特表 2023-548937 脂質ヒドロゲル、その製造方法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-21

(54)【発明の名称】脂質ヒドロゲル、その製造方法および使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/06 20060101AFI20231114BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 31/133 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20231114BHJP

【ＦＩ】

A61K9/06

A61P1/00

A61P17/00

A61K47/24

A61K9/51

A61K45/00

A61K31/133

A61K31/56

A61K38/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023528256

(86)(22)【出願日】2021-11-11

(85)【翻訳文提出日】2023-07-10

(86)【国際出願番号】 ES2021070815

(87)【国際公開番号】W WO2022101537

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】P202031135

(32)【優先日】2020-11-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】ES

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511000083

【氏名又は名称】コンセホ スペリオール デ インベスティガシオネス シエンティフィカス（セエセイセ）

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）

【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｓｅｒｒａｎｏ，１１７，Ｅ－２８００６ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】タロ ドミンゲス，キリアン

(72)【発明者】

【氏名】ロペス セラーノ，オルガ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA65

4C076BB01

4C076BB21

4C076BB24

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4C076CC10

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4C076CC18

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4C076GG41

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4C206MA76

4C206MA78

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4C206NA03

4C206NA20

4C206ZA33

4C206ZA66

4C206ZA89

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つの両性イオン性リン脂質および水（７０重量％～９７重量％）を含む、相互接続されたシートおよび小胞の三次元ネットワークからなるナノ構造脂質ヒドロゲルに関する。前記ヒドロゲルは、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸または脂肪アルコールを含まない。本発明はまた、その製造方法および使用、特に、有効成分放出系としての使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

相互接続されたシートおよび小胞の三次元ネットワークによって形成されたナノ構造脂質ヒドロゲルであって、
－ 少なくとも１つの両性イオン性リン脂質を含む、３重量％～３０重量％の脂質、
－ ７０重量％～９７重量％の水、
を含み、
前記ヒドロゲルが、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸または脂肪アルコールを含まないことを特徴とする、ナノ構造脂質ヒドロゲル。

【請求項2】

前記両性イオン性リン脂質が、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含む一覧から選択される、請求項１に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項3】

前記両性イオン性リン脂質が、水素化大豆ホスファチジルコリンである、請求項２に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項4】

前記脂質が、前記両性イオン性リン脂質に加えて、アニオン性またはカチオン性脂質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項5】

前記両性イオン性リン脂質と前記アニオン性またはカチオン性脂質とのモル比が、１００：１～３：１である、請求項４に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項6】

前記両性イオン性リン脂質と前記アニオン性またはカチオン性脂質とのモル比が２０：１である、請求項５に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項7】

前記カチオン性脂質が、２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパンである、請求項４～６のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項8】

前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリンである、請求項４～６のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項9】

有効成分をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項10】

前記有効成分が、スフィンゴ脂質、コレステロール、抗酸化剤、抗生物質、抗炎症剤、タンパク質またはそれらの組み合わせである、請求項９に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項11】

前記脂質と水との重量比が、５：９５である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲル。

【請求項12】

以下の工程を含む、請求項１～１１に記載のナノ構造脂質ヒドロゲルの製造方法：
－ ポリマー、界面活性剤、脂肪アルコールまたは脂肪酸を介さずに、脂質を水中に分散させる工程、
－ 前工程で得られた脂質分散液からヒドロゲルを形成する工程であり、該方法は、ポリマー、界面活性剤、脂肪アルコールまたは脂肪酸の介在なしに実施され、前記ヒドロゲルの形成が以下のサブ工程を含むことを特徴とする：
－ 脂質分散液のｐＨを２～１３に調整する工程、
－ 前記分散液を－２０℃以下の温度に調整したｐＨで１分間以上凍結する工程、
－ 前記分散液を５℃～９０℃の温度まで解凍加熱する工程、
－ 前記サブ工程からのゲル化分散液を室温で冷却する工程。

【請求項13】

水中、脂質分散液が、有機溶媒中で対応する脂質を混合し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、その後、乾燥し、次いで、攪拌条件下、室温で所定濃度範囲の水を加えて水和することにより行われる、請求項１２に記載の脂質ヒドロゲルの製造方法。

【請求項14】

前記有機溶媒が、クロロホルムである、請求項１２または１３に記載の脂質ヒドロゲルの製造方法。

【請求項15】

前記脂質分散液のｐＨの調整が、水酸化ナトリウムまたは塩酸溶液を用いて行われる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の脂質ヒドロゲルの製造方法。

