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特表2023-548816陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターの精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-21
(54)【発明の名称】陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡＡＶベクターの精製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20231114BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231114BHJP
B01D 15/36 20060101ALI20231114BHJP
G01N 30/02 20060101ALI20231114BHJP
G01N 30/74 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 112Z
C12N15/864 100Z
B01D15/36 ZNA
G01N30/02 B
G01N30/74 E
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525475
(86)(22)【出願日】2021-11-01
(85)【翻訳文提出日】2023-06-15
(86)【国際出願番号】 IB2021060095
(87)【国際公開番号】W WO2022097008
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】63/109,049
(32)【優先日】2020-11-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/217,194
(32)【優先日】2021-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/253,215
(32)【優先日】2021-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】593141953
【氏名又は名称】ファイザー・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100133927
【弁理士】
【氏名又は名称】四本 能尚
(74)【代理人】
【識別番号】100147186
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 眞紀
(74)【代理人】
【識別番号】100174447
【弁理士】
【氏名又は名称】龍田 美幸
(74)【代理人】
【識別番号】100185960
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 理愛
(72)【発明者】
【氏名】アレキサンダー ベリール
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム エス． キッシュ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン アール． ライトホルダー
(72)【発明者】
【氏名】マシュー ケー． ローチ
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム ビー． ウェルボーン
(72)【発明者】
【氏名】タマラ ゼコビック
【テーマコード（参考）】
4D017
【Ｆターム（参考）】
4D017AA08
4D017AA09
4D017BA04
4D017BA07
4D017CA13
4D017CA17
4D017CB01
4D017DA03
4D017DB01
4D017EA05
(57)【要約】
本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを溶液から陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製して、フルカプシドが富化されており、空カプシドが枯渇されている溶出液を生成する方法を提供する。
【図１】
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップであって、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含むステップと、
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項2】
カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定することをさらに含む、請求項１に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項3】
固定相に適用する前に、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で約２倍～２５倍（たとえば１５倍）に希釈し、任意選択で濾過する、請求項１または２に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項4】
溶液が親和性溶出液である、請求項１から３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項5】
希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液のｐＨが、溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液の伝導率が、溶液の伝導率と比較して減少している、請求項４に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項6】
第１の勾配溶出緩衝液が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス、約０．００５％～約０．０１５％のＰ１８８を含み、ｐＨ約８．５～９．５のｐＨを有しており、第２の勾配溶出緩衝液が、約４００ｍＭ～約６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス、約０．００５％～約０．０１５％のＰ１８８を含み、ｐＨ約８．５～９．５のｐＨを有しており、１０～６０カラム体積（ＣＶ）（たとえば、約２０ＣＶ、約３７．５ＣＶ）の第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物を勾配溶出中に固定相に適用する、請求項１から５のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項7】
勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が５０％～１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が５０％～１００％であり、第２の溶出緩衝液の百分率を、勾配溶出にわたって約２％～５％／ＣＶの速度で増加させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項8】
第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物の酢酸ナトリウムの濃度を、勾配溶出中に連続的に増加させ、酢酸ナトリウムの濃度を、勾配溶出にわたって約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ（たとえば、約１０ｍＭ／ＣＶ、約２５ｍＭ／ＣＶ）の速度で増加させる、請求項１から７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項9】
フルカプシドが、勾配溶出中に固定相から第１の溶出ピーク中および／または第２の溶出ピークの最初の部分中に溶出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項10】
空カプシドが、勾配溶出中にカラムフロースルー中で第１の溶出ピーク中および／または第２の溶出ピークの最後の部分中で回収される、請求項１から９のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項11】
溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を２８０ｎｍで測定し、任意選択で、吸光度閾値が、２８０ｎｍで測定して≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項12】
溶出液の少なくとも１つの画分の体積が、ＣＶの１／８～１０ＣＶ、たとえば、ＣＶの１／８、ＣＶの１／４、ＣＶの１／３、ＣＶの１／２、ＣＶの３／４、１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ、８ＣＶ、９ＣＶ、１０ＣＶ、またはＣＶのそれより多くに等しく、任意選択で、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比が１．２５以上である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項13】
溶出液の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個、またはそれより多くの画分を収集する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項14】
それぞれ≧０．９８または≧１．０のＡ２６０／Ａ２８０比を有する、カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項15】
プールした溶出液が、２０％～１００％（たとえば６３＋／－２６％）の％ＶＧカラム収率、３１％～６６％（たとえば４７＋／－１１％）の％ＶＧステップ収率、および／または≧１．０のＡ２６０／Ａ２８０比を有する、請求項１４に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項16】
プールした溶出液が、カラム上にロードした溶液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている、請求項１４または１５に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項17】
精製ｒＡＡＶベクターが生成される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項18】
プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項19】
原薬が、ｉ）全カプシドの４５％～６５％（たとえば５２＋／－７％）のフルカプシド、ｉｉ）全カプシドの１９％～３７％（たとえば２８＋／－５％）の中間体カプシド、および／またはｉｉｉ）全カプシドの１０％～３７％（たとえば２０＋／－７％）の空カプシドを含む、請求項１８に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項20】
原薬が、カラム上にロードした溶液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている、請求項１８または１９に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項21】
ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３号の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５からなる群から選択されるＡＡＶ血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項22】
ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質および配列番号１の核酸を含む導入遺伝子を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項23】
ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質および配列番号１５のアミノ酸配列をコードしている核酸を含む導入遺伝子を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項24】
ｉ）第１の溶液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、ｉｉ）ステップｉ）からの第１の溶液を、フィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップと
を含み、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少している、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【請求項25】
ｒＡＡＶベクターを含む第１の溶液が、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される、請求項２４に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【請求項26】
希釈溶液が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８を含み、ｐＨ８．５～９．５のｐＨを有する、請求項２４または２５に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【請求項27】
ｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが８．５～９．５である、ｉｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が１．７～３．３ｍＳ／ｃｍである、ならびに／またはｉｉｉ）希釈溶液の％ＶＧ希釈収率が３５％～１００％である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【請求項28】
ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【請求項29】
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における塩の濃度の増加の速度が約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ（たとえば約２５ｍＭ／ＣＶ）であるように、塩の濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップ、および／または
ｖｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項30】
Ａ２６０／Ａ２８０比が≧１．０であるときにカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、請求項２９に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項31】
塩が酢酸ナトリウムである、請求項２９または３０に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項32】
ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項33】
ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、固定相上にロードする前に希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項34】
固定相から溶出された材料がｒＡＡＶベクターを含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項35】
プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項36】
原薬を、疾患、障害、または状態を処置するためにヒト対象への投与に適している薬物製品を作製するために使用する、請求項３５に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項37】
疾患、障害、または状態がＤＭＤまたはウィルソン病であり、ｒＡＡＶベクターが配列番号２または配列番号１５のアミノ酸配列をコードしている核酸を含んでいてもよい、請求項３６に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【請求項38】
ｉ）親和性溶出液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、ｉｉ）ステップｉ）からの親和性溶出液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液を生成するステップと
を含み、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液のｐＨが、親和性溶出液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液の伝導率が、親和性溶出液の伝導率と比較して減少している方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項39】
希釈溶液が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５を含む、請求項３８に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項40】
親和性溶出液のｐＨが希釈および任意選択で濾過のステップの前に３．０～４．４であり、希釈および任意選択で濾過のステップの後の親和性溶出液のｐＨが８．５～９．５または８．７～９．０（たとえば、８．８、９．０）である、請求項３８または３９に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項41】
親和性溶出液の伝導率が、希釈および任意選択で濾過のステップの前に５．０～７．０ｍＳ／ｃｍ（たとえば５．５～６．５ｍＳ／ｃｍ）であり、親和性溶出液の伝導率が、希釈および任意選択で濾過のステップの後に１．７～３．３ｍＳ／ｃｍ、１．８～２．８ｍＳ／ｃｍ、および／または２．２～２．６ｍＳ／ｃｍである、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項42】
希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液の％ＶＧ希釈収率が３５％～１００％である、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項43】
ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含む、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項44】
希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液をＡＥＸ固定相上にロードする、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【請求項45】
ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、約１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、および／または
ｉｉｉ）約４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ
のうちの少なくとも１つのステップを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための固定相を調製する方法。
【請求項46】
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０ＭのＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化のステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７％～１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む、保存液を固定相に適用するステップ
を含む、ＡＥＸ固定相を再生する方法。
【請求項47】
ステップｉ）～ｖ）のうちの任意の１つが、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法のクロマトグラフィー溶出ステップに続く、請求項４６に記載のＡＥＸ固定相を再生する方法。
【請求項48】
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０ＭのＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化のステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７％～１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む、保存液を固定相に適用するステップ
を含む方法によって調製した、再生したＡＥＸ固定相。
【請求項49】
再生したＡＥＸ固定相をｒＡＡＶベクターの精製に使用する、請求項４８に記載の再生したＡＥＸ固定相。
【請求項50】
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させ、勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が約７５％～約１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約６０％～約１００％であり、第２の溶出緩衝液の百分率を、勾配溶出にわたって約２％～５％／ＣＶの速度で増加させるステップと、
ｉｉｉ）第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約３０％～約３５％であるときに開始して、勾配溶出を行う際に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップと
を含み、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項51】
ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む緩衝液で約１５倍に希釈されている親和性溶出液である、請求項５０に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項52】
第１の勾配溶出緩衝液が、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む、および／または第２の勾配溶出緩衝液が、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む、請求項５０または５１に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項53】
溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップが、溶出液の少なくとも１つの画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器内に収集することを含む、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項54】
溶出液の少なくとも１つの画分が、親和性溶出液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ｒＡＡＶベクターがｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相がＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【請求項55】
勾配溶出を行う際に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップが、第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約５０％～約５５％であるときに終了する、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、そのそれぞれの内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２０２１年１０月７日出願の米国仮特許出願第６３／２５３，２１５号、２０２１年６月３０日出願の米国仮特許出願第６３／２１７，１９４号、および２０２０年１１月３日出願の米国仮特許出願第６３／１０９，０４９号の優先権を主張するものである。
本出願は、そのそれぞれの内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２０２１年１０月７日出願の米国仮特許出願第６３／２５３，２１５号、２０２１年６月３０日出願の米国仮特許出願第６３／２１７，１９４号、および２０２０年１１月３日出願の米国仮特許出願第６３／１０９，０４９号の優先権を主張するものである。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出され、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている配列表を含有する。２０２１年１０月１５日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＰＣ０７２５５５Ａ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが１，０４８，５７６バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出され、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている配列表を含有する。２０２１年１０月１５日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＰＣ０７２５５５Ａ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが１，０４８，５７６バイトである。
【0003】
本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡＡＶ、具体的には組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの精製に関する。
【背景技術】
【0004】
治療的導入遺伝子を送達するために組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを使用する遺伝子療法は、治癒方法が存在せず、多くの場合は限定的な処置しか存在しない、広範囲の重篤な疾患を処置する潜在性を有する（Ｗａｎｇら（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：３５８～３７８）。遺伝子療法ベクターの製造は複雑であり、宿主細胞不純物から、および治療的導入遺伝子をコードしている完全ベクターゲノムを含有しないウイルスカプシドから治療的ｒＡＡＶベクターを精製するために、専門的な方法を必要とする。高純度かつ良好な安全性および有効性プロファイルを有する臨床グレードのｒＡＡＶベクター組成物を生じる精製方法の開発に加えて、精製方法はまた、患者の要求を満たすために高体積のｒＡＡＶ生成まで拡張可能である必要もある。
【0005】
塩化セシウム勾配沈降を使用した超遠心分離は、宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡを除去するため、ならびに空である（すなわちベクターゲノムを含有しない）ウイルスカプシド、部分的にパッケージングされた（「中間体カプシド」とも呼ばれ、部分的ベクターゲノムおよび／もしくは非導入遺伝子関連ＤＮＡを含有する）、またはフルにパッケージングされたベクター（「フルカプシド」とも呼ばれ、完全ベクターゲノムを含有する）を分離するための、ロバストな方法である（Ｂｕｒｎｈａｍら（２０１５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ． ２６：２２８～２４５）。しかし、塩化セシウム勾配精製は労力を要し、時間がかかり、大スケール製造に応じない。イオジキサノール勾配を使用した超遠心分離、労働集約性はより低いが、一般に、より低い純度のベクター収率をもたらす（Ｈｅｒｍｅｎｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０：１８８５～１８９１）。親和性および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー方法は、空ウイルスカプシドをフルｒＡＡＶベクターから分離することを含む、臨床グレードのｒＡＡＶの大スケール生産に有用であることが証明されている。
【0006】
空カプシドは、ウイルスカプシド中に組換えベクターゲノムを生成してパッケージングする宿主細胞によって生成される。ほとんどの哺乳動物発現系においてフルベクターに対して過剰の空カプシドが生成され、様々な系が１～３０％のフルベクターを生産する（Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖ（２０１８）８：１６６～１８０）。空カプシドの生成は、導入遺伝子をコードしているプラスミド対ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子のプラスミド比の不均衡が原因であり得る。薬物製品中における空カプシドの存在は、望ましくない免疫応答を引き起こす、および／または標的細胞上の結合部位について組換えベクターと競合する場合がある。
【0007】
酢酸緩衝液ならびにＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱおよびＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬなどの樹脂を用いた、特定の陰イオン交換クロマトグラフィー方法が、フルベクターと比較して空カプシドの陰イオン性特徴がわずかにより低いことに依存することによって、空カプシドをｒＡＡＶ２ベクタープールから分離するために使用されている（ＵＳ７，２６１，５４４号、Ｑｕら（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ． １４０（１）：１８３～１９２）。同様の手法では、親和性およびイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）とＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂を用いた１０ｍＭ～３００ｍＭのトリスアセテート勾配、ｐＨ８との組合せを使用して、様々な血清型のフルＡＡＶベクターを富化させた（Ｎａｓｓら（２０１８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａ．Ｍｅｔｈ．＆ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ． ９：３３～４６）。他の研究は、フルＡＡＶベクターからの空カプシドのクロマトグラフィー分離に有用な緩衝液および条件を同定した。たとえば、Ｕｒａｂｅは、ＡＡＶ１材料を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム上にロードするためにＭｇＣｌ２およびグリセロールを含むトリス－ＨＣｌ緩衝液で希釈することができ、抗カオトロピックイオンを含む溶液が、空ＡＡＶ１カプシドのフルベクターからの分離のために有効な溶出緩衝液であることを決定した（Ｕｒａｂｅら（２００６）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ． １３（４）：８２３～８２８）。他の者は、空カプシドのフルＡＡＶベクターからの分離のために、ＡＥＸ方法における、親和性クロマトグラフィー溶出液の希釈（たとえば５０倍）およびモノリシック支持体からの浅い勾配溶出（たとえば２０ｍＭ～１８０ｍＭのＮａＣｌ）の使用を記載している（ＵＳ２０１９－０００２８４１号、ＵＳ２０１９－０００２８４２号、ＵＳ２０１９－０００２８４３号、ＵＳ２０１８－０００２８４４号）。しかし、これらの方法では、高いｐＨ（９．８～１０．２）も用いており、これはｒＡＡＶベクターの脱アミド化および／または凝集をもたらす場合があり、治療効力の減少をもたらし得る。
【0008】
たとえば、宿主細胞上清のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、硫酸アンモニウムを使用したカプシド材料（ｒＡＡＶベクターおよび空カプシドを含む）の沈殿、ＡＥＸクロマトグラフィー、ならびにサイズ排除クロマトグラフィーを順不同で含む方法の組合せを使用したプロセスが、ｒＡＡＶを空カプシドから分離するために開発されている（Ｔｏｍｏｎｏら（２０１８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ． １１：１８０～１９０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
最適な純度、効力、および一貫性を有する、臨床グレードのｒＡＡＶベクター（たとえばｒＡＡＶ９）を調製するための方法の必要性が、依然として残る。これらの方法は、疾患（たとえば、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ））を処置するための臨床的要求を満たすために必要なスケールで、治療的導入遺伝子を有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを空ＡＡＶカプシドから分離することを含む。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、それだけには限定されないが、フルｒＡＡＶベクター（たとえばｒＡＡＶ９ベクター）の空カプシドからの分離を含む、ｒＡＡＶベクターの精製の改善されたＡＥＸ方法を提供する。そのような精製されたフルｒＡＡＶベクターは、ＤＭＤを有する対象などのヒト対象に投与するための薬物製品の生産に適している。本開示はまた、ＡＥＸによるさらなる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含むクロマトグラフィー溶出液（たとえば親和性クロマトグラフィーからのもの）を調製する新規方法も提供する。本開示はまた、プロセスの完全性（たとえば、ｒＡＡＶベクターの精製の成功、フルベクターの空カプシドからの分離）を維持しながら製造費用を下げつつ、固定相を複数のクロマトグラフィーの実行において使用することを可能にする、ＡＥＸ固定相を再生する方法も提供する。
【0011】
当業者は、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多数の均等物を、理解する、または日常的な実験より多くのことを使用せずに確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることを意図する。
【0012】
Ｅ１．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中の固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップと
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中の固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップと
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0013】
Ｅ２．ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップが、２．５×１０１５～３．０×１０１７個のベクターゲノム（ＶＧ）／Ｌのカラム体積をカラム上に適用することを含む、Ｅ１に記載の方法。
【0014】
Ｅ３．ロードするステップが、８．０×１０１２～２．０×１０１８個の全ＶＧをカラムに適用することを含む、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
【0015】
Ｅ４．ロードするステップが、ベクターゲノム内の導入遺伝子配列のｑＰＣＲ分析によって測定して、２．６×１０１２～６．８×１０１３ＶＧ／ｍＬのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液を、カラム（たとえば６．４Ｌのカラム）上に適用することを含む、Ｅ１からＥ３のいずれか一項に記載の方法。
【0016】
Ｅ５．ロードするステップが、ベクターゲノム内のＩＴＲ配列のｑＰＣＲ分析によって測定して、５×１０１３～１．３×１０１４ＶＧ／ｍＬのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液を、カラム（たとえば１．３Ｌのカラム）上に適用することを含む、Ｅ１からＥ４のいずれか一項に記載の方法。
【0017】
Ｅ６．ｒＡＡＶベクターを容器中で生成させ、容器の体積が、約１Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、またはそれより大きい、Ｅ１からＥ５のいずれか一項に記載の方法。
【0018】
Ｅ７．容器が単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）である、Ｅ１からＥ６のいずれか一項に記載の方法。
【0019】
Ｅ８．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ロードする前に希釈および任意選択で濾過した、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される、Ｅ１からＥ７のいずれか一項に記載の方法。
【0020】
Ｅ９．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ロードする前に希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液である、Ｅ１からＥ８のいずれか一項に記載の方法。
【0021】
Ｅ１０．溶液が、少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップを受けている、Ｅ１からＥ９に記載の方法。
【0022】
Ｅ１１．少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップが、細胞溶解、凝結、濾過、クロマトグラフィー（たとえば親和性クロマトグラフィー）、希釈、ｐＨ調節、伝導率調節、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ１０に記載の方法。
【0023】
Ｅ１２．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ある体積を有する単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる親和性溶出液である、Ｅ１からＥ１２のいずれか一項に記載の方法。
【0024】
Ｅ１３．ＳＵＢが約１Ｌ～約２０００Ｌの体積を有する、Ｅ１２に記載の方法。
【0025】
Ｅ１４．固定相がＡＥＸ固定相である、Ｅ１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【0026】
Ｅ１５．固定相が正電荷である、Ｅ１からＥ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0027】
Ｅ１６．固定相が共有結合した四級化ポリエチレンイミンを有するポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、固定相がＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、Ｅ１からＥ１５のいずれか一項に記載の方法。
【0028】
Ｅ１７．任意選択でｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードした後に、ロードチェイス溶液をカラム中のＡＥＸ固定相に適用することをさらに含む、Ｅ１からＥ１６のいずれか一項に記載の方法。
【0029】
Ｅ１８．緩衝剤（たとえば、トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシン）を含む１～１５カラム体積（ＣＶ）のロードチェイス溶液をカラム中の固定相に適用する、Ｅ１７に記載の方法。
【0030】
Ｅ１９．ロードチェイス溶液が約１０ｍＭ～３０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、ｐＨ８～１０を含む、Ｅ１７またはＥ１８に記載の方法。
【0031】
Ｅ２０．カラム中の固定相の使用前のフラッシュをさらに含む、Ｅ１からＥ１９のいずれか一項に記載の方法。
【0032】
Ｅ２１．カラム中の固定相の使用前のフラッシュが、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行する、Ｅ２０に記載の方法。
【0033】
Ｅ２２．カラム中の固定相の使用前のフラッシュが、注入用水を固定相に適用することを含む、Ｅ２０またはＥ２１に記載の方法。
【0034】
Ｅ２３．カラム中の固定相を浄化することをさらに含む、Ｅ１からＥ２２のいずれか一項に記載の方法。
【0035】
Ｅ２４．カラム中の固定相を浄化することが、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行する、Ｅ２３に記載の方法。
【0036】
Ｅ２５．カラム中の固定相を浄化することが、ＮａＯＨを含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２３またはＥ２４に記載の方法。
【0037】
Ｅ２６．カラム中の固定相を浄化することが、約０．１Ｍ～約１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２３からＥ２５のいずれか一項に記載の方法。
【0038】
Ｅ２７．カラム中の固定相を浄化することが、約５ＣＶ～約１０ＣＶまたは約１４．４ＣＶ～約１７．６ＣＶの、約０．１Ｍ～約１．０ＭのＮａＯＨを含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２３からＥ２６のいずれか一項に記載の方法。
【0039】
Ｅ２８．カラム中の固定相を浄化することが上向流によるものである、Ｅ２３からＥ２７のいずれか一項に記載の方法。
【0040】
Ｅ２９．カラム中の固定相を再生することをさらに含む、Ｅ１からＥ２８のいずれか一項に記載の方法。
【0041】
Ｅ３０．カラム中の固定相を再生することが、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行する、Ｅ２９に記載の方法。
【0042】
Ｅ３１．カラム中の固定相を再生することが、塩、緩衝剤、およびその組合せからなる群から選択される構成成分を含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
【0043】
Ｅ３２．カラム中の固定相を再生することが、約１Ｍ～約３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８～１０（たとえば約９）を含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２９からＥ３１のいずれか一項に記載の方法。
【0044】
Ｅ３３．カラム中の固定相を再生することが、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ９を含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２９からＥ３２のいずれか一項に記載の方法。
【0045】
Ｅ３４．カラム中の固定相を再生することが、４．５～５．５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ２９からＥ３３のいずれか一項に記載の方法。
【0046】
Ｅ３５．カラム中の固定相の再生を複数回行う、Ｅ２９からＥ３４のいずれか一項に記載の方法。
【0047】
Ｅ３６．カラム中の固定相の平衡化をさらに含む、Ｅ１からＥ３５のいずれか一項に記載の方法。
【0048】
Ｅ３７．カラム中の固定相の平衡化が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行するまたは続く、Ｅ３６に記載の方法。
【0049】
Ｅ３８．カラム中の固定相の平衡化が、緩衝剤、塩、アミノ酸、界面活性剤、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６またはＥ３７に記載の方法。
【0050】
Ｅ３９．緩衝剤が、トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシン、ならびにその組合せからなる群から選択される、Ｅ３８に記載の方法。
【0051】
Ｅ４０．塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ３６またはＥ３９に記載の方法。
【0052】
Ｅ４１．塩が酢酸ナトリウムである、Ｅ３８からＥ４０のいずれか一項に記載の方法。
【0053】
Ｅ４２．アミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、シトルリン、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ３８からＥ４１のいずれか一項に記載の方法。
【0054】
Ｅ４３．アミノ酸がヒスチジンである、Ｅ３８からＥ４２のいずれか一項に記載の方法。
【0055】
Ｅ４４．界面活性剤が、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ３８からＥ４３に記載の方法。
【0056】
Ｅ４５．界面活性剤がＰ１８８である、Ｅ３８からＥ４４のいずれか一項に記載の方法。
【0057】
Ｅ４６．カラム中の固定相の平衡化が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ約８～１０（たとえば約９）を含む平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ４５のいずれか一項に記載の方法。
【0058】
Ｅ４７．カラム中の固定相の平衡化が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約２５０ｍＭ～約７５０ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約０．００５～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８～約１０（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ４６のいずれか一項に記載の方法。
【0059】
Ｅ４８．カラム中の固定相の平衡化が、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、約０．１％～約１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ約８～約１０（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ４７のいずれか一項に記載の方法。
【0060】
Ｅ４９．カラム中の固定相の平衡化が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８～約１０（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ４８のいずれか一項に記載の方法。
【0061】
Ｅ５０．カラム中の固定相の平衡化が、約４．５ＣＶを超える平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ４９のいずれか一項に記載の方法。
【0062】
Ｅ５１．カラム中の固定相の平衡化が、４．５～５．５ＣＶの平衡化緩衝液を固定相に適用することを含む、Ｅ３６からＥ５０のいずれか一項に記載の方法。
【0063】
Ｅ５２．カラム中の固定相の平衡化を複数回行う、Ｅ３６からＥ５１のいずれか一項に記載の方法。
【0064】
Ｅ５３．少なくとも１つの平衡化緩衝液を、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップの前に固定相に適用し、少なくとも１つの平衡化緩衝液を、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップの後に固定相に適用する、Ｅ３６からＥ５２のいずれか一項に記載の方法。
【0065】
Ｅ５４．カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップを含む、Ｅ１からＥ５３のいずれか一項に記載の方法。
【0066】
Ｅ５５．勾配溶出が、１０～６０ＣＶの少なくとも２つの異なる溶液（たとえば勾配溶出緩衝液）または２つの混合物を固定相に適用することを含み、勾配溶出の経過中、第１の溶液の百分率を、第２の溶液の百分率に対して反比例する様式で変動させる、Ｅ５４に記載の方法。
【0067】
Ｅ５６．少なくとも２つの異なる溶液（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液）が、緩衝剤、塩、界面活性剤、およびその組合せからなる群から選択される構成成分を含む、Ｅ５４またはＥ５５に記載の方法。
【0068】
Ｅ５７．緩衝剤が、トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシンからなる群から選択される、Ｅ５６に記載の方法。
【0069】
Ｅ５８．塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ５６またはＥ５７に記載の方法。
【0070】
Ｅ５９．界面活性剤が、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ５６からＥ５８のいずれか一項に記載の方法。
【0071】
Ｅ６０．少なくとも２つの異なる溶液が異なるｐＨ、塩濃度、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を有する、Ｅ５５からＥ５９のいずれか一項に記載の方法。
【0072】
Ｅ６１．第１の溶液（たとえば緩衝液Ａ）が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む、Ｅ５５からＥ６０のいずれか一項に記載の方法。
【0073】
Ｅ６２．第２の溶液（たとえば緩衝液Ｂ）が、約４００ｍＭ～約６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む、Ｅ５５からＥ６１のいずれか一項に記載の方法。
【0074】
Ｅ６３．勾配溶出を行うことが、約１０～６０ＣＶ、約２０～４０ＣＶ、または約２０～２４ＣＶの少なくとも２つの異なる溶液を固定相に適用することを含む、Ｅ５５からＥ６２のいずれか一項に記載の方法。
【0075】
Ｅ６４．勾配溶出の開始時に第１の溶液（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）の百分率が５０％～１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の溶液（たとえば、第２の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ｂ）の百分率が５０％～１００％であり、任意選択で、１０～６０ＣＶの第１の溶液、第２の溶液、または両方の混合物を勾配溶出中に固定相に適用する、Ｅ５５からＥ６３のいずれか一項に記載の方法。
【0076】
Ｅ６５．勾配溶出の開始時に第１の溶液（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）の百分率が１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の溶液（たとえば、第２の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ｂ）の百分率が１００％であり、任意選択で、１０～６０ＣＶの第１の溶液、第２の溶液、または両方の混合物を勾配溶出中に固定相に適用する、Ｅ５５からＥ６４のいずれか一項に記載の方法。
【0077】
Ｅ６６．第１の溶液（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）または第２の溶液（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）の構成成分の濃度が、勾配溶出中に連続的に増加または減少し、第１の溶液または第２の溶液の構成成分の濃度の増加または減少の速度が、全ＣＶあたりの構成成分の濃度の変化に等しく、勾配溶出にわたる構成成分の濃度の変化の速度が約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶである、Ｅ５５からＥ６５のいずれか一項に記載の方法。
【0078】
Ｅ６７．フルカプシドが、固定相から勾配溶出の第１の溶出ピーク中および／または第２の溶出ピークの最初の部分中で溶出される、Ｅ５４からＥ６６のいずれか一項に記載の方法。
【0079】
Ｅ６８．空カプシドが、ＡＥＸカラムフロースルー中および／または勾配溶出の第２の溶出ピークの最後の部分中で回収される、Ｅ５４からＥ６７のいずれか一項に記載の方法。
【0080】
Ｅ６９．勾配保持を行うことを含む、Ｅ１からＥ６８のいずれか一項に記載の方法。
【0081】
Ｅ７０．勾配保持が、１～１０ＣＶの、塩、緩衝剤、界面活性剤、およびその組合せからなる群から選択される構成成分を含む勾配保持溶液を、カラム中の固定相に適用することを含む、Ｅ６９に記載の方法。
【0082】
Ｅ７１．勾配保持を行うことが、１～１０ＣＶの、約５ｍＭ～約１Ｍ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む勾配保持溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、Ｅ６９またはＥ７０に記載の方法。
【0083】
Ｅ７２．カラム中の固定相からステップ溶出（たとえば定組成溶出）を行うことを含む、Ｅ１からＥ７１のいずれか一項に記載の方法。
【0084】
Ｅ７３．ステップ溶出を行うことが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多くのステップ溶出溶液をカラム固定相に適用することを含む、Ｅ７２に記載の方法。
【0085】
Ｅ７４．少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多くのステップ溶出溶液がそれぞれ、緩衝剤、塩、界面活性剤、およびその組合せからなる群から選択される構成成分を含む、Ｅ７２またはＥ７３に記載の方法。
【0086】
Ｅ７５．少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多くのステップ溶出溶液がそれぞれ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリスおよび約５ｍＭ～約６００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約８～１０（たとえば約８．９～約９．１）を含む、Ｅ７２からＥ７４のいずれか一項に記載の方法。
【0087】
Ｅ７６．漸増濃度の酢酸ナトリウムを有するステップ溶出溶液をカラムに順次適用する、Ｅ７２からＥ７５のいずれか一項に記載の方法。
【0088】
Ｅ７７．最後のステップ溶出溶液が約２０ｍＭのトリス、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約８．９～約９．１を含む、Ｅ７２からＥ７６のいずれか一項に記載の方法。
【0089】
Ｅ７８．任意選択で勾配溶出中に、溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集して、フルｒＡＡＶカプシドを回収することを含む、Ｅ１からＥ７７のいずれか一項に記載の方法。
【0090】
Ｅ７９．溶出液の少なくとも１つの画分の体積が、ＣＶの１／８、ＣＶの１／４、ＣＶの１／３、ＣＶの１／２、ＣＶの３／４、１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ、８ＣＶ、９ＣＶ、１０ＣＶ、またはそれより多くからなる群から選択される、Ｅ７８に記載の方法。
【0091】
Ｅ８０．溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を２８０ｎｍで測定し、任意選択で、閾値が、２８０ｎｍで測定して≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である、Ｅ７９に記載の方法。
【0092】
Ｅ８１．溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに溶出液の少なくとも１つの画分を収集する、Ｅ８０に記載の方法。
【0093】
Ｅ８２．溶出液の少なくとも１つの画分の体積が、ＣＶの１／８～１０ＣＶ、たとえば、ＣＶの１／８、ＣＶの１／４、ＣＶの１／３、ＣＶの１／２、ＣＶの３／４、１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ、８ＣＶ、９ＣＶ、１０ＣＶ、またはＣＶのそれより多くに等しく、任意選択で、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比が１．２５以上である、Ｅ８０またはＥ８１に記載の方法。
【0094】
Ｅ８３．溶出液の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個、またはそれより多くの画分を収集する、Ｅ７８からＥ８２のいずれか一項に記載の方法。
【0095】
Ｅ８４．任意選択で勾配溶出中に、カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することをさらに含む、Ｅ７８からＥ８３のいずれか一項に記載の方法。
【0096】
Ｅ８５．溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することが、ｉ）１４．３％～１５％の重量による溶出液体積重量の緩衝剤、ｐＨ約３．５を含む溶液を、溶出液の少なくとも１つの画分に添加すること、またはｉｉ）溶出液の少なくとも１つの画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の緩衝剤を含む溶液を含む容器内に収集することを含む、Ｅ８４に記載の方法。
【0097】
Ｅ８６．緩衝剤が、約２００ｍＭ～約３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウムである、Ｅ８５に記載の方法。
【0098】
Ｅ８７．カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを、約８．５～約９．１の初期ｐＨから約６．８～約７．６のｐＨへと調節する、Ｅ８４からＥ８６に記載の方法。
【0099】
Ｅ８８．カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを、約８．５～約９．１の初期ｐＨから約７．０～約７．４のｐＨへと調節する、Ｅ８４からＥ８７に記載の方法。
【0100】
Ｅ８９．任意選択で勾配溶出中に、カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定することをさらに含む、Ｅ７８からＥ８８のいずれか一項に記載の方法。
【0101】
Ｅ９０．吸光度を２６０ｎｍ（Ａ２６０）、２８０ｎｍ（Ａ２８０）、または２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定してもよい、Ｅ８９に記載の方法。
【0102】
Ｅ９１．２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定する、Ｅ９０に記載の方法。
【0103】
Ｅ９２．任意選択でＳＥＣによって測定して、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比が、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５、少なくとも１．０、少なくとも、１．０５、少なくとも１．１０、少なくとも１．１１、少なくとも１．１２、少なくとも１．１３、少なくとも１．１４、少なくとも１．１５、少なくとも１．１６、少なくとも１．１７、少なくとも１．１８、少なくとも１．１９、少なくとも１．２０、少なくとも１．２１、少なくとも１．２２、少なくとも１．２３、少なくとも１．２４、少なくとも１．２５、少なくとも１．２６、少なくとも１．２７、少なくとも１．２８、少なくとも１．２９、少なくとも１．３０、少なくとも１．３１、少なくとも１．３２、少なくとも１．３３、少なくとも１．３４、少なくとも１．３５、少なくとも１．３６、少なくとも１．３７、少なくとも、１．３８、少なくとも１．３９、少なくとも１．４０である、または、約０．５～約２．０、約０．５～約１．８、約０．５～約１．６、約０．５～約１．４、約０．５～約１．２、約０．５～約１．０、約０．５～約０．８、約０．６～約２．０、約０．８～約１．８、約０．８～約１．６、約０．８～約１．４、約１．０～約１．４、または約１．０～約１．２である、Ｅ９０またはＥ９１に記載の方法。
【0104】
Ｅ９３．溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比が少なくとも１．２５である、Ｅ９０からＥ９２のいずれか一項に記載の方法。
【0105】
Ｅ９４．任意選択で勾配溶出中に、カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、Ｅ７８からＥ９３のいずれか一項に記載の方法。
【0106】
Ｅ９５．２～５０個の溶出液画分を合わして、プールした溶出液を形成する、Ｅ９４に記載の方法。
【0107】
Ｅ９６．溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれが、≧１．２５のＡ２６０／Ａ２８０比を有する、Ｅ９４またはＥ９５に記載の方法。
【0108】
Ｅ９７．プールした溶出液の吸光度を測定することをさらに含み、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５（たとえば約１．２８～１．３５）である、Ｅ９４からＥ９６のいずれか一項に記載の方法。
【0109】
Ｅ９８．プールした溶出液が６．８～７．６（たとえば７．０～７．４）のｐＨを有する、Ｅ９４からＥ９７のいずれか一項に記載の方法。
【0110】
Ｅ９９．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～９８％、２０％～９９％、２０％～９９％より高く、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％（たとえば、４４％、４５％、５０％、５３％）を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ７８からＥ９８のいずれか一項に記載の方法。
【0111】
Ｅ１００．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの約５５％（たとえば５５％＋／－７％）を構成する、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0112】
Ｅ１０１．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの約４９％（たとえば４９％＋／－２％）を構成する、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0113】
Ｅ１０２．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの５２＋／－７％を構成する、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0114】
Ｅ１０３．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの４８％～６２％のフルｒＡＡＶカプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0115】
Ｅ１０４．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの４７％～５１％のフルｒＡＡＶカプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0116】
Ｅ１０５．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの３０％を超える（たとえば、４０％～５５％、４５％～６５％、４０％～９９％より高い）フルカプシドを含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、溶液中の全カプシドの３０％未満（たとえば１２％～２５％）のフルカプシドを含む、Ｅ７８からＥ９９のいずれか一項に記載の方法。
【0117】
Ｅ１０６．空カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの１０％～９９％、１０％～９０％、１０％～８０％、１０％～７０％、１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２９％（たとえば≦２９％）を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ７８からＥ１０５のいずれか一項に記載の方法。
【0118】
Ｅ１０７．空カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２０％＋／－７％（たとえば２１％）を構成する、Ｅ７８からＥ１０６のいずれか一項に記載の方法。
【0119】
Ｅ１０８．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの１１％～３１％の空カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１０６のいずれか一項に記載の方法。
【0120】
Ｅ１０９．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの１８％～２２％の空カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１０６のいずれか一項に記載の方法。
【0121】
Ｅ１１０．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの３０％未満の空カプシドを含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、溶液中の全カプシドの４０％～９０％の空カプシドを含む、Ｅ７８からＥ１０６のいずれか一項に記載の方法。
【0122】
Ｅ１１１．中間体カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２２％を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ７８からＥ１１０のいずれか一項に記載の方法。
【0123】
Ｅ１１２．中間体カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２８％＋／－５％を構成する、Ｅ７８からＥ１１１のいずれか一項に記載の方法。
【0124】
Ｅ１１３．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの２１％～２７％の中間体カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１１１のいずれか一項に記載の方法。
【0125】
Ｅ１１４．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの２８％～３６％の中間体カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１１１のいずれか一項に記載の方法。
【0126】
Ｅ１１５．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの４５％～６５％のフルｒＡＡＶカプシド、１９％～２８％の中間体カプシド、および１０％～３７％の空カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１１１のいずれか一項に記載の方法。
【0127】
Ｅ１１６．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの５５％＋／－７％を構成する、Ｅ１１５に記載の方法。
【0128】
Ｅ１１７．中間体カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２４％＋／－３％を構成する、Ｅ１１５に記載の方法。
【0129】
Ｅ１１８．空カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２１％＋／－１０％を構成する、Ｅ１１５に記載の方法。
【0130】
Ｅ１１９．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、全カプシドの４５％～５２％のフルｒＡＡＶカプシド、２７％～３７％の中間体カプシド、および／または１８％～２２％の空カプシドを含み、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ７８からＥ１１８のいずれか一項に記載の方法。
【0131】
Ｅ１２０．フルカプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの４９％＋／－２％を構成する、Ｅ１１９に記載の方法。
【0132】
Ｅ１２１．中間体カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの３２％＋／－４％を構成する、Ｅ１１９に記載の方法。
【0133】
Ｅ１２２．空カプシドが、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液中の全カプシドの２０％＋／－２％を構成する、Ｅ１１９に記載の方法。
【0134】
Ｅ１２３．プールした溶出液が、カラム上にロードした溶液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている、Ｅ９４からＥ１２２のいずれか一項に記載の方法。
【0135】
Ｅ１２４．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が、１％～１０％、１～２０％、１％～３０％、１％～４０％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９９％、５％～９５％、１０％～８５％、１５％～７５％、２０％～６５％、２５％～５５％、３０％～４５％、３０％～８０％、４０％～７０％、または１００％である、Ｅ７８からＥ１２３のいずれか一項に記載の方法。
【0136】
Ｅ１２５．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が、３１％～６６％（たとえば４７％＋／－１１％）である、Ｅ１２４に記載の方法。
【0137】
Ｅ１２６．２５０ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が３０％～７０％（たとえば３７％～６０％）である、Ｅ１２４に記載の方法。
【0138】
Ｅ１２７．２５０ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が４５％＋／－８％である、Ｅ１２４に記載の方法。
【0139】
Ｅ１２８．２０００ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が２５％～７５％（たとえば３１％～６６％）である、Ｅ１２４に記載の方法。
【0140】
Ｅ１２９．２０００ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が５０％＋／－１３％である、Ｅ１２４に記載の方法。
【0141】
Ｅ１３０．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率が、超遠心分離および陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した、それ以外は同一である溶出液画分またはプールした溶出液の％ＶＧステップ収率よりも高い、Ｅ１２４からＥ１２９のいずれか一項に記載の方法。
【0142】
Ｅ１３１．２５０ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０（ＳＥＣ）が１．２９＋／－０．０３である、Ｅ７８からＥ１３０のいずれか一項に記載の方法。
【0143】
Ｅ１３２．２０００ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０（ＳＥＣ）が１．３０＋／－０．０１である、Ｅ７８からＥ１３０のいずれか一項に記載の方法。
【0144】
Ｅ１３３．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧカラム収率が、１％～１０％、１～２０％、１％～３０％、１％～４０％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９９％、５％～９５％、１０％～８５％、１５％～７５％、２０％～６５％、２５％～５５％、３０％～４５％、３０％～８０％、４０％～７０％、または１００％である、Ｅ７８からＥ１３２のいずれか一項に記載の方法。
【0145】
Ｅ１３４．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧカラム収率が２０％～１００％（たとえば６３％＋／－２６％）である、Ｅ１３３に記載の方法。
【0146】
Ｅ１３５．２５０ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧカラム収率が４０％～１００％である、Ｅ１３３に記載の方法。
【0147】
Ｅ１３６．２０００ＬのＳＵＢ中で生成した溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液の％ＶＧカラム収率が１０％～７０％（たとえば２０％～６１％）である、Ｅ１３３に記載の方法。
【0148】
Ｅ１３７．溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される濾過方法にさらに供して、原薬を生成する、Ｅ７８からＥ１３６のいずれか一項に記載の方法。
【0149】
Ｅ１３８．フルカプシドが、原薬中の全カプシドの２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～９８％、２０％～９９％、２０％～９９％より高く、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％（たとえば、４４％、４５％、５０％、５３％）を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ１３７に記載の方法。
【0150】
Ｅ１３９．原薬が、全カプシドの４５％～６５％のフルｒＡＡＶカプシドを含み、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１３７またはＥ１３８に記載の方法。
【0151】
Ｅ１４０．フルカプシドが、原薬中の全カプシドの５２＋／－７％を構成する、Ｅ１３７からＥ１３９のいずれか一項に記載の方法。
【0152】
Ｅ１４１．原薬が、全カプシドの４５％～５２％のフルｒＡＡＶカプシドを含み、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ１３７またはＥ１３８に記載の方法。
【0153】
Ｅ１４２．原薬が、原薬中の全カプシドの３０％を超える（たとえば、４０％～５５％、４５％～６５％、４０％～９９％より高い）フルカプシドを含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、溶液中の全カプシドの３０％未満（たとえば１２％～２５％）のフルカプシドを含む、Ｅ１３７またはＥ１３８に記載の方法。
【0154】
Ｅ１４３．空カプシドが、原薬中の全カプシドの１０％～９９％、１０％～９０％、１０％～８０％、１０％～７０％、１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２９％（たとえば≦２９％）を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ１３７からＥ１４２のいずれか一項に記載の方法。
【0155】
Ｅ１４４．原薬が、全カプシドの１０％～３７％の空カプシドを含み、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１４３のいずれか一項に記載の方法。
【0156】
Ｅ１４５．空カプシドが、原薬中の全カプシドの２０％＋／－７％を構成する、Ｅ１４３またはＥ１４４に記載の方法。
【0157】
Ｅ１４６．原薬が、全カプシドの１８％～２２％の空カプシドを含み、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１４３のいずれか一項に記載の方法。
【0158】
Ｅ１４７．原薬が、原薬中の全カプシドの３０％未満の空カプシドを含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、溶液中の全カプシドの４０％～９０％の空カプシドを含む、Ｅ１４３からＥ１４６のいずれか一項に記載の方法。
【0159】
Ｅ１４８．中間体カプシドが、原薬中の全カプシドの１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２２％を構成し、カプシドを分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい、Ｅ１３７からＥ１４７のいずれか一項に記載の方法。
【0160】
Ｅ１４９．原薬が、全カプシドの１９％～３７％の中間体カプシドを含み、原薬が、２５０Ｌまたは２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１３７からＥ１４８のいずれか一項に記載の方法。
【0161】
Ｅ１５０．中間体カプシドが、原薬中の全カプシドの２８％＋／－５％を構成する、Ｅ１４８またはＥ１４９に記載の方法。
【0162】
Ｅ１５１．原薬が、全カプシドの４５％～６５％のフルｒＡＡＶカプシド、１９％～２８％の中間体カプシド、および１０％～３７％の空カプシドを含み、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ１３７からＥ１５０のいずれか一項に記載の方法。
【0163】
Ｅ１５２．フルカプシドが、全カプシドの５５％＋／－７％を構成する、Ｅ１５１に記載の方法。
【0164】
Ｅ１５３．中間体カプシドが、全カプシドの２４％＋／－３％を構成する、Ｅ１５１またはＥ１５２に記載の方法。
【0165】
Ｅ１５４．空カプシドが、全カプシドの２１％＋／－１０％を構成する、Ｅ１５１からＥ１５３のいずれか一項に記載の方法。
【0166】
Ｅ１５５．原薬が、全カプシドの４５％～５２％のフルｒＡＡＶカプシド、２７％～３７％の中間体カプシド、および／または１８％～２２％の空カプシドを含み、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ１３７からＥ１５０のいずれか一項に記載の方法。
【0167】
Ｅ１５６．フルカプシドが、全カプシドの４９％＋／－２％を構成する、Ｅ１５５に記載の方法。
【0168】
Ｅ１５７．中間体カプシドが、全カプシドの３２％＋／－４％を構成する、Ｅ１５５またはＥ１５６に記載の方法。
【0169】
Ｅ１５８．空カプシドが、全カプシドの２０％＋／－２％を構成する、Ｅ１５５からＥ１５７のいずれか一項に記載の方法。
【0170】
Ｅ１５９．精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量と比較して、原薬のＨＣＰが枯渇されている、Ｅ１３７からＥ１５８のいずれか一項に記載の方法。
【0171】
Ｅ１６０．ＥＬＩＳＡによって測定して、原薬が最低定量レベル（ＬＬＯＱ）未満のＨＣＰの量を含む、Ｅ１３７からＥ１５９のいずれか一項に記載の方法。
【0172】
Ｅ１６１．ＥＬＩＳＡによって測定して、原薬がＬＬＯＱ未満であるＨＣＰの量を含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、約１～５００ｐｇのＨＣＰ／１×１０９ＶＧを含み、溶液が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から作製されていてもよい、Ｅ１３７からＥ１６０のいずれか一項に記載の方法。
【0173】
Ｅ１６２．ＥＬＩＳＡによって測定して、原薬がＬＬＯＱ未満であるＨＣＰの量を含み、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、約１００～１０００ｐｇのＨＣＰ／１×１０９ＶＧを含み、溶液が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から作製されていてもよい、Ｅ１３７からＥ１６１のいずれか一項に記載の方法。
【0174】
Ｅ１６３．任意選択で逆相ＨＰＬＣによって測定して、原薬の純度が、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である、Ｅ１３７からＥ１６２のいずれか一項に記載の方法。
【0175】
Ｅ１６４．原薬の純度が約９８．６＋／－０．６％であり、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６３に記載の方法。
【0176】
Ｅ１６５．原薬の純度が約９９．３＋／－０．３％であり、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６４に記載の方法。
【0177】
Ｅ１６６．任意選択でＳＥＣによって測定して、原薬が約０～１０％のＨＭＭＳを含む、Ｅ１３７からＥ１６５のいずれか一項に記載の方法。
【0178】
Ｅ１６７．原薬が２．６＋／－０．８％のＨＭＭＳを含み、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６６に記載の方法。
【0179】
