特表 2023-548948 エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含有するエルゴチオネイン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-21

(54)【発明の名称】エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含有するエルゴチオネイン組成物

(51)【国際特許分類】

   C07D 233/84 20060101AFI20231114BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20231114BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 31/4172 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20231114BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20231114BHJP

   C12P 13/04 20060101ALN20231114BHJP

【ＦＩ】

C07D233/84

A23L33/17

A61P43/00 111

A61P43/00 107

A61K31/4172

A61K47/36

A61K47/26

A61K9/14

C12P13/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023529006

(86)(22)【出願日】2021-11-09

(85)【翻訳文提出日】2023-05-10

(86)【国際出願番号】 CN2021129504

(87)【国際公開番号】W WO2022100567

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】202011249538.8

(32)【優先日】2020-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521282033

【氏名又は名称】ブルーメイジ バイオテクノロジー コーポレイション リミティド

(71)【出願人】

【識別番号】523174217

【氏名又は名称】ブルーメイジ バイオテック（ティアンジン）コーポレイション リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】魏玉潔

(72)【発明者】

【氏名】陸震

(72)【発明者】

【氏名】陳清平

(72)【発明者】

【氏名】李杰

(72)【発明者】

【氏名】孫元軍

(72)【発明者】

【氏名】謝文娟

(72)【発明者】

【氏名】杜冉冉

(72)【発明者】

【氏名】郭文逸

(72)【発明者】

【氏名】郭学平

【テーマコード（参考）】

4B018

4B064

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018MD19

4B018MD29

4B018MD42

4B018MD82

4B018ME06

4B018MF06

4B018MF13

4B064AE03

4B064CA07

4B064CC15

4B064CE16

4B064DA01

4B064DA10

4C076AA30

4C076BB01

4C076CC21

4C076CC26

4C076DD67

4C076DD67Q

4C076EE37

4C076EE37Q

4C076FF01

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC38

4C086GA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA43

4C086MA52

4C086NA03

4C086ZB22

4C086ZC21

(57)【要約】

本願は、エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含むエルゴチオネイン安定化用の添加剤、及びエルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩及びトレハロースを含む組成物を提供する。本発明によるヒアルロン酸又はその塩及びトレハロースは、他の補助材料と比較して、高温によるエルゴチオネインの破壊を著しく軽減し、エルゴチオネイン粉末製品の収率を向上させることができる。本発明により得られる組成物は、優れた抗酸化作用及び抗アポトーシス効果を有する。ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを複合化したものを補助材料とした組成物は、ヒアルロン酸又はその塩又はトレハロース単独を補助材料とした組成物よりも、細胞内活性酸素フリーラジカルの抑制・除去効果が著しく高い。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用。

【請求項2】

前記ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースはエルゴチオネインの熱安定性を向上させるために使用されることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａであることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項4】

ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含むことを特徴とするエルゴチオネイン安定化用の添加剤。

【請求項5】

ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを含み、前記ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとの質量比が１：９９～５０：５０、好ましくは１：１９～１：１０であることを特徴とする請求項４に記載の添加剤。

【請求項6】

前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａであることを特徴とする請求項４に記載の添加剤。

【請求項7】

エルゴチオネイン発酵液を噴霧乾燥処理するための補助材料として用いられることを特徴とする請求項４に記載の添加剤。

【請求項8】

エルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩、及びトレハロースを含むことを特徴とする組成物。

【請求項9】

重量部として、エルゴチオネインは１重量部、ヒアルロン酸又はその塩は２０～１０００重量部、好ましくは１００～１８０重量部、トレハロースは１０００～１９８０重量部、好ましくは１８００～１９００重量部であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａであることを特徴とする請求項８に記載の組成物。

【請求項11】

抗酸化効果を有することを特徴とする請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物化学の技術分野に関し、特にエルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含有するエルゴチオネイン組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

エルゴチオネイン（Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ；２－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｔａｉｎｅ）は希少なアミノ酸であり、抗酸化、紫外線保護や細胞修復の効果がある。エルゴチオネインは多くの動植物の体内に存在し、動物の生体自体で合成することはできず、食物から摂取するしかない。エルゴチオネインの製造方法は化学合成法、抽出法及び微生物発酵法の３種類がある。化学合成と抽出法によるエルゴチオネインの製造はコストが高く、安全でないなどの問題があるため、微生物発酵法によるエルゴチオネインの製造はますます注目されている。

