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特表2023-548659細胞懸濁液への組織の処理のための一体化された微小流体システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-20
(54)【発明の名称】細胞懸濁液への組織の処理のための一体化された微小流体システム
(51)【国際特許分類】
C12M 3/08 20060101AFI20231113BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231113BHJP
C12M 3/06 20060101ALI20231113BHJP
【ＦＩ】
C12M3/08
C12M1/00 A
C12M3/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023521720
(86)(22)【出願日】2021-10-11
(85)【翻訳文提出日】2023-06-07
(86)【国際出願番号】 US2021054440
(87)【国際公開番号】W WO2022081488
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】63/090,497
(32)【優先日】2020-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592110646
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ハウン，ジェレッド
(72)【発明者】
【氏名】ロンバルド，ジェレミー エイ．
【テーマコード（参考）】
4B029
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029BB11
4B029CC01
4B029GB05
4B029HA10
(57)【要約】
組織試料を処理するための微小流体システムは、解離／濾過デバイスの入口に流体連結された出口を有する微小流体消化デバイスを含む。微小流体消化デバイスは、入口および出口ならびに複数の上流流体チャネルおよび複数の下流流体チャネルに連結する組織チャンバーを含む。微小流体解離／濾過デバイスは、入口、第１の出口、第２の出口、ならびにその長さに沿って配置された複数の拡大および縮小の領域を有する複数の分岐した解離チャネルを含み、１つまたは複数のフィルターが複数の分岐した解離チャネルの下流の流路に配置されている。消化デバイスおよび解離／濾過デバイスを通して緩衝剤および／または酵素を含む流体を送液するポンプが備えられている。組織は最初に消化デバイスで処理され、次いで解離／濾過デバイスに通過する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
入口および出口ならびに前記入口と前記出口との間に画定された流路を含み、前記流路が、組織試料を保持するように構成された組織チャンバーならびに前記流路の前記入口側において前記組織チャンバーと連通する複数の上流流体チャネルおよび前記流路の前記出口側において前記組織チャンバーと連通する複数の下流流体チャネルを含む、微小流体消化デバイス、緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体を前記微小流体消化デバイスの前記入口に送液するように構成された第１のポンプ、
入口、第１の出口、第２の出口、および前記入口と前記出口との間に画定された流路を含み、前記流路がその長さに沿って配置された複数の拡大および縮小の領域を有する複数の分岐した解離チャネルを含み、前記複数の分岐した解離チャネルの下流の流路に１つまたは複数のフィルターが配置されている、微小流体解離／濾過デバイス、
緩衝剤を含む流体またはその他の流体を前記微小流体解離／濾過デバイスの前記入口に送液するように構成された第２のポンプ
を含む、前記組織試料を処理するための微小流体システムであって、
前記微小流体消化デバイスの前記出口が前記微小流体解離／濾過デバイスの前記入口に流体連結されている、微小流体システム。
【請求項2】
前記微小流体消化デバイスの前記出口と前記微小流体解離／濾過デバイスの前記入口との間に介在する１つまたは複数のバルブをさらに含む、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項3】
前記第１の出口が前記第１の出口を閉じるためのバルブまたはキャップを含み、前記微小流体解離／濾過デバイスの前記第１の出口が閉じられた場合に、流体が流体を前記１つまたは複数のフィルターを含む流路を通って流れさせる、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項4】
前記第２の出口が前記第２の出口を閉じるためのバルブまたはキャップを含み、前記微小流体解離／濾過デバイスの前記第２の出口が閉じられた場合に、流体が前記１つまたは複数のフィルターを通過することなく、前記第１の出口を介して前記微小流体解離／濾過デバイスを流出する、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項5】
前記１つまたは複数のフィルターが、約５０～１００μｍの範囲内の孔径を有する第１のフィルターおよび約１５～５０μｍの範囲内の孔径を有する第２のフィルターを含む、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項6】
前記上流流体チャネルの数が前記下流流体チャネルの数と等しい、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項7】
前記上流および下流の流体チャネルが約２５０μｍ～７５０μｍの範囲内の幅を有する、請求項６に記載の微小流体システム。
【請求項8】
前記微小流体消化デバイスに配置され前記組織チャンバーと連通するポートをさらに含む、請求項１に記載の微小流体システム。
【請求項9】
前記組織試料を前記微小流体消化デバイスの前記組織チャンバーに負荷するステップ、前記緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体を前記微小流体消化デバイスの前記入口に前記第１のポンプによって送液するステップ、
処理された組織試料を含む流体を前記微小流体解離／濾過デバイスに移送するステップ、
緩衝剤を含む流体またはその他の流体を前記微小流体消化デバイスからの前記処理された組織とともに前記第２のポンプによって前記微小流体解離／濾過デバイスの前記入口に送液するステップ、ならびに
前記微小流体解離／濾過デバイスの前記第２の出口から流出液を収集するステップ
を含む、請求項１に記載の微小流体システムを使用する方法。
【請求項10】
前記緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体を前記微小流体消化デバイスの前記入口に前記第１のポンプによって送液するステップが、流体を前記微小流体消化デバイスに前記第１のポンプによって再循環するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記酵素を含む流体がコラーゲナーゼを含む流体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体の前記微小流体消化デバイスの入口への送液が、流出液がそれぞれのインターバルの終わりに前記微小流体消化デバイスから除去され、代替の酵素を含む流体が前記微小流体消化デバイスに送液されるインターバルで実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記微小流体消化デバイスおよび前記微小流体解離／濾過デバイスにおける全処理時間が１分またはそれ以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記微小流体消化デバイスおよび前記微小流体解離／濾過デバイスにおける全処理時間が１５分またはそれ以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項15】
前記微小流体消化デバイスからの前記処理された組織が、前記第２の出口から出る前に、前記微小流体解離／濾過デバイスの中の前記複数の分岐した解離チャネルを通って複数回再循環される、請求項９に記載の方法。
【請求項16】
前記微小流体解離／濾過デバイスが単一のフィルターを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項17】
前記微小流体解離／濾過デバイスが複数のフィルターを含む、請求項９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０２０年１０月１２日出願の米国仮特許出願第６３／０９０，４９７号の優先権を主張する。優先権は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条および適用可能な他の任意の法規に従って主張する。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０２０年１０月１２日出願の米国仮特許出願第６３／０９０，４９７号の優先権を主張する。優先権は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条および適用可能な他の任意の法規に従って主張する。
【0002】
本技術分野は、組織検体または組織試料を細胞懸濁液に処理するために用いられる微小流体デバイスに関する。
【0003】
連邦支援の研究開発に関する声明
本発明は国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ））によって授与されたグラント番号ＩＩＰ－１３６２１６５の下の政府の援助によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ））によって授与されたグラント番号ＩＩＰ－１３６２１６５の下の政府の援助によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
組織は、多様な細胞サブタイプを含む高度に複雑なエコシステムである。活性化状態、遺伝的変異、遺伝子外の差異、確率論的事象、および微小環境因子における相違によって、所与のサブタイプの中で顕著な変動が生じることもある。このことは、細胞の不均一性を捕捉し、それにより、組織および器官の発達、正常な機能、および疾患の病因に関するより良い理解を得ることを試みる研究の急速な発展をもたらした。たとえば、がんに関して、腫瘍内不均一性は疾患の進行、転移、および薬物耐性の発現の重要な指標である。フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、および単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）等の高スループット単一細胞解析法は、分子情報に基づく包括的な様式で単一細胞を同定するために理想的であり、これらの方法は既に、これまで未知であった細胞の型および状態の同定を可能にすることによって、複雑な組織に関する我々の理解を変換し始めている。
【0005】
しかし、これらの努力に対する重大な障壁は、最初に組織を単一細胞の懸濁液に処理する必要があることである。現在の方法には、細切、消化、脱凝集、および濾過が含まれ、これらは労働集約的であり、時間がかかり、非効率であり、極めて変わりやすい。したがって、組織についての単一細胞解析法の信頼性および広範囲の採用を保証するには、新規なアプローチおよび技術が極めて必要とされている。これは単一細胞診断を臨床状況におけるヒトの検体に置き換えるために特に重要であろう。さらに、組織の解離を改善することによって、エクスビボ薬物スクリーニング、操作された組織の構築、および幹／前駆細胞療法のための初代細胞の抽出がより迅速かつ容易になるであろう。薬物試験を個別化するために複雑な天然の組織の再現を目指す患者由来のオーガンオンチップ（organ-on-a-chip）モデルは、組織の解離を改善することによって可能になり得る特に刺激的な将来の方向である。
【0006】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、個別の細胞の完全なトランスクリプトームを提供する強力で広範囲に適合する解析手法として最近出現した。これによって、正常および疾患の組織についての包括的な細胞参照マップまたはアトラスの生成、ならびにこれまで未知であった細胞のサブタイプまたは機能的状態の同定が可能になった。たとえば、正常マウスの腎について最近生成されたアトラスによって、過渡的な表現型および予期しないレベルの細胞可塑性を有する新規な集合管細胞が発見された。さらに、初代ヒト乳房上皮のアトラスによって独特の上皮細胞集団が既知の乳がんサブタイプに関連付けられ、これらのサブタイプが異なる起源細胞から発現している可能性が示唆された。黒色腫については、転写として区別される３つの状態がｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて同定され、その１つは薬物感受性であり、計算によって最適化された治療スケジュールを用いて薬物耐性が遅延できることがさらに実証された。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは明らかに強力な診断手段であるが、組織を破壊して単一細胞にする機械的プロセスは、データの品質および信頼性に悪い影響を与える複雑な要因を導入する可能性がある。１つの要因は標準化の欠如であり、これは様々な研究グループおよび組織型にわたって実質的な変動をもたらす可能性がある。もう１つの顕著な懸念は、不完全な破壊が、より遊離しやすい細胞型へ結果を偏らせる可能性である。マウス腎試料を用いる単一核ＲＮＡシーケンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）を利用した最近の研究によって、内皮細胞およびメサンギウム細胞がｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの中で少なく見積もられていたことが見出された。最後に、長時間の酵素消化によって、トランスクリプトームのシグネチャーが変化し、応力応答が発生し、これらが細胞の分類に干渉することが示されている。これらの懸念に対処することは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの刺激的な分野を組織のアトラス作成および疾患の診断のための未来に推進することの助けになるであろう。
【0007】
微小流体技術は、デバイスを細胞試料のスケールに小型化し、試料の正確な操作を可能にすることによって、生物学および医学の分野を発展させてきた。この仕事の大部分は単一細胞の操作および解析に注力されてきた。少数の研究のみが組織の処理に対処しており、さらに少ない研究が組織をより小さな成分に破壊することに注力している。たとえば、細胞凝集物を単一細胞に破壊することに特に注力した微小流体デバイスが開発されてきた。この解離デバイスは、サイズが約１００μｍまで徐々に減少する分岐したチャネルのネットワークを含み、剪断力を用いて凝集物を破壊するための繰り返し拡大縮小を含んでいた。そのようなデバイスに関する詳細は、Ｑｉｕ，Ｘ．ら、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １５，３３９－３５０（２０１５）およびＱｉｕ，Ｘ．ら、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｎｎｅｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ，Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ８，２７７４（２０１８）で見出すことができる。
【0008】
次いで、剪断力とタンパク質分解酵素の組合せを用いるオンチップ組織消化のためのデバイスが開発された。最後に、大きな組織断片を除去する一方、小さな細胞凝集物およびクラスターも解離させるナイロンメッシュ膜を含むフィルターデバイスが開発された。Ｑｉｕ，Ｘ．ら、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｉｌｔｅｒ ｄｅｖｉｃｅ ｗｉｔｈ ｎｙｌｏｎ ｍｅｓｈ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １８，２７７６－２７８６（２０１８）を参照されたい。微小流体消化、解離、およびフィルターデバイスは、独立に操作した場合にそれぞれ単一細胞の回収を増強した。しかし現在までに、これらの技術は、性能を最大化し、チップ上の完全な組織処理のワークフローを実行するように組み合わされていない。さらに、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いる微小流体処理された細胞懸濁液のバリデーションはなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
一実施形態では、分解を増強し、下流の単一細胞解析およびその他の使用のために即時使用可能な単一細胞懸濁液を産生する３つの異なる組織処理技術（消化、脱凝集、および濾過）を含む微小流体プラットフォームまたはシステムが開示される。最初に、システムは、細切した組織を負荷し、使用者との最小の相互作用で操作することができる消化デバイスを使用する。次に、消化デバイスに流体連結された別個のデバイスで、組織の解離および濾過の技術が単一のユニットに一体化されまたは組み合わされる。２デバイスのプラットフォームは、マウス腎を用いて単一細胞を従来法より迅速かつ多数で産生するように最適化された。最適化されたプロトコルを用い、２つの単一細胞解析法を用いて様々な細胞型を評価した。マウスの腎および乳腺腫瘍の組織については、微小流体処理は、生存率に影響することなく、約２．５倍多い上皮細胞および白血球、ならびに５倍を超える内皮細胞を産生することができる。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて、デバイスによって処理された試料は内皮細胞、線維芽細胞、および基底上皮が高度に富化されていることが示された。応力応答はいずれの細胞型においても誘起されず、短い処理時間を採用すれば低減さえできることも実証された。マウスの肝および心臓については、わずか１５分後に、また１分の短時間でも顕著な数の単一細胞が得られた。興味あることに、離散した間隔で試料を回収した場合に実質的により多くの肝細胞および心筋細胞が得られることが見出され、これはおそらくこれらの細胞型が剪断力に影響されやすいためであろう。重要なことに、微小流体プラットフォームは生存率に影響することなく処理時間を顕著に短縮するか、全ての組織型の研究において単一細胞の回収を増強することができ、ある場合にはその両方を達成することができる。さらに、組織処理ワークフローの全体は、自動化され信頼性の高い様式で実施される。即ち、微小流体プラットフォームは、組織からの単一細胞の遊離を必要とする多様な用途を発展させる刺激的な可能性を有している。
【0010】
