特表 2023-548669 緩衝液中のポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）を検出するための滴定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-20

(54)【発明の名称】緩衝液中のポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）を検出するための滴定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 31/16 20060101AFI20231113BHJP

   G01N 31/00 20060101ALI20231113BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20231113BHJP

【ＦＩ】

G01N31/16 Z

G01N31/00 V

C12Q1/68 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023522430

(86)(22)【出願日】2021-10-15

(85)【翻訳文提出日】2023-06-07

(86)【国際出願番号】 US2021055116

(87)【国際公開番号】W WO2022081938

(87)【国際公開日】2022-04-21

(31)【優先権主張番号】63/093,124

(32)【優先日】2020-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/251,465

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/144,744

(32)【優先日】2021-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ソト，ロバート・ジョーセフ

【テーマコード（参考）】

2G042

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G042AA01

2G042BA03

2G042BA04

2G042BA08

2G042BD15

2G042BD18

2G042CB03

2G042DA02

2G042DA06

2G042FA11

2G042GA05

4B063QA01

4B063QQ01

4B063QQ13

4B063QQ79

4B063QR90

4B063QS40

4B063QX01

(57)【要約】

本開示は、錯滴定又は滴定に基づく技術により、緩衝液などの流体中のポリビニルスルホネートなどのポリアニオンのレベルを検出するための、自動化された方法を含む方法を提供する。このようなポリアニオン性化合物は、生物学的製剤及びバイオシミラーなど、細胞培養から得られるタンパク質の純度を監視する取組みを混乱させる、ＰＣＲに関与する酵素を阻害することが示されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体中のポリアニオン性酵素阻害物質を検出するための滴定方法であって、
（ａ）流体を既知量のポリカチオン性化合物と接触させることと；
（ｂ）（ａ）の材料を指示化合物と接触させることであって、前記指示化合物は、ポリカチオン性化合物と複合体形成した場合、その形態と比較して遊離形態において変化した特性を示し、複合体形成がない場合、前記指示化合物の前記遊離形態を検出するために十分な指示化合物が添加される、接触させることと；
（ｃ）（ａ）を繰り返すことと；
（ｄ）滴定点で前記指示化合物の前記遊離形態を検出し、それにより前記ポリアニオン性酵素阻害物質を検出することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記流体が、緩衝液を含むか又はそれからなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記緩衝液の複数の試料が調製され、各緩衝液試料が、異なる濃度の緩衝化合物を有し、それにより前記緩衝液の希釈系列を生成する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）の検出限界が、緩衝溶液の１．５百万分率、緩衝溶液の０．２５百万分率又は緩衝溶液の０．１６μｇ／ｍＬである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

滴定の終点が、試料の吸光度が初期の試料の吸光度と定常状態の吸光度との間の中間である点であるか、又は試料の吸光度曲線の一次導関数の極大値である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

遊離指示化合物が、電気化学的又は分光学的に検出される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

分光法による前記検出が、比色検出、光度検出、蛍光検出、ラマン又はＦＴＩＲ分光法を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ポリアニオン性酵素阻害物質が、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）又はその誘導体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ポリアニオン性酵素阻害物質が、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ポリカチオン性化合物が、ｐＨ非依存性ポリカチオン性化合物又はｐＨ依存性ポリカチオン性化合物である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ｐＨ非依存性ポリカチオン性化合物が、第四級アンモニウム系ポリマーである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ｐＨ依存性ポリカチオン性化合物が、ポリアミンである、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記第四級アンモニウム系ポリマーが、臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）、ポリ（ジアリル）ジメチルアンモニウムクロリド（ｐＤＡＤＭＡＣ）又はメチルグリコールキトサンである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記第四級アンモニウム系ポリマーが、臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）である、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

合計で総流体量の少なくとも０．１％の複数のＨＤＢｒアリコートが、前記流体に添加される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第四級アンモニウム系ポリマーが、ポリ（ジアリル）ジメチルアンモニウムクロリド（ｐＤＡＤＭＡＣ）である、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

前記指示化合物が、染料である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記染料が、アゾ染料である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記アゾ染料が、エリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ）、エリオクロムブルーブラックＲ（カルコン）又はスルホナゾナトリウム塩である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記アゾ染料が、エリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ）である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

既知量の前記ポリカチオン性化合物を含む前記流体１ｍＬあたり０．８～１．７μｇのＥＣＢＴが添加される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記緩衝液が、グッド緩衝液である、請求項２～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記グッド緩衝液が、エタンスルホン酸誘導体又はプロパンスルホン酸誘導体を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記グッド緩衝液が、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＡＭＰＢ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ又はＣＡＢＳである、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記ポリアニオン性酵素阻害物質を滴定するために必要とされるポリカチオン性化合物の量から前記ポリアニオン性酵素阻害物質の濃度を決定することをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

結果を、前記ポリアニオン性酵素阻害物質の標準曲線で得られた結果と比較し、それにより前記流体中の前記ポリアニオン性酵素阻害物質の濃度を決定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

自動化されている、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

流体中のポリアニオン性酵素阻害物質を検出するための自動化された滴定方法であって、
（ａ）流体と指示化合物とを合わせることであって、前記指示化合物は、ポリカチオン性化合物と複合体形成した場合、その形態と比較して遊離形態において変化した特性を示し、複合体形成がない場合、前記指示化合物の前記遊離形態を検出するために十分な指示化合物が添加される、合わせることと；
（ｂ）（ａ）の材料を既知量のポリカチオン性化合物と接触させることと；
（ｃ）滴定器具を使用して、前記指示化合物及びポリカチオン性化合物を含む前記流体の吸光度を測定することと；
（ｄ）（ｂ）及び（ｃ）を自動的に繰り返すことと
を含み、前記指示化合物の前記遊離形態の検出は、前記ポリアニオン性酵素阻害物質を検出する、方法。

