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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-17
(54)【発明の名称】架橋可能なアリルアミドポリマー
(51)【国際特許分類】
C08L 79/04 20060101AFI20231110BHJP
C08G 73/02 20060101ALI20231110BHJP
A61K 8/84 20060101ALI20231110BHJP
A61Q 1/00 20060101ALI20231110BHJP
【ＦＩ】
C08L79/04 B
C08G73/02
A61K8/84
A61Q1/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524081
(86)(22)【出願日】2021-10-19
(85)【翻訳文提出日】2023-04-28
(86)【国際出願番号】 EP2021079003
(87)【国際公開番号】W WO2022084351
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】20202622.5
(32)【優先日】2020-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】505308917
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート ゲント
(71)【出願人】
【識別番号】518224598
【氏名又は名称】クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(74)【代理人】
【識別番号】100183656
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 晃
(74)【代理人】
【識別番号】100224786
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 卓之
(74)【代理人】
【識別番号】100225015
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 彩夏
(72)【発明者】
【氏名】フーゲンブーム，リチャード
(72)【発明者】
【氏名】ダーガヴィル，ティム
【テーマコード（参考）】
4C083
4J002
4J043
【Ｆターム（参考）】
4C083AD071
4C083AD072
4C083CC01
4C083CC02
4C083DD41
4C083FF01
4J002CM011
4J002EV026
4J002FD146
4J002GB00
4J002GC00
4J043PA02
4J043PA04
4J043PC036
4J043QA08
4J043RA08
4J043SA36
4J043SB03
4J043UB081
4J043XA04
4J043XA19
4J043ZB03
4J043ZB51
(57)【要約】
本発明は、アリルアミド側鎖を有するポリ（２－オキサゾリン）またはポリ（２－オキサジン）ポリマーまたはコポリマーと架橋剤との組み合わせ、それによって得られる架橋組成物、およびそれらのヒドロゲルに関連する。さらに、本発明は、本明細書に記載の組み合わせ、組成物、およびヒドロゲルを提供する方法、ならびにそれらの使用を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
- 以下に示す式を有する２つ以上のアリルアミド側鎖を有するポリマーまたはコポリマー【化1】
- 架橋剤、を含む組成物であって、
ここで、該ポリマーまたはコポリマーは、ポリ(2-オキサゾリン)またはポリ(2-オキサジン)骨格を有するものであり、および、前記ポリマーまたはコポリマーのアリルアミド側鎖および架橋剤は互いに架橋されている、組成物。
【請求項2】
架橋剤は、２つ以上のチオール基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ポリ(2-オキサゾリン)またはポリ(2-オキサジン)骨格は、次の式Ｙで表される：【化2】
【請求項4】
前記ポリマーまたはコポリマーが、2-メチル-2-オキサゾリン、2-エチル-2-オキサゾリン、2-プロピル-2-オキサゾリン、2-メチル-2-オキサジン、2-エチル-2-オキサジンおよび2-プロピル-2-オキサジンから選択されるモノマー単位を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記コポリマーが、１つ以上のアリルアミド側鎖を有する第１の2-オキサゾリンまたは2-オキサジンモノマー、およびアリルアミド側鎖を有さない第２の2-オキサゾリンまたは2-オキサジンモノマーを、95-5から5-95、好ましくは、70-30から10-90、より好ましくは、40-60 から10-90の比で含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記ポリマーまたはコポリマーが、式（Ｉ）で表され：(X - Z )n - Y (I)
式中、
Xはアリルアミド側鎖を表し;
Zは直接結合またはスペーサー、特にスペーサーを表し;
Yは、請求項３で規定されるポリ (2-オキサゾリン) またはポリ (2-オキサジン) 骨格を表し；および
ｎは２以上の整数である、請求項３～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ポリマーまたはコポリマーが、約５０から１０００までの、好ましくは１００から８００までの、より好ましくは２００から５００までの重合度を有するものであって、重合度は、多角度光散乱検出器を使用して絶対分子量値を決定するサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物を含むヒドロゲル。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物を提供する方法であって、以下の工程： a)
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のポリマーまたはコポリマー；および
- 請求項１または２に記載の架橋剤；
を提供する工程、
b)
ポリマーまたはコポリマーを架橋剤で硬化させ、それによって前記組成物を得る工程、
を含む、方法。
【請求項10】
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のポリマーまたはコポリマー；および- 請求項１または２に記載の架橋剤、
の組み合わせを含む、（バイオ）インク。
【請求項11】
３Ｄプリンティング、２光子重合、バイオプリンティングまたは生体材料のためのインクとしての請求項１０に記載の（バイオ）インクの使用。
【請求項12】
ヒトまたは獣医学において使用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物、請求項８に記載のヒドロゲル、または請求項１０に記載の組み合わせ。
【請求項13】
薬物送達、細胞送達、生物工学用途のいずれか１つにおいて使用するための、請求項１２に記載の組成物、ヒドロゲル、または組み合わせ。
【請求項14】
食品産業、化粧品のいずれか１つにおける、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物、請求項８に記載のヒドロゲル、または請求項１０に記載の組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は高分子化学およびヒドロゲルの分野に関連する。より具体的には、本発明は、アリルアミド側鎖を有するポリマーおよび架橋剤を含む組み合わせ、それによって得られる架橋組成物、およびそれらのヒドロゲルに関する。さらに、本発明は、本明細書に記載の組み合わせ、組成物、およびヒドロゲルを提供する方法、ならびにそれらの使用を開示する。
【0002】
本発明は、アリルアミド側鎖を有するポリ（２－オキサゾリン）またはポリ（２－オキサジン）ポリマーまたはコポリマーと架橋剤との組み合わせ、それによって得られる架橋組成物、およびそれらのヒドロゲルに特に関連する。さらに、本発明は、本明細書に記載の組み合わせ、組成物、およびヒドロゲルを提供する方法、ならびにそれらの使用を開示する。
【背景技術】
【0003】
ヒドロゲルは、物理的または化学的に架橋されたポリマー ネットワークであり、大量の水を吸収することができる。換言すると、ヒドロゲルは、天然または合成のポリマーマトリックスを含む組成物である。自然界では、ヒドロゲルの種類にはコラーゲン、ヒアルロン酸などが含まれる。過去数十年間、科学者は天然ヒドロゲルの特性を改善し、さまざまな用途で使用される合成ヒドロゲルを提供することに重点を置いてきた。ヒドロゲルは現在、食品および製薬業界で広く使用されており、ヒドロゲルが化学的に安定しており、生理学的条件下で互換性のある機械的特性を持っている必要がある組織工学などのバイオエンジニアリングへの適用で有用であることが証明されている。
【0004】
上述の通り、ヒドロゲルは、膨潤特性を提供するポリマーネットワークまたはマトリックスの存在によって特徴付けられる。前記ポリマーネットワークは、ホモポリマー、コポリマーのいずれかのポリマー骨格に結合した架橋可能な基を架橋することによって得られる。架橋を達成するために、様々な架橋方法が存在する。
【0005】
最先端の架橋方法は、主に物理的および化学的の２つのカテゴリーに分けることができる。これらの架橋方法の中で、化学的架橋方法は、ポリマー鎖間の共有結合の形成を提供し、これにより、より安定したヒドロゲルとより制御可能な機械的特性が得られる。特に、光架橋戦略の使用は、これらの方法が一般に、ヒドロゲルへの細胞のカプセル化などを可能にする比較的穏やかな条件によって特徴付けられるため、特に興味深いものである。光架橋は、さまざまなタイプの光反応性官能基を電磁放射線（例えばUV光）にさらすことによって実現できる。利用可能なさまざまな化学物質が存在する中で、チオール－エン（thiol-ene）化学は、その汎用性により、過去数十年にわたって関心を集めてきた。
【0006】
チオール－エン化学は、炭素－硫黄結合を作成するための汎用ツールであり、商業的価値と研究的価値の両方を持つ架橋構造を作成するために広く使用されてきた。チオール－エンカップリング反応は、（１）酸素阻害の影響を受けないと考えられ、（２）水性媒体を含む幅広い条件下で単一の工程で実行でき、（３）細胞の存在下で悪影響を与えることなく実施でき、および任意の範囲の遊離チオールおよびアクセス可能なビニル基から形成できるため、有利である。
【0007】
ヒドロゲル形成のためのチオール－エンカップリング反応では、中～高分子量の高分子前駆体から開始することが有用である。これらは、チオール基またはエン基 (例えば、アルケンまたはアリル部分) を含み、対応する反応性チオール基を含む第２の小分子または高分子と架橋する必要がある。
【0008】
ヒドロゲルの作製では、架橋ポリマーネットワークのポリマー骨格の選択によって、ヒドロゲルの最終的な特性が決まる。ヒドロゲルの所望の用途に基づき、ポリマー骨格が他のものよりも適している可能性がある。生物医学用途向けの新しい架橋性ポリマーを開発する際に目標とする望ましい属性のいくつかは、細胞適合性、最小限の異物反応 (FBR)、温和な条件下での高収量の迅速な架橋、副反応がほとんどまたはまったくないこと、製剤が単純であること、および安価で容易に入手できる、または合成が容易な出発物質が利用できることなどである。ポリマー骨格は、コラーゲンやゼラチンなどの天然ポリマー、または PEG、多糖類、タンパク質、ペプチド、成長因子などの合成ポリマーを含むことができる。
【0009】
