特表 2023-548844 ＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-21

(54)【発明の名称】ＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20231114BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231114BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20231114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231114BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231114BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20231114BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20231114BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231114BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/17

A61K35/15

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C07K14/705

C07K16/28

C07K19/00

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526562

(86)(22)【出願日】2021-10-29

(85)【翻訳文提出日】2023-05-01

(86)【国際出願番号】 CN2021127567

(87)【国際公開番号】W WO2022095802

(87)【国際公開日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】202011209352.X

(32)【優先日】2020-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523087364

【氏名又は名称】バイオヘン セラピューティクス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＨＥＮＧ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ＃４－２１０， Ｇｏｖｅｒｎｏｒｓ Ｓｑｕａｒｅ， ２３ Ｌｉｍｅ Ｔｒｅｅ Ｂａｙ Ａｖｅｎｕｅ， ＰＯ Ｂｏｘ ３２３１１， Ｇｒａｎｄ Ｃａｙｍａｎ ＫＹ１－１２０９ （ＫＹ）

(74)【代理人】

【識別番号】100146374

【弁理士】

【氏名又は名称】有馬 百子

(72)【発明者】

【氏名】周 亜麗

(72)【発明者】

【氏名】姜 小燕

(72)【発明者】

【氏名】陳 功

(72)【発明者】

【氏名】任 江涛

(72)【発明者】

【氏名】賀 小宏

(72)【発明者】

【氏名】王 延賓

(72)【発明者】

【氏名】韓 露

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＣＤ７抗体を含む抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現し、内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングする改変免疫細胞を提供する。ＣＤ７発現に関する疾患の治療における前記改変免疫細胞の使用をさらに提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変免疫細胞であって、（１）抗ＣＤ７抗体を含む抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現し、（２）内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングすることを特徴とする改変免疫細胞。

【請求項2】

前記キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ７抗体、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むことを特徴とする請求項１に記載の改変免疫細胞。

【請求項3】

前記抗ＣＤ７抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、配列番号４、５及び６で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３とを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の改変免疫細胞。

【請求項4】

前記キメラ受容体の抗原結合領域は、第２抗原を標的にする抗体又はその機能的断片をさらに含み、前記第２抗原が、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項5】

前記キメラ抗原受容体は、抗ＣＤ７抗体及び抗ＣＤ１９抗体を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項6】

前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項7】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ等のタンパク質の細胞内領域から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項8】

前記キメラ抗原受容体は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせなどのタンパク質の細胞内領域から選択される１つ又は複数の共刺激ドメインをさらに含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項9】

前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の改変免疫細胞。

【請求項10】

前記ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の改変免疫細胞。

【請求項11】

前記改変免疫細胞の内因性ＣＤ７と、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣから選択される少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子との発現は、抑制され又はサイレンシングすることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項12】

前記改変免疫細胞は、１つ又は複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子をさらに発現することを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項13】

前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体又はその機能的断片であり、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｄ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、Ｌｙ４９Ｇ４及びＫＬＲＧ１から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の改変免疫細胞。

【請求項14】

前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域であることを特徴とする請求項１２に記載の改変免疫細胞。

【請求項15】

前記ＮＫ阻害性分子は、ＣＤ３ζ細胞内領域を細胞内シグナル伝達ドメインとしてさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の改変免疫細胞。

【請求項16】

前記改変免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞であることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。

【請求項17】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞と、多種薬学的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項18】

ＣＤ７発現に関する疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項１から１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞又は請求項１７に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は免疫治療分野に属する。より具体的には、本発明は、ＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体、及び疾患の治療におけるキメラ抗原受容体の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、癌免疫療法の技術が急速に発展し、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）に関する免疫療法は、新しいタイプの養子免疫療法技術として、さまざまな固形腫瘍および血液腫瘍の治療において非常に顕著な臨床効果を示している。

【0003】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築に使用されるＴ細胞の供給源によって、自家ＣＡＲ－Ｔ細胞と同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞（ユニバーサルＣＡＲ－Ｔとも称される）に分けることができる。自家ＣＡＲ－Ｔ細胞の利点としては、最初のＴ細胞がＣＡＲ－Ｔ療法を受ける患者自身に由来するため、免疫拒絶のリスクがないことであるが、その欠点も非常に明瞭であり、即ちコストが高く準備期間が長い。故に、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の開発に注目する研究がますます増えている。ユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、健康なドナー末梢血から分離されたＴ細胞から調製されることができ、患者が治療を待つ時間を大幅に短縮できる。さらに、健康なドナーから得られたＴ細胞は、患者由来のＴ細胞よりも、活力と機能が優れ、ＣＡＲ細胞の感染率を高め、治療効果を向上させることができる。

【0004】

ＣＤ７は細胞表面タンパク質であり、分子量が約４０ｋＤａであり、免疫グロブリンスーパーファミリーの一つである。ＣＤ７は、ほとんどのＴ細胞、ＮＫ細胞、骨髄細胞、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、急性骨髄芽球性白血病及び慢性骨髄性白血病においていずれも発現される。報道によると、ＣＤ７分子は、そのリガンドＫ１２／ＳＥＣＴＭ１との結合により、Ｔ細胞活性化期間において共刺激シグナルの作用を果たす。また、マウスＴ前駆細胞におけるＣＤ７分子を破壊すると、相変わらず正常のＴ細胞発生とホメオスタシスが生じるが、これは、ＣＤ７は、Ｔ細胞の発生及び機能に重大な影響を与えることがなく、これによってＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の治療に非常に適当な治療標的となることが表明される。実際には、ＣＤ７は、白血病及びリンパ腫を治療する細胞毒性分子の標的として広く研究されている。

【0005】

ＣＤ７に対するＣＡＲ－Ｔ療法、特にユニバーサルＣＡＲ－Ｔ療法は、まだ非常に限られている。故に、本発明は、ＣＤ７を標的にする効率的なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、及び疾患の治療における使用を提供することを目的とする。

【発明の概要】

【0006】

第１態様で、本発明は、（１）抗ＣＤ７抗体を含む抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現し、（２）内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングすることを特徴とする改変免疫細胞を提供する。

【0007】

一実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ７抗体、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0008】

一実施形態において、前記抗ＣＤ７抗体は、それぞれ配列番号１、２及び３で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、配列番号４、５及び６で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３とを含む。好ましい一実施形態において、前記抗ＣＤ７抗体は、配列番号７、１０、１３、１６及び１９から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域と、配列番号８、１１、１４、１７及び２０から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域と、を含む。好ましい一実施形態において、前記抗ＣＤ７抗体のアミノ酸配列は、配列番号９、１２、１５、１８及び２１から選択される。

【0009】

一実施形態において、前記キメラ受容体の抗原結合領域は、第２抗原を標的にする抗体をさらに含み、前記第２抗原が、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。より好ましくは、前記第２抗原を標的にする抗体は、ＣＤ１９を標的にする抗体である。好ましい一実施形態において、前記抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５２及び５５から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変領域と、配列番号５３及び５６から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変領域と、を含む。好ましい一実施形態において、前記抗ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列は、配列番号５４及び５７から選択される。

【0010】

一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４及びＣＤ２８の膜貫通ドメインから選択される。

【0011】

一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄなどのタンパク質の細胞内領域から選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ細胞内領域を含む。

【0012】

一実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせなどのタンパク質の細胞内領域から選択される１つ又は複数の共刺激ドメインをさらに含む。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８の細胞内領域又はそれらの組み合わせである。

【0013】

一実施形態において、前記ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0014】

一実施形態において、前記ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ及びそれらの組み合わせから選択される。

【0015】

好ましい一実施形態において、本発明に記載の改変免疫細胞は、内因性ＣＤ７と、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣから選択される少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とを含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングする。より好ましくは、本発明に記載の改変免疫細胞は、内因性ＣＤ７と、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣから選択される少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、ＲＦＸ５とを含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングする。

【0016】

一実施形態において、前記改変免疫細胞は、１つ又は複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子をさらに発現する。

【0017】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体であり、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分（例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４）と、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３）と、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５及びＬＩＲ８）と、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー（例えばＮＫＲ－Ｐ１Ｂ及びＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）と、免疫チェックポイント受容体（例えばＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）と、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）と、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えばＳＩＧＬＥＣ７及びＳＩＧＬＥＣ９）と、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）と、Ｌｙ４９ファミリーメンバー（例えばＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１及びＬｙ４９Ｇ４）と、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択される。好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｄ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、Ｌｙ４９Ｇ４及びＫＬＲＧ１から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１から選択される。さらに、より好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＬＩＲ１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１から選択される。

