特表 2023-548510 治療用免疫細胞の有効性を増強するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-17

(54)【発明の名称】治療用免疫細胞の有効性を増強するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20231110BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231110BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20231110BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231110BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20231110BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20231110BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231110BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231110BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N5/10

C12N5/0783

C12N15/09 110

C12N9/12

C12N15/86 Z

A61K35/15

A61K35/17

A61K31/7088

A61K48/00

A61P43/00 121

A61K35/76

A61K9/127

A61K9/00

A61P35/00

A61P37/02

A61P31/00

A61P35/02

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526666

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(85)【翻訳文提出日】2023-06-27

(86)【国際出願番号】 US2021058047

(87)【国際公開番号】W WO2022098864

(87)【国際公開日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】63/109,517

(32)【優先日】2020-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】クリスタル エル．マッカル

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン アン フレイタス

(72)【発明者】

【氏名】エレナ ソティロ－ピネイロ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA03

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA29

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076FF70

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

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4C084NA05

4C084NA13

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4C084ZB26

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4C086ZB26

4C086ZB27

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4C087MA02

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4C087MA43

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB32

4C087ZC75

(57)【要約】

本開示は、概して、とりわけメディエーター複合体の１つ以上のサブユニットの発現量を低減するように改変された組換え免疫細胞に関し、特に、増強されたエフェクター機能を示す改変免疫細胞に関する。増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための方法、その医薬組成物、並びに健康状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、その健康状態を予防及び／又は治療するための方法及びキットも提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための方法であって、前記免疫細胞中のメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを、前記免疫細胞に導入することを含む、方法。

【請求項2】

前記メディエーター複合体サブユニットが、前記メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ミドルモジュールサブユニットである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ミドルモジュールサブユニットが、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記メディエーター複合体サブユニットが、テールモジュールサブユニットである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記テールモジュールサブユニットが、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＤＫ８モジュールサブユニットが、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３Ｌからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記核酸が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）ゲノム編集系、（ｉｉｉ）ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）によるＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集、（ｉｖ）アンチセンス核酸分子、（ｖ）二本鎖ＲＮＡｉ分子、及び（ｖｉ）ｍＲＮＡの抑制又は分解を誘導することができるヘアピンＲＮＡ分子、のうちの１つ以上に組み込まれる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記核酸が、前記メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はマクロファージである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｔリンパ球が、
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹メモリーＴ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞；又は
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹メモリーＴ細胞、及びバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球細胞である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記免疫細胞に１つ以上の組換え免疫受容体を導入することを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記１つ以上の組換え免疫受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法によって産生される、改変免疫細胞。

【請求項17】

改変免疫細胞であって、前記免疫細胞におけるメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを含む、改変免疫細胞。

【請求項18】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される、請求項１７に記載の改変免疫細胞。

【請求項19】

前記免疫細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項20】

前記免疫細胞が、Ｔリンパ球である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項21】

前記免疫細胞が、疲弊した免疫細胞又は疲弊していない免疫細胞である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項22】

請求項１６～２１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの改変免疫細胞、及び培養培地を含む、細胞培養物。

【請求項23】

薬学的に許容される賦形剤と、
ａ）請求項１６～２２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞；及び／又は
ｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む組換え核酸であって、前記メディエーター複合体サブユニットが、前記メディエーター複合体の前記ミドルモジュールサブユニット、前記テールモジュールサブユニット、及び前記サイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、組換え核酸と、を含む、医薬組成物。

【請求項24】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

薬学的に許容される賦形剤と、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞と、を含む、請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

薬学的に許容される賦形剤と、前記メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する組換え核酸と、を含む、請求項２３又は２４に記載の医薬組成物。

【請求項27】

ウイルスカプシド、リポソーム、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入された核酸を含む、請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

健康状態の治療を必要とする対象において、前記健康状態を治療するための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項１６～２２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞；
ｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む組換え核酸であって、前記メディエーター複合体サブユニットが、前記メディエーター複合体の前記ミドルモジュールサブユニット、前記テールモジュールサブユニット、及び前記サイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、組換え核酸；並びに／又は
ｃ）請求項２３～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、を含む、組成物を投与することを含む、方法。

【請求項29】

前記メディエーター複合体サブユニットが、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記健康状態が、増殖性疾患、自己免疫疾患、又は感染症である、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記対象が、哺乳動物対象である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記対象が、増殖性疾患、自己免疫疾患、又は感染症を有するか、又は有する疑いがある、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記増殖性疾患が、癌である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記癌が、白血病又は骨肉腫である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記投与された組成物が、成長速度（増殖）、サイトカイン産生、標的細胞阻害（例えば、抗癌細胞傷害性）、マクロファージ活性化、Ｔ細胞活性化、ＮＫ細胞活性化、及びｉｎ ｖｉｖｏ持続性（例えば、生存）からなる群から選択される増強されたエフェクター機能を付与する、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記増強されたエフェクター機能が、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及び／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生の増加を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記増強されたエフェクター機能が、エフェクターメモリーＴ細胞表現型の増加を含む、請求項３７～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記増強されたエフェクター機能が、酸素消費速度及び細胞外酸性化速度の増加を含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記組成物が、個別に、又は第２の療法と組み合わせた第１の療法として前記対象に投与され、前記第２の療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群から選択される、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、前記状態を予防及び／又は治療するためのキットであって、
ａ）請求項１６～２２のいずれか一項に記載の改変免疫細胞；
ｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む組換え核酸であって、前記メディエーター複合体サブユニットが、前記メディエーター複合体の前記ミドルモジュールサブユニット、前記テールモジュールサブユニット、及び前記サイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、組換え核酸；並びに／又は
ｃ）請求項２３～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、
を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府支援の研究開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された契約ＣＡ２３２５６８及びＣＡ０４９６０５に基づく政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，５１７号の優先権を主張するものであり、その開示は、任意の図面を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

配列表の組み込み
本出願は、配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。「０７８４３０－５２７００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の添付の配列表テキストファイルは、２０２１年１０月５日に作成されたものであり、３．４ＫＢである。

【0004】

本開示は、概して、とりわけメディエーター複合体の１つ以上のサブユニットの発現量を低減するように改変された組換え免疫細胞に関し、特に、増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞（engineered immune cell）に関する。増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための方法、その医薬組成物、並びに健康状態の予防及び／又は治療を必要とする対象においてその健康状態を予防及び／又は治療するための方法及びキットも提供される。

【背景技術】

【0005】

免疫細胞は、正常組織を温存しながら腫瘍細胞を標的にする潜在能力を有するため、免疫細胞は、強力かつ特異的な「生体薬物」になり得る。いくつかの臨床観察から、それらは主要な抗癌作用を有し得ることが示されている。この理由のため、遺伝子改変された免疫細胞の養子移入が、様々な悪性腫瘍に対する強力な療法として浮上してきた。例えば、養子Ｔ細胞療法の現在の様式には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの癌抗原に特異的な受容体を発現するように改変された細胞が含まれる。養子Ｔ細胞療法では、改変されたＴ細胞は、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで同族抗原に曝露することによって活性化され、増殖された後、個体に投与され、そこで増殖して細胞溶解活性を示し、かつ／又はシグナルを送って標的癌に対する免疫応答を開始する。

【0006】

近年、Ｂ細胞悪性腫瘍などの癌細胞上の適切な細胞表面分子にＴ細胞をリダイレクトすることに依るＣＡＲ改変自己Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）使用療法が開発され、Ｂ細胞悪性腫瘍などの癌治療に免疫系の力を活用することが期待されている。例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍に発現するＣＤ１９タンパク質に特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた最近の臨床試験では、進行癌患者の一部で顕著な疾患の退縮が実証されている。この成功により、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞治療薬であるａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ（ＹＥＳＣＡＲＴＡ（登録商標））及びｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ（ＫＹＭＲＩＡＨ（登録商標））の２剤がＦＤＡから承認され、他の療法も大Ｂ細胞リンパ腫（ＬＢＣＬ）及びＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）の治療用薬剤として臨床開発段階にある。

【0007】

しかし、この療法を他の種類の癌、特に固形腫瘍に拡張するには、いくつかの課題がある。例えば、Ｂ細胞などの血液悪性細胞はＣＤ１９を発現しており、ほとんど腫瘍に限定された抗原を標的とするため、特異性が高く、治療の幅が広いのに対して、固形腫瘍は通常、リンパ管循環で容易にアクセスできない場所に存在し、免疫抑制性の白血球及びサイトカインを保有する密な間質及び腫瘍微小環境によって隔離されている。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の遊走に対する障壁には、肺、肝臓及び脾臓などの非標的器官への優先性、異常な血管形成によって引き起こされる膠質浸透圧によるリンパ球の血管外遊出の制限、腫瘍血管系での接着分子の発現の下方制御、並びにリンパ球誘引ケモカインの放出の減少も含まれる。更に、固形腫瘍における腫瘍不均一性は、抗原選択に対する課題となる。更に、腫瘍微小環境は、養子細胞療法の有効性を低減させ得る多くの耐性及び免疫抑制のメカニズムを誘発する。更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞を認識して破壊する能力に加えて、治療用Ｔ細胞療法を成功させるには、増殖能力、長期にわたる持続能力、更に癌細胞の逃避をモニタリングする能力が必要である。Ｔ細胞の様々な表現型状態は、それがアネルギー、抑制又は疲弊の状態であるかどうかにかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性に対して様々な効果を有することが報告されている。加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞が効果を発揮するためには、投与後に存続（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで生存）し、ＣＡＲの抗原に応答して増殖する能力を維持する必要がある。

【0008】

したがって、養子細胞療法のための改善された治療用細胞を生成するための新しい組成物及び戦略が必要とされる。本開示の態様及び実施形態は、これらの必要性に対処し、他の関連する利点を提供する。

【発明の概要】

【0009】

本明細書で提供されるのは、とりわけ様々な健康状態の予防及び／又は治療のための、新規の方法及び組成物である。特に、本明細書に記載されるのは、例えば、癌療法のための増強された治療有効性を有する改変免疫細胞である。本開示のいくつかの実施形態は、メディエーター複合体の１つ以上のサブユニットの発現量を低減するように改変された免疫細胞に関する。いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、増強されたエフェクター機能を示す。増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞の集団を生成するための方法、及び増強されたエフェクター機能を有するこのような改変免疫細胞の集団を含有する医薬組成物、並びに健康状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、その健康状態を予防及び／又は治療するための方法及びキットも提供される。

【0010】

一態様において、本明細書で提供されるのは、増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための方法であって、免疫細胞におけるメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む、方法である。

【0011】

開示される方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、テールモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｉｉ）ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）ゲノム編集系、（ｉｉｉ）ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）によるＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集、（ｉｖ）アンチセンス核酸分子、（ｖ）二本鎖ＲＮＡｉ分子、又は（ｖｉ）ｍＲＮＡの抑制又は分解を誘導することができるヘアピンＲＮＡ分子、のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）である。いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹メモリーＴ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹メモリーＴ細胞、及びバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球細胞である。

【0013】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、免疫細胞に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの１つ以上の組換え免疫受容体を導入することを更に含む。

【0014】

一態様において、本明細書で提供されるのは、免疫細胞におけるメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを含む、改変免疫細胞である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。別の態様において、本明細書で提供されるのは、本開示の方法によって産生される改変免疫細胞である。本明細書に記載される改変免疫細胞の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、疲弊した免疫細胞又は疲弊していない免疫細胞である。関連する態様において、本開示の少なくとも１つの改変免疫細胞及び培養培地を含む、細胞培養物が本明細書で提供される。

【0015】

別の態様において、本明細書で提供されるのは、薬学的に許容される賦形剤と、ａ）本開示の改変免疫細胞；及び／又はｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸であって、メディエーター複合体サブユニットが、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、核酸と、を含む、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。

【0016】

本明細書に記載される医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の少なくとも１つの改変免疫細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、メディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸であって、メディエーター複合体サブユニットが、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、核酸を含む。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸を含む組成物は、ウイルスカプシド、リポソーム、又は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されている。

【0017】

別の態様において、本明細書で提供されるのは、健康状態の治療を必要とする対象において、その健康状態を治療するための方法であって、（ａ）本開示の改変免疫細胞と、ｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸であって、メディエーター複合体サブユニットが、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、核酸と、を含む、組成物を対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される；並びに／又はｃ）本開示の医薬組成物。

【0018】

本明細書に記載される治療方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、健康状態は、増殖性疾患、自己免疫疾患、又は感染症である。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物対象である。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、対象は、増殖性疾患、自己免疫疾患、又は感染症を有するか、又は有する疑いがある。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、白血病又は骨肉腫である。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、成長速度（増殖）、サイトカイン産生、標的細胞阻害（例えば、抗癌細胞傷害性）、マクロファージ活性化、Ｔ細胞活性化、ＮＫ細胞活性化、及びｉｎ ｖｉｖｏ持続性（例えば、生存）からなる群から選択される増強されたエフェクター機能を付与する。いくつかの実施形態において、増強されたエフェクター機能は、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及び／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生の増加を含む。いくつかの実施形態において、増強されたエフェクター機能は、エフェクターメモリーＴ細胞表現型の増加を含む。いくつかの実施形態において、増強されたエフェクター機能は、酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、個別に（単剤療法）、又は第２の療法と組み合わせた第１の療法として対象に投与され、第２の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は手術からなる群から選択される。

【0019】

更に別の態様において、本明細書で提供されるのは、状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、その状態を予防及び／又は治療するためのキットであって、（ａ）本開示の改変免疫細胞；（ｂ）メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸であって、メディエーター複合体サブユニットが、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される、核酸；及び／又はｃ）本開示の医薬組成物を含む、キットである。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。

【0020】

前述の概要は、例示的なものにすぎず、決して限定することを意図するものではない。本明細書に記載される例示的な実施形態及び特徴に加えて、本開示の更なる態様、実施形態、目的及び特徴は、図面及び詳細な説明及び特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＲＩＳＰＲノックアウトライブラリーの作製を概略的に示した図である。２人のヒトドナーからのＴ細胞を精製した。１遺伝子当たり１０個のガイドで約２０，０００個のタンパク質コード遺伝子を標的としたＣＲＩＳＰＲライブラリーを、レンチウイルスベクターを用いて低感染多重度（１０％陽性）で２億個のＴ細胞に組み込んだ。精製されたＣａｓ９タンパク質を３日目にＴ細胞にエレクトロポレーションし、活性化後３日目及び４日目にレトロウイルスによってＣＡＲを組み込んだ。

【0022】

【図2】ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの実験計画を概略的に示した図である。遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで２週間培養した。持続性シグナル伝達ＣＡＲの発現により、進行性のＴ細胞機能不全が誘導される。サイトカイン産生をスクリーニングするために、集団の一部を腫瘍細胞で刺激し、ＩＬ－２及びＴＮＦαを高レベルで発現するＴ細胞についてＦＡＣＳで選別した。増殖のスクリーニングのため、ＣＡＲ－Ｔ標的を発現する腫瘍細胞とＴ細胞を更に７日間共培養した。

【0023】

【図3】増殖スクリーニングから選択された遺伝子が、複製ドナー間で再現性を示すことを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ガイドＲＮＡの存在量を０日目及び２３日目に定量した。プロットは、各遺伝子を標的とする全てのガイドＲＮＡの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）を示す。右上象限にプロットされた遺伝子は、欠失すると増殖が促進され、左下象限の遺伝子は、欠失すると増殖が減少する。

【0024】

【図4A】統計的に有意な遺伝子を同定するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを説明するために実施した実験結果をグラフにまとめた図である。ＭＡＧＥＣＫアルゴリズムを用いて、ガイドの相対的な存在量を解析し、各遺伝子の調整Ｐ値を算出した（Ｌｉ ２０１４）。図４Ａに示すように、サイトカイン産生スクリーニングでは、全１５日の集団におけるガイドの存在量をサイトカイン高値の集団と比較する。図４Ｂに示すように、増殖スクリーニングでは、２３日目と０日目の存在量を比較する。ゲノムの安全な非コード領域を標的とするガイドを対照として含め、安全な標的ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）を垂直の破線で示す。統計的有意性についての閾値は、水平の破線で示されている。サイトカイン産生スクリーニングでは、統計的に有意な遺伝子が１つ同定され、増殖アッセイでは、統計的に有意な遺伝子が複数同定された。