Hoogenboom et al., 2009 による以前の研究では、これらの特性の多くを考慮して、ポリ (2-アルキル-2-オキサゾリン)(PAOx) に基づく新しいヒドロゲルの開発を目的としていた。他の非イオン性親水性材料よりもPAOxを使用する理由は、その豊富な化学的性質、比較的単純な合成、および潜在的な生体適合性にある。ヒドロゲルの基材としてのPAOxの魅力を強調するより詳細な考察が最近発表された(Dargaville etal., 2018)。また、ポリ (2-オキサジン)(PAOzi) ベースのポリマー材料は、薬物送達システム (DDS) およびポリマー治療における有望な材料として文献で強調されている。PAOxと同じように、PAOziはより広い合成変動性を提供し、ポリマー担体構造をより正確に設計して、その生物学的挙動を制御することができる。PAOxと PAOziポリマー、特にPMeOxと PMeOziの両方の優れた親水性は、PEG と比較して優れた防汚特性をもたらす（Sedlacek, O et al., 2020を参照）。
【0010】
過去数年間、Hoogenboom らは、2-ウンデセニル-2-オキサゾリン (DecenOx) または 2-ブテニル-2-オキサゾリン(ButenOx) を2-メチル- 2-オキサゾリン (MeOx) または 2-エチル-2-オキサゾリン (EtOx)と共重合して、アルケン末端アルキル側鎖を組み込んだ親水性 PAOxコポリマーを開発してきた。これらのポリマーは、チオール－エンカップリングを介して、任意の数のジチオール分子によって架橋することができる。
【0011】
Dargaville et al., 2016は、PAOxに基づくヒドロゲルの合成について説明している。これらのヒドロゲルは、多くの用途、特に生物医学用途で有利であることがわかっており、薬物／遺伝子送達または組織工学のためのシステムの構築において重要な役割を果たしている。特に、PAOxは、ブロック、グラデーション、星型構造を含む、実現可能なポリマー構造を完全に制御する。さらに、PAOxの特性は、側鎖基の変化や異なるモノマーの共重合によって高度に調整可能である。Dargavilleet al., 2016は、末端二重結合を含む疎水性架橋性基、すなわちデセニル（DecenOxを提供）は、より短く、より親水性の基、より具体的にはブテニル（ButenOxを提供）を有するものよりも迅速に硬化できると述べている。さらに、Dargavilleらは、疎水性架橋性基のより速い硬化は、そのような疎水性架橋性基の疎水性会合の結果である可能性があり、それがより高い局所二重結合濃度を決定し、したがってより速い架橋を提供すると述べている。
【0012】
Dargaville et al., 2016はより速い硬化が可能な基を開示しているが、それらの疎水性はそれらを極性溶媒、例えば水との相溶性を低下させ、したがって前記極性溶媒中での直接硬化との相溶性を低下させる。光架橋性官能基の極性溶媒とのより高い適合性は、水または水溶液が最適な生体適合性溶媒である生物工学用途において特に望まれる。換言すると、これらの材料の欠点は、アルケンを組み込んだ疎水性側鎖が、水溶性を維持するために、ポリマーの全体的な疎水性に大きく寄与することであり、これは、より親水性の高いMeOxモノマーと共重合するか、ポリマー中の濃度を低く保つ必要があることを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Hoogenboom et al., 2009
【非特許文献1】Dargaville et al., 2018
【非特許文献1】Sedlacek, O et al., 2020
【非特許文献1】Dargaville et al., 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
したがって、先行技術の欠点を克服するヒドロゲル、組成物およびそれらの組み合わせおよびその方法を提供する必要がある。さらに、本発明は、改善された硬化特性および改善された生体適合性を有するヒドロゲルおよび組成物、ならびにそれらの組み合わせを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0015】
第１の態様において、本発明は、１つ以上のアリルアミド側鎖を有するポリマーまたはコポリマー；および架橋剤を含む組み合わせであって、前記ポリマーまたはコポリマーは、ポリ（２－オキサゾリン）またはポリ（２－オキサジン）から選択されるものを提供する。驚くべきことに、本発明による組み合わせがより速い架橋を提供することが見出された。この発見は、アリル側鎖部分が、デセニルおよびブテニルなどの長い末端二重結合を含む部分と比較して、より遅い硬化を提供すると先行技術に基づいて予想される事実において驚くべきことである。Dargaville et al., 2016は、デセニルなどのより疎水性の架橋可能な基のより速い硬化は、より高い局所二重結合濃度を決定するそのような疎水性の架橋可能な基の疎水性会合の結果である可能性があり、したがってより速い架橋を提供すると考えている。したがって、例えば、デセニル（DecenOxを提供する）を含むポリマーは、より短く、より親水性の基、より具体的にはブテニル（ButenOxを提供する）を有するポリマーよりも速く硬化することができる。
【0016】
１つのさらなる実施形態において、架橋剤は、２つ以上のチオール基を含む。
【0017】
１つのさらなる実施形態において、前記ポリマーまたはコポリマーは、2-メチル-2-オキサゾリン、2-エチル-2-オキサゾリン、2-プロピル-2-オキサゾリン、2-メチル-2-オキサジン、2-エチル-2-オキサジンおよび2-プロピル-2-オキサジンから選択されるモノマー単位を含む。
【0018】
本発明による１つの実施形態において、前記組み合わせは、１つ以上のアリルアミド側鎖を有する第１の２－オキサゾリンまたは２－オキサジンモノマーと、アリルアミド側鎖を有さない第２の２－オキサゾリンまたは２－オキサジンモノマーとを、約95-5から5-95、好ましくは、70-30から10-90、より好ましくは、40-60 から10-90の比で含むコポリマーを含む。
【0019】
本発明による１つの実施形態において、この組み合わせにおける前記ポリマーは、式(I)によって表される：
(X - Z )n －骨格 (I)
ここで、
Xはアリルアミド側鎖を表し;
Zは直接結合またはスペーサーを表し; および
骨格は、ポリ (２-オキサゾリン) またはポリ (２-オキサジン) ポリマーまたはコポリマーであり；ｎは２以上の整数である。
(X - Z )n －骨格 (I)
ここで、
Xはアリルアミド側鎖を表し;
Zは直接結合またはスペーサーを表し; および
骨格は、ポリ (２-オキサゾリン) またはポリ (２-オキサジン) ポリマーまたはコポリマーであり；ｎは２以上の整数である。
【0020】
本発明による特定の実施形態において、前記組み合わせにおける前記ポリマーまたはコポリマーは、約５０から１０００までの、好ましくは１００から８００までの、より好ましくは２００から５００までの重合度を有する。
【0021】
第２の態様において、本発明は、本発明による組み合わせを含む組成物であって、アリルアミド側鎖と架橋剤は互いに架橋されている、組成物を提供する。
【0022】
第３の態様において、本発明は、本発明の実施形態によって記載される組成物を含むヒドロゲルを提供する。
【0023】
第４の態様において、本発明は、本発明による組成物を提供する方法であって、ａ）本発明によって定義される組み合わせを提供する工程；およびｂ）ポリマーを架橋剤で硬化させ、それによって前記組成物を得る工程、を含む方法を提供する。
【0024】
さらなる態様において、本発明は、本発明による組み合わせを含む（バイオ）インクを提供し、およびさらに、３Ｄプリンティング、２光子重合、バイオプリンティングまたは生体材料のための前記（バイオ）インクの使用を提供する。
【0025】
さらに別の態様において、本発明は、ヒトまたは獣医学において使用するための、本発明の他の実施形態によって記載される組み合わせ、または組成物、またはヒドロゲルを提供する。
【0026】
さらに別の態様において、 本発明は、食品産業、化粧品、薬物送達、細胞送達、生物工学用途のいずれか１つにおける、本発明の他の実施形態によって記載される組み合わせ、または組成物、またはヒドロゲルの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
ここで図面を特に参照すると、示されている特定事項は、例示のためであり、本発明の異なる実施形態の例示的な議論の目的のためだけであることが強調される。これらは、本発明の原理および概念的側面について最も有用で容易に説明できると考えられるものを提供する目的で提示される。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要な以上に、本発明の構造上の詳細を示す試みは行われていない。図面を用いた説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化されるかを当業者に明らかにするものである。
【0028】
【図1】図１は、開始剤（initiator）としてオキサゾリニウム塩（2-フェニル-2-オキサゾリニウム テトラフルオロボレート (HPhOx-BF4)） と停止剤（terminator）としてピペリジンを使用したEtOxとC3MestOxのカチオン開環重合 (CROP) メカニズムを示す。
【図5】図５Ａは、デセニル官能化ポリ（２－オキサゾリン）（P1DecenOx）および本発明によるアリルアミド含有ポリマー（P2EAOx）の光硬化挙動を、０から５００秒の時間枠での等しい条件下で示しており、明らかに後者の硬化挙動がはるかに速いことを明らかにしている。図５Ｂは、０から２００秒の短い時間枠で、図５Ａに記載されているポリマーと同じ条件下で、同じポリマーの光硬化挙動を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
ここで、本発明をさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義された各態様は、これに反することが明確に示されない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された特徴は、好ましいまたは有利であると示された他の特徴と組み合わせることができる。本発明の化合物を説明するとき、使用される用語は、文脈が別段の指示をしない限り、以下の定義に従って解釈されるべきである。
【0030】
パラメータ、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、開示された発明において実行することが適切である限りにおいて、指定された値の±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、およびさらにより好ましくは±０．１％以下の変動を含むことを意味する。「約」または「およそ」という修飾語が指す値自体も、具体的かつ好ましくは開示されていることが理解されるべきである。
【0031】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例として、「ポリマー」は、１つのポリマーまたは２つ以上のポリマーを意味する。
【0032】
本発明の化合物は、以下の実施例で提供される反応スキームに従って調製することができるが、当業者は、これらが本発明の単なる例示であること、および本発明の化合物が、有機化学の当業者によって一般的に使用されるいくつかの標準的な合成プロセスのいずれかによって調製できることを理解するであろう。
【0033】
第１の態様において、本発明は、２つ以上のアリルアミド側鎖を有するポリ（２－オキサゾリン）ポリマーまたはコポリマー；および架橋剤を含む組合せを提供する。本発明の文脈において、本明細書で使用される用語「組み合わせ」は、２つ以上の化学組成物または化合物の選択であることを意味する。すなわち、本発明の組み合わせは、架橋剤と共に、本明細書で定義されるポリマーまたはコポリマーを含み得る。
【0034】
本発明の文脈において、ポリ（２－オキサゾリン）ポリマーまたはコポリマーは、２－オキサゾリンまたはその２－オキサゾリンの誘導体の開環重合（ＲＯＰ）生成物に由来するポリマー骨格を含むポリマーまたはコポリマーである。本発明の文脈において、２－オキサゾリン誘導体は、２－アルキル－２－オキサゾリン（ＡＯｘ）であり得る。
【化1】
【0035】