【0003】

微生物発酵法を用いてエルゴチオネインを製造する場合、エルゴチオネイン発酵液の乾燥には噴霧乾燥法が一般的である。噴霧乾燥は噴霧で材料液を噴霧して霧滴にして高温中に分散させ、材料液に含まれる水分を急速に蒸発させる乾燥方法であり、伝熱が速く、水分蒸発が速く、乾燥時間が短いという特徴があり、しかも製品の品質が良く、組織がサクサクして、溶解性能も良く、ある製剤の溶解速度を改善することができる。一般的な噴霧乾燥補助材料はデキストリン、β－シクロデキストリン、可溶性デンプン、アエロシル、微結晶セルロース、ラクトース、マルトデキストリンである。既存の噴霧乾燥法でエルゴチオネインを乾燥する場合、エルゴチオネインが破壊されやすく、エルゴチオネインを乾燥して得られる粉末製品の収率に影響を与える。

【発明の概要】

【0004】

従来技術の問題を解決するために、本発明は、エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用、エルゴチオネイン安定化用の添加剤、及び組成物を提供する。本発明の技術的解決手段は次のとおりである。

【0005】

１．エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用。
２．前記ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースはエルゴチオネインの熱安定性を向上させるために使用される、ことを特徴とする項１に記載の使用。
３．前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａである、ことを特徴とする項１に記載の使用。
４．ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含む、ことを特徴とするエルゴチオネイン安定化用の添加剤。
５．ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを含み、前記ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとの質量比が１：９９～５０：５０、好ましくは１：１９～１：１０である、ことを特徴とする項４に記載の添加剤。
６．前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａである、ことを特徴とする項４に記載の添加剤。
７．エルゴチオネイン発酵液を噴霧乾燥処理するための補助材料として用いられる、ことを特徴とする項４に記載の添加剤。
８．エルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩、及びトレハロースを含む、ことを特徴とする組成物。
９．エルゴチオネインは１重量部、ヒアルロン酸又はその塩は２０～１０００重量部、好ましくは１００～１８０重量部、トレハロースは１０００～１９８０重量部、好ましくは１８００～１９００重量部である、ことを特徴とする項８に記載の組成物。
１０．前記ヒアルロン酸又はその塩の分子量が３ＫＤａ～３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａである、ことを特徴とする項８に記載の組成物。
１１．抗酸化効果を有する、ことを特徴とする項８に記載の組成物。

【発明の効果】

【0006】

本発明によるヒアルロン酸又はその塩及びトレハロースは、他の補助材料と比較して、高温によるエルゴチオネインの破壊を著しく軽減し、エルゴチオネイン粉末製品の収率を向上させることができる。本発明により得られる組成物は、優れた抗酸化作用及び抗アポトーシス効果を有する。ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを複合化したものを補助材料とした組成物は、ヒアルロン酸又はその塩又はトレハロース単独を補助材料とした組成物よりも、細胞内活性酸素フリーラジカルの抑制・除去効果が著しく高い。

【発明を実施するための形態】

【0007】

別段の定義がない限り、本明細書における技術的な用語及び科学的な用語は、当業者が一般に理解する意味と同じである。本明細書に記載されたものと類似又は同一の方法及び材料を、実験又は実際の応用において適用することができるが、本明細書では、材料及び方法については、以下で説明する。矛盾する場合は、本明細書に含まれているその定義は優先され、また、材料、方法及び例は単に説明に供するものであって、限定的なものではない。以下では、具体的な実施例を参照して本願をさらに説明するが、本願の範囲を限定するものではない。

【0008】

以下で使用する実験方法は特別な要求がなければ、すべて通常の方法である。

【0009】

下記に使用する材料、試薬等は、特別な説明がない限り、商業ルートから入手することができる。

【0010】

マツタケは、２０２０年１０月１６日に中国武漢市の武漢大学（郵便番号４３００７２）の中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０２０５８７となっているマツタケＳＲ－ＬＹ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ Ｍａｔｓｕｔａｋｅ ＳＲ－ＬＹ）が好ましい。

【0011】

ヤマブシタケは、２０１８年８月２３日に中国武漢市の武漢大学（郵便番号４３００７２）の中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託されたヤマブシタケ（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０１８５６７が好ましい。

【0012】

噴霧乾燥装置は、遠心式又は加圧式噴霧乾燥機である。

【0013】

本発明は、エルゴチオネインの安定化におけるヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースの使用を提供する。

