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特表2023-548294ＩＧＦ補充を調節するためのインスリン様増殖因子受容体変異体の過剰発現
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-16
(54)【発明の名称】ＩＧＦ補充を調節するためのインスリン様増殖因子受容体変異体の過剰発現
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231109BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231109BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231109BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20231109BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 120Z
C12N15/85 Z ZNA
C12N5/10
C07K16/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525494
(86)(22)【出願日】2021-11-01
(85)【翻訳文提出日】2023-06-22
(86)【国際出願番号】 US2021057606
(87)【国際公開番号】W WO2022094418
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/108,084
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダリス，クリスティン・マリー
(72)【発明者】
【氏名】レイ，ファイデス・ドウィーナン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065BA03
4B065CA25
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
目的の組換えタンパク質を発現させるための哺乳類細胞培養方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、構成的に活性なＩＧＦ１Ｒ変異体を発現する哺乳類細胞に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳類細胞培養プロセスから目的のタンパク質を発現させる方法であって、細胞培養培地中で哺乳類細胞を培養することを含み、前記哺乳類細胞は、構成的に活性なインスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ１Ｒ）変異体をコードする核酸を含み、前記目的のタンパク質をコードする異種核酸をさらに含む方法。
【請求項2】
前記細胞培養培地が、０．０３ｍｇ／Ｌ未満のインスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞培養培地が、ＩＧＦ－１を含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＩＧＦ１Ｒ変異体が、前記哺乳類細胞のゲノムに安定的に組み込まれる核酸によってコードされている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＩＧＦ１Ｒ変異体が、編集された内在性ＩＧＦ１Ｒ配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記哺乳類細胞が、０．１ｍｇ／ＬのＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で、前記ＩＧＦ１Ｒ変異体を含まない同系統の哺乳類細胞と同等の増殖率を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＩＧＦ１Ｒ変異体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＩＧＦ１Ｒ変異体が、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＩＧＦ１Ｒが、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされている、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記発現された組換えタンパク質の力価が、前記培養の１０日目で少なくとも５０ｍｇ／Ｌである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記目的のタンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記目的のタンパク質が、モノクローナル抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、免疫グロブリン、Ｆｃ融合タンパク質及びペプチボディからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記哺乳類細胞培養プロセスが、流加培養プロセス、灌流培養プロセス、及びそれらの組み合わせを利用するものである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記哺乳類細胞培養が、０．０３ｍｇ／Ｌ以下のＩＧＦ－１を含む無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０６～３．０×１０６細胞／ｍＬを、少なくとも１００Ｌのバイオリアクターに播種することによって構築される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＣＨＯ細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損している（ＤＨＦＲ－）か、又はグルタミンシンテターゼノックアウト（ＧＳＫＯ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記方法が、前記目的のタンパク質の回収工程をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記回収された目的のタンパク質が、精製され、薬学的に許容される製剤中で製剤化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
精製され、製剤化された請求項１８に記載の目的のタンパク質。
【請求項20】
１）構成的に活性なＩＧＦ１Ｒ分子を発現するＩＧＦ１Ｒ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の異種核酸と、２）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の異種核酸とを含む、遺伝子改変された哺乳類細胞。
【請求項21】
前記ＩＧＦ１Ｒ変異体をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の哺乳類細胞。
【請求項22】
前記第１の異種核酸が、宿主ゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２０又は２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項23】
前記第１の異種核酸が、編集された内在性ＩＧＦ１Ｒ配列である、請求項２０又は２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項24】
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【請求項25】
前記ＣＨＯ細胞が、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損している（ＤＨＦＲ－）か、又はグルタミンシンテターゼノックアウト（ＧＳＫＯ）である、請求項２４に記載の哺乳類細胞。
【請求項26】
前記細胞株が、０．０３ｍｇ／Ｌ以下のＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で増殖することができる、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の哺乳類細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、組換えタンパク質を生産するための哺乳類細胞株及び細胞培養におけるそれらの使用に関する。
【0002】
配列表
本出願には、開示の別の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：Ａ－２７１１－ＷＯ－ＰＣＴ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０２１年１１月１日作成、サイズ１２７ＫＢ）が含まれており、参照によりその全体が組み込まれる。
本出願には、開示の別の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：Ａ－２７１１－ＷＯ－ＰＣＴ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０２１年１１月１日作成、サイズ１２７ＫＢ）が含まれており、参照によりその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
生物学的製剤は、その幅広い用途から、治療及び診断などの様々な用途で世界中で使用されている。主流の細胞工場であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む哺乳類細胞株が、これらの生物学的製剤の主流の発現系である。Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５１：１２８－１４０を参照されたい。特にバイオシミラーの出現により、現在では、市場投入までのスピード及びコスト効率が以前にも増して重要なものとなっている。
【0004】
生物学的製剤の製造コストは、最適な細胞株の選択、大量の生産細胞の培養、細胞回収物からの所望の生物学的形態の精製に関与する多段階のプロセスを利用する、それらの生産が複雑であることにより、高いものとなっている。これらのコストは、生産のあらゆる面を改善することによって低下してきてはいるが、それらが最先端の治療として広く採用されるには、依然としてコストが極めて高額である場合がある。製造工程のいずれかに関連するコストを削減することにより、結果的に最終的なコストを削減することができる。
【0005】
生物学的製剤の製造に関連する商品コストに大きく貢献するものの１つが、細胞培養培地及び必要とされる様々なサプリメントである。そのようなサプリメントの１つが、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）である。
【0006】
インスリン様増殖因子は、インスリン様増殖因子受容体に結合することによって細胞内シグナル伝達を開始し、細胞増殖、繁殖及び分化を調節する増殖因子である。ＩＧＦ－１は細胞を増殖させる役割を有するため、細胞培養培地に補充されることが多いが、組換えタンパク質をラージスケールで商業的に製造するには高価な成分である。
【0007】
そのため、宿主細胞からの組換えタンパク質の生産に関連するコストを削減する必要がある。この目的を達成するための１つの方法としては、ＩＧＦ－１などの特定の細胞培養培地のサプリメントの必要性を低減又は排除することにより、商品コストを削減することである。細胞培養培地を血小板由来増殖因子ＢＢで補充することにより、間葉系幹細胞でインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）の発現が増強されたことが確認されている。米国特許出願公開第２０２００２４５３８８号明細書を参照されたい。しかしながら、このことは生物学的製剤のラージスケール生産には適用されておらず、依然として別の増殖因子を補充することが必要とされている。
【0008】
増殖及び生産性に及ぼす影響が最小限の組換えタンパク質を産生する、培地にＩＧＦ－１を補充する必要性が低減した、又は必要性のない宿主細胞株が依然として求められている。このような細胞株は、生物学的製剤のプロセス開発に有益である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０２００２４５３８８号明細書
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｌａｌｏｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５１：１２８－１４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
本開示は、哺乳類細胞培養プロセスから目的のタンパク質を発現させる方法であって、細胞培養培地中で哺乳類細胞を培養することを含み、哺乳類細胞は、構成的に活性なインスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ１Ｒ）変異体をコードする核酸を含み、目的のタンパク質をコードする異種核酸をさらに含む方法を提供する。
【0012】
特定の実施形態では、細胞培養培地は、０．０３ｍｇ／Ｌ未満のインスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）を含む。特定の実施形態では、細胞培養培地は、
ＩＧＦ－１を含まない。
ＩＧＦ－１を含まない。
【0013】
特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、哺乳類細胞のゲノムに安定的に組み込まれる核酸によってコードされている。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、編集された内在性ＩＧＦ１Ｒ配列である。
【0014】
特定の実施形態では、哺乳類細胞は、０．１ｍｇ／ＬのＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で、ＩＧＦ１Ｒ変異体を含まない同系統の哺乳類細胞と同等の増殖率を有する。
【0015】
特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１４、又は１６のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１４、又は１６のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされている。特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒは、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされている。
【0016】
本明細書に記載される方法を使用する特定の実施形態では、目的の発現タンパク質の力価は、培養の１０日目で少なくとも５０ｍｇ／Ｌである。
【0017】
特定の実施形態では、目的のタンパク質は、抗原結合タンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、モノクローナル抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、免疫グロブリン、Ｆｃ融合タンパク質及びペプチボディからなる群から選択される。
【0018】
特定の実施形態では、哺乳類細胞培養プロセスは、流加培養プロセス、灌流培養プロセス、及びそれらの組み合わせを利用する。
【0019】
特定の実施形態では、哺乳類細胞培養は、０．０３ｍｇ／Ｌ以下のＩＧＦ－１を含む無血清培養培地中の少なくとも０．５×１０６～３．０×１０６細胞／ｍＬを、少なくとも１００Ｌのバイオリアクターに播種することによって構築される。
【0020】
特定の実施形態では、哺乳類細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損している（ＤＨＦＲ－）か、又はグルタミンシンテターゼノックアウト（ＧＳＫＯ）である。
【0021】
特定の実施形態では、方法は、目的のタンパク質の回収工程をさらに含む。特定の実施形態では、回収された目的のタンパク質が精製され、薬学的に許容される製剤中で製剤化される。
【0022】
本開示はまた、本明細書に記載される方法を用いて調製された、精製され、製剤化された目的のタンパク質を提供する。
【0023】
本開示はまた、１）構成的に活性なＩＧＦ１Ｒ分子を発現するＩＧＦ１Ｒ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む第１の異種核酸と、２）目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の異種核酸とを含む、遺伝子改変された哺乳類細胞を提供する。
【0024】
特定の実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【0025】
特定の実施形態では、第１の異種核酸が、宿主ゲノムに安定的に組み込まれる。特定の実施形態では、第１の異種核酸は、編集された内在性ＩＧＦ１Ｒ配列である。
【0026】
特定の実施形態では、哺乳類細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠損している（ＤＨＦＲ－）か、又はグルタミンシンテターゼノックアウト（ＧＳＫＯ）である。
【0027】
特定の実施形態では、細胞株は、０．０３ｍｇ／Ｌ以下のＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で増殖することができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】（Ａ）ｄｅｌＬ１及び（Ｂ）Ｈ９０５ＣのｐＰＴ１．３４．７ＧＧのＩＧＦ１Ｒ構築物マップの概略図である。
【図1B】（Ａ）ｄｅｌＬ１及び（Ｂ）Ｈ９０５ＣのｐＰＴ１．３４．７ＧＧのＩＧＦ１Ｒ構築物マップの概略図である。
【図2】ＩＧＦ１Ｒ変異体ｄｅｌＬ１（上部パネル）又はＨ９０５Ｃ（下部パネル）を含むＣＳ９ ＣＨＯ細胞の回復率を示す。ＩＧＦ－１なし（黒）；ＩＧＦ－１を併用したピューロマイシン（濃い灰色）；ＩＧＦ－１なし（薄い灰色）。
【図3】ＣＳ９プラットフォーム宿主（黒）と比較した、ＩＧＦ１Ｒ変異体ｄｅｌＬ１（濃い灰色）又はＨ９０５Ｃ（薄い灰色）を含むＣＳ９ ＣＨＯ細胞の倍加時間を示す。倍加時間は、細胞株が回復した時点における３継代の平均を基準とする。
【図4】ＩＧＦ－１のみでＩＧＦ１Ｒ変異体ｄｅｌＬ１（上部パネル）又はＨ９０５Ｃ（下部パネル）を含むＣＨＯ ＧＳＫＯ細胞の回復率を示す。ＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主ＥＧ９、ＥＧ１０及びＳＲ３－Ｅ１は濃い色で、ＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主１１Ｓ及び１５－３Ｅ宿主は薄い色で示す。
【図5】ＣＨＯ ＧＳＫＯプラットフォーム宿主（黒）と比較した、ＩＧＦ１Ｒ変異体ｄｅｌＬ１（濃い灰色）又はＨ９０５Ｃ（薄い灰色）を含むＣＨＯ ＧＳＫＯ細胞の倍加時間を示す。倍加時間は、細胞株が回復した時点における２～３継代の平均を基準とする。
【図6A】Ａ）ＣＳ９バックグラウンドにおけるＢｉＴＥ及びｍＡｂ、並びにＢ）ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＢｉＴＥ及びＩｇＧｓｃＦｖの試験分子をトランスフェクトした細胞を含むＩＧＦ１Ｒ変異体の回復曲線を示す。対照（黒線）、Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）、ｄｅｌＬ１変異体（濃い灰色）。
【図6B】Ａ）ＣＳ９バックグラウンドにおけるＢｉＴＥ及びｍＡｂ、並びにＢ）ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＢｉＴＥ及びＩｇＧｓｃＦｖの試験分子をトランスフェクトした細胞を含むＩＧＦ１Ｒ変異体の回復曲線を示す。対照（黒線）、Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）、ｄｅｌＬ１変異体（濃い灰色）。
【図7A】Ａ）ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の平均１０Ｄ流加によるＶＣＤ及び生存率。Ｂ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の力価。Ｃ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株のＱｐ。Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）；対照細胞株（黒）。
【図7B】Ａ）ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の平均１０Ｄ流加によるＶＣＤ及び生存率。Ｂ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の力価。Ｃ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株のＱｐ。Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）；対照細胞株（黒）。
【図7C】Ａ）ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の平均１０Ｄ流加によるＶＣＤ及び生存率。Ｂ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の力価。Ｃ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株のＱｐ。Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）；対照細胞株（黒）。
【図8A】Ａ）ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の平均１０Ｄ流加によるＶＣＤ及び生存率。Ｂ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の力価及びＱｐ。Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）；ｄｅｌＬ１（濃い灰色）；対照細胞株（黒）。
