特表 2023-548339 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）試料中の不純物の特徴付け及びＡＡＶを安定させるための製剤組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-16

(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）試料中の不純物の特徴付け及びＡＡＶを安定させるための製剤組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/70 20060101AFI20231109BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20231109BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20231109BHJP

   C12Q 1/34 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231109BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20231109BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20231109BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20231109BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20231109BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20231109BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20231109BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/70

C12N15/10 112Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/34

A61K35/76

A61K48/00

A61K31/7088

A61K47/26

A61K47/18

A61K47/10

A61K47/02

A61K47/22

A61K9/19

C12N15/864 100Z

C12N7/01

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526505

(86)(22)【出願日】2021-11-01

(85)【翻訳文提出日】2023-06-21

(86)【国際出願番号】 US2021057587

(87)【国際公開番号】W WO2022094411

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】63/108,480

(32)【優先日】2020-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】リュウ ディンジャン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ボーウェン

(72)【発明者】

【氏名】ツル フランコ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR14

4B063QS08

4B063QS17

4B063QX01

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BD09

4B065BD14

4B065BD21

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA29

4C076CC26

4C076DD07

4C076DD09

4C076DD23

4C076DD26Z

4C076DD38

4C076DD51

4C076DD60

4C076DD67

4C076GG06

4C076GG47

4C084AA13

4C084MA05

4C084NA03

4C084ZB21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA03

4C086ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA05

4C087NA03

4C087ZB21

(57)【要約】

サイズ排除クロマトグラフィー及び分光光度法の使用を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物を特徴付けるための方法が提供される。糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールなどの賦形剤の使用を含む、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む試料中の核酸不純物を特定する方法であって、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含有する試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに接触させる段階と、
溶液を使用して前記ＳＥＣカラムを洗浄し、少なくとも１つの溶離液を提供する段階と、
分光光度計を使用して、前記少なくとも１つの溶離液中の核酸不純物を特定する段階と
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記核酸不純物が、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記核酸不純物を蛍光色素で処理する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記分光光度計を使用して、２８０ｎｍで、前記少なくとも１つの溶離液の吸光度を測定する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記分光光度計を使用して、２６０／２８０ｎｍで、前記少なくとも１つの溶離液の吸光度比を測定する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記核酸不純物を、核酸標準曲線に基づいて定量化する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記試料を前記ＳＥＣカラムに接触させる前に、前記試料をＤＮＡヌクレアーゼに接触させる段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ＳＥＣシステムが、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）システムである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの溶離液を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び少なくとも１つの賦形剤を含む、組成物であって、
前記少なくとも１つの賦形剤が、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールであり、前記少なくとも１つのＡＡＶベクターが、パックされた（ｐａｃｋｅｄ）核酸を含み、かつ
前記パックされた核酸を漏出させることから前記組成物中の前記少なくとも１つのＡＡＶベクターを保護する、
前記組成物。

【請求項11】

前記少なくとも１つのＡＡＶベクターが、少なくとも１つの凍結融解サイクルに曝露される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記パックされた核酸が、ＡＡＶゲノム由来の一本鎖ＤＮＡであり、前記パックされた核酸が、ＡＡＶキャプシド内部に存在する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

前記賦形剤が、約０．００１％～約１０％の濃度で存在し、前記組成物が、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項14】

前記糖が、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項15】

前記アミノ酸がプロリンである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項16】

前記界面活性剤がポロキサマー１８８である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項17】

前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤が、約０．００１％～約０．２％の濃度で存在する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項18】

前記組成物が、スクロース及びポロキサマー１８８を含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項19】

前記スクロースが、２．５％～１０％の濃度で存在し、かつ前記ポロキサマー１８８が、０．００１％～０．２％の濃度で存在する、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

パックされた核酸を漏出させることからアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを保護するための方法であって、
前記方法が、
少なくとも１つのＡＡＶベクターを含む試料を取得する段階と、
前記試料に安定化組成物を加えて、保護製剤を形成する段階と
を含み、
前記保護製剤が、パックされた核酸を漏出させることから前記少なくとも１つのＡＡＶベクターを保護し、前記安定化組成物が、少なくとも１つの賦形剤を含み、かつ前記賦形剤が、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールである、
前記方法。

【請求項21】

前記ＡＡＶベクターが、少なくとも１つの凍結融解サイクルに曝露される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記パックされた核酸が、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムであり、前記パックされた核酸が、ＡＡＶキャプシド内部に存在する、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記賦形剤が、前記保護製剤中に約０．００１％～約１０％の濃度で存在し、前記安定化組成物が、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

前記糖が、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項25】

前記アミノ酸がプロリンである、請求項２０に記載の方法。

【請求項26】

前記界面活性剤がポロキサマー１８８である、請求項２０に記載の方法。

【請求項27】

前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤であり、前記界面活性剤が、前記保護製剤中に約０．００１％～約０．２％の濃度で存在する、請求項２０に記載の方法。

【請求項28】

前記安定化組成物が、スクロース及びポロキサマー１８８を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項29】

前記スクロースが、前記保護製剤中に２．５％～１０％の濃度で存在し、かつ前記ポロキサマー１８８が、前記保護製剤中に０．００１％～０．２％の濃度で存在する、請求項２８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０２０年１１月２日出願の米国仮特許出願第６３／１０８，４８０号の優先権及び利益を主張するものである。

【0002】

分野
本発明は、概して、サイズ排除クロマトグラフィー及び分光光度法を使用して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む試料中の核酸不純物を特徴付けるための方法に関する。本出願はまた、ＡＡＶベクターからの、パックされた（ｐａｃｋｅｄ）ＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物も提供する。

【背景技術】

【0003】

背景
遺伝子療法は、例えば、遺伝物質を宿主ゲノムに組み込むことによって、長期的な遺伝子発現を達成しながら、実質的な毒性なしに、適切な量の治療遺伝子を標的組織に送達することによって、治療効果を媒介する。遺伝子治療療法には、核酸、プラスミド、ウイルス、ベクター、又は遺伝子操作された微生物が含まれる。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びＡＡＶベクターを含む現在利用可能な全てのウイルスベクターのうち、ＡＡＶベクターが、遺伝子療法のための遺伝物質を送達するために広く使用されてきた。

【0004】

遺伝子療法製品の評価には、製造工程を評価して製品の安全性及び品質を確保し、製造、保管、及び流通の段階で製品を評価することが含まれる。遺伝子療法製品は、典型的には、凍結溶液として保存されるため、凍結融解サイクル及び撹拌ストレスをとおした遺伝子療法製品の安定性を実証することが重要である。ＡＡＶベクター系遺伝子療法製品は、凍結融解サイクル中に分解を受けて、分解されたウイルスタンパク質及びＤＮＡ不純物を含む分解生成物を産生することができる。ベクター内部のパックされたＡＡＶゲノムは、凍結融解サイクル又は撹拌中に漏出し得る。このため、遺伝子療法製品の様々な製剤化戦略を調査して、製品の安定性を増加させ、製品の分解を最小限に抑えるために製剤を調製する必要がある。

【0005】

様々な保管条件中のそのような遺伝子療法製品中の核酸不純物を特徴付けるための方法に対する必要性が存在することが認識されよう。加えて、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑える治療遺伝子を有するＡＡＶベクターを含む組成物又は製剤を提供する必要性も存在する。

【発明の概要】

【0006】

概要
本出願は、サイズ排除クロマトグラフィー及び分光光度測定法の使用を含む、ＡＡＶベクター又は遺伝子療法製品を含む試料中の核酸不純物を特徴付け及び特定するための方法を提供する。本出願はまた、製造、輸送、保管、及び投与中に生じ得る凍結融解サイクル及び撹拌ストレスなどの保管条件中のＡＡＶベクターからの、パックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物を提供する。

【0007】

本開示は、ＡＡＶベクターを含む試料中の核酸不純物を特定する方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクターを含む試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに接触させる段階と、溶液を使用してＳＥＣカラムを洗浄し、少なくとも１つの溶離液を提供する段階と、分光光度計を使用して少なくとも１つの溶離液中の核酸不純物を特定する段階とを含む方法を提供する。一態様では、核酸不純物は、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムである。別の態様では、核酸不純物は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である。別の態様では、本出願の方法は、分光光度計を使用して２８０ｎｍでの少なくとも１つの溶離液の吸光度を測定する段階と、分光光度計を使用して２６０／２８０ｎｍでの少なくとも１つの溶離液の吸光度比を測定する段階とを更に含む。一態様では、本出願の方法は、核酸標準曲線に基づいて核酸不純物を定量化する段階を更に含む。一態様では、本出願の方法は、核酸不純物を、ｓｓＤＮＡに特に結合する蛍光色素で処理する段階を更に含む。別の態様では、本出願の方法は、試料をＳＥＣカラムに接触させる前に、試料をＤＮＡヌクレアーゼに接触させる段階を更に含む。更なる態様では、ＳＥＣシステムは、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）システムである。別の態様では、本出願の方法は、少なくとも１つの溶離液を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供する段階を更に含む。

【0008】

本開示は、少なくとも部分的に、パックされた核酸を漏出させることからＡＡＶベクターを保護するための組成物を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡＡＶベクター及び少なくとも１つの賦形剤を含む、組成物であって、少なくとも１つの賦形剤が、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールであり、少なくとも１つのＡＡＶベクターが、パックされた核酸を含み、パックされた核酸を漏出させることから組成物中の少なくとも１つのＡＡＶベクターを保護する、組成物を提供する。

