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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-14
(54)【発明の名称】顆粒球マクロファージコロニー刺激因子変異体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/535 20060101AFI20231107BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231107BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231107BHJP
C12N 15/27 20060101ALI20231107BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20231107BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231107BHJP
【ＦＩ】
C07K14/535
C12N1/15 ZNA
C12N5/10
C12N15/27
A61K38/19
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525008
(86)(22)【出願日】2021-10-25
(85)【翻訳文提出日】2023-04-24
(86)【国際出願番号】 US2021056413
(87)【国際公開番号】W WO2022093671
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/105,425
(32)【優先日】2020-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/177,481
(32)【優先日】2021-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522412493
【氏名又は名称】パートナー セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フェルダウス，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ヨスト，ジェフリー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA80X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA43
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084CA53
4C084DA19
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA12
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA25
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質を含む組成物であって、前記組換えタンパク質は、配列番号１または配列番号２と少なくとも約９７％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｅ３８位及び／またはＴ３９位またはそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、前記組成物。
【請求項2】
前記Ｎ３７位またはそれに対応する位置のアミノ酸が、極性及び中性電荷の親水性アミノ酸である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項3】
前記極性及び中性電荷の親水性アミノ酸が、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項4】
前記極性及び中性電荷の親水性アミノ酸がグルタミン（Ｑ）である、請求項３に記載の組換えタンパク質。
【請求項5】
前記Ｅ３８位またはそれに対応する位置のアミノ酸が、疎水性脂肪族アミノ酸であり、かつ／またはプロリンではない、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項6】
前記疎水性脂肪族アミノ酸が、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される、請求項５に記載の組換えタンパク質。
【請求項7】
前記Ｔ３９またはそれに対応する位置のアミノ酸が、疎水性脂肪族アミノ酸である、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項8】
前記疎水性脂肪族アミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される、請求項７に記載の組換えタンパク質。
【請求項9】
前記疎水性脂肪族アミノ酸がアラニン（Ａ）である、請求項８に記載の組換えタンパク質。
【請求項10】
前記組成物が、前記顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ－αまたはＣＳＦ２Ｒ）に結合及び／またはこれを活性化する、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項11】
前記ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ－αが細胞の表面に発現される、請求項１０に記載の組換えタンパク質。
【請求項12】
前記細胞が造血前駆細胞である、請求項１１に記載の組換えタンパク質。
【請求項13】
前記造血前駆細胞が免疫細胞である、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
【請求項14】
前記造血前駆細胞が放射線照射されている、請求項１２に記載の組換えタンパク質。
【請求項15】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが可溶性である、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項16】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦがサルグラモスチムと機能的に類似している、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項17】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが複数の分子形態を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項18】
前記分子形態が、非グリコシル化形態、Ｏ－グリコシル化形態、Ｎ－グリコシル化形態、及びＮ＋Ｏグリコシル化形態から選択される、請求項１７に記載の組換えタンパク質。
【請求項19】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが高マンノシル化形態を実質的に含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項20】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に３つのピークとして分離される、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項21】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に、約２０分未満の保持時間で実質的なピークを提供しない、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項22】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、有機溶媒を使用せずに精製された場合に高マンノシル化形態を実質的に含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項23】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、任意選択で逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを使用せずに精製された場合に、高マンノシル化形態を実質的に含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。
【請求項24】
先行請求項のいずれか１項に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸分子。
【請求項25】
前記核酸分子がコドン最適化配列を有する、請求項２４に記載の核酸。
【請求項26】
請求項２３または２４に記載の核酸分子を発現する非ヒト宿主細胞。
【請求項27】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項28】
前記酵母細胞が非メチロトローフ酵母細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項29】
前記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項30】
先行請求項のいずれか１項に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、及び薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、薬学的組成物。
【請求項31】
がん治療を受けている、もしくは受けたことがある、または骨髄移植を受けている、もしくは受けたことがある、及び／または骨髄抑制量の放射線に急性被ばくした患者または対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項３０に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項32】
前記患者が、造血前駆細胞のクローン増殖、生存、分化、及び活性化状態を調節することによって治療される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記患者が、巨核球系及び赤血球系前駆細胞の増殖を促進することにより骨髄単球細胞系譜を調節することによって治療される、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記患者が、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって治療される、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記患者が、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって骨髄移植後に治療される、請求項３１に記載の方法。
【請求項36】
治療有効量の請求項３０に記載の薬学的組成物を患者に投与すること、または治療有効量の請求項３０に記載の薬学的組成物と細胞を接触させ、治療有効量の前記細胞を投与することを含む治療方法であって、
前記治療が、
導入化学療法後の好中球の回復を促進し、及び／または感染症の発生率を低減する；
白血球除去及び移植による採取のために造血前駆細胞を末梢血に動員する；
自家または同種の骨髄または末梢血前駆細胞を移植した後の骨髄再構築を促進する；
自家または同種の骨髄移植後の好中球回復遅延または生着不全を治療する；及び／または
急性放射線症候群の造血症候群（Ｈ－ＡＲＳ）を治療する、前記方法。
【請求項37】
請求項１～２２のいずれか１項に記載の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質を含む有効量の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、コロナウイルスによる感染症を治療するための方法。
【請求項38】
前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３から任意に選択されるベータコロナウイルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記コロナウイルスが、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅから任意に選択されるアルファコロナウイルスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項40】
前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記患者がＣＯＶＩＤ－１９に罹患している、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記患者が、発熱、咳嚇、息切れ、下痢、上気道症状、下気道症状、肺炎、及び急性呼吸器症候群のうちの１つ以上に苦しんでいる、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記患者が低酸素症である、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記患者が呼吸窮迫に苦しんでいる、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記患者における急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発症を予防または緩和する、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記患者の酸素化を改善する、請求項３７～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記患者における呼吸窮迫からサイトカイン不均衡への移行を予防または緩和する、請求項３７～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
サイトカインストームを逆転または予防する、請求項３７～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
肺または全身のサイトカインストームを逆転または予防する、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記サイトカインストームが、全身性炎症反応症候群、サイトカイン放出症候群、マクロファージ活性化症候群、及び血球貪食性リンパ組織球症のうちの１つ以上から選択される、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項51】
１つ以上の炎症性サイトカインの過剰産生を逆転または予防する、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項52】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＬ－２ｒａ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、インターフェロン－γ、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ７のうちの１つ以上である、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記方法が、治療前と比べて前記患者のウイルス量を減少させる、請求項３７～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
それを必要とする対象においてウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記ウイルス感染症から回復したドナー対象から血漿を提供することであって、
前記血漿が、前記感染症を引き起こす前記ウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体を含み、
前記ドナー対象が、前記抗体の産生を刺激するために請求項１～２２のいずれか１項に記載の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質で処置されている、前記提供することと、
前記血漿をそれを必要とする前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項55】
それを必要とする対象においてウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、前記方法が、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質を、前記ウイルス感染症から回復したドナー対象に投与することと、
前記ドナー対象から前記感染症を引き起こす前記ウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体を含む血漿を単離することと、
前記血漿をそれを必要とする前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項56】
前記ウイルスに対する受動免疫を、それを必要とする前記対象に提供する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体がウイルス抗原に特異的に結合する、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体が前記ウイルスを中和する、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体が、前記ウイルスによる細胞の感染を予防または減少させる、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項60】
