特表 2023-548209 ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦ治療用ウイルスベクターおよび核酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-15

(54)【発明の名称】ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦ治療用ウイルスベクターおよび核酸

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20231108BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20231108BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20231108BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231108BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N15/63 Z

C12N15/11 Z

A61K31/7105

A61K48/00

A61P29/00

A61P29/00 101

A61P11/00

A61P19/02

A61P9/12

A61P17/00

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527121

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(85)【翻訳文提出日】2023-06-30

(86)【国際出願番号】 EP2021080697

(87)【国際公開番号】W WO2022096612

(87)【国際公開日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2020/081019

(32)【優先日】2020-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100122448

【弁理士】

【氏名又は名称】福井 賢一

(72)【発明者】

【氏名】クロイツ ゼバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】クライン ホルガー

(72)【発明者】

【氏名】シュトローベル ベンヤミン

(72)【発明者】

【氏名】クレー シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ラムラ トルシュテン

(72)【発明者】

【氏名】ケスレ マーク

(72)【発明者】

【氏名】イッケンシュタイン ルドガー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA41

4C084NA14

4C084ZA36

4C084ZA59

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZB15

4C084ZB26

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA41

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZA59

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB11

4C086ZB15

4C086ZB26

(57)【要約】

カプシドおよびパッケージ化された核酸を含み、前記核酸がブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの増加、または前記核酸がブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの阻害のいずれかをするウイルスベクター。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ウイルスベクター。

【請求項2】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、または
（ｉｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有する前記ｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、
ウイルスベクター。

【請求項3】

前記パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、請求項１または２に記載のウイルスベクター。

【請求項4】

前記パッケージ化された核酸が、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードする、請求項３に記載のウイルスベクター。

【請求項5】

カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸とを含む、請求項１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
－配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、および
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。

【請求項6】

カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、
－第１発現カセットが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡとをコードする第１トランスジーンを含み、および
－第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
請求項１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。

【請求項7】

前記ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、請求項５～６のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項8】

前記核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、請求項５～７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項9】

前記トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、請求項５～８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項10】

前記ベクターが、組換えＡＡＶベクターである、請求項１～９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項11】

前記ベクターが、ＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項12】

前記カプシドが、配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項13】

前記カプシドが、配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項14】

前記カプシドが、配列番号８２の第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含むが、前記第１タンパク質と前記第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、請求項１～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項15】

前記ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項16】

パッケージ化された核酸が２本鎖である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項17】

パッケージ化された核酸が１本鎖である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項18】

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項19】

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法が、それを必要とする患者に請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、治療方法。

【請求項20】

医薬品として使用される、請求項１～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項21】

２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、前記２つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ＡＡＶベクター。

【請求項22】

２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。

【請求項23】

前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を含むｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードする、請求項２１または２２に記載のＡＡＶベクター。

【請求項24】

前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードする、請求項２３に記載のＡＡＶベクター。

【請求項25】

前記ベクターゲノムが、さらに配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする、請求項２１～２４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。

【請求項26】

請求項２１～２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。

【請求項27】

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物とを含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。

【請求項28】

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項29】

前記予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、請求項２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項30】

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療は、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項31】

配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項２９または３０に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項32】

前記予防および／または治療が、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、請求項２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項33】

配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項３２に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項34】

前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項35】

配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、請求項３４に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項36】

線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、請求項２８～３５のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【請求項37】

ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物との使用。

【請求項38】

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項39】

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項40】

配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項41】

前記組成物中のｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入される、請求項３８、３９または４０に記載の医薬組成物。

【請求項42】

前記組成物がイオン化脂質を２５から６５ｍｏｌ％含む、請求項４１に記載の医薬組成物。

【請求項43】

前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍである、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項44】

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。

【請求項45】

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。

【請求項46】

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；
（ｃ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物；および
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。

【請求項47】

ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３８～４６のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項48】

ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３８、４０、４１、４２、４４、または４６に記載の医薬組成物。

【請求項49】

ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、請求項３９、４０、４１、４２、４５、または４６に記載の医薬組成物。

【請求項50】

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に請求項３８～４９のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、治療方法。

【請求項51】

ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、請求項３８～５０のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【請求項52】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。

【請求項53】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、または
（ｉｉ）前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡとを含む、
請求項５２に記載のウイルスベクター。

【請求項54】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。

【請求項55】

カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、請求項５４に記載のウイルスベクター。

【請求項56】

線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。

【請求項57】

（ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－前記オリゴマーは、配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
－前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
および
（ｅ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

間質性肺炎（ＩＬＤ）という用語は、大きく不均一な２００以上の肺疾患のグループを含み、そのほとんどは稀な疾患として分類される。ＩＬＤにおける主な異常は、遠位肺実質の破壊であり、結果としてガス交換障害および拘束性換気障害となる。一般的に、肺胞上皮細胞の幾つかの損傷形態が修復機構と対になった炎症性反応を始動すると考えられている。創傷治癒過程は炎症、線維症または両方の組合せとして病理学的に反映される。根底にある病態生理と関係なく、結果として生じる間質腔の変質は呼吸困難および咳のような臨床症状をもたらし、そして肺機能検査において制限的換気障害およびガス交換障害という結果になる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＭＩら、２０１１）。一般的に認められていたＩＬＤの単一の分類はない。それらは通常、その病因（関連性または原因が既知である突発性疾患またはＩＬＤ）、臨床経過（急性、亜急性、または慢性ＩＬＤ）、および主な病理学的特徴（炎症性または線維化性ＩＬＤ）に基づいて分類されうる。線維化性ＩＬＤは、それらの縦断的な疾患活動性に基づいて３つのグループに分けられる（Ｗｅｌｌｓ ＡＵ、２００４）。
● 本質的に非進行性、例えば薬剤除去後の薬剤誘導性肺疾患または誘因除去後の過敏性肺炎（ＨＰ）の幾つかの症例；
● 進行性だが免疫調節により安定、例えば結合組織病（ＣＴＤ）－ＩＬＤの幾つかの症例（Ｔａｓｈｋｉｎ ＤＰら、２００６、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ａら、２０１３、Ｍｏｒｉｓｓｅｔ Ｊら、２０１７、Ａｄｅｇｕｎｓｏｙｅ Ａら、２０１７）；
● 個々のＩＬＤで適当と考えられた治療にも関わらず進行性、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）。

【0002】

ＩＰＦは最も知られている進行性線維化を伴うＩＬＤ（ＰＦ－ＩＬＤ）の基本型である一方、ＩＰＦ以外の異なるＩＬＤ臨床診断を有し、その疾患経過中に進行性繊維化表現型を生じる患者グループがある。これらの患者は、疾患がイメージングでの肺線維症の程度の増加によって定義されること、肺機能の低下、それぞれのＩＬＤで適当とされる管理にも関わらず呼吸症状や生活の質の悪化、そして最終的には早期死亡といったＩＰＦを有する患者との多数の類似性を示す（Ｆｌａｈｅｒｔｙ ＫＲら、２０１７；Ｗｅｌｌｓ ＡＵら、２０１８；Ｃｏｔｔｉｎ Ｖら、２０１９；Ｋｏｌｂ Ｍら、２０１９）。ＩＰＦと同様、これらの他の線維化を伴うＩＬＤを有する患者において、ＦＶＣの低下は患者の死亡率を予想する（Ｊｅｇａｌ Ｙら、２００５；Ｓｏｌｏｍｏｎ ＪＪら、２０１６；Ｇｉｍｅｎｅｚ Ａら、２０１７；Ｇｏｈ ＮＳら、２０１７；Ｖｏｌｋｍａｎｎ ＥＲら、２０１９）。ＩＰＦの患者を除き、進行性線維化を伴うＩＬＤの患者に対しては承認された疾患緩和薬物療法がなく、満たされていない医療ニーズが多くある。それらの臨床的類似性に従って、進行性線維化を伴うＩＬＤは組織損傷に対して共通の線維化反応を示す病態生理学的メカニズムを共有する（図３参）（Ｔｈａｎｎｉｃｋａｌ ＶＪら、２０１４；Ｂａｇｎａｔｏ Ｇ ａｔｅ ａｌ．、２０１５；Ｗｏｌｌｉｎ Ｌら、２０１９；Ｌｕｃｋｈａｒｄｔ ＴＲら、２０１５）。これらのメカニズムは多因子性で複雑である。ＩＬＤ患者の肺における繊維化促進性および増殖促進性の環境は平滑筋細胞および内皮細胞の増加および増殖をもたらす。結果として生じた遠位肺小動脈の筋性化および増加した毛細血管の成長は血管抵抗の増加に寄与している可能性が高い。

【0003】

科学文献によると、進行性線維症を合併し得るＩＬＤは、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）（Ｋｉｍ ＭＹら、２０１２）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）（Ｇｕｌｅｒ ＳＡら、２０１８）、過敏性肺炎（ＨＰ）（Ｓａｄｅｌｅｅｒ ＬＪら、２０１９）、関節リウマチ関連ＩＬＤ（ＲＡ－ＩＬＤ）（Ｄｏｙｌｅ ＴＪ＆Ｄｅｌｌａｒｉｐａ ＰＦ ２０１７）およびＳＳｃ－ＩＬＤ Ｇｕｌｅｒ ＳＡら、２０１８）のような自己免疫性ＩＬＤ、サルコイドーシス（Ｗａｌｓｈ ＳＬら、２０１４）、職業関連肺疾患（Ｋｈａｌｉｌ Ｎら、２００７）を含むが、それに限定されるものではない。ＩＰＦのような進行性線維化を伴うＩＬＤの病因はまだ不明である。しかし、喫煙を含む様々な刺激物、職業上の危険、ウイルスおよび細菌感染ならびに放射線療法および化学療法剤（ブレオマイシンなど）がＩＰＦの進展の潜在的な危険因子として記述されている。過去数年間にわたるＩＰＦ診断基準の変化により、ＩＰＦの有病率は文献においてかなり異なる。最近のデータによると、ＩＰＦの有病率は１００，０００当たり１４．０から６３．０例で変動し、一方、その発生は１００，０００当たり年間の新規症例数が６．８と１７．４例の間にある（Ｌｅｙ Ｂら、２０１３）。ＩＰＦは通常高齢者で診断され、疾患発症の平均年齢は６６歳である（Ｈｏｐｋｉｎｓ ＲＢら、２０１６）。初期診断後、ＩＰＦは３から５年以内に約６０％の死亡率で急速に進行する。ＩＰＦと対照的に、ＣＴＤ（関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群および全身性強皮症（ＳＳｃ）などを含む）またはサルコイドーシス患者の可変部分は進行性線維化表現型を示し、ＲＡ患者の約１０～２０％、シェーグレン症候群の９～２４％、ＳＳｃの＞７０％（Ｍａｔｈａｉ ＳＣおよびＤａｎｏｆｆ ＳＫ、２０１６）およびサルコイドーシス患者の２０～２５％（Ｓｐａｇｎｏｌｏ Ｐら、２０１８）で肺線維症を発症する。

【0004】

２つの主な病理組織学的特徴がＰＦ－ＩＬＤで観察され、すなわち非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）および通常間質性肺炎（ＵＩＰ）である。ＩＰＦの病理組織学的特徴は、ＵＩＰおよび過度の細胞外マトリックス沈着によって引き起こされる進行性間質性線維症である。ＵＩＰは、胸膜下および胸膜傍の線維化領域と、影響の少ないまたは正常な肺実質組織領域が交互に現れる不均質な外観によって特徴づけられる。活動的な線維化領域、いわゆる線維芽細胞巣は、線維芽細胞集積および過剰なコラーゲン沈着によって特徴づけられる。線維芽細胞巣は血管内皮および肺胞上皮の間に位置することが多く、それによって肺の構造が破壊され、特徴的な「蜂巣状構造」が形成される、ＩＰＦの臨床症状は、劇的な酸素拡散障害、進行性肺機能低下、咳および深刻な生活の質の障害である。

【0005】

ＵＩＰはまた、ＲＡ－ＩＬＤおよび後期サルコイドーシスの主要な病理組織学的特徴の１つである。しかし、ＳＳｃまたはシェーグレンのような他のＣＴＤは主に非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）で特徴づけられる。

【0006】

ＮＳＩＰは少ない空間不均一性によって特徴づけられ、すなわち病理学的異常は肺にわたってやや均一な広がりを持つ。細胞ＮＳＩＰサブタイプ場合、病理組織は炎症細胞で特徴づけられるが、より一般的な線維化サブタイプの場合、著しい線維化の領域の追加が明らかである。しかし、病理学的症状は多種多様であるため、それによって正確な診断およびＵＩＰ／ＩＰＦのような他の線維症タイプとの区別が複雑になる。

【0007】

ＩＰＦの病因が不明であるため、細胞および分子レベルの病理学的メカニズムに関する知識はまだ限られている。しかし、機能的研究のための疾患実験モデル（インビトロおよびインビボ）ならびにゲノミクス／プロテオミクス分析のためのＩＰＦ患者からの組織サンプルを使用したトランスレーショナルリサーチの最近の進歩は重要な疾患メカニズムへの貴重な知見を可能にした。現時点での理解によると、ＩＰＦは反復的な肺胞上皮細胞（ＡＥＣ）の微小損傷で始まり、最終的には制御不能で持続的な創傷治癒反応をもたらす。さらに詳細には、ＡＥＣ損傷が隣接する上皮細胞の異常な活性化を誘導し、それによって損傷部位への免疫細胞および幹細胞または前駆細胞の動員につながる。様々なサイトカイン、ケモカインおよび成長因子を分泌することにより、浸潤細胞は炎症促進性環境を生み出し、最終的には線維芽細胞の拡大および活性化をもたらす。生理的状態の下では、これらのいわゆる筋線維芽細胞は胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分を産生し、損傷組織を安定化させ、修復する。さらに、創傷治癒過程の後期において、筋線維芽細胞はそれら固有の収縮性機能を通して組織収縮および創傷閉鎖に寄与する。生理的創傷治癒と対照的に、ＩＰＦにおいて炎症およびＥＣＭ産生は自己制限されない。その結果、これはＥＣＭの継続的な沈着につながり、最終的には進行性肺硬化および肺構造の破壊をもたらす。実際、ＥＣＭバイオマーカーはＰＦ－ＩＬＤの治療開始の決定に使用できる。ＷＯ２０１７／２０７６４３参照。分子レベルでは、ＩＰＦの病因は多数の線維化促進メディエーターおよびシグナリング経路により編成されている。強力な繊維化効果によりＩＰＦで中心的役割を果たすＴＧＦβの他に、チロシンキナーゼシグナリングおよび例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような様々な対応成長因子の上昇がＩＰＦの発病に寄与する。

【0008】

近年、いくつかの薬剤がＩＰＦ治療のために臨床試験された。しかし、今までのところピルフェニドン（Ｅｓｂｒｉｅｔ（登録商標）、ロシュ社／ジェネンテック社）およびニンテダニブ（Ｏｆｅｖ（登録商標）、ベーリンガーインゲルハイム社）の２剤だけが、肺機能低下率の低下の実証により疾患進行度の減速という納得できる治療効果を示した。これらの有望な結果にもかかわらず、ＩＰＦにおける医療ニーズはまだ高く、有効性が向上し、理想的には疾患修正の可能性を有する更なる治療法が緊急に求められている。ニンテダニブはまた、全身性強皮症関連のＩＬＤの治療ならび進行性表現型を有する慢性線維化性間質性肺炎に対して承認されている。一般的に、現在のＩＬＤ管理は副腎皮質ステロイドまたは免疫調節療法による炎症抑制が主である。後者は、事例報告およびアザチオプリン、シクロスポリン、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、リツキシマブおよびタクロリムスを使用した小規模な症例シリーズにおける制御されていない治療反応に基づいている。幾つかのＩＬＤ、例えばＣＴＤ－ＩＬＤの幾つかの症例は免疫調節により安定化でき（Ｔａｓｈｋｉｎ ＤＰら、２００６；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ａら、２０１３；Ｍｏｒｉｓｓｅｔ Ｊら、２０１７；Ａｄｅｇｕｎｓｏｙｅ Ａら、２０１７）、その他はそれぞれのＩＬＤで適当と考えられる（薬理学的および／または非薬理学的）治療にも関わらず進行性であり（Ｗｅｌｌｓ ＡＵ ２００４）、革新的な治療アプローチに対する残存する高い要求をさらに論証している。

【0009】

肺高血圧症（ＰＨ）は、最も頻繁なＩＬＤ合併症の１つであり、早期死亡率の独立した駆動因子でありうる（Ｇａｌｉe Ｎら、２０１５）。ＰＨは右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の上昇、右室圧過負荷、ならびに右心房および心室拡張を有する疾患として定義される（Ｓｍｉｔｈら（２０１３）、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ、３４６（３）：２２１－２２５）。

【0010】

慢性線維化珪肺症はＩＬＤの系統に属する。結晶性シリカの慢性的で反復的な吸入により引き起こされ、肺胞空間における上皮細胞を損傷し、マクロファージを活性化させて炎症反応を起こさせる。両因子は、常在線維芽細胞の活性化およびこれらの肺領域における関連する細胞外マトリックスの大量沈着をもたらす。

【技術分野】

【0011】

ＩＰＦおよび他の線維化ＩＬＤの発病に関わるおびただしい数の経路によって、様々な疾患メカニズムを同時に調節することを目的としたマルチターゲット治療が最も効果的である可能性が高い。しかし、低分子化合物（ＮＣＥ）または、例えばモノクローナル抗体のような生物物質（ＮＢＥ）を使用した古典的な薬理学的戦略では、それぞれのアプローチで実施するのが難しい。なぜなら両様式とも通常単一の薬物標的または密接に関わる分子の小さなセットを特異的に阻害または活性化するよう設計されるからである。ＰＦ－ＩＬＤに対するマルチターゲット治療を可能にするため、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、生理的および病態生理学的条件の下、特定の標的遺伝子セットのｍＲＮＡ発現レベルを制御することにより、シグナリング経路全体または細胞メカニズムを制御および微調節する能力に基づく新規かつ非常に魅力的な標的クラスの代表例である。ｍｉＲＮＡは小さな非コーディングＲＮＡであり、前駆体分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として転写される。核内で、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは第１成熟過程を受け、小ヘアピン構造によって特徴づけられる、いわゆるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが生成する。核外搬出に続いて、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはＤｉｃｅｒ酵素を介した第２プロセッシング工程を受け、それによって約２２ヌクレオチドの長さの２本鎖の完全な成熟ｍｉＲＮＡが生成される。その遺伝子制御機能を発揮するため、成熟ｍｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に統合され、標的ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに位置するｍｉＲＮＡ結合部位に結合することを可能にする。結合すると、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの不安定化および切断を誘導、および／または各ｍＲＮＡのタンパク質翻訳の阻害によって遺伝子発現を調節する。現在まで、ヒトでは２０００以上のｍｉＲＮＡが見出され、トランスクリプトームの３０％までを制御する可能性がある（Ｈａｍｍｏｎｄ ＳＭ、２０１５）。