Ｅ１６８．原薬が２．９＋／－０．４％のＨＭＭＳを含み、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６６に記載の方法。
【0180】
Ｅ１６９．原薬が約７．０～２５ｐｇ／１×１０９ＶＧの残留ＨＣ－ＤＮＡを含む、Ｅ１３７からＥ１６８に記載の方法。
【0181】
Ｅ１７０．原薬が約１７．４＋／－６．７ｐｇ／１×１０９ＶＧのＨＣ－ＤＮＡを含み、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６９に記載の方法。
【0182】
Ｅ１７１．原薬が約９．３＋／－１．２ｐｇ／１×１０９ＶＧのＨＣ－ＤＮＡを含み、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１６９に記載の方法。
【0183】
Ｅ１７２．任意選択でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定して、原薬が約１．２４～１．３２のＡ２６０／Ａ２８０を有する、Ｅ１３７からＥ１７１のいずれか一項に記載の方法。
【0184】
Ｅ１７３．任意選択でＳＥＣによって測定して、原薬が１．２４～１．３２のＡ２６０／Ａ２８０を有しており、原薬が、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製される、Ｅ１７２に記載の方法。
【0185】
Ｅ１７４．任意選択でＳＥＣによって測定して、原薬が１．２８～１．３１のＡ２６０／Ａ２８０を有しており、原薬が、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製から作製されていてもよい、Ｅ１７２に記載の方法。
【0186】
Ｅ１７５．カラムの体積が１．０ｍＬ～６．６Ｌである、Ｅ１からＥ１７４のいずれか一項に記載の方法。
【0187】
Ｅ１７６．カラムの体積が、約１．０ｍＬ、約５．１ｍＬ、約６．６７ｍＬ、約１．２５６Ｌ、約１．３Ｌ、約６．３Ｌ、約６．４Ｌ、または約６．６Ｌである、Ｅ１からＥ１７５のいずれか一項に記載の方法。
【0188】
Ｅ１７７．ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３号の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５からなる群から選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含む、Ｅ１からＥ１７６のいずれか一項に記載の方法。
【0189】
Ｅ１７８．精製ｒＡＡＶベクターが生成される、Ｅ１からＥ１７７のいずれか一項に記載の方法。
【0190】
Ｅ１７９．精製ｒＡＡＶベクターが原薬である、Ｅ１７８に記載の方法。
【0191】
Ｅ１８０．原薬と薬学的に許容できる賦形剤とを合わせて薬物製品を形成する、Ｅ１３７からＥ１７４またはＥ１７９のいずれか一項に記載の方法。
【0192】
Ｅ１８１．精製ｒＡＡＶベクター、原薬、および／または薬物製品が、疾患、障害、または状態を処置するために対象への投与に適している、Ｅ１７８からＥ１８０のいずれか一項に記載の方法。
【0193】
Ｅ１８２．疾患、障害、または状態がデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、Ｅ１８１に記載の方法。
【0194】
Ｅ１８３．ｒＡＡＶベクターが、ヒトミニジストロフィンをコードしている修飾核酸を含むベクターゲノムを含む、Ｅ１からＥ１８２のいずれか一項に記載の方法。
【0195】
Ｅ１８４．修飾核酸が、配列番号１の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１８３に記載の方法。
【0196】
Ｅ１８５．修飾核酸が、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるヒトミニジストロフィンをコードしている、Ｅ１８３またはＥ１８４に記載の方法。
【0197】
Ｅ１８６．ベクターゲノムが、合成ハイブリッド筋肉特異的プロモーターｈＣＫ、合成ハイブリッド筋肉特異的プロモーターｈＣＫプラス、ならびに合成筋肉特異的エンハンサーおよびプロモーターからなる群から選択される筋肉特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む、Ｅ１８３からＥ１８５のいずれか一項に記載の方法。
【0198】
Ｅ１８７．合成ハイブリッド筋肉特異的プロモーターｈＣＫが、配列番号３の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１８６に記載の方法。
【0199】
Ｅ１８８．合成ハイブリッド筋肉特異的プロモーターｈＣＫプラスが、配列番号４の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１８６に記載の方法。
【0200】
Ｅ１８９．合成筋肉特異的エンハンサーおよびプロモーターが、配列番号５の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１８６に記載の方法。
【0201】
Ｅ１９０．ベクターゲノムがポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む、Ｅ１８３からＥ１８９のいずれか一項に記載の方法。
【0202】
Ｅ１９１．ポリＡシグナル配列が、配列番号６の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１９０に記載の方法。
【0203】
Ｅ１９２．ベクターゲノムが転写ターミネーター配列を含む、Ｅ１８３からＥ１９１のいずれか一項に記載の方法。
【0204】
Ｅ１９３．転写ターミネーター配列が、配列番号９の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１９２に記載の方法。
【0205】
Ｅ１９４．ベクターゲノムが少なくとも１つのＩＴＲを含む、Ｅ１８３からＥ１９３のいずれか一項に記載の方法。
【0206】
Ｅ１９５．少なくとも１つのＩＴＲが、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、およびその組合せから選択される核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１９４に記載の方法。
【0207】
Ｅ１９６．ベクターゲノムが発現カセットを含み、発現カセットが、配列番号１０の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１８３からＥ１９５のいずれか一項に記載の方法。
【0208】
Ｅ１９７．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９のＶＰ１ポリペプチドを含む、Ｅ１からＥ１９６のいずれか一項に記載の方法。
【0209】
Ｅ１９８．ＶＰ１ポリペプチドが配列番号１１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ１９７に記載の方法。
【0210】
Ｅ１９９．ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と配列番号１の核酸配列を含む導入遺伝子とを含む、Ｅ１からＥ１９８のいずれか一項に記載の方法。
【0211】
Ｅ２００．ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製することをさらに含む、Ｅ１からＥ１９９のいずれか一項に記載の方法。
【0212】
Ｅ２０１．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ロードする前に希釈および任意選択で濾過した、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される、Ｅ２００に記載の方法。
【0213】
Ｅ２０２．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ロードする前に希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液である、Ｅ２００またはＥ２０１に記載の方法。
【0214】
Ｅ２０３．溶液が少なくとも１つの精製および／またはプロセスステップを既に受けている、Ｅ２００からＥ２０２のいずれか一項に記載の方法。
【0215】
Ｅ２０４．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる溶出液である、Ｅ２００からＥ２０３のいずれか一項に記載の方法。
【0216】
Ｅ２０５．調製が、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈することを含む、Ｅ２００からＥ２０４のいずれか一項に記載の方法。
【0217】
Ｅ２０６．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈することが、溶液を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２５倍に希釈して、希釈溶液を生成することを含む、Ｅ２０５に記載の方法。
【0218】
Ｅ２０７．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈することが、溶液を約１５倍に希釈して、希釈溶液を生成することを含む、Ｅ２０５またはＥ２０６に記載の方法。
【0219】
Ｅ２０８．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈することを、ＡＥＸカラムとインラインで行い、希釈溶液が、第１のチューブを通してＹ字コネクタへと送達され、ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、第２のチューブを通してＹ字コネクタへと送達される、Ｅ２０５からＥ２０７のいずれか一項に記載の方法。
【0220】
Ｅ２０９．溶液が約１５倍に希釈されるように、希釈溶液を１～５ｍＬ／分の流速で送達し、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を０．１～２ｍＬ／分の流速で送達する、Ｅ２０８に記載の方法。
【0221】
Ｅ２１０．希釈溶液が、緩衝剤、アミノ酸、界面活性剤、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む、Ｅ２０８またはＥ２０９に記載の方法。
【0222】
Ｅ２１１．緩衝剤が、トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、ビシン、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ２１０に記載の方法。
【0223】
Ｅ２１２．アミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、シトルリン、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ２１０またはＥ２１１に記載の方法。
【0224】
Ｅ２１３．アミノ酸がヒスチジンである、Ｅ２１０からＥ２１２のいずれか一項に記載の方法。
【0225】
Ｅ２１４．界面活性剤が、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される、Ｅ２１０からＥ２１３のいずれか一項に記載の方法。
【0226】
Ｅ２１５．界面活性剤がＰ１８８である、Ｅ２１０からＥ２１４のいずれか一項に記載の方法。
【0227】
Ｅ２１６．希釈溶液が、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、約０．１％～約１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～約９．５（たとえば約８．８）を含む、Ｅ２０８からＥ２１５のいずれか一項に記載の方法。
【0228】
Ｅ２１７．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈することが、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行する、Ｅ２０５からＥ２１６のいずれか一項に記載の方法。
【0229】
Ｅ２１８．ｒＡＡＶベクターを含む溶液の希釈後のｐＨが、希釈前の溶液のｐＨと比較して増加している、Ｅ２０５からＥ２１７のいずれか一項に記載の方法。
【0230】
Ｅ２１９．ｒＡＡＶベクターを含む溶液の希釈前のｐＨが３．０～４．４であり、希釈後の溶液のｐＨが８．５～９．５である、Ｅ２０５からＥ２１８のいずれか一項に記載の方法。
【0231】
Ｅ２２０．ｒＡＡＶベクターを含む溶液の希釈後の伝導率が、希釈前の溶液の伝導率と比較して減少している、Ｅ２０５からＥ２１９のいずれか一項に記載の方法。
【0232】
Ｅ２２１．ｒＡＡＶベクターを含む溶液の希釈前の伝導率が５．０～７．０ｍＳ／ｃｍ（たとえば５．５～６．５ｍＳ／ｃｍ）であり、希釈後の溶液の伝導率が１．７～３．５ｍＳ／ｃｍである、Ｅ２０５からＥ２２０のいずれか一項に記載の方法。
【0233】
Ｅ２２２．ｒＡＡＶベクターを含む希釈溶液を濾過することをさらに含む、Ｅ２０５からＥ２２１のいずれか一項に記載の方法。
【0234】
Ｅ２２３．希釈溶液を濾過することが、０．２μｍのフィルターを通した濾過を含む、Ｅ２２２に記載の方法。
【0235】
Ｅ２２４．フィルターがカラムとインラインである、Ｅ２２２またはＥ２２３に記載の方法。
【0236】
Ｅ２２５．ｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈および濾過することが、ｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードするステップに先行する、Ｅ２２２からＥ２２４のいずれか一項に記載の方法。
【0237】
Ｅ２２６．希釈および任意選択で濾過したｒＡＡＶベクターを含む溶液のパーセントベクターゲノム（％ＶＧ）収率が、希釈および任意選択で濾過の前の溶液中に存在するＶＧの量と比較して６０％～１００％である、Ｅ２０５からＥ２２５のいずれか一項に記載の方法。
【0238】
Ｅ２２７．ｒＡＡＶベクターを含む希釈溶液の％ＶＧ希釈収率が８８％＋／－３６％である、Ｅ２０５からＥ２２６のいずれか一項に記載の方法。
【0239】
Ｅ２２８．
ｉ）第１の溶液を希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）ステップｉ）からの溶液を、フィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少しているステップと
を含む、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
ｉ）第１の溶液を希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）ステップｉ）からの溶液を、フィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少しているステップと
を含む、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0240】
Ｅ２２９．ｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが８．５～９．５である、ｉｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が１．７～３．３ｍＳ／ｃｍである、ならびに／またはｉｉｉ）希釈後の溶液の％ＶＧ希釈収率が３５％～１００％である、Ｅ２２８に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0241】
Ｅ２３０．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、Ｅ２２８またはＥ２２９に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0242】
Ｅ２３１．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップと、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップと
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップと、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップと
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0243】
Ｅ２３２．カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、Ｅ２３１に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0244】
Ｅ２３３．ＡＥＸ固定相がＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱである、Ｅ２３１またはＥ２３２に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0245】
Ｅ２３４．溶液が、固定相上にロードする前に希釈および濾過した親和性溶出液である、Ｅ２３１からＥ２３３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0246】
Ｅ２３５．固定相から溶出された材料が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ２３１からＥ２３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを精製する方法。
【0247】
Ｅ２３６．第１の勾配溶出緩衝液が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む、Ｅ２３１からＥ２３５のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0248】
Ｅ２３７．第２の勾配溶出緩衝液が、約４００ｍＭ～約６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、約０．００５％～約０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ約８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む、Ｅ２３１からＥ２３６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0249】
Ｅ２３８．勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が１００％である、Ｅ２３１からＥ２３７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0250】
Ｅ２３９．約１５～約２５（たとえば２０ＣＶ）の第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物を勾配溶出中に固定相に適用し、勾配溶出の経過中における酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、勾配溶出中の酢酸ナトリウムの濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させる、Ｅ２３６からＥ２３８のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0251】
Ｅ２４０．フルカプシドが固定相から第１の溶出ピーク中に溶出され、フルカプシドが固定相から第２の溶出ピークの最初の部分中に溶出される、ならびに／または空カプシドが、ＡＥＸカラムフロースルー中でおよび／もしくは第２の溶出ピークの最後の部分中で回収される、Ｅ２３１からＥ２３９のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0252】
Ｅ２４１．吸光度閾値が、２８０ｎｍで測定して≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である、Ｅ２３１からＥ２４０のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0253】
Ｅ２４２．溶出液の少なくとも１つの画分の体積がＣＶの≧１／３に等しい、Ｅ２３１からＥ２４１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0254】
Ｅ２４３．溶出液の少なくとも１つの画分を収集することが、少なくとも１０個の溶出液画分を収集することを含む、Ｅ２３１からＥ２４２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0255】
Ｅ２４４．溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを６．８～７．６（たとえばｐＨ約７．２）のｐＨに調節する、Ｅ２３１からＥ２４２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0256】
Ｅ２４５．溶出液の少なくとも１つの画分、溶出液の少なくとも２つの画分、および／またはプールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比が、≧１．２５（たとえば約１．２８～１．３５）である、Ｅ２３１からＥ２４４のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0257】
Ｅ２４６．プールした溶出液が２０％～１００％（たとえば６３＋／－２６％）の％ＶＧカラム収率を有する、Ｅ２３１からＥ２４５のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0258】
Ｅ２４７．プールした溶出液が３１％～６６％（たとえば４７＋／－１１％）の％ＶＧステップ収率を有する、Ｅ２３１からＥ２４６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0259】
Ｅ２４８．カラム上にロードした、希釈および濾過した親和性溶出液と比較して、溶出液の少なくとも１つの画分および／またはプールした溶出液が、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されているＥ２３１からＥ２４７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0260】
Ｅ２４９．精製ｒＡＡＶベクターが生成される、Ｅ２３１からＥ２４８のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0261】
Ｅ２５０．プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、Ｅ２３１からＥ２４９のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0262】
Ｅ２５１．原薬が、全カプシドの４５％～６５％（たとえば５２＋／－７％）のフルカプシドを含む、Ｅ２５０に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0263】
Ｅ２５２．原薬が、全カプシドの１９％～３７％（たとえば２８＋／－５％）の中間体カプシドを含む、Ｅ２５０またはＥ２５１に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0264】
Ｅ２５３．原薬が、全カプシドの１０％～３７％（たとえば２０＋／－７％）の空カプシドを含む、Ｅ２５０からＥ２５２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0265】
Ｅ２５４．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、Ｅ２３１からＥ２５３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0266】
Ｅ２５５．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）上にロードするステップであって、溶出液が、
ａ）約２００ｍＭのヒスチジン、約２００ｍＭのトリス、約０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されており、任意選択で、
ｂ）固定相上にロードする前に０．２μｍのフィルターを通して濾過されている、ステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、酢酸ナトリウムの濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）溶出液のＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の約１０個の画分を収集し、溶出液の少なくとも１つの画分の体積がＣＶの≧１／３に等しいステップ、
ｉｖ）カラムからの約１０個の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節するステップ、
ｖ）カラムから収集した溶出液の約１０個の画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、ならびに／または
ｖｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップ
を含み、
溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５であり、
カラム上にロードした、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、プールした溶出液が、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、
精製ｒＡＡＶベクターが生成される、
ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）上にロードするステップであって、溶出液が、
ａ）約２００ｍＭのヒスチジン、約２００ｍＭのトリス、約０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されており、任意選択で、
ｂ）固定相上にロードする前に０．２μｍのフィルターを通して濾過されている、ステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、酢酸ナトリウムの濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）溶出液のＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の約１０個の画分を収集し、溶出液の少なくとも１つの画分の体積がＣＶの≧１／３に等しいステップ、
ｉｖ）カラムからの約１０個の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節するステップ、
ｖ）カラムから収集した溶出液の約１０個の画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、ならびに／または
ｖｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップ
を含み、
溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５であり、
カラム上にロードした、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、プールした溶出液が、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、
精製ｒＡＡＶベクターが生成される、
ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0267】
Ｅ２５６．固定相から溶出された材料が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ２５５に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0268】
Ｅ２５７．
ｉ）約５ＣＶの注入用水をカラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、
ｉｉ）任意選択で上向流によって、約１６ＣＶの、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、
ｉｉｉ）約５ＣＶの、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、
ｉｖ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖｉ）約５ＣＶの、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖｉｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップであって、任意選択で、溶出液が、
ａ）約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１５倍に希釈されており、任意選択で、
ｂ）固定相上にロードする前に０．２μｍのフィルターを通して濾過されている、ステップ、
ｖｉｉｉ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｉｘ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、酢酸ナトリウムの濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｘ）溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、勾配溶出中のカラムから約１０個の溶出液画分を収集するステップであって、約１０個の溶出液画分の体積がＣＶの約≧１／３であるステップ、
ｘｉ）約１０個の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節するステップ、
ｘｉｉ）カラムから収集した溶出液の約１０個の画分（ｆａｃｔｉｏｎ）の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、ならびに／または
ｘｉｉｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップ
を含み、
溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５であり、
親和性溶出液ならびに／または希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、プールした溶出液が、空カプシドが枯渇されているおよび／またはフルカプシドが富化されており、
ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．３Ｌのカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは約３１４ｍＬ／分の流速で、および／または約３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば４分／ＣＶ）の滞留時間で行い、ならびに／あるいは精製ｒＡＡＶベクターが生成される、
ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）約５ＣＶの注入用水をカラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、
ｉｉ）任意選択で上向流によって、約１６ＣＶの、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、
ｉｉｉ）約５ＣＶの、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、
ｉｖ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖｉ）約５ＣＶの、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｖｉｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップであって、任意選択で、溶出液が、
ａ）約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１５倍に希釈されており、任意選択で、
ｂ）固定相上にロードする前に０．２μｍのフィルターを通して濾過されている、ステップ、
ｖｉｉｉ）約５ＣＶの、約１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、
ｉｘ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、酢酸ナトリウムの濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｘ）溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、勾配溶出中のカラムから約１０個の溶出液画分を収集するステップであって、約１０個の溶出液画分の体積がＣＶの約≧１／３であるステップ、
ｘｉ）約１０個の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節するステップ、
ｘｉｉ）カラムから収集した溶出液の約１０個の画分（ｆａｃｔｉｏｎ）の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、ならびに／または
ｘｉｉｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップ
を含み、
溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５であり、
親和性溶出液ならびに／または希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、プールした溶出液が、空カプシドが枯渇されているおよび／またはフルカプシドが富化されており、
ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．３Ｌのカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは約３１４ｍＬ／分の流速で、および／または約３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば４分／ＣＶ）の滞留時間で行い、ならびに／あるいは精製ｒＡＡＶベクターが生成される、
ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0269】
Ｅ２５８．固定相から溶出された材料が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ２５７に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0270】
Ｅ２５９．
ｉ）親和性溶出液を、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む希釈溶液で約１５倍に希釈するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）からの親和性溶出液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および濾過した親和性溶出液を生成するステップであって、希釈および濾過した親和性溶出液のｐＨが、親和性溶出液のｐＨと比較して（たとえば約８．５～９．５まで）増加しており、希釈および濾過した親和性溶出液の伝導率が、親和性溶出液の伝導率と比較して（たとえば約１．７ｍＳ／ｃｍ～３．３ｍＳ／ｃｍまで）減少している、ステップと
を含む、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
ｉ）親和性溶出液を、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む希釈溶液で約１５倍に希釈するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）からの親和性溶出液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および濾過した親和性溶出液を生成するステップであって、希釈および濾過した親和性溶出液のｐＨが、親和性溶出液のｐＨと比較して（たとえば約８．５～９．５まで）増加しており、希釈および濾過した親和性溶出液の伝導率が、親和性溶出液の伝導率と比較して（たとえば約１．７ｍＳ／ｃｍ～３．３ｍＳ／ｃｍまで）減少している、ステップと
を含む、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0271】
Ｅ２６０．希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液をＡＥＸ固定相上にロードする、Ｅ２５９に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0272】
Ｅ２６１．親和性溶出液が、２５０Ｌまたは２０００Ｌの体積を有する容器中で生成したｒＡＡＶベクターの、親和性クロマトグラフィーに基づく精製から作製される、Ｅ２５９またはＥ２６０に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0273】
Ｅ２６２．親和性溶出液の希釈後の％ＶＧ希釈収率が８８％＋／－３６％である、Ｅ２５９からＥ２６１のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0274】
Ｅ２６３．
ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、
ｉｉ）任意選択で上向流によって、約１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ならびに／または
ｉｉｉ）約４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップであって、ステップｉ）～ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／もしくは３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい、ステップ
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための固定相を調製する方法。
ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、
ｉｉ）任意選択で上向流によって、約１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ならびに／または
ｉｉｉ）約４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップであって、ステップｉ）～ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／もしくは３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい、ステップ
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための固定相を調製する方法。
【0275】
Ｅ２６４．約５ＣＶの、ｉ）約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液、ｉｉ）約１００ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む溶液、およびｉｉｉ）約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む溶液のうちの１つまたは複数を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む平衡化ステップをさらに含む、Ｅ２６３に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための固定相を調製する方法。
【0276】
Ｅ２６５．少なくとも１つのステップを、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードする前に行う、Ｅ２６３またはＥ２６４に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための固定相を調製する方法。
【0277】
Ｅ２６６．Ｅ１からＥ２２７またはＥ２３１からＥ２５８のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0278】
Ｅ２６７．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における塩の濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、塩の濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した（たとえばＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である）際に、クロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に、カラムから少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分を収集するステップ、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／または
ｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成するステップ
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、約２０ＣＶの第１の勾配溶出緩衝液（たとえば、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、第２の勾配溶出緩衝液（たとえば、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９）、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における塩の濃度の変化の速度が約２５ｍＭ／ＣＶであるように、塩の濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した（たとえばＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である）際に、クロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に、カラムから少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分を収集するステップ、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／または
ｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成するステップ
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0279】
Ｅ２６８．固定相から溶出された材料が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ２６７に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0280】
Ｅ２６９．塩が酢酸ナトリウムである、Ｅ２６７からＥ２６８に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0281】
Ｅ２７０．溶液が、ａ）約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されており、任意選択でｂ）固定相上にロードする前に０．２μｍのフィルターを通して濾過されている、親和性溶出液である、Ｅ２６７からＥ２６９のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0282】
Ｅ２７１．カラムからの少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節することをさらに含む、Ｅ２６７からＥ２７０のいずれか一項に記載の方法によって調製した、精製ｒＡＡＶベクター。
【0283】
Ｅ２７２．溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０が≧１．２５であり、カラム上にロードした、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、プールした溶出液が、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、精製ｒＡＡＶベクターが生成される、Ｅ２６７からＥ２７１のいずれか一項に記載の精製ｒＡＡＶベクター。
【0284】
Ｅ２７３．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、Ｅ２６７からＥ２７２のいずれか一項に記載の精製ｒＡＡＶベクター。
【0285】
Ｅ２７４．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、クロマトグラフィーステップ中に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップ、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／または
ｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成するステップ
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、クロマトグラフィーステップ中に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップ、
ｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／または
ｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成するステップ
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0286】
Ｅ２７５．固定相から溶出された材料が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ２７４に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0287】
Ｅ２７６．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む、Ｅ２７４またはＥ２７５に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0288】
Ｅ２７７．プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、Ｅ２７４からＥ２７６のいずれか一項に記載の方法によって調製した、精製ｒＡＡＶベクター。
【0289】
Ｅ２７８．原薬を、疾患、障害、または状態を処置するためにヒト対象への投与に適している薬物製品を作製するために使用する、Ｅ２７７に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0290】
Ｅ２７９．疾患、障害、または状態がＤＭＤである、Ｅ２７８に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0291】
Ｅ２８０．
ｉ）第１の溶液（たとえば親和性溶出液）を、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む緩衝液で２～２５倍（たとえば約１５倍）に希釈するステップと、任意選択で
ｉｉ）ステップｉ）からの第１の溶液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少しているステップと
を含む方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
ｉ）第１の溶液（たとえば親和性溶出液）を、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む緩衝液で２～２５倍（たとえば約１５倍）に希釈するステップと、任意選択で
ｉｉ）ステップｉ）からの第１の溶液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少しているステップと
を含む方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0292】
Ｅ２８１．第１の溶液が親和性溶出液である、Ｅ２８０に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0293】
Ｅ２８２．親和性溶出液が、２５０Ｌまたは２０００Ｌの体積を有する容器（たとえば単回使用バイオリアクター）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性精製から作製される、Ｅ２８１に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0294】
Ｅ２８３．希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが８．５～９．５である、Ｅ２８０からＥ２８２のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0295】
Ｅ２８４．希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が１．７～３．３ｍＳ／ｃｍである、Ｅ２８０からＥ２８３のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0296】
Ｅ２８５．希釈および任意選択で濾過した溶液の％ＶＧ希釈収率が８８％＋／－３６％である、Ｅ２８０からＥ２８４のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0297】
Ｅ２８６．
ｉ）第１の溶液（たとえば親和性溶出液）を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）希釈したステップｉ）からの第１の溶液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少している、ステップと
を含む方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
ｉ）第１の溶液（たとえば親和性溶出液）を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）希釈したステップｉ）からの第１の溶液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップであって、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少している、ステップと
を含む方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0298】
Ｅ２８７．希釈溶液が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５を含む、Ｅ２８０に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0299】
Ｅ２８８．第１の溶液のｐＨが希釈および任意選択で濾過する前に３．０～４．４であり、希釈および任意選択で濾過した後の第１の溶液のｐＨが、８．５～９．５または８．７～９．０（たとえば、８．８、９．０）である、Ｅ２８０またはＥ２８１に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0300】
Ｅ２８９．第１の溶液の伝導率が、希釈および任意選択で濾過のステップの前に５．０～７．０ｍＳ／ｃｍ（たとえば５．５～６．５ｍＳ／ｃｍ）であり、希釈および任意選択で濾過のステップの後の第１の溶液の伝導率が、１．７～３．５ｍＳ／ｃｍ、１．８～２．８ｍＳ／ｃｍ、または２．２～２．６ｍＳ／ｃｍである、Ｅ２８０からＥ２８２のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0301】
Ｅ２９０．希釈および任意選択で濾過した第１の溶液の％ＶＧ希釈収率が３５％～１００％である、Ｅ２８０からＥ２８３のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0302】
Ｅ２９１．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含み、希釈および任意選択で濾過した溶液をＡＥＸ固定相上にロードしてもよい、Ｅ２８０からＥ２８９のいずれか一項に記載の方法によって調製した、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液。
【0303】
Ｅ２９２．
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、
ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化ステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む保存液を固定相に適用するステップ
を含み、ステップｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい、ＡＥＸ固定相を再生する方法。
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、
ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化ステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む保存液を固定相に適用するステップ
を含み、ステップｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい、ＡＥＸ固定相を再生する方法。
【0304】
Ｅ２９３．ステップｉ）～ｖ）のうちの任意の１つが、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法のクロマトグラフィー溶出ステップに続く、Ｅ２９２に記載のＡＥＸ固定相を再生する方法。
【0305】
Ｅ２９４．
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、
ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば、ｐＨ９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化ステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７％～１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む、保存液を固定相に適用するステップ
を含み、ステップｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい方法によって調製した、再生したＡＥＸ固定相。
ｉ）任意選択で上向流によって、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の使用後の浄化ステップ、
ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の再生ステップ、
ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば、ｐＨ９）を含む溶液を、固定相に適用することを含む、固定相の平衡化ステップ、
ｉｖ）≧４．５（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、固定相の使用後のフラッシュのステップ、および／または
ｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７％～１７．５％のエタノールを含む溶液を、固定相に適用することを含む、保存液を固定相に適用するステップ
を含み、ステップｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよい方法によって調製した、再生したＡＥＸ固定相。
【0306】
Ｅ２９５．再生したＡＥＸ固定相をｒＡＡＶベクターの精製に使用する、Ｅ２８８に記載の再生したＡＥＸ固定相。
【0307】
Ｅ２９６．Ｅ１からＥ２２７またはＥ２３１からＥ２５８のいずれか一項に記載の方法によって作製した精製ｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
【0308】
Ｅ２９７．Ｅ２６７からＥ２７９に記載の精製ｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
【0309】
Ｅ２９８．疾患、障害、または状態を処置および／または防止するための医薬品の製造における、Ｅ１からＥ２２７またはＥ２３１からＥ２５８のいずれか一項に記載の方法に従って精製したｒＡＡＶベクターの使用。
【0310】
Ｅ２９９．疾患、障害、または状態がＤＭＤである、Ｅ２９８に記載の使用。
【0311】
Ｅ３００．ｒＡＡＶベクターが、欠失した銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）タンパク質をコードしている修飾核酸を含むベクターゲノムを含む、Ｅ１からＥ１８２のいずれか一項に記載の方法。
【0312】
Ｅ３０１．修飾核酸が、配列番号１５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、欠失した銅輸送ＡＴＰａｓｅ２（ＡＴＰ７Ｂ）タンパク質をコードしている核酸配列を含む、Ｅ３００に記載の方法。
【0313】
Ｅ３０２．銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２が、重金属関連部位ＨＭＡ１、ＨＭＡ２、ＨＭＡ３、およびＨＭＡ４の欠失を含む、Ｅ３００またはＥ３０１に記載の方法。
【0314】
Ｅ３０３．ベクターゲノムが、α１－抗トリプシンプロモーター、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、５’ＩＴＲ、および３’ＩＴＲをさらに含む、Ｅ３００からＥ３０２のいずれか一項に記載の方法。
【0315】
Ｅ３０４．α１－抗トリプシンプロモーターが、配列番号１６の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ３０３に記載の方法。
【0316】
Ｅ３０５．ポリＡシグナル配列が、配列番号１７の核酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ３０３に記載の方法。
【0317】
Ｅ３０６．５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲがＡＡＶ２血清型ＩＴＲである、Ｅ３０３に記載の方法。
【0318】
Ｅ３０７．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ３ＢのＶＰ１ポリペプチドを含む、Ｅ１からＥ１８２のいずれか一項に記載の方法。
【0319】
Ｅ３０８．ＶＰ１ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、Ｅ３０７に記載の方法。
【0320】
Ｅ３０９．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させ、勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が約７５％～約１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約６０％～約１００％であり、第２の溶出緩衝液の百分率を、勾配溶出にわたって約２％～５％／ＣＶの速度で増加させるステップと、
ｉｉｉ）第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約３０％～約３５％であるときに開始して、勾配溶出を行う際に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップと
を含み、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させ、勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が約７５％～約１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約６０％～約１００％であり、第２の溶出緩衝液の百分率を、勾配溶出にわたって約２％～５％／ＣＶの速度で増加させるステップと、
ｉｉｉ）第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約３０％～約３５％であるときに開始して、勾配溶出を行う際に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップと
を含み、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0321】
Ｅ３１０．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む緩衝液で約１５倍に希釈されている親和性溶出液である、Ｅ３０９に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0322】
Ｅ３１１．第１の勾配溶出緩衝液が、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む、および／または第２の勾配溶出緩衝液が、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む、Ｅ３０９またはＥ３１０に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0323】
Ｅ３１２．溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップが、溶出液の少なくとも１つの画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器内に収集することを含む、Ｅ３０９からＥ３１１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0324】
Ｅ３１３．溶出液の少なくとも１つの画分が、親和性溶出液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ｒＡＡＶベクターがｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相がＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、Ｅ３１０からＥ３１２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0325】
Ｅ３１４．勾配溶出を行う際に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップが、第２の勾配溶出緩衝液の百分率が約５０％～約５５％であるときに終了する、Ｅ３０９からＥ３１３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0326】
Ｅ３１５．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップであって、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含むステップと、
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップと、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液の百分率を、第２の勾配溶出緩衝液の百分率の変動に対して反比例する様式で変動させるステップと、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集するステップであって、溶出液の少なくとも１つの画分が精製しようとするｒＡＡＶベクターを含むステップと、
を含む、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0327】
Ｅ３１６．カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定することをさらに含む、Ｅ３１５に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0328】
Ｅ３１７．固定相に適用する前に、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で約２倍～２５倍（たとえば１５倍）に希釈し、任意選択で濾過する、Ｅ３１５またはＥ３１６に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0329】
Ｅ３１８．溶液が親和性溶出液である、Ｅ３１５からＥ３１７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0330】
Ｅ３１９．希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液のｐＨが、溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液の伝導率が、溶液の伝導率と比較して減少している、Ｅ３１５からＥ３１８に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0331】
Ｅ３２０．第１の勾配溶出緩衝液が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス、約０．００５％～約０．０１５％のＰ１８８を含み、ｐＨ約８．５～９．５のｐＨを有しており、第２の勾配溶出緩衝液が、約４００ｍＭ～約６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのトリス、約０．００５％～約０．０１５％のＰ１８８を含み、ｐＨ約８．５～９．５のｐＨを有しており、１０～６０カラム体積（ＣＶ）（たとえば、約２０ＣＶ、約３７．５ＣＶ）の第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物を勾配溶出中に固定相に適用する、Ｅ３１５からＥ３１９のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0332】
Ｅ３２１．勾配溶出の開始時に第１の勾配溶出緩衝液の百分率が５０％～１００％であり、勾配溶出の終了時に第２の勾配溶出緩衝液の百分率が５０％～１００％であり、第２の溶出緩衝液の百分率を、勾配溶出にわたって約２％～５％／ＣＶの速度で増加させる、Ｅ３１５からＥ３２０のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0333】
Ｅ３２２．第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物の酢酸ナトリウムの濃度を、勾配溶出中に連続的に増加させ、酢酸ナトリウムの濃度を、勾配溶出にわたって約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ（たとえば、約１０ｍＭ／ＣＶ、約２５ｍＭ／ＣＶ）の速度で増加させる、Ｅ３１５からＥ３２１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0334】
Ｅ３２３．フルカプシドが、勾配溶出中に固定相から第１の溶出ピーク中および／または第２の溶出ピークの最初の部分中に溶出される、Ｅ３１５からＥ３２２のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0335】
Ｅ３２４．空カプシドが、勾配溶出中にカラムフロースルー中で第１の溶出ピーク中および／または第２の溶出ピークの最後の部分中で回収される、Ｅ３１５からＥ３２３のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0336】
Ｅ３２５．溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を２８０ｎｍで測定し、任意選択で、吸光度閾値が、２８０ｎｍで測定して≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長である、Ｅ３１５からＥ３２４のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0337】
Ｅ３２６．溶出液の少なくとも１つの画分の体積が、ＣＶの１／８～１０ＣＶ、たとえば、ＣＶの１／８、ＣＶの１／４、ＣＶの１／３、ＣＶの１／２、ＣＶの３／４、１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ、８ＣＶ、９ＣＶ、１０ＣＶ、またはＣＶのそれより多くに等しく、任意選択で、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比が１．２５以上である、Ｅ３１５からＥ３２５のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0338】
Ｅ３２７．溶出液の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個、またはそれより多くの画分を収集する、Ｅ３１５からＥ３２６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0339】
Ｅ３２８．それぞれ≧０．９８または≧１．０のＡ２６０／Ａ２８０比を有する、カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、Ｅ３１５からＥ３２７のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0340】
Ｅ３２９．プールした溶出液が、２０％～１００％（たとえば６３＋／－２６％）の％ＶＧカラム収率、３１％～６６％（たとえば４７＋／－１１％）の％ＶＧステップ収率、および／または≧１．０のＡ２６０／Ａ２８０比を有する、Ｅ３２８に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0341】
Ｅ３３０．プールした溶出液が、カラム上にロードした溶液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている、Ｅ３２８またはＥ３２９に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0342】
Ｅ３３１．精製ｒＡＡＶベクターが生成される、Ｅ３１５からＥ３３０のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0343】
Ｅ３３２．プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、Ｅ３２８からＥ３３１のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0344】
Ｅ３３３．原薬が、ｉ）全カプシドの４５％～６５％（たとえば５２＋／－７％）のフルカプシド、ｉｉ）全カプシドの１９％～３７％（たとえば２８＋／－５％）の中間体カプシド、および／またはｉｉｉ）全カプシドの１０％～３７％（たとえば２０＋／－７％）の空カプシドを含む、Ｅ３３２に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0345】
Ｅ３３４．原薬が、カラム上にロードした溶液と比較してフルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている、Ｅ３３２からＥ３３３に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0346】
Ｅ３３５．ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３号の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５からなる群から選択されるＡＡＶ血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含む、Ｅ３１５からＥ３３４のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0347】
Ｅ３３６．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質および配列番号１の核酸を含む導入遺伝子を含む、Ｅ３１５からＥ３３５のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0348】
Ｅ３３７．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質および配列番号１５のアミノ酸配列をコードしている核酸を含む導入遺伝子を含む、Ｅ３１５からＥ３３６のいずれか一項に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法。
【0349】
Ｅ３３８．
ｉ）第１の溶液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）ステップｉ）からの第１の溶液を、フィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップと
を含み、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少している、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
ｉ）第１の溶液を、ヒスチジン、トリス、およびＰ１８８を含む希釈溶液で２～２５倍（たとえば１５倍）に希釈するステップと、任意選択で、
ｉｉ）ステップｉ）からの第１の溶液を、フィルターを通して濾過して、希釈および任意選択で濾過した溶液を生成するステップと
を含み、希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが、第１の溶液のｐＨと比較して増加しており、希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が、第１の溶液の伝導率と比較して減少している、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0350】
Ｅ３３９．ｒＡＡＶベクターを含む第１の溶液が、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される、Ｅ３３８に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0351】
Ｅ３４０．希釈溶液が、約１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８を含み、ｐＨ８．５～９．５のｐＨを有する、Ｅ３３８またはＥ３３９に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0352】
Ｅ３４１．ｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液のｐＨが８．５～９．５である、ｉｉ）希釈および任意選択で濾過した溶液の伝導率が１．７～３．３ｍＳ／ｃｍである、ならびに／またはｉｉｉ）希釈溶液の％ＶＧ希釈収率が３５％～１００％である、Ｅ３３８からＥ３４０のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0353】
Ｅ３４２．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含む、Ｅ３３８からＥ３４１のいずれか一項に記載の、ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法。
【0354】
Ｅ３４３．
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における塩の濃度の増加の速度が約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ（たとえば約２５ｍＭ／ＣＶ）であるように、塩の濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップ、および／または
ｖｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
ｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードするステップ、
ｉｉ）カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップであって、第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、もしくは両方の混合物を固定相に適用し、勾配溶出の経過中における塩の濃度の増加の速度が約１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ（たとえば約２５ｍＭ／ＣＶ）であるように、塩の濃度を０ｍＭ～５００ｍＭで変動させるステップ、
ｉｉｉ）カラムフロースルーの吸光度が吸光度閾値に達した際に開始して、勾配溶出中に溶出液の少なくとも１つの画分をカラムから収集するステップ、および／または
ｖｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、
を含む方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0355】
Ｅ３４４．Ａ２６０／Ａ２８０比が≧１．０であるときにカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、精製ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液を形成することをさらに含む、Ｅ３４３に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0356】
Ｅ３４５．塩が酢酸ナトリウムである、Ｅ３４３またはＥ３４４に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0357】
Ｅ３４６．ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質を含む、Ｅ３４３からＥ３４５のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0358】
Ｅ３４７．ｒＡＡＶベクターを含む溶液が、固定相上にロードする前に希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液である、Ｅ３４３からＥ３４６のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0359】
Ｅ３４８．固定相から溶出された材料がｒＡＡＶベクターを含む、Ｅ３４３からＥ３４７のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0360】
Ｅ３４９．プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することをさらに含む、Ｅ３４４からＥ３４８のいずれか一項に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0361】
Ｅ３５０．原薬を、疾患、障害、または状態を処置するためにヒト対象への投与に適している薬物製品を作製するために使用する、Ｅ３４９に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【0362】
Ｅ３５１．疾患、障害、または状態がＤＭＤまたはウィルソン病であり、ｒＡＡＶベクターが配列番号２または配列番号１５のアミノ酸配列をコードしている核酸を含んでいてもよい、Ｅ３５０に記載の方法によって調製した精製ｒＡＡＶベクター。
【図面の簡単な説明】
【0363】
【図1】１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において４つの溶出塩を使用して作成した、例示的なＡＥＸクロマトグラムの溶出相を示す図である。Ａ２６０追跡を破線によって示す一方で、Ａ２８０および伝導率の追跡を実線によって示す。黒色のバーは、プールを形成するために使用した溶出画分を示す。
【図2】１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において４つの溶出塩を使用して作成した、ＡＥＸ溶出画分の例示的なＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を示す図である。
【図3】５．１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において実施した酢酸ナトリウムの９ステップの洗浄および溶出を使用して作成した、例示的なＡＥＸクロマトグラムを示す図である。Ａ２６０の追跡を破線によって示す一方で、Ａ２８０および伝導率の追跡を実線によって示す。洗浄（Ｗ）、溶出（Ｅ）、ストリッピング、および再生（Ｒｅｇｅｎ．）画分は、表５および表６と一致するように示す。
【図4-1】（図４Ａ）５．１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において実施した、６００ｃｍ／時の溶出、５．１×１０１３個のベクターゲノム／ｍＬの樹脂チャレンジ（ＩＴＲ配列のｑＰＣＲによって測定した樹脂のＶＧ／ｍＬ）、および５７ｍＭの酢酸ナトリウム洗浄を用いた実行した酢酸ナトリウムステップ溶出を使用して作成した、例示的なＡＥＸクロマトグラムを示す図である。Ａ２６０の追跡を破線によって示す一方で、Ａ２８０および伝導率の追跡を実線によって示す。