前記ウイルス感染症が、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３感染症から任意に選択されるベータコロナウイルス感染症から選択される、請求項５４～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記ウイルス感染症が、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅ感染症から任意に選択されるアルファコロナウイルス感染症から選択される、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記ベータコロナウイルス感染症が重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記ベータコロナウイルス感染症がコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）であるか、またはそれに関連している、請求項６１に記載の方法。
【請求項64】
前記ウイルス感染症が、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型インフルエンザウイルス感染症から任意に選択されるインフルエンザ感染症である、請求項５４～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記インフルエンザ感染症がパンデミック２００９インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）または鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記ドナー対象が、回復前に前記ウイルス感染症に陽性であると検査されている、請求項５４～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記ドナー対象が、ドナー提供前にウイルス感染症の症状が消失している、請求項５４～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
前記ドナー対象が、血清学的検査を用いて前記ウイルスに対して指向される抗体に陽性であると検査されている、請求項５４～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記ドナー対象が測定可能な中和抗体力価を示す、請求項５４～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記中和抗体力価が少なくとも約１：１６０である、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記血漿が前記ドナー対象からの血液試料から単離される、請求項５４～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記血漿がプラズマフェレシスによって単離される、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記血漿が、前記感染症を引き起こす前記ウイルスに対して指向される前記ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体の治療有効量を含む、請求項５４～７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項74】
組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む組成物を産生する組換え体を作製する方法であって、（ａ）配列番号２と少なくとも約９７％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｇ３８位、及び／またはＴ３９位またはそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする核酸をトランスフェクトされた細胞、またはその抽出物を得ることと、
（ｂ）１つ以上のＨＰＬＣカラムを使用して、前記トランスフェクトされた細胞から前記ＧＭ－ＣＳＦを精製することであって、前記精製が有機溶媒の非存在下である、前記精製することと、
（ｃ）前記精製されたＧＭ－ＣＳＦを収集することであって、前記精製されたＧＭ－ＣＳＦが高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦ形態を実質的に含まない、前記収集することと、を含む、前記方法。
【請求項75】
前記細胞が酵母細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７４に記載の方法。
【請求項78】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
前記組換えタンパク質の産生中、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の前記トランスフェクションが、非哺乳動物細胞を使用する産生方法と比較して、前記組換えタンパク質の発現レベルを増加させる、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、サルグラモスチムと比較して増強された機能を示す、請求項７４に記載の組換えタンパク質。
【請求項81】
前記組換えヒトＧＭ－ＣＳＦが、サグラモスチムと比較して増強された機能を示す、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞のトランスフェクションによって産生された請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項82】
配列番号１または配列番号２と少なくとも約９７％の同一性を有し、Ｎ３７Ｑ置換またはそれに対応する位置を有するアミノ酸配列を含む、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）タンパク質を含む組成物であって、前記ＧＭ－ＣＳＦが、実質的な高グリコシル化種を含まず、有機溶媒による精製を必要とせずに単離可能である、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２６日出願の米国特許仮出願第６３／１０５，４２５号及び２０２１年４月２１日出願の同第６３／１７７，４８１号の利益及びそれらに対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１０月２６日出願の米国特許仮出願第６３／１０５，４２５号及び２０２１年４月２１日出願の同第６３／１７７，４８１号の利益及びそれらに対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、一般に、変異体顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）に関する組成物及び方法に関する。
【0003】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１０月２０日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＮＲ－００３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で、サイズが４，０９６バイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１０月２０日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＮＲ－００３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で、サイズが４，０９６バイトである。
【背景技術】
【0004】
コロニー刺激因子、ＣＳＦとは、広く散らばって集積した骨髄細胞による細胞産生を制御及び調整する４つの糖タンパク質のファミリーを指す。これらには、顆粒球－マクロファージＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニーＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニーＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、及び多能性コロニー刺激因子（ＩＬ－３）が含まれる。これらのリンフォカインは、骨髄に見られる前駆細胞を誘導して、特定の種類の成熟血液細胞に分化させることができる。前駆細胞から生じる特定の種類の成熟血液細胞は、存在するＣＳＦの種類に依存する。Ｍｅｔｃａｌｆ Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１３，１（６）：３５１－３５６を参照のこと。
【0005】
ＧＭ－ＣＳＦは、造血細胞の産生、移動、増殖、分化、及び機能を調節する血液学的成長因子である。炎症刺激に応答して、ＧＭ－ＣＳＦは、Ｔリンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、及び内皮細胞を含む様々な細胞タイプによって放出される。次いで、ＧＭ－ＣＳＦは、好中球、好酸球、及びマクロファージの産生及び生存を活性化し、増強する。ネイティブＧＭ－ＣＳＦは通常、造血前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖、分化、及び生存を調節する作用部位の近くで産生されるが、循環血中にはピコモル濃度（１０－１０から１０－１２Ｍ）でしか存在しない。Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＷＳ．Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６：６５１－６８２；Ｇａｓｓｏｎ ＪＣ．Ｂｌｏｏｄ．１９９１，７７：１１３１－１１４５；Ｓｈａｎｎｏｎ ＭＦ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１７：３０１－３２３、Ｂａｒｒｅｄａ ＤＲ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，２８：５０９－５５４、及びＭｅｔｃａｌｆ Ｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９８７，６５：３５－４３を参照のこと。
【0006】
ヒトＧＭ－ＣＳＦ（ｈＧＭ－ＣＳＦ）は、１７個のアミノ酸のシグナルペプチドを有する１４４個のアミノ酸残基の前駆体タンパク質として合成される。この前駆体タンパク質をプロセシングすることにより、１４．４ｋＤａの推定分子量を有する１２７個のアミノ酸の成熟タンパク質が得られる。このタンパク質は２つのジスルフィド結合を有し、グリコシル化及びシアリル化により１５～３０ｋＤａの広いバンドとして移動する。Ｎ－結合型グリカンはＡｓｎ２７及びＡｓｎ３７に位置し、Ｏ－結合型グリコシル化の複数の可能性のある部位としてＳｅｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、及びＳｅｒ１０が存在するが、これらの部位のグリカン構造の程度は明確には決定されていない。ＧＭ－ＣＳＦのグリコシル化パターンは、その活性、受容体結合、免疫原性、及び半減期に影響を与えることが確認されている。Ｌｅｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５．８２：３６０－４３６４；Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９８５．４：２５６１－２５６８．Ｃｅｂｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１．２６５，４４８３－４４９１；Ｚｈａｎｇ Ｑ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１４，２８８５－２８９０を参照のこと。
【0007】
化学療法と組み合わせた、好中球減少症、血液疾患、及び白血病などの悪性腫瘍の治療向けに、組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ）が、ＦＤＡによって承認されている。臨床において、化学療法後の好中球減少症及び再生不良性貧血の治療に使用されるＧＭ－ＣＳＦは、骨髄移植に伴う感染症のリスクを大幅に軽減する。また、骨髄性白血病の治療及びワクチンアジュバントとしての有用性も十分に確立されている。Ｄｏｒｒ ＲＴ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１９９３．１５（１）：１９－２９；Ａｒｍｉｔａｇｅ ＪＯ．Ｂｌｏｏｄ １９９８，９２：４４９１－４５０８；Ｋｏｖａｃｉｃ ＪＣ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７，４２：１９－３３；Ｊａｃｏｂｓ ＰＰ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０１０，９：９３を参照のこと。
【0008】
異種タンパク質産生プラットフォームには、細菌、酵母、植物、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む５つのクラスが存在するが、現在市販されているバイオ医薬品の５０％超が哺乳動物細胞株で生産されている。これは、残りの４つのクラスが、ヒト様オリゴ糖で糖タンパク質を修飾できないことに部分的に起因する。これは、タンパク質結合グリカンが、循環半減期、組織分布、生物学的活性、及び免疫原性に影響を与えるため重要である。
【0009】
ＧＭ－ＣＳＦ発現系は、ＧＭ－ＣＳＦの薬物動態特性、生物学的活性、及び臨床毒性に影響を与える。臨床では、ＧＭ－ＣＳＦは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－ＧＭ、レグラモスチム）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ－ＧＭ、モルグラモスチム）、または酵母（酵母－ＧＭ、サルグラモスチム）で産生されている。Ｄｏｒｒ ＲＴ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１９９３．１５（１）：１９－２９；Ｗａｌｓｈ Ｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，２４：７６９－７７６；Ｊａｃｏｂｓ ＰＰ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９，４：５８－７０；Ｊａｃｏｂｓ ＰＰ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２０１０，９：９３；Ｗａｌｓｈ Ｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８，３６（１２）：１１３６－１１４５を参照のこと。ＧＭ－ＣＳＦの製造中には、４つの主要なＧＭ－ＣＳＦアイソフォーム／種：「高グリコシル化」種（約５０ｋＤａ）、Ｎ－及びＮ－＋Ｏ－グリコシル化種（約２０ｋＤａ）、Ｏ－グリコシル化種（約１６ｋＤａ）、及び非グリコシル化種（約１５ｋＤａ）が存在する。グリコシル化ＧＭ－ＣＳＦは、酵母（サルグラモスチム）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（レグラモスチム）を用いた組換え技術によってのみ得られ、グリコフォームの複雑な混合物が生成されるが、Ｅ．ｃｏｌｉを用いたものはない。グリカンの不均一性は、ＣＨＯ細胞の翻訳後グリコシル化において特異性が欠如していることを反映している。Ｚｈａｎｇ Ｑ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１１１（８）：２８８５－２８９０を参照のこと。
【0010】
サルグラモスチムの発現ベクターは、粗面小胞体での転写と成熟ＧＭ－ＣＳＦの細胞による分泌を指示するリーダー配列を含む。Ｎ－グリコシル化は、アスパラギン（Ａｓｎ）またはアルギニン（Ａｒｇ）側鎖の窒素にグリカンが付加される際に起こり、一方、Ｏ－グリコシル化は、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）またはチロシン（Ｔｙｒ）アミノ酸の水酸基酸素側鎖にグリカンが付加される際に起こる。アスパラギン残基は、Ｎ－グリコシル化のために、通常、Ａｓｎ－Ｘｘｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ（Ｘｘｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）のコンセンサス配列を必要とする。サルグラモスチムのｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦタンパク質配列には、Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ（ＮＬＳ）及びＡｓｎ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ（ＮＥＴ）という２つのコンセンサス配列が含まれており、そこでタンパク質がグリコシル化される可能性がある。サルグラモスチムの製造中、発酵槽に存在するいくつかのＧＭ－ＣＳＦ種においてＡｓｎ２７とＡｓｎ３７の両方のＮ－グリコシル化部位がグリコシル化される。Ｔｈｒ３９（またはＳｅｒ３９またはＣｙｓ３９）残基は、Ａｓｎ２７またはＡｓｎ３７でのグリコシル化を可能にする重要なアンカーである。アスパラギン残基３７にＮ－オリゴ糖が結合した種は、これらのグリコフォームが最大数百のマンノース残基を含むことから「高グリコシル化」種（３０～１００ｋＤａ）と呼ばれる。高マンノシル化はＮ３７でのみ発生する。先行報告で、グリコシル化に影響を与える可能性のある変異誘発について調査されている（例えば、Ｇｅｎｅ ５５：２８７－２９３（１９８７）及びＨｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８３：１－７（１９８８））が、これらの研究はタンパク質の収量に焦点を当てており、活性を評価したり、または精製プロセスの合理化を試みてはいなかった（例えば、Ｈｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８３：１－７（１９８８）の表２を参照のこと）。
【0011】
