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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-22
(54)【発明の名称】組込み混合物及びイメージング混合物
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/48 20060101AFI20231115BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20231115BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231115BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/48 Z
C12Q1/68
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580802
(86)(22)【出願日】2021-11-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-27
(86)【国際出願番号】 EP2021081501
(87)【国際公開番号】W WO2022101400
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/114,302
(32)【優先日】2020-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】502279294
【氏名又は名称】イルミナ ケンブリッジ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100132263
【弁理士】
【氏名又は名称】江間 晴彦
(72)【発明者】
【氏名】アルティオリ，ジャンルカ アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】ルサール－ヴィジェ，マチュー
(72)【発明者】
【氏名】メイザー，ブライアン ディ
(72)【発明者】
【氏名】マクドナルド，セス エム
(72)【発明者】
【氏名】パグリーズ，ケイトリン エム
(72)【発明者】
【氏名】フォン ハッテン，ゼイビア
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
組込み混合物の例としては、液体担体、複合体、及び標識ヌクレオチドが挙げられる。複合体は、ポリメラーゼ及びポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む。標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組込み混合物であって、液体担体と、
複合体であって、
ポリメラーゼ、及び
前記ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複合体と、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、標識ヌクレオチドと、を含む、組込み混合物。
【請求項2】
前記プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組込み混合物。
【請求項3】
前記プラズモンナノ構造が、前記ポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、請求項１に記載の組込み混合物。
【請求項4】
オリゴヌクレオチドが、前記ポリメラーゼに結合しており、前記オリゴヌクレオチドは、前記プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、請求項１に記載の組込み混合物。
【請求項5】
オリゴヌクレオチドが、前記ポリメラーゼに結合しており、前記オリゴヌクレオチドが、前記プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた追加の部分も含むオリゴヌクレオチドテザーの相補的部分にハイブリダイズする、請求項１に記載の組込み混合物。
【請求項6】
前記プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、前記ポリメラーゼが、前記結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、請求項１に記載の組込み混合物。
【請求項7】
前記第１のメンバー及び前記第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、請求項６に記載の組込み混合物。
【請求項8】
方法であって、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、前記組込み混合物が、
液体担体と、
複数の複合体であって、各複合体が、
ポリメラーゼ、及び
前記ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複数の複合体と、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、
それにより、少なくとも１つの前記ポリメラーゼが、ｉ）前記標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを前記鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込み、ｉｉ）前記標識ヌクレオチドの個々の１つの近接内にその連結されたプラズモンナノ構造を維持する、組込み混合物を導入する工程と、
前記プラズモンナノ構造が維持されている間に前記組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
【請求項9】
キットであって、組込み混合物であって、
液体担体と、
ポリメラーゼと、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、標識ヌクレオチドと、を含む組込み混合物、並びに
イメージング混合物であって、
第２の液体担体と、
前記標識ヌクレオチドが関与する組込み事象の後に、前記標識ヌクレオチドの近接内でそれ自体を会合するように官能化されたプラズモンナノ構造と、を含む、イメージング混合物、
を含むキット。
【請求項10】
前記プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
前記プラズモンナノ構造が、第２のポリメラーゼで官能化されている、請求項９に記載のキット。
【請求項12】
前記プラズモンナノ構造が、前記第２のポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
オリゴヌクレオチドが、前記第２のポリメラーゼに結合し、前記オリゴヌクレオチドが、前記プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、請求項１１に記載のキット。
【請求項14】
オリゴヌクレオチドが、前記第２のポリメラーゼに結合し、前記オリゴヌクレオチドが、前記プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた部分を含む相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、請求項１１に記載のキット。
【請求項15】
前記プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、前記ポリメラーゼが、前記結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、請求項９に記載のキット。
【請求項16】
前記第１のメンバー及び前記第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
前記ポリメラーゼが、その表面に結合したＤＮＡ結合ドメインを更に含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項18】
前記ポリメラーゼが、その表面に結合した表面テザーと、
前記表面テザーに結合したフローセル表面結合剤と、を更に含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項19】
前記プラズモンナノ構造が、ストレプトアビジンで官能化され、前記標識ヌクレオチドが、ビオチン化されている、請求項９に記載のキット。
【請求項20】
方法であって、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、前記組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、
それにより、少なくとも１つの前記ポリメラーゼが、前記標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを前記鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、
前記フローセルにイメージング混合物を導入する工程であって、前記イメージング混合物が、
第２の液体担体と、
複数の官能化プラズモンナノ構造と、を含み、
それによって、前記官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが、前記標識ヌクレオチドのうちの個々の１つの近接内にそれ自体を会合させる、イメージング混合物を導入する工程と、
前記官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが前記標識ヌクレオチドのうちの個々の１つと会合している間に、前記組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
【請求項21】
前記官能化プラズモンナノ構造の各々が、第２のポリメラーゼで官能化され、前記方法が、前記イメージング混合物を導入する前に、前記組込み混合物を除去することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記官能化プラズモンナノ構造の各々が、結合対の第１のメンバーで官能化され、前記ポリメラーゼの各々が、前記結合対の第２のメンバーを含み、
前記方法が、前記イメージング混合物を導入する前に、前記組込み混合物を除去することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記官能化プラズモンナノ構造の各々が、ストレプトアビジンで官能化され、前記標識ヌクレオチドの各々が、ビオチン化され、
前記方法が、前記イメージング混合物を導入する前に、前記組込み混合物を除去することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
標識ヌクレオチドであって、ヌクレオチドと、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基と、
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、
前記ヌクレオチドの塩基又は前記色素標識に結合したプラズモンナノ構造と、を含む、標識ヌクレオチド。
【請求項25】
前記プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項26】
前記プラズモンナノ構造が、二本鎖デオキシリボ核酸鎖を介して前記ヌクレオチドの塩基に結合している、請求項２４に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項27】
第１の連結分子が、前記色素標識を前記ヌクレオチドの塩基に結合させ、第２の連結分子が、前記プラズモンナノ構造を前記ヌクレオチドの塩基に結合させ、
前記第１の連結分子は、前記第２の連結分子の第２の長さの約３ｎｍ～約１２ｎｍ以内の第１の長さを有する、請求項２４に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項28】
第１の連結分子が、前記色素標識を前記ヌクレオチドの塩基に結合させ、第２の連結分子が、前記プラズモンナノ構造を前記ヌクレオチドの塩基に結合させ、
前記第１の連結分子が、第１の長さを有し、前記第２の連結分子が、第２の長さを有し、前記第１及び第２の長さが合わせて、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である、請求項２４に記載の標識ヌクレオチド。
【請求項29】
方法であって、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、前記組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
前記ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、
前記ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識、及び
前記ヌクレオチドの塩基に結合したプラズモンナノ構造を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、前記標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを前記鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、
前記組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／１１４，３０２号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／１１４，３０２号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
生物学的又は化学的研究における様々なプロトコルは、局所支持体表面上又は所定の反応チャンバ内で多数の制御された反応を実施することを含む。次いで、所望の反応を観察又は検出することができ、その後の分析は、反応に関与する化学物質の特性を同定又は明らかにするのに役立ち得る。いくつかの例では、制御された反応は、電荷、導電率、又はいくつかの他の電気的特性を変化させ、したがって、電子システムを検出に使用することができる。他の例では、制御された反応は蛍光を生成し、したがって、光学系を検出に使用することができる。
【発明の概要】
【0003】
組込み及びイメージング混合物が本明細書に開示される。これらの混合物は、ヌクレオチド塩基コールが光シグナルの検出を介して実行される配列決定方法での使用に好適である。本明細書に開示される混合物は、プラズモン共鳴及び組み込まれた標識ヌクレオチドの色素標識に対するプラズモンナノ構造の正確な位置決めを介してこれらの光学シグナルを増強する。配列決定中に新生核酸鎖に組み込まれた標識ヌクレオチドの構成要素である、色素標識の近接を増強するシグナル内にプラズモンナノ構造を局在化するいくつかの機構及び技術が本明細書に開示される。局在化により、プラズモンナノ構造は、イメージング中の色素標識の近接を増強するシグナル内に保持されることを可能にし、したがって、プラズモンナノ構造は、色素標識の光シグナルを増強することができる。
【0004】
導入
本明細書に開示される第１の態様は、液体担体と；複合体であって、ポリメラーゼ及びポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複合体と、標識ヌクレオチドであって、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、を含む、組込み混合物である。
本明細書に開示される第１の態様は、液体担体と；複合体であって、ポリメラーゼ及びポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複合体と、標識ヌクレオチドであって、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、を含む、組込み混合物である。
【0005】
第１の態様の例では、プラズモンナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0006】
第１の態様の例では、プラズモンナノ構造は、ポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートされる。
【0007】
第１の態様の例では、オリゴヌクレオチドはポリメラーゼに結合し、オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする。
【0008】
第１の態様の例では、オリゴヌクレオチドはポリメラーゼに結合し、オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた追加の部分も含むオリゴヌクレオチドテザーの相補的部分にハイブリダイズする。
【0009】
第１の態様の例では、プラズモンナノ構造は、結合対の第１のメンバーで官能化され、ポリメラーゼは、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれを用いて官能化される。一例では、第１のメンバー及び第２のメンバーは、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む。
【0010】
例えば、シーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成するために、第１の態様の任意の特徴を任意の望ましい方法で一緒に組み合わせてもよく、及び／又は本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせてもよいことを理解されたい。
【0011】
本明細書に開示される第２の態様は、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、液体担体と、複数の複合体であって、各複合体が、ポリメラーゼ、及びポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複数の複合体と、複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、ｉ）標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込み、ｉｉ）標識ヌクレオチドの個々の１つの近接内にその連結されたプラズモンナノ構造を維持する、組込み混合物を導入する工程と、プラズモンナノ構造が維持されている間に組込みを光学的にイメージングする工程と、含む、方法である。
【0012】
第２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様の特徴の任意の組合わせを一緒に使用してもよく、並びに／あるいは本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、例えばシーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成してもよいことを理解されたい。
【0013】
本明細書に開示される第３の態様は、液体担体と、ポリメラーゼと、標識ヌクレオチドであって、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、標識ヌクレオチドと、を含む組込み混合物、並びに第２の液体担体と、標識ヌクレオチドを含む組込み事象の後に標識ヌクレオチドの近接内でそれ自体を会合するように官能化されたプラズモンナノ構造と、を含むイメージング混合物を含むキットが開示される。
【0014】
第３の態様の例では、プラズモンナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0015】
第３の態様の例では、プラズモンナノ構造は、第２のポリメラーゼで官能化される。一例では、プラズモンナノ構造は、第２のポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートされる。別の例では、オリゴヌクレオチドは、第２のポリメラーゼに結合し、オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする。更に別の例では、オリゴヌクレオチドは、第２のポリメラーゼに結合し、オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた部分を含む相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズされる。
【0016】
第３の態様の例では、プラズモンナノ構造は、結合対の第１のメンバーで官能化され、ポリメラーゼは、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれを用いて官能化される。一例では、第１のメンバー及び第２のメンバーは、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む。いくつかの例では、ポリメラーゼは、その表面に結合したＤＮＡ結合ドメインを更に含む。他の例では、ポリメラーゼは、その表面に結合した表面テザーと、表面テザーに結合したフローセル表面結合剤とを更に含む。
【0017】
第３の態様の例では、プラズモンナノ構造は、ストレプトアビジンで官能化され、標識ヌクレオチドは、ビオチン化されている。
【0018】
第３の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様の特徴の任意の組合わせを一緒に使用してもよく、並びに／あるいは本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、例えばシーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成してもよいことを理解されたい。
【0019】
本明細書に開示される第４の態様は、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、液体担体と、複数のポリメラーゼと、複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及びヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチド、を含み、それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、フローセルにイメージング混合物を導入する工程であって、イメージング混合物が、第２の液体担体と、複数の官能化プラズモンナノ構造と、を含み、それによって、官能化プラズモンナノ構造の少なくとも１つは、標識ヌクレオチドの個々の１つの近接内でそれ自体を会合する、イメージング混合物を導入する工程と、官能化プラズモンナノ構造の少なくとも１つが標識ヌクレオチドの個々の１つに関連付けられている間に、組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む、方法である。
【0020】
第４の態様の例では、官能化プラズモンナノ構造の各々は、第２のポリメラーゼで官能化され、この方法は、イメージング混合物を導入する前に組込み混合物を除去することを更に含む。
【0021】