【図5】ＡＡＶ９親和性溶出液と１００ｍＭのトリス、ｐＨ９とをインライン混合してＡＥＸロード（本明細書中で希釈した親和性溶出液とも呼ぶ）を作製する例示的な方法を示す図である。蠕動ポンプを用いて流体をＹ字コネクタに送達した。
【図6】１００ｍＭのトリス、ｐＨ９で希釈したＡＡＶ９親和性溶出液の例示的なｐＨ、伝導率、Ｚ平均、および凝集（＋または－として示す）を示す図である。
【図7-1】（図７Ａ）２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、Ｘ％（ｗ／ｖ）のＰ１８８、ｐＨ８．８で５、９、または２５倍に希釈し（ただし、Ｘは、０．０１％、０．０５％、０．２％、および０．５％である）、続いて濾過した親和性溶出液の、例示的な％ベクターゲノム（ＶＧ）収率を示す図である。伝導率（希釈係数によって制御される）およびＰ１８８濃度の関数としての、％ＶＧ収率（希釈および濾過後）の等高線図を図７Ａに示す。データを表１３中にも提示する。
【図7-2】（図７Ｂ）２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、Ｘ％（ｗ／ｖ）のＰ１８８、ｐＨ８．８で５、９、または２５倍に希釈し（ただし、Ｘは、０．０１％、０．０５％、０．２％、および０．５％である）、続いて濾過した親和性溶出液の、例示的な％ベクターゲノム（ＶＧ）収率を示す図である。Ｐ１８８濃度または伝導率の関数としての、％ＶＧ収率（希釈および濾過後）の一元配置ＡＮＯＶＡ分析を図７Ｂに示す。データを表１３中にも提示する。
【図9】０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％のヌル親和性プール上において、最適化されたＡＥＸ方法を使用して作製したクロマトグラフィー画分の例示的なＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値を示す図である。フロースルーをＦ／Ｔとして略記する。
【図10】１０ｃｍの内径（ＩＤ）×１６ｃｍの床高（ＢＨ）、１．３ＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において実行したバッチ２５０Ｌ－４からの、例示的な２５０ＬのＳＵＢのＡＥＸクロマトグラムの溶出相を示す図である。Ａ２６０の追跡を破線によって示す一方で、Ａ２８０および伝導率の追跡を実線によって示す。
【図11】２０ｃｍのＩＤ×２０．５ｃｍのＢＨ、６．４ＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において実行したバッチ２０００Ｌ－４からの、例示的な２０００ＬのＳＵＢスケールのＡＥＸクロマトグラムの溶出相を示す図である。Ａ２６０の追跡を破線によって示す一方で、Ａ２８０および伝導率の追跡を実線によって示す。
【図12】ＡＡＶ３Ｂベクターの精製のための最適化されたＡＥＸプロセスを使用した、例示的なクロマトグラムを示す図である。Ａ２６０の追跡を実線によって示す一方で、Ａ２８０の追跡を破線によって示す。
【発明を実施するための形態】
【0364】
１．定義
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的だけのためのものであり、本発明を限定することを意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲中において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと示されない限りは、複数形も含むことを意図する。以下の用語は示す意味を有する。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的だけのためのものであり、本発明を限定することを意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲中において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと示されない限りは、複数形も含むことを意図する。以下の用語は示す意味を有する。
【0365】
本明細書中で使用する用語「約」または「およそ」とは、生物活性の量、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、ＧおよびＣヌクレオチドの含有率、コドン適応指標、ＣｐＧジヌクレオチドの数、用量、時間、温度などの測定可能な値をいい、別段に記述しない限りは、内容によりそうでないことが明白でない限りは、またはそのような数が可能な値の１００％を超える場合以外は、指定した量のいずれの方向にも（それを超えるまたは未満）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
【0366】
本明細書中で使用する用語「および／または」とは、関連する列挙した事項のうちの１つまたは複数任意かつすべての可能な組合せ、および代替（「または」）で解釈した場合は組合せの欠如をいう、それを包含する。
【0367】
本明細書中で使用する用語「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」とは、直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスおよびその変異体をいう。この用語は、そうでないことが必要な場合以外は、すべての亜型ならびに天然に存在するおよび組換え形態の両方を網羅する。
【0368】
カノニカルＡＡＶ野生型ゲノムは４６８１個の塩基を含み（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２４３～３０７）、それぞれの末端に末端リピート配列（たとえば逆方向末端反復（ＩＴＲ））を含み、これはｃｉｓでウイルスのＤＮＡ複製起点としておよびパッケージングシグナルとして機能する。このゲノムは、それぞれＡＡＶ複製（「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」）およびカプシド（「ＡＡＶ ｃａｐ」または「ｃａｐ」）遺伝子として知られている、２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書中でＡＡＶ「パッケージング遺伝子」とも呼び得る。これらの遺伝子は、ウイルスゲノムの複製およびパッケージングに関与しているウイルスタンパク質をコードしている。
【0369】
野生型ＡＡＶでは、３つのカプシド遺伝子、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、単一のオープンリーディングフレーム内で互いに重複しており、選択的スプライシングにより、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の生成がもたらされる（ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７９（１５）：９９３３～９９４４）。単一のＰ４０プロモーターが、３つすべてのカプシドタンパク質がＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３についてそれぞれ約１：１：１０の比で発現されることを可能にし、これはＡＡＶカプシドの生成を補完する。より詳細には、ＶＰ１は完全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、Ｎ末端が次第に切断されることが原因で次第に短くなる。周知の一例は米国特許第７，９０６，１１１号に記載されているＡＡＶ９のカプシドであり、ＶＰ１が配列番号１２３のアミノ酸残基１～７３６を含み、ＶＰ２が配列番号１２３のアミノ酸残基１３８～７３６を含み、ＶＰ３が配列番号１２３のアミノ酸残基２０３～７３６を含む。本明細書中で使用する用語「ＡＡＶ Ｃａｐ」または「ｃａｐ」とは、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３、ならびにその変異体および類似体をいう。カプシド遺伝子の第２のオープンリーディングフレームは、カプシドのアセンブリプロセスに必須であるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）と呼ばれるアセンブリ因子をコードしている（Ｓｏｎｎｔａｇら（２０１１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ８５（２３）：１２６８６～１２６９７）。
【0370】
少なくとも４つのウイルスタンパク質、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子から合成され、その見かけの分子量に従って命名されている。本明細書中で使用する「ＡＡＶ ｒｅｐ」または「ｒｅｐ」とは、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、および／またはＲｅｐ４０、ならびにその変異体および類似体を意味する。本明細書中で使用するｒｅｐおよびｃａｐとは、野生型および組換え（たとえば修飾キメラなど）のｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方、ならびにそれらがコードしているポリペプチドをいう。一部の実施形態では、ｒｅｐをコードしている核酸は、複数のＡＡＶ血清型からのヌクレオチドを含む。たとえば、ｒｅｐタンパク質をコードしている核酸は、ＡＡＶ２血清型からのヌクレオチドおよびＡＡＶ３血清型からのヌクレオチドを含み得る（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１）。
【0371】
本明細書中で使用する用語「組換えアデノ随伴ウイルスベクター」、「ｒＡＡＶ」、および／または「ｒＡＡＶベクター」とは、ベクターゲノムを含むＡＡＶカプシドをいう。ベクターゲノムは、天然に存在するＡＡＶには少なくとも部分的には由来しないポリヌクレオチド配列（たとえば、野生型ＡＡＶ中に存在しない異種ポリヌクレオチド）を含み、野生型ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子はベクターゲノムから除去されている。ＡＡＶのｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子が除去されている（ならびに／またはＡＡＶからのＩＴＲが付加されているもしくは残存する）場合、ＡＡＶ内の核酸を「ベクターゲノム」と呼ぶ。したがって、用語ｒＡＡＶベクターは、カプシドを含むが完全なＡＡＶゲノムを含まないｒＡＡＶウイルス粒子を包含する。その代わりに、組換えウイルス粒子は、異種、すなわち元々はカプシド中に存在しない核酸を含むことができ、本明細書中で以降ベクターゲノムと呼ぶ。したがって、「ｒＡＡＶベクターゲノム」（または「ベクターゲノム」）とは、ＡＡＶカプシド内に含有されていてよいが、そうである必要はない、異種ポリヌクレオチド配列（少なくとも１つのＩＴＲを含む）をいう。ｒＡＡＶベクターゲノムは、二本鎖（ｄｓＡＡＶ）、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）、または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）であり得る。典型的には、ベクターゲノムは、治療的導入遺伝子、遺伝子編集核酸などをしばしばコードしている、異種（それが由来する元のＡＡＶに対して）の核酸を含む。
【0372】
本明細書中で使用する用語「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、および／または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質からなり（とはいえ、典型的には、ＡＡＶのすべてのカプシドタンパク質、たとえば、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはその変異体が存在する）、異種核酸配列を含むベクターゲノムを含有する、ＡＡＶカプシドをいう。これらの用語は、組換えではない「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルス」から区別するべきであり、カプシドは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードしているウイルスゲノムを含有しており、ＡＡＶウイルスは、アデノウイルスおよび／もしくは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルス、および／またはそれからの必要なヘルパー遺伝子も含む細胞中に存在する場合は複製することができる。したがって、ｒＡＡＶベクター粒子の生成は、組換えＤＮＡ技術を使用した組換えベクターゲノムの生成を必然的に含み、したがって、ベクターゲノムはカプシド内に含有されてｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルス粒子、またはｒＡＡＶベクター粒子を形成する。
【0373】
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当分野で知られている。そのような配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベース中に見つけ得る。たとえば、その開示が本明細書中に参考として組み込まれている、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、ＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）、ＡＹ６３１９６５（ＡＡＶ１０）、ＡＹ６３１９６６（ＡＡＶ１１）、およびＤＱ８１３６４７（ＡＡＶ１２）を参照されたい。また、たとえば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９、Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５８：９２１、Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３、国際公開公報ＷＯ００／２８０６１号、ＷＯ９９／６１６０１号、ＷＯ９８／１１２４４号、ＷＯ２０１３／０６３３７９号、ＷＯ２０１４／１９４１３２号、ＷＯ２０１５／１２１５０１号、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および第７，９０６，１１１号も参照されたい。
【0374】
本明細書中で使用する用語「と関連している」とは、互いに、一方の存在、レベル、および／または形態が他方のものと相関している場合にいう。たとえば、特定の実体（たとえば、ポリペプチド、遺伝子署名、代謝物、微生物など）は、その存在、レベル、および／または形態が、疾患、障害、または状態の発生率および／またはそれに対する感受性と相関している場合に（たとえば関連集団にわたって）、特定の疾患、障害、または状態と関連しているとみなされる。一部の実施形態では、２つ以上の実体は、これらが互いに物理的に近接しているおよび／またはしたまま保たれるように、これらが直接または間接的に相互作用する場合に、互いに物理的に「関連している」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連している２つ以上の実体は、互いに共有結合している。一部の実施形態では、互いに物理的に関連している２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、たとえば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびその組合せによって、非共有的に関連している。
【0375】
本明細書中で使用する用語「コード配列」または「をコードしている核酸」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードしている核酸配列をいい、適切な調節配列の制御下に置かれた（作動可能に連結された）場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドへと転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される配列を示す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端にある翻訳ストップコドンによって一般に決定される。コード配列としては、それだけには限定されないが、原核または真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。
【0376】
本明細書中で使用する用語「キメラ」とは、その開示全体が本明細書中に参考として組み込まれているＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、ＵＳ６，４９１，９０７号に記載されているように、様々なパルボウイルス、好ましくは様々なＡＡＶ血清型からのカプシドまたは粒子配列を有する、ウイルスカプシドまたは粒子をいう。また、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７８（９）：４４２１～４４３２も参照されたい。一部の実施形態では、キメラウイルスカプシドは、以下の突然変異を有するＡＡＶ２カプシドの配列を有するＡＡＶ２．５カプシドである：２６３のＱからＡ、２６５のＴ挿入、７０５のＮからＡ、７０８のＶからＡ、および７１６のＴからＮ。そのようなカプシドをコードしているヌクレオチド配列は、ＷＯ２００６／０６６０６６号に記載されている配列番号１５として定義される。他の好ましいキメラＡＡＶカプシドとしては、それだけには限定されないが、ＷＯ２０１０／０９３７８４号に記載されているＡＡＶ２ｉ８、ＷＯ２０１４／１４４２２９号に記載されているＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ８Ｇ９、ＡＡＶ９．４５（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０～１０７８）、ＷＯ２０１３／０２９０３０号に記載されているＡＡＶ－ＮＰ４、ＮＰ２２、およびＮＰ６６、ＡＡＶ－ＬＫ０からＡＡＶ－ＬＫ０１９、ＷＯ２０１５／０１３３１３号に記載されているＲＨＭ４－１およびＲＨＭ１５＿１からＲＨＭ５＿６、ＷＯ２００７／１２０５４２号に記載されているＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９が挙げられる。
【0377】
本明細書中で使用する用語「溶出液」とは、移動相と固定相を通過したまたは固定相から置換された材料とから構成される、クロマトグラフィー固定相（たとえば、モノリス、膜、樹脂、媒体）から出る（たとえば「固定相から溶出する」）流体をいう。一部の実施形態では、固定相としては、たとえば、モノリス、膜、樹脂、または媒体が挙げられる。移動相は、カラム上にロードしてカラムを流通した溶液（すなわち「フロースルー画分」）であり得る。平衡化溶液（たとえば平衡化緩衝液）、定組成溶出溶液、勾配溶出溶液、固定相を再生するための溶液、固定相を浄化するための溶液、洗浄用溶液、およびその組合せであり得る。
【0378】
本明細書中で使用する用語「隣接した」とは、他の要素が隣接する配列をいい、配列に対して上流および／または下流、すなわち５’および／または３’の、１つまたは複数の隣接する要素の存在を示す。用語「隣接した」とは、配列が必ずしも連続することを示すことを意図しない。たとえば、導入遺伝子をコードしている核酸と隣接する要素との間に介在配列が存在し得る。２つの他の要素（たとえばＩＴＲ）が「隣接する」配列（たとえば導入遺伝子）とは、一方の要素が配列に対して５’側に位置し、他方が配列に対して３’側に位置することを示す。しかし、その間に介在配列が存在していてよい。
【0379】
本明細書中で使用する用語「凝結」とは、微粒子が一緒に凝集して綿状塊となることを引き起こすプロセスをいう。微粒子は、宿主細胞の溶解から生じるタンパク質、核酸、細胞断片を含み得る。一部の実施形態では、液相中で形成される綿状塊は、液体の上部へと浮上する（クリーム化）、液体の底部へと沈下する（沈降）、または液相から濾過され得る。
【0380】
本明細書中で使用する用語「断片」とは、全体の別個の部分を含むが、全体中に見つかる１つまたは複数の部分を欠く構造を有する材料または実体をいう。一部の実施形態では、断片は別個の部分からなる。一部の実施形態では、断片は、全体中に見つかる特徴的な構造要素または部分からなるまたはそれを含む。一部の実施形態では、ポリマー断片は、全体ポリマー中に見つかる少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００個、またはそれより多くの単量体単位（たとえばアミノ酸残基、ヌクレオチド）を含むまたはそれからなる。
【0381】
ｒＡＡＶベクターは、カプシドが、導入遺伝子を含む完全または本質的に完全なベクターゲノムを含有する場合に「フル」、「フルカプシド」、「フルベクター」、または「フルにパッケージングされたベクター」と呼ばれる。宿主細胞によるｒＡＡＶベクターの生成中、フルカプシドよりもパッケージング度がより低い核酸を有し、たとえば部分的または切断されたベクターゲノムを含有するベクターが生成され得る。これらのベクターは、「中間体」、「中間体カプシド」、「部分的」、または「部分的にパッケージングされたベクター」と呼ばれる。中間体カプシドはまた、分析用超遠心分離によって分析した場合に、中間の沈降速度、すなわち、フルカプシドと空カプシドとの間の沈降速度を有するカプシドでもあり得る。宿主細胞はまた、検出可能な核酸材料を全く含有しないウイルスカプシドも生成し得る。これらのカプシドは、「空」または「空カプシド」と呼ばれる。フルカプシドは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって決定したＡ２６０／Ａ２８０比に基づいて空カプシドから区別してよく、Ａ２６０／Ａ２８０比は、分析用超遠心分離によって単離したカプシド（すなわち、フル、中間体、および空）に対してあらかじめ較正されている。カプシドの特徴づけのための、当分野で知られている他の方法としては、ＣｒｙｏＴＥＭ、毛細等電点電気泳動、および荷電検出質量分析が挙げられる。空およびフルのＡＡＶ９カプシドのそれぞれ約６．２および約５．８の計算した等電点が報告されている（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１３）８７．９：４９７４～４９８４）。
【0382】
本明細書中で使用する用語「ヌルカプシド」とは、ベクターゲノムを意図的に欠くように生成したカプシドをいう。そのようなヌルカプシドは、ベクタープラスミドとしても知られる、ｒｅｐ／ｃａｐおよびヘルパープラスミドを用いるが、導入遺伝子カセット配列を含むプラスミドを用いない、宿主細胞の形質移入によって生成し得る。
【0383】
本明細書中で使用する用語「機能的」とは、それによりそれが特徴づけられている特性および／または活性を示す形態の生体分子をいう。生体分子は２つの機能（すなわち二機能的）または多数の機能（すなわち多機能的）を有し得る。
【0384】
本明細書中で使用する用語「遺伝子」とは、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質コードしていることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドをいう。「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、外来ＤＮＡを宿主細胞内に確実に挿入するための方法または系をいう。そのような方法は、組み込まれていない移入したＤＮＡの一過性発現、移入したレプリコン（たとえばエピソーム）の染色体外複製および発現、ならびに／または移入した遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡ内への組込みをもたらす場合がある。
【0385】
本明細書中で使用する用語「勾配溶出」とは、溶出の過程中に徐々に変化させる、異なるｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を有する少なくとも２つの異なる溶液の混合物を、クロマトグラフィー固定相（たとえば、モノリス、媒体、樹脂、膜を含む）に適用することをいう。勾配溶出は線形または非線形であり得る。対照的に、定組成溶出中、クロマトグラフィー移動相の組成は一定であり、「ステップ溶出」中、クロマトグラフィー移動相の組成は段階的な様式で変化する。勾配溶出の過程中に、第１の溶液の百分率は、第２の溶液の百分率に対して反比例する様式で連続的に変動させる。たとえば、溶液を混合し、固定相を流通させるにつれて、ｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度の連続的に変動する（実施形態に応じて増加または減少する）勾配が作られるように、勾配溶出の開始時に、混合物中の勾配溶出緩衝液Ａ（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）の百分率は１００％であり、混合物中の勾配溶出緩衝液Ｂ（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）の百分率は０％である。一部の実施形態では、酢酸ナトリウムなどの塩の濃度は、直線勾配の体積にわたって一定速度で変化する。たとえば、２０ｍＬの直線勾配を有する１ｍＬのカラム（すなわち２０ＣＶ）では、１ｍＬ／分の一定流速で操作して、塩濃度は５％／分の速度で変化する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシド（たとえば、フル、中間体、空）は、精製しようとするｒＡＡＶカプシドを含む溶液をＡＥＸ固定相上にロードする間、固定相に結合されている。勾配溶出中、塩（たとえば酢酸ナトリウム）の濃度が増加するように緩衝液Ｂの百分率が増加するにつれて、フルｒＡＡＶベクターが固定相から優先的に放出（溶出）され、空カプシドが固定相上に優先的に保持される。空カプシドは、緩衝液Ｂの百分率がさらに増加するにつれて、より大量に放出される。固定相からのフルｒＡＡＶベクターの溶出を、溶出液のＡ２６０およびＡ２８０を測定することによって、勾配溶出中にモニタリングすることができ、Ａ２６０／Ａ２８０の比の増加が溶出液中のフルｒＡＡＶベクターの百分率の増加の指標であり、逆に、Ａ２６０／Ａ２８０比の減少がフルｒＡＡＶベクターの百分率の減少および空カプシドの百分率の増加の指標である。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系における分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、オンラインＵＶ追跡、オフラインＵＶ方法などの方法を使用して測定し、吸光度を１つまたは複数の波長（たとえば２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍ）で測定する。
【0386】
本明細書中で使用する用語「異種」とは、細胞内への核酸のベクター媒介性移入／送達の目的のために、ベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）内に挿入した核酸をいう。異種核酸は、典型的にはベクター（たとえばＡＡＶ）核酸とは明確に異なる、すなわち、異種核酸は、ウイルス（たとえばＡＡＶ）核酸に関して非ネイティブである。細胞内に移入または送達した後、ベクター内に含有される異種核酸を発現させることができる（たとえば適切な場合は転写および翻訳させる）。あるいは、細胞中の、ベクター内に含有された移入または送達した異種核酸は、発現させる必要はない。用語「異種」は、本明細書中において必ずしも核酸に言及するために使用するわけではないが、修飾語「異種」の非存在においてでも、核酸への言及は異種核酸を含むことを意図する。たとえば、異種核酸は、ジストロフィンポリペプチドをコードしている核酸、またはその断片、たとえば、ＷＯ２０１７／２２１１４５号に記載されており、本明細書中に参考として組み込まれている、デュシェンヌ筋ジストロフィーの処置において使用するための、コドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子であろう。
【0387】
さらなる例示的な異種核酸は、以下の遺伝子のうちの１つ野生型コード配列またはその断片（たとえば切断された内部欠失）を含み、コドン最適化されていてもいなくてもよい。
【0388】
【表1】
【0389】
本明細書中で使用する用語「相同的な」または「相同性」とは、所定の領域または部分にわたって少なくとも部分的な同一性を共有する、２つ以上の参照実体（たとえばヌクレオチドまたはポリペプチド配列）をいう。たとえば、２つのペプチド中のアミノ酸位置が同一のアミノ酸によって占有されている場合、ペプチドはその位置で相同的である。とりわけ、相同的なペプチドは、未修飾または参照ペプチドに関連している活性または機能を保持し、修飾ペプチドは、一般に、未修飾配列のアミノ酸配列と「実質的に相同的な」アミノ酸配列を有する。ポリペプチド、核酸、またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似度」とは、適切な挿入または欠失を用いて別のポリペプチド、核酸（もしくはその相補鎖）、またはその断片と最適にアラインメントした場合に、配列の少なくとも約９５％～９９％において配列同一性が存在することを意味する。２つの配列間の相同性（同一性）の程度は、コンピュータプログラムまたは数学アルゴリズムを使用して確認することができる。パーセント配列相同性（または同一性）を計算するそのようなアルゴリズムは、一般に、比較領域または面積にわたる配列ギャップおよびミスマッチを考慮する。例示的なプログラムおよびアルゴリズムを以下に提供する。
【0390】
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、および「宿主細胞培養物」は、互換性があるように使用され、外因性の核酸が導入された細胞をいい、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質移入体」、「形質転換体」、「形質転換細胞」、および「形質導入細胞」が挙げられ、これは、初代の形質移入した、形質転換させた、または形質導入した細胞、および継代数を問わずそれに由来する子孫を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターの生成のためのパッケージング細胞である。
【0391】
本明細書中で使用する用語「宿主細胞ＤＮＡ」または「ＨＣＤＮＡ」とは、ｒＡＡＶベクターを生成した宿主細胞培養物に由来し、クロマトグラフィー画分（たとえば、親和性溶出液、ＡＥＸ溶出液、洗浄）またはクロマトグラフィーロード（たとえば、親和性ロード、ＡＥＸロード）中に存在する、残留ＤＮＡをいう。宿主細胞ＤＮＡは、ｑＰＣＲなどの当分野で知られている方法によって測定して、宿主細胞にユニークな配列を検出し得る。一般的なＤＮＡ濃度は、蛍光色素（たとえば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）もしくはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）、吸光度測定（たとえば２６０ｎｍもしくは２５４ｎｍで）、または電気泳動技法（たとえばアガロースゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動）を使用して推定し得る。溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量は、溶出液中に存在するｖｇの量に対して、たとえば、ｎｇ ＨＣＤＮＡ／１×１０１４ｖｇまたはｐｇ ＨＣＤＮＡ／１×１０９ｖｇで表し得る。溶出液中に存在するＨＣＤＮＡの量は、溶出液の体積中に存在するｖｇの量に対して、たとえば、ｐｇ ＨＣＤＮＡ／ｍＬの溶出液で表し得る。
【0392】
本明細書中で使用する用語「宿主細胞タンパク質」または「ＨＣＰ」とは、ｒＡＡＶベクターを生成した宿主細胞培養物に由来し、クロマトグラフィー画分（たとえば、親和性溶出液、ＡＥＸ溶出液、洗浄）またはクロマトグラフィーロード（たとえば、親和性ロード、ＡＥＸロード）中に存在する、残留タンパク質をいう。宿主細胞タンパク質は、ＥＬＩＳＡなどの当分野で知られている方法によって測定し得る。宿主細胞タンパク質は、様々な電気泳動染色方法（たとえば、銀染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および／またはウエスタンブロット）によって半定量的に測定することができる。溶出液中に存在するＨＣＰの量は、存在するｖｇの量に対して、たとえば、ｎｇ ＨＣＰ／１×１０１４ｖｇまたはｐｇのＨＣＰ／１×１０９ｖｇで表し得る。
【0393】
本明細書中で使用する用語「同一性」または「と同一」とは、ポリマー分子間、たとえば核酸分子（たとえばＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間、ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性をいう。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれより高く同一である場合に、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。
【0394】
２つの核酸またはポリペプチド配列のパーセント同一性の計算は、たとえば、最適比較目的のために２つの配列をアラインメントすることによって行うことができる（たとえば、ギャップは、最適アラインメントのために第１および第２の配列の一方および両方中に導入することができ、比較目的には非同一配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のためにアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。その後、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じ残基（たとえばヌクレオチドまたはアミノ酸）によって占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
【0395】
パーセント同一性または相同性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブにおいてｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを使用してアラインメントすることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）パッケージ中で利用可能なＦＡＳＴＡである。他のアラインメント技法はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．中に記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中のギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ７０：１７３～１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法を使用したＧＡＰプログラムを利用して配列をアラインメントすることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３～４５３（１９７０）を参照されたい。
【0396】
また、配列同一性を決定するための、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９）の局所的相同性アルゴリズムを使用したＢｅｓｔＦｉｔプログラムも興味深い。ギャップ作成ペナルティは、一般に１～５、通常は２～４の範囲であり、一部の実施形態では３である。ギャップ伸長ペナルティは、一般に約０．０１～０．２０の範囲であり、一部の例では０．１０である。プログラムは、比較するために入力した配列によって決定された初期設定パラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定された初期設定パラメータを使用して決定する。このプログラムも米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージから利用可能である。
【0397】
別の興味深いプログラムはＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢはＣｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ページ１２７～１４９、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．中に記載されている。パーセント配列同一性は、ＦａｓｔＤＢによって以下のパラメータに基づいて計算する：ミスマッチペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、結合ペナルティ：３０．０。
【0398】
本明細書中で使用する用語「不純物」とは、精製しているｒＡＡＶベクターを含む溶液中にやはり存在する、精製しているフルｒＡＡＶベクター以外の任意の分子をいう。不純物としては、空カプシド、中間体カプシド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生物学的高分子、非ＡＡＶタンパク質（たとえば宿主細胞タンパク質）、ＡＡＶ凝集物、損傷ＡＡＶカプシド、クロマトグラフィーに使用した吸収剤の一部であり、前の精製ステップ中に試料内に浸出し得る分子、内毒素、媒体構成成分を含む細胞培養物からの細胞細片および化学薬品、形質移入からのプラスミドＤＮＡ、外来性因子、細菌、ならびにウイルスが挙げられる。
【0399】
本明細書中で使用する用語「逆方向末端反復」、「ＩＴＲ」、「末端反復」、および「ＴＲ」とは、主に相補的な、対称的に配置された配列を含む、ＡＡＶウイルスゲノムの末端またはその付近にある回文構造の末端リピート配列をいう。これらのＩＴＲは、折り重なって、ＤＮＡ複製の開始中にプライマーとして機能するＴ字形状のヘアピン構造を形成することができる。また、これらは、宿主ゲノム内へのウイルスゲノムの組込みのため、宿主ゲノムからの救出のため、および成熟ビリオン内へのウイルス核酸のカプシド形成のためにも必要である。ＩＴＲは、ベクターゲノム複製およびウイルス粒子内へのそのパッケージングのために、ｃｉｓで必要である。「５’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの５’末端および／または組換え導入遺伝子に対して５’側にあるＩＴＲをいう。「３’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの３’末端および／または組換え導入遺伝子に対して３’側にあるＩＴＲをいう。野生型ＩＴＲはおよそ１４５ｂｐの長さである。修飾または組換えＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の断片または一部分を含み得る。当業者は、ＤＮＡ複製の逐次的なラウンド中、ＩＴＲ配列は５’ＩＴＲが３’ＩＴＲとなるよう交換される場合があり、その逆も同様であることを理解されよう。一部の実施形態では、ベクターゲノムをカプシド内にパッケージングして、ベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター（本明細書中で「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」とも呼ぶ）を生成することができるように、少なくとも１つのＩＴＲが組換えベクターゲノムの５’および／または３’末端に存在する。
【0400】
ＩＴＲは、ベクターゲノム複製およびウイルス粒子内へのそのパッケージングのために、ｃｉｓで必要である。「５’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの５’末端および／または組換え導入遺伝子に対して５’側にあるＩＴＲをいう。「３’ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの３’末端および／または組換え導入遺伝子に対して３’側にあるＩＴＲをいう。野生型ＩＴＲはおよそ１４５ｂｐの長さである。修飾または組換えＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列の断片または一部分を含み得る。当業者は、ＤＮＡ複製の逐次的なラウンド中、ＩＴＲ配列は５’ＩＴＲが３’ＩＴＲとなるよう交換される場合があり、その逆も同様であることを理解されよう。
【0401】
本明細書中で使用する用語「単離した」とは、１）人の手によって設計、生成、調製、およびもしくは製造された、および／または２）最初に生成された際に（自然中および／または実験設定中にかかわらず）それが関連している構成成分のうちの少なくとも１つから分離されている、物質または組成物をいう。一般に、単離した組成物は、自然ではそれらが通常関連している１つまたは複数の材料、たとえば、１つまたは複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、および／または細胞膜を実質的に含まない。用語「単離した」は、人工的な組合せ、たとえば、組換え核酸、組換えベクターゲノム（たとえばｒＡＡＶベクターゲノム）、ベクターゲノムをパッケージングする、たとえばカプシド形成するｒＡＡＶベクター粒子（たとえばそれだけには限定されないがＡＡＶ９カプシドを含むｒＡＡＶベクター粒子など）、および医薬配合物を排除しない。また、用語「単離した」は、ハイブリッド／キメラ、多量体／オリゴマー、修飾体（たとえば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）、変異体もしくは誘導体化形態、または人工である宿主細胞中で発現させた形態などの、組成物の代替の物理的形態も排除しない。
【0402】
単離した物質または組成物は、それらが最初に関連している他の構成成分の約１０％、約２０％、約３０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高くから分離されていてよい。一部の実施形態では、単離した薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高く純粋である。本明細書中で使用するように、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、たとえば１つまたは複数の担体または賦形剤（たとえば、緩衝液、溶媒、水など）等の特定の他の構成成分と合わせた後でも、依然として「単離された」またはさらには「純粋である」とみなし得る。そのような実施形態では、物質のパーセント単離または純度は、そのような担体または賦形剤を含めずに計算する。
【0403】
本明細書中で使用する用語「ロードチェイス」とは、ロードまたはロード溶液（下記に定義）を適用した後にカラムに適用する溶液をいう。ロードチェイスは、ロードまたはロード溶液の適用を完了させ、非結合材料をカラムから除去する役割を果たす。
【0404】
本明細書中で使用する用語「ロード」または「ロード溶液」とは、クロマトグラフィー固定相上にロードする、目的の生成物（たとえばフルｒＡＡＶベクター）を含有する任意の材料（たとえば溶液）をいう。一部の実施形態では、「ロード溶液」はクロマトグラフィー固定相に曝露される。一部の実施形態では、ロード溶液は親和性溶出液である。一部の実施形態では、ロード溶液は、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液である。
【0405】
本明細書中で使用する用語「固定相」または「クロマトグラフィー固定相」は、生成物を別の物質（たとえば不純物）から分離するために使用することができる任意の物質をいうために使用する。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、樹脂、媒体、膜、膜吸着剤、またはモノリスである。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相は、特定の条件下でＡＡＶカプシドと結合する媒体である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相はイオン交換媒体（たとえば、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱである。
【0406】
本明細書中で使用する用語「モディファイヤー」または「移動相モディファイヤー」とは、クロマトグラフィーを変更するために移動相を改変させる、移動相の構成成分である。クロマトグラフィーのそのような変更は、たとえば、不純物の固定相からの除去もしくは洗い流し、または目的の生成物もしくは材料の固定相からの溶出（たとえばｒＡＡＶベクター）をもたらす。「モディファイヤー」の例としては、塩、界面活性剤、アミノ酸（たとえば、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン、グリシン）、有機溶媒（たとえば、エタノール、エチレングリコール）、カオトロピック剤（たとえば尿素）、または置換剤（選択的溶出剤とも呼ばれる）が挙げられる。
【0407】
本明細書中で使用する用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」とは、互換性があるように、リン酸ジエステル結合によって接続された単量体ヌクレオチドから構成されるまたはそれを含む、任意の分子をいう。核酸はオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。核酸配列は、５’から３’の方向で本明細書中に提示する。本開示の核酸配列（すなわちポリヌクレオチド）はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であることができ、二本鎖分子、一本鎖分子、小または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、小または短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、エッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡなどの、核酸のすべての形態をいう。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子、または前述の分子のうちの任意のものの断片であることができる。ヌクレオチドは、本明細書中で一文字コードによって示す：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）。ヌクレオチド配列は化学修飾されているまたは人工であり得る。ヌクレオチド配列としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらの配列のそれぞれは、分子の主鎖への変化によって、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡから区別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドを使用し得る。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、本開示のヌクレオチド配列において使用し得る、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート、ならびにオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート、およびその２’－０－アリル類似体や２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。
【0408】
本明細書で使用する用語「核酸構築体」とは、組換えＤＮＡ技術（たとえば組換え核酸）の使用から生じる、天然に存在しない核酸分子をいう。核酸構築体は、自然で見つからない様式で組合せおよび配置された核酸配列のセグメントを含有するように改変された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子である。核酸構築体は「ベクター」（たとえば、プラスミド、ｒＡＡＶベクターゲノム、発現ベクターなど）であり得る、すなわち、外因的に作製されたＤＮＡを宿主細胞内に送達するように設計された核酸分子である。
【0409】
本明細書中で使用する用語「作動可能に連結された」とは、機能的関係にある核酸配列（またはポリペプチド）要素の連結をいう。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合に、作動可能に連結されている。たとえば、プロモーターまたは他の転写調節配列（たとえばエンハンサー）は、コード配列の転写に影響を与える場合に、コード配列と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、連結される核酸配列が連続していることを意味する。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、核酸配列が連続的に連結されていることを意味するのではなく、介在配列がこれらの連結されている核酸配列の間にある。
【0410】
本明細書中で使用する用語「パーセントベクターゲノム（ＶＧ）希釈収率」または「％ＶＧ希釈収率」とは、希釈前の親和性プール（本明細書中で親和性溶出液とも呼ぶ）中に存在するＶＧの量の百分率としての、希釈した親和性プール（本明細書中で希釈した親和性溶出液とも呼ぶ）中に存在するＶＧの量をいう。たとえば、％ＶＧ希釈収率＝（（希釈した親和性プール中のＶＧの量）／（親和性プール中のＶＧの量））＊１００である。
【0411】
本明細書中で使用する用語「パーセントＶＧカラム収率」または「％ＶＧカラム収率」とは、希釈だけした、または希釈および濾過した親和性溶出液中に存在するＶＧの量の百分率としての、ＡＥＸカラムから収集したプールした溶出液（すなわちＡＥＸプール）中に存在するベクターゲノム（ＶＧ）の量をいう。
【0412】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液は希釈だけし、「希釈した親和性プール」と呼ばれる。精製しようとするｒＡＡＶベクターは、２５０Ｌまたは２０００Ｌの容器（たとえば単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ））から回収されてもよい。たとえば、％ＶＧカラム収率＝（（ＡＥＸプール中のＶＧの量）／（希釈した親和性プール中のＶＧの量））＊１００である。
【0413】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液は希釈および濾過し、「ＡＥＸロード」と呼ばれる。精製しようとするｒＡＡＶベクターは、小スケール（たとえば２５０Ｌ未満）の容器（たとえばバイオリアクター）から回収されてもよい。たとえば、％ＶＧカラム収率＝（（ＡＥＸプール中のＶＧの量）／（希釈および濾過した親和性プール中のＶＧの量））＊１００である。
【0414】
本明細書中で使用する用語「パーセントＶＧステップ収率」または「％ＶＧステップ収率」とは、希釈または濾過前の親和性プール（本明細書中で親和性溶出液とも呼ぶ）中に存在するＶＧの量の百分率としての、ＡＥＸカラムから収集したプールした溶出液（すなわちＡＥＸプール）中のＶＧの量をいう。たとえば、％ＶＧステップ収率＝（（ＡＥＸプール中のＶＧの量）／（親和性プール中のＶＧの量））＊１００である。
【0415】
本明細書中で使用する用語「薬学的に許容できる」および「生理的に許容される」とは、１つまたは複数の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達、または接触に適した、生物学的に許容される配合物、気体、液体、もしくは固体、またはその混合物をいう。
【0416】
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」または「核酸配列によってコードされている」（すなわち、ポリヌクレオチド配列によってコードされている、ヌクレオチド配列によってコードされている）とは、天然に存在するタンパク質のような完全長ネイティブ配列、および、部分配列、修飾形態、または変異体がある程度のネイティブ完全長タンパク質の機能性を保持している限りは、機能的な部分配列、修飾形態、または配列変異体をいう。本開示の方法および使用において、核酸配列によってコードされているは、そのようなポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは、遺伝子療法を用いて処置した対象において欠陥がある、またはその発現が不十分である、または欠乏している内在性タンパク質と同一であることができるが、そうである必要はない。
【0417】
本明細書中で使用する用語「組換え」とは、クローニング、制限もしくはライゲーションステップ（たとえばそれ中に含まれるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに関して）、および／または自然で見つかる生成物とは明確に異なる構築体をもたらす他の手順の様々な組合せの産物である、ベクター、ポリヌクレオチド（たとえば組換え核酸）、ポリペプチド、または細胞をいう。組換えウイルスまたはベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）は、組換え核酸（たとえば、導入遺伝子および１つまたは複数の調節要素を含む核酸）を含むベクターゲノムを含む。この用語は、元のポリヌクレオチド構築体の複製物および元のウイルス構築体の子孫をそれぞれ含む。
【0418】
本明細書中で使用する用語「ステップ溶出」とは、定義されたｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を有する溶液の、クロマトグラフィー固定相（たとえば、モノリス、媒体、樹脂、膜を含む）への適用をいう。分離を最適化するために、一連のステップ溶出（たとえば漸増する伝導率または塩濃度を有する）を実施することができる。それぞれのステップ溶出溶液は、その適用中に変化しない定義された組成を有する。ステップ溶出の過程中に、一連の溶液（たとえば、ロードチェイス、ｐＨ安定化溶液、洗浄バッファー、溶出緩衝液）を固定相に適用するにつれて、ｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を、一連中の１つ前の溶液と比較して増加または減少させる。たとえば、一連のステップ溶出の開始時、第１の溶液中のモディファイヤー（たとえば塩、たとえば酢酸ナトリウム）の濃度は低く、（たとえば０～１０ｍＭ、たとえば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ）である。一連中のそれぞれの続く溶液において、２～２０個の溶液にわたって塩の濃度がたとえば５０ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ）まで増加するように、塩の濃度を増加させる。一連の２～２０個（またはそれより多く）の溶液中の塩濃度は、必ずしも等しいまたは比例する増分で変動しない。
【0419】
一部の実施形態では、ステップ溶出は、２～２０個の溶液、２～１０個の溶液、１０～２０個の溶液、たとえば、２、３、４、５、６、７、８ １９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれより多くの溶液を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシド（たとえば、フル、中間体、空）は、ｒＡＡＶカプシドを含む溶液のＡＥＸ固定相上へのロード中に、固定相と結合する。ステップ溶出中、ｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を変動させるにつれて、フルｒＡＡＶベクターが固定相から優先的に放出（溶出）され、空カプシドが固定相上に優先的に保持される。空カプシドは、モディファイヤー（たとえば塩）の濃度が増加するにつれて、より大量に放出される。固定相からのフルｒＡＡＶベクターの溶出を、溶出液のＡ２６０およびＡ２８０を測定することによって、ステップ溶出中にモニタリングすることができ、Ａ２６０／Ａ２８０の比の増加が溶出液中のフルｒＡＡＶベクターの百分率の増加の指標であり、逆に、Ａ２６０／Ａ２８０比の減少がフルｒＡＡＶベクターの百分率の減少および空カプシドの百分率の増加の指標である。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系における分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、オンラインＵＶ追跡、オフラインＵＶ方法などの方法を使用して測定し、吸光度を１つまたは複数の波長（たとえば２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍ）で測定する。
【0420】
本明細書中で使用する用語「対象」とは、生物、たとえば哺乳動物（たとえば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、イヌ）をいう。一部の実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児対象である。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態、たとえば、本明細書中に提供するように処置することができる疾患、障害、または状態を患っている。一部の実施形態では、対象は、ジストロフィンの欠乏または機能不全と関連している疾患、障害、または状態、たとえばデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。一部の実施形態では、対象は疾患、障害、または状態に罹り易い。一部の実施形態では、罹り易い対象は、疾患、障害、または状態を発生するリスクの素因を有する、および／またはその増加（参照対象もしくは集団において観察される平均リスクと比較して）を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の１つまたは複数の症状を示す。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（たとえば疾患の臨床徴候）または特徴を示さない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症状または特徴も示さない。一部の実施形態では、対象はヒト患者である。一部の実施形態では、対象は、診断および／または治療を投与するおよび／または投与されている、個体である（たとえばデュシェンヌ筋ジストロフィーのための遺伝子療法）。一部の実施形態では、対象は、デュシェンヌ筋ジストロフィーを有するヒト患者である。
【0421】
本明細書中に記載の方法に従って精製したｒＡＡＶベクターを使用して処置することができる疾患、障害、および状態としては、たとえば、代謝性の疾患もしくは障害（たとえば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症、糖原病）、尿素サイクルの疾患もしくは障害（たとえばオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）、リソソーム貯蔵の疾患もしくは障害（たとえば、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症）、肝臓の疾患もしくは障害（たとえば進行性家族性肝臓内胆汁鬱滞１～３型）、血液の疾患もしくは障害（血友病Ａ、血友病Ｂ、α地中海貧血症）、癌（たとえば、癌腫、肉腫、血液癌）、遺伝病もしくは障害（たとえば嚢胞性線維症）、または感染性疾患（たとえばＨＩＶ）が挙げられる。
【0422】
本明細書中に記載の方法に従って精製したｒＡＡＶベクターを使用して処置することができる疾患、障害、および状態としては、たとえば、２１－ヒドロキシラーゼ－欠乏性先天性副腎皮質過形成、軟骨無発生症１Ｂ型、軟骨形成不全症、色覚障害、酸性スフィンゴミエリナーゼ欠乏症（ニーマン－ピック病ＡまたはＢ型）、急性間欠性ポルフィリン症、アデノシンデアミナーゼ２欠乏症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（たとえば、重症複合型免疫不全、Ｘ連鎖）、副腎白質ジストロフィー（たとえばＸ連鎖）、加齢黄斑変性症（たとえば、血管新生、ウェット）、アラジール症候群、アルカプトン尿症、アルファ－１抗トリプシン欠乏症、アルファ－地中海貧血症、アルポート症候群、アルツハイマー病、アペール症候群、アルギナーゼ欠乏症、アルギニノコハク酸脱離酵素（ＡＳＬ）欠乏症、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）欠乏症（シトルリン血症１型）、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素欠乏症、常染色体劣勢先天性魚鱗癬、ベッカー型筋ジストロフィー、ベータ－地中海貧血症、カルバモイルホスファターゼ合成酵素Ｉ欠乏症、セロイドリポフスチン症、シャルコー－マリー－トゥース神経障害、脈絡膜欠如、慢性肉芽腫性疾患、シトリン欠乏症、クリグラー－ナジャール症候群１および２型、重症虚血肢、嚢胞性線維症、シスチン症、ダノン病、糖尿病性黄斑性網膜症、優性遺伝の低身長、ドラベ症候群、デュシェンヌ筋ジストロフィー、ディスフェルリン異常症（たとえば、三好ミオパチー、肢帯筋ジストロフィー２Ｂ）、栄養障害性表皮水疱症、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、家族性リポタンパク質リパーゼ欠乏症、ファンコニ貧血（たとえばファンコニ貧血Ａ）、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、糖原病１Ａおよび１Ｂ型（フォン・ギールケ病）、糖原病ＩＩＩ型、糖原病ＩＶ型、糖原病Ｖ型、糖原病ＶＩ型、糖原病ＸＶ型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、脳回転状萎縮、血友病Ａ、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ａｎｇｉｏｄｅｍａ）Ｉ～ＩＩＩ型、ハンチントン病、封入体筋炎、接合部表皮水疱症、歌舞伎症候群、レーバー先天性黒内障、赤血球粘着欠損１型、肢帯筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー２Ｃ型（ガンマ－サルコグリカン症）、肢帯筋ジストロフィー２Ｄ型、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター症候群）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型（モルキオＡ症候群）、ムコ多糖症ＩＶＢ型（モルキオＢ症候群）、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー－ラミー）、筋緊張性ジストロフィー１型、筋緊張性ジストロフィー２型、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠乏症、ネザートン症候群、神経セロイドリポフスチン症、オルニチン転位酵素欠乏症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損病、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポンペ、進行性家族性肝臓内胆汁鬱滞１～３型、進行性筋原線維ミオパチー、ピルビン酸キナーゼ欠乏症、網膜色素変性症、ＲＰＥ６５関連レーバー先天性黒内障、サンドホフ病、鎌状赤血球病、脊髄性筋萎縮症、テイ・ザックス病、ウィルソン病、ウィスコット－アルドリッチ症候群、ウィスコット－アルドリッチ症候群２、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、Ｘ連鎖筋細管ミオパチー、Ｘ連鎖網膜色素変性症、Ｘ連鎖網膜分離症、ならびにＸ連鎖重症複合型免疫不全が挙げられる。
【0423】
本明細書中で使用する用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の完全またはほぼ完全な程度または度合を示す定性的状態をいう。当業者は、生物学および化学的現象が完了する、および／または完全性まで進行するもしくは絶対的結果を達成することは、あったとしても稀であることを理解されよう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書中において、多くの生物学および化学的現象に特有の、完全性の潜在的な欠如を捕らえるために使用する。
【0424】
本明細書中で使用する用語「治療的ポリペプチド」とは、標的細胞（たとえば単離した細胞）または生物（たとえば対象）におけるタンパク質非存在または欠損から生じる症状を緩和または低下させ得るペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（たとえば、酵素、構造タンパク質、膜貫通タンパク質、輸送タンパク質）である。導入遺伝子によってコードされている治療的ポリペプチドまたはタンパク質は、たとえば、遺伝的欠陥を訂正するため、発現または機能に関連する遺伝子の欠損を訂正するために、対象に利点を与えるものである。同様に、「治療的導入遺伝子」とは、治療的ポリペプチドをコードしている導入遺伝子である。一部の実施形態では、宿主細胞中で発現させた治療的ポリペプチドは、導入遺伝子（すなわち宿主細胞内に導入された外因性の核酸）から発現させた酵素である。一部の実施形態では、治療的ポリペプチドは、筋肉細胞（たとえば骨格筋細胞）内に形質導入した治療的導入遺伝子から発現させたジストロフィンタンパク質またはその断片である。
【0425】
本明細書中で使用する用語「治療上有効な量」とは、そのためにそれを投与した所望の治療効果を生じる量をいう。一部の実施形態では、この用語は、治療的投薬レジメンに従って、疾患、障害、または状態を患っているまたはそれに罹り易い集団に投与した場合に、疾患、障害、または状態を処置するために十分な量をいう。一部の実施形態では、治療上有効な量とは、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状の、発生率および／もしくは重篤度を低下させる、ならびに／または発症を遅延させるものである。用語「治療上有効な量」は、特定の個体において処置の成功が達成されることを実際に必要としないことを、当業者は理解されよう。そうではなく、治療上有効な量は、そのような処置を必要としている患者に投与した場合に、有意数の対象において特定の所望の薬理学的応答を提供する量であり得る。
【0426】
本明細書中で使用する用語「導入遺伝子」は、宿主細胞、標的細胞、または生物（たとえば対象）への送達および／またはそれらの中での発現のための、任意の異種ポリヌクレオチドを意味するために使用する。そのような「導入遺伝子」は、ベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）を使用して宿主細胞、標的細胞、または生物に送達し得る。導入遺伝子は、プロモーターなどの制御配列と作動可能に連結されていてよい。発現制御配列を、宿主細胞、標的細胞、または生物中において導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択できることが、当業者に理解されよう。一般に、導入遺伝子は、自然において導入遺伝子と関連している内在性プロモーター作動可能に連結されていてよいが、より典型的には、導入遺伝子は、導入遺伝子が自然において関連していないプロモーターと作動可能に連結される。導入遺伝子の一例は、治療的ポリペプチド、たとえばジストロフィンポリペプチドをコードしている核酸またはその断片であり、例示的なプロモーターは、自然においてジストロフィンをコードしているヌクレオチドと作動可能に連結されていないものである。そのような非内在性プロモーターとしては、当分野で知られている多数のもののうち、ＣＢｈプロモーターまたは筋肉特異的プロモーターを挙げることができる。
【0427】
形質移入および形質導入を含む当分野で周知の多種多様な技法によって、宿主細胞を目的の核酸内に導入することができる。
【0428】
「形質移入」は、一般に、ウイルスベクターを使用せずに外因性の核酸を細胞内に導入するための技法として知られる。本明細書中で使用する用語「形質移入」とは、ウイルスベクターを使用しない、組換え核酸（たとえば発現プラスミド）の細胞（たとえば宿主細胞）内への移入をいう。組換え核酸がそれ内に導入されている細胞を「形質移入細胞」と呼ぶ。形質移入細胞は、組換えＡＡＶベクターを生成するための発現プラスミド／ベクターを含む宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞、Ｐｒｏ１０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）であり得る。一部の実施形態では、形質移入細胞（たとえばパッキング細胞）は、導入遺伝子（たとえばジストロフィン導入遺伝子）を含むプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにヘルパー遺伝子を含むプラスミドを含み得る。多くの形質移入技法が当分野で知られており、それだけには限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、陽イオン性または陰イオン性リポソーム、および核移行シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられる。
【0429】
本明細書中で使用する用語「形質導入」とは、ウイルスベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）による、細胞（たとえば標的細胞、たとえば筋肉細胞）への核酸（たとえばベクターゲノム）の移入をいう。一部の実施形態では、デュシェンヌ筋ジストロフィーの遺伝子療法は、ジストロフィンをコードしている修飾核酸またはその断片を含むベクターゲノムを、筋肉細胞内に形質導入することを含む。ウイルスまたはウイルスベクターによって導入遺伝子がそれ内に導入されている細胞を「形質導入細胞」と呼ぶ。一部の実施形態では、形質導入細胞は単離した細胞であり、形質導入はｅｘ ｖｉｖｏで起こる。一部の実施形態では、形質導入細胞は生物（たとえば対象）内の細胞であり、形質導入はｉｎ ｖｉｖｏで起こる。形質導入細胞は、生物の標的細胞がポリヌクレオチド（たとえば導入遺伝子、たとえばジストロフィンをコードしている修飾核酸またはその断片）を発現するように組換えＡＡＶベクターによって形質導入した生物の標的細胞であり得る。
【0430】
形質導入し得る細胞としては、任意の組織もしくは臓器種、または任意の起源（たとえば、中胚葉、外胚葉、もしくは内胚葉）の細胞が挙げられる。細胞の非限定的な例としては、肝臓（たとえば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（たとえば、ベータ島細胞、外分泌）、肺、脳（たとえば、神経もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎などの中枢または末梢神経系、腎臓、眼（たとえば網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心性）、筋肉または腰筋、腸（たとえば内分泌）、脂肪組織（白色、褐色、またはベージュ）、筋肉（たとえば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、あるいは造血（たとえば血液またはリンパ）細胞が挙げられる。さらなる例としては、肝臓（たとえば、肝細胞、類洞内皮細胞）、膵臓（たとえば、ベータ島細胞、外分泌細胞）、肺、脳（たとえば、神経もしくは上衣細胞、オリゴデンドロサイト）または脊椎などの中枢または末梢神経系、腎臓、眼（たとえば網膜）、脾臓、皮膚、胸腺、精巣、肺、横隔膜、心臓（心性）、筋肉または腰筋、腸（たとえば内分泌）、脂肪組織（白色、褐色、またはベージュ）、筋肉（たとえば、線維芽細胞、筋細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、唾液腺細胞、内耳神経細胞、あるいは造血（たとえば血液またはリンパ）細胞へと発生または分化する、多能性または多分化能前駆細胞などの幹細胞が挙げられる。
【0431】
一部の実施形態では、組織または臓器（たとえば筋肉）の特定の領域を、組織または臓器に投与する投与ｒＡＡＶベクター（たとえば、ジストロフィンまたはジストロフィンの一部分の導入遺伝子を有するｒＡＡＶベクター）によって形質導入し得る。一部の実施形態では、筋肉細胞を、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを用いて形質導入する。一部の実施形態では、骨格筋細胞を、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを用いて形質導入する。一部の実施形態では、心筋細胞を、ジストロフィン導入遺伝子を含むｒＡＡＶを用いて形質導入する。
【0432】
本明細書中で使用する用語「ベクター」とは、核酸（たとえば組換え核酸）の挿入または取り込みによって操作することができる、プラスミド、ウイルス（たとえばｒＡＡＶ）、コスミド、または他のビヒクルをいう。ベクターは、たとえば、遺伝子操作（たとえばベクターのクローニング）、核酸を細胞内に導入／移入するため、挿入した核酸を細胞中で転写または翻訳するためを含む、様々な目的のために使用することができる。一部の実施形態では、ベクター核酸配列は、少なくとも細胞中での増殖のための複製起点を含有する。一部の実施形態では、ベクター核酸は、異種核酸配列、発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（たとえば抗生物質耐性）、ポリ－アデノシン（ポリＡ）配列、および／またはＩＴＲを含む。一部の実施形態では、宿主細胞に送達した際、核酸配列が増殖される。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達した際、細胞は、異種核酸配列によってコードされているポリペプチド発現する。一部の実施形態では、宿主細胞に送達した際、核酸配列または核酸配列の一部分がカプシド内にパッケージングされる。宿主細胞は単離した細胞または宿主生物内の細胞であり得る。ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸配列（たとえば導入遺伝子）に加えて、付加配列（たとえば調節配列）が同じベクター内に（すなわち遺伝子に対してｃｉｓで）、遺伝子に隣接して存在し得る。一部の実施形態では、調節配列は、ｔｒａｎｓで作用して遺伝子の発現を調節する別の（たとえば第２の）ベクター上に存在し得る。プラスミドベクターは本明細書中で「発現ベクター」と呼び得る。
【0433】
本明細書中で使用する用語「ベクターゲノム」とは、ＡＡＶカプシド中にパッケージング／カプシド形成されてｒＡＡＶベクターを形成する核酸をいう。典型的には、ベクターゲノムは、異種ポリヌクレオチド配列（たとえば、導入遺伝子、調節要素など）および少なくとも１つのＩＴＲを含む。組換えベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）を構築または製造するために組換えプラスミドを使用する場合では、ベクターゲノムは、プラスミド全体を含むのではなく、ウイルスベクターによる送達を意図する配列のみを含む。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分を「プラスミド主鎖」と呼び、これは、組換えウイルスベクター生成の増殖に必要なプロセスであるプラスミドのクローニング、選択、および増幅に重要であるが、それ自体はｒＡＡＶベクター内にパッケージングまたはカプシド形成されない。典型的には、プラスミド主鎖から切断された際にカプシド内にパッケージングされるように、カプシド内にパッケージングしようとする異種配列にはＩＴＲが隣接する。
【0434】
本明細書中で使用する用語「ウイルスベクター」とは、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能し、ウイルス粒子内にパッケージングされたベクターゲノム（たとえば、野生型ｒｅｐおよびｃａｐを置き換えた導入遺伝子を含む）を含む、ウイルス粒子（すなわちカプシド）をいい、ＡＡＶ血清型および変異体（たとえばｒＡＡＶベクター）を含むたとえば、レンチおよびパルボウイルスが挙げられる。本明細書中の他の箇所に記載されているように、組換えウイルスベクターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有するウイルスゲノムを含まない。むしろ、これらの配列は、ベクターゲノムが目的の導入遺伝子を保有するための容量を提供するために除去されている。
【0435】
本開示は、ｒＡＡＶベクター（たとえばフルｒＡＡＶベクター）を宿主細胞回収物から精製する方法を提供する。具体的には、本開示は、ｒＡＡＶベクター（たとえばフルｒＡＡＶベクター）を、宿主細胞によって生成された他の核酸およびタンパク質（空カプシドを含む）から精製する方法を提供する。さらに、本開示は、空カプシドをフルｒＡＡＶベクター（たとえばベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクター）から分離する方法を提供する。本開示のこれらの態様のそれぞれは、続くセクション中で詳述されている。
【0436】
２．ＡＡＶおよびｒＡＡＶベクター
ＡＡＶ
上述のように、「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」とは、直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスおよびその変異体をいう。この用語は、そうでないことが必要な場合以外は、すべての亜型ならびに天然に存在するおよび組換え形態の両方を網羅する。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に貫入して核酸（たとえば導入遺伝子）を核内に導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。一部の実施形態では、導入した核酸（たとえばｒＡＡＶベクターゲノム）は、形質導入細胞の核中でエピソームとして存続する環状のコンカテマーを形成する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム中の特異的部位、たとえばヒト染色体１９上の部位に挿入される。部位特異的な組込みは、ランダムな組込みとは対照的に、予測可能な長期的発現プロファイルをもたらす可能性が高いと考えられている。ヒトゲノム内へのＡＡＶの挿入部位はＡＡＶＳ１と呼ばれる。細胞内に導入された後、核酸によってコードされているポリペプチドは細胞によって発現させることができる。ＡＡＶはヒトにおけるいかなる病原性疾患にも関連していないため、ＡＡＶによって送達された核酸は、ヒト対象において疾患、障害、および／または状態の処置のための治療的ポリペプチド発現させるために使用することができる。
ＡＡＶ
上述のように、「アデノ随伴ウイルス」および／または「ＡＡＶ」とは、直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスおよびその変異体をいう。この用語は、そうでないことが必要な場合以外は、すべての亜型ならびに天然に存在するおよび組換え形態の両方を網羅する。ＡＡＶを含むパルボウイルスは、細胞に貫入して核酸（たとえば導入遺伝子）を核内に導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。一部の実施形態では、導入した核酸（たとえばｒＡＡＶベクターゲノム）は、形質導入細胞の核中でエピソームとして存続する環状のコンカテマーを形成する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、宿主細胞ゲノム中の特異的部位、たとえばヒト染色体１９上の部位に挿入される。部位特異的な組込みは、ランダムな組込みとは対照的に、予測可能な長期的発現プロファイルをもたらす可能性が高いと考えられている。ヒトゲノム内へのＡＡＶの挿入部位はＡＡＶＳ１と呼ばれる。細胞内に導入された後、核酸によってコードされているポリペプチドは細胞によって発現させることができる。ＡＡＶはヒトにおけるいかなる病原性疾患にも関連していないため、ＡＡＶによって送達された核酸は、ヒト対象において疾患、障害、および／または状態の処置のための治療的ポリペプチド発現させるために使用することができる。
【0437】
ＡＡＶの複数の血清型が自然において存在し、少なくとも１５個の野生型血清型がこれまでにヒトから同定されている（すなわちＡＡＶ１～ＡＡＶ１５）。天然に存在するおよび変異体の血清型は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に明確に異なるタンパク質カプシドを有することによって区別される。多数のあるもののうち、とりわけ、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３Ａ型（ＡＡＶ３Ａ）やＡＡＶ３Ｂ型（ＡＡＶ３Ｂ）を含むＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０号を参照）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに、ＡＡＶ２ｉ８型（ＡＡＶ２ｉ８）、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＲＨＭ４－１と呼ばれる変異体などの、組換え生成した変異体（たとえば、挿入、欠失、および置換を有するカプシド変異体など）がある。ヒトＣＤ３４＋細胞から単離したＡＡＶ変異体としては、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５が挙げられる（Ｓｍｉｔｈら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（９）：１６２５～１６３４）。
【0438】
「霊長類ＡＡＶ」とは霊長類に感染するＡＡＶをいい、「非霊長類ＡＡＶ」とは非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶをいい、「ウシ科動物ＡＡＶ」とはウシ科哺乳動物に感染するＡＡＶをいい、他も同様である。血清型が明確に異なることは、別のＡＡＶと比較した、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の相違は、通常は、カプシドタンパク質配列および抗原決定基中の相違が原因である（たとえば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３配列の相違）。しかし、一部の天然に存在するＡＡＶまたは人工ＡＡＶ突然変異体（たとえば組換えＡＡＶ）は、現在知られている血清型のいずれとも血清学的の相違を示さない場合がある。その場合、これらのウイルスは対応する型の亜群、またはより単純に変異体ＡＡＶとみなし得る。したがって、本明細書中で使用する用語「血清型」とは、血清学的に明確に異なるウイルス、たとえばＡＡＶ、および血清学的に明確に異ならないが、所定の血清型の亜群または変異体内にあり得るウイルス、たとえばＡＡＶをどちらもいう。
【0439】
既知のＡＡＶ血清型のカプシドのアミノ酸配列の包括的なリストおよびアラインメントは、Ｍａｒｓｉｃら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００～１９０９によって、特に補足の図１に提供されている。