上流の製造プロセスでは、部分的に精製された発酵ブロス中に、４つの主要なＧＭ－ＣＳＦ種、「高グリコシル化」種（約５０ｋＤａ）、Ｎ－及びＮ－＋Ｏ－グリコシル化種（約２０ｋＤａ、ピーク２）、Ｏ－グリコシル化種（約１６ｋＤａ、ピーク３）、及び非グリコシル化種（約１５ｋＤａ、ピーク４）が存在する。「高グリコシル化」ＧＭ－ＣＳＦ種は非生成物とみなされ、下流プロセスで除去され、これにより３つの主要なグリコフォーム（ピーク２～４）を含む生成物、バルク原薬（ＢＤＳ）が得られる。Ｔ－００７５逆相グリコフォームアッセイにおいて、ＢＤＳ及びＤＰ中に少量の酸化ＧＭ－ＣＳＦ（４％以下）が検出され、これは「ピーク１」と表示される。Ｗａｌｔｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＪＣＢ．１９８１．９１（２ Ｐｔ１）：５４５－５０；Ｃａｎｔｒｅｌｌ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１９８５．８２：６２５０－６２５４を参照のこと。粗面小胞体で合成されたほとんどのタンパク質はグリコシル化を受けるが、これは酵素による部位特異的なプロセスである。Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ ＫＦ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８．４４６：２９３－３１６．Ｖａｒｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ ５６．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎを参照のこと。
【0012】
現在製剤に存在する３つの主要なｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦグリコフォームに加えて、生成物の６％未満を占める「高グリコシル化」形態が存在する。しかし、この「高グリコシル化」形態は、現在のサルグラモスチム（ＬＥＵＫＩＮＥ）製剤には存在しない。単離された「高グリコシル化」種は、２つのＮ－アセチルグルコサミン残基と、発酵ブロスに存在することが知られている範囲の下限にある平均４３個のマンノース残基を含むと推定された。アスパラギン残基３７にＮ－オリゴ糖が結合した種は、これらのグリコフォームが最大数百のマンノース残基を含むことから「高グリコシル化」種（３０～１００ｋＤａ）と呼ばれる。Ｓｔｒｅｎｌｅｒ ＫＥ，ｅｔ ａｌ．１９９４を参照のこと。この「高グリコシル化」種は、下流の精製プロセスで完全に除去され、サルグラモスチムの製造に使用される最終的なサルグラモスチムのバルク原薬（ＢＤＳ）では一切検出されない。
【0013】
サルグラモスチムの最終生成物は、Ｎ－グリコシル化及びＯ－グリコシル化グリコフォームと、非グリコシル化グリコフォームから構成される。このように、サルグラモスチムは、そのグリコフォームプロファイルに不均一性を有しており、その不均一性は、その承認歴全体を通して非常に一貫している。サルグラモスチムの３つの主要なグリコフォームは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離することができる。これら３つのグリコフォームの過去の平均相対量は、それぞれ２８．６８％±０．８６％、２２．５８％±０．７３％、及び４８．７４％±０．８％とかなり一貫している。サルグラモスチムのＧＭ－ＣＳＦタンパク質のほぼ半分は非グリコシル化されており、３分の１弱は完全にＮ－グリコシル化されている。Ｎ－グリコシル化種の全てではないにしても、そのほとんどはＯ－グリコシル化もされている。高度に分岐したＮ－結合型オリゴ糖構造は、受容体結合部位ならびにＨ６アルファヘリックス及びＣ末端ランダムコイルの一部を妨げずに、Ｈ１及びＨ５アルファヘリックスを含む分子のかなりの部分を覆っている。
【0014】
組換えＧＭ－ＣＳＦの炭水化物成分は細胞源に基づいて異なるが、グリコシル化は、受容体結合、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの生物学的活性に必要ではない。酵母ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ及び非グリコシル化Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦは、受容体親和性及び細胞増殖比活性の両方によって測定された同等の比活性を有する。Ｕｒｄａｌ ａｎｄ Ｐａｒｋ，１９８８；Ｍｅｔｃａｌｆ Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ １９９０：６５：２１８５－２１９５を参照のこと。
【0015】
ヒトの内因性タンパク質は、その機能に応じて大きく異なり得る様々な速度でｉｎ ｖｉｖｏで分解される。例えば、ヘモグロビンは赤血球の一生にわたって持続し、ヒストンは数年の半減期を有するが、オルニチン脱炭酸酵素（半減期１１分）のような他のタンパク質は非常に速い分解速度を有する。Ｔｈｏｍａｓ Ｅ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３）．“Ｃｈａｐｔｅｒ １０－Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ”．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．４６３－４７３．ＩＳＢＮ ０－７１６７－２３１７－４を参照のこと。真核生物では、細胞内空間の短命なタンパク質のほとんどは、ユビキチン－プロテアソーム経路（ＵＰＰ）によって分解される。Ｋｙｂｕｃｚｋｏｖａ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１４．１８：９４７－９６１を参照のこと。ＵＰＰは、細胞周期の進行、アポトーシス、及びＤＮＡ修復を制御するものを含む、タンパク質のプロセシング及び分解における細胞の恒常性において中心的な役割を果たす。Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７．２７２：２５２００－２５２０９を参照のこと。リソソームはまた、細胞質内及び細胞外から不要なタンパク質を除去する。細胞外からの物質はエンドサイトーシスによって取り込まれ、細胞内からの物質はオートファジーによって消化される。Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１３．１４（５）：２８３－９６を参照のこと。ＧＭ－ＣＳＦの半減期は５０～８５分に及び得ることが示されている。Ｃｅｂｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１９８８．７２：１３４０－１３４７；Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ ２００４を参照のこと。天然及び組換えＧＭ－ＣＳＦのｉｎ ｖｉｖｏの生物学的活性は、そのバイオアベイラビリティに大きく依存する。Ｄｏｒｒ ＲＴ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ｖｏｌ．１５，ＮＯ．１，１９９３を参照のこと。
【0016】
ヒトにおける治療用タンパク質（生物学的製剤またはバイオロジクス）のバイオアベイラビリティは、薬物の投与経路によっても影響を受ける可能性がある。Ｄｏｒｒ ＲＴ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ｖｏｌ．１５，ＮＯ．１，１９９３を参照のこと。静脈内（ＩＶ）投与直後は、ほぼ全ての治療用タンパク質が利用可能であるが、その後、血漿中に存在するプロテアーゼによって時間の経過とともに分解され得る。場合によっては、皮下（ＳＣ）投与は、高い血漿濃度をより長く維持することにより、消失半減期の短いタンパク質への曝露を延長し、ＩＶ投与と比較してより良好な忍容性を示すことができる。したがって、ＳＣ投与後の生物学的製剤の吸収は、不完全なバイオアベイラビリティの可能性を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でのその動態に影響され得る。Ｈａｌｅ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００４．１０４（４）：９４８－９５５を参照のこと。
【0017】
サルグラモスチムに存在する様々なアイソフォームの体循環への輸送は、分子サイズが異なるため、様々な経路が好ましい可能性がある。サルグラモスチムの２つの非グリコシル化ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ Ｌｅｕ２３種（ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで約１４ｋＤａ、全長分子及び切断型Ａｌａ３ｄｅｓ－Ａ１Ｐ２種のアミノ酸配列から決定された分子量＝１４，４３０．４７及び１４２６６．３１）は、明らかに毛細血管への拡散を優先するはずであり、したがって血流中のこれらのタンパク質分子のバイオアベイラビリティは非常に急速であるはずである。１～８個のマンノース糖残基を含む約８個のＯ－グリコシル化グリコフォーム（ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで約１６ｋＤａ、質量分析で測定された分子量は１４，５００～１６，０００）は、リンパ管と毛細血管の両方を通じて体循環に送達される可能性がある。しかしながら、２つのｎ－アセチルグルコサミン残基と６～２７個のマンノース残基を含むＮ－及びＮ－＋Ｏ－グリコシル化グリコフォーム（ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで約２１ｋＤａ、質量分析で測定された分子量は１６，２００～１９，０００）は、その分子サイズを考えると、リンパ経路による拡散及び吸収が強く優先されると考えられる。
【0018】
ＧＭ－ＣＳＦ発現系は薬物動態パラメータに影響を与える可能性があり、グリコシル化の程度はＧＭ－ＣＳＦの半減期、分布、及び排泄に影響を及ぼす可能性がある。ＧＭ－ＣＳＦのグリコシル化の程度とその分布、クリアランス、及び活性との関係は、ラットモデルを用いて報告されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されたＧＭ－ＣＳＦの比活性は、最も大きく最も完全にグリコシル化された形態のタンパク質では、より小さくグリコシル化度のより低い分子と比較して著しく低下していることが判明している。単回静脈内ボーラス注射後のラットの血流中のＧＭ－ＣＳＦの有効半減期は、Ｎ－結合型炭水化物の付加により著しく延長されることが示されている。ラットにおけるＧＭ－ＣＳＦのクリアランスは二相性の速度論に従い、炭水化物の修飾によって延長されるのは第１相またはｃ～相である。Ｄｏｎｏｈｕｅ ＲＥ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ．１９８６．５１：６８５－６９２及びＤｏｒｒ ＲＴ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．１９９３．１５（１）：１９－２９を参照のこと。
【0019】
「高グリコシル化」ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ種の生物学的活性は統計的に有意に低いことが示されているが、１９．５、１６．８、１５．５ｋＤａ種の比活性（ＳＡ）は非常に類似している。他の３つのグリコフォーム、Ｎ－及びＮ－＋Ｏ－グリコシル化種（２１ｋＤａ、ピーク２）、Ｏ－グリコシル化種（１６ｋＤａ、ピーク３）、ならびに非グリコシル化種（１４ｋＤａ、ピーク４）のＳＡは、親ＢＤＳであるサルグラモスチムについて得られた値から９９％の信頼レベルで統計的に異ならないことが示されている。
【0020】
単純な精製方法を適用でき、「高グリコシル化」種をほとんど含まないＧＭ－ＣＳＦ分子が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0021】
したがって、本発明は、ＧＭ－ＣＳＦの変異体形態、とりわけ、野生型またはサルグラモスチムと比較して固有のグリコフォームプロファイルを提供するＧＭ－ＣＳＦの変異形態に関するものである。
【0022】
諸態様において、配列番号１または配列番号２と少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ３７位、Ｅ３８位、及び／またはＴ３９位またはそれに対応する位置に置換または欠失を有する、例えば、Ｎ３７位またはそれに対応する位置のアミノ酸が、極性及び中性電荷の親水性アミノ酸（例えば、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ））に置換されていてもよく；Ｅ３８位またはそれに対応する位置のアミノ酸が疎水性脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）であり、かつ／またはプロリンではない）に置換されていてもよく；及び／または、Ｔ３９位またはそれに対応する位置のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）に置換されていてもよい、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質が提供される。
【0023】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、サルグラモスチムと機能的に類似している。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、複数の分子形態、例えば、非グリコシル化形態、Ｏ－グリコシル化形態、Ｎ－グリコシル化形態、及び／またはＮ＋Ｏグリコシル化形態を含む。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、高グリコシル化形態、例えば高マンノシル化形態を実質的に含まない。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に、３つのピークとして分離される。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に、約２０分未満の保持時間で実質的なピークを提供しない。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを使用せずに精製された際に、高グリコシル化形態、例えば高マンノシル化形態を実質的に含まない。
【0024】
諸実施形態において、哺乳動物細胞で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、酵母細胞で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦと比較して機能的に増強されている。
【0025】
諸実施形態において、哺乳動物細胞で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦの産生力価は、酵母細胞での産生と比較して増加する。
【0026】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸分子（例えば、コドン最適化配列）も提供される。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸分子を発現する非ヒト宿主細胞（例えば、酵母細胞、例えば非メチロトローフ酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も提供される。また、諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ及び薬学的に許容される賦形剤または担体を含む薬学的組成物も提供される。
【0027】
諸態様において、がん治療を受けている、もしくは受けたことがある、または骨髄移植を受けている、もしくは受けたことがある、及び／または骨髄抑制量の放射線に急性被ばくした患者または対象を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【0028】
諸態様において、ウイルス感染症、例えば限定されないがコロナウイルス、例えば限定されないが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染症を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含む、ウイルス感染症を治療する方法、またはそれを必要とする対象においてウイルス感染症を治療もしくは予防するための方法であって、該方法が、ウイルス感染症、例えば限定されないがコロナウイルス、例えば限定されないがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症から回復したドナー対象から血漿を提供することであって、該血漿が、感染症を引き起こすウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体を含み、該ドナー対象が、抗体の産生を刺激するために本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質で処置されている、提供することと、該血漿をそれを必要とする対象に投与することとによる、ウイルス感染症を治療もしくは予防するための方法が提供される。
【0029】
諸態様において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを含む組成物を産生する組換え体を作製する方法であって、（ａ）配列番号２と少なくとも約９７％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｇ３８位、及び／またはＴ３９位またはそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸をトランスフェクトされた酵素細胞、またはその抽出物を得ることと；（ｂ）１つ以上のＨＰＬＣカラムを使用して、トランスフェクトされた酵母細胞からＧＭ－ＣＳＦを精製することであって、該精製が、有機溶媒（例えば、限定されないがアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムの非存在下である、精製することと；（ｃ）精製されたＧＭ－ＣＳＦを収集することであって、該精製されたＧＭ－ＣＳＦが高グリコシル化、例えば高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦ形態を実質的に含まない、収集することと、を含む、組換え体を作製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】ＨＰＬＣによって定量化されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発現したＧＭ－ＣＳＦを示す。アスタリスクは、高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦピークを識別する。