【請求項29】

前記流体が、緩衝液を含むか又はそれからなる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記緩衝液が、グッド緩衝液である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記滴定器具が、前記ポリカチオン性化合物及び前記流体と流体連通する、シリンジポンプ又はインテリジェントドージングドライブなどのポンプを含む、請求項３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０９３，１２４号明細書、２０２１年２月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１４４，７４４号明細書及び２０２１年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２５１，４６５号明細書に対する優先権を主張し、これらは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、概して、化学分野に関し、より具体的には、流体中の化合物の濃度を決定又は滴定する分野に関する。

【背景技術】

【0003】

生物学的製剤及びバイオシミラーは、ヒト及び他の動物の疾患及び状態を治療するための重要な治療クラスになっている。結合能を保持する様々な形態の抗体及びその断片などの組換えタンパク質を含むこれらの製品は、典型的には、細胞培養から得られる。結果として、これらの治療薬は、細胞培養過程に固有の汚染物質、例えば培養における細胞増殖に付随する、不必要であり且つ場合により有毒性のタンパク質、脂質、炭水化物及び他の小分子から精製する必要がある。治療用の生物学的製剤及びバイオシミラーは、これらの培養汚染物質から単離することによって徐々に精製されるため、治療薬は、緩衝化溶液中で安定化される。さらに、精製が進むにつれて、治療薬が使用のための安全性を維持していることを確実にするために、精製レベルを監視する必要がある。細胞培養から治療薬を精製するときに見られる重大な汚染物質の１つは、宿主細胞ＤＮＡの断片である。宿主細胞ＤＮＡの残留量は、厳格な精製過程を生き残り、精製された治療薬の有害な汚染物質として残存する場合がある。ヒト患者などの動物に投与されるタンパク質製剤、例えば生物学的製剤又はバイオシミラーに含まれる残留宿主細胞ＤＮＡは、望ましくない免疫反応を誘発するか、又は癌のリスクを増加させる可能性がある。そのため、各国政府は、ヒト投与用の製剤に含まれる宿主細胞ＤＮＡの濃度に制限を課している。例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）及び欧州連合（ＥＵ）では、最大で１０ｎｇ／用量の残留宿主細胞ＤＮＡの量を認めているが、米国食品医薬品局では１００ｐｇ／用量以下が認められている。

【0004】

ヒトに投与することが意図される治療製剤に許容される宿主細胞ＤＮＡのレベルが低いことを考慮すると、そのような製剤中の宿主細胞ＤＮＡのレベルを決定するための感度がよく正確な方法が必要となる。試料中の低レベルの核酸を定量化する１つの手法は、ｑＰＣＲを使用してリアルタイムで核酸レベルを監視するなど、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによるものである。ＰＣＲは、酵素ポリメラーゼに依拠して低レベルの核酸を増幅して、それらの検出を容易にする、酵素をベースとした技法である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、試料、例えばＭＥＳなどのグッド緩衝液を含む試料中のポリアニオンのレベルを決定又は滴定するための方法を提供する。試料は、グッド緩衝液（例えば、グッド緩衝液の原材料又は製造ロット）を含み、生物学的製剤又は小分子などの治療化合物をさらに含み得る。例示的なポリアニオンは、多くの場合、回収及び精製の様々な段階でグッド緩衝液又は生物学的製剤の試料中に様々な量で存在するポリビニルスルホネート（すなわちＰＶＳ）である。これらのポリアニオン、特にＰＶＳは、ポリメラーゼなどのＲＮＡ及び／又はＤＮＡ酵素を含む様々な酵素を阻害することが分かっている。試料中のＰＶＳレベルを検出するための方法が本明細書に開示される。試料は、生物学的製剤などのタンパク質を含み得るか、又は生成、回収若しくは精製の様々な段階の他の治療化合物、例えば低分子治療薬を含み得るか、或いはその両方であり得る。当技術分野で公知の方法では、このような試料中の低レベルのＰＶＳを検出することができず、生物学的製剤などの治療化合物にＰＶＳによる汚染が生じていた。このような汚染により、ヒトにおける用途の認可が妨げられ、このＰＶＳの阻害効果によって宿主核酸などの製品製剤中の他の不純物を監視するための取組みを混乱させる可能性がある。ＰＶＳのようなポリアニオンは、ＰＣＲ、例えばｑＰＣＲなどの標準的な核酸アッセイに使用される酵素を阻害し、これにより汚染された宿主核酸の測定に不正確性がもたらされる。滴定により、グッド緩衝液を含む試料（タンパク質試料など）中のＲＮＡ酵素の公知の阻害物質であるＰＶＳのレベルを測定するための、感度よく正確且つ精密な方法が本明細書に開示される。本開示による滴定方法は、１．５桁の動的検出範囲を示し、ＭＥＳと比較してＰＶＳに高い選択性があり、変曲点又は等価点を含む単純な読み出しが得られ、この読み出しにより、生体試料などのタンパク質試料の宿主細胞の核酸汚染を監視するのに用いられることを考慮した、ＭＥＳ緩衝液ロットに対して簡単な合格／不合格の出力が提供される。この方法により、自動化された電気化学的又は分光学的（例えば、比色、光度、蛍光、ラマン又はＦＴＩＲ分光法）終点検出プローブが合理的なコストで提供され、且つ標準的な手動滴定構成に依拠した安価な実施形態も提供される。