【0014】

ヒアルロン酸（ＨＡ：Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）は、直鎖状のＤ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンの交互単位から形成される天然ムコ多糖類である。ヒアルロン酸は、その独特な分子構造と物理化学的性質により、生体内で多くの重要な生理学的機能を示し、特に重要なのは、特殊な保水作用を持ち、現在発見されている自然界で最も保湿性の高い物質であり、理想的な天然保湿因子（ＮＭＦ）と呼ばれている。また、ヒアルロン酸分子は空間的に剛直ならせん柱状をなしており、柱の内側には多量の水酸基が存在するため強い吸水性が生じ、一方、水酸基の連続的な配向によりヒアルロン酸分子鎖に撥水領域が形成され、これにより、ヒアルロン酸は三次元網目構造を形成する。

【0015】

トレハロースは２つのグルコース分子がヘミアセタールの水酸基を介して縮合してできたもので、遊離のアルデヒド基が存在しないため、非還元型の二糖類であり、分子式はＣ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１（結晶水を２つ含む）である。２つのグルコース分子はα－グルコピラノースとβ－グルコピラノースを形成することができるので、α－１,１グリコシド結合により連結すると、トレハロース（α,α）、イソトレハロース（β,β）、ネオトレハロース（α,β）の３つの異性体が得られ得る。トレハロースは独特な生物学的機能を持っており、過酷な環境でも細胞内生物膜と蛋白質、活性ペプチドの安定性と完全性を効果的に維持することができるので、生命の糖として称賛されており、生物製剤、医薬、食品、健康食品、精密化学工業、化粧品、飼料、農業科学などの各業界に広く使用されている。

【0016】

１つの具体的な実施形態では、前記ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースは、エルゴチオネインの熱安定性を向上させるために使用される。ここで、前記ヒアルロン酸塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、及び４級アンモニウム塩から選ばれる少なくとも１種である。

【0017】

エルゴチオネイン（Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ；２－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｂｅｔａｉｎｅ）は希少なアミノ酸であり、抗酸化、紫外線保護や細胞修復の効果がある。エルゴチオネインは多くの動植物の体内に存在し、動物の生体自体で合成することはできず、食物から摂取するしかない。

【0018】

微生物発酵法を用いてエルゴチオネインを製造する場合、エルゴチオネイン発酵液の乾燥には噴霧乾燥法が一般的である。噴霧乾燥は噴霧で材料液を噴霧して霧滴にして高温中に分散させ、材料液に含まれる水分を急速に蒸発させる乾燥方法であり、伝熱が速く、水分蒸発が速く、乾燥時間が短いという特徴があり、しかも製品の品質が良く、組織がサクサクして、溶解性能も良く、ある製剤の溶解速度を改善することができる。しかし、エルゴチオネインは高温で破壊されやすく、最終的に乾燥して得られるエルゴチオネイン粉末の収率に影響を与える。

【0019】

本発明は、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを含むエルゴチオネイン安定化用の添加剤を提供する。すなわち、前記添加剤は、ヒアルロン酸又はその塩であってもよいし、トレハロースであってもよいし、ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを任意の割合で配合したものであってもよい。ここで、前記ヒアルロン酸塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、及び４級アンモニウム塩から選ばれる少なくとも１種である。

【0020】

１つの具体的な実施形態では、前記添加剤は、ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを含む。前記ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとの質量比は１：９９～５０：５０、例えば１：９９、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１９、１：１０であってもよく、好ましくは１：１９～１：１０である。

【0021】

１つの具体的な実施形態では、前記添加剤中のヒアルロン酸又はその塩の分子量は３ＫＤａ～３０ＫＤａ、例えば３ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａ、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａであってもよい。

【0022】

１つの具体的な実施形態では、前記添加剤はエルゴチオネイン発酵液を噴霧乾燥処理するための補助材料として用いられる。ここで、エルゴチオネイン発酵液は、如何なる先行技術にも存在する微生物の発酵液であってもよい。例えばマツタケやヤマブシタケなどのエルゴチオネイン発酵液である。

【0023】

好ましくは、前記噴霧は遠心式又は加圧式噴霧乾燥であり、吸気温度は１５０℃～２００℃、排気温度は５０℃～１００℃である。

【0024】

好ましくは、前記エルゴチオネイン含有発酵液には、１～３０％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）の補助材料が添加されている。

【0025】

本発明は、エルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩、及びトレハロースを含む組成物も提供する。前記組成物は、優れた抗酸化作用及び抗アポトーシス効果を有する。また、ヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを複合化したものを補助材料とした組成物は、ヒアルロン酸又はその塩又はトレハロース単独を補助材料とした組成物よりも、細胞内活性酸素フリーラジカルの抑制・除去効果が著しく高い。ここで、前記ヒアルロン酸塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、及び４級アンモニウム塩から選ばれる少なくとも１種である。