【図8B】Ａ）ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の平均１０Ｄ流加によるＶＣＤ及び生存率。Ｂ）ＩＧＦ１Ｒ変異体試験分子トランスフェクト細胞株の力価及びＱｐ。Ｈ９０５Ｃ変異体（薄い灰色）；ｄｅｌＬ１（濃い灰色）；対照細胞株（黒）。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、受容体を構成的に活性な状態に維持するＩＧＦ１Ｒにおける変異により、培地に高レベルのＩＧＦ－１を補充する必要がなくなるという発見に部分的に基づくものである。ＩＧＦ－１は、ＩＧＦ１Ｒ経路のシグナル伝達を通じて細胞増殖をサポートするタンパク質サプリメントである。ＩＧＦ－１を補充することなく生存し増殖することのできる改変ＣＨＯ細胞により、組換えタンパク質をラージスケールで生産する際にＩＧＦ－１の補充にかかる高いコストを削減することができる。ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃと命名された、２つの構成的に活性なＩＧＦ１Ｒ変異体（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｅＬｉｆｅ，３：ｅ０３７７２を参照されたい）をＣＨＯ細胞株に過剰発現させると、ＩＧＦ－１補充の必要性が低減した、又は必要性がないということが分かった。
【0030】
本発明は、ＩＧＦ－１を欠く細胞培養培地中で目的のタンパク質を商業的に生産するのに特に有用であることが分かった。本発明において使用される細胞株（「宿主細胞」とも呼ばれる）は、ＩＧＦ１Ｒ変異体を安定的に発現するように遺伝子操作されている。特定の実施形態では、細胞株はまた、商業的又は科学的な目的のタンパク質も発現する。細胞株は、典型的には時間が制限されずに培養で維持され得る初代培養から生じる系統に由来する。細胞株の遺伝子操作には、宿主細胞にＩＧＦ１Ｒ変異体を発現させるように、細胞を組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換若しくは形質導入すること、及び／又は別の方法で改変すること（例えば、相同組換え及び遺伝子活性化、又は組換え細胞と非組換え細胞との融合によって）を含む。例えばＩＧＦ１Ｒ変異体を発現するように細胞及び／又は細胞株を遺伝子操作するための方法及びベクターは当業者によく知られており、例えば、種々の技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、及び四半期アップデート）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５－６９に説明されている。
【0031】
本願で使用する用語法は、当該技術分野内で標準的であるが、特定の用語の定義は、特許請求の範囲の意味において明快さ及び明確さを保証するために本明細書において提供される。単位、接頭辞、及び記号は、ＳＩ（国際単位系）で認められた形式で表記され得る。本明細書で列記される数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内の各整数を含み、それを支持する。別段の指示がない限り、本明細書に記載される方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる従来の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用され且つ論じられる様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、並びにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。
【0032】
本明細書で使用する場合、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」という用語は、特に別段の指示がない限り、１つ以上を意味する。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びに本明細書に記載されるタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。
【0033】
特許、特許出願、論文、書籍及び学術論文が挙げられるが、これらに限定されない、本願で引用される全ての文献又は文献の一部は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の一実施形態に記載されているものは、本発明の他の実施形態と組み合わせることができる。
【0034】
本開示は、「目的のタンパク質」を発現させる方法を提供するものであり、「目的のタンパク質」には、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、及び改変タンパク質（例えば、天然に存在せず、ヒトによって設計及び／又は作製されているタンパク質）が含まれる。目的のタンパク質は、治療に関連することが知られているか、又はそのように思われているタンパク質であり得るが、そうである必要はない。目的のタンパク質の特定の例としては、抗原結合タンパク質（本明細書に記載及び定義される）、ペプチボディ（すなわち、ペプチド部分が所望の標的に特異的に結合し、ペプチドがＦｃ領域に融合され得るか、若しくはＦｃループに挿入され得る、抗体のＦｃドメインなどの他の分子に直接若しくは間接的に融合されたペプチドを含む分子、又は、例えばその全体が本明細書に参照として組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１４０９３４号明細書に記載されているような改変Ｆｃ分子）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃフラグメントがペプチボディを含むタンパク質又はペプチドに融合されているＦｃ融合タンパク質）、サイトカイン、増殖因子、ホルモン及び他の天然に存在する分泌タンパク質、並びに天然に存在するタンパク質の変異型が挙げられる。
【0035】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語（例えば、目的のタンパク質又は目的のポリペプチドの文脈で使用されるような）は、本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語はまた、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマーと同様に、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語はまた、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加、又はリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在する非組換え細胞によって産生され得るか、又はポリペプチド及びタンパク質は、遺伝子操作された細胞又は組換え細胞によって産生され得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／若しくは置換を有する分子を含み得る。
【0036】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然に存在するアミノ酸だけから構成される分子と同様に、天然に存在しないアミノ酸から構成される分子も包含する。天然に存在しないアミノ酸の例（所望により、本明細書に開示される任意の配列に見られる任意の天然に存在するアミノ酸と置換することができる）としては、４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な使用法及び慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシル末端方向である。
【0037】
タンパク質若しくはポリペプチド配列に挿入され得る、又はタンパク質若しくはポリペプチド配列の野生型残基に対して置換され得る天然に存在しないアミノ酸の例の非限定なリストには、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び側鎖が誘導体化されたアミノ酸が含まれる。例としては、以下のものが含まれる（Ｌ－型又はＤ－型；括弧内のように省略される）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα－メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα－メチルホモシトルリン（Ｎα－ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα－メチルオルニチン（Ｎα－ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα－メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα－メチルロイシン（Ｎα－ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ－メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα－メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール－２－カルボン酸（Ｏｉｃ）、３－（１－ナフチル）アラニン（１－Ｎａｌ）、３－（２－ナフチル）アラニン（２－Ｎａｌ）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２－インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ－ヨードフェニルアラニン（ｐＩ－Ｐｈｅ）、パラ－アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４－アミノ－Ｐｈｅ）、４－グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε－グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」と省略）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅ又はアミノ－Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ－カルボキシグルタミン酸（γ－カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ－カルボキシル－フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα－メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ－α－メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα－メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４－メチル－フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β－ジフェニル－アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－フェニル－フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α－アミノ－イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ－アラニン、ベータ－アミノプロピオン酸、ピぺリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、４－ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、ω－メチルアルギニン、４－アミノ－Ｏ－フタル酸（４ＡＰＡ）及び他の類似のアミノ酸、並びにこれらの具体的に列挙されるいずれかの誘導体化形態。
【0038】
本明細書で使用する場合、核酸に関連して使用される「異種」という用語は、宿主細胞内に天然に存在しない核酸を有することを意味する。この用語には、変異配列、例えば、天然に存在する配列とは異なる配列が含まれ得る。この用語には、他種由来の配列が含まれ得る。また、宿主細胞内に自然に存在するのではなく、ゲノム上の異なる位置に配列を有することも含み得る。一般に、宿主細胞で発生する可能性のある自然変異は含まれない。例えば、発現カセットを安定的に組み込むことによって目的のタンパク質をコードする異種核酸を既に含む細胞は、異種核酸配列を含むものとみなされる。明確にするために、抗原結合タンパク質をコードする核酸を有するＣＨＯ細胞又はその誘導体（例えば、ｄｈｆｒ－又はＧＳノックアウト）は、異種核酸を有するものとみなされる。本開示は、以下の両方を想定するものである：（１）例えば、マスターセルバンク又はワーキングセルバンクを作製するために、本明細書に記載されるような変異型ＩＧＦ１Ｒをコードする核酸配列を組み込むように最初に改変され、次いで、例えば抗体をコードする核酸配列を組み込むようにさらに改変された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）；及び（２）目的の異種タンパク質、例えば抗体をコードする核酸を既に有し、次いで本明細書に記載されるような変異型ＩＧＦ１Ｒをコードする核酸配列を組み込むようにさらに改変された細胞、例えばマスターセルバンク又はワーキングセルバンク。
【0039】
本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」という用語は、最も広い意味で用いられ、抗原又は標的に結合する部分と、任意選択により、抗原結合部分が抗原と結合するのを促進する立体構造を取ることが可能な足場又はフレームワーク部分とを含むタンパク質を意味する。抗原結合タンパク質の例としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体、及びそのこれらのフラグメントが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、グラフト化ＣＤＲ又はＣＤＲ誘導体を有する代替のタンパク質足場又は人工の足場を含み得る。そのような足場としては、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入される変異を含む抗体に由来する足場だけでなく、例えば、生体適合性ポリマーを含む完全な合成足場も含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１－１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４を参照されたい。加えて、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、並びに足場としてフィブロネクチン成分を用いる抗体模倣体に基づく足場が使用され得る。
【0040】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する２つの同一の対のポリペプチド鎖から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとそれぞれ定義される。
【0041】
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２，（１９９１）の定義に従って行うことができる。必要に応じて、Ｃｈｏｔｈｉａのような代替的な命名スキームに従ってＣＤＲを再定義することもできる（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３又はＨｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０を参照されたい）。
【0042】
本開示の文脈では、抗原結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１０－８Ｍである場合に、その標的抗原に「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」と言われる。抗体は、ＫＤが≦５×１０－９Ｍである場合は「高い親和性」で抗原と特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０－１０Ｍの場合は「極めて高い親和性」で抗原と特異的に結合する。
【0043】
「抗体」という用語は、特に指定のない限り、任意のアイソタイプ若しくはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方、又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合領域への言及を含む。加えて、「抗体」という用語は、特に指定のない限り、インタクトな免疫グロブリン、又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術、又はインタクト抗体の酵素的若しくは化学的切断によって生成することができ、目的のタンパク質のエレメントを形成することができる。抗原結合部分には、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び特異的抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。
【0044】
ＦａｂフラグメントはＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり、ＦｄフラグメントはＶＨ及びＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖフラグメントは抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインを有し、ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（米国特許第６，８４６，６３４号明細書、同第６，６９６，２４５号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２０２５１２号明細書、同第２００４／０２０２９９５号明細書、同第２００４／００３８２９１号明細書、同第２００４／０００９５０７号明細書、同第２００３／００３９９５８号明細書、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）。
【0045】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して結合されて、連続的なタンパク質鎖を形成する抗体であり、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体折り畳まれ、且つ一価抗原結合部位を形成することを可能にするのに十分な長さである（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照されたい）。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖から構成される二価抗体であり、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合することが可能となるには短すぎるリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬドメインから構成されており、これによって各ドメインは別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対合することが可能となる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合によって得られるダイアボディは、同一の２つの抗原結合部位を有することになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用すると、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製することができる。同様に、トリアボディ及びテトラボディは、それぞれ３本及び４本のポリペプチド鎖から構成され、それぞれ同一でも異なっていてもよい３つ及び４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【0046】
１つ以上のＣＤＲを共有結合的又は非共有結合的に分子に組み込み、これを抗原結合タンパク質としてもよい。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込むことができ、そのＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合させることができ、又はそのＣＤＲを非共有結合により組み込むことができる。このＣＤＲによって、抗原結合タンパク質を特定の目的の抗原に特異的に結合させることが可能となる。
【0047】
抗原結合タンパク質は、１つ以上の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位が存在する場合、結合部位は互いに同一であってもよく、又は異なっていてもよい。例えば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合部位を有するが、「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【0048】
明確にするために、また、本明細書に記載するように、抗原結合タンパク質はヒト由来（例えば、ヒト抗体）であってよいが、そうである必要はなく、場合によっては非ヒトタンパク質、例えばラット又はマウスタンパク質から構成され、他の場合では抗原結合タンパク質はヒトタンパク質と非ヒトタンパク質とのハイブリッド（例えば、ヒト化抗体）から構成されてもよいことに留意する。
【0049】
目的のタンパク質は、ヒト抗体を含み得る。「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域及び定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変ドメイン及び定常ドメインの全てが、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。このような抗体は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＵｌｔｉＭａｂ（商標）、又はＶｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅ（登録商標）系に由来するマウスなどの、ヒト重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子由来の抗体を発現するように遺伝子改変されたマウスの対象となる抗原で免疫化することによるものを含む、様々な方法で調製することができる。ファージベースの手法を用いることもできる。