【0006】

より詳細には、本開示は、流体中のポリアニオン性酵素阻害物質を検出するための滴定方法であって、（ａ）流体を既知量のポリカチオン性化合物と接触させることと；（ｂ）（ａ）の材料を指示化合物と接触させることであって、指示化合物は、ポリカチオン性化合物と複合体形成した場合、その形態と比較して遊離形態において変化した特性を示し、複合体形成がない場合、指示化合物の遊離形態を検出するために十分な指示化合物が添加される、接触させることと；（ｃ）（ａ）を繰り返すことと；（ｄ）滴定点で指示化合物の遊離形態を検出し、それによりポリアニオン性酵素阻害物質を検出することとを含む滴定方法を対象とする。指示化合物は、ポリアニオン性指示化合物を含むが、これに限定されないアニオン性指示薬を含むか又はそれからなり得る。いくつかの実施形態では、流体は、緩衝液を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。（ｂ）指示化合物を流体に添加することは、（ａ）を最初に繰り返す前、それと同時又はその後に実施され得ることが想定されるが、その後、指示化合物を添加する場合、指示化合物は、（ａ）を繰り返す前に添加されることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、緩衝液の複数の試料が調製され、各緩衝液試料は、異なる濃度の緩衝化合物を有し、それにより緩衝液の希釈系列を生成する。いくつかの実施形態では、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）の検出限界は、緩衝溶液の１．５百万分率、緩衝溶液の０．２５百万分率又は緩衝溶液の０．１６μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）の検出限界は、緩衝化合物の１．５百万分率、緩衝化合物の０．２５百万分率である。例えば、本明細書に記載されるような自動化された方法は、緩衝化合物の０．２５百万分率の検出限界でＰＶＳを同定することができる。いくつかの実施形態では、滴定終点は、試料の吸光度が初期の試料の吸光度と定常状態の吸光度との間の中間である点であるか、又は試料の吸光度曲線の一次導関数の極大値である。いくつかの実施形態では、遊離した指示化合物は、電気化学的又は分光学的に検出される。いくつかの実施形態では、分光法による検出は、比色検出、光度検出、蛍光検出、ラマン又はＦＴＩＲ分光法を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性酵素阻害物質は、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性酵素阻害物質は、ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）である。いくつかの実施形態では、ポリカチオン性化合物は、ｐＨ非依存性ポリカチオン性化合物又はｐＨ依存性ポリカチオン性化合物である。いくつかの実施形態では、ｐＨ非依存性ポリカチオン性化合物は、第四級アンモニウム系ポリマーである。いくつかの実施形態では、ｐＨ依存性ポリカチオン性化合物は、ポリアミンである。いくつかの実施形態では、第四級アンモニウム系ポリマーは、臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）、ポリ（ジアリル）ジメチルアンモニウムクロリド（ｐＤＡＤＭＡＣ）又はメチルグリコールキトサンである。いくつかの実施形態では、第四級アンモニウム系ポリマーは、臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）である。いくつかの実施形態では、合計で総流体量の少なくとも０．１％の複数のＨＤＢｒアリコートが流体に添加される。いくつかの実施形態では、第四級アンモニウム系ポリマーは、ポリ（ジアリル）ジメチルアンモニウムクロリド（ｐＤＡＤＭＡＣ）である。

【0007】

アニオン性指示薬などの多くの好適な指示化合物が本明細書の実施形態で使用され得る。いくつかの実施形態では、指示化合物は、アゾ染料などの染料である。いくつかの実施形態では、アゾ染料は、エリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ）、エリオクロムブルーブラックＲ（カルコン）又はスルホナゾナトリウム塩である。いくつかの実施形態では、アゾ染料は、エリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ）である。いくつかの実施形態では、既知量のポリカチオン性化合物を含む流体１ｍＬあたり０．８～１．７μｇのＥＣＢＴが添加される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グッド緩衝液である。いくつかの実施形態では、グッド緩衝液は、エタンスルホン酸誘導体又はプロパンスルホン酸誘導体を含む。いくつかの実施形態では、グッド緩衝液は、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、コラミンクロリド、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＡＭＰＢ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ又はＣＡＢＳである。本方法のいくつかの実施形態は、ポリアニオン性酵素阻害物質を滴定するために必要とされるポリカチオン性化合物の量からポリアニオン性酵素阻害物質の濃度を決定することをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態は、結果を、ポリアニオン性酵素阻害物質の標準曲線で得られた結果と比較し、それにより流体中のポリアニオン性酵素阻害物質の濃度を決定することをさらに含む。例えば、一連の複数のポリアニオン（例えば、ＰＶＳ）の較正標準（例えば、３～５個の標準）の終点量を算出し得、標準曲線を生成し得る。試料の終点値に基づいて試料中のポリアニオンの濃度を算出するために、標準曲線を使用し得る。本方法のいくつかの実施形態は、「限界試験」を実施することをさらに含み、ブランク（ＰＶＳなどのポリアニオンを含まない）及び指定限界のポリアニオン（例えば、ＰＶＳ）の濃度を含有する試料の終点量が算出される。試料の終点量を決定し、試料中のポリアニオンの濃度が指定限界の範囲内であるか否かに基づいて「合格／不合格」の分析的な判断を行い得る。いくつかの実施形態では、方法は、自動化されている。

【0008】

本開示の別の態様は、流体中のポリアニオン性酵素阻害物質を検出するための自動化された滴定方法であって、（ａ）流体と指示化合物とを合わせることであって、指示化合物は、ポリカチオン性化合物と複合体形成した場合、その形態と比較して遊離形態において変化した特性を示し、複合体形成がない場合、指示化合物の遊離形態を検出するために十分な指示化合物が添加される、合わせることと；（ｂ）（ａ）の材料を既知量のポリカチオン性化合物と接触させることと；（ｃ）滴定器具を使用して、指示化合物及びポリカチオン性化合物を含む流体の吸光度を測定することと；（ｄ）（ｂ）及び（ｃ）を自動的に繰り返すこととを含み、指示化合物の遊離形態の検出は、ポリアニオン性酵素阻害物質を検出する、自動化された滴定方法に関する。（ａ）ポリカチオン性化合物を含む流体と指示化合物とを合わせることは、（ｂ）を最初に繰り返す前、それと同時又はその後に実施され得ることが想定されるが、その後、指示化合物が組み合わされる場合、指示化合物は、（ｂ）を繰り返す前に添加されることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、流体は、緩衝液を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グッド緩衝液である。いくつかの実施形態では、方法は、滴定器具で実行される。いくつかの実施形態では、滴定器具は、ポリカチオン性化合物及び流体と流体連通する、シリンジポンプ又はインテリジェントドージングドライブなどのポンプを含む。本明細書に記載される方法及びシステムに好適な吸光波長は、使用される指示化合物に基づいて選択され得る。例えば、ＥＣＢＴの指標化合物の場合、６６０～６６５ｎｍの波長が好適である。