【0009】

一態様では、本出願の組成物中のＡＡＶベクターは、少なくとも１つの凍結融解サイクルに曝露される。一態様では、パックされた核酸は、ＡＡＶのｓｓＤＮＡゲノムであり、パックされた核酸は、ＡＡＶキャプシド内部に存在する。一態様では、本出願の組成物の賦形剤は、約０．００１％～約１０％の濃度で存在し、本組成物は、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む。別の態様では、本出願の組成物中の糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである。一態様では、本出願の組成物中のアミノ酸は、プロリンである。一態様では、本出願の組成物中の界面活性剤は、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）である。一態様では、本出願の組成物中の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、界面活性剤は、約０．００１％～約０．２％の濃度で存在する。別の態様では、本組成物は、スクロース及びポロキサマー１８８を含む。特定の態様では、本組成物は、２．５％～１０％の濃度でスクロースを、０．００１％～０．２％の濃度でポロキサマー１８８を含む。

【0010】

本開示は、少なくとも部分的に、パックされた核酸を漏出させることからＡＡＶベクターを保護するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、少なくとも１つのＡＡＶベクターを含む試料を取得する段階と、試料に安定化組成物を加えて、保護製剤を形成する段階とを含み、保護製剤は、パックされた核酸を漏出させることから少なくとも１つのＡＡＶベクターを保護し、安定化組成物は、少なくとも１つの賦形剤を含み、賦形剤は、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールである。一態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つの凍結融解サイクルに曝露される。一態様では、パックされた核酸は、ＡＡＶのｓｓＤＮＡゲノムであり、パックされた核酸は、ＡＡＶキャプシド内部に存在する。

【0011】

別の態様では、賦形剤は、保護製剤中に約０．００１％～約１０％の濃度で存在し、安定化組成物は、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む。一態様では、糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである。更に別の態様では、アミノ酸はプロリンである。一態様では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）である。一態様では、本出願の組成物中の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、界面活性剤は、保護製剤中に約０．００１％～約０．２％の濃度で存在する。別の態様では、安定化組成物は、スクロース及びポロキサマー１８８を含む。特定の態様では、安定化組成物は、スクロースを、保護製剤中の最終濃度２．５％～１０％で含み、安定化組成物は、ポロキサマー１８８を、保護製剤中の最終濃度０．００１％～０．２％で含む。

【0012】

本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて検討すると、よりよく認識され、理解される。以下の説明は、様々な実施形態及びその多数の具体的な詳細を示すものの、例示目的であり、限定するものではない。多くの置き換え、修正、追加、又は再配置が、本発明の範囲内で行われ得る。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎらに従う、ＡＡＶ１キャプシドＶＰ３モノマーの結晶構造及びＡＡＶ１キャプシドの表面表現を含むＡＡＶ１ベクターの構造を示す。

【図2】例示的な実施形態に従い、保護製剤がある場合とない場合とのＡＡＶベクターの凍結融解の効果を例示する。

【図3】例示的な実施形態に従う、２８０ｎｍでのＡＡＶ８－ＧＦＰ試料のＳＥＣ画分の吸光度を示す。例示的な実施形態に従い、異なる量のＡＡＶ８－ＧＦＰ試料、例えば、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、又は２０μＬの試料を、ＳＥＣカラムにロードした。

【図4】例示的な実施形態に従う、２８０ｎｍの励起及び３５０ｎｍの発光でモニタリングしたＡＡＶ８－ＧＦＰ試料のＳＥＣ画分の蛍光強度を示す。

【図5】例示的な実施形態に従う、２８０ｎｍでのＡＡＶ８－ＧＦＰ試料のＳＥＣ画分の吸光度を示す。例示的な実施形態に従い、異なる濃度（力価）のＡＡＶ８－ＧＦＰ試料をＳＥＣカラムにロードした。

【図6】例示的な実施形態に従う、様々な回数の凍結融解サイクル及び撹拌処理後のＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のｓｓＤＮＡ濃度の定量化を示す。

【図7】例示的な実施形態に従う、ｔ＝０（太線）での、及び１０回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル（点線）後のＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図8】例示的な実施形態に従う、ベンゾナーゼ処理あり（点線）及びなし（太線）のＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図9】Ａは、例示的な実施形態に従う、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後の様々な製剤中のＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラム中のＤＮＡピークの不純物のパーセントを示す。Ｂは、例示的な実施形態に従う、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後の様々な製剤中のＡＡＶ８．ＧＦＰから漏出したｓｓＤＮＡの量を示す。

【図10】Ａは、例示的な実施形態に従う、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ｓｓＤＮＡキットによって測定した、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後にＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、及びＡＡＶＤＪから漏出した遊離ｓｓＤＮＡの量を示す。Ｂは、例示的な実施形態に従う、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後のＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、及びＡＡＶＤＪ中のＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムにおけるＤＮＡピークの不純物のパーセントを示す。

【図11】実施形態に従う、ＡＡＶキャプシドからのＤＮＡ漏出を低減するために異なる製剤を使用して様々な賦形剤をスクリーニングするためのＤＬＳを使用するＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のウイルス粒子の流体力学半径の分析を示す。例示的な実施形態に従い、ＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のＤＮＡ不純物を、１０回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクルの処理の前後に特徴付けた。

【図12】Ａは、例示的な実施形態に従う、１、２、又は４サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後の、異なる濃度のスクロース、プロピレングリコール、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を伴う製剤中のＡＡＶ８．ＧＦＰから漏出した遊離ｓｓＤＮＡの量を示す。Ｂは、例示的な実施形態に従う、１、２、又は４サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後の、異なる濃度のスクロース、プロピレングリコール、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を伴う製剤中のＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラム中のＤＮＡピークの不純物のパーセントを示す。

【図13】Ａは、例示的な実施形態に従う、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後のベース製剤（ＢＦ）又は最適化製剤（ＯＦ）中のＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶＤＪから漏出した遊離ｓｓＤＮＡの量を示す。Ｂは、例示的な実施形態に従う、１０サイクルの凍結融解（Ｆ／Ｔ）後のベース製剤（ＢＦ）又は最適化製剤（ＯＦ）中のＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶＤＪのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラム中のＤＮＡピークの不純物のパーセントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

詳細な説明
遺伝子療法により、患者の健康状態を改善するために、損傷した又は変異した遺伝子を改変、修復、又は代置する可能性が開かれた。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子送達のための理想的なツールであり、ヒト遺伝子療法のための卓越したベクターとなっている。ＡＡＶは、遺伝子療法用途のために核酸を送達する特定の機能を実行するように操作することができる。ＡＡＶの主な利点には、低免疫原性及び病原性、並びに全体的に高い安全性及び安定性が含まれる（Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１（４）（２０１７）３１７－３３４、Ｄｕｒｉｎｇ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２７（１）（１９９７）８３－９４）。ＡＡＶは、活性細胞分裂にかかわらず、導入遺伝子発現の持続時間を延長する穏やかな免疫応答を誘発しながら、広範囲の細胞に感染することができる（Ｄｕｒｉｎｇ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３（５）（１９９２）５３３－５３９、Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）（２００８）５８３－５９３）。加えて、ＡＡＶは、いずれの既知の疾患とも関連付けられていない（Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．；Ｄｕｒｉｎｇ；Ｃａｒｔｅｒ；Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １２（３）（１９９３）２０１－２１５、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ１９９２，ｐｐ．９７－１２９）。遺伝子送達ビヒクルとしてのＡＡＶの別の利点は、遺伝子機能を破壊し、挿入変異誘発を引き起こす可能性があるランダムなゲノム組み込みのリスクが低いことである（Ｇｏｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ９（２０１９）２９７、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １３４（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ＿１）（２０１９）６１１－６１１、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６（２）（２０１８）４２）。

【0015】

ＡＡＶは、ディペンドウイルス属下パルボウイルス科の非エンベロープウイルス及び非病原性メンバーであり、感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーを必要とする（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ ＶＰ１－ Ｕｎｉｑｕｅ Ｎ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｐｓｉｄ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ，２０１３，ｖｏｌ．８７，ｎｏ．９，４９７４－４９８４ページ）。ＡＡＶは、キャプシドウイルスタンパク質と呼ばれるタンパク質のシェルで作られる２０面体キャプシド中のサイズ約４．８キロベース（ｋｂ）のｓｓＤＮＡゲノムをカプセル化する。図１は、ＡＡＶ１キャプシドＶＰ３モノマーの結晶構造及びＡＡＶ１キャプシドの表面表現を含むＡＡＶ１の構造を示す（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら）。外側のキャプシドシェルを形成することに加えて、キャプシドウイルスタンパク質は、細胞結合及び内在化に積極的に関与する。

【0016】

ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）がキャプシドに封入されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ２０１２，ｐｐ．４７－９２、Ｄｒｏｕｉｎ ａｎｄ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｆｕｔｕｒｅ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８（１２）（２０１３）１１８３－１１９９）。細胞受容体に結合した後、ＡＡＶは続いてエンドサイトーシスを受け、エンドソームから放出された後、宿主核に向かって輸送され、脱コーティングされて、ｓｓＤＮＡをそれらのキャプシドから放出する。論理的には、形質導入効率は、少なくとも部分的に、放出部位に到達する前の封入されたｓｓＤＮＡゲノムの量及びＡＡＶの完全性に依存する（Ｎｏｎｎｅｎｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（６）（２０１２）６４９－６５８、Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８（２４）（２００４）１３６７８－１３６８６、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８（６）（２００４）３１１０－３１２２）。

【0017】

遺伝子送達ベクターとしての組換えＡＡＶの品質及び効率をモニタリングするためには、純度、キャプシド属性、ベクター粒子力価、及びＡＡＶバイオ医薬品の空／完全比をモニタリングすることが重要である。また、貯蔵（安定した温度貯蔵及び凍結融解サイクルなど）、希釈剤（ｐＨが異なる血清及び溶質など）、及び投与の様々な条件下で、ＡＡＶバイオ医薬品の安定性を実証することも重要である。ＡＡＶバイオ医薬品のような遺伝子療法製品は、典型的には、凍結溶液として貯蔵される。その結果、製造、製品用量調製、及び投与中の凍結融解サイクルは避けられない。まれに、輸送中の温度変動又は貯蔵中の冷凍庫の誤動作により、生物製剤が追加の凍結融解サイクルにさらされる可能性がある。ＡＡＶバイオ医薬品は、貯蔵条件における凍結融解サイクル中に安定性が低下して分解を受け得る。

