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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-17
(54)【発明の名称】抗微生物ペプチド半減期のモジュレーション
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20231110BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20231110BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C12N9/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526187
(86)(22)【出願日】2021-11-05
(85)【翻訳文提出日】2023-06-23
(86)【国際出願番号】 US2021072262
(87)【国際公開番号】W WO2022104321
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/112,073
(32)【優先日】2020-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520067943
【氏名又は名称】シングロン エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ガバント，フィリップ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ16
4B063QQ17
4B063QQ20
4B063QR82
(57)【要約】
抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法が記載される。本方法は、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで活性を維持するようにして、抗微生物ペプチドを環境に投与することと、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することにより抗微生物ペプチドを不活性化して、その半減期をモジュレートすることと、を含みうる。抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートするための組成物及びキットも記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法であって、前記方法が、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するようにして、前記抗微生物ペプチドを前記環境に投与することと、
前記特定のエンドポイントで又は前記特定のエンドポイントの後で、前記抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することにより、前記抗微生物ペプチドを不活性化して、それにより前記抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることと、
を含む方法。
【請求項2】
前記抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある１以上の微生物の成長を許容するとして前記環境を同定することをさらに含み、いずれかの微生物が前記抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前に前記抗微生物ペプチドが前記プロテアーゼで消化される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記抗微生物ペプチドが前記環境内で消化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記抗微生物ペプチドが望まれない微生物の成長又は繁殖を阻害する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記望まれない微生物又はそのクローンが前記抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前に前記抗微生物ペプチドが前記プロテアーゼで消化される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記望まれない微生物が、病原体、汚染菌、及び産業上の特性を失った産業用微生物からなる群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項7】
セルピンを前記環境に添加することをさらに含み、前記セルピンが前記プロテアーゼを阻害する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記抗微生物ペプチドが前記環境中で前記プロテアーゼにより消化される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記抗微生物ペプチドが前記環境外で前記プロテアーゼにより消化される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記プロテアーゼが基材上に配設され、前記抗微生物ペプチドを消化することが前記抗微生物ペプチドと前記基材とを接触させることを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記環境が、対象の器官、ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオーム、食品若しくはその一部分、医療デバイス、産業用供給原料、又は医薬品若しくは化粧品製造環境を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記環境が、前記対象の器官又は前記ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオームを含み、前記方法が、前記投与前に前記抗微生物ペプチドに関してｅｘ ｖｉｖｏ選択をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記抗微生物ペプチドが対象に投与され、前記環境が病原微生物を含み、及び前記特定のエンドポイントが前記病原微生物の成長又は繁殖を阻害することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記特定のエンドポイントが、特定の期間、閾値未満のレベルへの前記抗微生物ペプチドの標的となる微生物の量の減少、閾値未満のレベルへの前記抗微生物ペプチドの標的となる微生物の活性レベルの減少、又は前記環境の変化である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記環境が、前記抗微生物ペプチドをコードする核酸を含む第１の遺伝子工学操作微生物を含み、前記抗微生物ペプチドを投与することが、前記抗微生物ペプチドを発現して前記環境中に分泌する前記遺伝子工学操作微生物を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記第１の遺伝子工学操作微生物が、前記プロテアーゼをコードする核酸を含み、前記プロテアーゼをコードする核酸の転写、前記プロテアーゼをコードする核酸の転写物の翻訳、又は前記特定のエンドポイントでの前記コードされたプロテアーゼの分泌を誘発するように構成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記環境が、前記プロテアーゼをコードする核酸を含む第２の遺伝子工学操作微生物を含み、前記プロテアーゼをコードする核酸の転写、前記プロテアーゼをコードする核酸の転写物の翻訳、又は前記特定のエンドポイントでの前記コードされたプロテアーゼの分泌を誘発するように構成される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記抗微生物ペプチドが、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、及び抗癌ペプチドからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗微生物ペプチドが、前記抗微生物ペプチドとは異なる第１の追加の抗微生物ペプチドをさらに含むカクテルで投与され、前記第１の追加の抗微生物ペプチドが消化されない、
請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記カクテルが、前記抗微生物ペプチドとは異なる第２の追加の抗微生物ペプチドをさらに含み、前記第２の追加の抗微生物ペプチドが、前記プロテアーゼとは異なる第２のプロテアーゼにより消化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記追加の抗微生物ペプチドの少なくとも１つが、前記プロテアーゼにより消化される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
前記方法が、トリプシン感受性の前記抗微生物ペプチドを選択することをさらに含み、前記特定のエンドポイント前に、前記抗微生物ペプチドが、食品変敗の原因となる微生物の成長又は繁殖を阻害し、
前記特定のエンドポイントが前記食品の摂取であり、及び
前記プロテアーゼがトリプシンを含む、
請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記消化することが、前記抗微生物ペプチドの半減期を５０％以上減少する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記抗微生物ペプチドを消化することが、２以上の異なるプロテアーゼで前記抗微生物ペプチドを消化することを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記プロテアーゼが、遺伝子工学操作又は合成プロテアーゼを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記環境から製品を生産することをさらに含み、前記抗微生物ペプチドが、前記製品を生産する前に消化され、前記製品が前記抗微生物ペプチドを含まない、
請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記製品が、産業品、医薬品、化粧品、及び良品からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
プロテアーゼ、前記プロテアーゼにより特異的に消化される切断部位を含む抗微生物ペプチド、及び
前記抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物、
を含む、組成物。
【請求項29】
抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を標的とするように選択された前記抗微生物ペプチド、及び前記抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼ、
を含む、キット。
【請求項30】
前記抗微生物ペプチド及び前記プロテアーゼが別々の組成物中にある、請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
前記抗微生物ペプチド及び前記プロテアーゼが同一組成物中にあり、及び前記プロテアーゼが、特定のエンドポイント前に前記抗微生物ペプチドを消化しないように配設される、請求項２９に記載のキット。
【請求項32】
前記プロテアーゼが、前記プロテアーゼをアンタゴナイズするように構成されたセルピンと共に配設されている、請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
前記プロテアーゼが、前記抗微生物ペプチドから物理的に分離される、請求項２９又は３０に記載のキット。
【請求項34】
前記抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼが、ヒト対象へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のために製剤化される、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項35】
前記抗微生物ペプチドが、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、及び抗癌ペプチドからなる群から選択される、請求項２９～３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項36】
前記抗微生物ペプチドを含む抗微生物ペプチドのカクテルをさらに含み、前記プロテアーゼが、前記カクテルの少なくともいくつかの抗微生物ペプチドを消化する能力がない、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項37】
前記プロテアーゼを阻害するように選択されたセルピンをさらに含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の参照
[0001] 本願は、２０２０年１１月１０日出願の米国仮特許出願第６３／１１２０７３号に基づく利益を主張する。この関連出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001] 本願は、２０２０年１１月１０日出願の米国仮特許出願第６３／１１２０７３号に基づく利益を主張する。この関連出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列リスト、表、又はコンピュータープログラムリストの参照
[0002] 本願は、電子フォーマットの配列リストを添えて出願されている。配列リストは、４０２，８０３バイトのサイズで２０２１年１０月２７日に作成及び最終保存されたSYNG008WOSEQUENCE.TXTという名称のファイルとして提供される。配列リストの電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0002] 本願は、電子フォーマットの配列リストを添えて出願されている。配列リストは、４０２，８０３バイトのサイズで２０２１年１０月２７日に作成及び最終保存されたSYNG008WOSEQUENCE.TXTという名称のファイルとして提供される。配列リストの電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
背景
[0003] 微生物の成長を調節又は阻害することは、発酵槽、食品生産施設、医薬品及び化粧品、医療デバイス及び施設など、各種産業及び医療環境で重要である。微生物の成長を阻害する抗微生物化合物は、微生物の成長を制御するのに有効でありうる。
[0003] 微生物の成長を調節又は阻害することは、発酵槽、食品生産施設、医薬品及び化粧品、医療デバイス及び施設など、各種産業及び医療環境で重要である。微生物の成長を阻害する抗微生物化合物は、微生物の成長を制御するのに有効でありうる。
【0004】
[0004] 抗微生物ペプチドは、微生物の成長を調節又は阻害することが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
分野
[0005] 本開示の実施形態は、環境中での抗微生物ペプチドの使用、及びプロテアーゼによる抗微生物ペプチドの半減期のモジュレーションに関する。
[0005] 本開示の実施形態は、環境中での抗微生物ペプチドの使用、及びプロテアーゼによる抗微生物ペプチドの半減期のモジュレーションに関する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
概要
[0006] 本明細書には、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（「モジュレーション方法」ともいわれる）が記載されている。モジュレーション方法の実施形態は、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するようにして、抗微生物ペプチドを環境に投与することと、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することにより、抗微生物ペプチドを不活性化して、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることと、を含みうる。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、本方法は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物の成長を許容するとして環境を同定することを含みうる。抗微生物ペプチドは、いずれかの微生物が抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前にプロテアーゼで消化可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境内で消化される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、望まれない微生物（本明細書では「望ましくない微生物」ともいわれうる）の成長又は繁殖を阻害する。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、望まれない微生物又はそのクローンが抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前にプロテアーゼで消化される。たとえば、望まれない微生物は、病原体、汚染菌、及び産業上の特性を失ってしまった産業用微生物からなる群から選択可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、本方法は、セルピンを環境に添加することを含む。セルピンは、プロテアーゼを阻害可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境中でプロテアーゼにより消化される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境外でプロテアーゼにより消化される。
[0006] 本明細書には、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（「モジュレーション方法」ともいわれる）が記載されている。モジュレーション方法の実施形態は、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するようにして、抗微生物ペプチドを環境に投与することと、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することにより、抗微生物ペプチドを不活性化して、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることと、を含みうる。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、本方法は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物の成長を許容するとして環境を同定することを含みうる。抗微生物ペプチドは、いずれかの微生物が抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前にプロテアーゼで消化可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境内で消化される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、望まれない微生物（本明細書では「望ましくない微生物」ともいわれうる）の成長又は繁殖を阻害する。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、望まれない微生物又はそのクローンが抗微生物ペプチドへの耐性を生じる前にプロテアーゼで消化される。たとえば、望まれない微生物は、病原体、汚染菌、及び産業上の特性を失ってしまった産業用微生物からなる群から選択可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、本方法は、セルピンを環境に添加することを含む。セルピンは、プロテアーゼを阻害可能である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境中でプロテアーゼにより消化される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境外でプロテアーゼにより消化される。
