結合フラグメントから独立して選択される結合ペアの第２の結合パートナーである；
ただし、Ｘが抗原であるとき、ＹはＸで表される抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントであり、Ｙが抗原であるとき、ＸはＹで表される抗原に特異的な抗体又はその結合フラグメントである。
【0156】
ＣＤ４５抗体及び配列の例示
ＣＤ４５に特異的な任意の適切なパラトープを、本発明において採用することができる。そのような抗体の例示は、本明細書に記載されている。
一実施形態では、本発明の抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい：
ＣＤ４５に特異的な任意の適切なパラトープを、本発明において採用することができる。そのような抗体の例示は、本明細書に記載されている。
一実施形態では、本発明の抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい：
【表4】
【0157】
例えば、一実施形態では、抗体は、配列番号１～１４から少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含んでいてもよい。一実施形態では、配列番号１～１４に示されるものの中から少なくとも１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１～８に記載のものからのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及び／又はＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域を含んでもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号９～１４に記載のものからのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及び／又はＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。一実施形態では、抗体は、配列番号１～１４の６つのＣＤＲを含んでよく、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号１～１４の対応するＣＤＲ配列から選択され、特定のＣＤＲは４１３３特異性の元のＣＤＲ、又は配列番号１～１４に記載のバリアント配列の１つであってよい。一実施形態では、抗体は、配列番号１、３、５、９、１３、及び１４のＣＤＲを含むパラトープを含んでもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含むＣＤ４５に対する少なくとも１つのパラトープを含む。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＣＤ４５抗体を、任意の適切な抗体形式で提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ＣＤＲを含む本明細書に記載の結合ドメインの１つ以上を含む抗ＣＤ４５抗体又はそのフラグメントを提供するが、本明細書に記載の抗体形式のいずれかであってよい。
【0158】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７から２２の可変領域のいずれかを含んでいてもよい。一実施形態では、抗体の１つのパラトープは、配列番号１７又は１８から選択される軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、抗体の１つのパラトープは、配列番号１９から２２から選択される重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載の重鎖可変領域が、本明細書に記載の軽鎖可変領域と組み合わせて採用される。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７又は１８から選択される軽鎖可変領域と配列番号１９～２２から選択される重鎖可変領域とを含むＣＤ４５に特異的なパラトープを含む。
【0159】
一実施形態では、上記は、ＣＤ４５に対する少なくとも２つの特異性を有する本発明の抗体、又は抗体の混合物において使用される。一実施形態では、採用される抗体は、上記の配列のうちの１つを含んでいない。
一実施形態において、本発明の抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい：
一実施形態において、本発明の抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい：
【表5】
【0160】
例えば、一実施形態では、抗体は、配列番号２３から３１までの少なくとも１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲを含んでいてもよい。一実施形態では、配列番号２３～３１に示されるものの中から少なくとも１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２３～２８に記載のものからのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及び／又はＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２９から３１に記載のものからのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及び／又はＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。一実施形態では、抗体は、配列番号２３から３１の６つのＣＤＲを含んでよく、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、配列番号２３から３１の対応するＣＤＲ配列から選択され、特定のＣＤＲは６２９４特異性のオリジナルＣＤＲ又は配列番号２３から３１に記載のバリアント配列のうちの１つであってよい。一実施形態では、このようなＣＤＲ配列を含むＣＤ４５に対する１つのパラトープを含む本発明の抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体のパラトープは、配列番号２３～２５及び２９～３１のＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＣＤ４５抗体を、任意の適切な抗体形式で提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、ＣＤＲを含む本明細書に記載の結合ドメインの１つ以上を含む抗ＣＤ４５抗体又はそのフラグメントを提供し、本明細書に記載の抗体形式のいずれかであってよい。
【0161】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３２から３７の可変領域のいずれかを含んでいてもよい。一実施形態では、抗体の１つのパラトープは、配列番号３６及び３７から選択される軽鎖可変領域を含んでいる。別の実施形態では、抗体の１つのパラトープは、配列番号３４又は３５から選択される重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載の重鎖可変領域が、本明細書に記載の軽鎖可変領域と組み合わせて採用される。好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３６及び３７から選択される軽鎖可変領域と、配列番号３４及び３５から選択される重鎖可変領域とを含むＣＤ４５に特異的なパラトープを含む。
【0162】
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体の１つのパラトープは、上述の配列番号１～２２の配列、又はそれに由来する配列を含み、抗体の他のパラトープは、上述の配列番号２３～３７の配列、又はそれに由来する配列を含む。例えば、一実施形態では、ＣＤ４５に特異的な本発明の抗体の１つのパラトープは、上述の配列番号１～１４からの１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲを含み、抗体の他のパラトープは、上述の配列番号２３～３１からの１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗体の１つのパラトープは、上述のように配列番号１７から２１の可変領域配列、又はそれに由来する配列を含み、ＣＤ４５に特異的な他のパラトープは、上述のように配列番号３４から３７の可変領域配列、又はそれに由来する配列を含む。
【0163】
一つの特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５に特異的な本発明の抗体の少なくとも１つのパラトープは、本明細書で論じる４１３３ ＣＤ４５特異性からの１、２、３、４、５又は６個のＣＤＲを含む。別の特に好ましい実施形態では、抗体の少なくとも１つのパラトープは、配列番号１７及び１８から選択される４１３３特異性のための軽鎖可変領域を含む。別の特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５に特異的な抗体の少なくとも１つのパラトープは、４１３３特異性のための重鎖可変領域を含む。配列番号１９から２１までから選択される。別の特に好ましい実施形態では、ＣＤ４５に特異的な抗体の少なくとも１つのパラトープは、このような軽鎖及び重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、本明細書に規定される特定のＣＤＲ又は可変領域配列の１つではなく、本発明の抗体は、本明細書に規定される特定の配列と少なくとも９５％同一又は類似（９６、９７、９８、９９％同一又は類似など）の配列を有するＣＤＲ又は可変領域を含む。例えば、１つ以上のアミノ酸配列の変化、特に保存的配列の変化を有していてもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、実施例、特に例１３に規定されるフレームワーク修飾のうちの１つを含んでいてもよい。
【0164】
一実施形態では、本発明の抗体のパラトープに採用される重鎖可変領域ヒトフレームワークは、ＩＧＨＶ３‐２１、ＩＧＨＶ４‐４、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はそれ以上のアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸で置換され、例えばドナー抗体中の対応位置、例えばここに規定する特定のドナーＶＨ配列からの残基で置換されている上記の任意の１つのバリアントを含む群から選択される。別の実施形態では、フレームワークは、ＩＧＨＶ３‐４８、ＩＧＨＶ１‐１９、又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又はそれ以上のアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸で置換され、例えば、ドナー抗体中の対応する位置の残基、例えば本明細書に記載の特定のドナーＶＨ配列からの残基で置換されてなる上記のいずれか１つのバリアントを含む群から選択される。一実施形態では、ヒトフレームワークは、ＪＨ４又はＪＨ１ Ｊ領域のような適切なＪ領域配列をさらに含む。
【0165】
一実施形態では、本開示の抗体分子に採用されるヒトＶＨフレームワークは、２４、３７、４４、４８、４９、６７、６９、７１、７３、７６及び７８からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１位などの少なくとも１つの位置において置換されたアミノ酸を有しており、例えばヒトフレームワークの元のアミノ酸がシステイン以外の別のアミノ酸に置換されており、特にドナー抗体のフレームワークの対応する位置における残基で置換している。
【0166】
ＶＨフレームワークがＩＧＨＶ３型である場合の一実施形態では、４８、４９、６９、７１、７３、７６及び７８から選択される少なくとも５つの位置（通常は５つ又は６つの位置）、例えば４８、７１、７３、７６及び７８（特にＩＧＨＶ３‐７に好適）、又は４８、６９、７１、７３、７６及び７８（特にＩＧＨＶ３‐７に好適）、又は４８、４９、７１、７３、７６及び７８（特にＩＧＨＶ３‐２１に好適）において置換がなされてもよい。ＶＨフレームワークがタイプＩＧＨＶ４である場合の１つの実施形態では、置換は１つ以上（１、２、３、４、５、６又は７）において、例えば２４、３７、４８、４９、６７、６９、７１、７３、７６及び７８から選択される５つの位置で、例えば、２４、７１、７３、７６及び７８の位置のすべてにおいて、任意にさらに４８及び６７（これはＩＧＨＶ４‐４に特に適している）において、又は２４、３７、４９、６７、６９、７１、７３、７６及び７８（これはＩＧＨＶ４‐３１に特に適している）の位置すべてにおいて行われてもよい。
【0167】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲが由来する元のフレームワークからのアミノ酸２、３、及び／又は７０も移植された軽鎖可変領域を含んでいてもよい。例えば、４１３３軽鎖可変領域の場合、オリジナル抗体からのグルタミン（Ｑ２）、バリン（Ｖ３）及び／又はグルタミン（Ｑ７０）も、特にレシピエントフレームワークがＩＧＫＶ１Ｄ‐１３である場合、採用されるヒト化軽鎖可変領域に移植されてもよい。ある実施形態では、ＣＤＲＬ１は、潜在的なＮ‐グリコシル化部位を除去するために変異されてもよい。一実施形態では、４１３３重鎖可変領域の場合、ある実施形態では、４８、４９、７１、７３、７６及び／又は７８位の残基が、１又は複数のＣＤＲと同様に新しいフレームワークに移植され得る。例えば、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）、スレオニン（Ｔ７６）及び／又はバリン（Ｖ７８）も、それぞれ、特にアクセプターフレームワークがＩＧＨＶ３‐２１の場合、移植されてもよい。ある場合には、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２は、システイン残基を除去するように変異されてもよい（それぞれＣＤＲＨ１バリアント及びＣＤＲＨ２バリアント）。ＣＤＲＨ３はまた、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異されてもよい（ＣＤＲＨ３バリアント１～３）。別の実施形態では、４１３３重鎖可変領域からのＣＤＲが使用される場合、４１３３ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、特にアクセプターフレームワークがＩＧＨＶ４‐４配列である場合、２４、７１、７３、７６及び７８位に保持されてもよい。例えば、アラニン（Ａ２４）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）、スレオニン（Ｔ７６）及びバリン（Ｖ７８）もそれぞれ、ＣＤＲと同様に移される可能性がある。場合によっては、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２を変異させてシステイン残基を除去してもよい（それぞれ、ＣＤＲＨ１バリアント及びＣＤＲＨ２バリアント）。ＣＤＲＨ３はまた、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異されてもよい（ＣＤＲＨ３バリアント１～３）。本願の例１３は、６２９４特異性がＣＤＲの源として使用される場合に保持されてもよいフレームワーク残基も示し、これらの残基の保持は、いくつかの実施形態において、１つ以上のＣＤＲが６２９４特異性からである場合に採用されてもよい。
【0168】
一つの好ましい実施形態において、ヒトフレームワークは、ＪＨ１又はＪＨ４ Ｊ領域などの適切なヒトＪ領域をさらに含む。一つの好ましい実施形態において、ＪＨ１ Ｊ領域が採用される。
Ｋａｂａｔ番号付けは、文脈が他に示さない限り、本明細書で採用される。
一実施形態では、本開示のヒト化抗体分子に採用される軽鎖可変領域ヒトフレームワークは、ＩＧＫＶ１‐５、ＩＧＫＶ１‐１２、ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３、及び１、２、３、４又は５つのアミノ酸（２つのアミノ酸など）がシステイン以外のアミノ酸で置換された、例えば元のドナー抗体における対応位置のドナー残基、例えば配列番号６０、６９、７８又は８８に規定されているドナーＶＬ配列からの残基で置換された上記のいずれか１つのバリアントを含む群から選択される。典型的には、ヒトフレームワークは、ＪＫ４ Ｊ領域のような適切なヒトＪ領域配列をさらに含んでいる。
一実施形態では、軽鎖及び／又は重鎖フレームワークの変化（単数又は複数）は、本明細書に記載された配列に示される。
Ｋａｂａｔ番号付けは、文脈が他に示さない限り、本明細書で採用される。
一実施形態では、本開示のヒト化抗体分子に採用される軽鎖可変領域ヒトフレームワークは、ＩＧＫＶ１‐５、ＩＧＫＶ１‐１２、ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３、及び１、２、３、４又は５つのアミノ酸（２つのアミノ酸など）がシステイン以外のアミノ酸で置換された、例えば元のドナー抗体における対応位置のドナー残基、例えば配列番号６０、６９、７８又は８８に規定されているドナーＶＬ配列からの残基で置換された上記のいずれか１つのバリアントを含む群から選択される。典型的には、ヒトフレームワークは、ＪＫ４ Ｊ領域のような適切なヒトＪ領域配列をさらに含んでいる。
一実施形態では、軽鎖及び／又は重鎖フレームワークの変化（単数又は複数）は、本明細書に記載された配列に示される。
【0169】
一実施形態では、本開示の抗体分子に採用されるヒトＶＬフレームワークは、２、３、及び７０を含む群から選択される少なくとも１つの位置で置換されたアミノ酸を有し、例えば、ヒトフレームワークの元のアミノ酸がシステイン以外の別のアミノ酸について置換されており、特にドナー抗体のフレームワークの対応する位置の残基について置き換えられている。一実施形態では、ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３ヒトフレームワークが採用される場合、２、３及び７０から独立して選択される位置で１、２又は３つの置換が行われてもよい。一実施形態では、ＶＬフレームワークの置換後の位置２はグルタミンである。一実施形態では、ＶＬフレームワークの置換後の位置３はバリンである。一実施形態では、ＶＬフレームワークの置換後の位置７０は、グルタミンである。
本明細書に記載された置換の１つ又は複数を組み合わせて、本発明の抗体分子で使用するためのヒト化ＶＬ領域を生成してもよいことが理解されよう。
本明細書に記載された置換の１つ又は複数を組み合わせて、本発明の抗体分子で使用するためのヒト化ＶＬ領域を生成してもよいことが理解されよう。
【0170】
一つの独立した態様において、提供されるヒト化ＶＬ可変ドメインは、配列番号１７及び１８から独立して選択される配列、並びに同じもののうちの任意の１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（同じものの任意の１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似のものなど）を含む。代替の実施形態では、ヒト化ＶＬ可変ドメインは、配列番号３６、３７から独立して選択される配列、及び同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（同じもののいずれか１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似など）を含む。
【0171】
１つの独立した局面において、配列番号１９から２２から独立して選択される配列、及び同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（９６、９７、９８又は９９％同一又は類似のものなど）を含むヒト化ＶＨ可変ドメイン、並びに配列番号１７、１８から独立して選択される配列、及び同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（９６、９７、９８又は９９％同一又は類似のものなど）を含むヒト化ＶＬ可変ドメインが、提供されている。１つの代替的な局面において、配列番号３４、３５から独立して選択される配列、及び同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（９６、９７、９８、又は９９％同一又は類似のものなど）を含むヒト化ＶＨ可変ドメイン、並びに配列番号３６、３７から独立して選択される配列、及び同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似のヒト化配列（９６、９７、９８、又は９９％同一又は類似などのもの）を含むヒト化ＶＬ可変ドメインが提供されている。
【0172】
一つの独立した側面において、配列番号１９から２２から独立して選択される配列を含むヒト化ＶＨ可変ドメイン、及び配列番号１７及び１８から独立して選択される配列を含むヒト化ＶＬ可変ドメインが提供される。１つの代替的な態様では、配列番号３４及び３５から独立して選択される配列と、配列番号３６及び３７から独立して選択されるヒト化ＶＬ可変配列とを含むヒト化ＶＨ可変ドメイン、又は重鎖ＣＤＲ３が配列番号２６、２７及び２８から選択されるバリアントが提供されている。例えば、１つの好ましい実施形態では、提供される抗体は、配列番号２３のＨＣＤＲ１配列、配列番号２４のＨＣＤＲ２配列、及び配列番号２６、２７、及び２８の１つから選択されるバリアントＨＣＤＲ３配列を含む。好ましい実施形態では、提供される抗体は、配列番号２９のＬＣＤＲ１配列、配列番号３０のＬＣＤＲ２配列、及び配列番号３１のＬＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、抗体は、かかる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を両方含むので、配列番号２３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２配列、及び配列番号２６、２７、及び２８の１つから選択されるバリアントＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２９のＬＣＤＲ１、配列番号３０のＬＣＤＲ２、及び配列番号３１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。本発明はまた、バイパラトピック抗体に限定されない一般的にかかる６つのＣＤＲのセットを含む抗体を含むものである。
【0173】
また、本明細書に明示的に開示された抗体又は結合フラグメントのパラトープと同じエピトープに結合するパラトープを含む抗体又は結合フラグメントも提供される。
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５の配列又はこれと少なくとも９５％同一又は類似する配列（９６、９７、９８又は９９％同一又は類似など）を有する軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１８の配列を有する軽鎖、又はそれと少なくとも９５％同一若しくは類似の配列（９６、９７、９８又は９９％同一若しくは類似の配列など）を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体、特に２つの異なる特異性を有する抗体は、そのような軽鎖の両方を含むであろう。
好ましい一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５の配列又はこれと少なくとも９５％同一又は類似する配列（９６、９７、９８又は９９％同一又は類似など）を有する軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１８の配列を有する軽鎖、又はそれと少なくとも９５％同一若しくは類似の配列（９６、９７、９８又は９９％同一若しくは類似の配列など）を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体、特に２つの異なる特異性を有する抗体は、そのような軽鎖の両方を含むであろう。
【0174】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１６の配列又はこれと少なくとも９５％同一又は類似の配列（同じものの任意の１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似の配列）を有する重鎖を含み、好ましくはＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ修飾を保持している。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１７の配列又は同じもののいずれか１つと少なくとも９５％同一又は類似している配列（同じもののいずれか１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似など）を有する重鎖を含み、好ましくはＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＴ３５５Ｗ修飾を保持している）であろう。
【0175】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１９の配列、又はそれと少なくとも９５％同一又は類似の配列（９６、９７、９８又は９９％同一又は類似など）を有する重鎖を含み、好ましくはＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ修飾を保持しているであろう。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５～１１９の上記の重鎖及び軽鎖のうちの２つ、又はそれと少なくとも９５％の同一性又は類似性（少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性又は類似性など）を有する配列を含み、ＦＡＬＡ及び／又はノブ・イン・ホールに関する記載の修飾を保持しているであろう。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５及び１１８の軽鎖と、配列番号１１７及び１１９の重鎖を有するであろう。別の実施形態では、それは、ＦＡＬＡ及びノブ・イン・ホールの修飾を保持しながら、上記のいずれか１つ又はすべてと少なくとも９５％の同一性又は類似性を有するであろう（たとえば、上記のいずれか１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似のもの）。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５～１１９の上記の重鎖及び軽鎖のうちの２つ、又はそれと少なくとも９５％の同一性又は類似性（少なくとも９６、９７、９８又は９９％の同一性又は類似性など）を有する配列を含み、ＦＡＬＡ及び／又はノブ・イン・ホールに関する記載の修飾を保持しているであろう。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１５及び１１８の軽鎖と、配列番号１１７及び１１９の重鎖を有するであろう。別の実施形態では、それは、ＦＡＬＡ及びノブ・イン・ホールの修飾を保持しながら、上記のいずれか１つ又はすべてと少なくとも９５％の同一性又は類似性を有するであろう（たとえば、上記のいずれか１つと９６、９７、９８又は９９％同一又は類似のもの）。
【0176】
また、本発明は、抗体が必ずしもＣＤ４５に対してバイパラトピックである必要はなく、６２９４抗体のＣＤＲ、可変領域、軽鎖及び／又は重鎖配列、又は６２９４配列のバリアントを含む抗体を提供するものである。例えば、本発明は、抗体の特異性の１つが、６２９４抗体又はそのバリアントの配列を含む抗体を提供する。別の実施形態では、６２９４抗体のそのような配列を含む単一特異性抗体が提供される。例えば、そのような抗体は、配列番号２３から３１の６つのＣＤＲを含んでよく、ここで、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３が配列番号２３から３１の対応するＣＤＲ配列から選択され、特定のＣＤＲが６２９４特異性の元のＣＤＲ又は配列番号２３から３１に記載のバリアントの１つの配列でありえる。一つの代替的側面において、配列番号３４及び３５から独立して選択される配列を含むヒト化ＶＨ可変ドメインと、配列番号３６及び３７から独立して選択されるヒト化ＶＬ可変配列とを含む抗体が提供される。本発明はまた、６２９４抗体、並びにそのヒト化バージョン、及び他のバリアントを提供する。ベクター、核酸、医薬組成物など、本明細書に記載された抗体に対する様々な関連態様も、そのような抗体に採用され得る。
【0177】
アルブミン抗体及び配列の例示
本発明で用いられるアルブミンに特異的な抗体は、以下のＣＤＲ配列を有することができる。
そのような抗体は、配列番号１２６のＶＬ配列及び配列番号１２７のＶＨ配列を含んでもよい。そのような抗体は、代替的に、それぞれ配列番号１２８及び配列番号１２９のジスルフィド結合したＶＬ及びＶＨ配列を含んでもよい。２つのＣＤ４５パラトープ及びアルブミンパラトープを含むＴｒＹｂｅの場合、重鎖は配列番号１３０の配列を含むことができ、軽鎖は配列番号１３１の配列を含むことができる。
本発明で用いられるアルブミンに特異的な抗体は、以下のＣＤＲ配列を有することができる。
【表6】
そのような抗体は、配列番号１２６のＶＬ配列及び配列番号１２７のＶＨ配列を含んでもよい。そのような抗体は、代替的に、それぞれ配列番号１２８及び配列番号１２９のジスルフィド結合したＶＬ及びＶＨ配列を含んでもよい。２つのＣＤ４５パラトープ及びアルブミンパラトープを含むＴｒＹｂｅの場合、重鎖は配列番号１３０の配列を含むことができ、軽鎖は配列番号１３１の配列を含むことができる。
【0178】
エフェクター分子
本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子に結合（コンジュゲート）していてもよい。したがって、所望により、本発明で使用するための結合分子、特に抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子に結合（コンジュゲート）してもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の結合分子、特に抗体に結合できる単一の部位を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含んでもよいことが理解されよう。エフェクター分子に結合した本発明による結合分子、特に抗体を得ることが望まれる場合、これは、結合分子、特に抗体が直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に結合する、標準的な化学又は組み換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体に結合させる技術は、当技術分野でよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３‐５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９‐５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７‐１２３参照）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載のものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されているような組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子を含んでいてもよい。本明細書で使用するエフェクター分子という用語には、例えば、抗腫瘍剤、薬剤、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然由来のポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、ラジオアイソトープ、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えばＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出しうる蛍光化合物（単数又は複数）が含まれる。
本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子に結合（コンジュゲート）していてもよい。したがって、所望により、本発明で使用するための結合分子、特に抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子に結合（コンジュゲート）してもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の結合分子、特に抗体に結合できる単一の部位を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含んでもよいことが理解されよう。エフェクター分子に結合した本発明による結合分子、特に抗体を得ることが望まれる場合、これは、結合分子、特に抗体が直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に結合する、標準的な化学又は組み換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体に結合させる技術は、当技術分野でよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３‐５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９‐５８、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７‐１２３参照）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載のものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されているような組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子を含んでいてもよい。本明細書で使用するエフェクター分子という用語には、例えば、抗腫瘍剤、薬剤、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然由来のポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、ラジオアイソトープ、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えばＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出しうる蛍光化合物（単数又は複数）が含まれる。
【0179】
エフェクター分子の例には、細胞に有害な（例えば、殺傷する）任意の薬剤を含む細胞毒素又は細胞毒性薬剤が含まれ得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エミチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１‐デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン及びそのアナログ又は同族体などである。エフェクター分子にはまた、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６‐メルカプトプリン、６‐チオグアニン、シタラビン、５‐フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス‐ジクロロジアミンプラチナム（ＩＩ)（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び抗微生物剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）などがあるが、それだけにとどまらない。
【0180】
他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬剤（これらに限られない）などが含まれる。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。関心のある酵素には、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。関心のあるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α‐インターフェロン、β‐インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤又は抗血管形成薬、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、又は、リンホカイン、インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の成長因子などの生物反応修飾物質及び免疫グロブリンを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【0181】
他のエフェクター分子には、例えば診断に有用な検出可能な物質が含まれることがある。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影における使用のため）、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補綴基にはストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適切な蛍光性物質にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドとフィコエリスリンが含まれ；適切な発光物質にはルミノールが含まれ；適切な生物発光物質にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びイクオリンが含まれ；及び適切な放射性核種には１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【0182】
別の実施形態では、エフェクター分子は、結合分子、特に抗体の半減期をｉｎ ｖｉｖｏで増加又は減少させ、及び／又は免疫原性を低減し、及び／又は上皮障壁を越えて免疫系への送達を強化することができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものなどのアルブミン結合化合物が含まれる。エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成ポリマー又は天然由来のポリマー、例えば任意に置換された直鎖又は分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー又は分枝又は非分枝多糖類、例えばホモ又はヘテロ多糖類であってよい。上記合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意の置換基としては、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が挙げられる。合成ポリマーの具体例としては、任意に置換された直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体等の任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
【0183】
本発明の結合分子、特に抗体は、血清半減期を調節又は変化させる分子と結合（コンジュゲート）していてもよい。本発明の結合分子、特に抗体は、例えば、血清半減期を調節するために、アルブミンに結合してもよい。一実施形態において、本発明の結合分子、特に抗体はまた、アルブミンに特異的なパラトープを含むであろう。別の実施形態において、本発明の結合分子、特に抗体は、アルブミン結合ペプチドであるペプチドリンカーを含むことができる。アルブミン結合ペプチドの例は、ＷＯ２０１５／１９７７７２及びＷＯ２００７／１０６１２０に含まれ、その全体は参照により組み込まれる。
【0184】
別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、エフェクター分子に結合（コンジュゲート）していない。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、毒素に結合（コンジュゲート）していない。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、放射性同位元素と結合（コンジュゲート）していない。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、画像化のための薬剤と結合（コンジュゲート）していない。
好ましい一実施形態では、細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすのは、ＣＤ４５を結合する本発明の結合分子、特に抗体の能力であり、結合（コンジュゲート）したエフェクター分子の能力ではない。好ましい一実施形態では、細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすのは、ＣＤ４５を架橋する能力である。
好ましい一実施形態では、細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすのは、ＣＤ４５を結合する本発明の結合分子、特に抗体の能力であり、結合（コンジュゲート）したエフェクター分子の能力ではない。好ましい一実施形態では、細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすのは、ＣＤ４５を架橋する能力である。
【0185】
細胞死及び殺傷
特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、標的細胞において細胞死を誘導することができる。標的細胞を殺傷するために誘導され得る細胞死のタイプには、内在性アポトーシス、外在性アポトーシス、ミトコンドリア透過性転移（ＭＰＴ）駆動型ネクローシス、ネクロプトシス、フェロプトシス、ピロプトシス、パルタナス、エントティック細胞死、ＮＥＴｏｔｉｃ細胞死、リソソーム依存性細胞死、自食作用依存性細胞死、免疫原性細胞死、細胞老化及び分裂カタストロフィが含まれる。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体が、アポトーシスを誘導するために使用される。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、標的細胞を殺傷するために使用される。
特に好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、標的細胞において細胞死を誘導することができる。標的細胞を殺傷するために誘導され得る細胞死のタイプには、内在性アポトーシス、外在性アポトーシス、ミトコンドリア透過性転移（ＭＰＴ）駆動型ネクローシス、ネクロプトシス、フェロプトシス、ピロプトシス、パルタナス、エントティック細胞死、ＮＥＴｏｔｉｃ細胞死、リソソーム依存性細胞死、自食作用依存性細胞死、免疫原性細胞死、細胞老化及び分裂カタストロフィが含まれる。特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体が、アポトーシスを誘導するために使用される。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、標的細胞を殺傷するために使用される。
【0186】