【0012】

本発明は、線維化肺疾患の発病に関わるｍｉＲＮＡの同定、およびウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用したＩＬＤ患者、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ患者、特にＩＰＦ患者における、各ｍｉＲＮＡの機能調節によるＰＦ－ＩＬＤのような肺疾患の治療法を開示する。本発明は、ヒトの治療に焦点を当てるが、いずれかの哺乳動物、特にウマ、イヌ、ネコのような伴生種哺乳動物も発明の領域内である。

【発明の概要】

【0013】

中程度（チャイルドピューＢ）または重度（チャイルドピューＣ）の肝障害を有する患者でのオフェブ（Ｏｆｅｖ）の治療は推奨されていない（ＥＰＡＲ参照）。エスブリエット（Ｅｓｂｒｉｅｔ）は、既にフルボキサミンを服用している患者（鬱および強迫性障害の治療に使用される薬剤）または重度の肝または腎異常を有する患者に使用してはいけない（ＥＰＡＲ参照）。従って、ＰＦ－ＩＬＤ患者に対して、特に重度肝および腎異常を有するＩＰＦ患者に対してまだ高い医療ニーズがある。本発明の目的は、代替治療を提供することである。本発明の別の目的は、既存の治療から恩恵を受けることができない患者グループであっても適格な代替治療を提供することである。

【0014】

エスブリエットおよびオフェブは確実な有効性を示す一方、両剤の併用療法に対するオプションを制限する可能性がある副作用も伴う（両方のＥＰＡＲ参照）。従って、少ない副作用、または少なくともオフェブまたはエスブリエットとは異なる副作用がある、ＰＦ－ＩＬＤおよび特にＩＰＦ治療のようなＩＬＤ治療にはまだ高い医療ニーズがあるため、オフェブまたはエスブリエットのいずれかとの併用療法が全体的な治療効果を増加させるための選択肢となりうる。本発明の別の目的は、確立された治療オプションと比べて異なるリスク／ベネフィットプロファイルを持つ、例えば確立された治療選択肢と比較してより少ない副作用または異なる副作用を持つ、別の治療選択肢を提供することである。オフェブおよびエスブリエットは、経口すなわち全身的な使用が意図されているが、局所投与または局所および全身経路の両方によって投与可能な治療選択肢がまだ求められている。本発明の別の目的は、局所投与または局所および全身経路の両方によって投与可能な治療選択肢を提供することである。本発明の別の目的は、各マイクロＲＮＡを効率的に発現するウイルスベクターを提供することである。本発明のさらに別の目的は、ウイルスベクターがその対応物よりさらに効率的に各マイクロＲＮＡを発現することであり、例えば各マイクロＲＮＡが５ｐである場合、５ｐマイクロＲＮＡは、その３ｐ対応物より効率的に発現されることである。

【0015】

本発明のさらに別の目的は、
－有効成分の単回または回数限定の投与のＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦの表現型の複数の態様に対処するＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦの表現型の複数の態様でも対処するＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよび／またはＩＰＦと重大な併存疾患を起こす疾患に有益作用をもたらす可能性のあるＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦに対する治療選択肢、および／または
－ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの動物モデルおよび細胞モデルにおいて、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの表現型の１つあるいはそれ以上の態様を低減するツール化合物の組成物
を提供することである。

【0016】

本発明は、一態様において、一般にＩＬＤの治療、および特にＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦの治療のための治療薬、すなわちウイルスベクターまたはｍｉＲＮＡ模倣物に関する。

【0017】

本発明によるウイルスベクターは、ＩＬＤ、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ、さらに好ましくはＩＰＦで見られるＥＣＭ沈着のような組織変容の１つまたはそれ以上の態様をｍｉＲＮＡ機能調節により阻止または遅らせるため、これらの疾患で見られる肺活量低下を阻止または遅らせる（ＷＯ２０１７／２０７６４３および参考文献参照）。本発明に記載のウイルスベクターは局所（鼻腔内、気管内、吸入）または全身（静脈内）経路で患者に投与できる。特にＡＡＶベクターは、極めて効率的に肺を標的とすることができ、低い抗原性をするため、特に全身投与にも適している。

【0018】

治療の観点から、ｍｉＲＮＡ模倣物を送達することにより線維化状態でダウンレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡ効果を増大させることで、またはｍｉＲＮＡをブロックする分子あるいはいわゆるアンチｍｉＲまたはｍｉＲＮＡスポンジを送達することにより、その利用可能率を減少させて、病的状態下でアップレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡの機能性を阻害することで、ｍｉＲＮＡ機能は調節可能である。

【0019】

さらに、アップレギュレートされる本発明で記載のｍｉＲＮＡもまた天然の抗線維化反応の一部として保護機能を発揮することもある。しかし、この効果はそれ自体で病状を解消するには十分ではないことは明らかである。従って、特定のケースにおいては、線維化状態で既に上昇している配列のｍｉＲＮＡ模倣物の送達は、その抗線維化効力をさらに高める可能性があり、それによって治療介入に追加モデルを提供する。

【0020】

ｍｉＲＮＡが複数の標的遺伝子の同時制御を指揮するという事実に基づき、ウイルスベクターを介するｍｉＲＮＡ機能の調節は、異なる疾患経路に影響することでマルチターゲット治療を可能にする魅力的な戦略を示す。本発明に記載した肺線維症関連ｍｉＲＮＡは、異なる標的遺伝子セットを調節することにより、以前同定されたｍｉＲＮＡと区別され、それによって向上した治療有効性の可能性を提供する。

【0021】

本発明では、２つの疾患関連動物モデル、特に斑状の急性炎症誘発線維化表現型によって特徴づけられるブレオマイシン誘導型肺損傷、およびより均質なＮＳＩＰパターンを連想させるＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘発線維症の詳細な特性解析および計算解析により、肺線維症関連のｍｉＲＮＡセットが同定された。疾患関連ｍｉＲＮＡの同定を可能にするため、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの縦断的な転写プロファイルならびに機能データが作成された。さらに、配列と発現の反相関に基づいて高い信頼度のｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ調節関係が構築され、それらの標的セットに基づいて疾患モデルのコンテクストにおいてｍｉＲＮＡを特徴づけることができた。これらの知見をさらに具体化するために、選択されたｍｉＲＮＡ候補（ｍｉｒ－２９ａ－３ｐ、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉｒ－２１２－５ｐ）の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド模倣物を作製し、ヒト初代肺線維芽細胞、ヒト初代気管支気道上皮細胞およびＡ５４９細胞の細胞線維症モデルにおいて一過性のトランスフェクション実験に使用した。一過性にトランスフェクトされたｍｉＲＮＡの効果をＴＧＦβ誘導性線維化リモデリング（炎症、増殖、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）、上皮から間葉への移行（ＥＭＴ））の主な側面において調査することにより、選択されたｍｉＲＮＡの予測される抗線維化効果が確認された。最終的に、これらの知見を臨床応用に移すため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく遺伝子送達を使用することによりＰＦ－ＩＬＤ関連ｍｉＲＮＡの調節を可能にする線維化肺疾患に対する新規治療方法について記述する。

【0022】

本発明によるｍｉＲＮＡ模倣物は、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのようなＩＬＤＳで見られるＥＣＭ沈着のような組織変容の１つあるいはそれ以上の態様をｍｉＲＮＡ機能調節により阻止または遅らせるため、これらの疾患で見られる努力性肺活量の低下を停止または遅らせる（ＷＯ２０１７／２０７６４３および参考文献参照）。本発明によるウイルスベクターと比較して、それらは潜在的に低い抗原性などの異なる副作用プロファイル持ち、それによって免疫抑制剤併用治療を用いず複数の治療を潜在的に可能にする。

【0023】

２つの疾患関連動物モデル、すなわちマウスでのブレオマイシンおよびＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘発肺線維症モデルにおいて縦断的に詳細分析を行うことで、２８の新規ｍｉＲＮＡセットが同定された。最も関連性のあるｍｉＲＮＡを選択するために、遺伝子発現プロファイルデータおよび基本的な機能的疾患パラメータ間の体系的な相関分析に基づいて、本発明者らはヒット選択戦略を開発した。本発明者らは、ＰＦ－ＩＬＤの慢性的性質に配慮して、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターによるｍｉＲＮＡ、アンチｍｉＲまたはｍｉＲＮＡスポンジの発現を、線維症関連ｍｉＲＮＡの機能調節のための治療用核酸の長期持続発現を可能にする新規治療コンセプトとして記述する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】研究デザインを図示する。合計１３０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、気管内投与で、ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｋｇブレオマイシンまたはＡＡＶ６．２－スタッファーコントロールまたはＡＡＶ６．２－ＣＭＶ－ＴＧＦβ１ベクターのいずれかの２．５ｘ１０¹¹ベクターゲノム（ｖｇ）が投与された。スキームに示した各読出しおよびサンプリング（ＲＳ）時間で、肺機能測定が行われ、湿肺重量を測定した。次に、左肺は線維化進展の組織学的評価に使用され、右肺は全肺ＲＮＡの単離のため溶解した。ＲＮＡは、疾患の出現と相関する遺伝子発現変化をプロファイルするため次世代シーケンスに用いた。

【図2】肺病理の機能的特性解析に関するデータを示す。マウスは図１に記載したように処理し、線維化の進展を測定した。（Ａ）マッソントリクローム染色した組織学的肺切片は、投与後２１日から肺胞中隔肥厚、細胞外マトリックス沈着の増加および免疫細胞の存在から明らかな線維化出現を示した。下のパネル画像は、上のパネルの顕微鏡写真を１０ｘ拡大した詳細を示す。（Ｂ）ＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン処理動物での湿肺重量の増加は、ＥＣＭ沈着の増加を示し、（Ｃ）線維化動物での肺機能の強い障害に至った。平均＋／－ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、各コントロール処理と比較。

【図3】遺伝子発現解析の結果の概要を示す。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの並行シーケンシングを行うことによって、両モデルにおける分析された全時点でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたｍＲＮＡ（Ａ）およびｍｉＲＮＡ（Ｂ）が同定された。差次的発現遺伝子を同定するためのカットオフ基準、Ｐ ａｄｊ．（ＦＤＲ）≦０．０５、ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）≧０．５（ＦＣ≧１．４１４）。（Ｃ）１つのモデルでのみ差次的発現を示すｍＲＮＡを、両モデル（共通にＤＥ）で差次的に発現したｍＲＮＡから各時点で分離し、ＫＥＧＧ経路エンリッチメント分析を行った。データでは、ブレオマイシンモデルにおいて初期時点での急性炎症（「サイトカイン－サイトカイン相互作用」）に対するエンリッチメントが見られたがＡＡＶモデルでは見られなかった。一方、線維化進展（ＥＣＭ受容体相互作用）に対するエンリッチメントが両モデルにおいて時間依存的な様式で観察された。

【図4】線維症関連ｍｉＲＮＡの同定に適用したフィルタ処理の全体像を提供する。第１段階では、２つのモデルのうち少なくとも１つにおいて肺機能および／または肺重量と相関するｍｉＲＮＡ（Ｃ）または反相関するｍｉＲＮＡ（ＡＣ）が同定された。続いて、相関および反相関のｍｉＲＮＡをフィルタにかけ、差次的遺伝子発現を示す候補を探した。定義上、少なくとも１つの動物モデルにおいて１時点あるいはそれ以上で発現レベルが変化（Ｐ ａｄｊ．（ＦＤＲ）≦０．０５、ａｂｓ（ｌｏｇ２ＦＣ）≧０．５；上方または下方制御）した場合、ｍｉＲＮＡは差次的に発現したとみなした。最終段階では、フィルタしたｍｉＲＮＡを種の保存に関して評価した。シード領域において配列同一性を示し、マウスとヒトの間で成熟ｍｉＲＮＡ配列に対するアラインメント・スコアが少なくとも２０のｍｉＲＮＡはホモログとみなし、一方残りのｍｉＲＮＡはマウス特異的、従って非保存として分類した。最後に、結果として得られたヒットリストは、異なるまたは強い変動発現プロファイルを有する候補、特許取得済みのｍｉＲＮＡおよびアップレギュレートされる非保存ｍｉＲＮＡはヒトにおいて標的にはならないので除外することでマニュアルキュレーションした。

【図5A】図４に記載の通りフィルタ処理の適用により同定された線維症関連ｍｉＲＮＡを示す。ヒトホモログが同定されなかったｍｍｕ－ｍｉＲ－３０ｆおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－７６５６－３ｐを除いて、表示したｍｉＲＮＡは全て種保存されている（非常に類似または一致）。ヒトホモログに対するミスマッチは太字および下線で示す。表示した配列はプロセス化され完全成熟したｍｉＲＮＡを表す。

【図5B】マウス配列の最も近いヒトホモログで非常に類似した（しかし一致していない）ものを図５Ｂに示す。 表示した配列はまた配列表にまとめられている。配列表および図５Ａおよび図５Ｂの間で矛盾した場合、図５が真正の配列を表す。

【図6】標的予測のワークフローを模式的に示す。図５に載せたｍｉＲＮＡ候補について、ＤＩＡＮＡ、ＭｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎおよびｍｉＲＤＢデータベースで照合することによりｍＲＮＡ標的を予測した。５つのデータベースのうち少なくとも２つで予測されたｍＲＮＡを検討し、動物モデルでのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ測定値の間の発現の反相関によってさらにフィルタにかけた。その縦断的な発現が対応するｍｉＲＮＡ発現と反相関（ｒｈｏ≦－０．６）した予測ｍＲＮＡを推定標的と呼んだ。それに続き、標的リストは、ｍｉＲＮＡ標的スペクトルの機能的特徴のための経路エンリッチメント分析に供した。

【図7】予測された標的セットのエンリッチメントに基づいてｍｉＲＮＡ機能の特徴を示す。各ｍｉＲＮＡに対する予測標的セットには、異なるソースからの参照遺伝子セットに対してエンリッチメントテストを行った。表は、肺線維症のコンテクストにおいて関連のある選ばれた遺伝子セットの小さなサブセットに対する、選ばれたｍｉＲＮＡセットのサブセットの－ｌｏｇ（ｐ ａｄｊ）を示す。より高い値はより強いエンリッチメントを示す。

【図8】ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的コンストラクトの発現を可能にするためのベクターデザインを記載する。（Ａ）線維化状態下でダウンレギュレートされる単独のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ組合せはポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ－ＩＩ）またはポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ－ＩＩＩ）プロモーターを使ってベクターから発現できる。ｍｉＲＮＡ配列は各ｍｉＲＮＡの天然バックボーンを使ってまたは外来ｍｉＲＮＡバックボーンに埋め込むことで発現でき、それによって人工的ｍｉＲＮＡを産生する。両方の場合で、ｍｉＲＮＡは前駆体ｍｉＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）として発現し、細胞内で成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。機構的に、プロセシングされたｍｉＲＮＡは標的遺伝子の３’－ＵＴＲに位置するｍｉＲＮＡ結合部位に選択的に結合し、それによってｍＲＮＡ分解および／またはタンパク質翻訳阻害を通して線維症関連遺伝子の発現レベルの減少をもたらす。（Ｂ）線維化状態下でアップレギュレートされる内因性ｍｉＲＮＡの阻害は、アンチセンス様分子いわゆるアンチｍｉＲの発現により達成できる。各配列はｓｈＲＮＡバックボーンまたは人工的ｍｉＲＮＡバックボーンからＰｏｌ－ＩＩまたはＰｏｌ－ＩＩＩプロモーターを使用して発現させることができる。細胞内プロセシングの後、アンチｍｉＲが線維化促進性標的ｍｉＲＮＡに結合し、それによってそれらの機能性を阻害する。（Ｃ）線維化促進性ｍｉＲＮＡを阻害する別のアプローチは、ｍｉＲＮＡ特異的標的配列、いわゆるスポンジの発現である。Ｐｏｌ－ＩＩプロモーターを使用した発現によって、ｍｉＲＮＡスポンジは線維化促進性ｍｉＲＮＡの封鎖をもたらし、それによってそれらの病理学的機能を阻害する。

【図9】ｍｉＲＮＡ発現またはｍｉＲＮＡ標的コンストラクトの肺送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの生成を図示する。５’末端および３’末端でのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）による発現コンストラクトのフランキングは、ＡＡＶベクターへのパッケージングを可能にする。様々な天然血清型（ＡＡＶ５、ＡＡＶ６）または修飾カプシド変異（ＡＡＶ２－Ｌ１、ＡＡＶ６．２）は、局所（鼻腔内、気管内、吸入）または全身（静脈内）投与経路の両方で肺への効率的な遺伝子送達を可能にする非常に強力なベクターとして過去に記述されている。

【図10】異なるＡＡＶ血清型またはカプシド変異体による肺へのＡＡＶ仲介遺伝子送達の例を提供する。（Ａ）最近記載された全身投与で肺特異的遺伝子送達を可能にするペプチド挿入モチーフを内部に持つＡＡＶ２変異である、ＡＡＶ２－Ｌ１－ＧＦＰ（３ｘ１０¹¹ｖｇ／マウス）の静脈注射の２週間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス肺切片での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の免疫組織学的染色（Ｋоｒｂｅｌｉｎ Ｊら、２０１６）。ＰＢＳコントロール群ではバックグラウンド染色をこ得る特異的なシグナルは観察されなかった。１群当たり動物ｎ＝６のうちマウス２匹（ｍｓ１、ｍｓ２）からの代表画像。（Ｂ）ＦＶＢ／ＮマウスにおけるインビボイメージングによるＡＡＶ２－Ｌ１体内分布評価（発表データ、Ｋоｒｂｅｌｉｎ Ｊら、２０１６）。ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）の肺特異的発現は、投与量５ｘ１０¹⁰ｖｇ／マウスでｆＬｕｃ発現ＡＡＶ２－Ｌ１ベクターの静脈注射後２週間で観察された。（Ｃ）ｆＬｕｃ発現ＡＡＶ５ベクター（２．９ｘ１０¹⁰ｖｇ／マウス）または陰性コントロールとしてＰＢＳの気管内点滴２週間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから調製したマウス肺のエクスビボイメージング。定量的な肺形質導入は、ＡＡＶ５－ｆＬｕｃ処理動物においてｆＬｕｃ陽性細胞から生じる発光を発光（Ｌｕｍ）チャネルで検出することにより観察した。準備した肺の明視野（ＢＦ）像を上パネルに示す。グループ当たり動物ｎ＝４のうちマウス２匹（ｍｓ１、ｍｓ２）の代表画像を示す。（Ｄ）投与量３ｘ１０¹¹ｖｇ／マウスでＧＦＰ発現ＡＡＶ６．２ベクターの気管内投与３週間後のＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＡＶ６．２介在肺送達の分析。組織学的肺切片の顕微鏡写真は直接ＧＦＰ蛍光（右）およびＧＦＰ発現の免疫組織学的分析（左）を示す。ＰＢＳコントロール群ではバックグラウンド染色を超える特異的なシグナルは観察されなかった。１群当たり動物ｎ＝５の代表画像を示す。