本発明の文脈において、ポリ (２－オキサジン) ポリマーまたはコポリマーは、5,6-ジヒドロ-4H-1,3-オキサジンまたは その5,6-ジヒドロ-4H-1,3-オキサジンの誘導体の開環重合 (ROP) に由来するポリマー骨格を含むポリマーまたはコポリマーである。 本明細書において、5,6-ジヒドロ-4H-1,3-オキサジンは、単に 2-オキサジンとも呼ばれる。本発明の文脈において、２－オキサゾリン誘導体は、２－アルキル－２－オキサジン（ＡＯｚｉ）であり得る。
【化2】
【0036】
したがって、本発明の特定の実施形態では、ポリ（２－オキサゾリン）またはポリ（２－オキサジン）骨格はまた、以下の式：
で表され得る。
【化3】
【0037】
ここで、上記の式は、式Ｙによって統一して表記することができる：
【化4】
【0038】
式中、ポリマー主鎖に属するモノマー単位の炭素原子は、2 または 3 のいずれかであってよく、ここで、前記原子が 2 個の炭素原子である場合、ポリ (2-オキサゾリン) 骨格が表され、前記原子が 3 個の炭素原子である場合、ポリ（2-オキサジン）骨格が表され、式Ｙに示される波状の結合は、スペーサーなどの他の原子または分子に結合している。
【0039】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「側鎖」という用語は、骨格（主鎖）に結合した化学基であることを意味する。
【0040】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「アリルアミド」という用語は、以下に示される式を有する部分であることを意味する：
式中、波状の結合は、ポリマーまたはコポリマーの骨格、またはスペーサーなどの他の原子または分子に結合している。
【化5】
【0041】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「架橋剤」という用語は、これに限定されるものではないが、チオール－エン架橋などの様々な架橋方法に従って架橋できる部分を含む１つまたは複数の分子であることを意味する。チオール－エン架橋は、共有結合ポリマーネットワークの形成のためにチオール－エン化学を利用するポリマー架橋技術を指す。チオール－エン化学は、広義には、チオール含有化合物とアルケンまたは「エン」との反応を指す。チオール－エン化学は、例えばこれに限定されるものではないが、ｉ）穏やかな条件下で急速に進行し、細胞や他の生体分子と適合させることができること；ｉｉ）明確に定義され、十分に特徴付けられた反応メカニズムと生成物を持つこと；およびｉｉｉ）他の官能基と比較して、チオールおよびアルケン官能基のポリマーへの導入が容易であること、などの複数の利点に照らして好ましいものである。
【0042】
さらなる実施形態において、架橋剤は、２つ以上のチオール基を含む。例えば、ジチオスレイトールを使用することができ、本実施形態に従って使用することができるさらなるチオール含有架橋剤は：ＰＥＧ－ジチオール、オリゴＰＥＧ－ジチオール、２つ以上のシステイン基を含有する（オリゴ）ペプチド、ＰＥＧ－トリチオールおよびＰＥＧ－テトラチオールなどのチオール側鎖を有するさらなるポリマー、チオール化ゼラチン、チオール側鎖を有するＰＡＯｘである。
【0043】
１つの実施形態において、本発明は、前記ポリマーまたはコポリマーが：２－メチル－２－オキサゾリン、２－エチル－２－オキサゾリン、２－プロピル－２－オキサゾリン、２－メチル－２－オキサジン、２－エチル－２－オキサジンおよび２－プロピル－２－オキシジンから選択されるモノマー単位を含む、本明細書で定義される組み合わせを提供する。ここで、２－プロピル－２－オキサゾリンは、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン、２－i－プロピル－２－オキサゾリン、および２－ｃ－プロピル－２－オキサゾリンから選択でき、および２－プロピル－２－オキサジンは、２－ｎ－プロピル－２－オキサジン、２－ｉ－プロピル－２－オキサジンおよび２－ｃ－プロピル－２－オキサジンから選択することができる。
【0044】
すなわち、さらなる実施形態において、本発明は、本明細書で定義される組み合わせを提供するものであって、前記ポリマーまたはコポリマーが、１つ以上のアリルアミド側鎖を有する第１の２－オキサゾリンまたは２－オキサジンモノマーと、アリルアミド側鎖を有さない第２の２－オキサゾリンまたは２－オキサジンモノマーとを、約95-5から5-95、好ましくは、70-30から10-90、より好ましくは、40-60 から10-90の比で含む。
【0045】
本発明がコポリマーを提供する場合、前記アリルアミド含有２－オキサゾリンモノマーは「第１の」モノマーと見なすことができる。すなわち、本発明の文脈において、本明細書で使用される用語「第１のモノマー」は、側鎖にアリルアミド部分を有するポリマーのモノマーであることを意味する。
【0046】
本発明の文脈において、本明細書で使用される用語「第２のモノマー」は、側鎖にアリルアミド部分を持たないポリマーのモノマーであることを意味する。
【0047】
より具体的には、本発明によるポリマーは、必ずしも第２のモノマーを含有する必要はなく、したがってコポリマーであるが、アリルアミド含有モノマーのみからなるホモポリマーであってもよい。
【0048】
本発明のさらなる実施形態において、この組み合わせにおける前記ポリマーは、式(I)によって表される：
(X - Z )n - Y (I)
ここで、
Xはアリルアミド側鎖を表し;
Zは直接結合またはスペーサーを表し; および
Yは、ポリ (２-オキサゾリン) またはポリ (２-オキサジン) 骨格；特に、コポリマーのポリ (２-オキサゾリン)ポリマーを表し；およびｎは２以上の整数であり、これはアリルアミド部分を含む少なくとも２つの側鎖が存在することを意味する。
(X - Z )n - Y (I)
ここで、
Xはアリルアミド側鎖を表し;
Zは直接結合またはスペーサーを表し; および
Yは、ポリ (２-オキサゾリン) またはポリ (２-オキサジン) 骨格；特に、コポリマーのポリ (２-オキサゾリン)ポリマーを表し；およびｎは２以上の整数であり、これはアリルアミド部分を含む少なくとも２つの側鎖が存在することを意味する。
【0049】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「骨格」という用語は、ポリマーまたはコポリマーの骨格であることを意味し、換言すると、骨格は、一緒になってポリマーまたはコポリマーの連続した鎖を形成する、共有結合した原子の最長のシリーズである。本発明の骨格は、特にポリ（２－オキサゾリン）またはポリ（２－オキサジン）骨格である。
【0050】
本発明の文脈において、「スペーサー」という用語は、それが含まれる分子の他の２つの要素（element）の間に(柔軟な)ヒンジを提供し、それによって前記要素を空間的に分離することを意図した部分を意味する。可能性のあるスペーサーには、アルキルスペーサー、およびエチレンオキシド（ＰＥＧ）スペーサーが含まれる。「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、式CxH2x+1の完全飽和炭化水素を指し、式中xは1以上の数である。一般に、本発明のアルキル基は、１から２０個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖状または分枝状であってもよく、本明細書に示されるように置換されていてもよい。本明細書において炭素原子の後に下付き文字が使用される場合、下付き文字は、指定された基が含み得る炭素原子の数を指す。したがって、例えば、C1-4アルキルは、1から4個の炭素原子のアルキルを意味する。アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、ブチルおよびその異性体（例えば、n-ブチル、i-ブチル、t-ブチル）；ペンチルおよびその異性体、ヘキシルおよびその異性体、ヘプチルおよびその異性体、オクチルおよびその異性体、ノニルおよびその異性体；デシルおよびその異性体である。C1-C6アルキルは、１から６個の炭素原子を有するすべての直鎖状、分枝状、または環状アルキル基を含み、したがって、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、ブチルおよびその異性体（例えば、n-ブチル、i-ブチル、t-ブチル）；ペンチルおよびその異性体、ヘキシルおよびその異性体、シクロペンチル、2-、3-、または4-メチルシクロペンチル、シクロペンチルメチレン、およびシクロヘキシルを含む。
【0051】
例えば、本発明によるポリマー／コポリマーにおいて、Ｚは、Ｃ２アルキルまたはＣ３アルキルスペーサーなどのアルキルスペーサーであり得る。当業者には、本発明の文脈において様々なスペーサーを使用できることが明らかであり、その選択は、使用されるモノマーおよび提供されるアリルアミド側鎖に依存する。例えば、本発明によるポリマーがポリ（２－オキサゾリン）骨格である骨格を有する場合、上記で定義した式 Y に包含され、第１のモノマーはアリルアミド化 2-メトキシカルボキシプロピル-2-オキサゾリン (C3MestOx) であり、以下に示され、第２のモノマーは 2-エチル-2-オキサゾリン(EtOx) であり、示されず、式中m はモノマー単位の数を表す。本発明によるポリマー／コポリマーは、少なくとも１つのアリルアミド側鎖を含み、この特定の場合、第１のモノマーに存在する。前記第１のモノマーにおいて、Ｘはアリルアミド側鎖であり、Ｚはスペーサーであり、より具体的には以下のとおりである。
【化6】
【0052】
本発明による特定の実施形態において、前記組み合わせにおける前記ポリマーまたはコポリマーは、約５０から１０００、好ましくは１００から８００、より好ましくは２００から５００の重合度を有する。典型的には、重合度は、多角度光散乱検出器を使用して絶対分子量値を決定するサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される。
【0053】
第２の態様において、本発明は、アリルアミド側鎖と架橋剤が互いに架橋している、本発明による組み合わせを含む組成物を提供する。
【0054】
第３の態様において、本発明は、本発明の実施形態によって記載される組合せまたは組成物を含むヒドロゲルを提供する。ヒドロゲルは、組成物を得るための組み合わせを架橋し、および該組成物によって吸収される膨潤剤と組成物を接触させることによって得ることができる。換言すると、これにより、本発明に従って定義される架橋された組成物を膨潤剤で膨潤させる工程を含む、ヒドロゲルを提供する方法が記載される。水、血清、静脈内輸液、グルコース溶液、ハルトマン溶液、幹細胞溶液、血漿、リン酸緩衝液、HEPES、食塩溶液などであるがこれらに限定されないいくつかの膨潤剤を本発明の文脈で使用することができる。
【0055】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「ヒドロゲル」という用語は、ネットワーク内に液体を吸収または保持できるポリマーネットワークを含むポリマー組成物であることを意味する。
【0056】
第４の態様において、本発明は、本発明による組成物を提供する方法を提供するものであり、以下の工程を含む：ａ）本発明によって定義される組み合わせを提供する工程；ｂ）ポリマーを架橋剤で硬化させ、それによって前記組成物を得る工程。工程ｂ）のポリマーを架橋剤で硬化させ、それによって前記架橋された組成物を得る工程は、最先端のさまざまな技術の一部を使用して実行できる。本発明の特定の実施形態によれば、工程ｂ）の硬化はＵＶ硬化または熱硬化、好ましくはＵＶ硬化によって行われる。
【0057】
さらに、本発明の特定の実施形態において、硬化させる工程ｂ）は、2-ヒドロキシ-1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)フェニル]2-メチル-1-プロパノン(Irgacure 2959)、(4-ベンゾイルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル-1-プロパンアミニウムクロリドとメチルジエタノールアミン (Q-BPQ+MDEA)、ヒドロキシアルキルプロパノン（APi-180）、モノアシルホスフィンオキシドのナトリウム塩およびリチウム塩（Na-TPOおよびLi-TPO）、ビスアシルホスフィンオキシドのナトリウム塩およびリチウム塩 (BAPO-OLi および BAPO-ONa)を含む非限定的なリストから選択される光開始剤などの光開始剤の存在下で達成される。さらに、ここに記載されていない適切な光開始剤は、当業者には明らかであろう。