一実施形態では、標的細胞は、ＣＤ４５を、特に細胞の表面上に発現する細胞である。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、少なくともＴ細胞における細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、少なくともＢ細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導し得る。別の好ましい実施形態において、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、Ｂ細胞及びＴ細胞における細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導することができる。好ましい一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、造血幹細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導することができる。一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、全ての免疫細胞、例えば、顆粒球、マクロファージ及び単球において細胞死を誘導することはない。一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、顆粒球、マクロファージ及び単球とは別のすべての免疫細胞において細胞死を誘導する。一実施形態では、造血幹細胞における細胞死を誘導する効果は、すべての造血細胞を置換することができるという効果である。一実施形態において、本発明の結合分子は、細胞死を誘導することによって、上記の標的細胞を殺傷するために使用される。
【0187】
別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導するが、有意なサイトカイン放出はもたらされない。別の好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導するが、例えば、抗体がＦｃ領域を欠いているか、又はサイレンシング修飾されたＦｃ領域を有するため、Ｆｃエフェクター機能を示さない。
【0188】
サイトカイン
ある特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、有意なサイトカイン放出をもたらさない。特に好ましい実施形態において、本発明の結合分子、特に抗体は、標的細胞において細胞死を誘導することができるが、有意なサイトカイン放出をもたらさない。サイトカイン放出の減少又は不在は、対象（被験者）が望まないサイトカイン駆動性炎症に罹患しないことを意味し得る。例えば、本発明の治療法は、炎症を誘発することなく、特に、いくつかの治療に関連するいわゆる「サイトカインストーム」なしに、対象における標的細胞を殺傷することができる。
ある特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、有意なサイトカイン放出をもたらさない。特に好ましい実施形態において、本発明の結合分子、特に抗体は、標的細胞において細胞死を誘導することができるが、有意なサイトカイン放出をもたらさない。サイトカイン放出の減少又は不在は、対象（被験者）が望まないサイトカイン駆動性炎症に罹患しないことを意味し得る。例えば、本発明の治療法は、炎症を誘発することなく、特に、いくつかの治療に関連するいわゆる「サイトカインストーム」なしに、対象における標的細胞を殺傷することができる。
【0189】
一実施形態では、本発明の結合分子、特に本発明の抗体は、インターフェロンγ、ＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＭＣＰ１及びＩＬ‐８の１つ又はそれ以上の放出を有意に誘導することはない。一つの好ましい実施形態において、本発明の結合分子、特に抗体は、それらのサイトカインのいずれかの有意な放出をもたらさない。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＣＬ２、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐８のうちの１つ又は複数の放出を有意に誘導することはない。別の好ましい実施形態では、それは、それらのサイトカインのいずれかの放出を有意に誘導することはない。一実施形態では、そのようなレベルは、インターフェロンγ、ＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＭＣＰ１及びＩＬ‐８のうちの１つ以上についての場合であろう。別の実施形態では、そのようなレベルは、ＣＣＬ２、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、及びＩＬ‐８のうちの１つ以上についての場合であろう。別の実施形態では、そのようなレベルは、ＣＣＬ２、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、ＩＬ‐１０、及びＩＬ‐１１のうちの少なくとも１つについて見られることになる。別の実施形態では、そのようなレベルは、ＣＣＬ２、ＩＬ‐１ＲＡ、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８のうちの少なくとも１つについて見られることになる。
【0190】
サイトカイン放出は、任意の適切なアッセイを用いて測定することができる。例えば、本発明の結合分子、特に抗体がサイトカイン放出をもたらす能力は、細胞を結合分子と共にインビトロで培養し、サイトカイン放出を測定することによって決定され得る。一実施形態では、全血を抗体とインキュベートし、次にサイトカインレベル、例えば上記のサイトカインのいずれかを測定する。別の実施形態では、全血試料から単離した白血球を本発明の結合分子とインキュベートし、サイトカイン（複数可）のレベルを測定することができる。あるいは、サイトカインのレベルが、本発明の結合分子を投与された対象からのサンプルにおいて測定されることであってもよく、特にサイトカインのレベル（複数可）が対象からの血清サンプルにおいて測定されることであってもよい。
【0191】
ある実施形態では、サイトカイン放出を「有意に誘導しない」とは、本発明の結合分子が、例えばＰＢＳ単独でのインビトロ処理のネガティブコントロールと比較して、ネガティブコントロールで見られるよりも５倍超、４倍、３倍、又は２倍のサイトカイン放出を誘導しないことを意味する。ある実施形態では、サイトカイン放出のレベルは、ポジティブコントロール、例えばカンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）によるインビトロ処理と比較されるであろう。ある実施形態では、本発明の結合分子は、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）による処理で見られるものと比較して、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下を誘発することになる。一実施形態では、本発明の結合分子で見られるサイトカイン放出のレベルは、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）で見られるレベルの１０分の１を下回るであろう。一実施形態では、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）とのインキュベーション後のサイトカイン放出のレベルは、本発明の結合分子とのインキュベーション後に見られるものの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上であろう。一実施形態では、全血を２４時間インキュベートした後、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）で見られるレベルは、本発明の結合分子と比較したそれらのレベルであろう。
【0192】
別の実施形態では、有意に誘導されないことを定義するための比較基準は、別の結合分子であろう。例えば、本発明の結合分子がサイトカイン放出を減少させるように設計された修飾を含んでいる場合、比較基準は、そのような修飾を持たない同等の結合分子であろう。別の実施形態では、結合分子が抗体であり、サイトカイン放出を減少させることを意図したＦｃ領域修飾を有するか、Ｆｃ領域を有しない場合、行われる比較は、そのような修飾を有しない、又はＦｃ領域を有する同等の抗体となる。
【0193】
別の実施形態では、サイトカインを有意に放出しないための比較は、インビボで実施されるであろう。例えば、本発明の結合分子が対象に投与される場合、それは、上記で議論された比較物質と比較して、上記で議論されたサイトカイン放出のレベルのいずれかを示すことになる。別の実施形態では、サイトカイン放出を有意に誘導しないことは、本発明の抗体の投与前と比較したサイトカイン（単数又は複数）のレベルの観点からであり得る。例えば、サイトカインのレベルが、本発明の結合分子の投与後に１０倍以下、５倍以下、又はそれ以下にしか上昇しないことであってもよい。測定は、例えば、抗体の投与直前又は投与と同時に行ってもよく、また、例えば、投与後１日、１週間、又は２週間以上経過してから行ってもよい。一実施形態では、測定は、投与の１日後～１週間後に行われる。別の実施形態では、本発明の結合分子は、処置された対象が望ましくないサイトカイン放出に関連する副作用を経験しない、例えば対象が発熱、低血圧、又は不規則若しくは急速な心拍を経験しないという意味で、サイトカイン放出を著しく誘導することはない。
【0194】
機能的アッセイ
一実施形態では、機能的アッセイは、本発明の結合分子（単数又は複数）が、例えば本明細書で言及されるもののいずれかのような特定の特性を有するかどうかを決定するために採用され得る。したがって、機能的アッセイは、本発明の結合分子、特に抗体を評価する際に使用されてもよい。本明細書で使用される「機能的アッセイ」は、本発明の結合分子（単数又は複数）の１つ以上の所望の特性又は活性を決定するために使用することができるアッセイである。適切な機能的アッセイは、結合アッセイ、細胞死（好ましくはアポトーシス）アッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞静止効果）アッセイ、細胞傷害（細胞毒性）アッセイ、細胞シグナルアッセイ、サイトカイン生成アッセイ、抗体生成及びアイソタイプスイッチング、並びに細胞分化アッセイであってもよい。一つの実施形態において、アッセイは、本発明の抗体を採用することを介して、例えば、特定の細胞タイプについて、細胞枯渇の程度を測定し得る。一つの好ましい実施形態において、アッセイは、ＣＤ４５を発現する標的細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導する本発明の抗体の能力を測定し得る。さらなる好ましい実施形態において、機能的アッセイは、サイトカイン放出を誘導する本発明の結合分子、特に抗体の能力を測定し得る。一つの好ましい実施形態において、機能的アッセイは、本発明の結合分子、特に抗体が、細胞を殺傷するために使用され得るが、サイトカインを有意に誘導しないかどうかを決定するために使用されてもよい。
一実施形態では、機能的アッセイは、本発明の結合分子（単数又は複数）が、例えば本明細書で言及されるもののいずれかのような特定の特性を有するかどうかを決定するために採用され得る。したがって、機能的アッセイは、本発明の結合分子、特に抗体を評価する際に使用されてもよい。本明細書で使用される「機能的アッセイ」は、本発明の結合分子（単数又は複数）の１つ以上の所望の特性又は活性を決定するために使用することができるアッセイである。適切な機能的アッセイは、結合アッセイ、細胞死（好ましくはアポトーシス）アッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞静止効果）アッセイ、細胞傷害（細胞毒性）アッセイ、細胞シグナルアッセイ、サイトカイン生成アッセイ、抗体生成及びアイソタイプスイッチング、並びに細胞分化アッセイであってもよい。一つの実施形態において、アッセイは、本発明の抗体を採用することを介して、例えば、特定の細胞タイプについて、細胞枯渇の程度を測定し得る。一つの好ましい実施形態において、アッセイは、ＣＤ４５を発現する標的細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導する本発明の抗体の能力を測定し得る。さらなる好ましい実施形態において、機能的アッセイは、サイトカイン放出を誘導する本発明の結合分子、特に抗体の能力を測定し得る。一つの好ましい実施形態において、機能的アッセイは、本発明の結合分子、特に抗体が、細胞を殺傷するために使用され得るが、サイトカインを有意に誘導しないかどうかを決定するために使用されてもよい。
【0195】
機能的アッセイは、結果の信頼性を高めるために、必要に応じて何回も繰り返すことができる。統計的に有意な結果を同定し、したがって生物学的機能を有する結合分子、特に抗体を同定するために、当業者に知られている様々な統計的検定を採用することができる。一実施形態では、複数の結合分子が並行して、又は本質的に同時に試験される。本明細書で採用される同時とは、試料／分子／複合体が同じ分析、例えば同じ「実行」において分析される場合を指す。ある実施形態では、同時とは、信号出力が本質的に同時に装置によって分析される同時分析を指す。この信号は、得られた結果を解釈するためにデコンボリューションを必要とする場合がある。有利なことに、複数のバイパラトピックタンパク質複合体を試験することにより、多数の抗体をより効率的にスクリーニングし、新規で興味深い関係を同定することができる。明らかに、興味深いＣＤ４５の標的抗原に対する異なる可変領域は、生物学的機能における微妙なニュアンスへのアクセスを与えることができる。
【0196】
一実施形態では、本発明の結合分子がＣＤ４５に対して２つ以上の特異性を含む場合、機能的アッセイは、その結合分子の特性を、例えば、同じ価数を有するが本発明の結合分子の特異性のうちの１つだけを有する結合分子と比較するために使用され得る。一実施形態では、そのようなアッセイは、ＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なる特異性を有する本発明の結合分子が、比較基準の結合分子よりも優れていることを示すために使用され得る。したがって、１つの好ましい実施形態において、ＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なる特異性を含む本発明の結合分子、特に本発明によるそのような抗体の効力は、本発明の結合分子からのＣＤ４５に対する特異性のうちの１つだけを含む個々の「比較基準」結合分子、特に「比較基準」抗体に比較され得る。例えば、アッセイがＣＤ４５の架橋、又は架橋の効果を研究するために行われる場合、同じ価数を有するが、ただ１つの特異性を有する結合分子、特に抗体が、比較基準として採用され得る。一実施形態では、結合分子が本発明の抗体である場合、抗体の抗原結合部位の全てに本発明の抗体からのパラトープの同じ１つを含む抗体と比較されてもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、本発明の抗体と同じ価数及び形式のものであるが、本発明の抗体からのパラトープの同じ１つが抗原結合部位の全てに存在するものと比較されてもよい。一実施形態では、ＣＤ４５の異なるエピトープに特異的な２つの異なるパラトープを含む二価抗体は、それらのパラトープの１つだけを含む２つの可能な二価抗体のそれぞれと比較され得る。一実施形態では、そのような比較は、ＣＤ４５に特異的な本発明の抗体の異なる特異性ごと、特に異なるパラトープごとについて、１つの比較基準抗体で行われる。一実施形態では、本発明の抗体は、１つのそのような比較基準抗体に対してより良い結果を示すであろう。別の実施形態では、ＣＤ４５に特異的な抗体の各特異性、特にパラトープについて、比較基準抗体の全てよりも良好な結果を示すであろう。
【0197】
本発明の結合分子がＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なる特異性を含む別の実施形態では、単特異性結合分子、特に単特異性抗体が最初に評価され、選択された候補が次にＣＤ４５に対する少なくとも２つの異なる特異性を有する本発明の抗体の生成に使用される。一実施形態では、複数の結合分子、特に抗体が、上記で定義されたようなマルチプレックスを使用して試験され、１つ又は複数の機能的アッセイに供される。
本発明の少なくとも２つの結合分子、特に本発明の抗体の混合物は、機能的アッセイを使用して、本発明の混合物を構成する個々の結合分子と比較され得る。好ましい実施形態では、混合物は、個々の結合分子、特に個々の抗体のいずれかに対して優れた結果を与える。
本明細書で使用する「生物学的機能」という用語は、試験される生物学的実体にとって自然な活動又はその目的、例えば細胞、タンパク質又は同様のものの自然な活動を指す。理想的には、機能の存在は、生きている哺乳類細胞を利用するアッセイを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的アッセイを使用して試験することができる。本明細書で採用される天然の機能には、癌に関連する機能などの異常な機能が含まれる。
本発明の少なくとも２つの結合分子、特に本発明の抗体の混合物は、機能的アッセイを使用して、本発明の混合物を構成する個々の結合分子と比較され得る。好ましい実施形態では、混合物は、個々の結合分子、特に個々の抗体のいずれかに対して優れた結果を与える。
本明細書で使用する「生物学的機能」という用語は、試験される生物学的実体にとって自然な活動又はその目的、例えば細胞、タンパク質又は同様のものの自然な活動を指す。理想的には、機能の存在は、生きている哺乳類細胞を利用するアッセイを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的アッセイを使用して試験することができる。本明細書で採用される天然の機能には、癌に関連する機能などの異常な機能が含まれる。
【0198】
一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、比較基準の結合分子、特に上述したような比較基準の抗体よりも大きな程度でＣＤ４５を架橋することができるであろう。例えば抗体：ＣＤ４５ ＥＣＤのＣＤ４５多量体を形成する本発明の結合分子、特に抗体の能力は、両者を等量のように混合したときに試験することができる。多量体は、少なくとも２つの結合分子：ＣＤ４５ ＥＣＤ単位を有する構造であってよい。好適な手法の１つは質量測光であり、結合分子、特に抗体を、配列番号１１３のようなＣＤ４５ ＥＣＤと等しい濃度で混合し、試験試料に対して質量測光を実施する。抗体とＣＤ４５ ＥＣＤのみによる対照を行うこともできる。本発明の結合分子、特に抗体は、比較基準の結合分子、特に比較基準の抗体よりも多くの多量体を生じさせる可能性がある。本発明の結合分子、特に抗体は、比較基準よりも多くの量の２、３、４、又はそれ以上の結合分子：ＣＤ４５ ＥＣＤ単位を有する多量体を生じさせてもよい。それは、ＣＤ４５に特異的な特異性（特にパラトープ）のそれぞれについて可能な比較基準のすべてについてそうしてもよい。このような比較のためのさらに好適な技術は、分析的超遠心分離法（ＡＵＣ）である。ここでも、実行される比較はまた、混合物中の個々のタイプの結合分子とそれ自体で比較される結合分子の混合物の間であってもよい。
【0199】
別の実施形態では、比較は、細胞死を誘導する本発明の結合分子、特に抗体の能力という観点であってもよい。特に、好ましい実施形態では、結合分子（単数又は複数）、特に抗体（単数又は複数）の、アポトーシスを誘導する能力が研究されてもよい。例えば、本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５を発現する標的細胞がアポトーシスを受けることを、比較基準、例えば比較基準抗体よりも多く誘導してもよい。それはＴ細胞を用いて測定した場合、より多くのアポトーシスを誘導する可能性がある。例えば、ＰＢＭＣから単離されたＴ細胞を使用してもよい。本発明の任意の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてより高いレベルのアポトーシスを誘導し得る。それは、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてそうし得る。それは、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞においてそうし得る。それはＣＤ４＋ナイーブＴ細胞においてそうし得る。別の実施形態では、全血中の総細胞数は、本発明の結合分子、特に抗体とのインキュベーション後に測定され、比較基準について見られる結果と比較され得る。一つの実施形態において、総細胞数は、本発明の結合分子、特に抗体について測定され、対照の結合分子、特に抗体と比較されてもよい。本発明の特に好ましい実施形態では、アポトーシスを測定するためにアネキシンＶが使用されてもよい。したがって、例えば、本発明の結合分子、特に抗体は、比較基準と比較して、より大きな割合のＡｎｎｅｘｉｎＶ染色細胞をもたらすであろう。
【0200】
一実施形態では、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染又は細菌感染した齧歯類又は霊長類モデルなどを含む動物モデルなどのインビボアッセイが、本発明の結合分子を試験するために採用されてもよい。別の実施形態では、特定の細胞型の枯渇の程度は、例えばインビボで測定されてもよい。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、障害の動物モデルにおいて、そして好ましい実施形態では癌の動物モデルにおいて、比較基準よりも大きな枯渇のレベルをもたらすであろう。
【0201】
一実施形態では、本発明による結合分子、特に抗体分子は、新規又は相乗的な機能を有する。本明細書で使用される「相乗的な機能」という用語は、比較基準（複数可）を代わりに採用した場合に観察されない、又は観察されるよりも高い生物学的活性を意味する。したがって、「相乗的」は、新規な生物学的機能を含む。一実施形態では、ＣＤ４５に対する少なくとも２つの特異性を含む本発明の結合分子、特に抗体は、上述した比較基準などのＣＤ４５に対するいずれかの特異性を個別に含む結合分子、特に抗体よりも有効であるという点で相乗的である。好ましい一実施形態では、このような相乗効果は、ＣＤ４５の架橋に関連して示される。一実施形態では、結合分子の混合物は、混合物を構成する個々の結合分子のいずれかを単独で用いた場合と比較して、相乗効果を示す。
【0202】
一実施形態において、本明細書で採用される新規な生物学的機能とは、２つ以上の相乗効果を有する実体［タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂ］が一緒にされるまで明らかでない又は存在しない機能、又は以前に確認されなかった機能をいう。本明細書で採用される「より高い」とは、ゼロからの増加を含む活性の増加、すなわち、比較基準が関連する機能的アッセイにおいて活性を有しない結合分子（単数又は複数）における何らかの活性の増加をいい、本明細書では新規活性又は新規生物学的機能とも呼ばれる。本明細書で採用される「より高い」には、個々のパラトープと比較して、関連する機能的アッセイにおいて抗体における相加的な機能よりも大きいことを含み、例えば、関連する活性において１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれ以上の増加も含まれる。
【0203】
一つの実施形態では、新規の相乗機能は、より高い阻害活性である。
本発明の特に好ましい一実施形態では、相乗効果は、ＣＤ４５を発現する標的細胞型の細胞枯渇に関連している。一つの実施形態では、相乗効果は、細胞殺傷に関連している。
本発明で使用するための適切な結合ドメインはまた、機能的アッセイにおいて１つ以上の結合ドメインペアを試験することによって同定することができる。例えば、抗原ＣＤ４５に特異的な少なくとも結合部位を含む結合分子、例えば抗体を、１つ以上の機能的アッセイで試験することができる。
本発明の特に好ましい一実施形態では、相乗効果は、ＣＤ４５を発現する標的細胞型の細胞枯渇に関連している。一つの実施形態では、相乗効果は、細胞殺傷に関連している。
本発明で使用するための適切な結合ドメインはまた、機能的アッセイにおいて１つ以上の結合ドメインペアを試験することによって同定することができる。例えば、抗原ＣＤ４５に特異的な少なくとも結合部位を含む結合分子、例えば抗体を、１つ以上の機能的アッセイで試験することができる。
【0204】
一実施形態では、ＣＤ４５発現癌細胞株を殺傷する結合分子の能力がアッセイされ得る。細胞殺傷に関するこのようなアッセイに採用され得る癌細胞株の例には、白血病及びリンパ腫細胞株が含まれる。一実施形態では、ＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）によって分類される、様々な白血病及びリンパ腫細胞株を表す以下の細胞株のいずれかを、癌細胞の殺傷をもたらす能力を調べるために使用することができる：Ｊｕｒｋａｔ‐急性Ｔ細胞白血病、ＣＣＲＦ‐ＳＢ‐Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ＭＣ１１６‐Ｂ細胞未分化リンパ腫、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫のまれな型）、ＳＵ‐ＤＨＬ‐４、ＳＵ‐ＤＨＬ‐５、ＳＵ‐ＤＨＬ‐８、ＮＵ‐ＤＵＬ‐１、ＯＣＩ‐Ｌｙ３‐びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＴＨＰ‐１‐急性単球性白血病、及びＤａｋｉｋｉ‐Ｂ細胞鼻咽腔がん腫。本願の実施例において採用された、このような細胞株の殺傷をもたらす結合分子の能力を評価する方法は、細胞を殺傷する所定の結合分子の能力を研究するために使用され得る。一実施形態では、本発明のバリアント結合分子は、本明細書に規定される特定の結合分子の１つと同じかそれ以上の、かかるアッセイにおける癌細胞を殺傷する能力を有することになる。一実施形態において、それらは、そのようなアッセイにおいて上記の癌細胞株の１つを殺傷するために、本明細書に定められた特異的結合分子の１つの活性の少なくとも５０％、７５％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上を有することになるだろう。一実施形態では、本発明の結合分子は、そのようなアッセイにおいて、少なくとも２５％、４０％、５０％、６０％又は７５％の癌細胞を殺傷するであろう。別の実施形態では、本発明の結合分子は、そのようなアッセイにおいて癌細胞を１００％殺傷することになる。
【0205】
病理学的状態、医療用途、及び細胞の枯渇
本発明は、ヒト又は動物の身体の治療方法において使用するための、本発明の結合分子、特に抗体を提供する。本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５を標的とすることが治療上有益となり得るあらゆる状況、特にそのような細胞を殺傷することが治療上有益となり得る状況で採用することができる。本発明の結合分子、特に抗体はまた、ＣＤ４５の診断又は検出に使用されてもよい。本発明は、さらに、そのような使用のための本発明の医薬組成物を提供する。本発明はまた、このような使用のための本発明の核酸分子（複数可）及びベクター（複数可）を提供する。
本発明は、ヒト又は動物の身体の治療方法において使用するための、本発明の結合分子、特に抗体を提供する。本発明の結合分子、特に抗体は、ＣＤ４５を標的とすることが治療上有益となり得るあらゆる状況、特にそのような細胞を殺傷することが治療上有益となり得る状況で採用することができる。本発明の結合分子、特に抗体はまた、ＣＤ４５の診断又は検出に使用されてもよい。本発明は、さらに、そのような使用のための本発明の医薬組成物を提供する。本発明はまた、このような使用のための本発明の核酸分子（複数可）及びベクター（複数可）を提供する。
【0206】
したがって、本発明の結合分子は、治療的に採用され得る。一つの実施形態において、本発明の結合分子（単数又は複数）が投与されるのではなく、本発明の核酸分子（複数可）又はベクター（複数可）が、標的細胞内部での結合分子（単数又は複数）の発現をもたらすために投与されてもよい。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、投与される好ましい治療薬である。結合分子、特に抗体が以下に好ましい治療薬として規定されているが、本発明の医薬組成物、核酸分子、及びベクターもまた、規定された実施形態のいずれかに採用され得る。好ましい実施形態では、しかし、結合分子（複数可）又はそれらを含む医薬組成物は、好ましい治療薬である。特に好ましい実施形態では、抗体（単数）、抗体（複数）又はそれらを含む薬学的組成物が治療薬である。
【0207】
一つの特に好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇させるために採用され得る。特に好ましい実施形態では、本発明は、ＣＤ４５を発現する疾患原因細胞型を枯渇させるために使用される。特に、本発明は、細胞表面でＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇させるために用いられてもよい。特に好ましい実施形態では、核酸分子又はベクターによって採用又はコードされる結合分子は、ＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性を有するものである。特定の理論に拘束されるわけではないが、ＣＤ４５に対して少なくとも２つの異なる特異性、特にＣＤ４５の異なるエピトープに対して少なくとも２つの異なるパラトープを有することによって、本発明の結合分子、特に抗体は、標的細胞の表面上のＣＤ４５の架橋をよりよくもたらすことができ、それによって細胞死（好ましくはアポトーシス）をより有効にもたらすことができる、と考えられている。しかし、上述したように、このような効果は、結合分子の混合物を使用することによってももたらされ得る。
【0208】
本発明の抗体（単数又は複数）が採用される１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体（単数又は複数）を介した標的細胞における細胞死（好ましくはアポトーシス）の誘導は、本発明の抗体（単数又は複数）が、抗体が通常示すであろう１つ又は複数のＦｃ領域エフェクター機能を示すことが不要であることを意味する場合がある。一つの特に好ましい実施形態において、本発明の抗体（単数又は複数）は、したがって、標的細胞において細胞死（好ましくはアポトーシス）を誘導することができるが、活性Ｆｃ領域を有さない。特に好ましい実施形態では、抗体（単数又は複数）は、細胞死を誘導するが、有意なサイトカイン放出を誘導しない。
【0209】
特に好ましい実施形態では、本発明による細胞の枯渇の後に、対象への細胞又は組織の移植が行われる。さらなる特に好ましい実施形態では、移植された細胞又は組織は、本発明を用いて枯渇させたものと置き換わる。したがって、本明細書で議論される治療には、障害の実際の機構を標的とするのではなく、障害に関与する細胞タイプ、又はその殺傷、特に置換が単に治療上の利益を有することができるものを、全体的又は部分的に置き換えることが含まれる。一実施形態では、したがって、本発明は、本発明を採用することを含む、細胞を枯渇させる方法を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、細胞を枯渇させることと、その後に細胞又は組織を移植することの両方を含んでいてもよい。細胞の枯渇は、多くの治療的文脈で、標的細胞を殺傷するために効果的に使用され得る。
【0210】
好ましい実施例において、本発明の結合分子、特に抗体は、免疫細胞を殺傷するために使用される。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、造血起源であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含むことを意図しているが、これに限定されるものではない。一実施形態では、本発明は、対象におけるＴ細胞を枯渇させるために採用される。一実施形態では、本発明は、対象においてＢ細胞を枯渇させるために採用される。別の実施形態では、本発明は、両方を枯渇させるために採用される。別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を枯渇させるが、マクロファージを枯渇させないようにするために採用される。別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞を枯渇させるが、マクロファージは枯渇させないために採用される。別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞及びＴ細胞を枯渇させるために使用されるが、マクロファージの枯渇をもたらさない。一実施形態において、本発明は、造血幹細胞（ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）（ＨＳＣ）を枯渇させるために使用される。別の実施形態では、本発明は、造血幹細胞（ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を枯渇させるために採用される。一つの好ましい実施形態において、ＨＳＣは、対象の免疫系を再増殖させるためのＨＳＣの移植の前に、対象において本発明を介してＨＳＣを枯渇させる。別の実施形態では、本発明は、特定の細胞型を枯渇させるが、造血幹細胞は枯渇させない。別の実施形態では、本発明は、上記の細胞タイプを殺傷するために使用される。したがって、細胞枯渇のために本明細書で言及された実施形態のいずれにおいても、本発明は、記載された細胞を殺傷するために採用され得る。
【0211】
一実施形態では、本発明を介して治療される対象は、自己免疫疾患、血液疾患、代謝障害、癌、又は免疫不全（重症複合免疫不全又はＳＣＩＤなど）を有するものである。最初に細胞を枯渇させ、次に細胞を置き換えることによって状態を治療する能力は、本発明の結合分子、特に抗体が、癌を治療する際に特に有用であることを意味する。特に好ましい実施形態では、したがって、治療される障害は、癌である。一実施形態では、本発明は、したがって、癌細胞、例えば、免疫系細胞に由来する癌細胞を枯渇させるために採用される。一つの好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ４５を発現する癌細胞を枯渇させるために採用される本発明を投与することを含む癌を治療する方法を提供する。本方法は、対象に細胞を移植することをさらに含んでもよい。一実施形態では、移植された細胞は、枯渇した細胞を置き換える。一つの実施形態では、移植された細胞は、造血幹細胞である。
【0212】
一つの特に好ましい実施形態において、治療される障害は血液癌である。一つの好ましい実施形態では、癌は、骨髄が関与するものであり、特に造血系の細胞が関与するものである。
一つの好ましい実施形態において、癌は白血病であってよい。一つの実施形態において、白血病は、小児白血病であってよい。別の実施形態では、白血病は、成人白血病であってもよい。白血病は、急性白血病であってもよい。白血病は、慢性白血病であってもよい。本発明を採用することを介して治療され得る白血病の非限定的な例としては、リンパ球性白血病（急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病など）及び骨髄性白血病（急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病など）などがある。白血病は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、又はＢ細胞前リンパ球性白血病などのＢ細胞性白血病であってもよい。一実施形態において、本発明は、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、難治性小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、又は急性骨髄性白血病の治療に使用されてもよい。
一つの好ましい実施形態において、癌は白血病であってよい。一つの実施形態において、白血病は、小児白血病であってよい。別の実施形態では、白血病は、成人白血病であってもよい。白血病は、急性白血病であってもよい。白血病は、慢性白血病であってもよい。本発明を採用することを介して治療され得る白血病の非限定的な例としては、リンパ球性白血病（急性リンパ芽球性白血病又は慢性リンパ球性白血病など）及び骨髄性白血病（急性骨髄性白血病又は慢性骨髄性白血病など）などがある。白血病は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、又はＢ細胞前リンパ球性白血病などのＢ細胞性白血病であってもよい。一実施形態において、本発明は、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、難治性小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、又は急性骨髄性白血病の治療に使用されてもよい。
【0213】
本発明の一実施形態では、治療される血液癌は、リンパ腫であってもよい。治療することができるリンパ腫の非限定的な例としては、Ｂ細胞リンパ腫、再発又は難治性Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫、再発又は難治性びまん性大細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、原発縦隔Ｂ細胞リンパ腫、再発性縦隔、難治性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、再発性又は難治性非ホジキンリンパ腫、難治性進行性非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、及び難治性非ホジキンリンパ腫がある。
一実施形態では、治療される血球癌は、骨髄腫である。治療され得る骨髄腫の非限定的な例としては、再発性形質細胞骨髄腫、難治性形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、及び骨多発性骨髄腫が挙げられる。
一実施形態では、治療される血球癌は、骨髄腫である。治療され得る骨髄腫の非限定的な例としては、再発性形質細胞骨髄腫、難治性形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、再発性又は難治性多発性骨髄腫、及び骨多発性骨髄腫が挙げられる。
【0214】
一実施形態において、癌は、急性Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、及びＢ細胞鼻咽腔がん腫から選択される１つであってよい。別の実施形態では、癌は、急性Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及びＢ細胞鼻咽腔がん腫から選択される１つであってよい。別の実施形態では、癌は、急性Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性単球性白血病、Ｂ細胞鼻咽腔がん腫、Ｂ細胞未分化リンパ腫、及びＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫から選択される１つであってもよい。別の実施形態では、癌は、急性Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性単球性白血病、Ｂ細胞鼻咽腔がん腫、Ｂ細胞未分化リンパ腫、及びＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫から選択される１つであってもよい。好ましい一実施形態では、このような癌が治療される場合、採用される本発明の結合分子は、ＢＹｂｅ抗体である。
【0215】
別の実施形態では、治療される対象は、自己免疫障害を有する。一つの特に好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。別の特に好ましい実施形態では、本疾患は強皮症である。自己免疫疾患のさらなる例には、強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、１型糖尿病、又は本明細書に記載の別の自己免疫病態が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、代謝性貯蔵障害を有するか、又はそうでなくても影響を受けている。対象は、グリコーゲン貯蔵症、ムコ多糖症、ゴーシェ病、ハーラー病、スフィンゴ脂質症、メタクロマチック大脳白質萎縮症、又は本明細書に開示される治療及び療法から利益を得ることができる任意の他の疾患若しくは障害からなる群から選択される代謝障害を患っているか、そうでなくても影響を受けており、それは限定ではないが、重症複合免疫不全、Ｗｉｓｃｏｔｔ‐Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、高免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）症候群、チェディアック‐ヒガシ病、遺伝性リンパ組織球増多症、大理石骨症、骨形成不全症、沈着症、サラセミアメジャー、鎌状赤血球病、全身性硬化症。全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、若年性関節リウマチ、及び「Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease」，ＡＳＨ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｂｏｏｋ，１．３１９‐３３８（２０００）（その開示は、造血幹細胞移植療法の投与によって治療され得る病態に関連するものとして、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている疾患又は障害を含む。
【0216】
一実施形態では、治療される状態は、異常なＣＤ４５発現を含むことが知られているものである。特に好ましい一実施形態では、治療は、対象における障害において役割を果たすＣＤ４５を発現する細胞型を枯渇させる。そのような疾患の例には、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び狼瘡が含まれる。ＣＤ４５の発現の変化を含むことが知られている他の状態には、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）などの免疫不全症が含まれる。
一実施形態では、本発明は、細胞移植に先立って細胞を枯渇させるために使用され、したがって、本発明の方法は、いくつかの実施形態において、本発明の治療薬、特に結合分子、特に抗体、を用いる枯渇ステップに続いて、例えば枯渇した細胞の置換を助けるために対象に細胞を移植するステップを含むことができる。一実施形態では、このような移植は、同種異系細胞であってもよい。別の実施形態では、そのような移植は、自家移植細胞のものであってもよい。一実施形態では、移植された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞であってよい。いくつかの実施形態では、対象は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を必要としている。例えば、そのような療法は、本発明の方法の一部を形成してもよい。
一実施形態では、本発明は、細胞移植に先立って細胞を枯渇させるために使用され、したがって、本発明の方法は、いくつかの実施形態において、本発明の治療薬、特に結合分子、特に抗体、を用いる枯渇ステップに続いて、例えば枯渇した細胞の置換を助けるために対象に細胞を移植するステップを含むことができる。一実施形態では、このような移植は、同種異系細胞であってもよい。別の実施形態では、そのような移植は、自家移植細胞のものであってもよい。一実施形態では、移植された細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞であってよい。いくつかの実施形態では、対象は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を必要としている。例えば、そのような療法は、本発明の方法の一部を形成してもよい。
【0217】
別の好ましい実施形態では、本発明は、対象における細胞集団の生着を促進する方法を提供し、この方法は、細胞集団の生着に先立って細胞を枯渇させるために本発明の結合分子、特に抗体を採用することをさらに含む。したがって、本発明は、本発明の結合分子、特に抗体を投与することを介して対象においてＣＤ４５を発現する細胞を枯渇させ、その後、目的の細胞を移植することを含む、移植細胞の生着を促進する方法を提供するものである。一実施形態において、本発明は、幹細胞、特に造血幹細胞の生着促進のための方法を提供する。一実施形態では、造血幹細胞を、造血系統の１つ以上の細胞型に欠陥のある又は欠損した対象に投与し、欠陥のある又は欠損した細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで再形成する、又は部分的に再形成させる。一実施形態では、本発明は、幹細胞欠損を治療するために使用され、例えば、移植細胞が幹細胞欠損に対処する場合、本発明は、標的細胞を枯渇させ、移植細胞と置き換えるために使用される。一実施形態では、再導入された細胞は、遺伝子的に修飾されている。一実施形態では、対象からの細胞が除去され、遺伝子修飾された後、本発明が標的細胞、例えば対象にまだ存在するそのタイプの未修飾の細胞を殺傷するために使用された後、対象に戻される。好ましい一実施形態では、遺伝子改変された移植細胞は造血幹細胞である。