【0007】
[0007] いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、プロテアーゼは基材上に配設され、抗微生物ペプチドを消化することは、抗微生物ペプチドと基材とを接触させることを含む。たとえば、プロテアーゼは、共有結合や非共有結合などを介して基材上に固定されうる。例として、基材は、粒子、ビーズ、カプセル、又はマトリックスたとえばゲルマトリックスを含みうる。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、環境は、対象の器官、ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオーム、食品若しくはその一部分、医療デバイス、産業用供給原料、又は医薬品若しくは化粧品製造環境を含む。たとえば、環境は、対象の器官又はｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオームを含みうる。任意に、本方法は、投与前に抗微生物ペプチドのｅｘ ｖｉｖｏ選択をさらに含みうる。
【0008】
[0008] 本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、抗微生物ペプチドは対象に投与されうるとともに、環境は病原微生物を含み、特定のエンドポイントは、病原微生物の成長又は繁殖を阻害することを含む。本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、特定のエンドポイントは、特定の期間、閾値未満のレベルへの抗微生物ペプチドの標的となる微生物の量の減少、閾値未満のレベルへの抗微生物ペプチドの標的となる微生物の活性レベルの減少、又は環境の変化でありうる。本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、環境は、抗微生物ペプチドをコードする核酸を含む第１の遺伝子工学操作微生物を含みうるとともに、抗微生物ペプチドを投与することは、抗微生物ペプチドを発現して環境中に分泌する遺伝子工学操作微生物を含みうる。たとえば、第１の遺伝子工学操作微生物は、プロテアーゼをコードする核酸を含みうるとともに、プロテアーゼをコードする核酸の転写、プロテアーゼをコードする核酸の転写物の翻訳、又は特定のエンドポイントでのコードプロテアーゼの分泌を誘発するように構成される。
【0009】
[0009] 本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、環境は、プロテアーゼをコードする核酸を含む第２の遺伝子工学操作微生物を含みうるとともに、プロテアーゼをコードする核酸の転写、プロテアーゼをコードする核酸の転写物の翻訳、又は特定のエンドポイントでのコードプロテアーゼの分泌を誘発するように構成される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、及び抗癌ペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、前記抗微生物ペプチドとは異なる第１の追加の抗微生物ペプチドをさらに含むカクテルで投与され、第１の追加の抗微生物ペプチドは消化されない。いくつかの実施形態では、カクテルは、前記抗微生物ペプチドとは異なる第２の追加の抗微生物ペプチドをさらに含み、第２の追加の抗微生物ペプチドは、前記プロテアーゼとは異なる第２のプロテアーゼにより消化される。いくつかの実施形態では、追加の抗微生物ペプチドの少なくとも１種は、プロテアーゼにより消化される。
【0010】
[0010] 本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、本方法は、トリプシン感受性の抗微生物ペプチドを選択することをさらに含みうる。特定のエンドポイント前、抗微生物ペプチドは、食品変敗の原因となる微生物の成長又は繁殖を阻害しうる。特定のエンドポイントは、食品の摂取でありうるとともに、プロテアーゼは、トリプシンを含みうる。すなわち、いくつかの実施形態では、食品変敗を阻害する抗微生物ペプチドは、食品中に存在しうるとともに、対象により摂取されると対象の胃腸管内でトリプシンにより分解されうる（それゆえ、特定のエンドポイントは、食品の摂取でありうる）。
【0011】
[0011] 本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、抗微生物ペプチドを消化することは、抗微生物ペプチドの半減期を少なくとも５０％、たとえば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％減少させる。本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、抗微生物ペプチドを消化することは、２種以上の異なるプロテアーゼで抗微生物ペプチドを消化することを含む。本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、遺伝子工学操作又は合成プロテアーゼを含む。例として、合成プロテアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで所望のプロテアーゼ活性に関して選択可能である。本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれでも、いくつかの実施形態によれば、本方法は、環境から製品を生産することを含み、抗微生物ペプチドは、製品が抗微生物ペプチドを含まないように製品を生産する前に消化される。たとえば、製品は、産業品、医薬品、化粧品、及び食品からなる群から選択可能である。
【0012】
[0012] また、プロテアーゼ、プロテアーゼにより特異的に消化される切断部位を含む抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を含む組成物も記載される。
【0013】
[0013] また、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を標的とするように選択された抗微生物ペプチドと、抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼと、を含むキットも記載される。いくつかの実施形態のキットでは、抗微生物ペプチド及びプロテアーゼは、別々の組成物中にある。いくつかの実施形態のキットでは、抗微生物ペプチド及びプロテアーゼは、同一組成物中にあり、プロテアーゼは、特定のエンドポイント前に抗微生物ペプチドを消化しないように配設される。たとえば、プロテアーゼは、プロテアーゼをアンタゴナイズするように構成されたセルピンと共に配設可能である。いくつかの実施形態のキットでは、プロテアーゼは、抗微生物ペプチドから物理的に分離される。本明細書に記載のキットのいずれでも、いくつかの実施形態によれば、抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼは、ヒト対象へのｉｎ ｖｉｖｏ投与のために製剤化される。本明細書に記載のキットのいずれでも、いくつかの実施形態によれば、抗微生物ペプチドは、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、及び抗癌ペプチドからなる群から選択される。本明細書に記載のキットのいずれでも、いくつかの実施形態によれば、キットは、抗微生物ペプチドを含む抗微生物ペプチドのカクテルをさらに含み、プロテアーゼは、カクテルの少なくともいくつかの抗微生物ペプチドを消化する能力がない。本明細書に記載のキットのいずれでも、いくつかの実施形態によれば、キットは、プロテアーゼを阻害するように選択されたセルピンをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】[0014]本開示のいくつかの実施形態に係る抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法のフロー図である。
【図2】[0015]本開示のいくつかの実施形態に係る抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法を描く模式図である。
【図3】[0016]本開示のいくつかの実施形態に係る抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法を描く模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
詳細な説明
[0017] 本明細書には、環境中の抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（本明細書では「モジュレーション方法」といわれうる）が提供される。モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドを環境に投与することと、続いて、たとえば、プロテアーゼによる消化により、抗微生物ペプチドを不活性化することと、を含みうる。たとえば、抗微生物ペプチドは、特定のエンドポイントで又はその後で（たとえば、望まれない微生物がある特定のレベルに又はそれ未満になったら）不活性化可能であり、その時点では、抗微生物ペプチドは、必要とされず望まれもしない。抗微生物タンパク質を不活性化することは、微生物が抗微生物ペプチドへの耐性を生じる尤度を回避又は減少可能であることが企図される。
[0017] 本明細書には、環境中の抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（本明細書では「モジュレーション方法」といわれうる）が提供される。モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドを環境に投与することと、続いて、たとえば、プロテアーゼによる消化により、抗微生物ペプチドを不活性化することと、を含みうる。たとえば、抗微生物ペプチドは、特定のエンドポイントで又はその後で（たとえば、望まれない微生物がある特定のレベルに又はそれ未満になったら）不活性化可能であり、その時点では、抗微生物ペプチドは、必要とされず望まれもしない。抗微生物タンパク質を不活性化することは、微生物が抗微生物ペプチドへの耐性を生じる尤度を回避又は減少可能であることが企図される。
【0016】
[0018] プロテアーゼにより抗微生物ペプチドを消化することは、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートしうる。本明細書で用いられる「半減期」は、本開示に鑑みて当業者により理解されるその慣用的かつ通常の意味を有する。抗微生物ペプチドの半減期は、環境中のインタクト（たとえば、全長）抗微生物ペプチドの活性レベル（たとえば、抗微生物ペプチドによる標的微生物の成長の阻害レベル）又は量に基づきうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの半減期は、抗微生物ペプチドの活性レベルを５０％低減するのに要する時間（たとえば、抗微生物ペプチドの最初の活性レベルが最初の活性レベルの５０％に低減される時間）である。たとえば、活性レベルは、抗微生物ペプチドが環境に投与されたときの標的微生物の成長の阻害レベルを意味しうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの半減期は、インタクト抗微生物ペプチドの量を５０％低減するのに要する時間である。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することは、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、１０％～３０％、１０％～５０％、１０％～９０％、２０％～５０％、２０％～９０％、３０％～５０％、３０％～９０％、又は５０％～９０％を含めて、抗微生物ペプチドの半減期を１０％以上、たとえば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は約１００％低減する。
【0017】
[0019] 抗微生物ペプチドの標的は、１種以上の微生物（「標的微生物（target microbial organism）」又は「標的微生物（target microorganism）」といわれうる）を含みうる。標的微生物は、望まれない微生物、たとえば、限定されるものではないが、病原体、汚染性微生物、又は産業生産に使用される微生物であるがその産業上の特性を失ったものでありうる。いくつかの実施形態では、環境は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じうる微生物（たとえば、汚染性さもなければ望まれない微生物）の成長を許容しうる。プロテアーゼによる消化を介するなどして抗微生物ペプチドを不活性化することにより、微生物は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じないように阻害又は予防されうる。いくつかの実施形態では、ある特定の環境に対して抗微生物ペプチドがその環境外に存在しないように及びその環境外で活性でないように抗微生物ペプチドの活性を制限すること、たとえば、抗微生物ペプチドへの耐性が環境外で生じないように耐性を阻害又は予防することが望ましいであろう。
【0018】
[0020] いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることが望ましいいずれの好適な環境にも投与されうるとともに、たとえば、その場合、抗微生物ペプチドへの耐性を生じないように微生物を阻害又は予防することが望ましいであろう。好適な環境としては、限定されるものではないが、対象（たとえば、ヒト対象をはじめとする哺乳動物対象）の器官、ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオーム、食品若しくはその一部分、医療デバイス、産業用供給原料、又は医薬品若しくは化粧品製造環境（たとえば、バイオリアクター）、或いは列挙されたアイテムの２つ以上の組み合わせが挙げられる。製品の生産に環境が使用される場合、たとえば、医薬品、化粧品、又は食品の製造環境では、製品自体が製造環境外で活性抗微生物ペプチドを含有しないように、製品を作製する前及び／又は製品が製造環境を離れる前に抗微生物ペプチドを不活性化することが望ましいであろう。そのため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは環境内で消化される。
【0019】
[0021] また、プロテアーゼを含む、それからなる、又はそれから本質的になる組成物、プロテアーゼにより特異的に切断される切断部位を含む抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物も記載される。いくつかの実施形態では、キットは、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を標的とする抗微生物ペプチド（又は抗微生物ペプチドをコードする核酸）を含み、それからなり、又はそれから本質的になり、また、抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼ（又はプロテアーゼをコードする核酸）も提供される。
【0020】
微生物
[0022] 本明細書で用いられる場合、「微生物（microbial organism）」、「微生物（microorganism）」、及びこれらのルート語の変化形（たとえば、複数形など）は、本開示に鑑みて当業者により理解されるそれらの慣用的かつ通常の意味を有する。それらは、いずれの天然に存在する種も、完全合成原核又は真核単細胞生物も、さらには古細菌種も包含する。そのため、この用語は、細菌種、真菌種、及び藻類の細胞を意味しうる。「微生物（microbial organism）」及び「微生物（microorganism）」は、本明細書では互換的に用いられうるとともに、これらのルート語の対応する変化形も同様でありうる。
[0022] 本明細書で用いられる場合、「微生物（microbial organism）」、「微生物（microorganism）」、及びこれらのルート語の変化形（たとえば、複数形など）は、本開示に鑑みて当業者により理解されるそれらの慣用的かつ通常の意味を有する。それらは、いずれの天然に存在する種も、完全合成原核又は真核単細胞生物も、さらには古細菌種も包含する。そのため、この用語は、細菌種、真菌種、及び藻類の細胞を意味しうる。「微生物（microbial organism）」及び「微生物（microorganism）」は、本明細書では互換的に用いられうるとともに、これらのルート語の対応する変化形も同様でありうる。
【0021】
[0023] 本明細書の実施形態に従って使用可能な又は抗微生物ペプチドで成長が阻害されうる好適な微生物としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、及び藻類、たとえば光合成マイクロ藻類が挙げられる。さらに、連続自己複製能力のある合成微生物を生産するために、完全合成微生物ゲノムを合成して単一微生物細胞中に移植可能である（Gibson et al. (2010),“Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome,”Science 329:52-56（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を参照されたい）。このため、いくつかの実施形態では、微生物は完全合成である。遺伝子発現を調節するエレメントを含む遺伝子エレメントと、遺伝子産物（たとえば、抗微生物ペプチド、免疫モジュレーター、プロテアーゼ、毒、解毒剤、及び産業上有用な分子）をコードするエレメントと、の所望の組合せを所望のシャーシ上でアセンブルし、部分又は完全合成微生物にすることが可能である。また、産業用途向け遺伝子工学操作微生物の説明は、Wright,et al. (2013)“Building-in biosafety for synthetic biology”Microbiology 159:1221-1235にも見いだされうる。
【0022】
[0024] 本明細書の実施形態に従ってさまざまな細菌種及び株を使用可能であり又は抗微生物ペプチドの標的としうるとともに、遺伝子修飾バリアント又は既知種の「シャーシ（chassis）」に基づく合成細菌を提供可能である。本明細書の実施形態に従って使用可能である産業上適用可能な特性を有する模範的細菌としては、限定されるものではないが、バチルス属（Bacillus）種（たとえば、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis））、パエニバチルス属（Paenibacillus）種、ストレプトマイセス属（Streptomyces）種、マイクロコッカス属（Micrococcus）種、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）種、アセトバクター属（Acetobacter）種、シアノバクテリア門（Cyanobacteria）種、サルモネラ属（Salmonella）種、ロドコッカス属（Rhodococcus）種、シュードモナス属（Pseudomonas）種、ラクトバチルス属（Lactobacillus）種、エンテロコッカス属（Enterococcus）種、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）種、バクテロイデス属（Bacteroides）種、アルカリゲネス属（Alcaligenes）種、クレブシエラ属（Klebsiella）種、パエニバチルス属（Paenibacillus）種、アルスロバクター属（Arthrobacter）種、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）種、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）種、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、クロストリジウム・サーモセラス（Clostridium thermocellus）、並びにエシェリキア・コライ（Escherichia coli）が挙げられる。