【0009】

いくつかの態様には、流体中のポリアニオン性酵素阻害物質を検出するための自動化された滴定システムが含まれる。自動化された滴定システムは、ポンプなどの流体送達システムを含み得る。自動化された滴定システムは、本明細書に記載されるような方法を自動的に実行するように構成され得る。例として、自動化された滴定システムは、滴定装置を含み得る。例えば、本明細書に記載される方法及びシステムに好適な滴定装置は、Ｍｅｔｒｏｈｍ社のＴＩＴＲＡＮＤＯの一連の器具として商業的に入手可能である。任意選択により、滴定装置は、シリンジポンプ又はインテリジェントドージングドライブポンプなど、流体連通させるための（例えば、ポリカチオン性化合物を流体と流体連通して配置するための）ポンプを含み得る。

【0010】

本開示の他の特徴及び利点は、図面を含めて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び修正形態は、詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明及び具体的な実施例は、実施形態を示してはいるものの、単に例として提供されていることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】（ａ）酸形態として示される２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（すなわちＭＥＳ）及び塩基形態としてのＭＥＳ水和物である、ＭＥＳナトリウム塩の化学構造。（ｂ）ＲＮＡ酵素などの核酸で活性化する酵素を阻害する可能性のある化合物をもたらす化学反応。図１（ｂ）は、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２０９３４－２０９３８（２００３）の図から引用したものである。

【図2】（ａ）ポリビニルスルホネート（ＰＶＳ）の濃度を０～１．０ｐｐｍで変動させることにより、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、３０重量％の水溶液として提供された２つの異なるロットのＰＶＳ標準の直線較正曲線が明らかとなった。ＰＶＳの濃度は、ロット間で著しく変動することが分かった。しかしながら、特定のロットの濃度を希釈することで調整し、適切な標準とすることが想定される。（ｂ）ＰＶＳを滴定するために臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）を使用する滴定曲線を０～１．０ｐｐｍのＰＶＳ濃度の範囲にわたって作成した。約１．５桁の線形範囲が見出された。

【図3】（ａ）分光学的に終点を検出することによる、ＨＤＢｒでのＰＶＳの滴定による定量化の概略図。反応スキームは、誘引性の静電相互作用によって引き起こされるＰＶＳ及びＨＤＢｒ間の複合体形成を示す。滴定の終点では、指示化合物（ｎＤ^－）は、隣接するＨＤＢｒの電荷部位と結合すると、吸光特性に変化を起こす。図３（ａ）の青色の円形の「プラス」及び「マイナス」の記号は、溶液中のバックグラウンド塩を意味する。（ｂ）ＨＤＢｒを溶液に徐々に滴定したときの卓上型吸光分光計で測定されたブランク試料（すなわちＥＢＴ指示化合物を補充した５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．５）の溶液の吸光の発生を示すプロット。ＨＤＢｒの濃度を増加させると、吸光度最大値が約６３０ｎｍから５９３ｎｍにシフトするのに伴い、指示薬の６６５ｎｍの吸光度が低下する。

【図4】ＰＶＳ標準溶液の系列に関する、正規化し、量を補正した６６５ｎｍの吸光度をプロットした滴定曲線。

【図5】（ａ）ＭＥＳマトリックスブランク中で調製した３つの異なるＰＶＳ標準に関する、ＨＤＢｒ（滴定剤）質量に対し、量を補正した溶液の６６５ｎｍの吸光度のプロット。（ｂ）５０ｍＭのホウ酸ナトリウム中（緑色の三角形）及び５０ｍＭのホウ酸ナトリウムと混合したＭＥＳ（黒色の四角形）中で調製したＰＶＳ標準間の滴定曲線の変曲点の比較。

【図6】ＭＥＳマトリックスブランク（黒い四角形）、ＭＥＳの陰性対照ロット（青色の菱形）及びｑＰＣＲ無効アッセイの原因となったＭＥＳロット（ロット番号Ｉ；赤色の円形）中で調製したＰＶＳ標準に関する、滴定曲線の変曲点の比較。

【図7】０．０４ｍｇ／ｍＬのＨＤＢｒによるブランク標準（１．２５μｇ／ｍＬのＥＢＴ指示薬を補充した１００ｍＭの炭酸塩緩衝液）の滴定に関する代表的なプロファイル（黒線）及びそれに対応する一次導関数（赤線）。

【図8】（ａ）１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中に溶解した５０ｍＭのＭＥＳに添加されたＰＶＳの濃度に対する滴定終点量のプロット。（ｂ）１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中で調製した標準試料に関する、ＰＶＳの濃度に対する滴定終点量のプロット。

【図9】１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中に０（Ａ）又は０．７５（Ｂ）μｇ／ｍＬで調製した（Ａ、Ｂ）ＰＶＳ標準溶液及び１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中で調製した５０ｍＭのＭＥＳに０（Ｃ）又は０．７０（Ｄ）μｇ／ｍＬで添加された（Ｃ、Ｄ）ＰＶＳ（表２の試料Ｈ）の代表的な滴定曲線。

【図10】ＰＶＳの濃度に対する滴定終点量のプロットを示す。Ａ）は、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中で調製した標準試料に関する、ＰＶＳの濃度に対する滴定終点量のプロットである。Ｂ）は、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中に溶解した５０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩に添加されたＰＶＳの濃度に対する滴定終点量のプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