【0018】

学術研究室では、ＡＡＶを遺伝子送達ベクターとして設計及び開発するための多大な努力の後、研究者は、概して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの一般的に使用される緩衝液中にベクターを貯蔵し、比較的高濃度のグリセロールを凍結保護剤として加え、ＡＡＶ材料を－８０℃で貯蔵する。これはいささか標準的なプロトコルとなっているが、これらの条件は、ＡＡＶ機能に有害である可能性がある（Ｂｏｙｄ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）３８３、Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８（１７）（２００１）１２８１－１２９０）。いくつかの場合、これには、凍結保護剤の毒性を低下させるために、投与前に大規模な希釈が求められることがある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２３（２）（２００６）８７－９１、Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ５０（１）（２００５）１７－２０）。複数の凍結融解サイクル後にＡＡＶの力価及び形質導入効率が減少することが研究によって示されているが、この挙動の原因及び凍結融解サイクル後のＡＡＶ分解の機序は、十分に理解されていない（Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２０１９，３６（２）：２９、Ｈｏｗａｒｄ ａｎｄ Ｈａｒｖｅｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（１）（２０１７）３９－４８）。

【0019】

本開示は、ＡＡＶ試料中の不純物を特徴付ける方法を説明する。本発明の方法を使用して、凍結融解サイクルに供されるＡＡＶ８試料を特徴付けると、凍結融解サイクルの数の増加により、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって検出可能な産物関連不純物が増加することが発見された。これらのＡＡＶ８試料の更なる特徴付けにより、不純物が主にＡＡＶキャプシドから漏出するゲノムＤＮＡからなることが示された。同様の挙動は他のＡＡＶ血清型でも観察された。

【0020】

図２に示されるように、凍結融解サイクル中にＡＡＶのキャプシドが損傷すると、キャプシド内部のパックされたｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムが漏出し得る。ＡＡＶバイオ医薬品中で遊離ｓｓＤＮＡの存在が観察されると、これは貯蔵中のＡＡＶバイオ医薬品の安定性が低下したことを示す。様々な賦形剤を遺伝子送達製品に加えて、製品安定性を増加させ、製品の分解を最小限に抑えてもよい。賦形剤には、緩衝液、リオプロテクター（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒ）、等張化剤、及び界面活性剤が含まれてもよい（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら）。追加の製剤は、以下で詳述する。

【0021】

様々な貯蔵条件下で、ＡＡＶ試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物を特徴付けるための方法に対する必要性が存在する。加えて、貯蔵条件中のＡＡＶベクターからの、パックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるために、ＡＡＶバイオ医薬品の組成物又は製剤の安定化をもたらすべきである。

【0022】

本出願は、ＤＮＡ不純物をＡＡＶベクターから分離させるためにＳＥＣを使用することを含む、ＡＡＶ試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物、例えば、ＡＡＶのｓｓＤＮＡゲノムを特定するための方法を提供する。続いて、分光光度計を使用してＳＥＣ画分をモニタリングする。本出願はまた、リン酸緩衝液、塩、及び非イオン性界面活性剤の存在下で賦形剤を使用することを含む、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物も提供する。

【0023】

ＡＡＶバイオ医薬品中の不純物を測定及びモニタリングするための、迅速で、信頼性が高く、感度が高く、かつスループットの高い方法を開発する必要がある。所望の産物でも、産物関連物質でも、意図された製剤賦形剤でもない、精製ＡＡＶバイオ医薬品中のいずれの成分も、不純物とみなされ得る。ベクター産物関連不純物の例としては、空のＡＡＶキャプシド粒子、及び意図されない核酸断片をキャプシド化するＡＡＶ粒子が挙げられる。追加のＤＮＡ不純物には、精製中、精製後、又は貯蔵中にＡＡＶのキャプシドから漏出するＡＡＶゲノムのｓｓＤＮＡが含まれてもよい。不純物には、ベクター生成システムの生合成環境における組換え事象によって非意図的に生成され得るヘルパーウイルス依存性複製可能ＡＡＶ粒子が含まれてもよい。

【0024】

更に、ＡＡＶバイオ医薬品中の不純物はまた、ＡＡＶを生成するために使用される細胞培養物に由来する残留レベルのタンパク質及び核酸を含んでもよい。豊富な残留タンパク質不純物には、宿主細胞タンパク質及びウシ血清アルブミンが含まれてもよい。豊富な残留核酸には、プラスミド又はウイルスなどのヘルパー成分からの宿主細胞ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれてもよい。残留宿主細胞ＤＮＡは、ヌクレアーゼ感受性プロセス関連不純物及びヌクレアーゼ抵抗性産物関連不純物を含む２つの形態で存在し得る。ヌクレアーゼ感受性プロセス関連不純物には、所望のＡＡＶベクター産物と非特異的に同時精製される核酸が含まれる。ヌクレアーゼ抵抗性産物関連不純物には、ＡＡＶ粒子内にキャプシド化された核酸が含まれる。これらの異なる形態の残留宿主細胞ＤＮＡを最小限に抑えるには、異なる製造プロセス最適化戦略が求められる。（Ｊ．Ｆ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２０１４，２，８０－９７）ヌクレアーゼ処理を使用して、ＡＡＶベクター精製中にアクセス可能な核酸を除去するにしても、ＡＡＶバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物の除去は複雑である。ベクター粒子の完全性に起因してヌクレアーゼ処理に抵抗性である望ましくないＤＮＡ断片がパッケージされてもよい。

【0025】

ＡＡＶキャプシドは、タンパク質、例えば、キャプシドウイルスタンパク質のシェルで作られる２０面体キャプシドにｓｓＤＮＡゲノムをカプセル化するので、好適な宿主細胞が複製のためにＡＡＶゲノムを放出するための細胞進入を開始するようになるまで、キャプシドは、ＡＡＶゲノムを保護するために安定でなければならない。ＡＡＶのウイルスキャプシドタンパク質のアセンブリは、ウイルス感染性及びベクター効力に対して顕著な影響を有し得る（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，２５５－２６７ページ）。ＡＡＶのキャプシドウイルスタンパク質は、入力ゲノムの第２鎖合成と転写との両方の開始において役割を果たし得る（Ｓａｌｇａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｍａｙ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４，Ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．２，１０７１－１０７９ページ）。キャプシドタンパク質の分解は、ＡＡＶの感染性に有害であり得、これが、ＡＡＶ ｓｓＤＮＡゲノムの漏出を生じさせ得る。ＡＡＶ ｓｓＤＮＡゲノムはまた、キャプシドの破損なしに排出され得る（Ｂｅｒｎａｕｄ，Ｊｕｌｉｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃａｐｓｉｄ ｌｅｖｅｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｙｓｉｃｓ，２０１８，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．２，１８１－１９４ページ）。

【0026】

ＡＡＶ ｓｓＤＮＡゲノムは、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（キャプシド）、及びａａｐ（アセンブリ）を含む３つの遺伝子を含む。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノム複製及びパッケージングに関係する。ｃａｐ遺伝子は、キャプシドウイルスタンパク質をコードする。ｃａｐ遺伝子の発現により、共通のＣ末端を有する交互にスプライシングされたｍＲＮＡから作製される、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含むキャプシドウイルスタンパク質が産生される。ＶＰ３は約６１ｋＤａであり、キャプシドタンパク質含有量の約８５％を構成する。ＶＰ２は約７３ｋＤａである。ＶＰ１は約８７ｋＤａである。ＶＰ１及びＶＰ２は、ホスホリパーゼＡ２ドメイン及び核局在シグナルを含むＮ末端伸長（ＶＰ１ｕ）を含む（Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３，ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．２４，ｐ．１３１５０－１３１６０）。ＡＡＶのキャプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む６０個のウイルスタンパク質モノマーからなる。ＶＰ３が主要なキャプシドタンパク質である。ＡＡＶキャプシドには、約５０個のＶＰ３コピーが存在する。ＡＡＶキャプシドには、約５個のＶＰ１コピー及び５個のＶＰ２コピーが存在する（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら）。

【0027】

本出願は、ＤＮＡ不純物をＡＡＶベクターから分離させるためにＳＥＣを使用することを含む、ＡＡＶ試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物を特徴付け、特定、及び／又は定量化するための方法を提供する。続いて、分光光度計を使用してＳＥＣ画分をモニタリングする。本出願はまた、ＰＢＳ及び非イオン性界面活性剤の存在下で賦形剤を使用することを含む、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物も提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶベクターを含む試料中のＤＮＡ不純物を特定する方法を提供し、本方法は、試料をＳＥＣカラムに接触させる段階と、溶液を使用してＳＥＣカラムを洗浄し、溶離液を提供する段階と、分光光度計を使用して溶離液中の核酸不純物を特定する段階とを含む。ＡＡＶベクターを含む試料をＳＥＣカラムにロードする。分光光度計を使用して、ＳＥＣカラムを通過する画分をモニタリングし、２８０ｎｍでのＳＥＣ画分の吸光度を測定する。ＡＡＶベクターに対応する１つのメインピークが、ＳＥＣ溶出プロファイルにおいてＳＥＣ画分中で観察され得る。このメインピークは、分光光度計を使用して検出して２８０ｎｍでの有意な吸光度を有する。ＤＮＡ不純物に対応する１つの小さなピークが、ＳＥＣ溶出プロファイルにおいてＳＥＣ画分中で観察される。この小さなピークは、分光光度計を使用して検出して２８０ｎｍでの吸光度を有する。