【請求項16】

有効成分の放出のための、または皮膚および粘膜の保護剤としての、請求項１～１１のいずれか一項に記載のナノ構造脂質ヒドロゲルの使用。

【請求項17】

胃保護剤としての、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

皮膚適用、粘膜適用、眼適用の手段、または経口投与の手段による、請求項１６または１７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明の目的は、少なくとも１つの両性イオン性リン脂質および水を含む、相互接続されたシートおよび小胞の三次元ネットワークからなるナノ構造脂質ヒドロゲルである。本発明はまた、その製造方法および使用、特に、有効成分放出系としての使用に関する。

【0002】

したがって、本発明は、潜在的な生物医学的用途を有するゲル製剤の分野に含まれ得る。

【0003】

〔発明の背景〕
ゲルは、水性溶媒または有機溶媒のいずれかが溶質分子のネットワーク内に捕捉される材料として記載することができる。この組成物は、ゲルがその組成に応じて、軟質固体および粘性液体として挙動することを可能にする。それらのレオロジー挙動は、それらの微視的構造に作用する分子相互作用に関連している。共有結合のような高分子ゲル中の化学的相互作用は、変形に対する機械的耐性を提供する。対照的に、超分子ゲルにおける物理的相互作用は、静電力のように、より弱く、ゲルがより容易に変形および流動することを可能にする。異なる特性を有するゲルを形成するためにゲル化剤を組み合わせることの容易さは、ゲル副生成物の急速な成長をもたらす。それらの形成およびレオロジー挙動を制御するパラメータを理解することは、これらの材料の新しい用途を開発するための鍵となる。

【0004】

先行技術において、文書ＥＳ２７５４４７６ Ａ１に開示されているように、オレイン酸およびリン脂質から構成される超分子ゲルが記載されている。このゲルは、ｐＨ５～８の水中での脂質の希釈分散液から形成され、凍結－加熱プロセスに続いた。蛍光共焦点顕微鏡は、ゲル構造が凝集脂質小胞および脂質二重層からなることを明らかにした。前記文献に記載されているゲルはｐＨ５～８で安定であり、これらの値の間に含まれるｐＨを有する媒体へのそれらの適用を制限し、強酸性または塩基性の媒体において有用ではない。

【0005】

適用範囲を広げるために、本発明は、２～１３のより広い範囲のｐＨでそれらのレオロジー特性を維持する安定な脂質ゲルを提案する。その意味で、例えば、ｐＨが１～４の範囲である胃適用に使用することができる。

【0006】

以下の先行技術文献は、言及するに値する：
－ 「陽イオン性および両性イオン性リン脂質の混合物中の相互指状ゲル相」Ｅｒｉｃ ＡＳｍｉｔｈ、Ｐｈｏｅｂｅ Ｋ Ｄｅａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９６ （２０１５） ８６－９１；および
－ 「リン脂質－陽イオン性脂質相互作用：膜および小胞特性への影響」Ｒｏｂｅｒｔ ＢＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｓａｔｈｙａｍａｎｇａｌａｍ ＶＢａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｒｏｂｅｒｔ ＭＳｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ．。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ａｃｔ １５１２ （２００１） ２７－３９。

【0007】

この２つの文献はゲル相に言及しており、本節の第１段落で定義されるように、巨視的レベルでのゲル挙動を有する材料に言及していない。

【0008】

脂質膜の組織化に関連する異なる相が、前記２つの言及された論文に記載されている。これらの相の中には、いわゆるゲルまたは結晶固相および液晶相（とりわけ）がある。

【0009】

ゲルまたは結晶固相における組織化は、システムがゲルのように巨視的に挙動することを意味せず、むしろ炭化水素鎖が分子レベルで充填され、システムを形成する膜に、より高い剛性を与えることを意味する。使用される用語、すなわち「ゲル」は同じであるが、前記文献に記載されるゲル相は、その構造のために、それらが意図される用途に適した巨視的なゲル挙動およびレオロジー特性を示す本発明の脂質ゲルとは全く関係がない。実際、前記２つの論文で言及されている脂質混合物は、希釈された分散液、または直接的にリポソームと呼ばれ、これは、それらが液状溶液であることを意味する。

【0010】

〔発明の説明〕
本発明の目的は、相互接続されたシートおよび小胞の三次元ネットワークからなるナノ構造脂質ヒドロゲルである。

【0011】

「脂質ヒドロゲル」という用語は、その主成分が水であるが、脂質をさらに含むゲルを指す。脂質は、水性マトリックス内のシートおよび小胞の形態の構造にグループ化されるか、または配列される。

【0012】

本発明の文脈において、ヒドロゲルに関して「ナノ構造化された」という用語は、１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法で組織化されたゲルタイプのレオロジー挙動を有する材料に関するものとして理解されるべきである。それはまた、マイクロスケールで組織化されることも観察されている。すなわち、それらは、ナノスケールおよびマイクロスケールの両方で組織化される。