【図2】タンパク質の同一性を確認するために使用されたウエスタンブロットを示す。
【図3】ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦグリコフォームの構成比を決定するために使用された逆相ＨＰＬＣアッセイを示す。
【図4】酵母で増殖させたＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥ（参照標準）対ＣＨＯで発現したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦのクロマトグラムの比較を示す。ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥは、配列内にＴ３９ＡまたはＮ３７Ｑアミノ酸置換のいずれも含まない、配列番号１の野生型ＧＭ－ＣＳＦを指す。
【図5】酵母で増殖させたＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥ（参照標準）対ＣＨＯで発現したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦのサイズ排除クロマトグラムの比較を示す。
【図6】酵母で増殖させたｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ対ＣＨＯ細胞で増殖させたｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの発酵力価を示す。
【図7】変異Ｔ３９Ａ及びＮ３７Ｑを有するｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ、ならびにＬＥＵＫＩＮＥ（すなわち、Ｔ３９ＡまたはＮ３７Ｑを含まないＧＭーＣＳＦ）の生物学的活性を測定する機能的ＴＦ－１バイオアッセイの比較を示す。
【図8】ＣＨＯ細胞で増殖させた変異Ｎ３７Ｑを有するｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦを、異なる条件を使用して保存したＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥの３つの異なるバッチ（Ｌｅｕｋｉｎｅ ＢＤＳ新規物質、２～８℃で１２ヶ月保存したＬｅｕｋｉｎｅ ＢＤＳ、－７０℃で４８ヶ月保存したＬｅｕｋｉｎｅ）と比較して、その生物学的活性を測定するＴＦ－１アッセイデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、サルグラモスチムの配列中、例えば、サルグラモスチムの３７位、３８位、及び／または３９位、または等価物において単一のアミノ酸が変化することにより、有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮープロパノール）、及び／またはサルグラモスチムで観察される高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムによる精製を必要としない機能的ＧＭ－ＣＳＦが生成されるという発見に部分的に基づく。
【0032】
ＧＭ－ＣＳＦの組成物
一態様において、操作されたＧＭ－ＣＳＦタンパク質が提供される。
一態様において、操作されたＧＭ－ＣＳＦタンパク質が提供される。
【0033】
諸実施形態において、本発明の実施に使用される操作されたＧＭ－ＣＳＦは、任意の薬学的に安全かつ有効なＧＭ－ＣＳＦ、またはＧＭ－ＣＳＦの生物学的活性ならびに本発明の置換及び／または欠失を有するその任意の誘導体を含む。
【0034】
一実施形態において、本発明の方法の実施に使用される操作されたＧＭ－ＣＳＦは、サルグラモスチム（ＬＥＵＫＩＮＥ）などの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ）に由来する。サルグラモスチムは生合成された酵母由来の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦであり、２３位にプロリンの代わりにロイシンを有するという点で内因性ヒトＧＭ－ＣＳＦとは異なる単一の１２７アミノ酸糖タンパク質を有する。他の天然及び合成ＧＭ－ＣＳＦ、ならびに天然ヒトＧＭ－ＣＳＦの生物学的活性を有するそれらの誘導体は、本発明の実施において同等に有用であり得る。
【0035】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子はグリコシル化されている。諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、ＧＭ－ＣＳＦのグリコシル化に影響を与える１つ以上の置換及び／または欠失を含む。
【0036】
理論に拘束されることは望まないが、生合成ＧＭ－ＣＳＦのグリコシル化の程度は、半減期、分布、及び排泄に影響を与えると考えられる。（Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：２８－３５，１９９２；Ｄｏｒｒ，Ｒ．Ｔ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．１５：１９－２９，１９９３；Ｈｏｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５０：３２－３６，１９９３）。
【0037】
一態様において、配列番号１または配列番号２と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性、または１００％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｅ３８位、及び／またはＴ３９位またはそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質が提供される。
【0038】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦのＮ３７位またはそれに対応する位置のアミノ酸は、極性及び中性電荷の親水性アミノ酸である。諸実施形態において、極性及び中性電荷の親水性アミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される。諸実施形態において、極性及び中性電荷の親水性アミノ酸はグルタミン（Ｑ）である。
【0039】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦのＥ３８位またはそれに対応する位置のアミノ酸は、疎水性脂肪族アミノ酸であり、かつ／またはプロリンではない。諸実施形態において、疎水性脂肪族アミノ酸は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。
【0040】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦのＴ３９位またはそれに対応する位置のアミノ酸は、疎水性脂肪族アミノ酸である。諸実施形態において、疎水性脂肪族アミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。諸実施形態において、疎水性脂肪族アミノ酸はアラニン（Ａ）である。諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦのＴ３９位またはそれに対応する位置のアミノ酸は荷電していない。諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦのＴ３９位またはそれに対応する位置のアミノ酸は、Ｇｌｕグルタミン酸（Ｅ）ではない。
【0041】
諸実施形態において、配列番号１または配列番号２と、少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性、または１００％の同一性を有し、Ｎ３７欠失、Ｎ３７Ｑ、Ｎ３７Ｓ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｐ、Ｎ３７Ｃ、Ｅ３８欠失、Ｅ３８Ａ、Ｅ３８Ｌ、Ｅ３８Ｉ、Ｅ３８Ｍ、Ｅ３８Ｖ、Ｔ３９欠失、Ｔ３９Ａ、Ｔ３９Ｇ、Ｔ３９Ｌ、Ｔ３９Ｉ、Ｔ３９Ｍ、及びＴ３９Ｖのうちの１つ以上または対応する変異を有するアミノ酸配列を含む、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質が提供される。
【0042】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに対して約９０％、もしくは約９３％、もしくは約９５％、もしくは約９７％、もしくは約９８％の同一性の、本発明の置換及び／または欠失を有するバリアントを有する。
【0043】
諸実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦは、本発明の置換及び／または欠失を有するモルグラモスチム、サルグラモスチム、及びレグラモスチムのうちの１つである。
【0044】
理論に拘束されることは望まないが、ｈＧＭ－ＣＳＦのコアは、角度をなしてパッキングされた４つのヘリックスからなる。ｒｈＧＭ－ＣＳＦの結晶構造及び変異原性分析（Ｒｏｚｗａｒｓｋｉ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２６：３０４－１３，１９９６）により、タンパク質コアの無極性側鎖に加えて、１０個の埋もれた水素結合残基が、他の側鎖原子に水素結合する残基よりも良好に保存された主鎖原子に分子内水素結合すること；非対称ユニット内の２つの分子の同等位置に２４の溶媒和部位が見られ、このうち最も強力なものが二次構造要素間の裂け目に位置していることが判明した。疎水性側鎖の２つの表面クラスターは、予想される受容体結合領域の近くに位置する。ヘリックスＡ／ヘリックスＣ表面の残基の変異誘発により、特定のＧｌｕ、Ｇｌｙ、及びＧｌｎ残基の重要性が確認された。したがって、これらの残基は、本発明で使用するｈＧＭ－ＣＳＦの機能的置換バリアントでは置換されず、これらのヘリックスは、本発明で使用するｈＧＭ－ＣＳＦの機能的フラグメントまたは欠失バリアントにおいて保持される。
【0045】
さらに、諸実施形態において、当業者は、バリアントの同一性を知らせるための構造情報について、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０４１４１を参照することができる。
【0046】
ｈＧＭ－ＣＳＦのＮ末端ヘリックスは、その受容体への高親和性結合を支配する（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ Ａ Ｂ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １０：４１０５－１２，１９９１）。ＧＭ－ＣＳＦの生物学的効果の伝達には、少なくとも２つの細胞表面受容体成分との相互作用が必要である（そのうちの１つはサイトカインＩＬ－５と共有される）。上記の研究は、一連のヒト－マウスハイブリッドＧＭ－ＣＳＦサイトカイン上に固有の受容体結合ドメインを配置することにより、ＧＭ－ＣＳＦ内の受容体結合決定基を同定した。ＧＭ－ＣＳＦとそれらの高親和性受容体複合体の共有サブユニットとの相互作用は、ペプチド鎖の非常に小さな部分によって支配されていた。Ｎ末端αヘリックスに存在するいくつかの重要な残基は、相互作用に特異性を付与するのに十分であった。
【0047】
したがって、諸実施形態において、この情報は、アミノ酸配列における許容可能な変動に関して、当業者に知らせることができる。
【0048】
いくつかの実施形態において、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的置換及び／または非保存的置換を含み得る。
【0049】
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われ得る。２０個の天然アミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸グループに分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0050】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」とは、上記の６つの標準的なアミノ酸グループの同じグループ内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド内に１つの負電荷を保持する。さらに、αヘリックスを破壊する能力に基づいて、グリシンとプロリンが互いに置換されることもある。
【0051】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」とは、上記の６つの標準的なアミノ酸グループ（１）～（６）の異なるグループに列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
【0052】
様々な実施形態において、置換はまた、非古典的アミノ酸も含み得る（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡ及びδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体）。
【0053】
アミノ酸配列の修飾は、当技術分野における任意の周知の技術、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲベースの変異誘発を使用して、達成することができる。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されている。
【0054】
グリコフォーム
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、複数の分子形態を含む。諸実施形態において、分子形態は、非グリコシル化形態、Ｏ－グリコシル化形態、Ｎ－グリコシル化形態、及びＮ＋Ｏグリコシル化形態から選択される。
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、複数の分子形態を含む。諸実施形態において、分子形態は、非グリコシル化形態、Ｏ－グリコシル化形態、Ｎ－グリコシル化形態、及びＮ＋Ｏグリコシル化形態から選択される。
【0055】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、高グリコシル化形態、例えば高マンノシル化形態を実質的に含まない。諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、精製後に約１０％もしくは約１０％未満の高マンノシル化形態、または精製後に約５％もしくは約５％未満の高マンノシル化形態、または精製後に約３％もしくは約３％未満の高マンノシル化形態、または精製後に約２％もしくは約２％未満の高マンノシル化形態、または精製後に約１％もしくは約１％未満の高マンノシル化形態を有する。
【0056】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、同じ方法で発現及び精製された場合に、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムよりも高マンノシル化形態が少ない。諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、同じ方法で発現及び精製された場合に、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムよりも約１００％、または約９０％、または約８０％、または約７０％、または約６０％、または約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％、高マンノシル化形態が少ない。諸実施形態において、高マンノシル化形態の量は、当技術分野で知られているように検出することができ、例えば限定されないが、クロマトグラフィー法（例えば、サイズ分離（例えば、分子量及び／またはカラムにおける保持時間を介して、及び／または蛍光標識（例えば、２－アミノ安息香酸（２－ＡＡ）、２－アミノベンズアミド（２－ＡＢ）、及び２－アミノピリジン（２－ＡＰ）を用いて、アニオン交換クロマトグラフィーなど）、質量分析、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／染色（例えば、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）反応に基づくゲル染色法）、糖結合タンパク質（レクチンなど）の使用などの親和性ベースの方法、酵素ベースの方法、抗体ベースの方法、放出アッセイ（グリカンの酵素的切断もしくは化学的除去、または化学的誘導体化など）、キャピラリー電気泳動、ならびにイースタンブロットなどが挙げられる。
【0057】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、サルグラモスチムに使用されるものよりも複雑でない精製に適している。
【0058】
諸実施形態において、本発明の変異体ＧＭ－ＣＳＦタンパク質は、例えばＨＰＬＣによって、３つのグリコフォームとして分離され、高グリコシル化形態を欠く。図１と対比すると、図１ではＨＰＬＣで分離されたＧＭ－ＣＳＦの４つのピークが示されており、アスタリスクは、高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦピークを識別している。
【0059】
諸実施形態において、本発明のＧＭ－ＣＳＦタンパク質は、１つ以上の有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを必要としなくても、高グリコシル化種を含まずに精製することができる。諸実施形態において、本発明のＧＭ－ＣＳＦタンパク質は、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸及び／またはＮ－プロパノールを使用しなくても、高グリコシル化種を含まずに精製することができる。諸実施形態において、本発明のＧＭ－ＣＳＦタンパク質は、高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムなしで精製することができる。