【0218】
好ましい一実施形態では、枯渇細胞と移植細胞は、同じ細胞種であるか、又は同じ細胞種を含む。好ましい一実施形態では、枯渇させた細胞は、造血細胞、特に造血幹細胞である。一つの実施形態において、本発明は、骨髄移植の前に細胞を枯渇させるために採用される。別の実施形態では、本発明は、細胞を枯渇させるために、照射の代わりに採用される。別の実施形態では、本発明は、細胞を枯渇させるために、照射に加えて採用される。
別の実施形態では、本発明は、移植された細胞の拒絶反応の可能性を低減するのを助ける方法を提供し、この方法は、細胞の移植の前に細胞を枯渇させるために本発明の治療薬を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、免疫細胞の移入の前にＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇させることにより、対象における移植された免疫細胞の受け入れを促進するために採用され得る。標的細胞は、本明細書で議論されるもののうちのいずれかであってよい。一実施形態では、対象に移植又は移入される細胞は、幹細胞である。
別の実施形態では、本発明は、移植された細胞の拒絶反応の可能性を低減するのを助ける方法を提供し、この方法は、細胞の移植の前に細胞を枯渇させるために本発明の治療薬を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、免疫細胞の移入の前にＣＤ４５を発現する標的細胞を枯渇させることにより、対象における移植された免疫細胞の受け入れを促進するために採用され得る。標的細胞は、本明細書で議論されるもののうちのいずれかであってよい。一実施形態では、対象に移植又は移入される細胞は、幹細胞である。
【0219】
ＣＤ４５を発現する細胞を除去するために本明細書で議論される方法のいずれかが、細胞枯渇又は殺傷に採用され得る。しかし、本発明の１つの特に好ましい実施形態では、本発明は、ＣＤ４５を発現する細胞の細胞死（好ましくはアポトーシス）、ひいてはそのような細胞の枯渇をもたらすために使用されてもよい。特に、本発明は、ＣＤ４５の架橋とそれ故の細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすことができ、好ましくは、ＣＤ４５の架橋をもたらす本発明の能力の向上は、より多くの細胞死（好ましくはアポトーシス）をもたらすこともできる。
一実施形態において、細胞移植の一部として、対象は、細胞を移植する方法として骨髄を与えられてもよい。別の実施形態では、対象は、細胞を移植する方法として、臍帯血、又は臍帯血から分離された細胞を与えられてもよい。別の実施形態では、移植された細胞は、例えば幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで分化され、その後移植された分化した幹細胞に由来するものであってもよい。
一実施形態において、細胞移植の一部として、対象は、細胞を移植する方法として骨髄を与えられてもよい。別の実施形態では、対象は、細胞を移植する方法として、臍帯血、又は臍帯血から分離された細胞を与えられてもよい。別の実施形態では、移植された細胞は、例えば幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで分化され、その後移植された分化した幹細胞に由来するものであってもよい。
【0220】
本発明が細胞を枯渇させるか又は殺傷するために使用される一実施形態では、さらなる細胞枯渇剤又は殺傷剤がまた同様に使用されてもよい。好ましい実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、対象に投与される唯一の細胞枯渇剤である。一実施形態では、標的細胞の枯渇レベルは、例えば標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％程度であり、有効であるのに十分なレベルである。例えば、一実施形態では、標的細胞の少なくとも５０％が枯渇する。別の実施形態では、標的細胞の少なくとも７５％が枯渇している。別の実施形態では、標的細胞の少なくとも約９０％が枯渇している。別の実施形態では、標的細胞の少なくとも約９５％が枯渇している。
【0221】
上述したように、特に好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤ４５発現細胞の細胞死、特にアポトーシスをもたらすために使用されてもよい。ＣＤ４５誘導細胞死（好ましくはアポトーシス）は、例えば、細胞収縮、膜の緩み、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞膜外葉への露出常駐、ミトコンドリア膜貫通電位の低下、及び活性酸素種の生成のうちの１つ以上によって同定され得る。それらの測定又は同定は、一実施形態では、ＣＤ４５発現細胞の細胞死（好ましくはアポトーシス）を同定するために使用され得る。一実施形態において、本発明により細胞死（好ましくはアポトーシス）を起こすように刺激された細胞は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出（アネキシンＶ染色を可能にする）、膜ブレブ形成、膜完全性の保持、核凝縮、及び細胞死（好ましくはアポトーシス）の発生に必要でないＲＮＡ／タンパク質合成の１以上、好ましくは全てを示すことができる。細胞の完全性が典型的に保持され、ＰＳが細胞の外表面に存在するので、例えばＡｎｎｅｘｉｎＶによる染色は、細胞死、特に細胞のアポトーシスを識別するために使用され得る。したがって、好ましい実施形態では、アポトーシス細胞を同定するためにアネキシンＶ染色が使用される。しかしながら、細胞生存率、ひいては細胞死を評価するために、任意の適切な方法を使用することができる。
【0222】
別の実施形態では、本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関して使用され得る。一実施形態では、ＧＶＨＤは急性である。別の実施形態では、ＧＶＨＤは慢性的である。本発明は、例えば、ＧＶＨＤの発症を回避するため、又はＧＶＨＤが重症度を低下させるように改善するために使用されてもよい。例えば、本発明は、対象への移植の前に、移植される細胞、組織、又は器官における標的細胞を枯渇させ、及び／又は殺傷するために使用されてもよい。したがって、１つの実施形態において、本発明は、細胞を枯渇させるために、結合分子、特に抗体で細胞集団、組織、又は器官を処理するｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。
【0223】
別の実施形態では、本発明は、最初にそのようなｅｘ ｖｉｖｏ治療を行い、その後、移植を行うことを含む治療方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＧＶＨＤの可能性を低減する方法として、移植物を攻撃できる宿主細胞が少なくなるように、移植前に対象内の細胞を枯渇又は殺傷するために使用される。それゆえ、本発明はまた、細胞、組織、又は臓器の集団を移植する前に、細胞、組織、又は臓器の集団中の細胞を枯渇させるために本発明の結合分子、特に抗体を投与することを含む、ＧＶＨＤを治療又は予防するための方法を提供する。本方法は、さらに、移植そのものを含んでいてもよい。枯渇させた細胞及び移植された細胞、組織、又は臓器は、本明細書に記載されたもののいずれであってもよい。一つの好ましい実施形態では、移植される細胞は、造血幹細胞である。一つの好ましい実施形態では、枯渇した細胞はＴ細胞である。別の好ましい実施形態では、ＧＶＨＤを治療又は予防する本発明の能力は、心臓移植、肺移植、腎臓移植、又は肝臓移植において採用される。
【0224】
別の実施形態では、本発明は、レシピエントを治療するのではなく、その移植の前に細胞、組織、又は器官の集団中の細胞を枯渇させる及び／又は殺傷する方法を提供する。それゆえ、本発明はまた、移植前に細胞、組織、又は器官の集団を処理し、その後移植を行うことを含む、移植前の細胞、組織、又は器官の集団から標的細胞を除去する方法を提供する。
【0225】
一実施形態では、本発明は、特に従来の治療法が容易にアクセスできないか、又はその固有のメカニズムの一部として誇張された炎症を導くであろう、器官又は組織内の免疫細胞を枯渇させるために使用され得る。一実施形態では、本発明は、例えば脳、脊髄、眼、又は精巣などの閉鎖器官内の細胞を枯渇させるために使用される。一実施形態では、本発明は、免疫特権臓器におけるＣＤ４５＋細胞を枯渇させるために採用され得る。Ｆｃ媒介機能を採用することなくＣＤ４５＋細胞を枯渇させる本発明の結合分子の能力は、望ましくない副作用及び損傷を回避するのに役立つ可能性がある。一つの実施形態において、本発明は、免疫的に、かつ抗体エフェクター機構を必要とせずに細胞を枯渇させるために使用され得る。それは、例えば、閉鎖器官が、浸潤する白血球によって破壊され得る繊細でしばしば非分裂の組織細胞を含み得るので、望ましくない損傷を最小化するか、又は少なくとも低減するという利点を有し得る。本発明が、例えば脳、脊髄、眼球又は精巣などの器官に直接適用される場合、組織にさらなる損傷又は炎症を誘導することなく、又はさらなる損傷を低減して、ＣＤ４５陽性細胞の除去をもたらすことができる。一実施形態では、閉鎖器官における標的細胞は、リンパ球、Ｂ細胞、及びＴ細胞から選択される。一実施形態では、閉鎖器官内の標的細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であるか、又はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であるか、又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【0226】
さらなる好ましい実施形態において、本発明を介して治療される状態は、以下のうちの１つから選択され得る：
・ ウイルス性脳炎；
・ 緑内障、特に網膜へのＴ細胞浸潤を特徴とする緑内障；
・ パーキンソン病；
・ ＡＬＳ；
・ ＣＮＳの病変を有する腫瘍随伴症候群；
・ 視神経脊髄炎；
・ 自己免疫性脳炎
・ 自己免疫性ぶどう膜炎；及び
・ 慢性／自己免疫性精巣炎又は不妊症につながる精巣の他の病気
さらなる好ましい実施形態において、本発明が適用される状態は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤によって特徴付けられるものである。
・ ウイルス性脳炎；
・ 緑内障、特に網膜へのＴ細胞浸潤を特徴とする緑内障；
・ パーキンソン病；
・ ＡＬＳ；
・ ＣＮＳの病変を有する腫瘍随伴症候群；
・ 視神経脊髄炎；
・ 自己免疫性脳炎
・ 自己免疫性ぶどう膜炎；及び
・ 慢性／自己免疫性精巣炎又は不妊症につながる精巣の他の病気
さらなる好ましい実施形態において、本発明が適用される状態は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤によって特徴付けられるものである。
【0227】
医薬組成物
一態様では、以下のものを含む医薬組成物：（ａ）本発明の結合分子（単数又は複数）、核酸分子（単数又は複数）、又はベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤。一つの好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明の結合分子（単数又は複数）を含む。一態様では、本発明の１つ又は複数の抗体を含む医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態では、それは本発明の抗体（単数又は複数）を含む。薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、様々な異なる成分を組成物に含めることができる。組成物は、任意に、本発明の分子（複数可）の特性を変化させることができるさらなる分子を含み、それによって、例えば、分子（複数可）の機能を低減、安定化、遅延、調節及び／又は活性化させることができる。組成物は、固体、又は液体の形態であってよく、特に、粉末、錠剤、溶液、又はエアロゾルの形態であってよい。
一態様では、以下のものを含む医薬組成物：（ａ）本発明の結合分子（単数又は複数）、核酸分子（単数又は複数）、又はベクター（単数又は複数）；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤。一つの好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明の結合分子（単数又は複数）を含む。一態様では、本発明の１つ又は複数の抗体を含む医薬組成物が提供される。特に好ましい実施形態では、それは本発明の抗体（単数又は複数）を含む。薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、様々な異なる成分を組成物に含めることができる。組成物は、任意に、本発明の分子（複数可）の特性を変化させることができるさらなる分子を含み、それによって、例えば、分子（複数可）の機能を低減、安定化、遅延、調節及び／又は活性化させることができる。組成物は、固体、又は液体の形態であってよく、特に、粉末、錠剤、溶液、又はエアロゾルの形態であってよい。
【0228】
本発明はまた、本発明の分子を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と組み合わせて含む、医薬又は診断組成物を提供する。従って、提供されるのは、病的状態又は障害の治療における使用、及び治療のための医薬の製造のための、本発明の結合分子、特に抗体の使用である。本発明の治療剤が、第２の治療剤も与えられている対象に投与される一実施形態では、２つは、例えば、同時に、順次、又は別々に与えられてもよい。一実施形態では、２つは同じ薬学的組成物中で投与される。別の実施形態では、２つは、別々の薬学的組成物で与えられる。一実施形態では、本発明は、対象が第２の治療薬でも治療されている方法において使用するための、本発明の結合分子、特に抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象が本発明の結合分子、特に抗体で治療されている方法において使用するための第２の治療薬を提供する。本発明の核酸分子（複数可）及びベクター（複数可）はまた、このような組み合わせで投与され得る。
【0229】
本発明の組成物は、通常、無菌の、医薬組成物として供給されるであろう。本発明の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されるアジュバントを含んでいてもよい。別の実施形態では、そのようなアジュバントは、本発明の組成物中に存在しない。本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と共に添加及び混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のためのプロセスを提供する。
【0230】
本明細書で使用する「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本発明の組成物の所望の特性を高めるための薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加物を意味する。賦形剤は当該技術分野において周知であり、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニット、ソルビトール及びグリセロールなどが含まれる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌製造プロセスを採用した実質的に無菌の形態で提供されるであろう。
これには、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液のろ過による製造及び滅菌、無菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁、並びに当業者に周知の方法による無菌容器への製剤の分注が含まれ得る。
これには、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液のろ過による製造及び滅菌、無菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁、並びに当業者に周知の方法による無菌容器への製剤の分注が含まれ得る。
【0231】
薬学的に許容される担体は、それ自体が、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などの大型で代謝の遅い高分子であり得る。
薬学的に許容される塩を使用することができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を挙げることができる。治療用組成物における薬学的に許容される担体は、さらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化することを可能にする。
薬学的に許容される塩を使用することができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を挙げることができる。治療用組成物における薬学的に許容される担体は、さらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化することを可能にする。
【0232】
薬学的に許容される担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
本明細書で使用する「治療上有効量」という用語は、標的とする疾患又は状態を治療、改善又は予防するために、又は検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の結合分子、特に抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用することもできる。このような情報は、次に、ヒトへの投与に有用な用量及び投与経路を決定するために使用することができる。
本明細書で使用する「治療上有効量」という用語は、標的とする疾患又は状態を治療、改善又は予防するために、又は検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の結合分子、特に抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用することもできる。このような情報は、次に、ヒトへの投与に有用な用量及び投与経路を決定するために使用することができる。
【0233】
ヒト対象の正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間と頻度、薬物の組み合わせ、反応の過敏性及び治療に対する耐性／反応に依存する。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療上有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇとなるであろう。あるいは、１日当たり１～５００ｍｇ、例えば用量は、１日当たり１０～１００、２００、３００又は４００ｍｇとすることができる。医薬組成物は、本発明の活性剤の所定量を含む単位用量形態で都合よく提示され得る。一実施形態では、所定の用量における量は、特定の機能をもたらすのに少なくとも十分な量である。
【0234】
組成物は、患者に個別に投与してもよいし、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、順次又は別々に）投与してもよい。本発明が投与される用量は、治療されるべき状態の性質、存在する炎症の程度、及び結合分子、特に抗体が予防的に使用されるか、又は既存の状態を治療するために使用されるかどうかに依存する。
【0235】
投与頻度は、結合分子、特に抗体の半減期とその効果の持続時間に依存する場合がある。半減期が短い場合（例えば２～１０時間）、１日に１回以上の投与が必要な場合がある。あるいは、半減期が長い場合（例えば２～１５日）、１日に１回、１週間に１回、あるいは１～２ヶ月に１回の投与で済むかもしれない。いくつかの実施形態では、本発明の治療薬がその所望の効果を発揮した後、速やかに系から除去されることが望ましい場合があり、したがって、本発明の結合分子、特に抗体は、故意に半減期が短くなるように選択される場合がある。例えば、標的細胞を枯渇させ、対象に細胞を移植することを目的とする本発明の実施形態では、採用される本発明の結合分子、特に抗体が移植細胞も標的とする場合、採用される結合分子、特に抗体が移植細胞も標的としないように半減期が短いことが望ましい場合がある。これは、例えば、細胞の枯渇と新しい細胞の移植との間のギャップを少なくすることができることを意味する場合がある。
【0236】
本発明では、最終製剤のｐＨは、本発明の結合分子（特に抗体）の等電点の値とは類似していない。というのも、製剤のｐＨが７でも、８～９又はそれ以上のｐＩが適切である可能性があるからである。理論に束縛されることを望むものではないが、これにより、例えば結合分子（特に抗体）が溶液中に留まるなど、最終的に安定性が改善された最終製剤が得られると考えられる。
【0237】
本発明の結合分子、特に抗体、及び医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内（脳室内）、経皮的、経皮性（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む任意の数の経路によって投与されてよいが、これだけに限定されるものではない。ハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内、又は組織の間質空間への送達によって達成されるであろう。組成物はまた、関心のある特定の組織に投与することができる。投与処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってもよい。製品が注射又は点滴用である場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳剤の形態をとることができ、それは懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含有することができる。あるいは、結合分子、特に抗体は、適切な無菌液体で使用する前に再構成するために、乾燥形態であってもよい。組成物が胃腸管を使用する経路で投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護し、胃腸管から吸収された後に二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含む必要があるであろう。
【0238】
本発明によるネブライザブル製剤は、例えば、ホイル封筒に包装された単回投与単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液バッファーの体積、例えば、２ｍｌ中に単位用量を含む。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に添加及び混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のためのプロセスを提供する。
結合分子、特に抗体、核酸分子、又はベクターは、医薬又は診断組成物中の唯一の有効成分であってもよいし、抗体成分又はステロイド若しくは他の薬剤分子のような非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に添加及び混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のためのプロセスを提供する。
結合分子、特に抗体、核酸分子、又はベクターは、医薬又は診断組成物中の唯一の有効成分であってもよいし、抗体成分又はステロイド若しくは他の薬剤分子のような非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。
【0239】
医薬組成物は、好適には、本発明の結合分子、特に抗体の治療上有効な量を含んでいる。本明細書で使用する「治療上有効量」という用語は、対象とする疾患又は状態を治療、改善又は予防するために、又は検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。「治療上有効量」は、所望のレベルの細胞枯渇をもたらすために必要な量であってよい。任意の結合分子、特に抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用することもできる。このような情報は、次に、ヒトへの投与に有用な用量及び投与経路を決定するために使用することができる。
【0240】
医薬組成物は、１回あたりの所定量の本発明の活性剤を含む単位用量形態で都合よく提示され得る。本発明の医薬組成物は、対象への投与のための手段を提供する容器で提供されてもよい。本発明の医薬組成物は、プレフィルドシリンジで提供されてもよい。したがって、本発明は、このような装填されたシリンジを提供する。また、本発明の医薬組成物を装填した自動注射器も提供する。
組成物は、患者に個別に投与されてもよいし、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、順次又は別々に）投与されてもよい。
本明細書で採用される薬剤とは、投与されたときに生理的な影響を及ぼす実体を指す。本明細書で使用される薬物とは、治療用量において適切な生理学的影響を有する化学的実体を意味する。
組成物は、患者に個別に投与されてもよいし、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、順次又は別々に）投与されてもよい。
本明細書で採用される薬剤とは、投与されたときに生理的な影響を及ぼす実体を指す。本明細書で使用される薬物とは、治療用量において適切な生理学的影響を有する化学的実体を意味する。
【0241】
本発明の分子（単数又は複数）を投与する用量は、治療すべき状態の性質、存在する炎症の程度、及び本発明を予防的に使用するか、既存の状態を治療するかによって決まる。投与頻度は、結合分子、特に抗体の半減期、及びその効果の持続時間に依存する。結合分子、特に抗体の半減期が短い場合（例えば２～１０時間）、１日に１回又は複数回の投与が必要な場合がある。あるいは、結合分子、特に抗体が、長い半減期（例えば２～１５日）及び／又は長持ちする薬力学（ＰＤ）プロファイルを有する場合、１日に１回、１週間に１回、あるいは１～２ヶ月に１回だけ投与することが必要であり得る。一実施形態では、用量は隔週で、すなわち月に２回送達される。
【0242】
一実施形態では、単回投与が行われる。一実施形態では、本発明の方法は、標的細胞集団が枯渇するまで投与し、その後、全ての投与を停止することを含む。本方法は、抗体が対象のシステムからクリアになるための時間を与えるために、対象に細胞移植を行う前に、対象に投与からの休息を与えることを含んでいてもよい。一実施形態では、投与は、さらなる投与の前に抗薬物（この場合、抗抗体）応答が弱まるように間隔を空けて行われる。
【0243】
本明細書で使用される半減期は、循環中、例えば血清／血漿中の分子の持続時間を指すことを意図するものである。本明細書で使用される薬力学は、本発明による分子の生物学的作用のプロファイル、特に持続時間を意味する。
薬学的に許容される担体は、それ自体が、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などの大型で代謝が遅い高分子であってもよい。
薬学的に許容される担体は、それ自体が、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、不活性ウイルス粒子などの大型で代謝が遅い高分子であってもよい。
【0244】
薬学的に許容される塩を使用することができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を挙げることができる。治療用組成物における薬学的に許容される担体は、さらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、丸薬、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化することを可能にする。
【0245】
投与に適した形態としては、非経口投与、例えば注射又は点滴、例えばボーラス注射又は持続点滴による投与に適した形態が挙げられる。製品が注射又は点滴用である場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳剤の形態をとることができ、それは懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの形成剤を含むことができる。あるいは、抗体分子は乾燥形態であってもよく、使用前に適切な無菌液体で再構成する。
一旦製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。処置される対象は、動物であり得る。しかしながら、１つ以上の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合される。
一旦製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。処置される対象は、動物であり得る。しかしながら、１つ以上の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合される。
【0246】
好適には、本発明による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又はフラグメントの等電点の値に類似していない。例えば、タンパク質のｐＩが８～９又はそれ以上の範囲である場合、製剤ｐＨは７が適切である可能性がある。理論に束縛されることを望まないが、これは最終的に、例えば結合分子（特に抗体）が溶液中に留まるなど、改善された安定性を有する最終製剤を提供することができると考えられる。一例では、４．０から７．０の範囲のｐＨにおける医薬製剤は、以下を含む：１～２００ｍｇ／ｍＬの本発明による結合分子、特に抗体、１～１００ｍＭのバッファー、０．００１～１％の界面活性剤、ａ）１０～５００ｍＭの安定剤、ｂ）１０～５００ｍＭの安定剤及び５～５００ｍＭの張力剤、又はｃ）５～５００ｍＭの張力剤である。
【0247】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内（脳室内）、経皮的、経皮性（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む任意の数の経路によって投与することができるが、これらに限定されるものではない。ハイポスプレーはまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用されてもよい。典型的には、治療用組成物は、液体溶液又は懸濁液として、注射剤として調製され得る。注射の前に液体ビヒクルへの溶液又は懸濁液に適した固体形態もまた調製され得る。
【0248】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内、又は組織の間質空間への送達によって達成されるであろう。また、組成物は、病巣に投与することもできる。投与治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってもよい。組成物中の有効成分は、抗体分子であろうことが理解されよう。そのため、消化管内で分解されやすい可能性がある。したがって、組成物が胃腸管を使用する経路で投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体が胃腸管から吸収されると抗体を放出する薬剤を含んでもよい。本発明の組成物は、一実施形態において、例えば本明細書で言及されるいずれかの閉鎖器官に注入されてもよい。
【0249】
薬学的に許容される担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所的な投与のための製剤として提供される。好適な吸入可能な製剤には、吸入可能な粉末、推進剤ガスを含む計量エアロゾル、又は推進剤ガスを含まない吸入可能な溶液が含まれる。活性物質を含有する本発明による吸入可能な粉末は、上記の活性物質のみからなるか、又は生理学的に許容される賦形剤との上記の活性物質の混合物からなることができる。これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニット、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらと互いの混合物とを含んでもよい。単糖類又は二糖類が好適に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特にそれらの水和物の形態であるが、これに限定されない。
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所的な投与のための製剤として提供される。好適な吸入可能な製剤には、吸入可能な粉末、推進剤ガスを含む計量エアロゾル、又は推進剤ガスを含まない吸入可能な溶液が含まれる。活性物質を含有する本発明による吸入可能な粉末は、上記の活性物質のみからなるか、又は生理学的に許容される賦形剤との上記の活性物質の混合物からなることができる。これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニット、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらと互いの混合物とを含んでもよい。単糖類又は二糖類が好適に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特にそれらの水和物の形態であるが、これに限定されない。
【0250】
肺に沈着させるための粒子は、１０ミクロン未満、例えば１～９ミクロン、例えば１～５μｍの粒子径が必要である。活性成分（抗体又はフラグメントなど）の粒子径が最も重要である。
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用することができる推進剤ガスは、当技術分野において既知である。適切な推進剤ガスは、ｎ‐プロパン、ｎ‐ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上記の推進剤ガスは、単独で使用してもよいし、それらの混合物で使用してもよい。
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用することができる推進剤ガスは、当技術分野において既知である。適切な推進剤ガスは、ｎ‐プロパン、ｎ‐ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上記の推進剤ガスは、単独で使用してもよいし、それらの混合物で使用してもよい。
【0251】
特に好適な推進剤ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２‐テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３‐ヘプタフルオロプロパン）及びこれらの混合物が特に好適である。
推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、他の成分、例えば、共溶剤、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、潤滑剤、及びｐＨを調整するための手段を含有することもできる。これらの成分はすべて当該技術分野において既知である。
本発明による推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、活性物質を最大５重量％含有することができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２～５重量％、０．０１～３重量％、０．０１５～２重量％、０．１～２重量％、０．５～２重量％又は０．５～１重量％の活性物質を含有する。
推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、他の成分、例えば、共溶剤、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、潤滑剤、及びｐＨを調整するための手段を含有することもできる。これらの成分はすべて当該技術分野において既知である。
本発明による推進剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、活性物質を最大５重量％含有することができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２～５重量％、０．０１～３重量％、０．０１５～２重量％、０．１～２重量％、０．５～２重量％又は０．５～１重量％の活性物質を含有する。
【0252】
代替的に肺への局所投与はまた、例えば、ネブライザー、例えば、コンプレッサーに接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）コンプレッサーに接続されたＰａｒｉ ＬＣ‐Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネブライザー）等のデバイスを採用した液体溶液又は懸濁製剤の投与によってもあり得る。
本発明の結合分子、特に抗体は、溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することができる。それは、適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶媒又はバッファー溶液中に懸濁させることができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された結合分子、特に凍結乾燥された抗体を採用することができる。
本発明の結合分子、特に抗体は、溶媒中に分散して、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することができる。それは、適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水又は他の薬学的に許容される溶媒又はバッファー溶液中に懸濁させることができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された結合分子、特に凍結乾燥された抗体を採用することができる。
【0253】
治療用懸濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含むことができる。賦形剤は当技術分野でよく知られており、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニット、ソルビトール及びグリセロールなどが含まれる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌製造プロセスを採用した実質的に無菌の形態で提供されるであろう。これには、製剤に使用される緩衝化溶媒／溶液のろ過による製造及び滅菌、無菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌的懸濁、並びに当業者に周知の方法による無菌容器への製剤の分注が含まれ得る。
【0254】
本発明によるネブライザブル製剤は、例えば、ホイル封筒に包装された単回投与単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液バッファーの体積、例えば、２ｍＬ中に単位用量を含む。
本発明は、ネブライゼーションによる送達に適している場合がある。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を含む組成物を装填したシリンジを提供する。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体の単位用量が装填されたプレフィルドシリンジが提供される。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体を装填した自動注射器が提供される。さらなる実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体を装填したＩＶバッグが提供される。また、凍結乾燥形態でバイアル又は類似の容器に入った凍結乾燥形態の本発明の結合分子、特に抗体が提供される。
本発明は、ネブライゼーションによる送達に適している場合がある。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を含む組成物を装填したシリンジを提供する。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体の単位用量が装填されたプレフィルドシリンジが提供される。別の実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体を装填した自動注射器が提供される。さらなる実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体を装填したＩＶバッグが提供される。また、凍結乾燥形態でバイアル又は類似の容器に入った凍結乾燥形態の本発明の結合分子、特に抗体が提供される。
【0255】
また、本発明の結合分子、特に抗体は、遺伝子治療を用いて投与することも想定される。これを達成するために、結合分子が抗体である場合、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入され、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、ｉｎ ｓｉｔｕで組み合わされるようにする。
【0256】
一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体は、関心対象の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変化させるために、特にＣＤ４５を調節するために使用されてもよい。例えば、本発明は、直接的又は間接的に、前記抗原（単数又は複数）の活性を中和、アンタゴナイズ（拮抗）又はアゴナイズしてもよい。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を含む、キットにも及ぶ。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体のいずれかを含むキットが、任意に投与のための説明書とともに提供される。
さらに別の実施形態では、キットは、１つ又は複数の機能的アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
一実施形態では、本発明の抗体を含む本発明の分子は、実験室試薬として使用するために提供される。
本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を含む、キットにも及ぶ。一実施形態では、本発明の結合分子、特に抗体のいずれかを含むキットが、任意に投与のための説明書とともに提供される。
さらに別の実施形態では、キットは、１つ又は複数の機能的アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
一実施形態では、本発明の抗体を含む本発明の分子は、実験室試薬として使用するために提供される。
【0257】
さらなる側面
さらなる態様において、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、本明細書に記載されるような本発明の結合分子、特に抗体をコードするヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、２つ以上のポリヌクレオチド上に集合的に存在するが、集合的に一緒になって、本発明の結合分子、特に抗体をコードすることが可能である。
さらなる態様において、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、本明細書に記載されるような本発明の結合分子、特に抗体をコードするヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、２つ以上のポリヌクレオチド上に集合的に存在するが、集合的に一緒になって、本発明の結合分子、特に抗体をコードすることが可能である。
【0258】