【0026】

１つの具体的な実施形態では、前記組成物において、エルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩、及びトレハロースの質量比が１：（２０～１０００）：（１０００～１９８０）である。例えば、１：２０：１０００、１：２０：１５００、１：２０：１９８０、１：１００：１０００、１：１００：１５００、１：１００：１９８０、１：５００：１０００、１：５００：１５００、１：５００：１９８０、１：１０００：１０００、１：１０００：１５００、１：１０００：１９８０であってもよい。重量部として、エルゴチオネインは１重量部、ヒアルロン酸又はその塩は２０～１０００重量部、例えば、２０重量部、５０重量部、１００重量部、３００重量部、５００重量部、７００重量部、１０００重量部であってもよく、好ましくは１００～１８０重量部である。トレハロースは１０００～１９８０重量部、例えば１０００重量部、１１００重量部、１２００重量部、１３００重量部、１５００重量部、１７００重量部、１８００重量部、１９８０重量部であってもよく、好ましくは１８００～１９００重量部である。１つの具体的な実施形態では、前記組成物において、ヒアルロン酸又はその塩の分子量は３ＫＤａ～３０ＫＤａ、例えば３ＫＤａ、５ＫＤａ、１０ＫＤａ、１５ＫＤａ、２０ＫＤａ、２５ＫＤａ、３０ＫＤａであってもよく、好ましくは３ＫＤａ～１０ＫＤａである。

【0027】

本発明では、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はトレハロースを用いることにより、エルゴチオネインの安定性を著しく向上させ、特にエルゴチオネイン発酵液の噴霧乾燥において高温によるエルゴチオネインの破壊を著しく軽減することができる。エルゴチオネイン発酵液を噴霧乾燥するための補助材料としてヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとを一定の割合で用いて処理すると、得られるエルゴチオネイン、ヒアルロン酸又はその塩及びトレハロースを含有する組成物は、優れた抗酸化作用及び抗アポトーシス効果を有する。特に、組成物中のヒアルロン酸又はその塩とトレハロースとの質量比が１：１９～１：１０である場合、活性酸素フリーラジカルの抑制・除去作用が最適である。

【0028】

本願の以下の実施例は、本願を実現するための具体的な実施形態を説明するためにのみ使用され、これらの実施形態は本願を限定するものとは理解されない。本願の精神的本質及び原理から逸脱しない他の変更、修飾、代替、組合せ、簡略化はすべて同等の置換方法とみなされ、本願の特許範囲内に含まれる。

【実施例】

【0029】

以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、実施例は、本発明をさらに説明し説明するためにのみ使用されるものであり、本発明を限定するために使用されるものではないことを理解されたい。

【0030】

以下の実施例で使用される実験方法は、特別な要件がない限り、従来の方法である。

【0031】

下記の実施例で使用される材料、試薬等は、特段の説明がない限り、商業的に入手することができる。

【0032】

実施例１ エルゴチオネイン組成物の製造の最適化（マツタケ発酵）
液体種子培地：３．０％（ｗ／ｖ）のラクトース、２．０％（ｗ／ｖ）のジャガイモ浸出粉、０．１％（ｗ／ｖ）のリン酸水素二カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）の硫酸ナトリウム、残量の水を、ｐＨ ４．０～４．５、１２１℃で２０ｍｉｎ滅菌した。

【0033】

発酵培地：３．０％（ｗ／ｖ）のグルコース、２．０％（ｗ／ｖ）のマルトース、１．０％（ｗ／ｖ）の牛肉エキス、１．５％（ｗ／ｖ）のトリプトン、０．０６％（ｗ／ｖ）のリン酸二水素ナトリウム、０．０００３％（ｗ／ｖ）の塩化亜鉛、０．０００５％（ｗ／ｖ）のナイアシン、０．０００１％（ｗ／ｖ）のビタミンＢ_１、残量の水を、ｐＨ ４．０～４．５、１２１℃で２０ｍｉｎ滅菌した。

【0034】

マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ Ｍａｔｓｕｔａｋｅ）ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０２０５８７菌糸体斜面菌種を液体種子培地に接種し、２３℃、２００ｒｐｍの振とう条件下で２５日間培養し、マツタケ種子液を得た。種子液を体積比５％の接種量で発酵培地に接種し、２３℃、２００ｒｐｍの振とう条件下で２５日間培養し、培養２０日目に前駆物質であるシステイン、メチオニン、ベタインをそれぞれ５ｍＭずつ補充して、発酵液を得た。発酵終了後、ホモジナイザーを用いて菌糸体発酵液を８０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ均質化した。さらに１．２μｍの微細ろ過板紙、０．２２μｍのポリエーテルサルホンフィルターエレメントでろ過除菌し、エルゴチオネイン含有溶液を得た。

