(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-15
(54)【発明の名称】肝疾患の評価のためのキット、試薬、及び方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20231108BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231108BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526414
(86)(22)【出願日】2021-10-26
(85)【翻訳文提出日】2023-06-27
(86)【国際出願番号】 US2021056568
(87)【国際公開番号】W WO2022093757
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/107,730
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】スティーヴン・ケー・グリンスプーン
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045CA26
2G045DA36
(57)【要約】
本願発明は、患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価するための、及び対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するための方法、試薬、並びにキットに関するものである。本方法、試薬、及びキットは、対象からの血漿サンプル等の生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のレベルの判定に基づくものである。本方法、試薬、及びキットは、例えば、患者におけるＮＡＦＬＤの進行及び／又は治療に対する患者の応答を評価するために使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価する方法であって、前記方法は、前記患者からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）の第１のタンパク質レベルを第１の時点で測定する工程と、
前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを第２以降の時点で測定する工程と、を含み、
ここで、第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に後退していることを示し、
第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの増加は、ＮＡＦＬＤの重症度が患者において経時的に進行していることを示し、及び
第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第の２タンパク質レベルに変化がないことは、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に安定していることを示す、方法。
【請求項2】
前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＮＡＦＬＤの重症度が、線維化スコア及び／又はＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＮＡＦＬＤの重症度が、線維化スコアを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＮＡＦＬＤの重症度が、ＮＡＳを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
前記患者が、第１の時点と第２の時点との間にＮＡＦＬＤに対する治療を受けた、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）分子又はそのアナログの投与を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記生体試料が、血液由来試料である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記血液由来試料が、血漿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ＶＥＧＦＡのタンパク質量を測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
ＴＧＦＢ１のタンパク質量を測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ＣＳＦ１のタンパク質量を測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記患者が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
対象が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定する工程を含み、ここで、対応する対照レベルと比較して、前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の高いレベルは、前記対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性が高いことを示す、方法。
【請求項19】
前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＮＡＦＬＤが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＮＡＦＬＤが、肝線維症を含む、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記生体試料が、血液由来試料である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記血液由来試料が、血漿である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
ＶＥＧＦＡのタンパク質量を測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
ＴＧＦＢ１のタンパク質量を測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
ＣＳＦ１のタンパク質量を測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記方法が、ＮＡＦＬＤに罹患している疑いのある対象からの生体試料に対して実施される、請求項１８～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記対象が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルの上昇を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、請求項１８～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療するための方法であって、請求項１８～３２のいずれか１項に記載の方法を用いて、ＮＡＦＬＤに罹患している増加した可能性を有する対象を識別する工程と、及び前記対象にＮＡＦＬＤに対する治療を施す工程と、を含む、方法。
【請求項34】
前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）又はそのアナログの投与を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
ａ）患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価するため、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するために使用のキットであって、前記キットが、生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定するための試薬と、及び、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベル、及び／又は前記ＮＡＦＬＤの重症度及び／又はＮＡＦＬＤに罹患している可能性を相関させるための指示と、を備える、キット。
【請求項37】
前記キットが、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、請求項３７に記載のキット。
【請求項39】
ａ）生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）と、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）と、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルとを測定するための試薬と、並びに（ｂ）非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているか、罹患している疑いがある対象からの生体試料と、を備える、アッセイ混合物。
【請求項40】
前記アッセイ混合物が、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、請求項３９に記載のアッセイ混合物。
【請求項41】
前記アッセイ混合物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、請求項４０に記載のアッセイ混合物。
【請求項42】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部分にコンジュゲートされる、請求項４０又は４１に記載のアッセイ混合物。
【請求項43】
前記生体試料が、血液由来試料である、請求項３９～４２のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【請求項44】
前記血液由来試料が、血漿である、請求項４３に記載のアッセイ混合物。
【請求項45】
前記生体試料が、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである、請求項３９～４４のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の参照
本願は、２０２０年１０月３０日に出願された米国仮出願番号６３／１０７，７３０の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２０年１０月３０日に出願された米国仮出願番号６３／１０７，７３０の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本願は、２０２１年１０月１日に作成され、約２５ｋＢのサイズを有する「１１７１８＿４１９＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と題するコンピュータ可読形式の配列表を含む。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年１０月１日に作成され、約２５ｋＢのサイズを有する「１１７１８＿４１９＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と題するコンピュータ可読形式の配列表を含む。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、一般に、肝疾患の分野に関するものであり、より特定的には、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び肝繊維症の状態及び進行の評価に関するものである。
【背景技術】
【0004】
ＮＡＦＬは、肝細胞（ステアトーシス）へのトリグリセリドの過剰の蓄積によって定義され、その結果、炎症、細胞のバルーン化及び損傷、及び線維化によって特徴付けられる。この点が大きく変化すると、ＮＡＳＨにつながる。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、線維化、最終的には肝硬変へと進行する可能性があり、一般集団における末期肝疾患の原因としてますます重要となっており、ＨＩＶ感染者においても研究が行われている（１－６）。ＮＡＦＬ／ＮＡＳＨは、ＨＩＶ患者において有病率が高く、一般集団に比べて進行が早い傾向がある。ＨＩＶに関連する多くの併存疾患がＨＩＶ疾患の重症度の上昇に伴って悪化するのとは対照的に、ＮＡＦＬＤは体重増加したＨＩＶ患者においてより一般的に発生する可能性があり、中心脂肪率と関連している。ＨＩＶ感染者（ＰＬＷＨ）では、体重増加、腹部脂肪の蓄積、及び内臓脂肪の増加が一般的で、新しい抗レトロウイルス薬を使用してでさえ見られる。
【0005】
現在、患者のＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの発症と進行をモニターするためのシンプルで信頼性の高いアッセイはない。ＮＡＳＨの存在は、肝線維化の発症と進行の主な予測因子であり、肝線維化の進行は、肝臓関連の有害な臨床転帰の主な判定因子である。したがって、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ及び進行した線維症の識別とモニタリングは、予後及び疾患管理上重要性を有する。
【0006】
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨは、肝酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルが上昇した対象に疑われることがあるが、これらのマーカーは他の肝臓疾患でも上昇することがわかっている。肝臓の脂肪を検出するために、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、超音波エラストグラフィ（ＵＳＥ）、定量的超音波ベースの技術、磁気共鳴エラストグラフィ（ＭＲＥ）、及び磁気共鳴ベースの脂肪定量技術などの画像技術も使用されるが、通常、肝臓の炎症及び／又は線維化を検出できないことがある。また、これらの技術は専用の撮影装置と放射線科医による画像の解析を必要とする。肝生検は、主に信頼できる非侵襲的な方法がないため、ＮＡＳＨの診断と病期分類のためのゴールドスタンダードであり続けている。しかし、肝生検は高価であり、主観的であり、及び患者にとってリスクを伴うものである。
【0007】
そのため、患者さんのＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨや肝線維症の状態や進行を評価するための、シンプルで信頼性の高い非侵襲的アッセイの開発が求められている。
【0008】
本記載には、いくつかの文献を参照し、それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国仮出願番号６３／１０７，７３０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、一般に、肝疾患の分野に関するものであり、より特定的には、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び肝繊維症の状態及び進行の評価に関するものである。
【0011】
様々な態様及び実施形態において、本開示は、以下の項目を提供する：
１．患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価する方法であって、前記方法は、
前記患者からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）の第１のタンパク質レベルを第１の時点で測定する工程と、
前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを第２以降の時点で測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に後退していることを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの増加は、ＮＡＦＬＤの重症度が患者において経時的に進行していることを示し、及び
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルに変化がないことは、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に安定していることを示す、方法。
２．前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１に記載の方法。
３．前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１又は２に記載の方法。
４．前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、線維化スコア及び／又はＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、前記線維化スコアを含む、項目５に記載の方法。
７．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、ＮＡＳを含む、項目５又は６に記載の方法。
８．前記患者が、前記第１の時点と前記第２の時点との間にＮＡＦＬＤに対する治療を受けた、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）分子又はそのアナログの投与を含む、項目８に記載の方法。
１０．前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、項目９に記載の方法。