【図11】異なるｍｉＲＮＡ発現カセットの例を提供する。Ａ）ＣＭＶ－ｍｉｒ１８１ａ－ｓｃＡＡＶ（ｃＤＮＡ（ｅＧＦＰ）とｍｉＲＮＡの同時発現用２本鎖ＡＡＶベクターゲノム）およびＣＭＶ－ｍｉｒ１８１ａ－ｍｉｒ１８１ｂ－ｍｉｒ１０ａ－ｓｃＡＡＶ（３つのｍｉＲＮＡの同時発現用２本鎖ＡＡＶベクターゲノム）のベクターマップ。Ｂ）例としてｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを使用したｍｉＲ－Ｅバックボーンでの異なるｍｉＲＮＡデザインの図解。最初の２つの例では、完全に一致する相補鎖を使用してｍｉＲ－Ｅバックボーンでパッセンジャーまたはガイド位置で完全成熟ｍｉＲＮＡ（２３ｎｔ）として組み込まれたｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを示す。２番目の例では天然型ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとしてｍｉＲ－Ｅバックボーンにｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐを組み込んだコンストラクトデザインを示す。ｍｉｒＢａｓｅ由来の予測されるｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの２Ｄ構造（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）。

【図12】３’ＵＴＲに対応する標的配列を有するＧＦＰ発現コンストラクト上のｍｉｒ－ＥバックボーンにおけるｍｉＲ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐのノックダウン効率を示す。ＨＥＫ－２９３細胞に１つのｍｉＲＮＡをコードしたプラスミドと共にＧＦＰ発現コンストラクトを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。陽性コントロールは最適なｍｉｒ－Ｅコンストラクトであり、一方陰性コントロールは３’ＵＴＲに標的配列の無いＧＦＰコンストラクトである。ｍｉｒ１８１ａ－５ｐの実験は配列番号４９および４７によるガイド位置、ｍｉＲ－Ｅバックボーンを基にしたコンストラクトで行った。ｍｉＲ２１２－５ｐについての実験はそれぞれ配列番号６１および５９によるコンストラクト（ｍｉＲ－Ｅバックボーン、ガイド位置）に基づいた。図２５も参照。ｍｉＲ２９ａ－３ｐについての実験では配列番号８６によるコンストラクトを使用し、コントロールについても同様に配列番号８３によるコンストラクトを使用した。特に、配列番号４９および配列番号６１はそれぞれ配列番号１５および配列番号１７による各参照配列ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐおよびｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐより３’末端で１ｎｔ短いｍｉＲＮＡを保有する。

【図13】ｎ＝６の複製でｓｍａｌｌ ＲＮＡ配列決定を使用して測定した、ヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）におけるマウスｍｉＲＮＡ候補のヒトオルソログの基礎的ｍｉＲＮＡ発現を示す。発現レベルは１００万当たりのカウント（ｃｐｍ）で示す。矢印はさらに機能的特性解析に選択された、特に興味のあるｍｉＲＮＡ候補を示す。

【図14】無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したＡ５４９細胞で炎症性ＩＬ６発現に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。ＩＬ－６は、様々な線維性疾患、例えばＩＰＦまたは全身性強皮症において１つの主要な炎症性サイトカインである。上記サイトカインは、なかでもとりわけ、活性化した上皮細胞によって産生され、線維芽細胞および免疫細胞を刺激することができ、線維化反応／変容を刺激する。従って、ＴＧＦβ処理Ａ５４９肺上皮細胞はＩＰＦにおける炎症の病態生理学的側面を模倣する良い代替モデルである。（Ａ）ＩＬ６の発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物を濃度２ｎＭで細胞にトランスフェクションして評価した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１でさらに２４時間刺激した。抽出したＲＮＡはその後ｃＤＮＡへ逆転写し、ＩＬ６遺伝子発現をｑＰＣＲで測定した。（Ｂ）細胞をトランスフェクトし、（Ａ）に記載の通り刺激して、細胞上清の分泌されたＩＬ６タンパク質をＥＬＩＳＡ測定で検出した。発現レベルは無刺激ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）に対する相対値で表す。トリプル＝ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐの同時トランスフェクション。実験ｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。

【図15A】ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）の上皮－間葉移行（ＥＭＴ）における単独のｍｉＲＮＡおよびそれらの組合せの効果を示す。ＥＭＴは線維肺リモデリングの発生において１つの重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ）により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、上皮細胞の間葉（様）細胞への変化が誘導される。これらの細胞はその上皮細胞機能／完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を失い、バリア機能、空気交換能力の低下をもたらし、細胞外マトリックス沈着の増加がはじまる。３つの側面全てがＩＰＦ疾患の特徴である。機能的および完全体上皮細胞に対するマーカーは細胞マーカーＥ－カドヘリンである。Ｅ－カドヘリンの消失はＥＭＴのマーカーとしてみなされる。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。ＥＭＴは、図示するように、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭ、またはそれらの組合せ４ｎＭまたは１２ｎＭで細胞にトランスフェクションし、その後５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ１で刺激して評価した。Ｅ－カドヘリン（上皮細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数により正規化し、ここにｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍変化をここに示した。繰り返しｎ＝４、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。ＳＳＭＤ：厳密標準化平均差；＃：｜ＳＳＭＤ｜＞２、＃＃：｜ＳＳＭＤ｜＞３、＃＃＃：｜ＳＳＭＤ｜＞５。

【図15B】ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥＣ）の上皮－間葉移行（ＥＭＴ）における単独のｍｉＲＮＡ（それぞれｍｉＲ１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－３ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ）およびそれらの組合せの用量／応答実験を提供する。ＥＭＴは、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。表示した濃度は合計濃度である。２つまたは３つのｍｉＲＮＡ組合せについては、関与する単独のｍｉＲＮＡ模倣物の濃度にするために、合計濃度をそれぞれ２または３で割る必要がある。細胞は５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ１で刺激した。Ｅ－カドヘリン（上皮細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数により正規化し、ここにｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍変化を示した。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。繰り返しｎ＝４、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。

【図16】無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）における炎症性ＩＬ６発現に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。ＩＬ－６は、様々な線維性疾患、例えばＩＰＦまたは全身性強皮症において１つの主要な炎症性サイトカインである。上記サイトカインは、なかでもとりわけ、活性化した上皮細胞によって産生され、線維芽細胞および免疫細胞を刺激することができ、線維化反応／形質転換を引き起こす。しかし、活性化した線維化促進性の線維芽細胞も、特に老化表現型を有するものが、多くの炎症性サイトカインを産生し、一方ＩＬ－６は最も顕著な因子の一つである。従って、ＴＧＦβ処理ヒト初代肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）はＩＰＦにおける炎症の病態生理学的側面を模倣する良い代替モデルである。ＩＬ６の発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭで細胞をトランスフェクションして評価した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１でさらに２４時間刺激した。抽出したＲＮＡはその後ｃＤＮＡへ逆転写し、ＩＬ６遺伝子発現をｑＰＣＲで測定した。繰り返しｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。

【図17】無刺激またはＴＧＦβ１で刺激したヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）の増殖に対するｍｉＲＮＡの効果を示す。制御された線維芽細胞の増殖はあらゆる損傷治癒過程において重要な側面である。肺線維症を含む線維性疾患は、異常で制御されていない線維芽細胞増殖を有する異常な損傷治癒過程である。これも部分的には成長因子ＴＧＦβによって駆動される。従って、ＴＧＦβ活性化肺線維芽細胞の増殖の測定は、この病態生理学的な側面を模倣するのに重要な分析である。線維芽細胞増殖の減少は抗線維化効果としてみなされる。増殖は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）または表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭで細胞をトランスフェクション入し、その後５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ１で刺激して評価した。増殖は、細胞数との直接相関として細胞代謝活性（ミトコンドリア脱水素酵素）を測定する分光光度酵素的ＷＳＴ－１増殖分析を使用して測定した。繰り返しｎ＝３、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。

【図18】ヒト正常肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）の線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）に対する単独のｍｉＲＮＡおよびそれらの組合せの効果を示す。ＦＭＴは線維肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。α－平滑筋アクチンの発現により、筋線維芽細胞は非常に収縮しやすくなり、コラーゲンを含む多くの細胞外マトリックス構成成分の大量沈着の増加が始まる。筋線維芽細胞は線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。筋線維芽細胞の２つのマーカーはα－平滑筋アクチンとサブユニットＣｏｌ１ａ１を通して検出される沈着コラーゲンの細胞レベルの増加である。Ｅ－カドヘリンの増加は上皮特性の維持を示しており、従って抗線維化と考えられる。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。ＦＭＴは、図示するように、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物濃度２ｎＭ、またはそれらの組合せ４ｎＭまたは１２ｎＭで細胞をトランスフェクションし、その後５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ１で刺激して評価した。コラーゲンタイプ１ α１（筋線維芽細胞のマーカー）は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。ドナーｎ＝２（繰り返し各４回）、平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｍｉＲＮＡ候補対Ｃｔｒｌ）。ＳＳＭＤ：厳密標準化平均差；＃：｜ＳＳＭＤ｜＞２。

【図19】正常およびＩＰＦ肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着に対する単独のｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの効果を示す。コラーゲン１の沈着は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１で刺激した。コラーゲンタイプ１ α１は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。ドナーｎ＝７、平均±ＳＤ。２元配置分散分析、ダネットの多重比較。

【図20】肺線維芽細胞における異なるコラーゲンサブタイプの発現に対するｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐの効果を示す。ＦＭＴは線維性肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。筋線維芽細胞は、多くの細胞外マトリックス構成成分たとえば異なるタイプのコラーゲンを産生するため、線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。特にコラーゲン１、３および５は線維性瘢痕マトリックスの構成成分としてみなされる。ＴＧＦβ活性化後の線維芽細胞でのコラーゲンサブユニット（Ｃｏｌ１ａ１、３ａ１および５ａ１）の検出は、線維性疾患におけるこの病態生理学的側面の良好な代理としてみなされる。コラーゲンサブユニットの減少は、抗線維化として考慮される。Ａ）Ｃｏｌ１ａ１およびＢ）Ｃｏｌ５ａ１タンパク質の発現ならびにＣ）Ｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡの発現を、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭ（１本鎖ｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの組合せ２＋２ｎＭで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１で刺激した。７２時間後、コラーゲンタイプ１α１および５α１はウエスタンブロット技術で免疫染色し、デンシトメトリーで定量した。コラーゲンの発現はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。Ｃｏｌ３ａ１は２４時間後にＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴ ｍＲＮＡに対して正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。Ａ（ｎ＝５）およびＢ（ｎ＝３）についてはｍｉＲＮＡ候補とコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化、Ｃ（ｎ＝４）についてはｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。

【図21】Ａ５４９上皮－線維芽共培養における肺線維芽細胞上でのＣｏｌ１ａ１のｍＲＮＡ発現に対するｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐの効果を示す。Ｃｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭのどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。継代培養した肺線維芽細胞と共に、Ａ５４９細胞を透過性誘導細胞フィルタ上に１００％コンフルエントになるように播種した。Ａ５４９細胞および線維芽細胞はフィルタにより分離されているが、Ａ５４９分泌因子が線維芽細胞に流れ込むことは可能である。Ａ５４９細胞のみを５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１で刺激し、一方サブシードした肺線維芽細胞は外来ＴＧＦβ１で刺激しなかった。２４時間後、肺線維芽細胞中のコラーゲンタイプ１ａ１ ｍＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴ ｍＲＮＡで正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。ｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１（ｎ＝３）間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。

【図22】正常およびＩＰＦ肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着に対する単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ、ならびにこれらのｍｉＲＮＡの組合せの効果も示す。ＦＭＴは線維肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。α－平滑筋アクチンの発現により、筋線維芽細胞は非常に収縮しやすくなり、コラーゲンを含む多くの細胞外マトリックス構成成分の大量沈着の増加が始まる。筋線維芽細胞は線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。筋線維芽細胞の２つのマーカーはα－平滑筋アクチンとサブユニットＣｏｌ１ａ１を通して検出される沈着コラーゲンの細胞レベルの増加である。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。コラーゲン１の沈着は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物の増加濃度（単独のｍｉＲＮＡ：１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、２つの組み合わせ：各０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３つの組み合わせ：各０．３３、０．６６ｎＭ、１．３３ｎＭ）のどちらかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１で刺激した。コラーゲンタイプ１ α１は７２時間後に免疫染色し、ハイコンテント細胞イメージングにより定量し、検出された細胞数で正規化し、ｍｉＲＮＡ候補とコントロール間の倍率変化をここに示した。コラーゲンの減少は筋線維芽細胞特性の消失を示しており、従って抗線維化と考えられる。単独のｍｉＲＮＡ実験についてはドナーｎ＝７、ｍｉＲＮＡ組合せ実験についてはｎ＝４、平均±ＳＤ。２元配置分散分析、ダネットの多重比較。

【図23】肺線維芽細胞（健常者およびＩＰＦ）での異なるコラーゲンの発現に対する単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ２１２－５ｐ、ならびにこれらのｍｉＲＮＡの組合せの効果も示す。ＦＭＴは線維性肺リモデリングの発生において別の重要な開始因子としてみなされる。再発性上皮細胞損傷により、成長因子ＴＧＦβの慢性的分泌があり、正常な常在肺線維芽細胞の筋線維芽細胞への活性化を誘導する。筋線維芽細胞は、多くの細胞外マトリックス構成成分たとえば異なるタイプのコラーゲンを産生するため、線維性疾患において瘢痕過程の主な駆動因子としてみなされる。特にコラーゲン１、３および５は線維化瘢痕マトリックスの構成成分としてみなされる。ＴＧＦβ活性化後の線維芽細胞でのコラーゲンサブユニット（Ｃｏｌ１ａ１、３ａ１および５ａ１）の検出は線維性疾患におけるこの病態生理学的側面の良好な代理としてみなされる。コラーゲンサブユニットの減少は、抗線維化として考慮される。Ａ）Ｃｏｌ１ａ１およびＢ）Ｃｏｌ５ａ１タンパク質の発現、ならびにＣ）Ｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡの発現は、ｍｉＲＮＡコントロールコンストラクト（Ｃｔｒｌ）、表示するｍｉＲＮＡ候補の模倣物２ｎＭ（単独のｍｉＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡの組合せ２ｎＭ＋２ｎＭ、およびｍｉＲＮＡ１．３ｎＭごとの３つの組合せのいずれかで細胞をトランスフェクションして評価した。細胞は５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１で刺激した。７２時間後、コラーゲンタイプ１α１および５α１をウエスタンブロット技術で免疫染色し、デンシトメトリーで定量した。コラーゲンの発現はＧＡＰＤＨ発現で正規化した。Ｃｏｌ３ａ１は２４時間後にＲＴ－ｑＰＣＲで定量した。Ｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡの発現はデルタ／デルタｃＴ法でＨＰＲＴ ｍＲＮＡで正規化した。コラーゲンの減少は線維化の減少を示している。Ａ（ｎ＝５）およびＢ（ｎ＝３）についてはｍｉＲＮＡ候補とコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化、またはＣ（ｎ＝４）についてはｍｉＲＮＡ候補とｍｉＲＮＡコントロール＋ＴＧＦβ１間の倍率変化を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。

【図24】図２３で示した結果の一部を示す。

【図25】２２ｎｔカセットのＡＡＶ－ｍｉＲ－２１２－５ｐの発現後のｍｉＲ－２１２－５ｐの２２ｎｔの肺発現を示す。スタッファー陰性コントロールＡＡＶまたは３つの増加投与量（９ｘ１０⁹ｖｇ、１０ｘ１０¹⁰ｖｇおよび１ｘ１０¹¹ｖｇ）のｍｉＲ－２１２－５ｐ－ＡＡＶ（２２ｎｔ）をマウスに気管内点滴した。マウスはＡＡＶ投与後７、１４、２８日後に安楽死させた。肺は液体窒素で瞬間凍結し、総ＲＮＡ単離のため凍結肺粉末処理した。異なるＡＡＶ投与量間のｍｉＲ－２１２－５ｐ（２２ｎｔ）の倍率変化を、各時間点それぞれのスタッファーコントロールと比較して示す。表示されているのは平均±ＳＤである。スタッファー群ｎ＝６～７、ｍｉＲ－２１２－５ｐ ＡＡＶ群ｎ＝７、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、異なる時点でダネットの多重比較検定。実験は、配列番号９９によるｍｉＲ－２１２－５ｐ、２２ｎｔを発現するための配列番号６１によるコンストラクトに基づいた。対応プラスミドについては、配列番号９１を参照。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明はカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその後者の断片とを含む。本発明はまたカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその後者の断片とを含む。特に好ましい実施態様では、本発明はカプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、ｍｉＲＮＡは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む。従って、本発明は互いに組合せて使用される場合に効果が確認された選択されたｍｉＲＮＡの使用を意味する。ｍｉＲＮＡには、ｍｉｒ－２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ（配列番号９２）と、ｍｉｒ－２１２－５ｐ（配列番号１５）のｍｉＲＮＡまたはｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ（配列番号１７）のｍｉＲＮＡのいずれかとの組合せを含む。また、ここにｍｉｒ－２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡもまた分子の３’末端の末端ヌクレオチドを欠くｍｉｒ－２１２－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡの断片と組み合わせることができることが分かった。これらｍｉｒ－２１２－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡの断片は、それぞれ配列番号９９および配列番号１００としてここに示す。配列番号９９および配列番号１００のＲＮＡ分子は、本発明のコンテクストにおいて自己完結型ｍｉＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｍｉＲＮＡｓ）とみなされる。配列番号１５および１７の真正のｍＲＮＡとそれぞれ比較して配列番号９９および配列番号１００の３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、配列番号９９および配列番号１００によるｍｉＲＮＡの特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。Ｃｈｅｎ，Ｔ．らによって、マウスモデルの肺高血圧症におけるｍｉＲ－２１２－５ｐの増加は、ＲＶＳＰおよび肺血管壁リモデリングを低下しうることが示された（Ｃｈｅｎ，Ｔ．ら、２０１８，Ｃｈｅｎ，Ｔ．ら、２０１９）。珪肺症のコンテクストについては、Ｊｉａｎｇ，Ｒ．ら、２０１９およびＹａｎｇ，Ｘ．ら、２０１８参照。

【0026】

従って、本発明は、カプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、該核酸は、（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡであって、配列番号１５のｍｉＲＮＡもしくは配列番号９９の配列を有するその断片、または配列番号１７のｍｉＲＮＡもしくは配列番号１００の配列を有するその断片を含むｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の双方、を増加させる。１つの実施態様では、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてダウンレギュレートされ、パッケージ化された核酸によって増加するｍｉＲＮＡ（複数可）は、配列番号１９のｍｉＲＮＡをさらに含む。別の実施態様において、パッケージ化された核酸により増加される１つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡを含む。別の実施態様において、パッケージ化された核酸により増加した１つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡとを含む。

【0027】

このコンテクストでの増加は、標的細胞、好ましくは肺細胞のトランスダクションの結果として、トランスダクションされた細胞における各ｍｉＲＮＡのレベルが増加することを意味する。

【0028】

本発明はさらに、カプシドおよびパッケージ化された核酸を含むウイルスベクターに関するものであって、核酸は、（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡであって、配列番号１５のｍｉＲＮＡもしくは配列番号９９の配列を有するその断片、または配列番号１７のｍｉＲＮＡもしくは配列番号１００の配列を有するその断片を含むｍｉＲＮＡ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）両方、を増加させ、かつ核酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、および１６のｍｉＲＮＡ、または部分的な配列が保存されているｍｉＲＮＡの場合にはそれぞれの配列の最も近いヒトホモログからなる群から選択されるｍｉＲＮＡをさらに阻害する。