【0023】
[0025] 本明細書の実施形態に従ってさまざまな酵母種及び株を使用可能であり又は抗微生物ペプチドの標的としうるとともに、遺伝子修飾バリアント又は既知種の「シャーシ」に基づく合成酵母を提供可能である。本明細書の実施形態に従って使用可能である産業上適用可能な特性を有する模範的酵母としては、限定されるものではないが、サッカロマイセス属（Saccharomyces）種（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・ボウラルディー（Saccharomyces boulardii））、カンジダ属（Candida）種（たとえば、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei））、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）種（たとえば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シゾサッカロマイセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonica）））、ピキア属（Pichia）又はハンセヌラ属（Hansenula）種（たとえば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））、及びブレタノマイセス属（Brettanomyces）種（たとえば、ブレタノマイセス・クラウセニイ（Brettanomyces claussenii））が挙げられる。
【0024】
[0026] 本明細書の実施形態に従ってさまざまな藻類種及び株を使用可能であり又は抗微生物ペプチドの標的としうるとともに、遺伝子修飾バリアント又は既知種の「シャーシ」に基づく合成藻類を作り出すことが可能である。いくつかの実施形態では、藻類は、光合成マイクロ藻類を含む。バイオ燃料に有用でありうる及び本明細書の実施形態に従って使用可能な模範的藻類種としては、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Botryococcus braunii）、クロレラ属（Chlorella）種、デュナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、グラシラリア属（Gracilaria）種、プレウロクリシス・カルテラエ（Pleurochrysis carterae）、及びサルガサム属（Sargassum）種が挙げられる。そのほか、多くの藻類種は、食品、肥料品、廃棄物中和、環境レメディエーション、及び炭水化物製造（たとえば、バイオ燃料）に有用でありうる。
【0025】
[0027] 所望の微生物は、いずれかの好適な目的で環境に有益でありうる。いくつかの実施形態では、所望の微生物は、たとえば、環境中での微生物群集の成長及び／又は維持、微生物群集が属するより大きな環境、微生物を使用する目的などに利益を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の環境は、望まれない微生物により汚染される。望まれない微生物は、いずれかの関連する理由で望ましくないものでありうる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は病原体である。たとえば、望まれない微生物は、微生物群集の宿主生物（たとえば、哺乳動物）（たとえば、マイクロバイオームを含む宿主）に対して病原性がありうる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、微生物群集中で又はその周りで成長する生物に対して病原性がありうる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、微生物群集中で又はその周りで成長する生物に対して病原性がありうる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、環境中での所望の微生物の成長と競合する及び／又はそれに干渉する微生物である。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、病原体、汚染菌、並びに微生物群集中の所望の微生物の成長と競合する及び／又はそれに干渉する微生物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、産業上の特性を失ってしまった産業用微生物である。たとえば、産業用微生物は、環境中での産業品（たとえば、食品、医薬品、化粧品など）の生産に好適な微生物である。いくつかの実施形態では、環境は、産業用微生物により産業品に変換される前駆体成分を含み、産業上の特性は、前駆体成分が環境から枯渇したときに失われる。いくつかの実施形態では、産業用微生物は、製品を生産するように遺伝子工学操作され、及び産業上の特性は、微生物が遺伝子工学操作された核酸の一部又は全部を失ったときに失われる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、たとえば、製品若しくはその前駆体を汚染することにより、又は製品若しくはその前駆体を消費、損傷、若しくは破壊することにより、食品、化粧品、医薬品、産業品などの製品の生産に干渉する。
【0026】
[0028] いくつかの実施形態では、微生物（たとえば、望まれない微生物）は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力がある。抗微生物ペプチドに関して本明細書で用いられる「耐性を生じること」は、本開示に鑑みて当業者により理解されうるその通常かつ慣用的な意味を有する。それは、抗微生物ペプチドの存在下で成長させたときに抗微生物ペプチドの成長阻害及び／又は死滅効果を受けにくくなる微生物を意味する。たとえば、抗微生物ペプチドのＬＤ５０は、耐性を生じるにつれて増加しうる。耐性は、微生物の１世代以上の成長にわたり生じうる。そのため、抗微生物ペプチドへの耐性は、いずれのクローン又はその子孫も含めて微生物において獲得されうる。
【0027】
[0029] 耐性の発生は、いずれかの好適な手段により決定されうる。例として、耐性の発生は、有効量の抗微生物ペプチドの存在下の微生物の成長の量又は速度と参照のものとを比較することにより決定可能である。たとえば、参照は、抗微生物ペプチドの存在下の微生物と同一タイプ又は株の微生物を含みうるとともに、参照微生物は、抗微生物ペプチドナイーブである（すなわち、有効量の抗微生物ペプチドの存在下で成長されていない参照微生物）。いくつかの実施形態では、微生物は、抗微生物ペプチドが抗微生物ペプチドナイーブな同一株又は種の参照微生物に対するＬＤ５０の１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、又は２００％以下のその微生物に対するＬＤ５０を有する場合、抗微生物ペプチドへの耐性を生じていない。いくつかの実施形態では、微生物は、有効量の抗微生物ペプチドの存在下の成長速度が参照の成長速度の３０％以上、たとえば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上である場合、抗微生物ペプチドへの耐性を生じていない。
【0028】
[0030] いくつかの実施形態では、耐性の発生は、微生物の成長速度に及ぼす有効量の抗微生物ペプチドの阻害効果と、抗微生物ペプチドナイーブな参照微生物の成長速度に及ぼす効果や微生物の成長速度に及ぼす異なる抗微生物化合物の効果などの参照阻害効果と、を比較することにより決定される。いくつかの実施形態では、成長に及ぼす参照阻害効果は、同一タイプ又は株の微生物ただし抗微生物ペプチドナイーブなもの（たとえば、その存在下で以前に成長されていないもの）における有効量の抗微生物ペプチドにより誘発される成長速度の低減である。いくつかの実施形態では、微生物は、有効量の抗微生物ペプチドにより誘発される成長速度の低減が成長に及ぼす参照阻害効果の３０％以上、たとえば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％以上である場合、抗微生物ペプチドへの耐性を生じていない。
【0029】
[0031] 理論により限定されるものではないが、抗微生物ペプチドへの耐性を生じるいくつかの実施形態の微生物（たとえば、望まれない微生物）の能力は、環境及び／又は環境中に存在する抗微生物ペプチドの性質、さらには微生物自体に依存しうる。いくつかの実施形態では、環境は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物の成長を許容する。そのため、微生物は、環境中で抗微生物ペプチドの存在下で成長させた場合、耐性を生じる傾向、素因、又は能力を有するタイプでありうる。いくつかの実施形態では、望まれない微生物は、環境中で抗微生物ペプチドの存在下で成長させた場合、耐性を生じる能力がある。いくつかの実施形態では、投与される抗微生物ペプチドの標的となる微生物は、微生物が環境中での成長時に抗微生物ペプチドへの耐性を付与する１つ以上の変異、たとえば、抗微生物ペプチドを除去するチャネル若しくはトランスポーターに対するコード配列の変異、抗微生物ペプチドと相互作用するレセプター若しくはタンパク質の変異、又は抗微生物ペプチドを分解するプロテアーゼの変異を獲得できるように十分に高い変異率を有する。いくつかの実施形態では、投与される抗微生物ペプチドの標的となる微生物は、微生物の耐性バリアントが環境中で優先的に生存するように抗微生物ペプチドへの部分的耐性がある。微生物の複数の世代にわたり複数の選択ラウンドを介して抗微生物剤耐性を徐々に獲得しうることは、分かるであろう。
【0030】
抗微生物ペプチド
[0032] 本明細書で用いられる場合、「抗微生物ペプチド」（「抗微生物ペプチド」などのこれらのルート語の変化形を含む）は、本開示に鑑みて当業者により理解されうるその慣用的かつ通常の意味を有する。それは、微生物を死滅する又はその成長を停止するペプチドクラスを意味する。抗微生物ペプチドは、微生物を標的とする無脊椎動物及び脊椎動物遺伝子産物クラスと古典的にいわれてきたが、バクテリオシンは、微生物を標的とする微生物遺伝子産物クラスと古典的にいわれてきた。しかしながら、簡潔にするために、本明細書で用いられる「抗微生物ペプチド」は、古典的抗微生物ペプチド（たとえば、微生物に対する先天性免疫活性を付与するもの）さらにはバクテリオシンを広義に包含する。そのため、好適な抗微生物ペプチドは、微生物の成長を低減若しくは阻害する又はそれを死滅するいずれかの源に由来する（たとえば、原核生物若しくは真核生物、たとえば、哺乳動物、真菌、植物など、又は部分若しくは完全合成物に由来する）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、無脊椎動物及び脊椎動物の先天性免疫系のペプチドを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。そのため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、微生物を標的とする無脊椎動物及び脊椎動物遺伝子産物クラスを含む。
[0032] 本明細書で用いられる場合、「抗微生物ペプチド」（「抗微生物ペプチド」などのこれらのルート語の変化形を含む）は、本開示に鑑みて当業者により理解されうるその慣用的かつ通常の意味を有する。それは、微生物を死滅する又はその成長を停止するペプチドクラスを意味する。抗微生物ペプチドは、微生物を標的とする無脊椎動物及び脊椎動物遺伝子産物クラスと古典的にいわれてきたが、バクテリオシンは、微生物を標的とする微生物遺伝子産物クラスと古典的にいわれてきた。しかしながら、簡潔にするために、本明細書で用いられる「抗微生物ペプチド」は、古典的抗微生物ペプチド（たとえば、微生物に対する先天性免疫活性を付与するもの）さらにはバクテリオシンを広義に包含する。そのため、好適な抗微生物ペプチドは、微生物の成長を低減若しくは阻害する又はそれを死滅するいずれかの源に由来する（たとえば、原核生物若しくは真核生物、たとえば、哺乳動物、真菌、植物など、又は部分若しくは完全合成物に由来する）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、無脊椎動物及び脊椎動物の先天性免疫系のペプチドを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。そのため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、微生物を標的とする無脊椎動物及び脊椎動物遺伝子産物クラスを含む。
【0031】
[0033] 好適な抗微生物ペプチドの例は、たとえば、ワールドワイドウェブ上のaps.unmc.edu/AP/でアクセス可能な抗微生物ペプチドデータベース（Antimicrobial Peptide Database）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。１０００を超える抗微生物ペプチド及びそれらのバリアントが同定及びカタログされている。抗微生物ペプチドデータベース（Antimicrobial Peptide Database）は、Wang et al. (2016), Nucleic Acids Res.44 (Database issue): D1087-D1093（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本明細書の（たとえば、生産方法及び／又は微生物群集の）実施形態に好適な抗微生物ペプチドの例としては、バクテリオシン、抗細菌、抗ウイルス、抗ＨＩＶ、抗真菌、抗寄生生物、及び抗癌ペプチド、たとえば、デルマセプチン（たとえば、デルマセプチン－Ｂ２）、アバエシン、Ｃｔ－ＡＭＰ１、アンドロピン、アピダエシン、セクロピン、セラトトキシン、デルマシジン、マキシミンＨ５、モリシン、メリチン、マガイニン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレチン、ブフォリン、ＣＡＰ１８、ＬＬ３７、プロテグリン、プロフェニン、インドリシジン、タキプレシン、デフェンシン、ドロソマイシン、アウレイン１．１、ラクトフェリシンＢ、及びヘリオマイシン、又は列挙されたアイテムのいずれかの２以上の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、バクテリオシン、デルマセプチン（たとえば、デルマセプチン－Ｂ２）、アバエシン、Ｃｔ－ＡＭＰ１、アンドロピン、アピダエシン、セクロピン、セラトトキシン、デルマシジン、マキシミンＨ５、モリシン、メリチン、マガイニン、ボンビニン、ブレビニン、エスクレチン、ブフォリン、ＣＡＰ１８、ＬＬ３７、プロテグリン、プロフェニン、インドリシジン、タキプレシン、デフェンシン、ドロソマイシン、アウレイン１．１、ラクトフェリシンＢ、及びヘリオマイシン、又は列挙されたアイテムのいずれかの２以上の組合せを含む。いくつかの実施形態の本開示の抗微生物ペプチドは、天然に存在する抗微生物ペプチド又はその変異体若しくはバリアント或いはそれらをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗微生物ペプチドは、天然に存在しない抗微生物ペプチド（たとえば、部分若しくは完全合成抗微生物ペプチド又はバリアント抗微生物ペプチド）或いはそれらをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗微生物ペプチドは、天然に存在しないペプチド配列又はそれらをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、７０％～９９％、７５％～９９％、８０％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９９％、９７％～９９％、７０％～９５％、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～９５％、９０％～９５％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９０％、及び８５％～９０％を含めて、参照抗微生物ペプチド（たとえば、デルマセプチン－Ｂ２、アバエシン、Ｃｔ－ＡＭＰ１、アンドロピン、アウレイン１．１、ラクトフェリシンＢ、若しくはヘリオマイシン、又は配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）のいずれか）に対して少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。かかる抗微生物ペプチドは、「バリアント」抗微生物ペプチドといわれうる。パーセント同一性は、デフォルトパラメーターでＢＬＡＳＴソフトウェア（Altschul,S.F., et al. (1990)“Basic local alignment search tool.”J. Mol. Biol. 215:403-410、ワールドワイドウェブ上のblast.ncbi.nlm.nih.govでアクセス可能）を用いて決定されうる。
【0032】
[0034] いくつかの実施形態では、本開示の抗微生物ペプチドは、バクテリオシンを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。本明細書で用いられる場合、「バクテリオシン」及びこのルート語の変化形は、本開示に鑑みて当業者により理解されるその慣用的かつ通常の意味を有する。それは、宿主細胞及び他の微生物細胞にクローナルに関連する細胞を含めて、宿主細胞により分泌される、及びポリペプチドが作製される個別宿主細胞以外の少なくとも１の細胞を中和可能な、ポリペプチドを意味する。特定「免疫モジュレーター」（本明細書でより詳細に考察される）を発現する細胞は、特定バクテリオシン又はバクテリオシングループの中和作用に免疫がある。このため、バクテリオシンは、細胞が適切な免疫モジュレーターを産生しない限り、バクテリオシンを産生する細胞及び／又は他の微生物細胞を中和可能である。このため、宿主細胞は、バクテリオシンを分泌することにより複数の他の微生物に細胞傷害効果又は成長阻害効果を発揮可能である。バクテリオシン例は、配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）に示される。これらのバクテリオシンをコードする核酸例は、配列番号５～４５１（奇数）及び７００～７３８（偶数）として提供される。微生物細胞の成長を制御すべくバクテリオシンを使用するための方法及び組成物を含めて、バクテリオシンの詳細な説明は、たとえば、米国特許第９，３３３，２２７号（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）に見いだされうる。「バクテリオシン」は、ポリペプチドの起源により限定されるものではなく、例として、天然に存在するバクテリオシン、合成バクテリオシン、それらのバリアントや組合せなど、いずれのバクテリオシンも包含することが企図される。好適なバクテリオシンの例は、本明細書に詳細に記載される。
【0033】
[0035] バクテリオシンの多くは天然に存在するが（たとえば、配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）に示される天然に存在するバクテリオシン）、本明細書に記載の方法、システム、及びキットのいくつかの実施形態では、バクテリオシンが配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）のバクテリオシン及びコードヌクレオチド配列以外の天然に存在するバクテリオシン或いは天然に存在しないバクテリオシン若しくは合成バクテリオシン（たとえば、工学操作バクテリオシン）又はそれらのバリアント（これらはまた、いくつかの実施形態の工学操作バクテリオシンの一種でありうる）を含むことは、当業者であれば分かるであろう。いくつかの実施形態では、工学操作バクテリオシンは、野生型バクテリオシンと比べて、同一又は異なる微生物又は微生物種に対する細胞傷害活性又は成長阻害活性のレベルを増強又は減少させた。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド（又はバクテリオシン）は、ランチバイオティックを含まない。
【0034】