【0028】

一態様では、ＡＡＶベクターを含む試料中のＤＮＡ不純物は、ＡＡＶのｓｓＤＮＡゲノムである。一態様では、分光光度計を使用してＳＥＣ画分を分析し、核酸純度を評価するためにＵＶ２６０／２８０ｎｍでの吸光度比を測定する。一態様では、本出願の方法は、分光光度計を使用して２８０ｎｍでの溶離液の吸光度を測定する段階と、２６０／２８０ｎｍでの溶離液の吸光度比を測定する段階とを含む。一態様では、本出願の方法は、ＤＮＡ不純物を蛍光色素で処理する段階と組み合わせた、核酸標準曲線に基づいてＤＮＡ不純物を定量化する段階を更に含む。

【0029】

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、凍結融解サイクル及び撹拌などの貯蔵条件中に、パックされた核酸を漏出させることからＡＡＶベクターを保護するための方法及び安定化組成物を提供する。いくつかの態様では、ＡＡＶベクター及び賦形剤を含む安定化組成物は、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールを含む。いくつかの態様では、パックされた核酸を漏出させることからＡＡＶベクターを保護するための方法は、ＡＡＶベクターを安定化組成物と混合することを含む。

【0030】

一態様では、本出願の安定化組成物の賦形剤は、約０．００１％～約１０％の濃度で存在し、安定化組成物は、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む。一態様では、本出願の安定化組成物中の糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである。別の態様では、本出願の安定化組成物中のアミノ酸は、プロリンである。更に別の態様では、本出願の安定化組成物中の界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８である。一態様では、本出願の安定化組成物中の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、界面活性剤は、約０．００１％～約０．２％の濃度で存在する。

【0031】

遺伝子送達製品を評価して、製品の安全性及び品質を確保したいという要望は、様々な貯蔵条件の間のＡＡＶ試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物を特徴付けたいという要望の増加をもたらした。加えて、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための、ＡＡＶバイオ医薬品の組成物又は製剤を提供する必要性も存在する。本明細書に開示される例示的な実施形態は、長年にわたる必要を満たすための方法及び組成物を提供することによって、前述の要望を満たす。

【0032】

「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解され得るとおり、標準的な変動を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合には、終点が含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

【0033】

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶベクターを含む試料中の核酸不純物を特定する方法を提供し、本方法は、ＡＡＶベクターを含む試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに接触させる段階と、溶液を使用してＳＥＣカラムを洗浄し、少なくとも１つの溶離液を提供する段階と、分光光度計を使用して少なくとも１つの溶離液中の核酸不純物を特定する段階とを含む。

【0034】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を担持する組換えプラスミド又はウイルスを指す。

【0035】

ＡＡＶに由来するベクターは、遺伝子材料の送達に特に魅力的であり、その理由は、（ｉ）これらが、筋線維及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞種を感染（形質導入）させることができるため、（ｉｉ）これらが、ウイルス構造遺伝子を含まないことにより、ウイルス観戦に対する天然の宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介性応答を除去するため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおけるいずれの病理にも関連付けられていないため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込まれることができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損性ＡＡＶベクターは、概してエピソームとして存続し、このことにより、挿入変異誘発又はがん遺伝子の活性化のリスクが制限されるため、並びに（ｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは、顕著な免疫応答を誘発せず（ｉｉ参照）、このことにより、治療用導入遺伝子の長期発現がかなえられる（それらの遺伝子産物が拒絶されないことを条件とする）ためである。

【0036】

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、所望の産物でも、産物関連物質でも、意図された製剤賦形剤でもない、精製ＡＡＶ試料中の任意の成分を指す。ＤＮＡ不純物には、精製中、精製後、又は貯蔵中にＡＡＶのキャプシドから漏出するＡＡＶゲノムのｓｓＤＮＡが含まれてもよい。不純物には、ベクター生成システムの生合成環境における組換え事象によって非意図的に生成され得るヘルパーウイルス依存性複製可能ＡＡＶ粒子が含まれてもよい。ＡＡＶの精製後に残存する不純物には、ＡＡＶを生成するために使用される細胞培養物の成分に由来する残留レベルのタンパク質及び核酸が含まれてもよい。残留タンパク質不純物には、宿主細胞タンパク質及びウシ血清アルブミンが含まれてもよい。残留核酸には、プラスミド又はウイルスなどのヘルパー成分からの宿主細胞ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれてもよい。残留宿主細胞ＤＮＡは、（１）ヌクレアーゼ感受性プロセス関連不純物、例えば、所望のＡＡＶベクター産物と非特異的に同時精製された不純物、及び（２）ヌクレアーゼ抵抗性産物関連不純物、例えば、ＡＡＶ粒子内にキャプシド化された不純物の２つの形態で存在し得る（Ｊ．Ｆ．Ｗｒｉｇｈｔ）。

【0037】

本明細書で使用される場合、「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。いくつかの例示的な実施形態では、「核酸」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を包含し、これは、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシ－メチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチル－アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュード－ウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチル－グアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチル－シトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシ－アミノ－メチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５′－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリンなどであるが、これらに限定されない。

【0038】

本明細書で使用される場合、「サイズ排除クロマトグラフィー」又は「ＳＥＣ」という用語は、マトリックスをとおして濾過することによってサイズ（分子量など）に基づいて溶液中の分子を分離させることができるクロマトグラフィー法、例えば、分子ふるいクロマトグラフィーを指す。ゲルなどのマトリックスは、特定のサイズ分布を有する細孔を含む球状ビーズからなる。異なるサイズの分子がビーズ内に含まれるか又は細孔から除かれるとき、分子は、それらのサイズによって分離され得る。サイズのより小さい分子は細孔中に出ることができ、これにより、より小さな分子がＳＥＣカラムを通過するのに必要な期間が増加する。しかしながら、サイズの大きい分子は、細孔に入らない。大きな分子が細孔に入らないとき、それらはＳＥＣカラムの空隙体積中で溶出される。概して、大きな分子がＳＥＣカラムを通過する期間は、小さな分子の時間と比較して短い。このため、異なるサイズの分子がＳＥＣカラムを通過する期間が異なることを理由に、ＳＥＣカラムをとおして分子をサイズによって分離させることができる。ＳＥＣは、タンパク質複合体などの大きな分子又は高分子複合体を分離させるために使用することができる。一般に、ＳＥＣで使用される緩衝剤は、生体分子の天然構造及び配座を溶液中で保存することで、その天然構造及び配座を妨害することなく生体分子の分離を可能にするように配合される。

【0039】

本明細書で使用される場合、「分光光度計」という用語は、吸光分光光度計などの、吸収された光の強度を波長の関数として定量的に測定することができる機器を含む。分光光度計には、所望の波長を含む光ビームを生成するための単色光分光器又はプリズムと、キュベット又はフローセルに出入りする際のそのビームの強度の比を測定する手段とが含まれている。ＵＶ可視分光光度計では、好適なＵＶ及び／又は可視光源からの光のビームがプリズム又は回折格子単色光分光器を通過する。その後、光は、分析される試料通過した後、検出器に到達する。分光光度計はまた、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣシステムの一部であってもよく、検出器であってもよい。

【0040】

例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、ＡＡＶ試料又はバイオ医薬品中のＤＮＡ不純物を特徴付け、特定するための方法を提供する。本明細書に開示される実施形態はまた、ＡＡＶベクターからのパックされたＤＮＡの漏出を最小限に抑えるための方法及び組成物も提供する。

【0041】

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、ＡＡＶベクターを含む試料中の核酸不純物を特定する方法を提供し、本方法は、ＡＡＶベクターを含む試料をＳＥＣカラムに接触させる段階と、溶液を使用してＳＥＣカラムを洗浄し、少なくとも１つの溶離液を提供する段階と、分光光度計を使用して少なくとも１つの溶離液中の核酸不純物を特定する段階とを含む。一態様では、核酸不純物は、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムである。

【0042】

いくつかの例示的な実施形態では、本出願は、パックされた核酸を漏出させることからＡＡＶベクターを保護するための組成物を提供し、本組成物は、糖、アミノ酸、界面活性剤、又はポリオールを含む少なくとも１つの賦形剤を含む。一態様では、本出願の組成物の賦形剤は、約０．００１％～約１０％、約０．００１％～約８％、約０．００１％～約６％、約０．０５％～約５％、約０．１％～約１０％、約０．１％～約８％、約０．１％～約６％、約０．１％～約５％、約５％、約４％、約３％、約２．５％、約２％、約１．５％、約１％、約０．１％、約０．０５％、又は約０．００１％の濃度で存在する。

【0043】

一態様では、本組成物は、リン酸緩衝生理食塩水及び非イオン性界面活性剤を更に含む。別の態様では、本出願の組成物中の糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラフィノース、ラクトース、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、又はマルトヘプタオースである。別の態様では、本出願の組成物中のアミノ酸は、プロリンである。更に別の態様では、本出願の組成物中の界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８である。一態様では、本出願の組成物中の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり、界面活性剤は、約０．００１％～約０．２％、約０．１％、約０．０５％、又は約０．００１％の濃度で存在する。

【0044】

本システムは、前述のアデノ随伴ウイルス、サイズ排除クロマトグラフィー、分光光度計、ｓｓＤＮＡ、ＡＡＶベクター、及び賦形剤のうちのいずれにも限定されないことが理解される。

【0045】

本明細書で提供される方法ステップの数字及び／又は文字による連続的な標識は、方法又はその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文及び学術論文を含む種々の刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された参考文献の各々は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。それらは、例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0046】

分光光度計：分光光度計を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから得られた画分中のタンパク質及び核酸を検出しモニタリングした。タンパク質の検出は、２８０ｎｍでの吸光度を使用して行った。ＤＮＡ又はＲＮＡの検出は、２６０ｎｍでの吸光度を使用して行った。溶液中のタンパク質は、２８０及び２００ｎｍで最大となる吸光度で紫外線を吸収する。芳香環を伴うアミノ酸は、２８０ｎｍで吸光度ピークを有する。核酸は、分光光度計を使用して、２６０ｎｍで塩基によって吸収される紫外線放射の量を測定することによって定量化することができる。ＤＮＡヌクレオチドは、糖骨格、塩基、及びリン酸基を含む。塩基は窒素が豊富で、２６０ｎｍで光を吸収する。１ｃｍの光路長について、２６０ｎｍでの光学密度（２６０ｎｍでの吸光度、ＯＤ_２６０）は、以下の溶液について１．０に等しい：５０μｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ溶液、３３μｇ／ｍＬの一本鎖ＤＮＡ溶液、２０～３０μｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチド溶液、又は４０μｇ／ｍＬのＲＮＡの溶液。