１１．前記生体試料が、血液由来試料である、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．前記血液由来試料が、血漿である、項目１１に記載の方法。
１３．ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記患者が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、項目１～１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．対象が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定する工程を含み、ここで、対応する対照レベルと比較して、前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の高いレベルは、前記対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性が高いことを示す、方法。
１９．前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
２０．前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１８又は１９に記載の方法。
２１．前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記ＮＡＦＬＤが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記ＮＡＦＬＤが、肝線維症を含む、項目１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記生体試料が、血液由来試料である、項目１８～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記血液由来試料が、血漿である、項目２３に記載の方法。
２６．ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、項目１８～２６までのいずれか１項に記載の方法。
２８．ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記方法が、ＮＡＦＬＤに罹患している疑いのある対象からの生体試料に対して実施される、項目１８～２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記対象が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルの上昇を有する、項目３０に記載の方法。
３２．前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、項目１８～３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療するための方法であって、項目１８～３２のいずれか１項に記載の方法を用いて、ＮＡＦＬＤに罹患している増加した可能性を有する対象を識別する工程と、及び前記対象にＮＡＦＬＤに対する治療を施す工程と、を含む、方法。
３４．前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）又はそのアナログの投与を含む、項目３３に記載の方法。
３５．前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、項目３４に記載の方法。
３６．（ａ）患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価するため、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するために使用のキットであって、前記キットが、生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定するための試薬と、及び、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベル、及び／又は前記ＮＡＦＬＤの重症度及び／又はＮＡＦＬＤに罹患している可能性を相関させるための指示と、を備える、キット。
３７．前記キットが、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、項目３６に記載のキット。
３８．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目３７に記載のキット。
３９．（ａ）生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）と、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）と、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルとを測定するための試薬と、並びに（ｂ）非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているか、罹患している疑いがある対象からの生体試料と、を備える、アッセイ混合物。
４０．前記アッセイ混合物が、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、項目３９に記載のアッセイ混合物。
４１．前記アッセイ混合物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、項目４０に記載のアッセイ混合物。
４２．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部分にコンジュゲートされる、項目４０又は４１に記載のアッセイ混合物。
４３．前記生体試料が、血液由来試料である、項目３９～４２のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
４４．前記血液由来試料が、血漿である、項目４３に記載のアッセイ混合物。
４５．前記生体試料が、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである、項目３９～４４のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
１．患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価する方法であって、前記方法は、
前記患者からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）の第１のタンパク質レベルを第１の時点で測定する工程と、
前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを第２以降の時点で測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に後退していることを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの増加は、ＮＡＦＬＤの重症度が患者において経時的に進行していることを示し、及び
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルに変化がないことは、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に安定していることを示す、方法。
２．前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１に記載の方法。
３．前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１又は２に記載の方法。
４．前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、線維化スコア及び／又はＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、前記線維化スコアを含む、項目５に記載の方法。
７．前記ＮＡＦＬＤの重症度が、ＮＡＳを含む、項目５又は６に記載の方法。
８．前記患者が、前記第１の時点と前記第２の時点との間にＮＡＦＬＤに対する治療を受けた、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）分子又はそのアナログの投与を含む、項目８に記載の方法。
１０．前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、項目９に記載の方法。
１１．前記生体試料が、血液由来試料である、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．前記血液由来試料が、血漿である、項目１１に記載の方法。
１３．ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
１５．ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
１７．前記患者が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、項目１～１６のいずれか１項に記載の方法。
１８．対象が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している可能性を評価する方法であって、前記方法が、前記対象からの生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定する工程を含み、ここで、対応する対照レベルと比較して、前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の高いレベルは、前記対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性が高いことを示す、方法。
１９．前記方法が、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
２０．前記方法が、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１８又は１９に記載の方法。
２１．前記方法が、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む、項目１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
２２．前記ＮＡＦＬＤが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
２３．前記ＮＡＦＬＤが、肝線維症を含む、項目１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
２４．前記生体試料が、血液由来試料である、項目１８～２３のいずれか１項に記載の方法。
２５．前記血液由来試料が、血漿である、項目２３に記載の方法。
２６．ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程が、ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＶＥＧＦＡと前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
２７．ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＴＧＦＢ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、項目１８～２６までのいずれか１項に記載の方法。
２８．ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程が、ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと前記生体試料を接触させる工程と、ＣＳＦ１と前記抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体の量を測定する工程と、を含む、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の方法。
２９．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
３０．前記方法が、ＮＡＦＬＤに罹患している疑いのある対象からの生体試料に対して実施される、項目１８～２９のいずれか１項に記載の方法。
３１．前記対象が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルの上昇を有する、項目３０に記載の方法。
３２．前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に罹患している、項目１８～３１のいずれか１項に記載の方法。
３３．非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を治療するための方法であって、項目１８～３２のいずれか１項に記載の方法を用いて、ＮＡＦＬＤに罹患している増加した可能性を有する対象を識別する工程と、及び前記対象にＮＡＦＬＤに対する治療を施す工程と、を含む、方法。
３４．前記治療が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）又はそのアナログの投与を含む、項目３３に記載の方法。
３５．前記治療が、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２又はその薬学的に許容される塩の投与を含む、項目３４に記載の方法。
３６．（ａ）患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価するため、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するために使用のキットであって、前記キットが、生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルを測定するための試薬と、及び、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベル、及び／又は前記ＮＡＦＬＤの重症度及び／又はＮＡＦＬＤに罹患している可能性を相関させるための指示と、を備える、キット。
３７．前記キットが、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、項目３６に記載のキット。
３８．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部位にコンジュゲートされる、項目３７に記載のキット。
３９．（ａ）生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）と、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）と、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルとを測定するための試薬と、並びに（ｂ）非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患しているか、罹患している疑いがある対象からの生体試料と、を備える、アッセイ混合物。
４０．前記アッセイ混合物が、（ｉ）ＶＥＧＦＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉ）ＴＧＦＢ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、（ｉｉｉ）ＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、を備える、項目３９に記載のアッセイ混合物。
４１．前記アッセイ混合物は、（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む、項目４０に記載のアッセイ混合物。
４２．前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、検出可能な部分にコンジュゲートされる、項目４０又は４１に記載のアッセイ混合物。
４３．前記生体試料が、血液由来試料である、項目３９～４２のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
４４．前記血液由来試料が、血漿である、項目４３に記載のアッセイ混合物。
４５．前記生体試料が、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである、項目３９～４４のいずれか１項に記載のアッセイ混合物。
【0012】