【0013】

本発明のヒドロゲルは、その弾性係数値Ｇ’が、広範囲の周波数（好ましくは、０．０１～１０Ｈｚ）における粘性係数Ｇ’’の値よりも高いので、ゲル挙動を示す。

【0014】

先行技術において知られている他のゲルとは異なり、本発明のナノ構造化ヒドロゲルは低脂質含量で形成することができ、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸または脂肪アルコールの介在は、分散を促進するために必要とされない。

【0015】

本発明の第１の態様は、以下を含むことを特徴とする、相互接続されたシートおよび小胞の三次元ネットワークからなるナノ構造脂質ヒドロゲルに関する：
－ 少なくとも１つの両性イオン性リン脂質を含む、３重量％～３０重量％の脂質、
－ ７０重量％～９７重量％の水、
を含み、前記ヒドロゲルが、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸または脂肪アルコールを含まない。

【0016】

リン脂質は、２つの化学的に異なる部分：親水性極性頭部、および１つまたは２つの疎水性炭化水素鎖から構成される両親媒性分子である。リン脂質の極性頭部の性質に応じて、これらは、カチオン性、アニオン性および両性イオン性リン脂質として分類することができる。両性イオン性リン脂質は、異なる原子上に正および負の形式電荷を有し、それらが見出される溶液のｐＨに応じて、正味の電荷を獲得することができる。

【0017】

本発明において、「界面活性剤」という用語は、水－空気界面の表面張力を低下させ、臨界ミセル濃度を示すことができる、すなわち、水中で自発的にミセルを形成する、合成化合物を指す。本発明によれば、「界面活性剤」という用語は、リン脂質を含まない。

【0018】

本発明において、「ポリマー」という用語は、共有結合の手段により、単量体と呼ばれる少なくとも５個のシンプル単位（これらは、互いに同一であっても異なっていてもよい）が結合して形成される化合物を意味する。

【0019】

「脂肪酸」という用語は、最低４個の炭素を有する直鎖炭化水素鎖を有するモノカルボン酸を指し、飽和または不飽和であり得る。

【0020】

「長鎖アルコール」とも呼ばれる「脂肪アルコール」という用語は、少なくとも１つの第一級ヒドロキシル基を含有し、最低５個の炭素を有する直鎖状炭化水素鎖を有する脂肪族炭化水素を指し、飽和または不飽和であり得る。

【0021】

好ましい実施形態において、本発明のヒドロゲルは、以下からなる：
－ 少なくとも１つの両性イオン性リン脂質を含む、３重量％～３０重量％の脂質、
－ ７０重量％～９７重量％の水。

【0022】

本発明の方法の好ましい実施形態では、脂質：水の重量比は、５：９５である。

【0023】

好ましい実施形態において、両性イオン性リン脂質は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含むリストから選択される。より好ましくは、両性イオン性リン脂質は、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ、また、水素化（大豆）Ｌ－α－ホスファチジルコリンとも呼ばれる）である。

【0024】

好ましい実施形態において、脂質は、両性イオン性リン脂質に加えて、アニオン性またはカチオン性脂質を含む。この場合、両性イオン性リン脂質とアニオン性またはカチオン性脂質とのモル比は、好ましくは、１００：１～３：１、より好ましくは、８０：１～３：１、さらにより好ましくは、２０：１である。

【0025】

好ましい実施形態において、カチオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）である。

【0026】

好ましい実施形態において、アニオン性脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）である。

【0027】

好ましい実施形態において、ヒドロゲルはまた、有効成分、例えば、スフィンゴ脂質、コレステロール、抗酸化剤、薬物（例えば、抗生物質、抗炎症剤）、タンパク質またはそれらの組み合わせを含む。

【0028】

本発明によれば、「有効成分」という用語は、疾患の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防において薬理学的活性もしくは他の異なる効果を潜在的に提供するか、または対象の身体の構造もしくは機能に有益に影響を及ぼす、任意の成分を指す。本発明のヒドロゲルに含まれ得る有効成分は、親油性または親水性化合物であり得る。

【0029】

ヒドロゲル中の有効成分の重量比率は、ゲルの総重量に対して０～２０重量％の間で変動し得る。

【0030】

好ましい実施形態において、本発明のヒドロゲルは、以下からなる：
－ 少なくとも１つの両性イオン性リン脂質を含む、３重量％～３０重量％の脂質、
－ ７０重量％～９７重量％の水、
－ ０重量％～２０重量％の有効成分。