【0029】

このコンテクストでの阻害は、標的細胞のトランスダクションの結果として、相補的結合によりトランスダクションされた細胞で各ｍｉＲＮＡの機能が低下または消失することを意味する。

【0030】

１つの実施態様では、本発明は、ウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてダウンレギュレートされる１つ以上のｍｉＲＮＡをコードするパッケージ化された核酸を含み：
ａ）１つの好ましい実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９２のｍｉＲＮＡを含む。別の実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、以下を含む。
（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片、または
（ｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片、または
（ｉｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片、または
（ｉｖ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡ、または
（ｖ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡ。

【0031】

ｂ）１つの実施態様では、パッケージ化された核酸によってコードされる１つ以上のｍｉＲＮＡが、以下を含む。
（ｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡ、または
（ｉｉ）配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡ。

【0032】

核酸は通常はコーディングおよび非コーディング領域を含み、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるコード化ｍｉＲＮＡは、ウイルスベクターによってトランスダクションされた標的細胞における転写およびそれに続く成熟過程の結果であると理解される。

【0033】

核酸は通常はコーディングおよび非コーディング領域を含み、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルにおいてアップレギュレートされた１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するコード化ＲＮＡは、ウイルスベクターによってトランスダクションされた標的細胞における転写、および潜在的に、しかし必ずとは限らない、それに続く成熟過程の結果であると理解される。

【0034】

本発明によるウイルスベクターは、肺細胞をトランスダクションする可能性を有するように選択される。肺細胞をトランスダクションするウイルスベクターの非限定的例はレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、およびパラミクソウイルスベクターを含むが、それに限定されるものではない。これらのうち、ＡＡＶベクターは特に好ましく、とりわけＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５またはＡＡＶ－６．２血清型を有するものが好ましい。配列番号２９、３０または３１を含む組み換えカプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターが特に好ましい（ＷＯ２０１５／０１８８６０参照）。１つの実施態様において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ－６．２血清型であり、配列番号８２の配列のカプシドタンパク質を含む。

【0035】

ｍｉＲＮＡをコードしそれによってその機能を増加させる配列と、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする配列は、同じトランスジーンの中にあってもなくてもよい。

【0036】

１つの実施態様では、本発明はウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、以下を含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸を含む：
－２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするトランスジーンであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含むか、あるいは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含むトランスジーン、
－および、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードするトランスジーン。

【0037】

従って、ｍｉＲＮＡをコードし、そのレベルを増加させるトランスジーンと、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードするトランスジーンは異なる発現カセットに含まれる。

【0038】

１つの実施態様では、本発明はウイルスベクターに関するものであって、カプシドと、トランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸を含み、該トランスジーンが
－２つ以上のｍｉＲＮＡであって、配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含むか、あるいは配列番号９２のｍｉＲＮＡと、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、さらに
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする。

【0039】

従って、１つのトランスジーンは、その機能を増加させるｍｉＲＮＡと、１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡの両方をコードする。

【0040】

本発明の別の実施態様において、ウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡが配列番号１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、９２、９９および１００のｍｉＲＮＡ、または部分的な配列が保存されているｍｉＲＮＡの場合にはそれぞれの配列の最も近いヒトホモログからなる群から選択される。この群では、保存されたｍｉＲＮＡすなわち１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、９２、９９、１００またはそれらの最も近いヒトホモログが最も好ましい。それぞれの配列の最も近いヒトホモログを、図５Ｂに示す。

【0041】

本発明のさらなる実施態様において、核酸が偶数個のトランスジーン発現カセット、および、任意にプロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含む（またはからなる）トランスジーン発現カセットを有しており、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、ウイルスベクターが提供される。

【0042】

ウイルスベクターは、１つの実施態様において組換えＡＡＶベクターであり、本発明の他の実施態様においてＡＡＶ－２血清型、ＡＡＶ－５血清型またはＡＡＶ－６．２血清型のいずれかを有する。

【0043】

本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号２９または３０の配列を含む第１タンパク質（ＷＯ２０１５／０１８８６０参照）を含む。
ｉ）本発明のさらなる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２との間のアラインメントに１つあるいはそれ以上のギャップが許容される。
ｉｉ）本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の第２タンパク質に対して８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてカウントされる。
ｉｉｉ）本発明の異なる実施態様では、ウイルスベクターが提供され、該ウイルスベクターでは、カプシドが配列番号８２の第２タンパク質に対して８０％同一、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントにギャップがないことが許容される。

【0044】

実施態様（ｉ）から（ｉｉｉ）の全てに関し、第１タンパク質および比較タンパク質間の同一性の決定については、２つのタンパク質間のアラインメントにおいて一致する対応部分を有しない如何なるアミノ酸もミスマッチとしてみなす（対応部分を有しないオーバーハングを含む）。同一性の決定については、最も高い同一性スコアを与えるアラインメントを使用する。

【0045】

パッケージ化された核酸は１本または２本鎖でもよい。特にＡＡＶベクターの代替は、ベクターゲノムが２本鎖核酸としてパッケージ化されている自己相補的な設計を使用することである。発現開始はより迅速であるが、ベクターのパッケージング能力は約２．３ｋｂに低下する。Ｎａｓｏら、２０１７、文献参照。

【0046】

本発明のもう１つの態様は、肺疾患、好ましくはＩＬＤの治療における使用のための、１つの記載されたウイルスベクターである。本発明により治療され得る疾患は、好ましくはＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ；ｃｈｒｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、およびサルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される。

【0047】

組換えＡＡＶ治療薬の送達戦略は、例えば、Ｎａｓｏら、２０１７でも参照されている。

【0048】

ＡＡＶベクターゲノムを含む２本鎖プラスミドベクターは発明のさらなる実施態様である。

【0049】

本発明のさらなる実施態様は、医薬品として使用するためのこのｍｉＲＮＡ阻害剤に関する。

【0050】

本発明は、また、肺疾患、好ましくはＩＬＤの予防および／または治療のためのｍｉＲＮＡ模倣物の使用を企図する。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物で治療しうる肺疾患は、上記に提示され、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患を含む。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は、典型的にはおよび好ましくは、長さが２１、２２または２３の連続ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列からなる。ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合は「ヌクレオチドのオリゴマー」の長さ、または前記オリゴマーと前記オリゴマーに結合した他のオリゴヌクレオチドを含む２本鎖模倣物の場合「ヌクレオチドのオリゴマー」（すなわちセンス鎖）の長さ）は、一般的におよび好ましくは、それらが模倣する各ｍｉＲＮＡの長さに一致する。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐまたはｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのような２３ｎｔを有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の場合には、ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴマー、または２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）は、２３ｎｔ（好ましい）または３’末端で１つのヌクレオチドが欠失している条件で２２ｎｔのどちらかである。真正のｍＲＮＡ（例えば、配列番号９９および１００参照）と比較して３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、対応するｍｉＲＮＡ模倣物の特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。

【0051】

従って、本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、組合せが（ｉ）配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物とを含む。ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せは、配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８および３９からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号１８および１９からなる群から選択される配列を有するｍｉＲＮＡの１つあるいはそれ以上の模倣物をさらに含んでもよい。１つの実施態様では、ｍｉＲＮＡ模倣物がＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療の方法における使用のために提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２の配列を有し、該方法は配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。別の実施態様では、ｍｉＲＮＡ模倣物は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤおよびＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療の方法における使用のために提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２の配列を有し、該方法は配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。予防および／または治療は、好ましくは配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。

【0052】

同様に、さらに実施態様では、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の予防および／または治療法における使用のためのｍｉＲＮＡ模倣物が提供され、ここで、ｍｉＲＮＡは配列番号９２を有する。該予防および／または治療は、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。さらにより好ましくは、
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む、または
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、または
－該予防および／または治療は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む。

【0053】

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患治療のための、（ｉ）配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物、ならびにこれらのｍｉＲＮＡ模倣物、および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。

【0054】

本発明のさらなる実施態様は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。本発明の他の実施態様は、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物である。好ましくは、組成物中のｍｉＲＮＡ模倣物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入される。ＬＮＰはＬＮＰ平均粒子径が３０および２００ｎｍの間であることが好ましい。医薬組成物はさらに２５～６５ｍｏｌ％のイオン化脂質を含んでもよい。

【0055】

上記実施態様のいずれかにおいて、配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは配列番号９２の配列を有するオリゴマーである（１本鎖－１本鎖模倣物の場合）か、または該オリゴマーを含む（２本鎖模倣物の場合）。同様に、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは、配列番号１５の配列を有するオリゴマーまたは配列番号９９の配列を有するオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、好ましくは、配列番号１７の配列を有するオリゴマーまたは配列番号１００の配列を有するオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。

【0056】

本発明はまた、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療に使用されるｍｉＲＮＡ ｍ２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ模倣物を提供し、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は配列番号９２の群からなる選択された配列からなるヌクレオチドのオリゴマーである（やや好ましい）または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーはそれぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質にコンジュゲートされている、
ここで、前記予防および／または治療は、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。

【0057】

１つの実施態様では、予防および／または治療は、さらに配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む。好ましくは、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５（好ましい）または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー（やや好ましい）であるか、または該オリゴマーを含み、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。

【0058】

他の実施態様では、予防および／または治療は、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与を含む。好ましくは、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１７（好ましい）または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー（やや好ましい）である（やや好ましい）か、または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。

【0059】

ｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されて送達されない場合には、薬物送達を促進するために、前記条件に記載したオリゴマーが脂質とコンジュゲートしていることが望ましい。

【0060】

またさらに他の実施態様では、予防および／または治療は、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物の投与をさらに含む。好ましくは、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーである（やや好ましい）か、または該オリゴマーを含み（好ましい）、以下の条件を有する：
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、
－オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む。

【0061】

さらに本発明の実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療に使用される、ｍｉＲＮＡ ２９ａ－３ｐのｍｉＲＮＡ模倣物（配列番号９２）と、ｍｉＲＮＡ ２１２－５ｐ（配列番号１５）またはｍｉＲＮＡ １８１ａ－５ｐ（配列番号１７）の模倣物との組合せであり、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、それぞれ、配列番号９２、配列番号１５または９９、および配列番号１７または１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであり、それぞれ以下の条件を有する：
－オリゴマーはそれぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む、

【0062】

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患治療に使用される、ｍｉＲＮＡ ２９ａ－３ｐ（配列番号９２）とｍｉＲＮＡ ２１２－５ｐ（配列番号１５または９９）またはｍｉＲＮＡ １８１ａ－５ｐ（配列番号１７または１００）のとの組合せのｍｉＲＮＡ模倣物であり、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９２、配列番号１５または９９、および配列番号１７または１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または該オリゴマーを含む。

【0063】

これらの実施態様はｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ベースナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されて送達される場合が望ましい。ＬＮＰ粒子が送達に使用される場合、投与量は、治療対象の１ｋｇ当たりのｍｉＲＮＡ模倣物の質量が０．０１～５ｍｇ／ｋｇり、好ましくは０．０３～３ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～０．４ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｋｇであり得る。ＬＮＰ粒子の投与は好ましくは全身、より好ましくは静脈内である。

【0064】

２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の場合には、ｍｉＲＮＡ模倣物はｍｉＲＮＡ模倣物のセンス鎖に完全または部分的に相補的な１つあるいはそれ以上のオリゴヌクレオチドに結合したヌクレオチドオリゴマー（センス鎖）を含み、前記ｍｉＲＮＡ模倣物のセンス鎖は、これらの１つ以上のオリゴヌクレオチドと共に１本鎖領域を有するオーバーハング（複数可）を形成してもよい、または形成しなくてもよい。

【0065】

２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物が好ましい。

【0066】

本発明のさらなる実施態様は、上述に定義する医薬組成物に関し、ここで該組成物は吸入組成物である。

【0067】

本発明のさらなる実施態様は、上述に定義する医薬組成物に関し、ここで該組成物は全身投与、好ましくは静脈内投与のためのものである。

【0068】

本発明のさらなる実施態様は、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療または予防方法であって、それを必要とする対象に上記に定義する医薬組成物を投与することを含む方法である。

【0069】

例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡ模倣物の使用は、エアロゾル経路によって肺線維症を患う対象の病的呼吸上皮における線維化を阻害し、従って完全な機能性を回復するように病的組織の完全性を回復するのに有効でありうる。

【0070】

さらに本発明の実施態様を、以下の１～５５に記載する。

【0071】

１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。

【0072】

２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有すその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、
ウイルスベクター。

【0073】

３．前記パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、実施態様１または２に記載のウイルスベクター。

【0074】

４．前記パッケージ化された核酸が、配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードしている、実施態様３に記載のウイルスベクター。

【0075】

５． カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含む１つ以上のトランスジーン発現カセットを含むパッケージ化された核酸とを含む、実施態様１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
－配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、および
－配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。

【0076】

６．カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、
－第１発現カセットが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡと、をコードする第１トランスジーンを含む、および
－第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
実施態様１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。

【0077】

７．前記ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、実施態様５～６の１つに記載のウイルスベクター。

【0078】

８．核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、実施態様５～７の１つに記載のウイルスベクター。

【0079】

９．トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、実施態様５～８のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0080】

１０．ベクターが組換えＡＡＶベクターである、実施態様１～９のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0081】

１１．ベクターがＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、実施態様１～１０のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0082】

１２．カプシドが配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、実施態様１～１１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0083】

１３．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、実施態様１～１２のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0084】

１４．カプシドが配列番号８２の第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、実施態様１～１３のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0085】

１５．ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、実施態様１～１４のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0086】

１６．パッケージ化された核酸が２本鎖である、実施態様１～１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0087】

１７．パッケージ化された核酸が１本鎖である、実施態様１～１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0088】

１８．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0089】

１９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療法であって、前記方法が、それを必要とする患者に実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、治療法。

【0090】

２０．医薬品として使用される、実施態様１～１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0091】

２１．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片を含む、ＡＡＶベクター。

【0092】

２２．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１５のｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するｓｐの断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。

【0093】

２３．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号１５の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号９９の配列を有するその断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードしている、実施態様２１または２２に記載のＡＡＶベクター。

【0094】

２４．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡとをコードしている、実施態様２３に記載のＡＡＶベクター。

【0095】

２５．前記ベクターゲノムが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをさらにコードしている、実施態様２１～２４のいずれかに記載のＡＡＶベクター。

【0096】

２６．実施態様２１～２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。

【0097】

２７．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。

【0098】

２８．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、前記ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号１５または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、あるいは配列番号１５または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物。

【0099】

２９．前記予防および／または治療が配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0100】

３０．配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様２９に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0101】

３１．前記予防および／または治療が、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0102】

３２．配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは任意に配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様３１に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0103】

３３．前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様２８～３２のいずれか１つに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0104】

３４．配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、
実施態様３３に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0105】

３５．線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、実施態様２８から３４のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0106】

３６．ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の使用。

【0107】

３７．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0108】

３８．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0109】

３９．配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0110】

４０．前記組成物のｍｉＲＮＡ模倣物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている、実施態様３７、３８または３９に記載の医薬組成物。

【0111】

４１．前記組成物がイオン化脂質を２５～６５ｍｏｌ％含む、実施態様４０に記載の医薬組成物。

【0112】

４２．前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍの間である、実施態様３７から４１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0113】

４３． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマー、は配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている；
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0114】

４４． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0115】

４５． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１５又は配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１５の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；および
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１７の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
－オリゴマーは、配列番号１９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
－オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有するｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0116】

４６．ｍｉＲＮＡ ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７から４４のいずれかに記載の医薬組成物。

【0117】

４７．ｍｉＲＮＡ １８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７、３９、４０、４１、４５、または４７に記載の医薬組成物。

【0118】

４８．ｍｉＲＮＡ １８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様３７、３９、４０、４１、４５、４６、または４７に記載の医薬組成物。

【0119】

４９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療法であって、前記方法は、それを必要とする患者に、実施態様３７から４９のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、治療法。

【0120】

５０．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、実施態様３７から４９のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【0121】

５１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。

【0122】

５２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡを含む、
実施態様５１に記載のウイルスベクター。

【0123】

５３．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するそのｍｉＲＮＡを含む、ウイルスベクター。

【0124】

５４．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、前記パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、実施態様５３に記載のウイルスベクター。

【0125】

５５．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号１５の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。

【0126】

以下、本発明のさらに特に好ましい実施態様を、実施態様Ａ１～Ａ５７として記載する。

【0127】

Ａ１．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ウイルスベクター。

【0128】

Ａ２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含むウイルスベクターであって、前記パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含む、
ウイルスベクター。

【0129】

Ａ３．パッケージ化された核酸が３つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、ｍｉＲＮＡが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、実施態様Ａ１またはＡ２の１つに記載のウイルスベクター。

【0130】

Ａ４．パッケージ化された核酸が、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ３に記載のウイルスベクター。

【0131】

Ａ５．カプシドと、以下をコードするトランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含む、実施態様１～５のいずれかによるウイルスベクター。
● 配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、及び
● 配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡ。

【0132】

Ａ６．カプシドと、トランスジーンを含むトランスジーン発現カセットを２つ以上含むパッケージ化された核酸とを含み、
● 第１発現カセットが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１９または配列番号１０１の配列を有するその断片、および配列番号１７または配列番号１００の配列を有するその断片からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡとをコードする第１トランスジーンを含み、および
● 第２発現カセットが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードする第２トランスジーンを含む、
実施態様１～５のいずれかによるウイルスベクター。

【0133】

Ａ７．ＲＮＡ阻害がＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない、実施態様Ａ５からＡ６のいずれかの１つに記載のウイルスベクター。

【0134】

Ａ８．核酸が偶数個のトランスジーン発現カセットを有する、実施態様Ａ５～Ａ７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0135】

Ａ９．トランスジーン発現カセットが、プロモーター、トランスジーンおよびポリアデニル化シグナルを含み、プロモーターまたはポリアデニル化シグナルが互いに対向して位置する、実施態様Ａ５～Ａ８のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0136】

Ａ１０．ベクターが組換えＡＡＶベクターである、実施態様Ａ１～Ａ９のいずれか１つによるウイルスベクター。

【0137】

Ａ１１．ベクターがＡＡＶ－２血清型を有する組換えＡＡＶベクターである、実施態様Ａ１～Ａ１０のいずれか１つによるウイルスベクター。

【0138】

Ａ１２．カプシドが配列番号２９または３０の配列を有する第１タンパク質を含む、実施態様Ａ１～Ａ１１のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0139】

Ａ１３．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と８０％同一である第１タンパク質を含むが、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントに１つ以上のギャップが許容される、実施態様Ａ１～Ａ１２のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0140】

Ａ１４．カプシドが配列番号８２の配列を有する第２タンパク質と９５％同一である第１タンパク質を含み、第１タンパク質と第２タンパク質の間のアラインメントのギャップがミスマッチとしてみなされる、実施態様Ａ１～Ａ１３のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0141】

Ａ１５．ベクターがＡＡＶ５またはＡＡＶ６．２血清型を有する組換えＡＡＶベクターであり、組換えＡＡＶ６．２ベクターのカプシドが、好ましくは配列番号８２の配列を有するカプシドタンパク質を含む、実施態様Ａ１～Ａ１４のいずれか１つによるウイルスベクター。

【0142】

Ａ１６．パッケージ化された核酸が２本鎖である、実施態様Ａ１～Ａ１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0143】