[0036] いくつかのモチーフは、バクテリオシンの特性として認識されている。たとえば、モチーフＹＧＸＧＶ（配列番号２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）は、クラスＩＩａバクテリオシンに特有のＮ末端コンセンサス配列である。それゆえ、いくつかの実施形態では、候補（又はバリアント）バクテリオシン（たとえば、工学操作バクテリオシン）は、配列番号２又はそのバリアントに対して少なくとも約５０％の同一性を有するＮ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、候補（又はバリアント）バクテリオシン（たとえば、工学操作バクテリオシン）は、配列番号２を含むＮ末端配列を含む。そのほか、いくつかのクラスＩＩｂバクテリオシンは、ＧｘｘｘＧモチーフを含む。いかなる特定理論によっても限定されるものではないが、ＧｘｘｘＧモチーフは、たとえば、細胞膜相互作用を介してバクテリオシン媒介中和を促進するために、細胞膜中のヘリカルタンパク質間の会合を媒介可能であると考えられる。このため、いくつかの実施形態では、バクテリオシン（たとえば、工学操作バクテリオシン）は、細胞膜との相互作用を促進するモチーフを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオシンはＧｘｘｘＧモチーフを含む。任意に、ＧｘｘｘＧモチーフを含むバクテリオシンは、ヘリカル構造を含むことが可能である。本明細書に記載の構造に加えて、本明細書で用いられる「バクテリオシン」はまた、本明細書に明示的に提供されるバクテリオシンのいずれかと実質的に同一の効果を微生物細胞に及ぼす構造を包含する。
【0035】
[0037] いくつかのバクテリオシンは、同定及び特徴付けされている。理論により限定されるものではないが、模範的バクテリオシンは、典型的には翻訳後修飾を受ける「クラスＩ」バクテリオシン及び典型的には非修飾である「クラスＩＩ」バクテリオシンとして分類可能である。バクテリオシンの分類に関する追加情報は、Cotter, P.D. et al.“Bacteriocins- a viable alternative to antibiotics”Nature Reviews Microbiology (2013) 11: 95-105（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。
【0036】
[0038] いくつかのバクテリオシンは、本明細書の実施形態のモジュレーション方法、キット、及び組成物に従って抗微生物ペプチドとして使用可能である。バクテリオシン例は、配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）に示される。これらのバクテリオシンをコードする核酸例は、配列番号５～４５１（奇数）及び７００～７３８（偶数）として提供される。微生物細胞の成長を制御すべくバクテリオシンを使用するための方法及び組成物を含めて、バクテリオシン及びバクテリオシンをコードするいくつかのポリヌクレオチド配列の詳細な説明は、たとえば、米国特許第９，３３３，２２７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。好適なバクテリオシンのいくつかの例は、米国特許第９，３３３，２２７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表１．２に教示される。「バクテリオシン」は、ポリペプチドの起源により限定されるものではなく、例として、天然に存在するバクテリオシン、合成バクテリオシン、それらのバリアントや組合せなど、いずれのバクテリオシンも包含することが企図される。好適なバクテリオシンの例は、本明細書に詳細に記載される。
【0037】
[0039] いくつかの抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、細胞傷害活性（たとえば、「殺細菌」効果）を有するので、微生物、たとえば、細菌、酵母、藻類、合成微生物などを死滅させることが可能である。いくつかの抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、たとえば、細胞周期を停止することにより、微生物、たとえば、細菌、酵母、藻類、合成微生物などの繁殖を阻害可能である（たとえば、「静細菌」効果）。理論により限定されるものではないが、バクテリオシンは、さまざまな方法で標的微生物細胞の中和を行うことが可能である。たとえば、バクテリオシンは、細胞壁を透過化することにより、細胞壁を脱分極したり呼吸に干渉したりすることが可能である。
【0038】
[0040] 「抗生物質」及びこのルート語の変化形は、本開示に鑑みて当業者により理解されるその慣用的かつ通常の意味を有する。それは、少なくとも１の微生物細胞を死滅する又はその成長を停止することが可能な代謝物又は代謝経路の中間体を意味する。いくつかの抗生物質は、微生物細胞、たとえば、細菌により産生可能である。いくつかの抗生物質は、化学合成可能である。少なくとも、バクテリオシンが遺伝子産物（いくつかの実施形態では追加の翻訳後プロセシングを受ける）又はその合成アナログを意味し、一方、抗生物質が代謝経路の中間体若しくは産物又はそれらの合成アナログを意味という点で、バクテリオシンは、抗生物質とは異なるものと理解される。
【0039】
[0041] いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、翻訳後修飾を受けたポリペプチド、たとえば、切断又は１個以上の官能基の付加を含む。
【0040】
[0042] いくつかの実施形態では、２つ以上の抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）又はその一部分を含む融合ポリペプチドは、２つ以上の抗微生物ペプチド又はその一部分の個別抗微生物ペプチドのどちらかよりもより広範囲にわたる微生物に対する中和活性を有する。たとえば、ハイブリッド抗微生物ペプチドは、病原グラム陽性及びグラム陰性細菌に対する抗微生物活性を提示することが示されている（Acuna et al. (2012), FEBS Open Bio, 2: 12-19）。Ｅｎｔ３５－ＭｃｃＶ融合バクテリオシンは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｎ末端グリシン、エンテロシンＣＲＬ３５、３つのグリシンを含むリンカー、及びＣ末端マイクロシンＶを含むことに留意されたい。
【0041】
[0043] 抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、２つ以上のポリペプチドの融合体、たとえば、抗微生物（たとえば、バクテリオシン）活性を有する２つ以上のポリペプチドを含みうることが、本明細書では企図される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド又は候補抗微生物ペプチドは、キメリックタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、バリアント抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）又は工学操作抗微生物ペプチド（たとえば、工学操作バクテリオシン）は、２つ以上の抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、バリアント抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）又は工学操作抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、２つ以上の抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）を含むキメリックタンパク質又はそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、融合体の２つ以上の抗微生物ペプチドは、配列番号４～４５０（偶数）及び６９９～７３７（奇数）のポリペプチド及び又は配列番号５～４５１（奇数）及び７００～７３８（偶数）の核酸によりコードされたポリペプチド、又はそれらのバリアント若しくは修飾体を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、個別抗微生物ペプチドのどちらよりも広範な活性スペクトルを有し、たとえば、より多くの微生物に対する中和活性、より広範囲にわたる環境条件下での中和活性、及び／又はより高効率の中和活性を有する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の抗微生物ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗微生物ペプチドポリペプチドは、共有結合、たとえば、ペプチド連結を介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、融合ポリペプチドの２つの個別抗微生物ポリペプチド間に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン、たとえば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のグリシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、融合タンパク質に含まれる個別抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）を産生するために細胞内で切断される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるバリアント抗微生物ペプチド（たとえば、バリアントバクテリオシン）又は工学操作抗微生物ペプチド（たとえば、工学操作バクテリオシン）は、非修飾又は候補抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）と比べて所望の活性スペクトルを提供するように修飾を含む。たとえば、バリアント抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）又は工学操作抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、非修飾又は候補抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）と同一の生物に対して増強又は減少された活性を有しうる。代替的に、修飾抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）は、非修飾又は候補抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）がより低活性又は無活性を有する生物に対して増強された活性を有しうる。
【0042】
[0044] いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの特定中和活性又は活性範囲（たとえば、細胞傷害性又は微生物繁殖停止）は、望まれる抗微生物調節のタイプ及び標的となる微生物の特定分類カテゴリー、種、又は株に基づいて選択される。このため、いくつかの実施形態では、特定抗微生物ペプチド又は抗微生物ペプチドの組合せが選択される。たとえば、いくつかの実施形態では、特定抗微生物ペプチドは、調節される望まれない微生物に基づいて環境に投与される。いくつかの実施形態では、所望の微生物は、調節される望まれない微生物に基づいて特定抗微生物ペプチドを発現するように工学操作される。いくつかの実施形態では、たとえば、汚染性の望まれない微生物を死滅させるべきである場合、少なくとも１つの細胞傷害性抗微生物ペプチド（たとえば、細胞傷害性バクテリオシン）が提供される（たとえば、微生物により分泌される、環境に投与されるなど）。いくつかの実施形態では、特定培養物、マイクロバイオーム、特定地理的位置、又は特定地理的位置若しくは産業培養物で成長された特定培養物タイプに通常存在する汚染菌に対して有効なバクテリオシン又はバクテリオシンの組合せが選択される。いくつかの実施形態、たとえば、微生物細胞比の調節が望まれる実施形態では、微生物繁殖を阻害する抗微生物ペプチドが提供される。理論により限定されるものではないが、多くのバクテリオシンは、バクテリオシンを産生する種と同一の生態学的ニッチを典型的に占有する微生物に対する中和活性を有しうる。このため、いくつかの実施形態では、特定抗微生物ペプチド活性スペクトルが望まれるとき、バクテリオシンは、バクテリオシンの標的となる微生物又は生物と同一（又は類似）の生態学的ニッチを占有する宿主種から選択される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの特定組合せ及び／又は比は、単一微生物を標的とするように選択される（そのタイプの１以上の微生物、たとえば、クローナルに関連する微生物を標的とすることを含みうる）。たとえば、特定タイプの微生物は、抗微生物ペプチドのあらかじめ決められた混合物及び／又は比により、単一抗微生物ペプチドによるよりも効率的に標的とされうる。
【0043】
[0045] たとえば、いくつかの実施形態では、抗真菌活性（たとえば、抗酵母活性）が抗微生物ペプチドに望まれる。抗真菌活性を有するいくつかのバクテリオシンは、同定されている。たとえば、バチルス属（Bacillus）由来のバクテリオシンは、酵母株に対する中和活性を有することが示されており（Adetunji and Olaoye (2013) Malaysian Journal of Microbiology 9: 130-13（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を参照されたい）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ペプチド（ＷＬＰＰＡＧＬＬＧＲＣＧＲＷＦＲＰＷＬＬＷＬＱ ＳＧＡＱＹ ＫＷＬＧＮＬＦＧＬＧＰＫ、配列番号１）は、カンジダ属（Candida）種に対する中和活性を有することが示されており（Shekh and Roy (2012) BMC Microbiology 12: 132（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を参照されたい）、及びシュードモナス属（Pseudomonas）由来のバクテリオシンは、真菌、たとえば、クルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）、フザリウム属（Fusarium）種、ヘルミントスポリウム属（Helminthosporium）種、及びバイポラリス属（Biopolaris）種に対する中和活性を有することが示されている（Shalani and Srivastava (2008) The Internet Journal of Microbiology. Volume 5 Number 2. DOI: 10.5580/27dd - ワールドワイドウェブのarchive.ispub.com/journal/the-internet-journal-of-microbiology/volume-5-number-2/screening-for-antifungal-activity-of-pseudomonas-fluorescens-against-phytopathogenic-fungi.html#sthash.d0Ys03UO.1DKuT1US.dpuf（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）でアクセス可能）。例として、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）由来のボトリシジンＡＪ１３１６（Zuber, P et al. (1993) Peptide Antibiotics. In Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology、及びMolecular Genetics ed. Sonenshein et al., pp. 897-916, American Society for Microbiology（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を参照されたい）及びアリリンＢ１（Shenin et al. (1995) Antibiot Khimioter 50: 3-7（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を参照されたい）は、抗真菌活性を有することが示されている。このため、いくつかの実施形態、たとえば、真菌微生物の中和が望まれる実施形態では、バクテリオシンは、ボトリシジンＡＪ１３１６又はアリリンＢ１の少なくとも１つを含む。
【0044】
[0046] たとえば、いくつかの実施形態では、特定微生物群集の培養物などの特定環境中の抗微生物ペプチド活性が望ましく、抗微生物ペプチドは、望まれない微生物を死滅するために又はその成長を停止するために、あらかじめ決められたカクテル及び／又は比で選択される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、所望の微生物とは異なる望まれない微生物を死滅するために又はその成長を停止するために、あらかじめ決められたカクテル及び／又は比で選択される。所望の微生物により典型的に産生されるバクテリオシンは、所望の微生物がこうしたバクテリオシンに対する関連免疫モジュレーターをすでに産生可能であるので、又は免疫モジュレーターを産生するように簡単に工学操作可能であるので、選択可能である。このため、選択されたバクテリオシンは、所望の微生物の中和をほとんど又はまったく引き起こさずに、望まれない微生物細胞（微生物集団中にまだ存在しない望まれない微生物細胞を含む）を標的とすることが可能である。たとえば、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、シアノバクテリアを保持しつつ、シアノバクテリア培養環境中に典型的に見いだされる侵入性微生物を中和するために、特定比で選択される。保存されたバクテリオシンポリペプチドのクラスターは、多種多様なシアノバクテリア種で同定されている。たとえば、少なくとも１４５の推定バクテリオシン遺伝子クラスターは、Wang et al. (2011), Genome Mining Demonstrates the Widespread Occurrence of Gene Clusters Encoding Bacteriocins in Cyanobacteria. PLoS ONE 6(7): e22384（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）に報告されるように、少なくとも４３のシアノバクテリア種で同定されている。模範的シアノバクテリアバクテリオシンは、配列番号４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、及び４５０に示される。
【0045】
[0047] いくつかの実施形態では、１つ以上の抗微生物ペプチド活性が選択され、所望の化学量論量で抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態の抗微生物ペプチドは、１つ以上の抗微生物ペプチド配列を含む及び個別抗微生物ペプチドを産生するために開裂可能であるプロポリペプチド中で投与又は産生可能である。プロポリペプチドは、切断されると抗微生物ペプチドが特定化学量論量で存在するようなコピー数の個別抗微生物ペプチドを含みうる。このため、２つ以上の異なる抗微生物ペプチドの混合物は、所望の比又は化学量論量で産生されるように投与されることができる。所望の比及び所望の化学量論量で抗微生物ペプチドを作製する方法は、たとえば、ＰＣＴ国際公開第２０１９／０４６５７７号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、プロポリペプチドは、微生物細胞の翻訳機構（たとえば、リボソームなど）により産生される。プロポリペプチドは、抗微生物ペプチド自体のポリペプチドを産生するために切断（たとえば、天然に存在するプロテアーゼや合成プロテアーゼなどの切断酵素によるプロセシング）を受けることが可能である。このため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、前駆体ポリペプチドから産生される。プロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、たとえば、核酸合成及び／又は分子クローニングを用いて調製可能であり、プロポリペプチドを産生するために使用可能である。