【0031】

本発明の脂質ヒドロゲルの構造および流動性は、温度およびｐＨに可逆的に応答し、皮膚内および毛包内に、少なくとも１つの親水性物質を輸送することができる。それらの特定の組織は、水の一部が小胞に捕捉され、これらの小胞が延長されたシートの間に捕捉またはインターカレートされ、異なる極性の性質の分子を異なる区画に組み込むためのシステムとして非常に適している。それらの排他的な脂質組成は、高い生体適合性を保証し、それらのレオロジー挙動は、それらを皮膚、目または粘膜に容易に適用できるようにする。

【0032】

本発明者らが提供する実施例において実証した通り、本発明に記載されるヒドロゲルは、ｐＨ２～１３の極めて広いｐＨ範囲において安定である。そのために、例えば、それらは、ｐＨが１～４の範囲であり得る胃適用に使用することができる。

【0033】

さらに、前記ゲルは、粘性係数Ｇ’’および弾性係数Ｇ’の値が経時的に変化しないままであるので、添加剤を添加する必要がなく、それらのレオロジー挙動を維持しながら経時的に安定であることが証明されている。

【0034】

上述のように、本発明のヒドロゲルは、その弾性係数Ｇ’値が広範囲の周波数における粘性係数Ｇ’’値よりも大きいため、ゲル挙動を示す。

【0035】

本発明の別の態様は、本発明の第１の態様に記載のナノ構造脂質ヒドロゲルを調製するための製造方法であって：
－ ポリマー、界面活性剤、脂肪アルコールまたは脂肪酸を介さずに、脂質を水中に分散させる工程、
－ 前工程で得られた脂質分散液からヒドロゲルを形成する工程であり、該方法は、ポリマー、界面活性剤、脂肪アルコールまたは脂肪酸の介在なしに実施され、前記ヒドロゲルの形成が以下のサブ工程を含むことを特徴とする：
－ 分散液中に存在する少なくとも１つの脂質が、正または負の正味の電荷を獲得するか、または当該電荷を維持するように、脂質分散液のｐＨを２～１３に調整する工程、
－ ｐＨを調整した前記分散液を、－２０℃以下の温度に１分間以上凍結する工程、
－ 前記分散液を５℃～９０℃の温度まで解凍および加熱する工程、
－ 前記サブ工程からのゲル化分散液を室温で冷却する工程、を含む、製造方法に関する。

【0036】

脂質の水中への分散は、好ましくは、対応する脂質を有機溶媒中で指定された濃度およびモル比で混合し、その蒸発をロータリーエバポレーター中で行い、続いて、乾燥し、撹拌条件下、室温で所定濃度範囲の水を加えて水和することにより行われる。

【0037】

使用される有機溶媒は、使用される脂質に応じて、クロロホルム、メタノール、エタノール、それらの混合物等であり得る。好ましくは、有機溶媒はクロロホルムである。

【0038】

２～１３の間の脂質分散液のｐＨの調整は、例えば、塩酸または水酸化ナトリウム溶液を用いて、酸性または塩基性溶液を添加することにより行われる。

【0039】

少なくとも１つの脂質が荷電されるように分散液を調整しなければならないｐＨ値は、分散液中に存在する脂質（lipid）もしくは脂質（lipids）に基づいて、当業者が容易に決定することができるものである。正の脂質が存在する場合、正の脂質は好ましくは中性または塩基性ｐＨに調整され；負の脂質が存在する場合、負の脂質は中性または酸性に調整され、その結果、正の脂質および負の脂質は、それらの電荷を保持する。双性イオン性脂質のみが存在する場合、ｐＨは脂質がイオン化されるように、酸性および塩基性ｐＨの両方に調整することができる。

【0040】

最後に、本発明の第３の態様は、有効成分放出系として、または皮膚および粘膜の保護剤として、より好ましくは、胃保護剤としての、本発明の第１の態様に記載のヒドロゲルの使用に関する。

【0041】

ヒドロゲルは、皮膚、粘膜または眼、ならびに経口適用のためのものであり得る。

【0042】

本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、「含む」という単語およびその変形は、他の技術的特徴、添加剤、構成要素または工程を排除することを意図しない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点および特徴は、本発明の説明および実施形態の両方から部分的に導き出すことができる。以下の実施例および図面は、例示のために提供され、本発明を限定することを意図するものではない。

【0043】

〔図面の簡単な説明〕
図１．ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの共焦点顕微鏡画像、ｘ１０（Ａ、ＢおよびＣ）およびｘ６３（Ｄ、ＥおよびＦ）の倍率、３：１サンプル（ＡおよびＤ）、２０：１サンプル（ＢおよびＥ）、ならびに８０：１サンプル（ＣおよびＦ）。蛍光シグナル（明領域）は、蛍光プローブの組み込みに起因して脂質相から生じ、暗領域は水に対応する。矢印は、ラメラ構造を示す。