【図4B】統計的に有意な遺伝子を同定するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングを説明するために実施した実験結果をグラフにまとめた図である。ＭＡＧＥＣＫアルゴリズムを用いて、ガイドの相対的な存在量を解析し、各遺伝子の調整Ｐ値を算出した（Ｌｉ ２０１４）。図４Ａに示すように、サイトカイン産生スクリーニングでは、全１５日の集団におけるガイドの存在量をサイトカイン高値の集団と比較する。図４Ｂに示すように、増殖スクリーニングでは、２３日目と０日目の存在量を比較する。ゲノムの安全な非コード領域を標的とするガイドを対照として含め、安全な標的ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）を垂直の破線で示す。統計的有意性についての閾値は、水平の破線で示されている。サイトカイン産生スクリーニングでは、統計的に有意な遺伝子が１つ同定され、増殖アッセイでは、統計的に有意な遺伝子が複数同定された。

【0025】

【図5A】３３個のメディエーター複合体サブユニット全てが増殖スクリーニングで検出可能であることを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。各遺伝子を標的とした全ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）をプロットしている。最初に、ドナー１及びドナー２を平均することによって、各ガイドの平均濃縮度を算出した。次いで、ガイド平均値を平均することによって、各遺伝子の平均濃縮度を算出した。エラーバーは、ガイドの標準偏差を示す。ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣは、ともにＣＤＫ８キナーゼモジュール（ＣＫＭ）において見出される。ＣＫＭの全てのメンバーの喪失により、Ｔ細胞で発現していないＭＥＤ１２Ｌを除いて、増殖が増強された。ヘッド、バックボーン、及びミドルドメインに見られるメディエーターサブユニットの喪失により、ＭＥＤ２６とＭＥＤ１９を除いて、増殖が低減しミドルドメインとＣＫＭとの間の物理的接触を形成すると予測された。更に、テール領域のいくつかのメンバー（例えば、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、及びＭＥＤ２４）は、欠失すると増殖がわずかに増強された。

【図5B】３３個のメディエーター複合体サブユニット全てが増殖スクリーニングで検出可能であることを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。各遺伝子を標的とした全ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）をプロットしている。最初に、ドナー１及びドナー２を平均することによって、各ガイドの平均濃縮度を算出した。次いで、ガイド平均値を平均することによって、各遺伝子の平均濃縮度を算出した。エラーバーは、ガイドの標準偏差を示す。ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣは、ともにＣＤＫ８キナーゼモジュール（ＣＫＭ）において見出される。ＣＫＭの全てのメンバーの喪失により、Ｔ細胞で発現していないＭＥＤ１２Ｌを除いて、増殖が増強された。ヘッド、バックボーン、及びミドルドメインに見られるメディエーターサブユニットの喪失により、ＭＥＤ２６とＭＥＤ１９を除いて、増殖が低減しミドルドメインとＣＫＭとの間の物理的接触を形成すると予測された。更に、テール領域のいくつかのメンバー（例えば、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、及びＭＥＤ２４）は、欠失すると増殖がわずかに増強された。

【0026】

【図6A】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6B】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6C】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6D】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6E】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6F】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ Ｔ細胞がより多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生することを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂと共培養した。腫瘍細胞を添加してから２４時間後に上清を採取した。サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【0027】

【図7】ＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が単細胞ベースでより多くのＩＬ－２及びＴＮＦαを産生することを実証するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５日目にモネンシンの存在下で６時間、ＮＡＬＭ６腫瘍細胞で刺激した。未刺激細胞（上パネル）及び刺激細胞（下パネル）を固定し、ＩＬ－２及びＴＮＦαについて染色し、フローサイトメトリーで解析した。全ＣＤ４＋細胞のうちのＩＬ－２＋ＴＮＦα＋細胞のパーセンテージを各プロットの上に示す。

【0028】

【図8】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が培養においてより増殖することを実証するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させ、２８日目までＩＬ－２と共に細胞を培養した。平均総生細胞数をプロットし、エラーバーは３回の技術的反復の標準偏差を示す。

【0029】

【図9】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が生存のためにＩＬ－２に依存していることを実証するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。９日目に、細胞を洗浄し、ＩＬ－２を含む又は含まない培地に播種した。細胞密度は、培地１ｍＬ当たり５０万～１００万個の細胞に維持した。細胞をアクリジンオレンジ及びヨウ化プロピジウムで染色し、ＣｅｌｌａｃａＭＸ細胞カウンターで生存率をモニタリングした。ＩＬ－２の非存在下では、いずれの条件においても２８日目までに生存細胞は検出されなかった。

【0030】

【図10A】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示すことを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現する１００万個のＮＡＬＭ６細胞を０日目に注入し、２５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を３日目に注入した。ＳＩＩ Ｌａｇｏ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いた生物発光イメージングで腫瘍量をモニタリングし、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアで１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）を定量した。３０秒の露光は図１０Ａに示されており、飽和を避けるために定量にはより短い露光が用いられた（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。個々のマウスの値をＢに、平均値をＣに示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図10B】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示すことを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現する１００万個のＮＡＬＭ６細胞を０日目に注入し、２５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を３日目に注入した。ＳＩＩ Ｌａｇｏ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いた生物発光イメージングで腫瘍量をモニタリングし、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアで１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）を定量した。３０秒の露光は図１０Ａに示されており、飽和を避けるために定量にはより短い露光が用いられた（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。個々のマウスの値をＢに、平均値をＣに示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図10C】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示すことを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現する１００万個のＮＡＬＭ６細胞を０日目に注入し、２５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を３日目に注入した。ＳＩＩ Ｌａｇｏ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いた生物発光イメージングで腫瘍量をモニタリングし、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアで１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）を定量した。３０秒の露光は図１０Ａに示されており、飽和を避けるために定量にはより短い露光が用いられた（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。個々のマウスの値をＢに、平均値をＣに示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【0031】

【図11】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでの増殖の増加を示すことを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。Ｔ細胞注入から１０日後にマウスから血液を採取した（図１０参照）。血液を等量のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ヒトＣＤ４５を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）で赤血球を溶血した。ヒトＣＤ４５＋細胞をフローサイトメトリーによって定量した。

【0032】

【図12】ＭＥＤ１２－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－ＴがＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高めることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。マウスに１００万個のＮＡＬＭ６腫瘍細胞を注入し、３日目に１×１０^５、２．５×１０^５、又は５×１０^５Ｔ細胞を投与した。ＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞は生存を増加させ、ＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞はＡＡＶＳ１－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。

【0033】

【図13】ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、固形腫瘍成長を減少させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高めることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。０日目に１４３Ｂ骨肉腫細胞１００万個を筋肉内注射し、４日目にＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞５００万個を注入した。固形腫瘍をノギスで測定した。腫瘍径が１７ｍｍ以上になった時点でマウスを屠殺した。

【0034】

【図14】ＭＥＤ１２エクソン２の２つの切断部位を標的とすることにより、遺伝子欠失頻度が増加することを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３（ＩＤＴ）をＤｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）をＴＥ緩衝液で１００μＭに再懸濁した。１μＬのＣＡＳ９及び１μＬのｓｇＲＮＡを合わせ、室温で３０分間インキュベートした。２つのガイド条件については、各ｓｇＲＮＡを０．５μｌずつ添加した。２００万個のＴ細胞を１８μＬのＰ３緩衝液に再懸濁し、ＣＡＳ９と混合し、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓ Ｋｉｔ及び４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いてプロトコルＥＯ１１５でパルスした。細胞を１００μＬの温培地で直ちに回収し、次いで、１ｍＬの温培地に６時間かけて移した後、ＣＡＲで形質導入した。３日目に編集を行い、１１日目に遺伝子欠失を評価した。

【0035】

【図15A-1】ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【図15A-2】ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【図15B】ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【0036】

【図16A】ＭＥＤ１２の喪失がＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲを発現しないＴ細胞の増殖を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【図16B】ＭＥＤ１２の喪失がＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲを発現しないＴ細胞の増殖を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【0037】

【図17】ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失がｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【0038】

【図18A】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による投与が腫瘍面積を減少させ、ＣＡＲ投与マウスの生存を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【図18B】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による投与が腫瘍面積を減少させ、ＣＡＲ投与マウスの生存を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【0039】

【図19A】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後に、ＣＡＲ投与マウスの生存が増加することを説明するために実施した実験結果をグラフでまとめた図である。

【図19B】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後に、ＣＡＲ投与マウスの生存が増加することを説明するために実施した実験結果をグラフでまとめた図である。

【図19C】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後に、ＣＡＲ投与マウスの生存が増加することを説明するために実施した実験結果をグラフでまとめた図である。

【図19D】ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後に、ＣＡＲ投与マウスの生存が増加することを説明するために実施した実験結果をグラフでまとめた図である。

【0040】

【図20A】ＭＥＤ１２の喪失がＴ細胞におけるＩＬ２ＲＡの発現を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【図20B】ＭＥＤ１２の喪失がＴ細胞におけるＩＬ２ＲＡの発現を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。

【0041】

【図21A】ＭＥＤ１２の喪失がエフェクターメモリーＴ細胞表現型を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ＳＣＭ：幹細胞様メモリーＴ細胞；ＣＭ：セントラルメモリーＴ細胞；ＥＭ：エフェクターメモリーＴ細胞；ＴＥ：最終分化Ｔ細胞。

【図21B】ＭＥＤ１２の喪失がエフェクターメモリーＴ細胞表現型を増加させることを説明するために行われた実験結果をグラフにまとめた図である。ＳＣＭ：幹細胞様メモリーＴ細胞；ＣＭ：セントラルメモリーＴ細胞；ＥＭ：エフェクターメモリーＴ細胞；ＴＥ：最終分化Ｔ細胞。

【0042】

【図22-1】ＭＥＤ１２の欠損が、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化後１５日目の酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を増加させることを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。

【図22-2】ＭＥＤ１２の欠損が、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化後１５日目の酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を増加させることを説明するために行った実験結果をグラフにまとめた図である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本開示は、概して、とりわけ様々な健康状態の予防及び／又は治療のための方法及び組成物に関する。特に、本明細書に記載されるのは、メディエーター複合体の１つ以上のサブユニットの発現量を緩和するように改変された免疫細胞であり、特に、増強されたエフェクター機能を示す改変免疫細胞に関する。増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞の集団を生成するための方法、その医薬組成物、並びに健康状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、その健康状態を予防及び／又は治療するための方法及びキットも提供される。

【0044】

近年、Ｂ細胞悪性腫瘍などの癌細胞上の適切な細胞表面分子にＴ細胞をリダイレクトすることに依るＣＡＲ－Ｔ細胞使用療法が開発され、Ｂ細胞悪性腫瘍などの癌治療に免疫系の力を活用することが期待されている。養子Ｔ細胞療法では、改変されたＴ細胞は、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで同族抗原に曝露することによって活性化され、増殖された後、個体に投与され、そこで増殖して細胞溶解活性を示し、かつ／又はシグナルを送って標的癌に対する免疫応答を開始する。

【0045】

本明細書に提示される実験データは、メディエーター複合体サブユニットの発現及び／又は活性を下方制御することによって、免疫細胞における、例えばＭＥＤ１２又はＣＣＮＣにより、免疫細胞の活性化、サイトカイン分泌及び腫瘍死滅の増強がもたらされることを実証している。特に、メディエーター複合体のサイクリン依存性キナーゼモジュール（ＣＫＭ）のサブユニットをコードする遺伝子がＴ細胞で遺伝的に破壊された場合、遺伝子改変されたＴ細胞は、増殖性がより高く、炎症性サイトカインをより多く産生し、抗癌細胞傷害性の増加を示した。以下により詳細に記載されるように、欠失した場合にこの効果を示す遺伝子としては、ＣＣＮＣ、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１３、ＣＤＫ８、及びＣＤＫ１９が挙げられる。更に、本明細書に記載の実験結果から、ＣＫＭとコアメディエーター複合体との間の物理的接触を形成するメディエーター複合体サブユニットをコードする遺伝子（ＭＥＤ１９及びＭＥＤ２６）を欠失すると、Ｔ細胞機能に対し同じ効果が得られることが実証された。

【0046】

本開示に記載の知見は、ＣＡＲ免疫細胞療法（Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を含む）、ＴＣＲ改変Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの特異的な受容体の関与が必要で、腫瘍反応性細胞が腫瘍細胞と栄養を奪い合う養子免疫療法の状況において、大きな価値を持ち得る。特に、本明細書に記載のアプローチは、栄養素が制限された敵対的な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）が記録されている固形腫瘍の治療において特に価値があり得る。更に、このアプローチは、製造プロセス全体を通して免疫細胞産物の増殖及び分裂を増加させるために適用することができる。

【0047】

以下に詳述するように、メディエーター複合体サブユニットをコードする遺伝子の欠失は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、又は相同組換え、又は任意の他の遺伝子工学的方法を用いて達成することができる。これらの遺伝子改変のいずれかを有するヒト初代Ｔ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）で形質転換して、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製することができ、これはその後、ヒトの癌の治療に使用することができる。あるいは、患者の腫瘍から採取した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、癌患者に再注入することで、これらの遺伝子改変を行うことも可能である。これらの遺伝的変化は、養子細胞療法にも使用されるナチュラルキラー細胞又はマクロファージなどの他のリンパ球においても有用であり得る。別の言い方をすれば、本明細書に記載されるアプローチは、天然受容体を発現する免疫細胞、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、組換えＴＣＲなどの抗原特異的受容体を発現するための改変免疫細胞が、それらの細胞傷害性機能、増殖及びｉｎ ｖｉｖｏ持続性を改善するために、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの下方制御によって代謝的に再プログラムされ得ることを示す。

【0048】

更に、いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＣＤＫ８又はＣＤＫ１９の薬理学的阻害によりメディエーター複合体の触媒機能を阻害することで、サイクリン依存性キナーゼ８モジュール（ＣＫＭ）のサブユニットをコードする遺伝子の遺伝子欠失と同様の効果が得られ得ることが企図される。更に、ＣＤＫ８又はＣＤＫ１９の触媒ドメイン内のアミノ酸を変異させ、キナーゼ活性を消失させることで、ＣＫＭの喪失によって生じる効果と同様の効果が得られることが企図される。更に、前述の遺伝子のＲＮＡｉノックダウン、又はコアメディエーターサブユニットの過剰発現若しくは追加の遺伝子改変など、ＣＫＭの機能を低下させる他の方法で同じ効果を得ることができる。例えば、メディエーター複合体のミドルドメイン内のサブユニットのタンパク質改変により、ＣＫＭとコアメディエーター複合体との会合を無効にすると、ＣＫＭの喪失によって引き起こされる効果と同じ効果を引き起こすことが予測される。このようなタンパク質改変は、ＣＫＭとコアメディエーターとの間の接触を形成するアミノ酸を変異させることによって達成できる。本明細書に提示される実験データは、重要な接触点がＭＥＤ２６及びＭＥＤ１９内にあることを示す。「阻害」という用語には、部分的な阻害及び完全な阻害が含まれる。例えば、メディエーター複合体の触媒機能は、１つ以上の薬理学的アプローチ、化合物、又は手段によって、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％阻害され得る。

【0049】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学用語又は専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般的に理解される意味を有する用語は、明確化のため、及び／又は、すぐに参照できるように本明細書で定義されており、このような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当該技術分野で概ね理解されているものと実質的に異なることを表すものと解釈されるべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び手順の多くは、当業者によく理解され、従来の方法論を用いて一般的に採用されているものである。

【0050】

単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明らかに別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「細胞（a cell）」は、その混合物を含む１つ以上の細胞を含む。「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書では、「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、及び「Ａ及びＢ」の全ての選択肢を含むものとして使用される。

【0051】

用語「約」は、本明細書で使用される場合、およそというその通常の意味を有する。近似の程度が文脈から明らかでない場合、「約」は、提供された値のプラス若しくはマイナス１０％以内であること、又は提供された値を含む全ての場合において、最も近い有効数字に四捨五入されたことを意味する。範囲が提供されている場合、それらには境界値が含まれる。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、指定された値±１０％まで、±５％まで、又は±１％までを示す。

【0052】

「投与」及び「投与する」という用語は、本明細書で使用される場合、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、及び局所投与、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない投与経路による生物活性組成物又は製剤の送達を指す。この用語には、医療専門家による投与及び自己投与が含まれるが、これらに限定されない。

【0053】

「癌」は、無制限な増殖、不死性、転移能、急速な成長及び増殖速度、並びに特定の特徴的な形態学的特徴などの、癌を引き起こす細胞に典型的ないくつかの特徴を有する細胞の存在を指す。癌細胞は、腫瘍などの塊に凝集することもあれば、対象内に単独で存在することもある。腫瘍は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移性病変であり得る。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、他の種類の非腫瘍癌も包含する。非限定的な例としては、白血病などの血液癌又は血液学的癌が挙げられる。癌には、悪性の癌だけでなく、前悪性の癌も含まれ得る。