【0046】
[0048] いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド（及びその比）は、環境中、たとえば、産業用供給原料中、又は発酵槽中、又は食品、医薬品、若しくは化粧品製造環境中、又は組織環境、たとえば、消化管若しくは皮膚マイクロバイオーム中の特定有用微生物株の成長を限定するその能力、或いは植物、植物根、及び／又は土壌中の微生物集団を維持又はチューニングするその能力、或いは食品、薬剤、又は化粧品の品質を保持又は維持するその能力に基づいて選択されうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド（及びその比）は、特定培養物中で成長を試みるおそれのある１つ以上の侵入性生物を中和するその能力に基づいて選択されうる。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗微生物ペプチド活性（及び／又は比）は、既存の環境中の１つ以上の微生物株又は微生物株集団に基づいて選択される。たとえば、いくつかの実施形態では、特定インベーダークラス又は推定インベーダーが環境中で同定された場合、中和性抗微生物ペプチドのカクテル（及びその比）は、同定されたインベーダーを中和するように選択可能である。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、環境中の微生物細胞のすべて又は実質的にすべてを中和するために、たとえば、新しい産業培養物を培養環境に導入できるように培養環境中の産業培養物を排除するために、又は医薬品若しくは化粧品製造環境の汚染を予防若しくは阻害するために、又は食品、薬剤、若しくは化粧品の汚染若しくは変敗を予防若しくは最小化するために、選択される。
【0047】
[0049] 好適な抗微生物ペプチドとしては、プロテアーゼにより不活性化されやすいものが挙げられる。たとえば、好適な抗微生物ペプチドとしては、プロテアーゼによる消化により不活性化されうるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、環境に投与される抗微生物ペプチドは、プロテアーゼの１つ以上の切断部位を含む。本明細書で用いられる場合、「切断部位」は、本開示に鑑みて当業者により理解されるその慣用的かつ通常の意味を有する。それは、単一ポリペプチドを２つ以上の別個のポリペプチドに分離するためにポリペプチドの切断を媒介する（たとえば、ペプチド結合の加水分解により）ポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、切断部位は、プロテアーゼによる切断のためのコンセンサスポリペプチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、野生型、バリアント、又は合成プロテアーゼ、たとえば、野生型、バリアント、又は合成エンドペプチダーゼである。例として、プロテアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで好適なプロテアーゼ活性に関して選択可能である。
【0048】
[0050] いくつかの実施形態では、切断部位は、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン（ｐＨ１．３）、ペプシン（ｐＨ＞２）、プロリン－エンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン、又はトリプシンの切断部位を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなる。このため、本明細書のいくつかの実施形態の方法では、列挙されたプロテアーゼの１つ以上は、切断部位を切断するために使用される。
【0049】
[0051] いくつかの実施形態では、切断部位は、化学物質又はｐＨ感受性切断部位を含むか、それらから本質的になるか、又はそれからなる。かかる切断は、好適な化学物質（化学物質感受性の場合）又は好適なｐＨ（ｐＨ感受性の場合）の存在下でプロテアーゼによる消化を受けることが可能である。
【0050】
プロテアーゼ
[0052] 本明細書で用いられる場合、「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」は、本開示に鑑みて当業者により理解されうる、それらの慣用的かつ通常の意味を有する。それらは、酵素により特異的に切断される切断部位を含有するポリペプチドを消化する酵素クラスを意味する。本開示の実施形態での使用に好適なプロテアーゼとしては、プロテアーゼにより抗微生物ペプチドが切断されると環境に投与された抗微生物ペプチドを不活性化する能力のあるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解してタンパク質又はポリペプチドを消化する酵素である。また、他の機序、たとえば、ペプチドリアーゼにより実施される脱離反応でも、プロテアーゼにより消化又はタンパク質分解を達成しうることは、分かるであろう。そのほか、いくつかのプロテアーゼは、ある特定の条件下で最大又は最適プロテアーゼ活性を有するなど、異なる条件下で異なるプロテアーゼ活性レベルを呈しうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、又は中性プロテアーゼからなる群から選択される。天然に存在するプロテアーゼ、天然に存在するプロテアーゼのバリアント及び修飾体、並びにとくに合成プロテアーゼが企図される。
[0052] 本明細書で用いられる場合、「プロテアーゼ」又は「プロテイナーゼ」は、本開示に鑑みて当業者により理解されうる、それらの慣用的かつ通常の意味を有する。それらは、酵素により特異的に切断される切断部位を含有するポリペプチドを消化する酵素クラスを意味する。本開示の実施形態での使用に好適なプロテアーゼとしては、プロテアーゼにより抗微生物ペプチドが切断されると環境に投与された抗微生物ペプチドを不活性化する能力のあるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解してタンパク質又はポリペプチドを消化する酵素である。また、他の機序、たとえば、ペプチドリアーゼにより実施される脱離反応でも、プロテアーゼにより消化又はタンパク質分解を達成しうることは、分かるであろう。そのほか、いくつかのプロテアーゼは、ある特定の条件下で最大又は最適プロテアーゼ活性を有するなど、異なる条件下で異なるプロテアーゼ活性レベルを呈しうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ、又は中性プロテアーゼからなる群から選択される。天然に存在するプロテアーゼ、天然に存在するプロテアーゼのバリアント及び修飾体、並びにとくに合成プロテアーゼが企図される。
【0051】
[0053] プロテアーゼは、天然に存在する酵素、遺伝子工学操作プロテアーゼ、化学工学操作酵素、又は合成プロテアーゼでありうる。好適なプロテアーゼは、ポリペプチドを消化するいずれかの源に由来する（たとえば、原核生物若しくは真核生物、たとえば、哺乳動物、真菌、植物など、又は部分若しくは完全合成物に由来する）ポリペプチドを含む。
【0052】
[0054] いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、すなわち、ｐＨ７未満の酸性条件下で、たとえば、２～７のｐＨでタンパク質を切断する能力により特徴付けられるプロテアーゼである（又はそれに由来する）。いくつかの実施形態では、酸性プロテアーゼは、１～４の範囲内に最適ｐＨを有する。
【0053】
[0055] いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、アルカリ性プロテアーゼ、すなわち、ｐＨ７超のアルカリ性条件下で、たとえば、７～１１のｐＨでタンパク質を切断する能力により特徴付けられるプロテアーゼである（又はそれに由来する）。いくつかの実施形態では、アルカリ性プロテアーゼは、７～１１の範囲内に最適ｐＨを有する。
【0054】
[0056] いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、中性プロテアーゼ、すなわち、ｐＨ５～８の条件下でタンパク質を切断する能力により特徴付けられるプロテアーゼである（又はそれに由来する）。いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼは、５～８の範囲内に最適ｐＨを有する。
【0055】
[0057] 好適なプロテアーゼとしては、限定されるものではないが、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼＢ）、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、好中球エラスターゼ、ＮＴＣＢ（２－ニトロ－５－チオシアノ安息香酸）、ペプシン（ｐＨ１．３）、ペプシン（ｐＨ＞２）、プロリン－エンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブドウ球菌ペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン、又はトリプシンが挙げられる。
【0056】
[0058] 本明細書で用いられる「セルピン」は、本開示に鑑みて当業者により理解されうるその慣用的かつ通常の意味を有する。セルピンは、プロテアーゼ活性（たとえば、プロテアーゼのタンパク質消化活性）を阻害するポリペプチドクラスを意味しうる。セルピンは、天然に存在するもの、遺伝子工学操作されたもの、化学工学操作されたもの、又は合成のものでありうる。好適なセルピンは、環境に投与された抗微生物ペプチドの活性を阻害するいずれかの源に由来する（たとえば、原核生物若しくは真核生物、たとえば、哺乳動物、真菌、植物など、又は部分若しくは完全合成物に由来する）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態のモジュレーション方法、組成物、及びキットでは、セルピンは、たとえば、プロテアーゼがもはや必要でなくなると、プロテアーゼの活性を阻害するために提供される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法、組成物、及びキットでは、セルピンは、抗微生物ペプチドがプロテアーゼにより消化された後、環境に投与される。
【0057】
[0059] 好適なセルピンとしては、限定されるものではないが、α１－アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、α２－アンチプラスミン（ＳＥＲＰＩＮＦ２）アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）（ＳＥＲＰＩＮＤ１）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）（ＳＥＲＰＩＮＡ５）、α１－アンチトリプシン（α１ＡＴ）（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤－１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、Ｃ１－エステラーゼ阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＧ１）、プロテアーゼネキシン１（ＳＥＲＰＩＮＥ２）又はプロテインＺ依存阻害剤（ＳＥＲＰＩＮＡ１０）、ニューロセルピン（ＮＳ）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤２（セルピンＢ２）、マスピン（セルピンＢ５）、及びビクニンが挙げられる。
【0058】
核酸
[0060] 本明細書に記載のいくつかの実施形態のモジュレーション方法、組成物、及びキットによれば、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）及び／又はプロテアーゼは、核酸、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組合せによりコードされる。たとえば、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）遺伝子のＤＮＡ配列は、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）を含む、それからなる、又はそれから本質的になるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ転写物をコードしうる。いくつかの場合には、プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列は、プロテアーゼを含む、それから本質的になる、又はそれからなるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ転写物をコードしうる。核酸は、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド、たとえば、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含みうることが企図される。本明細書のいくつかの実施形態のモジュレーション方法では、プロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、微生物に送達可能であり、及びこの微生物の染色体中に安定にインテグレート可能であるか、又はゲノムフリーで、たとえば、プラスミド、染色体外アレイ、エピソーム、ミニ染色体などに存在可能である。
[0060] 本明細書に記載のいくつかの実施形態のモジュレーション方法、組成物、及びキットによれば、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）及び／又はプロテアーゼは、核酸、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの組合せによりコードされる。たとえば、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）遺伝子のＤＮＡ配列は、抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシン）を含む、それからなる、又はそれから本質的になるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ転写物をコードしうる。いくつかの場合には、プロテアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列は、プロテアーゼを含む、それから本質的になる、又はそれからなるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡ転写物をコードしうる。核酸は、１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド、たとえば、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含みうることが企図される。本明細書のいくつかの実施形態のモジュレーション方法では、プロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、微生物に送達可能であり、及びこの微生物の染色体中に安定にインテグレート可能であるか、又はゲノムフリーで、たとえば、プラスミド、染色体外アレイ、エピソーム、ミニ染色体などに存在可能である。
【0059】
[0061] 微生物細胞の遺伝子修飾のための例示的なベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、染色体外アレイ、エピソーム、ミニ染色体、ウイルス（バクテリオファージを含む）、及び転位性エレメントが挙げられる。そのほか、所望の配列を含む全微生物ゲノムを細胞で合成及びアセンブル可能であることは、分かるであろう（たとえば、Gibson et al. (2010), Science 329: 52-56を参照されたい）。このため、いくつかの実施形態では、微生物ゲノム（又はその一部分）は、所望の特徴、たとえば、バクテリオシンポリヌクレオチド及び／又はプロテアーゼポリヌクレオチドを有して合成され、微生物細胞に導入される。
【0060】
[0062] いくつかの実施形態では、１つ以上の所望のバクテリオシン及び／又はプロテアーゼポリヌクレオチドをポリヌクレオチド配列に挿入するため（たとえば、バクテリオシンを含むプロポリペプチドをコードするカセットを発現ベクターに挿入するため）のカセットが提供される。例示的なカセットとしては、限定されるものではないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘカセット又はＦＬＰ／ＦＲＴカセットが挙げられる。いくつかの実施形態では、カセットは、所望のプロポリペプチドをコードする所望のポリヌクレオチドを有するプラスミドを微生物細胞に簡単に導入できるように、プラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、カセットは、微生物細胞のゲノム中の所望の位置に位置する。
【0061】
[0063] いくつかの実施形態では、プラスミドコンジュゲーションは、所望のプラスミドを「ドナー」微生物細胞からレシピエント微生物細胞に導入するために使用可能である。Goni-Moreno, et al. (2013) Multicellular Computing Using Conjugation for Wiring. PLoS ONE 8(6): e65986（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）。たとえば、いくつかの実施形態の遺伝子修飾された所望の微生物は、抗微生物ペプチドをコードするプラスミドを微生物群集中の別の微生物に導入可能である。いくつかの実施形態では、プラスミドコンジュゲーションは、ドナー微生物細胞からレシピエント微生物細胞にコンジュゲーションプラスミドを導入することによりレシピエント微生物細胞を遺伝子修飾可能である。いかなる特定理論によっても限定されるものではないが、同一又は機能的に同一の複製遺伝子セットを含むコンジュゲーションプラスミドは、典型的には同一微生物細胞中で共存できない。このため、いくつかの実施形態では、プラスミドコンジュゲーションは、レシピエント細胞中に存在していた別のコンジュゲーションプラスミドに取って代わるように新しいコンジュゲーションプラスミドを導入することによりレシピエント微生物細胞を「再プログラムする」。いくつかの実施形態では、プラスミドコンジュゲーションは、抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼをコードする特定核酸で微生物細胞を工学操作（又は再工学操作）するために使用される。いくつかの実施形態によれば、多種多様な抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼを含む異なる核酸を含むさまざまなコンジュゲーションプラスミドが提供される。プラスミドは、本明細書に記載の追加の遺伝子エレメント、たとえば、プロモーター、翻訳開始部位などを含みうる。いくつかの実施形態では、さまざまなコンジュゲーションプラスミドは、プラスミドコンジュゲーションのために所望のプラスミドを含むドナー細胞を選択できるように一群のドナー細胞で提供される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの特定組合せ及び／又は比が選択され、適切なドナー細胞（特定プロポリペプチドをコードする）は、その組合せを含むコンジュゲーションプラスミドをレシピエント細胞に導入するために、目的の微生物細胞とコンジュゲートされる。
【0062】
分泌シグナル