【0044】

図２．３：１ ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの拡大画像。矢印は、ラメラ構造を示す。

【0045】

図３．２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの構造。矢印は、ラメラ構造を示す。

【0046】

図４．異なるモル比を有するＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルを比較する振動周波数掃引試験。

【0047】

図５．ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルをＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルと比較する振動周波数掃引試験。

【0048】

図６．異なるｐＨでのゲルのレオロジー挙動。

【0049】

図７．２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの経時安定性。

【0050】

図８．異なるモル比でのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルのＳＡＸＳ（Ａ）およびＷＡＸＳ（Ｂ）スペクトル。

【0051】

図９．異なるモル比でのＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルのＳＡＸＳ（Ａ）およびＷＡＸＳ（Ｂ）スペクトル。

【0052】

図１０．５重量％のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ脂質組成（３：１のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰモル比）および９５％の水を用いて実施例１で調製したヒドロゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。三次元網目構造を形成するシートおよび小胞は、前記画像において見ることができる。小胞と適合性のある構造と絡み合った折り畳まれたシートは、円で囲まれた領域に見ることができる。

【0053】

図１１．異なるｐＨおよび／または組成で形成された３つのゲル：ｐＨ１１．５でのＨＳＰＣゲル、ｐＨ２．５でのＨＳＰＣゲルおよびｐＨ７での２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの画像を示す。３つのゲルは、本発明の実施例１に記載のプロトコールに従って、５％脂質濃度で形成された。ゲルは、エッペンドルフ管内部の重力の影響のために移動しないため、厳格なゲル挙動が裸眼で観察される。

【0054】

図１２．５％脂質で形成された３つのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルを有する画像を示す。ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰモル比は、３：１、２０：１および８０：１である。２０：１ゲルが最も剛性であり、３：１ゲルはエッペンドルフチューブを回転させるときに、経時的により容易に流れることが分かる。画像はまた、共焦点顕微鏡の手段による脂質構造の違いを示し、灰色は脂質に対応し、黒色は水分に対応する。

【0055】

図１３．実施例５によるｐＨ２でのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの胃消化処理のシミュレーション。０．５ｍｌのゲルを酸性溶液に加えたモーメントを左の画像に見ることができる。右の写真は、３７℃で２時間撹拌した後のゲルの状態を示している。

【0056】

〔実施例〕
次に、本発明の生成物の有効性を実証する、本発明者らによって実施されたアッセイの手段によって、本発明を説明する。

【0057】

実施例１：本発明による脂質ヒドロゲルの調製
実施例１．１．：５重量％の総脂質を有し、かつ８０：１、２０：１および３：１のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰモル比を有する、ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ組成物を有するヒドロゲル
材料
水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）および１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。クロロホルムは、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ＤＯＰＳ）は、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨから購入した。

【0058】

脂質ゲルの調製
まず、ＨＳＰＣとＤＯＴＡＰとの水分散液を形成し（前記脂質のモル比を３：１、２０：１、および８０：１に設定）、前記脂質をクロロホルムに溶解させた後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を蒸発させて脂質膜を形成し、総脂質濃度が５質量％になるまで水を加えた。次に、０．１重量％ＮａＯＨ溶液を添加することによってｐＨを７に調整した。ゲルを形成するために、水溶液脂質分散液を、最初に密閉バイアル中に－２０℃で２時間保存し、試料を完全に凍結させた。次いで、全ての分散液が透明になるまで、試料を７０℃で１０分間加熱した。ゲルを室温に冷却し、測定前に冷蔵庫（５℃）に２４時間保存した。ゲル化および水分離の欠如は、バイアルを反転させることによって確認した。

【0059】

実施例１．２．：総脂質が５重量％であり、かつＨＳＰＣ／ＤＯＰＳモル比が８０：１、２０：１および３：１である、ＨＳＰＣ／ＤＯＰＳ組成を有するヒドロゲル
ＨＳＰＣ／ＤＯＰＳ組成を有するヒドロゲルを、ＤＯＴＡＰの代わりにＤＯＰＳを用いて、実施例１．１と同じ方法に従って調製した。

【0060】

実施例１．３．：脂質としてリン脂質ＨＳＰＣのみを５重量％で含むヒドロゲル
このヒドロゲルは前の場合と同様に調製したが、脂質としてＨＳＰＣのみを使用し、１つの場合にはｐＨを２．５に、別の場合にはｐＨを１１．５に調整した（同じ組成の２つのゲルを異なるｐＨで調製した）。