【0035】

発酵液５％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）のマルトデキストリン、微結晶セルロース、３ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、５ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、１０ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、１５ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、３０ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、５０ＫＤａポリグルタミン酸ナトリウム、フコース、マンニトール、β－シクロデキストリン、ラクトース、トレハロース及びデキストリンをそれぞれ添加して、均一に混合し、遠心式噴霧乾燥機で噴霧した。噴霧乾燥に用いた吸気温度は１８０℃、排気温度は９０℃で、得られた粉末はエルゴチオネイン含有組成物であり、各組成物中のエルゴチオネイン含有量の結果は表１に示される。

【0036】

【表1】

【0037】

エルゴチオネインは高温噴霧時にある程度の破壊が避けられず、表１の結果から、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースを補助材料として得られた組成物では、エルゴチオネインの含有量はそれぞれ０．１６７％、０．１６８％、０．１６９％、０．１６５％、０．１６７％及び０．１６８％であり、他のいくつかの通常の噴霧補助材料の場合に得られた粉末より明らかに高かった。このことは、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースが他の補助材料と比較して、高温によるエルゴチオネインの破壊を明らかに軽減できることを示している。

【0038】

実施例２ エルゴチオネイン組成物の製造の最適化（ヤマブシタケ発酵）
液体種子培地：４．０％（ｗ／ｖ）のスクロース、１．５％（ｗ／ｖ）の大豆かす粉、０．２％（ｗ／ｖ）のリン酸二水素ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）の硫酸ナトリウム、残量の水をｐＨ ４．０～４．５、１２１℃で２０ｍｉｎ殺菌した、

【0039】

発酵培地：３．０％（ｗ／ｖ）のグルコース、１．５％（ｗ／ｖ）の牛肉エキス、０．０５％（ｗ／ｖ）のリン酸二水素ナトリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）の硫酸ナトリウム、０．０００３％（ｗ／ｖ）の塩化亜鉛、０．０００６％（ｗ／ｖ）のナイアシン、０．０００１％（ｗ／ｖ）のビタミンＢ_１、残量の水を、ｐＨ ４．０～４．５、１２１℃で２０ｍｉｎ滅菌した。

【0040】

ヤマブシタケ（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ ２０１８５６７菌糸体斜面種菌を液体種子培地に接種し、２３℃、２００ｒｐｍの振とう条件下で７日間培養し、ヤマブシタケ種子液を得た。種子液を体積比５％の接種量で発酵培地に接種し、２３℃、２００ｒｐｍの振とう条件下で１０日間培養し、培養５日目に前駆物質であるシステイン、メチオニン、ベタインをそれぞれ５ｍＭずつ補充して、発酵液を得た。発酵終了後、ホモジナイザーを用いて菌糸体発酵液を８０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ均質化した。さらに１．２μｍの精密ろ過板紙、０．２２μｍのポリエーテルサルホンフィルターエレメントでろ過除菌し、エルゴチオネイン含有溶液を得た。発酵液５％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）のマルトデキストリン、微結晶セルロース、３ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、５ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、１０ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、１５ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、３０ＫＤａヒアルロン酸ナトリウム、５０ＫＤａポリグルタミン酸ナトリウム、フコース、マンニトール、β－シクロデキストリン、ラクトース、トレハロース及びデキストリンをそれぞれ添加して、均一に混合し、遠心式噴霧乾燥機で噴霧した。噴霧乾燥に用いた吸気温度は１８０℃、排気温度は９０℃で、得られた粉末はエルゴチオネイン含有組成物であり、各組成物中のエルゴチオネイン含有量の結果は表２に示される。

【0041】

【表2】

【0042】

表２の結果から、エルゴチオネインの含有量は、ヤマブタケ発酵を利用し、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースを補助材料とした組成物においても、他のいくつかの一般的な噴霧補助材料の場合に得られる粉末よりも明らかに高かった。このことは、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースが噴霧時の高温によるエルゴチオネインの破壊を明らかに軽減することを示している。