本明細書における発明は、上記で定義したようなヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一例は「プラスミド」であり、これは円形の二本鎖ＤＮＡループであり、そこに追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされることがある。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされることがある。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的な複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞のゲノムに統合され、そこで宿主ゲノムとともにその後複製され得る。本明細書では、プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」という用語を互換的に使用することができる。ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者によく知られている。この点に関して、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇが作成したＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌに言及される。
【0259】
また、本明細書において、ベクターとは、例えば、ベクターを含む粒子、例えば、ＬＮＰ（Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、脂質ナノ粒子）粒子、特にＬＮＰ‐ｍＲＮＡ粒子を含む。また、本発明のベクターを導入するために使用されるウイルス粒子も含まれる。
本明細書で使用する「選択マーカー」という用語は、その発現により、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を識別することができるタンパク質を意味する。広範な選択マーカーが当技術分野で知られている。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。また、選択マーカーは、例えば蛍光マーカーのような視覚的に識別可能なマーカーであってもよい。蛍光マーカーの例としては、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ及びそれらの各種コンジュゲートなどが挙げられる。
本明細書で使用する「選択マーカー」という用語は、その発現により、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を識別することができるタンパク質を意味する。広範な選択マーカーが当技術分野で知られている。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。また、選択マーカーは、例えば蛍光マーカーのような視覚的に識別可能なマーカーであってもよい。蛍光マーカーの例としては、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ及びそれらの各種コンジュゲートなどが挙げられる。
【0260】
一実施形態において、本発明は、本発明の結合分子、特に抗体をコードするベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の結合分子、特に抗体を集合的にコードするベクターを提供する。
また、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を用いてもよいし、真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を用いてもよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞などが挙げられる。本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供される。
また、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を用いてもよいし、真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を用いてもよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞などが挙げられる。本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供される。
【0261】
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を、本発明の分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くのに適した条件下で培養し、分子を単離することを含む、本発明による分子又はその成分の製造方法を提供する。
ヘテロダイマーテザーを含む抗体を製造する方法は、抗体の２つの部分を混合し、ヘテロダイマーテザーの結合パートナーを会合させることをさらに含んでもよい。この方法は、例えば、所望のヘテロダイマーとは別の任意の種を除去するための精製をさらに含んでもよい。
ヘテロダイマーテザーを含む抗体を製造する方法は、抗体の２つの部分を混合し、ヘテロダイマーテザーの結合パートナーを会合させることをさらに含んでもよい。この方法は、例えば、所望のヘテロダイマーとは別の任意の種を除去するための精製をさらに含んでもよい。
【0262】
本発明の結合分子、特に抗体は、診断／検出キットに使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体は固体表面上に固定される。固体表面は、例えば、チップ、又はＥＬＩＳＡプレートであってよい。
本発明の結合分子、特に抗体は、例えば、結合した抗体‐抗原複合体の検出を容易にする蛍光マーカーとコンジュゲートされていてもよい。これらは、免疫蛍光顕微鏡検査に使用することができる。あるいは、結合分子、特に抗体は、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡに使用することもできる。
本発明の結合分子、特に抗体は、例えば、結合した抗体‐抗原複合体の検出を容易にする蛍光マーカーとコンジュゲートされていてもよい。これらは、免疫蛍光顕微鏡検査に使用することができる。あるいは、結合分子、特に抗体は、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡに使用することもできる。
【0263】
一実施形態では、本発明による結合分子、特に抗体、又はその成分を精製するためのプロセスが提供される。一実施形態では、不純物がカラム上に保持され、抗体が非結合画分に維持されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含む、本発明による結合分子、特に抗体、又はその成分を精製するためのプロセスが提供される。このステップは、例えば、約６～８のｐＨで実施されてもよい。プロセスは、例えば約４～５のｐＨで実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを採用する最初の捕捉ステップをさらに含んでもよい。プロセスは、製品及びプロセスに関連する不純物が製品ストリームから適切に分離されることを確実にするために、追加のクロマトグラフィーステップをさらに含んでもよい。精製プロセスは、濃縮及び透析濾過ステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップを含んでもよい。
【0264】
上述で使用される「精製形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれ以上の純度など、少なくとも９０％の純度を指すことを意図している。
本明細書の文脈では、「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）として解釈される。特定の要素を含む本発明の態様は、関連する要素「からなる」又は「から本質的になる」という代替の実施形態にも及ぶことが意図される。
肯定的に言及された実施形態は、本明細書において、免責事項の根拠として採用され得る。
本明細書において、単数形が言及される場合、別途記載又は明白でない限り、複数形も包含される。特に、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などは、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、複数の参照語を含む。
本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
本明細書の文脈では、「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）として解釈される。特定の要素を含む本発明の態様は、関連する要素「からなる」又は「から本質的になる」という代替の実施形態にも及ぶことが意図される。
肯定的に言及された実施形態は、本明細書において、免責事項の根拠として採用され得る。
本明細書において、単数形が言及される場合、別途記載又は明白でない限り、複数形も包含される。特に、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などは、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、複数の参照語を含む。
本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
【0265】
本明細書における小見出しは、本明細書の構成を補助するために採用されており、本明細書における技術用語の意味を構築するために使用することを意図していない。
本発明の配列は、本明細書において以下に提供される。
本明細書の文脈では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈される。
特定の要素を含む本発明の態様は、関連する要素「からなる」又は「から本質的になる」という代替的な実施形態にも及ぶことが意図される。
肯定的に言及された実施形態は、本明細書において、免責事項の根拠として採用され得る。
本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
本発明の配列は、本明細書において以下に提供される。
本明細書の文脈では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈される。
特定の要素を含む本発明の態様は、関連する要素「からなる」又は「から本質的になる」という代替的な実施形態にも及ぶことが意図される。
肯定的に言及された実施形態は、本明細書において、免責事項の根拠として採用され得る。
本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
【0266】
参考文献
１．Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｅｌｅｃｔｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｅｓ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． （リボソームディスプレイは、免疫ライブラリーからｉｎ ｖｉｔｒｏで高親和性抗体を効率的に選択し、進化させる。）Ｈａｎｅｓ Ｊ，Ｊｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ，Ｗｅｂｅｒ－Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ Ｓ，Ｂｏｓｓｈａｒｄ ＨＲ，Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１４１３０－１４１３５
２．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （ｓｃＦｖ） ｗｉｔｈ Ｌｏｗ Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ． （低ピコモル親和性ペプチド結合性単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の体外進化と結晶学的解析。）Ｚｈａｎｄ Ｃ，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ Ｓ，Ｌｕｇｉｎｂｕｈｌ Ｂ，Ａｍｓｔｕｔｚ Ｐ，Ｃａｍｂｉｌｌａｕ Ｃ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１８８７０－１８８７７
３．Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（立体配座選択による抗原認識。）Ｂｅｒｇｅｒ Ｃ，Ｗｅｂｅｒ－Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ Ｓ，Ｅｇｇｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｙ，Ｈａｎｅｓ Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，Ｂｏｓｓｈａｒｄ Ｈ．Ｒ．（１９９９）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５０，１４９－１５３
１．Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｓｅｌｅｃｔｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｅｓ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． （リボソームディスプレイは、免疫ライブラリーからｉｎ ｖｉｔｒｏで高親和性抗体を効率的に選択し、進化させる。）Ｈａｎｅｓ Ｊ，Ｊｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ，Ｗｅｂｅｒ－Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ Ｓ，Ｂｏｓｓｈａｒｄ ＨＲ，Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ Ａ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１４１３０－１４１３５
２．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （ｓｃＦｖ） ｗｉｔｈ Ｌｏｗ Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ． （低ピコモル親和性ペプチド結合性単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）の体外進化と結晶学的解析。）Ｚｈａｎｄ Ｃ，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ Ｓ，Ｌｕｇｉｎｂｕｈｌ Ｂ，Ａｍｓｔｕｔｚ Ｐ，Ｃａｍｂｉｌｌａｕ Ｃ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１８８７０－１８８７７
３．Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（立体配座選択による抗原認識。）Ｂｅｒｇｅｒ Ｃ，Ｗｅｂｅｒ－Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ Ｓ，Ｅｇｇｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｙ，Ｈａｎｅｓ Ｊ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，Ｂｏｓｓｈａｒｄ Ｈ．Ｒ．（１９９９）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５０，１４９－１５３
【実施例】
【0267】
実施例で使用される用語Ｆａｂ‐Ｘ／‐Ｆａｂ‐Ｙ（又はＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ）は、式Ａ‐Ｘ：Ｙ‐Ｂを有するタンパク質複合体形式を説明し、ここで
Ａ‐Ｘは、第１の融合タンパク質である；
Ｙ‐Ｂは、第２の融合タンパク質である；
Ｘ：Ｙはヘテロダイマーテザーである；
Ａは、ＣＤ４５のような抗原に特異的なＦａｂフラグメントを含む；
ＢはＣＤ４５のような抗原に特異的なＦａｂフラグメントを含む；
Ｘは、ｓｃＦｖ（例えば、ＧＣＮ４ペプチドを結合するｓｃＦｖ）などの結合ペアの第１の結合パートナーである；
Ｙは、ペプチド（例えばＧＣＮペプチド）のような結合ペアの第２の結合パートナーである；
：は、ＸとＹの間の相互作用（結合相互作用など）である；
‐は結合又はリンカーである；
実施例で使用される多くの抗体分子は、このような形式である。その他はＢＹｂｅ形式である；実施例で使用されるＢＹｂｅ抗体は、以下の形式である：
ａ）ポリペプチド鎖：ＶＨＣＨ１‐ＳｃＦｖ；
ｂ）ポリペプチド鎖：ＶＬＣＬ；
ここで
ＶＨＣＨ１及びＶＬＣＬは互いに対になってＦａｂを形成する；
ＣＨ１とＳｃＦｖは結合又はリンカー「‐」によって結合されている。
Ａ‐Ｘは、第１の融合タンパク質である；
Ｙ‐Ｂは、第２の融合タンパク質である；
Ｘ：Ｙはヘテロダイマーテザーである；
Ａは、ＣＤ４５のような抗原に特異的なＦａｂフラグメントを含む；
ＢはＣＤ４５のような抗原に特異的なＦａｂフラグメントを含む；
Ｘは、ｓｃＦｖ（例えば、ＧＣＮ４ペプチドを結合するｓｃＦｖ）などの結合ペアの第１の結合パートナーである；
Ｙは、ペプチド（例えばＧＣＮペプチド）のような結合ペアの第２の結合パートナーである；
：は、ＸとＹの間の相互作用（結合相互作用など）である；
‐は結合又はリンカーである；
実施例で使用される多くの抗体分子は、このような形式である。その他はＢＹｂｅ形式である；実施例で使用されるＢＹｂｅ抗体は、以下の形式である：
ａ）ポリペプチド鎖：ＶＨＣＨ１‐ＳｃＦｖ；
ｂ）ポリペプチド鎖：ＶＬＣＬ；
ここで
ＶＨＣＨ１及びＶＬＣＬは互いに対になってＦａｂを形成する；
ＣＨ１とＳｃＦｖは結合又はリンカー「‐」によって結合されている。
【0268】
例１‐機能性アッセイ用Ｆａｂ‐Ｘ（Ｆａｂ‐５２ＳＲ４ｓｃＦｖ）及びＦａｂ‐Ｙ（Ｆａｂ‐ＧＣＮ４ペプチド）の作製
方法
クローニング方法
抗体可変領域ＤＮＡは、ＰＣＲ又は遺伝子合成によって生成され、フランキング制限酵素部位を含んでいた。これらの部位は、可変重鎖にはＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ、可変軽鎖にはＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉＷＩであった。これにより、重鎖可変領域は２つの重鎖ベクター（Ｆａｂ‐Ｙを持つｐＮＡＦＨとＦａｂ‐Ｘ ｄｓ［ジスルフィド安定化］を持つｐＮＡＦＨ）に、相補的な制限部位を持っているので、ライゲーションが可能になる。これは、可変領域の上流（又は５’）に、ネズミの定常領域とペプチドＹ（ＧＣＮ４）又はｓｃＦｖ Ｘ（５２ＳＲ４）をライゲーションし、全読み取り枠を作成する。軽鎖は、再び同じ相補的制限部位を使用する標準的な社内のネズミ定常κベクター（ｐＭｍＣＫ又はｐＭｍＣＫ Ｓ１７１Ｃ）にクローニングされた。ｐＭｍＣＫ Ｓ１７１Ｃベクターは、可変領域がウサギから単離された場合に使用される。クローニングイベントは、オープンリーディングフレーム全体にフランクするプライマーを用いたシークエンスによって確認された。
方法
クローニング方法
抗体可変領域ＤＮＡは、ＰＣＲ又は遺伝子合成によって生成され、フランキング制限酵素部位を含んでいた。これらの部位は、可変重鎖にはＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ、可変軽鎖にはＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉＷＩであった。これにより、重鎖可変領域は２つの重鎖ベクター（Ｆａｂ‐Ｙを持つｐＮＡＦＨとＦａｂ‐Ｘ ｄｓ［ジスルフィド安定化］を持つｐＮＡＦＨ）に、相補的な制限部位を持っているので、ライゲーションが可能になる。これは、可変領域の上流（又は５’）に、ネズミの定常領域とペプチドＹ（ＧＣＮ４）又はｓｃＦｖ Ｘ（５２ＳＲ４）をライゲーションし、全読み取り枠を作成する。軽鎖は、再び同じ相補的制限部位を使用する標準的な社内のネズミ定常κベクター（ｐＭｍＣＫ又はｐＭｍＣＫ Ｓ１７１Ｃ）にクローニングされた。ｐＭｍＣＫ Ｓ１７１Ｃベクターは、可変領域がウサギから単離された場合に使用される。クローニングイベントは、オープンリーディングフレーム全体にフランクするプライマーを用いたシークエンスによって確認された。
【0269】
ＣＨＯＳの培養
懸濁ＣＨＯＳ細胞は、２ｍＭ（１００Ｘ）ｇｌｕｔａｍａｘを添加したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に予め適応させた。細胞は、シェーカーインキュベーター（Ｋｕｎｅｒ ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で１４０ｒｐｍで撹拌した対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養を行った。
懸濁ＣＨＯＳ細胞は、２ｍＭ（１００Ｘ）ｇｌｕｔａｍａｘを添加したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に予め適応させた。細胞は、シェーカーインキュベーター（Ｋｕｎｅｒ ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で１４０ｒｐｍで撹拌した対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養を行った。
【0270】
エレクトロポレーションによるトランスフェクション
トランスフェクションの前に、ＣＥＤＥＸ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞数と生存率を測定し、必要量の細胞（２ｘ１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間スピンさせた。ペレット化した細胞を滅菌アールズバランス塩溶液に再懸濁し、１４００ｒｐｍでさらに１０分間スピンさせた。上清を吸引し、ペレットを所望の細胞密度に再懸濁した。
２ｘ１０８細胞／ｍｌに対してベクターＤＮＡを４００μｇの最終濃度で混合し、８００μｌをキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に注ぎ、社内のエレクトロポレーションシステムを使用して電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭのｇｌｕｔａｍｘで富化したＰｒｏＣＨＯＳ培地と抗生物質抗有糸分裂薬（１００Ｘ）溶液（５００分の１）を含む３Ｌ三角フラスコに直接移され、３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するＫｕｈｎｅｒシェーカーインキュベーターで培養された。トランスフェクション後２４時間目に２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）を添加し、温度を３２℃まで下げて１３日間培養した。４日目に３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｒｙｒａｔｅ（ｎ‐ＢＵＴＲＩＣ ＡＣＩＤナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ Ｂ‐５８８７）を添加し培養した。１４日目に培養物をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。保持した上清をさらに０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターで濾過した。最終的な発現量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ‐ＨＰＬＣによって決定した。
トランスフェクションの前に、ＣＥＤＥＸ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞数と生存率を測定し、必要量の細胞（２ｘ１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間スピンさせた。ペレット化した細胞を滅菌アールズバランス塩溶液に再懸濁し、１４００ｒｐｍでさらに１０分間スピンさせた。上清を吸引し、ペレットを所望の細胞密度に再懸濁した。
２ｘ１０８細胞／ｍｌに対してベクターＤＮＡを４００μｇの最終濃度で混合し、８００μｌをキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に注ぎ、社内のエレクトロポレーションシステムを使用して電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭのｇｌｕｔａｍｘで富化したＰｒｏＣＨＯＳ培地と抗生物質抗有糸分裂薬（１００Ｘ）溶液（５００分の１）を含む３Ｌ三角フラスコに直接移され、３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するＫｕｈｎｅｒシェーカーインキュベーターで培養された。トランスフェクション後２４時間目に２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）を添加し、温度を３２℃まで下げて１３日間培養した。４日目に３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｒｙｒａｔｅ（ｎ‐ＢＵＴＲＩＣ ＡＣＩＤナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ Ｂ‐５８８７）を添加し培養した。１４日目に培養物をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。保持した上清をさらに０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターで濾過した。最終的な発現量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ‐ＨＰＬＣによって決定した。
【0271】
大規模（１．０Ｌ）精製
Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙは、ＡＫＴＡ ＸｐｒｅｓｓシステムとＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌプレパックドニッケルカラム（ＧＥヘルスケア）を用いてアフィニティーキャプチャーにより精製した。培養上清を０．２２μｍの滅菌ろ過し、カラムにロードする前に、必要に応じて弱酸又は塩基でｐＨを中性に調整した。１５～２５ｍＭ イミダゾールを含む二次洗浄工程で、ニッケル樹脂から弱く結合した宿主細胞タンパク質や非特異的なＨｉｓ結合体を除去した。溶出は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールで行い、２ｍｌのフラクションを回収した。溶出の１カラム量は、溶出ピークを引き締めるために１０分間システムを一時停止し、その結果、総溶出量を減少させた。最もクリーンなフラクションをプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４にバッファー交換した後、０．２２μｍフィルターでろ過した。最終プールは、Ａ２８０ Ｓｃａｎ、ＳＥ‐ＨＰＬＣ（Ｇ３０００メソッド）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いてエンドトキシンについてアッセイした。
Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙは、ＡＫＴＡ ＸｐｒｅｓｓシステムとＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌプレパックドニッケルカラム（ＧＥヘルスケア）を用いてアフィニティーキャプチャーにより精製した。培養上清を０．２２μｍの滅菌ろ過し、カラムにロードする前に、必要に応じて弱酸又は塩基でｐＨを中性に調整した。１５～２５ｍＭ イミダゾールを含む二次洗浄工程で、ニッケル樹脂から弱く結合した宿主細胞タンパク質や非特異的なＨｉｓ結合体を除去した。溶出は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールで行い、２ｍｌのフラクションを回収した。溶出の１カラム量は、溶出ピークを引き締めるために１０分間システムを一時停止し、その結果、総溶出量を減少させた。最もクリーンなフラクションをプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４にバッファー交換した後、０．２２μｍフィルターでろ過した。最終プールは、Ａ２８０ Ｓｃａｎ、ＳＥ‐ＨＰＬＣ（Ｇ３０００メソッド）、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＰＴＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いてエンドトキシンについてアッセイした。
【0272】
例２‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅｓの製造
方法
抗ＣＤ４５抗体４１３３及び６２９４のＦａｂフラグメントを生成するために、それぞれの軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子を、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により設計及び構築した。ウサギ抗体４１３３のＶ領域遺伝子は、ウサギＣκ１領域と重鎖γＣＨ１領域をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローン化された。マウス抗体６２９４のＶ領域遺伝子は、それぞれマウスＣκ領域及び重鎖γ１ ＣＨ１領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。
同様に、４１３３‐６２９４とＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅｓの全長の重鎖（Ｆａｂ ＨＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐ｓｃＦｖ）を自動合成法（ＡＴＵＭ）により設計・構築した。両重鎖は、社内の哺乳類発現ベクターにクローニングされた。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ重鎖は、上記の４１３３軽鎖と対になっていた。ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅの軽鎖Ｖ領域遺伝子は、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により設計・構築し、次にマウスＣκ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅは、Ｆａｂ及びｓｃＦｖの両ポジションにおいて、抗原に無関係な特異性（ａｎｔｉｇｅｎ－ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する。
方法
抗ＣＤ４５抗体４１３３及び６２９４のＦａｂフラグメントを生成するために、それぞれの軽鎖及び重鎖のＶ領域をコードする遺伝子を、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により設計及び構築した。ウサギ抗体４１３３のＶ領域遺伝子は、ウサギＣκ１領域と重鎖γＣＨ１領域をそれぞれコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローン化された。マウス抗体６２９４のＶ領域遺伝子は、それぞれマウスＣκ領域及び重鎖γ１ ＣＨ１領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。
同様に、４１３３‐６２９４とＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅｓの全長の重鎖（Ｆａｂ ＨＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐ｓｃＦｖ）を自動合成法（ＡＴＵＭ）により設計・構築した。両重鎖は、社内の哺乳類発現ベクターにクローニングされた。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ重鎖は、上記の４１３３軽鎖と対になっていた。ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅの軽鎖Ｖ領域遺伝子は、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により設計・構築し、次にマウスＣκ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅは、Ｆａｂ及びｓｃＦｖの両ポジションにおいて、抗原に無関係な特異性（ａｎｔｉｇｅｎ－ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する。
【0273】
関連する重鎖と軽鎖のコンストラクトを対にして、製造者の指示に従ってＧｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＣＨＯ‐ＳＸＥ細胞へトランスフェクトした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するインキュベーターで７日間培養した。培養後、培養液をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。保持した上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
【0274】
上清からの全タンパク質を、製造者の指示に従って、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ 精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で２本の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（カタログ番号ＧＥ２９‐０４０５‐０１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を直列に用いて精製した。溶出したタンパク質の画分を合わせ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ‐１０メンブレン １０ｋＤａ（カタログ番号ＵＦＣ９０１０、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５遠心フィルターユニットで＜５ｍｌに濃縮した。
清浄な画分を得るために、次に、タンパク質をＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ １６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通過させた。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を使用して決定した。さらに、フラクションを４‐２０％トリスグリシンゲルで分析し、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＭＣＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いてエンドトキシンをテストした。
清浄な画分を得るために、次に、タンパク質をＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ １６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通過させた。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を使用して決定した。さらに、フラクションを４‐２０％トリスグリシンゲルで分析し、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＭＣＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いてエンドトキシンをテストした。
【0275】
例３‐ＣＤ４５細胞外ドメインの作製
方法
ＣＤ４５の細胞外ドメインのドメイン１‐４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０８５７５、残基位置２２５‐５７３）をコードする遺伝子を設計し、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により構築した。精製を助けるために、ＴＥＶ切断部位と１０‐Ｈｉｓタグを発現タンパク質のＣ末端に組み込んだ。この遺伝子を社内の哺乳類発現ベクターにクローニングし、次いでＧｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１４５２５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従いＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１４０ｒｐｍの振盪を行いながら７日間培養した。培養後、培養物をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。残った上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
方法
ＣＤ４５の細胞外ドメインのドメイン１‐４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０８５７５、残基位置２２５‐５７３）をコードする遺伝子を設計し、自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）により構築した。精製を助けるために、ＴＥＶ切断部位と１０‐Ｈｉｓタグを発現タンパク質のＣ末端に組み込んだ。この遺伝子を社内の哺乳類発現ベクターにクローニングし、次いでＧｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１４５２５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従いＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１４０ｒｐｍの振盪を行いながら７日間培養した。培養後、培養物をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。残った上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
【0276】
上清からのＨｉｓタグ付きタンパク質は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（カタログ番号ＧＥ１７‐３７１２‐０５、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）２本を直列に用いて製造者の指示に従い精製した。溶出したタンパク質の画分を合わせ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ‐３メンブレン ３ｋＤａ（カタログ番号ＵＦＣ９００３０８、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５ 遠心フィルターユニットで＜５ｍｌに濃縮した。清浄な画分を得るために、次に、タンパク質をＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ １６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通過させた。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を用いて決定した。さらに、分画を４‐２０％トリス‐グリシンゲルで分析した。
【0277】
例４‐抗ＣＤ４５ Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂによるアポトーシスの誘導（アネキシンＶ結合による判定）
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞のドナーコーンあたり２バイアルを、３７℃の水浴中で解凍し、次に５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に追加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌの完全培地に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００で計数して濃度と生存率を決定し、次いで１．２５ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。次に、８０μｌ中の１ウェルあたり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、３人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ６５２、６５８、及び６８６からのＰＢＭＣが使用された。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞のドナーコーンあたり２バイアルを、３７℃の水浴中で解凍し、次に５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に追加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌの完全培地に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００で計数して濃度と生存率を決定し、次いで１．２５ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。次に、８０μｌ中の１ウェルあたり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、３人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ６５２、６５８、及び６８６からのＰＢＭＣが使用された。
【0278】
Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ試薬は、ＸとＹとラベルされた２つの別々の半分を予混合することにより、非共有結合のＦａｂ‐Ｆａｂコンビネーションを形成できる。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐ＹのコンビネーションＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ、及び６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙを完全培地に加え、５００ｎＭのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度となるようにした。マイクロプレートは３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ及びＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｙは、無関係な抗原に特異的なネガティブコントロールである。
次に、各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ調製物２０μｌを細胞に添加し（最終Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度１００ｎＭ）、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇで５分間ＲＴでスピンさせ、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機（２０μｌ Ｕボトムアスピレート設定）を用いて培地を吸引し、２０ｕｌの残留培地に細胞を残留させた。