【0060】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に、３つのピークとして分離される。諸実施形態において、該組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって定量化された場合に、約２０分未満の保持時間で実質的なピークを提供しない。
【0061】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、２以上の種（例えば、グリコフォーム）を含む。諸実施形態において、分子量が約２０ｋＤａを超える種は存在しない。
【0062】
諸実施形態において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを使用せずに精製された際に、高マンノシル化形態を実質的に含まない。
【0063】
諸実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、グリコシル化アイソフォーム及び非グリコシル化アイソフォームの両方を有する不均一なグリコフォームを有する単量体である。
【0064】
組換えＧＭ－ＣＳＦの機能特性
諸実施形態において、本発明の置換及び／または欠失を有する本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムと機能的に類似している（例えば、１つ以上の機能パラメータが、アッセイされた機能パラメータの約５０％以下、もしくは約４０％以下、もしくは約３０％以下、もしくは約２０％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下、または約５倍以下、もしくは約４倍以下、もしくは約３倍以下、もしくは約２倍以下で異なる）。諸実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能パラメータは、当技術分野で知られているアッセイ、例えば限定されないが、ＴＦ－１細胞株、初代骨髄細胞などの細胞を使用する増殖アッセイ、生化学アッセイ、例えば、ＩＬＩＴＥ（ＥＡＧＬＥ）ＧＭ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦプロモータの制御下にあるルシフェラーゼ）など、細胞生存アッセイ、例えば、骨髄細胞生存アッセイ、細胞分化アッセイ、及び共培養実験などによって検出することができる。
諸実施形態において、本発明の置換及び／または欠失を有する本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムと機能的に類似している（例えば、１つ以上の機能パラメータが、アッセイされた機能パラメータの約５０％以下、もしくは約４０％以下、もしくは約３０％以下、もしくは約２０％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下、または約５倍以下、もしくは約４倍以下、もしくは約３倍以下、もしくは約２倍以下で異なる）。諸実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦの機能パラメータは、当技術分野で知られているアッセイ、例えば限定されないが、ＴＦ－１細胞株、初代骨髄細胞などの細胞を使用する増殖アッセイ、生化学アッセイ、例えば、ＩＬＩＴＥ（ＥＡＧＬＥ）ＧＭ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦプロモータの制御下にあるルシフェラーゼ）など、細胞生存アッセイ、例えば、骨髄細胞生存アッセイ、細胞分化アッセイ、及び共培養実験などによって検出することができる。
【0065】
諸実施形態において、本発明の置換及び／または欠失を有する本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ－αまたはＣＳＦ２Ｒ）に結合及び／またはこれを活性化する。諸実施形態において、本発明の置換及び／または欠失を有する本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムと同等の親和性、有効性、及び／または生物学的活性で顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ－αまたはＣＳＦ２Ｒ）に結合及び／またはこれを活性化する（例えば、１つ以上の機能パラメータが、約５０％以下、もしくは約４０％以下、もしくは約３０％以下、もしくは約２０％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下、または約５倍以下、もしくは約４倍以下、もしくは約３倍以下、もしくは約２倍以下で異なる）。ＧＭ－ＣＳＦの結合及び活性化に関するアッセイは、当技術分野で知られている。そのようなアッセイの非限定的な例としては、例えば、放射性リガンドアッセイまたは非放射性リガンドアッセイ（例えば、免疫沈降（ＩＰ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、蛍光偏光法（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。また、結合動態は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析など、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって評価することができる。全細胞リガンド結合アッセイ、及び可溶性ＧＭ－ＣＳＦ受容体α（ｓＧＭＲａ）を用いる無細胞アッセイ系を使用してもよい。使用できるいくつかの他の種類のアッセイとしては、放射性ヨウ素化ＧＭ－ＣＳＦを用いた受容体結合アッセイまたは飽和結合アッセイまたは競合結合アッセイと、細胞増殖アッセイが挙げられる。
【0066】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、１つ以上の細胞ベースの活性バイオアッセイを使用して、例えばＧＭ－ＣＳＦ依存性ヒト細胞株増殖アッセイを使用して、例えば、ＴＦ－１、Ｍ－０７ｅ、ＨＵ－３、Ｍ－ＭＯＫ、ＭＢ－０２、ＧＭ／ＳＯ、Ｆ－３６Ｐ、ＧＦ－Ｄ８、ＥＬＦ－１５３、ＡＭＬ－１９３、ＭＵＴＺ－３、ＯＣＩ－ＡＭＬ５、ＯＣＩ－ＡＭＬ６、ＯＣＩ－ＡＭＬ１、ＳＫＮＯ－１、ＵＣＳＤ－ＡＭＬ１、及びＵＴ－７を使用して、アッセイすることができる。
【0067】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子の効力を、ＧＭ－ＣＳＦに応答して増殖するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイを使用して測定する。このアッセイの詳細は当技術分野で知られている。例えば、参照標準、対照、及び試験試料をアッセイ培地で３連で連続希釈し、３つの別々の９６ウェルプレートに添加する。次いで、懸濁液中のＴＦ－１細胞を添加し、混合物を３７℃で６９．５～７２時間インキュベートする。蛍光色素（例えば、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ）を添加した後、プレートを３７℃で６．６～８時間インキュベートする。そして、ＴＦ－１細胞の増殖を、蛍光マイクロプレートリーダーで測定する。
【0068】
諸実施形態において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子は、変異を欠く組換えヒトＧＭ－ＣＳＦとほぼ同じ比活性を有する（例えば、ＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイを使用してアッセイされる）。
【0069】
諸実施形態において、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは、酵母細胞で産生された組換えヒトＧＭ－ＣＳＦと比較して機能的に増強されている。
【0070】
諸実施形態において、結合及び／または活性化が起こるＧＭ－ＣＳＦ－Ｒ－αは、細胞の表面に発現する。諸実施形態において、細胞は造血前駆細胞である。諸実施形態において、造血前駆細胞は免疫細胞である。実施形態において、造血前駆細胞は放射線照射されている。
【0071】
諸実施形態において、本発明の置換及び／または欠失を有する本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ分子の免疫原性は、野生型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び／またはサルグラモスチムと同等である（例えば、１つ以上の機能パラメータが、約５０％以下、もしくは約４０％以下、もしくは約３０％以下、もしくは約２０％以下、もしくは約１０％以下、もしくは約５％以下、または約５倍以下、もしくは約４倍以下、もしくは約３倍以下、もしくは約２倍以下で異なる）。諸実施形態において、免疫原性は、当技術分野で知られている方法を使用してアッセイされる。非限定的な例としては、例えば、スクリーニングアッセイ、例えば、直接または間接または架橋ＥＬＩＳＡ、電気化学発光、ビーズベースの化学発光アッセイ、放射性免疫沈降アッセイ、表面プラズマ共鳴、及びバイオレイヤー干渉法、ならびに細胞ベースのルシフェラーゼレポーター遺伝子中和抗体アッセイによってアッセイされる１以上の抗ＧＭ－ＣＳＦ結合抗体の検出が挙げられる。
【0072】
諸実施形態において、細胞組換えヒトＧＭ－ＣＳＦは可溶性である。
【0073】
核酸及び宿主細胞
諸実施形態において、本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸分子が提供される。諸実施形態において、核酸分子はコドン最適化配列を有する。
諸実施形態において、本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸分子が提供される。諸実施形態において、核酸分子はコドン最適化配列を有する。
【0074】
諸実施形態において、本明細書に記載の核酸分子を発現する非ヒト宿主細胞が提供される。
【0075】
諸実施形態において、宿主細胞は、酵母、哺乳動物、細菌、昆虫、藻類、または植物細胞である。
【0076】
諸実施形態において、酵母細胞は非メチロトローフ酵母細胞である。諸実施形態において、宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。
【0077】
諸実施形態において、本明細書に記載の核酸分子を発現するＣＨＯ細胞が提供される。
【0078】
薬学的組成物及び製剤
諸実施形態において、本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
諸実施形態において、本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
【0079】
本明細書に記載の任意の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または媒体を含む組成物の成分として対象に投与することができる。このような組成物は、適切な投与のための形態を提供するために、任意選択で、適切な量の薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
【0080】
様々な実施形態において、薬学的賦形剤は、水、及び例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などといった石油、動物、植物、もしくは合成起源の油を含む油などの液体であり得る。薬学的賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用してもよい。一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与されるときに無菌である。水は、本明細書に記載の任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロールの水溶液もまた、特に注射液のための液体賦形剤として用いられ得る。適切な薬学的賦形剤としてはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなども挙げられる。本明細書に記載のいずれの薬剤もまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。適切な薬学的賦形剤の他の例は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されている。
【0081】
本発明は、記載された薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）を様々な製剤で含む。本明細書に記載のいずれの本発明の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）も、液剤、懸濁剤、乳剤、点滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、粉末剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末剤、凍結懸濁剤、乾燥粉末剤、または使用に適した他の形態をとり得る。一実施形態において、組成物はカプセル剤の形態である。別の実施形態において、組成物は錠剤の形態である。さらに別の実施形態において、薬学的組成物は、ソフトゲルカプセル剤の形態で製剤化される。さらなる実施形態において、薬学的組成物は、ゼラチンカプセル剤の形態で製剤化される。さらに別の実施形態において、薬学的組成物は、液剤として製剤化される。
【0082】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）はまた、可溶化剤を含んでもよい。また、薬剤は、当技術分野で知られている好適な媒体または送達デバイスを用いて送達され得る。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達媒体または送達デバイスで共送達され得る。
【0083】
本発明の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）を含む製剤は、好都合に単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野において周知である任意の方法によって調製してもよい。このような方法は一般に、治療薬を１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。典型的には、製剤は、治療薬を液体担体、細かく分割した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させることによって調製され、次に必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形に成形する（例えば、湿式または乾式造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で公知である従来の方法を使用して錠剤化する）。
【0084】
様々な実施形態において、本明細書に記載の任意の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）は、慣用的な手順に従って、本明細書に記載の投与様式に適合した組成物として製剤化される。
【0085】
投与経路としては、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所的が挙げられる。投与は、局所性であっても全身性であってもよい。いくつかの実施形態において、投与は、経口によって行われる。別の実施形態において、投与は、非経口注射によるものである。投与様式は、施術者の裁量に委ねられ、ある程度患部に応じて異なる。ほとんどの場合、投与により、本明細書に記載の任意の薬剤が血流に放出される。
【0086】
特定の実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦ（及び／または追加の治療薬）は、静脈内経路を介して投与される。
【0087】
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）は、慣用的な手順に従って、経口投与に適合した組成物として製剤化される。経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤、顆粒剤、粉末剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態であり得る。経口投与される組成物は、１つ以上の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテーム、またはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはサクランボなどの香味剤；着色剤；及び保存剤を含み、薬学的に口当たりのよい調製物を提供することができる。さらに、錠剤または丸剤の形態では、組成物は、胃腸管における崩壊及び吸収を遅らせるために被覆されてもよく、それにより長期間にわたって持続作用を提供する。浸透圧活性駆動の本明細書に記載の任意の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）を包囲する選択的透過性膜もまた、経口投与される組成物に好適であり得る。これらの後者のプラットフォームにおいて、カプセル剤を包囲する環境からの流体は、駆動化合物によって吸水され、その化合物が膨張して開口部から薬剤または薬剤組成物を置換する。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤のスパイク状プロファイルとは対照的に、本質的にゼロ次送達プロファイルを提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料もまた有用であり得る。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含むことができる。一実施形態において、賦形剤は医薬品グレードのものである。懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、トラガカント、ならびにそれらの混合物を含有してもよい。