【0054】

「細胞」、「細胞培養物」、及び「細胞株」という用語は、特定の対象細胞、細胞培養物、又は細胞株だけでなく、培養物中の転移又は継代の数に関係なく、このような細胞、細胞培養物、又は細胞株の子孫又は潜在的子孫も指す。全ての子孫が親細胞と厳密に同一であるわけではないことを理解する必要がある。これは、変異（例えば、意図的な変異又は意図しない変異）又は環境の影響（例えば、メチル化又は他のエピジェネティックな改変）のいずれかにより、特定の改変が後継世代で発生する場合があるため、子孫が実際には親細胞と同一ではない場合があるが、子孫が元の細胞、細胞培養物、又は細胞株と同じ機能を保持する限り、本明細書に使用する用語の範囲になお含まれる。

【0055】

用語「作動可能に連結された」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の要素、例えば、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の間の物理的又は機能的連結を示し、それらがそれらの意図された様式で作動することを可能にする。例えば、用語「作動可能に連結された」は、本明細書に記載される核酸分子又は核酸分子中のコード配列及びプロモーター配列の文脈において使用される場合、コード配列及びプロモーター配列が、転写因子又はＲＮＡポリメラーゼによるそれぞれの結合の転写への影響を可能にするために、インフレームであり、適切な空間及び距離で離れていることを意味する。作動可能に連結された要素は、隣接していても隣接していなくてもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結されていてもよい）ことを理解されたい。ポリペプチド構築物の文脈において、「作動可能に連結された」は、構築物の記載された活性を提供するための、アミノ酸配列（例えば、異なるセグメント、部分、領域、又はドメイン）間の物理的連結（例えば、直接的又は間接的連結）を指す。本明細書に開示されるポリペプチド又は核酸分子の作動可能に連結されたセグメント、部分、領域、及びドメインは、隣接していても隣接していなくてもよい（例えば、リンカーを介して互いに連結されていてもよい）。

【0056】

本明細書で使用される場合、「組換え」又は「改変」核酸分子、ポリペプチド、又は細胞という用語は、ヒトの介入によって改変された核酸分子、ポリペプチド、又は細胞を指す。

【0057】

本明細書で使用される場合、特に指定がない限り、薬剤の「治療有効量」又は「治療有効数」は、疾患、例えば癌の治療若しくは管理において治療的利益を提供するのに、又は疾患に関連する１つ以上の症状を遅延若しくは最小化するのに十分な量又は数である。化合物の治療有効量又は治療有効数は、疾患の治療又は管理において治療的利益を提供する、単独又は他の治療薬と組み合わせた治療薬の量又は数を意味する。「治療有効量」という用語は、疾患の全体的な治療を改善する、疾患の症状若しくは原因を軽減若しくは回避する、又は別の治療薬の治療有効性を増強する量又は数を包含し得る。「有効量」の例は、疾患の症状又は複数の症状の治療、予防、又は低減に寄与するのに十分な量であり、これは「治療有効量」とも呼ばれ得る。症状の「低減」とは、症状の重症度若しくは頻度が減少すること、又は症状が消失することを意味する。「治療有効量」を含む組成物の正確な量は、治療の目的によって異なり、当業者であれば公知の技術を用いて確認できるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（Ｖｏｌｓ．１－３，２０１０）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（２０１６）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２０１２）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照されたい）。

【0058】

本明細書で使用される場合、「対象」又は「個体」には、ヒト（例えば、ヒト対象）及び非ヒト動物などの動物が含まれる。いくつかの実施形態において、「対象」又は「個体」は、医師の管理下にある患者である。したがって、対象は、関心疾患（例えば、癌）及び／又はその疾患の１つ以上の症状を有するか、有するリスクがあるか、又は有する疑いがあるヒト患者又は対象であり得る。また、対象は、診断時又はそれ以降に関心状態のリスクがあると診断された対象であり得る。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、非ヒト霊長類、及び他の哺乳動物、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、並びに非哺乳動物、例えば両生類、爬虫類等を含む。

【0059】

値の範囲が提供される場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限の間の各介在値、及びその述べられた範囲内の他の述べられた値又は介在する値は、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれる場合があり、記載された範囲において特に除外された制限を条件として、本開示内に包含されるものでもある。記載された範囲が制限値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる制限値のいずれか又は両方を除いた範囲も本開示に含まれる。

【0060】

特定の範囲は、「約」という用語が前に付いた数値で本明細書に提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近い又は近似する数について、文字通りの裏付けを与えるために使用する。ある数が具体的に列挙された数字に近いか近似しているかを判断する際、近い又は近似する未列挙の数字は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数字と実質的に同等のものを提供する数字であり得る。近似の程度が文脈から明らかでない場合、「約」は、提供された値を含む全ての場合において、提供された値のプラス若しくはマイナス１０％以内であること、又は最も近い有効数字に四捨五入されたことを意味する。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、指定された値±１０％まで、±５％まで、又は±１％までを示す。

【0061】

本明細書に記載される本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、「からなる（consisting）」、及び「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含有する（containing）」、又は「によって特徴付けられる（characterized by）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法の工程を除外しない。本明細書で使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求される組成物又は方法において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求される組成物又は方法の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。特に組成物の構成要素の説明又は方法の工程の説明における、用語「含む（comprising）」の本明細書における列挙はいずれも、列挙された構成要素又は工程から本質的になる、及びそれらからなる組成物及び方法を包含するものと理解される。

【0062】

見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示されている。本明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、工程又は要素がアルファベット順若しくは数字順に、又はそれらが提示された順序で実行されることを要件とするものではない。

【0063】

明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明されている本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されている本開示の様々な特徴も、別々に、又は任意の適切な下位組み合わせで提供され得る。本開示に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々に明示的に開示されている場合と同様に、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての下位組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆるこのような下位組み合わせが、本明細書において個々に明示的に開示されている場合と同様に、本明細書において開示される。

【0064】

メディエーター複合体
メディエーター複合体は、タンパク質コードＲＮＡ遺伝子及びほとんどの非コードＲＮＡ遺伝子を含むほとんどのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）転写物の発現を調節するために必要であることが報告されているマルチサブユニットアセンブリである。メディエーター及びｐｏｌ ＩＩは、メディエーター複合体、ｐｏｌ ＩＩ、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ及びＴＦＩＩＨからなる開始前複合体（ＰＩＣ）内で機能する。メディエーターは、ＰＩＣ内の中心的な足場として機能し、まだ十分に解明されていない方法でｐｏｌ ＩＩ活性を調節するのに役立っている。メディエーターはまた、概して、発生又は環境の合図に応答して遺伝子発現プログラムを制御するように働く、配列特異的なＤＮＡ結合転写因子（ＴＦ）によって標的にもなる。基本的なレベルでは、メディエーター複合体は、ＴＦからのシグナルを直接ｐｏｌ ＩＩ酵素に中継することによって機能し、それによって遺伝子発現のＴＦ依存性調節を促進する。

【0065】

したがって、メディエーターは、生物学的入力（ＴＦによって伝達される）を生理学的応答（遺伝子発現の変化を介して）に変換するのに不可欠であると考えられる。この理由のため、メディエーター複合体は、遺伝子発現の全体的な調節因子と見なされ、そしてそれ自体、全般的な転写因子と見なされる。しかし、メディエーターを他の全般的な転写因子（ＴＦＩＩＤを例外とすることが可能）と区別するものは、その高度な構造的柔軟性、その可変的なサブユニット構成、及び活性化（例えば、エンハンサー駆動）転写に対する全般的な要件である。活性化された転写を刺激するその能力と一致して、メディエーターは、ＰＩＣ内のＤＮＡ結合ＴＦの主要な結合界面であるとみられる。これらの特徴は、全般的機能及び状況特異的機能の両方にとって重要であり、そのため、この「全般的な転写因子」は、異なる遺伝子又は異なる細胞型において、メカニズム的に異なる方法で作動し得る。

【0066】

メディエーターサブユニット及びモジュール
メディエーター複合体は、試験対象となった全ての真核生物において、少なくとも３１個のサブユニットから構成される：ＭＥＤ１、ＭＥＤ４、ＭＥＤ６、ＭＥＤ７、ＭＥＤ８、ＭＥＤ９、ＭＥＤ１０、ＭＥＤ１１、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１４、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ１８、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２０、ＭＥＤ２１、ＭＥＤ２２、ＭＥＤ２３、ＭＥＤ２４、ＭＥＤ２５、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ２８、ＭＥＤ２９、ＭＥＤ３０、ＭＥＤ３１、ＣＣＮＣ、及びＣＤＫ８。例えば、ヒトメディエーターの組成的に異なる形態は、安定な実体として単離することができ、最も一般的なものは、２６サブユニットの「コア」複合体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレビシエ）における２１サブユニット）及び２９サブユニットの「ＣＤＫ８－メディエーター」複合体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける２５サブユニット）である。ヒトコアメディエーター複合体のサブユニット組成には、ＭＥＤ１、ＭＥＤ４、ＭＥＤ６、ＭＥＤ７、ＭＥＤ８、ＭＥＤ９、ＭＥＤ１０、ＭＥＤ１１、ＭＥＤ１４、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ１８、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２０、ＭＥＤ２１、ＭＥＤ２２、ＭＥＤ２３、ＭＥＤ２４、ＭＥＤ２５、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ２８、ＭＥＤ２９、ＭＥＤ３０、及びＭＥＤ３１が含まれる。ヒトＣＤＫ８－メディエーター複合体のサブユニット組成には、ＣＤＫ８、ＣＣＮＣ、ＭＥＤ１２、及びＭＥＤ１３が含まれる。更に、Ｍｅｄ２、Ｍｅｄ３及びＭｅｄ５と呼ばれる３つの真菌特異的な構成要素が存在する。

【0067】

構造的に、メディエーターは、ヘッドモジュール、ミドルモジュール、テールモジュール、及び一過性に結合したＣＤＫ８キナーゼモジュールの４つの主要部分に分けることができる。ヘッドモジュール及びミドルモジュールは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと直接相互作用し、細長いテールモジュールは、遺伝子特異的な調節タンパク質と相互作用する。ＣＤＫ８モジュールを含むメディエーターは、転写活性化の支持において、このモジュールを欠くメディエーターよりも活性が低い。ヘッドモジュールには、ＭＥＤ６、ＭＥＤ８、ＭＥＤ１１、ＳＲＢ４／ＭＥＤ１７、ＳＲＢ５／ＭＥＤ１８、ＳＲＢ２／ＭＥＤ２０及びＳＲＢ６／ＭＥＤ２２が含まれる。ミドルモジュールには、ＭＥＤ１、ＭＥＤ４、ＮＵＴ１／ＭＥＤ５、ＭＥＤ７、ＣＳＥ２／ＭＥＤ９、ＮＵＴ２／ＭＥＤ１０、ＲＯＸ３／ＭＥＤ１９、ＳＲＢ７／ＭＥＤ２１、ＭＥＤ２６、及びＳＯＨ１／ＭＥＤ３１が含まれる。ＣＳＥ２／ＭＥＤ９は、ＭＥＤ４と直接相互作用する。テールモジュールには、ＭＥＤ２、ＰＧＤ１／ＭＥＤ３、ＭＥＤ５、ＧＡＬ１１／ＭＥＤ１５、ＳＩＮ４／ＭＥＤ１６、ＭＥＤ２３、ＭＥＤ２４、ＭＥＤ２５、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ２８、及びＭＥＤ３０が含まれる。バックボーンはＭＥＤ１４から構成される。ＣＤＫ８モジュールは、ＭＥＤ１２（又はＭＥＤ１２Ｌ）、ＭＥＤ１３（又はＭＥＤ１３Ｌ）、ＣＣＮＣ、及びＣＤＫ８（又はＣＤＫ１９）を含有する。更に、１つ以上の異なるサブユニットを欠くメディエーター複合体の個々の調製物は、ＡＲＣ、ＣＲＳＰ、ＤＲＩＰ、ＰＣ２、ＳＭＣＣ及びＴＲＡＰと様々に呼ばれている。ヒト及び他の真核生物におけるメディエーター複合体に関する更なる情報は、例えば、Ｐｏｓｓ Ｚ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；４８（６）：５７５－６０８）及びＡｌｌｅｎ Ｂ．Ｌ．ａｎｄ Ｔａａｔｊｅｓ Ｄ．Ｊ．（Ｔｈｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｒ；１６（３）：１５５－１６６）による総説に見出すことができ、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。

【0068】

増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための方法。
本明細書でより詳細に説明するように、本開示のいくつかの実施形態は、増強されたエフェクター機能を有する改変免疫細胞を生成するための様々な方法であって、免疫細胞中の１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの量を調節することができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む、様々な方法を提供する。メディエーター複合体サブユニットの量に関して「調節する」という用語は、メディエーター複合体サブユニットの発現量（例えば、転写及び／又は翻訳、少なくとも１つの生物学的活性量（例えば、その天然リガンドへの結合）の変更を指す。調節には、メディエーター複合体サブユニットの量の増加（例えば、誘導、刺激）及び減少（例えば、低減、阻害）をどちらも行うこと、又は他の方法で影響を与えることが含まれる。例えば、ＭＥＤ１過剰発現により、ＪＵＮ、ＥＧＦＲ、及び他の増殖関連遺伝子の発現が増加する場合があることが報告されている。ＭＥＤ１は、乳癌の５０％において過剰発現している。ＭＥＤ２０及びＭＥＤ３１の過剰発現は骨肉腫において記載されており、一部のサブユニットの過剰発現が増殖を増加させる場合があるという考えを更に裏付けている。いくつかの実施形態において、本方法は、免疫細胞において１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量を誘導することができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＭＥＤ１、ＭＥＤ２０、ＭＥＤ３１、又はそれらのいずれかの組み合わせを誘導することができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、免疫細胞において１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減（例えば、緩和）することができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。開示される方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、免疫細胞において１つ以上のメディエーター複合体サブユニットをコードする１つ以上の内因性遺伝子の発現量の低減（例えば、発現の緩和）をもたらす核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、核酸及び／又はポリペプチドを導入することにより、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量が、対照（例えば、非改変免疫細胞又は非形質導入免疫細胞）と比較して、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％低減する。いくつかの実施形態において、核酸及び／又はポリペプチドを導入することにより、対照（例えば、非改変免疫細胞又は非形質導入免疫細胞）と比較して、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％、又は約１００％の結果をもたらす。メディエーター複合体サブユニットの発現量が１００％低減している免疫細胞の例としては、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子がノックアウト又は欠失されている改変免疫細胞（例えば、ヌル変異体）が挙げられる。例えば、実施例３～１２も参照されたい。

【0069】

適切なメディエーター複合体サブユニットとしては、コアメディエーター複合体、ＣＤＫ８－メディエーターモジュール、ヘッドモジュール、ミドルモジュール、又はテールモジュールに属するメディエーター複合体サブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本方法は、コアメディエーター複合体のサブユニット、例えば、ＭＥＤ１、ＭＥＤ４、ＭＥＤ６、ＭＥＤ７、ＭＥＤ８、ＭＥＤ９、ＭＥＤ１０、ＭＥＤ１１、ＭＥＤ１４、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、ＭＥＤ１７、ＭＥＤ１８、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２０、ＭＥＤ２１、ＭＥＤ２２、ＭＥＤ２３、ＭＥＤ２４、ＭＥＤ２５、ＭＥＤ２６、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ２８、ＭＥＤ２９、ＭＥＤ３０、及びＭＥＤ３１の発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ヘッドモジュールに属し、ＭＥＤ６、ＭＥＤ８、ＭＥＤ１１、ＳＲＢ４／ＭＥＤ１７、ＳＲＢ５／ＭＥＤ１８、ＳＲＢ２／ＭＥＤ２０及びＳＲＢ６／ＭＥＤ２２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、バックボーンサブユニット、例えばＭＥＤ１４である。いくつかの実施形態は、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールに属し、ＭＥＤ１、ＭＥＤ４、ＮＵＴ１／ＭＥＤ５、ＭＥＤ７、ＣＳＥ２／ＭＥＤ９、ＮＵＴ２／ＭＥＤ１０、ＲＯＸ３／ＭＥＤ１９、ＳＲＢ７／ＭＥＤ２１、ＭＥＤ２６、及びＳＯＨ１／ＭＥＤ３１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ１９である。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールに属し、ＭＥＤ２、ＰＧＤ１／ＭＥＤ３、ＭＥＤ５、ＧＡＬ１１／ＭＥＤ１５、ＳＩＮ４／ＭＥＤ１６、ＭＥＤ２３、ＭＥＤ２４、ＭＥＤ２５、ＭＥＤ２７、ＭＥＤ２８、及びＭＥＤ３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、テールモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ１５である。いくつかの実施形態において、テールモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ１６である。いくつかの実施形態において、テールモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、テールモジュールのサブユニットは、ＭＥＤ２７である。