一実施形態では、組織を消化し、解離し、必要に応じて濾過する、組織試料を処理するための微小流体システムが開示される。このシステムは、入口および出口ならびに入口と出口との間に画定された流路を有する微小流体消化デバイスを含み、流路は、組織試料を保持するように構成された組織チャンバーならびに流路の入口側において組織チャンバーと連通する複数の上流流体チャネルおよび流路の出口側において組織チャンバーと連通する複数の下流流体チャネルを含む。第１のポンプが、緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体を微小流体消化デバイスの入口に送液するように構成されている（この間、組織は組織チャンバーの中に存在する）。本システムは、入口、第１の出口、第２の出口、および入口と出口との間に画定された流路を含む微小流体解離／濾過デバイスをさらに含み、流路はその長さに沿って配置された複数の拡大および縮小の領域を有する複数の分岐した解離チャネルを含み、複数の分岐した解離チャネルの下流の流路に１つまたは複数のフィルターが配置されている。第１および第２の出口のいずれかは選択的に閉じられて、デバイスの解離領域のみを通る流れまたはデバイスの解離領域とデバイスのフィルター領域とを通る流れが可能になる。第２のポンプは、緩衝剤を含む流体を（微小流体消化デバイスからの処理された組織溶液とともに）微小流体解離／濾過デバイスの入口に送液するように構成されている。微小流体消化デバイスの出口は、微小流体解離／濾過デバイスの入口に流体連結されている。したがって、消化された組織を含む流体は、微小流体消化デバイスから微小流体解離／濾過デバイスへ通過する。
【0011】
一実施形態では、微小流体システムを使用する方法は、組織試料を微小流体消化デバイスの組織チャンバーに負荷する操作、緩衝剤を含む流体および／または酵素を含む流体を微小流体消化デバイスの入口に第１のポンプによって送液する操作、処理された組織試料を含む流体を微小流体解離／濾過デバイスに移送する操作、緩衝剤を含む流体を微小流体解離デバイスで処理された組織とともに微小流体解離／濾過デバイスの入口に送液する操作、および微小流体解離／濾過デバイスの第２の出口から流出液を収集する操作を含む。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１Ａは、組織を処理するための微小流体システムを図式的に示す。組織の処理には、組織の消化、解離／脱凝集、および濾過が含まれる。システムは、細切された組織を最初に処理する消化デバイスを含む。第１のポンプは緩衝剤および／または酵素の溶液を消化デバイスに送液するために用いられ、一方細切された組織は消化デバイスの中の組織チャンバーに含まれる。流体チャネルが流体力学的剪断力およびタンパク質分解酵素を導く一方、細切された組織片をチャンバー内に保持する。解離／濾過デバイスはバルブ（Ｖ）を介して消化デバイスの流出物に流体連結されている。解離／濾過デバイスは、組織断片および細胞凝集物に剪断力を付与するための拡大／縮小領域とともに小さな寸法の分岐した（たとえば２つに分岐した）一連のチャネルを含む。解離／濾過デバイスは、流路中に位置して大きなサイズの組織断片および細胞凝集物を濾過して除去するための１つまたは複数のフィルター媒体（たとえば２つの濾過膜）をさらに含む。別のポンプがバルブ（Ｖ）を介して解離／濾過デバイスに連結されており、緩衝液またはその他の流体を消化デバイスの流出物とともに解離／濾過デバイスに送液する。単一細胞は、流出物を介する解離／濾過デバイスからの流出物である。図１Ｂは、消化デバイスの中に形成された解離チャネルを示す。解離チャネルの様々なステージが多層デバイスの様々な層で形成され得ることに注目されたい。拡大および縮小の領域を図示する。図１Ｃは、ペリスタポンプ、消化デバイス、解離／濾過デバイス、ならびにバルブおよびチューブを介する連結部を含む実験装置の写真を示す。この写真では、システムは消化デバイスを通して流体を再循環する。図１Ｄは、図１Ｃの実験装置の構成を図式的に示す。ここでは、システムは消化デバイスを通して流体を再循環するように構成されている。ストップコックバルブを用いて、流れを再循環のために迂回させてポンプに戻している。図１Ｅは、ペリスタポンプ、消化デバイス、解離／濾過デバイス、ならびにバルブおよびチューブを介する連結部を含む実験装置の写真を示す。この写真では、システムはインターバルの間、または運転の終了時に、試料を溶出させる。図１Ｆは、図１Ｅの実験装置の構成を図式的に示す。ここでは、システムは、消化デバイスおよび解離／濾過デバイスを通して流体を送るように構成されている。これは細胞を溶出させるために用いられる。新鮮な酵素溶液をインターバルのために用い、緩衝液を最終溶出のために用いた。
【図2】図２Ａは、一実施形態による消化デバイスの概略図を示す。この設計には、２つの流体層、２つのビア層、ならびに上および下のエンドキャップを含む全部で６つの層が含まれている。組織はルアーポートを通って組織チャンバーの中に負荷される。図２Ｂは、組織チャンバーの概略図を示す。流体チャネルが流体力学的剪断力およびタンパク質分解酵素を導く一方、細切された組織片をチャンバー内に保持する。図２Ｃは、組み立てられた消化デバイスの写真を示す。図２Ｄは、一体化された解離／濾過デバイスの概略図を示す。消化デバイスからの組織断片および細胞凝集物は、拡大／縮小領域を有する分岐したマイクロチャネルおよびナイロンメッシュフィルターにおいて発生する流体力学的剪断力によってさらに破壊されることになる。図２Ｅは、組み立てられた解離／濾過デバイスの写真を示す。図２Ｆは、別の実施形態による消化デバイスの分解図を示す。
【図3】図３Ａ～図３Ｆは、マウス腎を用いるデバイスの最適化。（図３Ａ）腎を収穫し、細切し、細切消化デバイスを流量１０または２０ｍＬ／分で１５分または６０分、用いて処理し、全ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を定量した。ｇＤＮＡは対照から直接抽出し、したがってこれが最大回収を表す。流量２０ｍＬ／分の結果が、特に短い時点で優れていた。（図３Ｂ）流量１０（ｉ）または２０（ｉｉ）ｍＬ／分での１５分または６０分の処理の前および後の細切消化デバイスチャンバー内の組織の写真。１０ｍＬ／分では顕著な組織が残存していた一方、２０ｍＬ／分では組織は主として存在しなかった。（図３Ｃ）試料を細切消化デバイスで１５分、３０分、または６０分処理した後で、単一のＥｐＣＡＭ＋上皮細胞をフローサイトメトリーによって定量した。残存組織の処理を続けるためにより多くのコラーゲナーゼを加えて、様々なタイムインターバルにおける試料の回収も評価した。（図３Ｄ）上皮細胞の生存率は、全ての対照およびデバイス条件について約８０％であった。（図３Ｅ）１５分の消化デバイス処理に続いて、一体化された解離／濾過デバイスで試料を処理した。一体化されたデバイスを通るシングルパスによって最適の結果が得られた。（図３Ｆ）上皮細胞の生存率は、全ての条件について約８５～９０％であった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。＃は同じ消化時間の静的条件に対してｐ＜０．０５を示す。スケールバーは５ｍｍを表す。
【図4】図４Ａ～図４Ｃは、マウス腎についての微小流体プラットフォームの結果。腎を収穫し、細切し、消化デバイスで異なる１５分または６０分処理し、一体化された解離／濾過デバイスに１回通過させ、得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリーによって解析した。同じ組織試料からの１分、１５分、および６０分の時点におけるインターバル回収率を評価した。対照を細切し、１５分または６０分消化し、ピペッティング／ボルテックス処理し、細胞ストレーナーを通過させた。（図４Ａ）単一のＥｐＣＡＭ＋上皮細胞は、微小流体処理によって２．５倍増加した。インターバルの結果は静的な場合と同程度であり、１分のインターバルは１５分の対照と同程度の細胞数を産生した。傾向は内皮細胞（図４Ｂ）および白血球（図４Ｃ）で同様であった。微小流体処理は内皮細胞について特に効果的であり、６０分で対照より５倍を超えて多い細胞が得られた。内皮細胞は、１分のインターバルを除く全てのデバイス条件について対照に対して富化された。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図5】図５Ａ～図５Ｃは、マウス腎のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。１５分および６０分のインターバルで微小流体プラットフォームから得られた細胞懸濁液ならびに６０分の対照をＦＡＣＳで選別して死細胞およびデブリを除去し、１０Ｘクロミウムチップに負荷し、５０，０００リード超／細胞でシーケンシングした。（図５Ａ）２つの異なる近位尿細管サブタイプ、内皮細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球に対応する７つの細胞クラスターを呈示するＵＭＡＰ。７番目のクラスターは、遠位尿細管（ＤＣＴ）、ヘンレ係蹄（ＬＯＨ）、集合管（ＣＤ）、およびメサンギウム細胞（ＭＣ）に対応する混合集団を含んでいた。（図５Ｂ）それぞれの細胞クラスターおよび処理条件についての集団分布。近位尿細管は主として１５分のインターバルで微小流体プラットフォームから溶出した一方、内皮細胞およびマクロファージは６０分のインターバルで富化された。（図５Ｃ）応力応答スコアは一般に１５分のデバイスインターバルで低かった。
【図6】図６Ａ～図６Ｃは、マウス乳腺腫瘍についての微小流体プラットフォームの結果。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウス由来の乳腺腫瘍を切除し、細切し、微小流体プラットフォームで処理し、フローサイトメトリーによって解析した。（図６Ａ）ＥｐＣＡＭ＋上皮細胞は、両方の時点で約２倍高かった。（図６Ｂ）内皮細胞は微小流体プラットフォームによってさらに増強され、１５分および６０分後にそれぞれ５倍および１０倍多い細胞が回収された。（図６Ｃ）白血球は１５分および６０分後にそれぞれ３倍および５倍増加した。インターバルフォーマットは、やや高かった内皮細胞を除いて、対応する静的時点に対して同様の全細胞数を産生した。デバイス処理によって、１分以外の全ての時点で内皮細胞と白血球の両方が富化された。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を示す。
【図7】図７Ａ～図７Ｃは、マウス乳腺腫瘍のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ。１５分および６０分のインターバルで微小流体プラットフォームから得られた細胞懸濁液ならびに６０分の対照を処理し、腎と同様の条件を用いて解析した。（図７Ａ）上皮細胞、マクロファージ、内皮細胞、Ｔリンパ球、線維芽細胞、および顆粒球に対応する６つの細胞クラスターを呈示するＵＭＡＰ。（図７Ｂ）それぞれの細胞クラスターおよび処理条件についての集団分布。上皮細胞は主として１５分のインターバルで微小流体プラットフォームから溶出した一方、内皮細胞および線維芽細胞は６０分のインターバルで富化された。線維芽細胞は両方のプラットフォーム条件で富化された一方、顆粒球は枯渇した。（図７Ｃ）応力応答スコアは一般に、条件および細胞型にわたって同様であった。
【図8】図８Ａ～図８Ｅは、マウス肝についての微小流体プラットフォームの結果。（図８Ａ、８Ｂ）肝を収穫し、細切し、細切消化デバイス単独および一体化された解離／濾過デバイスとの組合せで評価した。肝細胞はフローサイトメトリーによって同定し、定量した。（図８Ａ）消化デバイスによって肝細胞の回収が１５分で約４倍増加したが、消化の継続および一体化された解離／濾過デバイスの１回の通過により、おそらく肝細胞のサイズが大きいことと脆弱性によって、肝細胞の収率が低下した。（図８Ｂ）肝細胞の生存率は、６０分の一体化条件を除く全ての条件について約７５～８０％であった。（Ｃ～Ｆ）短い消化時間および５０μｍのフィルターのみを含む解離／濾過デバイスによるシングルパスを用いた結果。（図８Ｃ）わずか５分の微小流体処理の後で、１５分の対照より４倍多く、６０分の対照よりわずかに少ない細胞が得られた。インターバル回収によって、肝細胞の収率は６０分の対照および１５分の静的条件に対して約２．５倍増強された。１分のインターバルが実質的に寄与し、６０分の対照の約７０％と多い肝細胞を産生した。インターバルの利点はさほど明白ではないが、内皮細胞（図８Ｄ）および白血球（図８Ｅ）でも同様の結果が観察された。微小流体処理は一般に白血球を富化したが、後のインターバルでは肝細胞へのシフトがあった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の６０分の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を示す。
【図9】図９Ａ～図９Ｃは、マウス心臓についての微小流体プラットフォームの結果。心臓を切除し、細切し、微小流体プラットフォーム（５０μｍと１５μｍの両方の膜）で処理し、フローサイトメトリーによって解析した。心筋細胞の感受性のため、短い消化デバイス時点を採用した。（図９Ａ）微小流体処理によって１５分後に１ｍｇあたり約１２，０００個の心筋細胞が産生され、これは６０分の対照より約２倍多かった。インターバル回収によって再び最適の結果が得られ、１５分の静的条件および６０分の対照条件に対して約５０％および約３倍増加した。内皮細胞（図９Ｂ）および白血球（図９Ｃ）の収率は、静的とインターバルの両方のフォーマットの下で６０分の対照より有意に低かった。インターバル回収は確かに改善したが、６０分の対照より約２分の１低いままであった。微小流体処理は一般に心筋細胞を富化した。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の６０分の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を示す。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｆは、ＭＣＦ－７細胞株による再循環研究。ＭＣＦ－７乳がん細胞を、様々な流量および様々な時点で、ペリスタポンプ（図１０Ａ、図１０Ｄ）、細切消化デバイス（図１０Ｂ、図１０Ｅ）、または解離／濾過デバイス（図１０Ｃ、図１０Ｆ）を通して連続的に送液した。（図１０Ａ～１０Ｃ）細胞計数を得て、対照に対して正規化した。細胞数は全ての条件下で、ポンプのみ（図１０Ａ）および消化デバイス（図１０Ｂ）においてやや低下した。（図１０Ｃ）解離デバイスは、１０ｍＬ／分における長い時点および２０ｍＬ／分における全ての時点で、細胞回収率を増加させた。（図１０Ｄ～１０Ｆ）細胞生存率は、５ｍＬ／分ではポンプのみ（図１０Ｄ）、消化デバイス（図１０Ｅ）、および解離デバイス（図１０Ｆ）で高いままであった。しかし、流量の増大は、単一細胞の収率の増加と逆相関する様式で解離デバイスについての生存率を低下させた。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図11】図１１Ａ～図１１Ｄは、マウス腎を用いる最適化研究からの白血球の結果。（図１１Ａ、図１１Ｂ）６０分消化した対照と比較した静的およびインターバルのフォーマットの下の細切消化デバイスの最適化。（図１１Ａ）白血球の収率は消化デバイスの処理時間とともに約１０００／ｍｇまで増加し、対照を約３０％上回った。インターバル回収は結果に影響しなかった。（図１１Ｂ）生存率は対照についての約６５％から全てのデバイス条件についての７０％超まで増加した。（図１１Ｃ、図１１Ｄ）消化デバイス中で１５分処理した試料を用い、１５分消化した対照と比較した、一体化された解離／濾過デバイスの最適化。（図１１Ｃ）白血球の回収はシングルパスの後で同じままであり、再循環でやや減少した。（図１１Ｄ）白血球の生存率は全ての条件について約８５％～９０％であった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５を示す。
【図12】図１２は、マウス腎についての赤血球の結果。大部分のＲＢＣはデバイス処理について早期の時点で溶出した。わずか１分後の大きな回収のため、全ての組織についてのインターバルの研究にこの時点を加えた。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図13】図１３Ａ～図１３Ｃはマウス腎を用いる最終の微小流体プラットフォーム研究からの細胞の生存率。（図１３Ａ）上皮細胞の生存率は全ての条件について約９５％であった。内皮細胞（図１３Ｂ）および白血球（図１３Ｃ）の生存率は約６０％～９０％の範囲であり、６０分の対照は両方の例で約７０％であった。デバイスプラットフォーム処理は、１分のインターバルを除く全ての条件で内皮細胞について高い生存率をもたらし、白血球は１５分の時点で（静的およびインターバル）増大した。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５を示す。
【図14】図１４Ａ～図１４Ｂは、腎細胞型の遺伝子スコアリング。７つの主要クラスター（図１４Ａ）およびサブクラスター（図１４Ｂ）のそれぞれについてのマーカー遺伝子シグネチャーを比較するために用いた細胞スコアリングの結果。
【図16】図１６Ａ～図１６Ｄは、腎クラスターにおけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５、およびＣＤ３１の発現。（図１６Ａ～Ｂ）ＥｐＣＡＭは、ＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ、およびＭＣクラスター（図１６Ａ）ならびにそれぞれの個別のサブクラスター（図１６Ｂ）の中で高度に発現した。（図１６Ｃ）ＣＤ４５はマクロファージ、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球のクラスターにおいて高度に発現した。（図１６Ｄ）ＣＤ３１は内皮細胞クラスターにおいて高度に発現した。
【図17】図１７Ａ～図１７Ｄは、マウス乳腺腫瘍を用いるデバイス最適化研究。（図１７Ａ、図１７Ｂ）様々な時点について操作した細切消化デバイス。（図１７Ａ）上皮細胞の収率は消化デバイスを用いることによって約２～２．５倍増加した。（図１７Ｂ）生存率は１５分の対照について約８０％で時間とともにわずかに減少した一方、全てのデバイス条件で８５％超であった。（図１７Ｃ、図１７Ｄ）消化デバイス中で１５分処理した試料を用いる一体化された解離／濾過デバイスの最適化。（図１７Ｃ）上皮細胞の回収はシングルパスの後で３０％増加した一方、再循環によって同様または少ない数が産生された。（図１７Ｄ）生存率は解離／濾過処理の後でわずかに低下したが、変化は有意でなかった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図18】図１８Ａ～図１８Ｃは、マウス乳腺腫瘍を用いる最終の微小流体プラットフォーム研究からの細胞の生存率。（図１８Ａ）上皮細胞の生存率は全ての条件について約７０～８０％であった。（図１８Ｂ）内皮細胞の生存率は一般に約５０～６０％で低かった。しかし、１分のデバイスインターバルは７５％で高かった一方、６０分の対照および１５分のデバイスインターバルはそれぞれ５０％および４０％で低かった。（図１８Ｃ）白血球の生存率は約６０％であった６０分の対照を除く全てで約８０％のままであった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。同じ消化時間の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５を示す。