【0050】
或いは、目的のタンパク質は、ヒト化抗体を含み得る。「ヒト化抗体」は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加により、非ヒト種由来の抗体の配列とは異なる配列を有する。そのため、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与した場合、非ヒト種抗体と比較して免疫応答を誘導する可能性が低くなり、且つ／又はそれほど重篤でない免疫応答を誘導する。一実施形態では、非ヒト種抗体のフレームワーク内、並びに重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン内の特定のアミノ酸を変異させて、ヒト化抗体を生成する。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合させる。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号明細書、同第５，８８６，１５２号明細書及び同第５，８７７，２９３号明細書に見出され得る。
【0051】
「Ｆｃ」領域は、この用語を本明細書で使用する場合、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントから構成されている。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって結合されている。抗原結合タンパク質及びＦｃ融合タンパク質を含む、Ｆｃ領域から構成される目的のタンパク質は、本開示の別の態様を構成する。
【0052】
「ヘミボディ」とは、完全な重鎖と、完全な軽鎖と、完全な重鎖のＦｃ領域と対合する第２の重鎖Ｆｃ領域とを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン構築物である。重鎖Ｆｃ領域と第２の重鎖Ｆｃ領域を結合するためにリンカーを使用することができるが、必ずしもそうである必要はない。特定の実施形態では、ヘミボディは、本明細書に開示される一価形態の抗原結合タンパク質である。他の実施形態では、荷電残基の対合を用いて一方のＦｃ領域を第２のＦｃ領域と結合させることができる。ヘミボディは、本開示の文脈における目的のタンパク質であり得る。
【0053】
本明細書で使用する場合、「バイオリアクター」という用語は、細胞培養物の増殖に有用なあらゆる容器を意味する。本開示の細胞培養物は、バイオリアクター内で増殖させることができ、このバイオリアクターは、バイオリアクター内で増殖する細胞によって生産される目的のタンパク質の用途に基づいて選択することができる。バイオリアクターは、細胞の培養に有用である限り、どのような大きさであってもよく、典型的にはその中で増殖させる細胞培養物の容積に適切な大きさである。典型的に、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、２、５、１０、５０、１００、２００、２５０、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、５０００、８０００、１００００、１２０００リットル以上、又はその間の任意の容積であってよい。培養期間中に、ｐＨ及び温度を含むがこれらに限定されないバイオリアクターの内部条件を制御することができる。当業者であれば、関連する懸念事項に基づいて、本明細書で開示される方法を実施する際に使用するのに好適なバイオリアクターを認識し、選択することができる。
【0054】
本明細書で使用する場合、「細胞培養」又は「培養」は、多細胞生物又は組織の外部での細胞の増殖及び繁殖を意味する。哺乳類細胞に好適な培養条件は、当該技術分野において公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳類細胞は、懸濁液中で、又は固形培養基に付着させながら培養してもよい。流動床バイオリアクター、中空糸型バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、又は撹拌槽バイオリアクターを、マイクロキャリアの有無に関わらず使用することができる。一実施形態では、５００Ｌ～２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。一実施形態では、１０００Ｌ～２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。
【0055】
「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）」（「培養培地」、「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」、「組織培養培地」とも呼ばれる）という用語は、増殖細胞、例えば、動物又は哺乳類細胞に使用される任意の栄養液を指し、一般に、以下に由来する少なくとも１つ以上の成分を提供するものである：エネルギー源（通常、グルコースなどの炭水化物の形態）；全ての必須アミノ酸、及び一般に２０種の基本的なアミノ酸とシステインのうちの１つ以上；典型的には低濃度で必要とされるビタミン及び／又は他の有機化合物；脂質又は遊離脂肪酸；並びに通常マイクロモル濃度範囲において典型的には非常に低濃度で必要とされる微量元素、例えば、無機化合物又は天然に存在する元素。
【0056】
栄養液は、培養される細胞の要件及び／又は所望の細胞培養パラメーターに応じて、細胞の増殖を最適化するための追加の任意選択的な成分、例えば、ホルモン及び他の増殖因子、例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、血清など；塩、例えばカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩、並びに緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ；ヌクレオシド及び塩基、例えばアデノシン、チミジン、ヒポキサンチン；並びにタンパク質及び組織加水分解物、例えば加水分解された動物性又は植物性タンパク質（動物由来成分から得られる可能性のあるペプトン又はペプトン混合物、精製ゼラチン又は植物材料）；抗生物質、例えばゲンタマイシン；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８とも称される）などの細胞保護剤又は界面活性剤；ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に挟まれたポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー；ポリアミン、例えばプトレシン、スペルミジン及びスペルミン（例えば、国際公開第２００８／１５４０１４号パンフレットを参照されたい）並びにピルベート（例えば、米国特許第８，０５３，２３８号明細書を参照されたい）で任意選択的に補充してもよい。
【0057】
細胞培養培地としては、以下に限定されないが、細胞の回分培養、拡張回分培養、流加培養及び／又は灌流培養若しくは連続培養などの任意の細胞培養プロセスにおいて典型的に利用され、且つ／又はそれとの使用に関して知られるものが挙げられる。
【0058】
「基礎」（又は回分）細胞培養培地は、典型的に、細胞培養を開始するのに使用され、細胞培養を補助するのに十分に完全である細胞培養培地を指す。
【0059】
「流加培養」とは、懸濁培養の一形態を指し、培養プロセスの開始時又はその後の時点で追加の成分が培養液に供給される細胞の培養方法を意味する。提供される成分は、典型的に、培養プロセス中に枯渇した細胞用栄養サプリメントを含む。加えて又は代替的に、追加の成分は、サプリメント成分（例えば、細胞周期阻害化合物）を含み得る。流加培養は、典型的に、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分が回収され、任意選択により精製される。
【0060】
「増殖」細胞培養培地は、典型的に、指数増殖の期間である「増殖期」の間の細胞培養に使用され、この期の間の細胞培養を補助するのに十分に完全である細胞培養培地を指す。増殖細胞培養培地はまた、宿主細胞株に組み込まれた選択マーカーに耐性又は生存を付与する選択薬剤を含有してもよい。このような選択薬剤としては、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシミン、メトトレキサート、グルタミンを含まない細胞培養培地、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠くか、又はチミジンのみを欠く細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
「灌流」細胞培養培地は、典型的に、灌流又は連続培養法によって維持され、このプロセスの間に細胞培養を補助するのに十分に完全である細胞培養に使用される細胞培養培地を指す。灌流細胞培養培地配合物は、使用済み培地を除去するために使用される方法に対応するために、基礎細胞培養培地配合物よりも濃いか、又はより濃縮されていてもよい。灌流細胞培養培地は、増殖期及び生産期の両方で使用することができる。
【0062】
「生産」細胞培養培地は、典型的に、指数増殖が終了し、タンパク質の生産に置き換わるときに移行する間の「移行」期及び／又は「生産」期の細胞培養に使用され、この期の間の所望の細胞密度、生存率及び／又は生産力価を維持するのに十分に完全である細胞培養培地を指す。
【0063】
濃縮細胞培養培地は、細胞培養を維持するために必要な栄養素の一部又は全てを含むことができ、特に、濃縮培地は、細胞培養の生産期の過程の間に消費されることが確認されているか又は知られている栄養素を含み得る。濃縮培地は、ほとんどのあらゆる細胞培養培地配合物を基準としてもよい。このような濃縮フィード培地は、細胞培養培地の一部又は全ての成分を、例えば、それらの通常の量の約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、或いは約１０００倍で含み得る。
【0064】
細胞培養培地を調製するために使用する成分は、完全に粉砕して粉末培地配合物にしてもよく、必要に応じて細胞培養培地に添加した液体サプリメントと共に部分的に粉砕してもよく、又は完全に液体の形態で細胞培養液に添加してもよい。
【0065】
細胞培養液はまた、製剤化が困難であるか、又は細胞培養液中で速やかに枯渇する可能性のある、特定の栄養素の個々の濃縮フィードで補充することができる。そのような栄養素は、チロシン、システイン及び／又はシスチンなどのアミノ酸であってよい（例えば、国際公開第２０１２／１４５６８２号パンフレットを参照されたい）。例えば、チロシンの濃縮溶液を、チロシンを含有する細胞培養培地中で増殖させた細胞培養液に、細胞培養液中のチロシンの濃度が８ｍＭを超えないように個々にフィードすることができる。別の例では、チロシン及びシスチンの濃縮溶液を、チロシン、シスチン又はシステインを欠く細胞培養培地中で増殖させた細胞培養液に個々にフィードする。個々のフィードは、生産期の前又は生産期が始まった時点で開始することができる。個々のフィードは、濃縮フィード培地と同日又は異なる日に細胞培養培地に流加することによって達成することができる。個々のフィードは、灌流培地と同日又は異なる日に灌流することもできる。
【0066】
「無血清」は、ウシ胎児血清などの動物血清を含まない細胞培養培地に適用される。定義された培養培地を含む様々な組織培養培地が市販されており、例えば、以下の細胞培養培地のいずれか１つ又はその組み合わせを使用することができる：特に、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）、ＭＣＤＢ ３０２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの無血清培地。そのような培養培地の無血清バージョンも利用可能である。細胞培養培地は、培養される細胞の要件及び／又は所望の細胞培養パラメーターに応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などの成分を追加して、又はこれらの濃度を上昇させて補充してもよい。カスタマイズされた細胞培養培地を使用することもできる。
【0067】
「細胞密度」とは、培養培地の所与の容積中の細胞の数を指す。「生存細胞密度」とは、標準的な生存アッセイ（トリパンブルー色素排除法など）によって測定したときの培養培地の所与の容積中の生細胞の数を指す。
【0068】
「細胞生存」とは、培養中の細胞が、所定の一連の培養条件又は実験変動下で生存する能力を意味する。この用語はまた、特定の時点における培養液中の生細胞及び死滅細胞を合計した数に対して、その時点で生存している細胞の部分を指す。
【0069】
「増殖停止」は、「細胞増殖停止」と称することもあるが、細胞の数の増加が止まる時点、又は細胞周期がもはや進行しなくなる時点のことである。増殖停止は、細胞培養液の生存細胞密度を測定することによって監視することができる。増殖停止状態の一部の細胞は、サイズが大きくなっても数が増えないことがあるため、増殖が停止した培養液の充填細胞容積が増大する場合がある。増殖停止は、細胞の健康が悪化していなければ、増殖停止をもたらす条件を逆転させることにより、ある程度逆転させることができる。
【0070】
「充填細胞容積」（ＰＣＶ）は、「充填細胞容積率」（％ＰＣＶ）とも称され、細胞培養液の全容積に対して細胞が占める容積の比率であり、百分率で表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．Ｄｅｃ ２０：９５（６）：１２２８－３３を参照されたい）。充填細胞容積は、細胞密度と細胞径の関数であり、充填細胞容積の増大は、細胞密度若しくは細胞径のいずれか又は両方が増大することによって生じ得る。充填細胞容積は、細胞培養液中の固形分の指標である。固形物は、回収及び下流の精製の間に取り除かれる。より多くの固形物があるほど、回収及び下流の精製工程中に所望の産物から固形材料を分離するためにより多くの労力が要求されることを意味する。また、所望の産物が固形物に捕捉され、回収プロセス中に失われる結果として、生産収量の低下がもたらされる可能性がある。宿主細胞のサイズにばらつきがあり、細胞培養液には死滅及び瀕死細胞、並びに他の細胞残屑も含まれているため、充填細胞容積は、細胞培養液内の固形分を表すのに細胞密度又は生存細胞密度よりも正確な方法である。例えば、５０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を有する２０００Ｌの培養液は、細胞のサイズに応じて充填細胞容積が大きく異なることになる。加えて、増殖停止状態では、一部の細胞でサイズが大きくなるため、細胞のサイズが大きくなる結果としてバイオマスが増加することにより、増殖停止前と増殖停止後の充填細胞容積が異なる可能性がある。
【0071】
「力価」とは、所与の量の培地容積中で細胞培養によって生産される目的のポリペプチド又はタンパク質（天然に存在する又は組換え目的タンパク質であってもよい）の総量を意味する。力価は、培地１ミリリットル（又は他の容積の指標）当たりのポリペプチド又はタンパク質を、ミリグラム又はマイクログラムの単位で表すことができる。「累積力価」とは、培養の過程の間に細胞によって生産される力価のことであり、例えば、力価を毎日測定し、その値を用いて累積力価を算出することにより求めることができる。
【0072】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、目的のポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞を含むものと理解される。細胞の遺伝子操作には、宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、細胞を組換えポリヌクレオチド分子（「目的の遺伝子」）をコードする核酸でトランスフェクト、形質転換若しくは形質導入すること、及び／又は別の方法で改変すること（例えば、相同組換え及び遺伝子活性化、又は組換え細胞と非組換え細胞との融合によって）を含む。目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／又は細胞株を遺伝子操作するための方法及びベクターは当業者によく知られており、例えば、種々の技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、及び四半期アップデート）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５－６９に説明されている。この用語には、目的の遺伝子が存在する限り、元の親細胞と形態又は遺伝的構造が同一であるか否かに関わらず、親細胞の後代が含まれる。細胞培養液は、１つ以上の宿主細胞を含み得る。
【0073】
ＩＧＦ１Ｒと関連して本明細書で使用する場合、「構成的に活性」とは、細胞膜内の受容体の領域が近接し、それによって受容体がＩＧＦ－１結合の不在下で活性化状態となる立体構造にあることを指す。
【0074】
構成的に活性なＩＧＦ１Ｒ変異体
ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様増殖因子１受容体）とは、哺乳類細胞の表面に見られるタンパク質であり、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）と呼ばれるホルモンによって活性化される膜貫通受容体である。ＩＧＦ１Ｒは、チロシンキナーゼ受容体の大きなクラスに属する。ＩＧＦ－１は、インスリンと分子構造が類似したポリペプチドタンパク質ホルモンである。加えて、ＩＧＦ－１は、成体哺乳類の成長及び同化に重要な役割を果たしている。
ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様増殖因子１受容体）とは、哺乳類細胞の表面に見られるタンパク質であり、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）と呼ばれるホルモンによって活性化される膜貫通受容体である。ＩＧＦ１Ｒは、チロシンキナーゼ受容体の大きなクラスに属する。ＩＧＦ－１は、インスリンと分子構造が類似したポリペプチドタンパク質ホルモンである。加えて、ＩＧＦ－１は、成体哺乳類の成長及び同化に重要な役割を果たしている。
【0075】
２つのαサブユニットと２つのβサブユニットによってＩＧＦ１Ｒが構成されている。αサブユニットとβサブユニットのどちらもが、単一のｍＲＮＡ前駆体から合成される。次いで、前駆体がグリコシル化され、タンパク質分解的に切断され、システイン結合によって架橋されて機能的な膜貫通型のαβ鎖が形成される。Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ；４３７－４６２を参照されたい。α鎖は細胞外に位置しているが、βサブユニットは膜にまたがっており、リガンドが刺激されると細胞内シグナル伝達に関与する。α鎖は５つの細胞外ドメイン（Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２）に分けられ、その後に挿入ドメイン（ＩＤ）が続く一方で、β鎖は、細胞外のＦｎ２ドメイン及びＦｎ３ドメインから構成され、その後に膜貫通（ＴＭ）領域及びチロシンキナーゼドメインが続く。Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０３７７２を参照されたい。
【0076】
ＩＧＲ１ＲはＡＴＰ結合部位を有し、この部位は自己リン酸化のためのリン酸を供給するために用いられる。チロシン残基１１６５及び１１６６の自己リン酸化複合体の構造が、ＩＧＦ１Ｒキナーゼドメインの結晶内で同定されている。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ８（４０５）：ｒｓ１３を参照されたい。
【0077】
α鎖は、リガンドの結合に応答してβ鎖のチロシン自己リン酸化を誘導する。この事象は、細胞型に特異的ではあるが、細胞内シグナル伝達のカスケードを引き起こし、多くの場合細胞生存及び細胞増殖を促進する。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６（１）：３－３４及びＬｅＲｏｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６（２）：１４３－６３を参照されたい。
【0078】
組換えタンパク質のラージスケール生産において、細胞培養培地にＩＧＦ－１を補充することが一般的になっているのは、細胞増殖におけるこの効果によるものである。本開示により、ＩＧＦ１Ｒを強制的に構成的に活性な状態にすることにより、同様の増殖率及び生産性を維持しながら、ラージスケールでの組換えタンパク質の製造にＩＧＦ－１を低減又は省略できることが発見された。
【0079】
本明細書に開示される方法及び細胞株では、構成的に活性な任意のＩＧＦ１Ｒ変異体を使用することができる。そのような変異体は、ＩＧＦ－１の不在下で以下の特徴の１つ以上を有する：（１）各βサブユニットの膜貫通ドメインが互いに結合し、（２）受容体がリン酸化され、（３）シグナル伝達が開始する。構成的に活性なＩＧＦ１Ｒを生成するための方式としては、細胞外ドメイン全体を除去すること、Ｌ１ドメインなどの細胞外ドメインのより小さなフラグメントを除去すること、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーを長くすること、及びシステイン残基を挿入／欠失することによってα鎖内のジスルフィド結合を生成／除去することが含まれる。
【0080】
２つの例示的な変異が説明されている。Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０３７７２を参照されたい。１つ目は、α鎖のＬ１領域全体の欠失であり、これによってＴＭ領域を隔てるＬ１：ＦＮ２’－３’間のサブユニット間の相互作用が排除される。２つ目は、ＥＣＤとＴＭの間の細胞外膜近傍領域内に位置するＨ９０５Ｃ変異（ヒト配列内）である。
【0081】
これら２つの変異体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、それぞれ表１及び２に示す。
【0082】
【表1】
【0083】
【表2】
【0084】
【表3】
【0085】
【表4】
【0086】
【表5】
【0087】
【表6】
【0088】
【表7】
【0089】
【表8】
【0090】
【表9】
【0091】
【表10】
【0092】
【表11】
【0093】
【表12】
【0094】
【表13】
【0095】
【表14】
【0096】
【表15】
【0097】
【表16】
【0098】
【表17】
【0099】
【表18】
【0100】
【表19】
【0101】
【表20】