次に、各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ調製物２０μｌを細胞に添加し（最終Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度１００ｎＭ）、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇで５分間ＲＴでスピンさせ、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機（２０μｌ Ｕボトムアスピレート設定）を用いて培地を吸引し、２０ｕｌの残留培地に細胞を残留させた。
【0279】
Ｍｕｌｔｉｃｙｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ カタログ番号９００５４）を製造者の指示に従い使用した。完全培地で２倍の作業濃度の染色カクテルを調製した。２０μｌの抗体染色カクテルを細胞に添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して生細胞を分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。
【0280】
結果
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐６８６）のデータを図１（Ａ）＆１（Ｂ）に示す。（Ａ）ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙで処理した細胞又は未処理の細胞と比較して、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ処理細胞ではリンパ球の細胞数の著しい減少が観察された。（Ｂ）６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙウェルの生存細胞のうち、３８％はアネキシンＶの結合を示した。これは、アポトーシスを起こしている細胞を示している。さらに、アネキシンＶの結合レベルは、他の処理及び未処理のウェルにおける結合レベルのおよそ３倍であった。
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐６８６）のデータを図１（Ａ）＆１（Ｂ）に示す。（Ａ）ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙで処理した細胞又は未処理の細胞と比較して、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ処理細胞ではリンパ球の細胞数の著しい減少が観察された。（Ｂ）６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙウェルの生存細胞のうち、３８％はアネキシンＶの結合を示した。これは、アポトーシスを起こしている細胞を示している。さらに、アネキシンＶの結合レベルは、他の処理及び未処理のウェルにおける結合レベルのおよそ３倍であった。
【0281】
例５‐精製Ｔ細胞のアポトーシス
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣは、冷凍アリコートとしてバンクされた。アッセイを実施する前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞のドナーコーンあたり２バイアルを、３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌのＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭグルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから供給、５％熱不活化ヒトＡＢ血清、カタログ番号、Ｈ３６６７‐２０ＭＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００で計数して濃度と生存率を決定し、次いで１．２５ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。次に、８０μｌ中の１ウェルあたり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間休ませた。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣは、冷凍アリコートとしてバンクされた。アッセイを実施する前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞のドナーコーンあたり２バイアルを、３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌのＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭグルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから供給、５％熱不活化ヒトＡＢ血清、カタログ番号、Ｈ３６６７‐２０ＭＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００で計数して濃度と生存率を決定し、次いで１．２５ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。次に、８０μｌ中の１ウェルあたり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間休ませた。
【0282】
Ｔ細胞は、製造者の指示に従ってＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した（カタログ番号１３０‐０９６‐５３３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。簡単に言うと、ＰＢＭＣを冷ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、４０μｌのＭＡＣＳバッファーに１０７細胞で再懸濁させた。その後、１０μｌのＣＤ４＋Ｔ細胞ビオチン‐抗体カクテルを加え（１０７細胞あたり）、混合し、そして５分間、４℃でインキュベートした）。その後、さらに３０μｌのＭＡＣＳバッファーを加え（１０７細胞あたり）、その後２０μｌのＣＤ４＋Ｔ細胞マイクロビーズカクテルを加えた（１０７細胞あたり）。細胞は混合され、その後４℃で１０分間インキュベートされた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を他の細胞から分離するために、それらは磁気選択カラム（ＬＳカラム）上に置かれ、３ｍｌのＭＡＣＳバッファーで３回洗浄された。精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、カラム溶出液から回収された。次に、細胞をＲＰＭＩ培地（上記の通り）で洗浄し、回収率及び生存率（９７％の細胞生存率として測定）を評価するために数えた。次に、１００μｌ中のウェル当たり１０５個の細胞を、コーニングＣｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。
【0283】
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ、４１３３‐Ｙ／６２９４‐Ｙ、６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙ及びＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙを、２００ｎＭのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度となるように完全培地に添加した。マイクロプレートは３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートされた。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ試薬をＲＰＭＩ培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回生成した。２つのＹ試薬が一緒に加えられると（ここでは４１３３‐Ｙと６２９４‐Ｙの組み合わせを使用）、これらは混合物を形成し、連結分子ではないことに注意されたい。
【0284】
次に、各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液１００μｌ（最終ウェル濃度１００‐０．００１２８ｎＭ）をＣＤ４＋細胞のプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを５００ｇで５分間、ＲＴでスピンさせた。その後、バッファーを吸引し（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機を使用、１５μｌ Ｕ底吸引設定）プレートを密封し、１８００ｒｐｍで３０秒間再スピンさせた。プレートに氷冷したＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、再度スピンさせた。バッファーを除去し、プレートを再スピンさせ、２０μｌの１：１０００ ｎｅａｒ ＩＲ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加した。２０分後、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１５μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングにより、最大細胞減少％及びＥＣ５０値を算出した。
【0285】
結果
精製ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少％は、図２に示されている。組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙは、９７％の最高レベルの減少を示し、０．３２ｎＭのＥＣ５０値を与える最も強力なものであった。他のすべての組み合わせは、細胞減少のための５０％最大レベルに到達せず、ＥＣ５０の測定値を生成するのに十分な効力はなかった。
精製ＣＤ４＋Ｔ細胞数の減少％は、図２に示されている。組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙは、９７％の最高レベルの減少を示し、０．３２ｎＭのＥＣ５０値を与える最も強力なものであった。他のすべての組み合わせは、細胞減少のための５０％最大レベルに到達せず、ＥＣ５０の測定値を生成するのに十分な効力はなかった。
【0286】
例６‐Ｆａｂ‐Ｘ／Ｆａｂ‐Ｙ及びＢＹｂｅとしてフォーマットされた抗ＣＤ４５抗体によって誘導されたＰＢＭＣのアポトーシス
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに入れた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞バイアル２個を、３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて前出Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、１００μｌ中のウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８０１と８０２からのＰＢＭＣが使用された。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに入れた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を各々含む凍結細胞バイアル２個を、３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて前出Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、１００μｌ中のウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８０１と８０２からのＰＢＭＣが使用された。
【0287】
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートで、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙを完全培地に加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度が１５００ｎＭとなるようにした。同様に、完全培地中の４１３３‐６２９４ＢＹｂｅの１５００ｎＭストックを調製した。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、１０ポイントの用量曲線を形成するために９回製造した。
【0288】
各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液２０μｌ（最終ウェル濃度２５０‐０．０００１２８ｎＭ）を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機でバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し洗浄し、次いで再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残留培地に残留させた。２０μｌの細胞特異的マーカー抗体カクテル溶液をウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。抗体カクテルの詳細は下記表４の通りである。
【0289】
細胞はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用してライブで分析された。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングにより、最大細胞減少％及びＥＣ５０値を算出した。
【0290】
【表7】
【0291】
結果
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８０２）に対する（Ａ）６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び（Ｂ）４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによるＰＢＭＣ細胞サブセット数の減少％を図３、及び以下の表５及び６に示す。６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅはともに、Ｔ細胞で０．１９‐０．５２ｎＭ、Ｂ細胞で０．６５‐１．５０ｎＭという非常に強力なＥＣ５０を示し、Ｔ細胞（＞９５％）とＢ細胞（８７％）でほぼ最大の減少を示した。
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８０２）に対する（Ａ）６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び（Ｂ）４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによるＰＢＭＣ細胞サブセット数の減少％を図３、及び以下の表５及び６に示す。６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅはともに、Ｔ細胞で０．１９‐０．５２ｎＭ、Ｂ細胞で０．６５‐１．５０ｎＭという非常に強力なＥＣ５０を示し、Ｔ細胞（＞９５％）とＢ細胞（８７％）でほぼ最大の減少を示した。
【0292】
【表8】
【0293】
【表9】
【0294】
例７‐全血中のリンパ球のアポトーシス
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫにて、倫理的に承認されたサンプル収集プロトコルに従い、２人のドナー（ＨＴＡ＃０５１１１９‐０１＆＃０５１１１９‐０２）からヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及びＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐ＹをＰＢＳに加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度２７５０ｎＭとした。同様に、ＰＢＳ中の４１３３‐６２９４ＢＹｂｅの２７５０ｎＭストックを調製した。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に９回連続希釈し、１０ポイントの用量曲線を形成した。
各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液５μｌをＮｕｎｃ（商標）９６‐Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。次に、５０μｌの血液を各ウェルに加え、プレートを穏やかに混合し、ガス交換が可能なプレートシールで密封した。その後、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。このアッセイを短時間で実行することにより、抗凝固剤を添加する必要性を回避することができる。
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫにて、倫理的に承認されたサンプル収集プロトコルに従い、２人のドナー（ＨＴＡ＃０５１１１９‐０１＆＃０５１１１９‐０２）からヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及びＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐ＹをＰＢＳに加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度２７５０ｎＭとした。同様に、ＰＢＳ中の４１３３‐６２９４ＢＹｂｅの２７５０ｎＭストックを調製した。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に９回連続希釈し、１０ポイントの用量曲線を形成した。
各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液５μｌをＮｕｎｃ（商標）９６‐Ｗｅｌｌ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ＤｅｅｐＷｅｌｌ（商標）プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加した。次に、５０μｌの血液を各ウェルに加え、プレートを穏やかに混合し、ガス交換が可能なプレートシールで密封した。その後、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。このアッセイを短時間で実行することにより、抗凝固剤を添加する必要性を回避することができる。
【0295】
インキュベーション後、９５０μｌのＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（カタログ番号ＢＤ５５８０４９、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。その後、プレートを５００ｇで８分間、４℃でスピンした。バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、Ｉｎｔｅｇｒａ Ｖｉａｆｌｏ ９６チャネルピペットを用いて細胞を洗浄した。プレートを５００ｇで８分間、４℃でスピンさせた。前回と同様に、バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加えて細胞を洗浄した。その後、２５０ｇで１０分間、４℃でゆっくりとスピンさせた。再び、バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加えて細胞を洗浄した。プレートを５００ｇで８分間、４℃で再スピンさせた。バッファーを吸引し、細胞特異的抗体染色用に細胞を最小限の残留量にした。２０μｌの細胞特異的抗体カクテル（以下の表７に示す）をウェルに加え、プレートを４℃で１時間インキュベートした。
【0296】
抗体カクテルとのインキュベーションの後、細胞を上記のように２回洗浄し、バッファーを吸引して２０μｌの残留バッファー中に細胞を残した。その後、２０μｌのＦＡＣＳバッファーをサンプルに加え、細胞を希釈した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングにより、最大細胞減少％及びＥＣ５０値を算出した。
【0297】
【表10】
【0298】
結果
６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ による、（Ａ）総リンパ球及び（Ｂ）ＣＤ４＋細胞（ドナー＃０５１１１９‐０１）と（Ｃ）総リンパ球及び（Ｄ）ＣＤ４＋細胞（ドナー＃０５１１１９‐０２）との、全血中の減少％を図４及び以下の表８に示す。データは、両ドナーにわたって広く類似している。ネガティブコントロールであるＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙは、どちらのドナーについても、総リンパ球数又はＣＤ４＋細胞数の減少を示さなかった。ドナー＃０５１１１９‐０２において、ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙの最高濃度での細胞減少のスパイクは、単一のデータポイントであり、真の活性を反映していないと考えられる。一方、わずか５時間で、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの両方は、３４‐４４％で総リンパ球の、４８‐５４％でＣＤ４＋細胞の最大減少を示した。総リンパ球に対するＥＣ５０値は０．３７‐５．９９ｎＭで、ＣＤ４＋細胞に対しては０．０５‐０．３３ｎＭで、これらの試薬の効力とｉｎ ｖｉｖｏでの活性の可能性を証明した。
６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ による、（Ａ）総リンパ球及び（Ｂ）ＣＤ４＋細胞（ドナー＃０５１１１９‐０１）と（Ｃ）総リンパ球及び（Ｄ）ＣＤ４＋細胞（ドナー＃０５１１１９‐０２）との、全血中の減少％を図４及び以下の表８に示す。データは、両ドナーにわたって広く類似している。ネガティブコントロールであるＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙは、どちらのドナーについても、総リンパ球数又はＣＤ４＋細胞数の減少を示さなかった。ドナー＃０５１１１９‐０２において、ＮｅｇＣｔｒｌ‐Ｘ／４１３３‐Ｙの最高濃度での細胞減少のスパイクは、単一のデータポイントであり、真の活性を反映していないと考えられる。一方、わずか５時間で、６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの両方は、３４‐４４％で総リンパ球の、４８‐５４％でＣＤ４＋細胞の最大減少を示した。総リンパ球に対するＥＣ５０値は０．３７‐５．９９ｎＭで、ＣＤ４＋細胞に対しては０．０５‐０．３３ｎＭで、これらの試薬の効力とｉｎ ｖｉｖｏでの活性の可能性を証明した。
【0299】
【表11】
【0300】
例８‐Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイによる２４時間後の全血中のサイトカイン放出量
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫの２名のドナー（ＨＴＡ＃３００１２０‐１＆＃３００１２０‐２）から、倫理的に認められたサンプル収集プロトコールに従って、ヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートに、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅと、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ 位置の両方に抗原と無関係な特異性を持つネガティブコントロールＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）を５０００ｎＭでＰＢＳ中に調製した。次に、ＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に順次希釈し、３回生成を繰り返して４点の用量曲線を形成した。ＢＹｂｅ希釈液１２．５μｌをＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）に移し、全血２３７．５μｌを各ウェルに追加した。ＢＹｂｅｓの最終的なウェル濃度は、２５０ｎｍ、５０ｎＭ、１０ｎｍ、２ｎＭであった。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（臨床グレード、３０ｍｇ／ｍｌストックからＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈、ロット番号Ｆ１００２Ｈ２９）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌでポジティブコントロールとして使用した。プレートをガス透過性粘着シールで密封し、プレートの蓋を取り替えた。その後、プレートを３７℃、５％加湿ＣＯ２で２４時間、乱れのない場所でインキュベートした。
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫの２名のドナー（ＨＴＡ＃３００１２０‐１＆＃３００１２０‐２）から、倫理的に認められたサンプル収集プロトコールに従って、ヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートに、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅと、Ｆａｂ及びｓｃＦｖ 位置の両方に抗原と無関係な特異性を持つネガティブコントロールＢＹｂｅ（ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ）を５０００ｎＭでＰＢＳ中に調製した。次に、ＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に順次希釈し、３回生成を繰り返して４点の用量曲線を形成した。ＢＹｂｅ希釈液１２．５μｌをＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）に移し、全血２３７．５μｌを各ウェルに追加した。ＢＹｂｅｓの最終的なウェル濃度は、２５０ｎｍ、５０ｎＭ、１０ｎｍ、２ｎＭであった。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（臨床グレード、３０ｍｇ／ｍｌストックからＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈、ロット番号Ｆ１００２Ｈ２９）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌでポジティブコントロールとして使用した。プレートをガス透過性粘着シールで密封し、プレートの蓋を取り替えた。その後、プレートを３７℃、５％加湿ＣＯ２で２４時間、乱れのない場所でインキュベートした。
【0301】
次に、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｅｘ １３‐ｐｌｅｘ ヒトサイトカインアッセイを使用してサイトカイン放出を評価した（サイトカインのカスタム選択：ＩＬ‐１ ＲＡ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１１、ＩＬ‐１３、ＣＣＬ２、ＩＬ‐８、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＧＭ‐ＣＳＦ及びＭ‐ＣＳＦ）。２４時間培養後、プレートを１０００ｇで１０分間スピンさせ、５０μｌの血漿を５０μｌのアッセイ希釈バッファー（ＬｕｍｉｎｅｘキットのＲＤ６‐５２）の入った別のプレートに移した。サンプルはマルチチャンネルピペットを用いて十分に再懸濁し、５０μｌをＬｕｍｉｎｅｘアッセイプレートに移した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ標準試料を１／２に７回希釈し、標準曲線を作成し、プレートに添加した。５０μｌの微粒子混合物を次に各ウェルに添加し、プレートを室温（ＲＴ)で２時間インキュベートし、８００ｒｐｍで混合した。各ウェルに１５０μｌの洗浄バッファーを加え、プレートを３回洗浄し、次いでＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機マグネットに磁気ビーズを結合させ、上清を吸引した。５０μｌのビオチン‐抗体カクテルを各ウェルに加え、プレートを振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。その後、プレートを前と同様に洗浄し、最後に５０μｌのストレプトアビジン‐ＰＥを各ウェルに添加した。最終の洗浄ステップの前に、プレートを室温で３０分間振とうしながらインキュベートし、５０μｌの洗浄バッファーを各ウェルに添加した。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイプレートは、ｉＱＵＥｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して実行した。標準曲線を作成し（提供されたアッセイコントロールを使用）、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して外挿されたサイトカイン値を生成した。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）に転送され、データの可視化が行われた。
【0302】
結果
試験試薬で２４時間インキュベート後の全血中の各サイトカインのレベルは、両ドナーともほぼ同じであった。図５には、両ドナーを代表するデータとして、＃３００１２０‐１のデータを示した。個々のサイトカインのレベルは、以下のように示される（Ａ）ＣＣＬ２、（Ｂ）ＧＭ‐ＣＳＦ、（Ｃ）ＩＬ‐１ ＲＡ、（Ｄ）ＩＬ‐６、（Ｅ）ＩＬ‐８、（Ｆ）ＩＬ‐１０、（Ｇ）ＩＬ‐１１、（Ｈ）Ｍ‐ＣＳＦ。サイトカインＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐１３、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１はいずれのウェルでも検出されなかった（データは示さず）。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）は、サイトカイン（Ａ）ＣＣＬ２、（Ｃ）ＩＬ‐１ ＲＡ、（Ｅ）ＩＬ‐８を標準曲線を超えるレベルまで誘導したので、このアッセイにおける最大シグナルでプロットした。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）はまた、ＰＢＳ処理したウェルのレベルを超える顕著なレベルのＩＬ‐６（Ｄ）を誘導した。重要なことは、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによる炎症性サイトカインの誘導は、ＰＢＳ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理したウェルにおけるレベルと一致し、ほとんど又は全く観察されなかったことである。
試験試薬で２４時間インキュベート後の全血中の各サイトカインのレベルは、両ドナーともほぼ同じであった。図５には、両ドナーを代表するデータとして、＃３００１２０‐１のデータを示した。個々のサイトカインのレベルは、以下のように示される（Ａ）ＣＣＬ２、（Ｂ）ＧＭ‐ＣＳＦ、（Ｃ）ＩＬ‐１ ＲＡ、（Ｄ）ＩＬ‐６、（Ｅ）ＩＬ‐８、（Ｆ）ＩＬ‐１０、（Ｇ）ＩＬ‐１１、（Ｈ）Ｍ‐ＣＳＦ。サイトカインＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐１３、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１はいずれのウェルでも検出されなかった（データは示さず）。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）は、サイトカイン（Ａ）ＣＣＬ２、（Ｃ）ＩＬ‐１ ＲＡ、（Ｅ）ＩＬ‐８を標準曲線を超えるレベルまで誘導したので、このアッセイにおける最大シグナルでプロットした。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）はまた、ＰＢＳ処理したウェルのレベルを超える顕著なレベルのＩＬ‐６（Ｄ）を誘導した。重要なことは、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによる炎症性サイトカインの誘導は、ＰＢＳ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理したウェルにおけるレベルと一致し、ほとんど又は全く観察されなかったことである。
【0303】
例９‐ＭＳＤアッセイにより測定した２４時間後の全血中のサイトカイン放出量＋Ｔ細胞数
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫにて、倫理的に承認されたサンプル収集プロトコルに従い、１人のドナー（ＨＴＡ＃０３１２１９‐０６）からヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐ＹをＰＢＳに加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度２０００ｎＭとした。同様に、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅとＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅのストックを２０００ｎＭでＰＢＳに調製した。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回生成した。
１２．５μｌのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液をＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）に移し、各ウェルに２３７．５μｌの全血を追加した。Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅｓの最終的なウェル濃度は、１００‐０．００１２８ｎＭであった。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（臨床グレード、ＰＢＳ中で３０ｍｇ／ｍｌストックから１ｍｇ／ｍｌに希釈、ロット番号Ｆ１００２Ｈ２９）を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度でポジティブコントロールとして使用した。プレートをガス透過性粘着シールで密封し、プレートの蓋を取り替えた。その後、プレートを３７℃、５％加湿ＣＯ２で２４時間、乱れのない場所でインキュベートした。
方法
ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫにて、倫理的に承認されたサンプル収集プロトコルに従い、１人のドナー（ＨＴＡ＃０３１２１９‐０６）からヒト全血（リチウムヘパリンチューブ）を採取した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐ＹをＰＢＳに加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度２０００ｎＭとした。同様に、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅとＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅのストックを２０００ｎＭでＰＢＳに調製した。マイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬をＰＢＳで５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回生成した。
１２．５μｌのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液をＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）に移し、各ウェルに２３７．５μｌの全血を追加した。Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅｓの最終的なウェル濃度は、１００‐０．００１２８ｎＭであった。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（臨床グレード、ＰＢＳ中で３０ｍｇ／ｍｌストックから１ｍｇ／ｍｌに希釈、ロット番号Ｆ１００２Ｈ２９）を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度でポジティブコントロールとして使用した。プレートをガス透過性粘着シールで密封し、プレートの蓋を取り替えた。その後、プレートを３７℃、５％加湿ＣＯ２で２４時間、乱れのない場所でインキュベートした。
【0304】
２４時間のインキュベーションの後、プレートを１０００ｇで１０分間スピンさせ、５０μｌの血漿を別のプレートに移し、サイトカイン放出アッセイまで－８０℃で保存した。細胞枯渇のレベルを決定するために、残りの細胞をＰＢＳに再懸濁し、未処理（ＰＢＳ）、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）及びＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ １００ｎＭウェルから５０μｌを、９６ディープウェルプレートに移した。９５０μｌのＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（カタログ番号ＢＤ５５８０４９、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。その後、プレートを５００ｇで８分間、４℃でスピンした。バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、Ｉｎｔｅｇｒａ Ｖｉａｆｌｏ ９６チャネルピペットを用いて細胞を洗浄した。プレートを５００ｇで８分間、４℃でスピンさせた。前回と同様に、バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した。その後、２５０ｇで１０分間、４℃でゆっくりとスピンさせた。再び、バッファーを吸引し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した。プレートを５００ｇで８分間、４℃で再スピンさせた。バッファーを吸引し、細胞特異的抗体染色用に細胞を最小限の残留量にした。２０μｌの細胞特異的抗体カクテル（以下の表９に示す）をウェルに加え、プレートを４℃で１時間インキュベートした。
【0305】
抗体カクテルとのインキュベーションの後、細胞を上記のように２回洗浄し、バッファーを吸引して２０μｌの残留バッファー中に細胞を残した。その後、２０μｌのＦＡＣＳバッファーをサンプルに加え、細胞を希釈した。Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングが適用された。
【0306】
【表12】
【0307】
サイトカインの測定は、Ｖ‐ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉ（４‐Ｐｌｅｘ）（ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＴＮＦ‐α、カタログ番号Ｋ１５０５２Ｄ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、製造者の指示に従って実施した。要するに、血漿サンプルをＲＴで解凍し、希釈液２で４分の１に希釈した。５０μｌのサンプル又は標準曲線キャリブレーターをＰｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ Ｉプレートに添加し、ＲＴでプレートシェーカー上で２時間インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレートウォッシャーでプレートをＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０添加）で洗浄し、３０μｌの検出抗体を各ウェルに添加した。プレートをさらに２時間、ＲＴのプレート振とう機でインキュベートした。プレートを前と同様に洗浄し、１５０μｌのリードバッファー（ｄＨ２Ｏで２分の１に希釈）を各ウェルに添加した。その後、プレートをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で分析した。
【0308】
結果
試験試薬で２４時間インキュベートした後の全血中のＴ細胞数を図６に示す。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）は、ＰＢＳ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅで処理したウェルと比較して、Ｔ細胞数が約８倍減少していた。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙも、それぞれ５倍及び３．６倍と、Ｔ細胞数の顕著な減少を示した。検出された炎症性サイトカインのレベルを図７（Ａ）ＩＦＮ‐γ、（Ｂ）ＩＬ‐６、（Ｃ）ＴＮＦ‐αに示す。ＩＬ‐１βのレベルは、顕著なレベルを登録したカンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）を除くすべての試薬について検出レベル以下であった（データは示されていない）。有意なことに、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙによる炎症性サイトカインの誘導は、ＰＢＳ‐及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理したウェルにおけるレベルと一致し、ほとんど又は全く観察されなかった。
試験試薬で２４時間インキュベートした後の全血中のＴ細胞数を図６に示す。カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）は、ＰＢＳ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅで処理したウェルと比較して、Ｔ細胞数が約８倍減少していた。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙも、それぞれ５倍及び３．６倍と、Ｔ細胞数の顕著な減少を示した。検出された炎症性サイトカインのレベルを図７（Ａ）ＩＦＮ‐γ、（Ｂ）ＩＬ‐６、（Ｃ）ＴＮＦ‐αに示す。ＩＬ‐１βのレベルは、顕著なレベルを登録したカンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）を除くすべての試薬について検出レベル以下であった（データは示されていない）。有意なことに、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙによる炎症性サイトカインの誘導は、ＰＢＳ‐及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理したウェルにおけるレベルと一致し、ほとんど又は全く観察されなかった。
【0309】
例１０‐抗ＣＤ４５ ＢＹｂｅによるマクロファージのアポトーシス抵抗性
ＰＢＭＣからの単球の単離
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに入れた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞２バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて先にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００でカウントして濃度と生存率を決定した。このアッセイでは、１人のドナー（ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅｓ ８０２）からのＰＢＭＣを使用した。