【図19】図１９Ａ～図１９Ｃは、マウス乳腺腫瘍についての上皮細胞のサブクラスタリング。（図１９Ａ）上皮細胞クラスターは、内腔、基底、および増殖型内腔に対応する３つの区別できるサブクラスターを含んでいた。（図１９Ｂ）それぞれのサブクラスターにおける集団分布。内腔細胞は１５分のインターバルで富化された一方、基底細胞は６０分で富化された。（図１９Ｃ）サブクラスターは、一次的にＫｒｔ１４（基底）、Ｋｒｔ１８（内腔）、およびＭｋｉ６７（増殖型）遺伝子の発現に基づいて同定された。
【図20】図２０Ａ～図２０Ｄは、乳腺腫瘍クラスターにおけるＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５、およびＣＤ３１の発現。（図２０Ａ～図２０Ｂ）ＥｐＣＡＭは、上皮細胞クラスター（図２０Ａ）およびそれぞれのサブクラスター（図２０Ｂ）の中で高度に発現した。（図２０Ｃ）ＣＤ４５はマクロファージ、Ｔリンパ球、および顆粒球のクラスターで高度に発現した。（図２０Ｄ）ＣＤ３１は内皮細胞クラスターにおいて高度に発現した。
【図21】図２１Ａ～図２１Ｂは、マウス肝を用いるデバイス最適化研究。肝を細切消化で１５分処理し、改変した解離／濾過デバイス（５０μｍのフィルターのみ）を通過させた。（図２１Ａ）肝細胞は消化デバイスのみに対して３０％、１５分の対照に対してほぼ３倍、増加した。（図２１Ｂ）肝細胞の生存率は全ての条件について８５％超であった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。
【図22】図２２Ａ～図２２Ｃは、マウス肝を用いる最終の微小流体プラットフォーム研究からの細胞の生存率。（図２２Ａ）肝細胞の生存率は、約８５％に減少した６０分のインターバルを除く全ての条件について約９０％のままであった。内皮細胞（図２２Ｂ）および白血球（図２２Ｃ）の生存率は一般に約７０％～８５％であり、デバイス処理によって早期の時点で増加した。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。６０分の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。同じ消化時間の静的条件に対して＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を示す。
【図23】図２３Ａ～図２３Ｂは、マウス心臓を用いるデバイス最適化研究。心臓を細切消化デバイスで１５分処理し、元の（５０μｍおよび１５μｍのフィルター）または改変した（５０μｍのフィルターのみ）フォーマットで、一体化された解離／濾過を通過させた。心筋細胞の収率（図２３Ａ）および生存率（図２３Ｂ）は全ての条件について同様であった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。
【図24】図２４Ａ～図２４Ｃは、マウス心臓を用いる最終の微小流体プラットフォーム研究からの細胞の生存率。（図２４Ａ）デバイス処理した試料についての心筋細胞の生存率は対照と一致するかそれを上回った。内皮細胞（図２４Ｂ）および白血球（図２４Ｃ）の生存率は、デバイスおよび対照の条件について一般に８０％超であった。エラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表す。６０分の対照に対して、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図25】図２５は、フローサイトメトリーのゲーティングスキーム。細胞懸濁液を蛍光プローブ（表１に列挙）で染色し、フローサイトメトリーによってシグナルを評価した。次いでシーケンシャルゲーティングスキームを用いてデータを解析した。ゲート１ではＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａを用いてオリジン付近のデブリを排除した。ゲート２ではＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈを用いて単一細胞を選択した。ゲート３ではＣＤ４５－ＢＶ５１０対ＴＥＲ１１９－ＡＦ６４７を用いて白血球（ＣＤ４５＋ＴＥＲ１１９－）と赤血球（ＣＤ４５－ＴＥＲ１１９＋）を識別した。ゲート４はＣＤ４５－ＴＥＲ１１９－サブセットに適用し、ＰＥを用いてＥｐＣＡＭを介して上皮細胞（腎および腫瘍）、ＡＳＧＰＲ１を介して肝細胞（肝）、またはトロポニンＴを介して心筋細胞（心臓）を同定した。ゲート５をＥｐＣＡＭ／ＡＳＧＰＲ１／トロポニンＴ陰性細胞サブセットに適用し、ＣＤ３１－ＡＦ４８８を用いて内皮細胞を同定した。最後に、ゲート６では７－ＡＡＤ（腎、腫瘍、肝）またはＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（心臓）を用いて生細胞と死細胞を識別した。
【図26】図２６Ａ～図２６Ｂは、有足細胞マーカーを図示する。Ｎｐｈｓ１（図２６Ａ）およびＮｐｈｓ２（図２６Ｂ）の遺伝子発現。陽性発現は、主としてＬＯＨ、ＤＣＴ、ＣＤ、およびＭＣクラスターに存在する少数の細胞のみで示された。
【発明を実施するための形態】
【0013】
図１Ａ、図１Ｄ、および図１Ｆは、組織を処理するための微小流体システム１０を図式的に示す。微小流体システム１０は、細切された組織を最初に処理する消化デバイス１２を含む。消化デバイス１２は、入口１４および出口１６を含む。チューブ（たとえば本明細書に記載したチューブまたは導管２４）が容易に固定され、流体が消化デバイス１２に流入し、ならびに消化デバイス１２から除去されるように、入口１４および出口１６に返しを位置させてもよい。図１Ａを参照して、第１のポンプ１８（たとえばペリスタポンプ）が緩衝剤および／または酵素の溶液を消化デバイス１２に送液するために用いられ、一方細切された組織は消化デバイスの中の組織チャンバー２０に含まれる。第１のポンプ１８は、緩衝剤および／または酵素の溶液を含む流体源２２にチューブまたは導管２４を介して流体連結されている。ここで説明するように、図１Ｃ～図１Ｆに示すような一部の実施形態では、単一のポンプ１８のみが用いられる。図１Ａに示すような他の実施形態では、第１のポンプ１８および第２のポンプ４４が用いられ、それらの操作は本明細書でさらに説明する。第１のバルブ２６がチューブまたは導管２４の途中に介在しており、これは本明細書で説明するように流体源２２と消化デバイス１２からの戻りの間に流体を切り替えるために用いられる。
【0014】
組織チャンバー２０は、正方形または長方形の形状であってよい。組織チャンバー２０の例示的な寸法は、長さ５ｍｍ、幅８ｍｍ、高さ１．５ｍｍを有するチャンバーであってよい。他の実施形態では、組織チャンバー２０はより大きな組織試料を収容するためにより大きくてもよい。たとえば、組織チャンバー３０は長方形の形状で、組織の小片またはより大きな片を収容する寸法でもよい。組織チャンバー３０は、数ｃｍ（たとえば約２～３ｃｍ）および約１０ｃｍまでもの長さを有してよい。第１のポンプ１８は、図１Ａに示すように、チューブまたは導管２４を介して消化デバイス１２に連結されていてよい。第１のポンプ１８を介する消化デバイス１２への流体流に応じて、流体チャネル２８が流体力学的剪断力およびタンパク質分解酵素（流体中に含まれる場合）を導く一方、細切された組織片を組織チャンバー２０の中に保持する。一実施形態では、上流の流体チャネル２８の数は下流の流体チャネル２８の数に等しい（たとえば、４つのそのような流体チャネル２８が図１Ａに示されている）。この実施形態では、上流の流体チャネル２８は下流の流体チャネル２８と対称である。他の数の流体チャネル２８を用いてもよい。上流／下流の流体チャネル２８の幅は一部の実施形態では同じであってよい。流体チャネル２８の例示的な幅は約２５０μｍであるが、本明細書で説明するように、他の寸法の流体チャネル２８を用いてもよい。流体チャネル２８の長さは数ｍｍ（たとえば４ｍｍ）であってよい。流体チャネル２８は、信頼できる組み立ておよび一体性が保証されるように、互いに約１ｍｍ離れている。流体チャネル２８は、これらが下部にあるビア層と連結される領域（即ちフレア）では拡大しており、これも目詰まりの防止を意図していた。
【0015】
流体チャネル２８の数は、組織チャンバー２０の寸法に応じて変動し得る。たとえば、図２Ｂは、４つの上流流体チャネル２８と４つの下流流体チャネル２８を示している。組織チャンバー２０がより大きな体積または寸法を有する他の実施形態では、流体チャネル２８の数は多くてよい。たとえば、細長いまたはより大きな組織片を組織チャンバー２０に挿入する他の実施形態では、組織チャンバー２０の上流側／下流側に１０～２０個の流体チャネル２８があってもよい。同様に、流体チャネル２８の幅も変動し得る。一部の実施形態については（たとえば大きな組織片を処理する場合）、流体チャネル２８の幅は大きくてもよく、たとえば約５００μｍ～約７５０μｍの範囲の幅を有してもよい。
【0016】
組織試料（たとえば細切された組織）は、図１Ａ、図２Ａ、図２Ｃで見られるようにポート３０（たとえばルアーポート）を介して、または以下に述べるように上層７０ｇ（図２Ｆ）を開けることによって、消化デバイス１２に負荷される。ポート３０は負荷の後で栓またはストップコックで閉じることができる。図１Ａで見られるように、第１のポンプ１８は、緩衝剤および／または酵素を消化デバイス１２に送液する。第１のバルブ２６は、緩衝液および／または酵素の消化デバイス１２への流れを調節するために用いられる。消化デバイス１２は、消化デバイス１２の流出液が消化デバイス１２を通してポンプで戻されるように、再循環モードで運転してもよい（即ち、出口１６からの流出液は第１のポンプ１８を介して入口１４にポンプで戻される）。再循環モードでは、第１のバルブ２６および第２のバルブ３２は、流体の流れ（およびその中に含まれる含有物）が消化デバイス１２を通って再循環することを可能にするように作動される。もちろん、消化デバイス１２は、流れを消化デバイス１２に戻して再循環させないモードで構成してもよい。この構成では、出口１６の流出液は、以下に述べるように解離／濾過デバイス４０に進む。この後者のモードでは、第２のバルブ３２は、流れを解離／濾過デバイス４０に導くように作動される。
【0017】
まだ図１Ａを参照し、解離／濾過デバイス４０は、消化デバイス１２と解離／濾過デバイス４０との間に介在する第３のバルブ４２とともに、チューブまたは導管２４を介して消化デバイス１２の流出液に流体連結されている。第３のバルブ４２は、消化デバイス１２の出口１６から、または第２のポンプ４４から、流れが解離／濾過デバイス４０に流入することを可能にするように作動される。解離／濾過デバイス４０は、入口４６、第１の出口４８、および第２の出口５０を含む。入口４６、第１の出口４８、および第２の出口５０は、チューブまたは導管２４をそれらに取り付けることを容易にするための返しのある端部を有してもよい。第１の出口４８は、解離／濾過デバイス４０の中で形成された一連の解離チャネル５２からの解離力を受けたがさもなければ濾過されていない、処理された組織断片および細胞凝集物を通過させるために用いられる。解離チャネル５２は、組織断片および細胞凝集物に剪断力を付与するためにその長さに沿って形成された拡大／縮小領域とともに流体流の方向における小さな寸法（たとえば幅）の一連の分岐した（たとえば二分岐した）チャネルによって形成されている。たとえば図１Ｂに見られるように、解離チャネル５２は、分岐５３において２つのチャネル５２に分岐する単一のチャネル５２を含んでよく、これは次に分岐５３において４つのチャネル５２に分岐し、これは次に分岐５３において８つのチャネル５２に分岐し、これは次に分岐５３において１６個のチャネル５２に分岐する。この実施形態では、したがって５つのステージが存在する。分岐した解離チャネル５２は、上流の解離チャネル５２と比較して幅が低減している（１／２）。解離チャネル５２の長さに沿って拡大領域５４および縮小領域５６があり、これらはこれを通過する組織断片および細胞凝集物に剪断応力を付与するように構成されている。拡大領域および縮小領域５４、５６は、好ましくは解離チャネル５２の長さに沿って連続している。解離チャネル５２における拡大領域および縮小領域５４、５６は、解離チャネル５２の幅が増加し減少する交互領域である。拡大領域および縮小領域５４、５６は、変化する寸法スケールおよび規模の流体ジェットを発生し、流体力学的剪断力を用いて組織断片および細胞凝集物の破壊を補助する。拡大領域および縮小領域の設計によって段階的な脱凝集が可能になり、それにより、大きな細胞損傷を惹起することなく、細胞収率を最大化することができる。
【0018】
１つの好ましい実施形態では、特定のステージの中の拡大領域５４の幅は、縮小領域５６の幅の３倍である。したがって、一実施形態では、第１ステージ（単一の解離チャネル５２）は２ｍｍの縮小領域５６の幅を有し、拡大領域５４の幅は６ｍｍである。第２ステージでは、縮小領域５６の幅は１ｍｍであり、拡大領域５４の幅は３ｍｍである。第３ステージでは、縮小領域５６の幅は０．５ｍｍであり、拡大領域５４の幅は１．５ｍｍである。第４ステージでは、縮小領域５６の幅は０．２５ｍｍであり、拡大領域５４の幅は０．７５ｍｍである。第５ステージでは、縮小領域５６の幅は約０．１２５ｍｍであり、拡大領域５４の幅は約０．３７５ｍｍである。解離チャネル５２の最終ステージの後では、チャネルは流体を共通収集領域５８に収集する。以下に論じるように、処理された組織を含む流体は、次に解離／濾過デバイス４０の外に（濾過なしに）、または濾過のためのフィルター媒体を通して、導いてよい。
【0019】
まだ図１Ａを参照し、解離／濾過デバイス４０は、処理された組織断片および細胞凝集物を含む流体のための２つの流路を有する。第１の流路では、解離チャネル５２を通過する処理された組織断片および細胞凝集物は第１の出口４８を通過する。この流路では、流路中に介在する濾過媒体は存在しない。たとえば、処理された組織断片および細胞凝集物は第１の出口４８を離れ、次いで第１のポンプ１８および／または第２のポンプ４４を用いて解離／濾過デバイス４０に再循環してもよい。この第２のポンプ４４は、緩衝剤源６０から解離／濾過デバイス４０を通して緩衝液を送液する（たとえば解離／濾過デバイス４０を洗い流す）ためおよび／または処理された組織断片および細胞凝集物を入口４６に戻して再循環するために用いられる。
【0020】
第２の流路では、処理された組織断片および細胞凝集物は、次に２つの異なるフィルター６２、６４（たとえばナイロンメッシュフィルター）に導かれる。第２の流路に沿う流れは、第１の出口４８からの流れを栓またはキャップで塞ぎ、次いで第１のポンプ１８および／または第２のポンプ４４による送液に応じて第２の流路に沿って流れ（および含有物）を強制することによって達成される。流路中の第１のフィルター６２は、大きな寸法の組織断片および細胞凝集物の第１の濾過およびそれに続く小さな孔径を有する小さなフィルターメッシュを可能にするために、流路中の第２のフィルター６４（たとえば約１５～５０μｍ）より大きな孔径（たとえば約５０～１００μｍ）を有してよい。典型的には、細孔の寸法範囲は約５μｍ～約１，０００μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約１，０００μｍ、または約５μｍ～約１００μｍの範囲内である。一実施形態では、第１のフィルター膜６２は直径ｄ１を有する細孔を有し、第２のフィルター膜６４は直径ｄ２を有する細孔を有し、ここでｄ１＞ｄ２である。第２のポンプ４４は導管またはチューブ２４を介して解離／濾過デバイス４４に連結されている。第４のバルブ６６が、解離／濾過デバイス４０からの流れの再循環および緩衝液またはその他の流体の解離／濾過デバイス４０への添加を可能にするために備えられている。第２の出口５０は、フィルター６２、６４を通過した流体を輸送する。この流体は、典型的には解離／濾過デバイス４０からの流出液である単一細胞を含んでいる。
【0021】
図２Ａは、一実施形態による消化デバイス１２の概略図を示す。この設計には、２つの流体層７０ａ、７０ｂ、２つのビア層７０ｃ、７０ｄ、ならびに上および下のエンドキャップ７０ｅ、７０ｆを含む全部で６つの層が含まれている。組織はルアーポート３０を通って組織チャンバー２０の中に負荷される。図２Ｃは、組み立てられた消化デバイス１２の写真を示す。図２Ｂは、流体層７０ａの中に位置する組織チャンバー２０の概略図を示す。流体チャネル２８が流体力学的剪断力を付与し、タンパク質分解酵素を運搬する流体を導く一方、細切された組織片を組織チャンバー２０の中に保持する。図２Ｄは、一体化された解離／濾過デバイス４０において用いられる層の分解図を示す。消化デバイス１２からの組織断片および細胞凝集物は、拡大／縮小領域５４、５６を有する分岐した解離チャネル５２およびナイロンメッシュフィルター６２、６４において発生する流体力学的剪断力によってさらに破壊される。
【0022】
図２Ｆは、消化デバイス１２の別の実施形態を示す。この実施形態では、図２Ａ～図２Ｃに示すようにポート３０を用いて組織を負荷するよりむしろ、組織チャンバー２０は図２Ｆで見られるように開いており、除去可能な上層７０ｇによってカバーされている。流体チャネル２８および組織チャンバー２０は層７０ａの中で形成され、上層７０ｇは組織試料を負荷した後で組織チャンバー２０をカバーおよびシールするために用いられる。層７０ａに対して上層７０ｇを固定しシールするために、一対のファスナー７１が用いられる。層７０ａに対して上層７０ｇを固定する前に、裏側に接着剤を有する薄いプラスチック層を用いて組織チャンバー２０をシールしてもよい。図２Ｅで見られるように、１つまたは複数の消化デバイス１２を収容するための寸法を有する凹部７３を含む基板７２が備えられている。ねじ山のついたねじ等を含んでもよいファスナー７１が、基板７２の開口７４に係合している。これに関して、消化デバイス１２に組織を素早く負荷し、次いで使用のために組み立ててもよい。図２Ｆで見られるように、入口１４および出口１６が位置する上層７０ｇの凹部に一対のＯリング７６が位置している。
【0023】
解離／濾過デバイス４０は、多層８０ａ～８０ｇ（たとえば７層）から形成されてもよい。図２Ｄで見られるように、これは本明細書に記載する任意選択のフィルター６２、６４のための流路に加えて、上層８０ａ、下層８０ｂ、および解離チャネル５２を含む中間流体チャネル層８０ｃ、８０ｄ、９０ｅを含む。垂直流のための穴または開口ならびに第１のフィルター６２および第２のフィルター６４を含む流路も含むビア層８０ｆ、８０ｇが備えられている。消化デバイス１２および解離／濾過デバイス４０は、硬いプラスチック（ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））にレーザーマイクロマシン加工されたチャネルおよびビア機構とともに、市販のラミネートプロセスを用いて組み立てることができる。次いで全ての層およびその他の部品を位置合わせして、感圧接着剤を用いて接着することができる。組み立てられたデバイスの写真を、図２Ｃ（消化デバイス１２）および図２Ｅ（解離／濾過デバイス４０）に示す。
【0024】