【0061】

実施例２：ゲルの共焦点顕微鏡試験
この技術では、ゲルの微細構造およびそれが水性媒体中でどのように組織化されるかを観察することができる。異なる形態およびサイズを有する構造の形成、ならびにゲルマトリックス中の前記構造間の相互接続を検出することができる。

【0062】

実施例１で調製した以下のヒドロゲルを用いて、蛍光共焦点顕微鏡試験を実施した：８０：１、２０：１および３：１の比率のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ；並びに２０：１の比率のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳ。

【0063】

２．１．試験方法
ゲルの脂質部分を標識するために、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）からの蛍光プローブ１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）を使用した。プローブの最終濃度は、ゲル構造を妨害することなく十分な蛍光強度を有するように、全てのサンプルにおいて０．００５重量％であった。

【0064】

５６１ｎｍのＤＰＳＳレーザーを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡をローダミンＢ励起のために使用した。１０Ｘ ０．４ＮＡ対物レンズおよび６３Ｘ １．４ＮＡグリセロール浸漬対物レンズを用いて画像を得た。画像は、ＩｍａｇｅＪ １．５２ｄソフトウェア（Ｊ．Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ９（２０１２）６７６）を用いて処理した。

【0065】

２．２．結果と結論
ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰおよびＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの微細構造を形成する脂質の組織は、それぞれ図１および図２に見ることができる。脂質はグレースケールで現れ、水は黒色で現れる。

【0066】

図１では、低倍率の画像（上の図）により、ゲル中で予想されるように、空間の大部分を占める相互に連結した凝集体中で脂質がどのように組織化されているかを見ることができる。高倍率画像（下の図）は、これらの脂質ドメインが直径約５～２０ｎｍの脂質シート（矢印で示す）および小胞様球状粒子の凝集体によってどのように形成されるかを示す。

【0067】

図２は、図３Ｄに示される３：１ ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの構造をより詳細に示す。これらの相互接続されたシートおよび小胞は、ここで明確に見ることができる。

【0068】

図３は、２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの画像を示しており、このゲルでは、これらの相互接続されたシートおよび小胞も見ることができる。

【0069】

実施例３．ゲルのレオロジー試験
レオロジーは、ゲルの巨視的特性を記載することを可能にする。以下に記載されるレオロジー試験では、振動応力に対する材料の応答が決定され、可変弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ’’）が決定される。ゲル挙動を示す材料では、Ｇ’で測定される弾性が、所定の周波数範囲についてＧ’’で決定される消散エネルギーまたは粘性挙動よりも大きい。

【0070】

実施例１で調製した以下のヒドロゲルを用いて試験を行った：８０：１、２０：１および３：１の比率のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ；ならびに２０：１の比率のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳ。

【0071】

３．１．試験方法
ペルチェ温度制御システムを備えたＡＲ－Ｇ２制御応力レオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて振動試験を行うことにより、ゲルのレオロジー挙動を試験した。測定は、ＩＣＴＳ ＮＡＮＢＩＯＳＩＳにおける、ＣＩＢＥＲ－ＢＢＮのナノ構造液体ユニット（Ｕ１２）によって行った。直径４０ｍｍ、コーン角４°、およびギャップ１０５μｍのコーンプレート形状を使用した。試料を２５℃で評価し、溶媒トラップを用いて試料の乾燥を防止した。各々の振動計測に先立ち、ゲルを１０秒間１０^－１で予備切断し、均一な状態を得た。次に、各点で応力応答を測定しながら、試料を正弦波剪断変形に供した。データは、ＴＲＩＯＳソフトウェア（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて分析した。試料の粘弾性挙動は、複素弾性係数Ｇ^＊＝τ／γによって記述された（ここで、τはせん断応力であり、γはせん断変形である。）。適用された振動応答と得られた振動応答との間の位相角δを用いて、ソフトウェアは、ベクトルＧ^＊の弾性係数Ｇ’および粘性係数Ｇ’’を以下のように決定した：
Ｇ’＝ Ｇ^＊ｃｏｓ δ
Ｇ’’＝ Ｇ^＊ｓｉｎ δ
弾性係数Ｇ’は貯蔵エネルギーに関連し、一方、粘性係数Ｇ’’は、消散エネルギーを表す。

【0072】

３．２．結果と結論
これらの試験において、試料の弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ’’）は、一定の周波数範囲の変形を適用することによって測定される。これにより、加えられた変形が持続する時間に応じて、材料がどのように挙動するかを見ることができる。