【0070】

いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュール（ＣＫＭ）に属し、ＭＥＤ１２（又はＭＥＤ１２Ｌ）、ＭＥＤ１３（又はＭＥＤ１３Ｌ）、ＣＣＮＣ、及びＣＤＫ８（又はＣＤＫ１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＫＭのサブユニットは、ＭＥＤ１２である。いくつかの実施形態において、ＣＫＭのサブユニットは、ＭＥＤ１３である。いくつかの実施形態において、ＣＫＭのサブユニットは、ＣＣＮＣである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールのサブユニットは、ＣＤＫ８である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールのサブユニットは、ＣＤＫ１９である。

【0071】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、免疫細胞において１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減（例えば、緩和）することができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含み、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットは、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。

【0072】

いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、テールモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＭＥＤ１２である。

【0073】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、免疫細胞において１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量を低減させることができる核酸及び／又はポリペプチドを免疫細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有し、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列へのポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内のその標的配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座内の標的配列に対して、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのミスマッチを除いて１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、標的配列は、内因性ゲノム遺伝子座のプロモーター領域内、例えば、転写開始部位の上流１ｋｂ内にある。いくつかの実施形態において、標的配列は、内因性ゲノム遺伝子座のコード領域内にある。

【0074】

例えば、いくつかの実施形態において、核酸は、関連するポリペプチド（例えば、部位指向性エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向させることができるゲノム標的化核酸に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書の「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」である。概して、ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列、及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を少なくとも有する。例えば、ＩＩ型系では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは二重鎖を形成する。両方の系において、二重鎖は、部位指向性エンドヌクレアーゼと結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位指向エンドヌクレアーゼが複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位指向性エンドヌクレアーゼとの会合により、複合体に標的特異性を提供する。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位指向性エンドヌクレアーゼの活性を指向する。以下により詳細に記載されるように、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、本開示の方法の様々な実施形態において使用することができる。エンドヌクレアーゼの他の適切な形態としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｈＥＳ）若しくはＭｅｇａＴＡＬ、又はヌクレアーゼの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、二分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化核酸は、一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。二分子ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）は、２本のＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。ＩＩ型系における一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡに対する追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を有し得る。一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ以上のヘアピンを有する。Ｖ型系における一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を有する。

【0076】

例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さいＲＮＡは、以下に例示され、当技術分野において記載されるような化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、ポリヌクレオチドの長さが１００程度のヌクレオチドを大幅に超えるにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの手順（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）によるこのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。

【0077】

したがって、いくつかの実施形態において、核酸は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子座における１つ以上の分子変化（例えば、変異、欠失、挿入、Ｉｎ／Ｄｅｌ、置換）の導入を誘導することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に組み込まれる。

【0078】

いくつかの他の実施形態において、核酸は、免疫細胞内のメディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子座に１つ以上分子変化を導入することができるＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）ゲノム編集系に組み込まれる。いくつかの他の実施形態において、核酸は、免疫細胞において、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）によるＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集に組み込まれる。いくつかの他の実施形態において、核酸は、免疫細胞においてメディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子座の発現抑制を誘導することができるアンチセンス核酸分子に組み込まれる。いくつかの他の実施形態において、核酸は、免疫細胞においてメディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子座の発現抑制を引き起こすことができる二本鎖ＲＮＡｉ分子に組み込まれる。いくつかの他の実施形態において、核酸は、ヘアピン構造を通知することができ、ｍＲＮＡの抑制又は分解を誘導することができる一本鎖ＲＮＡ分子に組み込まれる。

【0079】

２つ以上のＤＮＡ配列を一緒に作動可能に連結するための基本的な技術は、当業者によく知られており、このような方法は、標準的な分子生物学的改変のための多くのテキストに記載されている。これらの核酸分子を構築及び特徴付けることができる分子技術及び方法は、以下及び本明細書中の実施例においてより詳細に記載される。

【0080】

本開示のいくつかの実施形態において、核酸は、異種核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、異種核酸配列は、転写制御要素又は選択マーカーのコード配列を含む。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットの内因性遺伝子座に相補的な十分な配列を有するポリヌクレオチド配列は、転写制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、転写制御要素は、プロモーター配列である。適切なプロモーターの非限定的な例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現量を高くすることができる強力な構成的プロモーター配列である。しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス最初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、延長因子－１αプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列もまた使用され得る。更に、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が望まれる場合に作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができる分子スイッチ、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0081】

いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する核酸は、発現カセット又は発現ベクターに組み込むことができる。発現カセットは概して、コード配列と、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏでの細胞内におけるコード配列の適切な転写及び／又は翻訳を指示するのに十分な調節情報とを含有する遺伝物質の構築物を含むことが理解されるであろう。概して、発現カセットは、所望の宿主細胞への標的化のためのベクターに、及び／又は所望の宿主細胞に、及び／又は個体に挿入することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の発現カセットは、本明細書に開示されるメディエーター複合体サブユニットの内因性遺伝子座に相補的な十分な配列を有するポリヌクレオチド配列を含み、これは、プロモーターなどの発現制御要素、及び任意選択で、コード配列の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列のいずれか又は組み合わせに作動可能に連結する。発現カセットは、１つ以上の核酸配列が機能的に作動可能な様式で、すなわち、作動可能に連結されている核酸分子を含む、ゲノム統合又は自律複製が可能な、任意の供給源に由来する、線状又は環状、一本鎖又は二本鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド分子として、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージに挿入することができる。

【0082】

本明細書に記載されるメディエーター複合体サブユニットの内因性遺伝子座に相補的な十分な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子を含有するベクター、プラスミド、又はウイルスも本明細書において提供される。核酸分子は、例えば、ベクターで形質転換／形質導入された細胞において、それらの発現を指示することができるベクター内に含まれ得る。真核細胞及び原核細胞で使用するのに適したベクターは、当該分野で公知であり、そして市販されているか、又は当業者によって容易に調製される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｊｏｉｎｔｌｙ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｈｅｒｅｉｎ ａｓ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ（２０１４年までの付録を含む）；Ｂｏｌｌａｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．（１９９７）．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｆｅｒｒｅ，Ｆ．＆ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．（１９９４）．ＰＣＲ：ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ，（２０１４年までの付録を含む）；及びＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．（２００３）．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0083】

ＤＮＡベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって真核細胞に導入することができる。細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２、前出）及び他の標準的な分子生物学実験マニュアルで見出すことができ、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、バリスティック導入、ヌクレオポレーション、流体力学的ショック、及び感染がある。

【0084】

本開示において使用することができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、及びウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．），Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。例えば、本明細書に開示されるキメラ受容体は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、又はＨｅＬａ細胞）などの真核細胞において産生することができる。これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系を選択する際には、構成要素が互いに適合するように注意する必要がある。当業者であれば、このような判断が可能である。更に、発現系を選択する際にガイダンスが必要とされる場合、当業者は、Ｐ．Ｊｏｎｅｓ，「Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００９）を参考にすることができる。したがって、メディエーター複合体サブユニットの内因性遺伝子座に相補的な十分な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸配列を、ウイルスベクターに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、又はレトロウイルスに由来するウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、核酸は、ガイドＲＮＡ指向性ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックイン手順、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集、又はＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いたＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集、又はＴＡＬＥＮゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）における使用のための核構築物に組み込まれる。

【0085】

提供される核酸分子は、天然に存在する配列、又は天然に存在する配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のために同じポリペプチド、例えば抗体をコードする配列を含有し得る。これらの核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はホスホルアミダイトベースの合成によって産生されるものなどの合成ＤＮＡ）、又はこれらの種類の核酸内のヌクレオチドの組み合わせ若しくは改変からなり得る。更に、核酸分子は、二本鎖又は一本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか）であり得る。

【0086】

核酸分子は、ポリペプチド（例えば、抗体）をコードする配列に限定されない。また、コード配列（例えば、キメラ受容体のコード配列）の上流又は下流に位置する非コード配列の一部又は全部を含めることもできる。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための日常的な手順に精通している。例えば、核酸分子は、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理することによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生され得る。

【0087】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、又はマクロファージである。いくつかの特定の実施形態において、免疫細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、Ｔリンパ球は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹メモリーＴ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性リンパ球細胞である。いくつかの実施形態において、リンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹メモリーＴ細胞、及びバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態において、動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、対象から得られたサンプルに対して行われる白血球アフェレーシスによって得られる。

【0088】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）若しくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの１つ以上の組換え免疫受容体、及び／又はそれをコードする核酸を、免疫細胞に導入することを更に含む。例えば、免疫細胞は、抗原特異的受容体、例えば、抗原又はそのエピトープを免疫学的に認識及び／又はそれに特異的に結合できる受容体を含みかつ／又は発現することができ、その結果、抗原特異的受容体と抗原又はそのエピトープとの結合が免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態において、抗原特異的受容体は、癌抗原、例えば腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗原特異性を有する。

【0089】

いくつかの実施形態において、抗原特異的受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＴＣＲは概して、ＴＣＲのα－鎖、ＴＣＲのβ－鎖、ＴＣＲのγ－鎖、ＴＣＲのδ－鎖、又はこれらの組み合わせなどの２つのポリペプチド（例えば、ポリペプチド鎖）を含む。このようなＴＣＲのポリペプチド鎖は、当技術分野において公知である。抗原特異的ＴＣＲは、ＴＣＲが癌抗原又はそのエピトープなどの抗原に特異的に結合及び／又はそれを免疫学的に認識することができるという条件で、任意のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、内因性ＴＣＲ、例えば、Ｔ細胞に対して内因性又はネイティブ（自然に存在する）であるＴＣＲである。このような場合、内因性ＴＣＲを発現するＴ細胞は、特定の癌抗原を発現することが知られている哺乳動物から単離されたＴ細胞であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、癌を有する哺乳動物から単離された初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＴＩＬ又はヒト癌患者から単離されたＴ細胞である。

【0090】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、かつ／又は発現する。概ね、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに融合した抗原結合ドメイン、例えば抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。この場合、ＣＡＲの抗原特異性は、抗原又はそのエピトープに特異的に結合するｓｃＦｖによってコードされ得る。ＣＡＲ及びそれらを作製する方法は、当技術分野において公知である。

【0091】

いくつかの実施形態において、免疫細胞は、外因性（例えば、組換え）抗原特異的受容体をコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、このような外因性抗原特異的受容体、例えば、外因性ＴＣＲ及びＣＡＲは、内因性ＴＣＲが天然で特異的である抗原を超えて、更なる抗原に対する特異性をＴ細胞に付与することができる。

【0092】

いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現量が低減することにより、例えば、参照対照細胞、例えば、メディエーター複合体サブユニットのネイティブな発現量を有する細胞におけるこれらの分子の産生と比較して、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及び／又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）の産生増加によって示されるように、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能が改善される。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現が低減することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖能が高くなる。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現が低減することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能が増強され、例えば、成長速度（増殖）、サイトカイン産生、標的細胞阻害（例えば、抗癌細胞傷害性）、マクロファージ活性化、Ｔ細胞活性化、ＮＫ細胞活性化、及びｉｎ ｖｉｖｏ持続性（例えば、生存）が増加する。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現が低減することにより、エフェクターメモリーＴ細胞表現型が増加する。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの発現が低減することにより、酸素消費速度及び細胞外酸性化速度が増加する。

【0093】

一態様において、本明細書で提供されるのは、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットの量を低減（例えば、緩和）するように改変された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、テールモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣである。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＭＥＤ１２である。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の方法によって産生された、改変免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、疲弊した免疫細胞又は疲弊していない免疫細胞である。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの改変免疫細胞及び培養培地を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するために適切な方法及び系は、当該分野で公知である。

【0094】

本開示の組成物
本開示の改変免疫細胞及び核酸は、医薬組成物を含む組成物に組み込むことができる。このような組成物は、概して、本開示の１つ以上の改変免疫細胞及び核酸を含み得る。したがって、一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、ａ）本開示の改変免疫細胞；及び／又はｂ）１つ以上のメディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸を含む、組成物に関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。

【0095】

医薬組成物
本開示の改変免疫細胞及び核酸は、医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、概して、本開示の１つ以上の改変免疫細胞及び核酸、並びに薬学的に許容される賦形剤、例えば、担体を含み得る。したがって、一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、薬学的に許容される賦形剤と、ａ）本開示の改変免疫細胞；及び／又はｂ）１つ以上のメディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸と、を含む、医薬組成物に関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットは、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、テールモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣである。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＭＥＤ１２である。

【0096】

本明細書に記載される医薬組成物の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上のメディエーター複合体サブユニットをコードする核酸分子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現カセット又は発現ベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターである。

【0097】

いくつかの実施形態において、核酸分子を、宿主免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞に導入して、核酸を含む組換え（例えば、改変）免疫細胞を産生することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0098】

本開示の核酸分子の細胞への導入は、当業者に公知の方法、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって達成することができる。

【0099】

したがって、いくつかの実施形態において、核酸分子は、当該分野で公知のウイルス送達ビヒクル又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。例えば、核酸分子は、宿主ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、又はエピソーム的に複製され得るか、又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして宿主細胞中に存在し得る。したがって、いくつかの実施形態において、核酸分子は、エピソーム単位として宿主細胞中で維持及び複製される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定な組み込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術を用いて、又はガイドＲＮＡ指向性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集、若しくはＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）を用いたＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集、若しくはＴＡＬＥＮゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）などのより正確な技術を用いて達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして宿主細胞中に存在する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座を標的として発現を抑制するアンチセンス核酸分子に組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、メディエーター複合体サブユニットをコードする内因性ゲノム遺伝子座を標的として発現を抑制する二本鎖干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子に組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、メディエーター複合体サブユニットをコードするｍＲＮＡを標的とし分解することができるヘアピン構造を有するＲＮＡ分子に組み込まれる。

【0100】

核酸分子は、ウイルスカプシド、若しくはリポソーム、若しくは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入することができ、又はエレクトロポレーションなどの当技術分野で公知のウイルス若しくは非ウイルス送達手段及び方法によって送達することができる。例えば、細胞への核酸の導入は、ウイルス形質導入によって達成され得る。非限定的な例において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ウイルス形質導入を介して標的細胞に核酸を送達するように改変される。いくつかのＡＡＶ血清型が記載されており、公知の血清型の全てが、複数の多様な組織型の細胞に感染し得る。ＡＡＶは、毒性を示すことなく、ｉｎ ｖｉｖｏで広範な種及び組織に形質導入することができ、比較的穏やかな自然免疫応答及び適応免疫応答を生じさせる。

【0101】

レンチウイルス由来のベクター系もまた、ウイルス形質導入による核酸送達及び遺伝子治療に有用である。レンチウイルスベクターは、遺伝子送達ビヒクルとしていくつかの魅力的な特性を提供し、これには以下が含まれる：（ｉ）宿主ゲノムへの安定なベクターの組み込みによる持続的な遺伝子送達、（ｉｉ）分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力、（ｉｉｉ）重要な遺伝子及び細胞療法の標的細胞型を含む広範な組織向性、（ｉｖ）ベクター形質導入後にウイルスタンパク質を発現しないこと、（ｖ）ポリシストロン性配列又はイントロン含有配列などの複雑な遺伝要素を送達する能力、（ｖｉ）潜在的により安全な組み込み部位プロファイル、並びに（ｖｉｉ）ベクター改変及び産生のための比較的容易な系。

【0102】

いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の少なくとも１つの改変免疫細胞、及び薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの改変免疫細胞は、対象に導入された場合に増強されたエフェクター機能を示す。改変免疫細胞において増強されるエフェクター機能の例としては、成長速度（増殖）、サイトカイン産生、標的細胞阻害（例えば、抗癌細胞傷害性）、マクロファージ活性化、Ｔ細胞活性化、ＮＫ細胞活性化、及びｉｎ ｖｉｖｏ持続性（例えば、生存）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの改変免疫細胞により、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、及び／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生が増加する。