ポリ（ビニルスルホネート）（ＰＶＳ）などのポリアニオン性化合物は、ＭＥＳ緩衝液などのグッド緩衝液中のポリマー不純物である。これらのポリアニオン性化合物、例えばＰＶＳは、ＭＥＳなどの緩衝化合物と比較して百万分率の範囲の低レベルでこのような緩衝液中に存在している。このような緩衝液は、治療用タンパク質の製造に使用されており、これらの不純物、特にＰＶＳが定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のＤＮＡの検出を妨害する可能性のある強力なポリメラーゼ阻害物質であるため、グッド緩衝液中にこれらの不純物が存在することは重大な懸念事項となる。培養物から精製された治療用タンパク質の製剤又は他の治療化合物の製剤中の宿主細胞核酸（例えばＤＮＡ）を測定することは、ヒトに投与することが意図される治療薬の安全性を評価するために日常的に必要とされている。治療製剤中の宿主細胞核酸を検出し定量化するためにＰＣＲベースの技術を使用するにあたっての大きい課題は、生物学的製剤及びバイオシミラーなどのタンパク質を細胞培養から精製するのに使用される緩衝液（例えばグッド緩衝液）の多くに核酸酵素阻害物質が存在することである。これらの製剤中の宿主細胞核酸のレベルを検出し定量化するＰＣＲベースの方法の速度、精度及び再現性から、ＰＣＲに関与する核酸酵素、例えばＲＮＡ酵素の阻害物質を同定し除去することは、当技術分野において大きいニーズとなっている。従って、ＭＥＳなどのグッド緩衝液中にＰＶＳなどのポリアニオン性化合物が存在すると、宿主細胞ＤＮＡのｑＰＣＲ検出を妨害することにより、治療用タンパク質又は他の治療化合物のバッチがヒト投与用の基準に受け入れられない原因となる可能性がある。

【0013】

分析物（例えばＰＶＳ）を逆の電荷をもつ高分子量の滴定剤で複合体形成することに基づいた、滴定に関する方法が本明細書に開示される。この相互作用により、極めて高い平衡結合定数（Ｋ_ａ）が得られ、終点を電気化学的又は分光学的に検出することができる（例えば、比色、光度、蛍光、ラマン又はＦＴＩＲ分光法）。例示的な滴定剤である臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）を用いた、ＰＶＳの滴定に適用される検出スキームの概要を図３に示す。

【0014】

９ロットの市販のＭＥＳ緩衝液を入手し、本明細書に開示されるＰＶＳを検出及び測定するための滴定方法を用いて分析を行った。これらのロットのＭＥＳ緩衝液の比較評価を、ＰＶＳを検出及び測定する、開示された滴定方法を使用して且つｑＰＣＲを使用して行った。実験データが示すように、本方法によって低レベルのＰＶＳを感度よく検出することができ、ＰＶＳレベルのロット間の変動を正しく正確に検出することが可能となる。このような分析により、ＭＥＳ緩衝液の市販のロット（ロット番号Ｉ）は、高レベルのＰＶＳを著しく含んでいることが明らかとなり、このことは、ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲ）を使用した、生体試料の宿主細胞の核酸で汚染された緩衝液に関連する阻害がロット間で変動するという観察結果と一致するものである。

【0015】

以下の実施例で提供されるデータは、臭化ヘキサジメトリン（すなわちＨＤＢｒ）などのポリカチオン性化合物を用いて試料中のＰＶＳを検出及び測定する滴定方法が、ＭＥＳと比較してＰＶＳに高い選択性がある（Ｋ_{ａ，ＰＶＳ}＞＞Ｋ_{ａ，ＭＥＳ}であり、Ｋ_ａは滴定剤（ＨＤＢｒ）とＰＶＳ（Ｋ_{ａ，ＰＶＳ}）又はＭＥＳ（Ｋ_{ａ，ＭＥＳ}）のいずれかとの間の複合体形成反応に関する平衡結合定数を示す）ことを立証するものである。本明細書に開示される結果から、開示される滴定方法は再現性があり（正確であり）、約１００～２００ｎｇ／ｍＬの定量限界（すなわちＬＯＱ）で、ＭＥＳなどのグッド緩衝液中の低レベルのポリアニオン、例えばＰＶＳを検出することができることが明らかになった。

【0016】

本明細書に開示される手順は、２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液などのグッド緩衝液中のポリ（ビニルスルホネート）（ＰＶＳ）などのポリアニオンを定量化するためのポリマー電解質の滴定手法を説明するものである。この方法論は、ビニルスルホン酸から製造される他のグッド緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）にも拡大適用することが可能である。ＰＶＳの検出の根底にある機序は、ポリカチオン種である臭化ヘキサジメトリン（ＨＤＢｒ）との結合に基づくものである。結合反応の概略を図３ａに示す。この手法は、ＰＶＳと、モノアニオンであるＭＥＳと比較して選択性のあるＨＤＢｒとの間の高い平衡結合定数（Ｋａ）を利用するものである。実際に、ポリカチオンとポリアニオン間のＫａは、電荷部位の数と共に急激に増大する（ポリマー分子量と正の相関がある）。滴定の終点では、過剰なＨＤＢｒがアニオン性指示化合物であるエリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ）と結合し、指示薬の紫外－可視吸光プロファイルにシフトが生じる（図３ｂ）。滴定の進行を単一波長（すなわち６６５ｎｍ）で追跡し、図２に示すように、例えば、得られたシグモイド曲線の変曲点を算出することにより、試料中のＰＶＳの濃度と関連付けることが可能となる。

【実施例】

【0017】

実施例１
材料及び方法
約３０重量％のポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳ）ナトリウム塩をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（＃２７８４２４）及びＡｌｆａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（＃ＡＣＭ２５０５３２７４）から購入し、希釈して０．１～２０μｇ／ｍＬの範囲の既知濃度のＰＶＳ標準を調製した。従来技術を使用して５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）を調製した。炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃２２３４８４）及び炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｓ６０１４）から、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．０）を調製した。この炭酸塩及び重炭酸塩の緩衝液に、約０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＃０６１３３７１３）を補充した。１，５－ジメチル－１，５－ジアザウンデカメチレンポリメトブロミド（臭化ヘキサジメトリン；ＨＤＢｒ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（１０７６８９）及びＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ（＃ＦＨ１６５２８０）から購入した。エリオクロムブラックＴ（ＥＢＴ又はＥＣＢＴ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（＃８５８３９０）から購入した。すべての溶液は、１８ＭΩ－ｃｍの最小抵抗率となるように精製された水を用いて調製した。１００ｍＭのＭＥＳ水和物の溶液を、０．２μｍのＰｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）フィルター（表面積２．８ｃｍ^２）で濾過することでＰＶＳを除去し、実施例１の試料ブランクとした。