【0018】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体の天然リガンド、又はそれに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域である。好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１等）、及びそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択され、さらに好ましくは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域及びＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択される。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリン細胞外領域であり、ＥＣ１及びＥＣ２を含み、より好ましくはＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５を含む。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外領域である。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域である。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域である。

【0019】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子は、ＣＤ３ζ細胞内領域を細胞内シグナル伝達ドメインとしてさらに含む。

【0020】

一実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。好ましくは、前記改変免疫細胞は、例えばＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞のようなＴ細胞である。

【0021】

一態様で、本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞を活性剤として含有し、多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0022】

一態様で、本発明は、被験者に対して本発明に係る改変免疫細胞又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む、ＣＤ７発現に関する疾患を有する被験者を治療する方法を更に提供する。故に、本発明は、ＣＤ７発現に関する疾患を治療するための薬剤の調製における改変免疫細胞の使用をさらにカバーする。

【0023】

別段の指示がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
キメラ抗原受容体

【0024】

第１態様で、本発明は、（１）抗ＣＤ７抗体を含む抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現し、（２）内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングすることを特徴とする改変免疫細胞を提供する。

【0025】

本明細書で使用されるように、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語とは、人工的に構築されたハイブリッドペプチドを指し、このハイブリッドペプチドは一般的に抗原結合領域（例えば抗体又はその抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、任意の共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、各ドメインの間にリンカーにより連結される。ＣＡＲは、抗体の抗原結合特性を利用してＭＨＣ制限なしにＴ細胞と他の免疫細胞の特異性及び反応性を選択されたターゲットに新たにリダイレクトすることができる。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現する免疫細胞に抗原処理に関連しない抗原認識能力を付与するため、腫瘍逃避の主要なメカニズムを迂回する。

【0026】

一実施形態において、本発明で提供される改変免疫細胞が発現するＣＡＲは、ＣＤ７を標的にする抗体又はその抗原結合断片、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。

【0027】

本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、当業者が理解する最も広い意味を有し、且つモノクローナル抗体（インタクト抗体が含まれる）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示すことができる１つまたは複数のＣＤＲ配列を持つ抗体断片または合成ポリペプチドを含む。本発明に記載の抗体は、任意種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等）であってもよい。本発明の抗体は、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体及びその抗原結合部分も含む。

【0028】

本明細書で使用されるように、「抗体断片」又は「抗原結合部分」という用語とは、インタクト抗体の一部を指し、一般的にインタクト抗体の抗原結合部位を含み、これによって抗原に結合される能力を保留する。本発明における抗体断片の実例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｄ′、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合によるＦｖ（ｓｄＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、線形抗体、２つの抗原結合部位を有する「ダブルボディ」、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、前記抗原の天然リガンド又はその機能的断片等を含むが、それらに限定されない。故に、本発明の「抗体」は、上記定義した抗体の抗体断片又は抗原結合部分をカバーする。

【0029】

一実施形態において、本発明の抗ＣＤ７抗体は、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖである。「シングルチェーン抗体」と「ｓｃＦｖ」は本明細書で交互に使用可能で、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーにより連結された抗体である。リンカーの最適長さ及び又はアミノ酸成分は、需要に応じて特定されてもよい。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折り畳み及び相互作用の状況に明らかに影響をもたらす。実際に、短いリンカー（例えば５～１０個のアミノ酸にある）を使用すると、鎖内折り畳みを防止することができる。リンカーの大きさ及び組成の選択について、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、アメリカ専利出願公報番号２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照し、その全文が引用により本明細書に記載される。ｓｃＦｖは、例えばＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのような、任意の順序で連結されるＶＨ及びＶＬを含んでもよい。

【0030】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、それぞれ配列番号１、２、及び３で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、配列番号４、５及び６で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３とを含む、ＣＤ７を標的にする抗体を含む。好ましくは、本発明のＣＤ７を標的にする抗体は、配列番号７、１０、１３、１６及び１９から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域と、配列番号８、１１、１４、１７及び２０から選択されるもので示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、を含む。より好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体は、抗ＣＤ７抗体を含み、そのアミノ酸配列が配列番号９、１２、１５、１８又は２１で示される。

【0031】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる抗原結合領域は、ＣＤ７を標的にする抗体のほかに、第２抗原を標的にする抗体をさらに含み、前記第２抗原が、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。好ましくは、前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン及びそれらの任意の組み合わせから選択される。当分野で既知される上記腫瘍抗原を標的にする抗体はいずれも本発明に適用可能である。

【0032】

好ましい一実施形態において、前記第２抗原を標的にする抗体は、ＣＤ１９を標的にする抗体であり、配列番号５２又は５５で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号５３又は５６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、を含む。より好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ７を標的にする抗体と、ＣＤ１９を標的にする抗体とを含み、前記ＣＤ１９を標的にする抗体のアミノ酸配列は配列番号５４又は５７で示される。

【0033】

「機能的バリアント」又は「機能的断片」という用語とは、基本的に親アミノ酸配列を含むという意味であるが、この親アミノ酸配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾（置換、欠失、挿入など）のバリアントを含有し、条件として前記バリアントが親アミノ酸配列の生物活性を保留することである。一実施形態において、前記アミノ酸修飾好ましくは保守的な修飾である。

【0034】

本明細書で使用されるように、「保守的な修飾」という用語とは、当該アミノ酸配列を含有する抗体又は抗体断片の結合特徴を明らかに影響又は変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保守的な修飾はアミノ酸置換、添加及び欠失を含む。修飾は、当分野での既知の標準技術、例えば部位特異的変異導入及びＰＣＲ仲介の変異導入により、本発明のキメラ抗原受容体に導入される。保守的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当分野で定義され、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、ホルマジンチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保守的な修飾は、例えば極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は係わる残基の両親媒性の類似性に応じて選択されてもよい。

【0035】

従って、「機能的バリアント」又は「機能的断片」は、親アミノ酸配列に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、且つ親アミノ酸の生物活性、例えば結合活性を保留する。

【0036】

本明細書で使用されるように、「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が比較において同一位置で同じ残基を有する度合を表し、且つ一般的にパーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全体長さで決められる。従って、完全に同じ配列を有する２つのコピーは、１００％の同一性を有する。当業者は、いくつかのアルゴリズムが標準パラメータを用いて配列同一性を特定することに用いられることができ、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷであると認識している。

【0037】

本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」という用語とは、キメラ抗原受容体を免疫細胞（例えばリンパ球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）表面で発現させ、且つ免疫細胞の標的細胞に対する細胞応答をガイドするポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成のものであってもよいし、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。キメラ抗原受容体と標的抗原とが結合される場合に、膜貫通ドメインはシグナル伝達を行うことができる。特に本発明における膜貫通ドメインに適用され、例えばＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びその機能的断片に由来してもよい。或いは、膜貫通ドメインは合成したものであってもよく、且つ主に疎水性残基、例えばロイシンとバリンを含んでもよい。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖又はＣＤ２８に由来し、配列番号２２又は２４で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号２３又は２５で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0038】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合領域と膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「ヒンジ領域」という用語は、一般的に膜貫通ドメインを抗原結合領域に連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、抗原結合領域へより大きい柔軟性とアクセス性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、全部又は一部が天然分子に由来し、例えば全部又は一部がＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全部又は一部が抗体定常領域に由来してもよい。或いは、ヒンジ領域は、自然に発生するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又は完全に合成したヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＣＤ２８、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８又はＩｇＧ４からのヒンジであり、配列番号３８、４０又は４２で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、或いは、そのコード配列が配列番号３９、４１又は４３で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0039】

本明細書で使用されるように、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞が所定機能を行うように指導するタンパク質部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原結合領域が抗原に結合された一次細胞内シグナル伝達を担うことによって、免疫細胞及び免疫反応の活性化を招く。言い換えると、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常のエフェクター機能の少なくとも１種類を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はヘルパー活性であってもよく、サイトカインの分泌を含む。

【0040】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原受容体結合後に一緒に機能して一次シグナル伝達を誘導するＴ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列と、これらの配列の任意のデリバティブ又はバリアントと、同一又は類似の機能を有する任意の合成配列であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、沢山の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ，ＩＴＡＭ）を含んでもよい。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例は、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄの細胞内領域を含むが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内領域を含んでもよく、配列番号３０又は３２で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号３１又は３３で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0041】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、１つ又は複数の共刺激ドメインをさらに含む。共刺激ドメインは、共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメインであってもよく、前記共刺激分子の全体細胞内部分、又はその機能的断片を含む。「共刺激分子」とは、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合されることによって、Ｔ細胞の共刺激反応（例えば増殖）を仲介する同源結合配偶体を指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、それらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ及びＺＡＰ７０、並びにそれらの組み合わせなどのタンパク質の細胞内領域を含むが、それらに限定されない。