システム１０を用いるため、組織の試料を組織チャンバー２０に入れる。処理される組織は、組織チャンバー２０に入れる前に細切する（たとえば組織をメスで寸法約１ｍｍ３の小片に細切する）のが好ましい。組織の試料は、たとえば腎、肝、心臓、乳腺組織を含む任意の型の哺乳動物組織を含んでよい。組織は健常でも疾患を有してもよい。次いで第１のポンプ１８で消化デバイス１２に緩衝剤および酵素を満たす。第１のポンプ１８はペリスタポンプが好ましい。次いでポート３０をストップコック等でシールし、次いで第１のポンプ１８によって消化デバイス１２を通して流体を再循環する。消化デバイス１２を通る流量は変動し得るが、一般には約１０～約１００ｍＬ／分の範囲内である。再循環は、数分から１時間またはそれ以上まで行ってよい。一部の実施形態では、再循環流をこの全時間にわたって維持する（即ち静的流れ操作）。他の実施形態では、インターバル操作を用いて消化デバイス１２を運転する。この場合には、組織を短時間処理し、細胞懸濁液を溶出させ、消化デバイス１２の中の酵素（たとえばコラーゲナーゼ）を置き換え、次いで再循環を継続する。
【0025】
本明細書で開示する消化デバイス１２はルアーポート３０を使用しているが、他のポートを用いてもよい。さらに、まだ他の実施形態では、消化デバイス１２の上層７０ａは、消化デバイス１２の残りの部分に固定されて組織チャンバー２０の中に組織を負荷することができる蓋またはキャップを含んでもよい。蓋またはキャップは、１つまたは複数のファスナー等を用いて固定してもよい。システム１０のデバイス部品（たとえば微小流体消化デバイス１２および解離／濾過デバイス４０）は、光学的酵素活性を維持するために約３７℃で、インキュベーターまたは温度制御された環境中でインキュベートされたままにしておくことが好ましい。
【0026】
試料がいったん消化デバイス１２で処理されれば、ここで処理された試料は次に解離／濾過デバイス４０に移動する。流体は出口１６から出て、チューブまたは導管２４を通過し、解離／濾過デバイス４０の入口４６に入る。再循環を意図する場合には、チューブまたは導管２４は第１の出口４８（即ち直交流出口）と第２のポンプ４４とを連結する一方、第２の出口５０はストップコックによって閉じられる。次いで流体は第２のポンプ４４を用いて解離チャネル５２を通って送液または再循環される。この第２のポンプ４４はシリンジポンプまたはペリスタポンプを含んでよい。解離／濾過デバイス４０を通る流量は変動し得るが、一般に約５～約５０ｍＬ／分の範囲内である。試料の最終収集のため、または解離部品（即ち解離チャネル５２）を通るシングルパスのみが利用される場合は、直交流出口４８はストップコックバルブ（またはキャップ／栓）で閉じられ、試料は第２の出口５０（即ち流出液出口）を通して送液され収集される。この流体または流出液は単一細胞を含んでいる。残存する細胞があればこれを流し出して収集するために、解離／濾過デバイス４０を緩衝液で洗浄してよい。即ち、解離／濾過デバイス４０については、解離チャネル５２およびフィルター６２、６４を通り、第２の出口５０を出るシングルパスを作製することができる。あるいは、消化デバイス１２からの試料を、解離チャネル５２を通して複数サイクルで再循環し、続いてフィルター６２、６４を通し、第２の出口５０を通過させてもよい。
【0027】
微小流体消化デバイス１２および解離／濾過デバイス４０はチューブまたは導管２４を介して流体連結されていてよい。同様に、チューブまたは導管２４は、ポンプ１８、４４を微小流体消化デバイス１２および解離／濾過デバイス４０に連結している。バルブ２６、３２、４２、６６は、たとえば図１Ａに示すように、導管またはチューブ２４の中に介在している。これらのバルブ２６、３２、４２、６６、およびポンプ１８、４４は、制御ユニットまたはコンピューターデバイスを用いてコンピューター制御してよい。たとえば、制御ユニットまたはコンピューターデバイスは、ポンプ１８、４４の流量、ならびにバルブ２６、３２、４２、６６のタイミングおよび作動を制御してよい。
【実施例】
【0028】
デバイスの設計および組み立て
細切した組織を、デバイス１２の上部のポートを通して負荷する。次いでこのポートはキャップまたはストップコックを用いてシールすることができる。メスによる組織の約１ｍｍ３の片への細切は広く行われており、したがってこのフォーマットは多様な組織型および解離プロトコルとの適合性がある。負荷ポート３０、組織を適所に保持する組織チャンバー２０、および流体剪断力を適用し、タンパク質分解酵素を送達する流体チャネル２８を含む新たな細切組織消化デバイスの全体の設計レイアウトを図２Ａに示す。これらの機構を、２つの流体チャネル層７０ａ、７０ｂ、２つの「ビア」層７０ｃ、７０ｄ、ホース用の返しおよび負荷ポート３０を有する上部エンドキャップ７０ｅ、および下部エンドキャップ７０ｆを含む硬いプラスチックの６つの層、７０ａ～７０ｆにわたって配置した。組織チャンバー２０は最上部の流体層７０ａの中、負荷ポート３０および直径２．５ｍｍのビアの直下にあり、詳細な図を図２Ｂに示す。負荷の間、組織が均一に分布できるよう、長さおよび幅が５ｍｍの正方形の形状を採用した。組織チャンバー２０の高さは１．５ｍｍであり、試料の負荷およびデバイス１２の操作の間の塞栓を防止するために、細切組織よりわずかに大きい。流体チャネル２８は組織チャンバー２０の上流および下流に設けられ、両方の場合に幅２５０μｍの４つのチャネルを採用した。塞栓の防止を重視しているので、細切フォーマットには対称的なチャネル２８のデザインを選択した。大きな組織片がずっと絞られるのを防止するため、チャネル長さは４ｍｍに延長したが、下にあるビア層との連結を容易にするために末端を広げた。
細切した組織を、デバイス１２の上部のポートを通して負荷する。次いでこのポートはキャップまたはストップコックを用いてシールすることができる。メスによる組織の約１ｍｍ３の片への細切は広く行われており、したがってこのフォーマットは多様な組織型および解離プロトコルとの適合性がある。負荷ポート３０、組織を適所に保持する組織チャンバー２０、および流体剪断力を適用し、タンパク質分解酵素を送達する流体チャネル２８を含む新たな細切組織消化デバイスの全体の設計レイアウトを図２Ａに示す。これらの機構を、２つの流体チャネル層７０ａ、７０ｂ、２つの「ビア」層７０ｃ、７０ｄ、ホース用の返しおよび負荷ポート３０を有する上部エンドキャップ７０ｅ、および下部エンドキャップ７０ｆを含む硬いプラスチックの６つの層、７０ａ～７０ｆにわたって配置した。組織チャンバー２０は最上部の流体層７０ａの中、負荷ポート３０および直径２．５ｍｍのビアの直下にあり、詳細な図を図２Ｂに示す。負荷の間、組織が均一に分布できるよう、長さおよび幅が５ｍｍの正方形の形状を採用した。組織チャンバー２０の高さは１．５ｍｍであり、試料の負荷およびデバイス１２の操作の間の塞栓を防止するために、細切組織よりわずかに大きい。流体チャネル２８は組織チャンバー２０の上流および下流に設けられ、両方の場合に幅２５０μｍの４つのチャネルを採用した。塞栓の防止を重視しているので、細切フォーマットには対称的なチャネル２８のデザインを選択した。大きな組織片がずっと絞られるのを防止するため、チャネル長さは４ｍｍに延長したが、下にあるビア層との連結を容易にするために末端を広げた。
【0029】
解離／濾過デバイス４０は、消化デバイス１２の組織チャンバー２０を出るために十分小さな組織断片および細胞凝集物を処理する。これには、分岐したチャネルアレイ（即ち、解離チャネル５２）の中で生じる剪断力およびナイロンメッシュフィルター６２、６４との物理的相互作用を介する脱凝集が含まれる。ここで、解離および濾過の機能が単一のデバイス４０に一体化されて、ホールドアップ体積が最小化され、操作が単純化される。細切消化デバイスおよび一体化された解離／濾過デバイス１２、４０を、硬いプラスチック（ＰＭＭＡまたはＰＥＴ）にレーザーマイクロマシン加工されたチャネル機構とともに、市販のラミネートプロセスを用いて組み立てた。次いで全ての層およびその他の部品を位置合わせして、感圧接着剤を用いて接着した。組み立てたデバイスの写真を、図２Ｄおよび図２Ｅに示す。
【0030】
マウス腎を用いるプラットフォームの最適化
成体のマウス腎試料を用いて、消化デバイス１２を評価した。腎は解剖学的にも機能的にも区別できる構造からなる複雑な臓器であり、成体の腎組織は、単一細胞に解離することが困難な密な細胞外マトリックスを有している。新たに切除した腎を、メスを用いて約１ｍｍ３の片に細切し、ルアーポート３０を通して細切消化デバイス１２に負荷した。次いでデバイス１２およびチューブ２４に０．２５％Ｉ型コラーゲナーゼ含有ＰＢＳを充填し、ストップコックを用いてルアー流入ポート３０をシールし、ペリスタポンプ１８を用いてデバイス１２を通して流体を再循環した。流量１０および２０ｍＬ／分を試験した。１５分または６０分の再循環の後、試料を収集し、洗浄し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出して、全細胞回収率を評価した。上限回収率を得るために対照を細切してｇＤＮＡを直接抽出した。１０ｍＬ／分では、ｇＤＮＡは１５分後および６０分後にそれぞれ対照の約１５％および６０％であった（図３Ａ）。流量を２０ｍＬ／分に増加すると、結果はそれぞれ約４０％および８５％に改善された。それぞれの実験の終了時に組織チャンバー２０の画像を捕捉し、代表的な結果を図３Ｂに示す。組織は１０ｍＬ／分で組織チャンバー２０または隣接するチャネル２８の中に残存していることが一貫して観察され、低いｇＤＮＡ回収の結果が確証された。２０ｍＬ／分で６０分後に、少量の組織のみがチャネル／ビアの中で見出され、ｇＤＮＡの回収が対照よりわずかに少ない理由の説明の助けになる。もう１つの可能性は、細胞が再循環の間に損傷または破壊されたということである。この懸念に対処するため、ＭＣＦ－７乳がん細胞をシステム１０に再循環し、細胞数および生存率を評価した（図１０Ａ～図１０Ｆを参照）。細胞の回収率は流量または時間に関わらず、消化デバイス１２を通る再循環の後で約１０％減少することが観察された。さらに、ペリスタポンプ１８単独で再循環した後の結果も同様で、細胞の生存率は試験した全ての条件について高いままであった。これにより、試料の喪失は損傷ではなく、システム１０の中のホールドアップまたは移送ステップに関連している可能性が最も高いことが確認される。組織チャンバー２０を空にしてｇＤＮＡを単離するために２０ｍＬ／分がより効果的であったので、残りの実験にはこの流量を用いた。
成体のマウス腎試料を用いて、消化デバイス１２を評価した。腎は解剖学的にも機能的にも区別できる構造からなる複雑な臓器であり、成体の腎組織は、単一細胞に解離することが困難な密な細胞外マトリックスを有している。新たに切除した腎を、メスを用いて約１ｍｍ３の片に細切し、ルアーポート３０を通して細切消化デバイス１２に負荷した。次いでデバイス１２およびチューブ２４に０．２５％Ｉ型コラーゲナーゼ含有ＰＢＳを充填し、ストップコックを用いてルアー流入ポート３０をシールし、ペリスタポンプ１８を用いてデバイス１２を通して流体を再循環した。流量１０および２０ｍＬ／分を試験した。１５分または６０分の再循環の後、試料を収集し、洗浄し、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出して、全細胞回収率を評価した。上限回収率を得るために対照を細切してｇＤＮＡを直接抽出した。１０ｍＬ／分では、ｇＤＮＡは１５分後および６０分後にそれぞれ対照の約１５％および６０％であった（図３Ａ）。流量を２０ｍＬ／分に増加すると、結果はそれぞれ約４０％および８５％に改善された。それぞれの実験の終了時に組織チャンバー２０の画像を捕捉し、代表的な結果を図３Ｂに示す。組織は１０ｍＬ／分で組織チャンバー２０または隣接するチャネル２８の中に残存していることが一貫して観察され、低いｇＤＮＡ回収の結果が確証された。２０ｍＬ／分で６０分後に、少量の組織のみがチャネル／ビアの中で見出され、ｇＤＮＡの回収が対照よりわずかに少ない理由の説明の助けになる。もう１つの可能性は、細胞が再循環の間に損傷または破壊されたということである。この懸念に対処するため、ＭＣＦ－７乳がん細胞をシステム１０に再循環し、細胞数および生存率を評価した（図１０Ａ～図１０Ｆを参照）。細胞の回収率は流量または時間に関わらず、消化デバイス１２を通る再循環の後で約１０％減少することが観察された。さらに、ペリスタポンプ１８単独で再循環した後の結果も同様で、細胞の生存率は試験した全ての条件について高いままであった。これにより、試料の喪失は損傷ではなく、システム１０の中のホールドアップまたは移送ステップに関連している可能性が最も高いことが確認される。組織チャンバー２０を空にしてｇＤＮＡを単離するために２０ｍＬ／分がより効果的であったので、残りの実験にはこの流量を用いた。
【0031】
次に、フローサイトメトリーを用いて単一細胞を解析した。表１に列挙したように、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞）、ＴＥＲ１１９（赤血球）、ＣＤ４５（白血球）、および７－ＡＡＤ（生／死）に特異的な抗体および蛍光プローブのパネルを用いて、細胞懸濁液を標識した。
【0032】
【0033】
単一上皮細胞の数は１５分から６０分への処理時間とともに増加し、約１４，０００細胞／ｍｇ組織まで産生することが見出された（図３Ｃ）。これは、一定の撹拌の下に６０分消化し、続いて標準的な組織解離プロトコルに倣って繰り返しピペッティングおよびボルテックス処理をした対照に対して１．５倍の増加を表している。消化デバイス１２においてわずか１５分後に、上皮細胞は４倍長い時間消化した対照と統計的に同様であったことに注目されたい。短時間の処理、細胞懸濁液の溶出、消化デバイス１２におけるコラーゲナーゼの置き換え、および再循環の継続を含むインターバル操作フォーマットも検討した。上皮細胞数はインターバル操作のそれぞれの時点で静的操作と同様に集積したことが観察された。これはインターバル収集が結果を損なわないことを実証しており、上皮細胞が長時間の再循環に耐えることを示唆している。上皮細胞の生存率は全ての対照およびデバイス条件について約８０％であり、デバイス処理が細胞に悪影響を及ぼさないことがさらに確認された（図３Ｄ）。細胞数および生存率に関する結果は白血球についても同様であった（図１１Ａおよび図１１Ｂ参照）。
【0034】
一体化された解離／濾過デバイス４０が消化デバイス１２の後で単一細胞収率をさらに増強できるか否かを次に検討した（図１０Ａ～図１０Ｆ）。ＭＣＦ－７モデルを用いて最初の試験を実施し、２０ｍＬ／分の再循環は短時間であっても低い生存率をもたらすことが見出された。１０ｍＬ／分では、単一細胞は３０秒の再循環の後に約２０％増加し、生存率に変化はなかった。再循環時間が長いと単一細胞数が増強されたが、生存率は低下した。したがって、消化デバイスを用いて１５分処理した細切腎を用いる１０ｍＬ／分での短い再循環時間を選択した。最終ステップとして、フィルター６２、６４のナイロンメッシュ膜に１０ｍＬ／分で試料を通過させた。単一の上皮細胞回収数を図３Ｅに提示する。消化デバイス１２は、１５分消化した対照より４倍多い単一細胞を産生した。一体化されたデバイス（消化デバイス２および解離／濾過デバイス４０）を通るシングルパスによって、単一上皮細胞は対照より約５．５倍多い消化のみと比較して約４０％増加した。分岐チャネルアレイを通る再循環は、シングルパスより少ない細胞を産生した。上皮細胞の生存率は全ての条件において約８５～９０％であった（図３Ｆ）。同様の結果が白血球について観察された（図１１Ａ～図１１Ｄを参照）。これらの結果に基づき、腎を用いる全ての研究について、一体化された解離／濾過デバイス４０を通るシングルパス操作を選択した。一体化されたデバイスは、フローサイトメトリーに先立つ細胞のストレーナー処理ステップの必要性を除去することに注目されたい。
【0035】
マウス腎の単一細胞解析
完全な微小流体プラットフォームを用いる様々な消化時間の下に腎を評価した。内皮細胞（ＣＤ３１を介する。表１）も、これらが従来の解離法では単離が困難であるため、フローサイトメトリーのパネルに加えた。細切した組織を消化デバイス１２に負荷し、静的（１５分または６０分）またはインターバル（１分、１５分、および６０分）のフォーマットの下に処理し、次いで一体化された解離／濾過デバイス４０を一回通過させた。対照を細切し、消化（１５分または６０分）し、ボルテックス／ピペッティングによって脱凝集し、細胞ストレーナーを用いて濾過した。上皮細胞についての結果を図４Ａに提示する。これらは一般に最適化研究（図３Ｃ）と同様であるが、上皮細胞は約２０，０００／ｍｇ組織に増加した。これは一体化された解離／濾過デバイス４０による最適化研究より約４０％高く、全体として６０分の対照の２倍を超えていた。驚くべきことに、１分のインターバルは約１５００上皮細胞／ｍｇを産生し、これは１５分の対照と同様であった。この時点は、主として赤血球を除去するために選択した（図１２参照）。デバイス処理は内皮細胞についてさらにより効果的であり（図４Ｂ）、これは６０分の対照を５倍超、上回った。白血球についての知見（図４Ｃ）は一般に上皮細胞と同様であった。インターバルフォーマットで全ての細胞型について６０分の静的条件に対して全細胞回収率のわずかな減少が観察されたが、これは統計的に有意ではなかった。このわずかな減少は、移送および／または充填のプロセスの間の試料の損失によるものであろう。あるいは、消化デバイスの中に留まっていればさもなければ崩壊していたかもしれない細胞クラスターが初期のインターバルで溶出した可能性もある。６０分の対照に対して、内皮細胞は１分のインターバルを除く全てのデバイス条件で富化された。白血球は少なく見積もられた１５分の対照を除いて同様のレベルで存在していた。興味あることに、変動係数（下の表２を参照）によって測定されるバッチ間の再現性は、それぞれの条件について処理時間とともに低下し、インターバルを用いる微小流体システム１について最低であった。デバイス処理の後の３種全ての細胞型についての生存率は、対照と同様または対照を上回っていた（図１３Ａ～図１３Ｃ参照）。
完全な微小流体プラットフォームを用いる様々な消化時間の下に腎を評価した。内皮細胞（ＣＤ３１を介する。表１）も、これらが従来の解離法では単離が困難であるため、フローサイトメトリーのパネルに加えた。細切した組織を消化デバイス１２に負荷し、静的（１５分または６０分）またはインターバル（１分、１５分、および６０分）のフォーマットの下に処理し、次いで一体化された解離／濾過デバイス４０を一回通過させた。対照を細切し、消化（１５分または６０分）し、ボルテックス／ピペッティングによって脱凝集し、細胞ストレーナーを用いて濾過した。上皮細胞についての結果を図４Ａに提示する。これらは一般に最適化研究（図３Ｃ）と同様であるが、上皮細胞は約２０，０００／ｍｇ組織に増加した。これは一体化された解離／濾過デバイス４０による最適化研究より約４０％高く、全体として６０分の対照の２倍を超えていた。驚くべきことに、１分のインターバルは約１５００上皮細胞／ｍｇを産生し、これは１５分の対照と同様であった。この時点は、主として赤血球を除去するために選択した（図１２参照）。デバイス処理は内皮細胞についてさらにより効果的であり（図４Ｂ）、これは６０分の対照を５倍超、上回った。白血球についての知見（図４Ｃ）は一般に上皮細胞と同様であった。インターバルフォーマットで全ての細胞型について６０分の静的条件に対して全細胞回収率のわずかな減少が観察されたが、これは統計的に有意ではなかった。このわずかな減少は、移送および／または充填のプロセスの間の試料の損失によるものであろう。あるいは、消化デバイスの中に留まっていればさもなければ崩壊していたかもしれない細胞クラスターが初期のインターバルで溶出した可能性もある。６０分の対照に対して、内皮細胞は１分のインターバルを除く全てのデバイス条件で富化された。白血球は少なく見積もられた１５分の対照を除いて同様のレベルで存在していた。興味あることに、変動係数（下の表２を参照）によって測定されるバッチ間の再現性は、それぞれの条件について処理時間とともに低下し、インターバルを用いる微小流体システム１について最低であった。デバイス処理の後の３種全ての細胞型についての生存率は、対照と同様または対照を上回っていた（図１３Ａ～図１３Ｃ参照）。