本開示の他の目的、利点、及び特徴は、添付の図面を参照して実施例としてのみ与えられる、その特定の実施形態の以下の非制限的な説明を読めばより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】添付図面において、図１は、本明細書に記載された研究で行われた分析の概略図である。その結果、総１３種類の血漿タンパク質が検査され、差次的に変調された肝遺伝子パスウェイ内に含まれる最先端遺伝子に対応することがわかった。分析は、治療効果の方向性が肝遺伝子発現の変化の方向性と一致した９つのタンパク質のサブセットに焦点を当てた。略語：ＣＡＳＰ８、ｃａｓｐａｓｅ８（カスパーゼ８）、ＣＣＬ２０、Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ２０（Ｃ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド２０）、ＣＲＴＡＭ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（細胞傷害性及び調節性Ｔ細胞分子）、ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＣＸＣＬ１２、Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ１２（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド１２）、ＮＣＲ１、ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ナチュラルサイトトキシックトリガー受容体１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子β１）；ＴＮＦＲＳＦ２１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１）；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
【図2】図２Ａ～Ｃは、血漿中のＶＥＧＦＡ（図２Ａ）、ＴＧＦＢ１（図２Ｂ）、及びＣＳＦ１（図２Ｃ）の治療状態による異なる変化を示すグラフである。テサモレリンは、血漿中のＶＥＧＦＡ（ｌｏｇ２－倍率変化、平均±標準偏差，－０．２０±０．３５対．０．０５±０．３４、Ｐ＝０．０２）、ＴＧＦＢ１（ｌｏｇ２－倍率変化－０．３５±０．５６対．－０．０５±０．４３、Ｐ＝０．０５）及びＣＳＦ１（ｌｏｇ２－倍率変化－０．１７±０．２１対．０．０２±０．２０、Ｐ＝０．００４）がプラシーボと比較して著しく減少することがわかった。棒グラフは平均値、エラーバーは平均値の標準誤差をそれぞれ示す。略語：ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子β１）；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
【図3】図３Ａ及びＢは、テサモレリン治療参加者における血漿ＶＥＧＦＡ（図３Ａ）及びＣＳＦ１（図３Ｂ）の変化とＮＡＳスコアの変化との関係を示すグラフである。テサモレリン投与群では、血漿中のＶＥＧＦＡ（ｒ＝０．６２、Ｐ＝０．００６）及びＣＳＦ１（ｒ＝０．５０、Ｐ＝０．０４）の減少がＮＡＳスコアの低下と関連した。９５％信頼区間を含む直線回帰線を示す。略語：ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＮＡＳ、ＮＡＦＬＤ活動スコア；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
【図4】図４Ａ及び４Ｂは、血漿ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１の変化と、遺伝子レベルの線維化スコアの変化との関係を示すグラフである。テサモレリン治療参加者のうち、血漿ＴＧＦＢ１（図４Ａ）（ｒ＝０．６１、Ｐ＝０．００９）及びＣＳＦ１（図４Ｂ）（ｒ＝０．６４、Ｐ＝０．００６）の低下は、遺伝子レベルの線維化スコアの改善と関連した。９５％信頼区間を含む直線回帰線を示す。略語：ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ１（トランスフォーミング増殖因子β１）。
【図5】図５は、ヒトＶＥＧＦＡのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：５）を示す。アミノ酸１～２６（配列ＩＤ番号：６）はシグナルペプチドを定義し、アミノ酸２７～２３２（配列ＩＤ番号：７）は成熟ポリペプチドを定義する。
【図6】図６は、ヒトＴＧＦＢ１のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：８）を示す。アミノ酸１～２９（配列ＩＤ番号：９）はシグナルペプチドを定義し、アミノ酸３０～２７８（配列ＩＤ番号：１０）は潜伏期関連ペプチドを定義し、アミノ酸２７９～３９０（配列ＩＤ番号：１１）は成熟ポリペプチドを定義する。
【発明を実施するための形態】
【0014】
技術を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、並びに同様の指示対象の使用は、本明細書において別段示されないか、又は文脈に明らか矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するように解釈されるものである。
【0015】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する」という用語は、別段注釈が付かない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるものである。
【0016】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。
【0017】
本明細書に提供される任意の及びすべての実施例、又は例示的な言語（「例えば」、「など」）の使用は、単に特許請求される技術の実施形態をより良好に例示することを意図しており、別段特許請求されない限り、範囲の限定を提起するものではない。
【0018】
本明細書におけるいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を特許請求される技術の実施形態の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【0019】
本明細書では、「約」という用語は、その通常の意味を有する。「約」という用語は、値が、値を判定するために用いられるデバイス若しくは方法の誤差についての固有の変動を含むか、又は列挙された値に近い値、例えば、列挙された値（又は値の範囲）の１０％以内の値を包含することを示すために使用される。
【0020】
本明細書における値の範囲の言及は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に、範囲に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略方法として機能することを意図しており、各個別の値は本明細書に個別に言及されているかのように、本明細書に組み入れられる。範囲内の値のすべてのサブセットもまた、本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0021】
開示の特徴又は態様が、マーカッシュ群又は代替物の一覧の観点から説明される場合、当業者は、開示がまた、それによってマーカッシュ群又は代替物の一覧の任意の個々の構成要素又は構成要素の部分群の観点からも説明されることを認識するだろう。
【0022】
別段具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味（例えば、幹細胞生物学、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）と同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【0023】
別段示されない限り、本開示において利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、次のようなソースの文献で、記載され、説明される：Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｌ ｕｐｄａｔｅｓ ｕｎｔｉｌ ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までのすべてのアップデートを含む）。
【0024】
本明細書に記載の研究において、本発明者らは、テサモレリンを投与したＮＡＦＬＤに罹患している患者の血漿中に、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及びコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のレベルの低下が検出されることを示してきた。ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの病理学的特徴の改善、例えば患者のＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）及び／又は遺伝子レベルの線維化スコアの減少と相関があることが示された。
【0025】
ＮＡＳクリニカルリサーチネットワーク（ＮＡＳ ＣＲＮ）のスコアリングシステムに従って算出されたＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）は、脂肪症（０～３程度）、肝細胞バルーン（０～２程度）、及び小葉の炎症（０～３程度）の程度の合計を含む（Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００５；４１：１３１３－２１）。
【0026】
一態様において、本開示は、対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価する方法を提供し、前記方法は、前記対象の生体試料中の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦＢ１）、及び／又はコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）のタンパク質レベルの測定する工程を含み、ここで、対応する対照レベルと比較して、前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の高いレベルは、前記対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性が高いことを示す、前記測定する工程、を含む。
【0027】
「対照レベル」又は「参照レベル」又は「標準レベル」は、本明細書において互換的に使用され、広義には、疾患（例えば、ＮＡＦＬＤ）に罹患していない対象からであってもよい、１つ以上の同等の「対照」試料で測定された別のベースラインレベルを広く言及する。対応する対照レベルは、複数の参照対象又は対照対象で測定されたレベルに基づいて算出された標準／平均値又は中央値に対応するレベル（例えば、あらかじめ判定又は確立された標準レベル）であってよい。対照レベルは、当該技術分野で認知されているあらかじめ判定された「カットオフ」値であってもよいし、１人又は１群の対照対象からの試料で測定されたレベルに基づいて確立されてもよい。例えば、「閾値参照レベル」は、ＮＡＦＬＤに罹患している可能性又はそのリスクが高い患者を、ＮＡＦＬＤに罹患していない可能性又はそのリスクが高くない患者と統計的に有意に区別することができるＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の最小レベル（カットオフ）に相当するレベルでもよく、例えば、ＮＡＦＬＤ患者からの試料及び健康な対象（すなわち、ＮＡＦＬＤに罹患していない）からの試料を用いて判定できる場合がある。対応する基準／対照レベルは、年齢、性別、人種、又は他のパラメータに対して調整又は正規化してもよい。したがって、「対照レベル」は、すべての患者に等しく適用される単一の数値／値とすることができ、又は、対照レベルは、患者の特定の部分集団に応じて変化させることができる。したがって、例えば、年配の男性は若い男性とは異なる対照レベルを有する可能性があり、女性は男性とは異なる対照レベルを持つ可能性がある。所定の標準レベルは、例えば、被検集団を低リスク群、中リスク群、及び高リスク群などの群に等分（又は不等）するか、四分位又は五分位に分け、最低の四分位又は五分位はリスクが最も低い（すなわち、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のレベルが最も低い）個人であり、最も高い四分位又は五分位はリスクが最も高い（すなわち、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１レベルが最も高い）個人であるように配置できる。また、本開示による対照レベルは、所定のレベル又は標準に加えて、実験試料と並行して試験された他の試料（例えば、健康な／正常な対象から）で測定されたレベルでもよいことも理解されるだろう。参照レベル又は対照レベルは、正規化されたレベル、すなわち、ハウスキーピング遺伝子の発現に基づく正規化の対象となる参照値又は対照値に対応しても良い。
【0028】
実施形態において、対照レベルは、ＮＡＦＬＤに罹患していないことが知られている対象の生体試料において判定されたＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の対応するレベル、又はＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の確立した参照若しくは標準レベルである。
【0029】
本開示はまた、患者における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重症度を経時的に評価するための方法を提供し、前記方法は：
第１の時点で、前記患者からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、
前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを第２以降の時点において測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に後退していることを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの増加は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に進行していることを示し、及び
前記第１の時点と第２の時点との間でＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１のタンパク質レベルに変化がないことは、ＮＡＦＬＤの重症度が患者において経時的に安定していることを示す、方法。
第１の時点で、前記患者からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、
前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを第２以降の時点において測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの減少は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に後退していることを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの増加は、ＮＡＦＬＤの重症度が前記患者において経時的に進行していることを示し、及び
前記第１の時点と第２の時点との間でＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１のタンパク質レベルに変化がないことは、ＮＡＦＬＤの重症度が患者において経時的に安定していることを示す、方法。
【0030】
ＶＥＧＦＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５６９２）は、シグナルペプチドを定義するアミノ酸１－２６及び成熟ポリペプチドを定義するアミノ酸２７－２３２を有する２３２アミノ酸のタンパク質（前駆体、アイソフォーム１）である。ＶＥＧＦＡ（アイソフォーム１）のアミノ酸配列は、図５に示される。
【0031】
ＴＧＦＢ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０１１３７）は、シグナルペプチドを定義するアミノ酸１－２９を有する３９０アミノ酸（前駆体）のタンパク質であり、タンパク質分解処理されて１１２アミノ酸（残基２７９－３９０）の成熟ペプチドを生成する。ＴＧＦＢ１のアミノ酸配列は、図６に示される。
【0032】
ＣＳＦ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０９６０３）は、最初は膜に結合した前駆体として生成されるが、刺激により処理され分泌される。前駆体は、シグナルペプチドを定義するアミノ酸１－３２及び処理された成熟型を定義する残基３３－４５０を有する５５４アミノ酸（アイソフォーム１）を含む。ＣＳＦ１のアミノ酸配列（アイソフォーム１）は、図７に示される。
【0033】
ＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価する上記の方法は、複数の時点で実施することができる。すなわち、患者からの対応する生体試料（複数可）におけるＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第３、第４、第５などの時点で実施されてもよい。２つの時点の間の間隔は、例えば、１日、２日、３日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年などであり、すべての時点について同じであってもよいし、変化してもよい（例えば、第１の時点と第２の時点の間は１週間、第２の時点と第３の時点の間は１ヶ月など）。
【0034】