Ａ１７．パッケージ化された核酸が１本鎖である、実施態様Ａ１～Ａ１５のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0144】

Ａ１８．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシスおよび線維肉腫からなる群から選択される疾患の予防または治療に使用される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0145】

Ａ１９．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクターの治療的有効量を投与することを含む、方法。

【0146】

Ａ２０．医薬品として使用される、実施態様Ａ１～Ａ１７のいずれか１つに記載のウイルスベクター。

【0147】

Ａ２１．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片を含む、ＡＡＶベクター。

【0148】

Ａ２２．２つ以上のｍｉＲＮＡをコードするベクターゲノムを含むＡＡＶベクターであって、２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、ＡＡＶベクター。

【0149】

Ａ２３．ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を含むｍｉＲＮＡと、（ｉｉ）配列番号１７の配列または配列番号１００の配列を有するその断片と、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を含むｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とをコードしている、実施態様Ａ２１またはＡ２２に記載のＡＡＶベクター。

【0150】

Ａ２４．前記ベクターゲノムが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡと、（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ２３に記載のＡＡＶベクター。

【0151】

Ａ２５．ベクターゲノムが、さらに配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡをコードしている、実施態様Ａ２１～Ａ２４に記載のＡＡＶベクター。

【0152】

Ａ２６．実施態様Ａ２１～Ａ２５のいずれかのＡＡＶベクターを含む、２本鎖プラスミドベクター。

【0153】

Ａ２７．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、前記組合せが、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物とを含む、ｍｉＲＮＡ模倣物の組合せ。

【0154】

Ａ２８．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物。

【0155】

Ａ２９．予防および／または治療が、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、実施態様Ａ２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0156】

Ａ３０．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有し、
前記予防および／または治療が、さらに配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、ｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物。

【0157】

Ａ３１．配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１７または１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１７または１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ２９またはＡ３０に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0158】

Ａ３２．前記予防および／または治療が、さらに配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与を含む、実施態様Ａ２８に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0159】

Ａ３３．配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１９または１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ３２に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0160】

Ａ３４．前記予防および／または治療が、配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物の投与をさらに含む、実施態様Ａ２８～Ａ３３のいずれか１つに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0161】

Ａ３５．配列番号１８の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物が、配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１８の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
● オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
● オリゴマーは、配列番号１８の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；、
● オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、実施態様Ａ３４に記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0162】

Ａ３６．線維増殖性疾患がＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤである、実施態様Ａ２８からＡ３５のいずれかに記載の方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物。

【0163】

Ａ３７．ＩＰＦまたはＰＦ－ＩＬＤまたはＩＬＤのような線維増殖性疾患の治療薬の製造のための、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、（ｉｉ）配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物および／または配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物との使用。

【0164】

Ａ３８．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0165】

Ａ３９．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0166】

Ａ４０．配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片のｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１７の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを含む、医薬組成物。

【0167】

Ａ４１．前記組成物のｍｉＲＮＡ模倣物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている、実施態様Ａ３８、Ａ３９またはＡ４０に記載の医薬組成物。

【0168】

Ａ４２．前記組成物がイオン化脂質を２５～６５ｍｏｌ％含む、実施態様Ａ４１に記載の医薬組成物。

【0169】

Ａ４３．前記ＬＮＰの平均粒子径が３０～２００ｎｍである、実施態様Ａ３８からＡ４２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0170】

Ａ４４． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0171】

Ａ４５． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0172】

Ａ４６． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（C）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物と、
（ｃ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、
を含む医薬組成物。

【0173】

Ａ４７．ｍｉＲＮＡ ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３８からＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0174】

Ａ４８．ｍｉＲＮＡ １８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３８、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４２、Ａ４４、またはＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0175】

Ａ４９．ｍｉＲＮＡ １８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物が２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物である、実施態様Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４２、Ａ４５、またはＡ４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0176】

Ａ５０．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療方法であって、前記方法は、それを必要とする患者に実施態様Ａ３８からＡ４９またはＡ５７のいずれかに記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、方法。

【0177】

Ａ５１．ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤ、ＩＰＦ、結合組織病（ＣＴＤ）関連ＩＬＤ、関節リウマチＩＬＤ、慢性線維化を伴う過敏性肺炎（ＨＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ｉＮＳＩＰ）、分類不能型特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、環境性／職業性肺疾患、肺高血圧症（ＰＨ）、線維化珪肺症、全身性強皮症ＩＬＤ、サルコイドーシス、および線維肉腫からなる群から選択される疾患の治療薬の製造のための、実施態様Ａ３８からＡ５０のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。

【0178】

Ａ５２．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片を含むウイルスベクター。

【0179】

Ａ５３．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、
（ｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片とを含むか、または
（ｉｉ）２つ以上のｍｉＲＮＡが、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片と、配列番号１８のｍｉＲＮＡとを含む、
実施態様Ａ５２に記載のウイルスベクター。

【0180】

Ａ５４．カプシドと、パッケージ化された核酸とを含み、パッケージ化された核酸が１つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、前記１つ以上のｍｉＲＮＡが配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片を含む、ウイルスベクター。

【0181】

Ａ５５．カプシドと、パッケージ化された核酸を含み、パッケージ化された核酸は２つ以上のｍｉＲＮＡをコードしており、２つ以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１９のｍｉＲＮＡまたは配列番号１０１の配列を有するその断片と、配列番号１７のｍｉＲＮＡまたは配列番号１００の配列を有するその断片とを含む、実施態様Ａ５４に記載のウイルスベクター。

【0182】

Ａ５６．線維増殖性疾患の予防および／または治療方法に使用されるｍｉＲＮＡ模倣物の組合せであって、該組合せは、（ｉ）配列番号９９の配列を有するｍｉＲＮＡ断片の模倣物、および／または（ｉｉ）配列番号１７の配列を有すｍｉＲＮＡの模倣物および／または（ｉｉｉ）配列番号１９の配列を有するｍｉＲＮＡの模倣物を含む、組合せ。

【0183】

Ａ５７． （ａ）ｍｉＲＮＡ２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号９９の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号９９の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；または
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｂ）ｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１７または配列番号１００の配列からなるヌクレオチドのオリゴマー含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１７または配列番号１００の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
または
（ｃ）ｍｉＲＮＡ１８１ｂ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物であって、該ｍｉＲＮＡ模倣物が、配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーであるか、または配列番号１９または配列番号１０１の配列からなるヌクレオチドのオリゴマーを含み、以下の条件：
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
●前記オリゴマーは配列番号１９または配列番号１０１の配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログを任意に含む；
●前記オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている、
を有する、ｍｉＲＮＡ模倣物、
および
（ｄ）薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤
を含む、医薬組成物。

【0184】

前記ウイルスベクターは、好ましくは１．０ｘ１０¹⁰～１．０ｘ１０¹⁴ｖｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりのウイルスゲノム）の範囲のウイルス用量に相当する量として投与されるのが、１．０ｘ１０¹¹～１．０ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲がより好ましく、５．０ｘ１０¹¹～５．０ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇの範囲はさらに好ましく、および１．０ｘ１０¹²～５．０ｘ１０¹¹の範囲がよりさらに好ましい。約２．５ｘ１０¹²ｖｇ／ｋｇのウイルス用量が最も好ましい。投与されるウイルスベクター、例えば本発明によるＡＡＶベクターの量は、例えば、１つ以上のトランスジーンの発現の強さにより調節することができる。

【0185】

本発明のさらなる態様は、ニンテダニブまたはピルフェニドンとの併用療法のための、本発明によるウイルスベクター、ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｍｉＲＮＡ模倣物の使用である。

【0186】

使用される用語および定義

【0187】

発現カセットは、トランスジーンと、通常はプロモーターと、ポリアデニル化シグナルとを含む。プロモーターはトランスジーンに動作可能に連結されている。適するプロモーターは、肺胞上皮細胞のような肺細胞で選択的にまたは恒常的に活性化され得る。適当なプロモーターの非限定的な具体例には、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ヒト伸長因子ｌａプロモーターおよびヒトユビキチンｃプロモーターのような恒常的活性化プロモーターが含まれる。肺特異的プロモーターの非限定的な具体例には、サーファクタントタンパク質Ｃ遺伝子プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｂプロモーター、およびクララ細胞１０ｋＤ（「ＣＣ１０」）プロモーターが含まれる。

【0188】

トランスジーンは、本発明の実施態様によっては、（ｉ）１つ以上のｍｉＲＮＡ、例えば配列番号９２の配列を有するｍｉＲＮＡ、またはブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでダウンレギュレートされる１つ以上のｍｉＲＮＡ、または（ｉｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルまたはＡＡＶ－ＴＧＦβ１誘導性肺線維症モデルでアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの１つ以上の機能を阻害するＲＮＡ、または（ｉ）および（ｉｉ）の選択肢をコードする。トランスジーンは、トランスダクションレポートのための（ｅＧＦＰなど、図１１参照）または治療目的のためのタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含んでもよい。

【0189】

１つ以上のｍｉＲＮＡの機能を阻害するＲＮＡは、相補的結合によりその標的ｍｉＲＮＡの機能を低下または消失させる。図８Ｂおよび図８Ｃに記載されているように、２つの異なるベクターデザイン戦略が適用されうる。
１）線維化促進性ｍｉＲＮＡに対して特異的に結合し、それによってそれらの機能を阻害するように設計されたアンチセンス様分子の発現（図８Ｂ）。アンチ－ｍｉＲと呼ばれる各分子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工ｍｉＲＮＡとして発現ベクターに組み込むことができる。ｍｉＲＮＡ補充アプローチと同様に、いくつかのｍｉＲＮＡ標的配列を単一ベクターに組み込んで、それによって様々な標的ｍｉＲＮＡの阻害を可能にする。
２）線維化促進性ｍｉＲＮＡを選択的に隔離し、それによってそれらの機能を阻害することを目的とした、ｍｉＲＮＡ結合部位、いわゆるスポンジのいくつかのコピーを含むｍＲＮＡの発現（図８Ｃ）。この選択肢については、ＲＮＡ阻害はＲＮＡｉプロセシングまたはＲＮＡｉ成熟を受けない。

【0190】

本発明によるｍｉＲＮＡ阻害剤という用語は、７から少なくとも２２ヌクレオチド長の連続した配列からなるオリゴマーを指す。

【0191】

ここで使用されるヌクレオチドという用語は、糖部分（通常リボースまたはデオキシリボース）、塩基部分、およびホスフェートまたはホスホロチオエートのヌクレオチド間結合基のような共有結合基（結合基）を含むグリコシドを意味する。天然ヌクレオチドと、ここではヌクレオチドアナログとして呼ばれる修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を含む。非天然ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、または２’修飾ヌクレオチド、または２’置換ヌクレオチドなどの２’修飾ヌクレオチドのような糖部分を有するヌクレオチドが含まれる。

【0192】

非天然ヌクレオチドにつながる化学修飾を有するヌクレオチドは次の修飾を含む
（ｉ）非天然糖部分を有するヌクレオチド、
例には、二環式ヌクレオチド、または２’修飾ヌクレオチド、または２’置換ヌクレオチドのような２’修飾ヌクレオチドがある。

【0193】

（ｉｉ）ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジチオアート（ＰＳ２）修飾を有するヌクレオチド
ｍｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性の向上ならびに血清安定性の改善および血中濃度を増加のために、ｍｉＲＮＡ阻害剤または模倣物の１つ以上のヌクレオチドにおいて、ホスホロチオエート（ＰＳ）として定義される、硫黄をヌクレオチドホスフェート基の酸素と交換できる。いくつかの配列については、これはホスホロジチオアートＰＳ２として定義される、既存ＰＳへの硫黄基の第２の導入によって、組み合わせたり相補することができる。ヌクレオチド１９＋２０または３＋１２（５’末端から数えて）でのようなセンス鎖の異なる位置でのＰＳ２修飾は、さらに血清安定性を増加させ、従ってｍｉＲＮＡ阻害剤／ｍｉＲＮＡ模倣物の薬物動態学的特性を向上させうる（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２、７、１２１４－１２２０）。

【0194】

（ｉｉｉ）ボラノホスフェート修飾を有するヌクレオチド
いくつかのｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでは、リボースリン酸基の１つの酸素のＢＨ３基への交換は有益でありうる。ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのシード領域が他の化学修飾によって修飾されない場合、１つ以上のヌクレオチドにおけるボラノホスフェート修飾は血清安定性を向上させうる。ボラノホスフェート修飾はｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの血清安定性も増加させ得る（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．２０、５９９１－６０００）。

【0195】

（ｉｖ）２’Ｏ－メチル修飾を有するヌクレオチド
リン酸修飾以外またはリン酸修飾に加えて、リボース環の炭素Ｃ２に結合している酸素のメチル化は、オリゴヌクレオチド修飾のさらなる選択肢になりうる。センス鎖の２’Ｏ－メチルリボース修飾は熱安定性および酵素消化耐性を向上させうる。

【0196】

（ｖ）２’ＯＨでのフッ素修飾を有するヌクレオチド
オリゴヌクレオチドの血清安定性の増強およびｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのその標的に対する結合親和性を向上させるために、ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを２’ＯＨフッ素修飾することも有益でありうる。２’ＯＨフッ素修飾は、リボース環の炭素Ｃ２の水酸基をフッ素原子に交換する。フッ素修飾はセンスおよびアンチセンスの両鎖に適用できる。

【0197】

「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部分での修飾による天然オリゴヌクレオチドの変異体である。好ましくは、この説明に制限されないが、アナログはオリゴマーがその標的に結合するように働く方法に機能的効果を有する；例えば、標的に対する結合親和性の増強、および／またはヌクレアーゼに対する耐性の増強、および／または細胞への輸送の簡易性の強化による。ヌクレオシドアナログの具体的な例は、ＦｒｅｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ，２５：４４２９－４４４３，１９９７）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：２９３－２１３，２０００）によって記載されている。

【0198】

ロック核酸（ＬＮＡ（登録商標））を含む、オリゴマーにおける親和性増強アナログの取込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低下を可能にし、非特異的または異常な結合が生じる前のオリゴマーのサイズの上限も低下できる。「ＬＮＡ（登録商標）」という用語は、「ロック核酸」として知られる二環式ヌクレオシドアナログを指す（Ｒａｊｗａｎｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３９（９）１６５６－１６５９，２０００）。これは、ＬＮＡ（登録商標）モノマー、または「ＬＮＡ（登録商標）オリゴヌクレオチド」の文脈において使用される場合は１つ以上のそのような二環性アナログを含むオリゴヌクレオチドを指すことがある。

【0199】

好ましくは、本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、３４、３５および３６のｍｉＲＮＡからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ）に対して相補的な配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、最大７０％アナログ（ＬＮＡ（登録商標））で合計７から少なくとも２２の連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成され得る。最も短いオリゴマー（７ヌクレオチド）は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡの成熟体（mature to Certain up regulated miRNA）の５’末端に位置する最初の７ヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ標的特異性に関わる５’末端から２～８の位置の７ヌクレオチド配列（「シード」配列と呼ばれる）を含む）と完全な配列相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに相当するであろう（Ｌｅｗｉｓら、Ｃｅｌｌ．２００５年１月１４日；１２０（１）：１５－２０）。

【0200】

特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ標的部位ブロッカーは、特定のｍＲＮＡに位置する特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ結合部位に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、ＵＳ２００９０１３７５０４の教示に従って設計されてもよい。これらのオリゴマーは、合計８～２３の連続ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成され得る。これらの配列は、特定のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ「シード」配列の逆相補体に対応する配列から５’または３’方向に２０ヌクレオチドにわたりうる。

【0201】

発明のｍｉＲＮＡ模倣物という用語は、特定のｍｉＲＮＡの活性を特異的に増加できる１本鎖または２本鎖のヌクレオチドのオリゴマーであって、特定のｍｉＲＮＡという語は、配列番号１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３７、３８、３９および９２からなる群から選択される配列、好ましくは９２、１５、１７、１９、１８および２０、最も好ましくは１５、１７および１９、またさらに好ましくは配列番号１５を有するｍｉＲＮＡを意味する。ｍｉＲＮＡ模倣物という用語は、薬学的に許容される塩を含む。ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物は、細胞の前記ｍｉＲＮＡの機能的同等物の濃度を高め、それによって前記ｍｉＲＮＡの全体的な活性を増加させる。

【0202】

本発明のこれらのｍｉＲＮＡ模倣物は、典型的および好ましくは、２１、２２または２３の連続ヌクレオチド長の連続したヌクレオチド配列からなる。ｍｉＲＮＡ模倣物（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴヌクレオチド、または２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）の長さは、典型的にはそれらが模倣する各ｍｉＲＮＡの長さに一致する（好ましい）。

【0203】

ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐまたはｍｉＲＮＡ－２１２－５ｐのような２３ｎｔを有するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ模倣物の場合、ｍｉＲＮＡ模倣物の長さ（すなわち１本鎖模倣物の場合はオリゴマーまたは２本鎖模倣物の場合はセンス鎖）は、２３ｎｔ（好ましい）、または３’末端で１つのヌクレオチドが欠失している条件で２２ｎｔのどちらかである。真正のｍＲＮＡ（たとえば配列番号１００、９９参照）に比較して３’末端での欠失は、ｍｉＲＮＡのシード領域および１３～１６のヌクレオチド領域から離れているため、対応するｍｉＲＮＡ模倣物の特異性は許容される（Ｇｒｉｍｓｏｎら、２００７）。

【0204】

ｍｉＲＮＡ ２９ａ－３ｐ、２１２－５ｐ、ｍｉＲＮＡ １８１ａ－５ｐ、ｍｉＲＮＡ １８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲＮＡ １０ａ－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物は、それぞれ、ＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦのような線維増殖性疾患の治療での使用を目的としており、ここで、ｍｉＲＮＡ模倣物は、配列番号９２、配列番号１５または９９、配列番号１７または１００、配列番号１８、および配列番号１９の配列からなるヌクレオチドオリゴマーであるか、または該ヌクレオチドオリゴマーを含み、それぞれ条件（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、または（ｂ）および（ｃ）を有する。
（ａ）オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示す非天然型ヌクレオチドとなる化学修飾、好ましくは上記の（ｉ）から（ｖ）に示すような化学修飾を有するヌクレオチドを任意に含む；
（ｂ）オリゴマーは、それぞれのｍｉＲＮＡの配列で決定される対応位置（ＡＵおよびＧＣ）で塩基対形成挙動を示すヌクレオチドアナログ、好ましくはＦｒｅｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２５：４４２９－４４４３、１９９７）およびＵｈｌｍａｎｎ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３：２９３－２１３、２０００）によって記載されたヌクレオチドアナログまたは上記に記載された二環式アナログを任意に含む；
（ｃ）オリゴマーは、薬物送達を促進するために任意に脂質とコンジュゲートされている。

【0205】

脂質コンジュゲートオリゴマーは当該分野でよく知られており、Ｏｓｂｏｒｎｅら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ Ｖｏｌｕｍｅ ２８，Ｎｕｍｂｅｒ ３，２０１８参照。

【0206】

配列番号ｘの配列からなるオリゴマーは、オリゴマーが配列番号ｘの配列を含み、配列番号ｘに示されるのと同数の共有結合したヌクレオチド構成単位（任意に化学修飾を持つ）またはヌクレオチドアナログを有することを意味する。