【0042】

好ましい一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ又はＣＤ２７８などのタンパク質から選択されるもの１つ又は複数の細胞内領域を含む。例えば、一実施形態において、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢの細胞内領域を含む。一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８の細胞内領域を含む。一実施形態において、前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢの細胞内領域及びＣＤ２８の細胞内領域を含む。

【0043】

一実施形態において、４－１ＢＢの細胞内領域は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号２９で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。一実施形態において、ＣＤ２８の細胞内領域は、配列番号２６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列が配列番号２７で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0044】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞、例えばＴ細胞で発現される場合に、新生タンパク質が小胞体まで導入されてから細胞表面まで導入されるように、シグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含んでもよく、単一のα－螺旋を形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的にシグナルペプチダーゼによって認識、カットされたアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、移行中又は完成後にカットされ、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成する。その後、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼに消化される。本発明に適用可能なシグナルペプチドは、当業者によって周知されるものであり、例えばＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲα、Ｂ２Ｍ等から派生されるシグナルペプチドである。一実施形態において、本発明に適用可能なシグナルペプチドは、Ｂ２Ｍ又はＣＤ８αに由来し、配列番号３４又は３６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号３５又は３７で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0045】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間をコントロールするようにスイッチ構造をさらに含んでもよい。例えば、スイッチ構造は、二量体化ドメインの形式であってもよく、その対応するリガンドとの結合によりコンフォメーションの変化を引き起こし、細胞外の抗原結合領域を露出させることにより、それをターゲティング対象抗原に結合させてシグナル伝達通路を活性化する。或いは、スイッチドメインにより抗原結合領域とシグナル伝達ドメインをそれぞれ連結し、スイッチドメインが互いに結合される（例えば誘導化合物の存在下で）場合のみに、抗原結合領域及びシグナル伝達ドメインは、二量体によって連結されてシグナル通路を活性化するようにしてもよい。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形式であってもよい。マスキングペプチドは、細胞外の抗原結合領域をマスクし、ターゲティング対象抗原との結合を阻止することができ、例えばプロテアーゼによってマスキングペプチドがカットされた後、細胞外の抗原結合領域を露出させて、１つの「通常」のＣＡＲ構造とする。当業者の知っている様々なスイッチ構造はいずれも本発明に適用できる。

【0046】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは自殺遺伝子を含んでもよく、即ち、外因性物質によって誘導される１つの細胞死シグナルを発現させて需要時（例えば深刻な副作用を引き起こす時）にＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、插入されたエピトープの形式であってもよく、例えばＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８等であり、需要時に、これらのエピトープをターゲティングする抗体又は試薬を加入することでＣＡＲ細胞を除去することができる。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子は、細胞がガンシクロビルの治療を受けて誘導されて死亡するようにできる。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、例えばＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７等のような化学誘発剤によりｉＣａｓｐａｓｅ－９を二量体化させるように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化し、アポトーシスを引き起こす。当業者の知っている様々な自殺遺伝子はいずれも本発明に適用できる。
内因性遺伝子発現の抑制又はサイレンシング

【0047】

一実施形態において、本発明で提供される改変免疫細胞の内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子、及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現は抑制され又はサイレンシングする。

【0048】

ＣＤ７は、腫瘍細胞、例えばＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、急性骨髄芽球性白血病及び慢性骨髄性白血病において発現されるだけではなく、ほとんどの正常のＴ細胞及びＮＫ細胞においても発現される。故に、ＣＤ７を標的にするＣＡＲ細胞間の相互認識及び殺傷を回避するために、ＣＡＲ細胞の内因性ＣＤ７遺伝子の発現を抑制又はサイレンシングする必要がある。

【0049】

Ｔ細胞表面受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）は、すべてのＴ細胞表面の特徴的なマークであり、非共有結合でＣＤ３に結合されてＴＣＲ／ＣＤ３複合体が形成されるとともに、抗原提示細胞表面における特異的なＭＨＣ－抗原ペプチド複合体に結合されることによって、特異抗原刺激シグナルが生成し、Ｔ細胞を活性化し、殺傷作用を果たす。故に、ＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子の発現を抑制又はサイレンシングするのは、それが患者体内の正常の細胞又は組織へ攻撃することを回避することができ、さらに移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発症リスクを回避または低減する。ＴＣＲは、２本の異なるペプチド鎖からなるへテロダイマーであり、一般的にα／β型及びγ／δ型の２タイプに分けられ、ここで９５％以上の末梢Ｔリンパ球は、いずれもＴＣＲα／βを発現する。ＴＣＲα鎖は、ＴＲＡＣ遺伝子によってコードされ、β鎖はＴＲＢＣ遺伝子によってコードされる。ＴＣＲの各本のペプチド鎖は、可変領域（Ｖエリア）、定常領域（Ｃエリア）、膜貫通領域及び細胞質領域を含み、ここで細胞質領域は非常に短く、抗原刺激シグナルを伝達する能力を持たない。ＴＣＲ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性がＶエリアにあり、Ｖエリアは、それぞれ３つの超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有し、そのうち、ＣＤＲ３の変異が最大であるので、そのままＴＣＲの抗原結合特異性を決める。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識する場合に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識して結合される一方、ＣＤＲ３はそのまま抗原ペプチドに結合される。ＣＤ３は、γ、δ、ε、ζという４種類のサブユニットを含み、通常に二量体εγ、εδ、ζζの形で存在する。この４種類のサブユニットは、いずれも保存された免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ）を含み、そのうち、２つのチロシン残基は、チロシンプロテインキナーゼによってリン酸化された後、Ｔ細胞へ活性化シグナルを伝達する。故に、一実施形態において、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζから選択される。

【0050】

発明者は、患者体内の末梢血リンパ球の構成を検出することによって、ＣＤ４＋ＣＤ７－Ｔ細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞の総量の２０％ほどを占める（図１）ことを発見した。ＣＤ７を標的にするＣＡＲ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ７－Ｔのようなグループを認識できないため、このグループを効果的に殺傷することができない。逆に、ＣＤ４＋ＣＤ７－Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を認識することにより、さらに外因性のＣＡＲ細胞を殺傷する。故に、患者体内のＣＤ４＋ＣＤ７－Ｔ細胞による外因性ＣＡＲ－Ｔ細胞への殺傷を回避するために、発明者は、ＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現を抑制又はサイレンシングすることを考える。

【0051】

本発明で、ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子そのものと、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と互いに作用し又はその発現をコントロールする遺伝子と、を含む。

【0052】

主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）は、最初に移植反応において主に機能するタンパク質として特徴付けられ、すべての高等脊椎動物的表面上に発現され、かつマウスにおいてＨ－２と称され、ヒト細胞においてＨＬＡと称される。ＭＨＣは、主にクラスＩ及びクラスＩＩの２クラスがある。クラスＩのＭＨＣタンパク質は２種類のタンパク質のへテロダイマーであり、一方が、ＭＨＣ Ｉ遺伝子によってコードされた膜貫通タンパク質α鎖であり、他方が、ＭＨＣ遺伝子クラスター内に位置しない遺伝子によってコードされた細胞外タンパク質のβ２ミクログロブリン鎖である。α鎖は３つのドメインを含み、外来ペプチドは、Ｎ末端でも最も可変的な２つのドメインα１、α２に結合される。クラスＩＩのＭＨＣタンパク質もへテロダイマーであり、ＭＨＣ複合体内の遺伝子によってコードされた２つの膜貫通タンパク質を含む。クラスＩのＭＨＣ／抗原複合体は、細胞毒性Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞）と互いに作用する一方、クラスＩＩのＭＨＣは、ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）へ抗原を提示する。また、クラスＩのＭＨＣタンパク質は、ほぼすべての有核細胞と血小板（およびマウスの赤血球）で発現される傾向がある一方、クラスＩＩのＭＨＣタンパク質はより選択的に発現される。通常、クラスＩＩのＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、いくつかのマクロファージ及び単核細胞、活性化されたＴ細胞、ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ）及び樹状細胞で発現される。

【0053】

ヒトのクラスＩＩのＨＬＡクラスターは、３つの主な遺伝子座ＤＰ、ＤＱ及びＤＲを含む。クラスＩＩ分子は、いずれも膜にアンカーされたα鎖及びβ鎖からなるへテロダイマーであり、ここでα鎖は約３３－３５ｋＤａで、５つのエキソンを含む。エキソン１はリーダーペプチドをコードし、エキソン２及び３は２つの細胞外ドメインをコードし、エキソン４は膜貫通ドメインをコードし、エキソン５は、細胞質尾部をコードする。故に、一実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲＡから選択される。