【0102】
【表21】
【0103】
【表22】
【0104】
【表23】
【0105】
【表24】
【0106】
本開示は、上記のアミノ酸配列のいずれかに対して１つ以上のアミノ酸置換を有するさらなる変異型ＩＧＦ１Ｒ配列を提供する。例えば、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、ＩＧＦ１Ｒ変異体が構成的に活性である限り、少なくとも１つの変異、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の変異を含むことができる。
【0107】
本開示はまた、上記の配列のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は約９０％超（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するさらなる変異型ＩＧＦ１Ｒ配列を提供する。
【0108】
本開示はまた、Ｌ１サブユニットが、Ｌ１の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００個のアミノ酸全体の欠失を含み、変異体が構成的に活性である、さらなるＩＧＦ１Ｒ欠失変異体を提供する。
【0109】
例示的な実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、上記のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸を類似した性質、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香族性を有する別のアミノ酸に置換することを意味するものであり、以下の５つの群のうちの１つの範囲内における交換を含む：
Ｉ．小型で脂肪族の無極性又は微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそれらのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型で脂肪族の無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
Ｉ．小型で脂肪族の無極性又は微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそれらのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型で脂肪族の無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
【0110】
例示的な実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体は、上記のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は非保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用する場合、「非保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書では、あるアミノ酸を異なる特性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香族性を有する別のアミノ酸に置換することとして定義され、上記の５つの群以外の交換を含む。
【0111】
ＩＧＦ１Ｒ変異体を含む哺乳類宿主細胞の生成
細胞内のＩＧＦ１Ｒ変異体の過剰発現（すなわち、細胞内の少なくとも１コピーの発現）は、一過性又は安定発現のいずれかによる周知の方法によって達成することができる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒＪ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。一実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体コード配列は、ゲノム標的領域の一方又は両方のアレルに安定的に組み込まれる。
細胞内のＩＧＦ１Ｒ変異体の過剰発現（すなわち、細胞内の少なくとも１コピーの発現）は、一過性又は安定発現のいずれかによる周知の方法によって達成することができる（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒＪ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。一実施形態では、ＩＧＦ１Ｒ変異体コード配列は、ゲノム標的領域の一方又は両方のアレルに安定的に組み込まれる。
【0112】
安定的に組み込むための方法は、当該技術分野においてよく知られている。要約すると、安定的な組み込みは、異種ポリヌクレオチド又は異種ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に一過性に導入することによって一般に達成され、これによって前記異種ポリヌクレオチドの細胞ゲノムへの安定的な組み込みが促進される。典型的には、異種ポリヌクレオチドは、相同性アーム、すなわち、組み込み部位に対して上流及び下流領域に相同な配列と隣接している。それらを哺乳類宿主細胞に導入する前に、環状ベクターを線状にし、細胞ゲノムへの組み込みを容易にしてもよい。ベクターを細胞に導入するための方法は、当該技術分野においてよく知られており、ウイルス送達などの生物学的方法、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質若しくはカチオン性アミノ酸を用いるような化学的方法；エレクトロポレーション若しくはマイクロインジェクションなどの物理的方法；又はプロトプラスト融合などの混合手法によるトランスフェクションが挙げられる。
【0113】
哺乳類細胞を安定的にトランスフェクトする場合、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技法に応じて、ごくわずかな細胞のみで外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことができることが知られている。こうした組み込み体を識別して選択するため、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性のための）をコードする遺伝子が目的遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸で安定的にトランスフェクトした細胞は、他の方法の中でも特に、薬物選択によって識別することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存することになるが、他の細胞は死滅する）。
【0114】
ベクターは、情報をコードするタンパク質を宿主細胞及び／又は特定の位置及び／又は宿主細胞内の区画に移行させ、且つ／又は輸送するために使用するのに好適な任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ウイルスカプシド、ビリオン、ネイキッドＤＮＡ、複合体を形成したＤＮＡなど）であってよい。ベクターは、ウイルス及び非ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクターを含んでもよい。ベクターは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクター及びクローニングベクターと呼ばれることが多い。ベクターを宿主細胞に導入してベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅させることができる。クローニングベクターは、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列及び選択マーカーが一般的に挙げられるが、これらに限定されない配列成分を含有し得る。これらのエレメントは、当業者により必要に応じて選択され得る。
【0115】
ベクターは、宿主細胞の形質転換に有用であり、そこに作動可能に連結された１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と協働して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含む。発現構築物は、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、そこに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得るがこれに限定されない。「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、それらの固有機能を果たすことができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター内の制御配列、例えばプロモーターは、この制御配列が正常に活性化することによってタンパク質コード配列の転写がもたらされ、コードされたタンパク質の組換え発現が生じるように配置される。
【0116】
ベクターは、用いられる特定の宿主細胞内で機能的となるように選択され得る（すなわち、ベクターは、宿主の細胞機構と適合し、遺伝子の増幅及び／又は発現を可能にし得る）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどのタンパク質レポーターを使用するタンパク質断片相補アッセイを使用するベクターが使用される（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号明細書を参照されたい）。好適な発現ベクターは、当該技術分野において公知であり、また市販されている。
【0117】
典型的には、宿主細胞に使用されるベクターは、プラスミドを維持するための配列と、外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列とを含む。このような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写及び翻訳制御配列、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、グリコシル化又は収量を改善するための様々なプレ配列又はプロ配列、ポリペプチドを分泌するための天然又は異種シグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）、三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＰＬ）及びアデノウイルス２型に由来するＶＡ遺伝子ＲＮＡ、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築してもよく、さらなるエレメントを個別に入手してベクターに連結してもよい。成分の各々を得るために使用される方法は、当業者によく知られている。
【0118】
ベクター成分は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は株に由来する）、異種（例えば宿主細胞種又は宿主細胞株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち２つ以上の供給源に由来する隣接配列の組み合わせ）、合成又は天然であり得る。ベクターにおいて有用な成分の配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼによってこれまでに確認されたもののような、当該技術分野で周知の方法によって得ることができる。加えて、それらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、及び／又は好適なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【0119】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）を特徴とするものである。このエレメントは、典型的には、プロモーターの３’側及び発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【0120】
複製起点は、宿主細胞内のベクターの増幅を補助する。それらは、市販の原核生物ベクターの一部として含まれていてもよく、また、公知の配列に基づいて化学的に合成してベクターに連結してもよい。種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、哺乳類細胞でベクターをクローニングするのに有用である。
【0121】
哺乳類宿主細胞の発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。一般に使用されるプロモーター及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２型、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するものである。例えば、前初期遺伝子１のヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーを使用することができる。例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１－９８を参照されたい。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、並びにポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を使用して、哺乳類宿主細胞に構造遺伝子配列を発現させるための他の遺伝エレメントを提供することができる。ウイルス初期及び後期プロモーターは、どちらもウイルスゲノムからフラグメントとして容易に得られるものであり、また、ウイルス複製起点を含み得るため特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３；Ｋａｕｆｍａｎ，１９９０，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７－５１１）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＳＶ４０ウイルス複製起点の部位に位置するＢｇｌＩ部位に向かって伸びるおよそ２５０ｂｐの配列が含まれているのであれば、より小さな又はより大きなＳＶ４０フラグメントも使用することができる。
【0122】
転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドをコードする領域の末端に対して３’側に位置し、転写を終結させる役割を果たす。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ－Ｃリッチフラグメントとそれに続くポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされるか、又はさらにベクターの一部として商業的に購入されるが、当業者に公知の核酸合成方法を使用して容易に合成することもできる。
【0123】
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、若しくはカナマイシンに対する耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完し；又は（ｃ）複合培地若しくは規定培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子がある。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞及び真核生物宿主細胞の双方における選択に使用することができる。
【0124】
他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖又は細胞生存にとって重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、継続する世代の組換え細胞の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳類細胞に好適な選択マーカーの例としては、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）／メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）系、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞の形質転換体を、その形質転換体のみが唯一ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように適合されている選択圧下に置く。培地中の選択薬剤濃度を連続的に増加させる条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧をかけ、それによって選択遺伝子と目的のタンパク質をコードするＤＮＡとの両方が増幅される。その結果、増幅されたＤＮＡから多量の目的のポリペプチドが合成される。
【0125】
真核生物の宿主細胞発現系にグリコシル化が所望されるような場合、グリコシル化又は収量を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができるが、これらもグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、発現に付随する１つ以上のさらなるアミノ酸を－１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に有し得るが、このアミノ酸は、完全に除去されていなくてもよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。或いは、いくつかの酵素切断部位を使用すると、成熟ポリペプチド内のそのような領域で酵素によって切断された場合、わずかにトランケートされた形態の所望のポリペプチドが生じ得る。
【0126】
発現及びクローニングは、典型的には、宿主生物によって認識され、目的のタンパク質をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子（一般に、約１００～１０００ｂｐ以内）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置し、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。従来、プロモーターは、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無、又は温度の変化などの培養条件のなんらかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの上昇を引き起こす。一方、構成的プロモーターは、作動可能に連結されている遺伝子を一律に、すなわち遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
【0127】
哺乳類宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモーターはよく知られており、以下に限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２型など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の好適な哺乳類プロモーターとしては、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。
【0128】
対象となり得るさらなるプロモーターとしては下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９－６６３）、ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４－１４４５）；グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）；メタロチオニン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９－４２）；及びβ－ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７－３７３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１－２５）。また、対象となるのは、組織特異性を示し、且つトランスジェニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域である：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９－４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５－５１５）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５－１２２）；リンパ球系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３－５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６－１４４４）；精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５－４９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８－２７６）；肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９－１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３－５８）；肝臓において活性なα１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１－１７１）；骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８－３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３－７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３－２８６）；及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２－１３７８）。
【0129】