[0064] 抗微生物ペプチド又はプロテアーゼの分泌を促進するために、抗微生物ペプチド又はプロテアーゼは、好適な分泌シグナルをさらに含みうる。タクソン全体にわたる分泌系は、カノニカルにヘテロトリメリックタンパク質複合体である内在性膜トランスロケーション装置、たとえば、細菌のＳｅｃＹＥＧ複合体又は真核生物のＳｅｃ６１複合体又はこれらの複合体のメンバーの古細菌ホモログ、たとえば、古細菌のＳｅｃＹ／Ｓｅｃ６１α及びＳｅｃＥ／Ｓｅｃ６１γホモログを含めて、コア特徴を共有することが示されている（たとえば、Pohlschroder et al., Cell 91: 563-566 (1997)を参照されたい）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
[0064] 抗微生物ペプチド又はプロテアーゼの分泌を促進するために、抗微生物ペプチド又はプロテアーゼは、好適な分泌シグナルをさらに含みうる。タクソン全体にわたる分泌系は、カノニカルにヘテロトリメリックタンパク質複合体である内在性膜トランスロケーション装置、たとえば、細菌のＳｅｃＹＥＧ複合体又は真核生物のＳｅｃ６１複合体又はこれらの複合体のメンバーの古細菌ホモログ、たとえば、古細菌のＳｅｃＹ／Ｓｅｃ６１α及びＳｅｃＥ／Ｓｅｃ６１γホモログを含めて、コア特徴を共有することが示されている（たとえば、Pohlschroder et al., Cell 91: 563-566 (1997)を参照されたい）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0063】
[0065] グラム陽性、グラム陰性、又はその両方のタイプの細菌に適用可能でありうるいくつかのカノニカル細菌分泌系は、記載されており、たとえば、Green et al., Microbiol Spectr. 4: doi:10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-20 15 (2016)（その全体が本願をもって参照により本明細書に組み込まれる）にレビューされている。以下に再現されたGreenらの表１は、細菌Ｓｅｃ、Ｔａｔ、Ｔ１ＳＳ、Ｔ２ＳＳ、Ｔ３ＳＳ、Ｔ４ＳＳ、Ｔ５ＳＳ、Ｔ６ＳＳ、ＳｅｃＡ２、ソルターゼ、インジェクトソーム、及びＴ７ＳＳ分泌系の特性を浮き彫りにする。真核微生物のために、好適な分泌系も使用されてもよい。たとえば、酵母Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）の分泌経路は、詳細に特徴付けられている（たとえば、Novick et al., Cell 25: 461-469 (1981)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0064】
【表1】
【0065】
[0066] 細胞外環境へのトランスロケーションは、シグナル配列により開始されうる。シグナル配列は、ライフドメイン全体にわたりカノニカルに保存され、例として、Ｎ末端シグナル配列は、正荷電Ｎ末端、疎水性アミノ酸残基コア、及びより極性のＣ末端を含みうる、（Pohlschroder et al., Cell 91: 563-566 (1997)）。任意に、Ｃ末端シグナル配列に関しては、これらの特徴は、逆の順序でありうる。各種インフォマティクスツールは、たとえば、SignalP 5.0、Armenteros et al., Nature Biotechnology, 37, 420-423 (2019)（その全体が参照により組み込まれる）に記載のように、予測原核及び真核シグナル配列を同定するために利用可能である。SignalPの現在のバージョンは、ワールドワイドウェブ上のwww.cbs.dtu.dk/services/SignalPでアクセス可能である。
【0066】
[0067] 本明細書の実施形態によれば、所望の微生物は公知であり、そのため、好適な分泌シグナル（関連分泌系に適合可能）を選択しうることが理解されるであろう。
【0067】
免疫モジュレーター
[0068] いくつかの実施形態では、特定免疫モジュレーター又は特定免疫モジュレーター組合せは、特定抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシンなど）、特定抗微生物ペプチドクラス若しくはカテゴリー、又は特定抗微生物ペプチド組合せに対する免疫を付与する。免疫モジュレーターが免疫を付与可能な例示的な抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシンなど）は、米国特許第９，３３３，２２７号の表２に同定されている。免疫モジュレーター配列例としては、たとえば、配列番号４５２～５４０（偶数）及び配列番号４５３～５４１（奇数）のいずれかが挙げられる。
[0068] いくつかの実施形態では、特定免疫モジュレーター又は特定免疫モジュレーター組合せは、特定抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシンなど）、特定抗微生物ペプチドクラス若しくはカテゴリー、又は特定抗微生物ペプチド組合せに対する免疫を付与する。免疫モジュレーターが免疫を付与可能な例示的な抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシンなど）は、米国特許第９，３３３，２２７号の表２に同定されている。免疫モジュレーター配列例としては、たとえば、配列番号４５２～５４０（偶数）及び配列番号４５３～５４１（奇数）のいずれかが挙げられる。
【0068】
[0069] 米国特許第９，３３３，２２７号の表２及び本配列リストには、例示的免疫モジュレーターの「起源生物」が同定されているが、これらの免疫モジュレーターは、本明細書のいくつかの実施形態に従って所望の抗微生物ペプチド免疫活性を提供するために、他の天然に存在する、遺伝子修飾された、又は合成の微生物において簡単に発現可能である。このため、本明細書で用いられる場合、「免疫モジュレーター」は、本開示に鑑みて当業者により理解されるその慣用的かつ通常の意味を有し、本明細書に明示的に提供される構造だけでなく、完全合成免疫モジュレーター及び本明細書に開示される抗微生物ペプチドに機能的に等価な抗微生物ペプチド（たとえば、バクテリオシンなど）に対する免疫を提供する免疫モジュレーターを含めて、本明細書に記載の「免疫モジュレーター」構造と実質的に同一の効果を有する構造もまた意味する。
【0069】
[0070] 配列番号４５２～５４０（偶数）のポリペプチドをコードする例示的ポリヌクレオチド配列は、配列番号４５３～５４１（奇数）に示される。遺伝暗号は縮重しており、そのうえ、コドン使用頻度（codon usage）は、遺伝子産物が発現されている特定生物に基づいて変動可能であり、そのため、特定ポリペプチドは、１つ以上のポリヌクレオチドによりコード可能であることは、当業者であれば容易に理解されよう。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド免疫モジュレーターをコードするポリヌクレオチドは、抗微生物ペプチド免疫モジュレーターを発現する生物のコドン使用頻度に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド免疫モジュレーターをコードするポリヌクレオチドは、抗微生物ペプチド免疫モジュレーターを発現する特定生物に基づいてコドン最適化される。
【0070】
[0071] 莫大な範囲の機能免疫モジュレーターが、本明細書に開示される免疫モジュレーターの特徴を取り込むことが可能であり、そのため、配列番号４５２～５４０（偶数）の免疫モジュレーターに対して莫大な程度の同一性が提供される。いくつかの実施形態では、免疫モジュレーターは、米国特許第９，３３３，２２７号の表２のポリペプチドのいずれか１つに対して少なくとも約５０％の同一性、たとえば、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性又は上記値のいずれか２つにより規定される範囲の同一性を有する。
【0071】
プロモーター
[0072] プロモーターは、当技術分野で周知である。プロモーターは、１種以上の遺伝子の転写を駆動するために使用可能である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の抗微生物ペプチド又はプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、２以上の本明細書に記載の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、免疫モジュレーターポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の抗微生物ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するが、微生物細胞は、１以上のこれらの抗微生物ペプチドに対する免疫モジュレーターを発現しない（たとえば、細胞は、免疫モジュレーターの転写を駆動するプロモーターを欠如可能であるか、又は免疫モジュレーターをコードする核酸を欠如可能である）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、微生物細胞中で２以上の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するが、微生物細胞は、１以上のこれらの抗微生物ペプチドに対する免疫モジュレーターを発現しない（たとえば、細胞は、免疫モジュレーターの転写を駆動するプロモーターを欠如可能であるか、又は免疫モジュレーターをコードする核酸を欠如可能である）。
[0072] プロモーターは、当技術分野で周知である。プロモーターは、１種以上の遺伝子の転写を駆動するために使用可能である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の抗微生物ペプチド又はプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、２以上の本明細書に記載の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、免疫モジュレーターポリヌクレオチドの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の抗微生物ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するが、微生物細胞は、１以上のこれらの抗微生物ペプチドに対する免疫モジュレーターを発現しない（たとえば、細胞は、免疫モジュレーターの転写を駆動するプロモーターを欠如可能であるか、又は免疫モジュレーターをコードする核酸を欠如可能である）。いくつかの実施形態では、プロモーターは、微生物細胞中で２以上の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するが、微生物細胞は、１以上のこれらの抗微生物ペプチドに対する免疫モジュレーターを発現しない（たとえば、細胞は、免疫モジュレーターの転写を駆動するプロモーターを欠如可能であるか、又は免疫モジュレーターをコードする核酸を欠如可能である）。
【0072】
[0073] いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載のプロテアーゼの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の時間点、たとえば、特定のエンドポイントになると、プロテアーゼをコードする核酸の転写を誘発する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の時間点、たとえば、特定のエンドポイントになると転写物をプロテアーゼポリペプチドに翻訳するように、プロテアーゼをコードする核酸の転写を誘発する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、特定の時間点、たとえば、特定のエンドポイントになるとプロテアーゼを分泌するように、プロテアーゼをコードする核酸の転写を誘発する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、転写物をプロテアーゼプロポリペプチドに翻訳し、次いで、特異的時間点、たとえば、エンドポイントになるとそれが活性化されるように、プロテアーゼをコードする核酸の転写を誘発する。
【0073】
[0074] いくつかのプロモーターは、いつでも転写を駆動可能である（「構成的プロモーター」）。いくつかのプロモーターは、たとえば、環境条件、化学化合物、遺伝子産物、細胞周期のステージなどの有無に依存して、選ばれた状況下でのみ転写を駆動可能である（「条件的プロモーター」）。
【0074】
[0075] 所望の発現活性に依存して適切なプロモーターを選択し、発現される核酸配列に対してシスに配置可能であることは、当業者であれば理解されるであろう。例示的活性を有して本明細書のいくつかの実施形態に有用な例示的プロモーターは、本明細書の配列番号５４４～６９８に提供される。いくつかプロモーターが特定転写機構（たとえば、ＲＮＡポリメラーゼ、一般的転写因子など）に適合可能であることは、当業者であれば分かるであろう。このため、本明細書に記載のいくつかのプロモーターに適合可能な「種」が同定されるが、いくつかの実施形態では、これらのプロモーターは、同定された種以外の微生物、たとえば、適合可能な内因性転写機構を有する種、適合可能な転写機構を含む遺伝子修飾種、又は適合可能な転写機構を含む完全合成微生物で簡単に機能可能であることが企図される。
【0075】
[0076] 本明細書の配列番号５４４～６９８のプロモーターは、Biobricks財団から一般公開されている。Biobricks財団は、BioBrick（商標）Public Agreement（ＢＰＡ）に準拠したこれらのプロモーターの使用を奨励していることに留意されたい。配列番号５４４～６９８のプロモーターは、非限定的例としてのみ提供される。以上で参照されたプロモーターの多くのバリアント及び多くの他のプロモーター（天然に存在する生物から単離されたプロモーター、そのバリエーション、及び完全合成プロモーターを含む）を本明細書のいくつかの実施形態に従って簡単に使用可能であることは、当業者であれば容易に理解されるであろう。
【0076】
[0077] 本明細書に記載の「コーディング（coding）」ポリヌクレオチドはいずれも（たとえば、抗微生物ペプチドポリヌクレオチド、免疫ポリヌクレオチド、又は２種以上の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするヌクレオチド）、所望のプロモーターの制御下で一般に発現可能であることが、認識されるべきである。いくつかの実施形態では、単一「コーディング」ポリヌクレオチドは、単一プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、２以上の「コーディング」ポリヌクレオチド、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のポリヌクレオチドは、単一プロモーターの制御下にある。
【0077】
[0078] 一般に、特定転写物の翻訳開始は、転写物のコード配列の５’末端又はその５’側の特定配列により調節される。たとえば、コード配列は、イニシエーターｔＲＮＡに対合するように構成された開始コドンから始まりうる。天然に存在する翻訳系は、開始コドンとしてＭｅｔ（ＡＵＧ）を典型的に使用するが、イニシエーターｔＲＮＡは、いずれかの所望の１つ又は複数のトリプレットに結合するように工学操作可能であり、それゆえ、ＡＵＧ以外のトリプレットもまた、いくつかの実施形態で開始コドンとして機能可能であることは、容易に理解されるであろう。そのほか、開始コドンの近くの配列、たとえば、コザック配列（ｇｃｃ）（ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ、配列番号５４２、ここでＲは「Ａ」又は「Ｇ」を表す）、又は典型的真核翻訳系の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、又は典型的原核翻訳系のShine-Dalgarno配列（ＧＧＡＧＧＵ、配列番号５４３）は、リボソームアセンブリーを促進可能である。このため、いくつかの実施形態では、「コーディング」ポリヌクレオチド配列、たとえば、抗微生物ペプチドポリヌクレオチド又は免疫ポリヌクレオチド、又は２以上の抗微生物ペプチドを含むプロポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む転写物は、適切な開始コドン及び翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、たとえば、２以上の「コーディング」ポリヌクレオチド配列が転写物上にシスに位置する場合、各ポリヌクレオチド配列は、適切な開始コドン及び翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、たとえば、２以上の「コーディング」ポリヌクレオチド配列が転写物上にシスに位置する場合、２の配列は、単一翻訳開始配列の制御下にあり、及びどちらも、両方のコーディングポリペプチドをシスに有して機能可能な単一ポリペプチドを提供する。
【0078】
抗微生物ペプチドの活性をモジュレートする方法
[0079] 図１を参照すると、いくつかの実施形態に係る抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（「モジュレーション方法」）１００のフロー図が示される。モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するようにして、抗微生物ペプチドを環境に投与すること１１０と、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化すること１２０により、抗微生物ペプチドを不活性化して、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることと、を含みうる。抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することは、プロテアーゼの不在下での減少速度よりも速い速度で抗微生物ペプチドの抗微生物活性が減少するように、抗微生物ペプチドの半減期を一般に低減しうる。
[0079] 図１を参照すると、いくつかの実施形態に係る抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法（「モジュレーション方法」）１００のフロー図が示される。モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するようにして、抗微生物ペプチドを環境に投与すること１１０と、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化すること１２０により、抗微生物ペプチドを不活性化して、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることと、を含みうる。抗微生物ペプチドをプロテアーゼで消化することは、プロテアーゼの不在下での減少速度よりも速い速度で抗微生物ペプチドの抗微生物活性が減少するように、抗微生物ペプチドの半減期を一般に低減しうる。
【0079】
[0080] 抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するいくつかの実施形態では、環境中の抗微生物ペプチドの抗微生物活性は、少なくとも特定のエンドポイントまで、所望のレベルに又はその近傍に（たとえば、望まれない微生物の成長又は繁殖を阻害するのに十分な抗微生物活性レベル又は有効レベル）実質的に維持される。抗微生物ペプチドが特定のエンドポイントまで環境中で活性を維持するいくつかの実施形態では、環境中の抗微生物ペプチドの抗微生物活性は、少なくとも特定のエンドポイントまで、有効抗微生物活性レベルで又はそれを超えて実質的に維持される。いくつかの実施形態では、環境中の抗微生物ペプチドの抗微生物活性は、少なくとも特定のエンドポイントまで、初期抗微生物活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、又は上記値のいずれか２つにより規定されるパーセンテージ（たとえば、５０～６０％、６０～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～１００％）で維持される。いくつかの実施形態では、環境中の抗微生物ペプチドの抗微生物活性は、少なくとも特定のエンドポイントまで、所望の抗微生物活性レベル（たとえば、望まれない微生物の成長又は繁殖を阻害するのに十分な抗微生物活性レベル又は有効レベル）から約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、若しくは３％を超えて低減されないか、又は上記値のいずれか２つにより規定されるパーセンテージ（たとえば、５０～４０％、４０～３０％、３０～２５％、２５～２０％、２０～１５％、１５～１０％、１０～５％、５～３％）を超えて低減されないか、又は所望のレベルにある。