【0036】
【0037】
表２は、様々な処理条件における腎試料についての変動係数の値を示す。
【0038】
次にｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを実施した。これは、マウス腎の中に存在する多様な細胞型の一覧表を作成し、アトラスを創成するために用いられている。システム１０を用いて腎組織を処理し、６０分の対照の評価とともに１５分および６０分のインターバルを収集した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてデブリおよび死細胞から生きている単一細胞を単離し、液滴対応１０Ｘクロミウムプラットフォームに負荷して、３４，０３４個の細胞を約６０，０００リード／細胞の平均デプスでシーケンシングした。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ品質評価指標を下の表３に示す。これらは条件にわたって同程度であった。
【0039】
【0040】
表３は、腎および乳腺腫瘍の試料についてのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ評価指標を示す。
【0041】
濾過の後、Ｓｅｕｒａｔを用いて７種の細胞クラスターを同定（図５Ａ）およびアノテート（図１４Ａ～図１４Ｂを参照）した。これは、近位尿細管の２つのクラスター（渦巻き型、即ちＳ１、および直線状、即ちＳ２～Ｓ３）、内皮細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球を含んでいた。最終クラスターは不均一で、遠位渦巻き型尿細管（ＤＣＴ）、ヘンレ係蹄（ＬＯＨ）、および集合管（ＣＤ）に由来する細胞、ならびにメサンギウム細胞（ＭＣ）を含んでいた。対照およびデバイスの条件で７種全てのクラスターが表れた。それぞれのクラスターの細胞の相対数を図５Ｂに示す。近位尿細管が主要な細胞集団であり、対照の約５３％を表し、これは最近公開されたマウス腎アトラスとよく一致していた。近位尿細管は１５分のデバイス条件でさらに富化され、細胞懸濁液の約８６％を占めた。その他の細胞集団は対照に対して最大２分の１に少なく見積もられたが、マクロファージについては８倍にも達した。しかし、これが回収率の低下によって生じたのか、単に近位尿細管による希釈によるのかは明らかではない。６０分のデバイスインターバルのみが約２９％の近位尿細管を含んでいたが、大部分は１５分のインターバルで既に除去されていたことが推測された。内皮細胞は６０分で明らかに富化され、懸濁液の約２５％に増加した一方、残りの細胞型は対照値に近いままであった。ＤＣＴ、ＬＯＨ、ＤＣ、およびＭＣのサブクラスターの中で同様の傾向が観察された（図１５Ａ、図１５Ｂ参照）。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ（図５Ｂ）およびフローサイトメトリーから得られた集団パーセンテージを比較するため、どの細胞集団がそれぞれのマーカーを発現しそうかについて考慮しなければならない。ＣＤ４５およびＣＤ３１の遺伝子発現は適切なクラスターとよく相関した（図１６Ａ～図１６Ｄ参照）。ＥｐＣＡＭについてはＤＣＴおよびＣＤ細胞が高いレベルで発現することが示されている一方、近位尿細管およびＬＯＨ細胞は低いレベルから非検出レベルまでの範囲にあった。シーケンシング結果の検討により、ＥｐＣＡＭは少なくともＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ、およびＭＣサブクラスターのサブセットによって高度に発現することが示された（図１６Ａ～図１６Ｄ参照）。興味あることに、近位尿細管は主としてＥｐＣＡＭ陰性であったが、これは低い基底発現および／または低いタンパク質ターンオーバー等の起こり得る二次的要因によって説明されよう。低レベルの発現を識別することを助けるため、最も明るい蛍光色素であるフィコエリスリン（ＰＥ）を用いてＥｐＣＡＭを染色したが、一部の細胞近位尿細管が未検出のままであった可能性がある。全ての近位尿細管、ＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ、およびＭＣクラスターがＥｐＣＡＭ＋であったと仮定すれば、計算された集団パーセンテージは、対照、１５分のデバイス、および６０分のデバイス条件について、それぞれ対照の約６２、８８、および４０％であった。これは１５分のデバイスの例においてはフローサイトメトリーによる結果と直接一致しているが、他については大幅に低い。ＥｐＣＡＭの発現が少ないためにフローサイトメトリーがこれらの細胞型のいずれかを見落としているとすれば、これは単に不一致を拡大するのみであることに注目されたい。その代わりに、特に全ての細胞亜集団について明らかに陽性のバイオマーカーが欠けている場合に、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって細胞型が同定される包括的な方法がフローサイトメトリーより優れていることが提案される。フローサイトメトリーは細胞計数により良く適しているが、これらの結果に基づき、デバイス処理によって、６０分の対照に対して１５分で同程度の数の細胞が、また６０分で少なくとも５０％多い細胞が一貫して産生された。図５Ｂにおけるパーセンテージとともに、これらの推測値を重み付け因子（１５分について１倍、６０分について１．５倍）として用いて、凝集デバイスプラットフォームの収率を計算した（表４参照）。
【0042】
【0043】
表４．マウス腎におけるそれぞれのクラスターおよびサブクラスターについての重み付け集団値。図５Ｂにおける微小流体処理についての集団パーセンテージに重み付け（１５分について１倍、６０分について１．５倍）し、合計して全凝集微小流体プラットフォーム値を創成した。これらを対照によって正規化し、全凝集集団分布を計算するために用いた。
【0044】
全内皮細胞の回収率は対照より約４倍大きかった一方、他の細胞型は約２～２．５倍大きく、これらは全てフローサイトメトリーと一致した（図４Ａ～図４Ｃ）。真の重み付け因子はわずかに異なる可能性があるが、対照とデバイスプラットフォームとの間の相対的な数はフローサイトメトリーとｓｃＲＮＡ－ｓｅｑとの間で一致しているようである。しかし、細胞型にわたる相対数はかなり変動し、これはＦＡＣＳの収集または１０Ｘクロミウムシステムにおける液滴負荷の間の偏りに起因した可能性があり、これは既に報告されている。結果は、これらのステップの間の内皮細胞および白血球の優先的な選択を示唆している。それにも関わらず、微小流体システム１０は、標準的な組織解離ワークフローを用いる場合に少なく見積もられることが示された内皮細胞を富化することによって、単離の間の腎組織の細胞特異的な偏りに対処することができる一方、他の全ての細胞サブタイプを同様の数に維持することができる。わずかな潜在的な有足細胞が対照またはデバイス試料で観察されたことは注目に値し（図２６Ａ～図２６Ｂ参照）、これは酵素消化にコラーゲナーゼを用いたという事実に起因すると考えられる。リベラーゼを用いて調製した腎アトラスも有足細胞を欠いていた一方、コラーゲナーゼとプロナーゼの組合せ、ならびに寒冷活性プロテアーゼは有足細胞のクラスターを生じた。これは、増強された機械力を用いる設定においても酵素の選択がやはり重要であることを示している。
【0045】
最後に、トランスクリプトームの情報を用いる細胞同定に干渉する可能性のある応力応答遺伝子を評価した。応力応答の誘起は、従来の組織解離プロトコルに関連付けられてきた。多数の遺伝子が関係していると考えられてきたので、以前のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの研究に基づいて応力応答スコアを計算し、結果を図５Ｃに提示する。最近報告されたように、応力応答スコアは細胞型に特異的であることが見出され、近位尿細管が最小の値を示した。応力応答スコアは、６０分のインターバルおよび対照の例と比較して、１５分のインターバル条件について一般に低かった。これは、酵素消化時間を短くすると解離によって誘起される転写のアーチファクトが低減するという以前の知見と一致している。重要なことに、消化デバイスの中で流体剪断応力に曝露すると任意の細胞型について応力応答が増大するという証拠は見出されなかった。これは、時間が主要な因子であり、微小流体プラットフォームにおいてインターバルの概念を用いることによってこれが軽減されることを示唆している。選択した応力応答遺伝子についての発現値を図２７Ａ～図２７Ｃに個別に示す。
【0046】
マウス乳腺腫瘍組織の処理および単一細胞解析
固形腫瘍は高度の腫瘍内不均一性を呈することがあり、これはがんの進行、転移、および薬物耐性の発現に直接関係しているとみなされてきた。この不均一性はｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて成功裡に捕捉されており、膠芽細胞腫における生存率、黒色腫における薬物耐性、および結腸直腸がんにおける予後に関連付けられてきた。さらに、個別治療を導くための分子および細胞の情報を提供する臨床状況におけるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの適用の拡大が早期に出現することが期待されている。しかし、異常な細胞外マトリックス組成および密度のために、腫瘍組織は解離が最も困難な上皮組織に含まれると考えられている。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴトランスジェニックマウスにおいて自然に発生する乳腺腫瘍の微小流体処理を評価した。最初に、細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化した。消化デバイス１２は、１５分～３０分後に対照より約２倍多いＥｐＣＡＭ＋上皮細胞を生じ、差は６０分後に２．５倍に拡大した（図１７Ａ参照）。生存率は全ての時点でデバイス処理した試料について対照より高かった（図１７Ｂ参照）。次に、一体化された解離／濾過デバイス４０を試験し、再びシングルパスが最適であることを見出した（図１７Ｃ、図１８Ｄ参照）。この場合には、１分および４分の再循環は同様の細胞数を生じたが、生存率は低かった。
固形腫瘍は高度の腫瘍内不均一性を呈することがあり、これはがんの進行、転移、および薬物耐性の発現に直接関係しているとみなされてきた。この不均一性はｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて成功裡に捕捉されており、膠芽細胞腫における生存率、黒色腫における薬物耐性、および結腸直腸がんにおける予後に関連付けられてきた。さらに、個別治療を導くための分子および細胞の情報を提供する臨床状況におけるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの適用の拡大が早期に出現することが期待されている。しかし、異常な細胞外マトリックス組成および密度のために、腫瘍組織は解離が最も困難な上皮組織に含まれると考えられている。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴトランスジェニックマウスにおいて自然に発生する乳腺腫瘍の微小流体処理を評価した。最初に、細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化した。消化デバイス１２は、１５分～３０分後に対照より約２倍多いＥｐＣＡＭ＋上皮細胞を生じ、差は６０分後に２．５倍に拡大した（図１７Ａ参照）。生存率は全ての時点でデバイス処理した試料について対照より高かった（図１７Ｂ参照）。次に、一体化された解離／濾過デバイス４０を試験し、再びシングルパスが最適であることを見出した（図１７Ｃ、図１８Ｄ参照）。この場合には、１分および４分の再循環は同様の細胞数を生じたが、生存率は低かった。
【0047】
完全な微小流体デバイスシステム１０についての結果を図６Ａ～図６Ｃに示す。これらは一般に腎と同様であったが、細胞数／ｍｇ組織は２分の１～３分の１、少なかった。しかし、システム１０はやはり対照より有意に多い細胞を生じた。上皮細胞は両方の時点で約２倍多かった（図６Ａ）。内皮細胞もデバイス処理によってより効率的に遊離し、１５分後に５倍多い細胞、および６０分後に１０倍多い細胞が回収された（図６Ｂ）。白血球は１５分後および６０分後にそれぞれ３倍および５倍、増加した（図６Ｃ）。インターバルフォーマットは、対応する静的時点と比較して同様の全上皮細胞および白血球の数を生じた。しかし、インターバルから約３０％多い内皮細胞が得られた。１分のインターバルで著しく多数の上皮細胞（１５％超）が得られたことに注目されたい。デバイス処理によって、対照と同様のままであった１分の時点を除く全ての時点で内皮細胞および白血球が富化された。腎と同様に、微小流体処理は変動係数によって測定して大きなバッチ間再現性を伴っていた（下の表５参照）。３種全ての細胞型についての生存率は１５分の対照と同様であり、６０分の対照を上回った（図１８Ａ～図１８Ｃを参照）。したがって、微小流体システム１０は腫瘍からより多くの単一細胞を遊離させた一方、細胞の生存率をより良く維持していた。
【0048】
【0049】
表５は、様々な処理条件における乳腺腫瘍試料についての変動係数値を示す。
【0050】
１５分および６０分のデバイスインターバルおよび６０分の対照を用いて、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを再び実施した。全部で２４，５２７個の細胞を、平均約４５，０００リード／細胞でシーケンシングした。上皮細胞、マクロファージ、内皮細胞、Ｔリンパ球、線維芽細胞、および顆粒球に対応する６つのクラスターを同定した（図７Ａ）。上皮細胞が主要な細胞集団であり、対照細胞の６２．０％に相当した（図７Ｂ）。上皮細胞のパーセンテージは１５分のインターバルでわずかに増加し、６０分のインターバルで減少した。Ｋｒｔ１４、Ｋｒｔ１８、およびＭｋｉ６７の発現に基づいて、それぞれ内腔、基底、および増殖型内腔の細胞に対応する３つのサブクラスターを上皮細胞集団の中で同定した（図１９Ａ～図１９Ｃを参照）。ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ腫瘍について予想されたように、内腔サブタイプが主要であった。基底亜集団がデバイス処理によって富化された一方、増殖型内腔亜集団は少なく見積もられた。これらの結果は、基底上皮細胞がより解離しにくいことを示唆している。ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５、およびＣＤ３１が全て予想された細胞型とよく相関したので、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑとフローサイトメトリーとの細胞集団の比較はより容易であった（図２０Ａ～図２０Ｄを参照）。しかし、線維芽細胞はフローサイトメトリーによって検出されず、６０分のデバイス条件のかなりの部分を占めている。腎と同様に、腫瘍上皮細胞のパーセンテージはフローサイトメトリーデータで有意に高く、細胞選別および／または液滴カプセル化の間の偏りをさらに示唆しているようである。図７Ｂの集団パーセンテージと腎について用いた同じ重み付け因子（１５分について１倍、６０分について１．５倍）を組み合わせれば、再び凝集デバイスプラットフォーム収率を計算することができる（表６参照）。
【0051】
【0052】
表６は、マウス乳腺腫瘍におけるそれぞれのクラスターおよびサブクラスターについての重み付けした集団値を示す。微小流体処理についての集団パーセンテージに重み付け（１５分について１倍、６０分について１．５倍）し、合計して全凝集微小流体プラットフォーム値を創成した。これらを対照によって正規化し、全凝集集団分布を計算するために用いた。
【0053】
対照に対するデバイス凝集の差異は、上皮細胞について約２倍、Ｔリンパ球およびマクロファージについて２．５～３倍であり、これらは全てフローサイトメトリーの結果と同様である（図６Ａおよび図６Ｃ）。内皮細胞は微小流体システム１０について約４倍大きく、これはフローシンメトリーからの１０倍の差異（図６Ｂ）より小さい。注目すべきことに、デバイスプラットフォームを用いることによって、線維芽細胞は１０倍富化された。この結果は、微小流体システム１０による組織の処理によって、全ての細胞型の単離を少なくとも２．５倍、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および基底上皮細胞等の遊離させることが困難な細胞型の単離を４～１０倍、改善することができることが確認される。
【0054】
最後に、腎について述べたように、応力応答スコアを決定した。ＪｕｎおよびＦｏｓファミリーのメンバー等のいくつかの応答遺伝子が転移の進行および薬物耐性に関連付けられているので、応力応答の重要性を腫瘍について強調することができる。応力応答スコアは、腫瘍の全ての細胞型および条件にわたって同様であった（図７Ｃ）。腫瘍細胞は解離によって誘起される転写の変化への感受性がより高く、これらの応答を低減させるためにより短いインターバルでさえ必要である可能性がある。選択した応力応答遺伝子についての発現値を図２８Ａ～図２８Ｌに個別に示す。
【0055】
マウス肝からの肝細胞の単離
肝は薬物代謝において主要な役割を果たしており、薬物によって誘起される毒性について評価されることが多い。実際、肝の損傷は、承認された薬物の承認取り消しの主要な原因の１つである。したがって、初代肝組織に対する薬物のインビトロスクリーニングは、前臨床試験の重要な要素である。培養の状況における肝細胞の機能および活性をより良く維持し、患者由来の初代細胞についての個人化された試験を可能にするため、オーガンオンチップ（organ-on-a-chip）システムがますます採用されるようになっている。肝は柔軟で一般には解離が容易であるが、肝細胞は脆弱であることがよく知られており、したがって肝は特有の解離困難性を有している。したがって、肝には短いデバイス処理時間が有効であると仮定した。これらの実験のために、マウス肝を１ｍｍ３の片に細切し、ＡＳＧＰＲ１の発現に基づいて肝細胞を検出した。最初に細切消化デバイス１２を１５分または６０分、用いて肝を処理した。１５分後にデバイスについて肝細胞の回収は比較可能な対照より約４倍高かった（図８Ａ）。対照の消化を継続すると、肝細胞の数がさらに増加した。直観には反するが、消化デバイス１２で処理を継続すると、肝細胞の収率がほぼ半分に減少した。この知見は２つの因子の組合せによって惹起されたと考えられる。即ち柔軟な肝組織は早期の時点で効果的に破壊され、脆弱な肝細胞は再循環による損傷に対する感受性がより高い。一体化された解離／濾過デバイス４０を通るシングルパスも試験し、肝細胞の回収率が低下することを見出した。これはおそらく１５μｍの膜６４によって保持または損傷させる大きなサイズ（約３０μｍ）の肝細胞によるものである。６０分の消化デバイス処理および一体化されたデバイス４０の通過の後の生存率が４５％に低下した一方、他の全ての条件は約８０％であった（図８Ｂ）ことから、損傷は加成的であると思われる。一体化された解離／濾過デバイス４０から１５μｍのフィルター６４を除去すると、肝細胞が消化デバイス１２単独に対して３０％、対照に対してほぼ３倍増加した一方、生存率は維持された（図２１Ａ～図２１Ｂ参照）。