この方法によって、患者の状態が経時的に改善、悪化、又は安定しているかどうかを判定することができる。一実施形態において、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で減少し、その減少は、患者におけるＮＡＳスコア及び／又は肝線維化の減少を示すものである。一実施形態において、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で増加し、その増加は、患者におけるＮＡＳスコア及び／又は肝線維化の増加を示すものである。一実施形態において、ＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で減少し、その減少は、患者におけるＮＡＳスコア及び／又は肝線維化の減少を示すものである。一実施形態において、ＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で増加し、その増加は、患者におけるＮＡＳスコア及び／又は肝線維化の増加を示すものである。一実施形態において、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で減少し、その減少は、ＮＡＳスコアの減少を示すものである。一実施形態において、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で増加し、その増加は、ＮＡＳスコアの増加を示すものである。一実施形態において、ＶＥＧＦＡ及びＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で減少し、その減少は、患者におけるＮＡＳスコアの減少を示すものである。一実施形態において、ＶＥＧＦＡ及びＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で増加し、その増加は、患者におけるＮＡＳスコアの増加を示すものである。一実施形態において、ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で減少し、その減少は、患者における肝線維化の減少を示すものである。一実施形態において、ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１のタンパク質レベルは、第１の時点と第２の時点との間で増加し、その増加は、患者における肝線維化の増加を示すものである。
【0035】
ＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価する上記の方法は、ＮＡＦＬＤ罹患している患者がＮＡＦＬＤに対する治療／療法に応答するか否かを判定するため、すなわち、治療／療法が有効で患者の状態を改善するか否かを判定するために有用であり得る。したがって、別の実施形態では、患者は、第１の時点と第２の時点の間で治療／療法を施されている。別の実施形態では、患者は、第１の時点と第２の時点の間で、減量プログラム、すなわち、健康的な（低カロリーの）食事及び／又は身体運動を受ける。
【0036】
したがって、別の態様において、本開示は、治療がＮＡＦＬＤ罹患している患者の状態を改善するかどうかを評価するための方法に関し、前記方法は、
第１の時点で、前記患者からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、
ＮＡＦＬＤに対する治療薬を前記患者に一定期間投与する工程と、及び前記期間経過後の第２の時点において、前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの減少は、前記治療が前記患者の状態を改善したことを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間で、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルに変化無し又は増加は、前記治療が前記患者の状態を改善しなかったことを示す。
第１の時点で、前記患者からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、
ＮＡＦＬＤに対する治療薬を前記患者に一定期間投与する工程と、及び前記期間経過後の第２の時点において、前記患者からの対応する生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程と、を含み、
ここで、前記第１の時点と第２の時点との間のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの減少は、前記治療が前記患者の状態を改善したことを示し、
前記第１の時点と第２の時点との間で、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルに変化無し又は増加は、前記治療が前記患者の状態を改善しなかったことを示す。
【0037】
一実施形態において、患者の状態の改善は、ＮＡＳスコアの減少を含む。さらなる実施形態において、患者の状態の改善は、ＮＡＳスコアの減少を含み、前記方法は、ＶＥＧＦＡ及び／又はＣＳＦ１のレベルを測定する工程を含む。
【0038】
一実施形態において、患者の状態の改善は、肝線維症の軽減を含む。さらなる実施形態において、患者の状態の改善は、肝線維症の軽減を含み、前記方法は、ＴＧＦＢ１及び／又はＣＳＦ１のレベルを測定する工程を含む。
【0039】
一実施形態において、患者の状態の改善は、ＮＡＳスコアの減少及び肝線維症の軽減を含む。さらなる実施形態において、患者の状態の改善は、ＮＡＳスコアの減少及び肝線維症の軽減を含み、前記方法は、ＣＳＦ１のレベルを測定する工程を含む。
【0040】
別の態様において、本開示は、候補療法がＮＡＦＬＤの治療に有用であり得るかどうかを判定するための方法に関し、前記方法は、
ＮＡＦＬＤ罹患している対象の生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルを測定する工程と、
前記期間後、前記対象からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを測定する工程と、を含み、
ここで、第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質の低いレベルは、前記候補療法がＮＡＦＬＤの前記治療に有用である可能性を示す。
ＮＡＦＬＤ罹患している対象の生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルを測定する工程と、
前記期間後、前記対象からの生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを測定する工程と、を含み、
ここで、第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質の低いレベルは、前記候補療法がＮＡＦＬＤの前記治療に有用である可能性を示す。
【0041】
一実施形態では、そのような研究は、通常、ＮＡＦＬＤに罹患している第２の対象にプラセボを追加投与することを伴う臨床試験の面において実施される。そのような場合、一実施形態において、候補療法がＮＡＦＬＤの治療に有用であり得るかどうかを判定するための方法は、
ＮＡＦＬＤに罹患している第１及び第２の対象からの生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルを測定する工程と、
候補療法を第１の対象に、プラセボを第２の対象に、一定期間投与する工程と、及び
前記期間後、第１の対象及び第２の対象からの生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを測定する工程と、を含む。
ＮＡＦＬＤに罹患している第１及び第２の対象からの生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルを測定する工程と、
候補療法を第１の対象に、プラセボを第２の対象に、一定期間投与する工程と、及び
前記期間後、第１の対象及び第２の対象からの生体試料において、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第２のタンパク質レベルを測定する工程と、を含む。
【0042】
同様に、そのような実施形態では、第１の対象からの生体試料におけるＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の第１のタンパク質レベルに対する第２のタンパク質レベルの減少は、候補療法がＮＡＦＬＤの治療に有用であり得ることを示す。第２の対象における第１及び第２のタンパク質レベルの判定は、そのような試験の面における追加の制御を提供する。
【0043】
一実施形態において、上記方法は、ＶＥＧＦＡのタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦＢ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＶＥＧＦＡ及びＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。一実施形態において、上記方法は、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１のタンパク質レベルを測定する工程を含む。
【0044】
別の態様において、本開示は、非アルコール性ＮＡＦＬＤを治療するための方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の方法を用いて識別されるＮＡＦＬＤに罹患している可能性が増加した対象にＮＡＦＬＤに対する治療法を投与する工程を含む。
【0045】
別の態様において、本開示は、非アルコール性ＮＡＦＬＤを治療するための方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の方法を用いてＮＡＦＬＤに罹患している可能性が増加した対象を識別する工程と、前記対象にＮＡＦＬＤに対する治療法を投与する工程と、を含む。
【0046】
別の態様において、本開示は、対象におけるＮＡＦＬＤに対する治療の使用に関し、前記対象は、本明細書に記載のＮＡＦＬＤに罹患している可能性が増加した対象を識別する方法によって識別される。
【0047】
別の態様において、本開示は、対象におけるＮＡＦＬＤに対する治療に使用するための治療／療法に関し、ここで、前記対象は、本明細書に記載のＮＡＦＬＤに罹患している可能性が増加した対象を識別する方法によって識別される。
【0048】
本明細書に記載された方法で患者に投与される、又は患者に実施される治療／療法は、実験的又は候補の治療／療法、例えば、臨床研究で試験された治療／療法、又はＮＡＦＬＤに対して承認又は確立された治療／療法であってもよい。
【0049】
一実施形態において、治療／療法は、コレステロール低下薬、例えば、スタチン（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、胆汁酸隔離薬（例えば、コレスチラミン、コレセベラム、コレスチポール）、コレステロール吸収ブロッカー（例えば、エゼチミブ）、ＰＣＳＫ９阻害剤（例えば、アリロクマブやエボロクマブなどの抗ＰＣＳＫ９抗体）、ナイアシン、フィブラート（例えば、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル）、アデノシン三リン酸－クエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）阻害剤（例えば、ベンペド酸）、又はオメガ３製品（例えば、イコサペントエチル、オメガ３－酸エチルエステル）の投与又は使用を含む。別の実施形態では、治療／療法は、ライフスタイルの変化、例えば、減量プログラム、すなわち、健康的な（低カロリーの）食事や身体運動を含む。
【0050】
一実施形態では、治療／療法は、ＧＨＲＨ分子の投与又は使用を含む。本開示の文脈で使用される用語「ＧＨＲＨ分子」は、限定されないが、ヒトネイティブＧＨＲＨ（１－４４）及びそのフラグメント（例えば、ＧＨＲＨ（１－４０）、ＧＨＲＨ（１－２９）、１－２９と１－４４配列の間の範囲のフラグメント）、及び任意の他のフラグメント；他の種由来のＧＨＲＨ及びそのフラグメント；アミノ酸（複数可）の置換（複数可）、付加（複数可）、及び／又は欠失（複数可）を含むＧＨＲＨの変異体；例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、又は側鎖にＧＨＲＨアミノ酸配列に結合した有機基や部位を有するＧＨＲＨの誘導体又はアナログ、又はフラグメント若しくは変異体；及びＧＨＲＨ（ヒト又は他の種由来）の薬学的に許容される塩、及びネイティブＧＨＲＨ又はそのフラグメント、変異体、アナログ、及び誘導体の薬学的に許容される塩；を含む。本開示のＧＨＲＨ分子はまた、当技術分野で現在知られているＧＨＲＨ分子を包含し、限定されないが、アルブミン結合ＧＨＲＨ（米国特許第７，２６８，１１３号）；ペグ化ＧＨＲＨペプチド（米国特許第７，２５６，２５８号及び第６，５２８，４８５号）；豚ＧＨＲＨ（１－４０）（米国特許第６，５５１，９９６号）；イヌＧＨＲＨ（米国特許出願第２００５／００６４５５４号）；アミノ酸長１～２９～１～４４のＧＨＲＨ変異体（米国特許第５，８４６，９３６号，第５，６９６，０８９号，第５，７５６，４５８号、及び第５，４１６，０７３、及び米国特許出願公開第２００６／０１２８６１５号及び第２００４／０１９２５９３号）；及びＰｒｏ０－ＧＨＲＨペプチド及びその変異体（米国特許第５，１３７，８７２号）を含む。
【0051】
ＧＨＲＨアナログとしては、米国特許第５，６８１，３７９号及び第５，９３９，３８６号に記載のものを含み、それらの合成方法もまた記載される。より詳細には、これらのＧＨＲＨアナログは、以下の式Ａで定義される：
Ｘ－ＧＨＲＨペプチド（Ａ）
ここで、ＧＨＲＨペプチドは、下記式Ｂ（配列ＩＤ番号：２）のペプチドである：
Ａ１－Ａ２－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ａ８－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａ１３－Ｌｅｕ－Ａ１５－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ１８－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａ２４－Ａ２５－Ｉｌｅ－Ａ２７－Ａ２８－Ａｒｇ－Ａ３０－Ａ３１－Ａ３２－Ａ３３－Ａ３４－Ａ３５－Ａ３６－Ａ３７－Ａ３８－Ａ３９－Ａ４０－Ａ４１－Ａ４２－Ａ４３－Ａ４４－Ｒ０（Ｂ）
式中、
Ａ１はＴｙｒ又はＨｉｓである；
Ａ２はＶａｌ又はＡｌａである；
Ａ８はＡｓｎ又はＳｅｒである；
Ａ１３はＶａｌ又はＩｌｅである；
Ａ１５はＡｌａ又はＧｌｙである；
Ａ１８はＳｅｒ又はＴｙｒである；
Ａ２４はＧｌｎ又はＨｉｓである；
Ａ２５はＡｓｐ又はＧｌｕである；
Ａ２７はＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＮｌｅである；
Ａ２８はＳｅｒ又はＡｓｎである；
Ａ３０は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３１は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３２は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙである；
Ａ３３は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｕである；
Ａ３４は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳｅｒである；
Ａ３５は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｓｎである；
Ａ３６は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３７は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｕである；
Ａ３８は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ３９は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙである；
Ａ４０は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｌａである；
Ａ４１は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ４２は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｌａ；である；
Ａ４３は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ４４は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬｅｕである；及び
Ｒ０はＮＨ２又はＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＮＨ２であり、ｎは１から１２である。
Ｘ－ＧＨＲＨペプチド（Ａ）
ここで、ＧＨＲＨペプチドは、下記式Ｂ（配列ＩＤ番号：２）のペプチドである：
Ａ１－Ａ２－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ａ８－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａ１３－Ｌｅｕ－Ａ１５－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ａ１８－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａ２４－Ａ２５－Ｉｌｅ－Ａ２７－Ａ２８－Ａｒｇ－Ａ３０－Ａ３１－Ａ３２－Ａ３３－Ａ３４－Ａ３５－Ａ３６－Ａ３７－Ａ３８－Ａ３９－Ａ４０－Ａ４１－Ａ４２－Ａ４３－Ａ４４－Ｒ０（Ｂ）
式中、
Ａ１はＴｙｒ又はＨｉｓである；
Ａ２はＶａｌ又はＡｌａである；
Ａ８はＡｓｎ又はＳｅｒである；
Ａ１３はＶａｌ又はＩｌｅである；
Ａ１５はＡｌａ又はＧｌｙである；
Ａ１８はＳｅｒ又はＴｙｒである；
Ａ２４はＧｌｎ又はＨｉｓである；
Ａ２５はＡｓｐ又はＧｌｕである；
Ａ２７はＭｅｔ、Ｉｌｅ、又はＮｌｅである；
Ａ２８はＳｅｒ又はＡｓｎである；