【0440】
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＩＴＲ）、ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当分野で知られている。そのような配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベース中に見つけ得る。たとえば、その開示が本明細書中に参考として組み込まれている、受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４（ＡＡＶ６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ８）、ＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）、ＡＹ６３１９６５（ＡＡＶ１０）、ＡＹ６３１９６６（ＡＡＶ１１）、およびＤＱ８１３６４７（ＡＡＶ１２）を参照されたい。また、たとえば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９、Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５８：９２１、Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５～３８３、国際公開公報ＷＯ００／２８０６１号、ＷＯ９９／６１６０１号、ＷＯ９８／１１２４４号、ＷＯ２０１３／０６３３７９号、ＷＯ２０１４／１９４１３２号、ＷＯ２０１５／１２１５０１号、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および米国特許第７，９０６，１１１号も参照されたい。例示目的のみのために、野生型ＡＡＶ２は、重複する配列を有する３つのタンパク質から構成される、ＡＡＶの小さな（２０～２５ｎｍの）正二十面体のウイルスカプシドを含む（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３。合計６０個のカプシドタンパク質がＡＡＶカプシドを構成する）。タンパク質ＶＰ１（７３５個のアミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７８０）、ＶＰ２（５９８個のアミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７８）、およびＶＰ３（５３３個のアミノ酸、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ０３７７９）は、カプシド中で約１：１：１０の比で存在する。すなわち、ＡＡＶでは、ＶＰ１が完全長タンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１に対してＮ末端の切断が増加している、ＶＰ１の進行的により短いバージョンである。本明細書中に開示した方法の一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは配列番号１１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９ ＶＰ１を含む。
【0441】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
上述のように、「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」は、ウイルスゲノムの全部または一部の、非ネイティブ配列での置換えによって、野生型ＡＡＶから区別される。ウイルス内への非ネイティブ配列の取り込みが、ウイルスベクターを「組換え」ベクター、それ故「ｒＡＡＶベクター」として定義する。ｒＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチド（たとえば、ジストロフィンポリペプチドまたはその断片、たとえば配列番号２）をコードしている、異種ポリヌクレオチド（たとえば、ヒトミニジストロフィンをコードしているヒトコドン最適化遺伝子、たとえば配列番号１）を含むことができる。組換えベクター配列をＡＡＶカプシド内にカプシド形成またはパッケージングしてよく、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、または単に「ｒＡＡＶ」と呼ぶ。
上述のように、「組換えアデノ随伴ウイルス」または「ｒＡＡＶ」は、ウイルスゲノムの全部または一部の、非ネイティブ配列での置換えによって、野生型ＡＡＶから区別される。ウイルス内への非ネイティブ配列の取り込みが、ウイルスベクターを「組換え」ベクター、それ故「ｒＡＡＶベクター」として定義する。ｒＡＡＶベクターは、所望のタンパク質またはポリペプチド（たとえば、ジストロフィンポリペプチドまたはその断片、たとえば配列番号２）をコードしている、異種ポリヌクレオチド（たとえば、ヒトミニジストロフィンをコードしているヒトコドン最適化遺伝子、たとえば配列番号１）を含むことができる。組換えベクター配列をＡＡＶカプシド内にカプシド形成またはパッケージングしてよく、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター粒子」、「ｒＡＡＶウイルス粒子」、または単に「ｒＡＡＶ」と呼ぶ。
【0442】
本開示は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（たとえばＡＡＶに異種のポリヌクレオチド）を含むｒＡＡＶベクターを精製する方法を提供する。異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つ、場合によっては２つのＡＡＶ末端リピート配列（たとえば逆方向末端反復（ＩＴＲ））が隣接していてよい。ＩＴＲが隣接する異種ポリヌクレオチドは、本明細書中で「ベクターゲノム」とも呼び、典型的には、治療処置の標的（たとえば、デュシェンヌ筋ジストロフィーの処置のための、ジストロフィンをコードしている核酸またはその断片）などの、目的のポリペプチドまたは目的の遺伝子（「ＧＯＩ」）をコードしている。ｒＡＡＶベクターの対象（たとえば患者）への送達または投与は、コードされているタンパク質およびペプチドを対象に提供する。したがって、ｒＡＡＶベクターは、たとえば様々な疾患、障害、および状態を処置するために発現させるために、異種ポリヌクレオチドを移入／送達するために使用することができる。
【0443】
ｒＡＡＶベクターゲノムは、一般に、１４５塩基のＩＴＲを、ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を置き換える異種核酸配列に対してｃｉｓで保持する。そのようなＩＴＲは、組換えＡＡＶベクターを生成するために必要であるが、部分的または完全に合成の配列を含む修飾ＡＡＶ ＩＴＲおよび非ＡＡＶ末端反復もこの目的を果たすことができる。ＩＴＲはヘアピン構造を形成し、たとえば、感染後の相補的ＤＮＡ鎖の宿主細胞媒介性合成のためのプライマーとして役立つよう機能する。ＩＴＲはまた、ウイルスのパッケージング、組込みなどにおいても役割を果たす。ＩＴＲは、ｒＡＡＶベクター内へのＡＡＶゲノム複製およびパッケージングにｃｉｓで必要な、唯一のＡＡＶウイルス要素である。ｒＡＡＶベクターゲノムは、異種配列（たとえば、それだけには限定されないが、多数あるもののうち、とりわけ、アンチセンス、およびｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子を含む、目的の遺伝子または目的の核酸配列をコードしている導入遺伝子）を含むベクターゲノムの５’および３’末端に一般にある、２つのＩＴＲを含んでいてもよい。５’および３’ＩＴＲはどちらも同じ配列を含み得るか、またはそれぞれが異なる配列を含み得る。ＡＡＶ ＩＴＲは、それだけには限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１、または任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶからであり得る。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム複製およびパッケージングを媒介する配列である。
【0444】
本開示のｒＡＡＶベクターは、カプシドの血清型（たとえばＡＡＶ９または他のもの）とは異なるＡＡＶ血清型（たとえば、野生型ＡＡＶ２、その断片または変異体）からのＩＴＲを含み得る。１つの血清型からの少なくとも１つのＩＴＲを含むが、異なる血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含む、そのようなｒＡＡＶベクターは、ハイブリッドウイルスベクターと呼び得る（米国特許第７，１７２，８９３号を参照）。ＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列全体を含み得る、またはその変異体、断片、もしくは修飾体であり得るが、機能性を保持する。
【0445】
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ベクターゲノムの左および右末端（すなわちそれぞれ５’および３’末端）に位置するＩＴＲを含む（たとえば、ＡＡＶ２からのＩＴＲであるが、任意の野生型ＡＡＶ血清型からのＩＴＲ、またはその変異体を含むことができる）。一部の実施形態では、左（たとえば５’）のＩＴＲは、配列番号７または配列番号８の核酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、左（たとえば５’）のＩＴＲは、配列番号７または配列番号８と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、右（たとえば３’）のＩＴＲは、配列番号７または配列番号８の核酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、右（たとえば３’）のＩＴＲは、配列番号７または配列番号８と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。それぞれのＩＴＲは、ｃｉｓであるが、ジストロフィンをコードしている修飾核酸またはその断片および調節要素を含む組換え核酸などの可変長の核酸配列によって、互いにまたはベクターゲノム中の他の要素から分離されていてよい。一部の実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲまたはその変異体であり、ジストロフィン導入遺伝子に隣接している。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（たとえば、配列番号７または配列番号８に記載の配列を有するＩＴＲ）が隣接するジストロフィン導入遺伝子（たとえば配列番号１の核酸配列を含む）を含む。
【0446】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは直鎖状の一本鎖であり、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する。異種遺伝子の転写および翻訳の前に、およそ４７００個のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡゲノムは、第２の鎖の合成を開始させるために、自己プライミングＩＴＲのうちの１つの遊離３’－ＯＨを使用して、ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば形質導入細胞内のＤＮＡポリメラーゼ）によって二本鎖形態へと変換しなければならない。一部の実施形態では、完全長一本鎖ベクターゲノム（すなわちセンスおよびアンチセンス）は、アニーリングして完全長二本鎖ベクターゲノムを生じる。これは、逆の極性（すなわちセンスまたはアンチセンス）のゲノムを保有する複数のｒＡＡＶベクターを、同じ細胞に同時に形質導入した場合に起こり得る。これらがどのように生成されるかにかかわらず、二本鎖ベクターゲノムが形成された後、細胞は二本鎖ＤＮＡを転写および翻訳し、異種遺伝子を発現することができる。
【0447】
ｒＡＡＶベクターからの導入遺伝子の発現の効率は、発現前に一本鎖ｒＡＡＶゲノム（ｓｓＡＡＶ）を二本鎖ＤＮＡへと変換する必要性によって妨げられる可能性がある。このステップは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム間の塩基対合を必要とせずに二本鎖ＤＮＡへと折り畳まれることができる逆方向反復ゲノムをパッケージングすることができる自己相補的ＡＡＶゲノム（ｓｃＡＡＶ）を使用することによって、回避される（ＭｃＣａｒｔｙ、（２００８）Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１０）：１６４８～１６５６、ＭｃＣａｒｔｙら、（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１２４８～１２５４、ＭｃＣａｒｔｙら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２１１２～２１１８）。ｓｃＡＡＶベクターの制限は、カプシド中にパッケージングしようとするユニークな導入遺伝子、調節要素、およびＩＴＲのサイズが、ｓｓＡＡＶベクターゲノム（すなわち、２つのＩＴＲを含めて約４，９００個のヌクレオチド）の約半分のサイズであることである（すなわち、約２，５００個のヌクレオチドであり、そのうち、２，２００個のヌクレオチドが導入遺伝子および調節要素であり、それに加えて２コピーの約１４５個のヌクレオチドのＩＴＲであり得る）。
【0448】
ｓｃＡＡＶベクターゲノムは、発現プラスミドの１つのｒＡＡＶ ＩＴＲから末端分離部位（ＴＲＳ）を欠失させ、それによってその末端からの複製の開始を防止することによって、作製される（米国特許第８，７８４，７９９号を参照）。宿主細胞内でのＡＡＶ複製はゲノムの野生型ＩＴＲで開始され、末端分離を有さない突然変異ＩＴＲを通って継続し、その後、ゲノム全体を戻って、二量体を作製する。二量体は、突然変異ＩＴＲが中央にあり、両端に野生型ＩＴＲがある、自己相補的ゲノムである。一部の実施形態では、ＴＲＳが欠失した突然変異ＩＴＲはベクターゲノムの５’末端にある。一部の実施形態では、ＴＲＳが欠失した突然変異ＩＴＲはベクターゲノムの３’末端にある。一部の実施形態では、突然変異ＩＴＲは配列番号１３または配列番号１４の核酸配列を含む。
【0449】
理論に束縛されることを望まずに、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分は相補的である一方で、塩基の多くが内部のカプシド殻のアミノ酸残基と接触しており、リン酸主鎖が中心に向かって隔離されているため、カプシド内で実質的な塩基対合が存在する可能性は低い（ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１６（１０）：１６４８～１６５６）。脱外被の際に、ｓｃＡＡＶゲノムの２つの半分がアニーリングして、一方の端に共有的に閉じたＩＴＲを有し、他方に２つの開放型のＩＴＲを有するｄｓＤＮＡヘアピン分子を形成する可能性が高い。ＩＴＲは、とりわけ導入遺伝子およびそれにｃｉｓの調節要素をコードしている二本鎖領域に隣接する。
【0450】
ｒＡＡＶベクターのウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶ、または、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４（ＷＯ２０１６／２１０１７０号を参照）、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＲＨＭ４－１（ＷＯ２０１５／０１３３１３号の配列番号５）、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２９Ｇ、ＡＡＶ２．８Ｇ９、ＡＶＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、トリＡＡＶ、ウシ科動物ＡＡＶ、イヌ科動物ＡＡＶ、ウマ科動物ＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、およびその変異体などの変異体ＡＡＶからであり得る（たとえば、Ｆｉｅｌｄｓら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））を参照。カプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号、Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７８：６３８１、Ｍｏｒｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌ． ３３：３７５、ＷＯ２０１３／０６３３７９号、ＷＯ２０１４／１９４１３２号中に開示されているいくつかのＡＡＶ血清型に由来していてよく、ＷＯ２０１５／１２１５０１号中に開示されている真型ＡＡＶ（ＡＡＶ－ＴＴ）変異体、ならびにＷＯ２０１５／０１３３１３号中に開示されているＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１からＲＨＭ１５－６、およびその変異体が挙げられる。また、カプシドは、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５を含む、ヒトＣＤ３４＋細胞から単離したＡＡＶ変異体にも由来し得る（Ｓｍｉｔｈら（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（９）：１６２５～１６３４）。当業者は、同じまたは同様の機能を行う、未だ同定されていない他のＡＡＶ変異体が恐らく存在することを知っているであろう。ＡＡＶ ｃａｐタンパク質のフル補体としては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が挙げられる。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、フル補体ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質に満たないものを含み得る、またはＡＡＶ ｃａｐタンパク質のフル補体を提供し得る。
【0451】
別の実施形態では、本開示は、治療的ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法における使用のための、先祖ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ由来の配列を新規で合成し、生物活性のために特徴づけ得る。ｒＡＡＶベクター内へのアセンブリに加えて、先祖配列の予測および合成は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２０１５／０５４６５３号中に記載されている方法を使用して達成し得る。とりわけ、先祖ウイルス配列からアセンブリしたｒＡＡＶベクターは、現代のウイルスまたはその一部分と比較して、ヒト集団における既存の免疫に対して低下した感受性を示し得る。
【0452】
一部の実施形態では、複数のＡＡＶ血清型（たとえば、野生型ＡＡＶ血清型、変異体ＡＡＶ血清型）に由来するヌクレオチド配列によってコードされているカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶベクターは、「キメラベクター」または「キメラカプシド」と呼ばれる（その開示全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，４９１，９０７号を参照）。一部の実施形態では、キメラカプシドタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのＡＡＶ血清型に由来する核酸配列によってコードされている。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２ｉ８、またはその変異体に由来するカプシド配列を含み、その結果、前述のＡＡＶ血清型のうちの任意のものからのアミノ酸の組合せを含むキメラカプシドタンパク質をもたらす（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（２）：７９１～８０１を参照）。あるいは、キメラカプシドは、１つの血清型からのＶＰ１、異なる血清型からのＶＰ２、さらに異なる血清型からのＶＰ３、およびその組合せの混合物を含むことができる。たとえば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ ｃａｐタンパク質またはサブユニットおよび少なくとも１つのＡＡＶ２ ｃａｐタンパク質またはサブユニットを含み得る。キメラカプシドは、たとえば、１つまたは複数のＢ１９ ｃａｐサブユニットを有するＡＡＶカプシドを含むことができ、たとえば、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質またはサブユニットを、Ｂ１９ ｃａｐタンパク質またはサブユニットによって置き換えることができる。たとえば、一実施形態では、ＡＡＶカプシドのＶＰ３サブユニットをＢ１９のＶＰ２サブユニットによって置き換えることができる。
【0453】
一部の実施形態では、キメラベクターは、変更された指向性または特定の組織もしくは細胞種に対する指向性を示すように操作されている。用語「指向性」とは、ウイルスの特定の細胞もしくは組織型内への優先的な侵入、および／または、特定の細胞もしくは組織型内への侵入を容易にする、細胞表面との優先的な相互作用をいう。ＡＡＶの指向性は、明確に異なるウイルスカプシドタンパク質とその同族細胞受容体との間の特異的相互作用によって一般に決定される（Ｌｙｋｋｅｎら（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖ．Ｄｉｓｏｒｄ． １０：１６）。好ましくは、ウイルスまたはウイルスベクターが細胞内に入った後、ベクターゲノム（たとえばｒＡＡＶベクターゲノム）によって保有される配列（たとえば導入遺伝子などの異種配列）が発現される。
【0454】
「指向性プロファイル」とは、１つまたは複数の標的細胞、組織、および／または臓器の形質導入のパターンをいう。たとえば、ＡＡＶカプシドは、筋肉細胞の形質導入は効率的であり、たとえば脳細胞の形質導入は低いだけであることによって特徴づけられた指向性プロファイルを有し得る。
【0455】
３．組換え核酸
本開示の方法は、修飾核酸ならびに修飾核酸を含むプラスミドおよびベクターゲノムを含めた組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターの精製を含む。組換え核酸、プラスミド、またはベクターゲノムは、増殖をモジュレートする（たとえばプラスミドの）および／または修飾核酸（たとえば導入遺伝子）の発現を制御するための調節配列を含み得る。また、組換え核酸はウイルスベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）の構成成分としても提供し得る。一般に、ウイルスベクターは、カプシド中にパッケージングされた組換え核酸を含むベクターゲノムを含む。
本開示の方法は、修飾核酸ならびに修飾核酸を含むプラスミドおよびベクターゲノムを含めた組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターの精製を含む。組換え核酸、プラスミド、またはベクターゲノムは、増殖をモジュレートする（たとえばプラスミドの）および／または修飾核酸（たとえば導入遺伝子）の発現を制御するための調節配列を含み得る。また、組換え核酸はウイルスベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）の構成成分としても提供し得る。一般に、ウイルスベクターは、カプシド中にパッケージングされた組換え核酸を含むベクターゲノムを含む。
【0456】
修飾核酸
遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチド（たとえば導入遺伝子）の修飾形態または変異体形態とは、参照配列から逸脱した核酸をいう。参照配列は天然に存在する野生型配列（たとえば遺伝子）であってよく、天然に存在する変異体（たとえば、スプライス変異体、代替リーディングフレーム）を含み得る。当業者は、参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）などの公的に利用可能なデータベース中に見つけることができることを認識している。修飾／変異体核酸は、参照配列と比較して実質的に同じ、より高い、またはより低い活性、機能、または発現を有し得る。好ましくは、本明細書中で互換性があるように使用される、修飾または変異体核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、たとえば、それによってコードされているタンパク質は、細胞中における、内在性遺伝子（たとえば、野生型遺伝子、突然変異遺伝子）によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、それ以外は同一である細胞中において、検出可能により高いレベルで発現される。一部の実施形態では、本明細書中で互換性があるように使用される、修飾または変異体核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、たとえば、それによってコードされているタンパク質は、細胞中における、突然変異を含む内在性遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、それ以外は同一である細胞中において、検出可能により高いレベルで発現される。
遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチド（たとえば導入遺伝子）の修飾形態または変異体形態とは、参照配列から逸脱した核酸をいう。参照配列は天然に存在する野生型配列（たとえば遺伝子）であってよく、天然に存在する変異体（たとえば、スプライス変異体、代替リーディングフレーム）を含み得る。当業者は、参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）などの公的に利用可能なデータベース中に見つけることができることを認識している。修飾／変異体核酸は、参照配列と比較して実質的に同じ、より高い、またはより低い活性、機能、または発現を有し得る。好ましくは、本明細書中で互換性があるように使用される、修飾または変異体核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、たとえば、それによってコードされているタンパク質は、細胞中における、内在性遺伝子（たとえば、野生型遺伝子、突然変異遺伝子）によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、それ以外は同一である細胞中において、検出可能により高いレベルで発現される。一部の実施形態では、本明細書中で互換性があるように使用される、修飾または変異体核酸は、改善されたタンパク質発現を示し、たとえば、それによってコードされているタンパク質は、細胞中における、突然変異を含む内在性遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、それ以外は同一である細胞中において、検出可能により高いレベルで発現される。
【0457】
核酸に対する修飾としては、参照配列の、１つまたは複数のヌクレオチド置換（たとえば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個、またはそれより多くのヌクレオチドの置換）、付加（たとえば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個、またはそれより多くのヌクレオチドの挿入）、欠失（たとえば、１～３、３～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００個、またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、モチーフ、ドメイン、断片などの欠失）が挙げられる。修飾核酸は、参照配列と約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であり得る。
【0458】
修飾核酸は、参照ポリペプチドと約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしていてよい。一部の実施形態では、修飾核酸は、参照ポリペプチドと１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしている。
【0459】
一部の実施形態では、修飾核酸（たとえば導入遺伝子）は野生型タンパク質をコードしている。そのような修飾核酸はコドン最適化されていてよい。本明細書中で互換性があるようにいう「最適化された」または「コドン最適化された」とは、たとえば、稀なコドンの使用を最小限にすること、ＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させること、潜在性スプライスドナーまたはアクセプター部位を除去すること、コザック配列を除去すること、リボソーム進入部位を除去することなどによって、ポリペプチドの発現を増加させるために、野生型コード配列または参照配列（たとえば、ミニジストロフィンポリペプチドのコード配列、たとえば配列番号２、銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅポリペプチドのコード配列、たとえば配列番号１５）と比較して最適化されているコード配列をいう。一部の実施形態では、コドン最適化配列からのタンパク質の発現レベルは、それ以外は同一である細胞中における、野生型遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して、増加している。一部の実施形態では、コドン最適化配列からのタンパク質の発現レベルは、それ以外は同一である細胞中における、野生型遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して、増加していない（たとえば発現が実質的に同様である）。一部の実施形態では、コドン最適化配列からのタンパク質の発現レベルは、それ以外は同一である細胞中における、突然変異遺伝子からのタンパク質の発現レベルと比較して、増加している。
【0460】
修飾の例としては、１つまたは複数のｃｉｓ作用性モチーフの排除および１つまたは複数のコザック配列の導入が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数のｃｉｓ作用性モチーフが排除され、１つまたは複数のコザック配列が導入される。
【0461】
排除し得るｃｉｓ作用性モチーフの例としては、内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、ＡＲＥ、ＩＮＳ、および／またはＣＲＳ配列要素、リピート配列および／またはＲＮＡ二次構造、（潜在性）スプライスドナーおよび／またはアクセプター部位、分岐点、ならびに制限部位が挙げられる。
【0462】
一部の実施形態では、修飾核酸は、修飾または変異体ポリペプチドをコードしている。修飾核酸によってコードされている修飾ポリペプチド（たとえばコドン最適化されたミニジストロフィン）は、野生型のコードまたは参照配列によってコードされているポリペプチドの機能または活性のすべてまたは一部を保持し得る。一部の実施形態では、修飾ポリペプチドは１つまたは複数の非保存的または保存的なアミノ酸変化を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドの機能において役割が限定的であるまたは役割を果たさないことが実証されている特定のドメインは、修飾ポリペプチド中に存在しない（たとえば特定の結合ドメイン）（たとえばＷＯ２０１６／０９７２１９号）。ｒＡＡＶベクター中の修飾核酸は、ｒＡＡＶカプシドのパッケージング容量が原因で、野生型のコードまたは参照配列よりも少ないヌクレオチドを含んでいてよく（たとえば、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、短縮されたミニジストロフィン導入遺伝子、ＷＯ２００１／８３６９５号を参照、Ｂドメインが欠失したヒト因子ＶＩＩＩ導入遺伝子、ＷＯ２０１７／０７４５２６号を参照）、また、切断およびコドン最適化の両方がされた、短縮された導入遺伝子を含んでいてよい（たとえば、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、ＷＯ２０１７／２２１１４５号に記載されているコドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子、金属結合部位（ＭＢＳ）１～４が欠失している銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２、ＷＯ２０１６／０９７２１９号およびＷＯ２０１６／０９７２１８号を参照）。一部の実施形態では、修飾核酸によってコードされているポリペプチドは、参照配列によってコードされているポリペプチドよりも少ない、同じ、または多いが、少なくとも一部の機能または活性を有する。
【0463】
修飾核酸は、参照および／または野生型配列と比較して、改変されたＧＣ含有率（たとえば、核酸配列中に存在するＧおよびＣヌクレオチドの数）、改変された（たとえば増加もしくは減少した）ＣｐＧジヌクレオチド含有率、ならびに／または改変された（たとえば増加もしくは減少した）コドン適応指標（ＣＡＩ）を有し得る。たとえば、ＷＯ２０１７／０７７４５１号を参照されたい（最適化のために核酸配列を分析するための公的に利用可能なソフトウェアを含む、目的の核酸配列のコドン最適化のための、当分野で周知の様々な考慮事項を記述している）。本明細書中で使用する修飾とは、特定の値、量、または効果の減少または増加をいう。
【0464】
一部の実施形態では、本開示の修飾核酸配列のＧＣ含有率は、参照および／または野生型の遺伝子またはコード配列と比較して増加している。修飾核酸のＧＣ含有率は、野生型コード配列のＧＣ含有率よりも少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％高い。一部の実施形態では、ＧＣ含有率は、配列中のＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）ヌクレオチドの百分率として表す。
【0465】
一部の実施形態では、本開示の修飾核酸配列のコドン適応指標は、少なくとも０．７４、少なくとも０．７６、少なくとも０．７７、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．８６、少なくとも０．８７、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５、または少なくとも０．９８である。
【0466】
一部の実施形態では、本開示の修飾核酸配列は、ＣｐＧジヌクレオチドのレベルが低下しており、低下は、野生型または参照核酸配列と比較して約１０％、２０％、３０％、５０％、またはそれより多くである。一部の実施形態では、修飾核酸は、参照配列（たとえば野生型配列）よりも１～５個少ない、５～１０個少ない、１０～１５個少ない、１５～２０個少ない、２０～２５個少ない、２５～３０個少ない、３０～４０個少ない、４０～４５個少ない、もしくは４５～５０個少ない、またはさらにより数が少ないジヌクレオチドを有する。
【0467】
ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が真核生物における遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが知られている。具体的には、真核生物中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、転写機構に干渉することを通じて遺伝子発現をサイレンシングするために本質的に役立つ。したがって、ＣｐＧモチーフのメチル化によって誘起される遺伝子サイレンシングが原因で、ＣｐＧジヌクレオチドの数が低下した核酸およびベクターは、高いかつ長期間持続する導入遺伝子の発現レベルを提供するであろう。
【0468】
修飾核酸配列は、発現ベクター内へのサブクローニングを容易にするために、隣接する制限部位を含み得る。多くのそのような制限部位が当分野で周知であり、それだけには限定されないが、ＡｖａＩ、ＳｗａＩ、ＡｐａＬ１、およびＸｍａＩが挙げられる。
【0469】
本開示は、ジストロフィンポリペプチドの機能的に活性のある断片をコードしている、配列番号１の修飾核酸を含む。「機能的に活性のある」または「機能的ジストロフィンポリペプチド」とは、断片が、完全長ジストロフィンポリペプチドと同じまたは同様の生物学的機能および／または活性を提供することを示す。すなわち、断片は、それだけには限定されないが筋線維の筋フィラメントの構造タンパク質を含むものと、同じ機能を提供する。ジストロフィンの機能的断片の生物活性は、デュシェンヌ筋ジストロフィーに関連している神経筋表現型を好転させる、または防止することを包含する。
【0470】
したがって、本発明の一実施形態は、ミニジストロフィンタンパク質をコードしている修飾核酸を含むｒＡＡＶベクターを精製する方法であって、核酸が、配列番号１の核酸配列またはそれに少なくとも約９０％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる方法に関する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ある特定の実施形態では、核酸は、ウイルスベクター、たとえばパルボウイルスベクター、たとえばｒＡＡＶベクターの容量以内である長さを有する。一部の実施形態では、核酸は、約５０００、４９００、４８００、４７００、４６００、４５００、４４００、４３００、４２００、４１００、もしくは約４０００個のヌクレオチド、またはそれより少ない。
【0471】
一部の実施形態では、ミニジストロフィンタンパク質をコードしている核酸は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【0472】
一部の実施形態では、銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２タンパク質をコードしている核酸は、配列番号１５のアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【0473】
一部の実施形態では、核酸（たとえば配列番号１）は、ジストロフィンタンパク質の生成のための組換え核酸の一部である。組換え核酸は、ジストロフィンの発現を増加させるために有用な調節要素をさらに含み得る。一部の実施形態では、核酸は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２タンパク質の生成のための組換え核酸の一部である。組換え核酸は、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２の発現を増加させるために有用な調節要素をさらに含み得る。
【0474】
調節要素
本開示の方法は、ポリペプチド（たとえばミニジストロフィン）および様々な調節または制御要素をコードしている修飾核酸を含む組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターの精製を含む。典型的には、調節要素は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を与える核酸配列である。遺伝子発現に有用な調節要素の正確な性質は、生物間および細胞種間で変動し、適正な異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳を容易にする意図で、たとえば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどが挙げられる。調節性制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性などのレベルで及ぼすことができる。典型的には、転写をモジュレートする調節性制御要素は、転写されたポリヌクレオチドの５’末端付近（すなわち上流）に並置されている。また、調節性制御要素は、転写された配列の３’末端（すなわち下流）または転写物内（たとえばイントロン中）に位置し得る。調節性制御要素は、転写された配列から一定距離（たとえば、１～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～５０００、５０００～１０，０００個、またはそれより多くのヌクレオチド）離れて位置することができる。しかし、ＡＡＶベクターゲノムの長さが原因で、調節性制御要素は、典型的にはポリヌクレオチドから１～１０００個のヌクレオチド以内である。
本開示の方法は、ポリペプチド（たとえばミニジストロフィン）および様々な調節または制御要素をコードしている修飾核酸を含む組換え核酸を含むｒＡＡＶベクターの精製を含む。典型的には、調節要素は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を与える核酸配列である。遺伝子発現に有用な調節要素の正確な性質は、生物間および細胞種間で変動し、適正な異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳を容易にする意図で、たとえば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなどが挙げられる。調節性制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性などのレベルで及ぼすことができる。典型的には、転写をモジュレートする調節性制御要素は、転写されたポリヌクレオチドの５’末端付近（すなわち上流）に並置されている。また、調節性制御要素は、転写された配列の３’末端（すなわち下流）または転写物内（たとえばイントロン中）に位置し得る。調節性制御要素は、転写された配列から一定距離（たとえば、１～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～５０００、５０００～１０，０００個、またはそれより多くのヌクレオチド）離れて位置することができる。しかし、ＡＡＶベクターゲノムの長さが原因で、調節性制御要素は、典型的にはポリヌクレオチドから１～１０００個のヌクレオチド以内である。
【0475】
プロモーター
本明細書中で使用する用語、「真核プロモーター」などの「プロモーター」とは、真核細胞（たとえば筋肉細胞）中において、特定の遺伝子、または１つもしくは複数のコード配列（たとえばミニジストロフィンコード配列）の転写を開始させるヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、他の調節要素または領域と一緒に働いて、遺伝子またはコード配列の転写のレベルを指揮することができる。これらの調節要素としては、たとえば、転写結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびに、たとえば、アテニュエーター、エンハンサー、およびサイレンサーを含めた、直接または間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが知られている他のヌクレオチド配列が挙げられる。プロモーターは、ほとんどの場合、同じ鎖上かつ転写開始部位付近に、それが作動可能に連結された遺伝子またはコード配列の５’側に位置する。プロモーターは、一般に１００～１０００個のヌクレオチドの長さである。プロモーターは、典型的には、プロモーターの非存在下における同じ遺伝子の発現と比較して、遺伝子発現を増加させる。
本明細書中で使用する用語、「真核プロモーター」などの「プロモーター」とは、真核細胞（たとえば筋肉細胞）中において、特定の遺伝子、または１つもしくは複数のコード配列（たとえばミニジストロフィンコード配列）の転写を開始させるヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、他の調節要素または領域と一緒に働いて、遺伝子またはコード配列の転写のレベルを指揮することができる。これらの調節要素としては、たとえば、転写結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびに、たとえば、アテニュエーター、エンハンサー、およびサイレンサーを含めた、直接または間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが知られている他のヌクレオチド配列が挙げられる。プロモーターは、ほとんどの場合、同じ鎖上かつ転写開始部位付近に、それが作動可能に連結された遺伝子またはコード配列の５’側に位置する。プロモーターは、一般に１００～１０００個のヌクレオチドの長さである。プロモーターは、典型的には、プロモーターの非存在下における同じ遺伝子の発現と比較して、遺伝子発現を増加させる。
【0476】
本明細書中で使用する「コアプロモーター」または「最小限のプロモーター」とは、転写を正しく開始させるために必要な、プロモーター配列の最小限の一部分をいう。これには、以下のうちの任意のものを挙げ得る：転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、および一般的な転写因子結合部位。プロモーターはまた、他の一次調節要素（たとえば、エンハンサー、サイレンサー、境界要素、インスレーター）を含有する近位プロモーター配列（コアプロモーターの５’側）、および遠位プロモーター配列（コアプロモーターの３’側）も含み得る。一部の実施形態では、コアまたは最小限のプロモーターは、配列番号１６の核酸を含むまたはそれからなっていてもよい、α１－抗トリプシンのコアまたは最小限のプロモーターである。
【0477】
適切なプロモーターの例としては、アデノウイルス主要後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの異種プロモーター、呼吸器合胞体ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどの誘導性プロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、α－１－抗トリプシンプロモーター、Ｂ型肝炎表面抗原プロモーター、トランスフェリンプロモーター、アポリポタンパク質Ａ－１プロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ＣＢＡプロモーターのハイブリッド形態（ＣＢｈプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルス初期エンハンサー要素およびプロモーター、第１エクソンと、ニワトリベータ－アクチン遺伝子第１イントロンと、ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら（２００８）ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：２）、クレアチンキナーゼプロモーター、ならびにヒトジストロフィン遺伝子プロモーターが挙げられる。
【0478】
一部の実施形態では、プロモーターは、クレアチニンキナーゼプロモーター、たとえば、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプロモーターである。
【0479】
本開示の一部の実施形態では、真核プロモーター配列（たとえばクレアチンキナーゼプロモーター）は、たとえばミニジストロフィンまたは銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２をコードしている修飾核酸と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号６の核酸配列を含むプロモーター（たとえばクレアチンキナーゼプロモーター）は、ミニジストロフィンをコードしている修飾核酸と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸配列を含むプロモーターは、配列番号１の核酸配列を含む核酸と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、配列番号１６の核酸配列を含むプロモーター（たとえばα１－抗トリプシンプロモーター）は、ＭＢＳ１～４（たとえば配列番号１５）が欠失した銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２をコードしている修飾核酸と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、配列番号１６の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸配列を含むプロモーターは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む核酸と作動可能に連結されている。
【0480】
一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含むプロモーターは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列と作動可能に連結されており、筋肉細胞中において、配列番号１の核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導する。
【0481】
プロモーターは、構成的、組織特異的、または調節性であり得る。構成的プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子が本質的に常時発現されることを引き起こすものである。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ほとんどの真核組織中において、ほとんどの生理的および発生的条件下において活性である。
【0482】
調節性プロモーターとは、活性化または不活性化ができるものである。調節性プロモーターは、通常は「オフ」であるが誘導して「オン」にし得る誘導性プロモーター、および通常は「オン」であるが「オフ」にし得る「抑制性」プロモーターを含む。多くの様々な調節因子が知られており、温度、ホルモン、サイトカイン、重金属、および調節タンパク質が挙げられる。区別は絶対的ではなく、構成的プロモーターは多くの場合、一定度合まで調節され得る。一部の場合では、内在性経路を利用して、たとえば、病的状態が改善した場合に自然に下方調節されるプロモーターを使用して、導入遺伝子の発現の調節を提供し得る。
【0483】
組織特異的プロモーターとは、特異的な種類の組織、細胞、または臓器中でのみ活性であるプロモーターである。典型的には、組織特異的プロモーターは、特定の組織、細胞、および／または臓器に対して特異的な転写アクチベーター要素によって認識される。たとえば、組織特異的プロモーターは、他の組織中においてよりも、１つまたはいくつかの特定の組織（たとえば、２、３、または４つ）中において、より活性であり得る。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターによってモジュレートされる遺伝子の発現は、他の組織中においてよりも、プロモーターが特異的である組織中において、はるかに高い。一部の実施形態では、それが特異的であるもの以外のすべての組織において、プロモーターの活性はわずか、または実質的に無活性であり得る。プロモーターは、肝細胞中において活性であるマウスアルブミンプロモーターまたはトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）などの、組織特異的プロモーターであり得る。組織特異的プロモーターの他の例としては、骨格α－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、骨格筋中における発現を誘導する筋肉クレアチンキナーゼをコードしている遺伝子からのプロモーターが挙げられる（Ｌｉら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：２４１～２４５）。肝臓特異的発現は、アルブミン遺伝子（Ｍｉｙａｔａｋｅら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：５１２４～５１３２）、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：１００２～１００９）、およびアルファ－フェトプロテイン（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ． ７：１５０３～１５１４）からのプロモーターを使用して誘導し得る。
【0484】
エンハンサー
別の態様では、治療的ポリペプチドをコードしている修飾核酸は、治療的ポリペプチドの発現を増加させるためのエンハンサーをさらに含む。典型的には、エンハンサー要素はプロモーター要素の上流に位置するが、下流または別の配列（たとえば導入遺伝子）内に位置する場合もある。エンハンサーは、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、またはより多く、修飾核酸の上流または下流に位置し得る。エンハンサーは、典型的には、修飾核酸（たとえば治療的ポリペプチドをコードしているもの）の発現を、プロモーター要素単独によって提供された発現の増加を超えて、増加させる。
別の態様では、治療的ポリペプチドをコードしている修飾核酸は、治療的ポリペプチドの発現を増加させるためのエンハンサーをさらに含む。典型的には、エンハンサー要素はプロモーター要素の上流に位置するが、下流または別の配列（たとえば導入遺伝子）内に位置する場合もある。エンハンサーは、１００個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、またはより多く、修飾核酸の上流または下流に位置し得る。エンハンサーは、典型的には、修飾核酸（たとえば治療的ポリペプチドをコードしているもの）の発現を、プロモーター要素単独によって提供された発現の増加を超えて、増加させる。
【0485】
多くのエンハンサーが当分野で知られており、それだけには限定されないが、サイトメガロウイルス主要前初期エンハンサーが挙げられる。より詳細には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＭＩＥプロモーターは３つの領域を含む：モジュレーター、ユニーク領域、およびエンハンサー（ＩｓｏｍｕｒａおよびＳｔｉｎｓｋｉ（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７７（６）：３６０２～３６１４）。ＣＭＶエンハンサー領域は、別のプロモーターまたはその一部分と一緒にしてハイブリッドプロモーターを形成して、それに作動可能に連結された核酸の発現をさらに増加させることができる。たとえば、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターまたはその一部分は、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーまたはその一部分と一緒にして、「ＣＢｈ」プロモーター（ニワトリベータ－アクチンハイブリッドプロモーターの略、Ｇｒａｙら（２０１１、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３～１１５３）に記載）と呼ばれるＣＢＡのバージョンを作製することができる。プロモーターと同様、エンハンサーは、構成的、組織特異的、または調節性であり得る。
【0486】
本開示の一部の実施形態では、調節要素は、筋肉特異的転写調節要素（ｈＣＫ）として役立ち、ミニジストロフィンをコードしている修飾核酸と作動可能に連結されている、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する合成ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターなどの、ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターを含む。一部の実施形態では、配列番号５の核酸配列を含む合成ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターは、ミニジストロフィンをコードしている修飾核酸と作動可能に連結されている。一部の実施形態では、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する合成ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターは、配列番号１の核酸配列を含む核酸と作動可能に連結されている。
【0487】
一部の実施形態では、配列番号５の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）遺伝子に由来する合成ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーターは、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％同一である核酸配列と作動可能に連結されており、筋肉細胞中において、配列番号１の核酸配列によってコードされているポリペプチドの発現を誘導する。
【0488】
フィラー、スペーサー、およびスタッファー
本明細書中に開示するように、ｒＡＡＶベクター中における使用を意図する組換え核酸は、ｒＡＡＶベクター内へのＡＡＶのパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の正常な大きさ（たとえばおよそ４．７～４．９キロ塩基）の付近またはそれに、核酸の長さを調節するための、追加の核酸要素を含み得る（ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７９（１５）：９９３３～９９４４）。そのような配列は、フィラー、スペーサー、またはスタッファーと互換性があるように呼び得る。一部の実施形態では、フィラーＤＮＡは、核酸の翻訳されない（非タンパク質コード）セグメントである。一部の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０－９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、またはそれより大きい長さの配列である。
本明細書中に開示するように、ｒＡＡＶベクター中における使用を意図する組換え核酸は、ｒＡＡＶベクター内へのＡＡＶのパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の正常な大きさ（たとえばおよそ４．７～４．９キロ塩基）の付近またはそれに、核酸の長さを調節するための、追加の核酸要素を含み得る（ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７９（１５）：９９３３～９９４４）。そのような配列は、フィラー、スペーサー、またはスタッファーと互換性があるように呼び得る。一部の実施形態では、フィラーＤＮＡは、核酸の翻訳されない（非タンパク質コード）セグメントである。一部の実施形態では、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０－９０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１０００、１０００～１５００、１５００～２０００、２０００～３０００、またはそれより大きい長さの配列である。
【0489】
ＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶカプシド内への核酸の最適なパッケージングのために、約４ｋｂ～約５．２ｋｂまたは約４．１～４．９ｋｂの範囲の大きさを有するＤＮＡの挿入物を受け入れる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約３．０ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４．０ｋｂ、約４．０ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５．０ｋｂ、または約５．０ｋｂ～約５．２ｋｂの全長を有するベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、約４．５ｋｂの全長を有するベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、自己相補的であるベクターゲノムを含む。ｒＡＡＶベクター中の自己相補的（ｓｃ）ベクターゲノムの全長は一本鎖（ｓｓ）ベクターゲノムに等しい一方で（すなわち約４ｋｂ～約５．２ｋｂ）、ｓｃベクターゲノムをカプシド中にパッケージングするためには、ｓｃベクターゲノムをコードしている核酸配列（すなわち、導入遺伝子、調節要素、およびＩＴＲを含む）は、ｓｓベクターゲノムをコードしている核酸配列の半分の長さでしかなければならない。
【0490】
イントロンおよびエクソン
一部の実施形態では、組換え核酸は、たとえば、イントロン、エクソン、および／またはその一部分を含む。イントロンは、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能して、ｒＡＡＶベクター内へのベクターゲノムのパッケージングに適切な長さを達成し得る。また、イントロンおよび／またはエクソン配列は、イントロンおよび／またはエクソン要素の非存在下における発現と比較して、ポリペプチド（たとえば導入遺伝子）の発現を増強させることもできる（Ｋｕｒａｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０（１０）：５７６～５２８１、ＷＯ２０１７／０７４５２６号）。さらに、フィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列（「インスレーター」とも呼ばれる）は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、ＷＯ２０１４／１４４４８６号およびＷＯ２０１７／０７４５２６号中に記載されているものが挙げられる。
一部の実施形態では、組換え核酸は、たとえば、イントロン、エクソン、および／またはその一部分を含む。イントロンは、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能して、ｒＡＡＶベクター内へのベクターゲノムのパッケージングに適切な長さを達成し得る。また、イントロンおよび／またはエクソン配列は、イントロンおよび／またはエクソン要素の非存在下における発現と比較して、ポリペプチド（たとえば導入遺伝子）の発現を増強させることもできる（Ｋｕｒａｃｈｉら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０（１０）：５７６～５２８１、ＷＯ２０１７／０７４５２６号）。さらに、フィラー／スタッファーポリヌクレオチド配列（「インスレーター」とも呼ばれる）は当分野で周知であり、それだけには限定されないが、ＷＯ２０１４／１４４４８６号およびＷＯ２０１７／０７４５２６号中に記載されているものが挙げられる。
【0491】
イントロン要素は、異種ポリヌクレオチドと同じ遺伝子に由来し得る、または完全に異なる遺伝子もしくは他のＤＮＡ配列（たとえば、ニワトリβ－アクチン遺伝子、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ））に由来し得る。一部の実施形態では、組換え核酸は、非同族遺伝子に由来する（すなわち、修飾核酸、たとえば導入遺伝子に由来しない）イントロンおよびエクソンから選択される少なくとも１つの要素を含む。
【0492】
ポリアデニル化シグナル配列（ポリＡ）
さらなる調節要素としては、ストップコドン、終止配列、および、それだけには限定されないがウシ科動物成長ホルモンポリＡシグナル配列（ＢＨＧポリＡ）などのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を挙げ得る。ポリＡシグナル配列は、遺伝子転写の終結を導く、真核ｍＲＮＡの３’末端でのポリ－アデノシン「テイル」の効率的な付加を駆動する（たとえばＧｏｏｄｗｉｎおよびＲｏｔｔｍａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２３）：１６３３０～１６３３４を参照）。ポリＡシグナルは、新しく形成された前駆体ｍＲＮＡの、その３’末端でのエンドヌクレアーゼ的切断のため、およびこの３’末端へのアデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチの付加のためのシグナルとして作用する。ポリＡテイルは、ｍＲＮＡの核外移行、翻訳、および安定性に重要である。一部の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ Ｅ１ｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたポリアデニル化シグナルである。
さらなる調節要素としては、ストップコドン、終止配列、および、それだけには限定されないがウシ科動物成長ホルモンポリＡシグナル配列（ＢＨＧポリＡ）などのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を挙げ得る。ポリＡシグナル配列は、遺伝子転写の終結を導く、真核ｍＲＮＡの３’末端でのポリ－アデノシン「テイル」の効率的な付加を駆動する（たとえばＧｏｏｄｗｉｎおよびＲｏｔｔｍａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２３）：１６３３０～１６３３４を参照）。ポリＡシグナルは、新しく形成された前駆体ｍＲＮＡの、その３’末端でのエンドヌクレアーゼ的切断のため、およびこの３’末端へのアデニン塩基のみからなるＲＮＡストレッチの付加のためのシグナルとして作用する。ポリＡテイルは、ｍＲＮＡの核外移行、翻訳、および安定性に重要である。一部の実施形態では、ポリＡは、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ Ｅ１ｂポリアデニル化シグナル、成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＰＢＧＤポリアデニル化シグナル、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計されたポリアデニル化シグナルである。
【0493】
一部の実施形態では、かつ本明細書中に記載の１つまたは複数の他の調節要素と任意選択で組み合わせて、組換え核酸のポリＡシグナル配列は、たとえばミニジストロフィン（たとえば配列番号２）または銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２（たとえば配列番号１５）をコードしている修飾核酸の転写から生じる前駆体ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断およびポリアデニル化を指揮および達成することができる、ポリＡシグナルである。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６または配列番号１７の核酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号６または配列番号１７の核酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、組換え核酸は、プロモーター配列（たとえば、配列番号３、配列番号４）、ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーター（たとえば配列番号５）、およびポリＡ（配列番号６）のうちの少なくとも１つを含み、配列番号１の核酸配列によってコードされていてもよい異種ポリペプチドの発現をモジュレートする。一部の実施形態では、組換え核酸は、プロモーター配列（たとえば配列番号１６）およびポリＡ（配列番号１７）のうちの少なくとも１つを含み、配列番号１５のアミノ酸配列を含む異種ポリペプチドの発現をモジュレートする。
【0494】
一部の実施形態では、筋肉細胞に対する指向性を有するｒＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（たとえばＡＡＶ２ ＩＴＲ）と、ミニジストロフィンをコードしている修飾した（すなわちコドン最適化された）核酸を含む組換え核酸と、以下の調節要素、すなわち、プロモーター（たとえばヒトＣＫプロモーター）、ハイブリッドエンハンサー、およびポリＡシグナル配列のうちの少なくとも１つとを含むベクターゲノムを含有する。
【0495】
一部の実施形態では、肝細胞に対して指向性を有するｒＡＡＶ３Ｂベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（たとえばＡＡＶ２ ＩＴＲ）と、銅輸送欠失ＡＴＰａｓｅ２（たとえば配列番号１５のアミノ酸配列）をコードしている修飾した（すなわちコドン最適化された）核酸を含む組換え核酸と、以下の調節要素のうち、すなわち、プロモーター（たとえばα１－抗トリプシンプロモーター、たとえば配列番号１６の核酸配列）およびポリＡシグナル配列（たとえば配列番号１７の核酸）の少なくとも１つとを含むベクターゲノムを含有する。
【0496】
一部の実施形態では、筋肉細胞に対して指向性を有するｒＡＡＶ９ベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ（たとえば、配列番号７、配列番号８）と、ミニジストロフィンをコードしている修飾した（すなわちコドン最適化された）核酸（たとえば配列番号１）を含む組換え核酸と、以下の調節要素、すなわち、プロモーター（たとえば配列番号３または配列番号４）、ハイブリッドエンハンサーおよびプロモーター（たとえば配列番号５）、およびポリＡ（たとえば配列番号６）のうちの少なくとも１つとを含むベクターゲノムを含有する。
【0497】
４．ウイルスベクターのアセンブリ
導入遺伝子（たとえばミニジストロフィンをコードしているもの）を保有するウイルスベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）は、導入遺伝子をコードしているポリヌクレオチド、適切な調節要素、および、細胞形質導入を媒介する、ウイルスタンパク質の生成に必要な要素からアセンブリする。ウイルスベクターの例としては、それだけには限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、具体的にはｒＡＡＶベクターが挙げられる（上述）。
導入遺伝子（たとえばミニジストロフィンをコードしているもの）を保有するウイルスベクター（たとえばｒＡＡＶベクター）は、導入遺伝子をコードしているポリヌクレオチド、適切な調節要素、および、細胞形質導入を媒介する、ウイルスタンパク質の生成に必要な要素からアセンブリする。ウイルスベクターの例としては、それだけには限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、具体的にはｒＡＡＶベクターが挙げられる（上述）。
【0498】
本開示の方法に従って生成したｒＡＡＶベクターのベクターゲノム構成成分は、少なくとも１つの導入遺伝子、たとえば、コドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子、および、ジストロフィンまたはその断片をコードしている修飾核酸の発現を制御するための関連する発現制御配列を含む。
【0499】
例示的な非限定的な実施形態では、ベクターゲノムは、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失したおよび／または修飾核酸（たとえば導入遺伝子、たとえばコドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子）によって置き換えられているＡＡＶゲノム、ならびにその関連する発現制御配列などの、パルボウイルスゲノムの一部分を含む。ジストロフィンまたはその断片をコードしている修飾核酸は、典型的には、ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードしている核酸の代わりに、ウイルス複製に十分な１つまたは２つのＡＡＶ ＩＴＲまたはＩＴＲ要素に近接して（すなわち隣接して）挿入されている（Ｘｉａｏら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１（２）：９４１～９４８）。標的細胞（たとえば筋肉細胞）中においてコドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子の組織特異的発現を容易にするために使用するために適切な他の調節配列も含まれ得る。
【0500】
パッケージング細胞
当業者は、導入遺伝子を含み、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質（たとえばｃａｐおよびｒｅｐ）を欠くｒＡＡＶベクターは、そのようなタンパク質はウイルス複製およびパッケージングに必要であるため、複製できないことを理解されよう。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、ベクターゲノムに導入遺伝子を供給するプラスミドとは別々のプラスミドとして、細胞（たとえば宿主細胞、たとえばパッケージング細胞）に供給し得る。
当業者は、導入遺伝子を含み、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質（たとえばｃａｐおよびｒｅｐ）を欠くｒＡＡＶベクターは、そのようなタンパク質はウイルス複製およびパッケージングに必要であるため、複製できないことを理解されよう。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、ベクターゲノムに導入遺伝子を供給するプラスミドとは別々のプラスミドとして、細胞（たとえば宿主細胞、たとえばパッケージング細胞）に供給し得る。
【0501】
「パッケージング細胞」または「プロデューサー細胞」とは、ベクター、プラスミド、またはＤＮＡ構築体を用いて形質移入されていてよく、ウイルスベクターの完全な複製およびパッケージングに必要なすべての欠損した機能をｔｒａｎｓで提供する、細胞または細胞系を意味する。ｒＡＡＶベクターのアセンブリに必要な遺伝子は、ベクターゲノム（たとえば、コドン最適化されたミニジストロフィン導入遺伝子、調節要素、およびＩＴＲ）、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、およびたとえばアデノウイルスなどの他のウイルスからの特定のヘルパー遺伝子を含む。当業者には、ＡＡＶ生成のための必要な遺伝子は、たとえば１つまたは複数のプラスミドの形質移入を含む様々な方法で、パッケージング細胞内に導入できることを理解されるであろう。しかし、一部の実施形態では、一部の遺伝子（たとえば、ｒｅｐ、ｃａｐ、ヘルパー）は、ゲノム内に組み込まれてまたはエピソーム上に保有されてのいずれかで、パッケージング細胞中に既に存在し得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、構成的または誘導性の様式で、１つまたは複数の欠損したウイルス機能を発現する。
【0502】
当分野で知られている任意の適切なパッケージング細胞を、パッケージングされたウイルスベクターの生成において用い得る。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本開示の実施においてパッケージング細胞の生成に有用な細胞の例としては、たとえば、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３（構成的プロモーターの制御下で機能的なアデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０、または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞系などのヒト細胞系が挙げられる。適切な非ヒト哺乳動物細胞系としては、たとえば、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ２１－Ｆ、ＨＫＣＣ、またはＣＨＯ細胞が挙げられる。
【0503】
一部の実施形態では、パッケージング細胞は懸濁培養中で成長することができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞は無血清培地中で成長することができる。たとえば、ＨＥＫ２９３細胞は、無血清培地中の懸濁液中で成長させる。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号中に記載されており、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）ＰＴＡ １３２７４として受託されているＨＥＫ２９３細胞である。数々のｒＡＡＶパッケージング細胞系が当分野で知られており、それだけには限定されないが、ＷＯ２００２／４６３５９号中に開示されているものが挙げられる。
【0504】
パッケージング細胞として使用するための細胞系としては、昆虫細胞系が挙げられる。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中に維持することができる任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用することができる。例としては、Ｓｆ９またはＳｆ２１などのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞系、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の種の細胞系、または蚊の細胞系、たとえば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来の細胞系が挙げられる。好ましい細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞系である。以下の参照は、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、核酸をそのような細胞内に導入する方法、およびそのような細胞を培養物中に維持する方法に関するその教示について、本明細書中に組み込まれている：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｉｃｈａｒｄ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２～３８２８、Ｋａｊｉｇａｙａら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４６４６～４６５０、Ｒｕｆｆｉｎｇら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：６９２２～６９３０、Ｋｉｍｂａｕｅｒら（１９９６）Ｖｉｒｏｌ． ２１９：３７～４４、Ｚｈａｏら（２０００）Ｖｉｒｏｌ． ２７２：３８２～３９３、および米国特許第６，２０４，０５９号。
【0505】
さらなる代替方法として、本開示のウイルスベクターは、たとえばＵｒａｂｅら（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５～１９４３によって記載されているように、昆虫細胞中において、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためにバキュロウイルスベクターを使用して生成し得る。ＡＡＶのバキュロウイルス生成を使用する場合、一部の実施形態では、ベクターゲノムは自己相補的である。一部の実施形態では、宿主細胞は、バキュロウイルスヘルパー機能をコードしている追加の核酸を含んでいてもよく、それによってウイルスカプシドの生成を容易にする、バキュロウイルスに感染した細胞（たとえば昆虫細胞）である。
【0506】
パッケージング細胞は、一般に、１つまたは複数のウイルスベクター機能を、ウイルスベクターの複製およびパッケージングをもたらすために十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と共に含む。これらの様々な機能は、プラスミドまたは単位複製配列などの遺伝子構築体を使用して、一緒にまたは別々にパッケージング細胞に供給してよく、これらは、細胞系内に染色体外で、または宿主細胞の染色体内に組み込まれて存在し得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞を、少なくともｉ）導入遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、以下の調節要素：エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、およびポリＡのうちの少なくとも１つをさらに含むベクターゲノムを含むプラスミド、ならびにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ２ ｒｅｐ）およびｃａｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ９または他のｃａｐ）を含むプラスミドを用いて形質移入する。
【0507】
一部の実施形態では、それ内に取り込まれたパッケージングまたはヘルパー機能のうちの１つまたは複数を有する宿主細胞、たとえば、１つまたは複数のベクター機能が染色体外で取り込まれているまたは細胞の染色体ＤＮＡ内に組み込まれている宿主細胞系を供給する。
【0508】
ヘルパー機能
ＡＡＶは、ヘルパーウイルスによる細胞の同時感染がなければ細胞中で複製することができないという点で、ディペンドウイルスである。ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために必要な、パッケージング細胞の活性感染を確立するために必要なヘルパーウイルス要素を含む。ヘルパーウイルスとしては、典型的にはアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが挙げられる。アデノウイルスヘルパー機能としては、典型的には、アデノウイルス構成成分アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１ａ）、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡが挙げられる。ヘルパー機能（たとえば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）は、細胞を、様々なヘルパー要素をコードしている１つまたは複数の核酸を用いて形質移入することによって、パッケージング細胞に提供することができる。あるいは、宿主細胞（たとえばパッケージング細胞）は、ヘルパータンパク質をコードしている核酸を含むことができる。たとえば、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒト細胞をアデノウイルス５ ＤＮＡで形質転換させることによって作製し、ＨＥＫ２９３細胞は、今や、それだけには限定されないがＥ１およびＥ３を含むいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（たとえばＧｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９～７２を参照）。したがって、これらのヘルパー機能は、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞によって、これらを細胞に供給する必要なしに、たとえばそれらをコードしているプラスミドによって、提供することができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞を、少なくともｉ）導入遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、以下の調節要素：エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、およびポリＡのうちの少なくとも１つをさらに含むベクターゲノムを含むプラスミド、ならびにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ２ ｒｅｐ）およびｃａｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ９または他のｃａｐ）を含むプラスミド、ならびにｉｉｉ）ヘルパー機能を含むプラスミドを用いて形質移入する。