肝は薬物代謝において主要な役割を果たしており、薬物によって誘起される毒性について評価されることが多い。実際、肝の損傷は、承認された薬物の承認取り消しの主要な原因の１つである。したがって、初代肝組織に対する薬物のインビトロスクリーニングは、前臨床試験の重要な要素である。培養の状況における肝細胞の機能および活性をより良く維持し、患者由来の初代細胞についての個人化された試験を可能にするため、オーガンオンチップ（organ-on-a-chip）システムがますます採用されるようになっている。肝は柔軟で一般には解離が容易であるが、肝細胞は脆弱であることがよく知られており、したがって肝は特有の解離困難性を有している。したがって、肝には短いデバイス処理時間が有効であると仮定した。これらの実験のために、マウス肝を１ｍｍ３の片に細切し、ＡＳＧＰＲ１の発現に基づいて肝細胞を検出した。最初に細切消化デバイス１２を１５分または６０分、用いて肝を処理した。１５分後にデバイスについて肝細胞の回収は比較可能な対照より約４倍高かった（図８Ａ）。対照の消化を継続すると、肝細胞の数がさらに増加した。直観には反するが、消化デバイス１２で処理を継続すると、肝細胞の収率がほぼ半分に減少した。この知見は２つの因子の組合せによって惹起されたと考えられる。即ち柔軟な肝組織は早期の時点で効果的に破壊され、脆弱な肝細胞は再循環による損傷に対する感受性がより高い。一体化された解離／濾過デバイス４０を通るシングルパスも試験し、肝細胞の回収率が低下することを見出した。これはおそらく１５μｍの膜６４によって保持または損傷させる大きなサイズ（約３０μｍ）の肝細胞によるものである。６０分の消化デバイス処理および一体化されたデバイス４０の通過の後の生存率が４５％に低下した一方、他の全ての条件は約８０％であった（図８Ｂ）ことから、損傷は加成的であると思われる。一体化された解離／濾過デバイス４０から１５μｍのフィルター６４を除去すると、肝細胞が消化デバイス１２単独に対して３０％、対照に対してほぼ３倍増加した一方、生存率は維持された（図２１Ａ～図２１Ｂ参照）。
【0056】
最初の最適化研究に基づいて、微小流体システム１０は短い処理時間を利用し、５０μｍのフィルター６２のみを有する改変された解離／濾過デバイス４０を用いるべきであると結論した。消化デバイスによる５分の処理の後、約７００個／ｍｇ肝組織の肝細胞を回収した（図８Ｃ）。これは１５分の対照より４倍高く、６０分の対照（約１０００肝細胞／ｍｇ）よりわずかに少なかった。消化デバイス１２の処理時間を１５分に延長すると、肝細胞の回収率が６０分の対照と同じレベルに４０％増強された。最も特筆すべき結果はインターバルフォーマットの下で観察された。わずか１分後に、約７００個の肝細胞／ｍｇ組織が回収された。５分および１５分のインターバルを加えると、６０分の対照と１５分の静的条件の両方に対して約２．５倍の増強である約２４００個の肝細胞／ｍｇがもたらされた。肝細胞の生存率は対照および大部分のデバイス条件について９０％のままであった（図２２Ａ参照）。内皮細胞（図８Ｄ）および白血球（図８Ｅ）について、１分のインターバルからの大幅な回収およびインターバルフォーマットを用いて増強された全細胞数を含む同様の傾向が観察された。内皮細胞については、インターバル操作は６０分の対照および１５分の静的デバイスの例より約１．５倍高かった。白血球については、静的デバイス操作によって６０分の対照より２．５倍を超える細胞が産生され、インターバル操作は回収率を約３．５倍にさらに増強した。白血球によるデバイスプラットフォームの強い性能ならびに腎および腫瘍と比較して肝における相対的な量の多さを考慮して、細胞懸濁液は白血球について６０分の対照と比較して富化された。これは静的な時点および１分のインターバルについて特に正しかった。興味あることに、３つのインターバル条件は肝細胞および白血球の極めて異なった発現量を含んでおり、もし望まれれば溶出時間の選択がある集団を他の集団からおおまかに選択する手段として働き得ることを示唆している。下の表７で見られるように、バッチ間の再現性は内皮細胞を除く全ての細胞でインターバルを用いる微小流体処理について最も高かった。内皮細胞および白血球についての生存率は、対照と同様または対照より大きいままであった（図２２Ｂおよび図２２Ｃを参照）。
【0057】
【0058】
表７は、様々な処理条件における肝試料についての変動係数値を示す。
【0059】
総合すれば、肝についての微小流体システム１０の性能は、腎および腫瘍と比較して極めて独特であった。これは、組織を破壊するために流体剪断力が必要であるが、既に遊離したいくつかの細胞型が損傷され得るという事実によって惹起されると考えられる。全ての組織は、これらの効果の適正なバランスを必要とする。肝のような柔軟な組織では、特に傷つきやすい肝細胞についてバランスは破壊から保存の方向にシフトしなければならず、これはインターバル回収を用いることによって達成することができる。内皮細胞および白血球も、程度は低いが過度の処理に対していくらかの感受性を呈した。この知見が腎および腫瘍を含む他の組織に一般化できるか否かは明らかでない。肝の正弦波状内皮細胞は高度に専門化しており、卵円窓が豊富で下部基底膜がない。これらの特性によっても、正弦波状内皮細胞は特に損傷を受けやすくなっている可能性がある。白血球については、主としてクッパー細胞である肝内に起源のある細胞と、剪断にあまり敏感でない血液由来の細胞との間に区別はなかった。クッパー細胞ならびに肝星細胞を直接評価する将来の研究は、特に多数の細胞型を利用する複雑な肝モデルに向けて進歩するために極めて興味深い。
【0060】
マウス心臓からの心筋細胞の単離
心不全は市場からの薬物の撤退のもう１つの主な原因であり、肝不全と併せて撤退の約７０％を占めている。したがって、前臨床薬物スクリーニングのための初代心筋細胞を用いるハートオンチップ（heart-on-chip）技術の開発には強固な興味がある。心筋細胞は機械的および酵素的な解離手法には極めて感受性が高いことが示されている。さらに、これらは一方向に不釣り合いに長く、１００μｍおよびそれ以上のオーダーの長さである。これらの実験のため、マウス心臓を１ｍｍ３の片に細切し、トロポニンＴの発現に基づいて心筋細胞を検出した。トロポニンＴは細胞内マーカーであるので、７－ＡＡＤの代わりに固定可能な生存色素であるＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いた。心筋細胞の大きさおよび形状に関するあり得る懸念を考慮して、一体化された解離／濾過デバイス４０におけるフィルター孔径の影響を試験した。細切消化デバイス１２による１５分の処理の後、５０μｍと１５μｍの両方の孔径の膜６２、６４を有する元の一体化された解離／濾過デバイス４０または５０μｍの膜６２のみを有する改変されたバージョンに試料を通過させた。細胞の数および生存率は全ての条件について同様であり（図２３Ａ～図２３Ｂを参照）、両方の膜６２、６４を有する元のバージョンを心組織のために選択した。
心不全は市場からの薬物の撤退のもう１つの主な原因であり、肝不全と併せて撤退の約７０％を占めている。したがって、前臨床薬物スクリーニングのための初代心筋細胞を用いるハートオンチップ（heart-on-chip）技術の開発には強固な興味がある。心筋細胞は機械的および酵素的な解離手法には極めて感受性が高いことが示されている。さらに、これらは一方向に不釣り合いに長く、１００μｍおよびそれ以上のオーダーの長さである。これらの実験のため、マウス心臓を１ｍｍ３の片に細切し、トロポニンＴの発現に基づいて心筋細胞を検出した。トロポニンＴは細胞内マーカーであるので、７－ＡＡＤの代わりに固定可能な生存色素であるＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔを用いた。心筋細胞の大きさおよび形状に関するあり得る懸念を考慮して、一体化された解離／濾過デバイス４０におけるフィルター孔径の影響を試験した。細切消化デバイス１２による１５分の処理の後、５０μｍと１５μｍの両方の孔径の膜６２、６４を有する元の一体化された解離／濾過デバイス４０または５０μｍの膜６２のみを有する改変されたバージョンに試料を通過させた。細胞の数および生存率は全ての条件について同様であり（図２３Ａ～図２３Ｂを参照）、両方の膜６２、６４を有する元のバージョンを心組織のために選択した。
【0061】
次に、完全な微小流体システム１０を様々な消化時間で評価した。心筋細胞の感受性があり得るので、短い処理時間を用いた。消化デバイス１２による５分の処理の後、心組織１ｍｇあたり約２０００個の心筋細胞が回収された（図９Ａ）。これは１５分および６０分の対照よりそれぞれ約半分および３分の１、少なかった。消化デバイス処理を１５分に延長すると、回収は約１２，０００細胞／ｍｇに増加し、これは６０分の対照より約２倍多かった。腎と同様に、インターバルフォーマットによって心筋細胞の回収は約１８，０００細胞／ｍｇにさらに増加した。微小流体システム１０からの内皮細胞（図９Ｂ）および白血球（図９Ｃ）の収率は、６０分の対照より有意に少なかった。インターバルフォーマットは両方の場合において回収を確かに改善したが、６０分の対照は内皮細胞について約２倍、白血球について約１．５倍、多いままであった。この回収率の相違に基づけば、デバイスプラットフォーム１０による処理は、心筋細胞の顕著な富化をもたらした。バッチ間再現性はインターバルを用いる微小流体処理において最大であった（下の表８を参照）。
【0062】
【0063】
表８は、様々な処理条件における心臓試料についての変動係数値を示す。
【0064】
３種全ての細胞型についての生存率は対照と同様であった（図２４Ａ～図２４Ｃを参照）。全ての組織についての結果を総合的に考慮すると、心臓はおそらく腎／腫瘍と肝の両極端の間に位置している。組織はやはり破壊しにくく、これが早期の時点での回収が少なかった理由である。デスモソームおよびアドへリン接合部によって形成される強力な細胞内連結のために、心筋細胞についてそれ自体では消化が特に非効率的であったようであるが、微小流体システム１０はこれらの連結を破壊し、心筋細胞を分離するために必要な剪断応力を提供した。しかし、機械的損傷に対する心筋細胞の感受性は状況を悪化させる因子であり、そのため、消化時間を長くして結果を改善することは考えにくい。内皮細胞は、血管ならびに心房腔および心室腔の壁を裏打ちする内膜から生じ得る。心房腔および心室腔にはコラーゲナーゼが容易に接近できるので、内膜は消化のみによって効果的に遊離されたと考えられる。しかし腎および腫瘍について見られたように、微小流体システム１０を用いても、血管は内膜を効果的に放出させるために長い時間を必要とする。これは、結果が内膜に偏っていたこと、および回収が少なかったことは損傷が主な理由であったことを示唆している。心臓と肝の両方において評価した全ての細胞型についてインターバル回収が結果を改善したという事実は、このモードが最適な成績に重要であることを示している。実際、細胞の損傷を防止するには、おそらく時間分解能を増大させ、または理想的には継続させるべきである。それにも関わらず、本研究において現在構成し、操作している微小流体プラットフォームは、全細胞回収率の増大、処理時間の短縮、およびいくつかの場合にはその両方に基づいて、多様な細胞型に由来する単一細胞の回収を一貫して改善した。
【0065】
細切された検体の負荷および処理を容易にする消化デバイス１２、ならびに単一細胞懸濁液が下流における解析または代替の用途に直ちに使用可能になるように解離ワークフローを完了する新たに一体化された解離／濾過デバイス４０を含む新規な微小流体システム１０が開示される。新たな細切消化デバイス１２は組織の破壊を加速し、従来の方法より顕著に多い単一細胞を産生した一方、一体化された解離／濾過デバイス４０は全て生存率に影響せずに収率をさらに増大させた。これは、広範囲の特性を示す多様な組織型、ならびに異なる２つの単一細胞解析法、即ちフローサイトメトリーおよびｓｃＲＮＡ－ｓｅｑについて決定した。微小流体消化の間の異なる時点での単一細胞の抽出を可能にするインターバル操作を含む新規な処理スキームを用いた。腎および腫瘍のような物理的に硬くより強固な組織について、微小流体処理は劇的に短い時間（１５分対６０分）で同様の細胞数および全体でほぼ２．５倍多い単一細胞を産生することが見出された。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって、内皮細胞、線維芽細胞、および基底上皮細胞が微小流体システム１９によって高度に富化され、それぞれ４倍～１０倍、増加することがさらに確認された。さらに、いくつかの細胞型については短い消化時間が低い応力応答に付随しているが、さもなければいかなる場合でも微小流体処理は応力応答を増大しないことが見出された。これらの結果により、微小流体組織システム１０が、細胞のサブタイプによる偏り、処理時間、および／または応力応答を低減することによってｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ研究を進歩させるための刺激的な可能性を有していることが明らかに確認される。肝および心臓のように柔軟で感受性のある細胞型を含む組織について処理時間が劇的に低減されること、および細胞の損傷を避け、回収率を最大にするためにインターバル操作が重要であることが見出された。これらの結果は組織工学および再生医療における目標を進歩させ、薬理学研究のための患者由来のオーガンオンチップ（organ-on-a-chip）モデルのために特に刺激的になり得る。細切された検体に着目することによって、微小流体組織処理システム１０は、全てではないにしても大部分の器官および組織についての解離ワークフローの中に容易に組み込むことができる。組織の前処理を最小化することは有益であり、将来の研究において追求されよう。もう１つの将来の目標は、脆弱な細胞の保護、ある種の細胞サブタイプの意図的な富化、および応力応答の低減をさらに探索するためにインターバル回収の時点を低減させることであろう。理想的には、単一細胞が生成すれば直ちにこれをプラットフォームから溶出させることを可能にする細胞分離戦略が一体化される。微小流体システム１０は、多様な組織特性および細胞サブタイプに用いることができる。さらに、低温活性プロテアーゼ等の代替のタンパク質分解酵素を用いてもよい。最後に、臨床応用のためのヒト組織に着目した細胞系診断および薬物試験のための完全に一体化されたポイントオブケア（point-of-care）技術を創成するために、微小流体細胞選別および検出の能力をシステム１０に組み込んでもよい。
【0066】
材料および方法
デバイスの組み立て。微小流体細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０は、ＡＬｉｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）によって組み立てられた。簡単に述べると、流体チャネル、ビア、および膜のための開口、ルアーポート、ならびにホースの返しを、ＣＯ２レーザーを用いてＰＭＭＡポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）層にエッチングした。ナイロンメッシュ膜（フィルター６２、６４）はＡｍａｚｏｎ Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ（孔径１５および５０μｍ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から大きなシートとして購入し、ＣＯ２レーザーを用いてサイズに切断した。次いでデバイス層およびその他の部品（ホース返し、ナイロンメッシュ膜）を組み立て、接着剤を用いて接着し、圧力ラミネートして一体のデバイスを形成した。
デバイスの組み立て。微小流体細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０は、ＡＬｉｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）によって組み立てられた。簡単に述べると、流体チャネル、ビア、および膜のための開口、ルアーポート、ならびにホースの返しを、ＣＯ２レーザーを用いてＰＭＭＡポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）層にエッチングした。ナイロンメッシュ膜（フィルター６２、６４）はＡｍａｚｏｎ Ｓｍａｌｌ Ｐａｒｔｓ（孔径１５および５０μｍ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から大きなシートとして購入し、ＣＯ２レーザーを用いてサイズに切断した。次いでデバイス層およびその他の部品（ホース返し、ナイロンメッシュ膜）を組み立て、接着剤を用いて接着し、圧力ラミネートして一体のデバイスを形成した。
【0067】
マウス組織モデル。腎、肝、および心臓は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｒｖｉｎｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された探索研究の廃棄物と決定され、新たに犠牲死させたＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７Ｂ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から収穫した（Ａｎｇｅｌａ Ｇ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ博士の好意）。乳腺腫瘍は、新たに犠牲死させたＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から収穫した。腎については、それぞれ髄質および皮質の組織学的に同様の部分を含む長さ約１ｃｍ×直径約１ｍｍの組織片を、メスを用いて調製した。次いで組織片をメスでさらに約１ｍｍ３の片に細切した。肝、乳腺腫瘍、および心臓は、メスで約１ｍｍ３の片に均一に細切した。次いで細切した組織試料を秤量し、以下に述べるデバイスで処理した。対照をミクロ遠心管の中に入れ、振盪インキュベーター中、１５分、３０分、または６０分、穏やかに振盪しながら３７℃で消化し、ピペッティングおよびボルテックスを繰り返すことによって機械的に脱凝集した。０．２５％のＩ型コラーゲナーゼ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を対照とデバイス処理条件の両方に用いた。最後に、細胞懸濁液を１００単位のＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と３７℃で１０分、処理し、遠心分離によってＰＢＳ＋中で洗浄した。
【0068】