【0080】
[0081] 図２を参照すると、本開示のいくつかの非限定的実施形態に係るモジュレーション方法の模式図が示される。本方法は、特定のエンドポイントまで抗微生物ペプチドが活性である（たとえば、微生物２２０の成長を阻害する）環境２００に抗微生物ペプチド２１０を投与することを含みうる。いくつかの実施形態では、環境は、抗微生物ペプチドに対して感受性のある望ましくない微生物を有するか、又はその成長を促進する傾向があることが知られる。望ましくない微生物は、既知又は未知でありうる。いくつかの実施形態では、１以上の望ましくない微生物は、環境に投与される抗微生物ペプチドの標的となる。
【0081】
[0082] 本方法は、特定のエンドポイントで又はその後で抗微生物ペプチドをプロテアーゼ２６０で消化することをさらに含みうるとともに、抗微生物ペプチドは、それにより不活性化される２１５。いくつかの場合には、抗微生物ペプチドは、ある特定の期間が経過したときに若しくはその後で、抗微生物ペプチドの標的となる微生物の量の所望の減少が達成されたときに若しくはその後で、又は環境が変化したときに若しくはその後で不活性化されうる。抗微生物ペプチドが投与される環境２００及び抗微生物ペプチドが不活性化される環境２５０は、同一環境又は異なる環境でありうる。
【0082】
[0083] いくつかの実施形態のモジュレーション方法は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物の成長を許容するとして環境を同定することを含む。いくつかの実施形態では、環境２００は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じうる微生物の成長を許容するとして同定される。そのため、環境２３０中の抗微生物ペプチドの継続存在下では、微生物は、抗微生物ペプチドに耐性になりうる２４０。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、エンドポイントまで活性を維持することが許容され、その後、抗微生物ペプチドの標的となる微生物は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じるであろう（又は生じると予想される）。そのため、かかるエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドは、それを不活性化するために消化される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの標的となる微生物は、環境中で抗微生物ペプチドへの耐性を生じうる微生物と同一である。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドの標的となる微生物は、環境中で抗微生物ペプチドへの耐性を生じうる微生物とは異なる。
【0083】
[0084] モジュレーション方法で抗微生物ペプチドが投与される環境は、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることが望ましい、たとえば、抗微生物ペプチドへの耐性の発生を阻害又は予防することが望ましいいずれかの環境でありうる。好適な環境としては、限定されるものではないが、対象（たとえば、ヒト対象を含めて哺乳動物対象）の器官、ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオーム、食品若しくはその一部分（たとえば、酪農品）、医療デバイス、産業用供給原料、又は医薬品若しくは化粧品製造環境が挙げられる。好適な器官環境としては、限定されるものではないが、胃腸系、皮膚、肺、口腔、粘膜、子宮、膣、胆道が挙げられる。好適なマイクロバイオームは、対象の又は生態学的状況のマイクロバイオームを含む。たとえば、マイクロバイオームは、胃腸管、皮膚、乳腺、胎盤、バイオ流体、精液、子宮、膣、卵胞、肺、唾液、口腔、粘膜、結膜、胆道、及び土壌、又は列挙されたアイテムのいずれかの２つ以上の組合せからなる群から選択されるマイクロバイオームでありうる。医療デバイスは、患者において病態の処置、モニタリング、又は予防に使用されるいずれかの材料を含みうる。好適な医療デバイスは、植込み型医療デバイス、たとえば、プロテーゼ、血管移植片、骨又は軟骨インプラント、ステント、神経ガイド、心臓弁などを含む。好適な医療デバイスは、患者に接触した状態になりうる外科用ツール及びデバイス、たとえば、スカルペル、グラスパー、クランプ、ニードルドライバー、レトラクター、ディストラクター、カッター、ダイレーター、吸引デバイス、シーリングデバイス、針、ドリル、スコープ、プローブ、外科用テーブルなどを含む。いくつかの実施形態では、環境は、医療デバイスの外表面である。
【0084】
[0085] 本明細書で用いられる「対象」は、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートすることが望ましい、たとえば、抗微生物ペプチドへの耐性の発生を阻害又は予防することが望ましい微生物群集を有するいずれかの好適な対象でありうる。対象は、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、又は非哺乳動物対象でありうる。いくつかの実施形態では、対象は、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長動物、ネズミ、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、又はトリ対象である。いくつかの実施形態では、対象は家畜である。
【0085】
[0086] いくつかの実施形態のモジュレーション方法によれば、抗微生物ペプチドは、特定環境に好適ないずれかの方法を用いて環境に投与されうる。たとえば、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、局所、経口、非経口、静脈内、又は抗微生物ペプチドを器官若しくはｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオーム環境に投与するのに好適ないずれかの他の経路を介して対象に投与されうる。かかる場合には、いくつかの実施形態の方法は、投与前に抗微生物ペプチドを選択すること、たとえば、抗微生物ペプチドを選択することを含みうる。また、抗微生物ペプチドは、本明細書に記載されるように環境中で微生物により発現及び分泌されうることも企図される。
【0086】
[0087] いくつかの実施形態のモジュレーション方法によれば、抗微生物ペプチドは、いずれかの好適な方法により産業用供給原料又は製造環境に投与されうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、環境に接続されたマニホールドを介して産業用供給原料又は製造環境に投与される。投与される量は、たとえば、環境中の望まれない微生物に対する少なくともＬＤ５０量で、環境中の微生物、たとえば、望まれない微生物の成長を阻害するのに好適ないずれかの量ありうる。
【0087】
[0088] いくつかの実施形態に係るモジュレーション方法は、遺伝子工学操作微生物において抗微生物ペプチドを発現してそこからそれを分泌することにより抗微生物ペプチドを投与することを含む。たとえば、環境は、抗微生物ペプチドをコードする核酸で遺伝子工学操作された微生物を含みうる。微生物は、本明細書に記載の抗微生物ペプチドをコードするいずれかの好適な核酸で遺伝子工学操作されうる。いくつかの実施形態では、核酸は、抗微生物ペプチドが環境中の微生物により発現及び分泌されるように好適なプロモーター及び他の調節エレメントと共に構成されうる。
【0088】
[0089] いくつかの実施形態に係るモジュレーション方法では、環境に投与された抗微生物ペプチドは、特定のエンドポイントまで活性を維持する。エンドポイントは、抗微生物ペプチドの分解を許容できるいずれかの好適なエンドポイントでありうる。好適なエンドポイントは、限定されるものではないが、特定の時間量の経過、活性レベル若しくは量又は抗微生物ペプチドの標的となる微生物の成長速度の変化、又は環境の変化、或いは列挙されたアイテムの２つ以上の組合せでありうる。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、環境への抗微生物ペプチドの投与の３０分間以上後、たとえば、１時間以上、６時間以上、１２時間以上、１日間以上、３日間以上、１週間以上、２週間以上、１ヵ月間以上、３ヵ月間以上、６ヵ月間以上、又は１年間以上後である。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、環境への抗微生物ペプチドの投与の３０分間～１年間後、たとえば、１日間～５日間後を含めて、１時間～６ヵ月間、１時間～３ヵ月間、６時間～１ヵ月間、６時間～２週間、１２時間～１週間後である。
【0089】
[0090] いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドの標的となる微生物が低減されるまで又は環境から排除されるまで活性を維持することが望ましいであろう。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、抗微生物ペプチドの標的となる微生物（たとえば、望ましくない微生物、たとえば、汚染菌又は病原体）の量、成長速度、又は活性レベルの閾値レベルを超過した変化である。量、成長率、又は活性レベルは、限定されるものではないが、環境中の集団、集団密度、成長率、微生物により産生される毒素若しくは有害物質の量、又は列挙されたアイテムの２つ以上の組合せを含めて、標的微生物の量、成長率、又は活性のいずれかの好適な尺度でありうる。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、閾値未満への量、成長率、又は活性レベルの低減である。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、あらかじめ決められた参照活性レベル未満への量、成長率、又は活性レベルの低減である。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、投与前の活性レベルと比べた量、成長率、又は活性レベルの低減である。いくつかの実施形態では、特定のエンドポイントは、標的微生物の投与前の活性レベルと比較した量、成長率、又は活性レベルの１０％以上の低減、たとえば、約１００％を含めて２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上の低減である。いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、特定のエンドポイントは環境の変化である。
【0090】
[0091] いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、抗微生物ペプチドは、環境を離れる前に消化される。環境を離れる前に抗微生物ペプチドを消化することは、環境外で（たとえば、環境外の第２の異なる環境で）抗微生物ペプチドへの耐性の発生を阻害又は予防可能であることが企図される。そのため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、天然に存在しないように予防される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが環境を離れる（たとえば、第１の環境とは異なる別の環境に入る）以前に消化される。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが環境を離れて１以上の微生物を含む第２の環境に接触した状態になる以前に消化される。いくつかの実施形態では、環境は、産業製造環境、たとえば、食品、医薬品、化粧品などのためのものであり、この場合、特定の時間点は、製造品が製造環境を離れるとき又はその前である。
【0091】
[0092] いくつかの実施形態のモジュレーション方法では、特定のエンドポイントで又はその後で、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドを不活性化するためにプロテアーゼで消化されうる。いくつかの実施形態では、モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドを不活性化するために、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、１～５、１～１０、２～５、２～１０、又は５～１０の異なるプロテアーゼを含めて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の異なるプロテアーゼで、環境に投与された抗微生物ペプチドを消化することを含む。消化することは、いずれかの好適な方式で行われうる。いくつかの実施形態のモジュレーション方法は、抗微生物ペプチドが投与された環境中で抗微生物ペプチドを消化することを含む。いくつかの実施形態では、モジュレーション方法は、プロテアーゼを環境に投与することを含む。いくつかの実施形態では、モジュレーション方法は、抗微生物ペプチドが投与された環境外で抗微生物ペプチドを消化することを含む。消化することは、プロテアーゼが抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するのに十分な条件（たとえば、温度及びｐＨ）下で実施されうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドが投与される環境は、製品、たとえば、産業品、医薬品、化粧品、食品、又は良品を製造するために使用され、及びモジュレーション方法は、製品が環境を離れる前に環境中の抗微生物ペプチドを消化することを含む。かかる場合には、製品は、製品が環境外にあるときに抗微生物ペプチドを含まない。
【0092】
[0093] プロテアーゼは、抗微生物ペプチドを消化及び不活性化をするのに好適ないずれかのプロテアーゼでありうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、抗微生物ペプチド中に存在する切断部位で標的ポリペプチドを切断するものである。
【0093】
[0094] 抗微生物ペプチドは、いずれかの好適な方式でプロテアーゼに接触させうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、環境に投与される。たとえば、プロテアーゼは、環境に直接的若しくは間接的に添加されうるか、又は環境中の微生物により発現されうる。たとえば、環境中の微生物は、特定のエンドポイントで又はその後でプロテアーゼの発現を開始又は増加するプロモーターの制御下にプロテアーゼをコードする核酸を含みうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドを切断するプロテアーゼは、エンドポイント前にプロポリペプチド（不活性状態で）として存在し、エンドポイントで又はその後で活性化されうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、基材上に配設され、及び抗微生物ペプチドは、基材に接触させる。いくつかの実施形態では、基材は、固形担体、たとえば、ビーズ、キャピラリー、マトリックス、プレート、メンブレン、ウェルなどである。プロテアーゼは、いずれかの好適な手段により基材上に配設されうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、基材に装着（共有結合若しくは非共有結合で）又は会合される。
【0094】
[0095] いくつかの実施形態では、プロテアーゼの活性は調節されうる。たとえば、いくつかの実施形態のモジュレーション方法は、環境にセルピンを添加することを含み、この場合、セルピンは、プロテアーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、セルピンは、抗微生物ペプチドがいずれかのプロテアーゼにより消化される前に環境に添加される。いくつかの実施形態では、セルピンは、プロテアーゼが抗微生物ペプチドを消化した後に添加される。いくつかの実施形態では、セルピンは、実質的にすべてのプロテアーゼを不活性化するのに十分な量で添加される。
【0095】
[0096] いくつかの実施形態では、２以上の抗微生物ペプチド、たとえば、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、２～５、２～１０、２～３０、５～１０、５～３０、又は１０～３０の抗微生物ペプチドを含めて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０の抗微生物ペプチドを環境に投与することが望ましいであろう。そのため、いくつかの実施形態のモジュレーション方法は、２以上の異なる抗微生物ペプチドのカクテルを環境に投与することを含む。かかる場合には、所与のプロテアーゼは、１以上の抗微生物ペプチドを消化してもしなくてもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、環境に投与された抗微生物ペプチドのカクテル中の２の抗微生物ペプチドの１を消化し、及び第２の抗微生物ペプチドを消化しない。たとえば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、異なる速度で環境中の異なる抗微生物ペプチドを消化する。いくつかの実施形態では、３の異なる抗微生物ペプチドが環境に投与される。いくつかの実施形態では、２以上の異なる抗微生物ペプチドが環境に投与される場合、異なる抗微生物ペプチドの一部又は全部は、２以上の異なるプロテアーゼにより消化されうる。たとえば、いくつかの実施形態では、本方法は、後でプロテアーゼにより消化される抗微生物ペプチドを含む３の異なる抗微生物ペプチドのカクテルを投与することを含み、第１の抗微生物ペプチドとは異なるカクテル中の別の抗微生物ペプチドは、プロテアーゼにより消化されず、及び第１の抗微生物ペプチドとは異なるカクテル中の第３の抗微生物ペプチドは、第１のプロテアーゼとは異なる第２のプロテアーゼにより消化される。
【0096】
[0097] 図３を参照すると、いくつかの非限定的実施形態のモジュレーション方法の模式図が示される。いくつかの実施形態のモジュレーション方法は、抗微生物ペプチドを用いて食品の腐敗を阻害又は予防するのに有用でありうる。たとえば、本方法は、トリプシン感受性の抗微生物ペプチド３１０を選択することを含みうる（たとえば、抗微生物ペプチドは、トリプシンによる消化により不活性化される）。かかる場合には、トリプシンは、食品又はその一部分を含む環境３００に投与されうるとともに、抗微生物ペプチドは、食品腐敗の原因となる微生物３２０（たとえば、汚染性微生物）の成長又は繁殖を阻害する。対象（たとえば、ヒト対象）により食品が摂取されると、特定のエンドポイントに達して、対象の消化管３３０中のトリプシン３４０は、抗微生物ペプチド３１５を不活性化しうる。
【0097】
組成物
[0098] また、プロテアーゼ、プロテアーゼにより特異的に切断される切断部位を含む抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、抗微生物ペプチドが投与される環境中にある。プロテアーゼは、本明細書に記載のように、抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するのに好適ないずれかのプロテアーゼでありうる。組成物中のプロテアーゼの量は、組成物中の抗微生物ペプチドの量に依存しうる。いくつかの実施形態では、組成物中のプロテアーゼの量は、プロテアーゼの不在下の抗微生物ペプチドの半減期と比較して抗微生物ペプチドの半減期を１０％以上、たとえば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は約１００％低減するのに十分なものである。いくつかの実施形態では、組成物は、プロドメインの切断により活性化されたときに抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するプロテアーゼのプロポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、１、２、３、４、５、又はそれ以上のプロテアーゼを含み、その一部又は全部は、組成物中の抗微生物ペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、組成物は、プロテアーゼを阻害するセルピンを含む。組成物は、本明細書に記載のように、プロテアーゼの活性を阻害可能ないずれかの好適なセルピンを含みうる。