ＡＡＶは、ヘルパーウイルスによる細胞の同時感染がなければ細胞中で複製することができないという点で、ディペンドウイルスである。ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために必要な、パッケージング細胞の活性感染を確立するために必要なヘルパーウイルス要素を含む。ヘルパーウイルスとしては、典型的にはアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが挙げられる。アデノウイルスヘルパー機能としては、典型的には、アデノウイルス構成成分アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１ａ）、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡが挙げられる。ヘルパー機能（たとえば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）は、細胞を、様々なヘルパー要素をコードしている１つまたは複数の核酸を用いて形質移入することによって、パッケージング細胞に提供することができる。あるいは、宿主細胞（たとえばパッケージング細胞）は、ヘルパータンパク質をコードしている核酸を含むことができる。たとえば、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒト細胞をアデノウイルス５ ＤＮＡで形質転換させることによって作製し、ＨＥＫ２９３細胞は、今や、それだけには限定されないがＥ１およびＥ３を含むいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（たとえばＧｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９～７２を参照）。したがって、これらのヘルパー機能は、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞によって、これらを細胞に供給する必要なしに、たとえばそれらをコードしているプラスミドによって、提供することができる。一部の実施形態では、パッケージング細胞を、少なくともｉ）導入遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲを含み、以下の調節要素：エンハンサー、プロモーター、エクソン、イントロン、およびポリＡのうちの少なくとも１つをさらに含むベクターゲノムを含むプラスミド、ならびにｉｉ）ｒｅｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ２ ｒｅｐ）およびｃａｐ遺伝子（たとえばＡＡＶ９または他のｃａｐ）を含むプラスミド、ならびにｉｉｉ）ヘルパー機能を含むプラスミドを用いて形質移入する。
【0509】
複製およびパッケージングのためにヘルパー機能を保有するヌクレオチド配列を細胞性宿主内に導入するための任意の方法を用いてよく、それだけには限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、陽イオン性または陰イオン性リポソーム、担体分子（たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、および核移行シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられる。一部の実施形態では、ヘルパー機能は、ウイルスベクターを使用した形質移入によって、またはヘルパーウイルスを使用した感染によって提供し、ウイルス感染を生じる標準方法を使用し得る。
【0510】
ベクターゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築体などの任意の適切な組換え核酸であってよく、一本鎖、二本鎖、または二重鎖（すなわち、ＷＯ２００１／９２５５１号に記載のように自己相補的）であってよい。
【0511】
４．パッケージングされたウイルスベクターの生成
ウイルスベクターは、当業者に知られているいくつかの方法によって作製することができる（たとえばＷＯ２０１３／０６３３７９号を参照）。例示的な非とう限定的な方法は、すべての目的のためにその内容が本明細書中に参考として組み込まれているＧｒｉｅｇｅｒら（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７～２９７中に記載されている。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的な形質移入を開始点として使用し、有資格の臨床的マスター細胞バンクからの接着性ＨＥＫ２９３細胞系を使用して、動物構成成分を含まない懸濁液条件下で、迅速かつ拡張可能なｒＡＡＶ生成を可能にする振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター中において、成長させる。三重形質移入方法（たとえばＷＯ９６／４０２４０号）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞系の懸濁液は、形質移入の４８時間後に回収した場合に、１×１０５個を超えるベクターゲノム含有粒子（ＶＧ）／細胞、または１×１０１４ＶＧ／Ｌを超える細胞培養物を作製することができる。より詳細には、三重形質移入とは、パッケージング細胞を３つのプラスミドで形質移する方法をいう：１つのプラスミドＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ（たとえばＡＡＶ９ ｃａｐ）遺伝子をコードしており、別のプラスミドは様々なヘルパー機能（たとえば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡなどのアデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質をコードしており、別のプラスミドは、導入遺伝子（たとえばジストロフィンまたはその断片）および導入遺伝子の発現を制御するための様々な要素をコードしている。
ウイルスベクターは、当業者に知られているいくつかの方法によって作製することができる（たとえばＷＯ２０１３／０６３３７９号を参照）。例示的な非とう限定的な方法は、すべての目的のためにその内容が本明細書中に参考として組み込まれているＧｒｉｅｇｅｒら（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７～２９７中に記載されている。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的な形質移入を開始点として使用し、有資格の臨床的マスター細胞バンクからの接着性ＨＥＫ２９３細胞系を使用して、動物構成成分を含まない懸濁液条件下で、迅速かつ拡張可能なｒＡＡＶ生成を可能にする振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター中において、成長させる。三重形質移入方法（たとえばＷＯ９６／４０２４０号）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞系の懸濁液は、形質移入の４８時間後に回収した場合に、１×１０５個を超えるベクターゲノム含有粒子（ＶＧ）／細胞、または１×１０１４ＶＧ／Ｌを超える細胞培養物を作製することができる。より詳細には、三重形質移入とは、パッケージング細胞を３つのプラスミドで形質移する方法をいう：１つのプラスミドＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ（たとえばＡＡＶ９ ｃａｐ）遺伝子をコードしており、別のプラスミドは様々なヘルパー機能（たとえば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡなどのアデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質をコードしており、別のプラスミドは、導入遺伝子（たとえばジストロフィンまたはその断片）および導入遺伝子の発現を制御するための様々な要素をコードしている。
【0512】
一本鎖ベクターゲノムは、カプシド内にプラス鎖またはマイナス鎖としてほぼ等しい割合でパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターの一部の実施形態では、ベクターゲノムはプラス鎖極性（すなわち、センスまたはＤＮＡ鎖のコード配列）である。一部のｒＡＡＶベクターの実施形態では、ベクターはマイナス鎖極性（すなわち、アンチセンスまたは鋳型ＤＮＡ鎖）である。その５’から３’の配向のプラス鎖のヌクレオチド配列を考慮すると、その５’から３’の配向のマイナス鎖のヌクレオチド配列は、プラス鎖のヌクレオチド配列の逆補体として決定することができる。
【0513】
所望の収率を達成するために、成長および形質移入をどちらも支持する適合性がある無血清懸濁液媒体の選択、形質移入試薬、形質移入条件、および細胞密度の選択など、いくつかの変数を最適化する。
【0514】
ｒＡＡＶベクターは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によってなど、当分野において標準の方法によって精製し得る。ｒＡＡＶベクターを精製する方法は当分野で知られており、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）：１０３１～１０３９、ＳｃｈｅｎｐｐおよびＣｌａｒｋ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ． ６９：４２７～４４３、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７号中に記載されている方法が挙げられる。
【0515】
本開示のｒＡＡＶベクターを本明細書中に開示した方法に従って生成および精製した後、デュシェンヌ筋ジストロフィーを有するヒト対象などの対象に投与するための組成物を調製するために、これらを滴定することができる（たとえば、試料中のｒＡＡＶベクターの量を定量することができる）。ｒＡＡＶベクターの滴定は、当分野で知られている方法を使用して達成することができる。
【0516】
一部の実施形態では、ベクターゲノムを含有する粒子およびベクターゲノムを含有しない「空」カプシドを含めたウイルス粒子の数は、電子顕微鏡観察、たとえば透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって決定することができる。そのようなＴＥＭに基づく方法は、試料中のベクター粒子（または野生型ＡＡＶの場合はウイルス粒子）の数を提供することができる。一部の実施形態では、ベクターゲノムを含有する粒子（フルカプシド）、およびベクターゲノムを含有しない「空」カプシドの量は、荷電検出質量分析、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）、ならびに／またはＡ２６０／Ａ２８０比を決定するための２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定することができる。
【0517】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターゲノム中の任意の配列、たとえばＩＴＲ配列（たとえば配列番号７もしくは配列番号８）、および／または導入遺伝子（もしくは調節要素）中の配列に対するプライマーを使用した定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、滴定することができる。ベクターゲノムの配列を含有するプラスミドなどの既知の濃度の標準の希釈液に対してｑＰＣＲを平衡で行うことによって、検量線を作成することができ、これにより、ｒＡＡＶベクターの濃度を、マイクロリットルまたはミリリットルなどの単位体積あたりのベクターゲノム（ＶＧ）の数として計算することが可能になる。たとえばＳＥＣまたはＥＬＩＳＡによって測定したベクター粒子の数を、試料中のベクターゲノムの数と比較することによって、空カプシドの百分率を推定することができる。ベクターゲノムは治療的導入遺伝子を含有するため、ｖｇ／ｋｇまたはｖｇ／ｍｌのベクター試料が、その一部が空でありベクターゲノムを含有しない場合があるベクター粒子の数よりも、対象が受けるベクターの治療量をより示している場合がある。ストック溶液中のｒＡＡＶベクターゲノムの濃度が決定された後、これを、対象（たとえばデュシェンヌ筋ジストロフィーを有する対象）に投与するための組成物（たとえば原薬）の調製において使用するための適切な緩衝液で希釈する、またはそれに対して透析することができる。
【0518】
５．陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によるｒＡＡＶベクター精製
イオン交換クロマトグラフィー方法に基づく新規の普遍的な精製戦略を使用して、様々なＡＡＶ血清型の高純度のｒＡＡＶベクター調製物ならびに／またはキメラカプシド（たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ＡやＡＡＶ３Ｂを含むＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ、ウシ科動物ＡＡＶ、イヌ科動物ＡＡＶ、ウマ科動物ＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびにＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５と呼ばれる変異体などの、組換え生成した変異体（たとえば、挿入、欠失、および置換などを有するカプシド変異体））を作製し得る。一部の実施形態では、このプロセスは１週間未満で完了し、高いフル対空のカプシド比（７０％までのフルカプシド）をもたらし、７０％までのステップ収率および臨床的使用に適切な純度を提供することができる。一部の実施形態では、そのような方法はＡＡＶ血清型および／またはカプシドのキメラ化に関して普遍的である。本明細書中に記載の拡張可能な製造技術を使用して、疾患（たとえば、ＤＭＤ、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病など）を処置するためのＧＭＰ臨床および市販グレードのｒＡＡＶベクターを製造し得る。
イオン交換クロマトグラフィー方法に基づく新規の普遍的な精製戦略を使用して、様々なＡＡＶ血清型の高純度のｒＡＡＶベクター調製物ならびに／またはキメラカプシド（たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ＡやＡＡＶ３Ｂを含むＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ、ウシ科動物ＡＡＶ、イヌ科動物ＡＡＶ、ウマ科動物ＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびにＡＡＶ２ｉ８、ＮＰ４、ＮＰ２２、ＮＰ６６、ＡＡＶＤＪ、ＡＡＶＤＪ／８、ＡＡＶＤＪ／９、ＡＡＶＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶＨＳＣ１、ＡＡＶＨＳＣ２、ＡＡＶＨＳＣ３、ＡＡＶＨＳＣ４、ＡＡＶＨＳＣ５、ＡＡＶＨＳＣ６、ＡＡＶＨＳＣ７、ＡＡＶＨＳＣ８、ＡＡＶＨＳＣ９、ＡＡＶＨＳＣ１０、ＡＡＶＨＳＣ１１、ＡＡＶＨＳＣ１２、ＡＡＶＨＳＣ１３、ＡＡＶＨＳＣ１４、およびＡＡＶＨＳＣ１５と呼ばれる変異体などの、組換え生成した変異体（たとえば、挿入、欠失、および置換などを有するカプシド変異体））を作製し得る。一部の実施形態では、このプロセスは１週間未満で完了し、高いフル対空のカプシド比（７０％までのフルカプシド）をもたらし、７０％までのステップ収率および臨床的使用に適切な純度を提供することができる。一部の実施形態では、そのような方法はＡＡＶ血清型および／またはカプシドのキメラ化に関して普遍的である。本明細書中に記載の拡張可能な製造技術を使用して、疾患（たとえば、ＤＭＤ、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病など）を処置するためのＧＭＰ臨床および市販グレードのｒＡＡＶベクターを製造し得る。
【0519】
遺伝子療法のための組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の生成は、ベクターを生成した宿主細胞（たとえば、それだけには限定されないが、宿主細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、膜、およびオルガネラを含む宿主細胞細片）からのｒＡＡＶベクターの精製、ならびに完全ベクターゲノムを含有せず、したがって治療的導入遺伝子を含まないカプシド（たとえば中間体および／または空カプシド）の除去を必要とする。
【0520】
そのような精製方法は、一般に複数のステップを含み、たとえば、宿主細胞の溶解、細胞タンパク質およびＤＮＡの沈殿、ｒＡＡＶベクターの宿主細胞タンパク質および核酸からの分離、ならびに、カラム精製、低速遠心分離、超遠心分離、通常流濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション、またはこれらの方法の任意の組合せによる、ｒＡＡＶベクターの空および中間体カプシドからの分離が挙げられる。カラム精製としては、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、陰イオン、陽イオン）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィーを挙げ得る。遠心分離方法としては、たとえば、超遠心分離または低速遠心分離（たとえば固体の除去および清澄化のため）を挙げ得る。濾過方法としては、たとえば、ダイアフィルトレーション、デプス濾過、公称濾過および／または絶対濾過を挙げ得る。
【0521】
ＡＥＸは、物質（たとえば、ＡＡＶカプシド、ＤＮＡ、タンパク質、高いモル質量の種、アミノ酸）を、前記物質の電荷相違に基づいて分離するために、正電荷固定相（たとえば樹脂）を用い、中等度に酸性からアルカリ性のｐＨ（たとえばｐＨ６より高く）で電荷相違に基づいてｒＡＡＶカプシドを不純物から分離するために有用である。ＡＥＸはまた、フルカプシドと比較した空カプシドの電荷相違に依存することによって、空カプシドを、完全ベクターゲノムを含有するｒＡＡＶベクター（すなわちフルカプシド）から分離することもできる。
【0522】
理論に束縛されることを望まずに、ＡＡＶカプシドとＡＥＸクロマトグラフィー固定相との間の結合の堅固さは、カプシド内の任意の核酸からの電荷貢献を含むカプシドの負電荷の強度、溶液のｐＨ、および溶液の伝導率に関連する（Ｑｕ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）１４０：１８３～１９２）。一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、共有結合した四級化ポリエチレンイミンおよび任意選択でＯＨ基で修飾されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む樹脂である（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂）。ポリスチレンジビニルベンゼン粒子は、５００～１０，０００オングストローム（Å）の孔を含み得る。
【0523】
一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、アガロース粒子（たとえば、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能）を陽イオン性リガンドと共に含む樹脂である。一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＸＰ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ Ｑ ＸＬ、Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｑ、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ １５ Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ ３０ Ｑ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＢＢ、ＰＯＲＯＳ（商標）２０ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＱＡＥ－５５０Ｃ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｑ－６００Ｃ ＡＲ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｓ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｃ、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ （２０）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ （３０）、Ｑ セラミック ＨｙｐｅｒＤ Ｆ、ＥＳＨＭＵＮＯ（登録商標）Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ （Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ （Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ （Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ （Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ （Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ （Ｍ）、Ｎｕｖｉａ Ｑ、Ｎｕｖｉａ ＨＰ－Ｑ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ２５ Ｑ、ＢｉｏＲａｄ ＡＧ（登録商標）１－Ｘ２、ＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）４０Ｑ、ＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）１００Ｑ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ Ｑ－ｒ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ Ｑ－ｈ、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｑ６５、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｑ９０、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｊｅｔｔｅｄ Ｑ３５、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＰＯＬＹＱＵＡＴ、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）ＰＯＬＹＰＥＩ、ＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ Ｑ３０、ＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ Ｑ７５、ＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ１０、ＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ３０、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦ（高基質）、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＰＩ、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ Ｄ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＮＨ２－７５０Ｆ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ－６５０Ｓ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ－６５０Ｃ、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－５ＰＷ（３０）、セラミックＨｙｐｅｒＤ ＤＥＡＥ、Ｈｙｐｅｒｃｅｌ Ｓｔａｒ ＡＸ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＤＥＡＥ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＤＭＡＥ（Ｍ）樹脂、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ、ＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）４０ ＤＥＡＥ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ＭＡＸ ＤＥＡＥ、ＤＥＡＥ ＰｕｒａＢｅａｄ ＨＦ、およびＷｏｒｋＢｅａｄｓ（商標）４０ ＴＲＥＮからなる群から選択される樹脂である。
【0524】
一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、多孔性ポリ－メタクリレートを陽イオン性リガンド（たとえばＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ）と共に含むモノリスである。一部の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィー固定相は、ポリエーテルスルホンを陽イオン性リガンド（たとえば、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（登録商標）ＰＡ）と共に含む膜吸着剤である。
【0525】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、移動相と固定相を通過したまたは固定相から置換されたｒＡＡＶベクターまたはカプシドなどの材料とから構成される、親和性クロマトグラフィー固定相から出る（たとえば「固定相から溶出する」）溶液から精製することができる。この溶液は親和性溶出液または「親和性プール」と呼び得る。
【0526】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、本明細書中において、宿主細胞培養物からの溶解した宿主細胞の沈降後に収集した溶液を指す「細胞溶解液からの上清」（「清澄にした溶解物」としても知られる）から精製することができる。
【0527】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、本明細書中において、凝結、デプス濾過、および／または公称濾過を受けた細胞溶解から生じる溶液を指す「回収後の溶液」から精製することができる。
【0528】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けた溶液から精製することができる。一部の実施形態では、親和性溶出液は、親和性溶出液をＡＥＸカラム上にロードする前などの、ｒＡＡＶベクターの精製の前に、希釈および任意選択で濾過されている。
【0529】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けていてもよい親和性溶出液から精製することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けていてもよい細胞溶解液から精製することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＥＸによって、少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けていてもよい、回収後の溶液から精製することができる。
【0530】
精製しようとする物質（たとえばｒＡＡＶベクター）および不純物を含む溶液が、ＡＥＸ固定相を通って流れるにつれて、正電荷のＡＥＸ固定相と結合する物質（たとえば、ＡＡＶカプシドまたはｒＡＡＶベクターなどの負電荷タンパク質）は、固定相内に保持される。非結合物質はカラムを通過し、フロースルー中、および／または続く洗浄ステップ中に収集される。結合した物質は、固定相から、カラム内の塩濃度および／またはｐＨを調節することによって溶出させ得る。たとえば、任意の特定の動作理論に束縛されることを望まずに、塩中の陰イオン（たとえば、酢酸イオン（Ｃ２Ｈ３Ｏ２
－）、Ｃｌ－ＳＯ４
－２）が、樹脂と結合した物質と競合してそれを置換する（すなわち溶出させる）ように、溶出緩衝液の塩濃度を徐々に増加させる。別の実施形態では、カラム内の溶液のｐＨを徐々に減少させて、結合した物質の負電荷を減少させ、それが固定相から放出（すなわち溶出）されることを引き起こすことができる。固定相からの放出の際、物質をカラム溶出液として収集し得る。
【0531】
理論に束縛されることを望まずに、ＡＡＶカプシドの混合物、またはより詳細にはｒＡＡＶベクター（すなわちフルカプシド）、ＡＡＶカプシド（たとえば、空カプシド、中間体カプシド）、および宿主細胞タンパク質の混合物などの物質の分離は、物質の総電荷相違に依存する。イオン化可能な側基の電荷組成が、特定のｐＨでのタンパク質の総電荷を決定する。等電点（ｐＩ）では、タンパク質上の総電荷は０であり、これはマトリックスと結合しない。ｐＨがｐＩより高い場合、タンパク質は負電荷を有し、陰イオン交換カラム固定相と結合する。
【0532】
フルｒＡＡＶベクターを空カプシドから分離するためのＡＥＸプロトコルは、複数のステップ、たとえば、保存液を置換するためのカラム媒体の使用前のフラッシュのステップ、カラム固定相の使用前の浄化ステップ、カラム固定相の使用後の浄化ステップ、カラム固定相の平衡化ステップ、ｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば希釈した親和性溶出液）をカラム固定相上にロードするステップ、精製しようとする物質を固定相から（たとえば、勾配溶出によって、ステップ溶出によって）溶出させるステップ、カラム固定相に勾配保持を適用するステップ、カラム固定相の浄化ステップ、カラム固定相の再生ステップ、保存液をカラム固定相に適用するステップを含む。当業者には、ｒＡＡＶベクターの精製のためのＡＥＸプロトコルは、これらのステップのすべて、またはその一部のみを含み得ることを理解されよう。当業者はまた、これらのステップの順序は変動してよく、特定のステップを複数回かつ必ずしも順序通りでなく行ってよいことも、理解されよう。
【0533】
ＡＥＸカラムの調製
本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～２０Ｌの体積の範囲のカラムを利用して、様々なスケールで行い得る。一部の実施形態では、ＡＥＸ方法は、約１．０ｍＬ、約５．１ｍＬ、約４９ｍＬ、約５２ｍＬ、約６．６７ｍＬ、約１．２５６Ｌ、約１．３Ｌ、約６．０Ｌ、約６．１Ｌ、約６．２Ｌ、約６．３Ｌ、約６．４Ｌ、約６．５Ｌ、約６．６Ｌ、約６．７Ｌ、約６．８Ｌ、約６．９Ｌ、または約７．０Ｌのカラム体積（ＣＶ）を有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～２０Ｌ、たとえば、１．０ｍｌ～１０ｍＬ、３０ｍＬ～７０ｍＬ、１０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～１０００ｍＬ、１Ｌ～１．５Ｌ、１．５Ｌ～２．０Ｌ、２．０Ｌ～５Ｌ、５Ｌ～７．５Ｌ、７．５Ｌ～１０Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、または１５Ｌ～２０ＬのＣＶを有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～１０Ｌ、１０ｍＬ～１０Ｌ、１００ｍＬ～２０Ｌ、１００ｍＬ～１０Ｌ、１Ｌ～２０Ｌ、１Ｌ～１０Ｌ、１Ｌ～５Ｌ、１Ｌ～２Ｌ、または１ｌ～１．５ＬのＣＶを有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のＣＶを有するカラムの使用を含む。
本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～２０Ｌの体積の範囲のカラムを利用して、様々なスケールで行い得る。一部の実施形態では、ＡＥＸ方法は、約１．０ｍＬ、約５．１ｍＬ、約４９ｍＬ、約５２ｍＬ、約６．６７ｍＬ、約１．２５６Ｌ、約１．３Ｌ、約６．０Ｌ、約６．１Ｌ、約６．２Ｌ、約６．３Ｌ、約６．４Ｌ、約６．５Ｌ、約６．６Ｌ、約６．７Ｌ、約６．８Ｌ、約６．９Ｌ、または約７．０Ｌのカラム体積（ＣＶ）を有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～２０Ｌ、たとえば、１．０ｍｌ～１０ｍＬ、３０ｍＬ～７０ｍＬ、１０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～１０００ｍＬ、１Ｌ～１．５Ｌ、１．５Ｌ～２．０Ｌ、２．０Ｌ～５Ｌ、５Ｌ～７．５Ｌ、７．５Ｌ～１０Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、または１５Ｌ～２０ＬのＣＶを有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、１．０ｍＬ～１０Ｌ、１０ｍＬ～１０Ｌ、１００ｍＬ～２０Ｌ、１００ｍＬ～１０Ｌ、１Ｌ～２０Ｌ、１Ｌ～１０Ｌ、１Ｌ～５Ｌ、１Ｌ～２Ｌ、または１ｌ～１．５ＬのＣＶを有するカラムの使用を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＥＸ方法は、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のＣＶを有するカラムの使用を含む。
【0534】
カラムに、たとえばそれ中の固定相を平衡化するために適用する溶液の体積は、一般に「カラム体積」（ＣＶ）に関して表し、１ＣＶはカラムの体積に等しい。
【0535】
一部の実施形態では、本開示のＡＥＸクロマトグラフィー固定相（本明細書中で「樹脂」または「媒体」とも呼ぶ）は、共有結合した四級化ポリエチレンイミンを有するポリスチレンジビニルベンゼン粒子（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ樹脂）である。
【0536】
一般に、精製しようとする溶液（たとえば、親和性クロマトグラフィー溶出液、本明細書中で「親和性溶出液」または「親和性プール」とも呼ぶ）を、クロマトグラフィー固定相を含むカラムに適用（すなわちロード）する前に、少なくとも１つの溶液を固定相に適用して、たとえば、固定相をフラッシュ、浄化、再生、および／または平衡化する。一部の実施形態では、「親和性溶出液」または「親和性プール」は、溶液をＡＥＸカラム上にロードする前に、希釈および任意選択で濾過されている。
【0537】
本明細書中に開示するように、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相の使用前のフラッシュを含む。一部の実施形態では、ＡＥＸ固定相の使用前のフラッシュは、保存液（たとえばエタノールを含む溶液）を固定相から置換することを意図とする。一部の実施形態では、カラムの使用前のフラッシュは、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードすることに先行する。一部の実施形態では、使用前のフラッシュは、水（たとえば注入用水）をカラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、使用前のフラッシュは水の上向流を含む。使用前のフラッシュの上向流中、流れの方向は、溶液（たとえば水）がカラムの底部からカラムの上部へと流れるように、クロマトグラフィー分離ステップ（たとえば、ロード、洗浄、または溶出）の流れとは逆である一方で、クロマトグラフィー分離ステップ（たとえばロード）中、溶液はカラムの上部からカラムの底部へと流れる。一部の実施形態では、使用前のフラッシュは、１～１０カラム体積（ＣＶ）（たとえば約５ＣＶ）の水を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１０ｃｍ／時～１０００ｃｍ／時の線速度および／または０．２Ｌ／分～３．０Ｌ／分の流速で適用することを含む。一部の実施形態では、使用前のフラッシュは、≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間（すなわち接触時間）で適用することを含む。
【0538】
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相を浄化することを含む。ＡＥＸ固定相の浄化は、汚染微生物数（それだけには限定されないが細菌を含む）を低下させるため、ならびに／またはカラム内の微生物およびウイルスを不活性化させるため、ならびにより一般的にはタンパク質、粒子などの汚染物質を除去するために役立つ。一部の実施形態では、浄化は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードすることに先行する。一部の実施形態では、浄化は、ＮａＯＨ、エタノール、酢酸、リン酸、グアニジンＨＣｌ、尿素、ＰＡＢ（リン酸、酢酸、ベンジルアルコール）、過酢酸などを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、０．１Ｍ～１．０Ｍ、約０．１Ｍ～約０．８Ｍ、約０．１Ｍ～約０．６Ｍ、約０．２Ｍ～約０．８Ｍ、約０．２Ｍ～約０．６Ｍ、または約０．４Ｍ～約０．６Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、上向流（すなわち、流れの方向がクロマトグラフィー分離ステップ、たとえば、ロード、洗浄、または溶出の流れと逆である）を使用して適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、下向流（すなわち、流れの方向がクロマトグラフィー分離ステップ、たとえば、ロード、洗浄、または溶出の流れと同じ方向である）を使用して適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、１４．４ＣＶ～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、５ＣＶ～２０ＣＶの、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００ｃｍ／時～１０００ｃｍ／時の線速度および／または０．２Ｌ／分～３．０Ｌ／分の流速で適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、１４．４ＣＶ～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間（すなわち、溶液がカラム内の固定相と接触している、カラム体積あたりの時間の量であり、本明細書中で接触時間とも呼ぶ）で適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約２９８ｃｍ／時）の線速度および／または１．５分／ＣＶ～２．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0539】
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相を再生すること（本明細書中で「すすぎ」とも呼ぶ）を含む。当業者は、イオン交換固定相を再生することは、交換プロセス中に吸収されたイオンを、交換部位を占有していた元のイオンで置き換えるために役立つことを理解されよう。一部の実施形態では、再生は、たとえば強力な溶媒を使用して不純物を除去することによって、固定相をその元の状態に戻すこともいうことができる。一部の実施形態では、再生は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を固定相上にロードすることに先行する。一部の実施形態では、再生は固定相に対して複数回行い得る。
【0540】
一部の実施形態では、再生は、塩および／または緩衝剤を含み、８～１０の範囲のｐＨを有する溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム（酢酸Ｎａ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酢酸アンモニウム（酢酸ＮＨ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）からなる群から選択される。一部の実施形態では、溶液中の塩（たとえばＮａＣｌ）の濃度は、１Ｍ～５Ｍ（たとえば、約１Ｍ～約４．５Ｍ、約１～約４Ｍ、約１Ｍ～約３．５Ｍ、約１Ｍ～約３Ｍ、約１Ｍ～約２．５Ｍ、または約１．５Ｍ～約２．５Ｍの範囲である。一部の実施形態では、溶液中の塩（たとえばＮａＣｌ）の濃度は、約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、または約５Ｍである。一部の実施形態では、再生は、１Ｍ～３Ｍ（たとえば２Ｍ）のＮａＣｌを含む溶液を、カラム中の固定相に適用することを含む。
【0541】
一部の実施形態では、緩衝剤は、トリス（たとえばトリス塩基とトリス－ＨＣｌの混合物）、ビス－トリスプロパン、および／またはビシンからなる群から選択される。一部の実施形態では、溶液中の緩衝剤（たとえばトリス）の濃度は、１０ｍＭ～５００ｍＭ（たとえば、約１０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの範囲である。一部の実施形態では、溶液中の緩衝剤（たとえばトリス）の濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、または約５００ｍＭである。一部の実施形態では、再生は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば１００ｍＭ）のトリスを含む溶液を、カラム中の固定相に適用することを含む。
【0542】
一部の実施形態では、再生は、約７～１１（たとえば、約７．５～１０．５、約８～１０、または約７、７．５、８、８，５、９、９，５、１０、１０．５、もしくは１１）のｐＨを有する溶液を、カラム中の固定相に適用することを含む。
【0543】
一部の実施形態では、再生は、約１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、１～１０ＣＶの、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００～１０００ｃｍ／時の線速度および／または０．２～３．０Ｌ／分の流速で適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、４．５～５．５（たとえば約５）ＣＶの、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間（すなわち接触時間）で適用することを含む。
【0544】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法であって、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、約５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）もしくは約１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５ＭのＮａＯＨ）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用すること含む、浄化ステップ、および／または、ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップを含み、ステップｉ）～ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で行い、少なくとも１つのステップを、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードする前に行ってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。当業者は、上記ステップを任意の順序で行ってよく、複数回行ってよいことを理解されよう。
【0545】
平衡化
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相の平衡化を含む。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相の平衡化は、カラム上にロードした一部の物質が固定相と結合し、他のものが移動相と共に流通するように、移動および固定相のｐＨ、伝導率、モディファイヤー（たとえば、塩、界面活性剤、アミノ酸など）の濃度、または他の条件を調節するために役立つ。たとえば、カラム内の条件は、フルｒＡＡＶベクターが固定相と結合し、空カプシドの少なくとも一部分が結合しないように、一連の平衡化緩衝液をカラムに適用することによって、調節し得る。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相は、精製しようとする物質（たとえばｒＡＡＶベクター）を含む溶液をカラムに適用する前に平衡化する。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相は、平衡化緩衝液（たとえば、第１の平衡化緩衝液、第２の平衡化緩衝液、第３の平衡化緩衝液、第４の平衡化緩衝液など）の適用によって平衡化する。平衡化緩衝液は、本明細書中で「洗浄バッファー」、「浄化後のすすぎ」、「すすぎ」、または「再生緩衝液」とも呼び得る。第１、第２、第３、第４などの平衡化緩衝液としての平衡化緩衝液への言及は、必ずしも緩衝液をカラムに適用する順序を暗示しない。
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相の平衡化を含む。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相の平衡化は、カラム上にロードした一部の物質が固定相と結合し、他のものが移動相と共に流通するように、移動および固定相のｐＨ、伝導率、モディファイヤー（たとえば、塩、界面活性剤、アミノ酸など）の濃度、または他の条件を調節するために役立つ。たとえば、カラム内の条件は、フルｒＡＡＶベクターが固定相と結合し、空カプシドの少なくとも一部分が結合しないように、一連の平衡化緩衝液をカラムに適用することによって、調節し得る。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相は、精製しようとする物質（たとえばｒＡＡＶベクター）を含む溶液をカラムに適用する前に平衡化する。一部の実施形態では、カラム中のＡＥＸ固定相は、平衡化緩衝液（たとえば、第１の平衡化緩衝液、第２の平衡化緩衝液、第３の平衡化緩衝液、第４の平衡化緩衝液など）の適用によって平衡化する。平衡化緩衝液は、本明細書中で「洗浄バッファー」、「浄化後のすすぎ」、「すすぎ」、または「再生緩衝液」とも呼び得る。第１、第２、第３、第４などの平衡化緩衝液としての平衡化緩衝液への言及は、必ずしも緩衝液をカラムに適用する順序を暗示しない。
【0546】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液（たとえば、第１の平衡化緩衝液、第２の平衡化緩衝液、第３の平衡化緩衝液、第４の平衡化緩衝液など）は、緩衝剤、塩、アミノ酸、界面活性剤、および／またはその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む。一部の実施形態では、緩衝剤は、トリス（たとえばトリス塩基とトリス－ＨＣｌの混合物）、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシンである。当業者は、トリス塩基、トリス－ＨＣｌ、または両方を使用して、所望のｐＨを有するトリス緩衝液を調製できることを理解されよう。一部の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム（酢酸Ｎａ（ＣＨ３ＣＯＯＮａ））、酢酸アンモニウム（酢酸ＮＨ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）である。一部の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。一部の実施形態では、アミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリンである。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ－３５、またはノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）である。
【0547】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１０ｍＭ～３５０ｍＭの、トリス（たとえばトリス塩基とトリス－ＨＣｌの混合物）、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、およびビシンからなる群から選択される緩衝剤を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭのトリス、１０ｍＭ～２５０ｍＭのトリス、１０ｍＭ～２００ｍＭのトリス、１０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、１０ｍＭ～１００ｍＭのトリス、または１０ｍＭ～５０ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、３０ｍＭ～３５０ｍＭのトリス、３０ｍＭ～３００ｍＭのトリス、３０ｍＭ～２５０ｍＭのトリス、３０ｍＭ～２０００ｍＭのトリス、３０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、３０ｍＭ～１００ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、５０ｍＭ～３００ｍＭのトリス、５０ｍＭ～２５０ｍＭのトリス、５０ｍＭ～２００ｍＭのトリス、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１００ｍＭ～３５０ｍＭのトリス、１００ｍＭ～２５０ｍＭのトリス、または１００ｍＭ～１５０ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭのトリス、約２０ｍＭのトリス、約３０ｍＭのトリス、約４０ｍＭのトリス、約５０ｍＭのトリス、約６０ｍＭのトリス、約７０ｍＭのトリス、約８０ｍＭのトリス、約９０ｍＭのトリス、約１００ｍＭのトリス、約１１０ｍＭのトリス、約１２０ｍＭのトリス、約１３０ｍＭのトリス、約１４０ｍＭのトリス、約１５０ｍＭのトリス、約１６０ｍＭのトリス、約１７０ｍＭのトリス、約１８０ｍＭのトリス、約１９０ｍＭのトリス、約２００ｍＭのトリス、約２２０ｍＭのトリス、約２４０ｍＭのトリス、約２５０ｍＭのトリス、約２７５ｍＭのトリス、約３００ｍＭのトリス、または約３５０ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのトリス、または２００ｍＭのトリスを含む。
【0548】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１ｍＭ～１Ｍの塩、好ましくは約５００ｍＭの塩を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ～約９５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約９００ｍＭ、約１０ｍＭ～約８５０ｍＭ、約１０Ｍ～約８００ｍＭ、１０ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７００ｍＭ、約１０ｍＭ～約６５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７００ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約６００ｍＭ、約２００ｍＭ～約６００ｍＭ、約３００ｍＭ～約６００ｍＭ、または約４００ｍＭ～約６００ｍＭの塩を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約５００ｍＭの塩を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム（酢酸Ｎａ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酢酸アンモニウム（酢酸ＮＨ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、または硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）からなる群から選択される塩を含む。
【0549】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、５ｍＭ～１Ｍの酢酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ～約９５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約９００ｍＭ、約１０ｍＭ～約８５０ｍＭ、約１０Ｍ～約８００ｍＭ、１０ｍＭ～約７５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７００ｍＭ、約１０ｍＭ～約６５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７００ｍＭ、約５０ｍＭ～約６５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約６００ｍＭ、約２００ｍＭ～約６００ｍＭ、約３００ｍＭ～約６００ｍＭ、または約４００ｍＭ～約６００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、または約６００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約５００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。
【0550】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、アミノ酸、たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリンを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、または約３００ｍＭのアミノ酸（たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリン）を含む。
【0551】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、アミノ酸、たとえばヒスチジンまたはアルギニンを含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１００ｍＭ～３００ｍＭのアミノ酸（たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリン）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ～約６００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、約５０ｍＭ～約６００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約６００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約２５０ｍＭのアミノ酸（たとえばヒスチジン）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約２００ｍＭのヒスチジンを含む。
【0552】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、界面活性剤、たとえば、Ｐ１８８、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ－３５、またはＮＰ－４０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、０．００５％～１．０％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、０．００５％～０．０１５％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、０．１％～１．０％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約０．００５％～約１．０％、約０．００５％～約０．５％、約０．００５％～約０．１％、約０．００５％～約０．０５％、約０．００７％～約０．０７％、０．００８％～約０．０５％、または約０．００８％～約０．０３％のＰ１８８を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約０．０１％～約１．５％、約０．０１％～約１．０％、約０．０１％～約０．７５％、約０．０５％～約１．５％、約０．０５％～約１．０％、約０．０５％～約０．７５％、約０．１％～約１．５％、約０．１％～約１．０％、約０．１％～約０．７５％、または約０．２５％～約０．７５％のＰ１８８を含む。
【0553】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．２５％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．５％、約０．５５％、約０．６％、約０．６５％、約０．７％、約０．７５％、約０．８％、約０．８５％、約０．９％、０．９５％、または約１．０％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約０．０１％のＰ１８８を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約０．５％のＰ１８８を含む。
【0554】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、８～１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、８．７～９．３のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、８．７～９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、または約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約８．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約８．９のｐＨを有する。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約９．０のｐＨを有する。
【0555】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む。
【0556】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリスおよび５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０＋／－０．３を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリスおよび５００ｍＭの酢酸ＮＨ４、ｐＨ９．０＋／－０．３を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０＋／－０．３を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリスおよび５００ｍＭのＮａ２ＳＯ４、ｐＨ９．０＋／－０．３を含み。
【0557】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、７ｍＭの塩（たとえば、ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム（酢酸ＮＨ４）、ＭｇＣｌ２、およびＮａ２ＳＯ４）、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、７ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、１４ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、２１ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、４２ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、４９ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、５７ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、２０ｍＭのトリス、６７ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。
【0558】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、１００ｍＭ～３００ｍＭのヒスチジン（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む。
【0559】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液（たとえば第１の平衡化緩衝液）は、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液（たとえば第１または第２の平衡化緩衝液）は、１００ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液（たとえば第２または第３の平衡化緩衝液）は、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液（たとえば第３または第４の平衡化緩衝液）は、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む。
【0560】
一部の実施形態では、上述の平衡化緩衝液は、第１、第２、第３、および第４の平衡化緩衝液であり得る。一部の実施形態では、第１、第２、第３、または第４の平衡化緩衝液を、順次的な順序でカラム固定相に適用する。一部の実施形態では、溶液（たとえば親和性溶出液）は、２つの平衡化緩衝液の適用の間に、カラムに適用する。たとえば、第１、第２、および第３の平衡化緩衝液をカラムに適用し、次いで親和性溶出液を適用し、これに次いで第４の平衡化緩衝液を適用し得る。別の例では、第１および第２の平衡化緩衝液をカラムに適用し、次いで親和性溶出液を適用し、これに次いで第３の平衡化緩衝液を適用する。
【0561】
一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は、１ＣＶ～５ＣＶ、４ＣＶ～６ＣＶ、４ＣＶ～１０ＣＶ、４ＣＶ～１５ＣＶ、４ＣＶ～２１ＣＶ、１０ＣＶ～２１ＣＶ、１５ＣＶ～２１ＣＶ、または１９ＣＶ～２１ＣＶである。一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は≧４．５ＣＶである。一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は４．５ＣＶ～５．５ＣＶである。一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は、約２ＣＶ、約５ＣＶ、または約１０ＣＶである。一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は約５ＣＶである。一部の実施形態では、カラムに適用する平衡化緩衝液の量は約２０ＣＶである。
【0562】
それだけには限定されないがカラムに適用する平衡化緩衝液を含む溶液は、カラム内の溶液が、特定の期間（本明細書中で「滞留時間」または「接触時間」と呼ぶ）の間固定相と接触しているように、特定の速度（たとえば、ｃｍ／時、ｍＬ／分）で固定相を流通するように設定する。一部の実施形態では、カラム中の溶液の滞留時間は、０．１分／ＣＶ～１０分／ＣＶ、たとえば、０．１分／ＣＶ～１分／ＣＶ、１分／ＣＶ～２分／ＣＶ、２分／ＣＶ～４分／ＣＶ、４分／ＣＶ～６分／ＣＶ、６分／ＣＶ～８分／ＣＶ、または８分／ＣＶ～１０分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中の溶液の滞留時間は、０．１分／ＣＶ、約０．５分／ＣＶ、約１．５分／ＣＶ、約２分／ＣＶ、約３分／ＣＶ、約３．６分／ＣＶ、または約４分／ＣＶ、約５分／ＣＶ、約６分／ＣＶ、約７分／ＣＶ、約８分／ＣＶ、約９分／ＣＶ、または約１０分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中の溶液の滞留時間は１．５～４．５分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中の溶液の滞留時間は３．５～４．５分／ＣＶである。
【0563】
一部の実施形態では、高さ約５ｃｍ、直径約０．５ｃｍ、および体積約１．０ｍＬを有するカラム中の溶液の滞留時間は、約０．５分／ＣＶである。一部の実施形態では、高さ約１５ｃｍ、直径約０．６６ｃｍ、および体積約５．１ｍＬを有するカラム中の溶液の滞留時間は、約０．５分／ＣＶ、約１．５分／ＣＶ、または約４分／ＣＶである。一部の実施形態では、高さ約１９．５ｃｍ、直径約０．６６ｃｍ、および体積約６．６７ｍＬを有するカラム中の溶液の滞留時間は、約４分／ＣＶである。一部の実施形態では、高さ約１０ｃｍ、直径約２．５ｃｍ、および約４９ｍＬの体積を有するカラム中の溶液の滞留時間は、１．５分／ＣＶ～２．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ）である。一部の実施形態では、高さ約１６ｃｍ、直径約１０ｃｍ、および約１．２５６Ｌ～１．３Ｌの体積を有するカラム中の溶液の滞留時間は、３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）である。一部の実施形態では、高さ約２０．５ｃｍ、２０ｃｍの直径、および体積約６．４Ｌを有するカラム中の溶液の滞留時間は、約３．６分／ＣＶである。一部の実施形態では、約６．４Ｌのカラム中の溶液の滞留時間は、３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）である。一部の実施形態では、ＡＥＸ固定相を含む６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラム中の、それだけには限定されないが平衡化緩衝液を含む溶液の滞留時間は、３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）である。
【0564】
当業者は、カラムを通る溶液の線速度（本明細書中で「線形流速度」または「速度」とも呼ぶ）は、少なくとも部分的に、カラムの体積およびまたは寸法ならびにそれ中の固定相に関連することを理解されよう。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る、それだけには限定されないが平衡化緩衝液を含む溶液の線速度は、１００ｃｍ／時～１８００ｃｍ／時、たとえば、１００ｃｍ／時～２００ｃｍ／時、２００ｃｍ／時～４００ｃｍ／時、４００ｃｍ／時～６００ｃｍ／時、６００ｃｍ／時～８００ｃｍ／時、８００ｃｍ／時～１０００ｃｍ／時、１０００ｃｍ／時～１５００ｃｍ／時、または１５００ｃｍ／時～１８００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約１００ｃｍ／時、約２４０ｃｍ／時、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時、約６００ｃｍ／時、約６１１ｃｍ／時、または約１７９０ｃｍ／時である。
【0565】
一部の実施形態では、約５ｃｍの高さであり、直径約０．５ｃｍ、および体積約１．０ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約６１１ｃｍ／時である。一部の実施形態では、約１５ｃｍの高さであり、直径約０．６６ｃｍ、および体積約５．１ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約６００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、約１５ｃｍの高さであり、直径約０．６６ｃｍ、および体積約５．１ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約１７９０ｃｍ／時である。一部の実施形態では、約１０ｃｍの高さであり、直径約２．５ｃｍ、および体積約４９ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約２９８ｃｍ／時である。一部の実施形態では、約１６ｃｍの高さであり、直径約１０ｃｍ、および体積約１２５６ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、約２４０ｃｍ／時である。一部の実施形態では、約２０．５ｃｍの高さであり、直径約２０ｃｍ、および体積約６．４Ｌを有するカラム中の固定相を通る溶液の線速度は、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば３００ｃｍ／時）である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラム中のＡＥＸ固定相を通る、それだけには限定されないが平衡化緩衝液を含む溶液の線速度は、約２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）である。
【0566】
一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る、それだけには限定されないが平衡化緩衝液を含む溶液の流速（すなわち体積流速）は、１．０ｍＬ／分～３．０Ｌ／分、たとえば、１．０ｍＬ／分～１０ｍＬ／分、１０ｍＬ／分～１００ｍＬ／分、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分～１０００ｍＬ／分、１ｍＬ／分～１．５Ｌ／分、１ｍＬ／分～２Ｌ／分、または２ｍＬ／分～３Ｌ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る溶液の流速は、約１ｍＬ／分、約１．２８ｍＬ／分、約１．６７ｍＬ／分、約３１４ｍＬ／分、約１．５７Ｌ／分、約１．８Ｌ／分、約２Ｌ／分、約３Ｌ／分である。
【0567】
一部の実施形態では、高さ約１５ｃｍ、直径約０．６６、および約５．１ｍＬの体積を有するカラム中の固定相を通る溶液の流速は、約１．２８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、高さ約１９．５ｃｍ、直径約０．６６、および約６．６７ｍＬの体積を有するカラム中の固定相を通る溶液の流速は、約１．６７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、高さ約１６ｃｍ、直径１０ｃｍ、および体積約１２５６ｍＬを有するカラム中の固定相を通る溶液の流速は、約３１４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、高さ約２０．５ｃｍ、直径約２０ｃｍ、および体積約６．４Ｌを有するカラム中の固定相を通る溶液の流速は、約１．８Ｌ／分である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラム中のＡＥＸ固定相を通る、それだけには限定されないが平衡化緩衝液を含む溶液の流速は、１．５ｍＬ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）である。
【0568】
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法は、カラム中のＡＥＸ固定相を平衡化することを含む。一部の実施形態では、平衡化は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードすることに先行する。一部の実施形態では、平衡化は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液をカラム上にロードすることに続く。
【0569】
一部の実施形態では、平衡化は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、平衡化は、４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む平衡化緩衝液を、ＡＥＸ固定相を含む６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムに、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0570】
一部の実施形態では、平衡化は、４００ｍＭ～６００ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリス、および０．００５％～０．０１５％のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、平衡化は、４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、ＡＥＸ固定相を含むカラムに、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、カラムは６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）である。一部の実施形態では、カラムは３０ｍＬ～７０ｍＬ（たとえば、約４９ｍＬ、約５２ｍＬ）である。
【0571】
一部の実施形態では、平衡化は、１００ｍＭ～３００ｍＭのヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭのトリス、および０．０％～１．０％のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、平衡化は、≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む平衡化緩衝液を、ＡＥＸ固定相を含むカラムに、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、カラムは６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）である。一部の実施形態では、カラムは３０ｍＬ～７０ｍＬ（たとえば、約４９ｍＬ、約５２ｍＬ）である。
【0572】
一部の実施形態では、平衡化は、５０ｍＭ～１５０ｍＭのトリスおよび０．００５％～０．０１５％のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、平衡化は、４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む平衡化緩衝液を、ＡＥＸ固定相を含むカラムに、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、２分／ＣＶ、４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、カラムは６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）である。一部の実施形態では、カラムは３０ｍＬ～７０ｍＬ（たとえば、約４９ｍＬ、約５２ｍＬ）である。
【0573】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法において使用するための、ＡＥＸ固定相を調製する方法であって、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、約５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）もしくは約１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、および／またはｖｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップを含み、ステップｉ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよく、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ９ベクターまたはｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ステップ（たとえばロードステップ）が任意の平衡化ステップの間に起こる場合があってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、ステップｉ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つを、６Ｌ～６．６Ｌのカラム（たとえば約６．４Ｌ）を通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速で、または１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分で行う。当業者は、上記ステップの順序を変動させ得ることを理解されよう。
【0574】
希釈および濾過
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶液の希釈および任意選択で濾過による、溶液の調製を含む。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および／または少なくとも１つの精製もしくはプロセスステップを受けた回収後の溶液であり得る。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、溶液をＡＥＸカラムを通すプロセスに適合性があるようにするために、ＡＥＸカラム上にロードする前に希釈および任意選択で濾過し得る。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈および任意選択で濾過することは、溶液のｐＨおよび／または伝導率の変化をもたらす。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、１Ｌ～２０００Ｌ（またはそれより大きい）単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる溶出液である。
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶液の希釈および任意選択で濾過による、溶液の調製を含む。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および／または少なくとも１つの精製もしくはプロセスステップを受けた回収後の溶液であり得る。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、溶液をＡＥＸカラムを通すプロセスに適合性があるようにするために、ＡＥＸカラム上にロードする前に希釈および任意選択で濾過し得る。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液を希釈および任意選択で濾過することは、溶液のｐＨおよび／または伝導率の変化をもたらす。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、１Ｌ～２０００Ｌ（またはそれより大きい）単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる溶出液である。
【0575】
ＡＥＸによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む溶液を調製する方法は、ｉ）親和性溶出液を希釈するステップと、任意選択でｉｉ）ステップｉ）からの親和性溶出液を濾過して、希釈した親和性溶出液（本明細書中で「希釈した親和性プール」、「ロード」、または「ＡＥＸロード」とも呼ぶ）を生成するステップとを含む。一部の実施形態では、希釈および任意選択の濾過後の親和性溶出液のｐＨは、希釈前の親和性溶出液のｐＨと比較して増加している。一部の実施形態では、希釈および任意選択の濾過後の親和性溶出液の伝導率は、希釈前の親和性溶出液の伝導率と比較して減少している。一部の実施形態では、希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液をＡＥＸ固定相上にロードする。
【0576】