【0043】

実施例３ ヒアルロン酸とトレハロースの配合比の最適化
実施例１と実施例２の結果から、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースはいずれもエルゴチオネインに対して良好な安定化作用を有することが分かった。このうち、ヒアルロン酸ナトリウムは保湿、抗炎症等の効果に優れているが、価格が高いため、低コスト化と保湿、抗炎症等の効果に優れた組成物を得ることを両立させるため、噴霧補助材料としてヒアルロン酸ナトリウム（５ＫＤａ）とトレハロースを異なる割合で配合して使用することを検討した。実施例１の発酵液を用い、発酵液を噴霧乾燥する際に、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースとの混合物を補助材料とし、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースとの質量比を１：９９～５０：５０の間に調整する。同様に発酵液５％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）の補助材料添加量で上記同様の噴霧乾燥操作の条件を用いて得られた組成物では、エルゴチオネイン含有量を表３に示す。

【0044】

【表3】

【0045】

上記の表から、ヒアルロン酸ナトリウムとトレハロースを１：９９～５０：５０の質量比で配合したものを補助材料とすることにより、噴霧時の高温によるエルゴチオネインの破壊を効果的に軽減することができる。しかし、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量が１０ＫＤａ以上の場合、分子量が大きく粘度が高いため、噴霧による粉末収率が若干低下するため、ヒアルロン酸ナトリウムの分子量は３ＫＤａ～１０ＫＤａが好ましい。

【0046】

実施例４ 組成物の抗酸化活性
１．活性酸素フリーラジカル生成への影響
サンプル溶液の調製：上記実施例で製造したサンプルＣ３、Ｃ９、Ｓ１－９をそれぞれ無血清ＤＭＥＭ培養液で０．１％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）濃度の溶液に、サンプルＳ４を０．０５％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）、０．１％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）、０．２％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）、０．３％（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）濃度の溶液にそれぞれ製造し、０．２２μｍの膜ろ過で除菌した。

【0047】

（１）活性酸素フリーラジカル除去試験
ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）プローブ溶液の調製：ＤＣＦＨ－ＤＡをＰＢＳ溶液（０．１Ｍ、ｐＨ ７．４）で希釈し、１ｍＬＰＢＳを０．３７５μＬ加えて希釈した。
対数成長期にあるＨａＣａＴ細胞を取り、５×１０^４個／ｍＬの密度で１２ウェル培養プレートに接種し、１ウェル当たり２ｍＬの細胞懸濁液とし、二酸化炭素インキュベータに入れて３７℃、５％ＣＯ_２で通常培養を２４ｈ行った。以下のように群分けして操作した。

【0048】

（１）照射群では、培養液１ｍＬを捨ててラップをかけ、２０００μＷ／ｃｍ^２の強度でＵＶＡを２～３ｈ照射し、７００μＷ／ｃｍ^２の強度でＵＶＢを７ｍｉｎ照射した。照射終了後に、古い培養液を捨て、各サンプル溶液をウェルごとに２ｍＬずつ加えた。

【0049】

（２）損傷モデル群では、照射群と同じ操作を行い、照射終了後に、古い培養液を捨て、無血清培養液をウェルごとに２ｍＬずつ加えた。

【0050】

（３）正常対照群では、通常培養を行い、照射群と同時に液を交換し、無血清培養液をウェルごとに２ｍＬずつ加えた。

【0051】

その後、１６ｈ培養を続けた後、すべての培養液を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。ウェルごとにＤＣＦＨ－ＤＡ溶液１．５ｍＬを加え、細胞インキュベータに入れて３０ｍｉｎインキュベートを続け、５ｍｉｎごとに均一に混合してプローブを十分に結合させた。プローブ液を捨て、無血清培地で２回洗浄し、１ウェル当たり無血清培地１ｍＬを加えて、３７℃で１０ｍｉｎ培養した。ＰＢＳで洗浄後、トリプシンで細胞を消化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ ３００μＬに再懸濁させ、フローサイトメトリーによりダブルチャンネル検出を行い、サンプルのローディング前に細胞をろ過し、ＦＬ１－Ｈチャンネルでは、サンプルごとに１００００個の細胞を収集した。１チャンネル（ＦＬ１－Ｈ）で得られた信号データ、すなわちＤＣＦで発生した蛍光強度又は蛍光総量からＲＯＳクリアランスを算出した。平均蛍光強度を使用してＲＯＳクリアランスを算出した。

【0052】

ＲＯＳクリアランス％＝（１－実験群蛍光強度平均値／対照群蛍光強度平均値）×１００％

【0053】

（２）活性酸素フリーラジカル抑制試験
対数成長期にあるＨａＣａＴ細胞をとり、４×１０^４個／ｍＬの密度で１２ウェル培養プレートに接種し、１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液とし、二酸化炭素インキュベータに入れて３７℃、５％ＣＯ_２で通常培養を２４ｈ行った。