細切消化デバイスの操作。内径０．０５インチのチューブ２４（Ｓａｉｎｔ－Ｇｏｂａｉｎ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）をデバイス入口１４および出口１６のホース返しに固定することによって細切消化デバイス１２を準備し、これを次に内径２．６２ｍｍのチューブ２４（Ｓａｉｎｔ－Ｇｏｂａｉｎ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）でＩｓｍａｔｅｃペリスタポンプ１８（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ，Ｗｅｒｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した。実験に先立って、チャネル壁への細胞の非特異的結合を低減するためにデバイス１２、４０、およびチューブ２４をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中、室温で１５分、インキュベートし、ＰＢＳ＋で洗浄した。細切された組織片を、ルアー入口ポート３０を通してデバイス組織チャンバー２０に負荷した。次いでデバイス１２およびチューブ２４を０．２５％のＩ型コラーゲナーゼ溶液（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）で満たし、ストップコックを用いてルアーポート３０を閉鎖した。次いで最適の酵素活性を維持するために、デバイス１２、チューブ２４、およびペリスタポンプ１８からなる実験装置を３７℃のインキュベーターに入れた。流量１０または２０ｍＬ／分で特定した時間、ペリスタポンプ１８を用い、デバイス１２とチューブ２４を通してコラーゲナーゼ溶液を再循環させた。
【0069】
細胞懸濁液から回収したＤＮＡの定量。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用い、メーカーの使用説明書に従って単離した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、消化された腎組織懸濁液の精製されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の含量を評価した。デバイス処理された試料についてのｇＤＮＡは、操作後にデバイスから溶出した細胞内含量を表す一方、対照試料についてのｇＤＮＡは、これらの試料中に存在するｇＤＮＡの全量を表す。
【0070】
一体化された解離／濾過デバイスの操作。細切消化デバイス１２による処理に続いて、図１Ａおよび図１Ｆに見られるように、チューブ２４を細切消化デバイス１２の出口１６から一体化された解離・濾過デバイス４０の入口４６まで接続した。最循環を意図した場合には、チューブ２４を直交流出口からペリスタポンプ１８まで接続し、一方、一体化されたデバイス４０の出口４８をストップコックで閉じた。次いで流体をポンプ４４で解離／濾過デバイス４０を通して流量１０ｍＬ／分で送液した。試料の最終採取のため、または解離部品を通して１回のパスのみを利用する場合には、直交流出口をストップコックバルブで閉じ、試料を１０ｍＬ／分で送液して流出液出口５０から収集した。全ての実験に続いて、デバイス１２、４０を２ｍＬのＰＢＳ＋で洗浄して流し出し、残存する細胞があれば収集した。タイムインターバル回収については、それぞれのＰＢＳ＋洗浄に続いてデバイス１２、４０およびチューブにコラーゲナーゼ溶液を再充填し、次の収集時期まで再循環を継続するために、細切消化デバイス１２の出口１６をペリスタポンプ１８に再接続した。
【0071】
フローサイトメトリーを用いる細胞懸濁液の解析。表１に示す組織特異的フローサイトメトリーパネルを用いて、細胞懸濁液を解析した。腎による初期の研究のため、細胞懸濁液を５μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ４５－ＡＦ４８８（クローン３０－Ｆ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、７μｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ－ＰＥ（クローンＧ８．８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および５μ／ｍＬのＴＥＲ１１９－ＡＦ６４７（クローンＴＥＲ－１１９，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）モノクローナル抗体で３０分、同時に染色した。次いで試料をＰＢＳ＋による２回の遠心分離で２回洗浄し、３．３３μｇ／ｍＬの７－ＡＡＤ生存色素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で、氷上、少なくとも１０分、染色し、Ｎｏｖｏｃｙｔｅ ３０００フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって解析した。フローサイトメトリーデータは、単一染色細胞試料または補正ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて補正した。それぞれの補正試料の中の陽性および陰性の亜集団を包含するゲートを用いて、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）における補正マトリックスを計算した。生存および死滅した単一の上皮細胞、白血球、および赤血球を同定するために、シーケンシャルゲーティングスキーム（図２５参照）を用いた。シグナル陽性は適切なＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）対照を用いて決定した。腎、腫瘍、および肝を用いる最終研究では、ＢＶ５１０とＣＤ４５（１２．５μｇ／ｍＬ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、内皮細胞については８μｇ／ｍＬのＣＤ３１－ＡＦ４８８を組み込んだ。肝の実証では、肝細胞についてＥｐＣＡＭ－ＰＥを１０μｇ／ｍＬのＡＳＧＰＲ１－ＰＥ（クローン８Ｄ７，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で置き換えた。心臓の実証では、生存率のために７－ＡＡＤの代わりに１：１０００希釈のＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、心筋細胞についてＥｐＣＡＭ－ＰＥを０．１５μｇ／ｍＬのトロポニンＴ－ＰＥ（クローンＲＥＡ４００，Ｍｉｌｅｎｔｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で置き換えた。
【0072】
単一細胞ＲＮＡシーケンシング。これらの研究では１２週齢のマウス（腎についてはＣ５７ＢＬ／６、雄；乳腺腫瘍についてはＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ、雌、いずれもＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を用いた。これらをＣＯ２吸入によって安楽死させた。腎および乳腺腫瘍を切除し、約１ｍｍ３の片に細切し、微小流体システム１０について述べたように、０．２５％のＩ型コラーゲナーゼを用いて（１５分および６０分の消化デバイス１２インターバル、一体化された解離／濾過デバイス４０を通るシングルパス）または対照（６０分の消化）を調製した。回収した細胞を遠心分離（４００×ｇ、５分）し、１００単位のＤＮアーゼＩで３７℃、５分、処理し、遠心分離によってＰＢＳ＋中に洗浄した。次いで試料を氷上でＲＢＣ溶解緩衝液と５分インキュベートし、遠心分離し、ＰＢＳ＋中に再懸濁した。ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に先立って死細胞および環境中のＲＮＡを除去するために、細胞をＳｙｔｏｘＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色した。選別した生きている単一細胞（ＳｙｔｏｘＢｌｕｅ陰性）を遠心分離し、０．０４％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で１０００細胞／μＬの濃度で再懸濁した。次いで液滴対応ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのために１０Ｘクロミウムシステム（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いた。油、細胞、試薬、およびビーズを８チャネルの微小流体チップに負荷した。レーンには、試料のそれぞれから自動化セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて決定した約１７，０００細胞を負荷した。次いで、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖ３ケミストリーについてのライブラリー生成をメーカーの使用説明書に従って実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、腎について約６０，０００リード／細胞および乳腺腫瘍について約４５，０００リード／細胞のデブスで試料をシーケンシングした。１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェア（バージョン３．１．０）を用いてシーケンシングｆａｓｔｑファイルをインデックス付きｍｍ１０参照ゲノムと整列させた。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ａｇｇｒを用いて、それぞれのデータセットについてのライブラリーにわたる細胞のマッピングされたリードを正規化した。少なくとも３つの細胞で検出されなかった遺伝子は、さらなる解析から除外した。低い（２００未満）または高い（腎について３０００超、乳腺腫瘍について４０００超）特有の遺伝子が発現した細胞も、これらはそれぞれ低品質またはダブレット細胞を表している可能性があるので、廃棄した。高いミトコンドリア遺伝子パーセンテージ（腎について５０％超、乳腺腫瘍について２５％超）を有する細胞も、これらも低品質または死滅しつつある細胞を表している可能性があるので、廃棄した。クラスター同定のためにＳｅｕｒａｔパイプラインを用い、高度可変性の遺伝子を用いて主要成分解析（ＰＣＡ）を実施し、グループを同定するために密度クラスタリングを実施し、グループ分けを可視化するためにＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）プロットを用いた。腎については、２つのアプローチを用いて細胞クラスターをアノテートした。第１に、それぞれのクラスターにおける上位の異なる遺伝子を検討し、既知のマーカー遺伝子（たとえばＫａｐ、Ｎａｐｓａ、およびＳ２－Ｓ３近位尿細管についてのＳｌｃ２７ａ２、Ｓ１近位尿細管についてのＧｐｘ３、内皮細胞についてのＥｍｃｎ、ヘンレ係蹄についてのＳｌｃ１２ａ１、遠位尿細管についてのＳｌｃ１２ａ３等）の発現に基づいてクラスターの細胞型を決定した。第２に、マウス腎のよく確立されたアトラスが利用可能であるので、細胞スコアリング法を用いて、クラスターのそれぞれに由来するマーカー遺伝子シグネチャーを公開されたデータセットと比較し、クラスターのアノテーションを確認した（図１４Ａ～図１４Ｂを参照）。腫瘍については、それぞれのクラスターにおける上位の異なる遺伝子を検討し、既知のマーカー遺伝子（たとえば上皮細胞についてはＥｐＣＡＭ）の発現に基づいて細胞型を決定することによって、細胞クラスターをアノテートした。細胞の応力応答は、それぞれのクラスターに由来する応力応答遺伝子発現を既知の応力応答遺伝子の既に公開されたデータセットと比較する既に開発されたスコアリング法を用いて評価した。
【0073】
細胞凝集の研究。ＭＣＦ－７ヒト乳がん細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、推奨されているように培養した。実験に先立って、コンフルエントな単層をトリプシン－ＥＤＴＡで５分、簡単に消化した。これにより、かなりの数の凝集物とともに細胞が放出された。遠心分離および１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ＋）中の再懸濁によって、実験用に細胞懸濁液を調製した。次いでＭＣＦ－７細胞を、ペリスタポンプシステム単独、または本明細書に記載した方法を用いて取り付けられた消化デバイス１２もしくは一体化された解離／濾過デバイス４０を含むシステムを通して再循環させた。この初期の研究については、状況を悪化させる影響を避けるため、流れは一体化されたデバイス４０の解離部分を通してのみ再循環させ、最終試料収集のための濾過部品のナイロンフィルター６２、６４を通過させなかった。これを達成するため、一体化されたデバイス４０の流出液出口５０は、ポンプ操作の間、ストップコックを用いて閉じておいた。３つ全ての実験については、５、１０、または２０ｍＬ／分の流量、および０．５分、１分、４分、および１０分の再循環時間を用いた。実験に続いて、デバイス１２、４０、およびチューブ２４を２ｍＬのＰＢＳ＋で洗浄して、残存する細胞があれば流し出して収集した。再循環の前と後の両方で、ＭＦ－Ｓ型カセット（Ｏｒｆｏ，Ｈａｉｌｅｙ，ＩＤ）を有するＭｏｘｉ Ｆｌｏｗサイトメーターおよびヨウ化プロピジウム染色を用いて細胞数および生存率を得た。
【0074】
フローサイトメトリーのゲーティングプロトコル。消化されたマウスの腎、乳腺腫瘍、肝、および心臓の試料から得た細胞懸濁液を表１に列挙した蛍光プローブで染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。取得したデータを補正し、シーケンシャルゲーティングスキーム（図２５）を用いて評価した。ゲート１はＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａに基づき、起点付近のデブリを除外するために用いた。ゲート２はＦＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ｈに基づいて単一細胞を選択するために用いた。ゲート３はＣＤ４５－ＢＶ５１０陽性シグナルおよびＴＥＲ１１９－ＡＦ６４７陰性シグナルに基づいて白血球を識別した一方、赤血球はＴＥＲ１１９－ＡＦ６４７陽性シグナルおよびＣＤ４５－ＢＶ５１０陰性シグナルに基づいて同定した。ゲート４はＣＤ４５（－－）／ＴＥＲ１１９（－－）細胞サブセットに適用し、陽性のＥｐＣＡＭ－ＰＥシグナルに基づいて腎および腫瘍試料中の上皮細胞、陽性のＡＳＧＰＲ１－ＰＥシグナルに基づいて肝試料中の肝細胞、および陽性のトロポニンＴ－ＰＥシグナルに基づいて心臓試料中の心筋細胞を同定するために用いた。ゲート５は、陽性のＣＤ３１－ＡＦ４８８シグナルに基づいて内皮細胞を同定するために、腎および腫瘍試料中のＥｐＣＡＭ（－－）細胞サブセット、肝のＡＳＧＰＲ１（－－）細胞サブセット、および心臓組織中のトロポニンＴ（－－）細胞サブセットに適用した。最後に、ゲート６は、陰性の７－ＡＡＤまたはＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（心臓）シグナルに基づいて、上皮細胞、肝細胞、心筋細胞、白血球、および内皮細胞のサブセット中の生細胞を同定するために用いた。非特異的バックグラウンド染色を評価するために適切なアイソタイプ対照を最初に用い、陽性シグナルカットオフを決定してゲートを設定するために適切なフルオレッセンスマイナスワン（FMO）対照を用いた。対照試料は未染色のままとした。
【0075】
ＭＣＦ－７細胞を用いるポンプおよびデバイス再循環の評価
ＭＣＦ－７ヒト乳がん細胞株を用い、ペリスタポンプ１８および細切消化デバイス１２を通して細胞を繰り返し再循環することの効果を検討した。ＭＣＦ－７は強力な凝集性のある細胞型であり、通常の細胞培養の後で顕著な数の凝集物を保持しているので、より強力な解離法が必要である。実験に先立って、コンフルエントな単層をトリプシン－ＥＤＴＡによって簡単に消化し、遠心分離し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ＋）中に再懸濁した。次いで試料を、ポンプ１８を通してループとするか、または細切消化デバイス１２に連結したペリスタチューブ２４に負荷した。様々な時間および様々な流量での再循環に続いて、Ｍｏｘｉフローサイトメーターを用いる単一細胞数および生存率（ヨウ化プロピジウムによる排除）の測定のために、試料を収集した。結果を図１０Ａ～図１０Ｆに提示する。細胞数は対照に対して正規化した。ポンプ１８単独および細切消化デバイス１２を通る再循環は、試験した全ての条件についていずれも約１０～２０％のわずかな減少を伴うことが見出され、これは多くの場合に有意であった（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。細胞の生存率は一貫して対照と同様の約８０％であった（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。細胞数は凝集物の解離によって増加するか、または細胞の破壊によって減少する可能性があり、これらの因子の両方が流体力学的剪断応力とともに増大する可能性があることに注目されたい。全剪断力は流量および処理時間に関係する条件にわたってかなり変動するので、この結果は、観察された細胞数のわずかな減少がシステム内のホールドアップまたは移送ステップの間の細胞の損失に関連していることを示唆している。
ＭＣＦ－７ヒト乳がん細胞株を用い、ペリスタポンプ１８および細切消化デバイス１２を通して細胞を繰り返し再循環することの効果を検討した。ＭＣＦ－７は強力な凝集性のある細胞型であり、通常の細胞培養の後で顕著な数の凝集物を保持しているので、より強力な解離法が必要である。実験に先立って、コンフルエントな単層をトリプシン－ＥＤＴＡによって簡単に消化し、遠心分離し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ＋）中に再懸濁した。次いで試料を、ポンプ１８を通してループとするか、または細切消化デバイス１２に連結したペリスタチューブ２４に負荷した。様々な時間および様々な流量での再循環に続いて、Ｍｏｘｉフローサイトメーターを用いる単一細胞数および生存率（ヨウ化プロピジウムによる排除）の測定のために、試料を収集した。結果を図１０Ａ～図１０Ｆに提示する。細胞数は対照に対して正規化した。ポンプ１８単独および細切消化デバイス１２を通る再循環は、試験した全ての条件についていずれも約１０～２０％のわずかな減少を伴うことが見出され、これは多くの場合に有意であった（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。細胞の生存率は一貫して対照と同様の約８０％であった（図１０Ｄおよび図１０Ｅ）。細胞数は凝集物の解離によって増加するか、または細胞の破壊によって減少する可能性があり、これらの因子の両方が流体力学的剪断応力とともに増大する可能性があることに注目されたい。全剪断力は流量および処理時間に関係する条件にわたってかなり変動するので、この結果は、観察された細胞数のわずかな減少がシステム内のホールドアップまたは移送ステップの間の細胞の損失に関連していることを示唆している。
【0076】