一部の実施形態では、親和性溶出液は、１ｍＬ～２０００Ｌ、または２０００Ｌより大きい体積を有する容器（たとえば単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ））中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性精製から作製される。一部の実施形態では、親和性溶出液は、約１ｍＬ、約１０ｍＬ、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約２５０ｍＬ、約５００ｍＬ、約７５０ｍＬ、約１Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２５０Ｌ、約５００Ｌ、約１０００Ｌ、約２０００Ｌ、またはそれより大きい体積を有する容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から作製される。一部の実施形態では、親和性溶出液は、１ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～５００ｍＬ、５００ｍＬ～７５０ｍＬ、７５０ｍＬ～１Ｌ、１Ｌ～１０Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、５０Ｌ～１００Ｌ、１００Ｌ～２５０Ｌ、２５０Ｌ～５００Ｌ、５００Ｌ～７５０Ｌ、７５０Ｌ～１０００Ｌ、１０００Ｌ～１５００Ｌ、１５００Ｌ～２０００Ｌ、２０００Ｌ～３５００Ｌ、３５００Ｌ～４０００Ｌ、または４５００Ｌ～５０００Ｌの体積を有する容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性精製から作製される。一部の実施形態では、親和性溶出液は、１ｍＬ～５０００Ｌ、１００ｍＬ～５０００Ｌ、１００ｍＬ～４０００Ｌ、１００ｍＬ～２０００Ｌ、１００ｍＬ～１０００Ｌ、１Ｌ～５０００Ｌ、１Ｌ～４０００Ｌ、１Ｌ～２０００Ｌ、１Ｌ～１０００Ｌ、５００ｍＬ～５０００Ｌ、５００ｍＬ～２０００Ｌ、または５００ｍＬ～１０００Ｌの体積を有する容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性精製から作製される。
【0577】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を希釈することは、溶液を約２～２５倍もしくは約５～２０倍、または約１０～２０倍（たとえば、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍）に希釈して、希釈した親和性溶出液を生成することを含む。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を希釈することは、溶液を約２倍に希釈することを含む。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を希釈することは、溶液を約１５倍に希釈することを含む。
【0578】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を希釈することは、カラムと「インラインで」行い、希釈溶液（希釈剤）が、第１のチューブを通してＹ字コネクタへと送達され、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、第２のチューブを通してＹ字コネクタへと送達され、スタティックミキサーが、Ｙ字コネクタの後に位置する第３のチューブ内に含有されていてもよい。
【0579】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を希釈することは、「インラインで」行い、保持容器（たとえば受水槽）内へと導く。たとえば、希釈溶液（希釈剤）が、第１のチューブを通してＹ字コネクタへと送達され、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液が、第２のチューブを通してＹ字コネクタへと送達され、Ｙ字コネクタの終端が、クロマトグラフィーカラム（たとえばＡＥＸカラム）と接続されていてもよい保持容器に接続されている。
【0580】
一部の実施形態では、希釈は、希釈溶液を、第１のチューブを通してＹ字コネクタへと１～５ｍＬ／分（たとえば約３．５ｍＬ／分）の流速で送達すること、および精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、第２のチューブを通して０．１～２ｍＬ／分（たとえば約０．２５ｍＬ／分）の流速で送達することを含む。
【0581】
一部の実施形態では、希釈は、親和性溶出液が約１５倍に希釈されるように、希釈溶液を、第１のチューブを通してＹ字コネクタへと約３．５ｍＬ／分の流速で送達すること、および親和性溶出液を、第２のチューブを通して約０．２５ｍＬ／分の流速で送達することを含む。
【0582】
一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、緩衝剤（トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシン）を含む希釈溶液で希釈することを含む。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、１０ｍＭ～５００ｍＭの緩衝剤（たとえばトリス）を含む希釈溶液で希釈する。一部の実施形態では、希釈溶液は、約１０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、約５０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ、約３５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約２５０ｍＭのトリスを含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、約２００ｍＭのトリスを含む。
【0583】
一部の実施形態では、希釈溶液は、アミノ酸、たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリンを含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、または約６００ｍＭのアミノ酸（たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリン）を含む。
【0584】
一部の実施形態では、希釈溶液は、アミノ酸、たとえばヒスチジンまたはアルギニンを含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、１０ｍＭ～６００ｍＭのアミノ酸（たとえば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、またはシトルリン）を含む。一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ～約６００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４００ｍＭ、約１０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、約５０ｍＭ～約６００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約５０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約６００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約２５０ｍＭのアミノ酸（たとえばヒスチジン）を含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、約２００ｍＭのヒスチジンを含む。
【0585】
一部の実施形態では、希釈溶液は、界面活性剤、たとえば、Ｐ１８８、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ－３５、またはＮＰ－４０を含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、０．００５％～１．５％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、０．１％～１．０％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、約０．０１％～約１．５％、約０．０１％～約１．０％、約０．０１％～約０．７５％、約０．０５％～約１．５％、約０．０５％～約１．０％、約０．０５％～約０．７５％、約０．１％～約１．５％、約０．１％～約１．０％、約０．１％～約０．７５％、または約０．２５％～約０．７５％の界面活性剤（たとえばＰ１８８）を含む。一部の実施形態では、希釈溶液は、約０．５％のＰ１８８を含む。
【0586】
一部の実施形態では、希釈溶液は、８～１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、８．５～９．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、８．７～９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、または約１０．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、約８．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、約８．９のｐＨを有する。一部の実施形態では、希釈溶液は、約９．０のｐＨを有する。
【0587】
一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９；１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１；１００ｍＭのトリス、ｐＨ９；１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ９；１００ｍＭのトリス、０．１％のＰ１８８、ｐＨ９；１００ｍＭのトリス、１．０％のＰ１８８、ｐＨ９；１Ｍのトリス、ｐＨ９；１５０ｍＭのアセテート、１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ４．２；５ｍＭのアルギニン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＰ１８８、１００ｍＭのトリス、ｐＨ８．９；５０ｍＭのアルギニン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＰ１８８、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９；５００ｍＭのアルギニン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＰ１８８、４００ｍＭのトリス、ｐＨ９．１；２００ｍＭのグリシン、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのトリス、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のグリセロール、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％のグリセロール、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のイオジキサノール、ｐＨ８．８；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％のイオジキサノール、ｐＨ８．８；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．９；２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８；およびその組合せからなる群から選択される緩衝液で希釈することを含む。
【0588】
一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む緩衝液、約１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１を含む緩衝液、または両方で希釈することを含む。一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む緩衝液、約１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１を含む緩衝液、または両方で７～８倍（たとえば約７．１倍）に希釈することを含む。
【0589】
一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で希釈することを含む。一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）を、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０（たとえば約８．８）を含む緩衝液で、重量で１０～２０倍（たとえば約１５倍）に希釈することを含む。一部の実施形態では、希釈は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、約２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０（たとえばｐＨ約８．８）を含む緩衝液で、重量で１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈し、それによって希釈した親和性溶出液を形成することを含む。
【0590】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）の希釈の前に、希釈溶液中のＭｇＣｌ２の濃度が約１．７ｍＭであるように、溶液に２０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加する。一部の実施形態では、ＭｇＣｌ２は溶液中のｒＡＡＶベクターを安定化させる。
【0591】
一部の実施形態では、濾過は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液、希釈した親和性溶出液）を、溶液をＡＥＸカラム上にロードする前に濾過することを含む。一部の実施形態では、濾過の前に、フィルターを注入用水および／または希釈溶液で事前に濡らす。一部の実施形態では、濾過は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液、希釈した親和性溶出液）を、核酸もしくはタンパク質凝集物、または他の高分子質量種などの凝集物を収集するが、ＡＡＶカプシドが流通することを可能にするフィルターを通して濾過することを含む。一部の実施形態では、フィルターは、０．１μｍ～０．４５μｍのフィルター（たとえば０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターまたは０．４５μｍのＰＥＳフィルター）である。一部の実施形態では、濾過は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む希釈した親和性溶出液を、ＡＥＸカラム上にロードする前に、０．２μｍのフィルターを通して濾過することを含む。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液、希釈した親和性溶出液）を濾過するために使用するフィルターは、カラムと別々であり得る、またはカラムもしくはクロマトグラフィー装置（クロマトグラフィースキッドとも呼ばれる）とインラインであり得る。
【0592】
一部の実施形態では、濾過は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む希釈した親和性溶出液を、溶出液をＡＥＸカラム上にロードする前に、インラインの０．２μｍのフィルターを通して濾過することを含む。
【0593】
一部の実施形態では、希釈および任意選択で濾過する前の、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）のｐＨは、３．０～４．４であり、希釈および任意選択で濾過した後の、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）のｐＨは、８．５～９．５、８．７～９．０、または≧８．６（たとえば、ｐＨ約８．８、ｐＨ９．０）である。
【0594】
一部の実施形態では、希釈および任意選択で濾過する前の、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）の伝導率は、５．０ｍＳ／ｃｍ～７．０ｍＳ／ｃｍ（たとえば約５．５ｍＳ／ｃｍ～６．５ｍＳ／ｃｍ）であり、希釈および任意選択で濾過した後の、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）の伝導率は、１．７ｍＳ／ｃｍ～３．５ｍＳ／ｃｍ、１．８ｍＳ／ｃｍ～２．８ｍＳ／ｃｍ、２．２ｍＳ／ｃｍ～２．６ｍＳ／ｃｍ、または≦２．５ｍＳ／ｃｍである。一部の実施形態では、希釈および任意選択で濾過後の親和性溶出液の伝導率は、約１．８ｍＳ／ｃｍ～約２．８ｍＳ／ｃｍである。一部の実施形態では、希釈および任意選択で濾過後の親和性溶出液の伝導率は、約２．３＋／－０．５ｍＳ／ｃｍである。
【0595】
本明細書中で使用する用語「パーセントＶＧ希釈収率」または「％ＶＧ希釈収率」とは、希釈前の親和性プール（本明細書中で親和性溶出液とも呼ぶ）中に存在するＶＧの量の百分率としての、希釈した親和性プール（本明細書中で希釈した親和性溶出液とも呼ぶ）中に存在するＶＧの量をいう。たとえば、％ＶＧ希釈収率＝（（希釈した親和性プール中のＶＧの量）／（親和性プール中のＶＧの量））＊１００である。
【0596】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）中で回収されるＶＧの百分率（％ＶＧ希釈収率）は、希釈および任意選択で濾過する前に溶液（たとえば親和性溶出液）中に存在するＶＧの６０％～１００％である。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）の％ＶＧ収率は、希釈および任意選択で濾過する前に溶液（たとえば親和性溶出液）中に存在するＶＧの６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％である。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）の％ＶＧ収率は、希釈および任意選択で濾過する前に溶液中に存在するＶＧの約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％である。
【0597】
本明細書中に開示した方法に従って親和性溶出液を希釈する一部の実施形態は、８８％＋／－３６％の％ＶＧ希釈収率をもたらす。本明細書中に開示した方法に従って親和性溶出液を希釈する一部の実施形態は、１２０％＋／－１２％の％ＶＧ希釈収率をもたらす。２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる親和性溶出液を希釈することは、３５％～１００％（たとえば４１％～９２％）の％ＶＧ希釈収率をもたらす。２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる親和性溶出液を希釈することは、７０％～＞１００％（たとえば８８％～１５４％）の％ＶＧ希釈収率をもたらす。
【0598】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）のＺ平均（ｎｍの単位で与え、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定する）を測定する。Ｚ平均は、溶液中に存在するｒＡＡＶカプシドの凝集のレベルを測定する。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液のＺ平均は、約１５ｎｍ～４０ｎｍ、１５ｎｍ～２０ｎｍ、２０ｎｍ～３０ｎｍ、または３０ｎｍ～４０ｎｍである。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液のＺ平均は、約１５ｎｍ、約１６ｎｍ、約１７ｎｍ、約１８ｎｍ、約１９ｎｍ、約２０ｎｍ、２１ｎｍ、約２２ｎｍ、約２３ｎｍ、約２４ｎｍ、約２５ｎｍ、約２６ｎｍ、約２７ｎｍ、約２８ｎｍ、約２９ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、または約４０ｎｍである。
【0599】
ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターを溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶液を、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０（たとえばｐＨ約８．８）を含む緩衝液で１４～１６倍（たとえば約１５倍）に希釈することを含み、０．１μｍ～０．４５μｍ（たとえば約０．２μｍ）のフィルターを通した希釈溶液の濾過を含む濾過を含んでいてよく、希釈および任意選択で濾過した溶液は、約８．６～９．０のｐＨ（たとえばｐＨ約８．９）および１．８ｍＳ／ｃｍ～２．８ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【0600】
本明細書中に開示する、ＡＥＸクロマトグラフィーによる精製のための、ｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を調製する方法は、ｉ）親和性溶出液を、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８を含む緩衝液で２～２５倍（たとえば約１５倍）に希釈するステップと、ｉｉ）任意選択でステップｉ）からの親和性溶出液を、０．２μｍのフィルターを通して濾過して、希釈した親和性溶出液を生成するステップであって、希釈した親和性溶出液のｐＨが親和性溶出液のｐＨと比較して増加しており、希釈した親和性溶出液の伝導率が親和性溶出液の伝導率と比較して減少しており、ｒＡＡＶベクターがＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、親和性溶出液が２５０Ｌまたは２０００Ｌの体積を有する容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性精製によって生成されてもよい、ステップとを含む。
【0601】
ロード
本明細書中に開示する、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法は、精製しようとする物質（たとえばｒＡＡＶベクター）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードすることを含む。ロードは、ロードをカラム上に自重供給すること、またはロードをクロマトグラフィーカラム上にポンピングすることによって行い得る。一部の実施形態では、ＡＥＸによって精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、それぞれが少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けている、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、溶液をＡＥＸカラムを通すプロセスに適合性があるようにするために、溶液をＡＥＸカラム上にロードする前に希釈、濾過、および／またはｐＨ調節し得る。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）、またはより大きな容器（たとえば単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ））中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる溶出液であり、溶出液は希釈および濾過されている。
本明細書中に開示する、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法は、精製しようとする物質（たとえばｒＡＡＶベクター）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相上にロードすることを含む。ロードは、ロードをカラム上に自重供給すること、またはロードをクロマトグラフィーカラム上にポンピングすることによって行い得る。一部の実施形態では、ＡＥＸによって精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、それぞれが少なくとも１つの他の精製またはプロセスステップ（たとえば、細胞溶解、凝結、濾過、希釈、ｐＨ調節、クロマトグラフィー）を受けている、親和性溶出液、細胞溶解液からの上清、および回収後の溶液からなる群から選択される。精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、溶液をＡＥＸカラムを通すプロセスに適合性があるようにするために、溶液をＡＥＸカラム上にロードする前に希釈、濾過、および／またはｐＨ調節し得る。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液は、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）、またはより大きな容器（たとえば単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ））中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から生じる溶出液であり、溶出液は希釈および濾過されている。
【0602】
一部の実施形態では、ロードするステップは、ベクターゲノム内の配列のｑＰＣＲ分析によって測定して、約２．０×１０１２個のベクターゲノム（ＶＧ）／ｍＬ～２．０×１０１５ＶＧ／ｍＬ、たとえば、２．０×１０１２ＶＧ／ｍＬ～２．０×１０１３ＶＧ／ｍＬ、２．０×１０１３ＶＧ／ｍＬ～２．０×１０１４ＶＧ／ｍＬ、１．０×１０１４ＶＧ／ｍＬ～３．０×１０１４ＶＧ／ｍＬ、２．０×１０１４ＶＧ／ｍＬ～２．０×１０１５ＶＧ／ｍＬ、またはそれより多くのカラム体積（「カラムチャレンジＶＧ／ｍＬの樹脂」とも呼ぶ）を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、ＡＥＸカラム上に適用することを含む。一部の実施形態では、ロードするステップは、ベクターゲノム内の導入遺伝子配列のｑＰＣＲ分析によって測定して（たとえば導入遺伝子がＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子である場合）、６．３×１０１３～９．４×１０１３ＶＧ／ｍＬのカラム体積を含む希釈溶液（たとえば親和性溶出液）を、約３０ｍＬ～７０ｍＬのＡＥＸカラム上に適用することを含む。一部の実施形態では、ロードするステップは、ベクターゲノム内のＩＴＲ配列のｑＰＣＲ分析によって測定して、５×１０１３～１．３×１０１４ＶＧ／ｍＬのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、約１．３ＬのＡＥＸカラム上に適用することを含む。一部の実施形態では、ロードするステップは、ベクターゲノム内の導入遺伝子配列のｑＰＣＲ分析によって測定して、２．６×１０１２～６．８×１０１３ＶＧ／ｍＬのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、約６．４ＬのＡＥＸカラム上に適用することを含む。
【0603】
一部の実施形態では、ロードするステップは、２．５×１０１５ＶＧ／Ｌ～２．５×１０１６ＶＧ／Ｌ、２．５×１０１６ＶＧ／Ｌ～２．５×１０１７ＶＧ／Ｌ、２．５×１０１５ＶＧ／Ｌ～３．０×１０１７ＶＧ／Ｌ、またはそれより多くのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、ＡＥＸカラム上に適用することを含む。
【0604】
一部の実施形態では、ロードするステップは、８．０×１０１２個の全ＶＧ～２．０×１０１８個の全ＶＧ、たとえば、８．０×１０１２個の全ＶＧ～８．０×１０１３個の全ＶＧ、８．０×１０１３～８．０×１０１４個の全ＶＧ、８．０×１０１４個の全ＶＧ～８．０×１０１５個の全ＶＧ、８．０×１０１５個の全ＶＧ～８．０×１０１６個の全ＶＧ、８．０×１０１６個の全ＶＧ～８．０×１０１７個の全ＶＧ、８．０×１０１７個の全ＶＧ～２．０×１０１８個の全ＶＧ、またはそれより多くを含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、ＡＥＸカラム上に適用することを含む。一実施形態では、ロードするステップは、≦１５×１０１６ＶＧ／Ｌのカラム体積を含む、希釈および任意選択で濾過した溶液（たとえば親和性溶出液）を、ＡＥＸカラム上に適用することを含み、ＶＧは、導入遺伝子の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって測定してもよい。
【0605】
精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液（たとえば親和性溶出液）をカラム上にロードする際、溶液は、特定の速度（たとえば、ｃｍ／時、ｍＬ／分）でカラム固定相を通って流れ、特定の期間（すなわち滞留時間）の間固定相と接触している。
【0606】
一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の滞留時間は、０．１分／ＣＶ～５分／ＣＶ、たとえば、０．１分／ＣＶ～１．０分／ＣＶ、１．０分／ＣＶ～２分／ＣＶ、２分／ＣＶ～３分／ＣＶ、３分／ＣＶ～４分／ＣＶ、４分／ＣＶ～５分／ＣＶ、またはそれより長くである。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の滞留時間は、約０．５分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の滞留時間は、約１．５分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の滞留時間は、約２．０分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の滞留時間は、３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶである。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のＡＥＸカラム上にロードした、ｒＡＡＶベクターを含む希釈および／または濾過した親和性溶出液の滞留時間は、３．０分／ＣＶ～５．０分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）である。
【0607】
一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の線速度は、１００ｃｍ／時～１８００ｃｍ／時、たとえば、１００ｃｍ／時～２００ｃｍ／時、２００ｃｍ／時～４００ｃｍ／時、４００ｃｍ／時～６００ｃｍ／時、６００ｃｍ／時～８００ｃｍ／時、８００ｃｍ／時～１０００ｃｍ／時、１０００ｃｍ／時～１５００ｃｍ／時、１５００ｃｍ／時～１８００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の線速度は、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）である。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の線速度は、約３００ｃｍ／時、約６００ｃｍ／時、約６１１ｃｍ／時、または約１７９０ｃｍ／時である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のＡＥＸカラム上にロードした、ｒＡＡＶベクターを含む希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液の線速度は、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）である。
【0608】
一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の流速は、１．０ｍＬ／分～３．０Ｌ／分、たとえば、１．０ｍＬ／分～１０ｍＬ／分、１０ｍＬ／分～１００ｍＬ／分、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分～１０００ｍＬ／分、１ｍＬ／分～１．５Ｌ／分、１ｍＬ／分～２Ｌ／分、２ｍＬ／分～３Ｌ／分である。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の流速は、約１．２８ｍＬ／分である。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の流速は、約３１４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通るｒＡＡＶベクターを含む溶液の流速は、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分である。一部の実施形態では、カラム上にロードしたｒＡＡＶベクターを含む溶液の流速は、約１．８Ｌ／分である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラム上にロードした、ｒＡＡＶベクターを含む希釈および／または濾過した親和性溶出液の流速は、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）である。
【0609】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、ｉ）親和性溶出液を、界面活性剤（たとえばＰ１８８）、アミノ酸（たとえばヒスチジン）、および緩衝液（たとえばトリス）を含む緩衝液で希釈するステップと、ｉｉ）希釈した親和性溶出液を任意選択で濾過するステップと、ｉｉｉ）希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液を、ＡＥＸ固定相を含むカラム上にロードするステップであって、ロードする前にＡＥＸ固定相をフラッシュ、浄化、すすぎ、および／または平衡化し、ＡＥＸ固定相がＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよいステップとを含む。
【0610】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、ｉ）親和性溶出液を、約１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、１．０％～１．５％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で、１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈するステップと、ｉｉ）希釈した親和性溶出液を、インラインで０．１～０．４５μｍ（たとえば約０．２μｍ）のフィルターを通して、任意選択で濾過するステップと、ｉｉｉ）希釈および濾過した親和性溶出液を、ＡＥＸ固定相を含むカラム上にロードするステップとを含み、少なくとも１つのステップを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、カラムを通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい。一部の実施形態では、カラムは、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムである。
【0611】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法であって、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）もしくは１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ）、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．０（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉｉ）親和性溶出液をカラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、ａ）１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよく、任意選択で、ｂ）固定相に適用する前にインラインで０．１μｍ～０．４５μｍ（たとえば約０．２μｍ）のフィルターを通して濾過されていてもよい、ステップ、および／またはｖｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップを含み、ステップｉ）～ｖｉｉｉ）のうちの少なくとも１つは、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい。一部の実施形態では、ステップｉ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つは、６Ｌ～６．６Ｌのカラム（たとえば約６．４Ｌ）を通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）または１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速で行う、方法を提供する。当業者は、上記ステップの順序を変動させ得ることを理解されよう。
【0612】
ロードチェイス
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、ｒＡＡＶベクターを含む溶液の適用の後に、ロードチェイス溶液をカラム固定相に適用することを含む。ロードチェイスは、ロードまたはロード溶液の適用を完了させ、非結合材料をカラムから除去する役割を果たす。一部の実施形態では、ロードチェイスは、非結合材料をカラムから除去する役割を果たす。一部の実施形態では、ロードチェイス溶液は、５ｍＭ～５０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む。一部の実施形態では、９～１１ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）のロードチェイス溶液をカラム固定相に適用する。一部の実施形態では、ロードチェイス溶液は、２００ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時（たとえば約１８００ｃｍ／時）の速度および／または０．５分／ＣＶの滞留時間でカラム固定相に適用する。一部の実施形態では、９ＣＶ～１１ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）の、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含むロードチェイス溶液を、任意選択で２００ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時（たとえば約１８００ｃｍ／時）の速度および／または約０．５分／ＣＶの滞留時間で、カラム中のＡＥＸ固定相に適用する。
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、ｒＡＡＶベクターを含む溶液の適用の後に、ロードチェイス溶液をカラム固定相に適用することを含む。ロードチェイスは、ロードまたはロード溶液の適用を完了させ、非結合材料をカラムから除去する役割を果たす。一部の実施形態では、ロードチェイスは、非結合材料をカラムから除去する役割を果たす。一部の実施形態では、ロードチェイス溶液は、５ｍＭ～５０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む。一部の実施形態では、９～１１ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）のロードチェイス溶液をカラム固定相に適用する。一部の実施形態では、ロードチェイス溶液は、２００ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時（たとえば約１８００ｃｍ／時）の速度および／または０．５分／ＣＶの滞留時間でカラム固定相に適用する。一部の実施形態では、９ＣＶ～１１ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）の、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含むロードチェイス溶液を、任意選択で２００ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時（たとえば約１８００ｃｍ／時）の速度および／または約０．５分／ＣＶの滞留時間で、カラム中のＡＥＸ固定相に適用する。
【0613】
勾配溶出
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、勾配溶出によるフル、中間体、および／または空カプシドの回収を含む。勾配溶出は、異なるｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を有する、少なくとも２つの異なる溶液（たとえば勾配溶出緩衝液）の使用を含み得る。勾配溶出の経過中、溶液が混合され、カラム固定相を流通するにつれて、ｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度の勾配が作られるように、第１の溶液の百分率を、第２の溶液の百分率に対して反比例する様式で変動させる。たとえば、勾配溶出の開始時に、第１の溶液の百分率（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）は１００％であり、第２の溶液の百分率（たとえば、第２の勾配溶出、緩衝液Ｂ）は０％であり、勾配溶出の終了時に、第１の溶液の百分率は０％であり、第２の溶液の百分率は１００％である。別の実施形態では、勾配溶出の開始時に、第１の溶液の百分率（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）は１００％であり、第２の溶液の百分率（たとえば、第２の勾配溶出、緩衝液Ｂ）は０％であり、勾配溶出の終了時に、第１の溶液の百分率は２５％であり、第２の溶液の百分率は７５％である。当業者は、勾配の開始時および勾配の終了時でのそれぞれの溶液の百分率は、０％～１００％のどこでもよいことを理解されよう。たとえば、一部の実施形態では、溶出の開始時、溶出の終了時、または溶出の過程中の任意の時点に、第１の勾配溶出緩衝液の百分率対第２の勾配溶出緩衝液は、約１００％／０％、約９９％／１％、約９８％／２％、約９７％３％、約９６％／４％、約９５％／５％、約９０％１０％、約８０％２０％、約７５％／２５％、約７０％／３０％、約６０％／４０％、約５０％／５０％、約４０％／６０％、約３０％／７０％、約２５％／７５％、約２０％／８０％、約１０％／９０％、約５％／９５％、約４％／９６％、約３％／９７％、約２％／９８％、約１％／９９％、または約０％／１００％である。
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、勾配溶出によるフル、中間体、および／または空カプシドの回収を含む。勾配溶出は、異なるｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度を有する、少なくとも２つの異なる溶液（たとえば勾配溶出緩衝液）の使用を含み得る。勾配溶出の経過中、溶液が混合され、カラム固定相を流通するにつれて、ｐＨ、伝導率、および／またはモディファイヤー濃度の勾配が作られるように、第１の溶液の百分率を、第２の溶液の百分率に対して反比例する様式で変動させる。たとえば、勾配溶出の開始時に、第１の溶液の百分率（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）は１００％であり、第２の溶液の百分率（たとえば、第２の勾配溶出、緩衝液Ｂ）は０％であり、勾配溶出の終了時に、第１の溶液の百分率は０％であり、第２の溶液の百分率は１００％である。別の実施形態では、勾配溶出の開始時に、第１の溶液の百分率（たとえば、第１の勾配溶出緩衝液、緩衝液Ａ）は１００％であり、第２の溶液の百分率（たとえば、第２の勾配溶出、緩衝液Ｂ）は０％であり、勾配溶出の終了時に、第１の溶液の百分率は２５％であり、第２の溶液の百分率は７５％である。当業者は、勾配の開始時および勾配の終了時でのそれぞれの溶液の百分率は、０％～１００％のどこでもよいことを理解されよう。たとえば、一部の実施形態では、溶出の開始時、溶出の終了時、または溶出の過程中の任意の時点に、第１の勾配溶出緩衝液の百分率対第２の勾配溶出緩衝液は、約１００％／０％、約９９％／１％、約９８％／２％、約９７％３％、約９６％／４％、約９５％／５％、約９０％１０％、約８０％２０％、約７５％／２５％、約７０％／３０％、約６０％／４０％、約５０％／５０％、約４０％／６０％、約３０％／７０％、約２５％／７５％、約２０％／８０％、約１０％／９０％、約５％／９５％、約４％／９６％、約３％／９７％、約２％／９８％、約１％／９９％、または約０％／１００％である。
【0614】
一部の実施形態では、溶出の開始時、溶出の終了時、または溶出の過程中の任意の時点に、第１の勾配溶出緩衝液の百分率対第２の勾配溶出緩衝液の百分率は、約１００％～９０％／０％～１０％、９０％～８０％／１０％～２０％、８０％～７０％／２０％～３０％、７０％～６０％／３０％～４０％、６０％～５０％／４０％～５０％、５０％～４０％／５０％～６０％、４０％～３０％／６０％～７０％、３０％～２０％／７０％～８０％、２０％～１０％／８０％～９０％、１０％～０％／９０％～１００％。
【0615】
一部の実施形態では、１０～６０ＣＶの溶液をカラムに適用する過程中に、勾配溶出の終了時に、勾配溶出緩衝液Ａの百分率が０％であり、勾配溶出緩衝液Ｂの百分率が１００％であるように、緩衝液Ａ（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）の百分率を減少させ、緩衝液Ｂ（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）の百分率を増加させる。一部の実施形態では、約２０ＣＶの溶液をカラムに適用する過程中に、緩衝液Ｂの増加の速度が約５％の緩衝液Ｂ／ＣＶであり、溶液中の緩衝液Ｂの最終百分率は１００％であるように、緩衝液Ａ（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）の百分率を減少させ、緩衝液Ｂ（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）の百分率を増加させる。一部の実施形態では、約３７．５ＣＶの溶液をカラムに適用する過程中に、緩衝液Ｂの増加の速度が約２％の緩衝液Ｂ／ＣＶであり、溶液中の緩衝液Ｂの最終百分率が７５％であるように、緩衝液Ａ（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）の百分率を減少させ、緩衝液Ｂ（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）の百分率を増加させる。
【0616】
一部の実施形態では、１０～６０ＣＶの溶液をカラムに適用する過程中に、勾配溶出の終了時に、勾配溶出緩衝液Ａの百分率が１００％であり、勾配溶出緩衝液Ｂの百分率が０％であるように、緩衝液Ａ（たとえば第１の溶出緩衝液）の百分率を増加させ、緩衝液Ｂ（たとえば第２の溶出緩衝液）の百分率を減少させる。当業者は、勾配溶出を緩衝液の様々な百分率（たとえば、０％～７５％の緩衝液Ｂ、１００％～２５％の緩衝液Ａに対応；０％～５０％の緩衝液Ｂ、１００％～５０％の緩衝液Ａに対応）で実行し得ることを理解されよう。
【0617】
一部の実施形態では、本開示に記載の、ｒＡＡＶベクターをＡＥＸによって精製する方法はカラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップを含み、第１の勾配溶出緩衝液または第２の勾配溶出緩衝液の構成成分の濃度は、勾配溶出中に連続的に増加または減少する。一部の実施形態では、固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。第１の勾配溶出緩衝液または第２の勾配溶出緩衝液の構成成分の濃度の増加または減少の速度は、全ＣＶあたりの構成成分の濃度の変化と等しくてよい。一部の実施形態では、勾配溶出中の酢酸ナトリウムの濃度の増加速度は、溶出中に固定相に適用した全ＣＶあたりの酢酸ナトリウムの濃度の変化に等しい。一部の実施形態では、構成成分の濃度の変化は、溶出の終了時の構成成分の濃度と比較した、溶出の開始時の構成成分の濃度に相対的である。たとえば、勾配溶出の開始時の構成成分（たとえば酢酸ナトリウムなどの塩）の濃度は０ｍＭ～１００ｍＭであり、溶出の終了時の構成成分の濃度は１００ｍＭ～１Ｍである。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時の塩（たとえば酢酸ナトリウム）の濃度は０ｍＭであり、勾配溶出の終了時の塩の濃度は４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）である。一部の実施形態では、構成成分の濃度の変化は、２ＣＶ～１００ＣＶの溶出緩衝液の過程中に、勾配の開始から勾配溶出の終了までで２ｍＭ～１Ｍである。一部の実施形態では、塩の濃度の変化は、溶出勾配が２０ＣＶの溶液を含む場合に、酢酸ナトリウム濃度の変化の速度が約５００ｍＭ／２０ＣＶ、または２５ｍＭ／ＣＶであるように、１０ＣＶ～６０ＣＶ、１０ＣＶ～５０ＣＶ、１０ＣＶ～４０ＣＶ、１０ＣＶ～３０ＣＶ、または１５ＣＶ～２５ＣＶ（たとえば２０ＣＶ）の溶出緩衝液の過程中に、勾配の開始から勾配溶出の終了までで約０ｍＭ～約５００ｍＭである。一部の実施形態では、塩の濃度の変化は、溶出勾配が３７．５ＣＶの溶液を含む場合に、酢酸ナトリウム濃度の変化の速度が約３７５ｍＭ／３７．５ＣＶ、または１０ｍＭ／ＣＶであるように、１０ＣＶ～６０ＣＶ、１０ＣＶ～５０ＣＶ、１０ＣＶ～４０ＣＶ、１０ＣＶ～３０ＣＶ、または１５ＣＶ～２５ＣＶ（たとえば３７．５ＣＶ）の溶出緩衝液の過程中に、勾配の開始から勾配溶出の終了までで約０ｍＭ～約３７５ｍＭである。
【0618】
一部の実施形態では、勾配溶出中、第１の勾配溶出緩衝液、第２の勾配溶出緩衝液、または両方の混合物の酢酸ナトリウムの濃度を、勾配溶出中に連続的に増加させ、酢酸ナトリウムの増加速度は、固定相に適用する全ＣＶあたりの酢酸ナトリウムの濃度の変化に等しく、勾配溶出にわたる酢酸ナトリウムの濃度の変化の速度は、約５ｍＭ／ＣＶ～１５ｍＭ／ＣＶ、１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ、１０ｍＭ／ＣＶ～４０ｍＭ／ＣＶ、１０ｍＭ～３０ｍＭ／ＣＶ、または２０ｍＭ／ＣＶ～３０ｍＭ／ＣＶ（たとえば、約１０ｍＭ／ＣＶ、約２５ｍＭ／ＣＶ）である。
【0619】
一部の実施形態では、勾配溶出にわたる構成成分の濃度の変化は、約１ｍＭ／ＣＶ～１Ｍ／ＣＶ、たとえば、１ｍＭ／ＣＶ～１０ｍＭ／ＣＶ、１ｍＭ／ＣＶ～２５ｍＭ／ＣＶ、５ｍＭ／ＣＶ～１５ｍＭ／ＣＶ、１０ｍＭ／ＣＶ～５０ｍＭ／ＣＶ、５０ｍＭ／ＣＶ～１００ｍＭ／ＣＶ、１００ｍＭ／ＣＶ～５００ｍＭ／ＣＶ、５００ｍＭ／ＣＶ～１Ｍ／ＣＶ、１ｍＭ／ＣＶ～７５０ｍＭ／ＣＶ、１ｍＭ／ＣＶ～５００ｍＭ／ＣＶ、１ｍＭ／ＣＶ～１００ｍＭ／ＣＶ、１０ｍＭ／ＣＶ～７５０ｍＭ／ＣＶ、または５０ｍＭ／ＣＶ～５００ｍＭ／ＣＶである。
【0620】
一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の塩の濃度を変動させ得る。一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の塩（たとえば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せ）の濃度は、増加または減少し得る。たとえば、勾配溶出の開始時に、勾配溶液中の塩の濃度は０ｍＭ～１００ｍＭであってよく、勾配溶出の経過中に５０ｍＭ～１Ｍ、たとえば、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～１５０ｍＭ、１５０ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～２５０ｍＭ、２５０ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、５００ｍＭ～６００ｍＭ、６００ｍＭ～７００ｍＭ、７００ｍＭ～８００ｍＭ、８００ｍＭ～９００ｍＭ、９００ｍＭ～１Ｍ、５０ｍＭ～７５０ｍＭ、５０ｍＭ～５００ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～１Ｍ、１００ｍＭ～７５０ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭまで増加する。さらなる例では、勾配溶出の開始時に、勾配溶液中の塩の濃度は、５０ｍＭ～１Ｍ、たとえば、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～１５０ｍＭ、１５０ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～２５０ｍＭ、２５０ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、５００ｍＭ～６００ｍＭ、６００ｍＭ～７００ｍＭ、７００ｍＭ～８００ｍＭ、８００ｍＭ～９００ｍＭ、９００ｍＭ～１Ｍ、５０ｍＭ～７５０ｍＭ、５０ｍＭ～５００ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～１Ｍ、１００ｍＭ～７５０ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭであってよく、勾配溶出の経過中に０ｍＭ～１００ｍＭまで減少する。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時に勾配溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約０ｍＭであり、勾配溶出の終了時に酢酸ナトリウムの濃度は約５００ｍＭである。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時に勾配溶出溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約０ｍＭであり、勾配溶出の終了時に勾配溶出溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は約３７５ｍＭである。
【0621】
一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液のｐＨを変動させ得る。一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液のｐＨは増加し得るまたは減少し得る。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時に、勾配溶液のｐＨは、７．０～１１．０（たとえば、７．０～７．５、７．５～８．０、８．０～８．５、８．５～９．０、９．０～９．５、１０．０～１０．５、１０．５～１１、７．５～１０．５、８．０～１０．０、８．５～９．５、または８．０～９．０）であり得る。一部の実施形態では、勾配溶出の終了時に、勾配溶液のｐＨは、７．０～１１．０（たとえば、７．０～７．５、７．５～８．０、８．０～８．５、８．５～９．０、９．０～９．５、１０．０～１０．５、１０．５～１１、７．５～１０．５、８．０～１０．０、８．５～９．５、または８．０～９．０）であり得る。
【0622】
一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液の伝導率を変動させ得る。一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液の伝導率は増加し得るまたは減少し得る。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時に、勾配溶液の伝導率は、１．０ｍＳ／ｃｍ～２．５ｍＳ／ｃｍ、たとえば１．２ｍＳ／ｃｍ～２．０ｍＳ／ｃｍであり得る。一部の実施形態では、勾配溶出の終了時に、勾配溶液の伝導率は、２０ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍ、たとえば２７ｍＳ／ｃｍ～３３ｍＳ／ｃｍであり得る。一部の実施形態では、勾配溶出の開始時に勾配溶液の伝導率は約１．６ｍＳ／ｃｍであり、勾配溶出の終了時に勾配溶液の伝導率約３０ｍＳ／ｃｍである。
【0623】
一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の緩衝液の濃度を変動させ得る。一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の緩衝液（たとえば、トリス（たとえばトリス塩基とトリス－ＨＣｌの混合物）、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシン）の濃度は、増加または減少し得る。たとえば、勾配溶出の開始時に、勾配溶液中の緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、１０ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、またはそれより高い範囲であり得る。勾配溶出の終了時に、勾配溶液中の緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、１０ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、またはそれより高い範囲であり得る。
【0624】
一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の界面活性剤の濃度を変動させ得る。一部の実施形態では、勾配溶出の過程中に、勾配溶液中の界面活性剤（たとえば、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せ）の濃度は、増加または減少し得る。たとえば、勾配溶液中の勾配溶出の開始時に、界面活性剤（たとえばＰ１８８）の濃度は、０．００５％～１．０％、たとえば、０．００５％～０．０１％、０．００５％～０．５％、０．０１％～１．０％、０．０１％～０．５％、０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０３％、０．０３％～０．０４％、０．０４％～０．０５％、０．０５％～０．０６％、０．０５％～１．０％、０．０５％～０．５％、０．０７％～０．０８％、０．０８％～０．０９％、０．０９％～０．１％、０．１％～０．５％、０．１％～１．０％、０．５％～１．０％の範囲であり得る。
【0625】
一部の実施形態では、勾配溶出の終了時に、勾配溶液中の界面活性剤（たとえばＰ１８８）の濃度は、０．００５％～１．０％、たとえば、０．００５％～０．０１％、０．００５％～０．５％、０．０１％～１．０％、０．０１％～０．５％、０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０３％、０．０３％～０．０４％、０．０４％～０．０５％、０．０５％～０．０６％、０．０５％～１．０％、０．０５％～０．５％、０．０７％～０．０８％、０．０８％～０．０９％、０．０９％～０．１％、０．１％～０．５％、０．１％～１．０％、０．５％～１．０％の範囲であり得る。
【0626】
勾配溶出の経過中、勾配溶液の１つまたは複数の態様（たとえば塩濃度）を変動させ得る一方で、伝導率、ｐＨ、緩衝液濃度、界面活性剤濃度などの勾配の他の態様は、一定に保ち得る。たとえば、勾配溶液のｐＨは、７．０～１１．０、たとえば、７．５～１０．５、８．０～１０．０、８．５～９．５、または８．０～９．０、７．０～７．５、７．５～８．０、８．０～８．５、８．５～９．０、９．０～９．５、９．５～１０、１０．０～１０．５、または１０．５～１１．０の範囲であり得るが、勾配溶出全体にわたって一定であり得る（たとえば、約８．８、約８．９、約９のｐＨ）。一部の実施形態では、勾配溶出溶液のｐＨは約８．９である。
【0627】
一部の実施形態では、勾配溶出中の、トリス、ビス－トリスプロパン、ビシン、およびその組合せなどの緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、１０ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭ、約１０ｍＭ～２００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、またはそれより高い範囲であり得るが、勾配溶出全体にわたって一定であり得る（たとえば、約２０ｍＭ、約１００ｍＭ）。一部の実施形態では、勾配溶出中のトリスなどの緩衝液の濃度は５０ｍＭ～１５０ｍＭである。一部の実施形態では、勾配溶出溶液中のトリスなどの緩衝液の濃度は約１００ｍＭである。
【0628】
一部の実施形態では、勾配溶出中の、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せなどの界面活性剤の濃度は、０．００５％～０．０１％、０．００５％～０．５％、０．０１％～１．０％、０．０１％～０．５％、０．０１％～０．０２％、０．０２％～０．０３％、０．０３％～０．０４％、０．０４％～０．０５％、０．０５％～０．０６％、０．０５％～１．０％、０．０５％～０．５％、０．０７％～０．０８％、０．０８％～０．０９％、０．０９％～０．１％、０．１％～０．５％、０．１％～１．０％、０．５％～１．０％の範囲であり得るが、勾配溶出全体にわたって一定であり得る。一部の実施形態では、勾配溶出中のＰ１８８の濃度は０．０５％～０．１％である。一部の実施形態では、勾配溶出中のＰ１８８の濃度は約０．０１％である。
【0629】
勾配溶出中、カラム内の条件、たとえば、ｐＨ、伝導率、塩濃度、および／またはモディファイヤー濃度が変化するにつれて、カラム上にロードした物質は、勾配中の様々な時点でカラムから溶出される。
【0630】
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシド（たとえば、フル、中間体、空）は、精製しようとするカプシドを含む溶液をロードしている間に固定相に結合される。勾配溶出中、塩（たとえば酢酸ナトリウム）の濃度が増加するように勾配溶出緩衝液の百分率が増加するにつれて、フルｒＡＡＶベクターが固定相から優先的に放出（溶出）され、空カプシドが固定相上に優先的に保持される。空カプシドは、勾配溶出緩衝液の百分率が（塩濃度と共に）さらに増加するにつれて、より大量に放出される。空カプシドは、ＡＥＸカラムフロースルー、すなわち非結合画分中でも回収され得る。一部の実施形態では、フルおよび／または中間体カプシドは、ＡＥＸカラムから、第１の溶出ピーク中および第２の溶出ピークの一部分中（たとえば第２の溶出ピークの最初の２／３）中で回収される。固定相からのフルｒＡＡＶベクターの溶出は、勾配溶出中に、溶出液のＡ２６０およびＡ２８０を測定することによってモニタリングすることができ、Ａ２６０／Ａ２８０比の増加は、溶出液中のフルｒＡＡＶベクターの存在の増加の指標である。
【0631】
一部の実施形態では、勾配溶出を行うことは、約２０ＣＶの溶液をカラムに適用することを含み、溶液は、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物であり、溶出相の過程中に緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの間の勾配が作られるように、勾配溶出の開始時に溶液は１００％の緩衝液Ａであり、ステップの終了時に溶液は１００％のＢであり、緩衝液Ｂの増加の速度は約５％の緩衝液Ｂ／ＣＶであってもよく、緩衝液Ｂが酢酸ナトリウムを含む場合、酢酸ナトリウムの濃度は２５ｍＭ／ＣＶの速度で増加してもよい。
【0632】
一部の実施形態では、勾配溶出を行うことは、約３７．５ＣＶの溶液をカラムに適用することを含み、溶液は、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物であり、溶出相の過程中に緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの間の勾配が作られるように、勾配溶出の開始時に溶液は１００％の緩衝液Ａであり、ステップの終了時に溶液は７５％の緩衝液Ｂおよび２５％の緩衝液Ａであり、緩衝液Ｂの増加の速度は約２％の緩衝液Ｂ／ＣＶであってもよく、緩衝液Ｂが酢酸ナトリウムを含む場合、酢酸ナトリウムの濃度は１０ｍＭ／ＣＶの速度で増加してもよい。
【0633】
一部の実施形態では、緩衝液Ａ（たとえば第１の勾配溶出緩衝液）は、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む。一部の実施形態では、緩衝液Ｂ（たとえば第２の勾配溶出緩衝液）は、約４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む。
【0634】
一部の実施形態では、勾配溶出は、溶出相の過程中に緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの間の勾配が作られるように、２０ＣＶ～２４ＣＶ（たとえば約２０ＣＶ）の過程中に、１００％の緩衝液Ａをカラムに適用することで始まり、１００％の緩衝液Ｂをカラムに適用することで終わり、緩衝液Ａは、約１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含み、緩衝液Ｂは、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む。一部の実施形態では、勾配溶出は、溶出相の過程中に緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの間の勾配が作られるように、３０ＣＶ～４０ＣＶ（たとえば約３７．５ＣＶ）の過程中に、１００％の緩衝液Ａをカラムに適用することで始まり、７５％の緩衝液Ｂおよび２５％の緩衝液Ａをカラムに適用することで終わり、緩衝液Ａは、約１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含み、緩衝液Ｂは、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む。
【0635】
一部の実施形態では、勾配溶出緩衝液は、５ｍＭ～４０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、勾配溶出緩衝液は、５ｍＭ～４０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の塩（たとえば、ＮａＣｌ、酢酸Ｎａ、酢酸ＮＨ４、およびＮａ２ＳＯ４）、ｐＨ９．０を含む。一部の実施形態では、勾配溶出緩衝液は、約２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０を含む。
【0636】
一部の実施形態では、ＡＥＸカラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、０．１分／ＣＶ～１５分／ＣＶ、たとえば、０．１分／ＣＶ～１分／ＣＶ、１分／ＣＶ～２分／ＣＶ、１．５分／ＣＶ～２．５分／ＣＶ、２分／ＣＶ～４分／ＣＶ、４分／ＣＶ～６分／ＣＶ、６分／ＣＶ～８分／ＣＶ、または８分／ＣＶ～１０分／ＣＶ、１０分／ＣＶ～１２分／ＣＶ、１２分／ＣＶ～１５分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中の溶液の滞留時間は、０．１分／ＣＶ、約０．５分／ＣＶ、約１．５分／ＣＶ、約２．０分／ＣＶ、約２．５分／ＣＶ、約３分／ＣＶ、約３．６分／ＣＶ、または約４分／ＣＶ、約５分／ＣＶ、約６分／ＣＶ、約７分／ＣＶ、約８分／ＣＶ、約９分／ＣＶ、または約１０分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、約３．６分／ＣＶまたは４分／ＣＶである。一部の実施形態では、カラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、約２．０分／ＣＶである。
【0637】
一部の実施形態では、カラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、１．５～２．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ）である。一部の実施形態では、カラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）である。一部の実施形態では、カラム中における勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の滞留時間は、約１１分／ＣＶである。
【0638】
一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の線速度は、５０～１８００ｃｍ／時、たとえば、５０ｃｍ／時～１００ｃｍ／時、１００ｃｍ／時～２００ｃｍ／時、２００ｃｍ／時～４００ｃｍ／時、４００ｃｍ／時～６００ｃｍ／時、６００ｃｍ／時～８００ｃｍ／時、８００ｃｍ／時～１０００ｃｍ／時、１０００ｃｍ／時～１５００ｃｍ／時、または１５００ｃｍ／時～１８００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の線速度は、約２９８ｃｍ／時または約３００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の線速度は、約７５ｃｍ／時、約２０４ｃｍ／時、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時、約５９７ｃｍ／時、または約６００ｃｍ／時である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラム中のＡＥＸ固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の線速度は、約２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）である。
【0639】
一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約０．２ｍＬ／分～２．０Ｌ／分、たとえば、０．２ｍＬ／分～１ｍＬ／分、１．０ｍＬ／分～１０ｍＬ／分、１０ｍＬ／分～１００ｍＬ／分、１００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分～１Ｌ／分、１Ｌ／分～１．５Ｌ／分、または１Ｌ／分～２Ｌ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約０．４７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約１．６７ｍＬ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約３１４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約１．８Ｌ／分である。一部の実施形態では、カラム中の固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、１．５～２．０Ｌ／分である。一部の実施形態では、１．３Ｌのカラム中のＡＥＸ固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約３１４ｍＬ／分である。一部の実施形態では、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラム中のＡＥＸ固定相を通る勾配溶出緩衝液（たとえば、緩衝液Ａ、緩衝液Ｂ、または緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物）の流速は、約１．８Ｌ／分である。
【0640】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、勾配溶出緩衝液を、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ固定相を含むカラムに適用することを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、１５～４０ＣＶ（たとえば、約２０ＣＶ、約３７．５ＣＶ）にわたって、ＡＥＸ固定相を含むカラムに、１００％の緩衝液Ａ（たとえば、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む）を適用することで始まり、７５％～１００％の緩衝液Ｂ（たとえば、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９））を適用することで終わる、勾配溶出を行うことを含み、勾配溶出中の緩衝液Ｂの百分率の変化の速度は、２％の緩衝液Ｂ／ＣＶ～５％の緩衝液Ｂ／ＣＶである。一部の実施形態では、カラムは６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムである。
【0641】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、１５ＣＶ～４０ＣＶ（たとえば、約２０ＣＶ、約３７．５ＣＶ）にわたって、ＡＥＸ固定相を含むカラムに、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、２分／ＣＶ、４分／ＣＶ）の滞留時間で、溶出の過程中に第１の緩衝液と第２の緩衝液との間の勾配が作られるように、１００％の、約１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、７５％～１００％の、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、勾配溶出を行うことを含み、勾配溶出中の緩衝液Ｂの百分率の変化の速度は、２％の緩衝液Ｂ／ＣＶ～５％の緩衝液Ｂ／ＣＶである。一部の実施形態では、カラムは６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムである。
【0642】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法であって、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）もしくは１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００）ｍＭのトリス、ｐＨ８．５～９５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｖ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、ａ）１００～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよく、任意選択で、ｂ）ＡＥＸ固定相に適用する前にインラインで０．２μｍのフィルターを通して濾過されていてもよい、ステップ、ｖｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、および／またはｉｘ）固定相に、２０ＣＶ～２４ＣＶ（たとえば約２０ＣＶ）にわたって、１００％の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．０（たとえば約８．９）を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、１００％の、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップを含み、ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば、約２９８ｃｍ／時、約３００ｃｍ／時）の線速度、および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば、約２分／ＣＶ、約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターが、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、６Ｌ～６．６Ｌのカラム（たとえば約６．４Ｌ）を通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速で、または１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分で行う。一部の実施形態では、勾配溶出中に固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。当業者は、上記ステップの順序を変動させ得ることを理解されよう。
【0643】
勾配保持
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、好ましくは勾配溶出の後に、完全な勾配形成を確実にするために拡張した体積で、勾配保持溶液をＡＥＸ固定相（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）を含むカラムに適用することを含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩、緩衝液、界面活性剤、アミノ酸、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せからなる群から選択される塩を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、トリス、ビス－トリスプロパン、ビシン、およびその組合せからなる群から選択される緩衝液を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩、緩衝液、および界面活性剤を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、シトルリン、およびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、酢酸ナトリウム、トリス、およびＰ１８８を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、好ましくは勾配溶出の後に、完全な勾配形成を確実にするために拡張した体積で、勾配保持溶液をＡＥＸ固定相（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）を含むカラムに適用することを含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩、緩衝液、界面活性剤、アミノ酸、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せからなる群から選択される塩を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、トリス、ビス－トリスプロパン、ビシン、およびその組合せからなる群から選択される緩衝液を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、塩、緩衝液、および界面活性剤を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、シトルリン、およびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、勾配保持溶液は、酢酸ナトリウム、トリス、およびＰ１８８を含む。
【0644】
一部の実施形態では、勾配保持溶液は、５ｍＭ～１Ｍ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、１ｍＭ～１Ｍ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む。一部の実施形態では、１ＣＶ～１０ＣＶ、たとえば、１ＣＶ～３ＣＶ、１ＣＶ～５ＣＶ、４．４ＣＶ～５．５ＣＶ、１ＣＶ～８ＣＶ、または５ＣＶ～１０ＣＶの勾配保持溶液を、カラム固定相に適用する。一部の実施形態では、４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む勾配保持溶液を、ＡＥＸカラム固定相（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）に、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、０．４ｍＬ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）の流速、および／または３．５～１１分／ＣＶの滞留時間で適用する。
【0645】
ステップ溶出
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、ステップ溶出（「定組成溶出」とも呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出は、少なくとも１つのステップ溶出溶液をカラム固定相に適用することを含むが、より一般的には、複数のステップ溶出溶液（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多く）をカラム固定相に適用する。
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、ステップ溶出（「定組成溶出」とも呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出は、少なくとも１つのステップ溶出溶液をカラム固定相に適用することを含むが、より一般的には、複数のステップ溶出溶液（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれより多く）をカラム固定相に適用する。
【0646】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、塩、緩衝液、界面活性剤、アミノ酸、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの構成成分を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、およびその組合せからなる群から選択される塩を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、トリス、ビス－トリスプロパン、ビシン、およびその組合せからなる群から選択される緩衝液を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、シトルリン、およびその組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ステップ溶液は、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、Ｂｒｉｊ－３５、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）、およびその組合せからなる群から選択される界面活性剤を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、塩、緩衝液、および界面活性剤を含む。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、酢酸ナトリウムおよびトリスを含む。