高等真核生物による転写を増大させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入してもよい。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増大させる、通常約１０～３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、方向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側及び３’側の両方の位置に見出される。哺乳類遺伝子から入手できるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターを活性化するための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ベクターにおいてコード配列の５’側又は３’側のいずれに位置してもよいが、典型的には、プロモーターからの５’側の部位に位置する。
【0130】
目的のタンパク質の細胞外分泌を促進するために、適切な天然又は異種シグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を、発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、目的のタンパク質を産生する宿主細胞型に依存し、異種シグナル配列を天然のシグナル配列に置き換えることができる。哺乳類宿主細胞内で機能するシグナルペプチドの例としては、以下のものが挙げられる： 米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されているインターロイキン－７についてのシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されているインターロイキン－２受容体についてのシグナル配列；欧州特許第０３６７ ５６６号明細書に記載されているインターロイキン－４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されているＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０ ４６０ ８４６号明細書に記載されているＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド。
【0131】
哺乳類発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示されているさらなる制御配列としては、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．５２９－５３４（１９９７）；米国特許第６，３１２，９５１ Ｂ１号明細書、同第６，０２７，９１５号明細書、及び同第６，３０９，８４１ Ｂ１号明細書）並びに三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）（ＴＰＬ）及びアデノウイルス２型に由来するＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５－１３４９１）のようなエレメントが含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、ジシストロン性ｍＲＮＡを効率的に翻訳することが可能となる（Ｏｈ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５－３００；Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７－２７００）。
【0132】
構築後、１つ以上のベクターを増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な細胞に挿入してもよい。選択された細胞への発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウムによる共沈、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性送達、リポソーム媒介性トランスフェクション、微粒子銃、受容体－媒介性遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサン、及びペプチドによって媒介される送達を含む周知の方法によって行ってもよい。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞型に応じることになる。これらの方法及び他の好適な方法は、当業者によく知られており、マニュアル及びその他の技術出版物、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。
【0133】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように改変された場合、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、又は他の技法によって新しい遺伝物質を導入することにより、細胞がその天然状態から遺伝子改変された場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクション又は形質導入に続き、形質転換されたＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことにより、その細胞のＤＮＡで組換えられる可能性があるか、又はエピソームエレメントとして複製されることなく一過性に維持される可能性があるか、又はプラスミドとして独立して複製される可能性がある。形質転換ＤＮＡが細胞分裂しながら複製される場合、細胞は「安定的に形質転換」されているとみなされる。
【0134】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡ又は外因性ＤＮＡの取り込みを指す。多くのトランスフェクション技法が当該技術分野で公知であり、また、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上述）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。
【0135】
「形質導入」という用語は、これによってウイルスベクターを介して外来ＤＮＡが細胞に導入されるプロセスを指す。Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌを参照されたい。
【0136】
ＩＧＦ１Ｒ変異体は、ゲノム編集又は遺伝子編集によって内在性ＩＧＦ１Ｒを有する宿主細胞に導入することもできる。このようなゲノム編集技術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、ＰｈｉＣ３ファージインテグラーゼなどのインテグラーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥＳ）、配列特異的リコンビナーゼ、及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙなどのトランスポゾン／トランスポザーゼ系が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００３１１３２号明細書；国際公開第２０１８／０９８６７１号パンフレット；Ｉｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ ９１（４）：５０１－５１０；Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９－１５１２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６（２）：７５７－７６１；Ｗｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ；Ｖｏｌ：２０１１：Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ７１７０６９；Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ ４７８：３９１－３９６；Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１（１）：１１－２７；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｖｏｌ．８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，６４－７６；及びＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：３１０を参照されたい。
【0137】
宿主細胞は、内在性ＩＧＦ１Ｒを含むあらゆる細胞であってよい。遺伝子編集によって生成された点変異に関しては、宿主細胞種とＩＧＦ１Ｒ配列が確実に一致するように注意する必要がある。例えば、ヒトに関して前述したＨ９０５Ｃ変異は、対応するマウス配列内のＨ９０６Ｃ変異に関連付けられる。しかしながら、異なる種に由来するＩＧＦ１Ｒ配列を異なる種の宿主細胞株で使用することができる。例えば、下記の実施例では、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））のＩＧＦ１Ｒ変異配列をＣＨＯ細胞（モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ）属）で使用した。
【0138】
培養での増殖に好適な多種多様な哺乳類細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）及び販売業者から入手可能である。業界で一般的に使用されている細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養液中で増殖させるためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳類骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【0139】
商業用途のタンパク質のラージスケール生産は、典型的には懸濁培養で行われる。従って、本明細書に記載される組換え哺乳類細胞を生成するために使用される哺乳類宿主細胞は、懸濁培養における増殖に適合させることができるが、そうである必要はない。懸濁培養における増殖に適合した様々な宿主細胞は公知であり、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、並びにＣＦＩＯ－Ｓ、ＤＧ４４、及びＤＸＢ１１細胞株由来のＣＬＩＯ細胞が挙げられる。他の適切な細胞株としては、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＦ１Ｋ－２１細胞、ヒトＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ヒト胎児由来腎臓Ｆ１ＥＫ－２９３細胞、及び本明細書に開示される細胞株のいずれかに由来するか、又はそれらから操作された細胞株が挙げられる。
【0140】
ＣＨＯ細胞は、複雑な組換えタンパク質を生産するために広く使用されており、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）が含まれる。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０）であるＤＸＢ１１及びＤＧ－４４は、効率的なＤＨＦＲ選択可能及び増幅可能遺伝子発現系により、これらの細胞に高レベルの組換えタンパク質を発現させることができるため、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．，１９９０，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５３７－５６６）。また、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）をベースとしたメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択を利用した、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）ノックアウトＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株も含まれる。他の適切なＣＨＯ宿主細胞としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない（括弧内はＥＣＡＣＣアクセッション番号）：ＣＨＯ（８５０５０３０２）、ＣＨＯ（タンパク質フリー）（００１０２３０７）、ＣＨＯ－Ｋ１（８５０５１００５）、ＣＨＯ－Ｋ１／ＳＦ（９３０６１６０７）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ－（９４０６０６０７）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ－ＡＣ－フリー（０５０１１００２）、ＲＲ－ＣＨＯＫＩ（９２０５２１２９）。
【0141】
細胞培養プロセスについての説明
ＩＧＦ１Ｒ変異体を用いた本明細書に記載される方法及び細胞株により、目的のタンパク質を製造するために使用される細胞培養培地中のＩＧＦ－１の量を減少させることができる。典型的には、細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は０．１ｍｇ／Ｌである。本明細書で開示される方法では、細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、又は０．０１ｍｇ／Ｌ未満まで低減させることができる。特定の実施形態では、ＩＧＦ－１は細胞培養培地に必要とされず、すなわち細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は０ｍｇ／Ｌである。
ＩＧＦ１Ｒ変異体を用いた本明細書に記載される方法及び細胞株により、目的のタンパク質を製造するために使用される細胞培養培地中のＩＧＦ－１の量を減少させることができる。典型的には、細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は０．１ｍｇ／Ｌである。本明細書で開示される方法では、細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、又は０．０１ｍｇ／Ｌ未満まで低減させることができる。特定の実施形態では、ＩＧＦ－１は細胞培養培地に必要とされず、すなわち細胞培養培地中のＩＧＦ－１の濃度は０ｍｇ／Ｌである。
【0142】
本明細書に記載される方法では、細胞は、０．１ｍｇ／ＬのＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で、ＩＧＦ１Ｒ変異体を含まない同系統の細胞と同等の増殖率を有する。特定の実施形態では、増殖率は、生産の最初の５日間で１時間当たり０．０１５～０．０４である。特定の実施形態では、増殖率は、シードトレインでは１時間当たり０．０２２～０．０２５である。特定の実施形態では、細胞は、２３～３５時間の倍加時間を有する。
【0143】
本明細書に記載される方法では、細胞は、０．１ｍｇ／ＬのＩＧＦ－１を含む細胞培養培地中で、ＩＧＦ１Ｒ変異体を含まない同系統の細胞と同等の力価で目的の組換えタンパク質を生産する。特定の実施形態では、目的のタンパク質の力価は、培養の１０日後において少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、４５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、５５０ｍｇ／Ｌ、又は６００ｍｇ／Ｌである。
【0144】
本明細書に記載される方法では、低減した量のＩＧＦ－１を使用するか、又はＩＧＦ－１を全く使用しないことは、生産稼働の任意又は全ての段階で行うことができる。例えば、ＩＧＦ－１は、種スケール、生産スケール（Ｎ）、又はその間のどの時点においても（例えば、Ｎ－１、Ｎ－２など）、０．０３ｍｇ／Ｌ以下まで低減することができる。生産スケールでは、必要に応じて、初期細胞培養培地及び／又は灌流培地若しくは流加フィード培地中でＩＧＦ－１を低減させることができる。
【0145】
開示された方法は、撹拌槽リアクター（スピンフィルターを含んでもよいが、そうである必要はない従来の回分及び流加細胞培養を含む）、灌流システム（交互タンジェンシャルフロー（「ＡＴＦ」を含む）培養、音響灌流システム、デプスフィルター灌流システム、及び他のシステムを含む）、中空糸型バイオリアクター（ＨＦＢ、場合によっては灌流プロセスに用いてもよい）、並びに種々の他の細胞培養法（例えば、その全体が参考として本明細書に組み込まれる、Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：７５１－６５；Ｋｕｙｓｔｅｒｍａｎｓ ＆ Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ，（２０１１）“Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ” ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：２５－５２，Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ（ｅｄ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｃａｔａｐａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００９）“Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｃａｌｅ－Ｕｐ”ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｉｂｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）において増殖させる付着培養又は懸濁培養に適用可能である。
【0146】
組換えタンパク質を生産する間、細胞を所望の密度まで増殖させ、次いで、細胞がより多くの細胞を作る代わりに目的の組換えタンパク質を生産するようにエネルギー及び培養基を使用する、増殖が停止した高生産状態に細胞の生理学的状態を切り替える制御されたシステムを有することが望ましい。この目的を達成するための様々な方法が存在しており、温度変化及びアミノ酸欠乏、並びに細胞死を引き起こすことなく細胞の増殖を停止させることができる細胞周期阻害剤又は他の分子の使用が含まれる。
【0147】
組換えタンパク質の生産は、培養プレート、フラスコ、チューブ、バイオリアクター又は他の適切な容器内でタンパク質を発現する細胞の哺乳類細胞生産培養を確立することから始まる。典型的にはより小型の生産バイオリアクターが使用され、一実施形態では、バイオリアクターは５００Ｌ～２０００Ｌである。別の実施形態では、１０００Ｌ～２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。バイオリアクターの播種に用いられる種細胞密度は、生産される組換えタンパク質のレベルに良い影響を及ぼし得る。一実施形態では、無血清培養培地中に少なくとも０．５×１０６以下且つ３．０×１０６生存細胞／ｍＬ超でバイオリアクターに播種する。別の実施形態では、播種は、１．０×１０６生存細胞／ｍＬである。
【0148】
次いで、哺乳類細胞は指数増殖期を経る。細胞培養は、所望の細胞密度が達成されるまで、追加のフィードを行わずに維持され得る。一実施形態では、追加のフィードに関わらず、細胞培養を最大で３日間維持する。別の実施形態では、短期間の増殖期を伴わずに生産期を開始させるように、所望の細胞密度で培養物を播種することができる。本明細書の実施形態のいずれかでは、増殖期から生産期への切り替えは、前述の方法のいずれかにより開始させることもできる。
【0149】
増殖期から生産期の間の移行時、及び生産期の間、充填細胞容積率（％ＰＣＶ）は３５％以下である。生産期の間に維持される所望の充填細胞容積は、３５％以下である。一実施形態では、充填細胞容積は３０％以下である。別の実施形態では、充填細胞容積は２０％以下である。なお別の実施形態では、充填細胞容積は１５％以下である。さらなる実施形態では、充填細胞容積は１０％以下である。
【0150】
増殖期から生産期の間の移行時、及び生産期の間に維持される望ましい生存細胞密度は、プロジェクトに応じて様々であり得る。この望ましい生存細胞密度は、履歴データの対応する充填細胞容積に基づいて決定することができる。一実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～８０×１０６生存細胞／ｍＬである。一実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～７０×１０６生存細胞／ｍＬである。一実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～６０×１０６生存細胞／ｍＬである。一実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～５０×１０６生存細胞／ｍＬである。一実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～４０×１０６生存細胞／ｍＬである。別の実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～３０×１０６生存細胞／ｍＬである。別の実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約１０×１０６生存細胞／ｍＬ～２０×１０６生存細胞／ｍＬである。別の実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約２０×１０６生存細胞／ｍＬ～３０×１０６生存細胞／ｍＬである。別の実施形態では、生存細胞密度は、少なくとも約２０×１０６生存細胞／ｍＬ～少なくとも約２５×１０６生存細胞／ｍＬ、又は少なくとも約２０×１０６生存細胞／ｍＬである。
【0151】
生産期の間の充填細胞容積が少ないと、より高い細胞密度での灌流培養を妨げ得る溶存酸素のスパージングに関する問題を軽減することが助長される。また、充填細胞容積が少ないと、培地容積を少なくすることができ、これによってより小型の培地保存容器を使用することが可能となり、これをより遅い流量と組み合わせることができる。また、充填細胞容積が少ないと、より多量の細胞のバイオマス培養と比較して、回収及び下流プロセスに及ぼす影響も少なくなる。これらの全てにより、組換えタンパク質治療薬の製造に関連するコストが削減される。
【0152】