【0018】

上記に記載された手順に従った方法で調製したアッセイ緩衝液により、塩酸によってｐＨを８．５に調整した５０ｍＭのホウ酸ナトリウムを含む緩衝液Ａと、ｐＨ１０．０の溶液を生成するように配合した１００ｍＭの混合炭酸ナトリウム塩及び重炭酸塩を含む緩衝液Ｂとを得た。指示化合物、すなわち染料溶液、例えばエリオクロムブラックＴ（ＥＣＢＴ；５５重量％）を指示化合物とした。指示化合物がＥＣＢＴである場合、この材料の固形アリコートを室温で保存した。例示的なＥＣＢＴ染料溶液を調製するために、１２５ｍｇのＥＣＢＴを２５ｍＬのメスフラスコに添加し、実際の質量を記録した。ＥＣＢＴを２５ｍＬの脱イオン（すなわちＤＩ）水に溶解し、使用するまで１．６ｍＬのポリプロピレン製マイクロ遠心チューブ中の１ｍＬのアリコートとして２～８℃で保存した。開示される方法のポリカチオン性化合物は滴定剤であり、例示的な滴定溶液を、ＨＤＢｒを使用して作製した。この材料を２～８℃で保存した。溶液を調製するために、１８．７ｍｇのＨＤＢｒをガラス製バイアルに直接秤量し、３．７４ｍＬの水に溶解して５ｍｇ／ｍＬのストック溶液を得た。次いで、５ｍｇ／ｍＬのＨＤＢｒ溶液を、０．１ｍＭのＥＤＴＡで補充した５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液中にそれぞれ１：２０又は１：１００に希釈することにより、０．０５μｇ／ｍＬのＨＤＢｒ滴定剤を調製した。この溶液を、本明細書に開示されるアッセイ法の滴定溶液として使用した。ＨＤＢｒ滴定溶液は、１５ｍＬのポリプロピレン製遠心チューブ中に１０ｍＬの溶液として調製し、２～８℃で保存した。

【0019】

標準的な調製
ストック溶液を水で連続希釈することにより、市販のポリ（ビニルスルホネート）（ＰＶＳ）ストック溶液を使用してアッセイ標準を調製した（Ａｌｆａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５重量％、ナトリウム塩、ロット番号Ａ１９Ｘ０５１９１）。次いで、表１のＰＶＳ溶液を５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを補充した）に添加し、既知のＰＶＳ濃度の標準を調製した。

【0020】

【表1】

【0021】

ストック溶液及び標準溶液を２～８℃で保存した。

【0022】

試料の調製
ｐＨを７．００±０．０５に調整したＭＥＳ水和物（ロット番号Ｉ及びＩＩ）の１００ｍＭ溶液を以下のように調製した。２．１３２ｇのＭＥＳ水和物を９５ｍＬの水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を使用してｐＨを調整し、その後、溶液を水で１００ｍＬの最終体積となるように調整した。従来のｐＨメーターを使用してｐＨを測定した。溶液を２～８℃で保存した。

【0023】

アッセイ手順
下記に記載される簡単な手順を用いて滴定実証実験を実施したが、このような実験は、光度滴定器具を使用して自動化することにより、本明細書に記載されるステップを自動化することができる。分光計の電源を入れることにより、分光計の紫外線ランプ及び可視光線ランプを使用前に少なくとも２０分間温めた。各アッセイ前に、標準溶液又は試料溶液のいずれかを用いて分光計をブランクにした。開示されたアッセイに使用した標準セルは、１０ｍｍの１．５ｍＬ石英キュベットであった。標準は、アッセイ緩衝液で希釈したＰＶＳからなる。例示的なグッド緩衝液としての１００ｍＭのＭＥＳを、アッセイ緩衝液と混合することによって試料を調製する。例示的なＥＣＢＴ指示化合物が６～７のｐＨ値に対して色変化を起こす一方で、７を超えるｐＨ値ではＭＥＳの緩衝領域より高くなるため、このステップが実行される。従って、ＥＣＢＴ指示薬が確実に脱プロトン化するように、上記で説明したようにＭＥＳを塩基性緩衝液、すなわちＡ又はＢと混合した。

【0024】

最初の実験では、緩衝液ＡとＭＥＳとを１：１の比率で混合した。異なる体積比でＭＥＳと混合された、より塩基性の緩衝液（例えば、Ｂ及びＣ）では、アッセイ性能が向上することが予期される。

【0025】

一度分光計をブランクにしてから、標準／試料に少量のＥＣＢＴ溶液を添加した。最初に、９９５μＬの標準／試料を５μＬのＥＣＢＴ（５ｍｇ／ｍＬ）と混合し、２５μｇ／ｍＬの最終ＥＣＢＴ濃度とした。全波長の吸光度スキャンを得た。キュベットに少量（１０～１００μＬ）のＨＤＢｒ溶液０．０５０ｍｇ／ｍＬを添加することで標準／試料溶液を滴定し、各々のＨＤＢｒを添加する間に試料の吸光度を測定した。２００μＬのピペットを使用して溶液を混合し、この溶液を約１分間静置した後に吸光度を測定した。ＨＤＢｒの量を滴定の過程にわたって徐々に増加させた。例えば、滴定の初期に吸光度プロファイルが劇的に変化した場合、最初は少量（例えば１０μＬ）の添加を行った。吸光度の変化が希釈によってさらに顕著に影響を受ける場合、滴定の後により多くの量を添加した。

【0026】

いくつかの例では（例えば、より高濃度のＰＶＳを含む溶液の場合）、より高濃度のＨＤＢｒ溶液０．２５ｍｇ／ｍＬを使用した。次いで、分光光度計をブランクにし、標準／試料に少量の染料溶液を添加する先行ステップを試料ごとに繰り返した。

【0027】

データ解析
紫外－可視スペクトルから、添加したＨＤＢｒの質量（μｇ）に対して６６５ｎｍで吸光度をプロットした。吸光度は、希釈を考慮に入れて溶液量の変化を補正する必要があるが、この補正は、総溶液量（すなわち溶液の本来の量［１．０００ｍＬ］に加えて、添加された滴定溶液の累積量）でＡ６６５ｎｍを乗じることにより達成した。