【0207】

ｍｉＲＮＡ模倣物は１本鎖模倣物または２本鎖模倣物でもよい。１本鎖模倣物は、それに結合する他のオリゴヌクレオチド分子を持たず、完全または部分的な塩基対形成を有するオリゴヌクレオチドである。２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＮＡ模倣物と完全または部分的に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドと結合しているものと定義され、１本鎖領域を持つオリゴヌクレオチドオーバーハングを形成していてもまたはしていなくてもよい。項目１．１１に言及される３つのＲＮＡ鎖デザインは、２本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の例である。さらに例はＶｉｎｎｉｋｏｖら、（２０１４）、ｐ．１０６６１、最終段落、第１行に開示されている。

【0208】

ｍｉＲＮＡ模倣物は、項目１．１１に記載の通り１つ以上の実験で決定された同量の天然ｍｉＲＮＡの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％以上の生物学的効果を有することが好ましい。

【0209】

ｍｉＲＮＡ模倣物またはｍｉＲＮＡ阻害剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入され、天然または非天然のヌクレオチドとして送達することもできる。カーゴ分子としてのＲＮＡについては、最も効果的なＬＮＰはｐＫａ値が一般的にｐＨ７未満のイオン化脂質含み、最大４つの構成成分、すなわちイオン化脂質、構造脂質、コレステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質から構成される。

【0210】

イオン化脂質には、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレオイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎＭＣ３－ＤＭＡ）（Ｎａｓｅｒｉ Ｎ，Ｖａｌｉｚａｄｅｈ Ｈ，Ｚａｋｅｒｉ－Ｍｉｌａｎｉ Ｐ．Ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２０１５；５（３）：３０５－３１３）、ＡＴＸ－脂質（Ｒａｍａｓｗａｍｙ Ｓ，Ｔｏｎｎｕ Ｎ，Ｔａｃｈｉｋａｗａ Ｋ，ら、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１７；１１４（１０）：Ｅ１９４１－５０．）、またはＹＳＫ１２－Ｃ４－脂質（Ｓａｔｏ Ｙ，Ｈａｓｈｉｂａ Ｋ，Ｓａｓａｋｉ Ｋ，ら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１９；２９５：１４０－１５２．）が含まれるが、これらに限定されない。

【0211】

構造脂質には、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）などが含まれるが、これらに限定されない。コレステロールには、コレステロール、および３－（Ｎ－（Ｎ０，Ｎ０－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール、ステロール、ステロイドなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0212】

ＰＥＧ－脂質には、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＭＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＰＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＯＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀）、ならびにそれらのＰＥＧ長さが変化した、たとえばＰＥＧ₅₀₀、ＰＥＧ₁₀₀₀、ＰＥＧ₅₀₀₀などのＰＥＧ－脂質が含まれるが、これらに限定されない。

【0213】

ＬＮＰ製剤には、単一ＬＮＰ成分の異なる割合、異なる粒子サイズ、および正帯電ポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基と負帯電核酸ホスフェート（Ｐ）基の異なる比率（Ｎ／Ｐ比）を含むことができる。好ましい製剤は、２５～６５ｍｏｌ％のイオン化脂質、好ましくは４０ｍｏｌ％、５～３０ｍｏｌ％の構造脂質、好ましくは１５ｍｏｌ％、１５～５０ｍｏｌ％のコレステロール、好ましくは４０ｍｏｌ％および１～５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質、好ましくは２ｍｏｌ％で構成または含まれる。ＬＮＰ平均粒子径は３０～２００ｎｍ、Ｎ／Ｐ比は２～４の間で変更可能であるが、最も好ましいナノ粒子径は１００ｎｍ、Ｎ／Ｐ比は３である。

【0214】

最も好ましいＬＮＰ製剤は次の組成を有する：ＤＬｉｎＭＣ３－ＤＭＡまたはＡＴＸ脂質、またはＹＳＫ１２－Ｃ４－脂質からなるイオン化脂質４０ｍｏｌ％、ＤＳＰＣ１５ｍｏｌ％、コレステロール４０ｍｏｌ％、粒子径が１００ｎｍでＮ／Ｐ比が３のＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ₂₀₀₀ ２ｍｏｌ％。

【0215】

ｍｉＲＮＡ模倣物のＬＮＰ送達に最も好ましいｍｉＲＮＡ様式は、アンチセンス鎖に相補的なパッセンジャーセンス鎖を含む。パッセンジャー鎖は、アンチセンス鎖をエンドヌクレアーゼから保護する。Ｖｉｎｎｉｋｏｖらにより記述されているように、両鎖はＬＮＡ修飾を持つ２つのヌクレオチドからなるＬＮＡ修飾オーバーハングを３’側に有する（Ｖｉｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ，２０１４）。ＬＮＡはロック核酸を意味し、リボフラノース環の２－酸素と４－炭素の間にメチレン架橋を含む２つの糖部分、３’側における２つのヌクレオチドのＬＮＡ修飾オーバーハングによって定義される。また、センス鎖の５’側の最初のヌクレオチドも、ＬＮＡ修飾されており、ＲＩＳＣ複合体における鎖識別を容易にしている。ＬＮＡ部分は、ヌクレアーゼに対する並外れた耐性および非常に低い細胞毒性を持ちながらモノマーの柔軟性を制限し、それを硬い二環式Ｎ型コンフォメーションの中にロックする。さらに、これらの最小限の修飾は、インビトロおよびインビボの両適用おいて、安定性と機能性の間の妥協点を提供する（Ｅｌｍｅ’ｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｉｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌの引用のようにＭｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＬＮＡ修飾は、相補的配列とのハイブリダイゼーションにおける融解温度（Ｔｍ値）を高くする。各ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、形成されたヌクレオチドペアのＴｍを最大８℃まで上昇させることができる（ＤＯＩ：１０．１００７／３－５４０－２７２６２－３＿２１）。センスおよびアンチセンス鎖の長さは、通常２０～２２、２０～２３、２０～２４または２０～２５ヌクレオチドからなる。

【0216】

別の選択肢は、項目１．１１（細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能的特性解析）で記載した３つのＲＮＡ鎖デザインで、マイクロＲＮＡ模倣物をデザインすることである。

【0217】

ＬＮＰ粒子を送達に使用する場合、投与量は、治療対象の１ｋｇ当たりのｍｉＲＮＡ模倣物量が、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０３～３ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～０．４ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３ｍｇ／ｋｇであり得る。ＬＮＰ粒子の投与は好ましくは全身、より好ましくは静脈内である。

【実施例】

【0218】

１．方法および材料
１．１ ＡＡＶ産生、精製および定量
ＨＥＫ－２９３ｈ細胞を、１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地で培養した。トランスフェクションの３日前に、細胞を１５ｃｍの組織培養プレートに播種し、トランスフェクションの日に７０～８０％のコンフルエントに達するようにした。トランスフェクションのために、培養面積１ｃｍ²当たり合計０．５μｇの全ＤＮＡを、培養液の１／１０の容量の３００ｍＭ ＣａＣｌ₂およびＡＡＶ産生に必要な全プラスミドと等モル比で混合した。プラスミドコンストラクトは次の通りであった：ＡＡＶ６．２ ｃａｐ遺伝子をコードする１つのプラスミド（Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、コドン使用頻度を最適化したマウスＴｇｆｂ１遺伝子およびｈＧｈポリＡシグナルを発現させるＣＭＶプロモーターを含むＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接発現カセットを内部に持つプラスミドであってＴｇｆｂ１配列は活性タンパク質の断片を増加させるＣ２２３ＳおよびＣ２２５Ｓ変異を含む（Ｂｒｕｎｎｅｒ ＡＭら、１９８９）；ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（ＡＡＶ Ｈｅｌｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）。ＧＦＰおよびスタッファーコントロールベクターの作製のために、Ｔｇｆｂ１プラスミドを、ＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＳＶ４０ｐＡカセットを内部に持つｅＧＦＰプラスミド、およびＥ６－ＡＰユビキチンタンパク質リガーゼＵＢＥ３Ａの３’－ＵＴＲに由来するＡＡＶ２ ＩＴＲ隣接非コーディング領域の後にＳＶ４０ポリＡシグナルを含むＡＡＶ－スタッファーコントロールプラスミドにそれぞれ交換した。

【0219】

次に、プラスミドＣａＣｌ₂ミックスを、等容量の２ｘＨＢＳ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄）に滴下し、室温で２分間インキュベートして、細胞に添加した。５～６時間のインキュベーション後、培養液を新しい培地と交換した。トランスフェクションされた細胞は３７℃で合計７２時間増殖させた。細胞は最終濃度６．２５ｍＭのＥＤＴＡを加えて剥離し、室温で１０００ｘｇ、１０分間の遠心分離でペレット化した。細胞はその後、「溶解バッファー」（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．５）に再懸濁した。ＡＡＶベクターは基本的に以前記載したように精製した（Ｓｔｒｏｂｅｌ Ｂ ｅｔ ａｌ．２０１５）：イオジキサノール勾配に基づく精製では、最大４０プレートから採取した細胞を溶解バッファー８ｍＬに溶解した。その後、液体窒素および３７℃の水浴を使った３回の凍結／溶解サイクルにより細胞を溶解した。最初にトランスフェクションした各プレートに対して、１００単位ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を混合液に加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞の残骸を２５００ｘｇ、１５分間で沈殿させた後、上清を３９ｍＬ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｑｕｉｃｋ Ｓｅａｌチューブに移し、ＰＢＳ－ＭＫ（１ｘＰＢＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２．５ｍＭ ＫＣｌ）で希釈した５％ヨウジキサノール溶液８ｍＬ、２５％ヨウジキサノール溶液６ｍＬ、４０％ヨウジキサノール溶液８ｍＬ、５８％ヨウジキサノール溶液５ｍＬを細胞溶解液の下に層化することによって、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）段階勾配を調製した。ＮａＣｌは前もって最終濃度１Ｍで１５％相に加えておいた。
勾配内の相の境界を区別しやすくするために、１５％および２５ ％イオジキサノール溶液に０．５％フェノールレッドを１ｍＬ当たりに１．５μＬ加え、５８％相には０．５μＬ加えた。７０Ｔｉローターで１８℃、６３０００ｒｐｍ、２時間遠心分離の後、チューブの底に穴を開けた。最初の５ミリリットル（５８ ％相に対応）を捨て、ＡＡＶベクター粒子が含まれる次の３．５ｍＬを回収した。ＡＡＶ画分に全量１５ｍＬになるようＰＢＳを加え、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心式フィルタユニットを使用して限外濾過／濃縮を行った。約１ｍＬに濃縮した後、保持液を１５ｍＬまで満たし、再び濃縮した。この過程を合計３回繰り返した。グリセロールを最終濃度１０％で調製物に加えた。Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＣＬ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅｓを使用した濾過滅菌の後、ＡＡＶ産物を分注し、－８０℃で保存した。

【0220】

１．２ マウスモデルおよび機能的読出し
レポーター遺伝子研究のために、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した９～１２週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６またはＢａｌｂ／ｃマウスに２．９ｘ１０¹⁰ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ５－ＣＭＶ－ｆＬｕｃまたは３ｘ１０¹¹ｖｇのＡＡＶ６．２－ＣＭＶ－ＧＦＰのいずれかをそれぞれ浅麻酔（３～４％イソフルラン）下で気管内投与した。あるいは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに３ｘ１０¹¹ｖｇのＡＡＶ２－Ｌ１－ＣＭＶ－ＧＦＰを静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＡＡＶ投与後２～３週間に（図の説明参照）、レポーターの読出しを行った。ルシフェラーゼ・イメージングのために、画像取得前に基質としてルシフェリン３０ｍｇ／ｋｇをマウスの腹腔内に投与した。ＧＦＰレポーターの場合、組織学的な新鮮凍結切片を準備しＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡で直接分析するか、またはＧＦＰ ＩＨＣ分析のためにホルマリン固定パラフィン包埋切片を準備した（さらに以下の詳細な記載参照）。

【0221】

線維症モデルについては、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した９～１２週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２．５ｘ１０¹¹（ｖｇ）のＡＡＶ－ＴＧＦβ１またはＡＡＶ－スタッファー、ブレオマイシン１ｍｇ／ｋｇまたは生理食塩水５０μＬのどちらかを浅麻酔の下で気管内投与した。ＡＡＶ／ブレオマイシン投与後３、７、１４、２１および２８日に線維症を評価した。簡単に説明すると、肺機能を評価するために、ペントバルビタール／キシラジン塩酸塩の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与でマウスを麻酔し、気管内にカニューレ処置をして、パンクロニウムブロマイドの静脈内（ｉ．ｖ．）投与で処置した。その後、肺機能測定（すなわち肺コンプライアンス、努力性肺活量（ＦＶＣ））をＳｃｉｒｅｑ ｆｌｅｘｉＶｅｎｔ ＦＸ ｓｙｓｔｅｍを使って行った。その後、マウスをペントバルビタールの過剰投与で安楽死させ、肺を解剖し、重さを測定した後に、７００μＬ ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＡＬ免疫細胞およびタンパク質の層別解析用のＢＡＬ液を得た（データ未発表）。各マウスの左肺は組織病理学者による組織学的評価のために処置され、一方、右肺は以下に述べるように総ＲＮＡ抽出に使用した。

【0222】

ｍｉＲ－２１２－５ｐ ＡＡＶ薬物動態研究については、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓの１０～１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊを利用した。イソフルランの短時間暴露での浅麻酔の下、マウスにスタッファー陰性コントロールＡＡＶ（１ｘ１０¹¹ｖｇ）またはｍｉＲ－２１２－５ｐ－ＡＡＶの３つの増加投与量（９ｘ１０⁹ｖｇ、１０ｘ１０¹⁰ｖｇおよび１ｘ１０¹¹ｖｇ）を気管内（ｉ．ｔ．）注入した。マウスはＡＡＶ投与後７、１４、２８日後に安楽死させた。肺は液体窒素で瞬間凍結し、総ＲＮＡ単離のために凍結肺粉末に処理された（ＱｉａｇｅｎのｍｉＲＮＡｅａｓｙキットを利用）。

【0223】

１．３ 組織学
組織学的肺サンプルの準備のために、左肺葉を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で満たした分液漏斗に固定し、水深２０ｃｍの水圧で２０分間膨張させた。満たされた肺はその後、気管結紮により塞ぎ、少なくとも２４時間４％ＰＦＡに浸した。それに続いて、ＰＦＡ固定した肺はパラフィンに包埋した。ミクロトームを使用して、３μｍの肺切片を作製し、乾燥させ、キシレンを用いて脱パラフィンし、エタノール低下系列（１００～７０％）で再水和した。マッソントリクローム染色は、確立されたプロトコルに従って、Ｇｅｍｉｎｉ ＥＳ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｌｉｄｅ Ｓｔａｉｎｅｒを用いて行った。ＧＦＰ－ＩＨＣについては、酵素的抗原回収を行い、抗体は示した比率でＢｏｎｄ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に希釈した。スライドは１：１０００希釈のＡｂｃａｍウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体ａｂ２９０および適当なアイソタイプコントロール抗体でそれぞれ染色した。抗原回収のみが行われたスライドは追加の陰性コントロールとして使用した。最後に、切片はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｑｕａｔｅｘ ｍｅｄｉｕｍでマウントした。

【0224】

１．４ ＲＮＡ調製
全肺ＲＮＡの調製のために、右肺を解剖後直ちに液体窒素で瞬間凍結した。凍結肺は、Ｐｅｑｌａｂ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４デュアルホモジナイザーおよび７ ｍＬ－セラミック・ビーズ・チューブを使用して、予冷Ｑｉａｇｅｎ ＲＬＴバッファー＋１％β－メルカプトエタノール２ｍＬ中でホモジナイズした。ホモジネート１５０μＬを、その後、５５０μＬのＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。１４０μＬのクロロホルムを加えた後、混合液を１５秒間激しく振とうし、４℃、１２，０００ｘｇで５分間遠心した。３５０μＬの上層のＲＮＡ含有水相を、その後、さらにＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔを使用してメーカーの説明に従い精製した。精製後、ＲＮＡ濃度はＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマルチモードマイクロプレートリーダーおよびＴａｋｅ３モジュール（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。ＲＮＡの品質はＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使って評価した。

【0225】

１．５ ＲＮＡシーケンス
ｃＤＮＡライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して調製した。簡単に説明すると、２００ｎｇの総ＲＮＡをオリゴｄＴ結合磁性ビーズを使用したポリＡ濃縮に供した。ポリＡを含むｍＲＮＡを約１５０～１６０ｂｐの断片に断片化した。ランダムプライマーでの逆転写の後、第２のｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼＩで合成した。末端修復プロセスとアデニン１塩基付加の後、各ｃＤＮＡにホスホ－チミジン－結合インデックスアダプタを結合して、シーケンスフローセルへのサンプルの結合を容易にし、さらにマルチプレックスシーケンシング後のサンプル同定を可能にした。
精製およびｃＤＮＡのＰＣＲエンリッチメントの後、ライブラリを２ｎＭに希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＳＲ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｋｉｔ ｖ３－ｃＢｏｔ－ＨＳおよびｃＢｏｔ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して９．６ｐＭでフローセルにクラスター化した。５２ｂｐシングルリード７塩基インデックスリードのシーケンスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ Ｋｉｔ ｖ３－ＨＳを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００で実施した。サンプル当たり約２千万ロードをシーケンスした。

【0226】

ｍｉＲＮＡについては、ｃＤＮＡライブラリの調製にＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用した：ＤｉｃｅｒによるｍｉＲＮＡプロセスの結果として、ｍｉＲＮＡは、遊離の５’－リン酸基および３’－ヒドロキシル基を含み、これらは、第１および第２の鎖ｃＤＮＡ合成の前に特異的アダプタを連結するために使用した。ＰＣＲにより、その後ｃＤＮＡは増幅され、インデックスを付けた。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁性ビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、低分子ＲＮＡを濃縮した。サンプルは最終的に９．６ｐＭでクラスター化され、ｍＲＮＡシーケンスサンプルにスパイクされながらシーケンスされた。

【0227】

１．６ 計算プロセスおよびデータ分析（ｍＲＮＡ－ＳｅｑおよびｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑデータプロセス）
ｍＲＮＡ－Ｓｅｑリードは、ＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ．２．５．２ａ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使用して、マウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８．ｐ６およびＥｎｓｅｍｂｌ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ８６（ｈｔｔｐ：／／ｏｃｔ２０１６．ａｒｃｈｉｖｅ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にマップした。生の配列リードの質はＦａｓｔＱＣ ｖ０．１１．２使って評価し、アラインメント質メトリックスはＲＮＡＳｅＱＣ ｖ１．１８（Ｄｅ Ｌｕｃａ Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）を使用して確認した。その後、ｂａｍＵｔｉｌ ｖ１．０．１１を使用して、ＲＮＡ－Ｓｅｑサンプル中の重複リードをマークし、続けて重複率をｄｕｐＲａｄａｒ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ１．４（Ｓａｙｏｌｓ－Ｐｕｉｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）を使用して評価した。リードカウントベクトルはｆｅａｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔｓ ｐａｃｋａｇｅ（Ｌｉａｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用して生成した。カウント行列への集計後、データはＴｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ ｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）を使用して正規化し、ｌｏｇ（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＣＰＭ）にするためｖｏｏｍ変換した（Ｒｉｔｃｈｉｅ Ｍ．Ｅ．，２０１５）。ＰＣＡおよび階層クラスタリングのような記述分析を行って、外れ値の可能性を特定した。それぞれの時点における処理および各コントロール間の発現差は、ｐ ａｄｊ≦０．０５およびａｂｓ（ｌｏｇ₂ＦＣ）≧０．５の有意な閾値でｌｉｍｍａを使用して行った。合計１２４中２サンプルがＱＣ基準に合格しなかったため除外された。