【0058】
さらなる態様において、本発明は、本発明による組み合わせを含む（バイオ）インク、および、さらに、３Ｄプリンティング、２光子重合、バイオプリンティングまたは生体材料のための前記（バイオ）インクの使用を提供する。
【0059】
本発明の文脈において、本明細書で使用される「（バイオ）インク」という用語は、例えばプリンティングノズルまたは針による押し出しによる、フィラメントまたは液滴に成形するのに適した材料であることを意味し、および堆積後に形状忠実度を維持できる可能性があるものを意味する。
前記材料が液滴の形態である場合、例えば、圧電ジェッティング、サーマルジェッティング、マイクロバルブジェッティング、アコースティックジェッティングなどの、ジェッティングタイプのプリンティング技術を使用することができる。あるいは、ポリマーの溶液は、２光子重合プロセスによって架橋された３Ｄオブジェクトに変換できる。
前記材料が液滴の形態である場合、例えば、圧電ジェッティング、サーマルジェッティング、マイクロバルブジェッティング、アコースティックジェッティングなどの、ジェッティングタイプのプリンティング技術を使用することができる。あるいは、ポリマーの溶液は、２光子重合プロセスによって架橋された３Ｄオブジェクトに変換できる。
【0060】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトまたは獣医学において使用するための、本発明の他の実施形態によって記載される組み合わせ、または組成物、またはヒドロゲルを提供する。
【0061】
さらに別の態様では、本発明は、食品産業、化粧品、薬物送達、細胞送達、生物工学用途のいずれかにおける、本発明の他の実施形態によって記載される組み合わせ、または組成物、またはヒドロゲルの使用を提供する。
【0062】
より具体的には、本発明による組み合わせ、または組成物、またはヒドロゲルは、クリームとして、または軟膏もしくはゲル化剤もしくは増粘剤として、細胞外マトリックス模倣物として、美容処置、大量の組織再建、少量の組織再建、脂肪移植、脂肪注入、熱傷、歯科用途、コンタクトレンズ、軟骨および骨組織工学；脂肪、脊椎、心臓組織工学などの軟部組織工学；筋肉および腱組織工学に使用できる。
【実施例】
【0063】
実施例１
本実施例において、PEAOxと呼ばれる、本発明による新規のアリルアミド化ポリマーが記載されている。PEAOx の合成は、2-メトキシカルボキシプロピル-2-オキサゾリン (C3MestOx) から始まり、2-エチル-2-オキサゾリン(EtOx) と共重合した後、C3MestOx のメチルエステルを直接アリルアミド化して、 架橋のためのアリル基を持つ高水溶性ポリマーとする。光ヒドロゲル化のキネティクスと前駆体の細胞毒性は、ポリエチレングリコールヒドロゲルでベンチマークされたPEAOxヒドロゲルに対するFBR（異物反応）の最初の in vivo 評価とともに説明され、重要な動物の安全性データを提供し、生体材料応用の基礎が築かれる。
本実施例において、PEAOxと呼ばれる、本発明による新規のアリルアミド化ポリマーが記載されている。PEAOx の合成は、2-メトキシカルボキシプロピル-2-オキサゾリン (C3MestOx) から始まり、2-エチル-2-オキサゾリン(EtOx) と共重合した後、C3MestOx のメチルエステルを直接アリルアミド化して、 架橋のためのアリル基を持つ高水溶性ポリマーとする。光ヒドロゲル化のキネティクスと前駆体の細胞毒性は、ポリエチレングリコールヒドロゲルでベンチマークされたPEAOxヒドロゲルに対するFBR（異物反応）の最初の in vivo 評価とともに説明され、重要な動物の安全性データを提供し、生体材料応用の基礎が築かれる。
【0064】
材料と方法
特に明記しない限り、ポリマーの合成のためのすべての材料はMerckから入手した。Polymer Chemistry Innovations社から、2-エチル-2-オキサゾリンが提供され、これは使用前に BaO とニンヒドリンで蒸留し、グローブボックス内で不活性かつ乾燥条件下で保存した。2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート（HPhOx-BF4）の合成は、Monnery et al., 2018の文献手順に従い行った。ピペリジンは、使用前に CaH2で蒸留した。乾燥溶媒は、酸化アルミニウム乾燥カラムと窒素フローを備えた J.C. Meyer 社の溶媒精製システムから得た。1H NMR 分光法用の重水素化溶媒、すなわちクロロホルム-d (CDCl3、≧99.8% D、水 <0.01%) は、Euriso-top社から購入した。Irgacure 2959 (2-ヒドロキシ-4’-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン) は BASF社からの寄贈品であり、受け取ったままの状態で使用した。C3MestOxは、以前に報告されたP.J.M Bouten et al., 2015の手順に従って調製した。
特に明記しない限り、ポリマーの合成のためのすべての材料はMerckから入手した。Polymer Chemistry Innovations社から、2-エチル-2-オキサゾリンが提供され、これは使用前に BaO とニンヒドリンで蒸留し、グローブボックス内で不活性かつ乾燥条件下で保存した。2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート（HPhOx-BF4）の合成は、Monnery et al., 2018の文献手順に従い行った。ピペリジンは、使用前に CaH2で蒸留した。乾燥溶媒は、酸化アルミニウム乾燥カラムと窒素フローを備えた J.C. Meyer 社の溶媒精製システムから得た。1H NMR 分光法用の重水素化溶媒、すなわちクロロホルム-d (CDCl3、≧99.8% D、水 <0.01%) は、Euriso-top社から購入した。Irgacure 2959 (2-ヒドロキシ-4’-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン) は BASF社からの寄贈品であり、受け取ったままの状態で使用した。C3MestOxは、以前に報告されたP.J.M Bouten et al., 2015の手順に従って調製した。
【0065】
合成
C3MestOxとEtOxの共重合
2-エチル-2-オキサゾリン (EtOx) と 10 mol% のC3MestOxとの共重合は、文献の方法を修正して使用し、図１に示す合成スキームに従って実行された。すべてのガラス器具は洗浄し、クロロトリメチルシラン (TMS-Cl) でシラン化する前に、200℃のオーブンで乾燥して、ポリマー鎖の早期終結（premature termination）につながる可能性のある反応から水を排除し、ポリマーの分散度を高めた。次に、2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート塩（a, 60.6 mg, 0.258 mmol, 0.003当量）を開始剤としてフラスコに添加し、活性真空（1.6 x 10-1 mbar）下で融解した。シラン化したフラスコを不活性で乾燥した雰囲気下でグローブボックスに移した、ここでモノマーであるEtOx（7.85 mL, 77.76 mmol, 0.9 当量）とC3MestOx（1.29 mL, 8.64 mmol, 0.1 当量）を9：1比でEtOx:C3MestOxとして使用し、乾燥溶媒（アセトニトリル、8.87 mL）を添加した。混合物をしっかりと撹拌し、ｔ＝０のサンプルを出発点として取り、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および１Ｈ－ＮＭＲ分光法により変換を追跡した。P(EtOx-C3MestOx)コポリマーを91.5%の変換率で300の目標DPを得るために、反応混合物を60℃のオイルバスに60時間入れた。反応後、0℃でピペリジン51μLを加え、一晩撹拌した。精製は、氷冷ジエチルエーテル中でのコポリマーを沈殿させ、その後透析し（MWCO = 3.5 kDa）、その後凍結乾燥して、P（EtOx-C3MestOx）を無色でふわふわの粉末（Mw = 23kDa, D = 1.35）として得た（bを参照）。完全な特徴付けは、ガスクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および1H-NMR 分光法を使用して行われた。
C3MestOxとEtOxの共重合
2-エチル-2-オキサゾリン (EtOx) と 10 mol% のC3MestOxとの共重合は、文献の方法を修正して使用し、図１に示す合成スキームに従って実行された。すべてのガラス器具は洗浄し、クロロトリメチルシラン (TMS-Cl) でシラン化する前に、200℃のオーブンで乾燥して、ポリマー鎖の早期終結（premature termination）につながる可能性のある反応から水を排除し、ポリマーの分散度を高めた。次に、2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート塩（a, 60.6 mg, 0.258 mmol, 0.003当量）を開始剤としてフラスコに添加し、活性真空（1.6 x 10-1 mbar）下で融解した。シラン化したフラスコを不活性で乾燥した雰囲気下でグローブボックスに移した、ここでモノマーであるEtOx（7.85 mL, 77.76 mmol, 0.9 当量）とC3MestOx（1.29 mL, 8.64 mmol, 0.1 当量）を9：1比でEtOx:C3MestOxとして使用し、乾燥溶媒（アセトニトリル、8.87 mL）を添加した。混合物をしっかりと撹拌し、ｔ＝０のサンプルを出発点として取り、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および１Ｈ－ＮＭＲ分光法により変換を追跡した。P(EtOx-C3MestOx)コポリマーを91.5%の変換率で300の目標DPを得るために、反応混合物を60℃のオイルバスに60時間入れた。反応後、0℃でピペリジン51μLを加え、一晩撹拌した。精製は、氷冷ジエチルエーテル中でのコポリマーを沈殿させ、その後透析し（MWCO = 3.5 kDa）、その後凍結乾燥して、P（EtOx-C3MestOx）を無色でふわふわの粉末（Mw = 23kDa, D = 1.35）として得た（bを参照）。完全な特徴付けは、ガスクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および1H-NMR 分光法を使用して行われた。
【0066】
アリルアミンによる直接アミド化による P(EtOx90-stat-C3MestOx10)の重合後修飾（Post-polymerization modification）
本発明により記載されるアリルアミド化ポリオキサゾリンの合成は、図２に示される。合成された P(EtOx-C3MestOx)コポリマーには、重合後の修飾工程でアリルアミンによるアミド化によって官能化されている10 mol% (30 単位) のメチルエステル側鎖が含まれている。官能性メチルエステル基2.156mmol（1当量）を含む、先に合成したP（EtOx-C3MestOx）コポリマー（a、2g、0.0719mmol）は、触媒として1,5,7-トリアザビシクロ[4.4.0]デカ-5-エン（TBD, 0.5 当量,1.078 mmol, 150 mg）を含むアセトニトリル15.4 mLに溶解した。その後、アリルアミン (6 当量, 12.9 mmol, 0.97 mL) を加え、混合物を70℃で30時間反応させ、PEAOxに完全に変換した（b）。精製は、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させたあと、透析(MWCO = 1 kDa)し、その後の凍結乾燥することによって行った。メチルエステル側鎖のアリルアミド側鎖への完全な修飾は、1H-NMR分光法およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して確認された(Mw = 29 kDa、D = 1.22)。