【0054】

ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現は、例えばＲＦＸ複合体、ＣＩＩＴＡ等のような複数種類の重要なポジティブ調節タンパク質にも決められる。ＲＦＸ複合体は、ＲＦＸＡＮＫ（ＲＦＸＢとも称される）、ＲＦＸ５及びＲＦＸヘルパータンパク質（ＲＦＸＡＰとも称される）という３つのサブユニットから構成される。ＲＦＸ複合体は、他の転写因子とクラスＩＩのＭＨＣ分子のプロモーターとの結合を促進するとともに、プロモーターの結合の特異性を強化することによって、クラスＩＩのＭＨＣ分子の発現を促進する。ＣＩＩＴＡはクラスＩＩのＭＨＣが発現する主制御因子である。ＣＩＩＴＡは、酸性アミノ酸が豊富なＮ端と、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒが豊富なＰＳＴ領域と、中央のＧＴＰ結合領域と、Ｌｅｕリッチリピート（ＬＲＲ）が豊富なＣ端と、を含み、ここで、Ｎ端の酸性領域及びＰＳＴ領域は、転写活性化領域である。故に、一実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される。

【0055】

故に、一実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択され、好ましくはＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択され、より好ましくはＲＦＸ５である。

【0056】

一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＭＨＣ－Ｉクラス遺伝子（例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ等）は機能的である。他の一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＭＨＣ－Ｉクラス遺伝子の発現も抑制され又はサイレンシングする。

【0057】

一実施形態において、本発明に記載のＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体を発現する改変免疫細胞は、内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子を含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングし、前記少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ及びそれらの組み合わせから選択され、前記少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される。好ましい一実施形態において、本発明に記載のＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体を発現する改変免疫細胞は、内因性ＣＤ７と、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣから選択される少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ及びＣＩＩＴＡから選択される少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とを含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングする。より好ましくは、本発明に記載のＣＤ７を標的にするキメラ抗原受容体を発現する改変免疫細胞は、内因性ＣＤ７と、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣから選択される少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子と、ＲＦＸ５とを含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングする。一実施形態において、前記改変免疫細胞におけるＭＨＣ－Ｉクラス遺伝子、例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＢ２Ｍの発現は機能的である。

【0058】

一実施形態において、ＣＤ７、ＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子及びＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子のほかに、本発明の改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、及び例えばＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３のような免疫チェックポイント遺伝子から選択される少なくとも１種類の遺伝子を含み、それらの発現が抑制され又はサイレンシングするようにしてもよい。

【0059】

遺伝子の発現を抑制し、又は遺伝子をサイレンシングする方法は当業者にとってよく知っているが、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓ酵素によりＤＮＡ切断を仲介し、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ等の技術により遺伝子を不活化することを含むが、それらに限定されない。
ＮＫ阻害性分子

【0060】

発明者は、また、ＣＤ７ＣＡＲによって標的化、殺傷されることができないＣＤ７－ＮＫ細胞の大きい割合（約２０％）が患者体内に存在することを発見した（図１）。そして、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子発現が抑制され又はサイレンシングする場合には、この部分の細胞は、ＣＡＲ細胞を殺傷する可能性がある。

【0061】

故に、一実施形態において、患者体内のＮＫ細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞への殺傷を抑制するために、前記改変免疫細胞は、１つ又は複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子をさらに発現する。例えば、前記ＮＫ阻害性分子は、１つまたは２つのＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む。

【0062】

ＮＫ阻害性分子に含まれる膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインの定義は、上記キメラ抗原受容体に含まれる膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインの定義と同様である。

【0063】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体であり、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２／ＣＤ９４成分（例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４）と、キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３）と、白血球Ｉｇ様受容体（ＬＩＲ）ファミリーメンバー（例えばＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５及びＬＩＲ８）と、ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１）ファミリーメンバー（例えばＮＫＲ－Ｐ１Ｂ及びＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）と、免疫チェックポイント受容体（例えばＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）と、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）と、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えばＳＩＧＬＥＣ７及びＳＩＧＬＥＣ９）と、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）と、Ｌｙ４９ファミリーメンバー（例えばＬｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１及びＬｙ４９Ｇ４）と、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）から選択される。好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、好ましくは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、ＬＩＲ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｄ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、Ｌｙ４９Ａ、Ｌｙ４９Ｃ、Ｌｙ４９Ｆ、Ｌｙ４９Ｇ１、Ｌｙ４９Ｇ４及びＫＬＲＧ１から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＣＤ９４、ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１から選択される。さらに、より好ましくは、前記ＮＫ阻害性受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＬＩＲ１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ１及びＫＬＲＧ１から選択される。

【0064】

一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体を標的にする抗体であり、前記抗体は、インタクト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、線形抗体、ｓｄＡｂ又はナノ抗体である。

【0065】

好ましい一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体である。より好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体は、配列番号５９、６２又は７７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号５８、６１又は７６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、を含む。より好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａを標的にする抗体のアミノ酸配列は、配列番号６０、６３又は７８で示される。当分野でＮＫＧ２Ａを標的にする既知の他の抗体、例えばＺ２７０（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅから取得できる）、Ｚ１９９（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡから取得できる）、２０Ｄ５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡから取得できる）、Ｐ２５（Ｍｏｒｅｔｔａｅｔａｌ，Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙから取得できる）等も、本発明に適用可能である。

【0066】

好ましい一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３及びＫＩＲ３ＤＬ１のようなＫＩＲを標的にする抗体である。より好ましくは、前記ＫＩＲを標的にする抗体は、配列番号６５又は７９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号６６又は８０で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、を含む。より好ましくは、前記ＫＩＲを標的にする抗体のアミノ酸配列は、配列番号６７又は８１で示される。当分野でＫＩＲを標的にする既知の他の抗体、例えばＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３を標的にし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ及びＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから取得できる）、ＥＢ６（ＫＩＲ２ＤＬ１を標的にし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ及びＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから取得できる）、ＡＺ１３８（ＫＩＲ３ＤＬ１を標的にし、Ｍｏｒｅｔｔａｅｔａｌ，Ｕｎｉｖ．Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙから取得できる）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２を標的にし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅから取得できる）、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１を標的にし、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ及びＢｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡから取得できる）等も、本発明に適用可能である。

【0067】

好ましい一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＬＩＲ１を標的にする抗体である。より好ましくは、前記ＬＩＲ１を標的にする抗体は、配列番号６８又は７１で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号６９又は７２で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、を含む。より好ましくは、前記ＬＩＲ１を標的にする抗体のアミノ酸配列は、配列番号７０又は７３で示される。

【0068】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＮＫ阻害性受容体の天然リガンド、又はそれに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域である。好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、免疫チェックポイントリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１等）、及びそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、コラーゲン、ＯＣＩＬ、シアル酸、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、Ｇａｌ－９、ＦＧＬ１、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択され、さらに好ましくは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、カドヘリン、又はそれらに含まれるＮＫ阻害性受容体結合領域から選択される。より好ましくは、前記ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン（Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域及びＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択される。

【0069】

好ましい一実施形態において、前記ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリン細胞外領域であり、ドメインＥＣ１及びＥＣ２を含み、より好ましくはドメインＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５を含む。好ましくは、前記Ｅ－カドヘリン細胞外領域は、配列番号４４（ドメインＥＣ１及びＥＣ２を含む）又は配列番号４８（ドメインＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４及びＥＣ５を含む）で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0070】

一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外領域である。好ましくは、前記ＰＤ－Ｌ１細胞外領域は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、前記ＰＤ－Ｌ２細胞外領域は、配列番号４６で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0071】

一実施形態において、ＮＫ阻害性リガンドは、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域又はＨＬＡ－Ｇ細胞外領域である。好ましくは、前記ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域は、配列番号５０（ワイルドタイプ）又は配列番号５１（Ｙ８４Ｃ変異の変異体を含む）で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、前記ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域は、配列番号４９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。当分野で知られるように、非古典的なＨＬＡクラスＩ分子（例えばＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ）は、Ｂ２Ｍとともに複合体を形成する限り、その機能を果たすことができる。故に、Ｂ２Ｍがノックアウトされる必要がある場合に、非古典的なＨＬＡクラスＩ分子が正常に抑制機能を果たすために、遺伝子編集ツールによるノックアウトを回避するように、ＤＮＡ配列同義変異Ｂ２Ｍを導入する必要がある。言い換えれば、Ｂ２Ｍがノックアウトされた細胞において、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｂ２Ｍと、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域又はＨＬＡ－Ｇ細胞外領域との融合分子である。