【0228】

ｍｉＲＮＡ－Ｓｅｑリードは、Ｋｒａｋｅｎ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．１２－２７４（Ｄａｖｉｓ Ｍ．Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３）を使ってトリミングし、続けてＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ．２．５．２ａを使用してマウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８．ｐ６およびｍｉＲｂａｓｅ ｖ．２１ ｍｏｕｓｅ ｍｉＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）にマップした。生の配列リードの質は、ＦａｓｔＱＣ ｖ０．１１．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して評価し、トリミングサイズおよび生物型分布はインハウススクリプトを使用して評価した。カウント行列への集計後、データはＴｒｉｍｍｅｄ ｍｅａｎ ｏｆ Ｍ ｖａｌｕｅｓ（ＴＭＭ）を使用して正規化し、ｌｏｇ（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＣＰＭ）にするためｖｏｏｍ変換した。ＰＣＡおよび階層クラスタリングのような記述分析を行って、外れ値の可能性を特定した。それぞれの時点における処理および各コントロール間の発現差は、ｐ ａｄｊ≦０．０５およびａｂｓ（ｌｏｇ₂ＦＣ）≧０．５の有意な閾値でｌｉｍｍａを使用して行った。

【0229】

１．７ 統合データ分析（機能的パラメータと発現の相関）
肺機能および肺重量の測定値と、両モデルおよび全時点の全サンプルにわたる各ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡのｖｏｏｍ変換ｌｏｇ(ＣＰＭ)との間のスピアマンのｒｈｏ。

【0230】

１．８ 推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ標的ペアの決定
ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を決定するために、段階的アプローチを実施した。まず、低発現のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを発現マトリックスから取り除いた。続いて、ＷＧＣＮＡ ｖ．１．６０のｃｏｒＡｎｄＰｖａｌｕｅ関数（Ｌａｎｇｆｅｌｄｅｒ＆Ｈｏｒｖａｔｈ，２００８）を使用して、両モデルおよび全時点の全サンプルにおいて、各ｍｉＲＮＡ対各ｍＲＮＡのｖｏｏｍ変換ｌｏｇ(ＣＰＭ)間でスピアマンのｒｈｏを計算した。推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアに基づく相関セットは、相関≦－０．６である全ての組合せとして定義される。推定ｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアの配列ベースの予測を追加するために、バイオコンダクター パッケージｍｉＲＮＡｔａｐ ｖ．１．１０．０／ｍｉＲＮＡｔａｐ．ｄｂ ｖ．０．９９．１０（Ｐａｊａｋ＆Ｓｉｍｐｓｏｎ，２０１６）で利用可能で最も引用される５つのｍｉＲＮＡ予測アルゴリズム（ＤＩＡＮＡ、Ｍｉｒａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲＤＢ）のうち少なくとも２つで予測された全組合せを配列ベースのペアとした。最終的なｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡペアのセットは、反相関ベースの相互作用ペアと配列ベースの相互作用ペアの交差部分であり、予測数を顕著に減らし、信頼性の高いサブセットとした。

【0231】

１．９ マウスーヒトのｍｉＲＮＡ配列の保存性
ｍｉＲＢａｓｅ ２１から全てのマウスおよびヒトｍｉＲＮＡについて、シード領域（２から７位）を抽出した。マウスおよびヒトｍｉＲＮＡの全組合せについては、シード領域と成熟間のグローバルアラインメントをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｂｉｏｓｔｒｉｎｇｓ ｐａｃｋａｇｅ（ｖ２．４６．０）のペアワイズ・アラインメント関数を使用して計算した。マッチ・スコア１、ミスマッチ・スコア０としたＲＮＡ置換マトリックスを使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを適用した。ｍｉＲＮＡ候補に２つのカテゴリを割り当て、同じ名前を持つｍｉＲＮＡマウスーヒト・ペアのシード領域でアラインメント・スコアが６のｍｉＲＮＡは「保存」、同じ名前を持つｍｉＲＮＡマウスーヒト・ペアのシード領域でアラインメント・スコアが６未満のｍｉＲＮＡは「非保存」とした。また、各成熟配列のアラインメントのアラインメント・スコアが２０を超えるｍｉＲＮＡはカテゴリ「成熟高い類似度（ｍａｔｕｒｅ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」に割り当てた。

【0232】

１．１０ 標的遺伝子セットの遺伝子セットエンリッチメントに基づくｍｉＲＮＡの特性解析
ｍｉＲＮＡの機能解析は、ＭｅｔａｂａｓｅＲ ｐａｃｋａｇｅ ｖ．４．２．３および遺伝子セット分類「ｐａｔｈｗａｙ ｍａｐｓ」、「ｐａｔｈｗａｙ ｍａｐ ｆｏｌｄｅｒｓ」、「ｐｒｏｃｅｓｓ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、「ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ」、「ｔｏｘｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ」、「ＧＯ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」、「ＧＯ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、「ＧＯ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ」から予測されたｍＲＮＡ標的にエンリッチメント機能を使用して行った。エンリッチメント機能は、クエリー遺伝子セットとメタベースからの参照セットの重複部分について超幾何学的試験を行う。ｍｉＲＮＡ標的セットの特徴づけに関するデータ検索は、２０１８年３月１２日にメタベース上で行われた。

【0233】

１．１１ 細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能解析
ｍｉＲＮＡは、細胞の炎症促進性サイトカインＩＬ－６の産生および線維化促進性過程の線維芽細胞増殖、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行（ＦＭＴ）、コラーゲン発現、および上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）に対する影響により特徴づけた。図または図の説明で異なる記載がない限り、Ａ５４９、ＮＨＢＥＣ（ヒト正常気管支上皮細胞）またはＮＨＬＦ（ヒト正常肺線維芽細胞）細胞には、ｍｉＲＮＡ単独の場合は２ｎＭ、またはｍｉＲＮＡの組合せの場合は２＋２ｎＭの濃度でｍｉＲＮＡ模倣物を一過性にトランスフェクションした。

【0234】

図に示した実験で使用した全てのｍｉＲＮＡ模倣物は、Ｑｉａｇｅｎから３本鎖ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃフォーマットで購入した。ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃの設計には、従来のｍｉＲＮＡミミックを特徴づける２本のＲＮＡ鎖ではなく、３本のＲＮＡ鎖が含まれている。ｍｉＲＮＡ（ガイド）鎖は、ｍｉＲＢａｓｅのアノテーションに対して正確に対応する配列を有する、修飾されていないＲＮＡ鎖である。しかし、パッセンジャー鎖は２本のＬＮＡ強化ＲＮＡ鎖に分けられている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－ａｎｄ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ－ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ａｎｄ－ｃｅｌｌ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｍｉｒｎａ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｍｉｒｃｕｒｙ－ｌｎａ－ｍｉｒｎａ－ｍｉｍｉｃｓ／ｍｉｒｃｕｒｙ－ｌｎａ－ｍｉｒｎａ－ｍｉｍｉｃｓ／＃ｏｒｄｅｒｉｎｇｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。正しく設計されれば、これらの３つのＲＮＡ鎖模倣物は従来の２本鎖ＲＮＡ模倣物と同じくらい強力である。大きな利点は、パッセンジャー鎖のセグメント化された性質により、ｍｉＲＮＡ鎖のみがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされ、２本の相補的パッセンジャー鎖からのｍｉＲＮＡ活性を生じないことである。ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡミミックで観察される表現型変化は、従ってミミックによってシミュレートされたｍｉＲＮＡに起因すると考えて差し支えない（ビオチン化ミミックでのｍｉＲＮＡ標的同定の図参照）。

【0235】

独特の３本のＲＮＡ鎖デザインは、高親和性ＬＮＡヌクレオチドを２つのパッセンジャー鎖に組み込むことにより可能になる。２本のパッセンジャー鎖の配列、長さ、およびＬＮＡスパイクパターンは、精巧な経験由来の設計アルゴリズムを使用して最適化される。Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｒａｅｔ ａｌ．（２００７） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ. Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５：５８８６－５８９７．ＰＭＩＤ：１７７２６０５７。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．（２００４）Ｔｈｅ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ ３２：Ｄ１０９－１１１．３．ｍｉＲＢａｓｅ：ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ．Ｋａｈｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｇｌｏｂａｌｌｙ ｐｅｒｔｕｒｂｓ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（６）：５４９－５５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１５４３．

【0236】

図２２、２３および２４では、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－２１２－５ｐのｍｉＲＮＡ模倣物、ならびに対応するコントロールを使用した：
－ ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ：MIMAT0000086: 5'UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
－ ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ：MIMAT0000256: 5'AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
－ ｈｓａ－ｍｉＲ－２１２－５ｐ：MIMAT0022695: 5'ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU
－ 陰性コントロール４：GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA

【0237】

他の図に使用された他の全てのｍｉＲＮＡ模倣物も同様にデザインした。従って、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐには配列番号１９の配列が使用され、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐには配列番号１８による配列が使用された。

【0238】

後者の条件では、４ｎＭ ｍｉＲＮＡコントロールを使用した。２４時間後、細胞にＴＧＦβ１を５ｎｇ／ｍＬの濃度で加え、細胞を２４時間（ＩＬ－６、増殖分析およびコラーゲンｍＲＮＡ発現）または７２時間（コラーゲンタンパク質発現、ＦＭＴおよびＥＭＴ分析）インキュベートした。遺伝子発現の測定は、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ９６キットを使用して細胞から総ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＩＬ－６遺伝子発現は、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイ（Ｈｓ００１７４１３１＿ｍ１）で検出した。ＩＬ－６タンパク質は、ＭＳＤ Ｖ－ＰＬＥＸ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １ Ｈｕｍａｎ ｋｉｔを使用して細胞上清で定量した。細胞増殖を評価するために、細胞をＴＧＦβ１の存在下で２４時間増殖させ、ＷＳＴ－１ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ／Ｒｏｃｈｅ）を使用して分析した。ＦＭＴは、上記のようにＮＨＬＦ細胞を増殖させ、その後、固定およびコラーゲン１ａ１の蛍光免疫染色を行うことで評価した。画像は、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００ ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して取得し、コラーゲンを定量し、細胞数（ＤＡＰＩ染色細胞核により同定）で正規化した。ＥＭＴ評価は、ＮＨＢＥＣ細胞およびＥ－カドヘリン免疫染色を使用して、同じ原理で行った。

【0239】

免疫ブロットは、ノベックス・ゲルを使用し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのバッファー、ＢｉｏＲａｄの電気泳動装置により標準的な方法に従って行った。全ての一次抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。

【0240】

細胞分析はヒト患者材料由来の肺上皮細胞または初代肺線維芽細胞のいずれかで行った。従って、例えば遺伝的特徴、環境、疾患／手術の原因、細胞単離など、それぞれの患者ドナーの不均一性により、由来細胞もまた一定の不均一性が内在する。そのため、分析間でわずかなばらつきは起こりうることであり、これが、一定の標準偏差および同じ分析フォーマット間での異なる分析ウインドウを説明する。それでも、初代細胞を使用したのは、それが直接患者材料であり、従ってよりヒト疾患に関連があるからである。

【0241】

２．結果
マウスにおけるＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン投与は肺線維化病理を誘導する。ＡＡＶ－ＴＧＦβ１、ブレオマイシン、または適当なコントロール（ＮａＣｌ、ＡＡＶ－スタッファー）の投与後、図１に示すように縦断的な線維症進展を４週間に渡って測定した。マッソントリクローム染色した２１日目肺組織切片の組織学的分析から明らかなように、肺胞中隔の肥厚、細胞外マトリックス沈着の増加、および免疫細胞の存在により特徴づけられる肺線維症表現型がＡＡＶ－ＴＧＦβ１およびブレオマイシン処理動物で明らかであったが、ＮａＣｌおよびＡＡＶ－スタッファーコントトールマウスにはなかった（図２）。疾患動物での肺重量の大きな増加は、異常ＥＣＭ沈着および組織リモデリングをはっきりと確証した。さらに、機能的な結果として、ＴＧＦβ１過剰発現およびブレオマイシン処理の後に肺機能は著しく障害し、それによって線維化ＩＬＤ患者の臨床観察を反映していた。特に、機能的読出しでのブレオマイシン誘導変化はＡＡＶ－ＴＧＦβ１モデルの変化の１週間前に生じたが、非常に類似した表現型が２１日目から明らかであった。

【0242】

慢性疾患出現の転写特性解析。肺線維症の２つのモデルにおける疾患進展および進行の根底にある分子経路および遺伝子発現の全体的変化を分析するために、それぞれの動物の肺ホモジネートからＲＮＡを調製し、次世代シーケンス（ＮＧＳ）分析に供した。差次的に発現されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの数を図３に示す。パスウェイ解析（図３Ｃ）では、ブロマイシンモデルで早い時点で損傷および急性炎症関連プロセスのエンリッチメントが予想されが、ＡＡＶモデルにおいて炎症は初期には無く、線維症進展段階でのみ生じた（１４日目以降）。これに対して、リモデリング／ＥＣＭ関連プロセスのエンリッチメントは両方の疾患モデルで似たような様式で約１４日目以降に生じた。

【0243】

臨床的に関連する疾患表現型と関係するｍｉＲＮＡの同定。疾患発症と直接関連しそうなｍｉＲＮＡ候補を同定するために、複数のフィルタ基準を用いた段階的な選択戦略を設定した（図４）。中心となる－線維症関連性－は、その縦断的発現プロファイルが観察された肺機能の低下または肺重量の増加それぞれと強く相関または反相関のいずれかが認められたｍｉＲＮＡのみを選択することにより組み込まれた。さらに、ｍｉＲＮＡ候補は一つのモデルの少なくとも一時点で差次的発現が必要であった。次に、ｍｉＲＮＡは、シード配列および完全配列類似性に基づいて、種の保存性（ヒトに保存対マウスにだけ存在）に従って分類された。得られたｍｉＲＮＡ候補リストは最終的に手作業でキュレーションを行い、２つの疾患モデルで異なる発現を持つ候補および／または発現プロファイルに変動がある候補、ならびにアップレギュレートされるがヒトで標的にならない非保存ｍｉＲＮＡを除いた。文献テキストマインイングの結果から、肺線維症のコンテクストで過去に特許が取得されたｍｉＲＮＡをさらに除外した。最終的なヒットリストを図５に示す。

【0244】

ｍｉＲＮＡ標的予測（図６）。ｍｉＲＮＡの機能的役割を特徴づける最初のアプローチとして、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｍｉＲＮＡｔａｐを介して、ＤＩＡＮＡ、ＭｉＲａｎｄａ、ＰｉｃＴａｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、およびｍｉＲＤＢデータベースを検索し、推定ｍＲＮＡ標的をコンピュータ的に予測した（詳細は材料と方法の項を参照）。５つのデータベースのうち少なくとも２つで予測された標的をさらに検討した。その後、各ｍｉＲＮＡ標的遺伝子セットは、特定疾患関連プロセスのエンリッチメントに関して分析し、図７に特定のｍｉＲＮＡによって標的化された遺伝子の推定的機能を例示している。

【0245】

ｍｉｒ－ＥバックボーンにおけるｍｉＲＮＡの機能性（図１２）。ｍｉｒ－ＥバックボーンのｍｉＲＮＡ配列の機能性を実証するために、３’ＵＴＲにｍｉＲＮＡの標的配列を有するＧＦＰ発現コンストラクトを使用した。ＨＥＫ－２９３細胞に、１つのｍｉＲＮＡをコードしたプラスミドとＧＦＰ発現コンストラクトを組み合わせて一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後にＧＦＰ蛍光を測定した。陰性コントロール、すなわちＧＦＰの３’ＵＴＲに標的配列を持たないｍｉＲＮＡの蛍光シグナルを１００％に設定し、他の全てのコンストラクトの蛍光シグナルの倍数変化を陰性コントロールと関連付けた。陽性コントロールは、最適なｍｉｒ－Ｅコンストラクトであり、予想通り最も顕著なＧＦＰノックダウンをもたらした。他の全てのコンストラクトも明らかなＧＦＰノックダウンをもたらし、適切に発現しているだけでなく、正確にプロセッシングされていることを示している。ｍｉｒ－Ｅバックボーンにおけるガイド鎖の最適な長さは２２ヌクレオチド（ｎｔ））であり、これが、２３ｎｔのｍｉＲ２１２－５ｐは２２ｎｔだけのｍｉＲ２１２－５ｐほど有効ではない理由を説明し得る。従って、２２ｎｔのｍｉＲ２１２－５ｐは本発明の一つの好ましい実施態様である。

【0246】

ヒト初代肺線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ発現（図１３）。ヒトのコンテクストでｍｉＲＮＡ候補の発現を分析するために、初代ヒト肺線維芽細胞で低分子ＲＮＡのシーケンシングを行った。図１３に示されるように、候補リストの全ｍｉＲＮＡに多様なレベルではあるが強い発現が観察され、それはマウス肺線維症モデルにおける知見をヒトに種変換するという概念を支持している。

【0247】

細胞分析におけるｍｉＲＮＡの機能解析（図１４－２１）。ｍｉＲＮＡ候補の抗線維化機能を実証するために、完全に成熟したｍｉＲＮＡ配列を含む合成ｍｉＲＮＡ模倣物を作製し、線維化リモデリングの重要なメカニズムを反映する細胞分析において一過性のトランスフェクション実験を行った。最初の実験セットでは、５つの選択したｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉｒ－２１２－３ｐ、ｍｉｒ－２１２－５ｐ）の効果を、Ａ５４９細胞および初代気管支気道上皮細胞において線維化促進ＴＧＦβ刺激の有無で分析した。図１４（Ａ）に示したように、５つのｍｉＲＮＡ模倣物のうちの４つの一過性のトランスフェクションは、よく知られている炎症遺伝子マーカーであるＩＬ６のＴＧＦβ誘導ｍＲＮＡ発現を顕著に減少させた。唯一の例外はｍｉｒ－２１２－３ｐであり、この設定において有意な抗炎症効果は見られなかった。面白いことに、同じ結果が無刺激のＡ５４９細胞でも得られた。さらにタンパク質レベルでのこれらの知見を明確に示すために、細胞培養上清中のＩＬ６発現をＥＬＩＳＡで測定した。これらの実験では、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐ、およびこれらｍｉＲＮＡ３つの組合せを調べた。図１４（Ｂ）に示すように、各ｍｉＲＮＡならびに３つの組合せの全てで、無刺激およびＴＧＦβ刺激Ａ５４９細胞においてＩＬ６発現の有意な減少を示し、それによってこれらｍｉＲＮＡの抗炎症効果が確認された。ＴＧＦβは、その炎症促進機能の他に、肺線維症における線維化リモデリングの特徴である上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の誘導因子として中心的役割を果たしている。ＴＧＦβ誘導性ＥＭＴの間、上皮から線維芽細胞様（間葉）細胞表現型への転換のため、気道上皮マーカー遺伝子であるＥ－カドヘリンの発現は減少する。ＴＧＦβ誘導性ＥＭＴに対する選択されたｍｉＲＮＡ候補の潜在的な保護的役割を評価するために、Ｅ－カドヘリン発現の定量のために、ヒト初代気管上皮細胞を使用した細胞分析とハイコンテント細胞イメージング分析を組み合わせた細胞分析を適用した。図１５に示すように、コントロール群と比較してｍｉＲＮＡ処理グループではＥ－カドヘリン発現レベルが有意に高いことから実証されるように、この設定で試験した全てのｍｉＲＮＡはＴＧＦβ介在ＥＭＴ誘導に対して顕著な阻害効果を示した。