単球の単離は、Ｐａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０‐０９６‐５３７）とＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０‐０４２‐４０１）を用いて製造者の指示に従い実施した。単離後の単球純度を確認するため、１００μｌの細胞を取り出し、氷上で保存した。単離した細胞をＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６３７４３）で染色し、ＦＡＣＳを用いて単球の純度を確認した。
ＰＢＭＣからの単球の単離
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに入れた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞２バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて先にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を２０ｍｌのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００でカウントして濃度と生存率を決定した。このアッセイでは、１人のドナー（ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅｓ ８０２）からのＰＢＭＣを使用した。
単球の単離は、Ｐａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０‐０９６‐５３７）とＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０‐０４２‐４０１）を用いて製造者の指示に従い実施した。単離後の単球純度を確認するため、１００μｌの細胞を取り出し、氷上で保存した。単離した細胞をＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６３７４３）で染色し、ＦＡＣＳを用いて単球の純度を確認した。
【0310】
細胞を５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレートウォッシャーでバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し洗浄後、再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残液で残留させた。２０μｌのビオチン‐抗体カクテルをウェルに加え、プレートを４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを前と同様にスピンし、細胞をＦＡＣＳバッファで１回洗浄し、前と同様に再度スピンした後、過剰なバッファを吸引し、細胞を５０μｌの残留バッファに残した。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して生細胞を分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して生細胞を分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。
【0311】
単球からのマクロファージの誘導
Ｍ‐ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＲＰ３１１０）及び ＧＭ‐ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５‐ＧＭ／ＣＦ）を１００μｇ／ｍｌで調製した。細胞は、Ｍ１培地（完全培地＋５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ‐ＣＳＦ）又はＭ２培地（完全培地＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ‐ＣＳＦ）中に２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で調製した。２００μｌの細胞を２枚のＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＢｌａｃｋポリスチレンマイクロプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
Ｍ‐ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＲＰ３１１０）及び ＧＭ‐ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５‐ＧＭ／ＣＦ）を１００μｇ／ｍｌで調製した。細胞は、Ｍ１培地（完全培地＋５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ‐ＣＳＦ）又はＭ２培地（完全培地＋５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ‐ＣＳＦ）中に２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度で調製した。２００μｌの細胞を２枚のＣｏｒｎｉｎｇ ９６ウェルＢｌａｃｋポリスチレンマイクロプレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0312】
３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養後、プレートをスピンさせ（５００ｇ、５分、ＲＴ）、バッファーを吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に２００μｌのＭ１培地又はＭ２培地に再懸濁させた。さらに４日間培養した後（３７℃、５％ＣＯ２）、プレートを前と同様にスピンさせ、バッファーを吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで１５０μｌのＭ１培地（５０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ添加、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＲＰ３０５８）又はＭ２培地（２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ‐４添加、Ｇｉｂｃｏ カタログ番号ＰＨＣ００４４）に再懸濁させた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターで一晩インキュベートした。
【0313】
ＢＹｂｅによるマクロファージの処理
単離後８日目に、Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートで、４１３３‐６２９４‐ＢＹｂｅ又はＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅを４０００ｎＭの濃度でＭ１メディア又はＭ２メディアに添加した。その後、ＢＹｂｅ タンパク質を５分の１の割合で連続的に３回希釈し、４つの作業濃度を作製した。各ＢＹｂｅ希釈液１０μｌを、９６ウェルＢｌａｃｋポリスチレンマイクロプレートのウェル内の１５０ｕｌの細胞に加えた。ウェル内の最終濃度は、２５０ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、及び２ｎＭであった。アポトーシスのポジティブコントロールとして、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（カタログ番号Ｃ９９１１‐１００ＭＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）（カタログ番号Ｓ６９４２‐２００ＵＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。いずれもＭ１又はＭ２培地で希釈し、最終濃度が５μＭになるようにウェルに添加した。
単離後８日目に、Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートで、４１３３‐６２９４‐ＢＹｂｅ又はＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅを４０００ｎＭの濃度でＭ１メディア又はＭ２メディアに添加した。その後、ＢＹｂｅ タンパク質を５分の１の割合で連続的に３回希釈し、４つの作業濃度を作製した。各ＢＹｂｅ希釈液１０μｌを、９６ウェルＢｌａｃｋポリスチレンマイクロプレートのウェル内の１５０ｕｌの細胞に加えた。ウェル内の最終濃度は、２５０ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、及び２ｎＭであった。アポトーシスのポジティブコントロールとして、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（カタログ番号Ｃ９９１１‐１００ＭＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）（カタログ番号Ｓ６９４２‐２００ＵＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。いずれもＭ１又はＭ２培地で希釈し、最終濃度が５μＭになるようにウェルに添加した。
【0314】
マイクロプレート１枚を５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターでさらに２４時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）で細胞生存率を評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９６８１）は、製造者の説明書に従って実施した。１５０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）をウェルに添加し、シェーカーで２分間穏やかに混合した。その後、各ウェルの溶液１００μｌをＣｏｒｎｉｎｇ（商標）９６‐Ｗｅｌｌ Ｓｏｌｉｄ Ｗｈｉｔｅ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に移した後、ＲＴで１０分間インキュベートした。その後、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸマイクロプレートリーダーでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏプログラムを使用してプレートを読み取った。
【0315】
もう一方のマイクロプレートには、８日目に希釈したＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ‐３／７ Ｇｒｅｅｎ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号４４４０）とＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号４６３２）を１０μｌ加えた（それぞれ最終濃度５μＭと２．５μＭ）。次いでこれをＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ Ｌｉｖｅ‐Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに入れ、１０倍の対物レンズを用い、１時間ごとに６日間画像化した。カスパーゼ色素は緑色レーザー（３５０ｍｓ）で測定し、サイトトックス色素は赤色レーザー（６５０ｍｓ）で測定した。緑色色素のシグナルは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ２０１６Ｂを用いて解析した。赤色のサイトトックス色素のシグナル（ｃｙｔｏｔｏｘ ｄｙｅ ｓｉｇｎａｌ）は貧弱であったため、このチャンネルでの解析は行わなかった。
【0316】
結果
単球由来マクロファージＭ１及びＭ２マクロファージは、（図８）において表現型が異なって見えた。（Ａ）Ｍ１マクロファージは丸みを帯びていたのに対し、（Ｂ）Ｍ２マクロファージはより細長くなっていた。また、Ｍ２マクロファージはＭ１マクロファージよりも高いコンフルエンスを示し、これはＭ‐ＣＳＦ処理で予想されたことである。細胞生存率は、ＰＢＭＣのアッセイ期間と同じように２４時間後に評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。カンプトテシン及びスタウロスポリンの両方が、未処理細胞と比較して、Ｍ１（図９（Ａ））及びＭ２（図９（Ｂ））マクロファージの生存率を低下させた。スタウロスポリンの効果は顕著であり、生細胞はほとんど又は全く検出されなかった。一方、４１３３‐６２９４ＢＹｂｅ処理細胞は、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ及び未処理ウェルと同様の生存率を示した。
６日間の経過で、有意なレベルのＣａｓｐａｓｅ‐３／７、は、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）処理マクロファージでのみ検出され得た（図１０（Ａ）＆（１０Ｂ））。スタウロスポリン処理マクロファージにおけるシグナルは非常に低く、したがって両方のプロットから除外された。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ処理したＭ１及びＭ２マクロファージにおけるＣａｓｐａｓｅ‐３／７のレベルは、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理及び未処理マクロファージと一致していた。このことは、マクロファージが４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ誘導アポトーシスに対して大きな抵抗性を持っていることを示していた。およそ１６時間後、Ｍ２マクロファージは、すべての処理でＣａｓｐａｓｅ‐３／７レベルの小さなピークを示した。これは、高い細胞密度によって引き起こされるストレスによるものと考えられた。
単球由来マクロファージＭ１及びＭ２マクロファージは、（図８）において表現型が異なって見えた。（Ａ）Ｍ１マクロファージは丸みを帯びていたのに対し、（Ｂ）Ｍ２マクロファージはより細長くなっていた。また、Ｍ２マクロファージはＭ１マクロファージよりも高いコンフルエンスを示し、これはＭ‐ＣＳＦ処理で予想されたことである。細胞生存率は、ＰＢＭＣのアッセイ期間と同じように２４時間後に評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。カンプトテシン及びスタウロスポリンの両方が、未処理細胞と比較して、Ｍ１（図９（Ａ））及びＭ２（図９（Ｂ））マクロファージの生存率を低下させた。スタウロスポリンの効果は顕著であり、生細胞はほとんど又は全く検出されなかった。一方、４１３３‐６２９４ＢＹｂｅ処理細胞は、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ及び未処理ウェルと同様の生存率を示した。
６日間の経過で、有意なレベルのＣａｓｐａｓｅ‐３／７、は、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）処理マクロファージでのみ検出され得た（図１０（Ａ）＆（１０Ｂ））。スタウロスポリン処理マクロファージにおけるシグナルは非常に低く、したがって両方のプロットから除外された。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ処理したＭ１及びＭ２マクロファージにおけるＣａｓｐａｓｅ‐３／７のレベルは、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ処理及び未処理マクロファージと一致していた。このことは、マクロファージが４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ誘導アポトーシスに対して大きな抵抗性を持っていることを示していた。およそ１６時間後、Ｍ２マクロファージは、すべての処理でＣａｓｐａｓｅ‐３／７レベルの小さなピークを示した。これは、高い細胞密度によって引き起こされるストレスによるものと考えられた。
【0317】
例１１‐質量測光
方法
データはＲｅｆｅｙｎＯｎｅＭＰ質量光度計（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）でＡｃｑｕｉｒｅＭＰ（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ、ｖ２．２．１）ソフトウェアを用いて取得し、画像はＤｉｓｃｏｖｅｒＭＰ（ｖ２．３．ｄｅｖ１２）ソフトウェアで処理及び解析した。
測定は、２ｘ２ウェルにカットしたシリコンガスケット（ＣｕｌｔｕｒｅＷｅｌｌ（商標）Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｇａｓｋｅｔｓ、Ｇｒａｃｅ ｂｉｏｌａｂｓ）を取り付けた清潔なガラスカバースリップ（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ、Ｎｏ．１．５、２４×５０ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）を使用して行った。タンパク質ストックは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で直接希釈した。タンパク質複合体の典型的な作業濃度は、タンパク質複合体の解離特性に依存するが、１‐１００ｎＭであった。
方法
データはＲｅｆｅｙｎＯｎｅＭＰ質量光度計（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）でＡｃｑｕｉｒｅＭＰ（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ、ｖ２．２．１）ソフトウェアを用いて取得し、画像はＤｉｓｃｏｖｅｒＭＰ（ｖ２．３．ｄｅｖ１２）ソフトウェアで処理及び解析した。
測定は、２ｘ２ウェルにカットしたシリコンガスケット（ＣｕｌｔｕｒｅＷｅｌｌ（商標）Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｇａｓｋｅｔｓ、Ｇｒａｃｅ ｂｉｏｌａｂｓ）を取り付けた清潔なガラスカバースリップ（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ、Ｎｏ．１．５、２４×５０ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）を使用して行った。タンパク質ストックは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で直接希釈した。タンパク質複合体の典型的な作業濃度は、タンパク質複合体の解離特性に依存するが、１‐１００ｎＭであった。
【0318】
装置のレンズはイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で洗浄し、乾燥させた後、顕微鏡カバースリップとサンプルを光ステージに配置する前に、オリンパス低自動蛍光液浸オイル（ＮＣ０２９７５８９、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１滴レンズに配置した。焦点を見つけるために、１５μｌの新鮮なＤＰＢＳをシリコンウェルにピペッティングし、焦点位置を特定し、測定全体のために全内部反射に基づくオートフォーカスシステムで所定の位置に固定された。各測定において、５μｌの希釈タンパク質をウェルに導入し、十分に混合した後（オートフォーカス安定化前）、９０秒間の動画を記録した。各サンプルは１回ずつ測定し、測定ごとに新しいウェルとバッファーを使用した。ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物はプレインキュベーションされていないため、２つのタンパク質がウェルに加えられると複合化が起こった。
【0319】
結果
（Ａ）ＣＤ４５ ＥＣＤ、（Ｂ）４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、又は（Ｃ）ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物の質量測光シグナルを図１１に示す。ＣＤ４５ ＥＣＤでは、均一な調製物であることを示す単一のピークが観察された（Ａ）。ＣＤ４５ ＥＣＤの予測質量は４１．３ｋＤａであるが、ピークは６２ｋＤａの質量を表していた。Ｎ‐結合型グリコシル化部位が１０箇所あることから、この差はグリコシル化に起因すると思われる（図１２参照）。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ（Ｂ）では７６ｋＤａの質量に相当する単一のピークが観測された。これは、予測される質量７３．５ｋＤａと一致すると考えられた。
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物では、複数のピークが観察された（Ｃ）。７５ｋＤａのピークは、結合していないＢＹｂｅに相当すると思われる。さらに１３６、２７４、４１５、５５５ｋＤａにピークが観察された。ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの複合体の質量は、それぞれ６２ｋＤａと７６ｋＤａという観察された質量から、１３８ｋＤａと予測される。したがって、１３６ｋＤａのピークはＣＤ４５ ＥＣＤ‐４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの複合体に相当する可能性が高い。さらに、２７４、４１５及び５５５ｋＤａのピークは、それぞれＣＤ４５‐ＢＹｂｅ複合体の２コピー、３コピー及び４コピーを含む多量体に帰せられる可能性が高い（表１０）。
（Ａ）ＣＤ４５ ＥＣＤ、（Ｂ）４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、又は（Ｃ）ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物の質量測光シグナルを図１１に示す。ＣＤ４５ ＥＣＤでは、均一な調製物であることを示す単一のピークが観察された（Ａ）。ＣＤ４５ ＥＣＤの予測質量は４１．３ｋＤａであるが、ピークは６２ｋＤａの質量を表していた。Ｎ‐結合型グリコシル化部位が１０箇所あることから、この差はグリコシル化に起因すると思われる（図１２参照）。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ（Ｂ）では７６ｋＤａの質量に相当する単一のピークが観測された。これは、予測される質量７３．５ｋＤａと一致すると考えられた。
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物では、複数のピークが観察された（Ｃ）。７５ｋＤａのピークは、結合していないＢＹｂｅに相当すると思われる。さらに１３６、２７４、４１５、５５５ｋＤａにピークが観察された。ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの複合体の質量は、それぞれ６２ｋＤａと７６ｋＤａという観察された質量から、１３８ｋＤａと予測される。したがって、１３６ｋＤａのピークはＣＤ４５ ＥＣＤ‐４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの複合体に相当する可能性が高い。さらに、２７４、４１５及び５５５ｋＤａのピークは、それぞれＣＤ４５‐ＢＹｂｅ複合体の２コピー、３コピー及び４コピーを含む多量体に帰せられる可能性が高い（表１０）。
【0320】
【表13】
【0321】
例１２‐表面プラズモン共鳴で測定した４１３３及び６２９４Ｆａｂの親和性
方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ‐Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とＨＢＳ‐ＥＰランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いてＢｉａｃｏｒｅ ３０００システムで２５℃にて実施された。ポリクローナルヤギ Ｆ（ａｂ）２フラグメント抗ウサギＦ（ａｂ）２，（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ製品コード＃１１１‐００６‐０４７）とポリクローナルヤギＦ（ａｂ）２フラグメント抗マウスＦ（ａｂ）２，（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ 製品コード＃１１５‐００６‐０７２）によりそれぞれ４１３３ウサギＦａｂ及び６２９４マウスＦａｂを捕捉した。捕捉抗体の共有結合による固定化は、標準的なアミンカップリング化学によって、１０００‐３０００応答単位（ＲＵ）のレベルで達成された。
ＣＤ４５ Ｄ１‐Ｄ４は、５０ｎＭから０．０５ｎＭまで、捕捉精製抗体上で滴定された。各アッセイサイクルは、まず抗体Ｆａｂフラグメントを１０μｌ／ｍｉｎの流速で１分間注入して捕捉し、その後ＣＤ４５ Ｄ１‐Ｄ４を３０μｌ／ｍｉｎの流速で３分間注入して会合相を形成した。続く解離相は少なくとも３分間モニターされた。各サイクルの後、捕捉表面を１０μｌ／分の流速で、４０ｍＭ ＨＣｌを１分間注入し、その後５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間注入して再生させた。ブランクフローセルはリファレンスの減算に使用され、バッファーブランク注入は装置のノイズとドリフトを減算するために含まれた。動態パラメーターはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１．１）を用いて決定された。
方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ‐Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とＨＢＳ‐ＥＰランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いてＢｉａｃｏｒｅ ３０００システムで２５℃にて実施された。ポリクローナルヤギ Ｆ（ａｂ）２フラグメント抗ウサギＦ（ａｂ）２，（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ製品コード＃１１１‐００６‐０４７）とポリクローナルヤギＦ（ａｂ）２フラグメント抗マウスＦ（ａｂ）２，（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ 製品コード＃１１５‐００６‐０７２）によりそれぞれ４１３３ウサギＦａｂ及び６２９４マウスＦａｂを捕捉した。捕捉抗体の共有結合による固定化は、標準的なアミンカップリング化学によって、１０００‐３０００応答単位（ＲＵ）のレベルで達成された。
ＣＤ４５ Ｄ１‐Ｄ４は、５０ｎＭから０．０５ｎＭまで、捕捉精製抗体上で滴定された。各アッセイサイクルは、まず抗体Ｆａｂフラグメントを１０μｌ／ｍｉｎの流速で１分間注入して捕捉し、その後ＣＤ４５ Ｄ１‐Ｄ４を３０μｌ／ｍｉｎの流速で３分間注入して会合相を形成した。続く解離相は少なくとも３分間モニターされた。各サイクルの後、捕捉表面を１０μｌ／分の流速で、４０ｍＭ ＨＣｌを１分間注入し、その後５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間注入して再生させた。ブランクフローセルはリファレンスの減算に使用され、バッファーブランク注入は装置のノイズとドリフトを減算するために含まれた。動態パラメーターはＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１．１）を用いて決定された。
【0322】
結果
４１３３と６２９４Ｆａｂの親和性はそれぞれ６１ｎＭと８５ｐＭであることが実証された。結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）、親和性定数（ＫＤ）を以下の表１１に示す。
４１３３と６２９４Ｆａｂの親和性はそれぞれ６１ｎＭと８５ｐＭであることが実証された。結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）、親和性定数（ＫＤ）を以下の表１１に示す。
【0323】
【表14】
【0324】
例１３‐ヒト化
方法
ウサギ抗体４１３３及びマウス抗体６２９４のヒト化バージョンを、ドナー抗体Ｖ領域からのＣＤＲをヒト生殖細胞抗体Ｖ領域フレームワークにグラフトすることにより設計した。抗体の活性を回復させる可能性を高めるために、ドナーＶ領域からの多くのフレームワーク残基もヒト化配列に保持された。これらの残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体、ＷＯ９１／０９９６７）により概説されたプロトコルを用いて選択された。ドナーからアクセプター配列にグラフトされたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの複合定義が使用されるＣＤＲＨ１を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７）によって定義された通りである（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。さらに、ウサギ抗体のＶＨ遺伝子は、選択されたヒトＶＨアクセプター遺伝子よりも一般的に短い。ヒトのアクセプター配列と並べた場合、ウサギ抗体のＶＨ領域のフレームワーク１は、典型的にＮ末端残基を欠いており、これはヒト化抗体では保持されている。ウサギ抗体のＶＨ領域のフレームワーク３は、ベータシート鎖ＤとＥの間のループに１つ又は２つの残基（７５、又は７５と７６）を欠くのが典型的である。
ヒト化配列及びＣＤＲバリアントは、図１２に示され、以下に説明される。
方法
ウサギ抗体４１３３及びマウス抗体６２９４のヒト化バージョンを、ドナー抗体Ｖ領域からのＣＤＲをヒト生殖細胞抗体Ｖ領域フレームワークにグラフトすることにより設計した。抗体の活性を回復させる可能性を高めるために、ドナーＶ領域からの多くのフレームワーク残基もヒト化配列に保持された。これらの残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体、ＷＯ９１／０９９６７）により概説されたプロトコルを用いて選択された。ドナーからアクセプター配列にグラフトされたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの複合定義が使用されるＣＤＲＨ１を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、１９８７）によって定義された通りである（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｈｕｍａｎｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。さらに、ウサギ抗体のＶＨ遺伝子は、選択されたヒトＶＨアクセプター遺伝子よりも一般的に短い。ヒトのアクセプター配列と並べた場合、ウサギ抗体のＶＨ領域のフレームワーク１は、典型的にＮ末端残基を欠いており、これはヒト化抗体では保持されている。ウサギ抗体のＶＨ領域のフレームワーク３は、ベータシート鎖ＤとＥの間のループに１つ又は２つの残基（７５、又は７５と７６）を欠くのが典型的である。
ヒト化配列及びＣＤＲバリアントは、図１２に示され、以下に説明される。
【0325】
ＣＤ４５ 抗体 ４１３３
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３＋ＪＫ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を抗体４１３３軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。ＣＤＲに加えて、４１３３ ＶＫ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、２、３、及び７０位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、グルタミン（Ｑ２）、バリン（Ｖ３）、及びグルタミン（Ｑ７０）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＬ１は潜在的なＮ‐グリコシル化部位を除去するために変異していてもよい（ＣＤＲＬ１バリアント１‐２）。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３＋ＪＫ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を抗体４１３３軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。ＣＤＲに加えて、４１３３ ＶＫ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、２、３、及び７０位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、グルタミン（Ｑ２）、バリン（Ｖ３）、及びグルタミン（Ｑ７０）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＬ１は潜在的なＮ‐グリコシル化部位を除去するために変異していてもよい（ＣＤＲＬ１バリアント１‐２）。
【0326】
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３‐２１＋ＪＨ１ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）は、抗体４１３３の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、４１３３ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、４８、４９、７１、７３、７６及び７８位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）、スレオニン（Ｔ７６）及びバリン（Ｖ７８）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２は、システイン残基を除去するように変異されていてもよい（それぞれ、ＣＤＲＨ１バリアント及びＣＤＲＨ２バリアント）。ＣＤＲＨ３はまた、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異している場合がある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ４‐４＋ＪＨ１ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体４１３３の重鎖ＣＤＲの代替アクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、４１３３ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、２４、７１、７３、７６、及び７８位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、アラニン（Ａ２４）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）、スレオニン（Ｔ７６）、及びバリン（Ｖ７８）に保持されていてもよい。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）に置換することで、均質な産物の発現と精製を可能にした。場合によっては、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２を変異させてシステイン残基を除去してもよい（それぞれ、ＣＤＲＨ１バリアント及びＣＤＲＨ２バリアント）。ＣＤＲＨ３はまた、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異している場合がある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ４‐４＋ＪＨ１ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体４１３３の重鎖ＣＤＲの代替アクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、４１３３ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、２４、７１、７３、７６、及び７８位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、アラニン（Ａ２４）、リジン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）、スレオニン（Ｔ７６）、及びバリン（Ｖ７８）に保持されていてもよい。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）に置換することで、均質な産物の発現と精製を可能にした。場合によっては、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２を変異させてシステイン残基を除去してもよい（それぞれ、ＣＤＲＨ１バリアント及びＣＤＲＨ２バリアント）。ＣＤＲＨ３はまた、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異している場合がある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
【0327】
ＣＤ４５抗体６２９４
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ‐３３＋ＪＫ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体６２９４軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＫ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が４９、６３、６７、８５及び８７位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、フェニルアラニン（Ｆ４９）、スレオニン（Ｔ６３）、チロシン（Ｙ６７）、バリン（Ｖ８５）、及びフェニルアラニン（Ｆ８７）に保持されていてもよい。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ‐３３＋ＪＫ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体６２９４軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＫ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が４９、６３、６７、８５及び８７位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、フェニルアラニン（Ｆ４９）、スレオニン（Ｔ６３）、チロシン（Ｙ６７）、バリン（Ｖ８５）、及びフェニルアラニン（Ｆ８７）に保持されていてもよい。
【0328】
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ４‐１＋ＪＫ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を抗体６２９４軽鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択した。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＫ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が４９、６３、６７、８７位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、フェニルアラニン（Ｆ４９）、スレオニン（Ｔ６３）、及びフェニルアラニン（Ｆ８７）に保持されていてもよい。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ１‐６９＋ＪＨ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体６２９４の重鎖ＣＤＲの代替アクセプターとして選択した。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、１、４８及び７３位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、グルタミン酸（Ｅ１）、イソロイシン（Ｉ４８）及びリジン（Ｋ７３）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＨ３は潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異していることがある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３‐４８＋ＪＨ４Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体６２９４の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、４８、４９、７１、７３及び７６位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、アラニン（Ａ７１）、リジン（Ｋ７３）、及びセリン（Ｓ７６）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＨ３は潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異していることがある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ１‐６９＋ＪＨ４ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体６２９４の重鎖ＣＤＲの代替アクセプターとして選択した。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、１、４８及び７３位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、グルタミン酸（Ｅ１）、イソロイシン（Ｉ４８）及びリジン（Ｋ７３）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＨ３は潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異していることがある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３‐４８＋ＪＨ４Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）が、抗体６２９４の重鎖ＣＤＲのアクセプターとして選択された。ＣＤＲに加えて、６２９４ＶＨ遺伝子からの以下のフレームワーク残基（ドナー残基）の１つ以上が、４８、４９、７１、７３及び７６位（Ｋａｂａｔ番号付け）：それぞれ、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、アラニン（Ａ７１）、リジン（Ｋ７３）、及びセリン（Ｓ７６）に保持されていてもよい。場合によっては、ＣＤＲＨ３は潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するために変異していることがある（ＣＤＲＨ３バリアント１‐３）。
【0329】
例１４ 抗ＣＤ４５抗体により誘導された末梢血造血幹細胞のアポトーシス
方法