哺乳類細胞を培養することによって組換えタンパク質を生産するには、回分培養、流加培養、及び灌流培養という３つの方法が商業的なプロセスとして典型的に使用される。回分培養は、短期間で固定容積の培養培地中で細胞を増殖させた後に完全な回収を行う非連続的な方法である。回分法を用いて増殖させた培養物は、最大細胞密度に達するまで細胞密度の増大を経験し、その後、培地成分が消費され、且つ代謝副産物（乳酸及びアンモニアなど）のレベルが蓄積されるにつれて生存細胞密度が減少する。回収は、典型的には最大細胞密度に到達した時点で行われる（例えば、培地配合、細胞株などに応じて５×１０６細胞／ｍＬ以上）。回分プロセスは最も簡単な培養法であるが、生存細胞密度が栄養素利用性によって制限され、細胞が最大密度となった時点で培養物が減少し、生産が低下する。老廃物が蓄積し、栄養素が枯渇することによって培養物の急速な減少がもたらされるため、生産期を延長することはできない（典型的には約３～７日）。
【0153】
流加培養は、消費された培地成分を補充するためにボーラス培地又は連続培地のフィードを提供することによって、回分プロセスを改善するものである。流加培養は、稼働全体を通して追加の栄養素を受けるため、回分法と比較した場合に、高い細胞密度（培地配合、細胞株などに応じて＞１０～３０×１０６細胞／ｍｌ）及び生産力価の増大を達成する可能性がある。回分プロセスとは異なり、フィード方式及び培地配合を操作することによって二相培養を生成及び維持し、所望の細胞密度を達成するための細胞増殖期間（増殖期）と細胞増殖の停止又は停滞期間（生産期）とを区別することができる。そのため、回分培養と比較して、流加培養では、より高い生産力価を実現する可能性がある。典型的には、増殖期の間に回分法が用いられ、生産期の間に流加法が用いられるが、プロセス全体を通じて流加フィード方式を用いることができる。しかしながら、回分プロセスとは異なり、バイオリアクターの容積が制限要因となり、これによってフィード量が制限される。また、回分法と同様に、代謝副産物が蓄積することによって培養物が減少し、これによって生産期の期間が約１０～２１日に制限される。流加培養は不連続的なものであり、典型的には代謝副産物のレベル又は培養物の生存率が所定のレベルに達したときに回収が行われる。フィードを行わない回分培養と比較した場合、流加培養では、より大量の組換えタンパク質を生産することができる。例えば、米国特許第５，６７２，５０２号明細書を参照されたい。
【0154】
灌流法は、新鮮な培地を添加し、それと同時に使用済み培地を除去することにより、回分法及び流加法と比較して改善の可能性を提供するものである。典型的なラージスケールでの商業用細胞培養方式では、リアクター容積のほぼ３分の１から２分の１以上がバイオマスとなる６０～９０（＋）×１０６細胞／ｍＬという高い細胞密度を達成することを目指している。灌流培養によって＞１×１０８細胞／ｍＬという極限の細胞密度が達成されており、さらに高い密度が予測されている。典型的な灌流培養は、１日又は２日間続く回分培養を開始することから始まり、その後、培養物の増殖期及び生産期全体を通して、細胞及びさらなる高分子量化合物、例えばタンパク質（フィルターの分画分子量に基づく）を保持しながら、新鮮なフィード培地を培養液に連続的、段階的、及び／又は間欠的に添加し、それと同時に使用済み培地を除去する。細胞密度を維持しながら使用済み培地を除去するために、沈降、遠心分離、又は濾過などの様々な方法が使用され得る。１日当たりわずかな作業容積から最大で１日当たり多くの複数の作業容積の灌流流量が報告されている。
【0155】
灌流プロセスの利点は、生産培養を回分培養法又は流加培養法よりも長期間維持することができることである。しかしながら、さらに多くの栄養素も必要となる、特に高い細胞密度を有する長期間の灌流培養を支えるためには、増加した培地の調製、使用、保管及び廃棄が必要となり、これら全てによって回分法及び流加法と比較して生産コストがさらに高くなる。加えて、細胞密度が高いと、溶存酸素レベルの維持などの製造期間中の問題及びより多くの酸素を供給してより多くの二酸化炭素を除去するなどのガス処理の増加に伴う問題が引き起される可能性があり、これによってより泡が生じやすくなり、消泡方式を変更する必要性が生じる；同様に、回収及び下流プロセスの間に、過剰な細胞物質を除去するために必要とされる労力によって生産物の損失がもたらされる可能性があり、これによって細胞量の増加に起因して力価が増加するという利点が打ち消される。
【0156】
また、増殖期の間の流加フィードの後に生産期の間の連続灌流を組み合わせるラージスケールでの細胞培養方式も提供される。本方法は、細胞培養物を３５％以下の充填細胞容積で維持する生産期を目的とするものである。
【0157】
一実施形態では、増殖期の間に細胞培養を維持するために、ボーラスフィードによる流加培養が使用される。次いで、生産期の間に灌流フィードを使用することができる。一実施形態では、細胞が生産期に達したときに灌流を開始する。別の実施形態では、細胞培養の約３日目～約９日目に灌流を開始する。別の実施形態では、細胞培養の約５日目～約７日目に灌流を開始する。
【0158】
増殖期の間にボーラスフィードを使用すると、細胞を生産期に移行させることが可能となり、その結果、生産期を開始して制御する手段としての温度変化にそれほど依存しなくなるが、増殖期から生産期の間に約３６℃～約３１℃の温度変化が起こり得る。一実施形態では、この変化は３６℃～３２℃である。
【0159】
本明細書に記載されるように、無血清培養培地中に少なくとも０．５×１０６以下且つ３．０×１０６生存細胞／ｍＬ超、例えば、１．０×１０６生存細胞／ｍＬでバイオリアクターに播種することができる。
【0160】
灌流培養では、細胞培養物が新鮮な灌流フィード培地を受け入れながら、同時に使用済み培地が除去される。灌流は、連続的、段階的、断続的であってよいか、又はこれらのいずれか若しくは全ての組み合わせであってよい。灌流速度は、１日当たりの作業容積未満から数作業容積であり得る。細胞は培養液中に保持され、除去される使用済み培地は細胞を実質的に含まないか、又は培養物よりも極めて少ない細胞を有する。細胞培養により発現させた組換えタンパク質もまた、培養液中に保持され得る。灌流は、遠心分離、沈降、又は濾過を含む多くの手段によって達成することができ、例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８２：７５１－６５を参照されたい。濾過方法の一例としては、交互タンジェンシャルフロー濾過がある。交互タンジェンシャルフローは、中空繊維フィルターモジュールを通して培地をポンプ注入することにより維持される。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号明細書；Ｆｕｒｅｙ，２００２，Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７）：６２－６３を参照されたい。
【0161】
「灌流流量」とは、バイオリアクターを通過した（添加及び除去された）培地の量であり、典型的には、所定時間内の一部又は複数の作業容積で表される。「作業容積」とは、細胞培養に使用されるバイオリアクターの容積の量を指す。一実施形態では、灌流流量は１日当たり１作業容積以下である。灌流フィード培地は、灌流栄養素濃度を最大化して、灌流速度を最小化するように配合することができる。
【0162】
細胞培養液に、細胞培養の生産期の過程の間に消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含む濃縮フィード培地を補充することができる。
【0163】
濃縮フィード培地は、ほとんどのあらゆる細胞培養培地配合物を基準にしてもよい。このような濃縮フィード培地は、細胞培養培地の成分の大部分を、例えばそれらの通常量の約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、又はさらに約１０００倍で含み得る。濃縮フィード培地は、多くの場合、流加培養プロセスで使用される。
【0164】
倍加期の培養プロセスにおける組換えタンパク質の生産を改善するために、本発明による方法を使用してもよい。倍加段階のプロセスでは、細胞は、２以上の異なる期で培養される。例えば、細胞は、最初に細胞繁殖及び生存率を最大化させる環境条件下で１以上の増殖期で培養され、次いでタンパク質の生産を最大化する条件下で生産期に移行され得る。哺乳類細胞によってタンパク質を生産するための商業的プロセスでは、最終的な生産培養に先行する異なる培養容器内で生じる、複数の、例えば少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の増殖期が一般的である。
【0165】
増殖期及び生産期は、１以上の移行期に先行するか、又は１以上の移行期と隔てられていてもよい。倍加期プロセスでは、本発明による方法は、少なくとも商業用細胞培養の増殖期及び最終生産期の生産期の間に使用することができるが、増殖期に先行して使用することもできる。生産期は、ラージスケールで実施することができる。ラージスケールプロセスは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの容積で実施することができる。一実施形態では、生産は５００Ｌ、１０００Ｌ及び／又は２０００Ｌのバイオリアクター内で実施される。
【0166】
増殖期は、生産期よりも高温で起こり得る。例えば、増殖期は、約３５℃～約３８℃の第１の温度で起こり得、生産期は、約２９℃～約３７℃、任意選択により約３０℃～約３６℃、又は約３０℃～約３４℃の第２の温度で起こり得る。加えて、例えば、カフェイン、ブチレート、及びヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質生産の化学的誘導物質を、温度変化と同時に、その前に、及び／又はその後に添加してもよい。誘導剤が温度変化の後に添加される場合は、それらを温度変化の１時間～５日後、任意選択により温度変化の１～２日後に添加することができる。細胞培養は、細胞に所望のタンパク質を生産させながら、数日又はさらに数週間維持することができる。
【0167】
当該技術分野において公知の分析技術のいずれかを使用して、細胞培養物由来の試料を監視及び評価することができる。組換えタンパク質並びに培地の品質及び特性を含む様々なパラメーターを培養期間に監視することができる。試料は、連続監視、リアルタイム又はほぼリアルタイムなどの望ましい頻度で断続的に採取し、監視することができる。
【0168】
典型的には、最終生産培養前の細胞培養（Ｎ－ｘ～Ｎ－１）を用いて、生産バイオリアクターに播種するのに用いられる種細胞を生成する（Ｎ－１培養）。種細胞密度は、生産される組換えタンパク質のレベルに良い影響を及ぼし得る。生産レベルは、種密度が増加するにつれて高くなる傾向がある。力価の向上は、高い種密度と結び付けられるだけでなく、生産のために投入された細胞の代謝及び細胞周期の状態にも影響する可能性がある。
【0169】
種細胞は、任意の培養方法によって生成することができる。そのような方法の１つとしては、交互タンジェンシャルフロー濾過を用いた灌流培養がある。交互タンジェンシャルフロー濾過を使用してＮ－１バイオリアクターを稼働させ、生産バイオリアクターに播種するための高密度の細胞を提供することができる。Ｎ－１段階により、細胞を＞９０×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖させることができる。Ｎ－１バイオリアクターは、ボーラス種培養液を生成するために使用することができ、又は複数の生産バイオリアクターに高い種細胞密度で播種するために維持することができる回転種ストック培養として使用することができる。生産物の増殖段階の期間は７日～１４日の範囲であってよく、生産バイオリアクターの播種前に細胞を指数増殖状態に維持するように設計してもよい。細胞を増殖させるために、灌流速度、培地配合及びタイミングを最適化し、生産の最適化を最も促しやすい状態で細胞を生産バイオリアクターに送達する。種細胞密度を＞１５×１０６細胞／ｍＬとすることによって、生産バイオリアクターの播種を達成することができる。播種時の種細胞密度を高くすることで、所望の生産密度に到達するために必要とされる時間を低減するか、又はさらにこのような時間を削減することが可能となる。
【0170】
特定の実施形態では、本開示の哺乳類宿主細胞及び方法は、高収量の目的のタンパク質を生成するために使用することができる。高収量、又は高容積生産性とは、細胞が高レベルの目的のタンパク質を生産する能力を指す。特定の収量は、目的のタンパク質に依存するものであり、哺乳類宿主細胞に好適なフィード培地を使用し、且つ、ＩＧＦ－１を低減させた量を含むか又はＩＧＦ－１を欠きながら、アミノ酸、ビタミン、又は微量元素を含む流加又は灌流条件で増殖させた１０日目の培養液中で少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．１５ｇ／Ｌ、少なくとも０．２ｇ／Ｌ、少なくとも０．２５ｇ／Ｌ、少なくとも０．３ｇ／Ｌ、少なくとも０．３５ｇ／Ｌ、少なくとも０．４ｇ／Ｌ、少なくとも０．４５ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、又はそれ以上であり得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞及び方法は、目的のタンパク質を発現し、上記に記載される培養条件下で増殖させた場合に、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも０．６ｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｇ／Ｌ、少なくとも０．９ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、又はそれ以上、好ましくは最大で約３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、又は１０ｇ／Ｌを生産することが可能である。
【0171】
収量はまた、細胞株の特定の生産性の観点から測定することができ、１日当たりの細胞によって生産されるタンパク質の量に基づいて決定される（ｐｇ／細胞／日として表される）。本開示の哺乳類宿主細胞は、哺乳類宿主細胞に好適なフィード培地を使用し、且つ、ＩＧＦ－１を低減させた量を含むか又はＩＧＦ－１を欠きながら、アミノ酸、ビタミン、又は微量元素を含む流加又は灌流条件で増殖させた１０日目の培養液中で少なくとも１ｐｇ／細胞／日、少なくとも２ｐｇ／細胞／日、少なくとも３ｐｇ／細胞／日、少なくとも４ｐｇ／細胞／日、少なくとも５ｐｇ／細胞／日、少なくとも６ｐｇ／細胞／日、少なくとも７ｐｇ／細胞／日、少なくとも８ｐｇ／細胞／日、少なくとも９ｐｇ／細胞／日、少なくとも１０ｐｇ／細胞／日、少なくとも１１ｐｇ／細胞／日、少なくとも１２ｐｇ／細胞／日、少なくとも１３ｐｇ／細胞／日、少なくとも１４ｐｇ／細胞／日、少なくとも１５ｐｇ／細胞／日、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日、少なくとも２５ｐｇ／細胞／日、又はそれ以上、好ましくは最大で５０ｐｇ／細胞／日を生産することが可能である。特定の実施形態では、本開示の哺乳類宿主細胞は、目的のタンパク質を発現し、上記に記載される培養条件下で少なくとも１０ｐｇ／細胞／日、少なくとも１１ｐｇ／細胞／日、少なくとも１２ｐｇ／細胞／日、少なくとも１３ｐｇ／細胞／日、少なくとも１４ｐｇ／細胞／日、少なくとも１５ｐｇ／細胞／日、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日、少なくとも２５ｐｇ／細胞／日、又はそれ以上、好ましくは最大で５０ｐｇ／細胞／日の比生産性を有する。
【0172】
目的のタンパク質
目的のポリペプチド及びタンパク質は、タンパク質ベースの治療薬を含む科学的又は商業的な目的のものであってもよい。目的のタンパク質は、とりわけ、分泌タンパク質、非分泌タンパク質、細胞内タンパク質、又は膜結合型タンパク質を含む。目的のポリペプチド及びタンパク質は、細胞培養法を用いる組換え動物細胞株によって産生することができ、「組換えタンパク質」と称され得る。発現タンパク質は、細胞内で産生されもよいか、又は培養培地中に分泌されてもよく、そこから回収及び／又は収集することができる。「単離されたタンパク質」又は「単離された組換えタンパク質」という用語は、その治療的、診断的、予防的、研究又は他の使用を妨げるタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質から精製される、目的のポリペプチド又はタンパク質を指す。目的のタンパク質は、特に、そこから誘導される標的、それらに関連する標的、及びそれらの改変を含む、とりわけ下記に列挙される標的に結合することによって治療効果を発揮するタンパク質を含む。
目的のポリペプチド及びタンパク質は、タンパク質ベースの治療薬を含む科学的又は商業的な目的のものであってもよい。目的のタンパク質は、とりわけ、分泌タンパク質、非分泌タンパク質、細胞内タンパク質、又は膜結合型タンパク質を含む。目的のポリペプチド及びタンパク質は、細胞培養法を用いる組換え動物細胞株によって産生することができ、「組換えタンパク質」と称され得る。発現タンパク質は、細胞内で産生されもよいか、又は培養培地中に分泌されてもよく、そこから回収及び／又は収集することができる。「単離されたタンパク質」又は「単離された組換えタンパク質」という用語は、その治療的、診断的、予防的、研究又は他の使用を妨げるタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質から精製される、目的のポリペプチド又はタンパク質を指す。目的のタンパク質は、特に、そこから誘導される標的、それらに関連する標的、及びそれらの改変を含む、とりわけ下記に列挙される標的に結合することによって治療効果を発揮するタンパク質を含む。
【0173】
目的のタンパク質は、「抗原結合タンパク質」を含む。抗原結合タンパク質は、結合する別の分子（抗原）に親和性を有する抗原結合領域又は抗原結合部分を含むタンパク質又はポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質は、抗体、ペプチボディ、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体アナログ、融合タンパク質（単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、二重鎖（二価）ｓｃＦｖ、及びＩｇＧｓｃＦｖ（例えば、Ｏｒｃｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３：２２１－２２８を参照されたい）を含む）、ヘテロＩｇＧ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０：７５３５－７５６２を参照されたい）、ムテイン、並びにＸｍＡｂ（登録商標）（Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）を包含する。また、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））、半減期延長などの延長を有する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、例えばＨＬＥ ＢｉＴＥ、ＨｅｔｅｒｏＩｇ ＢＩＴＥなど、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、ＣＡＲ Ｔ）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含まれる。
【0174】
ｓｃＦｖは、共に連結された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する単鎖抗体フラグメントである。米国特許第７，７４１，４６５号明細書及び同第６，３１９，４９４号明細書、並びにＥｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ４５：１３１－１３６を参照されたい。ｓｃＦｖは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持している。
【0175】
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ若しくはサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方、又は特異的結合についてインタクト抗体と競合するこれらの抗原結合領域への言及を含む。特に指定のない限り、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、多特異性、モノクローナル、ポリクローナル、ヘテロＩｇＧ、二重特異性、及びそれらのオリゴマー又は抗原結合フラグメントを含む。抗体は、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３又はｌｇＧ４型を含む。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、単鎖抗体分子、単一ドメインＶＨＨ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどの抗原結合フラグメント又は領域を有するタンパク質、及び標的ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドも含まれる。
【0176】
また、ヒトに投与した場合に著しく有害な免疫応答を生じない、ヒト、ヒト化、及び他の抗原結合タンパク質、例えばヒト及びヒト化抗体も含まれる。
【0177】
また、非共有結合、共有結合、又は共有結合と非共有結合の両方によって化学的に修飾されるタンパク質などの修飾タンパク質も含まれる。また、細胞改変システムによって生成され得る１つ以上の翻訳後修飾、又は酵素及び／若しくは化学的方法によってエクスビボで導入されるか若しくは他の方法で導入される修飾をさらに含むタンパク質も含まれる。
【0178】
目的のタンパク質はまた、例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分などの多量体化ドメインを含む組換え融合タンパク質を含んでもよい。また、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）のアミノ酸配列の全て若しくは一部を含むタンパク質又はそれらのリガンド或いはこれらのいずれかと実質的に同様なタンパク質も含まれる。