Ａ３０は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３１は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３２は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙである；
Ａ３３は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｕである；
Ａ３４は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳｅｒである；
Ａ３５は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｓｎである；
Ａ３６は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｎである；
Ａ３７は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｕである；
Ａ３８は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ３９は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙである；
Ａ４０は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｌａである；
Ａ４１は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ４２は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｌａ；である；
Ａ４３は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡｒｇである；
Ａ４４は存在しないか、又は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬｅｕである；及び
Ｒ０はＮＨ２又はＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＮＨ２であり、ｎは１から１２である。
【0052】
グループＸは、ペプチドのＮ末端にアミド結合を介して固定された疎水性テールであり、疎水性テールは、５～７個の原子のバックボーンを規定する。バックボーンは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ３－６シクロアルキル、又はＣ６－１２アリールによって置換され得、バックボーンは、バックボーンの少なくとも２つの原子に接続された少なくとも１つの剛性化部位を含む。剛直化部位は、二重結合、三重結合、飽和、又は不飽和のＣ３－９シクロアルキル、又はＣ６－１２アリールである。
【0053】
一実施形態において、グループＸは、以下の通りである：
【化1】
【0054】
実施形態において、式Ｂにおいて、Ａ３０～Ａ４４は：（ａ）不在、（ｂ）ネイティブＧＨＲＨペプチド（配列ＩＤ番号：３）の３０～４４位に対応するアミノ酸配列、又は（ｃ）そのＣ末端から１～１４アミノ酸の欠失を有する（ｂ）のアミノ酸配列、である。
【0055】
一実施形態において、ＧＨＲＨペプチドは、配列ＩＤ番号：４のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【0056】
実施形態において、ＧＨＲＨ分子は、（ヘキセノイルトランス－３）ｈＧＨＲＨ（１－４４）ＮＨ２（配列ＩＤ番号：１）又はその薬学的に許容される塩である。トランス－３－ヘキセノイル］ｈＧＨＲＨ（１－４４）アミド（テサモレリン、（ヘキセノイルトランス－３）ｈＧＨＲＨ（１－４４）ＮＨ２とも呼ばれる）は、ｈＧＨＲＨの４４アミノ酸配列にＣ６側鎖であるヘキセノイル部分がアミノ末端チロシン残基に固定されている合成ヒトＧＨＲＨ（ｈＧＨＲＨ）アナログである。［トランス－３－ヘキセノイル］ｈＧＨＲＨ（１－４４）アミドの構造は、図８に示す通りである。
【0057】
「薬学的に許容される塩」とは、投与される対象に対して薬学的に許容され、実質的に無毒であるＧＨＲＨ分子（例えば、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２）の塩のことを指す。より具体的には、これらの塩はＧＨＲＨ分子（例えば、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２）の生物学的有効性と特性を保持し、適切な非毒性の有機又は無機の酸又は塩基から形成される。
【0058】
例えば、これらの塩には、ＧＨＲＨ分子（例えば、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２）の酸付加塩が含まれ、このような塩を形成するのに十分な塩基性を有する。このような酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩又はエタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩などのアリールスルホン酸塩、 若しくはトルエンスルホン酸塩（トシル酸塩ともいう）、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンホレート、カンファースルホン酸塩、シンナメート、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコネート、ドデシルサルフェート、エタンスルホレート、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルフェート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸水素塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、イタコネート、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過塩素酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、ウンデカノプレート、及び類似物を含む。
【0059】
さらに、塩基性医薬化合物から医薬的に有用な塩を形成するのに一般的に適していると考えられる酸については、例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｍｉｌｌｅ Ｇ．（ｅｄｓ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．（２００２）Ｚｕｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ；Ｓ．Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６（１）１-１９；ＰＧｏｕｌｄ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９８６）３３ ２０１－２１７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ａｎｄ ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｒａｎｇｅ Ｂｏｏｋ（Ｆｏｏｄ ＆ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｗｅｂｓｉｔｅ）によって議論されている。
【0060】
このような塩は、当業者であれば標準的な技術を使って極めて容易に形成することができる。実際、医薬化合物（すなわち、薬物）を塩に化学修飾することは、医薬化学者によく知られた技術である（例えば、Ｈ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（６ｔｈ Ｅｄ．１９９５）ａｔ ｐｐ．１９６ ａｎｄ １４５６－１４５７を参照）。トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２の塩は、例えば、トランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２を等量などの酸又は塩基と、塩が沈殿するような媒体中又は水性媒体中で反応させてから凍結乾燥することによって形成することができる。
【0061】
一実施形態において、ＧＨＲＨ分子の薬学的に許容される塩、好ましくはトランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２は、酢酸塩である。
【0062】
一実施形態において、ＧＨＲＨ分子、好ましくはトランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２、又はその薬学的に許容される塩は、約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの用量で医薬組成物中に存在する。さらなる実施形態において、ＧＨＲＨ分子、好ましくはトランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２、又はその薬学的に許容される塩は、約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ～約８ｍｇ／ｍｌ又は約４ｍｇ／ｍｌ～約８ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、又は約８ｍｇ／ｍｌの用量で医薬組成物中に存在する。
【0063】
一実施形態において、ＧＨＲＨ分子、好ましくはトランス－３－ヘキセノイル－ＧＨＲＨ（１－４４）－ＮＨ２、又はその薬学的に許容される塩が、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に存在する。
【0064】
本明細書で使用する「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、有効成分（薬物）自体ではない任意の成分である。賦形剤には、例えば結合剤、潤滑剤、希釈剤、増量剤（充填剤）、増粘剤、崩壊剤、可塑剤、コーティング剤、バリア層製剤、潤滑剤、安定化剤、放出遅延剤、及びその他の成分を含む。本明細書で使用する「薬学的に許容される賦形剤」とは、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げず、対象に対して毒性がない賦形剤、すなわち、賦形剤の一種であり、及び／又は対象に対して毒性がない量で使用するための任意の賦形剤を指す。賦形剤は当技術分野でよく知られており、本組成物はこれらの点で限定されるものではない。特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、限定されないが、１つ以上のバインダー（結合剤）、増粘剤、界面活性剤、希釈剤、放出遅延剤、着色剤、香味剤、充填剤、崩壊剤／溶解促進剤、潤滑剤、可塑剤、シリカ流動調整剤、滑剤、ケーキング防止剤、付着防止剤、安定化剤、帯電防止剤、膨潤剤及びこれらの任意の組み合わせを含む、１つ以上の賦形剤を含む。当業者であれば認識するように、単一の賦形剤は一度に２つ以上の機能を果たすことができ、例えば、結合剤と増粘剤の両方として作用することができる。また、当業者であれば認識するように、これらの用語は必ずしも相互に排他的ではない。治療用製剤は、所望の純度を有する有効成分を、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は安定化剤と混合することにより、当該技術分野で知られる標準的な方法を用いて調製される。賦形剤（複数可）は、例えば、静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科的、脳室内、嚢内、脊髄内、髄腔内、硬膜外、嚢胞内、腹膜内、鼻内、又は肺（例えば、エアゾール）投与に適していてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ，２０１２，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ｂｙ Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓを参照）。一実施形態において、医薬組成物は、注射用組成物である。一実施形態において、医薬組成物は、皮下投与／注射のための１つ以上の賦形剤を含む。
【0065】
生体試料中のタンパク質の量／レベルを測定する方法は、当技術分野でよく知られている。タンパク質レベルは、抗体やそのフラグメントのような、タンパク質（成熟タンパク質）に特異的に結合するリガンドを用いて直接検出することができる。実施形態において、そのような結合分子又は試薬（例えば、抗体）は、複合体の検出及び定量化（直接検出）を促進するために、例えば、放射性標識、発色団標識、蛍光体標識、又は酵素標識で標識／コンジュゲートされる。代替的に、結合分子又は試薬を用いてタンパク質レベルを間接的に検出し、その後、結合分子又は試薬を特異的に認識する第２のリガンド（又は第２の結合分子）を用いて［タンパク質／結合分子又は試薬］複合体を検出する（間接検出）こともできる。そのような第２のリガンドは、複合体の検出や定量を促進するために、放射性標識、発色団標識、蛍光団標識、又は酵素標識されてもよい。イムノアッセイ用の抗体の標識に使用される酵素は当技術分野で知られており、最も広く使用されているのはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。結合分子又は試薬の実施例として、抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、天然又は合成リガンド、及び類似物を含む。
【0066】
試料中のタンパク質の量／レベルを測定する方法の実施例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ウェスタンブロット、イムノブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫測定法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、プロキシミティエクステンションアッセイ（Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）（ＰＥＡ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ケミルミネセンス、蛍光偏光法、リン光法、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析法、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、抗体アレイ、顕微鏡法（例えば、電子顕微鏡）、フローサイトメトリー、プロテオミクスベースのアッセイ、及びリガンド結合や他のタンパク質パートナーとの相互作用、酵素活性、蛍光など、タンパク質の特性又は活性に基づくアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、標的タンパク質が所定の標的をリン酸化することが知られているキナーゼである場合、試験化合物の存在下で標的のリン酸化レベルを測定することによって、標的タンパク質のレベル又は活性を判定されても良い。標的タンパク質が、１つ以上の標的遺伝子（複数可）の発現を誘導することが知られている転写因子である場合、標的タンパク質のレベル又は活性は、標的遺伝子（複数可）の発現レベルを測定することによって判定されても良い。一実施形態において、試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の量／レベルは、プロキシミティエクステンションアッセイ（ＰＥＡ）により測定される。ＰＥＡは、あらかじめ決められたタンパク質セットの存在量を評価するアフィニティーベースのアッセイである。各タンパク質は、ユニークなオリゴヌクレオチド標識抗体のペアで標的にされる。オリゴヌクレオチドが近接すると、近接依存的なＤＮＡ重合現象が起こり、ＰＣＲ標的配列が形成される。得られたＤＮＡ配列は、標準的なリアルタイムＰＣＲを用いて検出及び定量される。ＰＥＡは、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅＸｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＮＰＸ）というタンパク質存在量のレベルをｌｏｇ２－スケールで表示する。
【0067】
一実施形態において、上記のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの測定は、タンパク質（複数可）に特異的に結合するリガンド、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと生体試料を接触させることと、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１とリガンド（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）の複合体の量を測定することを含む。本明細書で使用する用語「抗体又はその抗原結合フラグメント」は、所望の抗原特異性／結合活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ－グラフト抗体、キメラ抗体、及び抗体フラグメントを含むあらゆるタイプの抗体／抗体フラグメントを指す。抗体フラグメントは、全長抗体の一部、一般的には抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの実施例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ類由来）、鮫ＮＡＲ単一ドメイン抗体、及び抗体フラグメントから形成される多特異抗体などがある。抗体フラグメントは、ＶＨ領域（ＶＨ、ＶＨ－ＶＨ）、アンチカリン、ペプボディ、抗体－Ｔ細胞エピトープ融合体（トロイボディ）、又はペプチボディなど、ＣＤＲや抗原結合ドメインを含む結合部位を指す場合もあるが、これらに限定されない。