ヒト全血（Ｋ２ＥＤＴＡチューブ）を、１人の１８歳のドナーから受け取った（＃ＰＲ２０Ｔ３８６５０５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫから）。全血からＰＢＭＣを予め充填したＬｅｕｃｏＳｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いて単離した。全血をＬｅｕｃｏＳｅｐフィルターに重ね、チューブをスピンさせた（８００ｇ、１５分、低速加速・減速、ＲＴ）。バフィーコートを抽出し、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣを５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させた。細胞はＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用してカウントした。次に、８０μｌのウェル当たり１ｘ１０６個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙを、１０００ｎＭのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度を与えるために完全培地に添加した。同様に、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅの１０００ｎＭストックを完全培地中に調製した。マイクロプレートは３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬を完全培地で半対数希釈系列で連続的に７回希釈し、８点用量曲線を作成した。
方法
ヒト全血（Ｋ２ＥＤＴＡチューブ）を、１人の１８歳のドナーから受け取った（＃ＰＲ２０Ｔ３８６５０５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫから）。全血からＰＢＭＣを予め充填したＬｅｕｃｏＳｅｐチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いて単離した。全血をＬｅｕｃｏＳｅｐフィルターに重ね、チューブをスピンさせた（８００ｇ、１５分、低速加速・減速、ＲＴ）。バフィーコートを抽出し、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣを５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁させた。細胞はＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用してカウントした。次に、８０μｌのウェル当たり１ｘ１０６個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐Ｘ及びＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙを、１０００ｎＭのＦａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度を与えるために完全培地に添加した。同様に、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅの１０００ｎＭストックを完全培地中に調製した。マイクロプレートは３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ及びＢＹｂｅ試薬を完全培地で半対数希釈系列で連続的に７回希釈し、８点用量曲線を作成した。
【0330】
各Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ又はＢＹｂｅ希釈液２０μｌ（最終ウェル濃度２００～０．００６３２ｎＭ）を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機でバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し洗浄し、次いで再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残留培地に残留させた。２０μｌの細胞特異的マーカー抗体カクテル溶液をウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。抗体カクテルの詳細は以下の表１２に記載されている。洗浄と吸引のステップを繰り返し、細胞を２０μｌの残量に残した。次に、１０００分の１希釈のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ‐ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色し、４℃で１０分間インキュベートした。洗浄と吸引のステップを繰り返し、２０μｌの残量に細胞を残した。１００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、４℃で１５分間、細胞を固定した。洗浄と吸引のステップを繰り返し、ＦＡＣＳ取得のための最終体積をウェルあたり２００μｌに調整した。
Ｂｉｏ‐Ｒａｄ ＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、細胞を分析した。細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。造血幹細胞は、リンパ球系列陰性、ＣＤ４５陽性、ＣＤ３４陽性集団として定義された。
Ｂｉｏ‐Ｒａｄ ＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、細胞を分析した。細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。造血幹細胞は、リンパ球系列陰性、ＣＤ４５陽性、ＣＤ３４陽性集団として定義された。
【0331】
【表15】
【0332】
結果
６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによるＰＢＭＣ中のＣＤ３４＋幹細胞への影響を図１３に示す。両試薬とも、幹細胞はそれぞれ５４％、５３％と有意に減少した（（Ａ）＆（Ｂ））。ＰＢＭＣにおける以前の実験と同様に、総リンパ球ではそれぞれ９９％及び９８％の減少が観察された（（Ｃ）＆（Ｄ））。ＣＤ３４＋幹細胞の開始時の数は、全リンパ球が約３０万個であるのに対して、およそ２５０個であったことに注意しなければならない。循環幹細胞は非常に低いレベルで存在することが知られているので、これは予想されたことであった。
６２９４‐Ｘ／４１３３‐Ｙ及び４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅによるＰＢＭＣ中のＣＤ３４＋幹細胞への影響を図１３に示す。両試薬とも、幹細胞はそれぞれ５４％、５３％と有意に減少した（（Ａ）＆（Ｂ））。ＰＢＭＣにおける以前の実験と同様に、総リンパ球ではそれぞれ９９％及び９８％の減少が観察された（（Ｃ）＆（Ｄ））。ＣＤ３４＋幹細胞の開始時の数は、全リンパ球が約３０万個であるのに対して、およそ２５０個であったことに注意しなければならない。循環幹細胞は非常に低いレベルで存在することが知られているので、これは予想されたことであった。
【0333】
例１５‐沈降速度
方法
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅをモル比で１：１に混合し、室温で１時間インキュベートした。モル比は、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの予測質量７３．５ｋＤａと、質量測光で求めたＣＤ４５ ＥＣＤの質量６２ｋＤａを用いて決定した。
ＣＤ４５ ＥＣＤ‐４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ混合物、ＣＤ４５ ＥＣＤのみ、又は ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅのみを、光路長１２ｍｍの２チャンネルチャコールエポン・センターピースと石英ガラス窓を備えたセルにロードした。対応するバッファーは、各セルのリファレンスチャンネルにロードされた（装置はデュアルビーム分光器のように機能する）。それらのロードされたセルを次にＡＮ‐６０Ｔｉ分析用ローターに入れ、Ｂｅｃｋｍａｎ‐ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ分析用超遠心機に装填し、２０℃にした。その後、ローターを３，０００ｒｐｍにし、サンプルを２８０ｎｍでスキャンして、細胞の装填が適切であることと、レーザーの遅延設定により、レーザーが適切に調整されていることを確認した。その後、ローターを５０，０００ｒｐｍの最終回転速度まで回転させた。スキャンは２０秒ごとに８時間記録された。ラジアルスキャンは５．７５ｃｍから７．２５ｃｍの範囲であった。
方法
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅをモル比で１：１に混合し、室温で１時間インキュベートした。モル比は、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの予測質量７３．５ｋＤａと、質量測光で求めたＣＤ４５ ＥＣＤの質量６２ｋＤａを用いて決定した。
ＣＤ４５ ＥＣＤ‐４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ混合物、ＣＤ４５ ＥＣＤのみ、又は ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅのみを、光路長１２ｍｍの２チャンネルチャコールエポン・センターピースと石英ガラス窓を備えたセルにロードした。対応するバッファーは、各セルのリファレンスチャンネルにロードされた（装置はデュアルビーム分光器のように機能する）。それらのロードされたセルを次にＡＮ‐６０Ｔｉ分析用ローターに入れ、Ｂｅｃｋｍａｎ‐ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ分析用超遠心機に装填し、２０℃にした。その後、ローターを３，０００ｒｐｍにし、サンプルを２８０ｎｍでスキャンして、細胞の装填が適切であることと、レーザーの遅延設定により、レーザーが適切に調整されていることを確認した。その後、ローターを５０，０００ｒｐｍの最終回転速度まで回転させた。スキャンは２０秒ごとに８時間記録された。ラジアルスキャンは５．７５ｃｍから７．２５ｃｍの範囲であった。
【0334】
データは、Ｎ．Ｉ．ＨのＰｅｔｅｒ Ｓｈｕｃｋが開発し、彼の解析プログラムＳＥＤＦＩＴバージョン１４．６ｅに実装されているｃ（ｓ）メソッドを用いて解析された。この手法では、多くの生データを直接スキャンして（今回は各サンプルに３６，０００のデータポイント）、沈降係数の分布を導き出すとともに、分解能を高めるためにデータへの拡散の影響をモデル化している。この方法は、すべての種が同じ流体力学的形状（球体に対する摩擦係数ｆ／ｆ０によって定義される形状）を持っているという仮定に基づいて、沈降係数の各値に拡散係数を割り当てることによって機能する。ｆ／ｆ０の値は、各サンプルのデータの全体的な適合度が最も高くなるように変化させた。最大エントロピー正則化確率０．９５を使用し、時間不変のノイズを除去した。解析は、標準溶媒モデルを用いて行った。
【0335】
結果
ＣＤ４５ ＥＣＤモノマー、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅモノマー、ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅのモル比１：１混合物の分析用超遠心機で測定した沈降速度を図１４に示す。ＣＤ４５ ＥＣＤの沈降係数の値は３．５４７で、５８ｋＤａの質量を与えた。これは、ＣＤ４５ ＥＣＤの予測質量４１．３ｋＤａより大きいが、例１１の質量測光で観測された質量（６２ｋＤａ）とほぼ一致する。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの沈降係数の値は４．３９５で、７２ｋＤａの質量を示した。これは、予測される質量７３．５ｋＤａと一致する。
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物には複数のピークが観察され、ＣＤ４５ ＥＣＤ‐ＢＹｂｅの多量体複合体の存在が示唆された。この複合体を特定するために、ＣＤ４５ ＥＣＤ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ５ＦＭＶ）と４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの結晶構造からモデルを作成し（ＦａｂとｓｃＦｖの個々の自社結晶構造からモデリング）、これらを粗粒で複合化させた。これらの構造から抽出された流体力学パラメーターから計算されたＳ値は、我々の観測データと許容誤差（±０．５秒）で対応することがわかった。このことから、複合体の化学量論は自信を持って割り出すことができると結論した（表１３）。
ＣＤ４５ ＥＣＤモノマー、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅモノマー、ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅのモル比１：１混合物の分析用超遠心機で測定した沈降速度を図１４に示す。ＣＤ４５ ＥＣＤの沈降係数の値は３．５４７で、５８ｋＤａの質量を与えた。これは、ＣＤ４５ ＥＣＤの予測質量４１．３ｋＤａより大きいが、例１１の質量測光で観測された質量（６２ｋＤａ）とほぼ一致する。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの沈降係数の値は４．３９５で、７２ｋＤａの質量を示した。これは、予測される質量７３．５ｋＤａと一致する。
ＣＤ４５ ＥＣＤと４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの混合物には複数のピークが観察され、ＣＤ４５ ＥＣＤ‐ＢＹｂｅの多量体複合体の存在が示唆された。この複合体を特定するために、ＣＤ４５ ＥＣＤ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ５ＦＭＶ）と４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの結晶構造からモデルを作成し（ＦａｂとｓｃＦｖの個々の自社結晶構造からモデリング）、これらを粗粒で複合化させた。これらの構造から抽出された流体力学パラメーターから計算されたＳ値は、我々の観測データと許容誤差（±０．５秒）で対応することがわかった。このことから、複合体の化学量論は自信を持って割り出すことができると結論した（表１３）。
【0336】
【表16】
【0337】
トレースの曲線下面積を計算すると（表１４）、この混合物は主に２ｘＣＤ４５‐ＢＹｂｅが３７．７％、３ｘＣＤ４５‐ＢＹｂｅが３５．７％で構成されていることが示された。
【0338】
【表17】
【0339】
例１６‐ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及びＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨの製造
方法
抗ＣＤ４５抗体４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ・イン・ホールを生成するために、抗体４１３３及び６２９４のそれぞれの軽鎖及び重鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を自動合成法（ＡＴＵＭ）により設計及び構築した。抗体４１３３及び６２９４の軽Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣκ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。抗体４１３３の重Ｖ‐領域遺伝子を、ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）又はＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３５５Ｗ）定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。抗体６２９４の重Ｖ‐領域遺伝子を、ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホール（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。
４１３３軽鎖コンストラクトは４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ重鎖コンストラクトとペアにした。６２９４軽鎖コンストラクトは６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホールコンストラクトとペアにした。このＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従ってＣＨＯ‐ＳＸＥ細胞にトランスフェクションした。この細胞を３２℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するインキュベーターで１１日間培養した。培養後、培養液をチューブに移し、４０００ｒｐｍで２時間遠心分離した後、細胞から上清を分離した。保持した上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
方法
抗ＣＤ４５抗体４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ・イン・ホールを生成するために、抗体４１３３及び６２９４のそれぞれの軽鎖及び重鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を自動合成法（ＡＴＵＭ）により設計及び構築した。抗体４１３３及び６２９４の軽Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣκ領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。抗体４１３３の重Ｖ‐領域遺伝子を、ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）又はＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３５５Ｗ）定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。抗体６２９４の重Ｖ‐領域遺伝子を、ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホール（ヒトＩｇＧ４配列＋Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）定常領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにクローニングした。
４１３３軽鎖コンストラクトは４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ重鎖コンストラクトとペアにした。６２９４軽鎖コンストラクトは６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホールコンストラクトとペアにした。このＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従ってＣＨＯ‐ＳＸＥ細胞にトランスフェクションした。この細胞を３２℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するインキュベーターで１１日間培養した。培養後、培養液をチューブに移し、４０００ｒｐｍで２時間遠心分離した後、細胞から上清を分離した。保持した上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
【0340】
抗体４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ及び６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホールは、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の５ｍｌ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、製造者の指示に従って上清から精製された。溶出したタンパク質の画分を合わせ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ‐５０メンブレン５０ｋＤａ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５ 遠心フィルターユニットで５ｍｌ未満に濃縮した。清浄な画分を得るために、タンパク質は次にＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通された。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を使用して決定した。
４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ・イン・ホールを生成するために、精製した４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ及び６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホールタンパク質を１：１のモル比で組み合わせ、Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度５ｍＭとなるように加え、その後混合物を室温で一晩インキュベートした。次に、この混合物を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通した。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を使用して決定した。さらに、分画はＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＳＥＣ Ｓｙｓｔｅｍ上のＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ２００カラムを用い、４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシンゲル上のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された。エンドトキシンは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＭＣＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いて検査された。
４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ・イン・ホールを生成するために、精製した４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ及び６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホールタンパク質を１：１のモル比で組み合わせ、Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を最終濃度５ｍＭとなるように加え、その後混合物を室温で一晩インキュベートした。次に、この混合物を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム上のＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ ２６／６０ ＨＰＬＣサイズ排除カラムに通した。タンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（カタログ番号ＮＤ‐２０００）を使用して決定した。さらに、分画はＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＳＥＣ Ｓｙｓｔｅｍ上のＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ２００カラムを用い、４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシンゲル上のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって分析された。エンドトキシンは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ ｎｅｘｇｅｎ‐ＭＣＳシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を用いて検査された。
【0341】
例１７‐ＢＹｂｅ、ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ、及びＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨとしてフォーマットされた抗ＣＤ４５抗体によって誘導されたＰＢＭＣのアポトーシス
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣは、凍結アリコートとしてバンクされた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞バイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、８０μｌのウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８１１及び８３１からのＰＢＭＣを使用した。
４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨ、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの２５００ｎＭのストックを完全培地中で調製した。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合型マイクロプレートで、試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回希釈した。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣは、凍結アリコートとしてバンクされた。アッセイを行う前に、１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞バイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、８０μｌのウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８１１及び８３１からのＰＢＭＣを使用した。
４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨ、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの２５００ｎＭのストックを完全培地中で調製した。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合型マイクロプレートで、試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回希釈した。
【0342】
各希釈液２０μｌ（最終濃度５００‐０．００６４ｎＭ）を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５ マイクロプレートウォッシャーでバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し洗浄後、再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残液として残置した。２０μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ‐ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００ 希釈）をウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、ＥＣ５０値を導出した。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、ＥＣ５０値を導出した。
【0343】
結果
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８１１）に対する４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡによるリンパ球の減少％を図１５に示す。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨはそれぞれＥＣ５０が０．１０ｎＭ及び０．１７ｎＭと、いずれも非常に強力な活性を示した。一方、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡのＥＣ５０は４４ｎＭであった。
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８１１）に対する４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡによるリンパ球の減少％を図１５に示す。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨはそれぞれＥＣ５０が０．１０ｎＭ及び０．１７ｎＭと、いずれも非常に強力な活性を示した。一方、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡのＥＣ５０は４４ｎＭであった。
【0344】
例１８‐抗ＣＤ４５抗体の組み合わせにより誘導されたＰＢＭＣのアポトーシス
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、各々１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞バイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて先にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから提供された、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し，再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、８０μｌのウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８１１と８３１からのＰＢＭＣをこのアッセイに使用した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙを完全培地に加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度１２５０ｎＭとした。完全培地中の４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの１２５０ｎＭのストックを調製し、６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙと等モル比で混合し、最終抗体濃度２５００ｎＭとした。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの２５００ｎＭのストックも完全培地中で調製した。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートで、試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回希釈した。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）由来のヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、各々１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞バイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、すべて先にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから提供された、及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し，再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、８０μｌのウェル当たり１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静止させた。２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ ８１１と８３１からのＰＢＭＣをこのアッセイに使用した。
Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートにおいて、Ｆａｂ‐ＸとＦａｂ‐Ｙの組み合わせ６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙを完全培地に加え、Ｆａｂ‐ＫＤ‐Ｆａｂ濃度１２５０ｎＭとした。完全培地中の４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの１２５０ｎＭのストックを調製し、６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙと等モル比で混合し、最終抗体濃度２５００ｎＭとした。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの２５００ｎＭのストックも完全培地中で調製した。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートで、試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回希釈した。
【0345】
各希釈液２０μｌ（最終濃度５００‐０．００６４ｎＭ）を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５ マイクロプレートウォッシャーでバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁し洗浄後、再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残液として残置した。２０μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ‐ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（固定式近赤外死細胞染色剤）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００希釈）をウェルに添加し、４℃で１０分間インキュベートした。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、ＥＣ５０値を導出した。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳを使用して、細胞をライブで分析した。生細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、ＥＣ５０値を導出した。
【0346】
結果
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８１１）に対する４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの組み合わせによるリンパ球の減少％を図１６に示す。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅは０．１０ｎＭという非常に強力なＥＣ５０を示した。一方、４１３３ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡのＥＣ５０は４４ｎＭであった。４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡと６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙの組み合わせの効力は、４６ｎＭで４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ単独の効力と同様であった。
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８１１）に対する４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ及び４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡの組み合わせによるリンパ球の減少％を図１６に示す。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅは０．１０ｎＭという非常に強力なＥＣ５０を示した。一方、４１３３ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡのＥＣ５０は４４ｎＭであった。４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡと６２９４‐Ｘ／６２９４‐Ｙの組み合わせの効力は、４６ｎＭで４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ単独の効力と同様であった。
【0347】
例１９ ＴｒＹｂｅの製造
方法
４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅを生成するために、重鎖の全長（４１３３ Ｆａｂ ＨＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐６２９４ ｓｃＦｖ）及び軽鎖の全長（４１３３ Ｆａｂ ＬＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐６４５ ｓｃＦｖ）を自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）によって設計及び構築した。両鎖は社内の哺乳類発現ベクターにクローニングされた。６４５は、ヒト及びマウス血清アルブミンに同様の親和性で結合する（ＷＯ２０１１／０３６４６０、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１３／０６８５７１）。それは、ＴｒＹｂｅの血清半減期を延長させる。
重鎖及び軽鎖の構築物をペアにして、Ｇｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従って、ＣＨＯ‐ＳＸＥ細胞にトランスフェクトした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するインキュベーターで７日間培養した。培養後、培養液をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。保持した上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
方法
４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅを生成するために、重鎖の全長（４１３３ Ｆａｂ ＨＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐６２９４ ｓｃＦｖ）及び軽鎖の全長（４１３３ Ｆａｂ ＬＣ‐Ｇ４Ｓリンカー‐６４５ ｓｃＦｖ）を自動合成アプローチ（ＡＴＵＭ）によって設計及び構築した。両鎖は社内の哺乳類発現ベクターにクローニングされた。６４５は、ヒト及びマウス血清アルブミンに同様の親和性で結合する（ＷＯ２０１１／０３６４６０、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１３／０６８５７１）。それは、ＴｒＹｂｅの血清半減期を延長させる。
重鎖及び軽鎖の構築物をペアにして、Ｇｉｂｃｏ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ２９１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の指示に従って、ＣＨＯ‐ＳＸＥ細胞にトランスフェクトした。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２、１４０ｒｐｍで振盪するインキュベーターで７日間培養した。培養後、培養液をチューブに移し、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、上清を細胞から分離した。保持した上清を０．２２μｍ ＳＡＲＴＯ ＢＲＡＮ Ｐ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄフィルターでろ過した。
【0348】
４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅタンパク質は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、天然タンパク質Ｇキャプチャステップ、次いで調製サイズ排除ポリッシングステップで精製した。清澄化した上清を５０ｍｌ Ｇａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｒｅｓｉｎ Ｃｙｔｉｖａ、社内で充填したカラム）にロードし、２５分の接触時間を与え、２．５ｘカラム体積のＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。ＵＶ測定値＞２５ｍＡＵの洗浄画分を分画により回収した。結合した物質を０．１Ｍグリシン ｐＨ２．７ ステップ溶出で溶出し、分画し、２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で中和した。洗浄物質と溶出物質の両方を２８０ｎｍの吸光度によって定量した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ‐ＵＰＬＣ）を用いて、洗浄試料と溶出物の両方の純度状態を決定した。タンパク質（～３μｇ）をＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤｘ３００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ）にロードし、０．２Ｍリン酸 ｐＨ７のアイソクラティックグラジェントで０．３５ｍＬ／分で展開した。連続検出は２８０ｎｍの吸光度及びマルチチャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）により行った。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ‐ＵＰＬＣ）を用いて、洗浄試料と溶出物の両方の純度状態を決定した。タンパク質（～３μｇ）をＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤｘ３００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ）にロードし、０．２Ｍリン酸 ｐＨ７のアイソクラティックグラジェントで０．３５ｍＬ／分で展開した。連続検出は２８０ｎｍの吸光度及びマルチチャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）により行った。
【0349】