【0248】

ｍｉＲ－１０ａ＋ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐの他にｍｉＲＮＡ組合せも評価したかったため、以前のＥＭＴ分析を繰り返し、図１５Ｂに示す。単独のｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは、肺上皮細胞のＴＧＦβ処理後のＥ－カドヘリンタンパク質発現を再び回復させることができた。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－２１２－５ｐ＋ｍｉＲ１０ａ－５ｐの組合せ、およびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せも、ＥＭＴ分析でＥ－カドヘリン発現の有意な改善を示した。一貫して、最も優れた効果はｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ＋ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ＋ｍｉＲ１０ａ－５ｐの３つの組合せで観察され、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐまたはｍｉＲ－１０ａ－５ｐ単独と同様の効果を達成するためのｍｉＲＮＡ投与量の減少を可能にする（図１５Ｂ）。図１５Ａおよび図１５Ｂの間の分析ウインドウのばらつきは、わずかな分析間のばらつきと、異なるドナーからのヒト初代肺上皮細胞の異なる挙動との組合せにより説明できる。それでも、ｍｉＲＮＡ効果の方向およびその有意性は変わらない。

【0249】

気道上皮細胞に加えて、線維芽細胞は、線維化過程に対して関連性の高い細胞型と考えられている。コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス構成成分の過剰産生の主要源として作用することにより、線維芽細胞は、肺機能障害および肺の構造的完全性の最終的な消失に関わる肺硬化に直接寄与する。線維芽細胞活性化中のｍｉＲＮＡ候補の機能をさらに調べるために、ヒト初代肺線維芽細胞の無刺激およびＴＧＦβ刺激（線維化促進）条件の下で一過性トランスフェクション実験を行った。機能的指標として、ＩＬ６発現、コラーゲン発現、および線維芽細胞増殖を、ｍｉＲＮＡの有無で評価した。図１６に示すように、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したところ、分析した全てのｍｉＲＮＡはＴＧＦβ存在下及び非存在下でＩＬ６発現の有意な減少を示した。さらに、図１７に示すように、ｍｉｒ－２１２－３ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐは、基礎条件およびＴＧＦβ誘導条件の両方で線維芽細胞増殖に対する阻害効果を示した。図１８に示すように、ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの３つの組合せのみが、コントロール群と比較して、ＴＧＦβ誘導ＦＭＴに対して有意で用量依存的な効果を示した。一方、個々にトランスフェクションした場合、試験したｍｉＲＮＡはどれも有意な効果を示さなかった。それでも、ｍｉＲ－２１２－５ｐは、この線維芽細胞ドナーを用いたこの分析で（図１８）、コラーゲンの傾向的な減少を示した。観察されたｍｉＲ２１２－５ｐによるコラーゲン沈着の傾向的な減少が有意な減少をもたらすのかどうか、また初代細胞を扱うことにより分析変動性が生じるからなのかを明らかにするために、７つの異なる線維芽細胞ドナーとより広いｍｉＲＮＡ用量範囲でＦＭＴ分析を繰り返した（図１９）。

【0250】

図１９は、ＦＭＴ分析におけるＴＧＦβ刺激時のｍｉＲＮＡ１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐ単独のコラーゲン１沈着に対する効果を示す。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐは傾向的に高濃度でコラーゲン１沈着を低下させた。ｍｉＲ－２１２－５ｐは、を各ｍｉＲＮＡコントロール模倣物と比較して、０．２５ｎＭから、正常およびＩＰＦ－肺線維芽細胞のコラーゲン１沈着著しく減少させた（図１９）。コラーゲン１沈着に加えて、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは、ヒト肺線維芽細胞においてコラーゲン１以外の新たなコラーゲン発現に変化をもたらした（図２０および２１）。ＴＧＦβで刺激すると、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは細胞内コラーゲン１ａ１およびコラーゲン５ａ１を減少させた（図２０Ａ／Ｂ）。ｍｉＲＮＡ陰性コントロールと比較して、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せは、コラーゲン１ａ１タンパク質発現のさらなる有意な減少を示した（図２０Ａ）。Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ５ａ１の減少に従い、Ｃｏｌ３ａ１ｍＲＮＡ発現も、ｍｉＲ－２１２－５ｐ、およびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組合せによって有意に減少した（図２０Ｃ）。ヒト肺線維芽細胞におけるｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの観察された抗線維化効果がＴＧＦβシグナリングの調節を通して（だけ）ではないことを最終的に実証するために、ｍｉＲＮＡ模倣物を、細胞線維化ニッチを模倣した上皮－線維芽細胞の共培養においても試験した（図２１）。上皮細胞からの線維化促進メディエーターが共培養したヒト肺線維芽細胞を活性化する当該共培養系において、ｍｉＲ－２１２－５ｐは、上皮細胞のＴＧＦβでの前刺激とは関係なく、ヒト肺線維芽細胞でＣｏｌ１ａ１発現を有意に減少させた（図２１）。

【0251】

図２２は、ＦＭＴ分析におけるＴＧＦβ刺激時のコラーゲン１沈着に対する、単独のｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲＮＡ－１８１ａ－５ｐ、およびｍｉＲ－２１２－５ｐ、ならびにその組合せの効果を示す。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐはコラーゲン沈着を５０％まで有意に減少させ、ｍｉＲ－２１２－５ｐはコラーゲン沈着を７８％まで有意に減少させた。ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐは、ｍｉＲ－２９ａとの組合せで改善しうるコラーゲンの傾向的な減少を示し、より高い濃度では５０％減少にもつながった。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐの組み合わせは、コラーゲンを８０％まで有意に減少させた。これは、ｍｉＲＮＡ－２９ａ－３ｐまたはｍｉＲ－２１２－５ｐの単独ｍｉＲＮＡの用量と比較して、組合せのそれぞれ特定のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ用量の半分で達成しうることは注目に値する。３つの組合せにおける各ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐのたった１．３３ｎＭの使用でさえ、ｍｉＲＮＡコントロールと比較して、約７０％のコラーゲン減少を有意に達成した（図２２）。

【0252】

初代肺線維芽細胞におけるコラーゲン１沈着に従って、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐは細胞内コラーゲン１合成を、特に組み合わせて投与した場合に、大いに阻害する（図２３Ａ、２４）。このＣｏｌ１ａ１タンパク質合成の約５０％の減少は、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ／ｍｉＲ－２１２－３ｐの２つの組合せにｍｉＲ－２９ａ－３ｐを加えることで有意に改善され、結果としてＣｏｌ１ａ１合成の完全な阻害をもたらした。Ｃｏｌ５ａ１（図２３Ｂ、２４）タンパク質合成およびＣｏｌ３ａ１ＲＮＡデノボ合成（図２３Ｃ、２４）については、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの３つの組合せで同じ傾向が観察され、ＴＧＦβ刺激後のこれらコラーゲンサブタイプのより強い阻害を示した。

【0253】

ウイルスコンストラクトの性能を特徴づけるために、ｍｉＲ－２１２－５ｐ発現カセットを含むＡＡＶ ６．２コンストラクト（配列番号９１によるプラスミド由来の配列番号６１参照、図２６参照）の用量を増やしてナイーブマウスをトランスダクションし、これらのマウスをＡＡＶ気管内肺注入後７、１４、２８日後にサクリファイスした。図２５に示すように、ｍｉＲ－２１２－５ｐ ＡＡＶの用量の増加は、ｍｉＲ－２１２－５ｐ肺発現の用量依存的増加をもたらした（図２５）。７日目に、１ｘ１０¹¹ｖｇのｍｉＲ－２１２－５ｐ ＡＡＶは、ｍｉＲ－２１２－５ｐの３００倍のアップレグレートをもたらし、それは後の１４日および２８日の時点では３５０倍に増加した。

【0254】

要約すると、ヒト気道上皮細胞およびヒト肺線維芽細胞における機能解析は、選択されたｍｉＲＮＡ候補について、抗炎症、抗増殖および抗線維化効果を証明している。全ての分析フォーマットで最も顕著な効果は、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉｒ－２１２－５ｐで観察され、一方ｍｉｒ－１０ａ－５ｐおよびｍｉｒ－２１２－３ｐは、前述のｍｉＲＮＡに比べて有効性が低いものの、同様のプロファイルを示した。ＦＭＴ分析では、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐによりポジティブな効果が観察され、一方ｍｉｒ－１０ａ－５ｐ、ｍｉｒ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉｒ－１８１ｂ－５ｐの３つの組合せはＦＭＴ分析において改善された阻害効果を示し、この組合せの付加的または相乗的効果を示している。全体として、肺上皮細胞に対するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの非常に強い抗線維化効果、および線維芽細胞に対するｍｉＲ－２１２－５ｐの非常に強い抗線維化効果が観察され、このことは、これら２つのｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺線維症において最も重要な２つの細胞タイプに影響する非常に強力な抗線維化組合せであることを示唆している。従って、ｍｉＲＮＡ候補の組合せ、および特にｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２１２－５ｐの模倣物、またはそのそれぞれの模倣物は、単独のｍｉＲＮＡに比べて優れた効率プロファイルを持つ治療アプローチの開発の好ましい選択肢を提供する。さらに、線維化状態下で単独のｍｉＲ－２９ａ－３ｐの公表されているコラーゲン阻害効果を検証できた。ｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐとの２つの組合せ、またはｍｉＲ－２９ａ－３ｐとｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとの３つの組み合わせの特定の組合せによって、単独のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ－２１２－５ｐとｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとの２つの組合せに比べて、さらに顕著な抗線維効果をもたらすことを示すことができた。単独での使用に比較して、組合せで伴うｍｉＲＮＡを低用量で使用することにより、抗線維化作用を維持することができ、かつトランスダクションされた細胞における望ましくない／非特異的な効果の減少につながり得る。さらに、ｍｉｒＲ－２９ａ－３ｐと、ｍｉＲ－２１２－５ｐまたはｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの両方との特定の組合せは、すでに肺高血圧症（ＰＨ）を合併しているか、そうでなければそれを発症するであろうＩＬＤ、ＰＦ－ＩＬＤまたはＩＰＦの患者におけるＰＨに対処する可能性を与える。Ｃｈｅｎ，Ｔ．らによって、ｍｉＲ－２１２－５ｐの増加が肺高血圧症マウスモデルにおいてＲＶＳＰおよび肺血管壁リモデリングを減少させることが示された。（超）相加的または相乗的な利点に加えて、３つの組合せは、肺線維症の病因における２つの重要な細胞タイプ、上皮細胞および線維芽細胞での抗線維化効果も兼ねて備えている。肺上皮細胞の形質転換で大変著しい抗線維化効果を有するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐと、線維芽細胞活性化およびＥＣＭ沈着の阻害で大きな抗線維化効果を有するｍｉＲ－２１２－５ｐおよびｍｉＲ２９ａ－３ｐを組み合わせることにより、これら３つのｍｉＲＮＡのトリプルコンビネーションは単独のｍｉＲＮＡに対して生物学的治療スペクトルを増加させる。

【0255】

ｍｉＲＮＡの治療適用。 新規肺線維症関連ｍｉＲＮＡの発見を治療用途に移すために、ベクターを介する発現に基づくアプローチは、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的配列の長期にわたる発現を可能にすることにより、肺線維症のような慢性疾患に魅力的な機会を提供する。図８に示すように、ｍｉＲＮＡ機能を調節するために、様々なベクターデザイン戦略が利用できる。線維化状態下でダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの補充のために、ポリメラーゼＩＩプロモーター（例えばＣＭＶ、ＣＢＡ）またはポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６，Ｈ１）を使用したベクターを、単独のｍｉＲＮＡ配列または幾つかのｍｉＲＮＡの組合せの発現に対して適用できる（図８Ａ）。両プロモータークラスも一般にｍｉＲＮＡ発現に対して適用できるが、ポリメラーゼＩＩプロモーターに基づくコンストラクトは細胞型特異的プロモーターの使用を可能にすることによって更なる利点を提供し、それによってより特異的および潜在的に安全なベクターコンストラクトのデザインを可能にする。内因性ｍｉＲＮＡは、いわゆるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとよばれる前駆体分子として発現し、細胞ＲＮＡｉ機構を通して最初にｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに、そして第２段階では成熟した生物学的に活性な形態にプロセシングされる。ベクター由来ｍｉＲＮＡを効率的に成熟させるため、対象配列は内因性前駆体ｍｉＲＮＡとしてまたは成熟ｍｉＲＮＡ配列を外来ｍｉＲＮＡバックボーン例えばｍｉＲ３０ ｓｃａｆｆｏｌｄまたはその最適化された形のｍｉＲ－Ｅバックボーン（Ｆｅｌｌｍａｎｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２０１３）に組み込んだ人工的ｍｉＲＮＡとしてのどちらかで発現することが可能である。ｍｉＲ－Ｅバックボーンに基づくコンストラクトの例は、下記の例の部分および配列リストの中で提供される。「ガイド位置」と注記があるコンストラクトが好ましい（表１）。配列番号４０～８１では、ｍｉＲ－Ｅバックボーンを使用したｍｉＲＮＡ発現カセットのデザイン例を提供する。配列番号４０～６９では、各ｍｉＲＮＡに対する成熟ｍｉＲＮＡまたは天然ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを含む発現カセットの例が、個々のｍｉＲＮＡについて記載されているが、配列番号７０～８１はモノシストロン性発現カセットにおける３つの異なるｍｉＲＮＡの組合せが記載されている。与えられた全ての発現カセットは、ＡＡＶベクターバックボーンに埋め込まれ、ＡＡＶ２由来の逆方向末端反復、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および場合によってはｍｉＲＮＡ配列単数または複数）の上流の高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）から構成される。図８Ｂおよび図８Ｃに示すように、線維化状態下でアップレギュレートされるｍｉＲＮＡの機能性を調節するために、２つの異なるベクターデザイン戦略が適用可能である：１）線維化促進性ｍｉＲＮＡに対して特異的に結合し、それによってそれらの機能を阻害するようにデザインされたアンチセンス様分子の発現（図８Ｂ）。各分子は、いわゆるアンチ－ｍｉＲであり、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工ｍｉＲＮＡとして発現ベクターに組み込むことができる。ｍｉＲＮＡ補充法と同様に、いくつかのｍｉＲＮＡ標的配列は単一ベクターに組み込むことができ、それによって様々な標的ｍｉＲＮＡの阻害を可能にする。２）ｍｉＲＮＡ結合部位のいくつかのコピーを含むｍＲＮＡ、いわゆるスポンジの発現は、線維化促進性ｍｉＲＮＡを選択的に封鎖し、それによってそれらの機能を阻害することを目標としている（図８Ｃ）。要約すると、様々なベクターデザイン戦略が、肺線維症関連ｍｉＲＮＡの機能的調節（補充または阻害）に利用できる。

【0256】

前記発現コンストラクトの肺送達のために、非ウイルス性およびウイルス性の遺伝子治療ベクターが適用可能である。しかし、現在利用可能な非ウイルス性送達系、例えばリポソームのようなものと比較して、過去数年間にわたる様々な論文で実証されているように、ウイルスベクターは有効性および組織／細胞型選択性に関して優れた特性が実証済みである。さらに、ウイルスベクターは効力、選択性および安全特性をさらに向上するための工学的方法に大きな可能性をもたらす。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくウイルスベクターは、その優れた前臨床および臨床安全性プロファイルと、様々な標的臓器および完全分化細胞や非分裂細胞を含む細胞タイプへの非常に効率的かつ安定的な遺伝子送達に基づいて、インビボ遺伝子治療に最も良好なベクター系の１つとして出現した。１９６５年にＡＡＶの原型である血清型ＡＡＶ２の発見以来（Ａｔｃｈｉｓｏｎら）、ヒト、非ヒト霊長類、およびブタ、トリおよびその他の系統発生学的に異なる種から様々なさらなる血清型が同定されてきた。今まで、１００以上の天然ＡＡＶ分離株が報告されており、興味深いことに、これらの分離株は組織向性に関して異なっている。カプシド工学的アプローチを適用することによって、近年、遺伝子治療アプローチに利用可能なＡＡＶベクターのレパートリーがさらに拡大している。Ｌｉｍｂｅｒｉｓら（２００９）による画期的な論文では、肺トランスダクションに関する２７のＡＡＶカプシド変異体および天然血清型の体系的比較が記載されており、Ｌｉｍｂｅｒｉｓら（２００９）による画期的な論文に基づき、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６．２が局所投与経路（例えば、鼻腔内または気管内投与）後の肺送達に非常に適したカプシドとして同定された。さらに、ＡＡＶ２に基づいて設計されたＡＡＶカプシド変異体（ＡＡＶ２－Ｌ１）は、ベクターの全身投与後に肺への特異的遺伝子送達を可能にする新規ベクターとして最近記載された（Ｋоｒｂｅｌｉｎら、２０１６）。図９に記載の通り、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの標的配列を含む発現ベクターは、５’および３’末端でＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接でき、それによってＡＡＶ２－Ｌ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６．２で例示されるような各コンストラクトの肺送達に適したＡＡＶカプシドへのパッケージが可能になる。前述のカプシド変異体を使用したＡＡＶを介する肺送達の有効性は、マウス研究でレポーター遺伝子を発現するコンストラクト（ＧＦＰ、ｆＬｕｃ）を使用して、免疫組織化学（図１０Ａ、Ｄ）またはインビボイメージング（図１０Ｂ、Ｃ）によるトランスジーン発現の評価により確認された。組織学的レベルでは、気管支気道上皮細胞、肺胞上皮細胞および実質性細胞はレポーター遺伝子発現で陽性染色され、これらの細胞タイプへの遺伝子送達の成功を示している。さらに、全身送達されたＡＡＶ２－Ｌ１の場合には、定量的なトランスジーン発現は肺内皮細胞でも検出された。トランスジーン発現が最初のベクター投与後６か月まで発現レベルが低下することなく安定していたことは注目に値する（データは示さず）。要約すると、ＡＡＶベクターは、治療用ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ標的配列を、肺の疾患関連細胞ライプで安定発現させるための非常に魅力的な送達システムを表し、それによってまだ満たされていない医療ニーズのあるＩＰＦおよび他の線維化間質性肺炎に対する新規かつ非常に革新的なマルチターゲット治療方法を提供する。

【0257】

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【0258】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【国際調査報告】