【0047】

ＤＮＡ試料は、２６０ｎｍでの吸光度に影響を及ぼし得る不純物を含み得る。２６０／２８０ｎｍでの吸光度比を分析して、核酸純度を評価した。純粋なＤＮＡは、２６０／２８０ｎｍで吸光度比が約１．８．～２．０である。純粋なＲＮＡは、２６０／２８０ｎｍで吸光度比が約２．０である。高品質のＤＮＡ又はＲＮＡ試料は、２６０／２８０ｎｍで吸光度比が約１．７を上回るべきである。ＤＮＡ又はＲＮＡ溶液の２６０／２８０ｎｍで観察された吸光度比が低い場合、タンパク質又はフェノールによって引き起こされた汚染の可能性が示される。吸光度が２８０ｎｍで最大であると、タンパク質汚染の可能性が示される。吸光度が２３０ｎｍで最大であると、フェノラート又はチオシアネート汚染の可能性が示される。吸光度が３４０ｎｍで最大であると、微粒子によって引き起こされた光の散乱が示される。

【0048】

試料調製．凍結融解試験のために、１ｍＬのガラスバイアル中の１００μＬのＡＡＶ溶液を、－８０℃で少なくとも１時間凍結させ、続いて、室温で少なくとも３０分間解凍させて、１サイクルを完了させた。

【0049】

ＳＥ－ＵＰＬＣピーク１に対するベンゾナーゼの効果を特徴付けるために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をＡＡＶ８．ＧＦＰ溶液に１：５０の体積比で加え、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析の前に十分に混合した。

【0050】

製剤スクリーニング試験のために、異なるＡＡＶ血清型を３．７×１０^１２ｖｇ／ｍＬのゲノム力価に調整した。次に、２倍濃縮製剤緩衝液を異なるＡＡＶ血清型試料と混合して標的製剤を得て、これらの試料を凍結融解サイクルに供した。分析は、ｔ＝０で、１、２、４、又は１０回の凍結融解サイクル後に実施した。

【0051】

ＳＥ－ＵＰＬＣ．ＡＡＶ８．ＧＦＰ試料を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム内で実行する、細孔サイズ５００オングストロームのＳｅｐａｘ ＳＥＣ ５μｍ、４．６×３００ｎｍカラムを使用して分析した。１．８３×１０^１２ｖｇ／ｍＬで１、５、１０、１５、及び２０μＬの標準を注入することによって、較正曲線を構築した。次に、１０μＬのＡＡＶ８試料を注入し、２倍ＤＰＢＳを移動相として用いて０．５ｍＬ／分の流量で溶出させた。溶出をフォトダイオードアレイ検出器によってモニタリングし、更なる分析のために２１０～４００ｎｍの範囲のスペクトルを記録した。

【0052】

ＳＥ－ＵＰＬＣ溶出プロファイルにおいて異なる種を画分するために、Ｗａｔｅｒｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｒ－ＡｎａｌｙｔｉｃａｌをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムに接続し、対応する保持時間で溶出した画分を収集するために使用した。数回の繰り返し注入を行い、複数回の注入からの画分を一緒にプールし、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルタユニットで５倍まで濃縮（体積の減少）した。収集した画分を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供して、属性を確認した。

【0053】

次世代シーケンシング．Ｌｅｃｏｍｔｅらによって説明されているプロトコルを若干修正して使用し、試料調製を行った（Ｌｅｃｏｍｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ４（２０１５）ｅ２６０）。不純物ピーク（メイン溶出ピークの前のＳＥ－ＵＰＬＣプロファイルのピーク１）を特定するために、一切のＤＮａｓｅ処理なしでＤＮＡ単離を行った。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリ調製キットを製造業者の指示に従って使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリを調製した。最終プールを、１５０サイクルの中間出力キットを使用してＮｅｘｔＳｅｑ５５０においてシーケンシングした。社内のデータ分析パイプラインを使用して、シーケンシング読み取りを分析した。

【0054】

蛍光ベースの遊離ＤＮＡアッセイ．Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）ｓｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。使用前に、２００倍ストックＱｕａｎｔ－ｉＴ ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ試薬及び１００μｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチド標準を室温まで温めた。２０倍ストックＴＥ緩衝液を、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２０倍に希釈して、作用濃度（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）にした。次に、ユーザーガイドに従って、ＴＥ緩衝液を使用して、試薬及びオリゴヌクレオチド標準を作用濃度に希釈した。ＡＡＶ及びオリゴヌクレオチド標準試料を、ユーザーガイドにある比を使用して試薬と混合し、ＡＡＶ試料中のｓｓＤＮＡを、異なる濃度（０、１０、１００、５００、及び１０００ｎｇ／ｍＬ）のオリゴヌクレオチド標準を含む５つの試料から生成された標準線形曲線を使用して補間した。試料を３８４ウェルプレート中に配置し、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して分析した。励起波長及び発光波長を、それぞれ４８０ｎｍ及び５２０ｎｍに設定した。

【0055】

実施例１．ＡＡＶ試料中のＤＮＡ不純物の特徴付け
ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）をＨＥＫ－２９３細胞中で生成すると、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を伴うＰＢＳ中に少なくとも５×１０^１２ゲノムコピー／ｍＬを含むことが報告された。ＤＮＡ不純物の分析のために、ペイロードＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を含むＡＶＶ８、例えば、ＡＡＶ８－ＧＦＰを使用した。異なる量のＡＡＶ８－ＧＦＰ試料、例えば、１μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、又は２０μＬの試料を、ＳＥＣカラムを使用して分析した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムにＡＡＶ８－ＧＦＰ試料をロードした。図３に示されるように、分光光度計を使用して、ＳＥＣカラムを通過する画分をモニタリングし、２８０ｎｍでのＳＥＣ画分の吸光度を測定した。図３では、Ｙ軸は、吸光度単位（ＡＵ）における２８０ｎｍでの吸光度を表し、Ｘ軸は、カラムを通過する画分の保持時間として表される。図３に示されるように、１２～１５分間の保持時間でのＡＡＶ８－ＧＦＰウイルス粒子に対応する１つのメインピークが、ＳＥＣ溶出プロファイルにおけるＳＥＣ画分中で観察され、これは、分光光度計を使用して検出して、２８０ｎｍで有意な吸光度を有した。８～１１分間の保持時間で２８０ｎｍでの吸光度を有する１つの小さなピーク、例えば、図３のピーク１が、ＳＥＣ溶出プロファイルにおいて観察された。

【0056】

図４に示されるように、ＳＥＣ画分の蛍光強度も、２８０ｎｍの励起及び３５０ｎｍの発光でモニタリングした。図４では、Ｙ軸は、正規化された蛍光強度を表し、Ｘ軸は、ＳＥＣカラムを通過する画分の保持時間として表される。図３のメインピークに対応する画分は、図４に示されるように、１２～１５分間の同じ保持時間で有意な蛍光強度を有する類似のピークとして現れた。図３のピーク１に対応する画分は、図４に示されるように、８～１１分間の対応する保持時間で、検出可能な蛍光強度（２８０ｎｍの励起及び３５０ｎｍの発光）を示さなかった。

【0057】

更に、分光光度計を使用してＳＥＣ画分のピーク１及びメインピークを分析し、核酸純度を評価するためにＵＶ２６０／２８０ｎｍでの吸光度比を測定した。表１に示されるように、ＳＥＣ画分のピーク１は、ＵＶ２６０／２８０ｎｍについて１．７の読み取りを示し、タンパク質汚染のないＤＮＡの良好な純度が示された。メインピークのＳＥＣ画分は、２６０／２８０ｎｍでのＵＶについて１．３の読み取りを示し、タンパク質の存在が示された。バルクＤＳ（ＡＡＶバイオ医薬品を含む原薬）のＵＶ可視は、精製ＡＡＶベクターに対応する２６０／２８０ｎｍでのＵＶについて１．３の読み取りを示した。ＡＡＶ８－ＧＦＰ試料をヌクレアーゼで処理すると、ピーク１の強度が有意に低下した。これらの結果により、ピーク１に対応するＳＥＣ画分がＤＮＡを含むことが示された。更に、結果により、ＳＥＣ画分のピーク１がＡＡＶゲノムのｓｓＤＮＡを含み得ることが示された。

【0058】

（表１）ＳＥＣ画分の２６０／２８０ｎｍでの吸光度比

【0059】

ピーク１がタンパク質汚染のない高純度ＤＮＡを含んだことが結果により示されたため、ＳＥＣと吸光度の測定との組み合わせを効果的に使用して、ＡＡＶ試料中のｓｓＤＮＡ不純物を定量化し得る。ＡＡＶ試料をＳＥＣカラムにロードして、ＡＡＶベクターからＤＮＡ不純物を分離させ得る。ＳＥＣ画分を吸光度２８０ｎｍでモニタリングして、ＳＥＣ溶出プロファイルにおけるＤＮＡ不純物及びＡＡＶベクターを特定し得る。続いて、ＤＮＡ不純物を含むＳＥＣ画分を、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量化し得る。ＤＮＡの純度は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度比を測定することによって評価し得る。精製ＡＡＶ試料中のＤＮＡ不純物は、凍結融解サイクル及び撹拌などの逸脱した貯蔵条件中にＡＡＶキャプシドから漏出したｓｓＤＮＡを含んでもよい。