【0072】

他の一実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子は、少なくとも２つのＮＫ阻害性リガンドを含み、前記ＮＫ阻害性リガンドは、抗ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ、抗ＫＩＲ ｓｃＦｖ、抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域及びＰＤ－Ｌ２細胞外領域から選択され、より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域及びＨＬＡ－Ｅ細胞外領域である。

【0073】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄなどのタンパク質の細胞内領域から選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζの細胞内領域を含む。

【0074】

一実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子は、シグナルペプチド、例えばＰＤＬ１又はＢ２Ｍからのシグナルペプチドを含んでもよい。一実施形態において、前記ＮＫ阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１シグナルペプチドを含み、それが配列番号４４で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。当業者は、需要に応じて他の適当なシグナルペプチドを選択することができる。
改変免疫細胞

【0075】

本発明は、（１）抗ＣＤ７抗体及び任意の第２抗原領域を含む抗原結合領域を含むキメラ抗原受容体を発現し、（２）内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングすることを特徴とする改変免疫細胞をさらに提供する。一実施形態において、本発明の改変免疫細胞は、１つ又は複数のＮＫ阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子をさらに発現する。

【0076】

本明細書で使用されるように、「免疫細胞」という用語とは、１つ以上の種類のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞の活性への殺傷、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫システムの任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であってもよく、或いは、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髓幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞等の幹細胞から派生される免疫細胞であってもよい。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞であってもよく、例えば、原代Ｔ細胞のような体外培養のＴ細胞、或いはＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等のようなＴ細胞インビトロで培養されたＴ細胞株からのもの、又は被験者から取得されたＴ細胞である。被験者の実例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらの遺伝子組み換え種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髓、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍の複数のソースから取得されることができる。Ｔ細胞は、濃縮され又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意の発育段階にあってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞等を含むが、それらに限定されない。好ましい一実施形態において、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。当業者に既知される多種技術、例えばＦｉｃｏｌｌを用いて被験者の血液を分離してＴ細胞を取得することができる。本発明で、免疫細胞は、キメラ抗原受容体を発現するとともに、内因性ＣＤ７、少なくとも１種類のＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及び少なくとも１種類のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子の発現を抑制し又はサイレンシングするように、改変される。

【0077】

当分野での既知の一般的な方法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換等）を採用して、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸配列及び任意のＮＫ阻害性分子のコード核酸配列を免疫細胞に導入する。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。一例としては、ＲＮＡトランスフェクションであり、即ち、ＲＮＡ（例えばインビトロ転写のＲＮＡ，ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルスアプローチに用いられる。「形質導入」という用語は一般的にウィルス仲介による核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するためのものである。動物細胞のトランスフェクションは、材料摂取を許容するように、一般的に細胞膜の一時的に開かれる孔または「穴」に係わる。リン酸カルシウムを用い、エレクトロポレーション、細胞押し出しにより、又カチオン性脂質と材料とを混合させて細胞膜に融合してそれらのキャリアを内部に沈着する脂質体が生成し、トランスフェクションを行うことができる。真核宿主細胞のトランスフェクションに用いる例示的技術は、脂質ベシクル仲介による取り込み、ヒートショック仲介による取り込み、リン酸カルシウム仲介によるトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）が細菌中、非動物真核細胞（植物細胞を含む）中の非ウィルスへも転移することを説明するためのものである。従って、形質転換は、細菌又は非動物真核細胞の遺伝子変更であり、細胞膜によりその周囲から直接的に取り込んでから外因性の遺伝子材料（核酸分子）に組み込んで生成される。形質転換は、人工手段により実現されてもよい。形質転換の発生のために、細胞又は細菌は有能な状態であればならない。原核形質転換について、技術は、ヒートショック仲介による取り込み、完全細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。

【0078】

核酸又はベクターを免疫細胞に導入すると、当業者は、一般的な技術により取得した免疫細胞を増幅、活性化することができる。
医薬組成物

【0079】

本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞を活性剤として含有し、多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0080】

本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」という用語とは、被験者および有効成分と薬理学的および／または生理学的に適合する（即ち、何らかの希望しない局部又は全身の作用を果たすことがなく、所要の治療効果を果たす）ベクター及び／又は賦形剤を指し、本分野で周知される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）。薬学的に許容される賦形剤の実例は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、粘着防止剤、流動促進剤、酸化防止剤、香料、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤および等張化剤を含むが、それらに限定されない。当業者は、適当な賦形剤を選択して本発明の所望の医薬組成物を調製することを知っている。本発明に用いる医薬組成物における例示的賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水である。通常、適当な賦形剤の選択は、特に使用される活性剤、治療対象の疾患及び医薬組成物の所望の剤型によって決められる。

【0081】

本発明に係る医薬組成物は、複数の経路による投与に適用である。一般的に、非経口で投与を完了する。非経口投与法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、または鼻腔内で投与することを含む。

【0082】

本発明に係る医薬組成物は、例えば固体、液体、気体、凍結乾燥形態等の様々な形式で調製されることができ、特に軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒、丸剤、懸濁液、乳液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、液体エキス剤抽出物の形態であってもよく、或いは、特に所要の投与方法に適用する形態である。本発明で既知の薬を製造するプロセスは、例えば、ルーチンの混合、溶解、造粒、糖衣製造、製粉、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスを含んでもよい。例えば本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は一般的に溶液の形態で提供され、且つ好ましくは薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0083】

本発明に係る医薬組成物は、治療対象の疾患の治療及び／又は予防に適用する１つ以上の種類の他の薬剤と組み合わせて投与されることもできる。組み合わせに適用する薬剤の好ましい実例は、例えばシスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーポルフィリンナトリウムＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びアドリアマイシン等の既知の抗癌薬と、例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ酵素等のペプチド細胞毒素と、例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５及びアスタチン２１３等の放射性核種と、例えば抗体指向性酵素プロドラッグのプロドラッグと、例えば血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等の免疫刺激剤と、例えば抗ＣＤ３抗体又はその断片のような抗体又はその断片と、補体活化剤と、ヘテロタンパク質ドメインと、ホモタンパク質ドメインと、ウイルス／細菌タンパク質ドメインと、ウィルス／細菌ペプチドと、を含む。また、本発明の医薬組成物は、例えば化学療法、放射線療法等の他の１つ以上の種類の治療方法と組み合わせて使用されてもよい。
治療への応用

【0084】

本発明は、被験者に対して本発明に記載の免疫細胞又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む、ＣＤ７発現に関する疾患を有する被験者を治療する方法を更に提供する。故に、本発明は、ＣＤ７発現に関する疾患を治療する薬剤の調製における前記改変免疫細胞及び医薬組成物の使用をさらにカバーする。

【0085】

一実施形態において、被験者に対して本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物を有效量だけ直接的に投与する。

【0086】

別の一実施形態において、本発明の治療方法は、生体外治療である。具体的には、この方法は、（ａ）免疫細胞を含むサンプルを提供するステップと、（ｂ）生体外で、本発明のキメラ抗原受容体及び外因性遺伝子（例えばＮＫ阻害性分子）を前記免疫細胞に導入し、前記免疫細胞における特定の遺伝子（例えば、内因性ＣＤ７、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子）の発現を抑制又はサイレンシングさせ、修飾された免疫細胞を取得するステップと、（ｃ）前記修飾された免疫細胞を、それを必要とする被験者に投与するステップと、を含む。好ましくは、ステップ（ａ）で提供される免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞から選択され、且つ前記免疫細胞は、当分野での既知の一般的方法で被験者のサンプル（特に血液サンプル）から取得されることができる。しかし、本発明のキメラ抗原受容体を発現し、本明細書に記載の所要の生物効果機能を発揮することができる他の免疫細胞を使用してもよい。また、一般的に選択された免疫細胞は、被験者の免疫システムに適合し、即ち好ましくは前記免疫細胞は免疫原性応答を誘発しない。例えば、「ユニバーサル受容細胞」、即ち所要の生物効果機能を発揮する普遍的に適合する生体外培養及び増殖のリンパ球を使用してもよい。このような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を取得及び／又は提供する必要がなくなる。ステップ（ｃ）の生体外導入は、エレクトロポレーションを介して本明細書に記載の核酸又はベクターを免疫細胞に導入し、又はウィルスベクターにより免疫細胞を感染することによって実施されることができ、前記ウィルスベクターは、上記したレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである。想到できる他の方法は、トランスフェクション試剤（例えば脂質体）又は一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用を含む。

【0087】

一実施形態において、前記免疫細胞は、自家又は同種異系の細胞であり、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であり、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。