第４の態様の例では、官能化プラズモンナノ構造の各々は、結合対の第１のメンバーで官能化され、ポリメラーゼの各々が、結合対の第２のメンバーを含み、方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む。
【0022】
第４の態様の例では、官能化プラズモンナノ構造の各々は、ストレプトアビジンで官能化され、標識ヌクレオチドの各々が、ビオチン化され、方法は、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む。
【0023】
第４の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び又は第４の態様の特徴の任意の組合わせを一緒に使用してもよく、並びに／あるいは本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、例えばシーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成してもよいことを理解されたい。
【0024】
本明細書に開示される第５の態様は、ヌクレオチドと、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基と、ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、ヌクレオチドの塩基又は色素標識に結合したプラズモンナノ構造と、を含む、標識ヌクレオチドである。
【0025】
第５の態様の例では、プラズモンナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される。
【0026】
第５の態様の例では、プラズモンナノ構造は、二本鎖デオキシリボ核酸鎖を介してヌクレオチドの塩基に結合している。
【0027】
第５の態様の例では、第１の連結分子は、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、第２の連結分子が、ヌクレオチドの塩基にプラズモンナノ構造を結合させ、第１の連結分子が、第２の連結分子の第２の長さの約３ｎｍ～約１２ｎｍ以内の第１の長さを有する。
【0028】
第５の態様の例では、第１の連結分子は、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、第２の連結分子が、ヌクレオチドの塩基にプラズモンナノ構造を結合させ、第１の連結分子が、第１の長さを有し、第２の連結分子が、第２の長さを有し、第１及び第２の長さが合わせて、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である。
【0029】
第５の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び又は第４の態様及び／又は第５の態様の特徴の任意の組合わせを一緒に使用してもよく、並びに／あるいは本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、例えばシーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成してもよいことを理解されたい。
【0030】
本明細書に開示される第６の態様は、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、液体担体と、複数のポリメラーゼと、複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、ヌクレオチド、ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基と、ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識、及びヌクレオチドの塩基に結合したプラズモンナノ構造を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む、方法である。
【0031】
第６の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様の特徴の任意の組合わせを一緒に使用してもよく、並びに／あるいは本明細書に開示される例のいずれかと組み合わせて、例えばシーケンシングイメージング中の増強された蛍光シグナルを含む、本開示に記載される利点を達成してもよいことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0032】
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。
【図1】組込み混合物の一例の概略図である。
【図2A】ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介してポリメラーゼに結合した例示的なプラズモンナノ構造の概略図である。
【図2B】ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド及びプラズモンナノ構造の周りを包むのに十分な長さのオリゴヌクレオチドテザーを介してポリメラーゼに結合した例示的なプラズモンナノ構造の概略図である。
【図4】標識ヌクレオチドの異なる例の化学構造を示す概略図である。
【図5A】組込み混合物の別の例の概略図である。
【図5B】組込み混合物の別の例の概略図である。
【図7A】組込み混合物の異なる例及びイメージング混合物の異なる例を含む例示的なキットの概略図である。
【図7B】組込み混合物の異なる例及びイメージング混合物の異なる例を含む例示的なキットの概略図である。
【図7C】組込み混合物の異なる例及びイメージング混合物の異なる例を含む例示的なキットの概略図である。
【図8A】フローセルの例の上面図である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本明細書に開示される例では、配列決定中のヌクレオチド塩基コールは、プラズモン強化光シグナルの検出を介して実行される。プラズモン共鳴を介したシグナル増強は、組み込まれた標識ヌクレオチドの色素標識に対するプラズモンナノ構造の正確な位置決めによって達成される。配列決定中に新生核酸鎖に組み込まれた標識ヌクレオチドの構成要素である、色素標識の近接を増強するシグナル内にプラズモンナノ構造を局在化する機構及び技術が本明細書に開示される。「シグナル増強近接性」とは、プラズモンナノ構造及び色素標識が、ｉ）プラズモンナノ構造及び色素標識が互いに近接すぎる場合に起こり得るクエンチングを防止し、ｉｉ）より大きな距離で有意に低下する可能性のあるプラズモン増強を増加させることを意味する。近接を増強する信号に対応する距離は、０ｎｍ超～約１００ｎｍの範囲であり得るが、プラズモンナノ構造（例えば、組成、形状、サイズ）並びに色素標識に依存する。場合によっては、近接を強化する信号に対応する距離は、約０．１ｎｍ～約２５ｎｍ、例えば、約１ｎｍ～約２０ｎｍ等の範囲である。一具体例では、近接を強化する信号に対応する距離は、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である。本明細書に開示される機構及び技術は、プラズモンナノ構造が、イメージング中に色素標識の近接を増強するシグナル内に保持されることを可能にし、したがって、プラズモンナノ構造は、色素標識の光シグナルを増強することができる。
【0034】
定義
本明細書に使用される用語は、別段の指定がない限り、関連する技術分野における通常の意味をとるものと理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
本明細書に使用される用語は、別段の指定がない限り、関連する技術分野における通常の意味をとるものと理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
【0035】
単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0036】
含む（comprising）、含む（including）、含有する（containing）という用語、及びこれらの用語の様々な形態は、互いに同義であり、等しく広義であることを意味する。
【0037】
フローセル及び／又はフローセルの様々な構成要素を説明するために、本明細書では、上（top）、下（bottom）、下方（lower）、上方（upper）、近接（adjacent）、上（on）等の用語が使用される。これらの方向を示す用語は、特定の配向を示すことを意味するものではなく、構成要素間の相対的な配向を指定するために使用されることを理解されたい。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示される例を任意の特定の配向に制限すると解釈されるものではない。
【0038】
第１、第２などの用語はまた、特定の配向又は順序を示すことを意味するものではなく、むしろ１つの構成要素を別の構成要素から区別するために使用される。
【0039】
「アクリルアミドモノマー」は、構造
【0040】
【化1】
【0041】
【化2】
【0042】
【化3】
【0043】
本明細書に使用されるとき、「アルデヒド」とは、構造－ＣＨＯを含む官能基を含有する有機化合物であり、これは、水素、及び、アルキル又は他の側鎖などのＲ基にも結合した炭素原子を有するカルボニル中心（すなわち、酸素に二重結合した炭素）を含む。アルデヒドの一般構造は、
【0044】
【化4】
【0045】
本明細書に使用されるとき、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合又は三重結合を含有しない）直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有し得る。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。ある例として、表記「Ｃ１～４アルキル」は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。
【0046】
本明細書に使用されるとき、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得る。例示的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
【0047】
本明細書に使用されるとき、「アルキン」又は「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得る。
【0048】
本明細書で使用するとき、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環又は環系（すなわち、２個の隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有し得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、及びアントラセニルが挙げられる。
【0049】
「アミノ」官能基は、－ＮＲａＲｂ基を指し、式中、Ｒａ及びＲｂは各々、本明細書で定義されるように、水素（例えば、
【0050】
【化5】
【0051】
本明細書に使用されるとき、「結合した（attached）」という用語は、２つのものが、直接的又は間接的のいずれかで、互いに、接合、締結、接着、接続、又は結着されている状態を指す。例えば、核酸は、共有結合又は非共有結合によってポリマーヒドロゲルに結合し得る。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない物理結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用、及び疎水性相互作用を挙げることができる。
【0052】
「アジド（azide）」又は「アジド（azido）」官能基は、－Ｎ３を指す。
【0053】
本明細書に使用されるとき、「炭素環」は、環系骨格に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環又は環系を意味する。炭素環が環系である場合、２つ以上の環が、縮合、架橋、又はスピロ結合方式で一緒に接合され得る。炭素環は、環系内の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有し得る。したがって、炭素環には、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニルが含まれる。炭素環基は、３～２０個の炭素原子を有し得る。炭素環式環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、及びスピロ［４．４］ノナニルが挙げられる。
【0054】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「カルボン酸」又は「カルボキシル」という用語は、－ＣＯＯＨを指す。
【0055】
「複合体」という用語は、それに連結されたプラズモンナノ構造を有するポリメラーゼを指す。
【0056】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して分子の残りに結合した完全飽和炭素環式環又は環系を意味する。
【0057】
本明細書に使用されるとき、「シクロアルケニル」又は「シクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。例としては、シクロヘキセニル又はシクロヘキセン及びノルボルネニル又はノルボルネンが挙げられる。また、本明細書に使用されるとき、「ヘテロシクロアルケニル」又は「ヘテロシクロアルケン」とは、少なくとも１つの二重結合を有する、環骨格内に少なくとも１つのへテロ原子を有する炭素環又は環系を意味し、環系の中のいずれも環も、芳香族ではない。
【0058】
本明細書に使用されるとき、「シクロアルキニル」又は「シクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。例は、シクロオクチンである。別の例は、ビクロノニンである。本明細書に使用されるとき、「ヘテロシクロアルキニル」又は「ヘテロシクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格内に少なくとも１つのへテロ原子を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。
【0059】
本明細書で使用される場合、「くぼみ」という用語は、基材の間隙領域（複数可）によって少なくとも部分的に囲まれた表面の開口部を有する、基材で画定される別個のくぼみフィーチャーを指す。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するように取られたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。
【0060】
「それぞれ」という用語は、項目の集合を参照して使用されるとき、集合内の個々の項目を識別することを意図しているが、必ずしも集合内の全ての項目を指すものではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。
【0061】
「エポキシ」という用語（グリシジル又はオキシラン基とも称される）は、本明細書で使用するとき、
【0062】
【化6】
【0063】
本明細書で使用される場合、「フローセル」という用語は、反応を行うことができるフローチャネル、試薬（複数可）をフローチャネルに送達するための入口、及びフローチャネルから試薬（試薬）を除去するための出口を有する容器を意味することを意図する。いくつかの例では、フローセルは、フローセル内で起こる反応の検出に対応する。例えば、フローセルは、アレイ、光学的標識分子などの光学的検出を可能にする１つ又は複数の透明な表面を含み得る。
【0064】
本明細書に使用されるとき、「フローチャネル」又は「チャネル」は、液体サンプルを選択的に受容することができる、２つの結合した構成要素間に画定される領域であり得る。いくつかの例では、フローチャネルは、２つの基材間に画定され得、したがって、基材の各々の活性領域と流体連通し得る。他の例では、フローチャネルは、基材と蓋との間に画定されてもよく、したがって、基材の活性領域と流体連通してもよい。
【0065】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に窒素、酸素、及び硫黄を含むがこれらに限定されない、１個以上のヘテロ原子、すなわち炭素以外の元素を含有する芳香環又は環系（すなわち、２個の隣接する原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。ヘテロアリール基は、５～１８環員を有し得る。
【0066】
本明細書で使用するとき、「複素環」は、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を含有する非芳香族環又は環系を意味する。複素環どうしは、縮合、架橋、又はスピロ結合式に、一体に接合されてもよい。複素環は、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有してもよい。環系の中で、ヘテロ原子は、非芳香環又は芳香環のいずれかに存在してよい。複素環基は、３～２０環員（すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む、環骨格を形成する原子の数）を有してよい。いくつかの例では、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳである。
【0067】
本明細書に使用されるとき、用語「ヒドラジン」又は「ヒドラジニル」とは、－ＮＨＮＨ２基を意味する。
【0068】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ヒドラゾン」又は「ヒドラゾニル」という用語は、
【0069】
【化7】
【0070】
本明細書に使用されるとき、「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、－ＯＨ基を指す。
【0071】
本明細書で使用される場合、「間隙領域」という用語は、例えば、くぼみを分離するか又はレーンを囲む基材の領域を指す。例えば、間隙領域は、アレイの１つの凹部を、アレイの別の凹部から分離することができる。別の例では、間隙領域は、フローセルの１つのレーンをフローセルの別のレーンから分離することができる。互いに分離されたくぼみ及びレーンは、別個であってもよい、すなわち、互いとの物理的な接触が欠如していてもよい。多くの例では、間隙領域は、連続的であるが、くぼみ又はレーンは、例えば、それ以外が連続的である表面に、又はその上に画定される複数のくぼみ又はレーンの場合のように、別個である。間隙領域によって提供される分離は、部分的又は完全な分離であり得る。間隙領域は、くぼみ又はレーンの表面材料とは異なる表面材料を有してもよい。例えば、くぼみ又はレーンは、その中にポリマーヒドロゲル及びプライマーを有することができ、間隙領域は、ポリマーヒドロゲル及びプライマーの両方を含まなくてもよい。
【0072】
「ニトリルオキシド」は、本明細書で使用される場合、「ＲａＣ≡Ｎ＋Ｏ－」基を意味し、式中、Ｒａは本明細書で定義される。ニトリルオキシドの調製例としては、クロラミド－Ｔでの処理による、又は、イミドイルクロリド［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］上での塩基作用による、又は、ヒドロキシルアミンとアルデヒドとの反応によるアルドキシムからのｉｎ ｓｉｔｕ生成が挙げられる。
【0073】
本明細書で使用される「ニトロン」は、Ｒ３が水素（Ｈ）ではないことを除いて、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が本明細書で定義されるＲａ及びＲｂ基のいずれかであり得る
【0074】
【化8】
【0075】
本明細書に使用されるとき、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖は、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基が欠如している糖である。窒素含有複素環式塩基（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよい。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合する。核酸類似体は、リン酸骨格、糖、又は核酸塩基のいずれかが変化していてもよい。核酸類似体の例としては、例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）などのユニバーサル塩基又はリン酸－糖骨格類似体が挙げられる。「標識ヌクレオチド」は、少なくとも色素標識が結合したヌクレオチドである。
【0076】
「プラズモンナノ構造」は、プラズモン共鳴を呈することができる任意の独立した構造を含む。
【0077】
「ポリマーヒドロゲル」という用語は、液体及びガスに対して透過性である半硬質ポリマーを指す。ポリマーヒドロゲルは、液体（例えば、水）が取り出され、例えば乾燥によって液体が除去されるときに収縮する可能性がある場合に膨潤することができる。ヒドロゲルは水を吸収し得るが、水溶性ではない。
【0078】
本明細書で使用するとき、「プライマー」という用語は、一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡ）として定義される。本明細書において増幅プライマーと称されるいくつかのプライマーは、鋳型増幅及びクラスター生成の開始点として機能する。本明細書において配列決定プライマーと称される他のプライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として機能する。プライマーの５’末端は、ポリマーヒドロゲルの官能基でカップリング反応を可能にするように修飾されてもよい。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の短鎖である。
【0079】
「実質的に距離を規定する」という語句は、イメージング中にプラズモンナノ構造と色素標識との間に所望の分離を生じさせる構成要素を説明するために使用される。本明細書で使用される場合、この語句は、列挙された構成要素（複数可）が、プラズモンナノ構造と色素標識との間の所望の分離の少なくとも８５％を生成することを意味する。他の１５％は、標識ヌクレオチド（例えば、塩基）の一部、空気、又はプラズモンナノ構造と色素標識との間に存在し得る流体を含み得る。構成要素も可撓性であり、溶液中で急速に移動することができることを理解されたい。したがって、プラズモンナノ構造と色素標識との間の距離は、イメージング中にわずかに変化し得る。
【0080】
「チオール」官能基とは、－ＳＨを意味する。
【0081】
本明細書に使用されるとき、用語「テトラジン」及び「テトラジニル」とは、４つの窒素原子を含む６員のヘテロアリール基を意味する。テトラジンは、任意に置換され得る。
【0082】
本明細書に使用されるとき、「テトラゾール」とは、４つの窒素原子を含む５員の複素環基を意味する。テトラゾールは、任意に置換され得る。
【0083】
プラズモンナノ構造