【0060】

実施例２．凍結融解サイクルの処理後のｓｓＤＮＡ漏出の特徴付け
現在、ＡＡＶ遺伝子療法薬物製品は、製品の品質及び安定性を保存するために凍結液体として貯蔵され、したがって、ＡＡＶ粒子は、製造、輸送、貯蔵、及び投与中に複数回の凍結融解サイクルに供される。このため、ＡＡＶ８製剤の安定性を理解し、可能性のある分解経路を決定するために、複数回の凍結融解サイクルを、特性評価及び安定性試験においてストレス条件のうちの１つとして選択した。

【0061】

ＧＦＰペイロードを含むＡＡＶ８を原料として使用し、凍結融解サイクルの処理後のｓｓＤＮＡ漏出を特性評価した。ｐＨ７．４の０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を伴うＰＢＳ中の８．３４×１０^１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ８－ＧＦＰを含む原料を、この分析に使用した。この原料を使用して、異なるＡＡＶ力価を含む試料を調製した。原料を、Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルタを使用して濃縮し、２倍（濃縮２倍）、４倍、及び１０倍での力価などの所望の標的濃度（より高い濃度）に到達させた。ＡＡＶベクターを含む試料を－８０℃で１時間以上凍結させ、続いて室温で０．５時間以上解凍させることによって、凍結融解サイクルを実施した。別途記載のない限り、試料処理のために８回の凍結融解サイクルを実施した。

【0062】

図５のＳＥＣクロマトグラムに示されるように、原料（図５のＡＡＶ８．ＧＦＰ）及び試料を異なる力価、例えば、２倍、４倍、及び１０倍での力価で含むＳＥＣカラムに、８回の凍結融解サイクルで処理したＡＡＶ８－ＧＦＰ試料をロードした。分光光度計を使用して、ＳＥＣカラムを通過する画分をモニタリングし、２８０ｎｍでのＳＥＣ画分の吸光度を測定した。図５では、Ｙ軸は、２８０ｎｍ（ＵＶ）での正規化された吸光度を表し、Ｘ軸は、ＳＥＣカラムを通過する画分の保持時間として表される。図５に示されるように、１２～１５分間の保持時間でのＡＡＶ８－ＧＦＰウイルス粒子に対応する１つのメインピークが、ＳＥＣ溶出プロファイルにおけるＳＥＣ画分中で観察された。このメインピークは、分光光度計を使用して検出して２８０ｎｍでの有意な吸光度を有した。図５のピーク１と表示される、８～１１分間の保持時間で２８０ｎｍでの吸光度を有する１つの小さなピークが、ＳＥＣ溶出プロファイルにおいて観察された。

【0063】

ＳＥＣ溶出プロファイルにおけるピーク１のサイズは、ＡＡＶ８－ＧＦＰ試料に対する８回の凍結融解サイクルの処理後に有意に増加した。ピーク１のサイズの増加は、ＡＡＶ８－ＧＦＰの濃度、例えば、ＡＡＶの力価に依存していた。表２は、ＳＥＣ溶出プロファイルにおける８回の凍結融解サイクルの処理前後のピーク１のサイズ変動を示す。これらの結果により、ピーク１のサイズが凍結融解処理後に有意に増加したことが示され、凍結融解処理後のウイルスキャプシドからのＡＡＶゲノムのｓｓＤＮＡの放出が示された。更に、分光光度計を使用してＳＥＣ画分のピーク１及びメインピークを分析し、核酸純度を評価するためにＵＶ２６０／２８０ｎｍでの吸光度比を測定した。表３に示されるように、ＳＥＣ画分のピーク１は、ＵＶ２６０／２８０ｎｍについて２．１の読み取りを示し、タンパク質が最小限であるＤＮＡの良好な純度が示された。ＳＥＣ画分のメインピークは、ＵＶ２６０／２８０ｎｍについて１．４の読み取りを示し、タンパク質の存在が示された。バルクＤＳのＵＶ可視は、ウイルス粒子に対応する２６０／２８０ｎｍでのＵＶについて１．３の読み取りを示した。

【0064】

加えて、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、試料中のＡＡＶベクターについての球のサイズ分布プロファイルを決定した。表４は、ＤＬＳによって検出した、８回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクルの処理の前後のＡＡＶベクターの流体力学半径（単位ｎｍ）を示す。

【0065】

（表２）凍結融解処理前後のピーク１のサイズ変動

【0066】

（表３）ＵＶ２６０／２８０ｎｍでの画分のＳＥＣ吸光度比

【0067】

（表４）ＡＡＶベクターの流体力学半径

【0068】

凍結融解処理後のＡＡＶウイルスキャプシドからのｓｓＤＮＡの放出を特性評価し、ｓｓＤＮＡに特に結合する蛍光色素を使用して定量化した。凍結融解（Ｆ／Ｔ）処理後、蛍光色素をＡＡＶ８－ＧＦＰ試料にスパイクした。標準曲線を生成するために、異なる濃度の合成オリゴヌクレオチドを含む試料を標準として調製した。２５μＬのｓｓＤＮＡ標準溶液を２５μＬの１倍色素溶液と混合して、１０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲のｓｓＤＮＡを得ることによって、標準曲線を調製した。標準を分析して、３８４ウェルプレート中の５０μＬ試料について励起４８０ｎｍ及び放出５２０ｎｍで蛍光を検出した。

【0069】

５回の凍結融解サイクル（Ｆ／Ｔ ５回）又は１０回の凍結融解サイクル（Ｆ／Ｔ １０回）など、複数回の凍結融解サイクルで処理した、又は４８時間水平に振盪したＡＡＶ８－ＧＦＰ試料を、ｓｓＤＮＡ濃度について定量化した。図６は、凍結融解処理及び４８時間の振盪後のＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のｓｓＤＮＡ濃度の定量化を示す。図６に示されるように、凍結融解処理及び振盪後に、ＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のｓｓＤＮＡ量が増加した。図６のＹ軸は、ｓｓＤＮＡ濃度をｎｇ／ｍＬ単位で表す。

【0070】

ｓｓＤＮＡ漏出に対する凍結融解サイクルの影響を更に評価するために、ＳＥ－ＵＰＬＣを使用して、凍結融解ストレスに起因するＡＡＶ８．ＧＦＰ試料中のサイズ変動レベルの変化を測定した。図７に示されるように、ｔ＝０での未処理のＡＡＶ８．ＧＦＰ試料のＳＥ－ＵＰＬＣ溶出プロファイルは、保持時間７．９分前後でメインピークを示し、本明細書ではピーク１と称される早期溶出ピークはおよそ６．３分であった。興味深いことに、ピーク１は１０回の凍結融解サイクル後にピーク面積及びピーク高さが増加した。ピーク１はＳＥ－ＵＰＬＣプロファイルにおけるメインピークよりも早く溶出したため、これに対する可能性のある説明は、６．３分前後でのピークがＡＡＶキャプシドの凝集体などの高分子量種であることである。

【0071】

ピーク１種を更に特性評価するために、ＡＡＶ８．ＧＦＰ試料のＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムから２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで収集したＵＶシグナルを分析した。概して、ＵＶ２６０／２８０比が０．６である試料は「純粋な」タンパク質とみなされ、ＵＶ２６０／２８０比が１．８である試料は「純粋な」ＤＮＡとみなされる（Ｗｉｌｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２（３）（１９９７）４７４－４８１、Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｚｌｏｔｎｉｃｋ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０７（２）（２０１０）２８１－２８８）。ＳＥ－ＵＰＬＣによって分析したＡＡＶ８試料について、ピーク１のＵＶ２６０／２８０比は１．８であり、メインピークのＵＶ２６０／２８０比は１．２であった（表５）。メインピークについて観察されたＵＶ２６０／２８０比により、タンパク質とＤＮＡとの両方からのＵＶ吸光の寄与が示され、これは、ｓｓＤＮＡゲノムを封入するＡＡＶキャプシドを表すメインピークと一致する。ピーク１で観察されたＵＶ２６０／２８０比は、代わりに２８０ｎｍでのタンパク質吸光度からの寄与に起因してＵＶ２６０／２８０比がより低いＡＡＶ凝集体ではなく、ＤＮＡ不純物を示唆している。

【0072】

（表５）ＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムにおけるプレピーク及びメインピークのＵＶ２６０／２８０比

【0073】

この不純物ピークの属性を確認するために、蛍光検出器に接続したＳＥ－ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ－ＦＬＲ）、ヌクレアーゼ処理、及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、追加の特性評価を行った。まず、蛍光検出器を液体クロマトグラムシステムに接続し、励起２８０ｎｍ及び発光３５０ｎｍで蛍光シグナルを収集した。蛍光検出器では、メインピークのみが観察され、ＵＶクロマトグラムで見られるピーク１は存在しなかった。この観察により、タンパク質含有種としてではなく、ＤＮＡとしての不純物ピークの組成が更に確認された。第２に、ベンゾナーゼを使用して、ＡＡＶ８．ＧＦＰ試料を処理した。ベンゾナーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして周知であり、様々な目的で試料中のＤＮＡを消化するために広く使用されてきた（Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（２）（２００４）２２１－２２６、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １２１６（１７）（２００９）３６０６－３６１２、Ｋｏｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２１（２）（２００５）４６６－４７２）。図８に示されるように、約６．３分でのピーク１の強度は著しく（ほぼベースラインレベルに）減少し、同時にメインピークの高さも低下した。これらのデータにより、ＳＥ－ＵＰＬＣの主要な種の前に溶出した不純物のピークは実にＤＮＡであったことが示される。