【0068】
一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは標識される。抗体又はその抗原結合フラグメントは、ビオチン標識、蛍光標識、酵素標識、補酵素標識、化学発光標識、又は放射性同位体標識などの１つ以上の標識で標識されてもよい。一実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識／部位、例えば蛍光部位（蛍光体）で標識される。検出可能なラベルとしては、蛍光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、アレクサフロール（登録商標）色素、及び類似物）、放射性標識、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、その他タンパク質検出アッセイによく使われるもの）、ストレプトアビジン／ビオチン、及びコロイド状金などの比色ラベル、着色ガラス又はプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のような比色標識を含む。また、化学発光化合物が使用されてもよい。別の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、上記のようにプロキシミティエクステンションアッセイを行うために、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【0069】
一実施形態において、タンパク質（複数可）に特異的に結合するリガンド（例えば、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント）は、固体支持体上に付着又は固定化される。固体支持体は、リガンドの結合（例えば、固定化）を可能にし、所望の用途に使用することができる任意の固体支持体であってもよい。例えば、ガラスやプラスチック板／スライドを含む。一実施形態において、上記固体支持体は、プラスチック板／スライドである。実施形態において、上記の板／スライドは、リガンドの固定化の前に修飾（例えば、コーティング、化学的修飾、誘導体化）されてもよい。一実施形態において、固体支持体は、当該技術分野で知られている任意の方法を用いて、リガンドの共有結合又は非共有結合の固定化を許容又は促進するように修飾される。固体支持体は、そのＣ末端又はＮ末端を介したリガンドの固定化が望ましいかどうかに応じて、アミノ又はカルボキシ官能基のいずれかを有されてもよい。例えば、ＮＴＡ－「Ｈｉｓ－Ｔａｇ」システム、ビオチン－アビジン／ストレプトアビジンシステム、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－グルタチオンシステム、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－アミロースシステム、及び抗原－抗体システムなどの一般的なアフィニティータグベースのシステムを使用して、固体支持体はリガンドにコンジュゲートされる対応する部位（アフィニティータグ）に結合することができる任意の従来の部位を使って修飾／被覆されてもよい。
【0070】
一実施形態において、上記方法は、異なる試料間の比較を促進するために、タンパク質レベルを正規化する工程、すなわち、安定的に発現した対照タンパク質（又はハウスキーピングタンパク質）に対して上記タンパク質の測定レベルを正規化する工程を含む。本明細書で使用する「正規化する」又は「正規化」とは、タンパク質の品質、精製効率などのような「外来」パラメータの違いを考慮するために、異なる試料間の生のタンパク質レベルの値／データを試料バリエーションごとに補正すること、すなわち、試料中のタンパク質の実際の「内在」変動に起因しない違いを指す。そのような正規化は、異なる実験条件下で生体試料中のレベルが一定であることが知られている（すなわち、比較的低い変動を示す）１つ以上の「ハウスキーピング」又は「対照」タンパク質について測定したタンパク質レベルの値／データに基づいて、試験タンパク質（又は対象のタンパク質、すなわち、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１）の生のタンパク質レベルの値／データを補正することにより行われる。したがって、一実施形態において、上記方法は、生体試料中のハウスキーピングタンパク質の発現レベルを測定する工程をさらに含む。
【0071】
試料で測定されたＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の生のレベルは、分析の前に、対数変換などの数学的変換に供されてもよい。一実施形態において、本明細書に記載の方法は、分析前に、試料において測定されたＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の生レベルのＬｏｇ２変換を行う工程を含む。
【0072】
本開示によれば、生体試料（例えば、医療／臨床試料）は、本明細書に記載の１つ以上の標的タンパク質（ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１）を含む疑いのある対象／患者から得られた任意の試料（粗製又は処理）を包含する。このような物質は、様々な源から発生してもよい。一実施形態において、１つ以上の標的タンパク質を含むと疑われる試料は、任意の組織／臓器から、及び／又は体内の排泄物又は体液から得られてもよい。試料は、必要に応じて、限定されないが、機械的溶解、洗剤抽出、超音波処理、エレクトロポレーション、変性剤などを含む当業者に周知の技術を用いて調製されてもよく、また必要に応じて精製されてもよい。さらなる実施形態において、試料は、比較的粗いものから比較的純粋なタンパク質調製物に至るまで、タンパク質に富むその抽出物を得るために処理されてもよい。
【0073】
一実施形態において、上記生体試料は、生体液、例えば、尿、唾液、リンパ液、又は血液由来の試料である。本明細書で使用する「血液由来試料」という用語は、血液（例えば、新鮮な血液、保存血液）又は血清、血漿、及び類似物のようなその分画を指す。また、血液（例えば、静脈穿刺により得られる）を出発材料として、１つ以上の精製、濃縮、及び／又は処理工程を経て得られるあらゆる試料も指す。一実施形態において、生体試料は血液由来の試料であり、さらなる実施形態では血漿である。
【0074】
試料は、ＮＡＦＬＤに罹患している疑いがある対象、例えば、脂肪肝及び／又は肝線維症の１つ以上の症状を有する対象から得てもよい。対象は、肝酵素であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇等の臨床検査、画像技術によって検出された肝脂肪の証拠、及び／又は肝生検等の結果に基づいて、ＮＡＦＬＤに罹患していると疑われるか、又はＮＡＦＬＤと診断される場合がある。ＮＡＦＬＤとは、アルコール使用、ステアトジェニック薬、及び遺伝性疾患など、肝脂肪蓄積の二次的な原因の不在で、肝脂肪症（肝臓の断面積の５％未満が脂肪空胞で占められている）が病的に存在すると定義される慢性肝疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、２つのカテゴリーに単純化される疾患のスペクトルを含む：（１）単純性脂肪症（ＳＳ）又は非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、症例の７０～７５％、炎症や細胞傷害を伴わない過剰な肝脂肪により定義され、（２）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、症例の２５～３０％、炎症と細胞傷を伴う過剰肝脂肪の存在により、類洞周囲線維化の有無を問わず定義される。一実施形態において、生体試料は、ＮＡＦＬに罹患している又は罹患している疑いのある対象からである。別の実施形態では、生体試料は、ＮＡＳＨに罹患している又は罹患している疑いのある対象からである。別の実施形態では、対象は、ＨＩＶ感染者であり、すなわち、対象は、ＨＩＶ関連ＮＡＦＬＤに罹患している。
【0075】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、対象におけるＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨを評価／診断するために、１つ以上の追加のアッセイを実施する工程をさらに含む。そのようなアッセイは、例えば、対象の生体試料中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及び／又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のような肝酵素のレベルを判定すること、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波エラストグラフィ（ＵＳＥ）、定量的超音波法、磁気共鳴エラストグラフィ（ＭＲＥ）、及び磁気共鳴ベースの脂肪定量法、又は肝臓試料の組織学的分析（例えば、肝生検）のような画像技術を使用して肝臓のイメージングを実行することを含む。そのような追加のアッセイ（複数可）は、本明細書に記載されているように、生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の（基準レベルに対する）高い／増加したレベルに基づき、ＮＡＦＬＤに罹患していると疑われる患者に対して実施されてもよい。
【0076】
別の態様において、本開示は、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するための、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するためのアッセイ混合物であって、前記アッセイ混合物は、（ｉ）ＮＡＦＬＤに罹患しているか又は罹患している疑いのある対象からの生体試料と、及び（ｉｉ）前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の前記タンパク質レベルを判定／測定する１つ以上の試薬と、を備える、前記アッセイ混合物を提供する。一実施形態において、生体試料は血液由来の試料であり、さらなる実施形態では血漿である。一実施形態において、生体試料は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである。別の実施形態において、生体試料は、ＨＩＶに感染した対象からである。
【0077】
別の態様において、本開示は、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するための、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するためのシステムであって、前記システムは、（ｉ）ＮＡＦＬＤに罹患しているか又は罹患している疑いのある対象からの生体試料と、及び（ｉｉ）前記試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１の前記タンパク質レベルを判定／測定する１つ以上のアッセイと、を備える、前記システムを提供する。一実施形態において、生体試料は血液由来の試料であり、さらなる実施形態では血漿である。一実施形態において、生体試料は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである。別の実施形態において、生体試料は、ＨＩＶに感染した対象からである。
【0078】
別の態様において、本開示は、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するための、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するシステムであって、前記システムは、前記対象の生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルに対応する信号を生成するように構成される試料分析器と、及び前記１つ以上のタンパク質レベルに基づいて、前記信号が基準値よりも高いか低いかについて計算するようにプログラミングされたコンピュータサブシステムと、を備える、前記システムを提供する。様々な実施形態において、システムは、生体試料をさらに含む。一実施形態において、生体試料は血液由来の試料であり、さらなる実施形態では血漿である。一実施形態において、生体試料は、ＮＡＦＬＤに罹患している対象からである。別の実施形態において、生体試料は、ＨＩＶに感染した対象からである。
【0079】
別の態様において、本開示は、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するために、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するために使用のキットであって、前記キットは、生体試料中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルの測定するための試薬と、及びＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のタンパク質レベルと、及びＮＡＦＬＤの重症度及び／又はＮＡＦＬＤに罹患している可能性とを相関させる指示と、を備える、前記キットに関する。
【0080】
一実施形態において、アッセイ混合物、システム、及び／又はキットの試薬は、例えば、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のリガンド（例えば、抗体（複数可）又はそのフラグメント）、溶液（複数可）、緩衝液（複数可）、核酸増幅試薬（複数可）（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ捕因子、ｄＮＴＰ）、核酸ハイブリダイゼーション／検出試薬（複数可）、及び／又は抗原抗体複合体検出試薬などを含む。一実施形態において、試薬は、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及び／又はＣＳＦ１のうちの少なくとも２つに対するリガンド（例えば、抗体（複数可）又はそのフラグメント）を含む。一実施形態において、試薬は、（ｉ）ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦＢ１、（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ及びＣＳＦ１、（ｉｉｉ）ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１、又は（ｉｖ）ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１のリガンド（例えば、抗体（複数可）又はそのフラグメント）を含む。一実施形態において、アッセイ混合物、システム、及び／又はキットは、（ｉ）ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦＢ１、（ｉｉ）ＶＥＧＦＡ及びＣＳＦ１、（ｉｉｉ）ＴＧＦＢ１及びＣＳＦ１、又は（ｉｖ）ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１のリガンド（例えば、抗体（複数可）又はそのフラグメント）を含むアレイを備える。
【0081】
一実施形態において、本開示によるキットは、上記で説明したそれぞれの試薬成分を含む別々のパッケージ又はコンパートメントに分割されてもよい。
【0082】
さらに、そのようなキットは、以下のうちの１つ以上を任意に含んでもよい：（１）本明細書に記載された方法を実施するための試薬を使用するための、及び／又は得られた結果の解釈のための指示と、（２）１つ以上の容器と、及び／又は（３）適切な対照／標準。そのようなキットは、患者から生体試料を採取するための試薬と、生体試料を処理するための試薬と、が含み得る。
【0083】
キットに含まれる情報資料は、本明細書に記載の方法及び／又は本明細書に記載の方法のための試薬の使用に関連する、説明、指導、マーケティング又は他の資料とすることができる。例えば、キットの情報提供資料には、キットの使用者が本明細書に記載の方法の実行及び結果の解釈に関する実質的な情報を得ることができる連絡先情報（例えば、物理的な住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、又は電話番号）を含み得る。
【0084】
また、本明細書で紹介するキットは、タンパク質レベルのデータから、患者のＮＡＦＬＤの重症度及び／又は対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を推測するのに必要なソフトウェアを提供することができる。
別の態様において、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するための、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するための、本明細書に記載のキット又はアッセイ混合物の使用が提供される。
別の態様において、（ａ）患者におけるＮＡＦＬＤの重症度を経時的に評価するための、及び／又は（ｂ）対象がＮＡＦＬＤに罹患している可能性を評価するための、本明細書に記載のキット又はアッセイ混合物の使用が提供される。
【0085】
本開示は、以下の非限定的な例によってさらに詳細に例示される。
【実施例1】
【0086】
実施例１：材料及び方法
研究設計