【0028】

図４及び図５は、評価の結果をまとめたものである。図４は、３つの異なるＰＶＳのレベルで添加されたアッセイ緩衝液のＨＤＢｒ滴定剤の質量に対して、量を補正した溶液の６６５ｎｍにおける吸光度を表している。

【0029】

図５ａは、３つの異なるＰＶＳのレベルで添加されたＭＥＳマトリックスブランクのＨＤＢｒ滴定剤の質量に関する、量を補正した溶液の６６５ｎｍにおける吸光度を表している。０ｐｐｍのＰＶＳ標準及び試料ブランク（すなわちＭＥＳブランク）のいずれも滴定剤を添加することによって最初にＡ_６６５の低下が引き起こされ、溶液に約５．００μｇのＨＤＢｒを添加した後に安定化した。商業的に供給されるＰＶＳを溶液に添加することによって調製された、残りのＰＶＳ標準及び試料は、定常状態の吸光度に達するまでにより多くの量の滴定剤が必要であった。例えば、７．５ｐｐｍの試料（図５ａ）は、４０μｇ超のＨＤＢｒを添加した後にはじめて安定したＡ_６６５を達成した。まとめると、これらのデータにより、試料溶液中のＰＶＳの量に関して滴定曲線に明確な違いがあることが示された（図４及び図５ａ）。図５ｂは、５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）中で調製したＰＶＳ標準溶液（緑色の三角形）又はＰＶＳが添加されており、その後５０ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）と混合して溶液のｐＨを調整したＭＥＳ（黒い四角形）に関して算出された変曲点をプロットすることにより、この関係性をまとめたものである。２つのデータセットの傾きは同等であり、高濃度（１００ｍＭ）のＭＥＳが存在してもＰＶＳの定量化が妨害されなかったことを示している。さらに、これらのデータは、１００ｍＭのＭＥＳ溶液中では１．５ｐｐｍ（μｇ／ｍＬ）、アッセイ緩衝液中では０．３ｐｐｍもの低い濃度でＰＶＳが検出されることを裏付けるものである。

【0030】

滴定手順の性能をさらに評価するために、２つの別々のロットのＭＥＳをＰＶＳ標準と共に評価した。いくつかの製品で無効なｑＰＣＲ結果が得られたＭＥＳ水和物のロット（試料Ｉ）を、ｑＰＣＲアッセイにより最小量のＰＶＳを有する別のＭＥＳ試料（すなわち図５の試料ブランクを生成するのに使用したものと同じ材料）と比較した。図６に示されるこの評価の結果により、ＭＥＳ試料Ｉには測定可能な量のＰＶＳが存在したが、陰性対照のＭＥＳ材料には存在せず、ＰＶＳを除去したマトリックスブランクと区別がつかなかったことが示された。これらの結果は、開示された方法論は、適切でないＰＶＳのレベルを有するＭＥＳ水和物材料を正確に同定できることを立証するものである。さらに、ＰＶＳを含まないＭＥＳ水和物又はｑＰＣＲを妨害することのない中間レベルのＰＶＳを含むＭＥＳ水和物が、好適でないＭＥＳ材料と区別される。

【0031】

実施例２
自動化された滴定
インテリジェントドージングドライブ（＃２．８００．００１０）及び２０ｍＬの体積容量のドージングユニット（＃６．３０３．２２００）を備えたＭｅｔｒｏｈｍ ９０７ Ｔｉｔｒａｎｄｏ器具を使用して、ＰＶＳ標準溶液及びＭＥＳ試料溶液の自動化された滴定を実施した。１００ｍＬの標準溶液又は試料溶液を、滴定する直前に、（例えば、０．５～１．０ｍｇ／ｍＬのＥＢＴストック中に添加することによって）０．８～１．７μｇ／ｍＬのＥＢＴ指示薬で補充した。試料を５０～１５０μＬの量のＨＤＢｒで増分しながら単調に滴定し、投与増分の間に光度プローブからのシグナルを安定させることにより、得られた溶液をアッセイした。浸漬光度プローブ（Ｏｐｔｒｏｄｅ、＃６．１１１５．０００）を使用して試料溶液の６６０ｎｍの吸光度を連続的に測定することによって滴定の進行を監視し、滴定曲線の一次導関数の最大ｄＵ／ｄＶを用いて滴定終点を求めた。

【0032】

ブランク標準の代表的な滴定プロファイルを図７に示し（黒線）、対応する一次導関数と共に示す（赤線）。一次導関数の最大値が生じるときの量（すなわち図７では約０．５５ｍＬのＶ_{Ｔｉｔｒａｎｔ}）が滴定終点に相当するものであり、ＰＶＳ濃度の決定に使用される。

【0033】

試料溶液のｐＨは、ＰＶＳ分析物のアニオンの電荷密度に影響を及ぼすか、又は間接的には指示化合物をプロトン化し、ＨＤＢｒと複合体形成するときに吸光度に変化を起こさない一価のアニオン（Ｈ_２Ｉｎ^－）を形成することにより、ＰＶＳを測定するのに重要な役割を果たす。実施例１の上記に記載された実験により、調製されたＭＥＳ溶液をアルカリ性緩衝液と混合することが試料の適切なｐＨを確実にするための有効な手法となることが示された。自動化滴定実験におけるこの手法（すなわち１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中５０ｍＭのＭＥＳでＭＥＳ試料を溶解することによる）の使用について、ＭＥＳ試料溶液中のＰＶＳ添加回収率を評価することによって検証した。この評価では、ＭＥＳ水和物試料溶液（試料Ｈ；表２を参照されたい）に様々な濃度の１０ｐｐｍのＰＶＳストック溶液を添加した。試料にさらなるＰＶＳを添加せずに滴定することでアッセイしたときに、この材料でブランク標準と区別がつかない終点量が得られたが、このことは、ＰＶＳのレベルが本方法の検出限界未満であったことを示している。