【0074】

分子レベルでピーク１の属性を決定するために、これを、５．８～７．２分間溶出させた画分を収集し、得られたプール画分を５倍に濃縮することによって、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用したＮＧＳ分析用に選択的に濃縮した（表６）。濃縮プールを使用して、一本鎖ＤＮＡウイルスシーケンシング（ＳＳＶ－Ｓｅｑ）のためのＬｅｃｏｍｔｅらのプロトコルに従って、ＮＧＳライブラリを調製した（Ｌｅｃｏｍｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ２０１９，ｐｐ．８５－１０６）。ＳＳＶ－Ｓｅｑプロトコルは、４つの実験ステップ：（ステップ１）ＡＡＶプールからのＤＮＡ抽出、（ステップ２）第２鎖ＤＮＡ合成、（ステップ３）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリの調製、及び（ステップ４）Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームに基づくハイスループットシーケンシングで構成される。データ分析は、社内の専用バイオインフォマティクスパイプラインを使用して行った。ＳＳＶ－Ｓｅｑは、（例えば、プライマーを生成するために必要とされるように）いずれの事前の知識もなくＤＮＡ種を検出し、特定することができるので、（例えば、ｑＰＣＲとは対照的に）配列に依存しない技法である。

【0075】

（表６）ＡＡＶ８．ＧＦＰのＳＥ－ＵＰＬＣクロマトグラムにおける濃縮プレピークのＮＧＳ結果

【0076】

ベンゾナーゼ処理により不純物ピークが除去されたことを観察したら、いずれのＤＮａｓｅ処理も用いずにＤＮＡ単離を行った。読み取りを、以下の参照配列の各々に割り当てた：（ｉ）ＣＡＧ－ｅＧＦＰ ｂＧＨｐＡゲノムを含むＩＴＲ、（ｉｉ）ベクタープラスミドの細菌骨格、（ｉｉｉ）Ｒｅｐ－Ｃａｐ８プラスミド全体、（ｉｖ）ヘルパープラスミド全体、（ｖ）ＨＥＫ２９３パッケージング細胞株ゲノムに組み込まれたＡｄ５ゲノムの断片、及び（ｖｉ）ヒトゲノム一次アセンブリＧＲＣｈ３８。

【0077】

ＮＧＳからの読み取りの大部分は、ＣＡＧ－ｅＧＦＰゲノム（約９７％）にマッピングされ、続いて、より少量が、ベクタープラスミド骨格（約１．２％）、Ｒｅｐ－Ｃａｐ８（約１～１．１％）、及びヘルパープラスミド（０．６％）に一致した。いずれの読み取りも、ヒトゲノムにはマッピングされなかった。これらの観察により、ＤＮＡ不純物がＡＡＶベクターゲノムとして明白に特定された。

【0078】

ＡＡＶ試料中の遊離ＤＮＡの絶対量を定量化するために、十分に確立されたＱｕａｎｔ－ｉＴ ｓｓＤＮＡアッセイを使用した。このアッセイでは、外部蛍光色素を試験試料に加えて、励起時にｓｓＤＮＡの蛍光シグナルを増幅した。様々な濃度のオリゴヌクレオチドによる標準曲線を確立し、未知の試料中のＤＮＡ濃度を計算するために使用した。図９に示されるように、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ｓｓＤＮＡ検出アッセイにより、１０回の凍結融解サイクル後に、ベース製剤（１倍ＤＰＢＳ、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）中で、ＡＡＶ８．ＧＦＰ試料中の遊離ｓｓＤＮＡの絶対量が３６４ｎｇ／ｍＬから１３０３ｎｇ／ｍＬに３．６倍増加したことが示された。９５℃で１０分間加熱したベース製剤中のＡＡＶ８．ＧＦＰの対照試料は、３４０００ｎｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡを含んだ。９５℃での熱処理により、封入されたｓｓＤＮＡの１００％が放出されたと仮定すると、これらのデータにより、遊離ｓｓＤＮＡの濃度が、１０回の凍結融解サイクル後に、ＡＡＶ８．ＧＦＰ試料中の全封入ｓｓＤＮＡの約１％から４％に増加したことが示された。最近になって、Ｂｅｅらが、類似の色素ベースの方法により、凍結融解サイクル後にＡＡＶ８－Ｘ試料中で遊離ＤＮＡが増加したことを報告した（Ｂｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０２１）。ポロキサマー１８８を含むＤＰＢＳ緩衝液では、凍結融解サイクル当たりの遊離ＤＮＡの０．３８％±０．０８％の増加が観察された。Ｂｅｅらは、初期試料中ほぼ１％の遊離ＤＮＡ、及び５回の凍結融解サイクル後にほぼ３％の遊離ＤＮＡを観察し、これは、本明細書に記載の発明者らのデータと一致する。要約すると、ＳＥ－ＵＰＬＣプロファイルにおいてプレピーク、ピーク１として提示される産物関連不純物は、ＡＡＶキャプシドから漏出したｓｓＤＮＡであった。

【0079】

実施例３．他のＡＡＶ血清型におけるｓｓＤＮＡ漏出
ｓｓＤＮＡ漏出がＡＡＶ８．ＧＦＰに固有であるかどうかを決定するために、前述の分析を異なるＡＡＶ血清型：ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、及びＡＡＶＤＪのパネルに適用した。全ての試料を、同じベース製剤中のＡＡＶ８試料と同じ力価に調整した。次に、これらの試料を１０回の凍結融解サイクルに供し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴアッセイ及びＳＥ－ＵＰＬＣによって分析した。図１０に示されるように、全ての試験されたＡＡＶ血清型は、当初、非常に低レベルの遊離ＤＮＡを示した。１０回の凍結融解サイクルの後、ＡＡＶ２を除く全ての試料において、ピーク１不純物のＵＶシグナル（ＳＥ－ＵＰＬＣ）及び蛍光シグナル（Ｑｕａｎｔ－ｉＴアッセイ）の有意な増加が観察された。凍結融解による全漏出ｓｓＤＮＡの絶対量は試料間で異なっていたが、ＡＡＶ２を除く全てのＡＡＶ血清型についてｓｓＤＮＡ漏出が検出された。この結果により、凍結融解ストレスに起因するＡＡＶ８キャプシドからのｓｓＤＮＡ放出の機序が他の血清型にも適用可能であることが示唆される。

【0080】

ＡＡＶの様々な血清型にわたって、キャプシドタンパク質配列における主な違いは、それらが様々な効率で様々な種類の細胞に結合することを可能にする超可変表面領域にある（Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ２０１１）。キャプシドタンパク質に関与する複製及び構造遺伝子は、概して、血清型にわたって高度に保存されており、このことが、それらを同様に凍結融解ストレスに対して感受性にしている可能性がある。したがって、凍結融解ストレス中のＡＡＶ安定性に対する賦形剤の影響は、これらのＡＡＶ血清型の各々に適用可能であり得る。

【0081】

実施例４．ＤＮＡ漏出を低下させる賦形剤スクリーニング
封入されたｓｓＤＮＡの完全性及び送達成功は、ＡＡＶベースの遺伝子療法に不可欠であるため、凍結融解ストレスを含む様々な条件下でのＡＡＶキャプシドからのｓｓＤＮＡの漏出を最小限に抑えることが重要である。タンパク質安定化賦形剤をＡＡＶ製剤に加えることは、凍結融解ストレスに対するＡＡＶ安定性を支援してもよく、またｓｓＤＮＡ漏出機序の理解にも寄与し得る。したがって、キャプシドタンパク質を安定化することによって、凍結融解サイクル中のｓｓＤＮＡ漏出を低下させることができるかどうかを試験するために、タンパク質安定化賦形剤を含む製剤を設計した。ＤＰＢＳ緩衝液は、生理学的条件との一貫性に起因してＡＡＶに一般的に使用されるため、これをベース製剤として選択した。ポリオール（スクロース、トレハロース、マンニトール、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール）、アミノ酸（プロリン）、及び界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８））を含む賦形剤のいくつかの一般的なカテゴリーを選択して、それらが凍結融解ストレスに対してタンパク質の安定性（例えば、ＡＡＶキャプシドの完全性）を保護し、それによりｓｓＤＮＡ漏出を低下させ得る能力を評価した。

【0082】

図９に示されるように、蛍光ベースの遊離ＤＮＡアッセイ及びＳＥ－ＵＰＬＣ分析の結果により、ベース製剤（ベース）と比較して、設計された製剤が、１０回の凍結融解サイクル後のｓｓＤＮＡの漏出を減少させたことが示された。例えば、図９Ａ及び表７に示されるように、５％スクロース又は５％トレハロースを加えると、ＳＥ－ＵＰＬＣによって検出して、ｓｓＤＮＡの漏出が４倍の増加から２倍未満の増加に低下した。図９Ｂ及び表８に示されるように、蛍光遊離ＤＮＡアッセイによって検出して、５％スクロース又は５％トレハロースを加えると、ｓｓＤＮＡ漏出が３．６倍の増加から５０％未満の増加に低下した。しかしながら、５％マンニトールは、ｓｓＤＮＡ漏出を低下させる上で、スクロース及びトレハロースほど有効ではなかった。スクロース及びトレハロースと同様に、５％グリセロール、５％プロピレングリコール、又は５％ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）は、ＳＥ－ＵＰＬＣによって検出して、ｓｓＤＮＡ漏出を、４倍の増加から５０％未満の増加に、蛍光遊離ＤＮＡアッセイによって検出して、３．６倍の増加から約５０％の増加に低下させた。ＡＡＶ産物製剤で使用されることが多い界面活性剤である０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、スクロース及びトレハロースに匹敵する、ｓｓＤＮＡ漏出からＡＡＶを保護する能力を示した。プロリンも、アミノ酸凍結保護剤として、蛍光遊離ｓｓＤＮＡアッセイ及びＳＥ－ＵＰＬＣ分析に基づいて、ｓｓＤＮＡ漏出に対する有意な保護効果を示した。加えて、図１１及び表９に示されるように、ＤＬＳを使用して、試料中のウイルス粒子の流体力学半径を分析した。

【0083】

（表７）ＳＥＣを使用したＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のＤＮＡ不純物の特性評価

【0084】

（表８）蛍光色素標識を使用したＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のｓｓＤＮＡ不純物の定量化