【0054】

古い培養液を捨て、実験群はウェルごとにサンプル溶液２ｍＬを加え、正常対照群はウェルごとに無血清培養液２ｍＬを加え、２４ｈ培養を持続した後に照射し、正常対照群はアルミホイルで覆って照射しなかった。

【0055】

照射群は培地１ｍＬを捨ててラップをかけ、２０００μＷ／ｃｍ^２の強度でＵＶＡを１ｈ照射し、７００μＷ／ｃｍ^２の強度でＵＶＢを３ｍｉｎ照射し、正常対照群は照射しなかった。培地を捨て、ＰＢＳで２回洗浄した。ウェルごとＤＣＦＨ－ＤＡ に１．５ｍＬを加え、細胞インキュベータに入れて３０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに１回均一に混合して、プローブを十分に結合させた。プローブを捨て、予熱した無血清培地で２回洗浄し、１ウェル当たり無血清培地１ｍＬを加えて、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシンで細胞を消化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ ３００μＬに再懸濁させ、フローサイトメトリーによりダブルチャンネル（サンプルのローディング前の細胞はろ過が必要）を行い、ＦＬ１－Ｈチャンネルでは、サンプルごとに１００００個の細胞を収集した。１チャンネル（ＦＬ１－Ｈ）で得られた信号データ、すなわちＤＣＦで発生した蛍光強度又は蛍光総量からＲＯＳ抑制率を算出した。平均蛍光強度を用いてＲＯＳ抑制率を算出した。

【0056】

ＲＯＳ抑制率％＝（１－実験群蛍光強度平均値／対照群蛍光強度平均値）×１００％

【0057】

得られた各サンプルのＲＯＳクリアランスと抑制率の結果を表４と表５に示す。

【0058】

【表4】

【0059】

【表5】

【0060】

表４の結果から、本発明により得られるエルゴチオネイン組成物では、優れた抗酸化効果を有し、また、ヒアルロン酸塩とトレハロースを複合したものを補助材料とした組成物は、ヒアルロン酸塩又はトレハロース単独を補助材料とした組成物よりも、細胞内活性酸素フリーラジカルの抑制及び除去効果が著しく高い。また、ヒアルロン酸塩とトレハロースの添加割合が１：１９～１：１０の場合、活性酸素フリーラジカルの抑制と除去作用が最も顕著であった。表５の結果から、サンプルＳ４は０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％の濃度範囲内で、０．１％濃度ではエルゴチオネインは紫外損傷による細胞内活性酸素フリーラジカルに対して最も強い抑制と除去効果があり、抑制率とクリアランスはそれぞれ１９．２８％と３２．４３％であり、比較的低濃度と比較的高濃度では、抑制と除去効果はいずれも低下した。

【0061】

２．ＤＰＰＨラジカル除去試験
上記で製造したサンプルＳ４を水に溶解し、最終濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）の溶液を製造しておく。１,１－ジフェニル－２－トリニトロフェニルヒドラジン（ＤＰＰＨ）溶液５．０ｍＬと、さまざまな濃度のＳ５サンプル溶液５．０ｍＬをそれぞれ精密に秤量して、栓付き試験管に入れ、均一に混合した。等体積の９５％エタノール－水混合溶液でゼロ調整を行った。室温で３０分間放置し、５２３ ｎｍで溶液の吸光度を測定し、濃度ごとに３回繰り返した、別の群を設けて、ＤＰＰＨ溶液５．０ｍＬと精製水５．０ｍＬをそれぞれ精密に秤量し、混合し、ブランク対照とし、同様に操作した。計算方法は次のとおりである。

【0062】

ラジカルクリアランス（％）＝（１－サンプル吸光度値／ブランク対照吸光度値）×１００％

【0063】

得られた結果を表６に示す。

【0064】

【表6】

【0065】

表６の結果から、組成物濃度が高くなるにつれてＤＰＰＨラジカルのクリアランスが向上し、組成物濃度が０．３％である場合、クリアランスは７４．８０％、濃度が０．５％である場合、８８．１４％のクリアランスに達する。

【0066】

実施例５ 組成物の抗アポトーシス効果の評価
サンプル溶液の調製：サンプルＳ４を無血清培地で濃度０．１％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）の溶液にそれぞれ製造し、０．２２μｍの膜ろ過で除菌した。
（１）ＵＶＢ照射によるアポトーシスに対する被検品の修復作用
プレートへの接種：対数成長期にあるＨａＣａＴ細胞を取り、トリプシンで消化した後、細胞密度を１×１０^６個／ｍＬに調整し、６ウェル細胞培養プレートに接種し、１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液とし、二酸化炭素インキュベータに入れて３７℃、５％ＣＯ_２で通常培養を一晩行った。