本発明により記載されるアリルアミド化ポリオキサゾリンの合成は、図２に示される。合成された P(EtOx-C3MestOx)コポリマーには、重合後の修飾工程でアリルアミンによるアミド化によって官能化されている10 mol% (30 単位) のメチルエステル側鎖が含まれている。官能性メチルエステル基2.156mmol（1当量）を含む、先に合成したP（EtOx-C3MestOx）コポリマー（a、2g、0.0719mmol）は、触媒として1,5,7-トリアザビシクロ[4.4.0]デカ-5-エン（TBD, 0.5 当量,1.078 mmol, 150 mg）を含むアセトニトリル15.4 mLに溶解した。その後、アリルアミン (6 当量, 12.9 mmol, 0.97 mL) を加え、混合物を70℃で30時間反応させ、PEAOxに完全に変換した（b）。精製は、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させたあと、透析(MWCO = 1 kDa)し、その後の凍結乾燥することによって行った。メチルエステル側鎖のアリルアミド側鎖への完全な修飾は、1H-NMR分光法およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して確認された(Mw = 29 kDa、D = 1.22)。
【0067】
特徴付け
計測手段
サンプルをガスクロマトグラフィー（GC）で測定して、モノマーと反応溶媒からの積分の比率に基づいてモノマー転化率を決定した。GC は、VWR Carrier-160 水素発生装置と、長さ 30 m、直径 0.320 mm のAgilent Technologies HP-5 カラムを備えた Agilent Technologies7890A システムで実行した。FID 検出器を使用し、注入口を 250℃ に設定し、比率 25:1 のスプリット注入を行った。キャリアガスとして水素を2 mL/minの流速で使用した。オーブン温度を20℃ min-1で 50℃ から 120℃ に昇温し、続いて 50℃ min-1で 120℃ から 300℃ に昇温した。
計測手段
サンプルをガスクロマトグラフィー（GC）で測定して、モノマーと反応溶媒からの積分の比率に基づいてモノマー転化率を決定した。GC は、VWR Carrier-160 水素発生装置と、長さ 30 m、直径 0.320 mm のAgilent Technologies HP-5 カラムを備えた Agilent Technologies7890A システムで実行した。FID 検出器を使用し、注入口を 250℃ に設定し、比率 25:1 のスプリット注入を行った。キャリアガスとして水素を2 mL/minの流速で使用した。オーブン温度を20℃ min-1で 50℃ から 120℃ に昇温し、続いて 50℃ min-1で 120℃ から 300℃ に昇温した。
【0068】
サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は、1260 オンライン脱気装置、1260 ISO ポンプ、1260 自動液体サンプラー (ALS)、２つの PLgel 5 μm 混合 D カラムおよび直列のプレカラムを直列に備えた50℃の恒温カラムコンパートメント (TCC)、1260 ダイオードアレイ検出器 (DAD) および1260屈折率検出器(RID)を備えたAgilent 1260シリーズHPLCシステムで実施した。使用した溶離液は、50 mMのLiClを含む N,N-ジメチルアセトアミド (DMA)で0.5 mL min-1の流速だった。GPCアドオンを備えたAgilent Chemstationソフトウェアを使用して、SEC eluogramsを分析した。モル質量値と D 値は、PSS の PMMA 標準に対して計算された。
【0069】
凍結乾燥は、Martin Christ 凍結乾燥機、モデルAlpha 2-4 LSCplus で実行された。モノマーと重合混合物は、VIGOR Sci-Lab SG1200/750 Glovebox System で保存および調製され、水と酸素の含有量の両方で 1 ppm 未満の純度レベルが得られた。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Bruker Avance 400 MHz分光計により室温で記録した。1H NMRスペクトルは、Euriso-top社から購入したクロロホルム－ｄ（(CDCl3）中で測定した。
【0070】
フォトレオロジー（Photo-rheology）
ゲル化速度論は、30℃で10 mm平行プレート-プレート形状を備えた Anton Paar MCR302 レオメーターを用いて、小さなひずみ振動剪断実験を実行することによって研究した。365nm フィルターを備えた Omnicure Series 1000 紫外光源と、レオメーターの石英底板の下に取り付けられた光ファイバープローブを使用して、サンプルに照射した。ポリマーサンプルの調製方法の例は次のとおりである：チオール対エン化学量論が１：１の10% PEAOxヒドロゲルを作製するために、75μＬの水中PEAOxの12% wt/vol溶液を、6.4μＬの10%ＤＴＴ溶液、4.5μＬの2% I2959溶液と混合し、蒸留水 4.1μL を加えて合計90μL とする。この溶液のアリコート (28μL) を石英プレートにピペットで移し、ベースラインデータを収集してから30 秒または60 秒後に UV光源をオンにしてテストを開始した。照射後、サンプルを回収し、水で洗浄し、凍結乾燥し、重量を測定して膨潤率を決定した。
ゲル化速度論は、30℃で10 mm平行プレート-プレート形状を備えた Anton Paar MCR302 レオメーターを用いて、小さなひずみ振動剪断実験を実行することによって研究した。365nm フィルターを備えた Omnicure Series 1000 紫外光源と、レオメーターの石英底板の下に取り付けられた光ファイバープローブを使用して、サンプルに照射した。ポリマーサンプルの調製方法の例は次のとおりである：チオール対エン化学量論が１：１の10% PEAOxヒドロゲルを作製するために、75μＬの水中PEAOxの12% wt/vol溶液を、6.4μＬの10%ＤＴＴ溶液、4.5μＬの2% I2959溶液と混合し、蒸留水 4.1μL を加えて合計90μL とする。この溶液のアリコート (28μL) を石英プレートにピペットで移し、ベースラインデータを収集してから30 秒または60 秒後に UV光源をオンにしてテストを開始した。照射後、サンプルを回収し、水で洗浄し、凍結乾燥し、重量を測定して膨潤率を決定した。
【0071】
細胞毒性
ヒト胎児線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清 (FBS) および L-グルタミン (2 mM) を添加したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に 50,000 で播種した。37℃、5%CO2で一晩インキュベーションした後、培地を新鮮な DMEM に交換し、FBS を 0.1% ウシ血清アルブミン(BSA) に置き換えた。H2O2 (200 mM; 陰性対照) または可溶性ポリマー (0.25から2mg/mL) をこの培地中の細胞に添加し、6時間インキュベートした。培地を捨て、細胞を PBS で洗浄した後、CellTiter 96（登録商標）AQueous MTS 溶液（Promega、カタログ番号 G3582）を透明な(clear)DMEM で 1:10 に希釈した。１時間のインキュベーション後、490 nmでの吸光度を測定した。データ：MTS溶液のみのバックグラウンド補正後のコントロールからの吸光度の変化率として表されるs.e.mの平均。
ヒト胎児線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清 (FBS) および L-グルタミン (2 mM) を添加したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) に 50,000 で播種した。37℃、5%CO2で一晩インキュベーションした後、培地を新鮮な DMEM に交換し、FBS を 0.1% ウシ血清アルブミン(BSA) に置き換えた。H2O2 (200 mM; 陰性対照) または可溶性ポリマー (0.25から2mg/mL) をこの培地中の細胞に添加し、6時間インキュベートした。培地を捨て、細胞を PBS で洗浄した後、CellTiter 96（登録商標）AQueous MTS 溶液（Promega、カタログ番号 G3582）を透明な(clear)DMEM で 1:10 に希釈した。１時間のインキュベーション後、490 nmでの吸光度を測定した。データ：MTS溶液のみのバックグラウンド補正後のコントロールからの吸光度の変化率として表されるs.e.mの平均。
【0072】
ヒドロゲル微小球の生成
PEAOx (60 mg、1.684 mmol)、ジチオスレイトール (DTT) (3.9 mg、25.2 mmol、PEAOx のアルケンに対して 0.5 eq.) を含むストック溶液を510 μL の PBS (pH 7.3) で調製し、溶液をシリンジにロードする直前に、水中の 2% w/v I2959 を 30 μL 添加した。次いで、ポリマー溶液を、25 mLの丸底フラスコ中で1.5 cmのマグネチックスターラーバーを用いて400 rpmで撹拌している10 mLのポリ（ジメチルシロキサン）オイルに、29Gの針を通して滴下した。次いで、懸濁液の撹拌を続けながらＵＶ光（OmnicureS2000、365 nm）で600秒間照射した。得られたヒドロゲル球体を200 mLのジクロロメタンで洗浄し、５回ろ過し、次いでアセトン（５x）およびエタノール（５x）で順次洗浄した。ヒドロゲルは、マウスへの移植前に層流フード内の無菌条件下で超高純度エタノール (1x)および滅菌PBS (5x)で最終的に洗浄された。
PEAOx (60 mg、1.684 mmol)、ジチオスレイトール (DTT) (3.9 mg、25.2 mmol、PEAOx のアルケンに対して 0.5 eq.) を含むストック溶液を510 μL の PBS (pH 7.3) で調製し、溶液をシリンジにロードする直前に、水中の 2% w/v I2959 を 30 μL 添加した。次いで、ポリマー溶液を、25 mLの丸底フラスコ中で1.5 cmのマグネチックスターラーバーを用いて400 rpmで撹拌している10 mLのポリ（ジメチルシロキサン）オイルに、29Gの針を通して滴下した。次いで、懸濁液の撹拌を続けながらＵＶ光（OmnicureS2000、365 nm）で600秒間照射した。得られたヒドロゲル球体を200 mLのジクロロメタンで洗浄し、５回ろ過し、次いでアセトン（５x）およびエタノール（５x）で順次洗浄した。ヒドロゲルは、マウスへの移植前に層流フード内の無菌条件下で超高純度エタノール (1x)および滅菌PBS (5x)で最終的に洗浄された。
【0073】
異物反応の in vivo 測定
動物を含む実験は、科学目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアのコードと、研究のためのクイーンズランド工科大学の行動規範に従って行われ、大学動物倫理委員会によって承認された。合計 6 匹の 8 週齢の雄 C57BL/6マウス (体重、23±1 g) を Animal Resources Center (ワシントン州、オーストラリア) から購入した。動物には自由に水を与え、放射線照射したげっ歯類の食事を与えた。マウスは、医療工学研究施設 (クイーンズランド工科大学、オーストラリア) で 12 時間の明／暗サイクルの下で、特定の病原体のない条件 (フィルターラック、Tecniplast) で飼育された。マウスをイソフルラン (Laser AnimalHealth) で麻酔し、メロキシカム (1mg/kg) およびブプレノルフィン (0.05 mg/kg) の皮下投与を先制鎮痛として使用した。腹臥位で、背部の上下を切り取り、10% ポビドンヨード (Betadine) を塗布した後、縦に４箇所の切開 (約 3 mm) を行い、鈍的切開により皮下ポケットを形成した。２つのヒドロゲルサンプル - 2 セットの 10x PEAOx 球体を鉗子を使用してポケットに入れた。傷は縫合で閉じた。トラマドール (25 mg/L) は、手術後の鎮痛として、手術後５日間飲料水で提供された。28 日間マウスを毎日監視し、適切なチャンバー内で CO2 窒息による安楽死を行い、ヒドロゲルサンプルを収集して組織学的分析のために処理し、in vivo FBR を調べた。