【0085】

（表９）ＤＬＳを使用したＡＡＶ８－ＧＦＰ試料中のウイルス粒子の流体力学半径の分析

【0086】

いくつかの賦形剤が、凍結融解サイクルの処理後にＡＡＶキャプシドからのｓｓＤＮＡの漏出を最小限に抑えるのに有効であることが判明した。試験中にｓｓＤＮＡ漏出を効果的に低下させることができる賦形剤には、スクロース、トレハロース、マンニトール、プロリン、グリセロール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、及びプロピレングリコールが含まれる。これらの結果に基づいて、スクロース、プロピレングリコール、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を、更なる分析のために選択した。ＡＡＶ薬物製品の開発、製造、及び投与中の凍結融解サイクルの代表的な数を反映する、１、２、又は４回の凍結融解サイクル後の分析のために、様々な濃度のスクロース（２．５％、５％、及び１０％）、プロピレングリコール（２．５％、５％、及び１０％）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（０．００１％、０．０１％、及び０．１％）を含む製剤を選択した。図１２に示されるように、Ｆ１中のＡＡＶにより多くの凍結融解サイクルを適用したため、ｓｓＤＮＡ漏出の増加が観察された。４回の凍結融解サイクルの後、スクロースとプロピレングリコールとの両方が、３つの試験濃度（２．５％、５％、及び１０％）にわたってｓｓＤＮＡ漏出に対する有意な保護及び同等の保護を呈した。より高い濃度のスクロース及びプロピレングリコールでは、わずかに少ないｓｓＤＮＡ漏出が観察された。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、スクロース及びプロピレングリコールよりもｓｓＤＮＡ漏出の防止には効果的ではなかった。とはいえ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８濃度を増加させると、ｓｓＤＮＡ漏出はますます低下した。

【0087】

凍結保護剤及び界面活性剤は、通常、様々な種類のストレスに対する保護を提供するために、生物学的製剤において一緒に使用される。凍結融解ストレスに対する組み合わせた賦形剤の効果を試験し、タンパク質安定化賦形剤が他の血清型においてｓｓＤＮＡ漏出を低下させるかどうかを試験するために、スクロースとＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８との両方を含む製剤を設計し、様々なＡＡＶ血清型で評価した。

【0088】

図１３では、ベース製剤（ＢＦ）はＤＰＢＳであり、一方で最適化製剤（ＯＦ）は、ＤＰＢＳ中に１０％スクロース及び０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含んだ。最適化製剤は、スクロース及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含まないベース製剤と比較して、１０回の凍結融解サイクル後に、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶＤＪについて、ｓｓＤＮＡ漏出を劇的に阻害した。蛍光ベースの遊離ＤＮＡアッセイにより、ｓｓＤＮＡ漏出の低減は１０～２０倍であり、ＳＥ－ＵＰＬＣにより、ｓｓＤＮＡ不純物ピーク面積の低減は、３～１０倍の範囲であり、ＡＡＶＤＪについては４０倍の低減が観察された。興味深いことに、ＡＡＶ２については、保護効果はわずかであり、これは、凍結保護剤及び界面活性剤なしの遊離ＤＮＡ漏出が他の血清型と比較して取るに足らなかったことを理由とする可能性が高い。これらの知見に基づくと、凍結保護剤及び界面活性剤を含む最適化製剤は、様々なＡＡＶ血清型を凍結融解ストレスから保護し得る。

【0089】

賦形剤は、それらの特性と、タンパク質安定化のための確立された機序とに基づいて選択する。ポリオールのサブタイプとしてのスクロース及びトレハロースは、タンパク質を安定させるために最も一般的に使用される糖ベースの賦形剤の１つである（Ｓｉｎｇｈ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ２０１８，ｐｐ．６３－９５）。グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール（これらの実験のためにはＰＥＧ ４００）も、タンパク質分子のための従来のポリオール凍結保護剤である。凍結保護剤は、タンパク質表面からの優先的排除、タンパク質分子の周りにガラス状マトリックスを形成すること、又はタンパク質と水素結合を形成することを含む様々な機序により機能する（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２２（１）（１９９３）６７－９７、Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３（１）（２０１３）１－１０、Ｍａｒｋａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ４９（１）（２００４）１－９）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、製造及び輸送中の機械的ストレス及び凍結融解サイクル中の界面ストレスに対抗する界面活性剤としてＡＡＶ製剤に加えられ、これらの目的のためにタンパク質医薬品に一般的に使用される（Ｎａｉｌ ａｎｄ Ａｋｅｒｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ２０１２）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８は、非イオン性界面活性剤として、機械的撹乱及び凍結融解サイクルによって創出される界面での表面張力を低下させることができ、よって、界面活性剤との競合に起因して界面でのタンパク質の吸収を阻害する（Ｋａｓｉｍｂｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０８（１）（２０１９）１５５－１６１、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ９７（２０１５）６０－６７、Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（７）（２０１３）１８４８－１８５９）。これらの賦形剤がタンパク質構造の安定化及び安定性の維持に果たす役割を考えると、これらの知見はまた、ＡＡＶキャプシドにおけるｓｓＤＮＡ漏出機序の解明を裏付ける。

【0090】

これらの安定性試験では、凍結融解サイクル後のＡＡＶ溶液中の遊離ｓｓＤＮＡのレベルの増加が観察された。凍結融解処理前のバルク原薬中の遊離ｓｓＤＮＡは、細胞培養又は精製から持ち越された残留ＤＮＡであり得るが、複数回の凍結融解サイクル後の増加したｓｓＤＮＡは、ＡＡＶキャプシドから漏出したことが示されたゲノムｓｓＤＮＡである。これは、ＮＧＳの特性評価結果によって裏付けられ、タンパク質安定化賦形剤が凍結融解後のｓｓＤＮＡの漏出を阻害したという観察と一致する。ｓｓＤＮＡの漏出がゲノム排出（すなわち、キャプシドが無傷の状態）をとおして生じたのかＡＡＶキャプシドの分解を介して生じたのかを、以下で更に考察する。

【0091】

ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、５０～８０℃でのインキュベーションなどの熱ストレス下での分解機序を探索するために、単一ウイルスキャプシドレベルで調査されている（Ｂｅｒｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ４４（２）（２０１８）１８１－１９４）。封入されたＤＮＡゲノムを、無傷又は部分的に折り畳み解除されたキャプシドから排出し、これを原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって視覚化した。仮に、排出がｓｓＤＮＡ漏出の主な機序である場合、完全なキャプシドの力価は、時を同じくした空のキャプシドの力価の増加と共に減少するはずであり、完全なキャプシドと空のキャプシドとの合計は、ストレスの前後で一定のままであるはずである。あるいは、ｓｓＤＮＡの漏出がＡＡＶの分解（すなわち、キャプシドの破裂）によって生じる場合、全キャプシド力価は、完全なキャプシドの力価の減少に起因して、ストレス後に減少するはずであり（空のキャプシドの力価は影響を受けないままであるはずである）。遊離ｓｓＤＮＡは、未処理のＡＡＶ試料中の全封入ｓｓＤＮＡの約１％であり、１０回の凍結融解サイクル後に約５％に増加したため、完全／空のキャプシド力価の変化は、同程度のレベルであるはずである。

【0092】

残念ながら、キャプシド力価についての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおける典型的な１０～２０％の変動係数（ＣＶ％）では、キャプシド力価の１％～５％の同時変化が、遊離ｓｓＤＮＡの１％～５％の変化と共に生じているかどうかを決定することは困難である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでのＳＥ－ＵＰＬＣ分析は、方法の分散並びに近似及び推定の限界（例えば、ｓｓＤＮＡ及びキャプシドタンパク質の消失係数及び分子量、並びにＵＶ検出器内のフローセルの経路長）に起因して、分解機序の決定において同様に決定的ではなかった。ＳＥ－ＵＰＬＣの代替方法として動的光散乱（ＤＬＳ）を利用して、サイズ変動をモニタリングしたが、明らかなＡＡＶ凝集又は断片化は見られなかった。ＳＥ－ＵＰＬＣ溶出プロファイルを注意深く調べたところ、同じく、ＡＡＶキャプシド後のいずれの明らかなＶＰタンパク質ピークも明らかにならなかった。要約すると、ＤＬＳ及びＳＥ－ＵＰＬＣ方法（可能性としてはＥＬＩＳＡも）の変動性により、ＡＡＶからのｓｓＤＮＡ漏出の機序の決定的な解明が妨げられた。ｓｓＤＮＡ漏出機序をよりよく理解するために、より正確かつ精密な力価方法による更なる調査が必要とされ得る。先に述べたように、ＡＦＭのような可視化ツールも、凍結融解サイクル後のキャプシド完全性の展望を提示し、機序の理解に寄与し得る。

【0093】

ＡＡＶベースの遺伝子療法薬物製品は、通常、製造、輸送、貯蔵、及び投与中に１回以上の凍結融解サイクルを受ける。ＤＰＢＳ緩衝液中のＡＡＶ８の本特性評価により、封入されたｓｓＤＮＡの一部が、１回の凍結融解サイクルの後でもＡＡＶ８から漏出したことが明らかとなった。漏出したｓｓＤＮＡの属性は、最初はキャプシドに封入されていたゲノムＤＮＡであると確認された。ゲノム漏出の程度は、凍結融解サイクルの数が増えると共に増加した。ゲノム漏出は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、及びＡＡＶＤＪを含む他の試験した血清型でも様々な程度で観察された。

【0094】

製剤スクリーニング試験により、ＡＡＶからのゲノムＤＮＡ漏出を阻害するのに有効である、ポリオール、アミノ酸、及び界面活性剤などの賦形剤が特定された。スクロース、プロピレングリコール、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を用いた更なる研究により、ｓｓＤＮＡ漏出に関するＡＡＶ安定性に対するそれらの効果のより良い理解が得られた。これらの結果は、凍結融解からのストレスを分解経路とする、ＡＡＶからのｓｓＤＮＡ漏出に関する洞察を提供する。更に、これらの知見は、安定したＡＡＶ原薬及び薬物製品製剤の将来的な開発に役立つ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【国際調査報告】