【0088】

本明細書で使用されるように、「自家」という用語とは、個体に由来する任意の材料が後に当該同一個体に再びに導入されるという意味である。

【0089】

本明細書で使用されるように、「同種異系」という用語とは、任意の材料が当該材料に導入された個体と同一物種の異なる動物又は異なる患者に由来するという意味である。１つ又は複数の遺伝子座の所在する遺伝子が異なる場合に、２つ又はより多い個体が互い同種異系のものであると認定される。いくつかの場合に、同一物種のそれぞれの個体の同種異系材料の遺伝子における相違によっては、抗原相互作用が発生する可能性が高い。

【0090】

本明細書で使用されるように、「被験者」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、人間以外の霊長類動物、マウス、ラット、犬、猫、馬又は牛であってもよいが、これらの実例に限定されない。人間以外の哺乳動物は、癌動物モデルを代表する被験者として有利的に用いられる。好ましくは、前記被験者はヒトである。

【0091】

一実施形態において、ＣＤ７発現に関連する疾患は、非固形腫瘍（例えば白血病及びリンパ腫のような血液腫瘍）と固形腫瘍を含む。血液腫瘍は、血液又は骨髄の癌であり、急性白血病（例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球性、前骨髄性、顆粒単球型、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（例えば慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ芽球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（痛くないハイグレードなフォルム）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫（Ｔ－ＬＢＬ）、早期プロＴリンパ芽球性白血病（ＥＴＰ－ＡＬＬ）、節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）及び骨髄形成異常を含むが、それらに限定されない。固形腫瘍は、通常、嚢胞または流体領域の組織を含まない異常な腫瘤であり、良性または悪性であってもよい。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成した細胞タイプによって命名される（例えば肉腫、癌及びリンパ腫）。固形腫瘍の実例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫中皮腫、膵臓癌、卵巣癌、腹膜、大網、及び腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、黒色腫、腎臓癌、咽喉癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門癌、眼癌、肝内胆管癌、関節癌、頸部癌、胆のう癌、胸膜癌、鼻癌、中耳癌、口腔癌、外陰癌、甲状腺癌及び尿管癌を含むが、それらに限定されない。

【0092】

一実施形態において、ＣＤ７発現に関連する疾患としては、好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔリンパ芽球性リンパ腫（Ｔ－ＬＢＬ）、早期プロＴリンパ芽球性白血病（ＥＴＰ－ＡＬＬ）及び節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫から選択される。

【0093】

以下、図面を参照しながら実例を合わせて本発明を詳細に説明する。説明すべきこととして、当業者は、本発明の図面及びその実施例が例示なものに過ぎず、本発明に対する任意の制限を構成しないと理解するはずである。矛盾しない場合、本出願における実施例及び実施例における特徴は互いに組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0094】

【図1】患者の末梢血リンパ球におけるＣＤ７＋細胞とＣＤ７－細胞との比率を示す。

【図2】ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを示す。

【図3】ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力を示す。

【図4】ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞と標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを示す。

【図5】ＮＫ阻害性分子によるＮＫ細胞殺傷作用への抑制効果を示す。Ａ：ＮＫ阻害性分子は抗ＫＩＲ ｓｃＦｖを含む。Ｂ：ＮＫ阻害性分子は抗ＬＩＲ ｓｃＦｖを含む。Ｃ：ＮＫ阻害性分子は抗ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域又はＥ－Ｃａｄ細胞外領域を含む。

【図6】ＣＤ３ζのＮＫ阻害性分子を含むＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）によるＮＫ細胞への殺傷作用を表す。

【図7】ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを示す。

【図8】ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞のＮＫ阻害性分子の発現レベルを示す。

【図9】ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力を示す。

【図10】ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞と標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを示す。

【図11】ＣＡＲ７－Ｅ Ｔ細胞、ＣＡＲ７－ＰＤＬ１ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖ発現レベルを示す。

【図12】ＣＡＲ７－Ｅ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅの発現レベル、及びＣＡＲ７－ＰＤＬ１ Ｔ細胞におけるＰＤＬ１発現レベルを示す。

【図13】ＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１の発現レベルを示す。

【図14】ＣＡＲ７－Ｅ Ｔ細胞、ＣＡＲ７－ＰＤＬ１ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力を示す。

【図15】ＣＡＲ７－Ｅ Ｔ細胞、ＣＡＲ７－ＰＤＬ１ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１ Ｔ細胞と標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを示す。

【図16】ＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞におけるＣＤ７ ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ ｓｃＦｖの発現レベルを示す。

【図17】ＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞による２種類の標的細胞への殺傷能力を示す。

【図18】ＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞と２種類の標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0095】

実施例１．抗ＣＤ７のユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞の調製
ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ｓｃＦｖ（配列番号２１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号３８）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２４）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３０）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順にクローンするとともに、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0096】

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）に加入して上記プラスミドを希釈してから、プラスミド：ウイルス包装ベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１という比率で、包装ベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２５９）を加入する。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに均一に混ぜて、室温で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を２９３Ｔ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入する。２４時間及び４８時間の後にウイルスを収集し、それを合わせた後に、超遠心分離して（２５０００ｇ、４℃、２．５時間）濃縮レンチウイルスを取得する。

【0097】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号４０２０３Ｄ）を用いて野生型Ｔ細胞を活性化し、３７℃及び５％のＣＯ２で引き続き１日間培養する。そして、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて野生型Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３成分（具体的にＴＲＡＣ遺伝子）、ＣＤ７遺伝子及び任意のＭＨＣクラスＩＩ関連遺伝子（具体的にＲＦＸ５）をノックアウトして、ＴＣＲ／ＣＤ７ダブルノックアウトのｄＫＯ－Ｔ細胞及びＴＣＲ／ＣＤ７／ＲＦＸ５トリプルノックアウトのｔＫＯ－Ｔ細胞を取得する。遺伝子がノックアウトされない野生型Ｔ細胞（即ちＮＴ細胞）を対照とする。

【0098】

ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５５９１６）抗体、ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ７（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ商品番号３９５６０４）及びＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３６１７１４）抗体を用い、フローサイトメトリーによりＴ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ７／ＲＦＸ５の遺伝子編集効率を検出し、結果を表１に示す。

【0099】

表１．Ｔ細胞における遺伝子発現効率

【0100】

表１からわかるように、本発明で調製されるｄＫＯ－Ｔ細胞及びｔＫＯ－Ｔ細胞における関連遺伝子の発現は、効果的に抑制され又はサイレンシングする。

【0101】

濃縮したレンチウイルスをｄＫＯ－Ｔ細胞及びｔＫＯ－Ｔ細胞に加入して、ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞を取得する。Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）₂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１０９－０６５－０９７）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーによりＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図２に示す。

【0102】

これによってわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖは、いずれも効果的に発現されることができる。
実施例２：ＣＡＲ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果及びサイトカイン放出
２．１ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果

【0103】

ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力を検出するために、まず１ｘ１０^４／孔でフルオレセイン遺伝子を持つＪｕｒｋａｔ標的細胞を９６ウェルプレートに入れ、その後、０．５：１、０．２５：１及び０．１２５：１のエフェクター：標的比（即ちエフェクターＴ細胞と標的細胞との比率）でＣＡＲ Ｔ細胞及びＮＴ細胞を９６ウェルプレートに入れて一緒に培養し、１６～１８時間の後にマイクロプレートリーダーを用いて蛍光値を測定する。計算式：（標的細胞蛍光平均値－サンプル蛍光平均値）／標的細胞蛍光平均値×１００％に基づいて、殺傷効率を算出して取得し、結果を図３に示す。

【0104】

これによって分かるように、ＮＴに比べると、ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞は、標的細胞に対していずれも特異的殺傷を有し、且つＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞は、ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞よりも殺傷能力が高い。
２．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン放出

【0105】

Ｔ細胞が標的細胞を殺傷する場合に、標的細胞は、数が低減するとともに、サイトカインも放出する。下記のステップに従って、サンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）で本発明のＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を殺傷するときのサイトカインＩＦＮγの放出レベルを測定する。
（１）細胞共培養上澄み液の収集

【0106】

１ｘ１０^５／孔でＪｕｒｋａｔ標的細胞を９６ウェルプレートに入れ、その後、０．１２５：１の比率でＣＡＲ Ｔ及びＮＴ細胞（陰性対照）を標的細胞とともに一緒に培養し、１８～２４時間後に細胞共培養上澄み液を収集する。
（２）ＥＬＩＳＡによる上澄みにおけるＩＦＮγ分泌量の検出