ＴｒＹｂｅモノマーを含む洗浄画分と溶出画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５濃縮器（３０ｋＤａ分子量カット膜）及びスイングアウトローターで４０００ｇでの遠心分離を用いて濃縮した。濃縮したサンプルをＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４のアイソクラティックグラジェントで１ｍｌ／分で展開した。画分を回収し、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤｘ３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）でサイズ排除クロマトグラフィーにより分析し、０．２Ｍリン酸 ｐＨ７のアイソクラティックグラジェントで０．３５ｍＬ／分で展開し、２８０ｎｍの吸光度、マルチチャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）で検出した。選択したモノマー画分をプールし、０．２２μｍの滅菌ろ過を行い、最終サンプルはＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０ ＵＶ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＡ２８０スキャニングで濃度測定した。エンドトキシンレベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）テストカートリッジを使用したＣｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒのＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ によって評価され、１．０ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【0350】
最終的なＴｒＹｂｅのモノマー状態は、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍＩＤｘ３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、０．２Ｍリン酸 ｐＨ７のアイソクラティックグラジェントにより０．３５ｍＬ／分で展開し、２８０ｎｍでの吸光度とマルチチャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）により検出した。最終的なＴｒＹｂｅ抗体は＞９９％の単量体であることが確認された。
ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）による分析のために、４ｘＮｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０Ｘ ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ Ｎ‐エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を～３μｇ精製タンパク質に加えてサンプルを作成し、３分間９８℃に加熱した。サンプルを１５ウェルＮｏｖｅｘ ４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシン １．０ｍｍ ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、Ｔｒｉｓ‐グリシンＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて ２２５Ｖ、４０分の一定電圧で分離した。標準品としてＮｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２ ｗｉｄｅ‐ｒａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｉｎ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）による分析のために、４ｘＮｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０Ｘ ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ Ｎ‐エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を～３μｇ精製タンパク質に加えてサンプルを作成し、３分間９８℃に加熱した。サンプルを１５ウェルＮｏｖｅｘ ４‐２０％Ｔｒｉｓ‐グリシン １．０ｍｍ ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードし、Ｔｒｉｓ‐グリシンＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて ２２５Ｖ、４０分の一定電圧で分離した。標準品としてＮｏｖｅｘ Ｍａｒｋ１２ ｗｉｄｅ‐ｒａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｉｎ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
【0351】
例２０‐ＴｒＹｂｅ、ＢＹｂｅ及びＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨとしてフォーマットされた抗ＣＤ４５抗体によって誘導されたＰＢＭＣのアポトーシス
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、各々１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞のバイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し，再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、１００μｌ中のウェル当たり１０５個の細胞を、コーニングＣｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ８０２と８１２からのＰＢＭＣを使用した。
方法
血液白血球血小板アフェレーシスコーン（ＮＨＳＢＴ Ｏｘｆｏｒｄ）から得られたヒトＰＢＭＣを、凍結アリコートとしてバンクに保管した。アッセイを行う前に、各々１ｍｌ中に５×１０７個の細胞を含む凍結細胞のバイアル２本を３７℃の水浴で解凍し、次いで５０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、３０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し，再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。次に、１００μｌ中のウェル当たり１０５個の細胞を、コーニングＣｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間静止させた。このアッセイには、２人のドナー、ＵＣＢ‐Ｃｏｎｅ８０２と８１２からのＰＢＭＣを使用した。
【0352】
４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨの２５００ｎＭのストックが完全培地で調製された。次いで、Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ウェル非結合マイクロプレートで、試薬を完全培地で３．５分の１の希釈系列で１１回連続希釈し、１２点の用量曲線を作成した。２０μｌの各試薬希釈液（最終ウェル濃度５００‐０．０００５１８ｎＭ）を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５マイクロプレート洗浄機でバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁して洗浄し、次いで再スピンしてバッファーを吸引し細胞を２０μｌ残存培地に残留させた。２０μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ‐ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００希釈）をウェルに添加し、４℃で１０分間インキュベートした。Ｂｉｏ‐Ｒａｄ ＺＥ５ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて細胞を分析した。細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、ＥＣ５０値を導き出した。
【0353】
結果
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８０２）に対する４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨによるリンパ球の減少％を図１７に示す。４１３３‐６２９４ ＴｒＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３ ‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨは、ＥＣ５０値がそれぞれ０．３５ｎＭ、０．１５ｎＭ及び０．０９ｎＭと同様に強力な活性を持っていた。
代表的なドナー（ＵＣＢ Ｃｏｎｅ‐８０２）に対する４１３３‐６２９４‐６４５ ＴｒＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ、及び４１３３‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨによるリンパ球の減少％を図１７に示す。４１３３‐６２９４ ＴｒＹｂｅ、４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及び４１３３ ‐６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ ＫｉＨは、ＥＣ５０値がそれぞれ０．３５ｎＭ、０．１５ｎＭ及び０．０９ｎＭと同様に強力な活性を持っていた。
【0354】
例２１‐抗ＣＤ４５ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された細胞株のアポトーシス
方法
ＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）で分類された、様々な白血病及びリンパ腫を代表する以下の細胞株を使用した。Ｊｕｒｋａｔ‐急性Ｔ細胞白血病、ＣＣＲＦ‐ＳＢ‐Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ＭＣ１１６‐Ｂ細胞未分化リンパ腫、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫のまれな型）、ＳＵ‐ＤＨＬ‐４、ＳＵ‐ＤＨＬ‐５、ＳＵ‐ＤＨＬ‐８、ＮＵ‐ＤＵＬ‐１、ＯＣＩ‐Ｌｙ３‐びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＴＨＰ‐１‐急性単球性白血病、及びＤａｋｉｋｉ‐Ｂ細胞鼻咽腔がン腫。
アッセイを行う前に、上記の細胞株の各１バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、次いで２０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、２０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。各細胞株の６ｘ１０６個の細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、４．８ｍｌの完全培地に再懸濁させた。次に、８０μｌ中の１ｘ１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静置した。
方法
ＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）で分類された、様々な白血病及びリンパ腫を代表する以下の細胞株を使用した。Ｊｕｒｋａｔ‐急性Ｔ細胞白血病、ＣＣＲＦ‐ＳＢ‐Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ＭＣ１１６‐Ｂ細胞未分化リンパ腫、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ‐Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫のまれな型）、ＳＵ‐ＤＨＬ‐４、ＳＵ‐ＤＨＬ‐５、ＳＵ‐ＤＨＬ‐８、ＮＵ‐ＤＵＬ‐１、ＯＣＩ‐Ｌｙ３‐びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＴＨＰ‐１‐急性単球性白血病、及びＤａｋｉｋｉ‐Ｂ細胞鼻咽腔がン腫。
アッセイを行う前に、上記の細胞株の各１バイアルを３７℃の水浴中で解凍し、次いで２０ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから以前に供給、＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、２０ｍｌの完全培地に再懸濁させて洗浄し、再度スピンした。細胞を１０ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いでＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ‐３０００を使用して計数した。各細胞株の６ｘ１０６個の細胞をスピンし（５００ｇ、５分、ＲＴ）、４．８ｍｌの完全培地に再懸濁させた。次に、８０μｌ中の１ｘ１０５個の細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル、細胞培養処理、Ｕ字底マイクロプレート（カタログ番号０７‐２００‐９５）の各ウェルに添加した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２時間静置した。
【0355】
４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ及びＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅの２５００ｎＭの完全培地中のストックを調製した。Ｇｒｅｉｎｅｒ９６ウェル非結合マイクロプレートで、両試薬を完全培地で５分の１に連続希釈し、８ポイントの用量曲線を形成するために７回希釈した。各希釈液２０μｌ（最終ウェル濃度５００‐０．００６４ｎＭ）を細胞に添加した。各濃度は、３連で作製した。アポトーシスのポジティブコントロールとして、カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）（カタログ番号Ｃ９９１１‐１００ＭＧ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びスタウロスポリン（Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）（カタログ番号Ｓ６９４２‐２００ＵＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。両者とも完全培地で希釈し、最終濃度５μＭとなるようにウェルに添加した。追加のポジティブコントロールには、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ、ＦＤＡにより条件付けレジメンでの使用に適応）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０、ＦＤＡにより非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ性白血病に適応）及びカンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（抗ＣＤ５２、ＦＤＡによりＢ細胞慢性リンパ性白血病に適応）などがあった。抗胸腺細胞グロブリン、リツキシマブ及びカンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）は、それぞれ最終濃度が２００μｇ／ｍｌ、５００ｎＭ及び２００μｇ／ｍｌとなるようにウェルに添加した。コントロールの各濃度は、２回だけ複製したＪｕｒｋａｔを除いて、３回複製で製造された。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２で２１時間インキュベートした。
【0356】
インキュベーション後、プレートを５００ｇ、５分、ＲＴでスピンし、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５ マイクロプレートウォッシャーでバッファーを吸引し、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁して洗浄し、次いで再スピンしてバッファーを吸引して細胞を２０μｌ残液で残留させた。２０μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ‐ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１０００希釈）をウェルに添加し、４℃で１０分間インキュベートした。Ｂｉｏ‐Ｒａｄ ＺＥ５ セルアナライザーを用いて細胞を分析した。細胞数はメトリクスとして抽出され、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．１（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いてグラフ化された。Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ Ｔｙｐｅ ＨｉｌｌＳｌｏｐｅを「Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｑｕａｌ ｔｏ １」（１に等しい定数）に設定した非対称（５パラメータ）カーブフィッティングを適用し、最適なフィットを得て、細胞の最大減少量とＥＣ５０値を導出した。
【0357】
結果
４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された、Ｊｕｒｋａｔ（９９．２７％）、ＣＣＲＦ‐ＳＢ（８３．４０％）、ＯＣＩ‐Ｌｙ３（３９．８４％）、ＴＨＰ‐１（６０．７２％）及びＤａｋｉｋｉ（７６．３７％）細胞の最大減少率は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるそれぞれ６．５２％、５９．８７％、１９．０５％、２３．１２％及び５８．５５％、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）によるそれぞれ５．６４％、２４．８６％、６．７２％、１５．４０％及び８．８３％よりも、有意に大きかった（表１５、図１８、図１９）。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された、ＭＣ１１６（９９．４５％）、Ｒａｊｉ（７４．０２％）、及びＲａｍｏｓ（９６．１１％）細胞の最大減少率は、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）によるそれぞれ７０．２４％、３６．００％、３９．４０％より有意に大きく、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるそれぞれ９８．１３％、８７．８９％、９１．０５％と同様であった。ＳＵ‐ＤＨＬ‐８の４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された最大減少率（１６．７７％）は，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによる１５．２５％，カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）による７．９７％と同程度であった。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅは、ＳＵ‐ＤＨＬ‐４（９１．８８％）とＳＵ‐ＤＨＬ‐５（９１．０１％）という有意な減少を誘導したが、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅでもそれぞれ３２．０９％と２５．６３％の減少を誘導した。ＮＵ‐ＤＨＬ‐１の４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された最大減少率（４４．８７％）は，リツキシマブの８７．０４％、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）の６７．４９％よりも低かった．
４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された、Ｊｕｒｋａｔ（９９．２７％）、ＣＣＲＦ‐ＳＢ（８３．４０％）、ＯＣＩ‐Ｌｙ３（３９．８４％）、ＴＨＰ‐１（６０．７２％）及びＤａｋｉｋｉ（７６．３７％）細胞の最大減少率は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるそれぞれ６．５２％、５９．８７％、１９．０５％、２３．１２％及び５８．５５％、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）によるそれぞれ５．６４％、２４．８６％、６．７２％、１５．４０％及び８．８３％よりも、有意に大きかった（表１５、図１８、図１９）。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された、ＭＣ１１６（９９．４５％）、Ｒａｊｉ（７４．０２％）、及びＲａｍｏｓ（９６．１１％）細胞の最大減少率は、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）によるそれぞれ７０．２４％、３６．００％、３９．４０％より有意に大きく、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによるそれぞれ９８．１３％、８７．８９％、９１．０５％と同様であった。ＳＵ‐ＤＨＬ‐８の４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された最大減少率（１６．７７％）は，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂによる１５．２５％，カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）による７．９７％と同程度であった。４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅは、ＳＵ‐ＤＨＬ‐４（９１．８８％）とＳＵ‐ＤＨＬ‐５（９１．０１％）という有意な減少を誘導したが、ＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅでもそれぞれ３２．０９％と２５．６３％の減少を誘導した。ＮＵ‐ＤＨＬ‐１の４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅにより誘導された最大減少率（４４．８７％）は，リツキシマブの８７．０４％、カンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）の６７．４９％よりも低かった．
【0358】
表１５．４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅの細胞減少％及びＥＣ５０（ｎＭ）値の上下のレベル、並びにＮｅｇＣｔｒｌ ＢＹｂｅ、リツキシマブ及びキャンパスの細胞減少％の平均値。各細胞株に関連する疾患も示している：Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ‐ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫（ＢＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）である。
＊最低濃度における細胞減少％の平均値は３３．８５％であるが、曲線の形状がシグモイド型ではないため、計算上の底値は－６５．４６％となっている。
＊最低濃度における細胞減少％の平均値は３３．８５％であるが、曲線の形状がシグモイド型ではないため、計算上の底値は－６５．４６％となっている。
【0359】
【表18】
【配列表フリーテキスト】
【0360】
配列番号１ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ１
配列番号２ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ１バリアント
配列番号３ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２
配列番号４ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２バリアント
配列番号５ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３
配列番号６ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント１
配列番号７ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント２
配列番号８ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント３
配列番号９ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１
配列番号１０ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント１
配列番号１１ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント２
配列番号１２ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント３
配列番号１３ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ２
配列番号１４ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ３
配列番号１５ ＜２２３＞ ウサギ抗体４１３３ ＶＬ領域
配列番号１６ ＜２２３＞ ウサギ抗体４１３３ ＶＨ領域
配列番号１７ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＬ７ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３フレームワーク
配列番号１８ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＬ１ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３フレームワーク
配列番号１９ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ１ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐２１フレームワーク
配列番号２０ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ４ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐２１フレームワーク
配列番号２１ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ１ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ４‐４フレームワーク
配列番号２２ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ３ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ４‐４フレームワーク
配列番号２３ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ１
配列番号２４ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２
配列番号２５ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３
配列番号２６ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント１
配列番号２７ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント２
配列番号２８ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント３
配列番号２９ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１
配列番号３０ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ２
配列番号３１ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ３
配列番号３２ ＜２２３＞ マウス抗体６２９４ ＶＬ領域
配列番号３３ ＜２２３＞ マウス抗体６２９４ ＶＨ領域
配列番号３４ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＨ２ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐４８フレームワーク
配列番号３５ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＨ４ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ１‐６９フレームワーク
配列番号３６ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＬ２ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐３３フレームワーク
配列番号３７ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＬ３ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ４‐１フレームワーク
配列番号３８ ＜２２３＞ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ重鎖
配列番号３９ ＜２２３＞ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ軽鎖
配列番号４０ ＜２２３＞ ＣＤ４５ドメイン１‐４、ＴＥＶ切断部位及び１０‐ヒスチジンタグ付き
配列番号４１ ＜２２３＞ ヒトＣＤ４５
配列番号４２ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４３ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４８ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４９ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号５０ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号５１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６７ ＜２２３＞ リンカー
配列番号６８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９２ ＜２２３＞ リジッドリンカー
配列番号９３ ＜２２３＞ リジッドリンカー
配列番号９４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９８ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９９ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１００ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０１ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０２ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０３ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０８ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１０９ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１１０ ＜２２３＞ ＧＣＮ４配列
配列番号１１１ ＜２２３＞ ＧＣＮ４配列
配列番号１１２ ＜２２３＞ ５２ＳＲ４配列
配列番号１１３ ＜２２３＞ ５２ＳＲ４配列
配列番号１１４ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１１５ ＜２２３＞ ４１３３軽鎖
配列番号１１６ ＜２２３＞ ４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ
配列番号１１７ ＜２２３＞ ４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ
配列番号１１８ ＜２２３＞ ６２９４軽鎖
配列番号１１９ ＜２２３＞ ６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホール
配列番号２ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ１バリアント
配列番号３ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２
配列番号４ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２バリアント
配列番号５ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３
配列番号６ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント１
配列番号７ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント２
配列番号８ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント３
配列番号９ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１
配列番号１０ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント１
配列番号１１ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント２
配列番号１２ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１バリアント３
配列番号１３ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ２
配列番号１４ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ３
配列番号１５ ＜２２３＞ ウサギ抗体４１３３ ＶＬ領域
配列番号１６ ＜２２３＞ ウサギ抗体４１３３ ＶＨ領域
配列番号１７ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＬ７ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３フレームワーク
配列番号１８ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＬ１ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐１３フレームワーク
配列番号１９ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ１ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐２１フレームワーク
配列番号２０ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ４ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐２１フレームワーク
配列番号２１ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ１ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ４‐４フレームワーク
配列番号２２ ＜２２３＞ ４１３３ ｇＨ３ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ４‐４フレームワーク
配列番号２３ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ１
配列番号２４ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ２
配列番号２５ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３
配列番号２６ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント１
配列番号２７ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント２
配列番号２８ ＜２２３＞ ＣＤＲＨ３バリアント３
配列番号２９ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ１
配列番号３０ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ２
配列番号３１ ＜２２３＞ ＣＤＲＬ３
配列番号３２ ＜２２３＞ マウス抗体６２９４ ＶＬ領域
配列番号３３ ＜２２３＞ マウス抗体６２９４ ＶＨ領域
配列番号３４ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＨ２ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ３‐４８フレームワーク
配列番号３５ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＨ４ Ｖ領域‐ＩＧＨＶ１‐６９フレームワーク
配列番号３６ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＬ２ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ１Ｄ‐３３フレームワーク
配列番号３７ ＜２２３＞ ６２９４ ｇＬ３ Ｖ領域‐ＩＧＫＶ４‐１フレームワーク
配列番号３８ ＜２２３＞ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ重鎖
配列番号３９ ＜２２３＞ ４１３３‐６２９４ ＢＹｂｅ軽鎖
配列番号４０ ＜２２３＞ ＣＤ４５ドメイン１‐４、ＴＥＶ切断部位及び１０‐ヒスチジンタグ付き
配列番号４１ ＜２２３＞ ヒトＣＤ４５
配列番号４２ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４３ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４８ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号４９ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号５０ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号５１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号５９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
＜２２３＞ Ｘａａは任意の天然アミノ酸であり得る
配列番号６４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６７ ＜２２３＞ リンカー
配列番号６８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号６９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号７９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８２ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８３ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８４ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８５ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８６ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８７ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８８ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号８９ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９０ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９１ ＜２２３＞ フレキシブルリンカー配列
配列番号９２ ＜２２３＞ リジッドリンカー
配列番号９３ ＜２２３＞ リジッドリンカー
配列番号９４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９８ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号９９ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１００ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０１ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０２ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０３ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０４ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０５ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０６ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０７ ＜２２３＞ ヒンジリンカー配列
配列番号１０８ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１０９ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１１０ ＜２２３＞ ＧＣＮ４配列
配列番号１１１ ＜２２３＞ ＧＣＮ４配列
配列番号１１２ ＜２２３＞ ５２ＳＲ４配列
配列番号１１３ ＜２２３＞ ５２ＳＲ４配列
配列番号１１４ ＜２２３＞ リンカー
配列番号１１５ ＜２２３＞ ４１３３軽鎖
配列番号１１６ ＜２２３＞ ４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ
配列番号１１７ ＜２２３＞ ４１３３ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡノブ
配列番号１１８ ＜２２３＞ ６２９４軽鎖
配列番号１１９ ＜２２３＞ ６２９４ ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡホール
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図12-5】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【図19-4】
【図19-5】
【図19-6】
【図19-7】
【配列表】
【国際調査報告】