ＨＩＶ関連のＮＡＦＬＤを患っている個人が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）アナログのテサモレリンを１日につき２ｍｇ、又は同一のプラセボを１２ヶ月服用するように割り当てられた、二重盲検無作為化試験である。（７）本試験での血漿検体を活用し、本研究では、先行する純粋なトランスクリプトーム解析（８）を大幅に発展させ、特定のタンパク質を検査する。治療群間での、テサモレリンに反応するパスウェイの最先端遺伝子に対応するタンパク質の循環レベルの変化を調査し、これらタンパク質と、組織学的、放射線、及びトランスクリプトームに関する指標との関係を評価して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの血漿マーカーを特定し、テサモレリン反応に関する潜在的メカニズムを明らかにした。
研究設計
ＨＩＶ関連のＮＡＦＬＤを患っている個人が、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）アナログのテサモレリンを１日につき２ｍｇ、又は同一のプラセボを１２ヶ月服用するように割り当てられた、二重盲検無作為化試験である。（７）本試験での血漿検体を活用し、本研究では、先行する純粋なトランスクリプトーム解析（８）を大幅に発展させ、特定のタンパク質を検査する。治療群間での、テサモレリンに反応するパスウェイの最先端遺伝子に対応するタンパク質の循環レベルの変化を調査し、これらタンパク質と、組織学的、放射線、及びトランスクリプトームに関する指標との関係を評価して、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨの血漿マーカーを特定し、テサモレリン反応に関する潜在的メカニズムを明らかにした。
【0087】
ＨＩＶ感染及び、プロトン核磁気共鳴スペクトロスコピー（１Ｈ－ＭＲＳ）において肝臓内脂肪率５％以上と定義される肝脂肪症が証明された、１８～７０歳の男女６１名が登録された。参加者は、３ヶ月以上の間、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が１００個／ｍｍ３より多く、及びＨＩＶウイルス量が４００コピー／ｍＬ未満の状態で、安定した抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）を受けていることが必要とされた。除外基準には、過度のアルコール摂取（女性は１日２０ｇ超過、又は男性は１日３０ｇ超過）、活動性Ｂ型又はＣ型肝炎、その他の既知の肝疾患、肝硬変、及び不適切に管理された糖尿病（ＨｂＡ１ｃが７％以上）が含まれた。参加者は、２０１５年８月２０日から２０１９年１月１６日の間、マサチューセッツ総合病院（ＭＧＨ、ボストン、マサチューセッツ州）及び米国国立衛生研究所（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州）で登録された。各参加者より、書面でのインフォームド・コンセントを取得した。すべての方法は、ガイドラインと規則に従って実施された。
【0088】
研究手順
その母体となる治験の研究手順は、他で詳細に記載されている。（７、９）すべての研究手順は、絶食状態で実施された。簡潔に説明すると、肝臓内脂肪率の測定のため、ベースライン時と１２ヶ月目に１Ｈ－ＭＲＳを実施した。また、各時点で、２つのコアを得る超音波ガイド下の経皮的肝生検を実施した。１つ目のコアはホルマリンで固定され、その後、治療に対して盲検化された１人の専門病理学者によって病理組織学的評価が下された。（Ｄ．Ｅ．Ｋ．、米国国立衛生研究所）ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）と線維化ステージを含む、組織学的スコアリングは、非アルコール性脂肪性肝炎クリニカルリサーチネットワークのスコアリングシステムに従って実施された。（１０）２つ目のコアは、遺伝子発現解析のため、ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）、キアゲン）に入れて、-８０℃にて保管された。採血検体はベースライン時及び１２ヶ月の時点で採取され、-８０℃で保管された。標準的な技術を用いて、血清ＩＧＦ－１を測定した。（Ｑｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
その母体となる治験の研究手順は、他で詳細に記載されている。（７、９）すべての研究手順は、絶食状態で実施された。簡潔に説明すると、肝臓内脂肪率の測定のため、ベースライン時と１２ヶ月目に１Ｈ－ＭＲＳを実施した。また、各時点で、２つのコアを得る超音波ガイド下の経皮的肝生検を実施した。１つ目のコアはホルマリンで固定され、その後、治療に対して盲検化された１人の専門病理学者によって病理組織学的評価が下された。（Ｄ．Ｅ．Ｋ．、米国国立衛生研究所）ＮＡＦＬＤ活動スコア（ＮＡＳ）と線維化ステージを含む、組織学的スコアリングは、非アルコール性脂肪性肝炎クリニカルリサーチネットワークのスコアリングシステムに従って実施された。（１０）２つ目のコアは、遺伝子発現解析のため、ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）、キアゲン）に入れて、-８０℃にて保管された。採血検体はベースライン時及び１２ヶ月の時点で採取され、-８０℃で保管された。標準的な技術を用いて、血清ＩＧＦ－１を測定した。（Ｑｕｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
【0089】
肝臓トランスクリプトーム評価
すでに記載されている方法を用いて、肝組織に対してＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡライブラリーの構築、及びイルミナシーケンシングを実施した。（９）テサモレリン及びプラセボ治療参加者の間で、治療前から治療後の時点にかけて差次的に変調されたパスウェイを特定するために、ブロード研究所（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／）からのデスクトップモジュールを用いてＧＳＥＡが実施された。使用された遺伝子セットには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭｓｉｇＤＢ）ホールマーク遺伝子セットのコレクション（１１）及びＨＣＣ予後に関するカスタム遺伝子セット（９）が含まれた。ＧＳＥＡ最先端遺伝子は、濃縮シグナルを占める著しく濃縮された遺伝子セット内の遺伝子のサブセットであり、その後のパスウェイ遺伝子発現の定量化に使用された。偽発見率（ＦＤＲ）が０．０５未満の遺伝子セットは濃縮と見なされた。
すでに記載されている方法を用いて、肝組織に対してＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡライブラリーの構築、及びイルミナシーケンシングを実施した。（９）テサモレリン及びプラセボ治療参加者の間で、治療前から治療後の時点にかけて差次的に変調されたパスウェイを特定するために、ブロード研究所（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／）からのデスクトップモジュールを用いてＧＳＥＡが実施された。使用された遺伝子セットには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭｓｉｇＤＢ）ホールマーク遺伝子セットのコレクション（１１）及びＨＣＣ予後に関するカスタム遺伝子セット（９）が含まれた。ＧＳＥＡ最先端遺伝子は、濃縮シグナルを占める著しく濃縮された遺伝子セット内の遺伝子のサブセットであり、その後のパスウェイ遺伝子発現の定量化に使用された。偽発見率（ＦＤＲ）が０．０５未満の遺伝子セットは濃縮と見なされた。
【0090】
この手法を利用して、プラセボと対比してテサモレリンによって差次的に制御される１４のホールマーク遺伝子パスウェイを前もって発見した。この点で、酸化的リン酸化に関する遺伝子セットが治療によって増加した。さらに、テサモレリン治療者の間では、炎症、組織修復、及び細胞分裂に関わる１３の遺伝子セットが減少した（図１）。ＲＮＡシーケンスデータは、国立バイオテクノロジー情報センターの遺伝子発現オムニバスのリポジトリに提出された（アクセッション番号ＧＳＥ１５００２６）。
【0091】
血漿プロテオーム評価
この分析では、Ｏｌｉｎｋ（登録商標）のマルチプレックスプロキシミティエクステンションアッセイ（ＰＥＡ）のプラットフォームを用いて、対象となるタンパク質の変化を１２ヶ月以上にわたって評価した。前記ＰＥＡは、あらかじめ決められたタンパク質セットの存在量を評価するアフィニティーベースのアッセイである。各タンパク質は、ユニークなオリゴヌクレオチド標識抗体のペアで標的にされる。オリゴヌクレオチドが近接すると、近接依存的なＤＮＡ重合現象が起こり、ＰＣＲ標的配列が形成される。結果として生じるＤＮＡシーケンスは、フリューダイムバイオマーク（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ）（商標）ＨＤリアルタイムＰＣＲプラットフォーム上で、標準のリアルタイムＰＣＲを用いて検出し、定量化する。前記ＰＥＡは、ｌｏｇ２－スケールで、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅＸｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＮＰＸ）のタンパク質存在量のレベルを表示する。検出限界やアッセイ性能の測定を含むアッセイの特性は、製造元（Ｏｌｉｎｋ、ウプサラ、スウェーデン）から入手可能である。前記方法の精度により特異性が高く、経時的な変化の評価が可能となった。利用された高マルチプレックスパネル（下記）内のすべてのタンパク質において、平均アッセイ内変動及びアッセイ間変動は、それぞれ８．３％及び１１．５％を記録した。
この分析では、Ｏｌｉｎｋ（登録商標）のマルチプレックスプロキシミティエクステンションアッセイ（ＰＥＡ）のプラットフォームを用いて、対象となるタンパク質の変化を１２ヶ月以上にわたって評価した。前記ＰＥＡは、あらかじめ決められたタンパク質セットの存在量を評価するアフィニティーベースのアッセイである。各タンパク質は、ユニークなオリゴヌクレオチド標識抗体のペアで標的にされる。オリゴヌクレオチドが近接すると、近接依存的なＤＮＡ重合現象が起こり、ＰＣＲ標的配列が形成される。結果として生じるＤＮＡシーケンスは、フリューダイムバイオマーク（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ）（商標）ＨＤリアルタイムＰＣＲプラットフォーム上で、標準のリアルタイムＰＣＲを用いて検出し、定量化する。前記ＰＥＡは、ｌｏｇ２－スケールで、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅＸｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＮＰＸ）のタンパク質存在量のレベルを表示する。検出限界やアッセイ性能の測定を含むアッセイの特性は、製造元（Ｏｌｉｎｋ、ウプサラ、スウェーデン）から入手可能である。前記方法の精度により特異性が高く、経時的な変化の評価が可能となった。利用された高マルチプレックスパネル（下記）内のすべてのタンパク質において、平均アッセイ内変動及びアッセイ間変動は、それぞれ８．３％及び１１．５％を記録した。
【0092】
対象となるプロテオーム解析
現行の研究の目的は、ＮＡＦＬＤにおけるテサモレリン効果の潜在的な反応パスウェイを叙述し、ＮＡＦＬＤ患者の間でのテサモレリンへの治療反応の検出に使用され得るタンパク質の特徴を判断することであった。そのために、テサモレリン応答性遺伝子セットの最先端遺伝子と重複することが判明した、およそ１００のタンパク質（Ｏｌｉｎｋ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、タンパク質の全リストについては、ｗｗｗ．ｏｌｉｎｋ．ｃｏｍを参照）からなる高マルチプレックスパネル内のすべての血漿タンパク質にフラグがつけられた。（８）標的となるこのタンパク質のセットにおいて、治療状況による血漿レベルの変化を比較した。プラセボと比較してテサモレリンによって差次的に変調されることが判明したタンパク質は、その後、ベースライン時及び長期の両方において、ＮＡＦＬＤ重症度の、放射線、組織学、及びトランスクリプトームにおける指標に関連して検査された。繊維化ステージの代用として、繊維化（１１）との関連が見られた１８の遺伝子の肝発現に由来する遺伝子レベルの繊維化スコアを利用し、すでに記載されたように、前記の現行の試料で組織学的変化に対して検証した。（８）これらのタンパク質のレベルの変化はまた、これらに対応する肝臓転写レベル及び血清ＩＧＦ－１の変化と関連していた。
現行の研究の目的は、ＮＡＦＬＤにおけるテサモレリン効果の潜在的な反応パスウェイを叙述し、ＮＡＦＬＤ患者の間でのテサモレリンへの治療反応の検出に使用され得るタンパク質の特徴を判断することであった。そのために、テサモレリン応答性遺伝子セットの最先端遺伝子と重複することが判明した、およそ１００のタンパク質（Ｏｌｉｎｋ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、タンパク質の全リストについては、ｗｗｗ．ｏｌｉｎｋ．ｃｏｍを参照）からなる高マルチプレックスパネル内のすべての血漿タンパク質にフラグがつけられた。（８）標的となるこのタンパク質のセットにおいて、治療状況による血漿レベルの変化を比較した。プラセボと比較してテサモレリンによって差次的に変調されることが判明したタンパク質は、その後、ベースライン時及び長期の両方において、ＮＡＦＬＤ重症度の、放射線、組織学、及びトランスクリプトームにおける指標に関連して検査された。繊維化ステージの代用として、繊維化（１１）との関連が見られた１８の遺伝子の肝発現に由来する遺伝子レベルの繊維化スコアを利用し、すでに記載されたように、前記の現行の試料で組織学的変化に対して検証した。（８）これらのタンパク質のレベルの変化はまた、これらに対応する肝臓転写レベル及び血清ＩＧＦ－１の変化と関連していた。
【0093】
連続変数は平均±標準偏差で表し、反してカテゴリー変数は頻度（％）で示した。群間での違いは、連続変数においては両側独立標本ｔ検定、またカテゴリー変数においてはカイ二乗検定を用いて比較した。相関関係は、ピアソン相関係数で評価した。０．０５以下のＰの値を統計的有意性の閾値としてあらかじめ定義した。ＪＭＰ Ｐｒｏ １４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ケーリー、ノースカロライナ州、米国）を用いて統計分析を実施した。
略語：ＣＡＳＰ８、ｃａｓｐａｓｅ８（カスパーゼ８）、ＣＣＬ２０、Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ２０（Ｃ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド２０）、ＣＲＴＡＭ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（細胞傷害性及び調節性Ｔ細胞分子）、ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＣＸＣＬ１２、Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ１２（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド１２）、ＮＣＲ１、ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ナチュラルサイトトキシックトリガー受容体１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子β１）；ＴＮＦＲＳＦ２１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１）；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
【表1】
【実施例2】
【0094】
実施例２：研究参加者の特徴
前記無作為化比較試験でのＨＩＶ関連のＮＡＦＬＤを患っている参加者６１名のうち、５８の個人がベースライン時に血漿タンパク質パネルを得ており、分析に利用可能であった。さらに、これら４４の個人（テサモレリンに割り当てられた２０名、プラセボに割り当てられた２４名）には、１２ヶ月目に血漿タンパク質パネルが繰り返された。前記の全体的試料の各治療群の特徴は表２に要約されており、すでに記載されている。（７）テサモレリン及びプラセボ群は、主要な臨床変数に関して非常にバランスの取れたものであった。簡単に説明すると、参加者（５３±７歳、７９％男性）は１７±９年間、ＨＩＶ感染をうまく制御していた。すべての対象者は、インテグラーゼ阻害剤ベースのレジメンが６４％と、安定したＡＲＴを受けていた。ベースラインの肝臓内脂肪含有量は、１Ｈ－ＭＲＳによる測定では１４±８％であった。初回の肝生検にて、ＮＡＳＨ及び繊維化で組織学的証拠を得たのは、それぞれ合計３３％及び４３％であった。
ベースライン時では、上記に示された変数のいずれにおいても、群間で統計的に有意差はなかった。
連続変数は平均値±標準偏差として示される。
略語：ＮＡＳＨ、ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（非アルコール性脂肪性肝炎）、ＮＮＲＴＩ、ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤）、ＮＲＴＩ、ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤）、ＰＩ、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロテアーゼ阻害剤）。