【0088】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内への注射及び点滴）に好適な剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、分散液、乳剤などが挙げられる。それらはまた、使用直前に無菌注射用媒体に溶解または懸濁することができる、無菌の固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。これらは、例えば、当技術分野で知られている懸濁剤または分散剤を含んでもよい。非経口投与に好適な製剤成分としては、滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒など；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など；及び浸透圧調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを挙げることができる。
【0089】
静脈内投与では、好適な担体としては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、微生物から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。
【0090】
本明細書に記載の任意の本発明の薬学的組成物（及び／または追加の治療薬）も、制御放出もしくは持続放出手段によって、または当業者に周知である送達デバイスによって投与され得る。その例には、これらに限定されないが、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、及び同第５，７３３，５５６号に記載されているものが含まれ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはこれらの組み合わせを使用して、１つ以上の活性成分の制御放出または持続放出を提供するために有用であり得る。本明細書に記載のものを含む当業者に既知の好適な制御放出製剤または持続放出製剤は、本明細書に記載の薬剤の活性成分とともに使用するために容易に選択することができる。本発明は、このため、制御放出または持続放出するように適合された錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、及びカプレットなどであるが、これらに限定されない経口投与に適した単一の単位剤形を提供する。
【0091】
活性成分の制御放出または持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度もしくは利用能、水の濃度もしくは利用能、または他の生理学的条件もしくは化合物を含むがこれらに限定されない種々の条件によって刺激され得る。
【0092】
別の実施形態において、制御放出系は、治療される標的領域の近くに配置され得、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前述，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４））を参照のこと）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３）による総説で論じられている他の制御放出系を使用してもよい。
【0093】
薬学的製剤は滅菌であることが好ましい。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、フィルター滅菌を、凍結乾燥及び再構成の前または後に行うことができる。
【0094】
薬学的に許容される塩及び賦形剤
本明細書に記載される組成物は、十分に塩基性の官能基を保有することができ、それは、無機酸もしくは有機酸、またはカルボキシル基と反応することができ、無機塩基または有機塩基と反応して、薬学的に許容される塩を形成することができる。当技術分野で周知のように、薬学的に許容される酸付加塩は、薬学的に許容される酸から形成される。このような塩としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２－１９（１９７７）及びＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される薬学的に許容される塩が含まれ、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される組成物は、十分に塩基性の官能基を保有することができ、それは、無機酸もしくは有機酸、またはカルボキシル基と反応することができ、無機塩基または有機塩基と反応して、薬学的に許容される塩を形成することができる。当技術分野で周知のように、薬学的に許容される酸付加塩は、薬学的に許容される酸から形成される。このような塩としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２－１９（１９７７）及びＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される薬学的に許容される塩が含まれ、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0095】
薬学的に許容される塩には、非限定的な例として、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、安息香酸メチル、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α－ヒドロキシ酪酸塩、ブチン－１，４－ジカルボン酸塩、ヘキシン－１，４－ジカルボン酸塩、カプリン酸塩、カプリル酸塩、ケイ皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、リンゴ酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テラフタル酸塩、プロピオール酸塩、プロピオン酸塩、プロピオン酸フェニル、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ナフタレン－１，５－スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、及び酒石酸塩が挙げられる。
【0096】
「薬学的に許容される塩」という用語は、カルボン酸官能基などの酸性官能基及び塩基を有する本発明の組成物の塩も指す。好適な塩基としては、ナトリウム、カリウム、及びリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウム及び亜鉛などの他の金属の水酸化物；アンモニア、及び非置換またはヒドロキシ置換モノ－、ジ－、またはトリ－アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機アミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ－、ビス－、またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミンなどのモノ－、ビス－、またはトリス－（２－ＯＨ－低級アルキルアミン）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ－ジ－低級アルキル－Ｎ－（ヒドロキシル－低級アルキル）－アミン；Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン；及びアルギニン、リジンなどのアミノ酸、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される塩の形態である。
【0098】
使用方法
一態様において、がん治療を受けている、もしくは受けたことがある、または骨髄移植を受けている、もしくは受けたことがある、及び／または骨髄抑制量の放射線に急性被ばくした患者または対象を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質またはその薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。諸実施形態において、患者は、造血前駆細胞のクローン増殖、生存、分化、及び活性化状態を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、巨核球系及び赤血球系前駆細胞の増殖を促進することにより骨髄単球細胞系譜を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって骨髄移植後に治療される。
一態様において、がん治療を受けている、もしくは受けたことがある、または骨髄移植を受けている、もしくは受けたことがある、及び／または骨髄抑制量の放射線に急性被ばくした患者または対象を治療する方法であって、治療有効量の本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質またはその薬学的組成物を患者に投与することを含む、方法が提供される。諸実施形態において、患者は、造血前駆細胞のクローン増殖、生存、分化、及び活性化状態を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、巨核球系及び赤血球系前駆細胞の増殖を促進することにより骨髄単球細胞系譜を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって治療される。諸実施形態において、患者は、好中球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の生存、増殖、及び活性化を刺激することにより造血前駆細胞を調節することによって骨髄移植後に治療される。
【0099】
一態様において、治療有効量の本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質またはその薬学的組成物を患者に投与すること、または有効量の本明細書に記載の薬学的組成物と細胞を接触させ、治療有効量の細胞を投与することを含む治療方法であって、治療が、導入化学療法後の好中球の回復を促進し、及び／または感染症の発生率を低減する；白血球除去及び移植による採取のために造血前駆細胞を末梢血に動員する；自家または同種の骨髄または末梢血前駆細胞を移植した後の骨髄再構築を促進する；自家または同種の骨髄移植後の好中球回復遅延または生着不全を治療する；及び／または急性放射線症候群の造血症候群（Ｈ－ＡＲＳ）を治療する、治療方法が提供される。
【0100】
一態様において、本発明の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質を含む有効量の組成物またはそれを含む薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ウイルスによる感染症を治療するための方法が提供される。
【0101】
諸実施形態において、ウイルス感染症は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型インフルエンザウイルス感染症から任意に選択されるインフルエンザ感染症である。
【0102】
諸実施形態において、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。諸実施形態において、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３から任意に選択されるベータコロナウイルスである。諸実施形態において、コロナウイルスは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅから任意に選択されるアルファコロナウイルスである。
【0103】
コロナウイルスは、ベータコロナウイルス及びアルファコロナウイルスの呼吸器病原体を含むＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科に属し、比較的最近、人間に侵入することが知られるようになった。Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科には、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３などのベータコロナウイルスが含まれる。アルファコロナウイルスには、例えばＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅが含まれる。
【0104】
コロナウイルスは、宿主細胞へのウイルス侵入を促進する、哺乳動物宿主の膜貫通受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）のウイルス認識を担う「スパイク」表面糖タンパク質を介して細胞に侵入する。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｕｔｂｒｅａｋ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｆ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂａｔ ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２０２０。
【0105】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされる新型コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、コウモリ起源であると考えられている新しいウイルスである。ＣＯＶＩＤ－１９は重度の呼吸窮迫を引き起こし、このＲＮＡウイルス株は、公衆衛生に対する大きな脅威であり、世界的な緊急事態と宣言された最近の爆発的感染の原因となっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ゲノムの系統解析により、このウイルスはＳＡＲＳ様コロナウイルス群（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属、Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ亜属）に最も近縁である（ヌクレオチド類似性８９．１％）ことが判明した。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂ ３，２０２０。
【0106】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、細胞表面受容体への結合を媒介する表面糖タンパク質であるＳタンパク質としても知られる「スパイク」タンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質、及びヌクレオカプシドタンパク質をコードするエンベロープ型一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｓ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含むＳタンパク質は、ウイルス膜を宿主細胞膜と融合するように構造的再編成を受ける融合前コンフォメーションで存在する三量体クラスＩ融合タンパク質である。例えば、Ｌｉ，Ｆ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｖｉｒｏｌ．３：２３７－２６１（２０１６）を参照のこと。本文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。融合前コンフォメーションでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の構造は、これまでに発見されている。Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ Ｆｅｂ ２０２０を参照のこと。本文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0107】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＭＮ９０８９４７）の系統解析により、このウイルスはＳＡＲＳ様コロナウイルス群（Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属、Ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ亜属）に最も近縁である（ヌクレオチド類似性８９．１％）ことが判明した。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂ ３，２０２０（本文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0108】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、スパイク表面糖タンパク質、膜糖タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及びヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎを有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの全ゲノム（２９９０３個のヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡ）は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＭＮ９０８９４７としてＮＣＢＩデータベースに記載されている。コロナウイルスタンパク質は、以下からなる群から選択され得る：コロナウイルススパイクタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＱＨＤ４３４１６）、コロナウイルス膜糖タンパク質Ｍ（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＱＨＤ４３４１９）、コロナウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＱＨＤ４３４１８）、及びコロナウイルスヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列：ＱＨＤ４３４２３）。
【0109】
諸実施形態において、本方法は、患者における急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発症を予防または緩和する。
【0110】
諸実施形態において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。諸実施形態において、患者はＣＯＶＩＤ－１９に罹患している。諸実施形態において、患者は、発熱、咳嚇、息切れ、下痢、上気道症状、下気道症状、肺炎、及び急性呼吸器症候群のうちの１つ以上に苦しんでいる。