[0098] また、プロテアーゼ、プロテアーゼにより特異的に切断される切断部位を含む抗微生物ペプチド、及び抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、抗微生物ペプチドが投与される環境中にある。プロテアーゼは、本明細書に記載のように、抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するのに好適ないずれかのプロテアーゼでありうる。組成物中のプロテアーゼの量は、組成物中の抗微生物ペプチドの量に依存しうる。いくつかの実施形態では、組成物中のプロテアーゼの量は、プロテアーゼの不在下の抗微生物ペプチドの半減期と比較して抗微生物ペプチドの半減期を１０％以上、たとえば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は約１００％低減するのに十分なものである。いくつかの実施形態では、組成物は、プロドメインの切断により活性化されたときに抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するプロテアーゼのプロポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、１、２、３、４、５、又はそれ以上のプロテアーゼを含み、その一部又は全部は、組成物中の抗微生物ペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、組成物は、プロテアーゼを阻害するセルピンを含む。組成物は、本明細書に記載のように、プロテアーゼの活性を阻害可能ないずれかの好適なセルピンを含みうる。
【0098】
[0099] 抗微生物ペプチドは、本明細書に記載のように、プロテアーゼにより切断される切断部位を含むいずれかの好適な抗微生物ペプチドでありうる。組成物中の抗微生物ペプチドの量は、環境中の標的微生物（たとえば、望まれない微生物）の成長を阻害するのに好適ないずれかの量でありうる。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、１、２、３、４、５、又はそれ以上の異なる抗微生物ペプチドを含み、その一部又は全部は、組成物中のプロテアーゼの切断標的でありうる。
【0099】
[0100] 抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物は、抗微生物ペプチドの標的となるいずれかのかかる微生物でありうる。いくつかの実施形態では、微生物は、望まれない微生物、たとえば、病原体、汚染性微生物、若しくは産業生産に使用される微生物であるがその産業上の特性を失ったものであるか、又はそのようになる傾向があるものである。組成物は、いずれかの好適な量で微生物を含みうる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の微生物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、又は１０９ｃｆｕの微生物／ミリリットルの組成物を含み、この場合、組成物は、液状サスペンジョンを含む。
【0100】
[0101] 本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のように、製品、たとえば、食品、医薬品若しくは医療品、又は化粧品を含む。
【0101】
キット
[0102] また、抗微生物ペプチド及び抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼを含むキットも記載され、この場合、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を標的とする。抗微生物ペプチドは、本明細書に記載のように、プロテアーゼにより切断される切断部位を含むいずれかの好適な抗微生物ペプチドでありうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、若しくは抗癌ペプチド、又は列挙されたアイテムの２つ以上の組合せを含む。抗微生物ペプチドは、いずれかの好適な微生物、たとえば、望まれない微生物を標的とするように選択されうる。標的微生物は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力がありうることが企図される。キットは、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、１～５の抗微生物ペプチドを含めて、少なくとも１、２、３、４、又は５の抗微生物ペプチドを含みうる。いくつかの実施形態では、キットは、抗微生物ペプチドのカクテルを含み、この場合、プロテアーゼは、少なくともの１の抗微生物ペプチドを消化可能でない。
[0102] また、抗微生物ペプチド及び抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼを含むキットも記載され、この場合、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力のある微生物を標的とする。抗微生物ペプチドは、本明細書に記載のように、プロテアーゼにより切断される切断部位を含むいずれかの好適な抗微生物ペプチドでありうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチドは、バクテリオシン、抗細菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗ＨＩＶペプチド、抗真菌ペプチド、抗寄生生物ペプチド、若しくは抗癌ペプチド、又は列挙されたアイテムの２つ以上の組合せを含む。抗微生物ペプチドは、いずれかの好適な微生物、たとえば、望まれない微生物を標的とするように選択されうる。標的微生物は、抗微生物ペプチドへの耐性を生じる能力がありうることが企図される。キットは、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲、たとえば、１～５の抗微生物ペプチドを含めて、少なくとも１、２、３、４、又は５の抗微生物ペプチドを含みうる。いくつかの実施形態では、キットは、抗微生物ペプチドのカクテルを含み、この場合、プロテアーゼは、少なくともの１の抗微生物ペプチドを消化可能でない。
【0102】
[0103] プロテアーゼは、本明細書に記載のように、抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するのに好適ないずれかのプロテアーゼでありうる。いくつかの実施形態では、キットは、プロドメインの切断により活性化されたときに抗微生物ペプチドを消化及び不活性化するプロテアーゼのプロポリペプチドを含む。キットは、本明細書に記載のように、列挙された値のいずれかの２つの間の範囲を含めて、少なくとも１、２、３、４、又は５のプロテアーゼを含みうる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のように、プロテアーゼを阻害するセルピンを含む。いくつかの実施形態では、セルピンは、プロテアーゼと共に配設され、及びプロテアーゼをアンタゴナイズするように構成される。
【0103】
[0104] いくつかの実施形態では、キットは、１以上の組成物を含み、この場合、本明細書に開示されるように、１以上の組成物は、抗微生物ペプチド及び抗微生物ペプチドを消化する能力のあるプロテアーゼを含む。キットの異なる成分は、本開示のキット中の同一又は別々の組成物中でありうる。いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド及びプロテアーゼは、別々の組成物中にある。たとえば、抗微生物ペプチドは、１つの容器（たとえば、バイアル、ボトルなど）中にありうるとともに、プロテアーゼは、抗微生物ペプチドを含有する第１の容器とは異なる第２の容器（たとえば、バイアル、ボトルなど）中にありうる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、抗微生物ペプチドから物理的に分離される。たとえば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、抗微生物ペプチドを含有する区画から物理的に別々の区画にある。
【0104】
[0105] いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド及びプロテアーゼは、同一組成物中にある。かかる場合には、プロテアーゼは、特定のエンドポイント前に抗微生物ペプチドを消化しないように配設されうる。たとえば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、同一組成物中にセルピンと共に配設されうる。たとえば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、抗微生物ペプチドから隔離されうる。特定のエンドポイントは、本明細書に記載のように、いずれかの好適なエンドポイントでありうる。
【0105】
[0106] いくつかの実施形態では、キットは、ｉｎ ｖｉｖｏ環境、たとえば、対象の器官又はｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオームでの使用に好適である。そのため、いくつかの実施形態では、抗微生物ペプチド及びプロテアーゼの一方又は両方は、ヒト対象への投与のために製剤化されうる。
【実施例】
【0106】
実施例
実施例１：食品の腐敗を阻害又は予防する抗微生物ペプチドの半減期のモジュレーション
[0107] バチルス・セレウス（Bacillus cereus）に対して活性なバクテリオシンは、食中毒の原因となりうるＢ．セレウス（B. cereus）による汚染を予防するために酪農食品に提供される。バクテリオシンはトリプシン感受性である。ヒト対象が酪農食品を摂取したとき、バクテリオシンは、対象の消化系のトリプシンにより消化及び不活性化され、それにより、バクテリオシンの半減期をモジュレートする。
実施例１：食品の腐敗を阻害又は予防する抗微生物ペプチドの半減期のモジュレーション
[0107] バチルス・セレウス（Bacillus cereus）に対して活性なバクテリオシンは、食中毒の原因となりうるＢ．セレウス（B. cereus）による汚染を予防するために酪農食品に提供される。バクテリオシンはトリプシン感受性である。ヒト対象が酪農食品を摂取したとき、バクテリオシンは、対象の消化系のトリプシンにより消化及び不活性化され、それにより、バクテリオシンの半減期をモジュレートする。
【0107】
実施例２：腸球菌の抗生物質耐性株を阻害する抗微生物ペプチドの半減期のモジュレーション
[0108] バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（バンコマイシン耐性腸球菌）の成長を阻害するバクテリオシンは、医学的手順に備えて医療デバイスの表面に適用される。バクテリオシンは、このバンコマイシン耐性腸球菌の成長を阻害する。医学的手順の直前に、プロテイナーゼＫは、バクテリオシンを消化及び不活性化するために医療デバイスの表面に適用される。任意に、プロテイナーゼＫを阻害するセルピンは、プロテイナーゼＫを阻害するために医療デバイスの表面に適用される。
[0108] バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（バンコマイシン耐性腸球菌）の成長を阻害するバクテリオシンは、医学的手順に備えて医療デバイスの表面に適用される。バクテリオシンは、このバンコマイシン耐性腸球菌の成長を阻害する。医学的手順の直前に、プロテイナーゼＫは、バクテリオシンを消化及び不活性化するために医療デバイスの表面に適用される。任意に、プロテイナーゼＫを阻害するセルピンは、プロテイナーゼＫを阻害するために医療デバイスの表面に適用される。
【0108】
[0109] 本明細書に記載の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される１つ以上のエレメントは、他の実施形態で互換的に使用可能である。ただし、かかる交換が技術的に実現可能である場合に限る。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び構造に各種他の省略、追加、及び変更を行いうることは、当業者であれば理解されるであろう。かかる変更及び変化はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される主題の範囲内に含まれることが意図される。
【0109】
[0110] 本明細書に記載の実質的にいずれの複数形及び／又は単数形の用語の使用に関しても、文脈上及び／又は適用上適切であれば、当業者は複数形から単数形へ及び／又は単数形から複数形への変換が可能である。各種単数形／複数形の入替えは、明確にするために本明細書に明示的に定められうる。
【0110】
[0111] 一般的には、本明細書とくに添付の特許請求の範囲（たとえば添付の特許請求の範囲の本文）で用いられる用語は「オープン」用語であることが一般に意図されることは当業者であれば理解されよう（たとえば、「including（～を含む）」という用語は「～を含むがこれらに限定されるものではない」と解釈すべきであり、「having（～を有する）」という用語は「少なくとも～を有する」と解釈すべきであり、「includes（～を含む）」という用語は「～を含むがこれらに限定されるものではない」と解釈すべきであるなど）。さらに、導入クレームレシテーションの特定数が意図される場合、かかる意図はクレームで明示的にリサイトされ、かかるレシテーションの不在下ではかかる意図は存在しないことは当業者であれば理解されよう。たとえば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、クレームレシテーションを導入するために導入語句「at least one（少なくとも１つ）」及び「one or more（１つ以上）」の使用を含みうる。しかしながら、かかる語句が用いられたとしても、不定冠詞「a」又は「an」によるクレームレシテーションの導入が、かかる導入クレームレシテーションを含む任意の特定の請求項を、一方のかかるレシテーションを含む実施形態のみに限定することを意味するものと解釈すべきでない。たとえ同一の請求項が導入語句「one or more（１つ以上）」又は「at least one（少なくとも１つ）」と不定冠詞たとえば「a」又は「an」とを含む場合でさえも、そのように解釈すべきでない（たとえば、「a」及び／又は「an」は「at least one（少なくとも１つ）」又は「one or more（１つ以上）」を意味するものと解釈すべきである）。定冠詞を用いてクレームレシテーションを導入する場合にも、同じことが当てはまる。そのほかに、たとえ特定数の導入クレームレシテーションが明示的にリサイトされたとしても、かかるレシテーションは少なくともリサイトされた数を意味すると解釈すべきであることは当業者であれば理解されるであろう（たとえば、「２つのレシテーション」という他の修飾語を含まないベアのレシテーションは、少なくとも２つのレシテーション又は２つ以上レシテーションを意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つ」に類似した条件が用いられる場合、一般的には、かかる構成は当業者がその条件を理解する意味であることが意図される（たとえば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有する系」は、限定されるものではないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、及び／又はＡとＢとＣの全部などを有する系を含であろう）。「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つなど」に類似した条件が用いられる場合、一般的には、かかる構成は当業者がその条件を理解する意味であることが意図される（たとえば、「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つを有する系」は、限定されるものではないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、及び／又はＡとＢとＣの全部などを有する系を含であろう）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語及び／又は語句は、明細書、請求項、又は図面にかかわらず、用語の１つ、用語のいずれか、又は用語の両方を含む可能性が企図されると理解すべきであることは当業者であれば理解されよう。たとえば、「Ａ又はＢ」という語句は「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むものと理解されよう。
【0111】
[0112] そのほか、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループにより記述される場合、それにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個別のメンバー又はメンバーのサブグループによっても記述されることは当業者であれば理解されるであろう。
【0112】
[0113] 当業者であれば理解されるであろうが、あらゆる目的で、たとえば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能なサブ範囲及びそのサブ範囲の組合せをも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されてその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされうるものとして容易に認識可能である。たとえば、限定されるものではないが、本明細書で考察される各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１に容易に分解可能である。当業者であれば同様に理解されるであろうが、「～まで」、「少なくとも～」、「～超」、「～未満」などの表現はすべて、列挙された数を含み、本明細書で考察されるように後続的にサブ範囲に分解可能な範囲を意味する。最終的に、当業者であれば理解されるであろうが、範囲は各個別のメンバーを含む。したがって、たとえば、１～３個の物品を有するグループは、１、２、又は３個の物品を有するグループを意味する。同様に、１～５個の物品を有するグループは、１、２、３、４、又は５個の物品を有するグループを意味し、他も同様である。
【0113】
[0114] 各種態様及び実施形態を本明細書に開示してきたが、他の態様及び実施形態は当業者には自明であろう。本明細書に開示される各種態様及び実施形態は、例示を目的としたものであり、限定を意図したものではなく、真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲により示される。本明細書に記載の各方法に対して、本方法での使用のための関連組成物は、明示的に企図され、本方法での組成物の使用及び適用可能であれば本方法での使用のための医薬剤の作製方法もまた、明示的に企図される。たとえば、抗微生物ペプチドの半減期をモジュレートする方法に対して、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境で、対応する方法での使用のための抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼ（及び／又は抗微生物ペプチド及び／又はプロテアーゼをコードする核酸）もまた、企図される。抗生物質耐性の阻害又は予防での使用のための抗微生物ペプチド（及び／又は抗微生物ペプチドをコードする核酸）を含む医薬剤の作製方法もまた、企図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】