前記無作為化比較試験でのＨＩＶ関連のＮＡＦＬＤを患っている参加者６１名のうち、５８の個人がベースライン時に血漿タンパク質パネルを得ており、分析に利用可能であった。さらに、これら４４の個人（テサモレリンに割り当てられた２０名、プラセボに割り当てられた２４名）には、１２ヶ月目に血漿タンパク質パネルが繰り返された。前記の全体的試料の各治療群の特徴は表２に要約されており、すでに記載されている。（７）テサモレリン及びプラセボ群は、主要な臨床変数に関して非常にバランスの取れたものであった。簡単に説明すると、参加者（５３±７歳、７９％男性）は１７±９年間、ＨＩＶ感染をうまく制御していた。すべての対象者は、インテグラーゼ阻害剤ベースのレジメンが６４％と、安定したＡＲＴを受けていた。ベースラインの肝臓内脂肪含有量は、１Ｈ－ＭＲＳによる測定では１４±８％であった。初回の肝生検にて、ＮＡＳＨ及び繊維化で組織学的証拠を得たのは、それぞれ合計３３％及び４３％であった。
【表2-1】
【表2-2】
連続変数は平均値±標準偏差として示される。
略語：ＮＡＳＨ、ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（非アルコール性脂肪性肝炎）、ＮＮＲＴＩ、ｎｏｎ－ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤）、ＮＲＴＩ、ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤）、ＰＩ、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロテアーゼ阻害剤）。
【実施例3】
【0095】
実施例３：テサモレリンによって差次的に制御される血漿タンパク質
９つの血漿タンパク質が、テサモレリンによって変調される最先端遺伝子に対応して識別された（図１）。これらの最先端遺伝子は、炎症、組織修復、及び細胞分裂（表１）に関する遺伝子セットに含まれており、プラセボと対比してテサモレリン治療によって減少した。これらのタンパク質のうち、テサモレリン治療は、プラセボと比較して、血漿ＶＥＧＦＡ（ｌｏｇ２倍率変化-０．２０±０．３５対０．０５±０．３４、Ｐ＝０．０２）、ＴＧＦＢ１（ｌｏｇ２倍率変化-０．３５±０．５６対-０．０５±０．４３、Ｐ＝０．０５）、及びＣＳＦ１（ｌｏｇ２倍率変化-０．１７±０．２１対０．０２±０．２０、Ｐ＝０．００４）の減少につながった（図２Ａ～２Ｃ）。さらに、血漿ＣＣＬ２０は、群間の差は統計的有意性には至らなかったものの（ｌｏｇ２倍率変化-０．２８±０．８８対０．２０±０．７９、Ｐ＝０．０６）、テサモレリンによって減少する傾向にあった。９つすべての血漿タンパク質における、プラセボと対比した治療の効果は表３に要約されている。
９つの血漿タンパク質が、テサモレリンによって変調される最先端遺伝子に対応して識別された（図１）。これらの最先端遺伝子は、炎症、組織修復、及び細胞分裂（表１）に関する遺伝子セットに含まれており、プラセボと対比してテサモレリン治療によって減少した。これらのタンパク質のうち、テサモレリン治療は、プラセボと比較して、血漿ＶＥＧＦＡ（ｌｏｇ２倍率変化-０．２０±０．３５対０．０５±０．３４、Ｐ＝０．０２）、ＴＧＦＢ１（ｌｏｇ２倍率変化-０．３５±０．５６対-０．０５±０．４３、Ｐ＝０．０５）、及びＣＳＦ１（ｌｏｇ２倍率変化-０．１７±０．２１対０．０２±０．２０、Ｐ＝０．００４）の減少につながった（図２Ａ～２Ｃ）。さらに、血漿ＣＣＬ２０は、群間の差は統計的有意性には至らなかったものの（ｌｏｇ２倍率変化-０．２８±０．８８対０．２０±０．７９、Ｐ＝０．０６）、テサモレリンによって減少する傾向にあった。９つすべての血漿タンパク質における、プラセボと対比した治療の効果は表３に要約されている。
【表3】
【0096】
太字はＰが０．０５未満であることを示す。データは平均値（９５％信頼区間）又は平均値±標準偏差として示される。
略語：ＣＡＳＰ８、ｃａｓｐａｓｅ８（カスパーゼ８）、ＣＣＬ２０、Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ２０（Ｃ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド２０）、ＣＲＴＡＭ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（細胞傷害性及び調節性Ｔ細胞分子）、ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＣＸＣＬ１２、Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ１２（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド１２）、ＮＣＲ１、ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（ナチュラルサイトトキシックトリガー受容体１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子β１）；ＴＮＦＲＳＦ２１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１）；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
略語：ＣＡＳＰ８、ｃａｓｐａｓｅ８（カスパーゼ８）、ＣＣＬ２０、Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ２０（Ｃ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド２０）、ＣＲＴＡＭ、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（細胞傷害性及び調節性Ｔ細胞分子）、ＣＳＦ１、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ１（マクロファージコロニー刺激因子１）、ＣＸＣＬ１２、Ｃ－Ｘ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ１２（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ ケモカイン リガンド１２）、ＮＣＲ１、ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（ナチュラルサイトトキシックトリガー受容体１）、ＴＧＦＢ１、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １（トランスフォーミング増殖因子β１）；ＴＮＦＲＳＦ２１、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１）；ＶＥＧＦＡ、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ（血管内皮増殖因子Ａ）。
【実施例4】
【0097】
実施例４：主要な血漿タンパク質とＮＡＦＬＤ表現型の関連性
テサモレリンによるこれらの差異のある制御を考慮して、次に、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１のＮＡＦＬＤ表現型との関係性（表４）を研究した。ベースライン時では、前記の全体的試料のうち、血漿ＣＳＦ１レベルがＮＡＳスコア（ｒ＝０．３８、Ｐ＝０．００４）、及び遺伝子レベルの繊維化スコア（ｒ＝０．３７、Ｐ＝０．０３）と直接的に相関していた。反対に、ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦＢ１では、これらのパラメータのいずれとも関連性が見られなかった。さらに、ベースラインにおいて、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１と肝臓内脂肪率との関係はなかった。
テサモレリンによるこれらの差異のある制御を考慮して、次に、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１のＮＡＦＬＤ表現型との関係性（表４）を研究した。ベースライン時では、前記の全体的試料のうち、血漿ＣＳＦ１レベルがＮＡＳスコア（ｒ＝０．３８、Ｐ＝０．００４）、及び遺伝子レベルの繊維化スコア（ｒ＝０．３７、Ｐ＝０．０３）と直接的に相関していた。反対に、ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦＢ１では、これらのパラメータのいずれとも関連性が見られなかった。さらに、ベースラインにおいて、ＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、又はＣＳＦ１と肝臓内脂肪率との関係はなかった。
【表4】
【0098】
テサモレリン投与群では、血漿中のＶＥＧＦＡ（ｒ＝０．６２、Ｐ＝０．００６）及びＣＳＦ１（ｒ＝０．５０、Ｐ＝０．０４）の減少がＮＡＳスコアの低下と大きく相関していた（図３Ａ、３Ｂ、及び表４）。さらに、テサモレリン治療参加者のうち、ＴＧＦＢ１（ｒ＝０．６１、Ｐ＝０．００９）及びＣＳＦ１（ｒ＝０．６４、Ｐ＝０．００６）の減少は、遺伝子レベルの線維化スコアの低下と関連した（図４Ａ、４Ｂ）。これら３つの血漿タンパク質の変化は、プラセボ治療参加者の間では、ＮＡＳスコア又は遺伝子レベルの繊維化スコアとの相関は見られず、またいずれの治療群でも肝臓内脂肪率の変化との相関は見られなかった。
【実施例5】
【0099】
実施例５：主要な血漿タンパク質の変化と、肝臓転写レベル及び血清ＩＧＦ－１の変化の関連性
血漿中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１の制御を明らかにするために、次に、全体的試料のうち、それらに対応する肝臓転写レベル及び血清ＩＧＦ－１レベルとの関係性を調査した。ＣＳＦ１は血漿タンパク質の変化と肝臓転写レベルの変化の間に相関を示した（ｒ＝０．５０、Ｐ＝０．００２）。さらに、血清ＩＧＦ－１の増加はＣＳＦ１の直線的な低下に関連していた（ｒ＝-０．３８、Ｐ＝０．０１）。
血漿中のＶＥＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、及びＣＳＦ１の制御を明らかにするために、次に、全体的試料のうち、それらに対応する肝臓転写レベル及び血清ＩＧＦ－１レベルとの関係性を調査した。ＣＳＦ１は血漿タンパク質の変化と肝臓転写レベルの変化の間に相関を示した（ｒ＝０．５０、Ｐ＝０．００２）。さらに、血清ＩＧＦ－１の増加はＣＳＦ１の直線的な低下に関連していた（ｒ＝-０．３８、Ｐ＝０．０１）。
【0100】
本発明は、本明細書に上記の特定の実施形態によって説明されてきたが、添付の特許請求の範囲で定義される主題発明の趣旨及び性質から逸脱することなく、変更され得る。特許請求の範囲では、「含む」という単語は、「限定されないが、含む」という語句と実質的に等価である、オープンエンド用語として使用される。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別段文脈が明らかに指示しない限り、対応する複数の対象物を含む。
【0101】
参考文献
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１３．Ｃｏｕｌｏｎ Ｓ，Ｆｒａｎｃｑｕｅ Ｓ，Ｃｏｌｌｅ Ｉ，Ｖｅｒｒｉｊｋｅｎ Ａ，Ｂｌｏｍｍｅ Ｂ，Ｈｅｉｎｄｒｙｃｋｘ Ｆ，Ｄｅ Ｍｕｎｔｅｒ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２０１２；５９：４４２－４４９．
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１５．Ｃｏｕｌｏｎ Ｓ，Ｌｅｇｒｙ Ｖ，Ｈｅｉｎｄｒｙｃｋｘ Ｆ，Ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅ Ｃ，Ｃａｓｔｅｌｅｙｎ Ｃ，Ｏｌｉｅｖｉｅｒ Ｋ，Ｌｉｂｂｒｅｃｈｔ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｉｎ ｔｗｏ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１３；５７：１７９３－１８０５．
１６．Ｆａｂｒｅｇａｔ Ｉ，Ｍｏｒｅｎｏ－Ｃａｃｅｒｅｓ Ｊ，Ｓaｎｃｈｅｚ Ａ，Ｄｏｏｌｅｙ Ｓ，Ｄｅｗｉｄａｒ Ｂ，Ｇｉａｎｎｅｌｌｉ Ｇ，Ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅ Ｐ．ＴＧＦ－β ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．ＦＥＢＳ Ｊ ２０１６；２８３：２２１９－２２３２．
１７．Ｙａｎｇ Ｌ，Ｒｏｈ ＹＳ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｂ，Ｌｉｕ Ｃ，Ｌｏｏｍｂａ Ｒ， Ｓｅｋｉ Ｅ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；５９：４８３－４９５．
１８．Ｃａｙｏｎ Ａ，Ｃｒｅｓｐｏ Ｊ，Ｍａｙｏｒｇａ Ｍ，Ｇｕｅｒｒａ Ａ，Ｐｏｎｓ－Ｒｏｍｅｒｏ Ｆ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｂ－Ｒｂ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－ｂｅｔａ１ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ ２００６；２６：１０６５－１０７１．
１９．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｏｋ，Ａ．Ｄ．＆ Ｔａｋ，Ｐ．Ｐ．Ａｎｔｉ－ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１６，５３－７０
２０．Ｓｔｕｔｃｈｆｉｅｌｄ ＢＭ，Ａｎｔｏｉｎｅ ＤＪ，Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ ＡＣ，Ｇｏｗ ＤＪ，Ｂａｉｎ ＣＣ，Ｈａｗｌｅｙ ＣＡ，Ｈｕｇｈｅｓ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．ＣＳＦ１ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｆｔｅｒ Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｌｅｖｅｌｓ Ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｃｕｔｅ Ｌｉｖｅｒ Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１５；１４９：１８９６－１９０９ ｅ１８１４．
２１．Ｎａｉｔｏ Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｓ，Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．Ａｂｎｏｒｍａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ‘ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ’（ｏｐ）ｍｉｃｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９１；１３９：６５７－６６７．
２２．Ｒａｄｉ ＺＡ，Ｋｏｚａ－Ｔａｙｌｏｒ ＰＨ，Ｂｅｌｌ ＲＲ，Ｏｂｅｒｔ ＬＡ，Ｒｕｎｎｅｌｓ ＨＡ，Ｂｅｅｂｅ ＪＳ，Ｌａｗｔｏｎ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｒｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏ ｓｉｇｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｏｒ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０１１；１７９：２４０－２４７．
２３．Ｔｏｓｅｌｌｏ－Ｔｒａｍｐｏｎｔ ＡＣ，Ｌａｎｄｅｓ ＳＧ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｖ，Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ ＴＩ，Ｈａｈｎ ＹＳ．Ｋｕｐｐｆｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２；２８７：４０１６１－４０１７２．
２４．Ｌｉ Ｈ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｑｉｕ Ｐ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ Ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０２０；１１：１１６９．
２５．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ＭＥ，Ｙｌａ－Ｈｅｒｔｔｕａｌａ Ｓ，Ｌｉｐｔｏｎ ＢＡ， Ｏｒｄ ＶＡ，Ｗｉｔｚｔｕｍ ＪＬ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ Ｄ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９２；１４０：２９１－３００．
２６．Ｓｊａａｒｄａ Ｊ，Ｇｅｒｓｔｅｉｎ Ｈ，Ｃｈｏｎｇ Ｍ，Ｙｕｓｕｆ Ｓ，Ｍｅｙｒｅ Ｄ，Ａｎａｎｄ ＳＳ，Ｈｅｓｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ＣＳＦ１ ａｎｄ ＣＸＣＬ１２ ａｓ Ｃａｕｓａｌ Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１８；７２：３００－３１０．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】