【0179】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子を含んでもよい。このようなＧ－ＣＳＦ剤には、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）及びＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグフィルグラスチム）が含まれるが、これらに限定されない。また、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチンアルファ）、Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）、Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）、Ｈｅｍａｔｉｄｅ（登録商標）、ＭＲＫ－２５７８、ＩＮＳ－２２、Ｒｅｔａｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンゼータ）、Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）、Ｓｉｌａｐｏ（登録商標）（エポエチンゼータ）、Ｂｉｎｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）、エポエチンアルファＨｅｘａｌ、Ａｂｓｅａｍｅｄ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ｒａｔｉｏｅｐｏ（登録商標）（エポエチンシータ）、Ｅｐｏｒａｔｉｏ（登録商標）（エポエチンシータ）、Ｂｉｏｐｏｉｎ（登録商標）（エポエチンシータ）、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンゼータ、エポエチンシータ、及びエポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト、並びにそれらの分子又は変異体又は類似体及び前述のいずれかのバイオシミラーなどの赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）も含まれる。
【0180】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、１つ以上のＣＤタンパク質、ＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、細胞接着分子、増殖因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子、骨誘導性因子、インスリン及びインスリン関連タンパク質、凝固及び凝固関連タンパク質、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、他の血液及び血清タンパク質、血液型抗原；受容体、受容体関連タンパク質、成長ホルモン、成長ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体；神経栄養因子、ニューロトロフィン、リラキシン、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス抗原、リポタンパク質、インテグリン、リウマチ因子、免疫毒素、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、並びにイムノアドヘシンに特異的に結合するタンパク質を含んでもよい。
【0181】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、単独で又は任意の組み合わせで、以下のうちの１つ以上に結合する：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、及びＣＤ１７４を含むがこれらに限定されないＣＤタンパク質、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４を含むＨＥＲ受容体ファミリータンパク質、及びＥＧＦ受容体であるＥＧＦＲｖＩＩＩ、細胞接着分子、例えばＬＦＡ－１、Ｍｏｌ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、及びαｖ／β３インテグリン、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）を含むがこれらに限定されない増殖因子；ＶＥＧＦＲ２、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー抑制物質、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＮＧＦ－βなどの神経成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦを含む線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｃｒｉｐｔｏ、とりわけ、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４又はＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βを含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳内ＩＧＦ－Ｉ）及び骨形成促進因子、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン及びインスリン様増殖因子結合タンパク質を含むがこれらに限定されないインスリン及びインスリン関連タンパク質、凝固及び凝固関連タンパク質、例えばとりわけ第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子、プロテインＣ、α－１－アンチトリプシン、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ－ＰＡ」）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンバジン、トロンビン、トロンボポエチン、及びトロンボポエチン受容体、とりわけ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＧ－ＣＳＦを含むコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アルブミン、ＩｇＥ及び血液型抗原を含むがこれらに限定されない他の血液及び血清タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、成長ホルモン受容体及びＴ細胞受容体を含む受容体及び受容体関連タンパク質；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びニューロトロフィン－３、－４、－５又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５又はＮＴ－６）を含むがこれらに限定されない神経栄養因子；リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖及びプロレラキシン、例えば、インターフェロン－α、－β及び－γを含むインターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ１－Ｒ１、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－４受容体及び／又はＩＬ－１３から受容体であるＩＬ－１３ＲＡ２又はＩＬ－１７受容体、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原を含むがこれらに限定されないウイルス抗原、リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、腫瘍壊死因子－α及び－β、エンケファリナーゼ、ＢＣＭＡ、Ｉｇκ、ＲＯＲ－１、ＥＲＢＢ２、メソセリン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮａｓｅ、ＦＲ－α、インヒビン及びアクチビン、インテグリン、プロテインＡ若しくはＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドディスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、ＭＩＣ（ＭＩＣ－ａ、ＭＩＣ－Ｂ）、ＵＬＢＰ １～６、ＥＰＣＡＭ、アドレシン、制御タンパク質、イムノアドヘシン、抗原結合タンパク質、ソマトロピン、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ４、エオタキシン－１、ＭＵＣ１、ＣＥＡ、ｃ－ＭＥＴ、クローディン－１８、ＧＰＣ－３、ＥＰＨＡ２、ＦＰＡ、ＬＭＰ１、ＭＧ７、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣＡ、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＭ２、ＢＡＦＦ、ＯＰＧＬ（ＲＡＮＫＬ）、ミオスタチン、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ－１）、Ａｎｇ２、ＮＧＦ、ＩＧＦ－１受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ｃ－Ｋｉｔ、Ｂ７ＲＰ－１、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄ－１、プログラム細胞死タンパク質１及びリガンド、ＰＤ１及びＰＤＬ１、マンノース受容体／ｈＣＧβ、Ｃ型肝炎ウイルス、メソセリンｄｓＦｖ［ＰＥ３８］コンジュゲート、レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ｌｌｙ）、ＩＦＮγ、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＩＦＮＡＲ、ＴＡＬＬ－１、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、幹細胞因子、Ｆｌｔ－３、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ＯＸ４０Ｌ、α４β７、血小板特異的血小板糖タンパクＩｉｂ／ＩＩＩｂ（ＰＡＣ－１）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＦＧβ）、透明帯精子結合タンパク質３（ＺＰ－３）、ＴＷＥＡＫ、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）、スクレロスチン並びに前述のいずれかの生物活性フラグメント又は変異体。
【0182】
別の実施形態では、目的のタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフリベルセプト、アレムツズマブ、アリロクマブ、アナキンラ、アタシセプト、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビオソズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カンツズマブメルタンシン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、コナツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エタネルセプト、エボロクマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、レルデリムマブ、ルミリキシマブ、イキセキズマブ（ｌｘｄｋｉｚｕｍａｂ）、マパツムマブ、モテサニブ二リン酸、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ネシリチド、ニモツズマブ、ニボルマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オプレルベキン、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ラニビズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロミプロスチム、ロモソズマブ、サルグラモスチム、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ザノリムマブ、ザルツムマブ、及び前述のいずれかのバイオシミラーを含む。
【0183】
本発明による目的のタンパク質は、前述の全てを包含し、上述の抗体のいずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５、又は６を含む抗体をさらに含む。また、目的のタンパク質の参照アミノ酸配列に対して７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらにより具体的には９５％以上、詳細には９７％以上、より詳細には９８％以上、さらにより詳細には９９％以上のアミノ酸配列が同一である領域を含む変異体も含まれる。この点に関する同一性は、様々なよく知られ且つ容易に利用可能なアミノ酸配列分析ソフトウェアを使用して特定することができる。好ましいソフトウェアには、配列の検索及び整列に関する問題に対する満足な解決策と考えられている、スミス－ウォーターマンアルゴリズムを実装するものが含まれる。特に速度が重要な考慮事項である場合は、他のアルゴリズムを用いてもよい。この点に関して用いることができる、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びポリペプチドのアライメント及び相同性マッチングに一般に用いられるプログラムには、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＰＲＯＳＲＣＨ、ＢＬＡＺＥ及びＭＰＳＲＣＨが含まれ、後者は、ＭａｓＰａｒによって製造された超並列プロセッサ上で実行するためにスミス－ウォーターマンアルゴリズムが実装されている。
【0184】
目的のタンパク質には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ又はＣＡＲ－Ｔ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの遺伝子操作された受容体、並びにその標的抗原と相互作用する抗原結合分子を含む他のタンパク質も含まれ得る。ＣＡＲは、その標的抗原と相互作用する抗原結合分子を組み込むことにより、抗原（細胞表面抗原など）に結合するように操作することができる。ＣＡＲは、典型的には、１つ以上の共刺激（「シグナル伝達」）ドメイン及び１つ以上の活性化ドメインとタンデムに抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖなど）を組み込むものである。
【0185】
好ましくは、抗原結合分子は、その抗体フラグメントであり、より好ましくは１つ以上の単鎖抗体フラグメント（「ｓｃＦｖ」）である。ｓｃＦｖは、他のＣＡＲ成分と共に単鎖の一部として発現するように操作することができるため、キメラ抗原受容体に使用することが好ましい。Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８（４）；６１９－６２６；Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１；２７９１－２７９７を参照されたい。
【0186】
キメラ抗原受容体は、その効能を高めるために、１つ以上の共刺激（シグナル伝達）ドメインを組み込んでいる。米国特許第７，７４１，４６５号明細書及び同第６，３１９，４９４号明細書、並びにＫｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（上記）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６；Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３，及びＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３を参照されたい。好適な共刺激ドメインは、供給源の中でもとりわけ、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｔ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（α、β、δ、ε、γ、ζ）、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８））、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇα（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｃγ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ、ＴＮＦｒ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ－ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、４１－ＢＢ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、又はこれらのフラグメント若しくは組み合わせに由来するものであり得る。共刺激ドメインは、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分の１つ以上を含み得る。
【0187】
また、ＣＡＲには１つ以上の活性化ドメインが含まれる。ＣＤ３ゼータは、天然Ｔ細胞上のＴ細胞受容体のエレメントであり、ＣＡＲにおいて重要な細胞内活性化エレメントであることが証明されている。
【0188】
ＣＡＲは、細胞外ドメインを含み、典型的には目的の抗原を認識して結合することができる抗原結合タンパク質を含み、「ヒンジ」領域も含む膜貫通タンパク質である。加えて、膜貫通ドメイン及び細胞内（細胞質）ドメインがある。
【0189】
細胞外ドメインは、シグナル伝達に有用なものであり、且つ本明細書に記載される任意のタンパク質又はそれらの任意の組み合わせに由来する抗原に対してリンパ球が効率的に応答するのに有益なものである。細胞外ドメインは、合成の供給源又は天然の供給源のいずれか、例えば、本明細書に記載されるタンパク質に由来するものであってよい。細胞外ドメインは、ヒンジ部分を含むことが多い。ヒンジ部分は、細胞外ドメインの一部であり、「スペーサー」領域と称する場合がある。ヒンジは、標的細胞から所望の特定の距離を達成するような、本明細書に記載されるようなタンパク質、特に上記に記載した共刺激タンパク質、並びに免疫グロブリン（Ｉｇ）配列又は他の好適な分子に由来するものであってよい。
【0190】
膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合されていてもよい。同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合されていてもよい。膜貫通ドメインは、合成の供給源又は天然の供給源のいずれか、例えば、本明細書に記載されるタンパク質、特に上記に記載した共刺激タンパク質に由来するものであってよい。
【0191】
細胞内（細胞質）ドメインは、膜貫通ドメインに融合されていてもよく、免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化をもたらすことができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。細胞内ドメインは、本明細書に記載されるタンパク質、特にＣＤ３に由来するものであってよい。
【0192】
本発明によるポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、免疫細胞、組成物などを作製するために、様々な公知の技法を利用することができる。
【0193】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図されている本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の方法及び構成要素が本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に図示され記載されるものに加えて、本発明の様々な変更形態は、上述の説明及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【実施例】
【0194】
実施例１：ＩＧＦ１Ｒ変異細胞株の構築
ＣＨＯ ＣＳ９及びＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主細胞株のバックグラウンドでＩＧＦＲ変異体を過剰発現する細胞株を、細胞培養培地にＩＧＦ－１リガンドを補充する必要のない、受容体を構成的に活性な状態に保持するＩＧＲ１Ｒの変異体を使用して構築した。ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃと命名されたこれら２つの変異体（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｅＬｉｆｅ ３；ｅ０３７７２を参照されたい）をベクターにクローニングし、ＣＨＯ宿主細胞株で過剰発現させた。
ＣＨＯ ＣＳ９及びＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主細胞株のバックグラウンドでＩＧＦＲ変異体を過剰発現する細胞株を、細胞培養培地にＩＧＦ－１リガンドを補充する必要のない、受容体を構成的に活性な状態に保持するＩＧＲ１Ｒの変異体を使用して構築した。ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃと命名されたこれら２つの変異体（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｅＬｉｆｅ ３；ｅ０３７７２を参照されたい）をベクターにクローニングし、ＣＨＯ宿主細胞株で過剰発現させた。
【0195】
ＩＧＦ１Ｒ変異体Ｈ９０５Ｃ（Ｈ９０６Ｃ）及びｄｅｌＬ１プラスミドの構築
２つのＩＧＦ１Ｒ変異配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０５１３から得られた野生型（ｗｔ）マウスＩＧＲ１Ｒのヌクレオチド配列に基づく。始まりから終わりまでの全配列を、クローニングと独立したライゲーションを容易にするためにフラグメント間に２０塩基のオーバーラップを含む、ヌクレオチド１～２０２８からなるＩＧＦ１Ｒ－１とヌクレオチド２００８～４１１０からなるＩＧＦ１Ｒ－２との２つのフラグメントとして合成した。ｄｅｌＬ１のヌクレオチド配列は、９０塩基のＩＧＦ１Ｒ天然シグナルペプチドから始まり、ｗｔ配列の６９１塩基にジャンプしている。このことは、成熟ＩＧＦ１Ｒタンパク質の最初の２００アミノ酸（Ｌ１領域として同定されている）の欠失に相当する。ヒトＩＧＦ１Ｒで同定されたＨ９０５Ｃ変異は、マウス配列ではＨ９０６Ｃに相当する。Ｈ９０６Ｃの塩基配列では、ｗｔのＩＧＦ１Ｒ配列の２８０６～２８０７位のヌクレオチドＣ及びＡがそれぞれＴ及びＧに変更されており、成熟タンパク質におけるＨ９０６Ｃのアミノ酸変化に相当する。Ｈ９０６Ｃは、全ての実験でＨ９０５Ｃと称される。合成したフラグメントからＰＣＲフラグメントを増幅し、次いで組み込みベクターであるｐＰＴ１．３４．７ＧＧ（例えば、米国特許第１０，２０２，６１６号明細書を参照されたい）のＳａｌＩ及びＮｏｔＩ部位の間にクローニングした。図１Ａ～Ｂを参照されたい。