本明細書に記載されるように、プラズモンナノ構造は、プラズモン共鳴を呈することができる任意の独立した構造を含む。プラズモン共鳴は、材料表面層内の電子が、ある特定の入射角で入射光の光子によって励起され、次いで材料表面に平行に伝播する現象である。プラズモンナノ構造の表面は、伝搬する又は局所的な表面プラズモンとの結合を通じて電磁界を強く閉じ込めることができる。この相互作用は、局所電界の大きな増強に関連付けられており、これにより、励起及び発光速度を向上させ、蛍光エミッタの励起状態の寿命を減少させる可能性がある。これにより、増幅蛍光シグナルが得られ、光漂白に対する耐性も改善され得る。
本明細書に記載されるように、プラズモンナノ構造は、プラズモン共鳴を呈することができる任意の独立した構造を含む。プラズモン共鳴は、材料表面層内の電子が、ある特定の入射角で入射光の光子によって励起され、次いで材料表面に平行に伝播する現象である。プラズモンナノ構造の表面は、伝搬する又は局所的な表面プラズモンとの結合を通じて電磁界を強く閉じ込めることができる。この相互作用は、局所電界の大きな増強に関連付けられており、これにより、励起及び発光速度を向上させ、蛍光エミッタの励起状態の寿命を減少させる可能性がある。これにより、増幅蛍光シグナルが得られ、光漂白に対する耐性も改善され得る。
【0084】
本明細書で「プラズモン材料」と称されるプラズモン共鳴が可能な任意の材料は、プラズモンナノ構造として使用され得る。いくつかの金属（例えば、金、銀、スズ、ロジウム、ルテニウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム、白金、銅、アルミニウム等）、ドープされた半金属（例えば、ドープケイ素）、直接バンドギャップ半導体（例えば、ガリウムヒ素）、及び金属複合材料が、プラズモン共鳴可能である。金属複合材料は、上記の金属のうちの２つ以上を含み得る。例として、２金属複合材料は銀及び金を含み、３金属複合材料は銀、金、及び白金を含む。本明細書に記載の例のいずれかでは、プラズモンナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択され得る。
【0085】
一例では、プラズモンナノ構造は球状ナノ粒子である。別の例では、プラズモンナノ構造は、立方体、三角形、棒形状、ケージ様（例えば、多孔質シェルを有する非球形、中空粒子）等の非球状ナノ粒子である。更に別の例では、プラズモンナノ構造は、不規則な形状のナノ粒子である。
【0086】
プラズモンナノ構造はまた、固体、中空、又はコア－シェル構造であり得る。コア－シェル構造は、コアとして１つの材料、及びコアを少なくとも部分的にカプセル化するシェルとして別の材料を有する。いくつかの例では、２つの異なるプラズモン材料がコア及びシェルとして使用される。他の例では、コアは、プラズモン材料であり、シェルは、非プラズモン材料である。好適なシェル材料のいくつかの例としては、シリカ、アルミナ、チタニア、及び酸化タンタル等の金属酸化物、ウシ血清アルブミン等のタンパク質、及び配列決定中に使用される波長に対して透過性の有機ポリマー、例えばポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、及びポリ（メチルアクリレート）（ＰＭＡ）が挙げられる。非プラズモン材料は、コアのプラズモン共鳴を妨げず、その厚さは、色素標識の近接性を高めるシグナル内にコアを位置付けるのを助けるように調整することができる。一例として、コア－シェルプラズモンナノ構造のシリカシェルが、例えば標識ヌクレオチドに結合している結合対の第２のメンバーに結合することができる結合対の第１のメンバーで官能化されている場合、シリカシェルの厚さ及び結合対の結合メンバーの長さ（任意のリンカーを含む）は、色素標識とプラズモンナノ構造コアとの間の距離を実質的に規定する。別の例として、コア－シェルプラズモンナノ構造のシリカシェルが、例えば、ポリメラーゼに結合している結合対の第２のメンバーに結合することができる結合対の第１のメンバーで官能化される場合、結合対の結合メンバーの長さ（任意の連結分子を含む）、及びポリメラーゼのサイズは、色素標識とプラズモンナノ構造コアとの間の距離を実質的に画定する。
【0087】
プラズモンナノ構造の寸法は、その形状に応じて変化し得る。本明細書に開示される例では、プラズモンナノ構造の最大寸法（例えば、直径、長さ、中央値等）はナノスケールであり、したがって約１ｎｍ～１０００ｎｍ未満の範囲である。いくつかの例では、ナノ構造は、１ｎｍ以上、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、又は１００ｎｍ以上の直径を有するナノ粒子である。
【0088】
光シグナルのプラズモン増強は、シグナルが増強される色素標識からのプラズモンナノ構造の距離に強く依存する。本明細書に開示される機構及び技術は、プラズモンナノ構造がイメージング中に色素標識の近接を増強するシグナル内に保持されることを可能にする。これらの機構及び技術の各々をここで説明する。
【0089】
組込み混合物中のプラズモンナノ構造
プラズモンナノ構造は、組込み混合物に含まれ得る。いくつかの例では、プラズモンナノ構造は、ポリメラーゼも含む複合体の一部である。これらの例では、複合体は、プラズモンナノ構造が、色素標識の近接性を増強するシグナル内に保持される機構である。他の例では、ナノ構造は、標識ヌクレオチドの一部である。これらの実施例では、標識ヌクレオチドは、プラズモンナノ構造が色素標識の近接性を増強するシグナル内に保持される機構である。
プラズモンナノ構造は、組込み混合物に含まれ得る。いくつかの例では、プラズモンナノ構造は、ポリメラーゼも含む複合体の一部である。これらの例では、複合体は、プラズモンナノ構造が、色素標識の近接性を増強するシグナル内に保持される機構である。他の例では、ナノ構造は、標識ヌクレオチドの一部である。これらの実施例では、標識ヌクレオチドは、プラズモンナノ構造が色素標識の近接性を増強するシグナル内に保持される機構である。
【0090】
組込み混合物の一例を図１に概略的に示す。この例示的な組込み混合物１０Ａは、液体担体１２、ポリメラーゼ１６を含む複合体１４、及びポリメラーゼ１６に連結されたプラズモンナノ構造１８、及びヌクレオチド２２を含む標識ヌクレオチド２０、ヌクレオチド２２の糖に結合した３’ＯＨブロッキング基２４、及びヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６を含む。
【0091】
組込み混合物１０Ａの液体担体１２は、水及び／又はイオン性塩緩衝液、例えばミリモルからモル濃度のクエン酸生理食塩水、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸緩衝生理食塩水等、及び／又は他の緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）若しくは（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）であり得る。液体担体１２はまた、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋等の組込み反応を意図した触媒金属を含んでもよい。単一の触媒金属又は触媒金属の組合わせを使用してもよく、総濃度は約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭの範囲であってもよい。
【0092】
複合体１４は、ポリメラーゼ１６と、ポリメラーゼ１６に連結されたプラズモンナノ構造１８とを含む。組込み混合物１０Ａ中の複合体１４の濃度は、約１ｎＭ～約１０ｍＭの範囲であり得る。他の例として、組込み混合物１０Ａ中の複合体１４の濃度は、約５０ｎＭ～約１００μＭ、約１ｎＭ～約５０μＭ等の範囲であり得る。
【0093】
標識ヌクレオチド２２を受け入れることができ、ヌクレオチド塩基を鋳型鎖に沿って新生鎖に成功裏に組み込むことができる任意のポリメラーゼ１６が使用され得る。ポリメラーゼの例としては、Ｂｓｕ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ７ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ等のファミリーＡのポリメラーゼ；Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ及び他の高度にプロセッシブなポリメラーゼ（ファミリーＢ２）、Ｐｆｕポリメラーゼ（ファミリーＢ）、ＫＯＤポリメラーゼ（ファミリーＢ）、９ｏＮ（ファミリーＢ）等のファミリーＢ及びＢ２からのポリメラーゼ；大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ等のファミリーＣからのポリメラーゼ、及び他の多くのポリメラーゼ、及び多くの他のもの、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ等のファミリーＤからのポリメラーゼ、及び多くの他のもの；ＤＮＡ Ｐｏｌ μ、ＤＮＡ Ｐｏｌ β、ＤＮＡ Ｐｏｌ σ、及び他の多く等のファミリーＸからのポリメラーゼが挙げられる。
【0094】
プラズモンナノ構造１８は、標識ヌクレオチド組込みを実行するポリメラーゼ１６に連結されているため、ポリメラーゼ１６は、色素標識２６とプラズモンナノ構造１８との間の空間を少なくとも部分的に画定する。したがって、ポリメラーゼ１６のサイズは、近接を強化する信号を作成するように選択され得る。一例では、ポリメラーゼ１６のサイズは、約３ｎｍ～約９ｎｍの範囲である。別の例では、ポリメラーゼ１６のサイズは約４ｎｍ～約７ｎｍの範囲である。更に別の例では、ポリメラーゼ１６のサイズは、約５ｎｍである。
【0095】
ポリメラーゼ１６に加えて、複合体１４はまた、ポリメラーゼ１６に連結されたプラズモンナノ構造１８を含む。複合体１４のプラズモンナノ構造１８は、本明細書に記載の例のいずれかであり得る。ポリメラーゼ１６は、ヌクレオチド組込みのための活性部位を有し、活性部位から離れたポリメラーゼ１６の領域にプラズモンナノ構造１８を連結することが望ましい場合がある。例えば、活性部位から遠位にある内部又は末端タグは、ポリメラーゼ１６の活性が阻害されないようにプラズモンナノ構造体１８の結合に望ましい場合がある。プラズモンナノ構造１８をポリメラーゼ１６に連結するために、以下の技術のいずれかを使用することができる。
【0096】
一例では、プラズモンナノ構造１８は、ポリメラーゼ１６に化学的にコンジュゲートされる。化学的コンジュゲーションは、結合対で達成され得、プラズモンナノ構造１８は、結合対の第１のメンバーで官能化され、ポリメラーゼ１６は、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれを用いて官能化される。例示的な結合対では、第１のメンバー及び第２のメンバーは、それぞれ、ＮｉＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸）配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン若しくはアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、若しくはマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む。これらの実施例のいくつかは、ポリメラーゼ１６上に存在するアミン又はシステインへの化学的コンジュゲーションを伴う。ポリメラーゼ１６上の天然又は操作されたシステインは、いくつかの官能化プラズモンナノ構造（例えば、金、銀、白金、それらの合金）の表面と容易に反応する。ポリメラーゼ１６上の天然又は操作されたシステインはまた、いくつかの官能化プラズモンナノ構造の表面に組み込まれたマレイミド基と容易に反応する。任意のプラズモンナノ粒子をカルボキシル基で官能化することができ、これをＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）で活性化することにより、ポリメラーゼ１６上の天然に存在するアミン又は操作されたアミンと反応させることができる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）を使用して、リジン等のポリメラーゼ１６上のアミン基を標識することができる。一例では、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学物質は、Ｎ末端アミンのみが反応性であるｐＨ範囲（例えば、ｐＨ７）で用いられ得、その結果、単一のプラズモンナノ構造１８が、ポリメラーゼ１６に対して添加される。化学的コンジュゲーションはまた、πクランプ媒介システインコンジュゲーション、ＳＵＭＯ（小ユビキチン様修飾剤）タンパク質、又は任意の他の好適なコンジュゲーション法によって達成され得る。
【0097】
別の例では、プラズモンナノ構造１８は、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを介してポリメラーゼ１６に結合している。この例は、図２Ａに概略的に示されている。この例では、一本鎖オリゴヌクレオチド２８は、ポリメラーゼ１６に結合し、その相補的一本鎖オリゴヌクレオチドテザー３０は、プラズモンナノ構造１８に結合している。オリゴヌクレオチド２８は、相補的オリゴヌクレオチドテザー３０にハイブリダイズして、プラズモンナノ構造１８をポリメラーゼ１６に連結する。本明細書に開示される化学的コンジュゲーション技術のいずれかを使用して、オリゴヌクレオチド２８をポリメラーゼ１６に結合させ、相補的オリゴヌクレオチドテザー３０をプラズモンナノ構造１８に結合させることができる。２つの例として、チオール化オリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子又は銀ナノ粒子の表面に直接結合することができる。更に、相補的オリゴヌクレオチドテザー３０は、アジド－アルキンクリック反応、銅フリークリック反応、アルデヒド官能性オリゴアミンプラズモンナノ構造反応を含む様々な他の化学物質を通して、プラズモンナノ構造１８に結合し得る。
【0098】
オリゴヌクレオチド２８及び相補的オリゴヌクレオチドテザー３０は、同じ長さを有し、これは、約５ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲であり得る。
【0099】
この例では、ポリメラーゼ１６並びにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２８及び３０は、色素標識２６とプラズモンナノ構造１８との間の距離を少なくとも部分的に規定する。したがって、ポリメラーゼ１６のサイズ及びオリゴヌクレオチド２８及び３０の長さは、イメージング中に、プラズモンナノ構造１８が色素標識２６の近接性を増強するシグナル内にもたらされるように選択され得る。
【0100】
更に別の例では、プラズモンナノ構造１８は、プラズモンナノ構造１８に巻き付くオリゴヌクレオチドテザー３２を介してポリメラーゼ１６に結合している。このオリゴヌクレオチドテザー３２は、プラズモンナノ構造１８の周りに巻き付けるのに十分な長さの部分３４と、ポリメラーゼ１６に結合したオリゴヌクレオチド２８に相補的な部分３６とを含む。プラズモンナノ構造１８を包むのに十分な長さである部分３４の長さは、プラズモンナノ構造１８のサイズに依存するであろう。一例では、プラズモンナノ構造１８は、約５ｎｍ～約１２ｎｍの範囲の直径を有し、プラズモンナノ構造１８の周りに巻き付けるのに十分な長さの部分３４は、約４０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドを含み得る。これらのヌクレオチドは、プラズモンナノ構造１８の表面と選択的に結合することができる。一例では、プラズモンナノ構造１８は金であり、プラズモンナノ構造１８の周りに巻き付けるのに十分に長い部分３４は、ポリ－アデニンである。
【0101】
オリゴヌクレオチドテザー３２の相補的部分３６は、ポリメラーゼ１６上のオリゴヌクレオチド２８にハイブリダイズして、部分３４に巻き付けられたプラズモンナノ構造１８をポリメラーゼ１６に連結する。この例では、相補的部分３６及びオリゴヌクレオチド２８は、同じ長さを有し、これは、約５ヌクレオチド～約２０ヌクレオチドの範囲であり得る。本明細書に開示される化学的コンジュゲーション技術のいずれも、オリゴヌクレオチド２８をポリメラーゼ１６に結合させるために使用され得る。
【0102】
この例では、ポリメラーゼ１６並びにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２８及び部分３６は、色素標識２６とプラズモンナノ構造１８との間の距離を少なくとも部分的に規定する。したがって、ポリメラーゼ１６のサイズ及びオリゴヌクレオチド２８及び部分３６の長さは、イメージング中に、プラズモンナノ構造１８が色素標識２６の近接性を増強するシグナル内にもたらされるように選択され得る。
【0103】
いくつかの例では、複合体１４はまた、洗浄サイクル後のフローセルにおける複合体１４の保持を改善するための追加の構成要素を含み得る。
【0104】
洗浄サイクル後の複合体保持を改善するための一例では、複合体１４は、ポリメラーゼ１６に遺伝子融合されたＤＮＡ結合ドメインを含む。一例では、ＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ－ＤＮＡ）結合ドメインを含み得、これは、例えば、フローセル内の鋳型鎖のアダプター部分に結合することができる。ｓｓ－ＤＮＡ結合ドメインは、非配列特異的であり得る。これらのＤＮＡ結合ドメインの例としては、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖／オリゴペプチド結合（ＯＢ）折畳み、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、及びｗｈｉｒｌｙドメインが挙げられる。別の例では、ＤＮＡ結合ドメインは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ－ＤＮＡ）結合ドメインを含み得、これは、例えば、配列決定プライマー／鋳型二本鎖の二本鎖部分に結合することができる。これらのＤＮＡ結合ドメインの例としては、ＴＯＰＯ－Ｖヘリックス－ヘアピン－ヘリックスドメイン及びＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）が挙げられる。
【0105】
洗浄サイクル後の複合体保持を改善する別の例では、複合体１４は表面テザー４２（図３に示す）を含み得る。表面テザー４２は、組込み及びイメージング中に、複合体１４をパターン化された又は非パターン化されたフローセル表面４４に固定するために使用される。一例では、ポリメラーゼ１６は、その表面に結合した表面テザー４２を含み、フローセル表面結合剤は、表面テザー４２に結合する（例えば、ポリメラーゼ１６が結合している場所の反対側の末端に）。この例では、フローセル表面４４は、ポリメラーゼ１６がフローセルに導入されるときにポリメラーゼ結合表面テザー４２を結合させるように官能化される。別の例では、フローセルは、その表面４４に結合した表面テザー４２を含み、ポリメラーゼ結合剤は、表面テザー４２に結合している。この例では、ポリメラーゼ１６がフローセルに導入されるとき、ポリメラーゼ表面は、フローセル結合表面テザー４２に結合するように官能化される。これらの例のいずれかにおいて、表面テザー４２は、結合対の１つのメンバーを含み得、ポリメラーゼ１６は、他のメンバー：ビオチン／アビジン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｈｉｓ６／ＮｉＮＴＡ、Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ００２／Ｓｐｙｔａｇ００２、又はグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ／グルタチオンを有する。
【0106】
好適な表面テザー４２の１つの具体的な例としては、ビオチン－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ビオチンが挙げられる。この例では、表面テザー４２のビオチン末端は、ポリメラーゼ１６の表面上及びフローセル表面４４上に位置するストレプトアビジン又はアビジンにそれぞれコンジュゲートすることができる。したがって、この例では、一方の末端でのビオチンは、フローセル表面結合剤である。好適な表面テザー４２の別の具体的な例は、フローセル表面４４上にアビジンタンパク質を含む。この例では、ポリメラーゼ１６は、ビオチン化され得る。好適な表面テザー４２の更に別の具体的な例としては、ハロゲン－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。この例では、ＰＥＧは、フローセル表面４４に結合し得、ハロゲンは、ポリメラーゼ１６に結合したＨａｌｏＴａｇ（登録商標）に結合し得る。
【0107】
表面テザー４２の長さは、表面結合ポリメラーゼ１６が鋳型鎖４８と配列決定プライマー５０又は配列決定プライマー５０から延在する成長する新生鎖５２との間の接合部４６のどこにでも結合するのを可能にするのに十分である。一例では、表面テザー４２は、フローセル表面４４上で配列決定されるライブラリー断片の長さに部分的に応じて、約２ｎｍ～約２００ｎｍ、又は約５ｎｍ～約１５０ｎｍ、又は約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の長さを有し得る。
【0108】
図１を再び参照すると、複合体１４に加えて、図１に示される組込み混合物１０Ａはまた、標識ヌクレオチド２０を含む。本明細書で言及されるように、標識ヌクレオチド２０は、ヌクレオチド２２、ヌクレオチド２２の糖に結合した３’ＯＨブロッキング基２４、及びヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６を含む。標識ヌクレオチド２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃのいくつかの例を図４に示す。
【0109】
標識ヌクレオチド２０のヌクレオチド２２は、窒素含有複素環塩基と、糖と、１つ以上のリン酸基とを含む。ヌクレオチド２２は、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖は、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基が欠如している糖である。窒素含有複素環式塩基（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよい。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。リボース又はデオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合する。ヌクレオチド２２は、一リン酸塩、又はいくつかのリン酸基（例えば、トリホスフェート（すなわち、ガンマリン酸）、テトラホスフェート、ペンタ－リン酸塩、ヘキサ－リン酸塩等）を含むポリリン酸塩であり得る。核酸類似体は、リン酸骨格、糖、又は核酸塩基のいずれかが変化していてもよい。核酸類似体の例としては、例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）などのユニバーサル塩基又はリン酸－糖骨格類似体が挙げられる。図４では、ヌクレオチド２２の塩基はシトシンであり、糖はデオキシリボースであり、リン酸は三リン酸又はγ－リン酸である。
【0110】