【0107】

捕獲抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号５０６５０２）を用いて９６ウェルプレートを被覆させて４℃で１晩インキュベートす、その後、抗体溶液を除去し、２％ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ，商品番号Ｖ９００９３３－１ｋｇ）含有の２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）溶液を加入し、３７℃で２時間インキュベートする。そして、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。各孔に５０μＬの細胞共培養上澄み液又は標準品を加入し、３７℃で１時間インキュベートし、その後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。そして、各孔にそれぞれ５０μＬの検出抗体Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ抗体［ＭＤ－１］（Ｂｉｏｔｉｎ）（ａｂｃａｍ，商品番号ａｂ２５０１７）を加入し、３７℃で１時間インキュベートした後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。ＨＲＰ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号４０５２１０）を再加入して、３７℃で３０分間インキュベートした後、上澄み液を放棄し、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を加入し、５回洗浄する。各孔に５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加入する。反応を室温で暗い場所で３０分間発生させ、その後、各孔に５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ_２ＳＯ_４を加入して反応を停止させる。反応の停止中の３０分間において、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を検出し、標準曲線（標準品の読み取り値及び濃度に基づいて描いたもの）に基づいてサイトカインの含有量を算出し、結果を図４に示す。

【0108】

これによってわかるように、ＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞による標的細胞のサイトカイン放出は、いずれも対照ＮＴ群よりも高く、且つＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞はＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞よりも放出レベルが高い。

【0109】

上記結果から分かるように、ＣＡＲ７－ｔＫＯ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力及びサイトカインの放出レベルは、いずれもＣＡＲ７－ｄＫＯ Ｔ細胞よりも高く、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のノックアウトによってはＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷活性を強化したことが表明される。これは予想外であるが、既存の報告では、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現が免疫拒絶に関連すると考えられるが、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とＣＡＲ－Ｔ細胞自体の活性との関係についての報告がまだないからである。
実施例３．ＮＫ阻害性分子によるＮＫ細胞殺傷作用への抑制効果

【0110】

Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号３４）、ＮＫ阻害性リガンド、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号４０）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）等のタンパク質のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順にクローンし、ここで、ＮＫ阻害性リガンドは、Ｅ－カドヘリンの細胞外領域（配列番号４７，ＥＣａｄ０プラスミド対応）、Ｂ２ＭとＨＬＡ－Ｅ細胞外領域との融合分子（提示ペプチド（配列番号７５）、Ｂ２Ｍ（配列番号７４）及びＨＬＡ－Ｅ細胞外領域変異体（配列番号５１）が含まれ、Ｂ２Ｍのコード配列である配列番号８２に同義変異が含まれ、Ｅ０プラスミドに対応する）、或いはＢ２ＭとＨＬＡ－Ｇ細胞外領域との融合分子（Ｂ２Ｍ（配列番号７４）及びＨＬＡ－Ｇ細胞外領域（配列番号４９）が含まれ、Ｂ２Ｍのコード配列である配列番号８２に同義変異が含まれ、Ｇ０プラスミドに対応する）である。ＥＣａｄ０、Ｅ０及びＧ０プラスミドには、さらにＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２６）が含まれ、それぞれＥＣａｄ２８、Ｅ２８及びＧ２８プラスミドが取得される。シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0111】

Ｂ２ｍシグナルペプチド（配列番号３４）、ＮＫ阻害性リガンド、ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号４２）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２２）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２６）等のタンパク質のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順にクローンし、ここで、ＮＫ阻害性リガンドは、抗ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ（配列番号６３，Ａ２８プラスミド対応）、抗ＫＩＲ ｓｃＦｖ（配列番号６７，ＫＩＲＧ４プラスミド対応）、又は抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号７０，ＬＩＲ１－１プラスミド対応）である。シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0112】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ（配列番号７３）、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号４０）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号２８）等のタンパク質のコード配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順にクローンし、ＬＩＲ１－２プラスミドを取得する。シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0113】

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）に加入して上記プラスミドを希釈してから、プラスミド：ウイルス包装ベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１という比率で、包装ベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２５９）を加入する。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに均一に混ぜて、室温で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を２９３Ｔ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入する。２４時間及び４８時間の後にウイルスを収集し、それを合わせた後に、超遠心分離して（２５０００ｇ、４℃、２．５時間）濃縮レンチウイルスを取得する。

【0114】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号４０２０３Ｄ）を用いてＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％のＣＯ２で１日間培養する。そして、濃縮したレンチウイルスを加入し、３日間連続培養後、ＮＫ阻害性分子を発現するＴ細胞、即ちＵＮＫｉ－Ｔ細胞を取得する。

【0115】

そして、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて野生型Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ Ｔ細胞，対照として用いられる）、及び前記ＵＮＫｉ－Ｔ細胞におけるＴＣＲ／ＣＤ３成分（具体的にＴＲＡＣ遺伝子）及びＭＨＣ関連遺伝子（具体的にＢ２Ｍ及びＲＦＸ５）をノックアウトするとともに、フローサイトメトリーにより各遺伝子が効果的にノックアウトされることを確認する。

【0116】

そして、下記の方法に従って、本発明で調製されるＵＮＫｉ－Ｔ細胞によるＮＫ細胞の殺傷作用への抑制効果を検出し、即ちＦａｒ－Ｒｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，商品番号Ｃ３４５６４）を用いて本発明で調製されるＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ－Ｔ細胞をマークする。そして、１ｘ１０⁴個の細胞／孔の濃度で、マークされたＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ Ｔ細胞を９６ウェルプレートに入れ、２：１のエフェクター：標的比でＮＫ９２細胞（ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、抗ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ、抗ＫＩＲ ｓｃＦｖ又は抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖを発現するためのＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＭｏｃｋ Ｔ細胞）、又はＮＫ９２－ＫＬＲＧ１細胞（Ｅ－カドヘリン細胞外領域を発現するためのＵＮＫｉ－Ｔ細胞であって、ＫＬＲＧ１遺伝子をＮＫ９２細胞に導入することによって調製する）を加入し、共培養を行う。１６～１８時間後、フローサイトメトリーを用いてカルチャーにおけるＴ細胞の比率を検出して、さらにＮＫ細胞によるＴ細胞への殺傷効果を算出し、結果を図５に示す。

【0117】

図５から分かるように、ＮＫ阻害性分子を発現しないＭｏｃｋ Ｔ細胞に比べると、阻害性リガンド、例えば抗ＫＩＲ ｓｃＦｖ、抗ＬＩＲ１ ｓｃＦｖ、抗ＮＫＧ２Ａ ｓｃＦｖ、ＨＬＡ－Ｇ細胞外領域、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域、Ｅ－カドヘリン細胞外領域を発現するＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、いずれもＮＫ細胞によるＴ細胞への殺傷作用を顕著に低減させることができる。また、阻害性リガンド及び膜貫通ドメインのみ（即ち、共刺激ドメインが含まれない）を発現するＴ細胞（Ｇ０、Ｅ０、Ｅｃａｄ０）に比べると、共刺激ドメインの加入によっては、Ｔ細胞によるＮＫ細胞殺傷への抑制（Ｇ２８、Ｅ２８、ＥＣａｄ２８）を顕著に増加することができる。従って、本発明に記載の阻害性リガンド、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含むＮＫ阻害性分子は、ＮＫ細胞によるＵＮＫｉ－Ｔ細胞への殺傷作用を顕著に低減させて、ＨｖＧＤリスクを効果的に低減させることができる。。

【0118】

また、ある場合には、ＮＫ細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞への殺傷を抑制する必要があるだけではなく、さらにＴ細胞がＮＫ細胞を殺傷する必要もある。故に、発明者は、Ｅ２８プラスミド及びＡ２８プラスミド細胞を基にさらにＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３０）を含めるとともに、上記方法に従ってそれをレンチウイルスとしてパッケージ化し、そのうちのＴＣＲ／ＣＤ３成分（具体的にＴＲＡＣ遺伝子）及びＭＨＣ関連遺伝子（具体的にＢ２Ｍ及びＲＦＸ５）が効果的にノックアウトされたＴ細胞を感染して、Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞核Ａ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞を取得する。

【0119】

下記の方法によりＵＮＫｉ－Ｔ細胞によるＮＫ細胞への殺傷を検出し、即ち１ｘ１０^５個の細胞／孔の濃度で標的細胞（ＮＫ９２細胞）を９６ウェルプレートに入れ、その後、各孔に１：１の比率でＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｅ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞を加入すると同時に、１０μｌのＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５５８０１）を加入して、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件で共培養を行う。１時間後、Ｇｏｉｇｓｔｏｐ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５１－２０９２ＫＺ）を加入して、引き続き２．５時間インキュベートする。そして、各孔に５μｌのＡＰＣ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号：５５５３６９）及び５μｌのＦＩＴＣ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号：５６１００５）を加入し、３７℃で３０分間インキュベートし、フローサイトメトリーによりＣＤ１０７ａの発現状況を検出し、結果を図６Ａ（ＣＤ４＋Ｔ細胞毒性）及び図６Ｂ（ＣＤ８＋Ｔ細胞毒性）に示す。