【0103】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による医薬組成物は、それを必要とする個体への投与前に、洗浄、処理、組み合わせ、補充、又は他の方法で変更することができる改変免疫細胞の培養物を含む。更に、投与は、様々な用量、時間間隔で、又は複数回投与であり得る。

【0104】

本明細書で提供される医薬組成物は、組成物が対象に投与されることを可能にする任意の形態であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、医薬組成物は、ヒトへの投与に適している。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の全般的に認められている薬局方に記載されていることを意味する。担体は、医薬組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルであり得る。生理食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、注射用溶液を含む液体担体として使用することができる。適切な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。適切な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著）に記載されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、個体への投与のために無菌的に製剤化される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。当業者であれば、製剤が投与様式に適合する必要があることを理解するであろう。

【0105】

いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、個体への意図された投与経路に適するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口投与、腹腔内投与、結腸直腸投与、腹腔内投与、及び腫瘍内投与に適するように製剤化することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、又は腫瘍内投与用に製剤化され得る。

【0106】

注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌である必要があり、容易に注射できる程度に流動的である必要がある。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の夾雑作用から保護する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムの使用によって、維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、概して、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び／又は塩化ナトリウムを組成物中に含める。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

【0107】

滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。概して、分散液は、塩基性分散媒及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。

【0108】

いくつかの実施形態において、本開示の改変免疫細胞は、当業者に公知の技術を用いて対象への投与のために製剤化することができる。例えば、改変免疫細胞の集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。製剤中に含まれる賦形剤は、例えば、使用する改変免疫細胞及び投与様式によって目的が異なる。全般的に使用される賦形剤の例としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存剤、等張化剤、増量剤、並びに滑沢剤が挙げられる。改変免疫細胞を含む製剤は、非ヒト成分の非存在下で、例えば動物血清の非存在下で調製及び培養されたものであり得る。製剤は、改変免疫細胞の１つの集団、又は改変免疫細胞の２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の集団を含み得る。

【0109】

改変免疫細胞の集団を含む製剤は、当業者に公知の様式及び技術を用いて対象に投与することができる。例示的な様式としては、静脈内注射が挙げられるが、これに限定されない。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（Ｓ．Ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ－Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液内（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内、及び髄腔内（髄液）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤の非経口注射又は注入に有用なデバイスを用いて、このような投与を行うことができる。

【0110】

治療方法
本明細書に記載される治療用組成物、例えば、改変免疫細胞、核酸、及び医薬組成物のいずれか１つの投与は、増殖性疾患（例えば、癌）、自己免疫疾患、及び微生物感染（例えば、ウイルス感染）などの関連する健康状態の治療において、患者の治療に用いることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の改変免疫細胞、核酸、及び医薬組成物は、増殖性疾患（例えば、癌）、自己免疫疾患、及び慢性感染症などの１つ以上の健康状態を有する対象、有する疑いがある対象、又はその発症のリスクが高い場合がある対象を治療する方法において使用するための治療薬に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、個体は、医師の管理下にある患者である。

【0111】

したがって、一態様において、本開示のいくつかの実施形態は、健康状態の予防及び／又は治療を必要とする対象において、その健康状態を予防及び／又は治療するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に本開示の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本開示の改変免疫細胞を含む組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、メディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む核酸を含む組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、メディエーター複合体のミドルモジュールサブユニット、テールモジュールサブユニット、及びサイクリン依存性キナーゼ８（ＣＤＫ８）モジュールサブユニットから選択されるメディエーター複合体サブユニットをコードするゲノム遺伝子座内の標的配列に対して十分な配列相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、ＭＥＤ１３、ＭＥＤ１３Ｌ、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ミドルモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ミドルモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１９又はＭＥＤ２６である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、テールモジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、テールモジュールサブユニットは、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、又はＭＥＤ２４である。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＤＫ８モジュールサブユニットである。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ８モジュールサブユニットは、ＣＣＮＣ、ＣＤＫ１８、ＣＤＫ１９、ＭＥＤ１２、ＭＥＤ１２Ｌ、及びＭＥＤ１３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＣＣＮＣである。いくつかの実施形態において、メディエーター複合体サブユニットは、ＭＥＤ１２である。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、本方法は、治療有効量の本開示の組成物（例えば、改変免疫細胞、核酸分子、及び医薬組成物）を、それを必要とする対象に投与することを含む。本開示の対象の改変免疫細胞又は医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」、又は「薬学的有効量」という用語は、概して、改変免疫細胞集団又は医薬組成物が存在しない場合と比較して、明示された目的を達成する（例えば、それが投与される効果の達成、疾患の治療、シグナル伝達経路の低減、又は疾患若しくは健康状態の１以上の症状の軽減）ために、改変免疫細胞の集団又は医薬組成物が十分である量又は数を指す。「有効量」の例は、疾患の症状又は複数の症状の治療、予防、又は低減に寄与するのに十分な量であり、これは「治療有効量」とも呼ばれ得る。症状の「低減」とは、症状の重症度若しくは頻度が減少すること、又は症状が消失することを意味する。「治療有効量」を含むＴ細胞集団又は組成物の正確な量は、治療の目的に依存し、当業者であれば公知の技術を用いて確認できるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（Ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。

【0113】

本明細書に記載される治療方法の非限定的な例示的実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、健康状態は、増殖性疾患又は感染症である。例示的な増殖性疾患としては、限定されないが、血管新生疾患、転移性疾患、腫瘍形成性疾患、腫瘍性疾患及び癌が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、小児癌である。いくつかの実施形態において、癌は、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、中皮腫、乳癌、尿路上皮癌、肝臓癌、頭頸部癌、肉腫、子宮頸癌、胃癌、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆管癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、及び神経膠芽腫である。いくつかの実施形態において、癌は、白血病である。

【0114】

いくつかの実施形態において、癌は、多剤耐性癌又は再発性癌である。本明細書に開示される組成物及び方法は、非転移性癌及び転移性癌の両方に適していることが企図される。したがって、いくつかの実施形態において、癌は、非転移性癌である。いくつかの他の実施形態において、癌は、転移性癌である。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、対象における癌の転移を阻害する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象における腫瘍成長を阻害する。

【0115】

例示的な増殖性疾患としては、限定されないが、血管新生疾患、転移性疾患、腫瘍形成性疾患、腫瘍性疾患及び癌が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、癌である。「癌」という用語は、概して、異常細胞の急速かつ無制限な成長を特徴とする疾患を指す。異常細胞は、固形腫瘍を形成し得るか、又は血液学的悪性腫瘍を構成し得る。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を介して身体の他の部分に拡散し得る。本開示の組成物及び方法によって治療することができる癌に関して、特定の制限はない。適切な癌の非限定的な例としては、卵巣癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌などが挙げられる。

【0116】

本開示の組成物及び方法で適切に治療され得る他の癌としては、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、子宮頸癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）、眼癌、移行上皮癌、腟癌、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌及び下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮肉腫）、移行上皮癌、腟癌、外陰癌、中皮腫、扁平上皮細胞若しくは類表皮癌、気管支腺腫、絨毛癌、頭頸部癌、奇形癌、又はワルデンシュトレームマクログロブリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、骨肉腫である。

【0117】

特に適切な癌としては、乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、中皮腫、白血病、リンパ腫、脳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、黒色腫、膀胱癌、骨肉腫、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、腎腫瘍、神経芽細胞腫、及び癌腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0118】

いくつかの実施形態において、癌は、多剤耐性癌又は再発性癌である。本明細書に開示される組成物及び方法は、非転移性癌及び転移性癌の両方に適していることが企図される。したがって、いくつかの実施形態において、癌は、非転移性癌である。いくつかの他の実施形態において、癌は、転移性癌である。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、対象における癌の転移を阻害する。例えば、いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、対象における転移性結節を低減させることができる。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、対象における腫瘍成長を阻害する。

【0119】

いくつかの実施形態において、増殖性疾患は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、インスリン依存性真性糖尿病、溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、クローン病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、円形脱毛症、乾癬、白斑、栄養障害型表皮水疱症、全身性紅斑性狼瘡、中等度から重度の尋常性乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び移植片対宿主病からなる群から選択される。

【0120】

いくつかの実施形態において、投与された組成物は、標的癌細胞の増殖を阻害し、かつ／又は対象における癌の腫瘍成長を阻害する。例えば、標的細胞は、その増殖が低減する場合、その病理学的又は病原性挙動が低減する場合、標的細胞が破壊又は死滅する場合などで阻害されることがある。阻害には、測定された病理学的又は病原性挙動の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％の低減が含まれる。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示される有効数の改変免疫細胞を個体に投与することを含み、改変免疫細胞は、改変免疫細胞を投与されていない対象における標的細胞の増殖及び／又は標的癌の腫瘍成長と比較して、対象における標的細胞の増殖を阻害し、及び／又は標的癌の腫瘍成長を阻害する。

【0121】

本明細書に記載される組成物、例えば、改変免疫細胞、核酸、及び医薬組成物の投与は、免疫応答の刺激において使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される改変免疫細胞、核酸、及び／又は医薬組成物のうちの１つ以上は、化学療法による癌の寛解誘導後、又は自己若しくは同種造血幹細胞の移植後に個体に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載れる組成物は、本明細書に開示される治療用組成物のうちの１つを投与されていない対象におけるこれらの分子の産生と比較して、投与された対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及び／又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）の産生の増加を必要としている対象に投与される。

【0122】

いくつかの実施形態において、投与される組成物は、免疫細胞の増強されたエフェクター機能を付与する。改変免疫細胞において増強され得る免疫細胞のエフェクター機能の例としては、成長速度（増殖）、死滅速度、死滅速度の型、標的細胞阻害（細胞傷害性）、標的細胞死滅、標的細胞生存、分化クラスター変化、マクロファージ活性化、Ｂ細胞活性化、サイトカイン産生、ｉｎ ｖｉｖｏ持続性が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、増加したエフェクターメモリーＴ細胞表現型を付与する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、増加した酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を付与する。いくつかの実施形態において、本開示の組成物を含む免疫細胞のエフェクター機能は、基準免疫細胞と比較して、少なくとも１０％高い、例えば、約１０％より少なくとも約１０％より高い、少なくとも約２０％より高い、少なくとも約３０％より高い、少なくとも約４０％より高い、少なくとも約５０％より高い、少なくとも約６０％より高い、少なくとも約７０％より高い、少なくとも約８０％より高い、少なくとも約９０％より高い、少なくとも約２倍より高い、約３倍より高い、約４倍より高い、約５倍より高い、約６倍より高い、約７倍より高い、約８倍より高い、約９倍より高い、約２０倍より高い、約５０倍より高い、約１００倍より高い、又は約２００倍より高いレベルで増強される。いくつかの実施形態において、基準免疫細胞は、本開示の組成物を含まない。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、免疫細胞における増加した解糖フラックスを付与する。いくつかの実施形態において、投与された組成物は、基準免疫細胞（例えば、非改変免疫細胞又は非形質導入免疫細胞）と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、又は約２００倍増加した解糖フラックスを付与する。

【0123】

本明細書に記載される組成物、例えば、改変免疫細胞、核酸、及び／又は医薬組成物の有効量は、意図される目標、例えば、癌の退縮に基づいて判断することができる。例えば、既存の癌が治療されている場合、本明細書に開示される組成物の投与量は、組成物の投与が癌の予防のためである場合よりも多くなり得る。当業者は、本開示を考慮して、組成物の投与量及び投与頻度を判断することができるであろう。また、投与量は、投与回数及び用量の両方に応じて、投与される個体、個体の状態、及び望まれる保護により異なる。組成物の正確な量はまた、医師の判断に依存し、対象ごとに固有である。投与頻度は、医師の判断に応じて、１～２日から、２～６時間まで、６～１０時間まで、１～２週間まで、又はそれ以上の範囲であり得る。

【0124】

組成物の投与量の判断は、当業者によって行われ、癌の程度及び重症度、並びに改変免疫細胞が既存の癌の治療又は癌の予防のために投与されるかどうかに部分的に依存する。例えば、予防を目的とする場合には、投与間隔を長くし、組成物の量を少なくすることが採用できる。例えば、１回当たりの組成物の投与量は、活動性疾患の治療において投与される用量の５０％であり得、投与は週１回の間隔であり得る。当業者であれば、本開示に照らして、組成物の有効量及び投与頻度を判断することができるであろう。この判断は、存在する特定の臨床状況（例えば、癌の種類、癌の重症度）に部分的に依存する。

【0125】

いくつかの実施形態において、治療対象、例えば、患者に本明細書に開示される組成物の連続供給を提供することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、関心領域（腫瘍等）の連続灌流が好適であり得る。灌流の期間は、特定の対象及び状況に対して臨床医によって選択されるが、時間は、約１～２時間から、２～６時間まで、約６～１０時間まで、約１０～２４時間まで、約１～２日まで、約１～２週間まで、又はそれ以上の範囲であり得る。概して、連続灌流による組成物の用量は、単回又は複数回の注射によって与えられる用量と同等であり、用量が投与される期間に合わせて調整される。

【0126】

いくつかの実施形態において、投与は静脈内注入によるものである。本明細書に開示される改変免疫細胞、核酸、及び／又は医薬組成物の有効量は、意図される目標、例えば、腫瘍退縮に基づいて判断することができる。例えば、既存の癌が治療される場合、投与される細胞の数は、本明細書に開示される改変免疫細胞の投与が癌の予防のためである場合よりも多くなり得る。当業者であれば、本開示を考慮して、投与される細胞数及び投与頻度を判断することができるであろう。また、投与量は、投与回数及び用量の両方に応じて、投与される個体、個体の状態、及び望まれる保護により異なる。治療用組成物の正確な量もまた、医師の判断に依存し、個体ごとに固有である。投与頻度は、医師の判断に応じて、１～２日から、２～６時間まで、６～１０時間まで、１～２週間まで、又はそれ以上の範囲であり得る。概して、連続灌流による治療用組成物の用量は、単回又は複数回の注射によって与えられる用量と同等であり、用量が投与される期間に合わせて調整される。

【0127】

改変免疫細胞の対象への投与
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、本明細書で提供される有効量又は有効数の改変免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを伴う。この投与工程は、当該分野における任意の移植送達方法を用いて達成することができる。例えば、改変免疫細胞は、対象の血流に直接注入され得るか、又は他の方法で対象に投与され得る。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、所望の効果が生じるように、所望の部位に導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路によって、改変免疫細胞を個体に投与することを含み、この用語は、「導入する」、「埋め込む」、及び「移植する」という用語と互換的に使用される。改変免疫細胞又はそれらの分化した子孫は、投与された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部分が生存したままである個体の所望の位置に送達する任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間という短いものから、数日、数年、又は更に個体の一生、例えば長期生着であり得る。

【0129】

予防的に提供される場合、本明細書に記載される改変免疫細胞は、治療される疾患又は健康状態のあらゆる症状の前に、対象に投与することができる。したがって、いくつかの実施形態において、改変免疫細胞集団の予防的投与は、疾患又は健康状態の症状の発生を予防する。

【0130】

いくつかの実施形態において治療的に提供される場合、改変免疫細胞は、疾患又は健康状態の症状又は徴候の発症時（又は発症後）に、例えば、疾患又は健康状態の発症時に提供される。

【0131】

本明細書に記載される様々な実施形態において使用するために、本明細書に開示される改変免疫細胞の有効量は、少なくとも１０^２細胞、少なくとも５×１０^２細胞、少なくとも１０^３細胞、少なくとも５×１０^３細胞、少なくとも１０^４細胞、少なくとも５×１０^４細胞、少なくとも１０^５細胞、少なくとも２×１０^５細胞、少なくとも３×１０^５細胞、少なくとも４×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも６×１０^５細胞、少なくとも７×１０^５細胞、少なくとも８×１０^５細胞、少なくとも９×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも２×１０^６細胞、少なくとも３×１０^６細胞、少なくとも４×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも６×１０^６細胞、少なくとも７×１０^６細胞、少なくとも８×１０^６細胞、少なくとも９×１０^６細胞、又はその倍数であり得る。