【0647】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液中の緩衝液（たとえばトリス）の濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、１ｍＭ～１０ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭである。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液中のトリスの濃度は約２０ｍＭである。
【0648】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液中の塩（たとえば酢酸ナトリウム）の濃度は、約５ｍＭ～６００ｍＭ、たとえば、５ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、５００ｍＭ～６００ｍＭである。一部の実施形態では、ステップ溶出溶液中の酢酸ナトリウムの濃度は、約６４ｍＭ、約７５ｍＭ、約８５ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１０９ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、またはそれより高い。
【0649】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液は、１０ｍＭ～５０ｍＭ（たとえば約２０ｍＭ）のトリス、５～６００ｍＭの塩、ｐＨ８．９～９．１を含む。一部の実施形態では、塩は酢酸ナトリウムである。一部の実施形態では、少なくとも１つのステップ溶出溶液は、２０ｍＭのトリス、６４ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、７５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、８５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、９５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、１０５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；２０ｍＭのトリス、１０９ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０；および２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ９．０からなる群から選択される緩衝液を含む。
【0650】
一部の実施形態では、１ＣＶ～２０ＣＶ、たとえば、１ＣＶ～３ＣＶ、２ＣＶ～３ＣＶ、１ＣＶ～８ＣＶ、４ＣＶ～１１ＣＶ、５ＣＶ～１０ＣＶ、１０ＣＶ～２０ＣＶ、または１５ＣＶ～２０ＣＶの少なくとも１つのステップ溶出溶液を、カラム固定相に適用する。一部の実施形態では、約２．５ＣＶ、約５ＣＶ、約１０ＣＶ、または約２０ＣＶの少なくとも１つのステップ溶出溶液を、カラム固定相に適用する。
【0651】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液を、カラム固定相に、５０ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時（たとえば、約７５ｃｍ／時、約１５０ｃｍ／時、約２０４ｃｍ／時、約６００ｃｍ／時、約１８００ｃｍ／時）の線速度で適用する。一部の実施形態では、カラム固定相内のステップ溶出溶液の滞留時間は、１分／ＣＶ～１５分／ＣＶ（たとえば、約１．５分／ＣＶ、約６分／ＣＶ、約１２分／ＣＶ）である。
【0652】
一部の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれより多くのステップ溶出溶液を、カラム中の固定相に適用する。一部の実施形態では、１ＣＶ～２０ＣＶの、２０ｍＭのトリス、５～６００ｍＭの塩（たとえば酢酸ナトリウム）、ｐＨ８．９～９．１（たとえば、ｐＨ９．０）を含む少なくとも１つ（たとえば、２つ、３つ、４つ、５つなど）のステップ溶出溶液を、ＡＥＸカラム（たとえばＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ）に、５０ｃｍ／時～２０００ｃｍ／時の線速度および１分／ＣＶ～１５分／ＣＶの滞留時間で適用する。
【0653】
一部の実施形態では、ステップ溶出溶液はストリッピング溶液であってもよく、好ましくは、最終ステップ溶出のステップとしてカラム固定相に適用する。最終ステップ溶出溶液（すなわちストリッピング溶液）は、固定相からの物質（たとえばｒＡＡＶベクター）の放出を引き起こすためにカラム固定相に適用し得る。一部の実施形態では、最終ステップ溶出溶液は、高い塩濃度（たとえば＞４５０ｍＭ）を有し得る。一部の実施形態では、最終ステップ溶出溶液は、２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの塩（たとえば酢酸ナトリウム）、ｐＨ８．９～９．１を含んでいてよい。
【0654】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、好ましくは少なくとも１つのステップ溶出溶液の適用の後に、ストリッピング溶液をカラム固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、ストリッピング溶液は、２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ８．９～９．１を含む。
【0655】
画分の収集、中和、およびプール
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集して、フルカプシドを回収および富化させることを含む。一部の実施形態では、フルカプシドは、第１の溶出ピーク中および第２の溶出ピークの一部分中（たとえば第２の溶出ピーク最初の２／３）中で収集される。空カプシドは、ＡＥＸカラムフロースルー、すなわち非結合画分中で回収され得る。空カプシドは溶出ピーク中でも回収され得るが、一般にカラムフロースルー中での回収と比較してより低いレベルである。中間体カプシドは、フルカプシドまたは空カプシドと共に回収され得る。
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集して、フルカプシドを回収および富化させることを含む。一部の実施形態では、フルカプシドは、第１の溶出ピーク中および第２の溶出ピークの一部分中（たとえば第２の溶出ピーク最初の２／３）中で収集される。空カプシドは、ＡＥＸカラムフロースルー、すなわち非結合画分中で回収され得る。空カプシドは溶出ピーク中でも回収され得るが、一般にカラムフロースルー中での回収と比較してより低いレベルである。中間体カプシドは、フルカプシドまたは空カプシドと共に回収され得る。
【0656】
ｒＡＡＶベクターを精製するＡＥＸ方法の溶出（たとえば勾配溶出）中、ＡＥＸカラムからの溶出液は、特定の体積および／または特定の性状（たとえば特定の波長での吸光度）を有する別個の画分中で収集し得る。たとえば、１ｍＬ～４Ｌ、たとえば、１ｍＬ～１０ｍＬ、１ｍＬ～３Ｌ、１ｍＬ～２Ｌ、１ｍＬ～１Ｌ、１ｍＬ～１００ｍＬ、１０ｍＬ～５０ｍＬ、５０ｍＬ～１００ｍＬ、１００ｍＬ～２５０ｍＬ、２５０ｍＬ～５００ｍＬ、５００ｍＬ～１Ｌ、１Ｌ～１．５Ｌ、１．５Ｌ～２Ｌ、２Ｌ～３Ｌ、３Ｌ～４Ｌ、もしくはそれより多く（たとえば、約１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌなど）などの溶出液の体積、または、ＣＶの１／８～１０ＣＶ、たとえば、ＣＶの１／８～１ＣＶ、１ＣＶ～２ＣＶ、２ＣＶ～５ＣＶ、５ＣＶ～８ＣＶ、８ＣＶ～１０ＣＶ、もしくはそれより多く（たとえば、ＣＶの１／８、ＣＶの１／４、ＣＶの１／３、ＣＶの１／２、１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ、８ＣＶ、９ＣＶ、またはそれより多く）の溶出液などの具体的なＣＶ均等量を、ＡＥＸカラムからクロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に収集し得る。一部の実施形態では、溶出液の体積≧１／３ＣＶを、ＡＥＸカラムからクロマトグラフィーステップ中に収集し得る。一部の実施形態では、約１／２ＣＶの溶出液の体積を、ＡＥＸカラムからクロマトグラフィーステップ中に収集し得る。一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分をクロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に収集することは、カラムフロースルーの吸光度（たとえば２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍでの吸光度）が吸光度閾値に達した（たとえば、≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長、たとえば１０ｍＡＵ／ｍｍ経路長）際に、溶出液を収集することを含む。一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分をクロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に収集することは、勾配溶出溶液が特定の百分率の溶出緩衝液を含む際に、たとえば、勾配溶出溶液が約３０％～約３５％（たとえば約３２％）から約５０％～約５５％（たとえば約５２％）の第２の溶出緩衝液（たとえば緩衝液Ｂ）を含む際に、溶出液を収集することを含む。一部の実施形態では、第２の溶出緩衝液（たとえば緩衝液Ｂ）は、５００ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのトリス、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む。
【0657】
一部の実施形態では、溶出液は、特定の体積（たとえば、１／３ＣＶ、１／２ＣＶ）の複数の画分（たとえば、５個の画分、１０個の画分、２０個の画分、またはそれより多く）で収集する。一部の実施形態では、溶出液は単一画分として収集する。一部の実施形態では、溶出液は、溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵであるときに単一画分で収集し、約２．３ＣＶを収集してもよい。
【0658】
一部の実施形態では、少なくとも１つの画分の溶出液をＡＥＸカラムから収集することは、任意選択で勾配溶出中に、カラムから収集した溶出液の２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６０）および／または２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を測定することを含む。一部の実施形態では、ＡＥＸ溶出液の吸光度（たとえばＡ２６０またはＡ２８０）を測定することは、少なくとも１つの画分溶出液の収集とインラインで行う。一部の実施形態では、クロマトグラフィー溶出（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから収集した溶出液が０．５～１０ｍＡＵ／ｍｍ経路長のＡ２８０を有するときに、溶出液の少なくとも１つの画分を収集する。一部の実施形態では、溶出液をＡＥＸカラムから収集することは、ＣＶの≧１／３の体積を有する、溶出液の少なくとも１つの画分を収集することを含む。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、溶出液の少なくとも１つの画分（たとえば第１の溶出液画分）をＡＥＸカラムから収集することは、溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに溶出液の少なくとも１つの画分を収集することを含み、溶出液の少なくとも１つの画分の体積はＣＶの≧１／３である。
【0659】
一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、１～２５個の画分、たとえば、１～５個の画分、５～１０個の画分、１０～１５個の画分、１５～２０個の画分、または２０～２５個の溶出液画分をＡＥＸカラムから収集する。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５個、またはそれより多くの画分を、ＡＥＸカラムから収集する。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、それぞれＣＶの≧１／３の体積を有する少なくとも１０個の溶出液画分を、ＡＥＸカラムから収集する。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、それぞれＣＶの約１／２の体積を有する少なくとも２０個の溶出液画分を、ＡＥＸカラムから収集する。
【0660】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、約１０個の溶出液画分の第１群を、ＡＥＸカラムから、溶出液のＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに収集することを含み、それぞれの画分はＣＶの≧１／３の体積を有する。
【0661】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえばｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、約２０個の溶出液画分の第１群を、ＡＥＸカラムから、勾配溶出溶液の第２の溶出緩衝液（たとえば緩衝液Ｂ）の百分率が約３０％～約３５％（たとえば約３２％）であるときに収集し、第２の溶出緩衝液の百分率（たとえば緩衝液Ｂ）が勾配溶出溶液の約５０％～５５％（たとえば約５２％）であるまで収集し続けることを含み、それぞれの画分はＣＶの約１／２の体積を有する。
【0662】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することを含む。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することは、中和ステップと呼ぶ。一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨは、ｐＨ調節の前にｐＨ８．５～９．１である。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを６．８～７．６（たとえばｐＨ約７．２）のｐＨに調節する。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを７．５～７．７のｐＨ（たとえばｐＨ約７．６）に調節する。
【0663】
一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨは、１４％～１６％（溶出液体積重量）（たとえば、１４．３％～１４．７％、１４．３％～１５％、１５％～１６％）の、５０ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、約５０ｍＭ～１００ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、または４００ｍＭ～５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節する。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することは、溶出液体積重量１４％～１６％（たとえば約１５％）の溶出液体積重量の約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液の添加によって、６．８～７．６（たとえばｐＨ約７．２）にｐＨを調節することを含む。一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨは、約５０ｍＭのシトレート、ｐＨ３．６を含む溶液の添加によって調節する。
【0664】
一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨは、少なくとも１つのファクション（ｆａｃｔｉｏｎ）を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、５０ｍＭ～５００ｍＭ、たとえば、約５０ｍＭ～１００ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、３００ｍＭ～４００ｍＭ、または４００ｍＭ～５００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器に収集することによって、約７．５～７．７のｐＨに調節する。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のｐＨを調節することは、少なくとも１つの画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を含む溶液を含む容器内に収集することによって、７．５～７．７（たとえばｐＨ約７．６）のｐＨに調節することを含む。
【0665】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定することを含む。一部の実施形態では、溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系における分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定し、１つまたは複数の波長（たとえば２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍ）での吸光度を測定する。
【0666】
一部の実施形態では、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定することは、２６０ｎｍ（Ａ２６０）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）での吸光度を測定し、任意選択でＡ２６０／Ａ２８０比を決定することを含む（ＳＥＣによって測定した場合、測定値はＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０またはＡ２６０／Ａ２８０（ＳＥＣ）と呼び得る）。ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも０．５～２．０、たとえば、少なくとも０．５～０．７５、０．７５～１．０、１．０～１．２５、１．２５～１．５、０．５～１．５、１．５～２．０、またはそれより高い。ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも１．０、少なくとも１．１０、少なくとも１．１１、少なくとも１．１２、少なくとも１．１３、少なくとも１．１４、少なくとも１．１５、少なくとも１．１６、少なくとも１．１７、少なくとも１．１８、少なくとも１．１９、少なくとも１．２０、少なくとも１．２１、少なくとも１．２２、少なくとも１．２３、少なくとも１．２４、少なくとも１．２５、少なくとも１．２６、少なくとも１．２７、少なくとも１．２８、少なくとも１．２９、少なくとも１．３０、少なくとも１．３１、少なくとも１．３２、少なくとも１．３３、少なくとも１．３４、少なくとも１．３５、少なくとも１．３６、少なくとも１．３７、少なくとも、１．３８、少なくとも１．３９、少なくとも１．４０、またはそれより大きい）。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも１．２５である。
【0667】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の、高分子質量種（ＨＭＭＳ）の％を測定することを含む。一部の実施形態では、ＨＭＭＳの％はＳＥＣによって測定する。一部の実施形態では、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分の％ＨＭＭＳは、０％～１０％（たとえば０％～３．２％）の範囲である。一部の実施形態では、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分の％ＨＭＭＳは、０．５％～１５％（たとえば１．２％～８．３％）の範囲である。
【0668】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の％純度を決定することを含む。一部の実施形態では、％純度はＲＰ－ＨＰＬＣによって決定する。一部の実施形態では、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分の％純度は、９５％～１００％（たとえば９９．１％～９９．４％）の範囲である。一部の実施形態では、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分の％純度は、７５％～１００％（たとえば７９．６％～９８．７％）の範囲である。
【0669】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）の量を測定することを含む。一部の実施形態では、ＨＣ－ＤＮＡの量はｑＰＣＲによって測定する。一部の実施形態では、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＨＣ－ＤＮＡの量は、０．１ｐｇ／１×１０９ＶＧ～２０ｐｇ／１×１０９ＶＧ（たとえば１．０ｐｇ／１×１０９ＶＧ～５．９ｐｇ／１×１０９ＶＧ）の範囲である。一部の実施形態では、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＨＣ－ＤＮＡの量は、０．１ｐｇ／１×１０９ＶＧ～５０ｐｇ／１×１０９ＶＧ（たとえば２．７ｐｇ／１×１０９ＶＧ～２６．５ｐｇ／１×１０９ＶＧ）の範囲である。
【0670】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量を測定することを含む。一部の実施形態では、ＨＣＰの量はＥＬＩＳＡによって測定する。一部の実施形態では、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＨＣＰの量は、定量レベルより低い（ＬＬＯＱ）量～５．７８ｐｇ／１×１０９ＶＧの範囲である。一部の実施形態では、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターのＡＥＸ精製中に収集した溶出液の少なくとも１つの画分のＨＣＰの量はＬＬＯＱである。
【0671】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）から精製する方法は、ＡＥＸカラムから収集した溶出液（たとえば勾配溶出中）の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液（本明細書中で「ＡＥＸプール」とも呼ぶ）を形成することを含む。一部の実施形態では、少なくとも０．５～２．０、たとえば、少なくとも０．５～０．７５、０．７５～１．０、１．０～１．２５、１．２５～１．５、０．５～１．５、１．５～２．０、またはそれより高いＡ２６０／Ａ２８０比（たとえばＳＥＣによって測定）をそれぞれ有する、ＡＥＸカラムからの溶出液の少なくとも２つの画分。一部の実施形態では、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも１．０、少なくとも１．１０、少なくとも１．１１、少なくとも１．１２、少なくとも１．１３、少なくとも１．１４、少なくとも１．１５、少なくとも１．１６、少なくとも１．１７、少なくとも１．１８、少なくとも１．１９、少なくとも１．２０、少なくとも１．２１、少なくとも１．２２、少なくとも１．２３、少なくとも１．２４、少なくとも１．２５、少なくとも１．２６、少なくとも１．２７、少なくとも１．２８、少なくとも１．２９、少なくとも１．３０、少なくとも１．３１、少なくとも１．３２、少なくとも１．３３、少なくとも１．３４、少なくとも１．３５、少なくとも１．３６、少なくとも１．３７、少なくとも、１．３８、少なくとも１．３９、少なくとも１．４０、またはそれより大きい）Ａ２６０／Ａ２８０比（たとえばＳＥＣによって測定）をそれぞれ有する、ＡＥＸカラムからの溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成する。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせることは、それぞれ≧０．９８のＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することを含む。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせることは、それぞれ≧１．０のＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することを含む。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせることは、それぞれ≧１．２２のＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することを含む。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせることは、それぞれ≧１．２４のＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することを含む。一部の実施形態では、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせることは、それぞれ≧１．２５のＡ２６０／Ａ２８０比を有する溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することを含む。
【0672】
一部の実施形態では、溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することは、任意選択で勾配溶出中に、ＡＥＸカラムから収集した溶出液の２～７、２～１０、２～１５、２～２０、または２～５０個の画分をプールすることを含む。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも０．５～２．０、たとえば、少なくとも０．５～０．７５、０．７５～１．０、１．０～１．２５、１．２５～１．５、０．５～１．５、１．５～２．０、またはそれより高い。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも１．０、少なくとも１．１０、少なくとも１．１１、少なくとも１．１２、少なくとも１．１３、少なくとも１．１４、少なくとも１．１５、少なくとも１．１６、少なくとも１．１７、少なくとも１．１８、少なくとも１．１９、少なくとも１．２０、少なくとも１．２１、少なくとも１．２２、少なくとも１．２３、少なくとも１．２４、少なくとも１．２５、少なくとも１．２６、少なくとも１．２７、少なくとも１．２８、少なくとも１．２９、少なくとも１．３０、少なくとも１．３１、少なくとも１．３２、少なくとも１．３３、少なくとも１．３４、少なくとも１．３５、少なくとも１．３６、少なくとも１．３７、少なくとも、１．３８、少なくとも１．３９、少なくとも１．４０、またはそれより高い）。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は＞０．９７である。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は０．９７～１．０３である。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は１．０～１．０５である。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は１．２０～１．４０である。一部の実施形態では、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０比は≧１．２５、たとえば約１．２８～１．３５であり、ＡＥＸによる精製前の親和性溶出液または希釈した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されている。
【0673】
一部の実施形態では、たとえば単一画分のみがＡ２８０値またはＡ２６０／Ａ２８０比などの事前に決定された基準を満たす場合は、プールした溶出液は単一画分のみを含む。一部の実施形態では、たとえば、勾配溶出を行う過程中に、特定の時点（たとえば特定のＡ２８０値が測定されたとき）から開始し、特定の時点（たとえば、特定のＡ２８０値が測定されたとき、具体的な溶出液の体積が収集されたとき）で終わる、単一画分を収集した場合は、プールした溶出液は単一画分のみを含む。
【0674】
一部の実施形態では、プールした溶出液は、約６．５～８、６．８～７．６、約６．８～７．８、７．０～７．６、約７．０～７．４、または約７．０～７．２のｐＨを有する。一部の実施形態では、プールした溶出液は、約６．８～７．６のｐＨを有する。
【0675】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、ｉ）溶出液のＡ２８０が＞０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、クロマトグラフィーステップ（たとえば勾配溶出）中に、ＡＥＸカラムから少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分の第１群を収集し、溶出液の少なくとも１つの画分の体積がＣＶの１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／３）に等しいステップ、ｉｉ）カラムからの少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分のｐＨを、１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の、約２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液の添加によって、６．８～７．６のｐＨに調節するステップ、ｉｉｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／またはｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成することステップを含み、溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０は≧１．２５であり、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０は≧１．２５（たとえば約１．２８～１．３５）であり、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液のｐＨは６．８～７．６であってもよく、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液は、ＡＥＸによる精製の前の親和性溶出液または希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている。
【0676】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液から精製する方法は、ｉ）勾配溶出溶液が、約６５％～約７０％（たとえば約６８％）の、約１００ｍＭのトリス、約０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む第１の溶出緩衝液（たとえば緩衝液Ａ）、および約３０％～約３５％（たとえば約３２％）の、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１００ｍＭのトリス、約０．０１％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む第２の溶出緩衝液（たとえば緩衝液Ｂ）を含むときに、勾配溶出ステップ中にＡＥＸカラムからの溶出液の少なくとも１つ（たとえば約２０個）の画分の第１群を収集し、第１の溶出緩衝液の百分率が約４５％～約５０％（たとえば約４８％）であり、第２の溶出緩衝液の百分率が約５０％～約５５％（たとえば約５２％）であるまで、溶出液のすべての画分を収集し続け、溶出液の少なくとも１つの画分の体積がＣＶの１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／２）に等しいステップ、ｉｉ）溶出液の少なくとも１つの画分を、０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、約２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器内に収集することによって、カラムからの溶出液の少なくとも１つ（たとえば約２０個）の画分のｐＨを７．５～７．７のｐＨに調節するステップ、ｉｉｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ、および／またはｉｖ）カラムから収集した溶出液の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップを含み、溶出液の少なくとも２つの画分のそれぞれのＡ２６０／Ａ２８０は≧０．９８であり、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０は≧１．０であり、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液は、ＡＥＸによる精製前の親和性溶出液または希釈した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されている。
【0677】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法であって、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップと、ｉｉ）任意選択で上向流によって、１４．４ＣＶ～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップと、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップと、ｉｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｖｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｖｉｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、ａ）１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば、約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよく、任意選択で、ｂ）固定相に適用する前にインラインで０．２μｍのフィルターを通して濾過されていてもよい、ステップと、ｖｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｉｘ）固定相に、２０ＣＶ～２４ＣＶ（たとえば約２０ＣＶ）にわたって、１００％の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、１００％の、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップと、ｘ）溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長を有するときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つ（たとえば約１０個）の画分の第１群を収集し、溶出液の少なくとも１つの画分の体積が１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／３）に等しいステップと、ｘｉ）任意選択で１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の、２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液の添加によって、カラムからの少なくとも１つ（たとえば約１０個）の溶出液画分のｐＨを６．８～７．６のｐＨに調節するステップと、ｘｉｉ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ（たとえばＳＥＣによる）と、および／またはｘｉｉｉ）カラムから収集した溶出液画分の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップとを含み、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０は≧１．２５であり、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０は≧１．２５（たとえば約１．２８～１．３５）であり、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液のｐＨは６．８～７．６であってもよく、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液は、親和性溶出液または希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、勾配溶出中に固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。
【0678】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ＡＡＶ３Ｂなど）ベクターをＡＥＸによって精製する方法であって、ｉ）５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップと、ｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップと、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｉｖ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００）ｍＭのトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｖ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば、約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよい、ステップと、ｖｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップと、ｖｉｉ）固定相に、２０～４０ＣＶ（たとえば約３７．５ＣＶ）にわたって、１００％の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、７５％の、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップと、ｖｉｉｉ）第１の緩衝液の百分率が約６５％～約７０％（たとえば約６８％）であり、第２の緩衝液の百分率が約３０％～３５％（たとえば約３２％）であるときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の少なくとも１つ（たとえば約２０個）の画分の第１群を収集し、第１の緩衝液の百分率が約４５％～約５０％（たとえば約４８％）であり、第２の緩衝液の百分率が約５０％～５５％（たとえば約５２％）であるまで溶出液のすべての画分を収集し続け、溶出液の少なくとも１つの画分の体積が１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／２）に等しいステップと、ｉｘ）任意選択で、溶出液の少なくとも１つの画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器内に収集することによって、カラムからの少なくとも１つ（たとえば約２０個）の溶出液画分のｐＨを、７．５～７．７のｐＨに調節するステップと、ｘ）カラムから収集した溶出液の少なくとも１つの画分の吸光度を測定し、Ａ２６０／Ａ２８０比を決定するステップ（たとえばＳＥＣによる）と、および／またはｘｉｉ）カラムから収集した溶出液画分の少なくとも２つの画分を合わせて、プールした溶出液を形成するステップとを含み、溶出液の少なくとも１つの画分のＡ２６０／Ａ２８０は≧０．９８であり、プールした溶出液のＡ２６０／Ａ２８０は≧１．０であり、溶出液の少なくとも１つの画分またはプールした溶出液は、親和性溶出液または濾過した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ステップｉ）～ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約２９８ｃｍ／時）の線速度および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、勾配溶出中に固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。
【0679】
一部の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ（たとえばｒＡＡＶ９など）ベクターをＡＥＸによって精製する方法、ｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、使用前のフラッシュのステップ、ｉｉ）任意選択で上向流によって、１４．４ＣＶ～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、ａ）１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよく、任意選択で、ｂ）固定相に適用する前にインラインで０．２μｍのフィルターを通して濾過されていてもよい、ステップ、ｖｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｉｘ）固定相に、２０ＣＶ～２４ＣＶ（たとえば約２０ＣＶ）にわたって、１００％の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、１００％の、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップ、ｘ）溶出液のＡ２８０が≧０．５ｍＡＵ／ｍｍ経路長であるときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の画分を収集し、溶出液画分の体積が１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／３）に等しいステップ、および／またはｘｉ）任意選択で１４．３％～１５％（溶出液体積重量）の、約２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０～４．５（たとえば約３．５）を含む溶液の添加によってカラムからの溶出液画分のｐＨを６．８～７．６のｐＨに調節するステップを含み、溶出液画分が、親和性溶出液または希釈および任意選択で濾過した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ステップｉ）～ｉｘ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０Ｌ～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５Ｌ／分～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、勾配溶出中に固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。
【0680】
一部の実施形態では、本開示は、ＡＥＸによってｒＡＡＶ（たとえば、ｒＡＡＶ９、ＡＡＶ３など）ベクターを精製する方法であって、ｉ）５ＣＶ～１０ＣＶ（たとえば約８ＣＶ）の、０．１Ｍ～１．０Ｍ（たとえば約０．５Ｍ）のＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、浄化ステップ、ｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１Ｍ～３Ｍ（たとえば約２Ｍ）のＮａＣｌ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば１００ｍＭ）のトリス、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約９）を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｉｖ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖ）≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば約８．８）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉ）精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液を、カラム中のＡＥＸ固定相にロードするステップであって、溶出液が、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のヒスチジン、１００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２００ｍＭ）のトリス、０．１％～１．０％（たとえば約０．５％）のＰ１８８、ｐＨ８．７～９．０を含む緩衝液で約１４．４～１５．５倍（たとえば約１５倍）に希釈されていてもよい、ステップ、ｖｉｉ）４．５ＣＶ～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．４～９．５（たとえば約８．９）を含む平衡化緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｖｉｉｉ）固定相に、２０ＣＶ～４０ＣＶ（たとえば約３７．５ＣＶ）にわたって、１００％の、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえば８．９）を含む第１の緩衝液を適用することで始まり、７５％の、４００ｍＭ～６００ｍＭ（たとえば約５００ｍＭ）の酢酸ナトリウム、５０ｍＭ～１５０ｍＭ（たとえば約１００ｍＭ）のトリス、０．００５％～０．０１５％（たとえば約０．０１％）のＰ１８８、ｐＨ８．５～９．５（たとえばｐＨ８．９）を含む第２の緩衝液を適用することで終わる、カラム中の固定相からの材料の勾配溶出を行うステップ、ｉｘ）第１の緩衝液の百分率が約６５％～約７０％（たとえば約６８％）であり、第２の緩衝液の百分率が約３０％～約３５％（たとえば約３２％）であるときに、勾配溶出中のカラムから溶出液の画分を収集し、第１の緩衝液の百分率が約４５％～約５０％（たとえば約４８％）であり、第２の緩衝液の百分率が約５０％～５５％（たとえば約５２％）であるまで溶出液のすべての画分を収集し続け、溶出液画分の体積が１／８～２ＣＶ（たとえばＣＶの約１／２）に等しいステップ、および／またはｘ）任意選択で、溶出画分を、約０．０１ＣＶ～０．１ＣＶ（たとえば約０．０６６ＣＶ）の、２００ｍＭ～３００ｍＭ（たとえば約２５０ｍＭ）のクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０～４．０（たとえば約３．５）を含む溶液を含む容器内に収集することによって、カラムからの溶出液画分のｐＨを７．５～７．７のｐＨに調節するステップを含み、溶出液画分は、親和性溶出液または希釈した親和性溶出液と比較して、フルカプシドが富化されているおよび／または空カプシドが枯渇されており、ステップｉ）～ｖｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを、２７０ｃｍ／時～３３０ｃｍ／時（たとえば約２９８ｃｍ／時）の線速度および／または１．５分／ＣＶ～４．５分／ＣＶ（たとえば約２分／ＣＶ）の滞留時間で行ってもよく、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、ＡＥＸ固定相はＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであってもよい、方法を提供する。一部の実施形態では、勾配溶出中に固定相から溶出された材料は、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む。
【0681】
プールした溶出液および原薬の特徴づけ
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、溶液中のフルカプシドの百分率と比較してフルカプシドが富化されているプールした溶出液を形成することを含む。溶出ステップ中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、プールした溶出液を形成することを含む、ｒＡＡＶベクターを溶液からＡＥＸによって精製する方法は、プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することを、さらに含む。一部の実施形態では、プールした溶出液の、Ａ２６０／Ａ２８０（たとえばＳＥＣによって測定）、フルカプシド、中間体カプシド、および空カプシドの百分率、％純度、％ＨＭＭＳ、ＨＣＰの量、ならびに／またはＨＣ－ＤＮＡの量を含む品質性状は、プールした溶出液から生成した原薬の同じ品質性状と実質的に異ならない。
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、溶液中のフルカプシドの百分率と比較してフルカプシドが富化されているプールした溶出液を形成することを含む。溶出ステップ中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、プールした溶出液を形成することを含む、ｒＡＡＶベクターを溶液からＡＥＸによって精製する方法は、プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される方法によって濾過して、原薬を生成することを、さらに含む。一部の実施形態では、プールした溶出液の、Ａ２６０／Ａ２８０（たとえばＳＥＣによって測定）、フルカプシド、中間体カプシド、および空カプシドの百分率、％純度、％ＨＭＭＳ、ＨＣＰの量、ならびに／またはＨＣ－ＤＮＡの量を含む品質性状は、プールした溶出液から生成した原薬の同じ品質性状と実質的に異ならない。
【0682】
一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液中のフルカプシドの百分率は、全カプシドの２０％未満である。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、フルカプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～９８％、２０％～９９％、２０％～９９％より高く、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％（たとえば、４４％、４５％、５０％、５３％）を構成するように、フルカプシドが富化されており、カプシドは分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい（Ｂｕｒｎｈａｍ Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１５）２６；２２８～２４２）。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、フルカプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの５２＋／－７％を構成するように、フルカプシドが富化されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液から精製する方法は、フルカプシドの百分率を、親和性溶出液中の３０％未満（たとえば１２％～２５％）からプールしたＡＥＸ溶出液または原薬中の全カプシドの３０％を超える（たとえば、４０％～５５％、４５％～６５％、４０％～９９％より高く）まで増加させることを含む。
【0683】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールしたＡＥＸ溶出液は、フルカプシドが、プールした溶出液中の全カプシドの２２．９＋／－２．９％を構成するように、フルカプシドが富化されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液から精製する方法は、フルカプシドの百分率を、親和性溶出液中の２０％未満（たとえば１０％～１９％）からプールしたＡＥＸ溶出液中の全カプシドの２０％、またはそれより高く（たとえば、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５５％、４５％～６５％、４０％～９９％より高く）まで増加させることを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液から精製する方法は、フルカプシドの百分率を、親和性溶出液中の１１．１±２．１からプールしたＡＥＸ溶出液中の全カプシドの２２．９±２．９％まで増加させることを含む。
【0684】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから少なくとも１つの溶出液画分を収集し、溶液中の空カプシドの百分率と比較して枯渇された百分率の空カプシドを有する、プールした溶出液を形成することを含み、プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される濾過方法にさらに供して、原薬を生成する。一部の実施形態では、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む親和性溶出液中の空カプシドの百分率は、全カプシドの７０％またはそれより高い。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、空カプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２９％（たとえば≦２９％）を構成するように、空カプシドが枯渇されており、カプシドは分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、空カプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの２０％＋／－７％を構成するように、空カプシドが枯渇されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液から精製する方法は、空カプシドの百分率を、親和性溶出液中の４０％～９０％からプールしたＡＥＸ溶出液または原薬中の全カプシドの≦３０％まで低下させることを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液から精製する方法は、空カプシドの百分率を、親和性溶出液中の７９．７±２．５％からプールしたＡＥＸ溶出液または原薬中の全カプシドの６７．５±３．８％まで低下させることを含む。
【0685】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ＡＡＶ３など）を溶液から（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、中間体カプシドを含むプールした溶出液を形成することを含み、プールした溶出液を、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される濾過方法にさらに供して、原薬を生成する。一部の実施形態では、中間体カプシドは、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、１０％～２０％、２０％～６５％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、または１８％～２２％を構成し、カプシドは分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって測定してもよい。一部の実施形態では、中間体カプシドは、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの２８％＋／－５％を構成する。一部の実施形態では、中間体カプシドは、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの９．６％＋／－１．４％を構成する。
【0686】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、精製しようとするｒＡＡＶベクターを含む溶液中のフルカプシドおよび空カプシドの百分率と比較して、フルカプシドが富化されており、空カプシドが枯渇されている、プールした溶出液または原薬を形成することを含む。フルカプシドおよび空カプシドに加えて、部分的ベクターゲノム（切断もしくは断片化ベクターゲノムとも呼ぶ）および／または非導入遺伝子関連ＤＮＡ（すなわち中間体カプシド）を含有するカプシドが、特定の非限定的な例示的な実施形態では、プールした溶出液（たとえばプールしたＡＥＸ溶出液）または原薬中のカプシド種のバランスを構成し得る。
【0687】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、全カプシドの約５３％のフルｒＡＡＶカプシド、約２３％の中間体カプシド、および約２４％の空カプシドを含む、プールした溶出液または原薬を生成する。
【0688】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、全カプシドの約４４％のフルｒＡＡＶカプシド、約２７％の中間体カプシド、および約２９％の空カプシドを含む、プールした溶出液または原薬を生成する。
【0689】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、全カプシドの２０％～＞９９％のフルｒＡＡＶカプシド、５％～６５％の中間体カプシド、および１０％～６５％の空カプシドを含む、プールした溶出液または原薬を生成する。
【0690】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、４５％～６５％のフルｒＡＡＶカプシド、１９％～２８％の中間体カプシド、および１０％～３７％の空カプシドを含む、プールした溶出液または原薬を生成する。一部の実施形態では、親和性溶出液は、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）の体積を有する容器中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から作製され、容器はＳＵＢであってもよい。
【0691】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、フルカプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの５５％＋／－７％を構成するように、フルカプシドが富化されている。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0692】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの２４％＋／－３％の中間体カプシドを含む。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0693】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、空カプシドが、プールした溶出液または原薬中全カプシドの２１％＋／－１０％を構成するように、空カプシドが枯渇されている。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１００Ｌ～５００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0694】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターを親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、４５％～５２％のフルｒＡＡＶカプシド、２７％～３７％の中間体カプシド、および／または１８％～２２％の空カプシドを含む、プールした溶出液または原薬を生成する。一部の実施形態では、親和性溶出液は、約１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）の容器中で生成したｒＡＡＶベクターの親和性クロマトグラフィー精製から作製され、容器はＳＵＢであってもよい。
【0695】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、フルカプシドが、プールした溶出液または原薬中全カプシドの４９％＋／－２％を構成するように、フルカプシドが富化されている。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0696】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの３２％＋／－４％の中間体カプシドを含む。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0697】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法によって調製したプールした溶出液または原薬は、空カプシドが、プールした溶出液または原薬中の全カプシドの２０％＋／－２％を構成するように、空カプシドが枯渇されている。一部の実施形態では、プールした溶出液または原薬中に存在するｒＡＡＶベクターは、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）の体積を有する容器中で生成させ、容器はＳＵＢであってもよい。
【0698】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、ベクターゲノム（ＶＧまたはｖｇ）の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって定量し得るｒＡＡＶベクターを含む、プールした溶出液および任意選択で原薬を形成することを含む。ｑＰＣＲ分析は、ＩＴＲ配列のコピー数、導入遺伝子配列のコピー数および／またはインタクトなベクターゲノム中に存在する任意の他のヌクレオチド配列のコピー数を測定し得る。
【0699】
ＡＥＸカラムからのプールした溶出液中に存在するＶＧの量は、％ＶＧカラム収率として表してよく、これは、ＡＥＸカラムから収集したプールした溶出液（すなわちＡＥＸプール）中に存在するＶＧの量を、精製しようとする試料、たとえば、一部の実施形態では希釈だけした、または希釈および濾過し、ＡＥＸカラムに適用した親和性溶出液中に存在するＶＧの量の百分率として言及する。
【0700】
本明細書中に開示した方法に従ってｒＡＡＶベクターを精製する方法は、６３％＋／－２６％の％ＶＧカラム収率をもたらす。本明細書中に開示した方法に従ってｒＡＡＶベクターを精製する方法は、１％～１０％、１～２０％、１％～３０％、１％～４０％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９９％、５％～９５％、１０％～８５％、１５％～７５％、２０％～６５％、２５％～５５％、３０％～４５％、３０％～８０％、３５％～６５％、４０％～７０％、または１００％の％ＶＧカラム収率をもたらす。
【0701】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、４０％～１００％の％ＶＧカラム収率をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、１０％～７０％（たとえば２０％～６１％）の％ＶＧカラム収率をもたらす。
【0702】
ＡＥＸカラムからのプールした溶出液中に存在するＶＧの量は、％ＶＧステップ収率として表してよく、これは、ＡＥＸカラムから収集したプールした溶出液（すなわちＡＥＸプール）中に存在するＶＧの量を、希釈または濾過前の親和性溶出液中に存在するＶＧの量の百分率として言及する。
【0703】
本明細書中に開示した方法に従ってｒＡＡＶベクターを精製する方法は、４７％＋／－１１％の％ＶＧステップ収率をもたらす。本明細書中に開示した方法に従ってｒＡＡＶベクターを精製する方法は、１％～１０％、１～２０％、１％～３０％、１％～４０％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９９％、５％～９５％、１０％～８５％、１５％～７５％、２０％～６５％、２５％～５５％、３０％～４５％、３０％～８０％、３５％～６５％、４０％～７０％、または１００％の％ＶＧステップ収率をもたらす。
【0704】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、３０％～７０％（たとえば３７％～６０％）の％ＶＧステップ収率をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、４５％＋／－８％の％ＶＧステップ収率をもたらす。
【0705】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、５０％＋／－１３％の％ＶＧステップ収率をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、２５％～７５％（たとえば３１％～６６％）の％ＶＧステップ収率をもたらす。
【0706】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、溶液中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量と比較してＨＣＰの量が低下した、プールした溶出液または原薬を形成することを含む。一部の実施形態では、プールした溶出液中、溶出液の少なくとも１つの画分中、または原薬中のＨＣＰの量の低下は、ＥＬＩＳＡによって測定して定量レベルより低い（ＬＬＯＱ）。一部の実施形態では、プールした溶出液中、溶出液の少なくとも１つの画分中、または原薬中のＨＣＰの量の低下は、１０ｎｇ～２０００ｎｇ／１×１０９ＶＧ、５０ｎｇ～２００ｎｇ／１×１０９ＶＧ、１００ｎｇ～１０００ｎｇ／１×１０９ＶＧ、または２００～２０００ｎｇ／１×１０９ＶＧである。
【0707】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３ｂなど）を親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、ＨＣＰの量を、親和性溶出液中の１～５００ｐｇ／１×１０９ＶＧ（たとえば約５０ｐｇ／１×１０９）からプールした溶出液中、溶出液の少なくとも１つの画分中、または原薬中でＬＬＯＱの量まで低下させることを含み、ｒＡＡＶベクターは２５０ＬのＳＵＢ中で生成する。
【0708】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を親和性溶出液からＡＥＸによって精製する方法は、ＨＣＰの量を、親和性溶出液中の１００～５００ｐｇ／１×１０９ＶＧ（たとえば約３３０ｐｇ／１×１０９）からプールした溶出液中、溶出液の少なくとも１つの画分中、または原薬中でＬＬＯＱの量まで低下させることを含み、ｒＡＡＶベクターは２０００ＬのＳＵＢ中で生成する。
【0709】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、ｒＡＡＶベクターを含むプールした溶出液または原薬を形成することを含み、ｒＡＡＶベクターの純度は、たとえば、分析用逆相ＨＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動によって測定して、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
【0710】
一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、９８．６％＋／－０．６％の純度を有するｒＡＡＶベクター調製物（たとえば原薬）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、１０００Ｌ～３０００Ｌ（たとえば約２０００Ｌ）の容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、９９．３％＋／－０．３％の純度を有するｒＡＡＶベクター調製物（たとえば原薬）をもたらす。
【0711】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、０％～１０％のＨＭＭＳの百分率を有する、プールした溶出液または原薬を形成することを含む。一部の実施形態では、ＨＭＭＳの百分率はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定する。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、１００Ｌ～３００Ｌ（たとえば約２５０Ｌ）の容器（たとえばＳＵＢ）中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、ＳＥＣによって測定して２．６％＋／－０．８％のＨＭＭＳを含むｒＡＡＶベクター調製物をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、２．９％＋／－０．４％のＨＭＭＳを含むｒＡＡＶベクター調製物をもたらす。
【0712】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、約７．０～２５ｐｇの残留ＨＣ－ＤＮＡ／１×１０９ＶＧを有する、プールした溶出液または原薬を形成することを含む。一部の実施形態では、ＨＣ－ＤＮＡの量はｑＰＣＲによって測定する。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、１７．４＋／－６．７ｐｇのＨＣ－ＤＮＡ／１×１０９ＶＧを含むｒＡＡＶベクター調製物（たとえば、プールした溶出液、原薬）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、９．３＋／－１．２ｐｇのＨＣ－ＤＮＡ／１×１０９ＶＧを含むｒＡＡＶベクター調製物（たとえば、プールした溶出液、原薬）をもたらす。
【0713】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、約１．２４～１．３２のＡ２６０／Ａ２８０を有するプールした溶出液または原薬を形成することを含む。一部の実施形態では、Ａ２６０／Ａ２８０はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定する。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２５０ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、ＳＥＣによって測定して１．２４～１．３２のＡ２６０／Ａ２８０を有するｒＡＡＶベクター調製物（たとえば、プールした溶出液、原薬）をもたらす。一部の実施形態では、本明細書中に開示した方法による、２０００ＬのＳＵＢ中で生成したｒＡＡＶベクターの精製は、ＳＥＣによって測定して１．２８～１．３１のＡ２６０／Ａ２８０を有するｒＡＡＶベクター調製物（たとえば、プールした溶出液、原薬）をもたらす。
【0714】
ｒＡＡＶベクター（たとえば、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ３Ｂなど）を溶液（たとえば親和性溶出液）からＡＥＸによって精製する方法は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）中にＡＥＸカラムから溶出液の少なくとも１つの画分を収集し、プールした溶出液を形成し（プールした溶出液は、ウイルス濾過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、０．２μｍのフィルターを通した濾過、およびその組合せからなる群から選択される濾過方法に供する）、治療薬生成物の生成に適切な原薬を生成することを含む。一部の実施形態では、原薬は、疾患、障害、または状態（たとえばデュシェンヌ筋ジストロフィー）を処置するためにヒト対象への投与に適している。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。
【0715】
ＡＥＸ固定相の再生
フルｒＡＡＶカプシドを含む溶出液の少なくとも１つの画分のＡＥＸカラムからの溶出（たとえば勾配溶出）および収集の後、カラム固定相をさらなるｒＡＡＶ精製の実行のために調製するために、追加のステップを行い得る。そのようなステップとしては、たとえば、浄化、平衡化、再生、フラッシュ、および／または保存を挙げ得る。当業者は、１つまたは複数のステップを、変動する順序および頻度で行い得ることを理解されよう。
フルｒＡＡＶカプシドを含む溶出液の少なくとも１つの画分のＡＥＸカラムからの溶出（たとえば勾配溶出）および収集の後、カラム固定相をさらなるｒＡＡＶ精製の実行のために調製するために、追加のステップを行い得る。そのようなステップとしては、たとえば、浄化、平衡化、再生、フラッシュ、および／または保存を挙げ得る。当業者は、１つまたは複数のステップを、変動する順序および頻度で行い得ることを理解されよう。
【0716】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行において使用するためにカラム中のＡＥＸ固定相を再生する方法は、固定相を使用後に浄化することを含む。一部の実施形態では、固定相の使用後の浄化は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）に続く。一部の実施形態では、浄化は、約０．１Ｍ～１Ｍ、約０．２Ｍ～０．８Ｍ、約０．３～約０．７Ｍ、または約０．４Ｍ～約０．６ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、浄化は、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、使用後の浄化は、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することおよび上向流の使用を含む。一部の実施形態では、使用後の浄化は、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、使用後の浄化は、２～２０ＣＶ、５～１５ＣＶ、７～１３ＣＶ（たとえば、約５、約７．５、約１０、約１６ＣＶなど）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、５０～２０００ｃｍ／時の線速度、０．２～３．０Ｌ／分の流速、および／または２～１５分／ＣＶの滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、使用後の浄化は、１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0717】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにカラム固定相を再生する方法は、固定相を再生することを含む（一部の実施形態ではそのようなステップを「平衡化」と呼び得る）。一部の実施形態では、カラム固定相を再生することは、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）に続く。一部の実施形態では、再生は、塩（たとえば、ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム（酢酸ＮＨ４）、ＭｇＣｌ２、およびＮａ２ＳＯ４）ならびに緩衝剤（たとえば、トリス、ビス－トリスプロパン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリシン、トリエタノールアミン、および／またはビシン）を含む溶液を、カラム中の固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、約０．１Ｍ～５Ｍ（たとえば、０．１Ｍ～４Ｍ、０．１Ｍ～３．５Ｍ、０．１Ｍ～３Ｍ、０．１Ｍ～２．５Ｍ、０．５Ｍ～４Ｍ、０．５Ｍa～３．５Ｍ、０．５Ｍ～３．０Ｍ、０．５Ｍ～２．５Ｍ、１Ｍ～４Ｍ、１Ｍ～３．５Ｍ、１Ｍ～３Ｍ、１Ｍ～２．５Ｍ、または約１．５Ｍ～２．５Ｍ）の塩を含む溶液を、固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、約１ｍＭ～５００ｍＭ（たとえば、１ｍＭ～４５０ｍＭ、１ｍＭ～４００、１ｍＭ～３５０ｍＭ、１ｍＭ～３００ｍＭ、１ｍＭ～２５０ｍＭ、１ｍＭ～２００ｍＭ、５０ｍＭ～４５０ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～３５０ｍＭ、５０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、または５０ｍＭ～１５０ｍＭ）の緩衝剤を含む溶液を、固定相に適用することを含む。
【0718】
一部の実施形態では、再生は、約７．０および１１．０（たとえば、７．５～１０．５、８．０～１０．０、８．５～９．５、または８．０～９．０）のｐＨを有する溶液を、固定相に適用することを含む。
【0719】
一部の実施形態では、再生は、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、２ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、２～１５ＣＶ（たとえば、約５ＣＶ、約１０ＣＶ）の溶液（たとえば再生溶液）を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、２～１５ＣＶ（たとえば、約５ＣＶ、約１０ＣＶ）の、２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００～２０００ｃｍ／時の線速度、０．２～３．０Ｌ／分の流速、および／または２分／ＣＶ～１５分／ＣＶの滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、再生は、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0720】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにカラム固定相を再生する方法は、固定相を平衡化することを含む（一部の実施形態ではそのようなステップを「再生ステップ」と呼び得る）。一部の実施形態では、カラム中の固定相の平衡化は、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）に続く。一部の実施形態では、カラム中の媒体の平衡化は、約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの平衡化は、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの平衡化は、２～１５ＣＶ（たとえば、約５ＣＶ、１０ＣＶ）の溶液（たとえば平衡化溶液）を、カラム中のＡＥＸ媒体に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの平衡化は、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの平衡化は、２～１５ＣＶ（たとえば、約５ＣＶ、約１０ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００～２０００ｃｍ／時の線速度、０．２～３．０Ｌ／分の流速、および／または２分／ＣＶ～１５分／ＣＶの滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの平衡化は、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0721】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにカラム固定相を再生する方法は、固定相の使用後のフラッシュを含む（すなわちフラッシュした）。一部の実施形態では、カラムの使用後のフラッシュは、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）に続く。一部の実施形態では、カラムの使用後のフラッシュは、注入用水（たとえば精製水）を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの使用後のフラッシュは、≧４．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの使用後のフラッシュは、２～１５ＣＶ（たとえば、約５ＣＶ、約１０ＣＶ）の、注入用水を含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００～２０００ｃｍ／時の線速度、０．２～３．０Ｌ／分の流速、および／または２分／ＣＶ～１５分／ＣＶの滞留時間で適用することを含む。一部の実施形態では、カラムの使用後のフラッシュは、４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば約６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0722】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにカラム固定相を再生する方法は、保存液を固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、カラムに保存液を適用することは、溶出ステップ（たとえば勾配溶出）に続く。一部の実施形態では、１６％～２０％のエタノール（たとえば約１７．５％）を含む保存液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用する。一部の実施形態では、２～１１ＣＶ（たとえば、約３ＣＶ、約１０ＣＶ）の保存緩衝液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用する。一部の実施形態では、２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、１７．５％のエタノールを含む保存液を、カラム中のＡＥＸ固定相に適用する。一部の実施形態では、２～１１ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、１７．５％のエタノールを含む保存液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、１００～２０００ｃｍ／時の線速度、０．２～３．０Ｌ／分の流速、および／または２分／ＣＶ～１５分／ＣＶの滞留時間で適用する。一部の実施形態では、カラムに保存液を適用することは、２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、１７．５％のエタノールを含む溶液を、カラム中のＡＥＸ固定相に、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0723】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにカラム固定相を再生する方法であって、ｉ）１４．４～１７．６ＣＶ（たとえば約１６ＣＶ）の、約０．５ＭのＮａＯＨを含む溶液を、固定相に適用することを含む、使用後の浄化ステップ、ｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約２ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、固定相に適用することを含む、再生ステップ、ｉｉｉ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の、約１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、固定相に適用することを含む、平衡化ステップ、ｉｖ）４．５～５．５ＣＶ（たとえば約５ＣＶ）の注入用水を固定相に適用することを含む、使用後のフラッシュのステップ、および／またはｖ）２．７～３．３ＣＶ（たとえば約３ＣＶ）の、約１７．５％のエタノールを含む保存液を、カラムに適用することを含む、保存液を固定相に適用するステップを含み、ステップｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを、２７０～３３０ｃｍ／時（たとえば約３００ｃｍ／時）の線速度、６．０～６．６Ｌ（たとえば６．４Ｌ）のカラムを通して１．５～２．０Ｌ／分（たとえば約１．８Ｌ／分）もしくは１．３Ｌのカラムを通して約３１４ｍＬ／分の流速、および／または３．５～４．５分／ＣＶ（たとえば約４分／ＣＶ）の滞留時間で行い、固定相は、ＡＥＸ固定相、任意選択でＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱ固定相である、方法。