【0111】
諸実施形態において、患者は低酸素症である。諸実施形態において、患者は呼吸窮迫に苦しんでいる。諸実施形態において、本方法は、患者の酸素化を改善する。諸実施形態において、本方法は、患者の呼吸窮迫からサイトカイン不均衡への移行を予防または緩和する。諸実施形態において、本方法は、サイトカインストームを逆転または予防する。諸実施形態において、本方法は、肺または全身のサイトカインストームを逆転または予防する。諸実施形態において、サイトカインストームは、全身性炎症反応症候群、サイトカイン放出症候群、マクロファージ活性化症候群、及び血球貪食性リンパ組織球症のうちの１つ以上から選択される。諸実施形態において、本方法は、１つ以上の炎症性サイトカインの過剰産生を逆転または予防する。諸実施形態において、炎症性サイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ＩＬ－２ｒａ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、インターフェロン－γ、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ７のうちの１つ以上である。
【0112】
諸実施形態において、本方法は、治療前と比べて患者のウイルス量を減少させる。
【0113】
一態様において、それを必要とする対象においてウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、該方法が、ウイルス感染症から回復したドナー対象から血漿を提供することであって、該血漿が、感染症を引き起こすウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体を含み、該ドナー対象が、抗体の産生を刺激するために本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質で処置されている、提供することと、該血漿をそれを必要とする対象に投与することと、を含む方法が提供される。一態様において、それを必要とする対象においてウイルス感染症を治療または予防するための方法であって、ウイルス感染症から回復したドナー対象に本明細書に記載の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦタンパク質を投与することと、該ドナー対象から感染症を引き起こすウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体を含む血漿を単離することと、該血漿をそれを必要とする対象に投与することと、を含む方法が提供される。
【0114】
諸実施形態において、そのような方法は、ウイルスに対する受動免疫を、それを必要とする対象に提供する。
【0115】
諸実施形態において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体はウイルス抗原に特異的に結合する。諸実施形態において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体はウイルスを中和する。諸実施形態において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体は、ウイルスによる細胞の感染を防止または軽減する。
【0116】
諸実施形態において、ウイルス感染症は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３感染症から任意に選択されるベータコロナウイルス感染症から選択される。諸実施形態において、ウイルス感染症は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅ感染症から任意に選択されるアルファコロナウイルス感染症から選択される。
【0117】
諸実施形態において、ベータコロナウイルス感染症は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である。
【0118】
諸実施形態において、ベータコロナウイルス感染症は、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）であるか、またはそれに関連している。
【0119】
諸実施形態において、ウイルス感染症は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型インフルエンザウイルス感染症から任意に選択されるインフルエンザ感染症である。諸実施形態において、インフルエンザ感染症は、パンデミック２００９インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）または鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）である。
【0120】
諸実施形態において、ドナー対象は、回復前にウイルス感染症に陽性であると検査されている。諸実施形態において、ドナー対象は、ドナー提供前にウイルス感染症の症状が消失している。諸実施形態において、ドナー対象は、血清学的検査を用いてウイルスに対して指向される抗体に陽性であると検査されている。諸実施形態において、ドナー対象は、測定可能な中和抗体力価を示す。諸実施形態において、中和抗体力価は少なくとも約１：１６０である。諸実施形態において、血漿は、ドナー対象からの血液試料から単離される。諸実施形態において、血漿は、プラズマフェレシスによって単離される。諸実施形態において、血漿は、感染症を引き起こすウイルスに対して指向されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＡ抗体の治療有効量を含む。
【0121】
併用療法及び追加の治療薬
様々な実施形態において、本発明の薬学的組成物は、追加の薬剤（複数可）と組み合わせて併用投与される。併用投与は、同時または逐次的であり得る。
様々な実施形態において、本発明の薬学的組成物は、追加の薬剤（複数可）と組み合わせて併用投与される。併用投与は、同時または逐次的であり得る。
【0122】
一実施形態において、本発明の追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦは、対象に同時に投与される。本明細書で使用される「同時に」という用語は、追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦが、約６０分以下、例えば、約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下、約５分以下、または約１分以下の時間間隔で投与されることを意味する。追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦの投与は、単一の製剤（例えば、追加の治療薬とＧＭ－ＣＳＦ組成物とを含む製剤）または別個の製剤（例えば、追加の治療薬を含む第１の製剤とＧＭ－ＣＳＦ組成物を含む第２の製剤）の同時投与によるものであり得る。
【0123】
併用投与は、追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦの薬理学的活性が時間的に重なり、それにより併用治療効果がもたらされるようなタイミングである場合、治療薬を同時に投与することを必要としない。例えば、追加の治療薬及び標的化部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）、ＧＭ－ＣＳＦ組成物を逐次的に投与することができる。本明細書で使用される「逐次的に」という用語は、追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦが、約６０分を超える時間間隔で投与されることを意味する。例えば、追加の治療薬とＧＭ－ＣＳＦとの逐次的投与の間の時間は、約６０分超、約２時間超、約５時間超、約１０時間超、約１日超、約２日超、約３日超、約１週間超、約２週間超、または約１ヶ月超の間隔であり得る。最適な投与時間は、投与される追加の治療薬及びＧＭ－ＣＳＦの代謝速度、排泄速度、及び／または薬力学的活性の速度に依存する。追加の治療薬またはＧＭ－ＣＳＦ組成物のいずれかが最初に投与され得る。
【0124】
併用投与はまた、治療薬を同じ投与経路によって対象に投与することを必要としない。むしろ、各治療薬は、例えば、非経口的または非経口的以外の、任意の好適な経路によって投与することができる。
【0125】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＧＭ－ＣＳＦは、別の治療薬と併用投与されると相乗的に作用する。そのような実施形態において、標的化部分、ＧＭ－ＣＳＦ組成物、及び追加の治療薬は、薬剤が単剤療法に関連して使用されるときに用いられる用量よりも低い用量で投与され得る。
【0126】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は抗ウイルス薬である。
【0127】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、抗ウイルス薬、例えばレムデシビル、ファビピラビル、オセルタミビル、バロキサビル、ガリデシビル、アンプレナビル、チプラナビル、サキナビル、ネルフィナビル、インジナビル、ダルナビル、アタザナビル、エメチン、ロピナビル及び／またはリトナビル、アルビドール及びロピナビル／リトナビル、及び／またはリバビリン、ダルナビル及びコビシスタット、及び／またはＩＦＮ－β－１ｂ、β－Ｄ－Ｎ４－ヒドロキシシチジン（ＮＨＣ）、例えばＥＩＤＤ－１９３１またはＥＩＤＤ－２８０１またはＥＩＤＤ－２８０１など；免疫調節剤、例えばグルココルチコイド、ＩＦＮ－ａ ２ａ、ＩＦＮ－ａ ２ｂ、ＩＦＮ－ｂ、ペグ化ＩＦＮ－ｇ、バリシチニブ、シロリムス、クラザキズマブ、カナキヌマブ、ＸＰｒｏ１５９５、トシリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、アダリムマブ、エクリズマブ、イベルメクチン、アナキンラ、プレジコビックス、シーヤンピン（ｘｉｙａｎｐｉｎｇ）、フィンゴリモド、メチルプレドニゾロン、レロンリマブ、サリドマイド、ＭＫ－２２０６、ニコラサミド、ニタゾキサミド（ｎｉｔａｚｏｘａｍｉｄｅ）、クロロキン、またはヒドロキシクロロキン；抗生物質、例えばカリマイシン、ブリラシジン、アジスロマイシン、バリノマイシン、血管拡張阻害剤／拮抗剤、例えばｒｈＡＣＥ２／ＧＳＫ２５８６８８１／ＡＰＮ０１、ロサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンなど；セリンプロテアーゼ阻害剤、例えばカモスタットメシル酸塩、ナファモスタットなど、他の薬物、例えばブロムヘキシン、アプロチニン、クロルプロマジン、ゾタチフィン、メトトレキサート、レナリドミド、抗ＶＥＧＦ－Ａ、及び静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）などを含む薬剤から選択される。例えば、諸実施形態において、任意のこれらの追加の治療薬が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の状況で使用される。
【0128】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、ファビピラビル、ラニナミビルオクタノエート、ペラミビル、ザナミビル、オセルタミビルリン酸塩、バロキサビルマルボキシル、ウミフェノビル、ウルミン アマンタジン塩酸塩、リマンタジン塩酸塩、アダプロミン、ＬＡＳＡＧ／ＢＡＹ８１－８７９８１、セレコキシブ、エタネルセプト、メトホルミン、ゲムシタビン、ダピビリン、トラメチニブ、リシノプリル、ナプロキセン、ナリジクス酸、ドルゾラミド、ルキソリチニブ、ミドドリン、ジルチアゼム；スタチン類、例えば、アトルバスタチン、ニタゾキサニド；ＰＰＡＲアンタゴニスト、例えばゲムフィブロジルから選択される。例えば、諸実施形態において、任意のこれらの追加の治療薬が、インフルエンザ感染症の状況で使用される。
【0129】
作製方法
諸態様において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを含む組成物を産生する組換え体を作製する方法であって、（ａ）配列番号１または配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｇ３８位、及び／またはＴ３９位または本明細書に記載のそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸をトランスフェクトされた細胞、またはその抽出物を得ることと；（ｂ）１つ以上のＨＰＬＣカラムを使用して、トランスフェクトされた酵母細胞からＧＭ－ＣＳＦを精製することであって、該精製が、有機溶媒（例えば、限定されないがアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）の非存在下である、精製することと；（ｃ）精製されたＧＭ－ＣＳＦを収集することであって、該精製されたＧＭ－ＣＳＦが高グリコシル化、例えば高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦ形態を実質的に含まない、収集することと、を含む、方法が提供される。
諸態様において、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを含む組成物を産生する組換え体を作製する方法であって、（ａ）配列番号１または配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有し、Ｎ３７位、Ｇ３８位、及び／またはＴ３９位または本明細書に記載のそれに対応する位置に置換または欠失を有するアミノ酸配列を含む組換えヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする核酸をトランスフェクトされた細胞、またはその抽出物を得ることと；（ｂ）１つ以上のＨＰＬＣカラムを使用して、トランスフェクトされた酵母細胞からＧＭ－ＣＳＦを精製することであって、該精製が、有機溶媒（例えば、限定されないがアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）の非存在下である、精製することと；（ｃ）精製されたＧＭ－ＣＳＦを収集することであって、該精製されたＧＭ－ＣＳＦが高グリコシル化、例えば高マンノシル化ＧＭ－ＣＳＦ形態を実質的に含まない、収集することと、を含む、方法が提供される。
【0130】
諸実施形態において、細胞は、原核宿主細胞または真核宿主細胞、例えば、酵母、哺乳動物、細菌、昆虫、藻類、または植物細胞である。
【0131】
好適な原核宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、または他の適切な細菌細胞）及び古細菌細胞（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及びＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）が挙げられる。
【0132】
いくつかの実施形態において、本開示の宿主細胞は真核宿主細胞である。好適な真核宿主細胞としては、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、及び魚類細胞）、及び植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0133】
好適な真菌宿主細胞としては、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
好適な酵母宿主細胞としては、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【0135】
適切な糸状菌宿主細胞としては、例えば、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ及びＯｏｍｙｃｏｔａの任意の糸状形態が挙げられる。実施形態において、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａの種、またはそれらのテレオモルフ、またはアナモルフ、及びシノニム、または分類学的同等物の細胞であり得る。一実施形態において、糸状菌は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ、及びＡ．ｎｉｇｅｒ群のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群から選択される。一実施形態において、糸状菌はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである。
【0136】
諸実施形態において、細胞は酵母細胞であり、例えば限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【0137】
諸実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、例えば限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0138】
諸実施形態において、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の産生は、非哺乳動物細胞を使用する産生と比較して、組換えタンパク質の発現レベルを増加させる。
【0139】
諸実施形態において、本方法は、注射、例えば皮下注射または静脈内注射用に精製されたＧＭ－ＣＳＦを製剤化することをさらに含む。
【0140】
配列
配列番号１は野生型ＧＭ－ＣＳＦである。欠失の本発明の置換部位は、下線と太字で示されている。
配列番号１は野生型ＧＭ－ＣＳＦである。欠失の本発明の置換部位は、下線と太字で示されている。
【0141】
【化1】
【0142】
配列番号２はサルグラモスチムである。欠失の本発明の置換部位は、下線と太字で示されている。
【0143】
【化2】
【0144】
定義
以下の定義は、本明細書に開示の発明に関連して使用される。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下の定義は、本明細書に開示の発明に関連して使用される。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0145】