【0132】

いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、治療を必要とする対象にとって非自己細胞である。いくつかの実施形態において、養子細胞療法は、同種養子細胞療法である。例えば、いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、治療を必要とする対象に対して同種細胞である。同種養子細胞療法では、改変免疫細胞は、養子細胞療法を受ける個体に由来しない。同種細胞療法は、概して、免疫細胞を提供する個体（ドナー）が、細胞療法を受ける個体とは異なる（同じ種の）個体である療法を指す。例えば、個体に投与される改変免疫細胞の集団は、１人以上の血縁関係のないドナーに由来するか、又は１人以上の同一でない兄弟姉妹に由来する。したがって、改変免疫細胞は、１人以上のドナーに由来し得るか、又は自己供給源から得られ得る。いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、それを必要とする対象に投与する前に、培養において増殖される。

【0133】

いくつかの実施形態において、方法又は経路による対象への細胞組成物（例えば、本明細書に記載の細胞のいずれかによる複数の改変免疫細胞を含む組成物）を送達することにより、所望の部位における細胞組成物が少なくとも部分的に局在化する。改変免疫細胞を含む組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、例えば、投与は、送達された組成物の少なくとも一部分、例えば、少なくとも１×１０^４個の細胞が一定期間、所望の部位に送達される、対象における所望の部位への送達をもたらす。投与様式としては、注射、注入、点滴注入が挙げられる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、経路は静脈内である。細胞の送達では、注射又は注入による送達が標準的な投与様式と見なされることが多い。

【0134】

いくつかの実施形態において、改変免疫細胞は、例えば、注入又は注射を介して全身投与される。例えば、本明細書に記載される改変免疫細胞の集団は、対象の循環系に入ることにより代謝及び他の類似の生物学的プロセスに供されるように、標的部位、組織、又は器官に直接投与される以外の方法で投与される。

【0135】

疾患又は健康状態の予防又は治療のための、本明細書で提供される組成物のいずれかを含む治療の有効性は、熟練した臨床医によって判断することができる。しかし、当業者であれば、疾患の徴候又は症状又はマーカーのいずれか１つ又は全てが改善又は寛解される場合、予防又は治療が有効である見なされることを理解するであろう。有効性は、入院又は医学的介入の必要性の減少により評価された場合、対象が悪化し得ない（例えば、疾患の進行が停止するか、又は少なくとも遅くなる）ことによっても測定できる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、かつ／又は本明細書に記載されている。治療には、対象又は動物（いくつかの非限定的な例としては、ヒト又は哺乳動物が挙げられる）における疾患の任意の治療が含まれ、また、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を停止すること若しくは遅らせること；又は（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の退縮を引き起こすこと；及び（３）症状の発症を予防すること若しくはその可能性を低減することが含まれる。

【0136】

有効性の程度の測定は、治療される疾患及び経験した症状に関して選択されるパラメータに基づく。概して、疾患の程度又は重症度と相関することが知られているか又は認められているパラメータ、例えば、医学界において認められているか又は使用されているパラメータが選択される。例えば、固形癌の治療において、適切なパラメータは、転移の数及び／又はサイズの低減、無増悪生存期間の月数、全生存期間、疾患のステージ又はグレード、疾患進行速度、診断バイオマーカーの低減（例えば、限定されないが、循環腫瘍ＤＮＡ又はＲＮＡの低減、循環無細胞腫瘍ＤＮＡ又はＲＮＡの低減など）、及びこれらの組み合わせを含み得る。有効用量及び有効性の程度は、概して、単一の対象及び／又は対象の群若しくは集団に関連して判断されることが理解されるであろう。本開示の治療方法は、症状及び／又は疾患重症度及び／又は疾患バイオマーカーを、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％低減する。

【0137】

上述のように、医薬組成物の治療有効量は、疾患又は健康状態を有するか、有する疑いがあるか、又はそのリスクがある人などの対象に投与したときに、特定の有益な効果を促進するのに十分な医薬組成物の量であり得る。いくつかの実施形態において、有効量は、疾患若しくは健康状態の症状の発症を予防若しくは遅延させる、疾患若しくは健康状態の症状の経過を変化させる（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）、又は疾患若しくは健康状態の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の場合について、適切な有効量は、日常的な実験を用いて当業者によって判断され得ることが理解される。

【0138】

追加療法
上述したように、本明細書に開示される組成物、例えば、改変免疫細胞及び医薬組成物のいずれか１つは、それを必要とする対象に、単一の療法（例えば、単剤療法）として投与することができる。加えて又はあるいは、本開示のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変免疫細胞及び医薬組成物の１つ以上を、１つ以上の追加の療法、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの追加の療法と組み合わせて対象に投与することができる。本開示の組成物と組み合わせて施される適切な療法としては、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び手術が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な療法には、化学療法剤、抗癌剤、及び抗癌療法剤などの治療薬が含まれる。

【0139】

１つ以上の追加の療法「と組み合わせた」投与には、同時（並行）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、及び手術からなる群から選択される。本明細書で使用される化学療法という用語は、抗癌剤を包含する。本明細書に開示される方法には、様々な種類の抗癌剤を適切に使用することができる。抗癌剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン、抗体（例えば、モノクローナル又はポリクローナル抗体）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）又はＧｌｉｖｅｃ（登録商標）））、ホルモン治療、可溶性受容体、及び他の抗悪性腫瘍薬が挙げられる。

【0140】

トポイソメラーゼ阻害剤もまた、本明細書で使用することができる別の種類の抗癌剤である。トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼを阻害すると、適切なＤＮＡのスーパーコイル化が乱れることにより、ＤＮＡの転写及び複製の両方に支障をきたす。一部のＩ型トポイソメラーゼ阻害剤には、イリノテカン及びトポテカンなどのカンプトテシンが含まれる。ＩＩ型阻害剤の例としては、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、及びテニポシドが挙げられる。これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｙａｐｐｌｅ（アメリカハッカクレン）（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ）の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシンの半合成誘導体である。

【0141】

抗悪性腫瘍薬としては、免疫抑制剤のダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドが挙げられる。抗悪性腫瘍化合物は、概して、細胞のＤＮＡを化学的に修飾することによって作用する。

【0142】

アルキル化剤は、細胞内に存在する条件下で多くの求核性官能基をアルキル化することができる。シスプラチン及びカルボプラチン、並びにオキサリプラチンはアルキル化剤である。これらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、及びホスフェート基と共有結合を形成することにより、細胞機能を損なう。

【0143】

ビンカアルカロイドは、チューブリン上の特定の部位に結合し、チューブリンの微小管への集合を阻害する（細胞周期のＭ期）。ビンカアルカロイドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンデシンが挙げられる。

【0144】

代謝拮抗物質は、プリン（アザチオプリン、メルカプトプリン）又はピリミジンに似ており、これらの物質が細胞周期の「Ｓ」期にＤＮＡに組み込まれるのを防ぎ、正常な発生及び分裂を停止させる。代謝拮抗物質はＲＮＡ合成にも影響を与える。

【0145】

植物アルカロイド及びテルペノイドは植物から得られ、微小管機能を妨げることによって細胞分裂をブロックする。微小管は細胞分裂に不可欠であるので、微小管なしでは、細胞分裂は起こり得ない。主な例は、ビンカアルカロイド及びタキサンである。

【0146】

ポドフィロトキシンは、消化を助けることが報告されている植物由来化合物であるだけなく、他の２つの細胞増殖抑制薬であるエトポシドとテニポシドの生成にも使用されている。これらは、細胞がＧ１期（ＤＮＡ複製の開始）及びＤＮＡの複製（Ｓ期）に入るのを妨げる。

【0147】

グループとしてのタキサンには、パクリタキセル及びドセタキセルが含まれる。パクリタキセルは、元々はタキソールとして知られていた天然物で、最初はタイヘイヨウイチイの樹皮から誘導された。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成類似体である。タキサンは微小管の安定性を高め、後期における染色体の分離を防ぐ。

【0148】

いくつかの実施形態において、抗癌剤は、レミケード、ドセタキセル、セレコキシブ、メルファラン、デキサメタゾン（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（登録商標））、ステロイド、ゲムシタビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、シクロホスファミド、テモダール、カルボプラチン、プロカルバジン、グリアデル、タモキシフェン、トポテカン、メトトレキサート、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、タキソール、タキソテール、フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、ゼローダ、ＣＰＴ－１１、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ（例えば、ＰＥＧ ＩＮＴＲＯＮ－Ａ）、カペシタビン、シスプラチン、チオテパ、フルダラビン、カルボプラチン、リポソームダウノルビシン、シタラビン、ドキセタキソール、パシリタキセル（pacilitaxel）、ビンブラスチン、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ダカルバジン、ビノレルビン、ゾレドロン酸、パルミトロネート（palmitronate）、ビアキシン、ブスルファン、プレドニゾン、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、ビスホスホネート、三酸化ヒ素、ビンクリスチン、ドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（登録商標））、パクリタキセル、ガンシクロビル、アドリアマイシン、エストラウスチンリン酸ナトリウム（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、スリンダク、エトポシド、及びこれらの任意の組み合わせから選択することができる。

【0149】

他の実施形態において、抗癌剤は、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、デキサメタゾン、ドキソルビシン、インターフェロン－アルファ、レナリドミド、メルファラン、ペグ化インターフェロン－アルファ、プレドニゾン、サリドマイド、又はビンクリスチンから選択することができる。

【0150】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される予防方法及び／又は治療方法は、免疫療法を更に含む。いくつかの実施形態において、免疫療法は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の投与を含む。したがって、本明細書に記載される治療方法のいくつかの実施形態は、１つ以上の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物の更なる投与を含む。免疫チェックポイント分子の非限定的な例としては、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫チェックポイント分子を阻害する化合物は、アンタゴニスト抗体を含む。本明細書に開示される組成物及び方法に適したアンタゴニスト抗体の例としては、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、トレメリムマブ、及びアベルマブが挙げられるが、これらに限定されない。

【0151】

いくつかの態様において、１つ以上の抗癌療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、放射線療法は、癌細胞を死滅させるための放射線の投与を含み得る。放射線は、ＤＮＡなどの細胞内の分子と相互作用して、細胞死を誘導する。放射線はまた、細胞膜及び核膜、並びに他の細胞小器官にも損傷を与え得る。放射線の種類によって、ＤＮＡ損傷のメカニズムが異なる場合があり、相対的な生物学的効果も異なる。例えば、重粒子（すなわち、陽子、中性子）はＤＮＡを直接損傷し、相対的な生物学的効果が大きくなる。電磁放射線は、主に細胞内の水分がイオン化することによって生じる短寿命のヒドロキシルフリーラジカルを介して間接的にイオン化をもたらす。放射線の臨床応用は、外部ビーム放射線（外部線源から）及び近接照射療法（患者に移植又は挿入された放射線源を使用する）で構成される。外部ビーム放射線は、Ｘ線及び／又はガンマ線で構成され、近接照射療法では崩壊してアルファ粒子又はベータ粒子をガンマ線とともに放出する放射性核種を用いる。また、本明細書において企図される放射線には、例えば、癌細胞への放射性同位体の指向性送達が含まれる。本明細書では、マイクロ波及びＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。

【0152】

放射線は、単回投与又は線量分割スケジュールで少量ずつ続けて投与することができる。本明細書で企図される放射線の量は、例えば、約５～約８０、約１０～約５０Ｇｙ、又は約１０Ｇｙを含む、約１～約１００Ｇｙの範囲である。総線量は、分割レジメンで適用することができる。例えば、レジメンは、２Ｇｙの分割された個別線量を含み得る。放射性同位体の線量範囲は多岐にわたり、同位体の半減期、並びに放出される放射線の強度及び種類によって異なる。放射線が放射性同位元素の使用を含む場合、同位体は、放射性ヌクレオチドを標的組織（例えば、腫瘍組織）に運ぶ治療用抗体などの標的化剤にコンジュゲートされ得る。

【0153】

本明細書に記載される手術は、癌性組織の全部又は一部が物理的に除去、施術、及び／又は破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術（モース手術）が含まれる。前癌又は正常組織の除去もまた本明細書において企図される。

【0154】

したがって、いくつかの実施形態において、本開示の方法は、単一療法（例えば、単剤療法）として、本明細書に開示される組成物を対象に個別に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、第２の療法と組み合わせた第１の療法として対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、及び手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１の療法及び第２の療法は、同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法は、第２の療法と同時に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法及び第２の療法は、連続的に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法は、第２の療法の前に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法は、第２の療法の後に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法は、第２の療法の前及び／又は後に施される。いくつかの実施形態において、第１の療法及び第２の療法は、交代で施される。いくつかの実施形態において、第１の療法及び第２の療法は、単一製剤で一緒に施される。

【0155】

キット
本明細書に記載の方法を実施するためのキットも本明細書で提供される。キットは、本明細書に記載及び提供される改変免疫細胞及び医薬組成物のうちの１つ以上を含み得る。例えば、本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、本開示の１つ以上の改変免疫細胞を含むキットである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本開示の１つ以上の医薬組成物を含むキットである。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、本開示の改変免疫細胞、核酸、及び医薬組成物を作製するための、並びにこれらを使用するための書面による指示書を更に含む。

【0156】

いくつかの実施形態において、本開示のキットは、提供される免疫細胞、核酸、及び医薬組成物のいずれか１つを、それを必要とする対象に投与するために使用される、１つ以上のシリンジ（プレフィルドシリンジを含む）及び／又はカテーテル（プレフィルドシリンジを含む）を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、所望の目的のために、例えば、細胞の活性を調節するため、標的癌細胞を阻害するため、又はそれを必要とする対象において、健康状態を治療するために、他のキット構成要素と同時に又は連続的に投与することができる１つ以上の追加の治療薬を有し得る。

【0157】

例えば、上記のキットのいずれも、１つ以上の追加の試薬を更に含むことができ、このような追加の試薬は希釈緩衝液、再構成溶液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクター、陰性対照Ｔ細胞集団、陽性対照Ｔ細胞集団、Ｔ細胞集団のｅｘ ｖｉｖｏ産生用試薬から選択することができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、キットの構成要素は、別々の容器に入れることができる。いくつかの他の実施形態において、キットの構成要素は、単一容器内で組み合わせることができる。

【0159】

いくつかの実施形態において、キットは、方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための指示書を更に含み得る。本方法を実施するための指示書は、概して、適切な記録媒体に記録されている。例えば、指示書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷することができる。指示書は、添付文書としてキット中に、キット又はその構成要素の容器のラベル中など（例えば、パッケージ又はサブパッケージに付随して）に存在することができる。指示書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。場合によっては、実際の指示書はキット中に存在しないが、リモートソースから（例えば、インターネットを介して）指示書を得るための手段を提供することができる。この実施形態の例は、指示書を見ることができ、及び／又は指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基材上に記録することができる。

【0160】

本明細書に記載される態様及び実施形態の各々は、実施形態又は態様の文脈から明示的又は明確に除外されない限り、一緒に使用することができる。

【0161】

本開示で言及された全ての刊行物及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0162】

本明細書に引用されたいずれの参考文献も先行技術を構成すると認めるものではない。参考文献の考察は、それらの著者が主張することを述べており、本出願人は、引用された文書の正確さ及び妥当性に異議を申し立てる権利を留保する。本明細書では、科学雑誌論文、特許文書、及び教科書を含むいくつかの情報源が言及されているが、この参考文献は、これらの文書のいずれかが当技術分野における共通の全般知識の一部を形成することを認めるものではないことが明確に理解されるであろう。

【0163】

本明細書に示される全般的な方法の考察は、例示目的のみを意図している。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるものである。

【実施例】

【0164】

本発明の実施では、別段の指示がない限り、当業者に周知である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，＆ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｊｏｉｎｔｌｙ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｈｅｒｅｉｎ ａｓ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ（２０１４年までの付録を含む）；Ｂｏｌｌａｇ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉ．（１９９７）．Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ：ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｄｏｙｌｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｆｅｒｒｅ，Ｆ．＆ Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．（１９９４）．ＰＣＲ：ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ，（２０１４年までの付録を含む）；及びＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．（２００３）．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．，などの文献で十分に説明されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0165】

更なる実施形態は、以下の実施例において更に詳細に開示され、これらは例示のために提供され、本開示又は特許請求の範囲の範囲を限定することを決して意図するものでない。

【0166】

実施例１．
全般的な実験手順
Ｔ細胞単離
全血バフィーコートは、スタンフォード血液センター（Stanford Blood Center）から４１歳未満の応募者から入手した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＴ細胞を単離した。Ｔ細胞を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）細胞凍結保存培地ＣＳ１０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて液体窒素中で保存した。