【0724】
さらなるｒＡＡＶ精製の実行のためにＡＥＸ固定相を再生する方法は、ｒＡＡＶベクターを精製する方法の第１のステップの前（すなわち、浄化の前、平衡化の前など）に、エタノール洗い出し溶液を固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、エタノール洗い出し溶液は、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む。一部の実施形態では、エタノール洗い出し溶液のカラム固定相への適用は、８～１２ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）の、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、ＡＥＸ固定相に適用することを含む。一部の実施形態では、エタノール洗い出し溶液のＡＥＸ固定相への適用は、８～１２ＣＶ（たとえば約１０ＣＶ）の、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を含む溶液を、ＡＥＸ固定相に、１００～１０００ｃｍ／時（たとえば約６００ｃｍ／時）の速度および／または１～１０分／ＣＶ（たとえば約１．５分／ＣＶ）の滞留時間で適用することを含む。
【0725】
均等物
前述の記述した明細書は、当業者が本開示を実施することを可能にするために十分であるとみなされる。前述の説明および例は、本開示の特定の例示的な実施形態を詳述する。しかし、前述の記述が文章上でいかに詳細にみえようと、本開示は多くの方法で実施してよく、本開示は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。
前述の記述した明細書は、当業者が本開示を実施することを可能にするために十分であるとみなされる。前述の説明および例は、本開示の特定の例示的な実施形態を詳述する。しかし、前述の記述が文章上でいかに詳細にみえようと、本開示は多くの方法で実施してよく、本開示は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることを理解されたい。
【0726】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書中で引用したすべての参考文献、およびそれらの中に引用されている参考文献は、既に組み込まれてはいない範囲において、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている。
【0727】
例示的な実施形態
本発明は、以下の実験の実施例を参照してさらに詳述する。これらの実施例は、例示目的でのみ提供し、別段に指定しない限りは限定することを意図しない。したがって、本発明は、いかなる様式でも以下の実施例に限定されると解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書中に提供する教示の結果として明らかとなる任意かつすべての変動を包含すると解釈されるべきである。
本発明は、以下の実験の実施例を参照してさらに詳述する。これらの実施例は、例示目的でのみ提供し、別段に指定しない限りは限定することを意図しない。したがって、本発明は、いかなる様式でも以下の実施例に限定されると解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書中に提供する教示の結果として明らかとなる任意かつすべての変動を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【0728】
（実施例１）
ＡＥＸクロマトグラフィーによってフルＡＡＶ９ベクターを富化するための、溶出塩のスクリーニング
溶出塩スクリーニングのためのＡＥＸロードの調製
ＡＥＸクロマトグラフィーによってフルＡＡＶ９ベクターを富化するための、溶出塩のスクリーニング
溶出塩スクリーニングのためのＡＥＸロードの調製
【0729】
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において成長させ、３つのプラスミドを用いて形質移入して、当分野で知られている標準方法によってＡＡＶ９ベクターを生成した（Ｇｒｉｅｇｅｒら（２０１６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７～２９７）。ＨＥＫ２９３細胞を回収し、溶解し、凝結させ、生じた溶解物を濾過した。ＡＡＶ９ベクターを清澄にした溶解物から親和性クロマトグラフィーによって精製した。親和性カラムを平衡化し、清澄にした溶解物をロードし、洗浄し、精製ＡＡＶ９ベクターが溶出された。ＡＡＶ９ベクター親和性プール（親和性溶出液とも呼ばれる）はｐＨ４．４であり、伝導率は５．３ｍＳ／ｃｍであった。親和性プールを２０ｍＭのトリス、ｐＨ９で７．６倍に希釈し、１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１でｐＨ９に調節し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生じた溶液はｐＨ９であり、伝導率は１．９ｍＳ／ｃｍであり、溶出塩スクリーニング研究のためにＡＥＸカラム上にロードした。
【0730】
１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上におけるＡＥＸクロマトグラフィーによる溶出塩スクリーニング
【0731】
４つの溶出塩を、ＡＥＸクロマトグラフィー中にＡＡＶ９の空（すなわち、組換えベクターゲノムを含有しないＡＡＶカプシド）およびフルカプシド（すなわち、組換えベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシド）を分離するその能力について研究した。表１と一致して、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム（０．５ｃｍの内径、５ｃｍの床高、１ｍＬのカラム体積）を平衡化し、ロードし、洗浄した。５０ＣＶの勾配を０～５０％のＢ緩衝液から展開し、次いで１０ＣＶのステップ溶出を１００％のＢ緩衝液を用いて実施した。４つのＢ緩衝液を用い、２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの塩、ｐＨ９の組成であった。塩は、ＮａＣｌ、酢酸Ｎａ、酢酸ＮＨ４、またはＮａ２ＳＯ４のうちの１つであった。
【0732】
【表2】
【0733】
溶出ピークの形状およびＡ２６０／Ａ２８０比に対する溶出塩の影響を、図１のクロマトグラムによって示す。Ａ２６０／Ａ２８０比は、組換えベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシドの百分率（％フル）の推定を提供し、より高い比はより高い％フルを示す（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）７（１）：１２２～１２８）。ＮａＣｌによる溶出は、高いＡ２６０／Ａ２８０を有する主ピーク（フルベクターを示す）および低いＡ２６０／Ａ２８０を有する近くに連結された肩（空カプシドを示す）をもたらした。酢酸Ｎａおよび酢酸ＮＨ４による溶出は、高いＡ２６０／Ａ２８０を有する主ピークおよび低いＡ２６０／Ａ２８０を有する２つの分離したピークを生じた。これらの結果は、酢酸Ｎａおよび酢酸ＮＨ４が、ＮａＣｌよりも良好に、空カプシドをＡＡＶ９ベクターから分離したことを示す。逆に、Ｎａ２ＳＯ４は、ＡＡＶ９材料を、中等度のＡ２６０／Ａ２８０を有する１つの鋭いピークで溶出させ、ＡＡＶ９ベクターの空カプシドからの分離がわずかであったことを暗示している。
【0734】
１ミリリットルの溶出液画分を勾配全体にわたって収集し、０．１５ｍＬの５０ｍＭのシトレート、ｐＨ３．６で中和した。中和した画分をＨＰＬＣ－ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０によって分析した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣ方法中、吸光度を２１４、２６０、および２８０ｎｍでモニタリングした。Ａ２６０／Ａ２８０比は、ＡＡＶカプシドの％フルの推定を提供する（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３）７（１）：１２２～１２８）。２６０および２８０ｎｍでのＡＡＶ９のシグネチャＳＥＣ溶出ピークを積分し、これら２つの値比を、図２に示すようにＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０として報告する。酢酸Ｎａ勾配が、最大ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０が１．２７である溶出画分を生じ、これは、ＮａＣｌ（１．２３）、酢酸ＮＨ４（１．２２）、およびＮａ２ＳＯ４（１．１５）の類似の最大値よりも高い。さらに、酢酸Ｎａに基づく溶出は、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．１９を有する７個の連続する溶出液画分を生じ、これは、ＮａＣｌ（３個の画分）、酢酸ＮＨ４（４個の画分）、およびＮａ２ＳＯ４（０個の画分）の類似の結果よりも高い。ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．１９を有する画分を一緒にプールし、ＩＴＲのｑＰＣＲによってアッセイしてベクターゲノム（ＶＧ）収率を決定し、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって分析して、空、フル、ならびに中間体（フルカプシドよりもパッケージングされた核酸が少なく、たとえば、部分的、断片化、または切断ベクターゲノムおよび／または非導入遺伝子関連ＤＮＡを含有するＡＡＶカプシド）カプシドの分布を決定した。
【0735】
溶出塩スクリーニング研究により、酢酸Ｎａが、ＶＧ収率ならびにＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０およびＡＵＣによって判断した回収されたＡＡＶ９ベクターの％フルに関して、ＮａＣｌ、酢酸ＮＨ４、およびＮａ２ＳＯ４よりも優れていたことが実証された（表２）。酢酸ＮａのＡＥＸプールは１．２４のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を有しており、これは、ＮａＣｌ（プールＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２３）および酢酸ＮＨ４（ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２１）を使用して得られた類似の値よりもわずかに高く、Ｎａ２ＳＯ４プール（ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．１５）よりも有意に高かった。ＡＥＸプールに対するＡＵＣ分析は、酢酸Ｎａ勾配が、ＮａＣｌ勾配（約３８％）よりもわずかに高い％フル（４３％）、およびＮａ２ＳＯ４勾配（２０％）よりも有意に高い％フルを生じたことを暗示している。とりわけ、酢酸Ｎａ勾配溶出は、空カプシドの百分率（％空）をＡＥＸロード中の７５％からＡＥＸプール中ｎ２９％まで低下させた。溶出塩の性能をより良好に描写するために、ＮａＣｌ、酢酸Ｎａ、および酢酸ＮＨ４を、５．１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上において使用するために選択し、以下のセクション中に記載する。
【0736】
【表3】
【0737】
５．１ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上におけるＡＥＸクロマトグラフィーによる溶出塩スクリーニング
【0738】
溶出塩ＮａＣｌ、酢酸Ｎａ、および酢酸ＮＨ４を、ＡＥＸクロマトグラフィー中にＡＡＶ９の空カプシドおよびフルベクターを分離するその能力について研究した。ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム（０．６６ｃｍの内径、１５ｃｍの床高、５．１ｍＬのカラム体積）を平衡化し、ロードし、洗浄し、ＮａＣｌ、酢酸Ｎａ、または酢酸ＮＨ４勾配で溶出させた（表３）。１ミリリットルの溶出画分を勾配全体にわたって収集し、０．１５ｍＬの５０ｍＭのシトレート、ｐＨ３．６で中和し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０によって分析した。
【0739】
酢酸Ｎａに基づく溶出は、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＞＝１．１９を有する２０個の連続する画分を生じ、これは、ＮａＣｌ（８個の画分）および酢酸ＮＨ４（１１個の画分）の類似の結果よりも高い。ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．１９を有する画分を一緒にプールし、ＩＴＲのｑＰＣＲによってアッセイしてＶＧ収率を決定し、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によって分析して％フルを決定した。
【0740】
【表4】
【0741】
溶出塩スクリーニング研究により、酢酸Ｎａが、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０およびＡＵＣによって判断した回収されたＡＡＶ９ベクターの％フルに関して、ＮａＣｌおよび酢酸ＮＨ４よりも優れていたことが実証された（表４）。酢酸ＮａのＡＥＸプールは１．２６のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を有しており、これは、ＮａＣｌ（プールＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２４）および酢酸ＮＨ４（ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０＝１．１９）を使用して得られた類似の値よりも高かった。ＡＥＸプールに対するＡＵＣ分析は、酢酸Ｎａ勾配が、ＮａＣｌ勾配（３９％）および酢酸ＮＨ４勾配（３６％）よりもわずかに高い％フルカプシド（４３％）を生じたことを暗示している。
【0742】
総合すると、１ｍＬおよび５．１ｍＬのカラム体積スケールで実施したＡＥＸ実行は、酢酸Ｎａが、ＮａＣｌおよび酢酸ＮＨ４よりも良好に、空カプシドをフルＡＡＶ９ベクターから分離したことを示した。したがって、ＡＥＸプロセスのさらに発展したバージョンにおいて、酢酸Ｎａを溶出塩として用いた。
【0743】
【表5】
【0744】
（実施例２）
酢酸ナトリウムステップ溶出を用いたＡＥＸクロマトグラフィーによるフルＡＡＶ９ベクターの富化
実施例１の結果に少なくとも部分的に基づいて、ＡＡＶ９空カプシドをフルベクターから分離するためのＡＥＸクロマトグラフィーカラムの、ステップ溶出操作を研究するために、酢酸Ｎａを選択した。親和性溶出液を実施例１に記載のように作製し、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９および１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
酢酸ナトリウムステップ溶出を用いたＡＥＸクロマトグラフィーによるフルＡＡＶ９ベクターの富化
実施例１の結果に少なくとも部分的に基づいて、ＡＡＶ９空カプシドをフルベクターから分離するためのＡＥＸクロマトグラフィーカラムの、ステップ溶出操作を研究するために、酢酸Ｎａを選択した。親和性溶出液を実施例１に記載のように作製し、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９および１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【0745】
最適な酢酸Ｎａステップ溶出条件のスクリーニング
【0746】
スクリーニング目的のために、９ステップの洗浄および溶出ＡＥＸ方法を、酢酸Ｎａ濃度のステップ増加を用いて、２０ｍＭのトリス、ｐＨ９中で実施した。表５と一致して、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム（０．６６ｃｍのＩＤ×１５ｃｍのＢＨ、５．１ｍＬのＣＶ）を平衡化し、ロードし、洗浄し、溶出させた。洗浄および溶出緩衝液は、ＦＰＬＣ系中において、Ａ緩衝液：２０ｍＭのトリス、ｐＨ９およびＢ緩衝液：２０ｍＭのトリス、１４０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ９を混合することによって形成した。画分を中和し、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０、ＡＵＣ、およびＩＴＲのｑＰＣＲによってアッセイした。図３は９ステップのクロマトグラムを示し、洗浄および溶出緩衝液の酢酸Ｎａ濃度を徐々に増加させた際の、インラインＡ２６０／Ａ２８０の明確な変化を示す。
【0747】
【表6-1】
【0748】
【表6-2】
【0749】
９ステップの実行からの分析結果は、酢酸Ｎａステップ洗浄および溶出によって、空ＡＡＶ９カプシドをフルＡＡＶ９ベクターから分離することができることを示す（表６）。洗浄１および２は、結合した空カプシドをＡＥＸカラムから選択的に除去した。とりわけ、洗浄１および２は、それぞれ０．５８および０．７９のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値、ならびにそれぞれ９８％および８５％の％空（ＡＵＣ）を生じた。溶出画分１～４はフルＡＡＶ９ベクターが富化され、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値が１．２７～１．３０の範囲であり、％フル（ＡＵＣ）が２９～５３％の範囲であり、これはＡＥＸロード中の１２％のフルよりも相当高い。これらの発見に基づいて、酢酸Ｎａに基づくステップ洗浄および溶出方法を設計し、以下に提供する。
【0750】
【表7】
【0751】
ステップ酢酸Ｎａ洗浄、溶出方法によるフルＡＡＶ９ベクターの富化
【0752】
上記結果に基づいて、様々なステップ酢酸Ｎａ洗浄および溶出を用いたＡＥＸ方法を、フルＡＡＶ９ベクターカプシドを富化させるその能力について試験した。表７と一致して、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム（０．６６ｃｍのＩＤ×１５ｃｍのＢＨ、５．１ｍＬのＣＶ）を平衡化し、洗浄し、溶出させた。洗浄、ｐＨ安定化、および溶出緩衝液は、ＦＰＬＣ系中において、Ａ緩衝液：２０ｍＭのトリス、ｐＨ９およびＢ緩衝液：２０ｍＭのトリス、１４０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ９を混合することによって作製した。研究した方法にわたって、複数のパラメータ、すなわち、溶出の線速度（７５～６００ｃｍ／時）、ロードチャレンジ（５．１×１０１３～１．１×１０１５ＶＧ／ｍＬの樹脂）、および洗浄ステップにおける酢酸Ｎａの濃度（５７ｍＭまたは６８ｍＭ）を変動させた。
【0753】
６００ｃｍ／時の溶出、５．１×１０１３ＶＧ／ｍＬの樹脂チャレンジ、および５７ｍＭの酢酸Ｎａ洗浄を用いたステップ洗浄および溶出実行のクロマトグラムを、図４Ａおよび図４Ｂ中に示す。表８は結果を報告し、開発したステップ酢酸Ｎａ洗浄および溶出ＡＥＸ方法がフルＡＡＶ９ベクターを富化させ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを低下させたことを明らかにする。開発したステップ方法は、％フル（ＡＵＣによって判断）を１８％から４０～５３％まで増加させ、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を０．９５から１．２５～１．２７まで増加させた。ＡＡＶ９フルカプシドを富化させることに加えて、開発したステップ方法は、大量のＨＣＰおよび中等度の量の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）を低いカラムチャレンジで除去した。ステップ酢酸Ｎａ洗浄および溶出方法は、超遠心分離または酢酸Ｎａ勾配溶出によるＡＥＸクロマトグラフィーほど高い％ＶＧ収率またはＡＡＶ９の％フルは提供しなかった（以下の実施例６、７、および８）。しかし、ステップ溶出手法は超遠心分離に関連する複雑な操作を回避する。
【0754】
【表8-1】
【0755】
【表8-2】
【0756】
【表9】
【0757】
（実施例３）
ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性溶出液を調製する方法のスクリーニング
ＡＡＶ９の大スケールの下流プロセスの一実施形態は、細胞溶解、濾過、および親和性クロマトグラフィーを含み、生成物の溶出は、低いｐＨおよび中等度の伝導率である。様々なＡＡＶ血清型のウイルスタンパク質に関する研究は、空およびフルＡＡＶ９カプシドについてそれぞれ約６．２および約５．８の計算した等電点を報告している（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１３）８７．９：４９７４～４９８４）。様々な条件のスクリーニングにより、ＡＡＶ９は、比較的アルカリ性の低い伝導率環境下でのみＡＥＸ樹脂と結合することが明らかになっている（データ示さず）。したがって、酸性のＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性溶出液の調製は、ベクター含有緩衝液のｐＨを上げ、伝導率を下げることを必要とする。このプロセスはＡＡＶ９等電点を行き来し、これは、ベクターの損失をもたらす場合がある不安定な移行である。
ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性溶出液を調製する方法のスクリーニング
ＡＡＶ９の大スケールの下流プロセスの一実施形態は、細胞溶解、濾過、および親和性クロマトグラフィーを含み、生成物の溶出は、低いｐＨおよび中等度の伝導率である。様々なＡＡＶ血清型のウイルスタンパク質に関する研究は、空およびフルＡＡＶ９カプシドについてそれぞれ約６．２および約５．８の計算した等電点を報告している（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１３）８７．９：４９７４～４９８４）。様々な条件のスクリーニングにより、ＡＡＶ９は、比較的アルカリ性の低い伝導率環境下でのみＡＥＸ樹脂と結合することが明らかになっている（データ示さず）。したがって、酸性のＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性溶出液の調製は、ベクター含有緩衝液のｐＨを上げ、伝導率を下げることを必要とする。このプロセスはＡＡＶ９等電点を行き来し、これは、ベクターの損失をもたらす場合がある不安定な移行である。
【0758】
本実施例は、酸性の親和性プールをＡＥＸクロマトグラフィーロード内にプロセスするための様々な手法を詳述する。希釈、インライン混合（図５）、およびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）のロード調製方法を研究した。結果は、高い生成物収率および低い凝集を伴ってＡＡＶ９親和性溶出液をＡＥＸクロマトグラフィーロード内にプロセスすることは、新規および進歩的なプロセスおよび手順の専門的な開発を必要としたことを示す。
【0759】
ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性プールを調製するための希釈方法
【0760】
親和性溶出プールは約３．８～４．４のｐＨ、約５．５～６．５ｍＳ／ｃｍの伝導率を有し、７×１０１３～１．４×１０１４個のＡＡＶ９ＶＧ／ｍＬを含む。親和性プールは、実施例１に記載のように、すなわち、プールをアルカリ性緩衝液で希釈することによって、ＡＥＸクロマトグラフィー用に調製し得る。表９と一致して、ｐＨを上昇させて伝導率を減少させるために、ＡＡＶ９親和性プールを、アルカリ性緩衝液の組合せを用いて、ＰＥＴＧ容器内で希釈した。生じる溶液を、希釈緩衝液で事前に濡らした０．２μｍのフィルターに通過した。大スケール下流プロセスを模倣するために、希釈した試料を０．２μｍで濾過し、フィルターはクロマトグラフィーカラムの入口に配置した。生じた濾液は、ｐＨ８．７～９．０であり、伝導率は１．８～２．１ｍＳ／ｃｍの範囲であり、これは、ＡＡＶ９とＡＥＸ樹脂との高い結合を可能にする条件である。試料を希釈後に採り、濾過後に、ＩＴＲのｑＰＣＲによってＶＧ力価についてアッセイした。
【0761】
表９は結果を報告し、大量のＡＡＶ９が希釈および濾過中に失われたことを明らかにする。続く２０ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いた希釈および１Ｍのトリス塩基、ｐＨ１１を用いたｐＨ調節、次いで０．２μｍの濾過により、３９％のＶＧ損失がもたらされた。これらの希釈剤の順序を逆にすることは同様の結果をもたらし、濾過後のベクターの損失は３７％であった。より高い希釈はより大量のＶＧ損失をもたらした。１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いた２５倍希釈、次いで１Ｍのトリス、ｐＨ９を用いたｐＨ調節は、わずか３６％の濾過後のＶＧ収率を与えた。同じ緩衝液を用いた１５倍希釈は、６５％の濾過後収率を与えた。
【0762】
ＡＡＶ９と希釈容器およびフィルターの表面との非特異的結合を減らすために、０．０１％（ｖ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）を希釈緩衝液１００ｍＭのトリス、ｐＨ９に加えた。この手法は、０．０１％のＰ１８８あり、およびなしで、濾過後のＶＧ収率をそれぞれ６５％から７４％までわずかに増加させただけであった。これらの希釈技法は所望よりも低い％ＶＧ収率を与えたため、さらなる緩衝液交換技法を調査した。
【0763】
【表10-1】
【0764】
【表10-2】
【0765】
ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性プールを調製するためのインライン希釈
【0766】
ベクターが曝露される表面積を減らし、ベクターが前記表面に曝露される時間の量を減らす一方で、ＡＥＸロードを作製するために、ＡＡＶ９親和性プールのインライン希釈を調査した。インライン希釈装置を図５に示す。
【0767】
３片のプラチナ硬化シリコンチューブをＹ字コネクタによって結合した。蠕動ポンプが１００ｍＭのトリス、ｐＨ９をＹ字コネクタに３．５ｍＬ／分の流速で送達した。第２の蠕動ポンプがＡＡＶ９親和性プールをＹ字コネクタに０．２５ｍＬ／分の流速で送達した。これらの流速の比（１４部の希釈剤対１部の親和性プール）は、１５倍希釈を達成し、同様の希釈係数との直接比較を可能にするために選択した（表９および表１２）。合わせた流体は、内径０．１６ｃｍおよび長さ１００ｃｍを有するプラチナ硬化シリコンチューブを通過した。混合チューブの寸法は、これらの条件が安定した十分に混合された溶液を達成したことを示した緩衝液混合研究に基づいて設計した。
【0768】
インラインで混合した溶液を収集し、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和し、ＩＴＲのｑＰＣＲによって分析した。装置内にポンプしたＶＧの７９％が混合チューブの出口で回収された。この結果はバッチ希釈実験と比較して％ＶＧ収率のわずかな改善を表したが、収率は依然として所望よりも低かった。したがって、さらなるＡＥＸロードの調製実験をタンジェンシャルフロー濾過によって実施した。
【0769】
ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９親和性プールを調製するためのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）
【0770】
ＡＥＸロードの調製に負うＶＧ損失を回避するために、ＴＦＦを使用して、ＶＧ濃度を高く保ち、アルギニンをベクター含有溶液内に一時的に取り込ませた。表１０と一致して、２回のＴＦＦの実行を、新しい２０ｃｍ２のｍＰＥＳ中空繊維膜を用いて実施した。膜を平衡化し、ＡＡＶ９親和性プールをロードし、ＡＡＶ９親和性プールと同じ緩衝液である１５０ｍＭのアセテート、１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ４．２に対してダイアフィルトレーションした。それぞれのステップの終わりに、ＴＦＦ系を一時停止させ、濃縮水容器をサンプリングした。試料をＩＴＲのｑＰＣＲによってＶＧ力価について分析し、結果を表９および表１０に示す。
【0771】
実行＃１では、親和性溶出プール類似体緩衝液から１００ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％のＰ１８８、ｐＨ９内への直接のダイアフィルトレーションは、６６％のＶＧ収率をもたらした。実行＃２では、５００ｍＭのアルギニン（タンパク質凝集を低下させることが知られている共溶媒（Ａｒａｋａｗａら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）１２７（１）：１～８））をダイアフィルトレーション緩衝液２内に添加することで、アルギニンの非存在下で得られた６６％の収率と比較してＶＧ収率が９３％まで改善された。しかし、実行＃２における系からのアルギニンの除去は有意な損失を与え、７８％のＶＧ収率となった。５００ｍＭのアルギニンは、高い伝導率（約２０ｍＳ／ｃｍ）のＡＥＸロードを生じ、これがＡＥＸ樹脂との結合に干渉するため、最終ダイアフィルトレーション緩衝液に含めなかった。しかし、この発見は、ＡＡＶ９を安定化させることができるが、アルカリ性ｐＨでより低い溶媒伝導率を有する、他のアミノ酸共溶媒の研究を促した。これらの研究を実施例６に記載する。
【0772】
【表11-1】
【0773】
【表11-2】
【0774】
１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いた希釈の際の、ＡＡＶ９親和性プールの動的光散乱法分析
【0775】
動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９で希釈したＡＡＶ９親和性プール中におけるＺ平均（Ｚ－ＡＶＧ）をカプシド凝集の推定として測定した。Ｚ平均は、溶液中の粒子の平均サイズの信頼性のある測度である。表１１に示すように、ＡＡＶ９親和性プールを、ポリプロピレンチューブ中で、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９で希釈し（０～３０倍）、ＤＬＳによって直ちに分析した。それぞれの希釈係数について、別の実験を、新しいＡＡＶ９親和性プールを用いて、新しいポリプロピレンチューブ中で実施した。ＤＬＳ分析が完了した後、溶液をｐＨおよび伝導率について測定した。
【0776】
結果を表１１に要約し、図６にグラフで示し、ＡＡＶ９親和性プールの希釈が凝集およびＺ平均の増加をもたらしたことを示す。未希釈のＡＡＶ９親和性プールは、４．１のｐＨ、６．０ｍＳ／ｃｍの伝導率、１５ｎｍのＺ平均、および凝集なしであった。１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いた２倍希釈は、ＡＡＶ９親和性プールと比較して、溶液のｐＨを７．２まで増加させ、伝導率を５．８ｍＳ／ｃｍに維持し、凝集の５倍の増加および７７ｎｍのＺ平均をもたらした。この結果は、溶液のｐＨを推定されるＡＡＶ９等電点（（フルおよび空ＡＡＶ９カプシドについてそれぞれ約５．８および約６．２であると計算（Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７（９）：４９７４～４９８４））を通って上げることが、ベクターを不安定化させ、生成物の損失をもたらしたことを暗示している。５および１０倍希釈係数は、凝集ならびにそれぞれ３９５ｎｍおよび２２１ｎｍの非常に高いＺ平均をもたらした。１５～３０倍の範囲のより高い希釈係数は、４６～６６ｎｍのＺ平均および凝集を示した。
【0777】
総合すると、表９および表１０に示す結果は、大量のＡＡＶ９ベクターがＡＥＸロードの調製中に失われたことを明らかにした。高いＶＧ濃度でのＴＦＦ、インライン希釈、および０．０１％のＰ１８８の存在下での希釈のロード調製方法は、ＶＧ損失を防止することができなかった。表１１のデータにより、ＶＧ損失の裏にある機構が凝集であったことが実証された。この観察に基づいて、凝集を防止することができる希釈剤を用いて一連の希釈実験を実施し、実施例６に記載されている。
【0778】
【表12】
【0779】
（実施例４）
ＡＥＸ用のＡＡＶ９親和性溶出液を調製するための希釈共溶媒のスクリーニング
ＡＥＸロードの調製中に％ＶＧ収率を最大限にした条件を同定するために、ＡＡＶ９親和性溶出液を様々な希釈共溶媒で１５倍に希釈した。スクリーニングした共溶媒は、界面活性剤、イオジキサノール、グリセロール、塩化マグネシウム、およびアミノ酸を含む。ｐＨまたは伝導率を変更せずに希釈単独の効果を研究するために、ＡＡＶ９親和性溶出液を、親和性溶出液プール緩衝液、すなわち、１５０ｍＭのアセテート、１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ４．２で希釈した。１４ｍＬの希釈剤をポリプロピレンチューブに加え、次いで１ｍＬのＡＡＶ９親和性溶出液を加えた。生じた溶液を端から端までの攪拌によって穏やかに混合し、ｐＨおよび伝導率について測定し、濾過前の試料を採った。その後、希釈した試料を、希釈剤で事前に濡らした０．２μｍのフィルターを通して濾過した。希釈後および濾過後の試料を２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和した。中和した試料を動的光散乱法によって分析して粒子のＺ－ＡＶＧおよび凝集の相対量を推定し、ＩＴＲのｑＰＣＲによって分析してＶＧ力価を決定した。
ＡＥＸ用のＡＡＶ９親和性溶出液を調製するための希釈共溶媒のスクリーニング
ＡＥＸロードの調製中に％ＶＧ収率を最大限にした条件を同定するために、ＡＡＶ９親和性溶出液を様々な希釈共溶媒で１５倍に希釈した。スクリーニングした共溶媒は、界面活性剤、イオジキサノール、グリセロール、塩化マグネシウム、およびアミノ酸を含む。ｐＨまたは伝導率を変更せずに希釈単独の効果を研究するために、ＡＡＶ９親和性溶出液を、親和性溶出液プール緩衝液、すなわち、１５０ｍＭのアセテート、１００ｍＭのグリシン、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ４．２で希釈した。１４ｍＬの希釈剤をポリプロピレンチューブに加え、次いで１ｍＬのＡＡＶ９親和性溶出液を加えた。生じた溶液を端から端までの攪拌によって穏やかに混合し、ｐＨおよび伝導率について測定し、濾過前の試料を採った。その後、希釈した試料を、希釈剤で事前に濡らした０．２μｍのフィルターを通して濾過した。希釈後および濾過後の試料を２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和した。中和した試料を動的光散乱法によって分析して粒子のＺ－ＡＶＧおよび凝集の相対量を推定し、ＩＴＲのｑＰＣＲによって分析してＶＧ力価を決定した。
【0780】
希釈共溶媒スクリーニングの結果は、ベースライン希釈剤１００ｍＭのトリス、ｐＨ９と比較して、一部の共溶媒が凝集を低下させ、３０ｎｍ近くのＺ－ＡＶＧを維持し、％ＶＧ収率を増加させたことを明らかにした（表１２）。未希釈のＡＡＶ９親和性溶出プールは２９ｎｍのＺ－ＡＶＧを有しており、見かけの凝集はなかった。親和性溶出液プール緩衝液を用いたＡＡＶ９親和性プールの希釈は、Ｚ－ＡＶＧの増加なし、凝集なしであったが、６９％しかないＶＧ収率をもたらした。このデータは、凝集は親和性プールの条件で起こらなかったが（ｐＨ４．２、７ｍＳ／ｃｍ）、ＶＧ損失が増加した表面積（希釈による）との非特異的結合によって起こったことを示唆している。
【0781】
実施例３からの結果（上記）に一致して、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いたＡＡＶ９親和性プールの希釈は、Ｚ－ＡＶＧの増加、高い凝集、および５９％しかないＶＧ収率をもたらした。０．０１～１％のＰ１８８を１００ｍＭのトリス、ｐＨ９に加えることは、ベースライン緩衝液と比較して、性能を有意に改善させず、同様のＺ－ＡＶＧおよび凝集を伴った。５０ｍＭのアルギニン、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＰ１８８、１００ｍＭのトリス、ｐＨ９を用いたＡＡＶ９親和性溶出液の希釈は、３３ｎｍのＺ－ＡＶＧ、凝集なし、および約８０％のＶＧ収率をもたらしたが、ＡＡＶ９とＡＥＸ樹脂との結合と干渉するであろう４．５ｍＳ／ｃｍの伝導率をもたらした。複数のヒスチジン含有希釈剤が望ましい結果を提供した。たとえば、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％のイオジキサノール、ｐＨ８．８を用いたＡＡＶ９の希釈は、９９％のＶＧ収率をもたらした。イオジキサノールはＵＶ活性が強く、クロマトグラフィー系におけるＵＶ読取りと干渉するであろうため、これおよび同様の緩衝液はＡＥＸ実行において用いなかった。
【0782】
重要なことに、０．５％のＰ１８８、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、ｐＨ８．８を用いたＡＡＶ９親和性溶出液の１５倍希釈、次いで事前に濡らしたフィルターを通した濾過は、３５ｎｍのＺ－ＡＶＧおよび１０１％のＶＧ収率をもたらした。生じた希釈した濾過した溶液はｐＨ８．８であり、伝導率は２．５ｍＳ／ｃｍであり、これは、ＡＥＸ樹脂と結合しやすい可能性が高い条件である。したがって、この希釈スキームを続く実施例において最適化した。
【0783】
ＡＡＶ２凝集の研究は、ＤＬＳと組み合わせた希釈ストレス試験による様々な共溶媒のスクリーニングを含み、ＡＡＶ２凝集が、イオン強度≧２００ｍＭの様々な塩を含有する緩衝液内への希釈によって防止されることが見出された（Ｆｒａｓｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２（１）：１７１～１７８）。ＡＥＸクロマトグラフィー用のＡＡＶ９を調製するための同様の手法は、イオン強度≧２００ｍＭを有する溶液がベクターとＡＥＸ樹脂との結合を低下したため、本実施例に適用可能でなかった（データ示さず）。興味深いことに、アミノ酸ヒスチジン、アルギニン、またはグリシンの希釈剤への添加はＡＡＶ２凝集を阻害しなかった（Ｆｒａｓｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２（１）：１７１～１７８）。
【0784】
本実施例では、ＭｇＣｌ２、Ｐ１８８、および／またはグリセロールと組み合わせた、ヒスチジン、アルギニン、およびグリシンの混合物は、ＡＡＶ９凝集を低下させたが、６９～８０％の％ＶＧ収率しか与えなかった（表１２の希釈剤結果Ｒ２、Ｈ２、Ｈ３を参照）。高い％ＶＧ収率は、ヒスチジンを界面活性剤Ｐ１８８およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と相乗作用で用いた場合にのみ達成された（表１２の希釈剤結果Ｈ７およびＨ８を参照）。これらの結果は、ＡＡＶカプシド（たとえばＡＡＶ９）のＡＥＸロードの調製のために高いＶＧを与える希釈共溶媒は、表面（たとえば希釈容器およびフィルター）との非特異的結合を低下させるために界面活性剤を含有し、ＡＡＶカプシド粒子（たとえばＡＡＶ９ベクター粒子）間の電荷相互作用および／または水素結合をモジュレートするためにヒスチジンまたは同様の部分を用いるべきであることを示す。
【0785】
【表13-1】
【0786】
【表13-2】
【0787】
（実施例５）
ＡＥＸクロマトグラフィー用の組換えＡＡＶ９ベクター親和性溶出液を調製するための、希釈共溶媒の最適化
ＡＡＶ９ベクターの最大回収を達成するために、希釈剤中のＰ１８８の濃度、および希釈した試料の生じた伝導率を最適化した。０．０１％、０．０５％、０．２％、および０．５％の希釈剤Ｐ１８８の濃度を、２、２．５、および３ｍＳ／ｃｍの希釈した試料の伝導率と合わせて試験した。変動する伝導率を達成するために、変動する希釈係数を用いた。希釈したＡＡＶ９ベクター親和性溶出液を、それぞれの対応する希釈剤で事前に濡らした０．２μｍのフィルターに通過した。生じた濾液を導入遺伝子のｑＰＣＲによってアッセイしてＶＧ力価を決定し、結果を表１３ならびに図７Ａおよび図７Ｂに示す。図７Ａおよび図７Ｂに示すデータは、最大のＶＧ収率を達成するために０．５％のＰ１８８が必要であること、およびより低い濃度（すなわち０．５％未満）のＰ１８８の使用がより低いＶＧ収率をもたらしたことを実証している。最終伝導率（またはそれに関連して希釈係数）はどちらも、研究した範囲内で％ＶＧ収率に有意な影響を与えなかった。
ＡＥＸクロマトグラフィー用の組換えＡＡＶ９ベクター親和性溶出液を調製するための、希釈共溶媒の最適化
ＡＡＶ９ベクターの最大回収を達成するために、希釈剤中のＰ１８８の濃度、および希釈した試料の生じた伝導率を最適化した。０．０１％、０．０５％、０．２％、および０．５％の希釈剤Ｐ１８８の濃度を、２、２．５、および３ｍＳ／ｃｍの希釈した試料の伝導率と合わせて試験した。変動する伝導率を達成するために、変動する希釈係数を用いた。希釈したＡＡＶ９ベクター親和性溶出液を、それぞれの対応する希釈剤で事前に濡らした０．２μｍのフィルターに通過した。生じた濾液を導入遺伝子のｑＰＣＲによってアッセイしてＶＧ力価を決定し、結果を表１３ならびに図７Ａおよび図７Ｂに示す。図７Ａおよび図７Ｂに示すデータは、最大のＶＧ収率を達成するために０．５％のＰ１８８が必要であること、およびより低い濃度（すなわち０．５％未満）のＰ１８８の使用がより低いＶＧ収率をもたらしたことを実証している。最終伝導率（またはそれに関連して希釈係数）はどちらも、研究した範囲内で％ＶＧ収率に有意な影響を与えなかった。
【0788】
【表14】
【0789】
（実施例６）
最適化された希釈およびＡＥＸクロマトグラフィー技法によるフルＡＡＶ９の富化
実施例４および５からの上位の性能の希釈剤を実施例１からの上位の性能の溶出塩と組み合わせて、高い％ＶＧ収率でフルＡＡＶ９ベクターカプシドを富化させることができる、最適化されたＡＥＸクロマトグラフィー方法を形成した。
最適化された希釈およびＡＥＸクロマトグラフィー技法によるフルＡＡＶ９の富化
実施例４および５からの上位の性能の希釈剤を実施例１からの上位の性能の溶出塩と組み合わせて、高い％ＶＧ収率でフルＡＡＶ９ベクターカプシドを富化させることができる、最適化されたＡＥＸクロマトグラフィー方法を形成した。
【0790】
ＡＡＶ９親和性溶出液を、アミノ酸および界面活性剤共溶媒を含む新規緩衝液（２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．９）で１５倍に希釈し、０．２μｍのフィルターで濾過した。１５倍希釈は、他の方法（ＵＳ２０１９－０００２８４１号、ＵＳ２０１９－０００２８４２号、ＵＳ２０１８－０００２８４４号を参照）において使用した希釈よりも低く、大スケール製造においてより実施しやすく、高いＶＧ収率をもたらす。
【0791】
生じた濾液はｐＨ８．８であり、伝導率は２．３ｍＳ／ｃｍであった。表１４と一致して、濾液をＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラム上にロードし、酢酸ナトリウム勾配によって溶出させ、ＣＶの０．３９に等しい画分を勾配溶出中に収集した。
【0792】
ロードおよびクロマトグラフィー画分を２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和し、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０、ＡＵＣ、およびＩＴＲのｑＰＣＲによってアッセイした。ＡＥＸプロセスの再現性を試験するために、第１の実行と同じ材料および方法を使用して第２の実行を実施した。第１の実行ＡＥＸクロマトグラムを図８Ａおよび図８Ｂに示す。勾配溶出画分のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を表１５に提供し、最適化されたＡＥＸ方法が、ロードと比較してフルＡＡＶ９ベクターを富化させたことを示す。親和性プール（カラム上にロードした）、フロースルー画分、および溶出プール中のフル、中間体、および空カプシドの百分率を、分析用超遠心分離を使用して決定した。データを表１６中に提供し、最適化されたＡＥＸ方法が、フルＡＡＶ９ベクターカプシドの百分率を富化させた一方で、高い％ＶＧ収率をもたらしたことを示す。
【0793】
【表15-1】
【0794】
【表15-2】
【0795】
【表16】
【0796】
【表17】
【0797】
ＡＡＶ９親和性溶出液の希釈および濾過は９３％のＶＧ収率をもたらし、実施例３および４における結果の確証を提供した。フロースルー画分は、親和性プール出発物質からの１０％のＶＧを含有しており、０．７０のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を有しており、１％のフル、１４％の中間体、および８５％の空のカプシド集団を有していた。この結果は、開発したＡＥＸ方法が、一部の空カプシドをカラムを通って分配し、酢酸ナトリウム勾配溶出によるさらなる富化を容易にすることを示す。
【0798】
どちらのＡＥＸ実行においても、３つの仮想溶出プール、すなわち、画分１～８からなる広範囲プール、画分２～６から構成される狭範囲プール、および画分８～１３から作られる第２のピークのプールを形成した。第２のピークのプールは２０％のＶＧ収率を有しており、ほとんど空カプシドから構成されていた。広範囲プールは、５３％のＶＧ収率を含有しており、１．２６の平均ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を有しており、４７％のフルＡＡＶ９ベクターカプシドであり、したがって％フルの２．６倍の富化を表す。狭範囲溶出プールは、平均３８％のＶＧ収率を含有しており、１．２８～１．２９のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比であり、５３％フル、２３％の中間体、および２４％の空の平均ＡＡＶ９ベクターカプシド集団であった。したがって、最適化されたＡＥＸ方法は、フルＡＡＶ９ベクターを２．９倍および枯渇された空カプシドを２．８倍に富化させた。
【0799】
狭範囲プールから得られた結果は、％フルと％ＶＧ収率との間の望ましいバランスを表していた。したがって、続く実施例の大多数において同様の結果を得るために、本発明者らは、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２５（狭範囲プール画分２～６で得られた１．２５の最小値と同様、表１６）の画分プール閾値を採用した。したがって、続く実施例中において１０個のうち８個の大スケールＡＥＸ実行において、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２５を有する画分をプールに含め、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≦１．２４を有するすべての画分を排除した。
【0800】
上記データおよび戦略は、最適化されたＡＥＸ方法の強力な特徴、すなわちプール戦略の柔軟性を例示している。高分解能の勾配溶出クロマトグラフィーを、収集した画分のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０分析と合わせて利用することで、供給流またはプロセス操作の軽微な変化にかかわらず、回収された生成物の高い％フルが確実となる。
【0801】
組換えＡＡＶベクターの精製、具体的には空カプシドのフルＡＡＶベクターからの分離のために開発された他のクロマトグラフィー方法とは対照的に（ＵＳ２０１９－０００２８４１号、ＵＳ２０１９－０００２８４２号、ＵＳ２０１８－０００２８４４号）、開示した本方法は、より低い希釈係数、ヒスチジンを含有する希釈緩衝液、より急勾配の溶出勾配、溶出塩として酢酸Ｎａ、およびアルカリ性がより低い条件（ｐＨ９）を利用する。本明細書中に開示し、実施例１～９中に例示した方法はまた、開示した方法が、約７ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するＡＥＸロードの調製を利用せず、硫安塩析を利用せず、サイズ排除クロマトグラフィーを利用しないという点で、Ｔｏｍｏｎｏら（Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１８）１１：１８０～１９０）のものなどの他の報告されている方法と異なる。本明細書中に開示した新規および進歩的な方法は、大スケールで実施し、高い収率のＶＧを親和性クロマトグラフィー溶出液から生成することができる。
【0802】
最適化されたＡＥＸ方法の柔軟性およびロバスト性をさらに例示するために、実施例７では、変動する％フルベクターカプシドを有する供給流を試験した。
【0803】
（実施例７）
最適化されたＡＥＸプロセスの性能に対する親和性溶出液中のフルカプシドの百分率の効果
最適化されたＡＥＸ方法を、フルＡＡＶ９ベクターを、変動する百分率のＡＡＶ９空カプシドを有する供給材料から富化させるその能力について試験した。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において成長させ、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびＲｅｐ２Ｃａｐ９プラスミドを用いて形質移入した（導入遺伝子カセットを含むプラスミドは含めなかった）。細胞を形質移入後３日間培養し、回収し、溶解し、凝結させ、デプスフィルターを行い、絶対濾過した。親和性クロマトグラフィーを生じた濾液に対して行って、ベクターゲノムを含有しないＡＡＶ９粒子を含有する親和性プール（ヌル形質移入ＡＡＶ９親和性溶出液、本明細書中でヌルカプシドと呼ぶ）を作製した。変動する百分率のフルカプシドを有するＡＥＸ出発物質を作製するために、ヌル形質移入ＡＡＶ９親和性溶出液を、標準のＡＡＶ９親和性溶出液と、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％のヌルカプシドの体積比で混合した。
最適化されたＡＥＸプロセスの性能に対する親和性溶出液中のフルカプシドの百分率の効果
最適化されたＡＥＸ方法を、フルＡＡＶ９ベクターを、変動する百分率のＡＡＶ９空カプシドを有する供給材料から富化させるその能力について試験した。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において成長させ、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびＲｅｐ２Ｃａｐ９プラスミドを用いて形質移入した（導入遺伝子カセットを含むプラスミドは含めなかった）。細胞を形質移入後３日間培養し、回収し、溶解し、凝結させ、デプスフィルターを行い、絶対濾過した。親和性クロマトグラフィーを生じた濾液に対して行って、ベクターゲノムを含有しないＡＡＶ９粒子を含有する親和性プール（ヌル形質移入ＡＡＶ９親和性溶出液、本明細書中でヌルカプシドと呼ぶ）を作製した。変動する百分率のフルカプシドを有するＡＥＸ出発物質を作製するために、ヌル形質移入ＡＡＶ９親和性溶出液を、標準のＡＡＶ９親和性溶出液と、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％のヌルカプシドの体積比で混合した。
【0804】
混合物を２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．８で１５倍に希釈し、０．２μｍで濾過して、ｐＨ８．８であり、伝導率が２．６ｍＳ／ｃｍであるＡＥＸロードを作製した。表１７と一致して、最適化されたＡＥＸ方法を、変動する百分率の、ヌルで形質移入作製したカプシドを含有する６個のロードに対して行った。６回のＡＥＸ実行のそれぞれについて、６．６７ｍＬのＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラムを、１．５×１０１５個の総ウイルス粒子（ＶＰ）または２．２×１０１４個のＶＰ／ｍＬの樹脂を用いて均一にチャレンジした。クロマトグラフィーのロード、フロースルー、および溶出画分を２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和し、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０によって分析した。
【0805】
ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０データを表１８および図９に報告し、０％、２０％、および４０％のヌルカプシド形質移入出発物質を用いた場合に、最適化されたＡＥＸ方法がＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２５を有する個々の溶出画分を生じたことを示す。０％、２０％、および４０％のヌルカプシドを含有するカラムロードは、それぞれ１．１６、１．１０、および１．０１のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値を有していた。最適化されたＡＥＸ方法では、これらの材料を使用して、それぞれＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２５を有する６または７個の連続する溶出画分を生じた。
【0806】
６０％、８０％、および１００％のヌルカプシドを含有するロードは、それぞれ０．９０、０．７７、および０．６２のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値を有していた。最適化されたＡＥＸ方法は、６０％、８０％、および１００％のヌルカプシドを有する出発物質を富化させて、それぞれ１．２３、１．１６、および０．８３の最大ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０値を有する溶出画分を生じた。
【0807】
２５０Ｌおよび２０００Ｌの単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）スケールで実施したＡＡＶ９上流プロセスは、回収および親和性クロマトグラフィーの下流操作と組み合わせて、１．１０±０．１（ｎ＝７）のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を有するＡＡＶ９親和性溶出液を生じた。したがって、上流および下流プロセス（本明細書中に記載の最適化されたＡＥＸプロセスを含む）は、遺伝子療法の適用に有用な％フルを有するＡＡＶ９カプシドを生じた。これらの結果に基づいて、最適化されたＡＥＸプロセスを、続く実施例に記載のように２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢスケールでの製造を可能にするためにスケールアップした。
【0808】
【表18-1】
【0809】
【表18-2】
【0810】
【表19】
【0811】
（実施例８）
フルＡＡＶ９ベクターの富化のための、最適化されたＡＥＸプロセスのスケールアップ
２５０Ｌおよび２０００Ｌの単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で生成したＡＡＶベクターの下流プロセスのために、フルＡＡＶ９ベクターを富化させるために最適化されたＡＥＸ方法をスケールアップした。ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラムは、３×１０１４ＶＧ／ｍＬの樹脂の、スケール非依存性の最大チャレンジに基づいてサイズ決定した。表１９および表２０は、それぞれ２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢプロセスについて実施した、最適化されたＡＥＸ方法を提供する。２５０ＬのＳＵＢスケールでは、１０ｃｍの内径（ＩＤ）および１６ｃｍの床高を有する１．３ＬのＡＥＸカラムを使用した。ＡＥＸプロセスは、２０００ＬのＳＵＢスケールで、２０ｃｍのＩＤおよび２０．５ｃｍの床高を有する６．４ＬのＡＥＸカラムを使用して実施した。４±０．５分／ＣＶの滞留時間は両方のスケールにわたって固定であり、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢについてＡＥＸプロセス内のすべてのステップでそれぞれ３１４ｍＬ／分および１．８Ｌ／分の体積流速をもたらした。これらの流速は、クロマトグラフィースキッド上のポンプおよびミキサーが生成物の溶出中に平滑な形状の線形酢酸ナトリウム勾配を形成することを可能にするための、許容される範囲内であった。両方のスケールにわたって、２０００ＬのＳＵＢのＡＥＸプロセスが注入用水のフラッシュおよび使用前の浄化および再生ステップを含むことを例外として、それぞれのクロマトグラフィーステップでは、同じ緩衝液の組を同じＣＶの長さで使用した。図１０および図１１は、２５０ＬのＳＵＢスケールおよび２０００ＬのＳＵＢスケールで実施した代表的なＡＥＸ実行のクロマトグラムを提供する。試験したすべてのスケールにわたって（様々な小スケールの実行、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢスケール）、最適化されたＡＥＸプロセスは同様のＡ２６０／Ａ２８０クロマトグラフィープロファイルを生じた。
フルＡＡＶ９ベクターの富化のための、最適化されたＡＥＸプロセスのスケールアップ
２５０Ｌおよび２０００Ｌの単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）中で生成したＡＡＶベクターの下流プロセスのために、フルＡＡＶ９ベクターを富化させるために最適化されたＡＥＸ方法をスケールアップした。ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラムは、３×１０１４ＶＧ／ｍＬの樹脂の、スケール非依存性の最大チャレンジに基づいてサイズ決定した。表１９および表２０は、それぞれ２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢプロセスについて実施した、最適化されたＡＥＸ方法を提供する。２５０ＬのＳＵＢスケールでは、１０ｃｍの内径（ＩＤ）および１６ｃｍの床高を有する１．３ＬのＡＥＸカラムを使用した。ＡＥＸプロセスは、２０００ＬのＳＵＢスケールで、２０ｃｍのＩＤおよび２０．５ｃｍの床高を有する６．４ＬのＡＥＸカラムを使用して実施した。４±０．５分／ＣＶの滞留時間は両方のスケールにわたって固定であり、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢについてＡＥＸプロセス内のすべてのステップでそれぞれ３１４ｍＬ／分および１．８Ｌ／分の体積流速をもたらした。これらの流速は、クロマトグラフィースキッド上のポンプおよびミキサーが生成物の溶出中に平滑な形状の線形酢酸ナトリウム勾配を形成することを可能にするための、許容される範囲内であった。両方のスケールにわたって、２０００ＬのＳＵＢのＡＥＸプロセスが注入用水のフラッシュおよび使用前の浄化および再生ステップを含むことを例外として、それぞれのクロマトグラフィーステップでは、同じ緩衝液の組を同じＣＶの長さで使用した。図１０および図１１は、２５０ＬのＳＵＢスケールおよび２０００ＬのＳＵＢスケールで実施した代表的なＡＥＸ実行のクロマトグラムを提供する。試験したすべてのスケールにわたって（様々な小スケールの実行、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢスケール）、最適化されたＡＥＸプロセスは同様のＡ２６０／Ａ２８０クロマトグラフィープロファイルを生じた。
【0812】
２５０Ｌおよび２０００Ｌのスケールのどちらにおいても、１／３のカラム体積（ＣＶ）のサイズの溶出画分を収集した。画分を２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で中和し、様々な分析技法によってアッセイした。ＳＥＣを実施して、Ａ２６０／Ａ２８０比および高いモル質量種の百分率（％ＨＭＭＳ）を決定した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣ－ＤＮＡ）の残留量は、それぞれＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲによって決定した。２５０Ｌのスケールでは、ｑＰＣＲを使用してＩＴＲコピー数を測定して、ＶＧを定量した。２０００Ｌのスケールでは、ｑＰＣＲを使用して導入遺伝子のコピー数を測定して、ＶＧを定量した。
【0813】
【表20-1】
【0814】
【表20-2】
【0815】
【表21-1】
【0816】
【表21-2】
【0817】
表２１は、それぞれ２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢのＡＥＸプロセスを用いて作製した溶出画分のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比を提供する。このプロセスは、広い範囲のカラムチャレンジ、すなわち２．７×１０１２～６．８×１０１３ＶＧ／ｍＬの樹脂に対してロバスト性を示した。１０回のうち９回のＡＥＸ実行が、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比≧１．２５を有する少なくとも６個の画分を生じた。バッチ２５０Ｌ－１では、研究中で最も低いＳＥＣ比（０．９４）を有する親和性プールを使用し、比≧１．２５を有する画分を生じなかった唯一のＡＥＸ実行であった。それぞれのＡＥＸ実行について、画分５が１０回うち７回の実行において最も高いＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比を与え、したがって、２つの異なるスケールおよび様々なＶＧ／ｍＬの樹脂チャレンジにわたって、クロマトグラフィーおよび画分収集操作における高い一貫性を示している。
【0818】
表２２および表２３は、２５０Ｌ－４および２０００Ｌ－４のバッチのそれぞれからの個々のＡＥＸ画分の不純物プロファイル、％ＨＭＭＳ、およびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０を提供する。最適化されたＡＥＸプロセスは、大量のＨＣＰを親和性プールから除去した。たとえば、２５０Ｌ－４の親和性プールは５１ｐｇのＨＣＰ／１×１０９ＶＧを含有しており、最適化されたＡＥＸプロセスは、ＡＥＸプールを形成するために使用した溶出画分２～８においてＨＣＰをＬＬＯＱまで除去した。２０００Ｌ－４の親和性プールは３３１ｐｇのＨＣＰ／１×１０９ＶＧを含有しており、これは、ＡＥＸプールを形成するために使用した溶出画分２～９においてＬＬＯＱまで除去された。
【0819】
ＡＥＸプロセスは、ＨＣ－ＤＮＡレベルを有意に低下させない。ＡＥＸプロセスは、酢酸ナトリウム溶出勾配を使用して、ＨＭＭＳを分離した。初期の溶出画分は、ＨＭＭＳが比較的枯渇していた（たとえば、２５０Ｌ－４および２０００Ｌ－４の実行のどちらにおいても画分１～５は＜３％のＨＭＭＳを含有していた）。逆に、後期の溶出画分は、より高い相対レベルのＨＭＭＳを含有していた（たとえば、２０００Ｌ－４の実行からの画分８～１０は＞７％のＨＭＭＳを含有していた）。
【0820】
【表22】
【0821】
【表23】
【0822】
【表24】
【0823】
２５０ＬのＡＥＸ実行では、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比に基づいて様々な画分プール閾値を使用した。２５０ＬのＡＥＸ実行、２５０Ｌ－１および２５０Ｌ－４からの画分は、それぞれＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２２および≧１．２４の時点に基づいてプールした。２５０ＬのＡＥＸ実行、２５０Ｌ－２、２５０Ｌ－３、および２５０Ｌ－５、ならびに２０００Ｌの５つすべてのＡＥＸ実行からの画分は、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０≧１．２５の時点に基づいてプールした。
【0824】
２０００Ｌのバッチ、２０００Ｌ－２、２０００Ｌ－３、２０００Ｌ－４、および２０００Ｌ－５からの生じるＡＥＸ生成物プールは、ウイルス濾過のステップを通してプロセスした一方で、２５０Ｌのバッチおよびバッチ２０００Ｌ－１はウイルス濾過しなかった。生じるＡＥＸプールおよび／またはウイルス濾過プールを、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）および０．２μｍの濾過を通してプロセスして、原薬（ＤＳ）を作製した。ＡＥＸクロマトグラフィー後のステップはどれも、ＡＡＶ９の空／フル比に有意な影響を与えなかった。ｑＰＣＲを親和性およびＡＥＸプールに対して行って、ＡＥＸステップの％ＶＧ収率を決定した。原薬材料をＡＵＣおよびＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０によって分析して、精製ＡＡＶ９ベクターの％フルを決定した。
【0825】
表２４は結果を報告し、スケールアップしたＡＥＸプロセスが、回収されたＡＡＶ９ベクターの％フルを高い収率で増加させたことを示す。スケールアップしたＡＥＸプロセスは、ＡＵＣによって測定して、１０個のうち９個の原薬バッチにおいて、ベクターの％フルを全カプシドの４５～６５％まで富化させ、空カプシドの量を全カプシドの≦２８％まで低下させた。１０回すべての実行において、ＡＥＸプロセスは、親和性プール中のＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０比を原薬において０．９４～１．２５から１．２４～１．３２まで増加させた。２５０Ｌおよび２０００Ｌのスケールで実施したＡＥＸプロセスの平均％ＶＧステップ収率は４７＋／－１１％であった。
【0826】
【表25-1】
【0827】
【表25-2】
【0828】
（実施例９）
空カプシドをフルＡＡＶベクターカプシドから分離するための超遠心分離および陽イオン交換クロマトグラフィー
ＡＡＶ９ベクターの２５０ＬのＳＵＢ下流プロセスの別の実施形態では、密度勾配超遠心分離（ＵＣ）を用いて空カプシドをフルベクターから分離した。以前に記載されている方法と同様に（Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１６）２４（２）：２８７～２９７）、４０％および６０％のイオジキサノールを含有するバンドをＵＣチューブ中で形成させた。２５％のイオジキサノールを含有する親和性溶出液をＵＣチューブに加え、超遠心分離した。完全長ベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシドが富化された画分を、４０％および６０％のイオジキサノールバンドの界面から収集した。イオジキサノールを除去するために、画分を希釈し、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム上にロードした。ＡＡＶ９ベクターカプシドはＣＥＸカラムと結合し、イオジキサノールの大多数は非結合画分中でカラムを通過した。ＡＡＶ９ベクターカプシドを、イオジキサノールを実質的に含まない画分中でＣＥＸカラムから溶出させた。ＣＥＸプールを、ＵＦ／ＤＦおよび０．２μｍの濾過を通して先へとプロセスして、ＡＡＶ９ベクターカプシドを含む原薬（ＤＳ）を作製した。
空カプシドをフルＡＡＶベクターカプシドから分離するための超遠心分離および陽イオン交換クロマトグラフィー
ＡＡＶ９ベクターの２５０ＬのＳＵＢ下流プロセスの別の実施形態では、密度勾配超遠心分離（ＵＣ）を用いて空カプシドをフルベクターから分離した。以前に記載されている方法と同様に（Ｇｒｉｅｇｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１６）２４（２）：２８７～２９７）、４０％および６０％のイオジキサノールを含有するバンドをＵＣチューブ中で形成させた。２５％のイオジキサノールを含有する親和性溶出液をＵＣチューブに加え、超遠心分離した。完全長ベクターゲノムを含有するＡＡＶカプシドが富化された画分を、４０％および６０％のイオジキサノールバンドの界面から収集した。イオジキサノールを除去するために、画分を希釈し、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム上にロードした。ＡＡＶ９ベクターカプシドはＣＥＸカラムと結合し、イオジキサノールの大多数は非結合画分中でカラムを通過した。ＡＡＶ９ベクターカプシドを、イオジキサノールを実質的に含まない画分中でＣＥＸカラムから溶出させた。ＣＥＸプールを、ＵＦ／ＤＦおよび０．２μｍの濾過を通して先へとプロセスして、ＡＡＶ９ベクターカプシドを含む原薬（ＤＳ）を作製した。
【0829】
表２５は、ＵＣ＋ＣＥＸおよび最適化されたＡＥＸ方法のプロセス性能、ならびにこれらの方法によって生成された原薬に関する生じる分析結果の比較を提供する。２５０Ｌおよび２０００Ｌのスケールの両方で実施した最適化されたＡＥＸプロセスは、それぞれ４５±８％および５０±１３％の平均ＶＧ収率を提供した。これらの値は、ＵＣ＋ＣＥＸプロセスによって提供された平均３３±９％のＶＧ収率よりも高かった。３つすべての方法は、ＳＥＣ Ａ２６０／Ａ２８０（１．２６～１．３０）、％フル（４９～５５％）、および％空（２０～２５％）の、非常に類似した平均ＤＳ読取りを生じた。中間体カプシドの平均百分率は、２５０ＬのＡＥＸ（２４±３）および２５０ＬのＵＣ＋ＣＥＸ（２３±４）プロセスによって生成されたＤＳと比較して、２０００ＬのＡＥＸプロセス（３２±４％）によって生成されたＤＳにおいてわずかに高かった。
【0830】
３つの方法は、％ＨＭＭＳ、％純度、ならびにＨＣＰおよびＨＣ－ＤＮＡのレベルにおいて高い類似度を有するＤＳを生じた。総合すると、このデータは、２５０Ｌおよび２０００ＬのＳＵＢスケールで実施したＡＥＸプロセスが、２５０ＬのＵＣ＋ＣＥＸプロセスと非常に類似したプロセス性能および生成物品質を提供したことを示す。
【0831】
【表26-1】
【0832】
【表26-2】
【0833】
（実施例１０）
フルＡＡＶ３Ｂベクターの富化のための最適化されたＡＥＸプロセス
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において成長させ、２つのプラスミドを用いて形質移入して、当分野で知られている標準方法によってＡＡＶ３Ｂベクターを生成した。ＨＥＫ２９３細胞を回収し、溶解し、凝結させ、生じた溶解物を濾過した。ＡＡＶ３Ｂベクターを清澄にした溶解物から親和性クロマトグラフィーによって精製した。親和性カラムを平衡化し、清澄にした溶解物をロードし、洗浄し、精製ＡＡＶ３Ｂベクターが溶出された。ＡＡＶ３Ｂベクター親和性プール（親和性溶出液とも呼ばれる）に２５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加して、希釈した親和性プール中で約１．７ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を達成した。親和性プールのｐＨはｐＨ７．６であった。親和性プールを、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む緩衝液で約１５倍（実行に応じて１４倍～１７．８倍）に希釈した。生じた希釈した親和性溶出液は≧８．６のｐＨおよび≦２．５ｍＳ／ｃｍの伝導率（標的２．３ｍＳ／ｃｍ）を有しており、ＡＥＸカラム上にロードした。
フルＡＡＶ３Ｂベクターの富化のための最適化されたＡＥＸプロセス
ＨＥＫ２９３細胞を懸濁培養において成長させ、２つのプラスミドを用いて形質移入して、当分野で知られている標準方法によってＡＡＶ３Ｂベクターを生成した。ＨＥＫ２９３細胞を回収し、溶解し、凝結させ、生じた溶解物を濾過した。ＡＡＶ３Ｂベクターを清澄にした溶解物から親和性クロマトグラフィーによって精製した。親和性カラムを平衡化し、清澄にした溶解物をロードし、洗浄し、精製ＡＡＶ３Ｂベクターが溶出された。ＡＡＶ３Ｂベクター親和性プール（親和性溶出液とも呼ばれる）に２５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加して、希釈した親和性プール中で約１．７ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を達成した。親和性プールのｐＨはｐＨ７．６であった。親和性プールを、２００ｍＭのヒスチジン、２００ｍＭのトリス、０．５％のＰ１８８、ｐＨ８．９を含む緩衝液で約１５倍（実行に応じて１４倍～１７．８倍）に希釈した。生じた希釈した親和性溶出液は≧８．６のｐＨおよび≦２．５ｍＳ／ｃｍの伝導率（標的２．３ｍＳ／ｃｍ）を有しており、ＡＥＸカラム上にロードした。
【0834】
４９ｍＬのカラム体積、１０ｃｍの床高および２．５ｃｍの直径を有するＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱカラムを使用した。標的カラムロードチャレンジは１×１０１４～３×１０１４ｖｇ／ｍＬの樹脂（たとえば約２．４×１０１４ｖｇ／ｍＬ）であった。表２６は、最適化されたＡＥＸ方法の条件を提供する。２分／ＣＶの滞留時間は、より浅い溶出勾配（以前の実施例と比較して）および比較的より小さなカラムに順応するために、ＡＥＸプロセス内のすべてのステップについて固定であった。空／フルの分離を最大限にするために、溶出勾配は以前の実施例の２．５分の１の浅さであった。空カプシドが最初に、次いでフルＡＡＶ３Ｂカプシドが溶出された（図１２）。本実施例では、フルＡＡＶ３Ｂカプシドは、配列番号１５のアミノ酸（金属結合部位１～４が欠失した銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）をコードしている導入遺伝子を有するベクターゲノムを含有する。より浅い勾配およびより広範囲の溶出ピークと一致して、画分の体積は０．５ＣＶまで増加した（０．３３ＣＶの以前の実施例と対照的）。
【0835】
【表27-1】
【0836】
【表27-2】
【0837】
勾配溶出は、１００％の緩衝液Ａから２５％の緩衝液Ａ／７５％の緩衝液Ｂまで、３７．５ＣＶにわたって、２％の緩衝液Ｂ／ＣＶの勾配で実行した。緩衝液Ｂの百分率が勾配にわたって３２％～５２％であるときに、合計２０個の溶出画分を収集した。画分を中和し、カプシドのアルカリ性ｐＨへの曝露を低下させるために、画分を、１３．２％ｖ／ｖ（０．０６６ＣＶ）の２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５を事前に充填した容器内に収集した。中和した画分のｐＨはｐＨ７．５～７．７の範囲であった。Ａ２６０／Ａ２８０≧０．９８（ＳＥＣによって決定）を有する第１の溶出画分を連続する溶出画分と共にプールしたが、合計１１個の画分（ｆａｃｔｉｏｎ）は超えない（表２７）。
【0838】
【表28】
【0839】
プールした画分を様々な分析技法によってアッセイした。実際のｖｇ／ｍＬの樹脂チャレンジは６．３Ｅ１３～９．４Ｅ１３の範囲であり、平均が７．４Ｅ１３±１．２Ｅ１３であった。ＳＥＣを実施してＡ２６０／Ａ２８０比を決定した。ＡＥＸプールのＡ２６０／Ａ２８０は、すべての実行において、親和性プールのＡ２６０／Ａ２８０と比較して増加していた（表２８）。親和性プールおよびＡＥＸ溶出プールのパーセントフル、中間体、および空カプシドは、分析用超遠心分離によって決定した。１１．２±２．１％の平均パーセントフルベクターを有する親和性プールは、ＡＥＸプール中で２２．９±２．９％のフルまで富化されていた。同じ親和性プールは、空カプシドが７９．７±２．５％からＡＥＸプール中で６７．５±３．８％まで枯渇していた。
【0840】
ｖｇ力価は導入遺伝子のＱＰＣＲによって決定した（表２８）。平均％ｖｇ希釈収率は１２０％±１２％であった。平均％ｖｇカラム収率は４７％±１１％であった。
【0841】
【表29】
【0842】
本実施例中に記載した方法を使用して、親和性溶出液である出発物質と比較してフルカプシドが富化されており、空カプシドが枯渇されている、精製ｒＡＡＶ３Ｂベクタープールを生成した。
【受託番号】
【0843】
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００２０７７
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０６３４９７
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１４０１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０４３３０３
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１７２９
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０２８７０５．１
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１８２９
ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８９７９０
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００６１５２
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０２８７０４
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ５１３８５１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ５１３８５２
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００６２６１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３０５７９
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ６３１９６５
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ６３１９６６
ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ８１３６４７
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７８０
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７７８
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７７９
ＡＴＣＣ ＰＴＡ １３２７４
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０６３４９７
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１４０１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０４３３０３
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１７２９
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０２８７０５．１
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００１８２９
ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８９７９０
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００６１５２
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０２８７０４
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ５１３８５１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ５１３８５２
ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００６２６１
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ５３０５７９
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ６３１９６５
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ６３１９６６
ＧｅｎＢａｎｋ ＤＱ８１３６４７
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７８０
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７７８
Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＣ０３７７９
ＡＴＣＣ ＰＴＡ １３２７４
【0844】
【配列表フリーテキスト】
【0845】
【表30-1】
【0846】
【表30-2】
【0847】
【表30-3】
【0848】
【表30-4】
【0849】
【表30-5】
【0850】
【表30-6】
【0851】
【表30-7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】