標識ヌクレオチド２０のヌクレオチド２２はまた、それに結合した３’ＯＨブロッキング基２４を含む。３’ＯＨブロッキング基２４は、ヌクレオチド２２中の糖分子の３’酸素原子に連結され得る。３’ＯＨブロッキング基２４は、各配列決定サイクルで単一塩基組込みを発生させることを可能にする可逆的ターミネータであり得る。可逆的ターミネータは、追加の塩基が、鋳型ポリヌクレオチド鎖（本明細書では鋳型鎖４８（図３）とも呼ばれる）に相補的である新生鎖５２（図３）に組み込まれることを停止する。これにより、単一の組み込まれた塩基の検出及び識別が可能になる。続いて、３’ＯＨブロッキング基２４を除去することができ、各鋳型ポリヌクレオチド鎖で追加の配列決定サイクルを行うことができる。３’－ＯＮＨ２可逆的ターミネータ（２４Ａに示す）、３’－Ｏ－アリル可逆的ターミネータ（すなわち、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２であり、２４Ｂに示されている）、及び３’－Ｏ－アジドメチル可逆的ターミネータ（すなわち、－ＣＨ２Ｎ３であり、２４Ｃで示されている）を含む、異なる３’ＯＨブロッキング基２４の例を図４に参照番号２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃで示す。他の適切な可逆的ターミネータとしては、ｏ－ニトロベンジルエーテル、アルキルｏ－ニトロベンジルカルボナート、エステル部分、他のアリル部分、アセタール（例えば、ｔｅｒｔ－ブトキシ－エトキシ）、ＭＯＭ（－ＣＨ２ＯＣＨ３）部分、２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル、テトラヒドロフラニルエーテル、３’ホスフェート、エーテル、－Ｆ、－Ｈ２、－ＯＣＨ３、－Ｎ３、－ＨＣＯＣＨ３及び２－ニトロベンゼンカルボナートが挙げられる。
【0111】
標識ヌクレオチド２０のヌクレオチド２２はまた、ヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６を含む。色素標識２６は、発光、化学発光、蛍光、蛍光発色、発色団及び／又は発色性部分を含む任意の光学的に検出可能な部分であり得る。好適な光学的に検出可能な部分のいくつかの例としては、フルオレセイン標識、ローダミン標識、シアニン標識（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）、及び蛍光色素のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）ファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から）及び他の蛍光及び蛍光発生色素）が挙げられる。
【0112】
色素標識２６は、任意の好適な連結分子を使用して、ヌクレオチド２２の塩基に結合し得る。一例では、連結分子は、式－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－（式中、ｎは２から５０の整数である）のスペーサー基である。連結分子の他の例は、図４の参照番号３８Ａ、３８Ｂ、及び３８Ｃに示されている。連結分子３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃは、図４の矢印によって同定される切断部位４０を含む。
【0113】
一例では、組込み混合物１０Ａは、異なる塩基、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ（及びＵ又はＩ）を含む、異なる標識ヌクレオチド２０の混合物を含む。異なる標識ヌクレオチド２０に対して異なる種類の色素標識２６を利用することも望ましい場合がある。例えば、蛍光又は蛍光発生標識は、各標識が、他の標識と区別可能な波長で励起放射線を吸収し、かつ／又は蛍光を放出するように選択され得る。そのような識別可能な類似体は、同じ反応混合物中で異なる標識２６の存在を同時に監視する能力を提供する。いくつかの例では、組込み混合物１０Ａ中の４つの標識ヌクレオチド２０のうちの１つは、色素標識２６を含まなくてもよく、他方の３つの標識ヌクレオチド２０は、異なる色素標識２６を含む。
【0114】
図３に戻って参照すると、以下の説明は、組込み混合物１０Ａを含む例示的な方法に関する。この説明を通して、フローセルが参照され、簡単に説明される。フローセルの例は、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃに示されており、それらの図を参照して以下でより詳細に説明される。
【0115】
配列決定中、配列決定される鋳型鎖４８は、フローセル表面４４上に固定化された増幅プライマー（図３には示されていない）を使用してフローセル表面４４上に形成され得る。鋳型鎖形成の開始時に、ライブラリー鋳型を任意の核酸試料（例えば、ＤＮＡ試料又はＲＮＡ試料）から調製することができる。ＤＮＡ核酸サンプルは、同様にサイズ決定された（例えば、１０００ｂｐ未満の）一本鎖ＤＮＡ断片に断片化されてもよい。ＲＮＡ核酸サンプルは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために使用することができ、ｃＤＮＡは、同様にサイズ決定された（例えば、１０００ｂｐ未満の）一本鎖ｃＤＮＡ断片に断片化されてもよい。調製中に、アダプターは断片いずれかの末端に追加され得る。低減されたサイクル増幅により、異なるモチーフ、例えば配列決定プライマー結合部位、インデックス、及びフローセル表面４４上の増幅プライマーに相補的な領域がアダプターに導入され得る。いくつかの例では、単一の核酸サンプルからの断片は、断片に追加された同じアダプターを有する。最終的なライブラリー鋳型は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片と、両端にアダプターとを含む。ＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片は、シーケンシングしようとする最終ライブラリー鋳型の一部分を表す。
【0116】
複数のライブラリー鋳型が、フローセルに導入されてもよい。複数のライブラリー鋳型は、例えば、フローセル表面４４に固定化された２種類の増幅プライマーのうちの一方にハイブリダイズする。
【0117】
次に、クラスター生成が実行され得る。クラスター生成の一つの例では、ライブラリー鋳型は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（high-fidelity DNA polymerase）を使用して３’伸長によって、ハイブリダイズされたプライマーからコピーされる。元のライブラリー鋳型を変性させ、コピーをフローセル表面４４に固定化したままにする。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は他の何らかの形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的なプライマーにハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジ構造を形成し、当該構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的なプライマーにハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスターを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスターが変性される。一例では、逆鎖は、特異的塩基切断によって除去され、順方向鋳型鎖を残す。単一の鋳型鎖４８が図３に示されているが、クラスタリングは、フローセル表面４４上に固定化されたいくつかの鋳型鎖４８の形成をもたらす（例えば、図８Ｂに示されるようなレーン、又は図８Ｃに示されるようなくぼみにある）。このクラスター化の例はブリッジ増幅と呼ばれ、実行できる増幅の一つの例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）などの他の増幅技術が使用され得ることを理解すべきである。
【0118】
鋳型鎖４８の配列の相補的部分にハイブリダイズする配列決定プライマー５０を導入することができる。この配列決定プライマー５０は、組込み混合物１０Ａを使用して、鋳型鎖４８を配列決定する準備が整うようにする。
【0119】
例示的な配列決定方法は、（配列決定プライマー５０がハイブリダイズした）鋳型鎖４８のクラスターを含むフローセルに組込み混合物１０Ａを導入することを含み、組込み混合物１０Ａは、複数の複合体１４及び複数の標識ヌクレオチド２０を含み、それにより、少なくとも１つのポリメラーゼ１６は、ｉ）標識ヌクレオチド２０の個々の１つを鋳型鎖４８の１つに沿って新生鎖５２に組み込み、ｉｉ）その連結されたプラズモンナノ構造１８を標識ヌクレオチド２０の個々の１つの近接内に維持し、プラズモンナノ構造１８が維持されている間の組込みを光学的にイメージングする。
【0120】
この例示的な方法では、組込み混合物１０Ａの任意の例が、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。組込み混合物１０Ａがフローセルに導入されると、混合物１０Ａはフローチャネルに入り、鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0121】
組込み混合物１０Ａは、フローセル内でインキュベートされ、標識ヌクレオチド２０は、複合体１４のそれぞれのポリメラーゼ１６によって組み込まれる。図３に示されるように、組込み中、標識ヌクレオチド２０のうちの一方は、それぞれのポリメラーゼ１６によって、一方の配列決定プライマー５０を伸長し、鋳型鎖４８のうちの一方に相補的な一方の新生鎖５２に組み込まれる。組込みは、鋳型鎖依存的様式で実施され、したがって、新生鎖５２に添加された標識ヌクレオチド２０の順序及びタイプの検出を使用して、鋳型鎖４８の配列を決定することができる。組込みは、単一の配列決定サイクル中にフローセル表面４４を横切る鋳型鎖４８の少なくとも一部で起こる。したがって、フローセルにわたる鋳型鎖４８の少なくともいくつかにおいて、それぞれのポリメラーゼ１６は、ハイブリダイズした配列決定プライマー５０を、組込み混合物１０Ａ中の標識ヌクレオチド２０のうちの１つだけ伸長させる。
【0122】
組み込まれた標識ヌクレオチド２０は、３’ＯＨブロッキング基２４の存在による可逆的終端特性を含み、標識ヌクレオチド２０が添加されると、更なる配列決定プライマー伸長を終了させる。
【0123】
インキュベーション及び組込みの所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチド２０を含む組込み混合物１０Ａは、洗浄サイクル中にフローセルから除去され得る。洗浄サイクルは、例えばポンプ又は他の適切な機構によって、洗浄液（例えば、緩衝液）がフローチャネル内に導かれ、フローチャネルを通り、次いでフローチャネルから出るフロースルー技術を含んでもよい。
【0124】
組込みを行うポリメラーゼ１６の少なくとも一部及びそれらのそれぞれの複合体１４は、洗浄サイクル後に鋳型鎖４８と最後に組み込まれた標識ヌクレオチド２０との間の接合部４６で定位置に留まる。一例では、複合体１４の約２０％～約９０％は、洗浄サイクル後にフローセル内に残る。１つの例示的な範囲が提供されるが、様々な異なる要因に応じて、残りの複合体１４のパーセンテージがより多くてもより少なくてもよいことを理解されたい。本明細書で言及されるように、洗浄サイクル中及び洗浄サイクル後に保持された複合体１４のパーセンテージを増加させるために、複合体１４は、鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に（例えば、表面テザー４２を介して）繋ぎ留められ得る。各保持された複合体１４はプラズモンナノ構造１８を含むため、これらのプラズモンナノ構造１８はまた、図３に示すように、鋳型鎖４８と最後に組み込まれた標識ヌクレオチド２０との間の接合部４６で定位置に保持される。したがって、プラズモンナノ構造１８は、組込み後に色素標識２６の近接を増強するシグナル内に保持される。
【0125】
更なる組込みが行われることなく、直近で組み込まれた標識ヌクレオチド２０を、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、フローセル表面４４に励起光を供給することができる。組み込まれた標識ヌクレオチド２０の色素標識２６は、励起光に応答して光シグナルを放出する。更に、保持されたプラズモンナノ構造１８は、それぞれの色素標識２６の近接を増強するシグナル内に保持されるため、色素標識２６からの信号は、プラズモン共鳴を通して増強され得る。
【0126】
イメージングを行った後、次いで切断混合物をフローセルに導入することができる。この例では、切断混合物は、ｉ）組み込まれたヌクレオチド２０から３’ＯＨブロッキング基２４を除去すること、及びｉｉ）組み込まれたヌクレオチド２０から色素標識２６を切断すること、ができる。切断混合物中の３’ＯＨブロッキング基２４及び好適な脱ブロッキング剤／構成要素の例は、以下を含み得る。塩基加水分解によって除去することができるエステル部分；Ｎａｌ、クロロトリメチルシラン及びＮａ２Ｓ２Ｏ３で又はアセトン／水中のＨｇ（ＩＩ）で除去することができるアリル部分；トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はトリ（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）などのホスフィンで切断することができるアジドメチル；酸性条件で切断することができるｔｅｒｔ－ブトキシ－エトキシなどのアセタール；ＬｉＢＦ４及びＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで切断することができるＭＯＭ（－ＣＨ２ＯＣＨ３）部分；チオフェノール及びチオサルフェートなどの求核剤で切断することができる２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル；Ａｇ（Ｉ）又はＨｇ（ＩＩ）で切断することができるテトラヒドロフラニルエーテル；並びにホスファターゼ酵素（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）によって切断され得る３’リン酸。切断混合物中の適切な色素標識切断剤／構成要素の例としては、隣接ジオールを切断することができる過ヨウ素酸ナトリウム；アジドメチル結合を切断することができるトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）等のホスフィン；アリルを切断することができるパラジウム及びＴＨＰ；エステル部分を切断することができる塩基；又は任意の他の好適な切断剤を挙げることができる。
【0127】
切断混合物又はその後の洗浄で洗浄することにより、鋳型鎖４８又はフローセル表面４４に別様に連結されていない保持複合体１４を除去することもできる。
【0128】
複合体１４が鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に連結されると（例えば、表面テザー４２を介して）、追加の複合体除去剤を切断混合物に添加することができる。複合体除去剤は、複合体１４と鋳型鎖４８との間、又は複合体１４とフローセル表面４４との間に形成される結合に依存する。本明細書に記載の例示的な色素標識切断剤のいくつかは、複合体１４を切断することができる場合がある。一例では、ビオチン－ストレプトアビジン結合対は、表面テザー４２をフローセル表面４４に連結する。この例では、複合体除去剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素とビオチンの組合わせ、又は約１０％体積～約５０％体積のホルムアミド及び任意の緩衝液を含むホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び生体適合性界面活性剤を含む塩緩衝液の残部との組合わせであり得る。別の例では、結合対構成要素のうちの過剰なものは、結合対間（例えば、ポリメラーゼ１６と表面テザー４２との間、又は表面テザー４２とフローセル表面４４との間）の結合を破壊することができ、そのいずれかがフローセル表面４４上で結合部位を開いたままにする。更に別の例では、ヌクレアーゼ又はアリル切断化学物質を添加して、表面テザー４２を切断することができる。更に別の例では、外因性ＤＮＡを添加して、ＤＮＡ結合ドメインが表面コンジュゲートＤＮＡから放出することを促進し得る。
【0129】
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルを「ｎ」回繰り返して、配列決定プライマー５０をｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。いくつかの例では、順鎖がシーケンシング及び除去され、次いで、逆鎖が構築され、シーケンシングされるペアエンドシーケンシングを使用してよい。
【0130】
ここで図５Ａを参照すると、組込み混合物１０Ｂの別の例が概略的に示されている。この例示的な組込み混合物１０Ｂは、標識ヌクレオチド２０’の別の例を含む。この標識ヌクレオチド２０’は、ヌクレオチド２２、ヌクレオチド２２の糖に結合した３’ＯＨブロッキング基２４、ヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６、及びヌクレオチド２２の塩基に結合したプラズモンナノ構造１８を含む。
【0131】
本明細書に記載のヌクレオチド２２、３’ＯＨブロッキング基２４、及び色素標識２６のいずれも、標識ヌクレオチド２０’に使用され得る。更に、本明細書に記載のプラズモンナノ構造１８のいずれも、標識ヌクレオチド２０’に使用され得る。
【0132】
この例では、第１の連結分子３８は、色素標識２６をヌクレオチド２２の塩基に結合させ、第２の連結分子３８’は、プラズモンナノ構造１８をヌクレオチド２２の塩基に結合させる。第１及び第２の連結分子３８、３８’の長さは、連結分子３８、３８’が塩基にどのように結合するかに依存し得る。いくつかの例では、信号増強近接性に関連する距離が０．１ｎｍ～１００ｎｍである場合、長さは約１ｎｍ～約１２ｎｍ、又は最大約１００ｎｍの範囲になる。
【0133】
第１及び／又は第２の連結分子３８、３８’は、色素標識２６を塩基に連結するために記載された連結分子のいずれか、例えばスペーサー基－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－（ｎは２～５０の範囲）又は図４の参照番号３８Ａ、３８Ｂ及び３８Ｃで示される例であり得る。いくつかの例では、第１及び／又は第２の連結分子３８、３８’は、組込み及びイメージング後に同じ機構を使用して切断され得るように、同じタイプのリンカーであるように選択される。第２の連結分子３８’の別の例は、ｄｓ－ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）である。ｄｓ－ＤＮＡリンカーの剛性が特に望ましい場合がある。これらの例のいずれにおいても、第２の連結分子３８’は、プラズモンナノ構造１８に化学的にコンジュゲートすることができる末端基を含み得る。一例として、ビオチンは、第２の連結分子３８’の末端に添加され得、プラズモンナノ構造１８は、ビオチンに結合することができるアビジン又はストレプトアビジンで官能化され得る。別の例として、チオールを第２の連結分子３８’の末端に添加してもよく、これは金ナノ粒子の表面に直接結合することができる。
【0134】
図５Ａに示すように、組込み混合物１０Ｂのこの例はまた、液体担体１２及びポリメラーゼ１６を含む。ポリメラーゼ１６及び／又は標識ヌクレオチド２０’の濃度は、約５０ｎＭ～約１００μＭ、約１ｎＭ～約５０μＭ等の範囲であり得る。
【0135】
組込み混合物１０Ｂの液体担体１２は、水及び／又は本明細書に記載の緩衝液のいずれかであり得る。
【0136】
組込み混合物１０Ｂのポリメラーゼ１６は、本明細書で提供される実施例のいずれかであり得る。これらの実施例では、組込み混合物１０Ｂ中のポリメラーゼ１６は、複合体１４の一部ではないことを理解されたい。したがって、ポリメラーゼ１６は、プラズモンナノ構造１８に結合していない。ポリメラーゼ１６とプラズモンナノ構造１８とは別個であるため、これらの例のポリメラーゼ１６は、鋳型鎖４８（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４（例えば、表面テザー４２を介して、）への繋ぎ留めのために官能化されていなくてもよい。
【0137】
ここで図５Ｂを参照すると、組込み混合物１０Ｃの別の例が概略的に示されている。この例示的な組込み混合物１０Ｃは、標識ヌクレオチド２０’’’の別の例を含む。この標識ヌクレオチド２０’’’は、ヌクレオチド２２、ヌクレオチド２２の糖に結合した３’ＯＨブロッキング基２４、ヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６、及び色素標識２６に結合したプラズモンナノ構造１８を含む。色素標識２６へのプラズモンナノ粒子１８の結合は、図５Ａに示される例示的な標識ヌクレオチド２０’よりも立体的に充填していなくてもよい。
【0138】
本明細書に記載のヌクレオチド２２、３’ＯＨブロッキング基２４、及び色素標識２６のいずれも、標識ヌクレオチド２０’’’に使用され得る。更に、本明細書に記載のプラズモンナノ構造１８のいずれも、標識ヌクレオチド２０’’’に使用され得る。
【0139】
この例では、第１の連結分子３８は、色素標識２６をヌクレオチド２２の塩基に結合させ、第２の連結分子３８’は、プラズモンナノ構造１８を色素標識２６に結合させる。第１及び第２の連結分子３８、３８’の全長は、連結分子３８が塩基にどのように結合するか、及び連結分子３８’が色素標識２６にどのように結合するかに依存し得る。いくつかの例では、連結分子３８’の長さは、近接を増強する信号と関連する距離が０．１ｎｍ～１００ｎｍである場合、約１ｎｍ～約１２ｎｍ、又は最大約１００ｎｍの範囲である。
【0140】
第１及び／又は第２の連結分子３８、３８’は、色素標識２６を塩基に連結するために記載された連結分子のいずれか、例えばスペーサー基－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－（ｎは２～５０の範囲）又は図４の参照番号３８Ａ、３８Ｂ及び３８Ｃで示される例であり得る。
【0141】
図５Ｂに示すように、組込み混合物１０Ｃのこの例はまた、液体担体１２及びポリメラーゼ１６を含む。ポリメラーゼ１６及び／又は標識ヌクレオチド２０’’’の濃度は、約５０ｎＭ～約１００μＭ、約１ｎＭ～約５０μＭ等の範囲であり得る。
【0142】
組込み混合物１０Ｃの液体担体１２は、水及び／又は本明細書に記載の緩衝液のいずれかであり得る。組込み混合物１０Ｃの液体担体１２はまた、触媒金属（複数可）を含み得る。
【0143】
組込み混合物１０Ｃのポリメラーゼ１６は、本明細書で提供される実施例のいずれかであり得る。これらの実施例では、組込み混合物１０Ｃ中のポリメラーゼ１６は、複合体１４の一部ではないことを理解されたい。したがって、ポリメラーゼ１６は、プラズモンナノ構造１８に結合していない。ポリメラーゼ１６とプラズモンナノ構造１８とは別個であるため、これらの例のポリメラーゼ１６は、鋳型鎖４８（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４（例えば、表面テザー４２を介して、）への繋ぎ留めのために官能化されていなくてもよい。
【0144】