動物を含む実験は、科学目的での動物の世話と使用に関するオーストラリアのコードと、研究のためのクイーンズランド工科大学の行動規範に従って行われ、大学動物倫理委員会によって承認された。合計 6 匹の 8 週齢の雄 C57BL/6マウス (体重、23±1 g) を Animal Resources Center (ワシントン州、オーストラリア) から購入した。動物には自由に水を与え、放射線照射したげっ歯類の食事を与えた。マウスは、医療工学研究施設 (クイーンズランド工科大学、オーストラリア) で 12 時間の明／暗サイクルの下で、特定の病原体のない条件 (フィルターラック、Tecniplast) で飼育された。マウスをイソフルラン (Laser AnimalHealth) で麻酔し、メロキシカム (1mg/kg) およびブプレノルフィン (0.05 mg/kg) の皮下投与を先制鎮痛として使用した。腹臥位で、背部の上下を切り取り、10% ポビドンヨード (Betadine) を塗布した後、縦に４箇所の切開 (約 3 mm) を行い、鈍的切開により皮下ポケットを形成した。２つのヒドロゲルサンプル - 2 セットの 10x PEAOx 球体を鉗子を使用してポケットに入れた。傷は縫合で閉じた。トラマドール (25 mg/L) は、手術後の鎮痛として、手術後５日間飲料水で提供された。28 日間マウスを毎日監視し、適切なチャンバー内で CO2 窒息による安楽死を行い、ヒドロゲルサンプルを収集して組織学的分析のために処理し、in vivo FBR を調べた。
【0074】
組織学
組織外植片を 4% パラホルムアルデヒドに一晩浸し、標準的な埋め込みプロトコルを使用してパラフィンに埋め込んだ。各包埋組織サンプルを 5 μm スライスに切断し、標準プロトコルを使用してH&Eで染色した。
組織外植片を 4% パラホルムアルデヒドに一晩浸し、標準的な埋め込みプロトコルを使用してパラフィンに埋め込んだ。各包埋組織サンプルを 5 μm スライスに切断し、標準プロトコルを使用してH&Eで染色した。
【0075】
結果と考察
C3MestOx モノマーと市販の2-エチル-2-オキサゾリン (EtOx) を9:1 モル比 (9:1 EtOx: C3MestOx) で共重合は、2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート塩を開始剤として300の目標DPで60℃で従来の加熱により達成し、それによりP(EtOx90-stat-C3MestOx10)コポリマーを得た（図１の合成スキーム参照）。コポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により、分散度は1.35であることが明らかになった。
C3MestOx モノマーと市販の2-エチル-2-オキサゾリン (EtOx) を9:1 モル比 (9:1 EtOx: C3MestOx) で共重合は、2-フェニル-2-オキサゾリニウムテトラフルオロボレート塩を開始剤として300の目標DPで60℃で従来の加熱により達成し、それによりP(EtOx90-stat-C3MestOx10)コポリマーを得た（図１の合成スキーム参照）。コポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により、分散度は1.35であることが明らかになった。
【0076】
チオール－エン架橋のために側鎖にアリル基を導入するために、過剰のアリルアミンを用いた単純なアミド化反応を選択した（図２の合成スキーム参照）。1H NMR分光法により、メチルエステルの消費と、アリル基と2級アミンの存在が確認された。
【0077】
ジチオスレイトール (DTT) によるチオール－エン光架橋を介したPEAOxのヒドロゲル化を、レオロジーを使用してリアルタイムで調査した。ゲル化速度論により、UV光の照射後15秒程度で急速な架橋が示されたが（図３参照）、チオールを使用しなかった場合、ゲル化は見られなかった。図３は、365 nm UV光の照射前と照射中の異なるチオール：エン比の10% PEAOx溶液の貯蔵弾性率 (G’) の代表的な曲線を示す。これは、ポリ（2-メチル-2-オキサゾリン-co-2-デセニル-2-オキサゾリン）コポリマーのヒドロゲル化を調査した従前の調査結果とは対照的です。これは、疎水性デセニル側鎖の凝集によって説明された。同様の凝集は、より極性の高いアリルアミドＯｘモノマーにより、ホモポリマー化が減少することから、ＰＥＡＯｘには存在しないはずである。アリルアミドＯｘを使用する他の利点は、ＥｔＯｘとのコポリマーが水溶性であることである；2-デセニル-2-オキサゾリンコポリマーと比較すると、ＥｔＯｘコポリマーは水に不溶性であるため、水の系で使用する場合、非常に親水性のモノマー（例えば、ＭｅＯｘ）との共重合に限定される。また、ＰＥＡＯｘは水にすばやく (数秒以内に) 溶解し、界面活性剤のような性質が少ないため、気泡を発生させずにピペッティングが容易で、欠陥のないヒドロゲルが得られる。エンに対するチオールの比率を変化させることにより、最終弾性率は使用されるチオールの量に比較的鈍感であることが観察されたが、最大値はモル比約0.5で発生した。 さらに、図４は、最大貯蔵弾性率に対するチオール－エン比の依存性を示す。おそらく、より高いチオール比では、かなりのジスルフィド結合が形成され、それによって貯蔵弾性率が低下する。
【0078】
PEAOxの毒性をテストするために、ヒト胎児線維芽細胞を最大2mg/mLの濃度の溶液に曝露した。標準的な MTS 代謝アッセイ (データは示さず) に基づいて、溶液はこれらの濃度で無毒であることがわかった。これは、幅広い濃度範囲で無毒であることが知られているPEtOxとPEAOxの構造的類似性による可能性がある。さらに、架橋PEAOxのFBR応答を評価するために、ポリマーを球状の形状に配合した。この研究では、PEAOx、DTT、およびI2959の溶液を撹拌したシリコーンオイルに滴下し、安定した球体が形成されるまでUV光を照射することによって、球体を調製することが選択された。NMR分光法によってシリコーンが検出されないように、すべての球体をエタノールで徹底的に洗浄した。
【0079】
球体のサイズ分布は、光学顕微鏡を使用して測定され、PEAOx 球体では 0.75から1.75 mm の範囲だった（データは示さず）。PEAOxの平均直径は 1.3 mmだった。本実施例のPEAOxは、モル比９：１のアリル化コポリマーからなる(9:1 EtOx: C3MestOx。PEAOx 球体の平衡膨潤比は10.0±0.8 (n=3)だった)。
【0080】
PEAOxヒドロゲルの球体約10個を免疫適格性のあるC57BL/6マウスの皮下に、動物１匹あたり４箇所の移植部位 (肩と股関節あたり１つのグループ) に移植した。28日後、動物を屠殺し、ヒドロゲル球の周囲の組織を外植した。１つを除くすべてのケースで、ヒドロゲルは分解の視覚的兆候なしで回収（recover）した (23または24のヒドロゲル移植)。この分解の欠如は、Lynn et al., 2010 とは対照的であり、Lynn et al., 2010 は、28 日後にマウスから5x1 mm ディスクの PEG-アクリル酸（PEG-acrylate）を20% しか回収しなかった。この場合、アクリレート基に切断可能なエステルが存在することが、マクロファージの動員とそれに続く完全な分解につながる初期分解生成物の供給源であると仮定されました。PEOAxヒドロゲルは分解部位を欠く。 シミュレートされた生物学的酸化ストレスを調べる従前の研究では、活性酸素種がポリ (2-エチル-2-オキサゾリン) を分解できることが示されている。しかしながら、取得された PEAOx球体の完全性が良好であることは、この実験の時間経過にわたって実質的な劣化がないことを意味する。
【0081】
回収されたヒドロゲル球体の周辺組織の分析は、球体の蛍光および明視野実体顕微鏡画像、および同じ球体のzスタック共焦点顕微鏡画像に基づいて行われた。球体は、細胞核 (DAPI)、筋線維芽細胞マーカー (α－平滑筋アクチン、α-SMA)、および F－アクチンについて染色された。PEAOx 球体の染色とそれに続く蛍光実体顕微鏡法および共焦点顕微鏡法により、細胞沈着(DAPI、F－アクチン) および筋線維芽細胞のマーカー (α－平滑筋アクチン、α-SMA) の存在が示された。α-SMAの存在は、線維芽細胞が線維化したことを意味する (データは示さず)。これらの結果は、PEAOx ヒドロゲルビーズの生体適合性を明確に示す。
【0082】
図５および図６は、本発明による組成物の硬化挙動が先行技術とどのように比較されるかを示す。より具体的には、図５および図６において、図では P2EAOx として識別される PEAOx (9:1 EtOx: C3MestOxに基づく) と、P1DecenOx として識別されるデセニル官能化ポリ (2-オキサゾリン) の硬化挙動の比較が提供されている。光硬化挙動は、同じ条件下、より具体的には、ポリマー濃度10wt%、アルケンと DDT の比率1:1、および Irgacure 2959 (I-2959) の 0.1% の光開始剤濃度で研究されている。
【0083】
さらに、サンプルは、先端（tip）から石英プレートまで10mmの距離で、80% の Omnicureで照射された。次に、使用したレオメーターを温度5 ℃、速度 8 rad/s、ひずみ =0.2% に設定した。
【0084】
特に、図５Ａは、デセニル官能化ポリ（2-オキサゾリン）（P1DecenOx）および本発明によるアリルアミド含有ポリマー（P2EAOx）の光硬化挙動を、時間枠０から５００秒の等しい条件下で示しており、後者の硬化挙動がはるかに速いことを明確に明らかにしている。次に図５Ｂは、図５Ａに記載されたポリマーと同じ条件下での、０から２００秒までのより短い時間フレームにおける、同じポリマーの光硬化挙動を示す。さらに、 図６ＡではP1DecenOx の硬化挙動について、硬化開始時のG’-A、中間曲線のG’-B、プラトー前のG’-Cの３つの貯蔵弾性率の値が特定されており、最大貯蔵弾性率 G’(max) に達している。図６Ａに示される曲線は、図５Ａにも示されている。
【0085】
図６Ｂは、P1DecenOxおよびP2EAOxについて図６Ａで識別されるように、G’-A、G’-BおよびG’-Cに到達するためのゲル化時間の差を示す。図６Ｂに示される情報に基づくと、P2EAOxが同じ貯蔵弾性率値G’-A、G’-BおよびG’-Cに到達するのに必要なゲル化時間は、対応するP1DecenOxのゲル化時間よりも常に短いことが明らかである。
【0086】
実施例２
実施例１に加えて、実施例１に記載したのと同様の手順を用いて、２－メトキシカルボニルエチル－２－オキサゾリン（C2MestOx）とEtOxとのコポリマー、およびC2MestOxと２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（nPrOx）とのコポリマーを調製した。これらのコポリマーをアリルアミンでアミド化した後、それぞれ P(EtOx-co-C2AamOx) および P(nPrOx-co-C2AamOx)で表される次のアリルアミド官能化コポリマーを得た：
実施例１で説明したのと同様の手順を使用して、P(EtOx-co-C2AamOx)を使用して、光ラジカル発生剤としてIrgacure2959 (DTT と比較して10 mol%)の存在下で、架橋剤としてDTTまたは2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール (アリル基と比較して 0.5 当量)の存在下で、水中のコポリマーの10 wt% 溶液を照射 (365 nm) することにより、透明なヒドロゲルを調製することに成功した。