【0073】

３．２．１．ゲル挙動試験
図４および図５において、すべてのゲルにおいて、弾性係数（Ｇ’）は周波数の全範囲において粘性係数（Ｇ）よりも高いことが分かる。これは、材料がゲル様の巨視的挙動を示すことを示す。これらの材料において予想されるように、Ｇ’およびＧ’’は、高周波数で増加する（急速な変形）。これは、サンプルの内部構造は加えられる変形に適応する時間がより短く、それ故、それに対してより大きな抵抗があるためである。

【0074】

表１は、ＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルおよびＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの２０：１のモル比における、図５からのＧ’およびＧ’’値の差を示す。ＤＯＴＡＰゲルは、より高いＧ’およびＧ’’値を示すので、ＤＯＴＡＰゲルが変形に対してどのように最も抵抗性であるかを見ることができる。同様に、ＤＯＴＡＰゲルは、低周波数でより低い位相角（Ｇ’’／Ｇ’比率）を有し、ＤＯＰＳゲルと比較して、構造の弾性挙動のより大きな優位性を示す。したがって、使用される脂質組成に応じて、異なるレオロジー特性を有するゲルを得ることができ、相互接続された小胞およびシートによって形成される構造を維持することができると推定できる。この事実は、最終用途に応じて異なるレオロジー挙動を有する材料を調製することが可能であるので、極めて多様な用途を可能にする。さらに、前述の脂質組成を使用することによって、他のタイプの分子の存在は、ゲルを得るために必要ではないことが見出された。

【0075】

【表1】

【0076】

３．２．２．ｐＨ安定性
ゲルを酸性、中性および塩基性ｐＨ（それぞれ、３、６．５および１０．５）で調製した場合、同じゲル挙動を図６に観察することができる。試験した異なる組合せを表２に示す。

【0077】

【表2】

【0078】

３．２．３．経時安定性
安定性に関して、これらのゲルは、経時的に安定であることが見出された。図７は、密閉容器内に５℃で保管された２０：１ ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルにおいて、３ヶ月後にゲルの同じレオロジー挙動がどのように維持されるかを示す。

【0079】

実施例４．Ｘ線散乱研究
Ｘ線散乱は、散乱角に基づいて試料中の散乱Ｘ線の強度を測定する分析技術である。Ｂｒａｇｇの法則から、散乱角が低下するにつれ、より大きな構造特性が解析されることが理解される。

【0080】

小角Ｘ線散乱信号（ＳＡＸＳ）は、材料がナノメートルスケール、一般に１～１００の範囲の構造特性を含む場合に観察される。一方、広角Ｘ線散乱（ＷＡＸＳ）は、原子間距離およびより小さい距離として、はるかに小さい長さスケールで材料中の構造を分析する。

【0081】

本発明のための実験において、これらの技術は、ゲルを形成するシートおよび小胞の脂質二重層のナノ構造（ＳＡＸＳ）、ならびに脂質間の側方充填（ＷＡＸＳ）の検出を可能にする。

【0082】

実施例１で調製した以下のヒドロゲルを用いて試験を行った：８０：１、２０：１および３：１の比のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ、ならびに８０：１、２０：１および３：１の比のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳ。

【0083】

４．１．試験方法
Ｘ線散乱測定は、ＡＬＢＡのＢＬ１１－ＮＣＤ－ＳＷＥＥＴビームライン（Ｃｅｒｄａｎｙｏｌａ ｄｅｌ Ｖａｌｌeｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）でシンクロトロン放射を用いて行った。試料を、１．５ｍｍガラスキャピラリーに装填し、Ｌｉｎｋａｍチャンバーに入れ、これを用いて温度を２５℃に制御した。試料を、１２．４ ｋｅＶのエネルギーを有するＸ線ビームと整列させた。小角（ＳＡＸＳ）測定値を、試料から２．７１ｍに配置された１Ｍ Ｐｉｌａｔｕｓ検出器を用いて取得し、広角（ＷＡＸＳ）測定値を、０．１３４ｍに配置されたＲａｙｏｎｉｘ ＬＸ２５５－ＨＳ検出器を用いて取得した。スペクトルは、５秒の取得時間で収集した。

【0084】

４．２．結果と結論
分子レベルでの脂質構造の組織化を試験するために、シンクロトロン放射を用いたＸ線散乱技術を用いた。図８および図９は、それぞれ、ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰおよびＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの小さい角度（ＳＡＸＳ）および大きい角度（ＷＡＸＳ）における散乱パターンを示す。使用したモル比は８０：１、２０：１および３：１であった。