ここで図６を参照すると、以下の説明は、組込み混合物１０Ｂを含む例示的な方法に関する。この方法はまた、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃを参照して詳細に示され説明されるフローセルの例を利用する。この方法の開始時に、鋳型鎖４８は、図３を参照して説明したように形成されている。
【0145】
図６に示すように、鋳型鎖４８の配列の相補的部分にハイブリダイズする配列決定プライマー５０を導入することができる。この配列決定プライマー５０は、組込み混合物１０Ｂを使用して、鋳型鎖４８を配列決定する準備が整うようにする。
【0146】
例示的な配列決定方法は、（配列決定プライマー５０がハイブリダイズした）鋳型鎖４８のクラスターを含むフローセルに組込み混合物１０Ｂを導入することを含み、組込み混合物１０Ｂは、液体担体１２、複数のポリメラーゼ１６、及び複数の標識ヌクレオチド２０’を含み、それにより、少なくとも１つのポリメラーゼ１６が、標識ヌクレオチド２０’の個々の１つを鋳型鎖４８の１つに沿って新生鎖５２に組み込み、前記組込みを光学的にイメージングする。
【0147】
この例示的な方法では、組込み混合物１０Ｂの任意の例が、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。組込み混合物１０Ｂがフローセルに導入されると、混合物１０Ｂはフローチャネルに入り、鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0148】
組込み混合物１０Ｂは、フローセル内でインキュベートされ、標識ヌクレオチド２０’は、それぞれのポリメラーゼ１６によって組み込まれる。図６に示されるように、組込み中、標識ヌクレオチド２０’のうちの一方は、それぞれのポリメラーゼ１６によって、一方の配列決定プライマー５０を伸長し、鋳型鎖４８のうちの一方に相補的な一方の新生鎖５２に組み込まれる。この組込みはまた、鋳型鎖依存的様式で実施され、したがって、新生鎖５２に添加された標識ヌクレオチド２０’の順序及びタイプの検出を使用して、鋳型鎖４８の配列を決定することができる。組込みは、単一の配列決定サイクル中にフローセル表面４４を横切る鋳型鎖４８の少なくとも一部で起こる。
【0149】
組み込まれた標識ヌクレオチド２０’は、３’ＯＨブロッキング基２４の存在による可逆的終端特性を含み、標識ヌクレオチド２０’が添加されると、更なる配列決定プライマー伸長を終了させる。
【0150】
インキュベーション及び組込みの所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチド２０’を含む組込み混合物１０Ｂは、洗浄サイクル中にフローセルから除去され得る。洗浄サイクルは、例えばポンプ又は他の適切な機構によって、洗浄液（例えば、緩衝液）がフローチャネル内に導かれ、フローチャネルを通り、次いでフローチャネルから出るフロースルー技術を含んでもよい。
【0151】
それぞれのプラズモンナノ構造１８は、組み込まれた標識ヌクレオチド２０’に連結されているため、これらのプラズモンナノ構造１８は、組込み後の色素標識２６の近接を増強するシグナル内の所定の位置に保持される。
【0152】
更なる組込みが行われることなく、直近で組み込まれた標識ヌクレオチド２０’を、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、フローセル表面４４に励起光を供給することができる。組み込まれた標識ヌクレオチド２０’の色素標識２６は、励起光に応答して光シグナルを放出し、組み込まれた標識ヌクレオチド２０’のそれぞれのプラズモンナノ構造１８は、プラズモン共鳴を通じてこれらの光シグナルを増強する。
【0153】
イメージングを行った後、次いで切断混合物をフローセルに導入することができる。この例では、切断混合物は、ｉ）組み込まれたヌクレオチド２０’から３’ＯＨブロッキング基２４を除去すること、ｉｉ）色素標識２６を組み込まれたヌクレオチド２０’から切断すること、及びｉｉｉ）組み込まれたヌクレオチド２０’からプラズモンナノ構造１８を切断することができる。
【0154】
この例では、３’ＯＨブロッキング基２４を切断するための本明細書に記載の脱ブロッキング剤／構成要素のいずれかを使用することができる。また、この例では、色素標識２６を切断するための本明細書に記載の切断剤／構成要素のいずれかが使用され得る。色素標識２６及びプラズモンナノ構造１８をそれぞれ結合するために使用される連結分子３８、３８’が同じである場合、切断混合物は、連結分子３８、３８’を切断することができる単一の切断剤／構成要素を含み得る。色素標識２６及びプラズモンナノ構造１８をそれぞれ結合させるために使用される連結分子３８、３８’が異なる場合、切断混合物は、それぞれの連結分子３８、３８’を切断することができる異なる切断剤／構成要素を含み得る。一例として、各連結分子３８、３８’の特定の配列を標的とする制限酵素を使用することができる。
【0155】
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、配列決定プライマー５０をｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。いくつかの例では、順鎖がシーケンシング及び除去され、次いで、逆鎖が構築され、シーケンシングされるペアエンドシーケンシングを使用してよい。
【0156】
組込み混合物１０Ｃは、組込み混合物１０Ｂの代わりに図６を参照して説明した方法で使用され得る。方法（例えば、組込み、インキュベーション、信号増強等）は、切断プロセスが簡略化され得ることを除いて、図６を参照して説明したものと同様であろう。組込み混合物１０Ｃでは、プラズモンナノ構造１８は、色素標識２６に結合している。したがって、色素標識２６が切断されると、プラズモンナノ構造１８も切断される。したがって、本方法中に、連結分子３８’に対する追加の切断剤は使用されない。
【0157】
イメージング混合物中のプラズモンナノ構造
本明細書に開示される他の例では、プラズモンナノ構造１８は、組込み混合物１０Ａ又は１０Ｂ又は１０Ｃではなく、イメージング混合物に含まれ得る。これらの実施例では、ナノ構造１８は、組み込まれた標識ヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド２０）と会合することができるように官能化される。これらの例では、官能化は、プラズモンナノ構造体１８が色素標識２６のシグナル増強近接内に局在化する機構の少なくとも一部である。
本明細書に開示される他の例では、プラズモンナノ構造１８は、組込み混合物１０Ａ又は１０Ｂ又は１０Ｃではなく、イメージング混合物に含まれ得る。これらの実施例では、ナノ構造１８は、組み込まれた標識ヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド２０）と会合することができるように官能化される。これらの例では、官能化は、プラズモンナノ構造体１８が色素標識２６のシグナル増強近接内に局在化する機構の少なくとも一部である。
【0158】
図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、組込み混合物１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆ並びにイメージング混合物５６、５６’及び５６’’の両方を含むキット５４、５４’、５４’’の３つの例を示す。各キット５４、５４’、５４’’は、液体担体１２、ポリメラーゼ１６又は１６’’の一例、及び標識ヌクレオチド２０又は２０’’の一例を含む、組込み混合物１０Ｄ、１０Ｅ、及び１０Ｆの異なる例を含む。各キット５４、５４’、５４’’はまた、第２の液体担体１２’と、標識ヌクレオチド２０又は２０’’を含む組込み事象の後に、標識ヌクレオチド２０又は２０’’の近接内でそれ自体を会合させるために官能化されたプラズモンナノ構造１８’、１８’’、又は１８’’’の例と、を含むイメージング混合物５６、５６’、５６’’の例も含む。
【0159】
組込み混合物１０Ｄ、１０Ｅ、及び１０Ｆの液体担体１２、並びにイメージング混合物５６、５６’、５６’’の第２の液体担体１２’は、水、及び／又は本明細書に記載の緩衝液のいずれかであってもよい。液体担体１２’はまた、触媒金属（複数可）を含み得る。
【0160】
これらの例示的キット５４、５４’、５４’’の各々は、一般に以下を含む配列決定方法で使用することができ、これは、鋳型鎖４８のクラスターを含むフローセルに組込み混合物１０Ｄ、１０Ｅ、及び１０Ｆを導入し、それにより、ポリメラーゼ１６又は１６’’の少なくとも１つは、標識ヌクレオチド２０又は２０’’の個々の１つを鋳型鎖４８の１つに沿って新生鎖５２に組み込む工程と、イメージング混合物５６又は５６’又は５６’’をフローセルに導入し、それによって、少なくとも１つの官能化プラズモンナノ構造１８’、１８’’、又は１８’’’は、標識ヌクレオチド２０又は２０’’のうちの個々の１つの近接内にそれ自体を会合させる工程と、少なくとも１つの官能化プラズモンナノ構造１８’、１８’’、又は１８’’’が、標識ヌクレオチド２０又は２０’’のうちの個々の１つと会合している間に、組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む。
【0161】
【0162】
図７Ａに示される例示的なキット５４では、組込み混合物１０Ｄは、図５Ａを参照して記載されているようなポリメラーゼ１６を含み、図１を参照して記載されているような標識ヌクレオチド２０を含む。ポリメラーゼ１６は、組込みで使用するために本明細書に開示される実施例のいずれかであってもよく、鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に（例えば、表面テザー４２を介して）繋ぎ留めるために官能化されていなくてもよい。ポリメラーゼ１６は、図６を参照して説明したように、組込み事象中に標識ヌクレオチド２０を組み込むために使用される。組込み混合物１０Ｄは、複数のポリメラーゼ１６を含むことを理解されたい。
【0163】
また、図７Ａに示される例示的なキット５４において、イメージング混合物５６は、第２のポリメラーゼ１６’で官能化されたプラズモンナノ構造１８’を含む。第２のポリメラーゼ１６’で官能化されたプラズモンナノ構造１８’は、第２のポリメラーゼ１６’が標識ヌクレオチド２０の組込みに利用されず、むしろ、組込みが行われた後に鋳型鎖４８と最後に組み込まれた標識ヌクレオチド２０との間の接合部４６付近にプラズモンナノ構造１８’を局在化するために利用されることを除いて、複合体１４と同様である。
【0164】
第２のポリメラーゼ１６’は、本明細書に記載のポリメラーゼ１６の任意の例であり得るか、又はヌクレオチド組込みに対して不活性であるポリメラーゼであり得る。本明細書に記載のポリメラーゼのいずれも、第２のポリメラーゼ１６’を組込み反応を触媒することができない、活性部位変異に曝露され得る。ポリメラーゼは、２つの活性部位アスパラギン酸残基を使用して共通の機構を共有し、これらの残基の一方又は両方を変異させることにより、重合が不活性になる。第２のポリメラーゼ１６’はまた、新生鎖５２の３’末端に特異的に結合することができるように選択される。
【0165】
プラズモンナノ構造１８’は、新生鎖５２の３’末端に特異的に結合する第２のポリメラーゼ１６’に連結されているため、ポリメラーゼ１６’は、少なくとも部分的に（組み込まれたヌクレオチド２０の）色素標識２６とプラズモンナノ構造１８’との間の空間を画定する。したがって、ポリメラーゼ１６’のサイズは、近接を強化する信号を作成するように選択され得る。一例では、ポリメラーゼ１６’のサイズは、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である。別の例では、ポリメラーゼ１６’のサイズは約４ｎｍ～約７ｎｍの範囲である。更に別の例では、ポリメラーゼ１６’のサイズは、約５ｎｍである。近接を増強する信号と関連付けられた距離が０．１ｎｍ～１００ｎｍである場合、ポリメラーゼ１６’のサイズは、より大きくてもよく、例えば、最大約１００ｎｍであってもよい。
【0166】
第２のポリメラーゼ１６’は、ポリメラーゼ１６をプラズモンナノ粒子１８に連結するための本明細書に記載の同じ技術を使用して、プラズモンナノ構造１８’に連結されてもよい。一例では、第２のポリメラーゼ１６’は、本明細書に記載の化学コンジュゲーション技術のいずれかを使用して、プラズモンナノ構造１８’に連結され得る。別の例では、図２Ａに示されるものと同様の結合は、オリゴヌクレオチド２８が第２のポリメラーゼ１６’に結合している場合に使用される。更に別の例では、オリゴヌクレオチド２８が第２のポリメラーゼ１６’に結合し、オリゴヌクレオチドテザー３２がプラズモンナノ粒子１８’の周りに巻き付けられている、図２Ｂに示されるものと同様の結合が使用される。
【0167】
以下の説明は、キット５４を含む例示的な方法に関する。この方法はまた、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃを参照して示され説明されるフローセルの例を利用する。この方法の開始時に、鋳型鎖４８は、図３を参照して説明したように形成されている。
【0168】
鋳型鎖４８の配列の相補的部分にハイブリダイズする配列決定プライマー５０を導入することができる。この配列決定プライマー５０は、組込み混合物１０Ｄ及びイメージング混合物５６を使用して、鋳型鎖４８を配列決定する準備が整うようにする。
【0169】
この例示的な方法では、組込み混合物１０Ｄは、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。組込み混合物１０Ｄがフローセルに導入されると、混合物１０Ｄはフローチャネルに入り、鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0170】
組込み混合物１０Ｄは、フローセル内でインキュベートされ、標識ヌクレオチド２０は、それぞれのポリメラーゼ１６によって組み込まれる。図６に示される例と同様に、組込み中、標識ヌクレオチド２０のうちの一方は、それぞれのポリメラーゼ１６によって、一方の配列決定プライマー５０を伸長し、鋳型鎖４８のうちの一方に相補的な一方の新生鎖５２に組み込まれる。この組込みはまた、鋳型鎖依存的様式で実施され、したがって、新生鎖５２に添加された標識ヌクレオチド２０の順序及びタイプの検出を使用して、鋳型鎖４８の配列を決定することができる。組込みは、単一の配列決定サイクル中にフローセル表面４４を横切る鋳型鎖４８の少なくとも一部で起こる。
【0171】
組み込まれた標識ヌクレオチド２０は、３’ＯＨブロッキング基２４の存在による可逆的終端特性を含み、標識ヌクレオチド２０が添加されると、更なる配列決定プライマー伸長を終了させる。
【0172】
インキュベーション及び組込みの所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチド２０を含む組込み混合物１０Ｄは、洗浄サイクル中にフローセルから除去され得る。組込み混合物１０Ｄは、イメージング混合物５６を導入する前に除去される。この例では、全てではないが、洗浄サイクル中に組込み混合物１０Ｄからのポリメラーゼ１６のほとんどが除去されることが望ましい。除去されるポリメラーゼ１６の割合を増加させるために、複数の洗浄サイクルを実行することができる。洗浄サイクル（複数可）は、本明細書に記載のフロースルー技術を含み得る。
【0173】
次いで、イメージング混合物５６は、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。イメージング混合物５６がフローセルに導入されると、混合物５６はフローチャネルに入り、直近に組み込まれた標識ヌクレオチド２０を含む鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0174】
イメージング混合物５６は、フローセル内でインキュベートされ、第２のポリメラーゼ１６’の少なくともいくつかは、新生鎖５２の少なくともいくつかの３’末端に特異的に結合する。各プラズモンナノ構造１８’は、第２のポリメラーゼ１６’で官能化されているため、各プラズモンナノ構造１８’は、結合した第２のポリメラーゼ１６’が新生鎖５２の３’末端に特異的に結合するときに、色素標識２６の近接を増強するシグナル内にもたらされる。更に、標識ヌクレオチド２０は、イメージング混合物５６で導入されず、したがって、追加の標識ヌクレオチド２０の組込みは行われない。
【0175】
更なる組込みが行われることなく、直近で組み込まれた標識ヌクレオチド２０を、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、フローセル表面４４に励起光を供給することができる。組み込まれた標識ヌクレオチド２０の色素標識２６は、励起光に応答して光シグナルを放出し、第２のポリメラーゼ１６’によって固定されたそれぞれのプラズモンナノ構造１８’は、プラズモン共鳴を通してこれらの光シグナルを増強する。
【0176】
イメージングを行った後、次いで切断混合物をフローセルに導入することができる。この例では、切断混合物は、ｉ）組み込まれたヌクレオチド２０から３’ＯＨブロッキング基２４を除去すること、ｉｉ）色素標識２６を組み込まれたヌクレオチド２０から切断すること、及びｉｉｉ）第２のポリメラーゼ１６’及びそれに結合したプラズモンナノ粒子１８’を除去することができる。
【0177】
この例では、３’ＯＨブロッキング基２４を切断するための本明細書に記載の脱ブロッキング剤／構成要素のいずれかを使用することができる。また、この例では、色素標識２６を切断するための本明細書に記載の切断剤／構成要素のいずれかが使用され得る。
【0178】
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、配列決定プライマー５０をｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。いくつかの例では、順鎖がシーケンシング及び除去され、次いで、逆鎖が構築され、シーケンシングされるペアエンドシーケンシングを使用してよい。
【0179】
【0180】
この例では、ポリメラーゼ１６’’は、標識ヌクレオチド２０の組込み、並びにイメージング混合物５６’に導入されるプラズモンナノ粒子１８’’を結合するために使用される。したがって、ポリメラーゼ１６’’は、ヌクレオチド組込みにおける使用のために本明細書に開示される実施例のいずれかであり、結合対の１つのメンバー５８Ａでも官能化される。組込み後にポリメラーゼ１６’’が所定の位置に留まることが望ましいため、ポリメラーゼ１６’’はまた、鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に（例えば、表面テザー４２を介して）繋ぎ留めるために官能化され得る。本明細書に記載の表面テザー４２の任意の例を使用して、ポリメラーゼ１６’’を固定することができる。組込み混合物１０Ｅは、複数のポリメラーゼ１６’’を含むことを理解されたい。
【0181】
プラズモンナノ構造１８’’は、最終的に、組込みに使用されるポリメラーゼ１６’’に結合するため、ポリメラーゼ１６’’は、少なくとも部分的に（組み込まれたヌクレオチド２０の）色素標識２６とプラズモンナノ構造１８’’との間の空間を画定する。したがって、ポリメラーゼ１６’’のサイズは、近接を強化する信号を作成するように選択され得る。一例では、ポリメラーゼ１６’’のサイズは、約３ｎｍ～約９ｎｍの範囲である。別の例では、ポリメラーゼ１６’’のサイズは約４ｎｍ～約７ｎｍの範囲である。更に別の例では、ポリメラーゼ１６’のサイズは、約５ｎｍである。
【0182】
また、図７Ｂに示される例示的なキット５４’では、イメージング混合物５６’は、結合対の別のメンバー５８Ｂで官能化されたプラズモンナノ構造１８’’を含む。プラズモンナノ粒子１８’’上のメンバー５８Ｂは、ポリメラーゼ１６’’上のメンバー５８Ａに結合することができる。例示的な結合対として、メンバー５８Ｂ（プラズモンナノ粒子１８’’上）及びメンバー５８Ａ（ポリメラーゼ１６’’上）はそれぞれ、ＮｉＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸）配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン若しくはアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む。
【0183】
以下の説明は、キット５４’を含む例示的な方法に関する。この方法はまた、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃを参照して詳細に示され説明されるフローセルの例を利用する。この方法の開始時に、鋳型鎖４８は、図３を参照して説明したように形成されている。
【0184】
鋳型鎖４８の配列の相補的部分にハイブリダイズする配列決定プライマー５０を導入することができる。この配列決定プライマー５０は、組込み混合物１０Ｅ及びイメージング混合物５６’を使用して、鋳型鎖４８を配列決定する準備が整うようにする。
【0185】
この例示的な方法では、組込み混合物１０Ｅは、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。組込み混合物１０Ｅがフローセルに導入されると、混合物１０Ｅはフローチャネルに入り、鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0186】
組込み混合物１０Ｅは、フローセル内でインキュベートされ、標識ヌクレオチド２０は、それぞれのポリメラーゼ１６’’によって組み込まれる。図６に示される例と同様に、組込み中、標識ヌクレオチド２０のうちの一方は、それぞれのポリメラーゼ１６’’によって、一方の配列決定プライマー５０を伸長し、鋳型鎖４８のうちの一方に相補的な一方の新生鎖５２に組み込まれる。この組込みはまた、鋳型鎖依存的様式で実施され、したがって、新生鎖５２に添加された標識ヌクレオチド２０の順序及びタイプの検出を使用して、鋳型鎖４８の配列を決定することができる。組込みは、単一の配列決定サイクル中にフローセル表面４４を横切る鋳型鎖４８の少なくとも一部で起こる。
【0187】
組み込まれた標識ヌクレオチド２０は、３’ＯＨブロッキング基２４の存在による可逆的終端特性を含み、標識ヌクレオチド２０が添加されると、更なる配列決定プライマー伸長を終了させる。
【0188】
インキュベーション及び組込みの所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチド２０を含む組込み混合物１０Ｅは、洗浄サイクル中にフローセルから除去され得る。組込み混合物１０Ｅは、イメージング混合物５６’を導入する前に除去される。組込みを行うポリメラーゼ１６の少なくとも一部は、洗浄サイクル後に鋳型鎖４８と最後に組み込まれた標識ヌクレオチド２０との間の接合部４６で定位置に留まる。一例では、約２０％～約９０％のポリメラーゼ１６’’は、洗浄サイクル後にフローセル内に残る。本明細書で言及されるように、洗浄サイクル中及び洗浄サイクル後に保持されたポリメラーゼ１６’’のパーセンテージを増加させるために、ポリメラーゼ１６’’は、鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に（例えば、表面テザー４２を介して）繋ぎ留められ得る。
【0189】
次いで、イメージング混合物５６’は、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。イメージング混合物５６’がフローセルに導入されると、混合物５６’はフローチャネルに入り、直近に組み込まれた標識ヌクレオチド２０を含む鋳型鎖４８が存在する表面（複数可）４４に接触する。