次に、分岐チャネル解離デバイス４０を通る再循環を試験した。この技術による以前の研究は往復アプローチを利用しており、これはシリンジポンプを用いて達成した。ここでは、結果を悪化させることを避けるために、一体化された解離／濾過デバイス４０は、解離部分を通してのみ再循環し、ナイロンフィルター６２、６４を通過しなかった流れとともに用いた。５、１０、および２０ｍＬ／分で、０．５分、１分、４分、および１０分、再循環した後で得られた細胞数を図１０Ｃに提示する。流量５ｍＬ／分では変化は観察されなかった。細胞数は１０ｍＬ／分では短い再循環時間でわずかに増加することが見出されたが、長い再循環は単一細胞の回収率を２．５倍まで増強した。流量２０ｍＬ／分では、それぞれの時点について２～４倍の増加がもたらされた。しかし、細胞生存率は、最大の単一細胞数の増加を提供する条件では急激に低下した（図１０Ｆ）。短い再循環時間の１０ｍＬ／分で観察された約２０％のオーダーの細胞数のわずかな増加は、シリンジポンプおよび往復フォーマットを用いた以前の研究と一致している。さらに、単一細胞数の極めて大きな増加と低い生存率との相関は、以前に極めて小さな孔径（５および１０μｍ）を用いた場合のフィルターデバイスで見られていた。これらの結果に基づいて、一体化された解離／濾過デバイス４０のための最適流量として１０ｍＬ／分を選択し、細胞の生存率を損なうことなく単一細胞の収率を増加させるために、短い処理時間を採用することに注力した。１０ｍＬ／分は、フィルター６２、６４を伴う解離／濾過デバイス４０において用いた流量でもある。
【0077】
マウス腎を用いるプラットフォーム最適化
マウス腎試料を用いて細切消化デバイス１２と一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化し、上皮細胞についての結果を図３Ａおよび図３Ｃ～図３Ｆに提示する。単一の白血球もＣＤ４５を介するフローサイトメトリーによって定量し、結果を図１１Ａ～図１１Ｄに提示する。消化デバイスの最適化研究から、白血球の収率（図１１Ａ）および生存率（図１１Ｂ）は上皮細胞と同様の傾向に従うことが見出された。白血球は消化デバイス１２における再循環時間とともに増加し、６０分で対照を上回ったが、よりわずかな約３０％であった。さらに、静的およびインターバルのフォーマットは同様の結果を生じた。白血球の生存率は、６０分のインターバルを除く全てについて消化デバイス１２処理でより高かった。次いで一体化された解離／濾過デバイス４０が１５分の消化デバイス処理の後で単一細胞の収率をさらに増強できるかを検討した。白血球については、回収率はシングルパスについては変化せず、再循環ではわずかに減少した（図１１Ｃ）。１５分の対照と比較して、微小流体デバイス処理は７倍多い細胞を産生した。白血球の生存率は、さらなる処理とともに上昇傾向を呈したが、差異は有意ではなかった（図１１Ｄ）。
マウス腎試料を用いて細切消化デバイス１２と一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化し、上皮細胞についての結果を図３Ａおよび図３Ｃ～図３Ｆに提示する。単一の白血球もＣＤ４５を介するフローサイトメトリーによって定量し、結果を図１１Ａ～図１１Ｄに提示する。消化デバイスの最適化研究から、白血球の収率（図１１Ａ）および生存率（図１１Ｂ）は上皮細胞と同様の傾向に従うことが見出された。白血球は消化デバイス１２における再循環時間とともに増加し、６０分で対照を上回ったが、よりわずかな約３０％であった。さらに、静的およびインターバルのフォーマットは同様の結果を生じた。白血球の生存率は、６０分のインターバルを除く全てについて消化デバイス１２処理でより高かった。次いで一体化された解離／濾過デバイス４０が１５分の消化デバイス処理の後で単一細胞の収率をさらに増強できるかを検討した。白血球については、回収率はシングルパスについては変化せず、再循環ではわずかに減少した（図１１Ｃ）。１５分の対照と比較して、微小流体デバイス処理は７倍多い細胞を産生した。白血球の生存率は、さらなる処理とともに上昇傾向を呈したが、差異は有意ではなかった（図１１Ｄ）。
【0078】
マウス腎についての単一細胞解析
マウス腎試料を用いて完全な微小流体システム１０またはプラットフォームを評価し、上皮細胞、内皮細胞、および白血球の数についての結果を図４Ａ～図４Ｃに提示する。単一のＲＢＣもＴＥＲ１１９を介するフローサイトメトリーによって定量し、結果を図１２に提示する。ＲＢＣは一般にデバイス処理について早期の時点で溶出し、１分のインターバルでほぼ５０％が回収された。これらのＲＢＣのかなりの部分は、臓器の収穫および細切の間に放出された血液に起因する可能性がある。しかし、ＲＢＣは対照の消化時間とともにまだ増加し、消化デバイス１２が未消化の組織の中から細胞および血液を急速に洗い出した可能性があることを示している。細胞の生存率は７－ＡＡＤ染料を介するフローサイトメトリーによって評価し、結果を図１３Ａ～図１３Ｃに提示する。上皮細胞の生存率は全ての対照およびデバイス条件で約９５％と最大であった（図１３Ａ）。内皮細胞（図１３Ｂ）および白血球（図１３Ｃ）の生存率は約６０％～９０％の範囲であり、６０分の対照で両方の例について約７０％であった。デバイス処理によって、１分のインターバルを除く全ての条件で内皮細胞について高い生存率がもたらされ、白血球は１５分の時点で（静的およびインターバル）上昇した。
マウス腎試料を用いて完全な微小流体システム１０またはプラットフォームを評価し、上皮細胞、内皮細胞、および白血球の数についての結果を図４Ａ～図４Ｃに提示する。単一のＲＢＣもＴＥＲ１１９を介するフローサイトメトリーによって定量し、結果を図１２に提示する。ＲＢＣは一般にデバイス処理について早期の時点で溶出し、１分のインターバルでほぼ５０％が回収された。これらのＲＢＣのかなりの部分は、臓器の収穫および細切の間に放出された血液に起因する可能性がある。しかし、ＲＢＣは対照の消化時間とともにまだ増加し、消化デバイス１２が未消化の組織の中から細胞および血液を急速に洗い出した可能性があることを示している。細胞の生存率は７－ＡＡＤ染料を介するフローサイトメトリーによって評価し、結果を図１３Ａ～図１３Ｃに提示する。上皮細胞の生存率は全ての対照およびデバイス条件で約９５％と最大であった（図１３Ａ）。内皮細胞（図１３Ｂ）および白血球（図１３Ｃ）の生存率は約６０％～９０％の範囲であり、６０分の対照で両方の例について約７０％であった。デバイス処理によって、１分のインターバルを除く全ての条件で内皮細胞について高い生存率がもたらされ、白血球は１５分の時点で（静的およびインターバル）上昇した。
【0079】
腎試料についてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、図５Ａ～図５Ｃに提示して解析する７種の細胞クラスターを同定した。腎細胞クラスターのアノテーションを確認するため、主要な細胞クラスター（図１４Ａ）およびサブクラスター（図１４Ｂ）のそれぞれに由来するマーカー遺伝子シグネチャーを確立されたデータセットと比較するＳｅｕｒａｔからの「ＡｄｄＭｏｄｕｌｅＳｃｏｒｅ」機能を実行することによる細胞スコアリング法を用いた。７種の細胞クラスターのそれぞれを、対照および両方の微小流体処理条件で表す。ＬＯＨ、ＤＣＴ、ＣＤ、およびＭＣクラスターを４つの異なる細胞型に分離することによって評価した。これらはヘンレ係蹄、遠位尿細管、集合管、およびメサンギウム細胞に対応し、これらをそれぞれＵＭＡＰダイアグラム（図１５Ａ）で呈示する。これらの細胞型のそれぞれについて得られた数を、全集団に対して図１５Ｃに提示する。これらの細胞型のそれぞれは１５分のプラットフォームインターバルが枯渇している一方、６０分のプラットフォームインターバルは比例表示を含んでいた。ＬＯＨ細胞のわずかな富化およびＣＤ細胞の枯渇が、６０分のインターバルで見出された。
【0080】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑとフローサイトメトリーの結果の間の相関を容易にするため、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３１、およびＣＤ４５の遺伝子発現を検討した。ＥｐＣＡＭは、細胞サブセットのそれぞれ（図１６Ｂ）を含む主要なＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ、およびＭＣクラスターにおいて主として高度に発現した（図１６Ａ）。近位尿細管はＥｐＣＡＭについて主として陰性であり、おそらく基本的発現が低いことおよび低いタンパク質ターンオーバー等のあり得る二次的因子によるものであろう。予想されたように、ＣＤ４５はマクロファージ、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球のクラスターで高度に発現し（図１６Ｃ）、ＣＤ３１は内皮細胞クラスターで高度に発現した（図１６Ｄ）。定量的比較を行うため、２つの仮定を行った。第１に、図４Ａ～図４Ｃのフローサイトメトリーによって得られた細胞数を決定し、微小流体処理が６０分の対照に対して１５分のインターバルでほぼ同数の全細胞および６０分のインターバルで約５０％多い細胞を産生したことを推測した。第２に、全ての近位尿細管ならびに全てのＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ、およびＭＣサブタイプがＥｐＣＡＭ陽性であると仮定した。これらの仮定に基づいて、図５Ｂの６０分のデバイスインターバルについて得られた集団パーセンテージを１．５倍に重み付けし、これを１５分値に加えて、微小流体プラットフォームの凝集値を推測した。結果を表２に提示する。これは６０分の対照への正規化および凝集集団パーセンテージの計算も含んでいる。これらの推測は注意を必要とするが、これらは図４Ａ～図４Ｃのフローサイトメトリーの結果と密接に一致しており、微小流体プラットフォームで６０分の対照に対して約２．５倍多い上皮細胞（近位尿細管、ＤＣＴ、ＬＯＨ、ＣＤ）、約２～２．５倍多い白血球（マクロファージ、ＢおよびＴリンパ球）、および約４倍多い内皮細胞が産生された。さらに、微小流体処理についての凝集集団パーセンテージは、内皮細胞が富化されたという例外を除いて一般に、図５Ｂにおける６０分の対照と同程度であった。
【0081】
マウス乳腺腫瘍組織の処理および単一細胞解析
マウス乳腺腫瘍モデル（トランスジェニックＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ）を用いて、細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化した。細切消化デバイス１２を用いて１５分、３０分、または６０分、試料を処理し、同じ時点で対照より約２～２．５倍多い上皮細胞を生成した（図１７Ａ）。上皮細胞の生存率は、全ての消化時間においてデバイス条件より対照の方が低かった（図１７Ｂ）。次に、消化デバイス１２による１５分の処理に続いて、一体化された解離／濾過デバイス４０に試料を通過させた。腎と同様に、シングルパスが上皮細胞の収率（図１７Ｃ）および生存率（図１７Ｄ）に関して最適であることが見出された。
マウス乳腺腫瘍モデル（トランスジェニックＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ）を用いて、細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に最適化した。細切消化デバイス１２を用いて１５分、３０分、または６０分、試料を処理し、同じ時点で対照より約２～２．５倍多い上皮細胞を生成した（図１７Ａ）。上皮細胞の生存率は、全ての消化時間においてデバイス条件より対照の方が低かった（図１７Ｂ）。次に、消化デバイス１２による１５分の処理に続いて、一体化された解離／濾過デバイス４０に試料を通過させた。腎と同様に、シングルパスが上皮細胞の収率（図１７Ｃ）および生存率（図１７Ｄ）に関して最適であることが見出された。
【0082】
次いで完全な微小流体システム１０を評価し、上皮細胞、内皮細胞、および白血球の数についての結果を図６Ａ～図６Ｃに提示する。細胞の生存率も７－ＡＡＤ染料を介するフローサイトメトリーによって評価し、結果を図１８Ａ～図１８Ｃに提示する。上皮細胞の生存率は、約７０％に低下した６０分の対照および１５分のデバイスインターバルを除く全ての条件について約８０％であった（図１８Ａ）。内皮細胞の生存率は一般に約６０％と低かった（図１８Ｂ）。しかし、１分のデバイスインターバルは７５％と高い一方、６０分の対照および１５分のデバイスインターバルは、それぞれ５０％および４０％と低かった。白血球の生存率は、約６０％であった６０分の対照を除く全てで約８０％を保っていた（図１８Ｃ）。
【0083】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑも実施し、図７Ａ～図７Ｃに提示し解析する６つの細胞クラスターを同定した。上皮細胞が主要なクラスターであり、内腔、基底、および増殖型内腔の細胞に対応する３つのサブクラスターをさらに同定した（図１９Ａ）。これらのサブクラスターは、Ｋｒｔ１４、Ｋｒｔ１８、およびＭｋｉ６７遺伝子の発現に関連していた（図１９Ｂ）。完全な集団に対する集団パーセンテージを図１９Ｃに提示する。内腔サブタイプは１５分のインターバルで富化され、基底サブタイプは６０分のインターバルで富化され、増殖型内腔は両方の時点で少なく見積もられた。
【0084】
最後に、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの結果を、腎と同様にしてフローサイトメトリーと相関させた。ここでＥｐＣＡＭは主要な上皮クラスター（図２０Ａ）ならびにそれぞれのサブクラスター（図２０Ｂ）とよく相関した。ＣＤ４５はマクロファージ、Ｔリンパ球、および顆粒球のクラスターで高度に発現した（図２０Ｃ）一方、ＣＤ３１は内皮細胞クラスターで高度に発現した（図２０Ｄ）。次いで腎について述べたのと同じアプローチを用いて微小流体システム１０の結果を統合し、６０分のインターバルの結果に１．５の重み付けをして１５分のインターバル値に加えて、結果を表３に提示する。これらの推測はそれぞれの細胞集団についてのフローサイトメトリーの結果と再び一致し（図６Ａ～図６Ｃ）、６０分の対照に対して約２倍多い上皮細胞および約４倍多い内皮細胞が微小流体システム１０によって産生された。対照に対する白血球の値は、マクロファージについて３倍多く、Ｔリンパ球について２．５倍多く、顆粒球について２０％少なかった。注目すべきことに、微小流体処理によって、線維芽細胞（１０倍超）および基底上皮細胞（６倍超）について実質的な増加が見出された。微小流体プラットフォームについての凝集集団パーセンテージは一般に、図７Ｂにおける６０分の対照と同程度であったが、マクロファージ、内皮細胞、および線維芽細胞の顕著な富化を伴っていた。
【0085】
マウス肝からの肝細胞の単離
マウス肝を用いて細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に試験し、一体化されたデバイス４０は肝細胞の収率（図８Ａ）および生存率（図８Ｂ）を減少させることを見出した。孔径１５μｍの第２のフィルター６４は、大きく脆弱な肝細胞には小さすぎることが仮定された。したがって、第２のフィルター６４を省略した一体化された解離／濾過デバイス４０の改変バージョンを創成した。細切消化デバイス１２で肝を１５分処理した後、改変された解離／濾過デバイス４０に細胞懸濁液を１回通過させた。これにより肝細胞は消化デバイス１２単独に対して３０％、対照に対してほぼ３倍、増加した（図２１Ａ）。肝細胞の生存率は保存され、全ての条件について８５％超を保っていた（図２１Ｂ）。
マウス肝を用いて細切消化デバイス１２および一体化された解離／濾過デバイス４０を個別に試験し、一体化されたデバイス４０は肝細胞の収率（図８Ａ）および生存率（図８Ｂ）を減少させることを見出した。孔径１５μｍの第２のフィルター６４は、大きく脆弱な肝細胞には小さすぎることが仮定された。したがって、第２のフィルター６４を省略した一体化された解離／濾過デバイス４０の改変バージョンを創成した。細切消化デバイス１２で肝を１５分処理した後、改変された解離／濾過デバイス４０に細胞懸濁液を１回通過させた。これにより肝細胞は消化デバイス１２単独に対して３０％、対照に対してほぼ３倍、増加した（図２１Ａ）。肝細胞の生存率は保存され、全ての条件について８５％超を保っていた（図２１Ｂ）。
【0086】
次いで完全な微小流体システム１０（改変された単一フィルター６２の構成を有する）を評価し、肝細胞、内皮細胞、および白血球の数についての結果を図８Ａ～図８Ｅに提示する。細胞の生存率は７－ＡＡＤ染料を介するフローサイトメトリーによって評価し、結果を図２２Ａ～図２２Ｃに提示する。肝細胞の生存率は試験した大部分の条件で約９０％を保っていた（図２２Ａ）。静的またはインターバルの処理条件でわずかな増加が観察されたが、値は対照と有意に相違しなかった。内皮細胞（図２２Ｂ）および白血球（図２２Ｃ）の生存率は肝細胞で見られたのと同様の傾向に従い、一般に約７０％～８５％であった。
【0087】
マウス心臓からの心筋細胞の単離
マウス心臓を用い、一体化された解離／濾過デバイス４０ありおよびなしで、細切消化デバイスを試験した。これには、元の一体化されたデバイス４０と、肝のために創成した１５μｍフィルター６４のない改変されたデバイス４０とが含まれていた。心組織を１５分処理した後で、心筋細胞の数および生存率はそれぞれの場合について変化しなかったことが見出された（図２３Ａ～図２３Ｂ）。結果として、標準バージョンの一体化された解離／濾過デバイス４０を５０μｍおよび１５μｍのフィルター６２、６４とともに心組織のために用いることを選択した。
マウス心臓を用い、一体化された解離／濾過デバイス４０ありおよびなしで、細切消化デバイスを試験した。これには、元の一体化されたデバイス４０と、肝のために創成した１５μｍフィルター６４のない改変されたデバイス４０とが含まれていた。心組織を１５分処理した後で、心筋細胞の数および生存率はそれぞれの場合について変化しなかったことが見出された（図２３Ａ～図２３Ｂ）。結果として、標準バージョンの一体化された解離／濾過デバイス４０を５０μｍおよび１５μｍのフィルター６２、６４とともに心組織のために用いることを選択した。
【0088】
次いで完全な微小流体システム１０を評価し、心筋細胞、内皮細胞、および白血球の数についての結果を図９Ａ～図９Ｃに提示する。細胞の生存率はＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料を介するフローサイトメトリーによって評価し、結果を図２４Ａ～図２４Ｃに提示する。心筋細胞の生存率は対照について約７０％であった一方、デバイス処理についての値は全て約７５～８５％であった（図２４Ａ）。内皮細胞（図２４Ｂ）および白血球（図２４Ｃ）についての生存率は、全てのデバイスおよび対照の条件について一般に８０％超であった。
【0089】
統計。データは平均±標準誤差として表している。エラーバーは少なくとも３回の独立した実験からの標準誤差を表している。Ｐ値は、少なくとも３回の独立した実験からスチューデントｔ検定を用いて計算した。
【0090】
本発明の実施形態を示して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の改変を行うことができる。したがって本発明は以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物を除いて限定されない。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24-1】
【図24-2】
【図25】
【図26】
【図27-1】
【図27-2】
【図28-1】
【図28-2】
【国際調査報告】