【0120】

これによって分かるように、ＮＫ阻害性分子を発現しないＭｏｃｋ Ｔ細胞は、標的細胞に対して殺傷がほとんどない。これとは逆に、本発明で調製されるＥ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞及びＡ２８ｚ－ＵＮＫｉ－Ｔ細胞と、標的細胞との共培養後、ＣＤ１０７ａの発現率が顕著に向上するが、本発明のＵＮＫｉ－Ｔ細胞は、ＮＫ細胞を顕著に殺傷することができることが示される。
実施例４．ＮＫ阻害性分子を発現するユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞の調製

【0121】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ（配列番号２１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号３８）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２２）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３０）、Ｆ２Ａ、Ｅ－カドヘリン細胞外領域（配列番号４８）、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号４０）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）及びＣＤ２８細胞内領域（配列番号２６）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをＭＳＣＶベクターにクローンし、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0122】

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）に加入して上記プラスミドを希釈してから、プラスミド：ウイルス包装ベクター＝３：１という比率で、包装ベクターｐＣＬ－Ｅｃｏ（上海禾午生物科技有限公司，商品番号Ｐ３０２９）を加入する。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに均一に混ぜて、室温で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を２９３ＧＰ細胞の培養フラスコに一滴ずつ加入する。７２時間及び９６時間の後にウイルスを収集し、それを合わせた後に、遠心分離し（２０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）、デフラグメンテーション後、レトロウイルス上澄み液を取得する。

【0123】

実施例１におけるノックアウト方式を参照し、ＴＣＲ／ＣＤ７ダブルノックアウトのｄＫＯ Ｔ細胞及びＴＣＲ／ＣＤ７／ＲＦＸ５トリプルノックアウトのｔＫＯ Ｔ細胞を調製する。遺伝子がノックアウトされない野生型Ｔ細胞（即ちＮＴ細胞）を対照とする。

【0124】

２４ウェルプレートをＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし４℃で１晩インキュベートし、その後、溶液を除去して、３００μＬの５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号）含有ＰＢＳ溶液を加入し、室温で３０分間置く。そして、上澄みを除去し、１ｍＬのＰＢＳでプレートを２回洗浄する。各孔に２ｍＬのレトロウイルス上澄み液及び０．５Ｍ ｄＫＯ－Ｔ細胞又はｔＫＯ－Ｔ細胞を加入し、２０００ｇ、３２℃で２時間遠心分離した後、二酸化炭素インキュベーターに置いて培養し、ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞を取得する。

【0125】

７日間培養した後、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）₂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１１５－０６５－０７２）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーによりＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞のＣＤ７ ｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図７に示す。Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ商品番号１３－５７００）及びＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，商品番号Ａ－１１００１）を用いて、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現を検出し、結果を図８に示す。

【0126】

これによってわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞における抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ及びＮＫｉ阻害性分子は、いずれも効果的に発現されることができる。

【0127】

実施例２の２．１に記載の方法に基づいてＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞によるＪｕｒｋａｔ標的細胞への殺傷効果を検出し、結果を図９に示す。これによってわかるように、２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞は、各エフェクター：標的比でいずれも標的細胞を顕著に殺傷することができ、且つ０．１２５：１のエフェクター：標的比で、ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞は、ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞よりも殺傷効果が優れる。

【0128】

実施例２の２．２に記載的方法に基づいてＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞のそれぞれとＪｕｒｋａｔ標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを検出し、結果を図１０に示す。これによってわかるように、本発明のＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞のサイトカイン放出レベルは、いずれも対照であるＮＴ細胞よりも顕著に高く、且つＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｔＫＯ Ｔ細胞群は、ＣＡＲ７－ＮＫｉ－ｄＫＯ Ｔ細胞群よりも放出レベルが顕著に高い。
実施例５．ＮＫ阻害性分子を発現するユニバーサルＣＡＲ Ｔ細胞の調製、及びその機能の検証

【0129】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ（配列番号２１）、ＣＤ２８ヒンジ領域（配列番号４０）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２２）、ＣＤ２８細胞内領域（配列番号２６）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３２）、Ｆ２Ａ、ＰＤ－Ｌ１シグナルペプチド（配列番号４４）、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域（配列番号４５）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）などのタンパク質をコードする配列を合成し、それをＭＳＣＶベクターにクローンし、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する（プラスミド名称：ＣＡＲ７－ＰＤＬ１）。

【0130】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ（配列番号２１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号３８）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３２）、Ｆ２Ａ、Ｂ２Ｍシグナルペプチド（配列番号３４）、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域（配列番号５０）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）、ＣＤ２８細胞内領域（配列番号２６）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをＭＳＣＶベクターにクローンし、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する（プラスミド名称：ＣＡＲ７－Ｅ）。

【0131】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ（配列番号２１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号３８）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２２）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３２）、Ｆ２Ａ、Ｂ２Ｍシグナルペプチド（配列番号３４）、ＨＬＡ－Ｅ細胞外領域（配列番号５０）、連結ペプチド（配列番号６４）、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域（配列番号４５）、ＣＤ２８膜貫通領域（配列番号２４）、ＣＤ２８細胞内領域（配列番号２６）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをＭＳＣＶベクターにクローンし、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する（プラスミド名称：ＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１）。

【0132】

実施例３に記載の方法に従って上記プラスミドをレトロウイルスとしてパッケージ化し、ｔＫＯ－Ｔ細胞を感染し、ＣＡＲ７－Ｅ Ｔ細胞、ＣＡＲ７－ＰＤＬ１ Ｔ細胞及びＣＡＲ７－ＥＰＤＬ１ Ｔ細胞をそれぞれ取得する。

【0133】

７日間培養した後、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）₂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１０９－０６５－０９７）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーにより３種類の細胞のｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図１１に示す。ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－Ｅ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３４２６０４）及びＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＰＤＬ１（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３２９７０６）を用いて、ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１の発現をそれぞれ検出し、結果を図１２及び図１３に示す。

【0134】

これによってわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞における抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ及びＮＫ阻害性分子（ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤ－Ｌ１）は、いずれも効果的に発現されることができる。

【0135】

実施例２の２．１に記載の方法に基づいて上記３種類のＣＡＲ Ｔ細胞によるＪｕｒｋａｔ標的細胞への殺傷効果を検出し、結果を図１４に示す。これによってわかるように、３種類のＣＡＲ－Ｔ細胞は、いずれも標的細胞を顕著に殺傷することができる。

【0136】

実施例２の２．２に記載的方法に基づいて３種類のＣＡＲ－Ｔ細胞のそれぞれとＪｕｒｋａｔ標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを検出し、結果を図１５に示す。ＮＴ群に比べると、３種類のＣＡＲ－Ｔ細胞サイトカイン放出レベルはいずれも顕著に高くなる。
実施例６．二重標的ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製及びその機能の検証

【0137】

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号３６）、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ（配列番号２０）、連結ペプチド（配列番号６４）、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（配列番号５４）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号３８）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号２２）、４－１ＢＢ細胞内領域（配列番号２８）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号３２）等のタンパク質をコードする配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）に順にクローンし、シーケンシングにより対象配列の正しい挿入を確認する。

【0138】

実施例１の方法に従って上記プラスミドベクターをレンチウイルスとしてパッケージ化し、ｔｋＯ－Ｔ細胞を感染し、ＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞を取得する。修飾されていない野生型Ｔ細胞は、陰性対照（ＮＴ）として用いられる。

【0139】

Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）₂ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１１５－０６５－０７２）又はＢｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’） ２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１０９－０６５－０９７）を一次抗体とし、ＦＩＴＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６０）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーによりＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞のｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図１６に示す。

【0140】

これからわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ７ ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ ｓｃＦｖは、いずれも効果的に発現されることができる。

【0141】

実施例２における方法に基づいて、それぞれＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞の殺傷功能及びサイトカイン放出レベルを検出し、結果をそれぞれ図１７及び図１８に示す。これによってわかるように、ＣＡＲ７－１９ Ｔ細胞は、Ｎａｌｍ６及びＪｕｒｋａｔという２種類の標的細胞に対していずれも特異的殺傷、及び顕著に向上するサイトカイン放出がある。

【0142】

説明すべきこととして、上記は、本発明の好ましい実施例に過ぎなく、本発明を制限するものではなく、当業者にとって、本発明は様々の変更及び変化を行うことができる。当業者によって理解されるように、本発明の思想と原則で行われたいかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】