【0085】

ＳＡＸＳパターン（図８Ａおよび図９Ａ）が、ｑ＝１ｎｍ^－１を中心とする主バンドと、それに続くｑ＝２．４および３．６ｎｍ^－１上に位置する２つの非常に小さな高調波を有することが分かる。このタイプのパターンは、脂質二重層によって形成される系の特徴であり、ほとんど相関がない。したがって、この散乱パターンは、二重層間の距離が約６ｎｍで可変である単層小胞および脂質シートから主になるシステムと適合する。対照的に、それが多層系であり、ほとんどの脂質が、それらの間に規則的な距離を有する密接に間隔を置いた二重層で組織化される場合、狭い等距離のバンドを有する散乱パターンが得られ得る。

【0086】

ＷＡＸＳパターンは、脂質二重層を構成する分子の側方充填を試験することを可能にする。図８Ｂおよび図９Ｂでは、１５ｎｍ^－１を中心とする小さなバンドが４．２ｎｍの脂質分子間の横方向の離隔に対応するスペクトルで見られ、これは斜方晶または六方晶充填に対応する。２０～２２ｎｍ^－１で生じる低輝度広バンドは、おそらくサンプル水分によって生成される信号に起因するので、考慮すべきではないことに言及することが重要である。

【0087】

実施例５．胃安定性試験
異なるｐＨ、極端な酸性および塩基性ｐＨにおいてさえ、安定であるゲルの能力は、極めて広い適用範囲を可能にする。例えば、それらは、ｐＨが１～４の範囲であり得る胃適用において使用され得る。２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルを、胃消化をシミュレートするインキュベーションに供した。この試験では、ｐＨ２の生理食塩水をＨＣｌおよびＮａＣｌで調製し、次いでゲルを添加し、３７℃で２時間、前後に撹拌した。ゲルの一部が攪拌により、小さな断片に粉砕されたが、溶解することなくゲルの外観を維持することが観察された（図１３）。これは、制御された薬物送達剤として、または潜在的な胃保護剤としてのゲルの使用を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0088】

【図1】ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの共焦点顕微鏡画像、ｘ１０（Ａ、ＢおよびＣ）およびｘ６３（Ｄ、ＥおよびＦ）の倍率、３：１サンプル（ＡおよびＤ）、２０：１サンプル（ＢおよびＥ）、ならびに８０：１サンプル（ＣおよびＦ）。蛍光シグナル（明領域）は、蛍光プローブの組み込みに起因して脂質相から生じ、暗領域は水に対応する。矢印は、ラメラ構造を示す。

【図2】３：１ ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの拡大画像。矢印は、ラメラ構造を示す。

【図3】２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの構造。矢印は、ラメラ構造を示す。

【図4】異なるモル比を有するＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルを比較する振動周波数掃引試験。

【図5】ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルをＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルと比較する振動周波数掃引試験。

【図6】異なるｐＨでのゲルのレオロジー挙動。

【図7】２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの経時安定性。

【図8】異なるモル比でのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルのＳＡＸＳ（Ａ）およびＷＡＸＳ（Ｂ）スペクトル。

【図9】異なるモル比でのＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルのＳＡＸＳ（Ａ）およびＷＡＸＳ（Ｂ）スペクトル。

【図10】５重量％のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰ脂質組成（３：１のＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰモル比）および９５％の水を用いて実施例１で調製したヒドロゲルの共焦点顕微鏡画像を示す。三次元網目構造を形成するシートおよび小胞は、前記画像において見ることができる。小胞と適合性のある構造と絡み合った折り畳まれたシートは、円で囲まれた領域に見ることができる。

【図11】異なるｐＨおよび／または組成で形成された３つのゲル：ｐＨ１１．５でのＨＳＰＣゲル、ｐＨ２．５でのＨＳＰＣゲルおよびｐＨ７での２０：１のＨＳＰＣ／ＤＯＰＳゲルの画像を示す。３つのゲルは、本発明の実施例１に記載のプロトコールに従って、５％脂質濃度で形成された。ゲルは、エッペンドルフ管内部の重力の影響のために移動しないため、厳格なゲル挙動が裸眼で観察される。

【図12】５％脂質で形成された３つのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルを有する画像を示す。ＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰモル比は、３：１、２０：１および８０：１である。２０：１ゲルが最も剛性であり、３：１ゲルはエッペンドルフチューブを回転させるときに、経時的により容易に流れることが分かる。画像はまた、共焦点顕微鏡の手段による脂質構造の違いを示し、灰色は脂質に対応し、黒色は水分に対応する。

【図13】実施例５によるｐＨ２でのＨＳＰＣ／ＤＯＴＡＰゲルの胃消化処理のシミュレーション。０．５ｍｌのゲルを酸性溶液に加えたモーメントを左の画像に見ることができる。右の写真は、３７℃で２時間撹拌した後のゲルの状態を示している。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【国際調査報告】