【0067】

照射：６ウェルプレートの蓋を開け、ラップで封止し、７０ｍＪ／ｃｍ^２ＵＶＢ（４００μＷ ３ｍｉｎ）をＨａＣａＴ細胞に照射し、試験の群分けを表７に示す。

【0068】

【表7】

【0069】

薬剤添加：照射終了後、培養液を捨て、試験群は１ウェルあたり２ｍＬの異なる濃度のサンプル溶液を、正常群とモデル群は同量の培地を加え、インキュベータに入れて培養を続けた。

【0070】

検出：２４ｈ培養を続けた後、６ウェルプレート中の各群の細胞を収集し、古い培養液をＥＰ管に吸い取り、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄し、トリプシンを加えて消化を行い、古い培養液を加えて消化を停止し、上記のＥＰ管に収集し、１０００ ｒｐｍ／ｍｉｎで５分遠心分離し、上清を捨て、予冷したＰＢＳで２回洗浄した後、１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁させ、細胞密度を１×１０^６個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液１００μＬを新しい１．５ｍＬ ＥＰ管に移し、キットの説明書に従って、それぞれ５μＬ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣとＰＩ染色液を加え、軽く均一に混合し、室温で１０分間の遮光培養を行い、フローサイトメーターで検出した。

【0071】

（２）ＵＶＢ照射によるアポトーシスに対する被検品の保護作用
プレートへの接種：対数成長期にあるＨａＣａＴ細胞を取り、トリプシンで消化後、細胞密度を１×１０^６個／ｍＬに調整し、６ウェル細胞培養プレートに接種し、１ウェルあたり２ｍＬ細胞懸濁液とし、二酸化炭素インキュベータに入れて３７℃、５％ＣＯ_２で通常培養を一晩行った。

【0072】

薬剤添加：古い培養液を捨て、試験群はウェルごとに異なる濃度のサンプル溶液を２ｍＬ加え、正常群とモデル群は同量の培地を加え、インキュベータに入れて培養を続けた。

【0073】

照射：６ウェルプレートの蓋を開け、ラップで封止し、７０ｍＪ／ｃｍ^２ＵＶＢ（４００μＷ ３ｍｉｎ）をＨａＣａＴ細胞に照射し、試験の群分けは表８に示す。

【0074】

【表8】

【0075】

検出：照射後２４ｈ続けて培養した後、６ウェルプレート中の各群の細胞を収集し、古い培養液をＥＰ管に吸い取り、ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、トリプシンを加えて消化を行い、更に古い培養液を加えて消化を停止し、上記のＥＰ管に収集し、１０００ ｒｐｍ／ｍｉｎで５分遠心分離し、上清を捨て、予冷したＰＢＳで２回洗浄した後、１×ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁させ、細胞密度を１×１０^６個／ｍｌに調整し、細胞懸濁液１００μＬを新しい１．５ｍＬ ＥＰ管に移し、キットの説明書に従って、それぞれ５μＬ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣとＰＩ染色液を加え、軽く均一に混合し、室温で１０分間の遮光培養を行い、フローサイトメーターで検出した。

【0076】

正常細胞では、ホスファチジルセリン（ＰＳ）は細胞膜脂質二重層の内側にのみ分布しているが、細胞アポトーシスの早期には、細胞膜中のホスファチジルセリン（ＰＳ）は脂質膜の内側から外側に転向する。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖは分子量３５～３６ｋＤのＣａ^２＋依存性リン脂質結合蛋白質であり、ホスファチジルセリンとの親和性が高いため、細胞の外側に露出したホスファチジルセリンを介してアポトーシス早期細胞の細胞膜に結合する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ：Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）は完全な細胞膜を透過しない核酸染料であるが、アポトーシスの中期および後期にある細胞や死んだ細胞では、ＰＩは細胞膜を透過して核を赤く染めることができる。そこで、Ａｎｎｅｘｉｎ ＶをＰＩと合わせて用いることで、異なるアポトーシス時期にある細胞を区別することができる。

【0077】

その結果、表９に示すように、紫外損傷の前にサンプルと接触しても、紫外照射損傷の後にサンプルと接触しても、０．１％濃度では、サンプルＳ４のアポトーシス抑制作用が最も強く、サンプル濃度の更なる向上に伴い、抗アポトーシス効果は逆に弱まった。

【0078】

【表9】

【国際調査報告】