２つのＩＧＦ１Ｒ変異配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１０５１３から得られた野生型（ｗｔ）マウスＩＧＲ１Ｒのヌクレオチド配列に基づく。始まりから終わりまでの全配列を、クローニングと独立したライゲーションを容易にするためにフラグメント間に２０塩基のオーバーラップを含む、ヌクレオチド１～２０２８からなるＩＧＦ１Ｒ－１とヌクレオチド２００８～４１１０からなるＩＧＦ１Ｒ－２との２つのフラグメントとして合成した。ｄｅｌＬ１のヌクレオチド配列は、９０塩基のＩＧＦ１Ｒ天然シグナルペプチドから始まり、ｗｔ配列の６９１塩基にジャンプしている。このことは、成熟ＩＧＦ１Ｒタンパク質の最初の２００アミノ酸（Ｌ１領域として同定されている）の欠失に相当する。ヒトＩＧＦ１Ｒで同定されたＨ９０５Ｃ変異は、マウス配列ではＨ９０６Ｃに相当する。Ｈ９０６Ｃの塩基配列では、ｗｔのＩＧＦ１Ｒ配列の２８０６～２８０７位のヌクレオチドＣ及びＡがそれぞれＴ及びＧに変更されており、成熟タンパク質におけるＨ９０６Ｃのアミノ酸変化に相当する。Ｈ９０６Ｃは、全ての実験でＨ９０５Ｃと称される。合成したフラグメントからＰＣＲフラグメントを増幅し、次いで組み込みベクターであるｐＰＴ１．３４．７ＧＧ（例えば、米国特許第１０，２０２，６１６号明細書を参照されたい）のＳａｌＩ及びＮｏｔＩ部位の間にクローニングした。図１Ａ～Ｂを参照されたい。
【0196】
ＣＨＯ ＣＳ９及びＧＳＫＯプラットフォーム宿主へのＩＧＦ１Ｒ変異体のトランスフェクション及び細胞培養
ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃの線状化プラスミドを、ＣＨＯ ＣＳ９ ｄｈｆｒ－宿主（Ｆｏｍｉｎａ－Ｙａｄｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １１１：９６５－９７９を参照されたい）及びＣＨＯ ＧＳＫＯ（グルタミンシンテターゼノックアウト）宿主の両方にエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトのため、エレクトロポレーションキュベット内で混合した約２×１０７個の細胞及び約２５μｇのＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ装置（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて３１７５ｕＦ（静電容量）、２００ボルト及び７００オーム（抵抗）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を直ちにＴフラスコ内の予熱した培地に移した。３６℃及び５％のＣＯ２で３日間、９．５ｍＭのグリシン、０．２ｍＭのチミジン及び２ｍＭのヒポキサンチン（ＣＨＯ ｄｈｆｒ－）又は５ｍＭのグルタミン（ＣＨＯ ＧＳＫＯ）及びＩＧＦ－１のいずれかを補充した非選択増殖培地中で細胞を回復させた。細胞生存率は、製造業者の指示書に従って、ＶｉＣＥＬＬ（商標）ＸＲ細胞生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。
ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃの線状化プラスミドを、ＣＨＯ ＣＳ９ ｄｈｆｒ－宿主（Ｆｏｍｉｎａ－Ｙａｄｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １１１：９６５－９７９を参照されたい）及びＣＨＯ ＧＳＫＯ（グルタミンシンテターゼノックアウト）宿主の両方にエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトのため、エレクトロポレーションキュベット内で混合した約２×１０７個の細胞及び約２５μｇのＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ装置（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて３１７５ｕＦ（静電容量）、２００ボルト及び７００オーム（抵抗）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を直ちにＴフラスコ内の予熱した培地に移した。３６℃及び５％のＣＯ２で３日間、９．５ｍＭのグリシン、０．２ｍＭのチミジン及び２ｍＭのヒポキサンチン（ＣＨＯ ｄｈｆｒ－）又は５ｍＭのグルタミン（ＣＨＯ ＧＳＫＯ）及びＩＧＦ－１のいずれかを補充した非選択増殖培地中で細胞を回復させた。細胞生存率は、製造業者の指示書に従って、ＶｉＣＥＬＬ（商標）ＸＲ細胞生存率アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて測定した。
【0197】
ルーチン培養のため、細胞を選択培地中に懸濁状態にして培養した。培養は、１２５ｍＬ若しくは２５０ｍＬの通気エルレンマイヤー振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）又は５０ｍＬの通気スピンチューブ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のいずれかの中で、３６℃、５％のＣＯ２及び相対湿度８５％で維持した。エルレンマイヤーフラスコを大容量の自動ＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）内で１２０ｒｐｍ、軌道径２５ｍｍで振盪し、スピンチューブを大容量のＩＳＦ４－Ｘインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で２２５ｒｐｍ、軌道径５０ｍｍで振盪した。
【0198】
選択方式として、３つの異なる手法を採用した：培地からＩＧＦ－１のみを除去する、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンと０．１ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ－１を培地に添加する、又はＩＧＦ－１を除去し、且つ１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加する。トランスフェクトされた宿主細胞を、３６℃及び５％のＣＯ２で＞９０％の生存率に回復するまで、３つの選択方式のうちの１つの非選択増殖培地中で３～４日ごとに継代した。ピューロマイシンを含む選択アームでは、細胞株が回復した時点でピューロマイシンを除去し、生存率が＞９０％になるまでＩＧＦ－１を含まない培地中で細胞を増殖させ、細胞をバンク化した。
【0199】
ＣＨＯ ｄｈｆｒ－バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞株に関して、全３つの選択方式により、さらに特性決定するためのプールが得られた。細胞株は、どちらの変異体に関しても、ピューロマイシンを添加し、且つＩＧＦ－１を含まない最も厳しい条件の細胞株よりも、ＩＧＦ－１を含まないか、又はＩＧＦ－１を併用したピューロマイシンのいずれかにおいてより早く回復した。Ｈ９０５変異体は、ｄｅｌＬ１変異体よりも早く回復した。図２を参照されたい。
【0200】
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドで回復したＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞株は、ＣＨＯ ＣＳ９プラットフォーム宿主と同様の倍加時間であり、概して３０時間未満であった。図３を参照されたい。
【0201】
ＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞株に関して、ＩＧＦ－１を除去した選択方式のみを先に進め、さらに試験した。全ての宿主でのＨ９０５変異体は、全ての宿主でｄｅｌＬ１変異体よりも早く回復した。図４を参照されたい。
【0202】
ＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドで回復したＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞株は、ＣＨＯ ＧＳＫＯプラットフォーム宿主と同様の倍加時間であり、Ｈ９０５Ｃ変異体の場合は概して３０時間未満であり、対照と同様であるか、又はｄｅｌＬ１変異体の場合はわずかに高かった。図５を参照されたい。
【0203】
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞株の標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ過剰発現変異細胞プールに対し、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）を用いてＩＧＦ１Ｒ変異遺伝子の組込みを確認し、ＣＨＯ宿主細胞内のＩＧＦ１Ｒ変異体発現ベクターの組込み部位を特定した。要約すると、１×１０７個の細胞を１％のホルムアルデヒドで固定して溶解した。クロマチンを可溶化し、ＮｌａＩＩＩで消化した後、近接ライゲーションとＤＮＡの逆架橋とを行った。続いて、プラスミドバックボーンの異なる領域に設計された２組のプライマーを用いて逆ＰＣＲを行うことによって、目的の領域を濃縮した。ＰＣＲ産物を、ＭｉＳｅｑ（商標）配列決定プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で配列決定した。組込み部位を特定するための分析を、ＢＷＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｉｇｖｔｏｏｌｓ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及びカスタムスクリプト（ｐｅｒｌ及びＲで記述される）を使用して実行した。ある領域が組込み部位と呼ばれるには、２組の濃縮プライマーによって独立して検出されなければならない。全てのプールでＩＧＦ１Ｒ変異体構築物の組込みが確認された。
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ過剰発現変異細胞プールに対し、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）を用いてＩＧＦ１Ｒ変異遺伝子の組込みを確認し、ＣＨＯ宿主細胞内のＩＧＦ１Ｒ変異体発現ベクターの組込み部位を特定した。要約すると、１×１０７個の細胞を１％のホルムアルデヒドで固定して溶解した。クロマチンを可溶化し、ＮｌａＩＩＩで消化した後、近接ライゲーションとＤＮＡの逆架橋とを行った。続いて、プラスミドバックボーンの異なる領域に設計された２組のプライマーを用いて逆ＰＣＲを行うことによって、目的の領域を濃縮した。ＰＣＲ産物を、ＭｉＳｅｑ（商標）配列決定プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で配列決定した。組込み部位を特定するための分析を、ＢＷＡ Ａｌｉｇｎｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｉｇｖｔｏｏｌｓ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、及びカスタムスクリプト（ｐｅｒｌ及びＲで記述される）を使用して実行した。ある領域が組込み部位と呼ばれるには、２組の濃縮プライマーによって独立して検出されなければならない。全てのプールでＩＧＦ１Ｒ変異体構築物の組込みが確認された。
【0204】
実施例２：ＩＧＦ１Ｒ変異細胞株における抗体構築物の発現
ＩＧＦ－１を補充せずに増殖し、異なるモダリティから治療薬を発現するこれらのＩＧＦ１Ｒ変異体の能力を、トランスフェクション及び１０Ｄ ＦＢ（１０日間流加）生産実験で試験した。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）又はｃ．ｓｉｇｈｔ（商標）（Ｃｙｔｅｎａ、ａ Ｃｅｌｌｉｎｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、ＣＨＯ ＣＳ９宿主及びＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主の両方に由来するＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞プールで単一細胞クローニングを行った。
ＩＧＦ－１を補充せずに増殖し、異なるモダリティから治療薬を発現するこれらのＩＧＦ１Ｒ変異体の能力を、トランスフェクション及び１０Ｄ ＦＢ（１０日間流加）生産実験で試験した。Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）又はｃ．ｓｉｇｈｔ（商標）（Ｃｙｔｅｎａ、ａ Ｃｅｌｌｉｎｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、ＣＨＯ ＣＳ９宿主及びＣＨＯ ＧＳＫＯ宿主の両方に由来するＩＧＦ１Ｒ変異体過剰発現細胞プールで単一細胞クローニングを行った。
【0205】
ＣＨＯ ＣＳ９及びＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドにおける試験分子のＩＧＦ１Ｒ変異細胞株へのトランスフェクション及び細胞培養
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異細胞株に対して、代表的なｍＡｂ及び代表的なＢｉＴＥ分子の線状化したスプリットＤＨＦＲプラスミドを、長時間のエレクトロポレーションプロトコルを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトのため、エレクトロポレーションキュベット内で混合した約２×１０７個の細胞及び約２５μｇのＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ装置（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて３１７５ｕＦ（静電容量）、２００ボルト及び７００オーム（抵抗）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を直ちにＴフラスコ内の予熱した培地に移した。トランスフェクトした細胞株を、ＩＧＦ－１を含まない非選択培地中で、３６℃及び５％のＣＯ２で３日間回復させた。トランスフェクトした宿主細胞を、３６℃及び５％のＣＯ２で、＞９０％に回復するまでＩＧＦ－１を含まない選択増殖培地（－ＧＨＴ）中で３～４日ごとに継代した。回復したら、細胞株を１０Ｄの流加生産で稼働させ、発現を評価した。登録商標の既知組成の培地を使用して、細胞を２４ディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）内で培養した。全ての条件で１ウェル当たり３．５ｍＬの作業容積を使用し、培養液を５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で培養した。細胞を８×１０５細胞／ｍｌで播種し、３日目、６日目及び８日目にフィードした。細胞密度、生存率、及び細胞径を、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して測定した。使用済み培地試料の力価を分析した。力価は、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、アフィニティープロテインＡ ＰＯＲＯＳ ＰＡ ＩＤセンサーカートリッジによって測定した。細胞株にはＭＴＸ増幅を施さなかった。
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異細胞株に対して、代表的なｍＡｂ及び代表的なＢｉＴＥ分子の線状化したスプリットＤＨＦＲプラスミドを、長時間のエレクトロポレーションプロトコルを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトのため、エレクトロポレーションキュベット内で混合した約２×１０７個の細胞及び約２５μｇのＤＮＡを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ装置（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて３１７５ｕＦ（静電容量）、２００ボルト及び７００オーム（抵抗）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を直ちにＴフラスコ内の予熱した培地に移した。トランスフェクトした細胞株を、ＩＧＦ－１を含まない非選択培地中で、３６℃及び５％のＣＯ２で３日間回復させた。トランスフェクトした宿主細胞を、３６℃及び５％のＣＯ２で、＞９０％に回復するまでＩＧＦ－１を含まない選択増殖培地（－ＧＨＴ）中で３～４日ごとに継代した。回復したら、細胞株を１０Ｄの流加生産で稼働させ、発現を評価した。登録商標の既知組成の培地を使用して、細胞を２４ディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）内で培養した。全ての条件で１ウェル当たり３．５ｍＬの作業容積を使用し、培養液を５％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で培養した。細胞を８×１０５細胞／ｍｌで播種し、３日目、６日目及び８日目にフィードした。細胞密度、生存率、及び細胞径を、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して測定した。使用済み培地試料の力価を分析した。力価は、Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、アフィニティープロテインＡ ＰＯＲＯＳ ＰＡ ＩＤセンサーカートリッジによって測定した。細胞株にはＭＴＸ増幅を施さなかった。
【0206】
ＧＳＫＯバックグラウンドにおけるＩＧＦ１Ｒ変異細胞株に対して、登録商標のＩＬＴトランスポザーゼを含有するプラスミドに加えて、代表的なｍＡｂ及び代表的なＢｉＴＥ分子の環状ｐＧＳ１．１ＰＢプラスミドを、長時間のエレクトロポレーションプロトコルを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、ＩＧＦ－１を含まない非選択培地中で、３６℃及び５％のＣＯ２で３日間回復させた。トランスフェクトした宿主細胞を、３６℃及び５％のＣＯ２で、＞９０％に回復するまでＩＧＦ－１を含まない選択増殖培地（－グルタミン）中で３～４日ごとに継代した。回復したら、細胞株を１０Ｄの流加生産で稼働させ、発現を評価した。
【0207】
回復率のグラフを図６Ａ～Ｂに示す。ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドでは、対照は概して４～５週間で回復し（図示せず）、変異体は同様の時間枠で回復し、Ｈ９０５Ｃ変異体はｄｅｌＬ１変異体よりも速く回復した。ＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドでは、ＢｉＴＥ、ｍＡｂ及びＩｇＧｓｃＦｖの試験分子をトランスフェクトしたＩＧＦ１Ｒ変異細胞の回復曲線は、ＩＧＦ１Ｒ変異細胞株が概して対照よりも遅く回復し、Ｈ９０５ＣがｄｅｌＬ１変異体よりも速く回復することを示している。
【0208】
流加生産細胞培養
ＣＨＯ ＣＳ９又はＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドのいずれかでＩＧＦ１Ｒ変異体を過剰発現する細胞株において、試験分子の増殖及び比生産性（Ｑｐ）を評価するために、１０日間の流加生産を行った。ＩＧＦ－１を含まない基礎生産培地中に、８×１０５細胞／ｍＬ（ＣＳ９ベース）又は１×１０６細胞／ｍＬ（ＧＳＫＯベース）のいずれかで培養物を播種し、３日目、６日目及び８日目に追加の栄養剤をフィードした。培養物を１０日目に回収した。流加の１０日目に抗体価を測定した。力価は、上記で説明したようなＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣを使用して、アフィニティープロテインＡ ＰＯＲＯＳ ＰＡ ＩＤセンサーカートリッジによって測定した。
ＣＨＯ ＣＳ９又はＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドのいずれかでＩＧＦ１Ｒ変異体を過剰発現する細胞株において、試験分子の増殖及び比生産性（Ｑｐ）を評価するために、１０日間の流加生産を行った。ＩＧＦ－１を含まない基礎生産培地中に、８×１０５細胞／ｍＬ（ＣＳ９ベース）又は１×１０６細胞／ｍＬ（ＧＳＫＯベース）のいずれかで培養物を播種し、３日目、６日目及び８日目に追加の栄養剤をフィードした。培養物を１０日目に回収した。流加の１０日目に抗体価を測定した。力価は、上記で説明したようなＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣを使用して、アフィニティープロテインＡ ＰＯＲＯＳ ＰＡ ＩＤセンサーカートリッジによって測定した。
【0209】
流加生産試験において、細胞を上記の力価で生産培地に播種した。２４ディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）では３ｍＬの作業容積、又は１２５ｍＬの通気振盪フラスコでは２５ｍＬの作業容積を使用した。３日目、６日目及び８日目に、初期培養容積の７％の単回のボーラスフィードを培養液に提供した。３日目、６日目及び８日目に、１０ｇ／Ｌを目標にグルコースをフィードした。遠心分離した馴化培地を、生産稼働の１０日目に回収した。試料も同様に３日目、６日目、８日目に採取した。
【0210】
ＣＨＯ ＣＳ９バックグラウンドでは、Ｈ９０５Ｃ変異体は、対照細胞株と比較して同等の増殖、同等以上の力価及び高いＱｐを有していた。図７Ａ～Ｃを参照されたい。ＣＨＯ ＧＳＫＯバックグラウンドでは、Ｈ９０５Ｃ変異体は対照細胞株と同様の増殖を有していた。ｄｅｌＬ１及びＨ９０５Ｃ変異体の両方は、対照細胞株と比較して同等以上の力価及びＱｐを有していた。図８Ａ～Ｂを参照されたい。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【配列表】
【国際調査報告】