【0190】
イメージング混合物５６’は、フローセル内でインキュベートされ、プラズモンナノ構造１８’’のメンバー５８Ｂの少なくともいくつかは、鋳型鎖４８と直近に組み込まれた標識ヌクレオチド２０との間の接合部４６に残るポリメラーゼ１６’’のメンバー５８Ａに結合する。したがって、プラズモンナノ構造１８’’は、そのメンバー５８Ｂがポリメラーゼ１６’’上のメンバー５８Ａに特異的に結合するとき、色素標識２６の近接性を高めるシグナル内にもたらされる。
【0191】
更なる組込みが行われることなく、直近で組み込まれた標識ヌクレオチド２０を、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、フローセル表面４４に励起光を供給することができる。組み込まれた標識ヌクレオチド２０の色素標識２６は、励起光に応答して光シグナルを放出し、ポリメラーゼ１６’’によって固定されたそれぞれのプラズモンナノ構造１８’’は、プラズモン共鳴を通してこれらの光シグナルを増強する。
【0192】
イメージングを行った後、次いで切断混合物をフローセルに導入することができる。この例では、切断混合物は、ｉ）組み込まれたヌクレオチド２０から３’ＯＨブロッキング基２４を除去すること、ｉｉ）色素標識２６を組み込まれたヌクレオチド２０から切断すること、及びｉｉｉ）ポリメラーゼ１６’’及びそれに結合したプラズモンナノ粒子１８’’を除去することができる。
【0193】
この例では、３’ＯＨブロッキング基２４を切断するための本明細書に記載の脱ブロッキング剤／構成要素のいずれかを使用することができる。また、この例では、色素標識２６を切断するための本明細書に記載の切断剤／構成要素のいずれかが使用され得る。ポリメラーゼ１６’’が鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に連結されると（例えば、表面テザー４２を介して）、本明細書に記載の追加のポリメラーゼ除去剤を切断混合物に添加することができる。ポリメラーゼ除去剤は、ポリメラーゼ１６’’と鋳型鎖４８との間、又はポリメラーゼ１６’’とフローセル表面４４との間に形成される結合に依存する。一例では、ビオチン－ストレプトアビジン結合対は、表面テザー４２（及びポリメラーゼ１６’’）をフローセル表面４４に連結する。この例では、ポリメラーゼ除去剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素とビオチンの組合わせ、又は約１０％体積～約５０％体積のホルムアミド及び任意の緩衝液を含むホルムアミド試薬と、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び生体適合性界面活性剤を含む塩緩衝液の残部との組合わせであり得る。
【0194】
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、配列決定プライマー５０をｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。いくつかの例では、順鎖がシーケンシング及び除去され、次いで、逆鎖が構築され、シーケンシングされるペアエンドシーケンシングを使用してよい。
【0195】
【0196】
組込み混合物１０Ｆのこの例では、ポリメラーゼ１６は、組込みで使用するために本明細書に開示される実施例のいずれかであってもよく、鋳型鎖４８に（例えば、ＤＮＡ結合ドメインを介して）又はフローセル表面４４に（例えば、表面テザー４２を介して）繋ぎ留めるために官能化されていなくてもよい。ポリメラーゼ１６は、図６を参照して説明したように、組込み事象中に標識ヌクレオチド２０’’を組み込むために使用される。組込み混合物１０Ｆは、複数のポリメラーゼ１６を含むことを理解されたい。
【0197】
標識ヌクレオチド２０’’は、ヌクレオチド２２、ヌクレオチド２２の糖に結合した３’ＯＨブロッキング基２４、ヌクレオチド２２の塩基に結合した色素標識２６を含む。標識ヌクレオチド２０’’もビオチン化されており、したがってビオチン標識６０を含む。ビオチン標識６０は、適切な連結分子、例えば式－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－（式中、ｎは２～５０の整数である）のスペーサー基、ＰＥＧリンカー、又は図４に示す連結分子３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃのいずれかを介して、標識ヌクレオチド２０’’の塩基に付加されてもよい。代替的に、ビオチン標識６０は、色素標識２６を過ぎて（すなわち、色素標識２６に結合して）組み込まれ得る。
【0198】
プラズモンナノ構造１８’’’は、最終的に、標識ヌクレオチド２０’’のビオチン標識６０に結合し、したがって、ビオチン標識６０に結合する連結分子の長さは、結合したプラズモンナノ構造１８’’’が標識ヌクレオチド２０’’の色素標識２６の近接性を増強するシグナル内にあるように選択され得る。一例では、ビオチンラベルの連結分子は、色素標識の連結分子３８の長さの約３ｎｍ～約１２ｎｍ以内の長さを有する。別の例では、ビオチン標識の連結分子は、第１の長さを有し、色素標識の連結分子３８は、第２の長さを有し、第１及び第２の長さは、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である。
【0199】
また、図７Ｃに示される例示的なキット５４’’では、イメージング混合物５６’’は、ストレプトアビジン６２で官能化されたプラズモンナノ構造１８’’’を含む。プラズモンナノ構造１８’’’上のストレプトアビジン６２及び標識ヌクレオチド２０’’上のビオチン標識６０は、結合対を形成する。
【0200】
以下の説明は、キット５４’’を含む例示的な方法に関する。この方法はまた、図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃを参照して詳細に示され説明されるフローセルの例を利用する。この方法の開始時に、鋳型鎖４８は、図３を参照して説明したように形成されている。
【0201】
鋳型鎖４８の配列の相補的部分にハイブリダイズする配列決定プライマー５０を導入することができる。この配列決定プライマー５０は、組込み混合物１０Ｆ及びイメージング混合物５６’’を使用して、鋳型鎖４８を配列決定する準備が整うようにする。
【0202】
この例示的な方法では、組込み混合物１０Ｆは、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。組込み混合物１０Ｆがフローセルに導入されると、混合物１０Ｆはフローチャネルに入り、表面（複数可）４４に接触し、鋳型鎖４８（配列決定プライマー５０がそれにハイブリダイズする）が存在する。
【0203】
組込み混合物１０Ｆは、フローセル内でインキュベートされ、標識ヌクレオチド２０’’は、それぞれのポリメラーゼ１６によって組み込まれる。図６に示される例と同様に、組込み中、標識ヌクレオチド２０’’のうちの一方は、それぞれのポリメラーゼ１６によって、一方の配列決定プライマー５０を伸長し、鋳型鎖４８のうちの一方に相補的な一方の新生鎖５２に組み込まれる。この組込みはまた、鋳型鎖依存的様式で実施され、したがって、新生鎖５２に添加された標識ヌクレオチド２０’’の順序及びタイプの検出を使用して、鋳型鎖４８の配列を決定することができる。組込みは、単一の配列決定サイクル中にフローセル表面４４を横切る鋳型鎖４８の少なくとも一部で起こる。
【0204】
組み込まれた標識ヌクレオチド２０’’は、３’ＯＨブロッキング基２４の存在による可逆的終端特性を含み、標識ヌクレオチド２０’’が添加されると、更なる配列決定プライマー伸長を終了させる。
【0205】
インキュベーション及び組込みの所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチド２０’’を含む組込み混合物１０Ｆは、洗浄サイクル中にフローセルから除去され得る。組込み混合物１０Ｆは、イメージング混合物５６’’を導入する前に除去される。この例では、全てではないが、洗浄サイクル中に組込み混合物１０Ｆからのポリメラーゼ１６のほとんどが除去されることが望ましい。除去されるポリメラーゼ１６の割合を増加させるために、複数の洗浄サイクルを実行することができる。洗浄サイクル（複数可）は、本明細書に記載のフロースルー技術を含み得る。
【0206】
次いで、イメージング混合物５６’’は、例えば、入力ポートを介してフローセルに導入される。イメージング混合物５６’’がフローセルに導入されると、混合物５６’’はフローチャネルに入り、直近に組み込まれた標識ヌクレオチド２０’’を含む鋳型鎖４８が存在するフローセル表面（複数可）４４に接触する。
【0207】
イメージング混合物５６’’をフローセル内でインキュベートし、プラズモンナノ粒子１８’’の少なくとも一部は、その表面のストレプトアビジン６２を介して、組み込まれたヌクレオチド２０’’の少なくとも一部のビオチン標識６０に特異的に結合する。ビオチン標識６０は、プラズモンナノ粒子１８’’’が結合する標識ヌクレオチド２０’’の一部であるので、プラズモンナノ構造１８’は、その標識ヌクレオチド２０’’の色素標識２６の近接を増強するシグナル内にもたらされる。
【0208】
更なる組込みが行われることなく、直近で組み込まれた標識ヌクレオチド２０’’を、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、フローセル表面４４に励起光を供給することができる。組み込まれた標識ヌクレオチド２０’’の色素標識２６は、励起光に応答して光学シグナルを放出し、それぞれのプラズモンナノ構造１８’’’は、ストレプトアビジン６２とビオチン標識６０との間の相互作用によって固定され、プラズモン共鳴によってこれらの光学シグナルを増強する。
【0209】
イメージングを行った後、次いで切断混合物をフローセルに導入することができる。この例では、切断混合物は、ｉ）組み込まれたヌクレオチド２０’から３’ＯＨブロッキング基２４を除去すること、ｉｉ）色素標識２６を組み込まれたヌクレオチド２０’から切断すること、及びｉｉｉ）組み込まれたヌクレオチド２０’からビオチン標識６０を切断することができる。
【0210】
この例では、３’ＯＨブロッキング基２４を切断するための本明細書に記載の脱ブロッキング剤／構成要素のいずれかを使用することができる。また、この例では、色素標識２６を切断するための本明細書に記載の切断剤／構成要素のいずれかが使用され得る。ビオチン標識連結分子が色素標識連結分子３８と同じである場合、切断混合物は、ビオチン標識６０及び色素標識２６の両方を切断することができる単一の切断剤／構成要素を含み得る。ビオチン標識連結分子が色素標識連結分子３８とは異なる場合、切断混合物は、それぞれの連結分子を切断することができる異なる切断剤／構成要素を含み得る。
【0211】
洗浄（複数可）は、様々な流体送達ステップの間で行ってもよい。次いで、配列決定サイクルをｎ回繰り返して、配列決定プライマー５０をｎ個のヌクレオチドだけ伸長させ、それによって長さｎの配列を検出することができる。いくつかの例では、順鎖がシーケンシング及び除去され、次いで、逆鎖が構築され、シーケンシングされるペアエンドシーケンシングを使用してよい。
【0212】
【0213】
フローセル６４の例の上面図を図８Ａに示す。図８Ｂ及び図８Ｃを参照して説明するように、フローセル６４のいくつかの例は、配列決定が行われ得る２つの対向するフローセル表面４４を含む。パターン化されていない配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’の一例が図８Ｂに示されており、パターン化された配列決定表面４４Ｂ、４４Ｂ’の一例が図８Ｃに示されている。各配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’、又は４４Ｂ、４４Ｂ’は、基材（一般に図８Ａに６６として示される）によって支持され、フローチャネル（一般に図８Ａの６８として示される）は、配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’又は４４Ｂ、４４Ｂ’の間に画定される。他の例では、フローセル６４は、基材６６によって支持された一方の配列決定表面４４Ａ又は４４Ｂと、基材６６に取り付けられた蓋とを含む。これらの例では、フローチャネル６８は、配列決定表面４４Ａ又は４４Ｂと蓋との間に画定される。
【0214】
いずれの例でも、基材６６は、単一の層／材料であってよい。単層基材の例を図８Ｂの参照番号６６Ａ及び６６Ａ’に示す。適切な単層基材６６Ａ、６６Ａ’の例としては、エポキシシロキサン、ガラス、修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓのＴＥＦＬＯＮ（登録商標）等）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（ＺｅｏｎのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）等）、ポリイミド等を含む）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／酸化セラミック、シリカ、溶融シリカ、又はシリカベースの材料、ケイ酸アルミニウム、ケイ素及び修飾ケイ素（例えば、ホウ素ドープｐ＋ケイ素）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）又は他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、炭素、金属、無機ガラス等が挙げられる。
【0215】
基材６６はまた、多層構造であってもよい。多層基材の例を図８Ｃの参照番号６６Ｂ及び６６Ｂ’に示す。多層構造６６Ｂ、６６Ｂ’のいくつかの例は、光学イメージングに使用される光に対して等価性な五酸化タンタル又は別の酸化物のコーティング層を有するガラス又はケイ素を含む。図８Ｃを特に参照すると、多層構造６６Ｂ、６６Ｂ’の他の例は、下部支持体７０、７０’を含み、その上にパターン化された樹脂７２、７２’を有する。多層基材６６Ｂ、６６Ｂ’の更に他の例は、ケイ素オンインシュレータ（ＳＯＩ）基材を含み得る。
【0216】
一例では、基材６６（単層であるか、多層である）は、円形であってもよく、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有するか、又は最大約１０フィート（～３メートル）の最大寸法を有する長方形のシート若しくはパネルを有し得る。一例では、基材２６は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェーハである。別の例では、基材６６は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法が提供されるが、任意の適切な寸法を有する基材６６を使用できることを理解すべきである。別の例として、３００ｍｍの丸いウェーハよりも大きな表面積を有する長方形の支持体であるパネルが使用され得る。
【0217】
図８Ａに示す例では、フローセル６４は、フローチャネル６８を含む。いくつかのフローチャネル６８が示されるが、任意の数のチャネル６８がフローセル６４（例えば、単一のチャネル６８、４つのチャネル６８等）に含まれ得ることを理解すべきである。本明細書に開示される例のいくつかでは、各フローチャネル６８は、２つの配列決定表面（例えば、４４Ａ及び４４Ａ’又は４４Ｂ及び４４Ｂ’）の間及び２つの結合した基材（例えば、６６Ａ及び６６Ａ’又は６６Ｂ及び６６Ｂ’）によって画定される領域である。本明細書に開示される実施例の他の例では、各フローチャネル６８は、１つの配列決定表面（例えば、４４Ａ又は４４Ｂ）と蓋との間に画定された領域である。組込み混合物１０Ａ～１０Ｆ、イメージング混合物５６、５６’、５６’’、及び本明細書に記載の他の流体は、フローチャネル（複数可）６８に導入され、そこから除去され得る。各フローチャネル６８は、任意の特定のフローチャネル６８に導入された流体が任意の隣接するフローチャネル６８に流れ込まないように、フローセル６４内でフローチャネル６８ごとに分離されていてよい。
【0218】
フローチャネル６８の一部分は、基材６６の材料に部分的に依存する任意の好適な技術を使用し、基材６６内に画定され得る。一例では、フローチャネル６８の一部は、基材６６Ａ、６６Ａ’等のガラス基材にエッチングされる。別の例では、フローチャネル６８の一部は、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ等を使用して多層基材６６Ｂ、６６Ｂ’の樹脂７２、７２’にパターニングされてもよい。別個の材料（例えば、図８Ｂ及び図８Ｃの材料７４）が基材６６に適用されて、別個の材料が、フローチャネル６８の壁の少なくとも一部を画定することができる。
【0219】
一例では、フローチャネル６８は、丸みを帯びた端部を有する実質的に長方形の構成を有する。フローチャネル６８の長さ及び幅は、それぞれ、基材６６の長さ及び幅よりも小さくてもよく、その結果、フローチャネル６８を取り囲む基材表面の一部分は、別の基材６６又は蓋への結合に利用可能である。いくつかの事例では、各フローチャネル６８の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ超であり得る。いくつかの事例では、各フローチャネル６８の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれ超であり得る。各フローチャネル６８の幅及び／又は長さは、上で指定した値よりも大きくてもよく、それよりも小さくてもよく、又はそれらの間であってもよい。別の例では、フローチャネル６８は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。
【0220】
各フローチャネル６８の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用して、フローチャネルの壁を画定する別個の材料７４を堆積させる場合、少数の単層の厚さ程度に薄くてよい。他の例では、各フローチャネル６８の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であってよい。一例では、深さは、約１０μｍから約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは約５μｍ以下である。各フローチャネル６８の深さはまた、上で指定された値よりも大きいか、小さいか、又はそれらの間であり得ることを理解すべきである。フローチャネル６８の深さはまた、例えば、パターン化された配列決定表面４４Ｂ、４４Ｂ’が使用される場合、フローセル６４の長さ及び幅に沿って変化してもよい。
【0221】
図８Ｂは、パターン化されていない対向する配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’を含むフローセル６４の断面図を示す。一例では、これらの表面４４Ａ、４４Ａ’のそれぞれは、基材６６Ａ、６６Ａ’上に作製されてもよく、次いで、基材４４Ａ、４４Ａ’は、フローセル６４の一例を形成するために互いに結合してもよい。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料等の任意の適切な結合材料７４を使用して、基材６６Ａ、６６Ａ’を共に結合してもよい。
【0222】
図８Ｂに示す例では、フローチャネル６８の一部は、単層基材６６Ａ、６６Ａ’の各々に画定される。例えば、各基材６６Ａ、６６Ａ’は、配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’の構成要素が導入され得るその中に画定されたくぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’を有し得る。配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’の構成要素によって占められていないくぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’内の任意の空間は、フローチャネル６８の一部であると見なされ得ることを理解されたい。
【0223】
配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’は、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’と、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’’に結合した増幅プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’とを含む。図示されていないが、配列決定面４４Ａ、４４Ａ’のいくつかの例はまた、表面テザー４２に結合することができる結合剤（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン等）を含むことができる。この結合剤は、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’内に存在してもよい。
【0224】
ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の例としては、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭ等のアクリルアミドコポリマーが挙げられる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表され、
【0225】
【化9】
ＲＡは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
ＲＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
ＲＣ、ＲＤ、及びＲＥはそれぞれ、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれは、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１から５０の範囲の整数であり、
ｎは１から５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１から１００，０００の範囲の整数である）。
【0226】
当業者は、構造（Ｉ）において繰り返される特徴「ｎ」及び「ｍ」の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組合わせ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。
【0227】
ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａから約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。
【0228】
いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。
【0229】
他の例では、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’は、構造（Ｉ）の変形であってもよい。一例では、アクリルアミドユニットはＮ，Ｎージメチルアクリルアミド
【0230】
【化10】
【0231】
【化11】
【0232】
【化12】
【0233】
ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の別の例として、構造（Ｉ）の反復する「ｎ」特徴は、構造（ＩＩ）を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられてもよく、
【0234】
【化13】
【0235】
更に別の例として、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’は、構造（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のそれぞれの反復単位を含み得、
【0236】
【化14】
【0237】
他のモノマーは、増幅プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’をグラフトするように官能化されている限り、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を形成するために使用され得ることが理解されるべきである。適切なポリマー層の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから合成され得る。適切なポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の更に他の例には、アクリルアミドとアクリレートの混合コポリマーが含まれる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星型ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造は利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミドなど）は、ランダムに又はブロックで、星型ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれ得る。
【0238】
ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’をくぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’に導入するために、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の混合物を生成し、次いで、それぞれの基材６６Ａ、６６Ａ’に塗布することができる（内部に画定されたくぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’を有する）。一例では、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’は、混合物中（例えば、水と、又はエタノール及び水と）に存在してもよい。次に、混合物は、スピンコーティング、浸漬又は浸漬コーティング、あるいは正圧又は負圧下での材料のフロー、又は別の適切な技術を使用し、それぞれの基材表面（くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’を含む）に適用され得る。これらのタイプの技術は、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を基材のそれぞれの基材６６Ａ、６６Ａ’上に無分別に堆積させる（例えば、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’内、及びそれに隣接する間隙領域８４Ａ、８４Ａ’上）。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術等を含む）を使用して、間隙領域８４Ａ、８４Ａ’ではなく、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’にポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を特異的に堆積させることができる。
【0239】
いくつかの例では、基材表面（くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’を含む）が活性化され得、次に、混合物（ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を含む）がそれに適用され得る。一例では、シラン又はシラン誘導体（例えば、ノルボルネンシラン）は、蒸着、スピンコーティング、又は他の堆積方法を使用し、基材表面に堆積され得る。別の例では、基材表面をプラズマ灰化に曝露させて、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’に付着し得る表面活性化剤（例えば、－ＯＨ基）を生成することができる。
【0240】
ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の化学的性質に応じて、適用された混合物を硬化プロセスに曝露してもよい。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。
【0241】
次いで、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’の周囲の間隙領域８４Ａ、８４Ａ’からポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を除去し、一方、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’の表面上のポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’を少なくとも実質的に無傷のままにするために、研磨を実行することができる。
【0242】
配列決定表面４４Ａ、４４Ａ’はまた、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’に結合した増幅プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’を含む。
【0243】
増幅プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’をくぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’内のポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’にグラフトするために、グラフト化プロセスを行うことができる。一例では、増幅プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’は、プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’の５’末端又はその近くでの単一点共有結合によってポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’に固定化することができる。この結合により、ｉ）プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’のアダプター特異的部分は、その同族の配列決定可能な核酸断片に自由にアニールすることができ、ｉｉ）３’ヒドロキシル基は、自由にプライマーを伸長することができる。この目的のために、任意の好適な共有結合を使用することができる。使用できる末端プライマーの例としては、アルキン末端プライマー（例えば、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’のアジド表面部分に結合し得る）、又はアジド末端プライマー（例えば、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’のアルキン表面部分に結合し得る）が挙げられる。
【0244】
好適なプライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’の具体例としては、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、及び他の機器プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている市販のフローセルの表面上で使用されるＰ５及びＰ７プライマーが挙げられる。Ｐ５及びＰ７プライマーのいずれも、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’のそれぞれにグラフトされ得る。
【0245】
一例では、グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合した蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー（複数可）８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’をポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’に結合させる別の適切な方法によるものであり得る。これらの例示的な技術のそれぞれは、プライマー（複数可）８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’、水、緩衝液、及び触媒を含み得る、プライマー溶液又は混合物を利用し得る。グラフト法のうちのいずれかを用いて、プライマー４２、４２’は、くぼみ領域７６Ａ、７６Ａ’においてポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’の反応基と反応し、周囲の基材６６Ａ、６６Ａ’に対して親和性を有さない。したがって、プライマー８０Ａ、８２Ａ、又は８０Ａ’、８２Ａ’は、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’に選択的に移植する。
【0246】
図８Ｃは、パターン化された対向する配列決定表面４４Ｂ、４４Ｂ’を含むフローセル６４の断面図を示す。一例では、これらの表面４４Ｂ、４４Ｂ’のそれぞれは、基材６６Ｂ、６６Ｂ’上に作製されてもよく、次いで、基材６６Ｂ、６６Ｂ’は、フローセル６４の一例を形成するために互いに（例えば、材料７４を介して）結合してもよい。
【0247】
図８Ｃに示す例では、フローセル６４は、多層基材６６Ｂ、６６Ｂ’を含み、その各々は、支持体７０、７０’と、支持体７０、７０’上に配置されたパターン化材料７２、７２’と、を含む。パターン化材料７２、７２’は、間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’によって分離されたくぼみ８８、８８’を画定する。
【0248】
図８Ｃに示す例では、パターン化された材料７２、７２’は、それぞれ支持体７０、７０’上に配置される。くぼみ８８、８８’及び間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’を形成するために選択的に堆積、又は堆積及びパターニングすることができる任意の材料を、パターニングされた材料７２、７２’に使用することができることを理解されたい。
【0249】
一例として、無機酸化物は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体７０、７０’に選択的に適用され得る。適切な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ２Ｏ５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ２）などが挙げられる。
【0250】
別の例として、樹脂は支持体７０、７０’に塗布されてからパターン化され得る。好適な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷等を含む。好適なパターニング技術としては、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（nanoimprint lithography：ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術等が挙げられる。好適な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサンベースの樹脂、非多面体オリゴマーシルセスキオキサンエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組合わせが挙げられる。
【0251】
本明細書で使用される場合、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓから商標名「ＰＯＳＳ」として市販）という用語は、シリカ（ＳｉＯ２）とケイ素（Ｒ２ＳｉＯ）とのハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ３／２］ｎを有する有機ケイ素化合物であり、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。ＰＯＳＳの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／若しくはメタクリレート、又は更には、例えば、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、及び／若しくはハロアルキル基が挙げられる。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマーユニットとして１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。平均ケージ含有量は、合成期間に調整され得、及び／又は精製方法によって制御され得、モノマーユニットのケージサイズの分布は本明細書に開示される実施例で使用され得る。
【0252】
図８Ｃに示すように、パターン化材料７２、７２’は、その中にそれぞれ画定されたくぼみ８８、８８’と、隣接するくぼみ８８、８８’を分離する間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’とを含む。規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ８８、８８’の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ８８、８８’は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線的な（長方形）レイアウト、三角形のレイアウトなどを含み得る。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ８８、８８’のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ８８、８８’及び／又は間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ８８、８８’及び／又は間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’のランダムな配置であり得る。パターンは、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、格子柄、対角線、矢印、及び／又は正方形を含んでもよい。
【0253】
くぼみ８８、８８’のレイアウト又はパターンは、画定された領域におけるくぼみ８８、８８’の密度（例えば、くぼみ８８、８８’の数）により特徴付けられ得る。例えば、くぼみ８８、８８’は、１ｍｍ２あたり約２００万の密度で存在し得る。例えば、１ｍｍ２あたり約１００、１ｍｍ２あたり約１，０００、１ｍｍ２あたり約１０万、１ｍｍ２あたり約１００万、１ｍｍ２あたり約２００万、１ｍｍ２あたり約５００万、１ｍｍ２あたり約１０００万、１ｍｍ２あたり約５０００万、又はそれ以下の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化材料７２、７２’のくぼみ８８、８８’の密度は、上記範囲から選択された下方値の１つと上方値の１つとの間であり得ることを更に理解されたい。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ８８、８８’を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍで分離されたくぼみ８８、８８’を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ８８、８８’を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の適切な密度を使用できることを理解すべきである。くぼみ８８、８８’の密度は、くぼみ８８、８８’の深さに部分的に依存し得る。いくつかの場合では、くぼみ８８、８８’間の間隔は、本明細書に列挙される例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。
【0254】
くぼみ８８、８８’のレイアウト又はパターンはまた、又は代替的に、平均ピッチ、又はくぼみ８８、８８’の中心から隣接するくぼみ８８、８８’の中心までの間隔（中心間の間隔）、又は１つのくぼみ８８、８８’の左端から隣接するくぼみ８８、８８’の右端までの間隔（エッジ間の間隔）に関して特徴付けられ得る。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそ約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ８８、８８’の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ８８、８８’は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。
【0255】
くぼみ８８、８８’のそれぞれのサイズは、その体積、開口面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。
【0256】
くぼみ８８、８８’のそれぞれは、フローセル６４に導入される少なくともいくらかの流体を隔離する（confining）ことができる任意の体積を有し得る。最小又は最大の体積は、例えば、フローセル６４の下流での使用に期待されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、体積は、少なくとも約１×１０－３μｍ３、少なくとも約１×１０－２μｍ３、少なくとも約０．１μｍ３、少なくとも約１μｍ３、少なくとも約１０μｍ３、少なくとも約１００μｍ３、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、体積は、最大で約１×１０４μｍ３、最大で約１×１０３μｍ３、最大で約１００μｍ３、最大で約１０μｍ３、最大で約１μｍ３、最大で約０．１μｍ３、又はそれ以下であり得る。
【0257】
各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の体積と同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみ開口部の面積は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、面積は、最大で約１×１０３μｍ２、最大で約１００μｍ２、最大で約１０μｍ２、最大で約１μｍ２、最大で約０．１μｍ２、最大で約１×１０－２μｍ２、又はそれ以下であり得る。各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0258】
各くぼみ８８、８８’の深さは、ポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’の一部を収容するのに十分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。それぞれのくぼみ８８、８８’の深さは、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0259】
いくつかの例では、くぼみ８８、８８’のそれぞれの直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径又は長さ及び幅は約０．４μｍである。各くぼみ８８、８８’の直径又は長さ及び幅は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0260】
この例では、配列決定表面４４Ｂ、４４Ｂ’の構成要素の少なくともいくつかがくぼみ８８、８８’に導入され得る。配列決定表面４４Ｂ、４４Ｂ’の構成要素によって占有されていないくぼみ８８、８８’内のあらゆる空間は、フローチャネル６８の一部であると見なされ得ることを理解すべきである。
【0261】
図８Ｃに示す例では、ポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’は、くぼみ８８、８８’のそれぞれの中に配置される。ポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’は、ポリマーヒドロゲル７８Ａ、７８Ａ’について本明細書に記載された例のいずれかであってもよく、図８Ｂを参照して説明したように適用することができ（例えば、堆積とそれに続く研磨）、その結果、ポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’はくぼみ８８、８８’内に存在し、周囲の間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’上には存在しない。
【0262】
図８Ｃに示す例では、プライマー８０Ｂ、８２Ｂ又は８０Ｂ’、８２Ｂ’は、プライマー８０Ａ、８２Ａ又は８０Ａ’、８２Ａ’について本明細書に記載の例のいずれかであってもよく、くぼみ８８、８８’のそれぞれ内のポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’にグラフトされてもよい。プライマー８０Ｂ、８２Ｂ又は８０Ｂ’、８２Ｂ’は、図８Ｂを参照して説明したように適用することができ、したがって、ポリマーヒドロゲル７８Ｂ、７８Ｂ’にグラフトし、周囲の間隙領域８４Ｂ、８４Ｂ’にはグラフトしない。
【0263】
図示されていないが、配列決定面４４Ｂ、４４Ｂ’のいくつかの例はまた、表面テザー４２に結合することができる結合剤（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン等）を含むことができる。この結合剤は、くぼみ８８、８８’に存在し得る。
【0264】
図８Ｂ及び図８Ｃに示すように、配列決定表面４４Ａ及び４４Ａ’又は４４Ｂ及び４４Ｂ’がその間に画定されたフローチャネル６８により対向するように、基材６６Ａ及び６６Ａ’又は６６Ｂ及び６６Ｂ’を互いに結合させる。
【0265】
基材６６Ａ及び６６Ａ’又は６６Ｂ及び６６Ｂ’は、間隙領域８４Ａ及び８４Ａ’又は８４Ｂ及び８４Ｂ’の一部又は全てにおいて互いに結合してもよい。基材６６Ａと６６Ａ’又は６６Ｂと６６Ｂ’との間に形成される結合は、化学的結合、又は機械的結合（例えば、留め具を使用する等）であり得る。
【0266】