実施例１に加えて、実施例１に記載したのと同様の手順を用いて、２－メトキシカルボニルエチル－２－オキサゾリン（C2MestOx）とEtOxとのコポリマー、およびC2MestOxと２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（nPrOx）とのコポリマーを調製した。これらのコポリマーをアリルアミンでアミド化した後、それぞれ P(EtOx-co-C2AamOx) および P(nPrOx-co-C2AamOx)で表される次のアリルアミド官能化コポリマーを得た：
【表1】
【0087】
P(PrOx-co-C2AamOx) を使用して、体積相転移温度が約 15℃ の熱応答性ヒドロゲルの調製に成功した。実施例１で説明したのと同様の手順を使用して、これらのヒドロゲルは、Irgacure2959 の存在下で架橋剤として DTT（アリル基と比較して0.5当量） またはペンタエリスリトールテトラキス (3-メルカプトプロピオネート) （アリル基と比較して0.25当量）の存在下で、エタノール中のコポリマーの10 wt% 溶液を照射（365 nm）することによって調製された。続いて、エタノールを水に交換してヒドロゲルを得た。
【0088】
実施例３－比較例
本発明者らは、ポリ（２－オキサゾリン）；より具体的にはポリ（アリルアクリルアミド）に結合したアリルアミド側基を含む他のポリマーの硬化特性をさらに調査した。左の式Ａで表されるポリ（アリルアクリルアミド）と右の式Ｂで表されるポリ (ペンテニルアクリルアミド)のコポリマーの硬化特性を比較するために実験を行った。より具体的には、下記式を有するコポリマーである：
結果は、ペンテニル末端二重結合を含むポリマーが、アリル部分を含むポリマーよりも速く架橋することを示す。本発見は、このような疎水性の架橋可能な基（ペンテニル）の疎水性会合が、より高い局所二重結合濃度を決定し、したがってより速い架橋を提供する結果によって説明される。同時に、これらの知見は、本発明による組み合わせによって達成される驚くべき技術的効果の存在を示すものであって、ここでポリマーはアリルアミド側鎖、架橋剤を含むものであって、および該ポリマーは、アリルアミド側鎖を有する第１のモノマーを含み、第１のモノマーは２－オキサゾリンである。特に、ポリ（アリルアクリルアミド）の発見とポリ（2-デセニル-2-オキサゾリン）含有ポリマーに関する従前の文献によると、より親水性のアリルアミド含有ポリマーではより遅い架橋速度が予想される。対照的に、我々は、これらのアリルアミド含有ポリ（２－オキサゾリン）ポリマーについて、はるかに速い架橋速度を確認した（実施例１を参照）。
本発明者らは、ポリ（２－オキサゾリン）；より具体的にはポリ（アリルアクリルアミド）に結合したアリルアミド側基を含む他のポリマーの硬化特性をさらに調査した。左の式Ａで表されるポリ（アリルアクリルアミド）と右の式Ｂで表されるポリ (ペンテニルアクリルアミド)のコポリマーの硬化特性を比較するために実験を行った。より具体的には、下記式を有するコポリマーである：
【化7】
【0089】
材料と方法
材料
以下の化学物質は、さまざまなプロバイダーから購入し、受け取ったまま使用した: トリアザビシクロデセン(TBD, 98%, TCI)、エタノールアミン(99%, TCI)、アリルアミン(99%, Sigma-Aldrich)、DL-ジチオスレイトール(DTT) (≧ 98%, Sigam-Aldrich)、Dowex（登録商標） 50W X8水素フォーム 強酸性 50－100メッシュ(Sigma-Aldrich)、アセトン (>99 % Sigma-Aldrich)。 Irgacure（登録商標） 2959 は、BASF から寄付された。PMA は Scientific Polymer Products から購入し(トルエン中 40.08% 溶液、約Mw: 40,000 g.mol-1) 、4-ペンテニルアミンは公開された方法（Byrne, J. et al., 2016を参照）に従って合成した。重水素化水 (D2O)は、Eurisotop から購入した。
材料
以下の化学物質は、さまざまなプロバイダーから購入し、受け取ったまま使用した: トリアザビシクロデセン(TBD, 98%, TCI)、エタノールアミン(99%, TCI)、アリルアミン(99%, Sigma-Aldrich)、DL-ジチオスレイトール(DTT) (≧ 98%, Sigam-Aldrich)、Dowex（登録商標） 50W X8水素フォーム 強酸性 50－100メッシュ(Sigma-Aldrich)、アセトン (>99 % Sigma-Aldrich)。 Irgacure（登録商標） 2959 は、BASF から寄付された。PMA は Scientific Polymer Products から購入し(トルエン中 40.08% 溶液、約Mw: 40,000 g.mol-1) 、4-ペンテニルアミンは公開された方法（Byrne, J. et al., 2016を参照）に従って合成した。重水素化水 (D2O)は、Eurisotop から購入した。
【0090】
器具類
Bruker Avance 300 MHz Ultrashield を使用して、室温で 1H-核磁気共鳴 (1H-NMR)スペクトルを測定した。化学シフトは、テトラメチルシランに対する百万分率 (δ) で示される。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は、1260 オンライン脱気装置、1260 ISO ポンプ、1260 自動液体サンプラー (ALS) 、２つの PLgel 5 μm 混合 D カラム (7.5 mm X 300 mm) および直列のプレカラム、1260 ダイオードアレイ検出器 (DAD) および 1260 屈折率検出器 (RID) を備えた 50℃ に設定された恒温カラム コンパートメント (TCC) ）を備えた Agilent 1260 シリーズ HPLC システムで実行した。使用した溶離液は、0.5 mL/min の流速で50 mMのLiClを含む N,N-ジメチルアセトアミド (DMA) だった。モル質量値およびモル質量分布、すなわち分散度 (D) 値は、PSSのポリメチルメタクリレート標準に対して計算された。FT-IR スペクトルは、Perkin-Elmer 1600 シリーズ FT-IR 分光計で測定され、波数 (cm-1) で報告される。遠心分離は、VWR 製のスクリューキャップ付きの50 ml遠心管またはFalcon製の15ml 高透明ポリプロピレン円錐管を使用して、Thermo Scientific製のALC 多速度冷却遠心分離機PK 121R で実行した。UVランプ源を備えたAnton Paar Rheometer MCR302を使用して、in-situ光架橋レオロジーによって光開始チオール－エンを実施した。
Bruker Avance 300 MHz Ultrashield を使用して、室温で 1H-核磁気共鳴 (1H-NMR)スペクトルを測定した。化学シフトは、テトラメチルシランに対する百万分率 (δ) で示される。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) は、1260 オンライン脱気装置、1260 ISO ポンプ、1260 自動液体サンプラー (ALS) 、２つの PLgel 5 μm 混合 D カラム (7.5 mm X 300 mm) および直列のプレカラム、1260 ダイオードアレイ検出器 (DAD) および 1260 屈折率検出器 (RID) を備えた 50℃ に設定された恒温カラム コンパートメント (TCC) ）を備えた Agilent 1260 シリーズ HPLC システムで実行した。使用した溶離液は、0.5 mL/min の流速で50 mMのLiClを含む N,N-ジメチルアセトアミド (DMA) だった。モル質量値およびモル質量分布、すなわち分散度 (D) 値は、PSSのポリメチルメタクリレート標準に対して計算された。FT-IR スペクトルは、Perkin-Elmer 1600 シリーズ FT-IR 分光計で測定され、波数 (cm-1) で報告される。遠心分離は、VWR 製のスクリューキャップ付きの50 ml遠心管またはFalcon製の15ml 高透明ポリプロピレン円錐管を使用して、Thermo Scientific製のALC 多速度冷却遠心分離機PK 121R で実行した。UVランプ源を備えたAnton Paar Rheometer MCR302を使用して、in-situ光架橋レオロジーによって光開始チオール－エンを実施した。
【0091】
合成
ＡとＢの調製手順
PMA（0.5 g、40 kDa、約5.81ミリモルのメチルエステル基に相当する0.0125ミリモル）を5 mLフラスコ（5 mLマイクロ波管）に秤量した。所定の比率（モル比1:1または2:1）の適切な量のアミン（メチルエステル基あたり合計6当量のアミン）をフラスコに導入し、溶液を0℃に冷却し、アルゴンで10分間バブリングし脱気した。フラスコ 1A、モル比 2:1、エタノールアミン(23.25 mmol、1.39 mL) ／アリルアミン(11.6 mmol、1.03 mL)。 フラスコ 2A、モル比 1:1、エタノールアミン (17.43 mmol、1.04 mL)／アリルアミン (17.43 mmol、1.54 mL)。フラスコ 1B、モル比2:1、エタノールアミン (23.25 mmol、1.39mL)／4-ペンテニルアミン (11.6 mmol、1.16 g)。フラスコ 2B、モル比1:1、エタノールアミン (17.43 mmol、1.04mL)／4-ペンテニルアミン (17.43 mmol、1.75 g)。次いでTBD（メチルエステル当たり81 mg、0.58 mmol、0.1当量）を混合物に添加し、フラスコをアルゴンでフラッシュし、蓋をして80℃で24時間加熱した。室温に戻した後、混合物を冷アセトン30 mLに注ぎ、ポリマーを沈殿させた。溶液を遠心分離し、液体の上澄みを廃棄した。最小量のメタノール（2-3 mL）に溶解し、冷アセトン（30 mL）に注ぐことにより、ポリマーをさらに３回沈殿させた。TBD と残留微量のアミンを除去するために、得られたポリマーを水に溶解し、各サンプルにDowex (160 mg、TBDの質量の2倍) を加えた。5 時間撹拌し、ろ過してDowex を除去した後、凍結乾燥によって水を除去し、得られた固体を真空オーブン40℃ で一晩乾燥させ、目的の純粋なポリマーを白色粉末として得た。
ＡとＢの調製手順
PMA（0.5 g、40 kDa、約5.81ミリモルのメチルエステル基に相当する0.0125ミリモル）を5 mLフラスコ（5 mLマイクロ波管）に秤量した。所定の比率（モル比1:1または2:1）の適切な量のアミン（メチルエステル基あたり合計6当量のアミン）をフラスコに導入し、溶液を0℃に冷却し、アルゴンで10分間バブリングし脱気した。フラスコ 1A、モル比 2:1、エタノールアミン(23.25 mmol、1.39 mL) ／アリルアミン(11.6 mmol、1.03 mL)。 フラスコ 2A、モル比 1:1、エタノールアミン (17.43 mmol、1.04 mL)／アリルアミン (17.43 mmol、1.54 mL)。フラスコ 1B、モル比2:1、エタノールアミン (23.25 mmol、1.39mL)／4-ペンテニルアミン (11.6 mmol、1.16 g)。フラスコ 2B、モル比1:1、エタノールアミン (17.43 mmol、1.04mL)／4-ペンテニルアミン (17.43 mmol、1.75 g)。次いでTBD（メチルエステル当たり81 mg、0.58 mmol、0.1当量）を混合物に添加し、フラスコをアルゴンでフラッシュし、蓋をして80℃で24時間加熱した。室温に戻した後、混合物を冷アセトン30 mLに注ぎ、ポリマーを沈殿させた。溶液を遠心分離し、液体の上澄みを廃棄した。最小量のメタノール（2-3 mL）に溶解し、冷アセトン（30 mL）に注ぐことにより、ポリマーをさらに３回沈殿させた。TBD と残留微量のアミンを除去するために、得られたポリマーを水に溶解し、各サンプルにDowex (160 mg、TBDの質量の2倍) を加えた。5 時間撹拌し、ろ過してDowex を除去した後、凍結乾燥によって水を除去し、得られた固体を真空オーブン40℃ で一晩乾燥させ、目的の純粋なポリマーを白色粉末として得た。