【0167】

ＣＲＩＳＰＲスクリーニング
Ｔ細胞の活性化及び培養

【0168】

２億個のＴ細胞を０日目に解凍し、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｔ細胞１個当たり３ビーズの比率で活性化した。細胞を、５％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１０ｍｇ／ＬのＩＬ－２を補充したＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞を、Ｔ１７５フラスコ中、５０万～１００万／ｍＬの密度で維持した。

【0169】

レンチウイルス形質導入

【0170】

Ｂａｓｓｉｋ Ｈｕｍａｎ ＣＲＩＳＰＲ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｌｉｂｒａｒｙの９つ全てのプールをＡｄｄｇｅｎｅから入手し、Ｅｎｄｕｒａ ＥｌｅｃｔｒｏＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で増幅した。ＬｅｎＴｉＸ細胞（タカラバイオ）を、ポリ－Ｄ－リジン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした１５０ｍｍプレートに播種し、１プレート当たり１８μｇのＲＥＶ、１８μｇのＧＡＧ／ＰＯＬ、７μｇのＶＳＶｇ、１５μｇのライブラリーベクター、３．３８ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）及び１３５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。１０枚のプレートを各ドナーについて調製した。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に上清を回収した。レンチウイルス上清をｌｅｎｔｉＸ（タカラバイオ）で濃縮し、活性化の２日後にＴ細胞培養培地に添加した。３日目に、フローによってｍＣｈｅｒｒｙ陽性について細胞を評価して、形質導入が８～１２％であったことを確認した。

【0171】

ＣＡＳ９エレクトロポレーション

【0172】

３日目に、１００μｌの反応物を、１０００万個のＴ細胞、３０μｇのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３（ＩＤＴ）、９０μｌのＰ３緩衝液（Ｌｏｎｚａ）、及び７μＬのＤｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴ）を用いて組み立てた。Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｌキット及び４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、プロトコルＥＯ１１５で細胞をパルスした。細胞を１ｍＬの温培地で直ちに回収し、次いで２００ｍＬの温培地に６時間かけて移した後、ＣＡＲで形質導入した。

【0173】

レトロウイルス形質導入

【0174】

２９３ＧＰ細胞を、ポリ－Ｄ－リジン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした１５０ｍｍプレート上に播種し、１プレート当たり１１μｇのＲＤ１１４、２２μｇのＨＡ－２８ｚ ＣＡＲｅｎｃｏｄｉｎｇプラスミド、３．３８ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）及び１３５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。この実験で使用したＨＡ－２８ｚ ＣＡＲは、１４ｇ２ａ－Ｅ１０１Ｋ ｓｃＦｖをコードし、これは、腫瘍細胞に天然に発現するジシアロガングリオシドであるＧＤ２に対してより高い親和性（ＨＡ）を示す（Ｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１９）。トランスフェクションの２４時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に上清を回収した。１０枚のプレートを各ドナーについて調製した。２日目及び３日目に、非組織培養処理した１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。３日目及び４日目に、１２ウェルプレートを２％ＢＳＡで５分間ブロックし、１ウェル当たり１ｍＬのレトロウイルス上清で３２℃、３２００ＲＰＭで２時間インキュベートした。７８０μｌの上清を除去し、１ｍＬの培地中で各ウェルに１００万個のＴ細胞を添加した。５日目に、磁気分離を用いてＤｙｎａｂｅａｄｓを除去した。７日目から１０日目まで２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンと共に細胞を培養して、ガイドを発現しない細胞を除去した。

【0175】

増殖スクリーニング

【0176】

ＣＡＲ－Ｔ細胞ライブラリーを、Ｔ１７５フラスコで１日おきに継代しながら培養した。１５日目に、１億個のＮＡＬＭ６－ＧＤ２細胞を１億個のＴ細胞に添加し、２３日目まで共培養した。各継代で培養液量の５０％を廃棄した。

【0177】

サイトカイン産生スクリーニング

【0178】

１５日目に、１億個のＣＡＲ－Ｔ細胞と１億個のＮＡＬＭ６－ＧＤ２－ＧＦＰ腫瘍細胞を２００ｍＬのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｏｎｅｎｓｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で６時間共培養した。細胞内サイトカイン染色を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて実施した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＴＮＦ－α（クローンＭＡｂ１１）、及びＩＬ－２（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２）に特異的な抗体、並びに固定可能な生存色素ｅＦｌｕｏｒ ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、細胞を染色した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｈａｒｅｄ ＦＡＣＳ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、７０μｍノズルを備えたＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで細胞選別を行った。ＴＮＦα＋及びＩＬ－２＋の上位１０％を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞についての個々のゲートを用いて選別した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サイトカイン高値の細胞をプールして、ゲノムＤＮＡ抽出を行った。

【0179】

ゲノムＤＮＡ抽出及び配列決定ライブラリー調製

【0180】

ゲノムＤＮＡ抽出、ライブラリー調製、及び配列決定のために、技術的な複製を行った。選別条件では各ドナーに対して１サンプルしか処理されず、各サンプルが約５００万個の細胞であったことを除いて、各時点で２，０００万～３，０００万個の細胞を採取した。０日目では、レンチウイルスベクタープラスミドライブラリーのマキシプレップを、実験開始時のＴ細胞におけるガイドの相対的存在量を概算するためのプロキシとして使用し、マキシプレップＤＮＡから複製配列決定ライブラリーを調製した。ゲノムＤＮＡを、前述のようにプロテイナーゼＫを含むＳＤＳ中で３７℃にて、一晩溶血して細胞ペレットから抽出した。簡単に説明すると、タンパク質を酢酸アンモニウムで沈殿させ、ゲノムＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。回収したゲノムＤＮＡの全てをＰＣＲのテンプレートとして用いて、配列決定ライブラリーを作製した。Ｍｏｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１７によって記載されているように、ライブラリーを調製した。カスタムプライマーを用いてＩｌｌｕｍｉｎａアダプターを付加し、ｌｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ ＰＥ１５０プラットフォーム上でディープ配列決定を実施した。Ｎｏｖｏｇｅｎｅ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）によって、配列決定を行った。

【0181】

ＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータ解析

【0182】

ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．２０を用いて、ＢＣＬファイルをＦＡＳＴＱファイルに変換した。ガイド配列をＦＡＳＴＱファイルから抽出し、カスタムＲスクリプトを用いてＢａｓｓｉｋライブラリーインデックスと照合した。各ガイドの生カウントを、ＭＡＧＥＣＫアルゴリズム（Ｌｉ ２０１４）への入力として提供した。増殖スクリーニングのために、「０日目」からの２つの複製を、２３日目に採取した４つのサンプル（各ドナーから２つ）と比較した。サイトカイン産生スクリーニングでは、１５日目に採取した４つのサンプル（各ドナーから２つ）を、サイトカイン高発現で選別した２つのサンプル（各ドナーから１つ）と比較した。ＭＡＧＥＣＫアルゴリズムにより、正規化を行い、ガイド及び遺伝子についてのｌｏｇ倍数変化を算出し、調整ｐ値を算出する。

【0183】

【表1】

【0184】

【表2】

【0185】

【表3】

【0186】

実施例２
ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞ライブラリーの増殖スクリーニング
本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞ライブラリーの増殖スクリーニングの実験計画及び結果を記載しており、多数のメディエーターサブユニットの喪失により、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖が低減することが見出された。

【0187】

図１は、本実験で使用したＣＡＲ－Ｔ細胞ＣＲＩＳＰＲノックアウトライブラリーの作製を概略的に示した図である。２人のヒトドナーからのＴ細胞を精製した。１遺伝子当たり１０個のガイドで約２０，０００個のタンパク質コード遺伝子全てを標的としたＣＲＩＳＰＲライブラリーを、レンチウイルスベクターを用いて低感染多重度（１０％陽性）で２億個のＴ細胞に組み込んだ。精製されたＣａｓ９タンパク質を３日目にＴ細胞にエレクトロポレーションし、活性化後３日目及び４日目にレトロウイルスによってＣＡＲを組み込んだ。

【0188】

ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの実験計画を図２に示す。このスクリーニングでは、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を２週間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、持続性シグナル伝達ＣＡＲの発現により進行性のＴ細胞機能不全が誘導された。サイトカイン産生をスクリーニングするために、培養集団の一部を腫瘍で刺激し、サイトカインＩＬ－２及びＴＮＦαを高レベルで発現する細胞についてＦＡＣＳで選別した。増殖のスクリーニングのため、ＣＡＲ－Ｔ標的を発現する腫瘍細胞とＴ細胞を更に７日間共培養した。スクリーニングの結果は図３に示されており、増殖スクリーニングから選択された遺伝子にノックアウト変異を有するＣＡＲ－Ｔ細胞が、複製ドナー間で再現性を示すことが観察された。これらの実験では、０日目及び２３日目にガイドＲＮＡの存在量を定量した。プロットは、各遺伝子を標的とする全てのガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）を示す。右上象限にプロットされた遺伝子は、欠失すると増殖が促進されることが見出され（例えば、ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣ）、左下象限にプロットされた遺伝子は、欠失すると増殖が減少することが見出された（例えば、ＭＹＣ及びＲＨＯＡ）。

【0189】

更に、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングも実施して、統計的に有意な遺伝子を同定した。これらの実験では、ＭＡＧＥＣＫアルゴリズムを用いて、ガイドの相対的な存在量を解析し、各遺伝子の調整Ｐ値を算出した（Ｌｉ ２０１４）。図４Ａに示すように、サイトカイン産生スクリーニングでは、全１５日の集団におけるガイドの存在量をサイトカイン高値の集団と比較した。図４Ｂに示すように、増殖スクリーニングでは、２３日目と０日目の存在量を比較した。これらの実験では、ゲノムの安全な非コード領域を標的とするガイドを対照として含め、安全な標的ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）を垂直の破線で示す。統計的有意性についての閾値は、水平の破線で示されている。サイトカイン産生スクリーニングでは、統計的に有意な遺伝子が１つ同定され、増殖アッセイでは、統計的に有意な遺伝子が複数同定された。

【0190】

特に、図５Ａ～図５Ｂに示されるように、３３個のメディエーター複合体サブユニット全てが、上記の増殖スクリーニングにおいて検出可能であった。これらの図では、各遺伝子を標的とした全ガイドの平均ｌｏｇ_２（倍数変化）をプロットしている。最初に、ドナー１及びドナー２を平均することによって、各ガイドの平均濃縮度を算出した。次いで、ガイド平均値を平均することによって、各遺伝子の平均濃縮度を算出した。エラーバーは、ガイドの標準偏差を示す。ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣは、ともにＣＤＫ８キナーゼモジュール（ＣＫＭ）において見出される。ＣＫＤ８モジュール（ＣＫＭ）の全てのメンバーの喪失により、Ｔ細胞で発現していないＭＥＤ１２Ｌを除いて、増殖が増強されることが観察された。ヘッドモジュール、バックボーン、及びミドルドメインに見られるメディエーターサブユニットの喪失により、ＭＥＤ２６とＭＥＤ１９を除いて、増殖が低減することも観察された。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＭＥＤ２６及びＭＥＤ１９が、ミドルドメインとＣＫＭとの間の物理的接触を形成し得ることが予測された。

【0191】

更に、テール領域のいくつかのメンバーが欠失すると、増殖がわずかに増強されることも観察された（例えば、ＭＥＤ１５、ＭＥＤ１６、ＭＥＤ２４、及びＭＥＤ２７）。

【0192】

特に、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、改変Ｔ細胞におけるＭＥＤ１２発現の低減が、Ｔ細胞の優れた増殖及びサイトカイン産生をもたらすことを示している。ＭＥＤ１２に関するこの結果は、２人の異なるヒトドナーで一貫していることが見出された。ＣＣＮＣについても同様の結果が観察されており、ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣはともにＣＫＭのサブユニットであることから、ＣＫＭがＴ細胞増殖の調節において重要な役割を有することが強く示唆される。更に、以下に更に詳述するように、全てのメディエーターサブユニットの試験は、Ｔ細胞増殖を調節する際のメディエーター複合体の本質的な役割を示す。

【0193】

実施例３
ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣサブユニットを欠く改変ＣＡＲ－Ｔ細胞は、より多くのＩＬ－２及びＩＦＮγを産生する
本実施例は、ＭＥＤ１２サブユニット又はＣＣＮＣサブユニットを欠く改変ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞）が、ＩＬ－２及びＩＦＮγによって例示されるサイトカインの産生増強を示すことを実証するために行われた実験結果について説明するものである。

【0194】

これらの実験では、標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させた。ＣＤ１９－２８ζ、ＨＡ－２８ζ、及びＨＥＲ２－４－１ＢＢζ受容体を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し、１０日目又は１５日目まで培養し、その後、それぞれＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ６－ＧＤ２、又は１４３Ｂ細胞株と共培養した。腫瘍細胞の添加から２４時間後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡでサイトカインを定量した。偽形質導入Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現せず、陰性対照として含めた。棒グラフは、２つの技術的反復の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

【0195】

図６Ａ～図６Ｆに示されるように、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＬ－２及びＩＦＮγの産生を増強できることが観察された。

【0196】

実施例４
ＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞は、単細胞ベースでより多くのＩＬ－２及びＴＮＦαを産生する
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が、単細胞ベースでより多くのＩＬ－２及びＴＮＦαを産生することを示すために行った実験結果について説明するものである。

【0197】

これらの実験では、ＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１５日目にモネンシンの存在下で６時間、ＮＡＬＭ６腫瘍細胞で刺激した。未刺激細胞（上パネル）及び刺激細胞（下パネル）を固定し、ＩＬ－２及びＴＮＦαについて染色し、フローサイトメトリーで解析した。全ＣＤ４＋細胞のうちのＩＬ－２＋ＴＮＦα＋細胞のパーセンテージを各プロットの上に示す。

【0198】

実施例３及び４に示される実験データは、ＣＫＭモジュールにおける機能喪失変異が、複数の炎症性サイトカインを分泌する能力を有するＴ細胞の数を増加させることを示している。ＩＮＦγ及びＴＮＦαは直接的な抗腫瘍効果があり、ＩＬ－２はＴ細胞増殖を促進する。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、このサイトカイン分泌能力の向上は、ＣＣＮＣ－ヌル及びＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖が増強され、腫瘍クリアランスが増加した理由を説明するのに役立つ。

【0199】

実施例５
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、培養において増強された増殖を示す
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が培養においてより多く増殖することを示すために行った実験結果について説明するものである。

【0200】

これらの実験では、標的遺伝子ＣＣＮＣ及びＭＥＤ１２並びに対照遺伝子ＡＡＶＳ１を活性化後３日目に欠失させ、２８日目までＩＬ－２と共に細胞を培養した。平均総生細胞数をプロットし、エラーバーは３回の技術的反復の標準偏差を示す。図８に示されるように、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、培養においてより多く増殖することが観察された。

【0201】

実施例６
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、生存のためにＩＬ－２に依存する
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が生存のためにＩＬ－２に依存することを示す実験結果について説明するものである。

【0202】

これらの実験では、９日目に、細胞を洗浄し、ＩＬ－２を含む又は含まない培地に播種した。細胞密度は、培地１ｍＬ当たり５０万～１００万個の細胞に維持した。細胞をアクリジンオレンジ及びヨウ化プロピジウムで染色し、ＣｅｌｌａｃａＭＸ細胞カウンターで生存率をモニタリングした。ＩＬ－２の非存在下では、いずれの条件においても２８日目までに生存細胞は検出されなかった。図９に示されるように、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、生存のためにＩＬ－２に依存することが観察された。

【0203】

上記の実施例５に示される実験データは、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの結果を検証し、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が、２０日間の培養で増殖が５～１０倍多いことを示している。実施例６に示される実験データは、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が、依然として生存のためにＩＬ－２に依存しており、これらのＴ細胞が癌細胞に形質転換されないことを示している。ＭＥＤ１２及びＣＣＮＣ変異はいくつかの種類の癌に関与しているので、これは重要な観察である。特にＣＣＮＣは腫瘍抑制遺伝子として説明されているが、この実験では、ＣＣＮＣの喪失のみでは形質転換に十分ではないことを実証している。ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を増加させることを実証するために、追加の実験を行った。これらの実験では、５×１０^４個のＴ細胞及び５×１０^４個の腫瘍細胞を、丸底９６ウェルプレート中のＩＬ－２を含まない２５０μｌの培地中で２４時間共培養した。腫瘍細胞との２４時間の共培養後に培養上清を採取し、サイトカインをＥＬＩＳＡ（例えば、図１５Ａ参照）又はＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズ（例えば、図１５Ｂ参照）によって定量した。ＩＬ－２及びＩＦＮγをＥＬＩＳＡ ＭＡＸキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で検出し、ＴＮＦ－アルファをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。図１５Ａ～図１５Ｂに記載される実験はまた、上記の実施例３に記載されている。