レーザー結合、拡散結合、陽極結合、共晶結合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、又は当技術分野で知られる他の方法等の任意の適切な技術を使用し、基材６６Ａ及び６６Ａ’又は６６Ｂ及び６６Ｂ’を共に結合し得る。一例では、スペーサー層（例えば、材料７４）を使用し、基材６６Ａ及び６６Ａ’又は６６Ｂ及び６６Ｂ’を結合し得る。スペーサー層は、基材６６Ａと６６Ａ’又は６６Ｂと６６Ｂ’の少なくとも一部を共にシールする任意の材料７４であり得る。いくつかの例では、スペーサー層は、結合を助ける放射線吸収材料であり得る。
【0267】
示されていないが、フローセルが１つの配列決定表面を有するように、蓋が基材６６Ａ又は６６Ｂのうちの１つに結合してもよいことを理解されたい。
【0268】
追記事項
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組合わせが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
【0269】
「一例」、「別の例」、「ある例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。
【0270】
本明細書に提供される範囲は、そのような値又は部分範囲が明示的に列挙されているかのように、示される範囲及びその示される範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解されたい。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に列挙された限界だけでなく、約４０ｍｍ、約２５０．５ｍｍ等の個々の値、及び約２５ｍｍ～約１７５ｍｍ等の部分範囲も含むと解釈されるべきである。
【0271】
更に、「約」及び／又は「実質的に」が値を説明するために利用される場合、それらは、示された値からのわずかな変動（最大で±１０％）を包含することを意味する。
【0272】
いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。
【0273】
代表的な特徴
代表的な特徴は、以下の番号付けされた条項に記載されており、単独であってもよく、又は任意の組合わせで、本明細書の本文及び／又は図面に開示される１つ以上の特徴と組み合わされてもよい。
条項１．組込み混合物であって、
液体担体と、
複合体であって、
ポリメラーゼ、及び
ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む複合体と、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む標識ヌクレオチドと、
を含む、組込み混合物。
条項２．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項１に記載の組込み混合物。
条項３．プラズモンナノ構造が、ポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、条項１又は条項２に記載の組込み混合物。
条項４．
オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼに結合しており、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、条項１～３のいずれか一項に記載の組込み混合物。
条項５．
オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼに結合しており、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた追加の部分も含むオリゴヌクレオチドテザーの相補的部分にハイブリダイズする、条項１～４に記載の組込み混合物。
条項６．
プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼが、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、条項１～５に記載の組込み混合物。
条項７．第１のメンバー及び第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、条項６に記載の組込み混合物。
条項８．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数の複合体であって、各複合体が、
ポリメラーゼ、及び
ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複数の複合体と、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、ｉ）標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込み、ｉｉ）標識ヌクレオチドの個々の１つの近接内にその連結されたプラズモンナノ構造を維持する、組込み混合物を導入する工程と、
プラズモンナノ構造が維持されている間に組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
条項９．キットであって、
組込み混合物であって、
液体担体と、
ポリメラーゼと、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、標識ヌクレオチドと、を含む組込み混合物、並びに
イメージング混合物であって、
第２の液体担体と、
標識ヌクレオチドが関与する組込み事象の後に、標識ヌクレオチドの近接内でそれ自体を会合するように官能化されたプラズモンナノ構造と、を含むイメージング混合物と、
を含む、組込み混合物を含むキット。
条項１０．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項９に記載のキット。
条項１１．プラズモンナノ構造が、第２のポリメラーゼで官能化されている、条項９又は条項１０に記載のキット。
条項１２．プラズモンナノ構造が、第２のポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、条項１１に記載のキット。
条項１３．
オリゴヌクレオチドが、第２のポリメラーゼに結合し、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、条項１１に記載のキット。
条項１４．
オリゴヌクレオチドが、第２のポリメラーゼに結合し、
オリゴヌクレオチドが、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた部分を含む相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズされる、条項１１に記載のキット。
条項１５．
プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼが、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、条項９～１４に記載のキット。
条項１６．第１のメンバー及び第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、条項１５に記載のキット。
条項１７．ポリメラーゼが、その表面に結合したＤＮＡ結合ドメインを更に含む、条項１５又は条項１６に記載のキット。
条項１８．ポリメラーゼが、
表面に結合した表面テザーと、
表面テザーに結合したフローセル表面結合剤と、を更に含む、条項１５～１７のいずれか一項に記載のキット。
条項１９．
プラズモンナノ構造が、ストレプトアビジンで官能化され、
標識ヌクレオチドが、ビオチン化されている、条項９～１８のいずれか一項に記載のキット。
条項２０．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、
を含み、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、
フローセルにイメージング混合物を導入する工程であって、イメージング混合物が、
第２の液体担体と、
複数の官能化プラズモンナノ構造と、を含み、
それによって、官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが、標識ヌクレオチドのうちの個々のものの近接内にそれ自体を会合させる、イメージング混合物を導入する工程と、
官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが標識ヌクレオチドのうちの個々のものと会合している間に、組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
条項２１．条項２０に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、第２のポリメラーゼで官能化され、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２０に記載の方法。
条項２２．条項２０又は２１に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼの各々が、結合対の第２のメンバーを含み、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２０又は２１に記載の方法。
条項２３．条項２１又は２２のいずれか一項に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、ストレプトアビジンで官能化され、
標識ヌクレオチドの各々が、ビオチン化され、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２１又は２２に記載の方法。
条項２４．標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチドと、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基と、
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、
ヌクレオチドの塩基又は色素標識に結合したプラズモンナノ構造と、を含む、標識ヌクレオチド。
条項２５．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項２４に記載の標識ヌクレオチド。
条項２６．プラズモンナノ構造が、二本鎖デオキシリボ核酸鎖を介してヌクレオチドの塩基に結合している、第２４項又は第２５項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２７．
第１の連結分子が、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第２の連結分子が、プラズモンナノ構造をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第１の連結分子は、第２の連結分子の第２の長さの約３ｎｍ～約１２ｎｍ以内の第１の長さを有する、条項２４～２６のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２８．
第１の連結分子が、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第２の連結分子が、プラズモンナノ構造をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第１の連結分子が、第１の長さを有し、第２の連結分子が、第２の長さを有し、第１及び第２の長さが、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である、条項２４～２７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２９．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識、及び
ヌクレオチドの塩基に結合したプラズモンナノ構造を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含む、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程と、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む工程と、
組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む、方法。
代表的な特徴は、以下の番号付けされた条項に記載されており、単独であってもよく、又は任意の組合わせで、本明細書の本文及び／又は図面に開示される１つ以上の特徴と組み合わされてもよい。
条項１．組込み混合物であって、
液体担体と、
複合体であって、
ポリメラーゼ、及び
ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む複合体と、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む標識ヌクレオチドと、
を含む、組込み混合物。
条項２．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項１に記載の組込み混合物。
条項３．プラズモンナノ構造が、ポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、条項１又は条項２に記載の組込み混合物。
条項４．
オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼに結合しており、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、条項１～３のいずれか一項に記載の組込み混合物。
条項５．
オリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼに結合しており、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた追加の部分も含むオリゴヌクレオチドテザーの相補的部分にハイブリダイズする、条項１～４に記載の組込み混合物。
条項６．
プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼが、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、条項１～５に記載の組込み混合物。
条項７．第１のメンバー及び第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、条項６に記載の組込み混合物。
条項８．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数の複合体であって、各複合体が、
ポリメラーゼ、及び
ポリメラーゼに連結されたプラズモンナノ構造を含む、複数の複合体と、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含み、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、ｉ）標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込み、ｉｉ）標識ヌクレオチドの個々の１つの近接内にその連結されたプラズモンナノ構造を維持する、組込み混合物を導入する工程と、
プラズモンナノ構造が維持されている間に組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
条項９．キットであって、
組込み混合物であって、
液体担体と、
ポリメラーゼと、
標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、標識ヌクレオチドと、を含む組込み混合物、並びに
イメージング混合物であって、
第２の液体担体と、
標識ヌクレオチドが関与する組込み事象の後に、標識ヌクレオチドの近接内でそれ自体を会合するように官能化されたプラズモンナノ構造と、を含むイメージング混合物と、
を含む、組込み混合物を含むキット。
条項１０．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項９に記載のキット。
条項１１．プラズモンナノ構造が、第２のポリメラーゼで官能化されている、条項９又は条項１０に記載のキット。
条項１２．プラズモンナノ構造が、第２のポリメラーゼのアミン又はシステインに化学的にコンジュゲートしている、条項１１に記載のキット。
条項１３．
オリゴヌクレオチドが、第２のポリメラーゼに結合し、
オリゴヌクレオチドは、プラズモンナノ構造に結合した相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズする、条項１１に記載のキット。
条項１４．
オリゴヌクレオチドが、第２のポリメラーゼに結合し、
オリゴヌクレオチドが、プラズモンナノ構造の周りに巻き付けられた部分を含む相補的オリゴヌクレオチドテザーにハイブリダイズされる、条項１１に記載のキット。
条項１５．
プラズモンナノ構造が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼが、結合対の第２のメンバーを含むか、又はそれで官能化されている、条項９～１４に記載のキット。
条項１６．第１のメンバー及び第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡ配位子及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイカッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はアジド及びジベンゾシクロオクチンを含む、条項１５に記載のキット。
条項１７．ポリメラーゼが、その表面に結合したＤＮＡ結合ドメインを更に含む、条項１５又は条項１６に記載のキット。
条項１８．ポリメラーゼが、
表面に結合した表面テザーと、
表面テザーに結合したフローセル表面結合剤と、を更に含む、条項１５～１７のいずれか一項に記載のキット。
条項１９．
プラズモンナノ構造が、ストレプトアビジンで官能化され、
標識ヌクレオチドが、ビオチン化されている、条項９～１８のいずれか一項に記載のキット。
条項２０．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、及び
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識を含む、複数の標識ヌクレオチドと、
を含み、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む、組込み混合物を導入する工程と、
フローセルにイメージング混合物を導入する工程であって、イメージング混合物が、
第２の液体担体と、
複数の官能化プラズモンナノ構造と、を含み、
それによって、官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが、標識ヌクレオチドのうちの個々のものの近接内にそれ自体を会合させる、イメージング混合物を導入する工程と、
官能化プラズモンナノ構造のうちの少なくとも１つが標識ヌクレオチドのうちの個々のものと会合している間に、組込みを光学的にイメージングする工程と、
を含む、方法。
条項２１．条項２０に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、第２のポリメラーゼで官能化され、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２０に記載の方法。
条項２２．条項２０又は２１に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、結合対の第１のメンバーで官能化され、
ポリメラーゼの各々が、結合対の第２のメンバーを含み、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２０又は２１に記載の方法。
条項２３．条項２１又は２２のいずれか一項に記載の方法であって、
官能化プラズモンナノ構造の各々が、ストレプトアビジンで官能化され、
標識ヌクレオチドの各々が、ビオチン化され、
方法が、イメージング混合物を導入する前に、組込み混合物を除去することを更に含む、条項２１又は２２に記載の方法。
条項２４．標識ヌクレオチドであって、
ヌクレオチドと、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基と、
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識と、
ヌクレオチドの塩基又は色素標識に結合したプラズモンナノ構造と、を含む、標識ヌクレオチド。
条項２５．プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープケイ素ナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合わせからなる群から選択される、条項２４に記載の標識ヌクレオチド。
条項２６．プラズモンナノ構造が、二本鎖デオキシリボ核酸鎖を介してヌクレオチドの塩基に結合している、第２４項又は第２５項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２７．
第１の連結分子が、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第２の連結分子が、プラズモンナノ構造をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第１の連結分子は、第２の連結分子の第２の長さの約３ｎｍ～約１２ｎｍ以内の第１の長さを有する、条項２４～２６のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２８．
第１の連結分子が、色素標識をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第２の連結分子が、プラズモンナノ構造をヌクレオチドの塩基に結合させ、
第１の連結分子が、第１の長さを有し、第２の連結分子が、第２の長さを有し、第１及び第２の長さが、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である、条項２４～２７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチド。
条項２９．方法であって、
鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程であって、組込み混合物が、
液体担体と、
複数のポリメラーゼと、
複数の標識ヌクレオチドであって、各標識ヌクレオチドが、
ヌクレオチド、
ヌクレオチドの糖に結合した３’ＯＨブロッキング基、
ヌクレオチドの塩基に結合した色素標識、及び
ヌクレオチドの塩基に結合したプラズモンナノ構造を含む、複数の標識ヌクレオチドと、を含む、鋳型鎖のクラスターを含むフローセルに組込み混合物を導入する工程と、
それにより、少なくとも１つのポリメラーゼが、標識ヌクレオチドのうちの個々の１つを鋳型鎖の１つに沿って新生鎖に組込む工程と、
組込みを光学的にイメージングする工程と、を含む、方法。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【国際調査報告】