【0092】
硬化実験
In situ光架橋実験は、二重結合（アリル基、ペンテニル基）あたり0.5当量のDDT、およびDDTあたり10 mol％の光開始剤（Irgacure2959）の濃度を含む、溶媒としての水中のポリマーの10 wt％溶液で実施された。溶液 (約0.4 mL) をレオメーターガラスプレート上に置き、ギャップを 0.4 mm (直径 25 mm の上部プロファイル) に固定した。貯蔵弾性率と損失弾性率は、0.1 % の (振動) せん断変形のガンマ振幅と１Hz の変形周波数で 665 秒間にわたって測定された。ベースラインを１分間測定した後、溶液を室温でＵＶランプ（365 nmでフィルター、光ファイバーを介したガラス板の底で照射）で照射した。
In situ光架橋実験は、二重結合（アリル基、ペンテニル基）あたり0.5当量のDDT、およびDDTあたり10 mol％の光開始剤（Irgacure2959）の濃度を含む、溶媒としての水中のポリマーの10 wt％溶液で実施された。溶液 (約0.4 mL) をレオメーターガラスプレート上に置き、ギャップを 0.4 mm (直径 25 mm の上部プロファイル) に固定した。貯蔵弾性率と損失弾性率は、0.1 % の (振動) せん断変形のガンマ振幅と１Hz の変形周波数で 665 秒間にわたって測定された。ベースラインを１分間測定した後、溶液を室温でＵＶランプ（365 nmでフィルター、光ファイバーを介したガラス板の底で照射）で照射した。
【0093】
結果と考察
図７Ａおよび図７Ｂは、ポリ（アリルアクリルアミド）とポリ（ペンテニルアクリルアミド）コポリマーの硬化特性を比較した硬化実験の結果を示しています。より具体的には、図７Ａおよび図７Ｂは、ポリ（アリルアクリルアミド）コポリマーとポリ（ペンテニルアクリルアミド）コポリマーの貯蔵弾性率G’と損失弾性率G’’の値を示す。図７Ａにおいて、テストされたアルケン (アリルまたはペンテニル) は、NMRによって測定されたポリマー内の濃度が3%であり、図７Ｂでは、テストしたアルケン (アリルまたはペンテニル) は、NMRによっても測定され、ポリマー内の濃度が3%である。
図７Ａおよび図７Ｂは、ポリ（アリルアクリルアミド）とポリ（ペンテニルアクリルアミド）コポリマーの硬化特性を比較した硬化実験の結果を示しています。より具体的には、図７Ａおよび図７Ｂは、ポリ（アリルアクリルアミド）コポリマーとポリ（ペンテニルアクリルアミド）コポリマーの貯蔵弾性率G’と損失弾性率G’’の値を示す。図７Ａにおいて、テストされたアルケン (アリルまたはペンテニル) は、NMRによって測定されたポリマー内の濃度が3%であり、図７Ｂでは、テストしたアルケン (アリルまたはペンテニル) は、NMRによっても測定され、ポリマー内の濃度が3%である。
【0094】
図７Ａおよび図７Ｂで説明される硬化実験は、溶媒として水を使用し、アリルあたり 0.5 当量の DDT、および DDT あたり 10%mol の光開始剤 (Irgacure) の濃度を使用し、10%wt のコポリマー濃度で実施した。
【0095】
【0096】
参考文献
1. Hoogenboom, R. Poly(2-oxazoline)s: A polymer classwith numerous potential applications. Angewandte Chemie - International Edition48, 7978-7994, doi:10.1002/anie.200901607 (2009).
2. Dargaville, T. R., Park, J. R. & Hoogenboom, R.Poly(2-oxazoline) Hydrogels: State-of-the-Art and Emerging Applications.Macromolecular Bioscience 18, doi:10.1002/mabi.201800070 (2018).
3. Sedlacek, O. and Hoogenboom, R. (2020), Drug DeliverySystems Based on Poly(2‐Oxazoline)s and Poly(2‐Oxazine)s. Adv. Therap., 3:1900168.
4. Dargaville, Tim & Lava, Kathleen &Verbraeken, Bart & Richard, Hoogenboom. Unexpected Switching of thePhotogelation Chemistry When Cross-Linking Poly(2-oxazoline) Copolymers.Macromolecules. 49. 10.1021/acs.macromol.6b00167 (2016).
5. Monnery, B. D. et al. Defined High Molar MassPoly(2-Oxazoline)s. Angewandte Chemie - International Edition 57, 15400-15404,doi:10.1002/anie.201807796 (2018).
6. P.J.M Bouten, Dietmar Hertsen, Maarten Vergaelen,Bryn D. Monnery, Saron Catak, Jan C. M. van Hest, Veronique Van Speybroek,Richard Hoogenboom, Synthesis of poly(2‐oxazoline)s with side chain methylester functionalities: Detailed understanding of living copolymerization behaviorof methyl ester containing monomers with 2‐alkyl‐2‐oxazolines, J. Polym. Sci.,Part A: Polym. Chem., 53, 2649-2661, https://doi.org/10.1002/pola.27733 (2015).
7. Lynn, A. D., Kyriakides, T. R. & Bryant, S. J.Characterization of the in vitro macrophage response and in vivo host responseto poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J. Biomed. Mater. Res., Part A 93,941-953, doi:10.1002/jbm.a.32595 (2010).
8. Byrne, J. P.; Blasco, S.; Aletti, A. B.; Hessman,G.; Gunnlaugsson, T., Formation of Self‐Templated2,6‐Bis(1,2,3‐triazol‐4‐yl)pyridine [2]Catenanes by Triazolyl Hydrogen Bonding:Selective Anion Hosts for Phosphate. Angewandte Chemie International Edition2016, 55 (31), 8938-8943.
1. Hoogenboom, R. Poly(2-oxazoline)s: A polymer classwith numerous potential applications. Angewandte Chemie - International Edition48, 7978-7994, doi:10.1002/anie.200901607 (2009).
2. Dargaville, T. R., Park, J. R. & Hoogenboom, R.Poly(2-oxazoline) Hydrogels: State-of-the-Art and Emerging Applications.Macromolecular Bioscience 18, doi:10.1002/mabi.201800070 (2018).
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5. Monnery, B. D. et al. Defined High Molar MassPoly(2-Oxazoline)s. Angewandte Chemie - International Edition 57, 15400-15404,doi:10.1002/anie.201807796 (2018).
6. P.J.M Bouten, Dietmar Hertsen, Maarten Vergaelen,Bryn D. Monnery, Saron Catak, Jan C. M. van Hest, Veronique Van Speybroek,Richard Hoogenboom, Synthesis of poly(2‐oxazoline)s with side chain methylester functionalities: Detailed understanding of living copolymerization behaviorof methyl ester containing monomers with 2‐alkyl‐2‐oxazolines, J. Polym. Sci.,Part A: Polym. Chem., 53, 2649-2661, https://doi.org/10.1002/pola.27733 (2015).
7. Lynn, A. D., Kyriakides, T. R. & Bryant, S. J.Characterization of the in vitro macrophage response and in vivo host responseto poly(ethylene glycol)-based hydrogels. J. Biomed. Mater. Res., Part A 93,941-953, doi:10.1002/jbm.a.32595 (2010).
8. Byrne, J. P.; Blasco, S.; Aletti, A. B.; Hessman,G.; Gunnlaugsson, T., Formation of Self‐Templated2,6‐Bis(1,2,3‐triazol‐4‐yl)pyridine [2]Catenanes by Triazolyl Hydrogen Bonding:Selective Anion Hosts for Phosphate. Angewandte Chemie International Edition2016, 55 (31), 8938-8943.
【0097】
図面の用語
initiation 開始
propagation 伝搬
termination 終結
no thiol チオールなし
Time(sec) 時間（秒）
Xthiol Xチオール
Time(s) 時間（秒）
Gelation time (s) ゲル化時間（秒）
Storage modulus G’ in Pa 貯蔵弾性率 G' (Pa)
Loss Modulus G’’ in Pa 損失弾性率 G'' (Pa)
Time in s 時間（秒）
allyl アリル
pentenyl ペンテニル
initiation 開始
propagation 伝搬
termination 終結
no thiol チオールなし
Time(sec) 時間（秒）
Xthiol Xチオール
Time(s) 時間（秒）
Gelation time (s) ゲル化時間（秒）
Storage modulus G’ in Pa 貯蔵弾性率 G' (Pa)
Loss Modulus G’’ in Pa 損失弾性率 G'' (Pa)
Time in s 時間（秒）
allyl アリル
pentenyl ペンテニル
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】