【0034】

４つの異なるＰＶＳレベル（それぞれ３回アッセイする）のＰＶＳの濃度に対して滴定終点量をプロットした、添加回収評価の結果を図８ａに示す。比較のため、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液のみで調製されたＰＶＳ標準の結果を図８ｂに示す。両方のデータセットについて、滴定終点量とＰＶＳ濃度間の線形回帰で同様の傾き（０．９９及び０．９５ｍＬ／（μｇ／ｍＬ））が得られ、適切な線形決定係数（Ｒ^２＝０．９９）であった。加えて、ＰＶＳ標準（図９Ａ及び９Ｂ）と添加回収試料（図９Ｃ及び９Ｄ）に関して図９に示される代表的な滴定曲線を目視検査すると、低いｐＨ又は５０ｍＭのＭＥＳの存在が滴定プロファイルに及ぼす影響は認識できないものであることが示された。まとめると、これらの結果は、試料の低いｐＨ又は５０ｍＭのＭＥＳの存在が、測定されたＰＶＳレベルに明らかに影響しないことを示している。

【0035】

滴定手順の展開過程にわたり、５０ｍＭのＭＥＳ（１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中に溶解させた）を０．１０ｍｇ／ｍＬのＨＤＢｒで滴定することにより、いくつかのＭＥＳ水和物ロットのＰＶＳ含有量を評価した。滴定終点をＰＶＳ標準溶液の系列で生じた結果と比較した。これらの評価の結果を表２に示す。これらの試料の中で、あるＭＥＳ水和物のロット（試料Ｉ）が、いくつかの治療用タンパク質のバッチに対してｑＰＣＲアッセイを失敗させる原因となっていた。試料Ｉでは、滴定によって測定されたＰＶＳレベルが、ＭＥＳ水和物１グラムあたり７１±４μｇのＰＶＳであり、この値は試験した他の試料のいずれかで測定されたＰＶＳレベルよりも著しく大きく、このことは、不適切なＰＶＳのレベルのＭＥＳ材料を選別するのに滴定が有用であることを裏付けるものであった。一部のＭＥＳ水和物ロット（すなわちＥ．１及びＥ．２、Ｆ．１及びＦ．２並びにＨ．１及びＨ．２）について、異なる繰り返しの滴定手順が示されていることに留意する。例えば、Ｅ．１は単一反復に基づく繰り返しを表し、Ｅ．２は３回の繰り返しに基づく繰り返しを表している。

【0036】

【表2】

【0037】

実施例３
検出方法の比較
タンパク質試料（例えば、生体試料）中のＰＶＳなどのポリカチオンを検出及び測定するためのいくつかの方法を評価した。比濁検出による、ＰＶＳによるポリイオン性レポーターの対イオンの誘導凝集に関与するイオン配位方法は、それほど複雑ではない簡単な方法であるが、この方法では、高レベルのＰＶＳを有するＭＥＳ緩衝液のロットを確実に検出することはできなかった。蛍光の励起及び検出によってＰＶＳ水溶液の直接的な検出に関与する蛍光に基づく方法は、それほど複雑でない別の簡単な方法であったが、この方法は、溶液中のＰＶＳが蛍光を発しない一方で、乾燥させたＰＶＳ試料に関連する蛍光が乾燥試料に関連したＰＶＳ非特異的アーチファクトであると判断されたため、ＰＶＳの検出には実現可能でないことが証明されている。蛍光レポーター分子のＰＶＳによって誘導される消光に関与する別の蛍光に基づく方法は、より複雑で、ＭＥＳに対してＰＶＳを選択的に検出する能力が限定的であるため、有望であるように見えなかった。グッド緩衝液に見られるポリアニオンの物理的特性に基づく方法には、荷電化粒子検出を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（すなわちＳＥＣ－ＣＡＤ）がある。この方法は、ＭＥＳ緩衝液中のＰＶＳを検出することができたが、他の方法よりもかなり複雑である。もう１つのイオン配位方法が評価されたが、この方法は、ポリマー電解質の複合体形成及び紫外－可視波長の吸光度検出を用いた滴定に関与するものであり、表３に示すグッド緩衝液を含むが、これに限定されないグッド緩衝液中のＰＶＳの正確で精密且つ感度のよい検出及び定量化を提供するという、予想外に優れた結果をもたらすことが判明した。滴定方法として本明細書に開示されるこの方法は、正確さ、精密さ及び感度のよさという利点を提供することに加えて、それほど複雑でなくコストも高くない簡単な方法である。

【0038】

【表3】

【0039】

実施例４
調製されたＭＥＳナトリウム塩水溶液中のＰＶＳの定量化
ＭＥＳ水和物共役酸の溶液よりもかなりアルカリ性（例えば、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中の５０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩及びＭＥＳ水和物の溶液のｐＨでそれぞれ約１０．０及び約８．５）のＭＥＳナトリウム塩の水溶液は、実施例２に示されたものと同様の滴定手順を用いたＰＶＳの決定にも適応させることができる。図１０（Ｂ）では、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液中で調製し、ＰＶＳ標準を添加した５０ｍＭのＭＥＳナトリウム塩溶液に関する、６６０ｎｍで光度的に決定された滴定終点がプロットされている。比較のため、図１０（Ａ）では、１００ｍＭの炭酸塩緩衝液のみで調製した標準に関するＰＶＳ濃度の関数として滴定終点量がプロットされている。両方のデータセットについて、滴定終点量とＰＶＳ濃度間の線形回帰で同様の傾き（１．０４及び１．０９ｍＬ／（μｇ／ｍＬ））が得られ、線形決定係数（Ｒ^２）は１．００であった。重要なことに、ＭＥＳ水和物試料とＭＥＳナトリウム塩試料との両方の添加回収率の傾きの大きさは、本方法の典型的な実験誤差の範囲内であった（すなわち２つの試料の種類間で分析反応に明らかな違いがなかった）。

【0040】

それぞれの引用特許又は他の刊行物は、文脈から当業者に明らかなように、その全体又は関連する部分が本明細書に参照として明示的に援用され、その援用は、例えば、本明細書に開示される情報に関連して使用され得るこのような刊行物に記載される方法論を有効に説明及び開示するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】