コロナウイルス感染症の治療に有効な薬剤に関連して使用される場合の「有効量」は、コロナウイルス感染症の治療または緩和に有効な量である。
【0146】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。さらに、言及された数値表示に関連して使用される場合の「約」という用語は、その言及された数値表示に、その言及された数値表示の最大１０％を加算または減算することを意味する。例えば、「約５０」という言葉は、４５から５５の範囲を包含する。
【0147】
本明細書で言及される場合、全ての組成パーセンテージは、別段の指定がない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語及びその変形は、リスト内の項目の記載が、本技術の材料、組成物、デバイス、及び方法でも有用であり得る他の類似の項目を除外するものではないように、非限定的であることを意図する。同様に、「～ことができる」及び「～し得る」いう用語及びそれらの変形は、実施形態が特定の要素または特徴を含むことができるまたは含み得るという記載が、それらの要素または特徴を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように非限定的であることが意図される。
【0148】
含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する、または有するなどの用語の同義語としての非制限用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書では本発明を説明及び特許請求するために使用されるが、本発明またはその実施形態は、代わりに、「からなる」または「から本質的になる」などの代替用語を用いて説明される場合がある。
【0149】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに説明される。
【実施例】
【0150】
実施例１：ＧＭ－ＣＳＦ変異体のクローニング及び精製
本発明の変異の有無にかかわらず、タンパク質ＧＭ－ＣＳＦ生成物の発酵及びプロセシングは、高グリコシル化ピークを除去するために使用される有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムの非存在下で実施した。
本発明の変異の有無にかかわらず、タンパク質ＧＭ－ＣＳＦ生成物の発酵及びプロセシングは、高グリコシル化ピークを除去するために使用される有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）、及び／または高グリコシル化ピークの精製及び／または除去の目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムの非存在下で実施した。
【0151】
重要なことには、有機溶媒及び逆相Ｃ４ ＨＰＬＣは、例えば３つのグリコフォームから大きな高グリコシル化形態ピークを除去するために、本発明の変異を欠くＧＭ－ＣＳＦの生成に使用される（図１参照）。このような有機溶媒は本明細書に記載の変異体には使用されないため、これらの有機溶媒を除去することが意図された逆相Ｃ４ ＨＰＬＣを使用する必要性もない。
【0152】
実施例２：ＧＭ－ＣＳＦ変異体の生化学的アッセイ
ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの生化学的同一性を、クマシー染色ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析によって確認した（図２）。精製したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦタンパク質試料をトリス－グリシンＳＤＳ試料緩衝液で希釈した。希釈したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ試料と参照標準を、ヒートブロック内で１００℃で５分間加熱して変性させた。参照標準及びｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ試料を、分子量マーカーとともにプレキャスト２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。ロードされたゲルを定電圧で電気泳動してタンパク質を分離し、続いてクマシーＧ－２５０染色液中でインキュベートしてタンパク質を可視化した。ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで３つのバンドとして移動した。上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ（４ｕｇ／レーン）、分子量ラダー及び参照標準と比較した。
ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの生化学的同一性を、クマシー染色ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析によって確認した（図２）。精製したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦタンパク質試料をトリス－グリシンＳＤＳ試料緩衝液で希釈した。希釈したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ試料と参照標準を、ヒートブロック内で１００℃で５分間加熱して変性させた。参照標準及びｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ試料を、分子量マーカーとともにプレキャスト２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。ロードされたゲルを定電圧で電気泳動してタンパク質を分離し、続いてクマシーＧ－２５０染色液中でインキュベートしてタンパク質を可視化した。ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで３つのバンドとして移動した。上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ（４ｕｇ／レーン）、分子量ラダー及び参照標準と比較した。
【0153】
ウエスタンブロット分析を実施して、タンパク質の同一性を確認した（図２）。精製したｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦタンパク質試料及び参照標準を、前述のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ用に調製した。参照標準及びｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ試料を、染色済み分子量マーカーとともにプレキャスト２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。ロードされたゲルを定電圧で電気泳動してタンパク質を分離し、続いてタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。次いで、ニトロセルロース膜をマウス抗ヒトＧＭ－ＣＳＦモノクローナル抗体でブロットし、続いて免疫検出のためにアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧでブロットした。アルカリホスファターゼ発色現像液を使用して、バンドを可視化した。全ての上清は、ブロットの結果、ＧＭ－ＣＳＦに陽性であった（参照標準と比較してＧＭ－ＣＳＦ領域において陽性バンドが存在）（図２）。
【0154】
逆相ＨＰＬＣを使用して、ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦグリコフォームの構成比を決定した（図３）。有機溶媒も逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムも使用しなかった。単一点変異体Ｔ３９Ａ（３９位のトレオニンのアラニン置換）及びＮ３７Ｑ（３７位のアスパラギンのグルタミン置換）を逆相ＨＰＬＣアッセイで試験し、力価及びグリコフォームを決定した。このアッセイは、参照標準で作成された検量線を使用して力価（ｍｇ／ｍｌ）を算出した。この手順により、ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦグリコシル化バリアントが３つの主要なグリコフォームグループに分割された。試験試料ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ濃度の結果は、ＧＭ－ＣＳＦ参照標準から準備された６レベルの外部標準検量線から補間した。対象の４つのピークを統合し、定量化した。それぞれの構成を以下に示す：
ピーク１＝ＧＭ－ＣＳＦ関連不純物（酸化）
ピーク２＝Ｎ－及び（Ｎ＋Ｏ）結合型グリコフォーム
ピーク３＝Ｏ－結合型グリコフォーム
ピーク４＝非グリコシル化ＧＭ－ＣＳＦ
このアッセイにより残留プロセス成分と高グリコシル化物質を生成物ピークから分離し、グリコフォームプロファイル（ピーク２～４）を得た。生成物ピークは、高グリコシル化物質を加味しないように正規化されて報告された。Ｔ３９Ａでは約６％の高グリコシル化があり、Ｎ３７Ｑでは約６．６％であった。２つの試料は、変異のないＧＭ－ＣＳＦよりも高グリコシル化割合が低い（約４０％、図１を参照）。高グリコシル化物質は、典型的には、有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）及び精製目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを用いたクロマトグラフィーによって除去される。本発明の変異体は、特に、プロセス工程を排除できる可能性があり、それにより時間、資源を節約し、精製プロセスにおいて危険性のある溶媒の使用を減らせる可能性があるため、興味深いものとなっている。
ピーク１＝ＧＭ－ＣＳＦ関連不純物（酸化）
ピーク２＝Ｎ－及び（Ｎ＋Ｏ）結合型グリコフォーム
ピーク３＝Ｏ－結合型グリコフォーム
ピーク４＝非グリコシル化ＧＭ－ＣＳＦ
このアッセイにより残留プロセス成分と高グリコシル化物質を生成物ピークから分離し、グリコフォームプロファイル（ピーク２～４）を得た。生成物ピークは、高グリコシル化物質を加味しないように正規化されて報告された。Ｔ３９Ａでは約６％の高グリコシル化があり、Ｎ３７Ｑでは約６．６％であった。２つの試料は、変異のないＧＭ－ＣＳＦよりも高グリコシル化割合が低い（約４０％、図１を参照）。高グリコシル化物質は、典型的には、有機溶媒（例えば限定されないが、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピリジン、酢酸、及び／またはＮ－プロパノール）及び精製目的で使用される逆相Ｃ４ ＨＰＬＣカラムを用いたクロマトグラフィーによって除去される。本発明の変異体は、特に、プロセス工程を排除できる可能性があり、それにより時間、資源を節約し、精製プロセスにおいて危険性のある溶媒の使用を減らせる可能性があるため、興味深いものとなっている。
【0155】
ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥのＧＭ－ＣＳＦグリコフォームをＣＨＯで発現した変異体ＧＭ－ＣＳＦと比較して決定するために、逆相ＨＰＬＣも使用した（図４）。モル質量分布を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー分析も使用した（図５）。単一点変異体Ｎ３７Ｑ（３７位のアスパラギンのグルタミン置換）及びＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥを逆相ＨＰＬＣアッセイ及びＳＥＣ分析で試験して、力価（図６）及びグリコフォーム（図４及び図５）を決定した。ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥは、酵母細胞であるＳａｃｃｒｏｍｙｃｅｓを使用して産生され、変異体ＧＭ－ＣＳＦは哺乳動物ＣＨＯ細胞を使用して産生された。このアッセイは、参照標準で作成された検量線を使用して力価（ｍｇ／ｍｌ）を算出した。この手順により、ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦグリコシル化バリアントが３つの主要なグリコフォームグループに分割された。試験試料ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ濃度の結果は、ＧＭ－ＣＳＦ参照標準から準備された６レベルの外部標準検量線から補間した。ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥと同様に、ＣＨＯで発現した変異体ＧＭ－ＣＳＦは単量体であり（図５）、両方の試料が複数のグリコフォームを示した（図４）。ＣＨＯ細胞での産生は、酵母での産生と比較して組換えタンパク質の力価を増加させた（図６）。ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥは、配列内にＴ３９ＡまたはＮ３７Ｑアミノ酸置換のいずれも含まない、配列番号１の野生型ＧＭ－ＣＳＦを指す。
【0156】
実施例３：ＧＭ－ＣＳＦ変異体の機能アッセイ
ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの効力を、ＧＭ－ＣＳＦに応答して増殖するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイを使用して測定した（図７）。参照標準（ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ）、対照、及び試験試料を、アッセイ培地で３連で連続希釈し、３つの別々の９６ウェルプレートに添加した。次いで、懸濁液中のＴＦ－１細胞を添加し、混合物を３７℃で６９．５～７２時間インキュベートした。蛍光色素（ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ，ＴＨＥＲＭＯ）を添加した後、プレートを３７℃で６．６～８時間インキュベートした。そして、ＴＦ－１細胞の増殖を、蛍光マイクロプレートリーダーで測定した。単一点Ｔ３９Ａ及びＮ３７Ｑ、ならびにＴ３９ＡまたはＮ３７Ｑ変異のないＧＭ－ＣＳＦ（ＬＥＵＫＩＮＥ）をＴＦ－１バイオアッセイで試験した。ミリグラムあたりの国際単位（ＩＵ／ｍｇ）での比活性（ＳＡ）は、参照標準（サルグラモスチム－ｒｈｕＧＭ－ＣＳＦ）を使用して標準曲線から算出した。両方の変異体は、ＬＥＵＫＩＮＥと同様の活性を示し、ＳＡは、ＬＥＵＫＩＮＥの８．１４×１０６ＩＵ／ｍｇと比較して、９．１３×１０６（Ｔ３９Ａ）及び７．４８×１０６（Ｎ３７Ｑ）であると算出された。
ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの効力を、ＧＭ－ＣＳＦに応答して増殖するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイを使用して測定した（図７）。参照標準（ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦ）、対照、及び試験試料を、アッセイ培地で３連で連続希釈し、３つの別々の９６ウェルプレートに添加した。次いで、懸濁液中のＴＦ－１細胞を添加し、混合物を３７℃で６９．５～７２時間インキュベートした。蛍光色素（ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ，ＴＨＥＲＭＯ）を添加した後、プレートを３７℃で６．６～８時間インキュベートした。そして、ＴＦ－１細胞の増殖を、蛍光マイクロプレートリーダーで測定した。単一点Ｔ３９Ａ及びＮ３７Ｑ、ならびにＴ３９ＡまたはＮ３７Ｑ変異のないＧＭ－ＣＳＦ（ＬＥＵＫＩＮＥ）をＴＦ－１バイオアッセイで試験した。ミリグラムあたりの国際単位（ＩＵ／ｍｇ）での比活性（ＳＡ）は、参照標準（サルグラモスチム－ｒｈｕＧＭ－ＣＳＦ）を使用して標準曲線から算出した。両方の変異体は、ＬＥＵＫＩＮＥと同様の活性を示し、ＳＡは、ＬＥＵＫＩＮＥの８．１４×１０６ＩＵ／ｍｇと比較して、９．１３×１０６（Ｔ３９Ａ）及び７．４８×１０６（Ｎ３７Ｑ）であると算出された。
【表1】
【0157】
驚くべきことに、これらのアミノ酸置換は劇的であるにもかかわらず（例えば、理論に束縛されることを望まないが、Ｔ３９Ａでは側鎖長を大幅に減少させ、Ｎ３７Ｑでは側鎖長を増加させる）、生物学的活性に影響を与えずに製造をより容易にする。
【0158】
さらに、変異体ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦの効力を、ＧＭ－ＣＳＦに応答して増殖するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ－１細胞を用いたバイオアッセイを使用して測定した。ＣＨＯ細胞で増殖させたＮ３７位に単一アミノ酸を有する変異体ｒｈｕ ＧＭ－ＣＳＦは、異なる条件を使用して保存した、酵母細胞Ｓａｃｃｒｏｍｙｃｅｓで増殖させたＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥの３つの異なるバッチ（Ｌｅｕｋｉｎｅ ＢＤＳ新規物質、２～８℃で１２ヶ月保存したＬｅｕｋｉｎｅ ＢＤＳ、－７０℃で４８ヶ月保存したＬｅｕｋｉｎｅ）と比較して、組換えタンパク質の活性を著しく増強した（図８）。ＢＤＳ ＬＥＵＫＩＮＥは、配列内にＴ３９ＡまたはＮ３７Ｑアミノ酸置換のいずれも含まない、配列番号１の野生型ＧＭ－ＣＳＦを指す。
【0159】
等価物
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に詳細に記載される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に詳細に記載される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
【0160】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0161】
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に構成上の理由によるものであり、いかなる様式においても本開示を限定することを意図するものではない。いかなる個々のセクションの内容も、全てのセクションに等しく適用可能であり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】