【0204】

実施例７
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示す
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示す実験結果について説明するものである。

【0205】

これらの実験では、ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するおよそ１００万個のＮＡＬＭ６細胞を０日目に注入し、２５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を３日目に注入した。ＳＩＩ Ｌａｇｏ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いた生物発光イメージングで腫瘍量をモニタリングし、Ａｕｒａ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアで１秒当たりの光子（ｐ／ｓ）を定量した。図１０Ａは３０秒間の露光を示し、飽和を回避するために、定量にはより短い露光を使用した（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。個々のマウスの値をＢに、平均値をＣに示す。エラーバーは標準偏差ｌを示す。ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示すことが観察された。

【0206】

注目すべきことに、実施例７では、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が、初期の時点で劇的かつ等しい腫瘍クリアランスを示すことが観察された。しかし、４２日目には、ＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスは、ＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスよりも腫瘍量が顕著に大きくなっており、ＭＥＤ１２の喪失が、ｉｎ ｖｉｖｏで数週間にわたってＴ細胞により許容され得ることを示している。

【0207】

実施例８
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖の増加を示す
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖の増加を示す実験結果について説明するものである。

【0208】

これらの実験では、Ｔ細胞注入の１０日後に、マウス（上記図１０に示す）から血液を採取した。血液を等量のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、ヒトＣＤ４５を染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）で赤血球を溶血した。ヒトＣＤ４５＋細胞をフローサイトメトリーによって定量した。図１１に示されるように、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍クリアランスの増加を示すことが観察された。

【0209】

追加の実験を行って、ＭＥＤ１２の喪失がＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲを発現しないＴ細胞の増殖を増加させることを実証した。これらの実験では、ＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞をバフィーコートから単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。細胞を３日目にＣＲＩＳＰＲ編集し、２３日目（例えば、図１６Ａ参照）又は１２日目（例えば、図１６Ｂ参照）までＩＬ－２で培養した。これらの実験では、Ｃｅｌｌａｃａ Ｍｘ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）を用いて、細胞数及び生存率の測定値を得た。細胞をアクリジンオレンジ及びヨウ化プロピジウムで染色して、生存率を評価した。各継代で培養液量の一部分を廃棄し、培養液中に維持された細胞の一部を用いて総細胞数を算出した。

【0210】

いかなる特定の理論にも束縛されることなく、実施例８に示されるデータは、腫瘍クリアランスが増強される理由についての説明を提供するものである。ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞の数の増加により、この時点における腫瘍焼失の減少を説明することができる。更に、この実施例は、ＩＬ－２又はＩＬ－７などのＴ細胞支持サイトカインが投与されなかったので、特に関連性が高い。これらの細胞によりＩＬ－２の産生が増加することで、ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖の増加が尤もなことと説明される。

【0211】

実施例９
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高める
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高めることを示す実験結果について説明するものである。

【0212】

これらの実験では、マウスに１００万個のＮＡＬＭ６腫瘍細胞を注入し、３日目に１×１０^５、２．５×１０^５、又は５×１０^５個のＴ細胞を投与した。図１２に示すように、ＭＥＤ１２－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞は生存を増加させ、ＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞はＡＡＶＳ１－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。

【0213】

実施例９及び１０に示される実験データは、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＣＡＲ－Ｔ細胞が、液体腫瘍及び固形腫瘍の両方の進行を遅らせるのに有効であることを示している。更に、これらの実施例は、ＭＥＤ１２／ＣＣＮＣの喪失の効果が、異なる抗原を標的とし、異なる共刺激ドメインを利用するＣＡＲに一般化可能であることを示している。この結果は、この戦略が全てのＣＡＲ－Ｔ細胞療法に適用可能であることを示唆する。

【0214】

実施例１０
ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍成長を減少させる
本実施例は、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、固形腫瘍成長を減少させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高めることを示す実験結果について説明するものである。

【0215】

これらの実験では、約１００万個の１４３Ｂ骨肉腫細胞を０日目に筋肉内注射し、５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を４日目に注入した。固形腫瘍をノギスで測定した。腫瘍径が１７ｍｍ以上になった時点でマウスを屠殺した。図１３に示されるように、ＭＥＤ１２－ヌル及びＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍成長を減少させ（図１）、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の生存効果を高める（図１３Ｂ）ことが観察された。

【0216】

実施例１１
ＭＥＤ１２エクソン２の２つの切断部位を標的とすることにより、遺伝子欠失頻度が増加する
本実施例は、ＭＥＤ１２エキソン２における２つの切断部位を標的とすることにより、遺伝子欠失頻度が増加することを示す実験結果について説明するものである。

【0217】

これらの実験では、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３（ＩＤＴ）をＤｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴ）で５ｍｇ／ｍＬに希釈した。ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）をＴＥ緩衝液で１００μＭに再懸濁した。１μＬのＣＡＳ９及び１μＬのｓｇＲＮＡを合わせ、室温で３０分間インキュベートした。２つのガイド条件については、各ｓｇＲＮＡを０．５μｌずつ添加した。２００万個のＴ細胞を１８μＬのＰ３緩衝液に再懸濁し、ＣＡＳ９と混合し、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓ Ｋｉｔ及び４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）を用いてプロトコルＥＯ１１５でパルスした。細胞を１００μＬの温培地で直ちに回収し、次いで、１ｍＬの温培地に６時間かけて移した後、ＣＡＲで形質導入した。３日目に編集を行い、１１日目に遺伝子欠失を評価した。

【0218】

ＭＥＤ１２又はＣＣＮＣの喪失がｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を増加させることを実証するために、追加の実験を行った。腫瘍を有するマウスに注入して１０日後に末梢血中のＴ細胞の頻度を評価した（例えば、図１７参照）。これらの実験では、後眼窩静脈叢からＥＤＴＡ入りＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ採血管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に血液を採取した。全血を抗ＣＤ４５（ＨＩ３０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、製造業者の指示書に従ってＦＡＣＳ Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ）で赤血球を溶血した。フローサイトメトリー解析の前に、サンプルをＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合した。

【0219】

実施例１１に示される実験データは、高効率でＭＥＤ１２の欠失を効率的に最適化する方法を例示する。典型的なＣＲＩＳＰＲ改変プロトコルには、１つのガイドＲＮＡの使用が含まれる。本実施例に記載の方法は、約５０ｂｐの間隔で２つのガイドの使用を含んでいた。このアプローチにより、単一ガイドを用いて生成された１ｂｐインデル変異よりも高い頻度で生成された４７ｂｐインデルが得られた。

【0220】

実施例１２
ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞による投与は、腫瘍面積を減少させ生存を増加させる
本実施例は、ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ Ｔ細胞による投与が腫瘍面積を減少させ、ＣＡＲ投与マウスの生存を増加させることを示す実験結果について説明するものである。

【0221】

これらの実験では、ＮＳＧマウスの腫瘍面積に１×１０^６個の１４３Ｂ骨肉腫細胞を筋肉内注射し、４日後に５×１０^６個のモック（偽）又はＣＣＮＣ－若しくはＭＥＤ１２－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。腫瘍面積をノギスで測定した。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡ検定。＊Ｐ＜０．０１。図１８Ａに示されるように、腫瘍面積は、ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスで最も低かった。図１８Ｂは、図１８ＡにおけるＣＡＲ投与マウスについての生存率パーセントを示す図である。生存曲線をＬｏｇ－ｒａｎｋ Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定で比較した。＊Ｐ＜０．０１。

【0222】

細胞株：

【0223】

ＮＡＬＭ－６白血病細胞及び１４３Ｂ骨肉腫細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。細胞株にＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入した。Ｎａｌｍ６－ＧＤ２を、ＧＤ２シンターゼ及びＧＤ３シンターゼを安定的に発現するように改変して、ＧＤ２ジシアロガングリオシドの表面発現を得た。ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、及びＧＤ２が高発現するよう、単細胞クローンを選別した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％のＦＢＳ、及び１×ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン補充物（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で細胞株を維持した。

【0224】

マウス：

【0225】

免疫不全ＮＯＤ ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマ^ヌル（ＮＳＧ）マウスをＪＡＸから購入し、無菌条件下で自社飼育した。マウスを１日１回モニタリングした。管理及び投与は、スタンフォード大学標準プロトコルに従った。白血病細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注射によって投与した。１４３Ｂ骨肉腫細胞を筋肉内注射によって投与した。いくつかの実験では、投与前に腫瘍量を評価し、投与群間で腫瘍量が等しくなるようにマウスを群に無作為化した。投与時間及び投与量を図に示す。研究者らは、Ｔ細胞の投与時に盲検化された。Ｌａｇｏ ＳＩＩ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて、白血病の進行をモニタリングした。Ａｕｒａソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて、生物発光の定量を行った。注射された脚領域のノギス測定を用いて、固形腫瘍進行を追跡した。研究者はまた、固形腫瘍測定中、投与群に対して盲検化された。麻痺、運動障害、体調不良（スコアＢＣ２－）が現れたとき、又は腫瘍径が１７ｍｍを超えた時点で、マウスを屠殺した。サンプルサイズは、これらのモデルに関する過去の経験に基づいて、１群当たり５例のマウスを選択した。全ての実験を、異なるドナーを用いて２回繰り返し、ｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用したドナーは、スクリーニング実験とは異なった。

【0226】

実施例１３
ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞による投与は、生存を増加させる
本実施例は、ＣＣＮＣ－ヌルＨＥＲ２－４－１ＢＢζ ＣＡＲ－Ｔ細胞による投与後に、ＣＡＲ投与マウスの生存が増加することを示す実験結果について説明するものである。図１９Ａ～図１９Ｂは、ＣＡＲ投与マウスの生存を示す。１群当たりのマウスの数を図の凡例に示す。腫瘍成長を生物発光イメージングによってモニタリングした。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による二元配置ＡＮＯＶＡ検定。＊Ｐ＜０．０１。

【0227】

実験では、ＮＳＧマウスに１．０×１０^６個のＮＡＬＭ６－ＧＤ２－Ｌｕｃ白血病細胞を静脈内注射し、腫瘍注入の９日後に２．０×１０^５個のモック又はＣＣＮＣ－若しくはＭＥＤ１２－ヌルＨＡ－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した（ｎ＝５例のマウス）（例えば、図１９Ｃ参照）。他の実験では、ＮＳＧマウスに１．０×１０^６個のＮＡＬＭ６－Ｌｕｃ白血病を静脈内注射し、腫瘍注入の３日後に２．５×１０^５個のモック又はＣＣＮＣ－ヌル若しくはＭＥＤ１２－ヌルＣＤ１９－２８ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した（ｎ＝５例のマウス）（例えば、図１９Ｄ参照）。これらの実験において使用される細胞株及びマウスの更なる詳細は、上記の実施例１２に提供されている。

【0228】

実施例１４
ＭＥＤ１２の喪失は、ＩＬ２ＲＡの発現を増加させる
本実施例は、ＭＥＤ１２の喪失がＴ細胞におけるＩＬ２ＲＡの発現を増加させることを示す実験結果について説明するものである。実験では、活性化後３日目に細胞をＣＲＩＳＰＲ編集し、続いてＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲで形質導入した。ＩＬ２ＲＡの発現を、活性化後１５日目にフローサイトメトリーによって評価した。ＭＥＤ１２欠損細胞が、増強されたエフェクター表現型を示すことが観察された。ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析によると、観察されたエフェクター表現型の増強は、ＩＬ２ＲＡの下流にある転写因子ＳＴＡＴ５の活性の増加に起因する場合がある。したがって、いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＩＬ２ＲＡ発現は、ＭＥＤ１２欠損ＣＡＲ－Ｔ細胞の重要な表現型特性であることが予想される。ＭＥＤ１２非存在下でのＩＬ２ＲＡ発現の増加が、非改変Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞の両方において見出されたことは注目に値し、ＭＥＤ１２喪失のメカニズムがＣＡＲの存在に依存しないことを示している。

【0229】

図２０Ａ及び図２０Ｂは、これらの実験をグラフにまとめた図である。図２０Ａは、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞についての結果を示し、図２０Ｂは、非形質導入Ｔ細胞についての結果を示す。これらの実験では、Ｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳカルシウムなし、マグネシウムなし（Ｇｉｂｃｏ）、２％ＦＢＳ入り）で洗浄した。細胞を、細胞表面マーカーに特異的な抗体と共にＦＡＣＳ緩衝液中、氷上で２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えたＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で解析した。

【0230】

実施例１５
ＭＥＤ１２の喪失は、エフェクターメモリーＴ細胞表現型を増加させる
本実施例は、ＭＥＤ１２の喪失がエフェクターメモリーＴ細胞表現型（ＣＣＲ７低、ＣＤ４５ＲＯ高）を増加させることを示す実験結果について説明するものである。

【0231】

これらの実験では、活性化の２２日後にフローサイトメトリーによって細胞を評価した。図２１Ａは、ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトメトリー結果を示し、この場合は以下の細胞型をゲーティングした：幹細胞様メモリーＴ細胞（ＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）、及び最終分化Ｔ細胞（ＴＥ）。図２１Ｂは、非形質導入Ｔ細胞について実施した並行実験結果を示す。

【0232】

実施例１６
ＭＥＤ１２欠損ＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞における酸素消費速度及び細胞外酸性化速度の増加
本実施例は、活性化の１５日後のＣＤ１９－２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞において、ＭＥＤ１２の欠損が、酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を増加させることを示すために行った実験結果について説明するものである。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、酸素消費及び細胞外酸性化の上昇によって示される代謝活性の増加は、エフェクターＴ細胞の特徴と見なすことができ、これは、ＭＥＤ１２の喪失がエフェクター表現型の増強を誘発するという仮説と一致する。

【0233】

Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、製造業者の指示書に従って、ミトコンドリアストレス試験を行った。図２２は、ミトコンドリアストレス試験の結果を示す図である。これらの実験では、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＸＦｅ９６を用いて代謝解析を行った。簡潔には、２×１０^６個の細胞を、２５ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＸＦアッセイ培地に再懸濁し、Ｃｅｌｌ－Ｔａｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングしたマイクロプレート上に播種して、ＣＡＲ Ｔ細胞の接着を可能にした。ミトコンドリアストレス及び解糖パラメータを、それぞれ酸素消費速度（ＯＣＲ）（ｐｍｏｌ／分）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）（ｍＰｈ／分）を介して、オリゴマイシン（１．５μＭ）、カルボニルシアニド－４（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；１μＭ）、並びにロテノン及びアンチマイシン（ともに１μＭ）のリアルタイム注入を用いて測定した。呼吸パラメータを、製造業者の指示書（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って算出した。全ての化学物質は、特に明記しない限り、Ａｇｉｌｅｎｔから購入したものである。

【0234】

本開示の特定の代替案が開示されているが、様々な修正及び組み合わせが可能であり、添付の特許請求の範囲の正確な趣旨及び範囲内で企図されることを理解されたい。したがって、本明細書に示される厳密な要約書及び開示に限定する意図はない。
参考文献
ＣＲＩＳＰＲライブラリー試薬の情報源
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ＤＮＡ抽出及び配列決定方法
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ＣＲＩＳＰＲスクリーニングを解析するためのアルゴリズムの情報源
Ｗ．Ｌｉ，Ｈ．Ｘｕ，Ｔ．Ｘｉａｏ，Ｌ．Ｃｏｎｇ，Ｍ．Ｉ．Ｌｏｖｅ，Ｆ．Ｚｈａｎｇ，Ｒ．Ａ．Ｉｒｉｚａｒｒｙ，Ｊ．Ｓ．Ｌｉｕ，Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｘ．Ｌｉｕ，ＭＡＧｅＣＫ ｅｎａｂｌｅｓ ｒｏｂｕｓｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｃｒｅｅｎｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１５（２０１４）５５４．
その他の参考文献
Ｍｏｒｇａｎｓ Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｍａｙ ５；８：１５１７８．
Ｒｏｓｅ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃａｓ９ ａｎｄ ＤＳＢ－ｄｄＰＣＲ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｓｅｐ；１４（９）：８９１－８９６．
Ｌｙｎｎ Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．ｃ－Ｊｕｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１９ Ｄｅｃ；５７６（７７８６）：２９３－３００．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A-1】

【図15A-2】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22-1】

【図22-2】

【配列表】

2023548510000001.app

【国際調査報告】